CN101955541B - 一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体。该种单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N端起第15-132位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列1自N端起第148-266位氨基酸残基所示。本发明抗体的亲和常数为8.06×10⁹L/mol、半数抑制量(IC₅₀)为0.076ng/mL。本发明为食品中克伦特罗残留检测方法的建立提供高效价、高特异性的抗体来源。本发明试剂盒的灵敏度高、准确度高、精密度高、对克伦特罗和沙丁胺醇的特异性好。另外，本发明试剂盒成本低廉。因此，本发明的抗体及试剂盒及检测方法在克伦特罗和沙丁胺醇的检测中将发挥重大作用。

Description

一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体

技术领域

本发明涉及一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体。

背景技术

克伦特罗(Clenbuterol，CLE)，俗称瘦肉精，是一种β兴奋剂。因其能改善脂肪型动物的肉与脂肪的比例，并能加速动物生长，而被广泛添加于动物饲料中，并且可以残留在动物体内。然而这种药物对人有严重的副作用。轻则导致心跳及心律不正常，重则可引发心脏病。目前，我国及许多国家已禁止其作为饲料添加剂使用。

在克伦特罗的检测方法方面，目前最为常用的方法包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、酶联免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等方法。HPLC法具有检测精确度高、假阳性率低的优点，主要缺点是仪器价格昂贵、操作比较繁琐，耗时长，检测费用昂贵；且前期样品的萃取条件的选择也对检测灵敏度和准确性有较大影响。GC-MS灵敏度很高，假阳性率低。该方法的主要缺点是样品需要衍生化这样复杂的前期处理。LC-MS的缺点与GC-MS一样，操作步骤繁琐，需要贵重仪器，所以一般用作对阳性结果的确认手段。酶联免疫吸附分析法是当前应用最广、发展最快的免疫酶技术之一，主要优点在于检测迅速，样品前处理简单，检测系统操作简单，成本低，同时便于进行大规模检测。化学发光免疫检测技术不同于酶联免疫吸附分析法，它是化学发光法和免疫分析法结合的产物，因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。化学发光免疫分析法的基本原理与ELISA相似，不同之处在于酶标记物的反应体系是化学发光反应。

目前，用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体或多克隆抗体的制备必须通过细胞培养获得，整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作。单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短肽链连接后融合表达出来的抗体片断，具有分子量小、特异性高、结合力强、易于利用基因工程技术操作等优点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种单链抗体及其编码基因。

本发明所提供的单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第15-132位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第148-266位氨基酸残基所示。

上述单链抗体中，所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第133-147位氨基酸残基所示。

所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)所示：

1)所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第43-396位核苷酸所示的DNA分子；

2)所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第442-798位核苷酸所示的DNA分子；

3)所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第397-441位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表中序列2自5′末端起第43-798位核苷酸所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)、2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒也属于本发明的保护范围。

上述任一所述单链抗体在检测克伦特罗或沙丁胺醇中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种检测克伦特罗或沙丁胺醇的免疫试剂盒。

本发明所提供的检测克伦特罗或沙丁胺醇的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试剂盒：

1)试剂盒中包括克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)试剂盒中包括克伦特罗半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)试剂盒中包括克伦特罗半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体；其中，所述单链抗体作为包被原；

4)试剂盒中包括克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

上述任一所述免疫试剂盒中，所述试剂盒中包括克伦特罗标准品溶液、洗涤液和样品浓缩液；所述克伦特罗标准品为盐酸克伦特罗；

所述克伦特罗标准品溶液为如下各浓度的溶液：0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、1350ng/L和4050ng/L；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20，5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005M-0.015M，具体为0.01M，pH值为7.2-7.6，具体为7.4；

所述样品浓缩液为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，具体为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。

