CN101955540B - 一种喹诺酮药物抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种喹诺酮药物抗体及其应用。该单链抗体由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N端起第1-118位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列1自N端起第134-248位氨基酸残基所示。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的抗体、试剂盒、胶体金试纸及检测方法在喹诺酮药物的检测中将发挥重大作用。

Description

一种喹诺酮药物抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种喹诺酮药物抗体及其应用。

背景技术

喹诺酮类(4-quinolones，QNs)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类合成抗菌药，主要作用于革兰阴性菌。喹诺酮按发明先后及其抗菌性能的不同，分为一、二、三、四代。第一代喹诺酮类，具体品种有萘啶酸和吡咯酸等，因抗菌谱及临床应用范围均较窄，现已不使用。第二代喹诺酮类，吡哌酸是国内主要应用品种，在抗菌谱方面有所扩大，但仅用于泌尿道和肠道感染，目前已少用。第三代喹诺酮类有氟哌酸等一系列药物，抗菌谱进一步扩大，对葡萄球菌等革兰阳性菌也有抗菌作用，对一些革兰阴性菌的抗菌作用则进一步加强。第四代喹诺酮类抗菌药包括恩诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、麻保沙星、双氟沙星、单诺沙星、培氟沙星和罗氟沙星等，已广泛应用于动物源性食品的生产中。

随着氟喹诺酮类抗菌药在兽医临床和水产养殖中的应用，其残留问题已引起广泛的关注。QNs残留除了其毒副作用对人直接危害外，更为严重的是其耐药菌株正逐年上升，新开发的氟喹诺酮类药品的市场周期大大缩短。因此，必须重视氟喹诺酮类药物在动物性食品中的残留问题。食品添加剂联合专家委员会和欧盟都对于QNs的MRLs作了规定。目前用于检测QNs残留的方法有：微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法(LC)、液相色谱-质谱(LC-MS)法和酶联免疫吸附分析(ELISA)。目前，用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体或多克隆抗体的制备必须通过细胞培养获得，整个生产过程复杂，消耗时间长，费用高，且不易进行操作。单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短肽链连接后融合表达出来的抗体片断，具有分子量小、特异性高、结合力强、易于利用基因工程技术操作等优点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测喹诺酮药物的单链抗体及其编码基因。

本发明所提供的单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-121位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第137-249位氨基酸残基所示。

上述单链抗体中，所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第122-136位氨基酸残基所示。

所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)所示：

1)所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第1-363位核苷酸所示的DNA分子；

2)所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第409-747位核苷酸所示的DNA分子；

3)所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第364-408位核苷酸所示的DNA分子；

4)自序列表中序列2所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)、2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒也属于本发明的保护范围。

上述任一所述单链抗体在检测喹诺酮药物中的应用也属于本发明的保护范围；所述喹诺酮药物为如下中的至少一种：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星。

本发明的另一个目的是提供检测喹诺酮药物的免疫试剂盒。

本发明所提供的检测喹诺酮药物的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试剂盒：

1)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体；其中，所述单链抗体作为包被原；

4)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

上述任一所述免疫试剂盒中，所述试剂盒中包括喹诺酮药物标准品溶液、洗涤液和样品浓缩液；所述喹诺酮药物标准品为环丙沙星；

所述喹诺酮药物标准品溶液为如下各浓度的溶液0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20，5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005M-0.015M，具体为0.01M，pH值为7.2-7.6，具体为7.4；

所述样品浓缩液为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，具体为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备的：将每0.1mmol喹诺酮药物半抗原和0.12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF和HCl的混合溶液中DMF与HCl的体积比为1∶1，磁力搅拌，得到溶液I；向所述溶液I中滴加1mL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的浓度为0.15mmol/ml，25℃搅拌1h，4℃冰箱搅拌12h，离心，取上清液；将所述上清液逐滴加到5mL载体蛋白的溶液中，25℃搅拌0.5h，透析，得到所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白的溶液按照如下方法制备：用pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的碳酸缓冲液将45mg载体蛋白溶解，并定容至5ml，得到所述载体蛋白的溶液；

