CN102680711A - 与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与四环素结合的蛋白TetR（又称TetR蛋白）在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试剂盒或检测四环素类抗生素的试纸条。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在四环素类抗生素的检测中将发挥重大作用。

Description

与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用

技术领域

本发明涉及与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用。

背景技术

四环素类抗生素（tetracycline antibiotics)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素（chlotetracycline)、土霉素（oxytetracycline）、四环素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。

四环素类抗生素具有如下应用：作为预防和治疗畜禽疾病的兽药，作为促进畜禽生长的饲料添加剂，在水产养殖业中用于治疗多种鱼类疾病，在乳业中用于提高奶牛产奶量，在养蜂业中用于预防蜜蜂的感染性疾病。四环素类抗生素过量使用不可避免的使母体、代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，影响人体健康。

鉴于抗生素的作用与危害并存，动物性食品中四环素族抗生素的残留问题受到关注，各国制定了动物源性食品中兽药最高残留标准和检测方法。我国2002年农业部发布的235公告中规定土霉素/金霉素/四环素在所有动物性食品的肌肉中的含量不得高于100μg/kg，在牛奶及羊奶中的含量也不能超过100μg/kg。

发明内容

本发明的目的是提供与四环素结合的蛋白TetR（又称TetR蛋白）在检测四环素类抗生素中的应用。

本发明公开了TetR蛋白在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质。

所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试剂盒。

本发明还保护一种检测四环素类抗生素的试剂盒，包括所述TetR蛋白（包被原）。

所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物显色液和终止液中的至少一种。

每1升洗涤液可按照如下方法配制得到：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到洗涤液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7.2-7.6、0.005M-0.015M的磷酸盐缓冲液，具体可为的浓度可为pH7.4、0.01M）的磷酸钠缓冲液。

所述样品稀释液可为pH7.2、0.1M的PBS缓冲液。

所述底物显色液包括显色液A和显色液B，可为独立包装的显色液A和显色液B，也可直接将显色液A和显色液B等体积混合得到。所述显色液可为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液；所述显色液B可为邻苯二胺（OPD）溶液或四甲基联苯胺（TMB）溶液。所述显色液A具体可为2％（g/100ml）过氧化脲水溶液。所述显色液B具体可为1％（g/100ml）四甲基联苯胺水溶液。

所述终止液具体可为0.2M硫酸水溶液。

所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试纸条。

本发明还保护一种检测四环素类抗生素的试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的N末端具有His标签的所述TetR蛋白；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有His-tag单克隆抗体；所述包被原为四环素与载体蛋白的偶联物；

所述试纸条上还可具有样品孔，所述样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

所述载体蛋白具体可为卵清白蛋白（OVA）。

以上任一所述TetR蛋白具体可为采用以下方法制备得到的蛋白质：培养重组菌，得到所述与四环素结合的蛋白TetR；所述培养过程中加入IPTG作为诱导剂；

所述重组菌为将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。所述重组表达载体具体可为在载体pET28b的多克隆位点插入所述与四环素结合的蛋白TetR的编码基因得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为在载体pET28b的NdeI和XhoI酶切位点之间插入所述编码基因得到的重组质粒。

所述编码基因具体可为如下1）-4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表中序列2自5’末端第4至624位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述重组菌更具体可为LYP-BLR（又称重组菌LYP-BLR-6）。LYP-BLR属于大肠埃希氏菌（Escherichia coli)，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5759。

所述方法中，在培养体系的OD₆₀₀为0.6时，加入所述IPTG，使IPTG在所培养体系中的浓度为1mM。

以上任一所述四环素类抗生素具体可为具有并四苯骨架的化合物。以上任一所述四环素类抗生素具体可为四环素、土霉素、金霉素或强力霉素。

本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在四环素类抗生素的检测中将发挥重大作用。

附图说明

图1为实施例5的步骤三得到的标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

载体pET28b购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69865。大肠杆菌BL21(DE3)购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69387。T4DNALigase购自美国Promega公司，产品目录号为M1801S。辣根过氧化物酶（HRP）购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。载体PMD19-T购自TAKARA公司，产品目录号为D102A。His-tag单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠抗体购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号分别为AB102-02和SA101-01。