上述任一所述免疫试剂盒中，所述克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备得到的：将每5mg克伦特罗半抗原溶于0.1M盐酸水溶液中，得到克伦特罗半抗原的水溶液，并预冷至0℃；向克伦特罗半抗原的水溶液中加入10mg NaNO₂，4℃条件下搅拌5h，形成溶液I；将20mg载体蛋白溶于0.1M磷酸盐缓冲溶液中，得到载体蛋白的溶液；将载体蛋白的溶液加到溶液I中，4℃条件下搅拌6h，得到所述克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物；

所述克伦特罗半抗原为克伦特罗；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；

所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种检测克伦特罗或沙丁胺醇的方法。

本发明所提供的检测克伦特罗或沙丁胺醇的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用上述任一所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)、c)和d)中的任一：

a)所述待测样品为猪尿或血清样品；将所述猪尿或血清样品直接作为待测样本溶液，或将所述猪尿或血清样品离心或过滤，取上清液或滤液，得到待测样本溶液；

b)所述待测样品为饲料；将每1g所述待测样品与10mL 0.01M盐酸水溶液混匀，调整pH值至6.5～8，2000r/min离心5min，取100μL上清液；将所述100μL上清液与400μL样品稀释液混匀，即得到待测样本溶液；

c)所述待测样品为液态奶；将每1mL液态奶、2mL蒸馏水和100μL 5M盐酸水溶液混合，在40℃保持3～5min，2000r/min离心5min，取上清液，记作上清液I；将所述上清液I与100μL 5M氢氧化钠水溶液和6.8mL蒸馏水混合，2000r/min离心15min，取上清液，记作上清液II；用400μL样品稀释液稀释所述上清液II，得到的溶液即为待测样本溶液；

d)所述待测样品为猪肉或猪肝；将每6g所述待测样品的均质化组织与12mL 3％(质量百分含量)的三氯乙酸水溶液混合，并颠倒混匀30min，10000r/min离心5min或3000r/min离心10min，取上清液；将所述上清液与异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液等体积比混合，振荡提取20min，放置2min，10000r/min离心5min或3000r/min离心10min，取3mL上层有机相，氮气吹干，用1mL样品稀释液溶解，得到的溶液即为所述待测样本溶液；所述异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液中，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为4∶6；

所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。

上述试剂盒既可以为酶联免疫试剂盒，又可为发光免疫试剂盒，当为发光免疫试剂盒时，试剂盒中还包括底物显色液；所述底物显色液由A液和B液组成；A液由(1)中所述物质(即发光剂)中的至少一种和(2)中所述物质(即发光增强剂)中的至少一种组成：(1)鲁米诺、异鲁米诺和4-氨基己基-N-乙基异鲁米诺，(2)对-碘苯酚、邻-碘苯酚和对甲苯酚；B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液。所述发光底物液分为A液和B液保存，在临用前按1∶1混合使用。

上述试剂盒的检测原理如下：

当在酶标板微孔条上预包被克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入克伦特罗单链抗体溶液，样本中残留的克伦特罗或克伦特罗标准品与酶标板上包被的克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物竞争克伦特罗单链抗体，加入酶标记二抗进行放大作用，催化底物发光，样本发光强度值与样本中克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中克伦特罗的含量。

当在酶标板微孔条上预包被二抗时，加入克伦特罗单链抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液，再加入酶标记克伦特罗半抗原溶液，样本中的克伦特罗或克伦特罗标准品与酶标记克伦特罗半抗原竞争克伦特罗特异性抗体，用催化底物发光，样本发光强度值与样本中克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中克伦特罗的含量。

当在酶标板微孔条上预包被克伦特罗单链抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记克伦特罗半抗原溶液，样本中残留的克伦特罗或克伦特罗标准品与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的克伦特罗单链抗体，用催化底物发光，样本发光强度值与克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中克伦特罗的含量。

当在酶标板微孔条上预包被克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记克伦特罗单链抗体溶液，样本中的克伦特罗或克伦特罗标准品与酶标板上包被的克伦特罗抗原竞争克伦特罗单链抗体，用催化底物发光，样本发光强度值与样本中克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中克伦特罗的含量。