所述喹诺酮药物半抗原为环丙沙星；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；

所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。

所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。

本发明的另一个目的是提供一种检测喹诺酮药物的胶体金试纸。

本发明所提供的检测喹诺酮药物的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶金垫包被有胶体金标记的上述任一所述单链抗体；所述反应垫上含有检测带和质控带，检测带位置包被有上述任一所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种检测样品中喹诺酮药物的方法。

本发明所提供的检测样品中喹诺酮药物的方法，为如下I)或II)所示：

I)检测样品中喹诺酮药物的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用上述任一所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)和c)中的任一：

a)所述待测样品为畜禽的肉、畜禽的肝脏或水产；将每3g所述待测样品的均质样品与9mL乙腈和氢氧化钠水溶液的混合溶液混匀，4000r/min离心10min，取4mL上清液，加入0.02mol/L PBS缓冲液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振荡10min，4000r/min离心10min，取下层有机相6mL，加入样品稀释液0.5mL和正己烷1mL，涡动2min，4000r/min离心10min，取下层清夜，即得到待测样本溶液；所述乙腈和氢氧化钠水溶液的混合溶液中乙腈与氢氧化钠水溶液的体积比为84∶16，所述氢氧化钠水溶液中氢氧化钠的浓度为0.1mol/L；

b)所述待测样品为蛋；用乙腈对所述待测样品进行提取，离心，取上清液；将所述上清液脱脂，得到待测样本溶液；具体为：将每2g所述待测样品的均质样品与8mL乙腈振荡混合5min，4000r/min离心5min，取上清液2mL，氮气吹干，用1mL正己烷溶解，涡动1min，加入样品稀释液1mL，涡动2min，4000r/min离心5min，取下层清夜，即得到待测样本溶液；

c)所述待测样品为蜂蜜；将每1g所述待测样品与2mL PBS缓冲溶液振荡混合5min，再加入8mL二氯甲烷，振荡5min，4000r/min离心5min，取下层有机相4mL，氮气吹干，用1mL样品稀释液溶解，得到的溶液即为待测样本溶液；

II)检测样品中喹诺酮药物的方法包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用上述任一所述胶体金试纸卡对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述a)、b)和c)中的任一：

a)所述待测样品为牛奶；将样品稀释液和牛奶混合，得到的混合溶液即为待测样本溶液；所述样品稀释液和牛奶的体积比为(3-5)∶1或4∶1；

b)所述待测样品为畜禽的肉、畜禽的肝脏或水产；将每1g所述待测样品的匀浆组织与4mL 0.02M、pH 7.4的PBS缓冲液混合均匀，3000转离心5min，取上清液，即为待测样本溶液；

c)所述待测样品为蜂蜜；将蜂蜜与提取剂混合，得到的混合溶液为待测样本溶液；具体为：将每1g蜂蜜与4mL提取剂混合均匀，得到的混合溶液即为待测样本溶液；每1升所述提取剂由5ml Tween-20和995ml 0.02M的PBS缓冲液组成，提取剂的pH值为7.4；

所述喹诺酮药物为如下中的至少一种：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星；

所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。

上述试剂盒既可以为酶联免疫试剂盒，又可为发光免疫试剂盒，当为酶联免疫试剂盒时，所述试剂盒中包括底物显色液；所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为浓度为1.5％-2.5％的过氧化脲的水溶液，B液为浓度为0.5％-1.5％的四甲基联苯胺的水溶液；

所述A液优选为浓度为2％的过氧化脲的水溶液，B液优选为浓度为1％的四甲基联苯胺的水溶液。本发明的单链抗体(scFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经济地大规模生产，从而使得免疫检测抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用，比杂交瘤细胞培养得到单抗的方法要简单得多。本发明抗体的亲和常数为3.74×10⁹L/mol、半数抑制量(IC₅₀)为1.5ng/mL。本发明为食品中喹诺酮药物残留检测方法的建立提供高效价、高特异性的抗体来源。