四环素：购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为87128，结构见式（Ⅰ）。

土霉素：购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为O5875，结构见式（Ⅱ）。

金霉素：购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为C4881，结构见式（Ⅲ）。

强力霉素：购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为44577，结构见式（Ⅳ）。

米诺环素购自百灵威生物技术有限公司，货号13614-98-7。新霉素、青霉素G、链霉素，均购自中监所。

pH7.0、0.05M的PBS缓冲液：先分别配置0.05mol/L Na₂HPO₄溶液（称取Na₂HPO₄·12H₂O 17.9g，加去离子水至1000mL）和0.05mol/L KH₂P0₄溶液（称取KH₂P0₄·2H₂O8.6g，加去离子水至1000mL）；取0.05mol/L Na₂HPO₄溶液60mL和0.05mol/L KH₂P0₄溶液40mL，加入8.5g NaCL，混匀。

pH7.2、0.1M的PBS缓冲液：先分别配置0.1mol/L Na₂HPO₄溶液（称取Na₂HPO₄·12H₂O35.8g，加去离子水至1000mL）和0.1mol/L NaH₂P0₄溶液（称取NaH₂P0₄·2H₂O 15.6g，加去离子水至1000mL）；取0.1mol/L Na₂HPO₄溶液72mL和0.1mol/L NaH₂P0₄溶液28mL，加入8.5gNaCL，混匀。

pH7.2、0.02M的PBS缓冲液：取pH7.2、0.1M的PBS缓冲液200mL，加入去离子水800mL，混匀。

pH7.4、0.01M的PBS缓冲液：将8g NaCl、0.2g KCl、3.53g Na₂HPO₄·12H₂O、0.24gKH₂PO₄和水混合，用去离子水定容至1000mL。

pH9.6、0.05M的碳酸钠水溶液：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，用去离子水定容至1升。

LB液体培养基：由0.5%（质量百分含量）酵母提取物、1%（质量百分含量）蛋白胨、1%（质量百分含量）NaCl和水组成。

binding buffer：将20mmol Tris、0.5mol NaCl和10mmol咪唑用水溶解，用HCl调pH值至8.0，再用水定容至1L。

wash buffer：将20mmol Tris、0.5mol NaC1和20mmol咪唑用水溶解，用HCl调pH值至8.0，再用水定容至1L。

elution buffer：将20mmol Tris、0.5mol NaCl和500mmol咪唑用水溶解，用HCl调pH值至8.0，再用水定容至1L。

实施例1、四环素受体蛋白及其编码基因的发现

携带四环素耐药基因(tetB)及其调控基因(tetR)的大肠杆菌（Escherichiacoli）来源于农业部畜禽产品质量监督检验测试中心微生物检测实验室，编号为LYP-20。大肠杆菌LYP-20菌株由病原菌例行监测获得，分离自山东种猪养殖场。

从LYP-20菌中发现一个可以与四环素特异结合的新蛋白（四环素受体蛋白）及其编码基因。

将序列表的序列1所示蛋白质命名为TetR蛋白（预期分子量约23kDa）。将TetR蛋白的编码基因命名为TetR基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例2、重组菌和对照菌的构建

一、重组质粒的构建

1、人工合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物（约633bp）。

F1：5’-TTGCTAGCTCTAGATTAGATAAAAGTAAAG-3’（下划线标注NheI酶切识别序列）；

R1：5’-TTCTCGAGTTAAGACCCACTTTCACATTTA-3’（下划线标注XhoI酶切识别序列）。

3、用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体pET28b，回收载体骨架（约5300bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET28b-TetR。根据测序结果，对重组质粒pET28b-TetR进行结构描述如下：在载体pET28b的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第4至624位核苷酸所示的DNA片段，该DNA片段的5’端与载体pET28b上的组氨酸标签的3’端连接，形成融合基因（表达N末端具有His标签的TetR蛋白）。

二、重组菌的构建

将重组质粒pET28b-TetR导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到8株重组菌，依次命名为重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8。

