CN105153280A - 苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，包括所述多肽在检测苯噻菌酯中的应用。本发明采用噬菌体展示技术，用苯噻菌酯免疫复合体对噬菌体展示随机环八肽库进行3轮淘选，淘选出与苯噻菌酯免疫复合体结合的噬菌体克隆；随机挑取若干噬菌体克隆进行扩增和质粒提取，通过非竞争噬菌体ELISA方法选择阳性噬菌体克隆，并将阳性克隆进行测序获得多肽序列。本发明还涉及该噬菌体展示多肽在苯噻菌酯检测中的应用。用该噬菌体展示多肽建立的非竞争噬菌体酶联免疫分析方法可用于快速、灵敏、简便和廉价检测环境和农产品中苯噻菌酯残留。

Description

苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，包括所述多肽在检测苯噻菌酯中的应用。

背景技术

苯噻菌酯(benzothiostrobin)是由华中师范大学研发的一种新型Strobilurins类杀菌剂。苯噻菌酯具有杀菌谱广，杀菌活性高，施用量低，持效期长等优点，具有保护及治疗作用，对作物白粉病、霜霉病均表现出优越的防效，具有良好的市场开发前景。为预防苯噻菌酯应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。

目前，对苯噻菌酯的残留检测包括仪器分析方法和免疫分析法。免疫检测方法具有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，在大量样品快速筛选和现场监测中显示出独特优势。免疫分析通常分为竞争模式和非竞争模式。由于农药等小分子化学品(包括苯噻菌酯)为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。非竞争分析模式一般需要抗原含有两个或两个以上不重叠抗原决定簇，但是绝大多数农药与抗体结合之后都会被抗体的结合位点包裹起来，不能直接被第二种抗体所识别，因此无法建立非竞争分析模式。但是，也有研究者们利用一些新颖的技术或手段建立了小分子化合物的非竞争免疫分析，并且显示非竞争性免疫分析具有更好的敏感性和特异性。所采用的方法有制备抗免疫复合体抗体、开放夹心分析法(OpenSandwichAssay)和筛选抗免疫复合体噬菌体展示多肽。

自从噬菌体展示技术第一次报道至今，已经作为一种强大的工具运用在不同的研究中，包括筛选抗体和酶的配体；筛选小分子的受体；抗体工程等。其原理是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。利用免疫复合体(抗体抗原结合物)对噬菌体展示随机多肽库进行生物淘选，可筛选出能够与免疫复合体特异性结合的噬菌体展示多肽，可用于建立非竞争免疫分析方法。一些研究结果表明，非竞争检测模式由于形成了抗原、抗体和多肽的三元复合机构，能够显著提高检测方法的敏感性和特异性。虽然非竞争分析模式具有优势，但是该技术还处于研发初期阶段，在建立该分析方法中存在的最大挑战是抗免疫复合体多肽的筛选。目前为止，尚未见具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽及其应用的研究和报道。

发明内容

本发明的目的是提供与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，及相关多肽在苯噻菌酯检测中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

(1)将蛋白A柱纯化的苯噻菌酯抗体包被在酶标板上，用3％BSA封闭酶标板，将苯噻菌酯加入形成苯噻菌酯免疫复合体；随后，将噬菌体展示随机环八肽库加入酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，一般经过3轮的淘选，每轮淘选降低包被抗体和苯噻菌酯的浓度；

(2)3轮淘选后，挑选48个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，39个阳性克隆进行扩增、质粒提取、测序，共发现3种序列，其序列如SEQIDNO1～3所示序列：CysProAsnIleTrpProGluSerTrpCys，CysLeuHisSerLysHisThrTyrGluCys，CysProAspIleTrpProThrAlaTrpCys；所述多肽由10个氨基酸组成，包含一个环状肽区域；该环肽区域由多肽两端的半胱氨酸残基形成的二硫键而被环化。

