CN108562741A - 一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法，首先将分析物与重组示踪物共同竞争硝酸纤维素膜上的捕获抗体的结合位点，然后洗膜，并加入反应底物产生荧光信号，配合手机检测配件，使用智能手机对检测结果进行拍照，最后对手机拍照的图像进行分析及结果判定。本发明提供的方法利用噬菌体展示多肽模拟表位与可催化发光酶的重组蛋白为示踪物，配合智能手机，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的检测。本发明灵敏度高、快速、简便、经济、实用性强，可以实现现场定量检测。

Description

一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法，利用噬菌体展示多肽模拟表位与可催化发光酶的重组蛋白为示踪物，配合智能手机，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的在线、定量检测。

背景技术

氯噻啉是我国自主研发的新烟碱类杀虫剂，广泛用于防治小麦、水稻、果树和蔬菜等作物上的害虫。然而，过量的使用使其广泛分布于水体和农产品中，对非靶标生物如蜜蜂等造成了潜在的威胁。因此，建立简单、快速、灵敏的检测方法监测环境和农产品中氯噻啉残留是保障环境和农产品安全的重要抓手。

噬菌体展示随机多肽库已广泛应用于免疫检测，病原细菌检测，细胞成像等领域。在小分子免疫分析中，噬菌体展示随机肽的主要有两个用途：1)筛选模拟表位代替化学半抗原或分析物，开发竞争型免疫分析；2)筛选抗免疫复合体，其能与抗原-抗体的复合物结合，开发非竞争型免疫分析。噬菌体展示随机多肽容易获得且在分析中具有较高的敏感性。然而，由于噬菌体颗粒的尺寸较大(880×6-7nm)，流动性较差，限制了噬菌体展示肽的应用。使得噬菌粒展示多肽技术不适合用于开发快速检测。另一方面，噬菌体不是一种常规的生产试剂，作为商业试剂使用可能存在不同批次间的差异，长期储存的稳定性和其生物安全性也进一步限制了其应用。为了克服这些缺陷，通过化学方式合成噬菌体展示的多肽，并与载体蛋白，纳米颗粒或者链霉亲和素偶联，已经被用于开发无噬菌体的小分子免疫分析，但化学合成代价较高，合成后仍需标记。并不适合大量生产。将多肽与蛋白质融合表达制备重组蛋白，则可通过细菌发酵来实现大量的生产，大大降低成本。而且，如果与多肽融合的蛋白是具有活性的酶，那么这种重组蛋白则又可以直接作为示踪物，避免了标记步骤。

随着智能手机摄像功能和数据处理功能的快速发展，使得其可作为一种便携式检测设备。而基于发光信号的检测，不需要外界光源的存在，是一种非常适合应用于便携式检测的信号。将智能手机检测和多肽模拟表位重组示踪物相结合，开发一种基于多肽模拟表位重组示踪物和智能手机读取信号的发光侧流免疫层析方法。该发明为食品安全检测、农产品等的出入境检测、环境监测部门的监测提供有效的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。目前，国内外尚未见有基于模拟表位多肽与可催化发光的酶重组表达示踪物的生物发光侧流免疫层析方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新颖、快速、灵敏和经济的发光侧流免疫层析系统，利用多肽模拟表位重组示踪物(在本说明书中使用纳米荧光素酶(NanoLuc)与氯噻啉多肽模拟表位C2-15融合表达)，结合智能手机检测，以实现对小分子的定量、在线检测。

本发明提供的一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法，包括：

1.一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法，其特征包括：

第一步：重组示踪物与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，

硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS稀释的分析物抗体(3.6mg/mL)和抗His-tag抗体(1.5mg/mL) 分别作为检测(test，T)线和控制(control，C)线，喷在NC膜上，两条线的间距为5mm，将NC膜在 37℃下干燥1小时，然后与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成5mm宽，并装入暗盒中，在室温下储存备用；加样：将50μL的样品与50μL的重组示踪物：SEQ ID No.1所示序列 (含有5μg蛋白质，0.2％吐温20和2mg/mL BSA)混合，并将混合物加入到上样孔并流过膜15分钟；

第二步：检测NC膜上的抗体捕获的重组示踪物

洗膜：加入100μL PBS洗膜10分钟；加入底物：从光学窗口向NC膜中加入发光底物产生发光信号；生物发光信号检测：将暗盒插入到手机检测配件中，并安装在智能手机上，开启相机，适当时间后手机拍照记录图像；