三、对照菌的构建

将载体pET28b导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，命名为重组菌BL21-pET28b。

实施例3、TetR蛋白的制备与纯化

一、蛋白粗提液的制备

本步骤中的菌液指的是培养容器内的所有物质，包括菌体和上清。

将重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7、重组菌LYP-BLR-8和重组菌BL21-pET28b分别进行以下平行处理：

1、将菌株接种至2mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养8小时，得到种子液。

2、将1mL步骤1的种子液接种于200mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.6；先取出1mL菌液作为未诱导对照，其余菌液加入IPTG（诱导剂）至终浓度为1mM，30℃、200pm振荡培养6小时。

3、收集步骤3的菌液，在4℃下10000rpm离心5min，收集菌体。

4、用Tris-HCl缓冲液(pH7.0，10mM)重悬菌体，然后进行冰浴超声（200W，超声10s，停10s）以破碎菌体直至悬液变澄清，然后4℃、12000×g离心20min，收集上清液，即为蛋白粗提液。

二、SDS-PAGE检测

将步骤一得到的蛋白粗提液进行10％SDS-PAGE检测。

结果表明：重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8的诱导后菌液中均含有23kD左右有明显的条带，与目的蛋白的预期大小一致，TetR蛋白（蛋白的N末端具有His标签）表达成功；重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8的诱导前菌液中均未含有该23kD左右的条带；重组菌BL21-pET28b的诱导前菌液和诱导后菌液中均不含有该23kD左右的条带。

三、TetR蛋白的纯化

分别将步骤一中重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8得到的蛋白粗提液进行镍离子亲和层析，利用组氨酸标签（His-tag）纯化TetR蛋白。

镍离子亲和层析采用的

Columns购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为70971。先用10倍柱体积的binding buffer平衡

Columns；然后加入蛋白粗提液；然后用5倍柱体积的wash buffer进行洗脱（洗脱杂蛋白）；最后用10倍柱体积的elution buffer进行洗脱（洗脱目标蛋白），流速为1ml/min，收集保留时间为5-10min的过柱后洗脱液；将过柱后洗脱液进行透析，得到TetR蛋白液。

四、TetR蛋白的验证

1、将步骤三得到的TetR蛋白液进行10％SDS-PAGE检测。结果表明：重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8的蛋白粗提液经过镍离子亲和层析纯化后均得到了高纯度的TetR蛋白。

2、Western blot验证

将步骤三得到的TetR蛋白进行10％SDS-PAGE，然后进行Western blot（采用的一抗为His-tag单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体）并DAB显色。

重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8得到的TetR蛋白液均为阳性结果。

五、蛋白产量检测

将步骤三得到的TetR蛋白液用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。重组菌LYP-BLR-1、重组菌LYP-BLR-2、重组菌LYP-BLR-3、重组菌LYP-BLR-4、重组菌LYP-BLR-5、重组菌LYP-BLR-6、重组菌LYP-BLR-7和重组菌LYP-BLR-8得到的TetR蛋白液中的蛋白含量依次为1.27mg、1.36mg、1.11mg、2.02mg、2.24mg、2.43mg、1.87mg和2.08mg。重组菌LYP-BLR-6生产TetR蛋白的能力最高。

六、重组菌的保藏

重复进行三次如下步骤：将重组菌LYP-BLR-6依次进行步骤一和步骤三，然后用BCA蛋白定量试剂盒测定TetR蛋白液中的蛋白含量。3次结果分别为2.48mg、2.54mg、2.55mg，表明重组菌LYP-BLR-6生产TetR蛋白的稳定性好。

将重组菌LYP-BLR-6命名为LYP-BLR。LYP-BLR属于大肠埃希氏菌（Escherichiacoli)，已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5759。

实施例4、重组菌株的保存

从转化平板中挑取LYP-BLR单克隆菌落，加入2mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，培养4小时至菌液略呈混浊；在含30μg/mL卡那霉素的平板上划线，37℃培养20h；取单克隆菌落，接种入2ml含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀达到0.5；将0.9ml的菌液与0.1ml 80％甘油混和，存于-70℃冰箱中。