本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。本发明试剂盒和胶体金试纸卡可以同时检测环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、依诺沙星多种药物，将在喹诺酮类药物的检测中发挥重要作用。因此，本发明的抗体、试剂盒、胶体金试纸及检测方法在喹诺酮药物的检测中将发挥重大作用。

附图说明

图1为试剂盒标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗体的制备及功能检测

一、喹诺酮药物单链抗体的制备

(一)抗体的筛选

取6个月雄性Balb/c小鼠，Trizol一步法提取脾细胞总RNA，纯化得到mRNA，再逆转录得到cDNA。使用全套引物，以cDNA为模板分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因，经叠加延伸聚合酶链式反应(Overlap-PCR)将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因(ScFv)，然后将ScFv与载体pCANTAB5E连接得pCANTAB5E/ScFv，并转化大肠杆菌TG1，即得到鼠源非免疫单链抗体库。用ELISA方法筛选得到带有特异性的抗多种喹诺酮类药物的单链抗体的噬菌体颗粒，通过测序得到其相应的核苷酸序列。

该单链抗体的编码基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5′末端起第1-363位核苷酸编码重链可变区，自序列2的5′末端起第409-747位核苷酸编码轻链可变区，自序列2的5′末端起第364-408位核苷酸编码短肽。

该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。该抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-121位氨基酸残基为重链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第137-249位氨基酸残基为轻链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第122-136位氨基酸残基为短肽序列。

(二)抗体的制备

表达载体pET20b购自德国NOVAGEN公司；大肠杆菌Escherichia coli BL21购自德国NOVAGEN公司；蛋白纯化用HisLink^TM Protein Purification Resin购自美国Promega公司，产品目录号为V8823。

合成序列表中序列2所示基因，并在两端引入酶切位点Xba I和Not I，用限制性内切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性内切酶Xba I和Not I酶切表达载体pET20b，回收载体大片段；连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选培养，挑取单克隆；将单克隆接入液体培养基进一步培养，提取质粒，酶切和测序验证，结果测得的序列如序列表中序列2所示，表明重组载体中基因插入方向和序列均正确，将阳性重组载体记作重组表达载体pET20b/ScFv。

采用氯化钙法将重组表达载体pET20b/ScFv转化大肠杆菌BL21，抗性筛选，经菌液PCR及质粒酶切验证，得到含有重组表达载体pET20b/ScFv的重组大肠杆菌，记作重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv。

2×TY培养液的组成：由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水组成，每1升2×TY培养液中胰蛋白胨的浓度为1.6％、酵母提取物的浓度为1％、NaCl的浓度为0.5％；各百分含量均为质量百分含量。

含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×TY培养液是按照如下方法得到的：向2×TY培养液中添加氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨苄青霉素在溶液中的终浓度为100μg/ml，使氯霉素在溶液中的终浓度为34μg/ml，使葡萄糖在溶液中的终浓度为1％(质量百分含量)。

发酵重组菌：将重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv的单个阳性菌落接种至含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×TY培养液中，37℃振摇，至培养体系的A₆₀₀为0.6时，收集细菌；将细菌重悬于2ml LB液体培养基中，按1∶20的体积比将菌悬液接种至50ml含相同浓度抗生素的LB液体培养基中(含相同浓度抗生素的LB液体培养基的组成：氨苄青霉素、氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水组成；溶液中各成分的浓度为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 1％，氨苄青霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml)，37℃振摇，至培养体系的A₆₀₀为0.6时，加IPTG(0.7mmol/L)诱导，30℃振摇2.5h，在4℃下5000r/min离心10min，收获细菌。用洗涤液(将20mmol Tris和0.15mol NaCl用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升洗涤液)洗涤1次，加溶菌液(将20mmol Tris、10ml Triton X-100、250μmol PMSF、62.5×10⁴U溶菌酶用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升溶菌液)，30℃放置15min，然后在冰上超声处理(输出功率80％)10s，停10s，反复3次，至细胞不再粘稠。在4℃2000×g离心20min，分别收集上清及沉淀。将沉淀用结合缓冲液I(将20mmol Tris、0.5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升结合缓冲液I)洗涤一次，而后，悬于结合缓冲液II(将20mmol Tris、0.5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升结合缓冲液II)中，4℃，12000×g离心20min，收集上清，经0.45mm滤膜过滤，收集滤液，得到抗体的粗制液。