本发明提供的试剂盒检测方法为：

当包被原为克罗特伦偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标二抗，温育后洗涤拍干，催化底物发光、用化学发光检测仪测定发光强度值；

当包被原为克伦特罗偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤拍干，催化底物发光、用化学发光检测仪测定发光强度值；

当包被原为克伦特罗单链抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记克伦特罗半抗原，温育后洗涤拍干，催化底物发光、用化学发光检测仪测定发光强度值；

当包被原为二抗时，向酶标板微孔中加入克伦特罗单链抗体，温育后洗涤拍干，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标克伦特罗半抗原，温育后洗涤拍干，催化底物发光、用化学发光检测仪测定发光强度值。

本发明提供的检测结果分析过程为：

以所获得的样品发光强度(B)与第一个标准(0标准)的发光强度(B₀)的比值(B/B₀)为纵坐标，以FB标准品浓度的对数为横坐标，通过专业分析软件绘制标准曲线，并求出IC₅₀，以20％的抑制作为最低检测限。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需较短时间，1.5h内即可以完成。

本发明的单链抗体(scFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经济地大规模生产，从而使得免疫检测抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用，比杂交瘤细胞培养得到单抗的方法要简单得多。本发明抗体的亲和常数为8.06×10⁹L/mol、半数抑制量(IC₅₀)为0.076ng/mL。本发明为食品中克伦特罗残留检测方法的建立提供高效价、高特异性的抗体来源。

标准品精密度试验中，本发明试剂盒的每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在3.5％～8.2％之间；样本准确度和精密度实验中，猪尿样品的添加回收率为87.5％～95.5％；猪肉样品的添加回收率为79.9％～92.6％。猪尿样品的批内变异系数为4.8％～8.2％，批间变异系数为10.9％～11.2％；猪肉样品的批内变异系数为4.9％～9.1％，批间变异系数为10.5％～11.1％。交叉反应检测实验中，本发明试剂盒对克伦特罗和沙丁胺醇的特异性好。综上表明，本发明试剂盒的灵敏度高、准确度高、精密度高、对克伦特罗和沙丁胺醇的特异性好。另外，本发明试剂盒成本低廉。用本发明的试剂盒检测样品中克伦特罗和沙丁胺醇的含量，具有操作简便快捷、样品前处理简单的特点，能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的抗体及试剂盒及检测方法在克伦特罗和沙丁胺醇的检测中将发挥重大作用。

附图说明

图1为克伦特罗试剂盒标准曲线。

图2为克伦特罗单链抗体的Western-Blotting结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗体的制备及功能检测

一、克伦特罗单链抗体的制备

(一)抗体的筛选及改造

取6个月雄性Balb/c小鼠，Trizol一步法提取脾细胞总RNA，纯化得到mRNA，再逆转录得到cDNA。使用Oligo(dT)引物，以cDNA为模板分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因，经重迭延伸聚合酶链式反应(SOE-PCR)通过一段柔性肽段((Gly4Ser)3-Linker)将VH、VL装配为scFv；将酶切scFv连接入核糖体展示载体(pRDV)中，通过PCR技术在scFv的5′端引入T7启动子和核糖体结合位点，3′端引入间隔区tolA序列而构建出核糖体展示模板，通过体外表达得到mRNA-核糖体-抗体三元复合物，构建出单链抗体核糖体展示文库，借助ELISA和PCR技术经四轮循环筛选出特异性克伦特罗单链抗体基因，其中在第二轮循环时，借助错配PCR和交替延伸PCR技术进行抗体改造，并引入酶切位点。

该单链抗体的编码基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5′末端起第43-396位核苷酸编码重链可变区，自序列2的5′末端起第442-798位核苷酸编码轻链可变区，自序列2的5′末端起第397-441位核苷酸编码短肽。

