CN108548917B - 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学检测应用领域，涉及一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用，所述检测体系中的样本量为0.3‑0.8mL。本发明能够提高检测记忆T细胞再次受刺激后分泌的细胞因子灵敏度，提高以检测记忆T细胞分泌细胞因子为基础的辅助诊断试剂盒整体地灵敏度，减少漏检的可能。

Description

一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用

技术领域

本发明属于医学检测应用领域，涉及一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用。

背景技术

细胞因子(cytokine)泛指一类跟机体炎症和免疫应答反应密切相关的小分子多肽糖蛋白。机体感染疾病时，一系列相关细胞子通过协调参与机体的免疫应答过程。以结核免疫为例，结核分枝杆菌通过T淋巴细胞介导引起机体Ⅳ型超敏反应，机体发挥T细胞免疫为主，多种细胞因子协同参与的免疫应答，主要由CD4+T细胞即T辅助性1型细胞(Th1)和CD8+T细胞即T辅助性2型细胞(Th2)介导。相关细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)等。

据报道，通过检测记忆T细胞再次受特异性抗原刺激的反应程度，通常表现为分泌各类细胞因子，可以揭示机体感染疾病的状态，这是一种可靠的检测方法，如γ干扰素释放实验(IGRAs)。IGRAs是在体外检测T细胞经结核特异性抗原刺激之后产生和释放γ-干扰素能力的技术，借此判断细胞介导的免疫反应。IGRAs是采用结核分枝杆菌特有的2种抗原ESAT-6和CFP-10刺激受检者全血或外周血单个核细胞使T淋巴细胞产生大量γ-干扰素，然后用酶联免疫吸附法或酶联免疫斑点法检测γ-干扰素浓度或计数分泌γ-干扰素细胞的方法。

国际上广泛使用的IGRAs商业试剂盒有以下几种，即澳大利亚Cellistis公司产的QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)，德国Qiagen公司的QFT，QFT-Gold；英国OxfordImmunotec产的T-SPOT.TB，中国万泰的TB-IGRA。

QuantiFERON-TB Gold已被美国FDA批准作为检测结核分枝杆菌感染的体外辅助诊断。它使用模拟ESAT-6，CFP-10和TB7.7(p4)蛋白的混合多肽来刺激肝素化全血中的细胞，用ELISA的方法检测γ-干扰素来鉴别对这些多肽抗原的体外反应，此反应与结核分枝杆菌感染相关。

QFT则是最早被美国FDA批准上市的IGRAs产品，并且在许多国家的指导原则和推荐中是替代TST的优先选择。QFT是一种高特异性、可控的血液学检测方法，可用于辅助诊断TB感染，并且提供结果来显示个体对结核分枝杆菌抗原高特异性的T细胞反应。QFT采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来检测与TB特异性抗原共同孵育后全血样本中的γ-干扰素反应。

QFT和QuantiFERON-TB Gold和TB-IGRA都是用0.8-1.2mL的血液来进行刺激实验。QFT和QuantiFERON-TB Gold是直接采血到刺激管中，从而进行后续检测。TB-IGRA是用精确分血1mL的血液来进行刺激实验。T-Spot TB则是需要从8mL成人的血液中分离出PBMC细胞后进行实验,要求每个检测孔含有25万个PBMC细胞。

通过细胞因子变化诊断疾病状态的方法依赖于检测标的细胞因子的高敏感度。以IGRAs为原理的商业化试剂盒为例，T-SPOT.TB、QFT-GIT检测记忆T细胞受结核抗原刺激后分泌IFN-γ的含量或分泌IFN-γ细胞数目的变化，从而判断机体是否感染结核分枝杆菌。据报道，T-SPOT.TB辅助诊断结核病的灵敏度达90％，但是T-SPOT.TB需先分离人外周血单核细胞(PBMC)，操作步骤繁琐。QFT-GIT方法操作相对比较容易，但是辅助诊断结核病的灵敏度仅达70％。目前有不少报道旨在于通过实验方法的调整提高QFT-GIT整体灵敏度，如提高孵育温度至39℃，即时孵育静脉血等，但在高温下T细胞会发生非特异性的激活，增加了检测的假阳性率。