纯化：利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过亲和层析纯化单链抗体蛋白。将HisLink^TM Protein Purification Resin装柱，以10倍柱体积的binding buffer(将100mmolHEPES、10mmol咪唑和500mmol NaCl用水溶解，再调节pH值至7.5，然后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡纯化柱，取抗体的粗制液上样，然后用5倍柱体积的wash buffer(将100mmolHEPES、100mmol咪唑和用水溶解，再调节pH值至7.5，然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脱杂蛋白，最后用10倍柱体积的elution buffer(将100mmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再调节pH值至7.5，然后用水定容至1升，得到1升elution buffer)洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，得到纯化的抗体。

蛋白验证Western blot：收集上述各阶段产物，进行12％SDS-PAGE电泳；将电泳条带印迹到NC膜上，再与HRP标记的环丙沙星杂交，检测发光条带。环丙沙星购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为33434

同时以转入空载体pET20b的大肠杆菌BL21作为对照，并按照上述方法进行表达和纯化，和Western blot检测。

Western blot检测结果表明：1)实验组得到的蛋白具有与环丙沙星结合的功能，蛋白的分子量为29kD，与预期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白为与环丙沙星结合的抗体。2)对照组没有检测到任何与环丙沙星结合的蛋白条带。

(三)抗体的功能检测

1、用ELISA方法，检测抗体的半抑制率(IC₅₀)：

a、将实施例2中制备得到的偶联物(CIP-BSA)用包被缓冲液溶解，得到CIP-BSA的溶液(该溶液中CIP-BSA的浓度为1μg/ml)。包被缓冲液：pH9.6、0.1mol/L的碳酸钠缓冲液。

向96孔板的孔中加入CIP-BSA的溶液，100μL每孔，37℃温育2h；倾去包被液，用PBST溶液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔，每次30s，甩干孔中液体；

b、然后向每孔中加入200μL2％BSA封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体；用PBST溶液(PBS+0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔，每次30s，甩干孔中液体。

c、向孔中加入单链抗体溶液和不同浓度的CIP标准品溶液，各50μL每孔，37℃孵育1小时。以只加入单链抗体溶液不加入CIP标准品溶液的孔作阳性对照。

单链抗体溶液的制备：用样品稀释液稀释实验(二)中的纯化抗体得到溶液，抗体在溶液中的浓度为5ng/mL；样品稀释液为0.002mol/L的磷酸盐缓冲液。

不同浓度的CIP溶液的制备：用样品稀释液稀释CIP得到溶液。

d、用PBST溶液(PBS，0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔，甩干孔中液体，加入HRP标记的鼠抗His标签单克隆抗体，37℃孵育1小时；

e、用PBST溶液(PBS，0.05％Tween20)洗涤3次，250μL每孔；加入TMB显色，37℃反应10分钟，加入2M硫酸终止显色反应，每孔50μL，使用酶标仪进行读数。

实验设3次重复。

结果如下：

1)吸光度值与每孔所加入的标准品溶液中CIP的浓度成反比；证明，所表达纯化得到的单链抗体具有针对CIP的结合特异性，并呈现线性关系，说明该抗体可用于对CIP的免疫检测。

2)半抑制率(IC₅₀)：阳性对照孔(即不添加CIP标准品溶液的孔)的吸光度值为B₀，各实验孔的吸光度值为B，当B/B₀为50％时所对应的CIP标准品溶液的浓度即为半抑制率(IC₅₀)。该单抗的半抑制率(IC₅₀)为1.5ng/mL。