该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。该抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第15-132位氨基酸残基为重链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第148-266位氨基酸残基为轻链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第133-147位氨基酸残基为短肽序列。

(二)抗体的制备

表达载体pET20b购自德国NOVAGEN公司；大肠杆菌BL21购自德国NOVAGEN公司；蛋白纯化用HisLink^TM Protein Purification Resin购自美国Promega公司，产品目录号为V8823。

合成序列表中序列2自5′末端起第43-798位核苷酸所示基因，并在两端引入酶切位点Xba I和Not I，用限制性内切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性内切酶Xba I和Not I酶切表达载体pET20b，回收载体大片段；连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选培养，挑取单克隆；将单克隆接入液体培养基进一步培养，提取质粒，酶切和测序验证，结果测得的序列如序列表中序列2自5′末端起第43-798位核苷酸所示，表明重组载体中基因插入方向和序列均正确，将阳性重组载体记作重组表达载体pET20b/ScFv。

采用氯化钙法将重组表达载体pET20b/ScFv转化大肠杆菌BL21，抗性筛选，经菌液PCR及质粒酶切验证，得到含有重组表达载体pET20b/ScFv的重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv。

2×TY培养液的组成：由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水组成，每1升2×TY培养液中胰蛋白胨的浓度为1.6％、酵母提取物的浓度为1％、NaCl的浓度为0.5％；各百分含量均为质量百分含量。

含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×TY培养液是按照如下方法得到的：向2×TY培养液中添加氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨苄青霉素在溶液中的终浓度为100μg/ml，使氯霉素在溶液中的终浓度为34μg/ml，使葡萄糖在溶液中的终浓度为1％(质量百分含量)。

发酵重组菌：将重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv的单个阳性菌落接种至含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×TY培养液中，37℃振摇，至培养体系的A₆₀₀为0.6时，收集细菌；将细菌重悬于2ml LB液体培养基中，按1∶20的体积比将菌悬液接种至50ml含相同浓度抗生素的LB液体培养基中(含相同浓度抗生素的LB液体培养基的组成：氨苄青霉素、氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水组成；溶液中各成分的浓度为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，氨苄青霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml)，37℃振摇，至培养体系的A₆₀₀为0.6时，加IPTG(0.7mmol/L)诱导，30℃振摇2.5h，在4℃下5000r/min离心10min，收获细菌。用洗涤液(将20mmol Tris和0.15mol NaCl用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升洗涤液)洗涤1次，加溶菌液(将20mmol Tris、10ml Triton X-100、250μmol PMSF、62.5×10⁴U溶菌酶用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升溶菌液)，30℃放置15min，然后在冰上超声处理(输出功率80％)10s，停10s，反复3次，至细胞不再粘稠。在4℃2000×g离心20min，分别收集上清及沉淀。将沉淀用结合缓冲液I(将20mmol Tris、0.5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升结合缓冲液I)洗涤一次，而后，悬于结合缓冲液II(将20mmol Tris、0.5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升结合缓冲液II)中，4℃，12000×g离心20min，收集上清，经0.45mm滤膜过滤，收集滤液，得到抗体的粗制液。

纯化：利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过亲和层析纯化单链抗体蛋白。将HisLink^TM Protein Purification Resin装柱，以10倍柱体积的binding buffer(将100mmolHEPES、10mmol咪唑和500mmol NaCl用水溶解，再调节pH值至7.5，然后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡纯化柱，取抗体的粗制液上样，然后用5倍柱体积的wash buffer(将100mmolHEPES、100mmol咪唑和用水溶解，再调节pH值至7.5，然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脱杂蛋白，最后用10倍柱体积的elution buffer(将100mmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再调节pH值至7.5，然后用水定容至1升，得到1升elution buffer)洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，得到纯化的抗体。