80％甘油的配制：取8mL甘油与2mL去离子水混合均匀，分装于冻存管中，每管0.1mL，121℃灭菌20min。

实施例5、检测四环素类抗生素的试剂盒及其应用

一、制备HRP标记的四环素（用羰基二咪唑法将四环素偶联于HRP上）

1、将20mg四环素溶于2mL无水丙酮，然后加入22mg N'N-羰基二咪唑，密闭反应4h后旋转蒸干丙酮，将残留物用1ml DMSO溶解，即为活化四环素溶液。

2、将30mg HRP溶于4ml硼酸钠缓冲液（pH8.5，0.05M），冰浴中将活化四环素溶液逐滴加入，室温搅拌反应48h，用pH7.0、0.05M的PBS缓冲液透析。

二、试剂盒的制备

试剂盒包括如下组件：

1、包被有TetR蛋白的酶标板

将实施例3中重组菌LYP-BLR-6步骤三得到的TetR蛋白液冻干，得到TetR蛋白；将TetR蛋白用包被缓冲液（pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠水溶液）配置成1μg/mL的溶液，即为包被液；取96孔聚苯乙烯酶标板，每孔加入100μL包被液，4℃放置过夜；倾去包被液，用洗涤液洗涤1次，拍干；然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

每1升所述封闭液按照如下方法配制：将5ml马血清、1g叠氮化钠和30g酪蛋白用pH7.2、0.02M的PBS缓冲液缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液。

2、酶标物工作液：将HRP标记的四环素用样品稀释液调整浓度，使其浓度为1μg/mL。

3、底物显色液：由A液和B液等体积混合而成，A液为2％（g/100ml）过氧化脲水溶液，B液为1％（g/100ml）四甲基联苯胺水溶液。

4、终止液：0.2M硫酸水溶液。

5、洗涤液：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml pH7.4、0.01M的PBS缓冲液混合，得到洗涤液。

6、样品稀释液：pH7.2、0.1M的PBS缓冲液。

7、封闭液：将50mg BSA、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合，用pH7.2、0.02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液。

8、四环素标准品：将四环素用含5g/100mL BSA的pH 7.4、0.01M PBS缓冲液配制成浓度为8.1μg/L的母液，每冻干瓶分装1mL，置于冻干机中冻干，密封后4℃保存。

三、用试剂盒检测四环素的灵敏度

采用步骤二制备的试剂盒检测四环素，具体步骤如下：

1、标准品溶液的配制

将四环素标准品用样品稀释液进行梯度稀释，分别得到如下浓度的四环素标准品溶液：8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L。

样品稀释液作为四环素浓度为0μg/L的标准品溶液（0标准）。

2、向包被有TetR蛋白的酶标板中加入四环素标准品溶液（每孔50μL），再加入酶标物工作液（每孔50μL），用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，甩干孔中液体。

3、每孔加入260μL洗涤液，30s后倒出孔中液体；如此重复操作共洗板4次；用吸水纸拍干。

4、每孔加入100μL底物显色液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10min。

5、每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值（OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长）。

用每个浓度的四环素标准品溶液的吸光度平均值（B）除以第一个0浓度溶液的吸光度值（B₀）再乘以100％，得到百分吸光度值。实验设3次重复，结果取平均值。以四环素浓度（μg/L）的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图（见图1）。该标准曲线的函数关系式为y=-18.95Ln^(x）+43.087,R²=0.9918。

四环素的50%抑制浓度（IC₅₀）为0.5μg/L。

四、用试剂盒检测四环素的特异性

1、将四环素类抗生素（四环素、土霉素、强力霉素或金霉素）用样品稀释液进行梯度稀释，分别得到如下浓度的四环素类抗生素稀释液：8.1μg/L、2.7μg/L、0.9μg/L、0.3μg/L、0.1μg/L。样品稀释液作为0标准溶液。

2、将各个四环素类抗生素稀释液分别进行如下试验：

（1）向包被有TetR蛋白的酶标板中加入四环素类抗生素稀释液（每孔50μL），再加入酶标物工作液（每孔50μL），用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，甩干孔中液体。