第三步：检测结果的分析及结果判定，

方法1：将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均光密度值，以校正后的光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量；

方法2：用肉眼观察手机拍摄的图像，相对阴性对照的结果，若T线区域蓝色荧光强度未减弱为阴性，若T线区域蓝色荧光强度明显减弱为弱阳性，若无蓝色荧光条带则为阳性。

本发明技术方案实现的有益效果：

1.经济实用：重组示踪物可通过细菌发酵大量产生，且无需额外标记步骤，大大降低了检测成本；

2.便携检测：反应结果的检测无需其他仪器和条件，只需一个暗盒和智能手机即可实现定量检测；

3.灵敏度高：应用于氯噻啉的检测，本方法的检测限为0.3ng/mL，比基于相同抗体的传统酶联免疫吸附分析法提高了59倍。

4.新颖度高：目前国内外尚未见有关将噬菌体展示多肽与可催化发光的酶进行融合表达应用于小分子检测上的报道。

附图说明

图1为本发明技术方案的原理示意图；

图中“1”表示上样孔；“2”表示光学窗口；“3”表示液体蒸发口；“4”表示试纸条；“5”表示手机检测配件；“6”表示透镜孔；“7”表示检测配件与手机的组装；“8”表示样品垫；“9”表示结合垫；“10”表示T线；“11”表示C线；“12”表示重组示踪物；“13”表示发光底物；

图2为本发明使用智能手机所拍摄的对不同浓度氯噻啉标准品溶液的检测图像；

图3为本发明对氯噻啉标准品检测的标准曲线；

图4为本发明使用智能手机所拍摄的氯噻啉添加样品的检测图像。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

使用载体pNL1.1(含纳米荧光素酶基因，购买自Promega公司)作为模板，通过PCR产生重组基因片段。用EcoRI和Xho I酶切，凝胶纯化后，将重组基因片段克隆到pET-22b(+)载体(购买自Novagen公司)中。连接后的载体转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中。随机选择10个阳性克隆验证序列。将含有正确序列的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。挑取转化后的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中于37℃、250rpm培养直至OD₆₀₀值达到0.6。然后加入0.1mM IPTG (终浓度)，并在20℃，250rpm培养过夜。通过“渗透性休克法”提取位于周质的重组蛋白，使用5mL HisTrap HP柱在avant 25上纯化获得重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

用PBS稀释的氯噻啉抗体(3.6mg/mL)和抗His-tag抗体(1.5mg/mL)分别作为T线和C线，喷在 NC膜上，两条线的间距为5mm。将NC膜在37℃下干燥1小时，然后与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装。将组装好的膜切成5mm宽，并装入暗盒中，在室温下储存备用。将50μL的检测样品与50μL 的重组示踪物(含有5μg蛋白质，0.2％吐温20和2mg/mL BSA)混合，并将混合物加入到上样孔并流过膜15分钟。然后，加入100μL PBS洗膜10分钟。通过可视窗口向NC膜上直接加25μL含有2μL纳米荧光素酶分析底物的分析缓冲液(购买自Promega公司)，以产生发光信号。将暗盒插入到手机检测配件中，并安装在智能手机上，开启相机，20秒后手机拍照记录图像。将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量 T线和相邻T线区域的平均光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均光密度值，以校正后的光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量。本实施例的同步反应方法中所涉及的各个过程和材料如图1 所示。

实施例1：发光侧流免疫层析检测法对氯噻啉农药标准品的检测

1.氯噻啉农药标准溶液的配制

用甲醇配制氯噻啉标准品母液(1mg/mL)，用含有5％甲醇的PBS将母液稀释成750ng/mL至0.01 ng/mL系列浓度用于侧流免疫层析检测。

2.重组示踪物与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点

将50μL的标准品溶液与50μL的重组示踪物(含有5μg蛋白质，0.2％吐温20和2mg/mL BSA)混合，并将混合物加入到上样孔并流过膜15分钟。

3.生物发光信号的检测

加入100μL PBS洗膜10分钟。通过可视窗口向NC膜上直接加25μL含有2μL纳米荧光素酶分析底物的分析缓冲液，以产生发光信号。将暗盒插入到手机检测配件中，并安装在智能手机上，开启相机，20 秒后手机拍照记录图像，如图2所示。