(三)抗体的功能检测

1、用ELISA方法，检测抗体的半抑制率(IC₅₀)：

a、将实施例2中制备得到的偶联物(CLE-OVA)用包被缓冲液溶解，得到CLE-OVA的溶液(该溶液中CLE-OVA的浓度为1μg/ml)。包被缓冲液：pH9.6、0.1mol/L的碳酸钠缓冲液。

向96孔板的孔中加入CLE-OVA的溶液，100μL每孔，37℃温育2h；倾去包被液，用PBST溶液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔，每次30s，甩干孔中液体；

b、然后向每孔中加入200μL2％BSA封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体；用PBST溶液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔，每次30s，甩干孔中液体。

c、向孔中加入单链抗体溶液和不同浓度的盐酸克伦特罗标准品溶液，各50μL每孔，37℃孵育1小时。以只加入单链抗体溶液不加入盐酸克伦特罗标准品溶液的孔作阳性对照。

单链抗体溶液的制备：用样品稀释液稀释实验(二)中的纯化抗体得到溶液，抗体在溶液中的浓度为5ng/mL；样品稀释液为0.002mol/L的磷酸盐缓冲液。

不同浓度的盐酸克伦特罗溶液的制备：用样品稀释液稀释盐酸克伦特罗得到溶液。

d、用PBST溶液(PBS，0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔，甩干孔中液体，加入HRP标记的鼠抗His标签单克隆抗体，37℃孵育1小时；

e、用PBST溶液(PBS，0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔；加入TMB显色，37℃反应10分钟，加入2M硫酸终止显色反应，每孔50μL，使用酶标仪进行读数。

实验设3次重复。

结果如下：

1)吸光度值与每孔所加入的标准品溶液中盐酸克伦特罗的浓度成反比；证明，所表达纯化得到的单链抗体具有针对盐酸克伦特罗的结合特异性，并呈现线性关系，说明该抗体可用于对盐酸克伦特罗的免疫检测。

2)半抑制率(IC₅₀)：阳性对照孔(即不添加盐酸克伦特罗标准品溶液的孔)的吸光度值为B₀，各实验孔的吸光度值为B，当B/B₀为50％时所对应的盐酸克伦特罗标准品溶液的浓度即为半抑制率(IC₅₀)。该单抗的半抑制率(IC₅₀)为0.076ng/mL。

2、抗体的亲和常数测定

方法：取定量的一定稀释度的抗体，分别加入逐渐增加的抗原里，可使抗体的结合达到饱和，以结合部分(B)为纵坐标，抗原浓度(mol/L)为横坐标绘制饱和曲线，求出抗体饱和程度为50％时的游离抗原浓度，其倒数即为该抗体在此稀释度下的亲和常数。

结果：抗体的亲和常数为8.06×10⁹L/mol。

3、Western-Blotting：取纯化的单链抗体10μL加入等量的2×上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳；将切好的凝胶块、NC膜和滤纸在转印缓冲液中浸泡，并转入转印夹中，200mA恒流转印1h。转印结束后，取出NC膜以10mL 3％的BSA(PBS配制)封闭2h。取一与膜相当大小的塑料袋，将膜放入其中，加入2mL抗原溶液(用PBST对克伦特罗-HRP按进行1∶2000稀释)，封口。4℃过夜，次日用PBST洗膜3次，每次10min，取一层保鲜膜，加1mL ECL发光液(等量A、B液混合)，将NC膜沥干洗液后，靠胶的一面朝下，浸入发光液中，室温放置1min，用保鲜膜将NC膜包好，靠胶的一面朝上，放入暗匣中，于暗室中用X光片曝光。该试验结果在30kD处出现了特异性的蛋白条带(见图2)，与单链抗体的大小相符，说明纯化后的单链抗体能够与克伦特罗特异性结合。图2中，泳道1表示蛋白低分子量Marker，泳道2表示克伦特罗单链抗体。