2、抗体的亲和常数测定

方法：取定量的一定稀释度的抗体，分别加入逐渐增加的抗原里，可使抗体的结合达到饱和，以结合部分(B)为纵坐标，抗原浓度(mol/L)为横坐标绘制饱和曲线，求出抗体饱和程度为50％时的游离抗原浓度，其倒数即为该抗体在此稀释度下的亲和常数。

结果：抗体的亲和常数为3.74×10⁹L/mol。

实施例2、检测喹诺酮药物的酶联免疫试剂盒及其制备

本实验中的样品稀释液：即为实验一种所述试剂盒中的样品稀释液。

本实验中的洗板液：即为实验一种所述试剂盒中的洗涤液。

一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成：

1、包被环丙沙星与载体蛋白偶联物的酶标板；

2、喹诺酮抗体：实施例1总所述单链抗体。抗体工作液的浓度为5.0ng/mL，抗体工作液是用样品稀释液稀释实施例1中的纯化抗体得到的到的；

3、喹诺酮标准品：喹诺酮标准品为环丙沙星(CIP)，标准品溶液浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L；环丙沙星(CIP)购自美国Sigma-Aldrich公司；产品目录号为33434；用样品稀释液稀释成上述各浓度；

4、酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗HIS标签单克隆抗体；购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A7058。

5、底物显色液：由A液和B液组成，A液为2％过氧化脲的水溶液，B液为1％四甲基联苯胺的水溶液；

6、终止液：0.2M硫酸水溶液；

7、洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4；

8、样品浓缩液：0.04mol/L的磷酸盐缓冲液；将其进行20倍稀释，成为样品稀释液后使用。

二、试剂盒组分的制备

(一)包被原的制备

以环丙沙星(CIP)作为喹诺酮半抗原。载体蛋白为BSA。

NHS的全称为：N-羟基琥珀酰亚胺；DMF的全称为：N，N-二甲基甲酰胺；DCC的全称为：二环己基碳二亚胺；

将0.1mmol喹诺酮药物半抗原和0.12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF和HCl的混合溶液中DMF与HCl的体积比为1∶1，磁力搅拌，得到溶液I；向所述溶液I中滴加1mL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的浓度为0.15mmol/ml(DCC为固体，溶解于DMF中)，25℃搅拌1h，4℃冰箱搅拌12h，离心，取上清液；将所述上清液逐滴加到5mLBSA的溶液中，BSA的溶液按照如下方法配制：用pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的碳酸缓冲液将45mg BSA溶解，并定容至5ml，25℃搅拌0.5h，透析，得到所述环丙沙星与BSA的偶联物(记作CIP-BSA)。

(二)包被有包被原的酶标板及其制备

包被有合成抗原CIP-BSA的聚苯乙烯酶标板：用10mM的碳酸盐溶液将抗原作1∶50000倍稀释(6.0μg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗板液稀释20倍后洗涤3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液；

封闭液：每1升封闭液按照如下方法配制：将5ml马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.2。

三、试剂盒检测方法

(一)样品前处理

1、检测样本为畜禽的肉、畜禽的肝脏或水产：取3g的均质样品分别加入乙腈-0.1mol/L氢氧化钠水溶液(84：16，V/V)9mL，振荡混合10min，4000r/min离心10min，取4mL上清液，加入0.02mol/L PBS缓冲液4mL，再加入二氯甲烷8mL，振荡10min，4000r/min离心10min，取下层有机相6mL，氮气吹干；加入样品稀释液0.5mL，加入正己烷1mL，涡动2min，4000r/min离心10min，取下层清夜50μL进行检测。

2、检测样本为鸡蛋：取2g的均质样品，加入8mL乙腈，振荡混合5min，4000r/min离心5min，取上清2mL，氮气吹干；加入正己烷1mL，涡动1min，加入样品稀释液1mL，涡动2min，4000r/min离心5min，取下层清夜50μL进行检测。

3、检测样本为蜂蜜：取1g的样品，加入PBS缓冲溶液2mL，振荡混合5min后，加入二氯甲烷8mL，振荡5min，4000r/min离心5min，取下层有机相4mL，氮气吹干；用1mL样品稀释液复溶，取50μL进行检测。