CN 102680684 A公开了结核杆菌检测技术领域，具体地说是一种结核病抗原特异的全血T细胞检测方法，将结核杆菌特异抗原表位肽，MHC供体和受检者的外周全血孵育，直接检测MHC供体-结核分枝杆菌抗原表位-特异性T细胞形成的复合物的信号。CN 101446585A公开了一种体外检测结核杆菌感染的试剂和方法，其包含SEQ ID NO.1所代表的M233多肽；通过使用M233多肽或其类似物，与结核杆菌宿主的T细胞相接触，检测从T细胞释放的细胞因子，确定T细胞是否识别M233多肽类似物。上述检测方法的检测样本的体积都在1-5mL，其检测灵敏度还有待进一步提高。

因此，开发一种能够进一步提高检测记忆性免疫细胞的灵敏度的检测方法意义重大。

发明内容

针对现有技术中，本专利提供了一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用，其能够提高检测记忆T细胞再次受刺激后分泌的细胞因子灵敏度，提高以检测记忆T细胞分泌细胞因子为基础的辅助诊断试剂盒整体地灵敏度，减少漏检的可能。

第一方面，本发明的目的在于提供一种记忆性免疫细胞的检测体系，所述检测体系中的样本量为0.3-0.8mL。

本发明中，发明人通过对刺激抗原孵育时间，孵育温度，孵育血液量等研究发现，控制孵育血液量有助于记忆免疫细胞再次受刺激后分泌的物质，且分泌量明显增多，且通过大量实验验证发现，当检测样本量在0.3-0.8mL时，在刺激抗原终浓度一致的情况下，能够明显提高检测分泌物质的灵敏度。

所述样本量例如可以是0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL或0.8mL，优选为0.6mL。

本发明中，发明人进一步发现，但样本体积为0.6mL的时候，其记忆性免疫细胞的分泌物质的分泌量最高，检测灵敏度最高。

根据本发明，所述检测体系的靶标为细胞受刺激后分泌的物质，所述细胞受刺激后分泌的物质为细胞因子、趋化因子或蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述细胞因子为免疫细胞和/或非免疫细胞受刺激分泌的细胞因子，优选为免疫细胞分泌的细胞因子。

本发明中，所述免疫细胞可以选自但不限于T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞，免疫细胞通过特定的细胞刺激物，刺激后会分泌相应的细胞因子，从而通过检测全血中的细胞分泌物实现检测。

根据本发明，所述检测体系还包括刺激抗原和/或阳性对照抗原。

根据本发明，所述刺激抗原为刺激记忆性T细胞的特异性抗原。

根据本发明，所述刺激记忆性T细胞的特异性抗原为天然蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物、病毒特异性抗原或细菌特异性抗原中的任意一种或至少两种的组合，优选为细菌特异性抗原，进一步优选为结核杆菌特异性抗原。

所述天然蛋白、多肽、核酸、多糖、小分子化合物可以是能够刺激细胞反应的过敏原。

所述病毒特异性抗原或细菌特异性抗原为只要能够刺激记忆T细胞的抗原都是可行的，包括病毒或细菌表面，内部的抗原蛋白、核蛋白，病毒或细菌分泌的蛋白，在此不作特殊限定，所述病毒特异性抗原例如可以是CMV病毒，所述细菌特异性抗原例如可以是结核杆菌特异性抗原。

根据本发明，所述阳性对照抗原为刺激免疫细胞的非特异性刺激剂。

根据本发明，所述刺激免疫细胞的非特异性刺激剂选自但不限于刀豆素A(ConcanavalinA,ConA)、植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)、人美洲商陆素(PWM)、花生凝集素(PNA)、大豆凝集素(SBA)、葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS)或肿瘤刺激剂(PMA)中的任意一种或至少两种的组合，优选为植物血凝素。