同时以转入空载体pET20b的大肠杆菌BL21作为对照。对照Western blot未检测出任何与克伦特罗结合的蛋白条带。

实施例2、化学发光免疫分析试剂盒及其制备与应用

一、化学发光免疫分析试剂盒由下述物质组成：

1、包被克伦特罗半抗原与载体蛋白偶联物的酶标板；

2、克伦特罗单链抗体：抗体工作液的浓度为5ng/mL，抗体工作液是用样品稀释液稀释实施例1中的纯化抗体得到的到的；

3、克伦特罗标准品：标准品溶液浓度分别为0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、1350ng/L和4050ng/L；克伦特罗标准品为盐酸克伦特罗(Clenbuterolhydrochloride)，购自Sigma-Aldrich公司；产品目录号为C275；用样品稀释液稀释成上述各浓度；

4、酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗HIS标签单克隆抗体；购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A7058。

5、底物显色液：由A液和B液组成，A液为鲁米诺与对-碘苯酚混合溶液，B液为过氧化氢水溶液；在该发光体系中加入增强剂对-碘苯酚可增加化学发光强度，并在较长时间保持稳定，从而大大提高免疫分析的灵敏度。所述发光底物液分为A液和B液保存，在临用前按1∶1混合使用。

6、洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

7、样品浓缩液：0.04mol/L的磷酸盐缓冲液；将其进行20倍稀释，成为样品稀释液后使用。

二、试剂盒的制备

半抗原为盐酸克伦特罗(CLE)，盐酸克伦特罗(CLE)购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为C275。

1、包被原及其制备

用重氮化法将半抗原CLE偶联与载体蛋白OVA上，由于CLE具有芳伯氨基的半抗原，在强酸和冷却条件下芳伯氨基生成亲电动重氮盐，与载体蛋白中的强给电子集团发生反应，生成重氮产物，形成包被抗原CLE-OVA。制备过程如下：

将5mg盐酸克伦特罗溶于0.1M盐酸水溶液中，得到盐酸克伦特罗的水溶液，并预冷至0℃；向克伦特罗的水溶液中加入10mg NaNO₂，4℃条件下搅拌5h，形成溶液I；将20mgOVA溶于0.1M磷酸盐缓冲溶液中，得到OVA的溶液。将OVA的溶液加到溶液I中，4℃条件下搅拌6h，得到的溶液中含有克伦特罗与OVA的偶联物(记作CLE-OVA)；用葡聚糖凝胶G-25进行纯化后，测包被原的浓度，存于4℃备用。

2、包被有包被原的酶标板及其制备

用包被缓冲液将步骤1制得的克伦特罗与载体蛋白的偶联物稀释成5.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液稀释20倍后洗涤3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：每1升封闭液按照如下方法配制：将5ml马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

三、试剂盒检测方法

(一)样品前处理

(1)猪尿和血清样品处理：可以直接进行检测分析；或者在样品比较混浊时，2000r/min离心5min或过滤，用上清液检测。

(2)饲料样品处理：将饲料样品粉碎，称取1g置于50mL试管中；加入0.01M盐酸10mL，充分混匀5min；用盐酸或氢氧化钠溶液调整pH值在6.5～8的范围；2000r/min离心5min或过滤；取100μL上清液加入400μL样品稀释液，混匀后取50μL用于检测。

(3)液态奶样品处理：称取1mL液态奶置于10mL离心管中，加入2mL蒸馏水；加100μL 5M盐酸(至pH 3.0)，加温至40℃3～5min直到奶样变性，2000r/min离心5min，将上清液转移至另一只离心管中，加入100μL(2滴)5M氢氧化钠，加入蒸馏水6.8mL，2000r/min离心15min，取100μL上清液用400μL样品稀释液稀释后取50μL用于检测。