本发明所述的多肽可与苯噻菌酯免疫复合体组合，建立非竞争ELISA，用于苯噻菌酯在环境与农产品中的残留检测。

本发明具有以下有益效果：(1)新颖：与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽为国内外首次报道；(2)实用：利用本发明提供的噬菌体展示多肽可以快速建立高敏感性的非竞争ELISA；(3)特异性强：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的非竞争ELISA与苯噻菌酯类似物的交叉反应均小于0.03％；(4)准确度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的非竞争ELISA在农产品中的添加回收率为70.4-125.0％，变异系数低于11.5％，符合残留分析标准；(5)灵敏度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的非竞争ELISA的饱和信号中浓度(SC₅₀)为2.27ng/mL，检测限(SC₁₀，LOD)为1.11ng/mL。

附图说明

图1是挑选的48个噬菌体克隆P-ELISA检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD₄₅₀值；

图2是非竞争P-ELISA检测苯噻菌酯，OD值与苯噻菌酯浓度的曲线；横坐标为苯噻菌酯的浓度，单位为ng/mL；纵坐标为OD₄₅₀值。

具体实施方式

本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：

主要实验材料：

蛋白A柱纯化苯噻菌酯单克隆抗体由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与环境毒理实验室制备；噬菌体展示随机环八肽库由美国加州大学-戴维斯分校，Hammock实验室提供。

主要试剂：

蛋白胨(OXOID)、酵母提取物(OXOID)、琼脂(Amresco)、琼脂糖(Amresco)、四甲基联苯胺(Sigma)、IPTG(Amresco)、Xgal(Amresco)、PEG8000(Sigma)、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(GE)

主要试剂配方：

1、LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl。高压灭菌，室温贮存；

2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mLIPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；

3、顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，7g琼脂粉，高压灭菌，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；

4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；

5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；

6、封闭液：含有3％BSA，0.15M，pH7.4PBS，过滤除菌，4℃保存；

7、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5MNaCl，高压灭菌，室温贮存；

8、IPTG/Xgal配方：将1.25gIPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside)和1gXgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；

9、显色液(四甲基联苯胺-H₂O₂底物溶液)：25mL0.1M，pH5.5柠檬酸盐缓冲液中加入0.4mL，6mg/mL四甲基联苯胺，0.1mL1％H₂O₂。

实施例1苯噻菌酯免疫复合体特异性结合多肽的淘选和制备

1、与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的噬菌体克隆的淘选

按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的淘选，具体操作如下：

(1)取100μL10μg/mL蛋白A柱纯化的苯噻菌酯抗体加入酶标板中，4℃包被过夜，共三个孔；

(2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37℃过夜培养；

(3)将步骤(1)的酶标板用PBST洗涤5遍，加入300μL3％BSA，37℃孵育1小时，用PBST洗涤5遍，存放于4℃备用；

(4)取10μg/mL的苯噻菌酯加入步骤(3)的酶标板中，室温轻微震荡1小时，用PBST洗涤5遍；

(5)将酶标板每孔加入2×10¹¹的噬菌体(100μL)，室温轻微震荡1小时；

(6)取20mLLB培养基加入250mL三角瓶中，加入ER2738单菌落，37℃培养至OD₆₀₀为0.01至0.05；

(7)将步骤(5)的微孔用PBST洗涤10遍，加入100μL0.2M，pH2.2甘氨酸盐酸缓冲液，室温轻微震荡15分钟；

(8)收集步骤(7)中的洗脱缓冲液，并用1M，pH9.1的Tris-HCl中和，4℃保存；

(9)取少量中性洗脱液测定噬菌体的滴度(操作方法见滴度测定)；

(10)剩余的洗脱缓冲液用于扩增，将剩余的洗脱缓冲液加入步骤(6)中的三角瓶中，37℃摇床培养4至4.5小时；

(11)将扩增的噬菌体移入50mL的离心管中，4℃12000g离心10分钟，取上清。重复离心一次；

(12)取上层80％的上清放入离心管中，加入上清1/6体积的20％PEG-8000/2.5MNaCl，混匀，4℃静置过夜；

(13)将(12)步骤的混合液4℃12000g离心15分钟，去上清，重复一次；

(14)取400μLPBS溶解步骤(13)的沉淀物用于下一轮的淘选，也可放于4℃短期(大约三周不会影响滴度)保存，或者加入甘油，放于-20℃长期保存；

(15)步骤(1)到(14)为一轮淘选和扩增，第二轮和第三轮的淘选和扩增步骤同上；第二轮，步骤(1)中使用的苯噻菌酯抗体浓度和步骤(4)中苯噻菌酯浓度分别为5μg/mL和1μg/mL；第三轮，步骤(1)中使用的苯噻菌酯抗体浓度和步骤(4)中苯噻菌酯浓度分别为2.5μg/mL和0.1μg/mL。