(二)用试剂盒检测

1、标准曲线的制作

向包被有包被原的酶标板微孔中加入环丙沙星标准品溶液50μL，再加入环丙沙星单链抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。以环丙沙星标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图1所示。

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

2、样品中喹诺酮浓度的测定

向包被有包被原的酶标板微孔中加入检测样本溶液50μL，再加入喹诺酮抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液100μL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入混合底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值。

结果判断：用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值，再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中喹诺酮药物的残留量。

四、试剂盒检测效果评价

(一)准确度和精密度试验

向不含喹诺酮药物的样品(鸡肉、猪肉、鸡肝、鱼肉、虾肉及鸡蛋、蜂蜜)中添加如下药物：环丙沙星(CIP)；使各添加药物在样品中的浓度为分别为20、40、60μg/kg(或μg/L)。蜂蜜样品的添加浓度与鸡肉一致。

将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。

表1  精密度试验结果

板内变异系数的计算方法：

板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。

批内变异系数的计算方法：

批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。

批间变异系数的计算方法：

批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。

结果表明：所有样品的添加回收率在82.6％～99.5％，批内变异系数在8.2％～8.8％，批间变异系数在6.5％～10.5％。

(二)试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、喹诺酮药物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

(三)交叉反应率试验：

选择与环丙沙星结构相似的其他喹诺酮类药物，通过各种标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率：

表2  试剂盒的特异性

实验表明，本发明试剂盒对环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星、依诺沙星的特异性好，即本发明试剂盒可以检测上述喹诺酮类药物。

实施例3、检测喹诺酮药物的试纸及其制备与应用

一、试纸的结构

所述试纸由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

所述样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的喹诺酮药物抗体；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(C线)和质控区(T线)均为与所述试纸的长相垂直的条带状；检测区位于近于胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体；

样品吸收垫为纤维素滤膜，反应膜为硝酸纤维素膜(NC膜)；吸水垫为吸水纸；胶体金垫为包被有胶体金标记的喹诺酮药物抗体的玻璃纤维膜；试纸顶端有样品孔。

二、试纸的制备

(1)胶体金标记抗体：

胶体金溶液的制备：取0.01％氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2-8℃保存。

0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH 8.2，将10mL胶体金溶液中加入50mL烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入1mL含0.35mg单链抗体溶液。逐滴加入3mL 5％BSA，持续搅拌10min。金标抗体溶液常温低速(1500r/min)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。红色上清溶液2-8℃，11000r/min离心40min。溶液分为三层，透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1％BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液混悬至原量。平衡过夜，同上重复离心2次。最后用1％BSA的0.01mol/L PB(含0.02％NaN₃)将沉淀混悬为原体积的1/40，2-8℃保存。

(2)喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

(3)喷膜：在反应膜上的T线和C线位置分别喷上包被原和鼠抗HIS标签单克隆抗体；

(4)组装：将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸按常规方法进行组装，然后切条，将试纸卡装入塑料制卡中，形成试纸卡。

三、用试纸进行检测

(1)样品前处理及检测

1、检测样本为新鲜牛奶：新鲜牛奶直接用样品稀释液进行稀释后检测，稀释4倍，混匀后滴加入4滴于样品孔中；

2、检测样本为畜禽的肉、畜禽的肝脏或水产；称1g匀浆过的组织样品于10mL离心管中，加入4mL PBS缓冲液(0.02M，pH 7.4)，振荡5min至混匀，3000转离心5min，用滴管吸取上清液逐滴加入4滴于样品孔中；

3、检测样本为蜂蜜；取1g蜂蜜于10mL离心管中，加入4mL提取剂，振荡5min至混匀，滴加入4滴于样品孔中；5-10min判断结果，15min后的判断结果无效。每1升所述提取剂由5ml Tween-20和995ml 0.02M的PBS缓冲液组成，提取剂的pH值为7.4。