根据本发明，所述细胞因子为免疫细胞或非免疫细胞受刺激分泌的细胞因子都是可行的，本领域技术人员可以根据实验需要进行选择，本发明中的细胞因子为IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-β、SCF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、神经白细胞素、IgA、IgG、穿孔素、颗粒素、IP10或TGF-β中的任意一种或至少两种的组合，优选为IL-2、IL-6、IFN-γ、IP10或TGF-β中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为IFN-γ。

本发明中，所述细胞因子大多数为质量小于25kDa的糖蛋白，本申请通过验证IL-2、IL-6、IFN-γ这三个细胞因子，发现其控制样本体积在0.3-0.8mL，确实提高了检测灵敏度，其他细胞因子的检测同样都采用相应的试剂盒进行，而通过本申请检测体系，其可用于大多数细胞因子的检测，通过控制检测样本的体积在0.3-0.8mL，从而进一步提高检测的灵敏度，而具体样本的体积，本领域技术人员可以根据每个细胞因子进行微调。

根据本发明，所述检测样本为肝素抗凝的血液。

根据本发明，所述检测体系还包括检测样本的刺激抗原，所述刺激抗原加入样本中，刺激其分泌细胞因子，从而进行检测。

根据本发明，所述检测体系还包括检测样本的常规试剂，所述常规试剂指的是检测细胞因子采用的常规检测试剂，如检测细胞因子IFN-γ可采用IFN-γ检测试剂盒进行检测，如检测IL-2可采用IL-2检测试剂盒进行检测，其检测试剂盒是市面上可买到的试剂盒即可。

第二方面，本发明提供一种采用如第一方面所述的检测体系的检测方法，包括如下步骤：

(1)采集血液样本到肝素抗凝采血管中，混匀，分装成0.3-0.8mL；

(2)向步骤(1)的样本中加入相应的刺激抗原，培养；

(3)检测上清中所述细胞因子的含量。

根据本发明，所述培养的温度为30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为35-38℃，进一步优选为37℃。

根据本发明，所述培养的时间为10-35h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h或35h，优选为18-24h。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的检测体系用于检测记忆性免疫细胞的功能。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的检测体系在制备疾病检测和/或诊断的试剂盒中的应用。

本发明中，所述疾病为结核病等疾病，只要能够通过检测记忆性免疫细胞的分泌物质，特别是细胞因子进行检测的疾病都是可行的，在此不作特殊限定。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所提供的检测体系在刺激抗原终浓度一致的情况下，能够明显提高检测细胞因子的灵敏度，但样本缩小到0.3-0.8mL的时候，相比于常规的1-5mL的样本体积，其细胞因子的分泌量明显增高，且检测灵敏度提高了1倍以上，显著提高了检测的灵敏度，减少漏检的可能；

(2)本发明提供的检测体系使用方法简便，快速高效；

(3)本发明所提供的检测体系的应用范围广泛，具有巨大的市场价值。

附图说明

图1为本发明检测体系检测INF-γ的检测结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原，TB表示病人编号；

图2为本发明检测体系检测INF-γ的检测结果图，其中，P代表植物凝聚素，TB表示病人编号；

图3为本发明检测体系对健康人血样检测的影响结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原，P代表植物凝聚素，N代表空白对照，WT代表对照的结核杆菌特异性刺激抗原；

图4为含氧量对本发明检测体系的影响结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原，WT代表对照的结核杆菌特异性刺激抗原；

图5为本发明检测体系检测病人样本的IL-2灵敏度的结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原；

图6为本发明检测体系检测健康人样本的IL-2灵敏度的结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原；

图7为本发明检测体系检测病人样本的IL-6灵敏度的结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原；

图8为本发明检测体系检测健康人样本的IL-6灵敏度的结果图，其中，LD表示结核杆菌特异性刺激抗原；

图9为本发明检测体系检测INF-γ的检测结果图，其中，PP65代表巨细胞病毒抗原(CMV-PP65)，TB表示病人编号。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的附图和实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