噬菌体滴度测定操作步骤如下：

(1)取4mLLB培养基，加入20μL50mg/mL的四环素，取大肠杆菌ER2738单菌落加入其中，37℃培养至OD₆₀₀为0.5；

(2)将LB/IPTG/Xgal平板放入37℃培养箱中预热1小时以上；

(3)取5mL融化的顶层琼脂(LB+7g/L琼脂糖)放入离心管中，并保持离心管在45℃；

(4)将需要测滴度的噬菌体进行稀释，通常洗脱缓冲液稀释10至10³倍，扩增之后的噬菌体稀释10⁸至10¹¹；

(5)取10μL稀释后的噬菌体加入到180μL步骤(1)的大肠杆菌培养液中，混匀；

(6)将步骤(5)的混合液加入步骤(3)中的顶层琼脂中，混匀；

(7)将步骤(6)的混合液均匀的加入到步骤(2)中的平板上，室温冷却，放入37℃培养箱中过夜培养；

(8)根据平板上蓝色斑点的数量来计算所测噬菌体的滴度。

整个淘选过程的洗脱噬菌体和扩增后的噬菌体的个数如表1所示。

表1与苯噻菌酯免疫复合体结合的噬菌体展示多肽淘选情况

2、噬菌体克隆的筛选及其展示多肽序列的测定

在完成最后一次淘选之后，对洗脱液进行滴度测定，选择蓝色斑点少于100个的LB/IPTG/Xgal平板，从中挑选出48个克隆用于扩增和鉴定。操作程序如下：

(1)用LB培养液将过夜培养的大肠杆菌ER2738以1∶100稀释，并以5mL每试管分散在48个试管中；

(2)从LB/IPTG/Xgal平板挑选出48个克隆放入试管中，37℃摇床培养4.5至5小时；

(3)将培养液4℃12000g离心10分钟，上清用于噬菌体酶联免疫分析(P-ELISA)验证(操作方法见P-ELISA)，沉淀用质粒提取试剂盒提取质粒，送测序公司进行序列测定。

噬菌体酶联免疫分析操作步骤：

(1)包被：用PBS缓冲液将苯噻菌酯抗体稀释后加入酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜；

(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；

(3)封闭：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小时；

(4)洗板：同(2)；

(5)加入分析物和噬菌体：每孔加入50μLPBS或50μL0.2μg/mL苯噻菌酯溶液，再加入50μL的噬菌体展示多肽，室温轻微震荡1小时，PBST洗涤5次，并平行设置阴性对照。

(6)洗板：同(2)；

(7)加入酶标二抗体：每孔加入100μL经1∶5000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；

(8)洗板：同(2)；

(9)显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育15分钟；

(10)终止：每孔加50μL2mol/L的H₂SO₄溶液；

(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。

挑选的48个噬菌体克隆中39个克隆在P-ELISA检测时有或无苯噻菌酯的OD₄₅₀值存在显著差异(图1)。将上述39个克隆的质粒送金斯瑞生物科技有限公司测序，测序引物为5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。测序结果共发现3种序列，其序列如表2中SEQIDNO1～3所示；所述多肽由10个氨基酸组成，包含一个环状肽区域；该环肽区域由多肽两端的半胱氨酸残基形成的二硫键而被环化。

