BR112012030535B1 - Método para detectar um componente da parede celular de levedura - Google Patents
Método para detectar um componente da parede celular de levedura Download PDFInfo
- Publication number
- BR112012030535B1 BR112012030535B1 BR112012030535-2A BR112012030535A BR112012030535B1 BR 112012030535 B1 BR112012030535 B1 BR 112012030535B1 BR 112012030535 A BR112012030535 A BR 112012030535A BR 112012030535 B1 BR112012030535 B1 BR 112012030535B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- glucan
- feed
- yeast
- sample
- mycosorb
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 91
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 claims description 92
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 claims description 88
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 86
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 84
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 84
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 44
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 25
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 22
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 14
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 7
- 239000004459 forage Substances 0.000 claims description 5
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 70
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 135
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 106
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 105
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 103
- 239000000463 material Substances 0.000 description 91
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 55
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 51
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 44
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 41
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 37
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 37
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 33
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 32
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 28
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 26
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 25
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 24
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 24
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 24
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 24
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 24
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 21
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 21
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 19
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 16
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 16
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 16
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 16
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 15
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 14
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- -1 variants Substances 0.000 description 13
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 12
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 12
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 12
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 11
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 11
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 11
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 11
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 9
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 9
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3s,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N 0.000 description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 8
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 7
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 4
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 4
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 4
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001234 nutrigenomic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101100102516 Clonostachys rogersoniana vern gene Proteins 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 2
- 241000006364 Torula Species 0.000 description 2
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N alpha-D-glucose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DVKNGEFBSA-N 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 2
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 2
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 125000002353 D-glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001047 Dixon's Q test Methods 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 241001598113 Laminaria digitata Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235072 Saccharomyces bayanus Species 0.000 description 1
- 241001326564 Saccharomycotina Species 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N Selenium-L-methionine Chemical compound C[Se]CC[C@H](N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N Selenomethionine Natural products C[Se]CCC(N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074686 Selenoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008114 Selenoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004993 binary fission Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000009838 combustion analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005496 eutectics Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000004463 hay Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012125 lateral flow test Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000020939 nutritional additive Nutrition 0.000 description 1
- 235000003715 nutritional status Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003227 pyridoxines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000013432 robust analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 125000003748 selenium group Chemical group *[Se]* 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960002718 selenomethionine Drugs 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 229940100445 wheat starch Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56961—Plant cells or fungi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
- G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
- G01N2333/395—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
- G01N2400/14—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar alpha-D-Glucans, i.e. having alpha 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. pullulan
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
- G01N2400/24—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar beta-D-Glucans, i.e. having beta 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. xanthan
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
componentes de parede celular de levedura e detecção dos mesmos a presente invenção refere-se a aditivos de alimentação animal e detecção do mesmo em produtos de alimentação. adicionalmente, a presente invenção refere-se a componentes de parede celular de levedura, seus métodos de isolamento, e composições e métodos para a detecção imunológica do mesmo.
Description
[0001] Este Pedido reivindica prioridade a Pedido de Patente Pro visório dos Estados Unidos No. De Série 61/334.995 depositado em 14 de maio de 2010, aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0002] Esta invenção refere-se a aditivos de alimentação animal e detecção em produtos de alimentação. Adicionalmente, a invenção refere-se a componentes de parede celular de levedura, seus métodos de isolamento, e composições e métodos para a detecção imunológica dos mesmos.
[0003] No campo de nutrição animal, uma ampla variedade de adi tivos e suplementos foram empregados para melhorar desempenho de gado. Em alguns casos, componentes de parede celular de levedura encontram uso como aditivos de alimentação animal. Um exemplo é o aditivo de alimentação MYCOSORB(fabricado por ALLTECH, Inc.). MYCOSORB liga contaminantes de micotoxina em alimento e alimentação, desse modo isolando as micotoxinas em um estado indigerível. Tais contaminantes de micotoxina geralmente ocorrem devido igualmente a crescimento fúngico de campo e pós-coleita em grãos, subprodutos de grão, e silagem de milho usado como componentes de carga de alimentação. Enquanto componentes de alimentação crus e acabados vendidos comercialmente sofrem monitoramento requerido para micotoxinas, nenhum sistema de monitoramento é 100% eficaz. Mundialmente, é estimado que aproximadamente 25% de todas as colheitas são afetadas por contaminação de micotoxina (Council for Agricultural Science and Technology (1989) “Mycotoxins: Economics e Health Risks”, Task Force Report No. 116, Ames, IA), e incidências onde materiais contaminados entram na cadeia de fornecimento de alimentação de gado e animal de companhia são portanto quase inevitáveis. Consequências de consumo de gado de alimentação contaminada por micotoxina incluem apetite diminuído, crescimento reduzido, função reprodutora reduzida e produção de leite, sistema imune su- presso, digestão prejudicada, e em casos severos morte. Portanto, sequestro de micotoxina provou ser uma estratégia útil para reduzir os perigos de toxinas de ocorrência natural que adversamente afetam saúde do animal e humana.