IFN-γ检测试剂盒(ELISA)：广州市雷德生物科技有限公司；

IGRA试剂盒(ELISA)：万泰生物药业股份有限公司；

IL-2检测试剂盒(ELISA)：广州市雷德生物科技有限公司；

IL-6检测试剂盒(ELISA)：广州市雷德生物科技有限公司；

原料：

特异性结核杆菌刺激抗原(LD，广州市雷德生物科技有限公司)：

阳性刺激物植物凝聚素(P，Sigma的PHA)：

特异性结核杆菌刺激抗原(WT，万泰生物药业股份有限公司)：

前期准备：招募18-45岁的病人志愿者和健康人志愿者，分别采集血液样本。

实施例1：不同体积检测样本对IFN-γ的检测的影响

将采集的病人的血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加0.3，0.6，1.0mL血样至3个阳性管(P)，6个检测管(T)分别加入0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0mL血样，6个阴性管(N)分别加入0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0mL血样，不同体积的血液控制加入刺激抗原(LD)，阳性刺激物(P)的终浓度一致；

(2)将步骤(1)混合物置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(3)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用γ-干扰素ELISA检测试剂盒进行IFN-γ检测。

6个检测管(T)的检测结果如图1所示，3个阳性管(P)的结果如图2所示，从图1可见，在0.3-1mL范围内，阴性对照管无非特异性刺激，随着血液样本的体积的增加，检测灵敏度呈现先升高后下降的趋势。从图2可以看出，三个体积0.3mL、0.6mL和1.0mL进一步比较，0.6mL的体积样本的灵敏度最高，可见，在0.3mL-0.6mL范围内，刺激血液体积越小，刺激抗原与阳性刺激物刺激记忆T细胞反应强度越强，表现为IFN-γ分泌量大幅增加。

实施例2：0.6mL与1.0mL体积检测样本对IFN-γ的检测的影响

将采集的32例病人的血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加0.6，1.0mL血样至2个检测管(T)，控制加入刺激抗原(LD)，使得其终浓度一致；

(2)将步骤(1)混合物置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(3)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用γ-干扰素ELISA检测试剂盒进行IFN-γ检测。

检测结果如表1。

表1

从表1可以看出，同样的刺激抗原浓度，采用0.6mL的样本血液量与1.0mL组相比，明显提高了抗原刺激T细胞的反应程度，0.6mL组分泌细胞因子IFN-γ的含量明显高于1.0mL组，分泌量0.6mL组/分泌量1.0mL组≥2的百分比达81.25％。

对比例1：健康人IFN-γ的检测

将采集的健康人的血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加1.0血样至阴性管(N)，阳性管(P)，2个检测管(T)分别加入0.6mL，1.0mL血样，同时以IGRA试剂盒检测抗原(WT)为对照组；

(2)将步骤(1)混合物置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(3)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用γ-干扰素ELISA检测试剂盒进行IFN-γ检测。

检测结果如图3所示，可见，健康人中0.6mL血样组的IFN-γ分泌量与阴性对照组，WT对照组无明显差异，表明该方法对健康人血样无非特异性刺激。

对比例2含氧量对IFN-γ的检测的影响

将采集的健康人的血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加1.0mL血样至阴性管(N)，阳性管(P)，对照管(WT)，2个检测管(T)分别加入0.6mL，1.0mL血样，拧紧孵育管盖子，同时以IGRA试剂盒检测抗原(WT)为对照组；

(2)按步骤(1)设置领另一组实验，全部拧松孵育管盖，保持氧气含量充足；

(3)将两组实验置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(4)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用γ干扰素-ELISA检测试剂盒进行IFN-γ检测。

检测结果如图4所示，可见，0.6mL血液量提高刺激抗原的刺激程度跟孵育管含氧量无关。

实施例3：不同体积检测样本对IL-2检测的影响

将采集的病人，健康人的血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加0.6，1.0mL病人，健康人的血样至2个检测管(T)，控制加入刺激抗原(LD)，使得其终浓度一致；

(2)将步骤(1)混合物置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(3)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用IL-2ELISA检测试剂盒进行IL-2检测。