（2）每孔加入260μL洗涤液，30s后倒出孔中液体；如此重复操作共洗板4次；用吸水纸拍干。

（3）每孔加入100μL底物显色液，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10min。

（4）每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值（OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长）。

用每个浓度的四环素类抗生素稀释液的吸光度平均值（B）除以0标准溶液的吸光度值（B₀）再乘以100％，得到百分吸光度值。实验设3次重复，结果取平均值。以四环素类抗生素浓度（μg/L）的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制曲线，得到每种四环素类抗生素的50%抑制浓度（IC₅₀）。

各种四环素类抗生素均显示如下结果：吸光度值与每孔所加入的各四环素类抗生素浓度成反比，证明TetR蛋白具有识别多种四环素类抗生素的特性，并呈现线性关系，说明TetR蛋白可用于多种四环素类抗生素的检测。

以四环素为标准药物，计算交叉反应率，即四环素的IC₅₀除以各药物的IC₅₀乘以100%。结果见表2。

结果如表2所示，TetR蛋白可以识别包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等在内的四环素类药物。

表2  四环素类药物的交叉反应率

药物名称	IC50	交叉反应率
			四环素	0.5μg/L	100.0%
土霉素	2.2μg/L	22.3%
			强力霉素	1.1μg/L	47.2%
金霉素	0.49μg/L	102.1%
			米诺环素	16.7μg/L	3.2%
新霉素	无	＜0.1%
			青霉素G	无	＜0.1%
链霉素	无	＜0.1%

五、用试剂盒检测待测样品

1、待测样品的前处理

待测样品为牛奶：取液态奶于离心管中，置于37℃恒温箱中温浴15min，涡动10s，取50μL进行检测；

待测样品为鱼肉或虾肉：将待测样品匀浆处理，得到均质样品，加入三氯乙酸，摇床振摇10min后离心，取上清至新的离心管中按1:1的体积比加入样品稀释液，混匀后再次离心，取上清50μL检测；

待测样品为猪肉或鸡肉：将待测样品匀浆处理，得到均质样品，加入样品提取液（将5mL乙腈与95mL 0.5%三氯乙酸水溶液混合），涡动混匀离心后取上清加入1M NaOH溶液，充分涡动，再加入样品稀释液，离心后取上清50μL检测。

2、用试剂盒检测待测样品的方法

与步骤三基本相同，差异仅在于用前处理得到的待测样本溶液代替标准品溶液。

将百分吸光度值代入标准曲线的函数关系式，即得到样本溶液中四环素类抗生素的残留量。

3、用试剂盒检测待测样品

向不含四环素类抗生素的样品中添加四环素，使四环素标准品在样品中的终浓度分别为10μg/L、20μg/L；将添加后的样品分别按照步骤1中所述方法进行前处理，然后按步骤2的方法进行检测。

从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表3。

回收率（RG）=测定值与真实值的比值×100%；

变异系数（CV）=（各平行样本的标准差与各平行样本平均值的比值）×100%；

批内变异系数（批内CV）=同一次测定中各平行样本的变异系数的平均值。

批间变异系数（批间CV）=同一样本在不同批次测定结果的变异系数的平均值。

结果表明：所有样品的添加回收率在72.2%~97.5%，批内变异系数在6.4%~9.9%，批间变异系数在9.8%~13.0%。

表3  用试剂盒检测待测样品的结果

六、试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、50%抑制浓度、四环素类抗生素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。

实施例6、检测四环素类抗生素的试纸条及其应用

一、试纸条的结构

所述试纸条由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TetR蛋白（蛋白的N末端具有His标签）；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原（包被原为四环素与OVA的偶联物），质控区包被有His-tag单克隆抗体。