(4)猪肉、猪肝样品处理：用超声仪或类似仪器将组织均质化，称取6g均质化后的样品置于20mL试管中，加12mL 3％的三氯乙酸，在旋涡振荡器上振荡1min，颠倒混匀30min，10000r/min离心5min或3000r/min离心10min，将6mL上清液转入20mL试管，加6mL(异丙醇+乙酸乙酯，4+6)振荡提取20min，放置2min，10000r/min离心5min或3000r/min离心10min，取3mL上层有机相，氮气吹干，用1mL样品稀释液充分溶解，取50μL用于检测。

(二)用试剂盒检测

1、标准曲线的制作

向包被有包被原的酶标板微孔中加入克伦特罗标准品溶液50μL，再加入克伦特罗单链抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的抗HIS抗体工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，加入底物显色液用化学发光检测仪进行测定。

用每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值(B)与第一个标准品溶液(0标准)的发光强度值(B₀)的比值(B/B₀)作为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线，得到的标准曲线如图1所示。

2、样品中克伦特罗浓度的测定

向包被有包被原的酶标板微孔中加入检测样本溶液50μL，再加入克伦特罗单链抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入HRP标记的抗HIS抗体工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，加入底物显色液用化学发光检测仪进行测定。

用每个检测样本溶液的发光强度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的发光强度值(B₀)的比值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值，再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中克伦特罗的残留量。

四、试剂盒的效果检测

(一)标准品精密度试验

用实验一中所述试剂盒进行检测，检测方法如实验三中所述。从3个不同批次的试剂盒中各抽取10个试剂盒(即10个酶标板)进行实验，每个酶标板抽出20个微孔，测定20μg/L的标准品的溶液的发光强度值，计算变异系数，结果见表1。

变异系数的计算方法：变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。

表1  标准品精密度试验结果(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各测定10次标准品变异系数在3.5％～8.2％之间。

(二)样本准确度和精密度试验

用实验一中所述试剂盒进行检测。

向不含克伦特罗的样品(猪尿和猪肉)中添加克伦特罗标准品，使克伦特罗标准品在样品中的终浓度分别为200、500、1000ng/kg(ng/L)；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表2。

回收率的计算方法：RG＝测定值与真实值的比值×100％；

变异系数的计算方法：CV＝(各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比值)×100％；

批内变异系数的计算方法：批内CV＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：批间CV＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

表2  准确度和精密度试验结果

结果表明，猪尿样品的添加回收率为87.5％～95.5％；猪肉样品的添加回收率为79.9％～92.6％，符合准确度的测定标准。猪尿样品的批内变异系数为4.8％～8.2％，批间变异系数为10.9％～13.1％；猪肉样品的批内变异系数为4.9％～9.1％，批间变异系数为10.5％～11.1％，符合精密度小于或等于20％的规定。

(三)交叉反应率试验：

沙丁胺醇购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为S5013。

选择与克伦特罗类似结构的化合物和临床使用的代表兽药，测定交叉反应率。通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。

结果如表5所示。

表3  试剂盒的特异性

实验表明，本发明试剂盒对盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的特异性好，即本发明试剂盒可以检测盐酸克伦特罗和沙丁胺醇。

(四)试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大发光强度值(零标准)、50％抑制浓度、克伦特罗添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存12个月以上。

序列表

<110>北京维德维康生物技术有限公司

<120>一种检测克伦特罗的免疫试剂盒及其专用抗体

<160>2

<210>1

<211>266

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val

1               5                   10                  15

Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Leu Pro Ser Ser Leu

            20                  25                  30

Ser His Leu Cys Thr Val Arg Leu Phe Ser Ser Thr Arg Leu Ser Ala

        35                  40                  45

Ser Ile Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Ala

    50                  55                  60

Tyr Ser Glu Leu Gln Ile Thr Val Gly Ser Tyr His Asn Pro Asn Ser

65                  70                  75                  80

Arg Ile Ser Val Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ser Ser Ala Ile

                85                  90                  95

Leu Asn Ser Asp Cys Thr Val Asn Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