检测结果如图5-图6所示，可见，刺激抗原浓度一致条件下，0.6mL组与1.0mL组相比，提高刺激抗原刺激记忆T细胞的反应程度，在病人样本中，0.6mL组分泌细胞因子IL-2的含量明显高于1.0mL组的分泌量。健康病人样本中，IL-2检测为0pg/mL。

实施例4：不同体积检测样本对IL-6检测的影响

将采集的病人，健康人的血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加0.6，1.0mL病人，健康人的血样至2个检测管(T)，控制加入刺激抗原(LD)，使得其终浓度一致；；

(2)将步骤(1)混合物置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(3)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用IL-6ELISA检测试剂盒进行IL-6检测。

检测结果如图7-图8所示，可见，刺激抗原浓度一致条件下，0.6mL组与1.0mL组相比，提高刺激抗原刺激记忆T细胞的反应程度，在病人样本中，0.6mL组分泌细胞因子IL-6的含量明显高于1.0mL组的分泌量；健康病人样本中，0.6mL组分泌细胞因子IL-6的含量同样明显高于1.0mL组的分泌量。

实施例5：巨细胞病毒抗原(CMV-PP65)刺激实验中，0.6mL与1.0mL体积检测样本对IFN-γ的检测的影响

将采集的病人血样，在4小时内进行以下实验步骤：

(1)上下颠倒5次混匀新鲜人静脉血，依次混匀加0.6，1.0mL血样至2个检测管(T)，控制加入巨细胞病毒抗原(CMV-PP65)，使得其终浓度一致；

(2)将步骤(1)混合物置于37℃培养箱中，培养20±2h；

(3)吸出血浆，置于1.5mL EP管中，采用γ-干扰素ELISA检测试剂盒进行IFN-γ检测。

检测结果如图9所示，从图9可以看出，同样的巨细胞病毒抗原(CMV-PP65)刺激浓度，采用0.6mL的样本血液量与1.0mL组相比，明显提高了抗原特异性记忆T细胞的反应程度，显示0.6mL组分泌细胞因子IFN-γ的含量明显高于1.0mL组。

综上所述，本发明所提供的检测体系在刺激抗原终浓度一致的情况下，能够明显提高检测细胞因子的灵敏度，但样本缩小到0.3-0.8mL的时候，相比于常规的1-5mL的样本体积，其细胞因子的分泌量明显增高，且检测灵敏度提高了1倍以上，显著提高了检测的灵敏度，减少漏检的可能；本发明检测体系应用范围广泛，具有巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种记忆性免疫细胞的检测体系，其特征在于，所述检测体系中的样本量为0.6mL；

所述检测体系还包括阴性对照，刺激抗原和/或阳性对照抗原；

所述刺激抗原为刺激记忆性T细胞的特异性抗原，所述刺激记忆性T细胞的特异性抗原为结核杆菌特异性抗原；

所述阳性对照抗原为刺激免疫细胞的非特异性刺激剂，所述刺激免疫细胞的非特异性刺激剂为刀豆素A、植物血凝素、人美洲商陆素、花生凝集素、大豆凝集素、葡萄球菌A蛋白的菌体、脂多糖或肿瘤刺激剂中的任意一种或至少两种的组合；

所述样本为肝素抗凝的血液；所述检测体系还包括检测样本的常规试剂；

所述检测体系的靶标为细胞因子，所述细胞因子为IFN-γ、IL-2或IL-6中的任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述刺激免疫细胞的非特异性刺激剂为植物血凝素。

3.一种采用如权利要求1-2中任一项所述的检测体系的非诊断目的的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集样本，分装成0.6mL；

(2)向步骤(1)的样本中加入相应的刺激抗原，培养；

(3)检测上清中如权利要求1所述的细胞因子的含量；

所述培养的温度为35-38℃；

所述培养的时间为18-24h。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述培养的温度为37℃。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的检测体系用于非诊断目的地检测记忆性免疫细胞的功能。

6.根据权利要求1-2中任一项所述的检测体系在制备疾病检测和/或诊断的试剂盒中的应用。

Images