4.检测结果的分析及结果判定

方法1：将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均光密度值，以校正后的光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，如图3所示。根据标准曲线计算，最低检测限(LOD)为0.3ng/mL，抑制中浓度 (IC₅₀)为6.4ng/mL。

方法2：用肉眼观察手机拍摄的图像，相对阴性对照的结果(0ng/mL)，0.01ng/mL至1.2ng/mL检测结果显示T线区域蓝色荧光强度未减弱，为阴性，6ng/mL和30ng/mL的检测结果显示T线区域蓝色荧光强度明显减弱，为弱阳性，浓度高于150ng/mL时，无蓝色荧光条带，为阳性。

本发明提供的发光侧流免疫层析方法，特异性通过交叉反应率(CR)进行评价，其计算公式为CR＝IC₅₀ (氯噻啉)/IC₅₀(其他化合物)×100，7种氯噻啉农药类似物的交叉反应率如表1所示。

表1 发光侧流免疫层析方法对氯噻啉类似物的交叉反应率

实施例2：发光侧流免疫层析检测法对添加样品进行检测

1.添加样品的制备及处理

将氯噻啉标准品分别添加到土壤、橘子和糙米样品进行添加回收试验。称取粉碎混匀后的土壤、橘子和糙米样品10g，添加标准品至20、100和500ng/g的终浓度，混匀，暗处室温静置过夜，加入20mL含 25％甲醇的PBS缓冲液混匀，涡旋5min，超声15min，4000rpm离心5min，将上清全部转移至25mL 容量瓶内，用PBS缓冲液定容至25mL。再用PBS缓冲液稀释4倍，在用含5％甲醇的PBS缓冲液稀释4 倍用于检测。

2.重组示踪物与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点

将50μL的样品溶液与50μL的重组示踪物(含有5μg蛋白质，0.2％吐温20和2mg/mLBSA)混合，并将混合物加入到上样孔并流过膜15分钟。

3.生物发光信号的检测

加入100μL PBS洗膜10分钟。通过可视窗口向NC膜上直接加25μL含有2μL纳米荧光素酶分析底物的分析缓冲液，以产生发光信号。将暗盒插入到手机检测配件中，并安装在智能手机上，开启相机，20 秒后手机拍照记录图像，如图4所示。

4.检测结果的分析及结果判定

方法1：将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均光密度值，将其带入标准曲线方程，计算获得样品溶液中氯噻啉的含量，并用样品前处理过程中的稀释倍数进行校正，获得样品中氯噻啉的残留量，结果见表2。

方法2：用肉眼观察手机拍摄的图像，相对阴性对照的结果，20ng/g样品检测结果显示T线区域蓝色荧光强度未减弱，为阴性，100ng/g和500ng/g的检测结果显示T线区域蓝色荧光强度明显减弱，为弱阳性。

本发明提供的发光侧流免疫层析方法，对添加样品的检测准确，结果如表2所示。

表2 发光侧流免疫层析方法对添加样品进行检测的结果

Claims (1)

1.一种氯噻啉生物发光侧流免疫层析方法，其特征包括：

第一步：重组示踪物与分析物共同竞争捕获抗体的结合位点，

硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS稀释的分析物抗体(3.6mg/mL)和抗His-tag抗体(1.5mg/mL)分别作为检测(test，T)线和控制(control，C)线，喷在NC膜上，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时，然后与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成5mm宽，并装入暗盒中，在室温下储存备用；加样：将50μL的样品与50μL的重组示踪物：SEQ ID No.1所示序列(含有5μg蛋白质，0.2％吐温20和2mg/mL BSA)混合，并将混合物加入到上样孔并流过膜15分钟；

第二步：检测NC膜上的抗体捕获的重组示踪物，

洗膜：加入100μL PBS洗膜10分钟；加入底物：从光学窗口向NC膜中加入发光底物产生发光信号；生物发光信号检测：将暗盒插入到手机检测配件中，并安装在智能手机上，开启相机，适当时间后手机拍照记录图像；

第三步：检测结果的分析及结果判定，

方法1：将图片导入imageJ 1.46r软件中，测量T线和相邻T线区域的平均光密度(背景信号)，而后扣除背景信号得到校正后的T线平均光密度值，以校正后的光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量；

方法2：用肉眼观察手机拍摄的图像，相对阴性对照的结果，若T线区域蓝色荧光强度未减弱为阴性，若T线区域蓝色荧光强度明显减弱为弱阳性，若无蓝色荧光条带则为阳性。