[0004] Desenvolvimento de métodos analíticos robustos, específi cos e kits para detecção qualitativa e quantitativa de aditivos de alimentação é complicado pela presença de muitos compostos de interferência, e pela concentração relativamente baixa de aditivos de alimentação usados em, alimentação pronta para consumo animal.
[0005] A presente invenção refere-se a aditivos de alimentação animal e detecção dos mesmos em produtos de alimentação. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a componentes de parede celular de levedura, seus métodos de isolamento, e composições e métodos para a detecção imunológica dos mesmos. Em algumas modalidades, um método de detectar um componente de parede celular de levedura e/ou fragmento do mesmo em uma amostra (por exemplo, amostras de alimentação, amostras de alimento, ou estratos dos mesmos) é fornecido. Um tal método encontra uso, por exemplo, determinando a presença de aditivos de alimentação e alimento compreendido de componentes de parede celular de levedura (por exemplo, glucano de levedura, (1-4)-«-Dglucano de levedura, (1-6)-β- Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, Aditivo de alimentação MYCOSORB, Aditivo de alimentação BIOMOSS, aditivo de alimentação ACTIGEN, e similar) em produtos de alimenta- ção (por exemplo, alimentação de gado, alimentação de animal de companhia, ou intermediários industriais dos mesmos). Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a métodos para extrair componentes de parede celular de levedura (por exemplo, glucano de levedura, (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, aditivo de alimentação MYCOSORB, e similar) de produtos de alimentação (por exemplo, alimentação de gado, alimentação de animal de companhia, ou intermediários industriais dos mesmos). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece antígenos que encontram uso elevando-se anticorpos para componentes de parede celular de levedura específicos (por exemplo, (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, e/ou conjugados dos mesmos). Em modalidades preferidas, tais antígenos são conjugados em um veículo, por exemplo, um veículo de proteína (por exemplo, albumina de soro bovino (BSA)). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para ativação de carboidratos (por exemplo, carboidratos compreendendo anéis de glucopiranose, glucanos, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura) na(s) posição(ões) C6OH. Em algumas modalidades, tal ativação compreende oxidação moderada (por exemplo, usando dimetilsulfóxido/anidrido acético). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos capazes de antígenos de parede de célula de levedura (por exemplo, anticorpos monoclonais ou policlonais capazes de reconhecer (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β- Dglucano de levedura, ou conjugados dos mesmos; anticorpos mono- clonais 513A161.1 ou 513A431.1 elevado contra antígeno de (1-4)-α- Dglucano/(1,6)-β-Dglucano/BSA; anticorpos policlonais elevados contra antígeno de (1-4)-α-Dglucano/(1-6)-β-Dglucano/BSA; ou formas purificadas, diluídas, conjugadas, e/ou mono-específicas dos mesmos). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece kitscompreendendo reagentes para a detecção de componentes de parede celular de levedura (por exemplo, glucano de levedura, (1-4)-«-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β- Dglucano de levedura, aditivo de alimentação MYCOSORB, e similar) em amostras (por exemplo, amostras de alimentação, amostras de alimento, ou extratos das mesmas).
[0006] A presente invenção não está limitada pelo tipo ou natureza da amostra usadas para análise. Em algumas modalidades preferidas, a amostra é ou está derivada de um produto de alimentação ou alimento. Um produto de alimentação ou alimento compreende quaisquer material(is) que são consumidos (por exemplo, por um animal) que contribuem energia e/ou nutrientes à dieta. Exemplos de gêneros alimentícios incluem, porém não são limitados a, Ração Misturada Total (TMR), forragem(ns), pelota(s), concentrado(s), pré-mistura(s) co- produto(s), grão(s), grão(s) destilador(es), melados, fibra(s), alimenta- dor(es) de gado, capim, forragem, semente(s), folhas, farinha, solú- vel(is), e suplemento(s). Alimentação e gêneros alimentícios não são limitados por sua forma física. Alimentação e gêneros alimentícios podem ser processados em tamanho de partícula menor (por exemplo, lascado, cortado, fundamentado, moído, ou similar); feito na forma lí-quida (por exemplo, extraído, fervido, concentrado, convertido a xarope ou outra forma viscosa); ou processado em tamanho maior (por exemplo, embalado, consolidado, comprimido, ou formado em formas compostas, por exemplo, pelotas, blocos, quadrados, flocos, e similar).