样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端的一端。

二、试纸条的制备

1、包被原的制备

用戊二醛法将四环素（半抗原）偶联于卵清白蛋白（OVA）上。

（1）取89mg四环素，溶于20mL pH7.4、0.01M的PBS缓冲液中。

（2）加入20mg戊二醛，室温搅拌反应2h

（3）再加入150mg OVA，4℃搅拌反应24h。

（4）装入透析袋，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液透析，得到四环素与OVA的偶联物。

2、制备胶体金标记的TetR蛋白

①胶体金溶液的制备

取0.01%氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热20min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用去离子水恢复到原体积，2-8℃保存。

②将实施例3中重组菌LYP-BLR-6步骤三得到的TetR蛋白液冻干，得到TetR蛋白，然后用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液溶解得到浓度为1mg/mL的TetR蛋白液。

③金标抗体溶液的制备

用0.1mol/L K₂CO₃水溶液调节胶体金溶液的pH至8.2，然后取10mL加入50mL烧杯中，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入1mL TetR蛋白液，逐滴加入3mL5g/100mLBSA水溶液，持续搅拌10min。

③将金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，取红色上清溶液。

④将步骤③的溶液4℃、11000r/min离心40min，溶液分为三层（透明上清、管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层），将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1g/100mL BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液混悬至原金标抗体溶液的体积，过夜，4℃、11000r/min离心40min，收集沉淀。

⑤用含1g/100mL BSA和0.02g/100mL NaN3的0.01mol/L磷酸盐缓冲液将步骤④的沉淀混悬至原金标抗体溶液的体积的1/40，2-8℃保存。

3、喷金：将步骤（1）得到的混悬液喷到玻璃纤维膜上，制成胶体金垫。

4、喷膜：在反应膜上的T线位置喷上包被原、C线位置喷上His-tag单克隆抗体。

5、组装：将样品吸收垫（纤维素滤膜）、胶体金垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫（吸水纸）按常规方法进行组装，然后切条，将试纸条装入塑料制卡中，形成试纸条（试纸卡）。

三、用试纸条进行检测

（1）样品前处理及检测

样品处理方法参照实施例4的步骤五中样品的前处理方法。

取出试纸卡，开封后平放于桌面，吸取待测液逐滴加入4滴于样品孔中，反应10min判断结果，20min后的结果无效。

（2）结果判断

阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。

阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。

无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸卡均判为无效。

四、试纸条的检测原理

当样品中含有过多的四环素类抗生素时，胶体金标记的四环素结合蛋白完全被样品中的四环素类抗生素结合，所以检测线上的四环素不能与胶体金标记的四环素结合蛋白结合，因此检测线上不显色，检测结果为阳性；当样品中不含有四环类抗生素时，胶体金标记的四环素结合蛋白只与检测线上的四环素结合，因此检测线上显色，检测结果为阴性。

五、试纸条的效果

用LC-MS/MS检测奶样中四环素含量，LC-MS/MS按照GB/T 22990-2008进行。

取经LC-MS/MS确证的阴性奶样（四环素含量小于50ng/ml）100份，取经LC-MS/MS确证的阳性奶样（四环素含量大于等于50ng/ml）100份。将样品分别用试纸卡进行检测，计算假阳性率和假阴性率。

结果：在100份阴性奶样测定中，试纸卡检测出阳性样品5份，假阳性率为5%。在100份阳性奶样测定中，试纸卡检测出阴性样品0份，假阴性率为0%。

六、试纸条保存期

稳定性试验结果表明，本试纸卡在2-8℃或室温条件下阴凉干燥处可保存6个月。

Claims (5)

1.TetR蛋白在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质。

2.TetR蛋白在制备检测四环素类抗生素的试剂盒中的应用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质。

3.一种检测四环素类抗生素的试剂盒，包括TetR蛋白；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质。

4.TetR蛋白在制备检测四环素类抗生素的试纸条中的应用；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质。

5.一种检测四环素类抗生素的试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；

沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连；

所述胶体金垫上包被有胶体金标记的N末端具有Hi s标签的TetR蛋白；所述TetR蛋白是如下（a）或（b）或（c）：（a）由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由（a）衍生的蛋白质；

所述反应膜上有检测区和质控区，检测区和质控区均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有His-tag单克隆抗体；所述包被原为四环素与载体蛋白的偶联物。

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