(2)结果判断

阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。

阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。

四、试纸卡的效果

(1)假阳性率

取经LC-MS/MS确证的阴性牛奶、阴性蜂蜜和阴性猪肉各50份。编号为1#-50#。将样品按照实验三中所述方法处理后分别用试纸卡进行检测，分别计算假阳性率。

结果：在50份阴性猪肉样品测定中，试纸卡检测出阳性样品分别为2份、3份、3份，假阳性率为4％-6％。在50份阴性牛奶样品测定中，试纸卡检测出阳性样品分别为2份、2份、3份，假阳性率为4％-6％。在50份阴性蜂蜜样品测定中，试纸卡检测出阳性样品分别为1份、3份、3份，假阳性率为2％-6％。

(2)假阴性率

取经LC-MS/MS确证的阴性牛奶、阴性蜂蜜和阴性猪肉样品各110份，分别按规定的检测限浓度进行添加环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)、达氟沙星(DAN)、氟甲喹(FLU)、噁喹酸(OXO)、麻保沙星(MAR)、氨氟沙星(AMI)、培氟沙星(PEF)、依诺沙星(ENO)，每种药物添加各10份。将样品按照实验三中所述方法处理后分别用试纸卡进行检测，分别计算假阴性率。

结果：在110份阳性猪肉样品测定中，试纸卡检测出阴性样品为0份，假阴性率为0。在110份阴性牛奶样品测定中，试纸卡检测出阴性样品为0份，假阴性率为0。在110份阴性蜂蜜样品测定中，试纸卡检测出阴性样品为0份，假阴性率为0。

(3)试纸卡保存期

稳定性试验结果表明，本试纸卡在2-8℃或室温条件下阴凉干燥处可保存1年。

序列表

<110>北京维德维康生物技术有限公司

<120>一种喹诺酮药物抗体及其应用

<160>2

<210>1

<211>249

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Gln Val His Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Ala Leu Val Asn Leu Ser

1               5                   10                  15

Ser Leu Ser His Leu Cys Thr Val Leu Arg Leu Phe Ser Ser Thr Ile

            20                  25                  30

Ser Val Glu Ser Tyr Asp His Pro Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn

        35                  40                  45

Lys Leu Glu Trp Met Ala Asn Val Ser Ser Glu His Tyr Ser Ala Tyr

    50                  55                  60

Ile Leu Arg Ile Ser Val Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ser Ser

65                  70                  75                  80

Ala Ile Leu Asn Ser Asp Cys Thr Asn Thr Ala Thr Gln Asn Ser Lys

                85                  90                  95

Val Glu Tyr Phe Ser Ala Arg Ser Gln Ser Arg Asp Thr Ala Lys Ala

            100                 105                 110

Pro Leu Ser Leu Ser Pro Gln Val Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

        115                 120                 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Arg Ser His Ser Phe Leu Ser

    130                 135                 140

Pro Ala Val Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Pro Pro Ser His Thr Gln Asp

145                 150                 155                 160

Asp Ser Pro Leu Pro Phe Gly Arg Phe Phe Gly Thr Asn Arg Asn Gln

                165                 170                 175

Asp Ser His Pro Asp Ser Ser Arg Ser Ile Glu Pro Tyr Arg Ser Asp

            180                 185                 190

Ser Thr Gly Pro Gln Val Gln Trp Gln Trp Val Trp Asp Arg Leu His

        195                 200                 205

Pro Gln His Pro Ser Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Asn Leu Leu Leu