            100                 105                 110

Tyr Pro Ser Lys Ala Thr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

        115                 120                 125

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

    130                 135                 140

Gly Gly Ser Asp Met Gln Met Thr Gln Phe Pro Val Pro Cys Cys Ile

145                 150                 155                 160

Ser Gly Thr Gly Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Ala Gly Ser Lys Pro Val

                165                 170                 175

Asn Ser Ser Val Ala Ser Ile Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly

            180                 185                 190

Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu

        195                 200                 205

Gly Ser Leu Pro Gly Ser Val Ala Val Gly Leu Gly Gln Thr Ser Pro

    210                 215                 220

Ser Thr Ser Ile Leu Trp Arg Arg Arg Met Leu Gln Pro Ile Thr Val

225                 230                 235                 240

Ser Thr Glu Gly Ala Val His Ser Ser Arg Met Asp Gln Val Gly Thr

                245                 250                 255

His Glu Cys Cys Arg Arg Gly Arg Lys Val

        260                 265

<210>2

<211>798

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cctttagttg ttcctttcta tgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctgaaggag    60

tctgggcctg gcctggtgaa cttaccatcg tctctgtccc acctctgcac tgtcaggctc    120

ttctcaagca cccgtttatc ggcgtccatc tggatccggc aatttccagg aaacaaactg    180

gagtggatgg cctactcaga gctacaaata actgtcgggt catatcacaa ccctaatagt    240

cgaatctctg tcagtcgaga cacatccaag aaccagtctt ctgcaattct gaattctgac    300

tgtacggtga acacagccac atatttctgt gcaagatatc catcaaaagc tacgtttgac    360

ctttggggcc aaggcaccac tctcactgtc tcctcaggtg gcggcggtag cggcggtggc    420

ggttctggag gcggcggttc tgatatgcag atgacacagt ttcctgtccc ctgctgtata    480

tctggcactg ggagggccac catctcatac gcaggcagca agcctgtcaa cagttctgta    540

gctagtatta tgcactggaa ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat    600

tttactagcg tccaaaagac tctggggtcc ctgccaggtt cagtggcagt gggtctggga    660

cagacttcac cctcaacatc catcctgtgg aggaggagga tgctgcaacc tattactgtc    720

agcactgagg gagcggttca cagttcgagg atggaccaag ttggaactca cgaatgctgt    780

cgacgcggcc gcaaggtg                                                  798

Claims (13)

1.一种单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第15-132位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第148-266位氨基酸残基所示；所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第133-147位氨基酸残基所示。

2.权利要求1所述单链抗体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为序列表中序列2自5′末端起第43-798位核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

8.权利要求1所述单链抗体在检测克伦特罗或沙丁胺醇中的应用。

9.一种检测盐酸克伦特罗或沙丁胺醇的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试剂盒：

1)试剂盒中包括克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1所述单链抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)试剂盒中包括克伦特罗半抗原的酶标记物、权利要求1所述单链抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)试剂盒中包括克伦特罗半抗原的酶标记物、权利要求1所述单链抗体；其中，所述权利要求1所述单链抗体作为包被原；

4)试剂盒中包括克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1所述单链抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

10.根据权利要求9所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括克伦特罗标准品溶液、洗涤液和样品浓缩液；所述克伦特罗标准品为盐酸克伦特罗；

所述克伦特罗标准品溶液为如下各浓度的溶液：0ng/L、50ng/L、150ng/L、450ng/L、1350ng/L和4050ng/L；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20，5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005M-0.015M，pH值为7.2-7.6；

所述样品浓缩液为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。

11.根据权利要求10所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述洗涤液的所述配制方法中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4。

12.根据权利要求10所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述样品浓缩液为浓度为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。

13.一种检测盐酸克伦特罗或沙丁胺醇的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求9-12中任一所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为：所述待测样品为猪尿或血清样品；将所述猪尿或血清样品直接作为待测样本溶液，或将所述猪尿或血清样品离心或过滤，取上清液或滤液，得到待测样本溶液。

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