表2噬菌体展示多肽的氨基酸序列

3、非竞争P-ELISA对苯噻菌酯的检测

3.1方法原理

采用非竞争免疫分析方法。将苯噻菌酯抗体吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗体，然后加入待测样品和噬菌体展示多肽。待测样品中的苯噻菌酯与固相抗体结合形成免疫复合体，噬菌体展示多肽与免疫复合体反应形成三元复合物，待测农药含量多，形成的抗体、苯噻菌酯和噬菌体展示多肽三元复合物越多(即噬菌体越多)，反之形成的三元复合物越少，反应后加入辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(只能与结合在固相抗体上的噬菌体结合)，最后用底物进行显色加以测定。被结合在固相抗体上的噬菌体多，显色强，OD₄₅₀值高，反之，则显色弱，OD₄₅₀值低，因而可根据已知量农药的标准曲线和待检样品的OD₄₅₀值，推算出待测农药的浓度。

3.2抗体和噬菌体展示多肽的工作浓度

非竞争P-ELISA抗体和噬菌体展示多肽工作浓度由信噪比(S/N)确定，选择S/N值最大的抗体和噬菌体展示多肽的浓度组合。经实验，抗体10μg/mL、SEQIDNO3噬菌体6.25×10⁸pfu/mL为最适工作浓度。

3.3P-ELISA程序

(1)包被：用PBS缓冲液将苯噻菌酯抗体稀释至10μg/mL加入酶标板，每孔100μl，4℃孵育过夜；

(2)洗板：用洗涤液PBST(0.05％吐温20，0.01mol/L，pH7.4)洗涤5次，吸水纸拍干；

(3)封闭：每孔加入300μL1％BSA，37℃孵育1小时；

(4)洗板：同(2)；

(5)加入分析物和噬菌体：每孔加入50μL待测样品，再加入50μL，6.25×10⁸pfu/mL的噬菌体展示多肽，室温轻微震荡1小时，PBST洗涤5次，并平行设置阳性对照和阴性对照。

(6)洗板：同(2)；

(7)加入酶标二抗体：每孔加入100μL经1∶5000倍PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体，室温轻微震荡1小时；

(8)洗板：同(2)；

(9)显色：每孔加入100μL新鲜配制的显色液，37℃温箱孵育15分钟；

(10)终止：每孔加50μL2mol/L的H₂SO₄溶液；

(11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值。

3.4标准曲线和灵敏度

根据OD₄₅₀值与苯噻菌酯浓度作图即得到标准曲线(图2)，计算饱和信号中浓度(SC₅₀)及最低检测限(SC₁₀，LOD)分别为0.94ng/mL，LOD为0.22ng/mL。

3.5特异性

常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应率越小，检测方法的特异性越好。非竞争P-ELISA除与其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂没有交叉反应(CR％＜0.03％)。从而可知，所制备的噬菌体展示多肽，可以用于特异性的检测苯噻菌酯。

3.6样品添加检测

3.6.1样品处理

称取粉碎后的黄瓜、番茄、梨、大米样品10g，装入50mL离心管中，加入10mL含50％甲醇的PBS缓冲液混匀，涡旋1min，4000rpm离心5min，将上清全部转移至25mL容量瓶内，再重复提取一次，最后用PBS缓冲液定容至25mL。再用PBS缓冲液稀释8用于检测。

3.6.2样品检测

样品检测步骤参考3.3。经分析可知，该非竞争P-ELISA的苯噻菌酯回收率为70.4-125.0％，相对标准偏差为1.8-11.5％。

实际样品中苯噻菌酯残留量检测参照3.6方法进行。

本发明建立的苯噻菌酯非竞争P-ELISA方法符合苯噻菌酯残留分析标准。该方法可用于环境和农产品中苯噻菌酯的残留检测，且前处理方法较仪器分析方法简单，适合大批量检测和现场监测。

Claims (4)

1.具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQIDNO：1～3的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，其特征在于，两端的半胱氨酸残基之间形成二硫键而被环化。

3.根据权利要求1和2所述具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽，其特征在于，通过GGGS连接在M13噬菌体外壳蛋白上。

4.权利要求1具有与苯噻菌酯免疫复合体特异性结合的多肽在检测苯噻菌酯中的应用。