    210                 215                 220

Trp His Gln Ala Tyr Leu Phe Asn Ile Tyr Ile Asp Thr Ile Met Asp

225                 230                 235                 240

Ser Lys Leu Leu Thr Asn Ala Val Glu

                245

<210>2

<211>747

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

caggtgcatc tgctgaagga gggccaccgg gccttggtga acttatcgtc tctgtcccac    60

ctctgcactg tcctgaggct cttctcaagc accataagtg tcgagtcata tgaccaccct    120

tggatccggc aatttccagg aaacaaactg gagtggatgg ccaatgtgtc ctcagaacat    180

tactccgcgt acatactccg aatctctgtc agtcgagaca catccaagaa ccagtcttct    240

gcaattctga attctgactg tacgaacaca gccacacaaa atagtaaggt tgaatacttc    300

tctgcaagat ctcaatcaag agatacggcc aaggcaccac tctcactgtc tcctcaggtg    360

gcgggtggcg gcggtagcgg cggtggcggt tctggaggcg gcggttcttg cagatcacac    420

agtttcctgt cccctgctgt atatctggca ctgggagggc caccatctca tacgcaggat    480

gatagtcctt tgccctttgg tcgattcttt ggaaccaaca gaaaccagga cagccaccca    540

gactcctcgc gatctataga gccctacaga tcggacagta cgggtcccca ggttcagtgg    600

cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct gtggaggagg aggatgctgc    660

aacctattac tgtggcatca ggcctatcta ttcaacattt atatcgatac tattatggac    720

tccaagttac tcacgaatgc tgtcgag                                        747

Claims (14)

1.一种单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-121位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第137-249位氨基酸残基所示；所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第122-136位氨基酸残基所示。

2.权利要求1所述单链抗体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

8.权利要求1所述单链抗体在检测喹诺酮药物中的应用，所述喹诺酮药物为如下中的至少一种：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星。

9.一种检测喹诺酮药物的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试剂盒：

1)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1所述单链抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；

2)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原的酶标记物、权利要求1所述单链抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；

3)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原的酶标记物、权利要求1所述单链抗体；其中，权利要求1所述单链抗体作为包被原；

4)试剂盒中包括喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1所述单链抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。

10.根据权利要求9所述的免疫试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒中包括喹诺酮药物标准品溶液、洗涤液和样品浓缩液；所述喹诺酮药物标准品为环丙沙星；

所述喹诺酮药物标准品溶液为如下各浓度的溶液0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L；

每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20，5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005M-0.015M，pH值为7.2-7.6；

所述样品浓缩液为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备的：将每0.1mmol喹诺酮药物半抗原和0.12mmolNHS溶解在2mL DMF和HCl的混合溶液中，DMF和HCl的混合溶液中DMF与HCl的体积比为1∶1，磁力搅拌，得到溶液Ⅰ；向所述溶液Ⅰ中滴加1mL DCC和DMF的混合溶液，DCC和DMF的混合溶液中DCC的浓度为0.15mmol/ml，25℃搅拌1h，4℃冰箱搅拌12h，离心，取上清液；将所述上清液逐滴加到5mL载体蛋白的溶液中，25℃搅拌0.5h，透析，得到所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物；所述载体蛋白的溶液按照如下方法制备：用pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的碳酸缓冲液将45mg载体蛋白溶解，并定容至5ml，得到所述载体蛋白的溶液；

所述喹诺酮药物半抗原为环丙沙星；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；

所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。

11.根据权利要求10所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述洗涤液的所述配制方法中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.4。

12.根据权利要求10所述的免疫试剂盒，其特征在于：所述样品浓缩液为浓度为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液。

13.一种检测喹诺酮药物的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的权利要求1所述单链抗体；所述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有权利要求10中所述喹诺酮药物半抗原与载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。

14.一种检测样品中喹诺酮药物的方法，包括如下步骤：

1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；

2)用权利要求13所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；

所述前处理的方法为下述b)和c)中的任一：

b)所述待测样品为畜禽的肉、畜禽的肝脏或水产；将每1g所述待测样品的匀浆组织与4mL 0.02M、pH 7.4的PBS缓冲液混合均匀，3000转离心5min，取上清液，即为待测样本溶液；

c)所述待测样品为蜂蜜；将蜂蜜与提取剂混合，得到的混合溶液为待测样本溶液；具体为：将每1g蜂蜜与4mL提取剂混合均匀，得到的混合溶液即为待测样本溶液；每1升所述提取剂由5ml Tween-20和995ml 0.02M的PBS缓冲液组成，提取剂的pH值为7.4；

所述喹诺酮药物为如下中的至少一种：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、麻保沙星、氨氟沙星、培氟沙星和依诺沙星。

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