[0007] A presente invenção não está limitada pelo tipo ou natureza de método de extração usado para obter amostras para análise. Em algumas modalidades, material original a ser analisado (por exemplo, um produto de alimentação ou alimento; um gênero alimentício) é submetido a uma técnica de extração para obter uma amostra para análise. Técnicas de extração incluem porém não são limitadas a extração de ácido, extração de álcali, extração com solvente orgânico, extração com tampão, extração com sal, extração com detergente, extração física (por exemplo, extração por ebulição, a vapor, extração de baixa temperatura, moagem, e similar), ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, material a ser analisado (por exemplo, um produto de alimentação ou alimento; um gênero alimentício) é extraído usando uma combinação de solvente orgânico e solução de ácido. Em algumas modalidades, material a ser analisado (por exemplo, um produto de alimentação ou alimento; um gênero alimentício) é extraído usando uma solução de dimetilsulfóxido (DMSO) e ácido clorídrico (HCl).
[0008] A presente invenção não é limitada pela quantidade de ana lisado (por exemplo, antígeno, componente de parede celular de levedura, glucano de levedura, (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β- Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, aditivo de alimentação MYCOSORB, e similar) presente na amostra original. A quantidade de analisado pode ser menor do que 0,005 mg, 0,005-0,05 mg, 0,05-0,5 mg, 0,5-1 mg, 1-5 mg, 5-10 mg, 10-25 mg, 25 mg ou mais. A presente invenção não está limitada pela quantidade de analisado (por exemplo, antígeno, componente de parede celular de levedura, glucano de levedura, (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)- β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, aditivo de alimentação MYCOSORB, e similar) presente no material original a ser testado. A quantidade de analisado detectada pode ser menor do que 0,05 kg por tonelada, 0,05-0,5 kg por tonelada, 0,5-1 kg por tonelada, 1,0-2,0 kg por tonelada, 2,0-3,0 kg por tonelada, 3,0-4,0 kg por tonelada, 4,0-5,0 kg por tonelada, 5,0-6,0 kg por tonelada, 6,0-10,0 kg por tonelada, 10 kg por tonelada ou mais.
[0009] A presente invenção não está limitada pela concentração de trabalho de anticorpos usados para detectar um analisado (por exemplo, antígeno, componente de parede celular de levedura, glucano de levedura, (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, aditivo de alimentação MYCOSORB, e similar). A diluição de trabalho dos anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais ou policlonais capazes de reconhecer (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)- α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, ou conjugados dos mesmos; anticorpos monoclonais 513A161.1 ou 513A431.1 elevados contra antígeno (1-4)-α-Dglucano/(1-6)-β-Dglucano/BSA; anticorpos policlonais elevados contra antígeno (1-4)-α-Dglucano/(1-6)-β-Dglucano/BSA; ou formas purificadas, diluídas, conjugadas e/ou mono-específicas dos mesmos) pode ser mais diluída do que 1:100.000; 1:50.000 a 1:100.000; 1:20.000 a 1:50.000; 1:10.000 a 1:20.000; 1:5.000 a 1:10.000; 1:1.000 a 1:5.000; 1:500 a 1:1.000; 1:100 a 1:500; 1:50 a 1:100; 1:10-1:50; 1:1 a 1:10; 2:1 a 1:1; ou mais concentrada do que 2:1.
[00010] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo componentes de parede celular de levedura. Em algumas modalidades um componente de parede celular de levedura compreende glucano de levedura. Em algumasmodalidades, o glucano compreende (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura, ou conjugados ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura conjugados em um veículo (por exemplo, um veículo de proteína). Veículos podem facilitar imunogenicidade e/ou estabilidade no animal hospedeiro. Exemplos de veículos incluem porém não são limitados a albumina de soro bovino (BSA), hemocianina de lapa (KLH), ovalbumina (OVA), tiroglobulina bovina (THY), e antígeno de núcleo de hepatite B de pato (DHBcAg) (Gathuru e outro (2005) Vaccine 23:4727-4733). A presente invenção não está limitada pela posição de ligação entre o antígeno e a um veículo. Em algumas modalidades preferidas, o antígeno (por exemplo, antígeno de carboidrato, glucano, carboidrato compreendendo anel(is) de glucopiranose, (1-4)-α-Dglucano de levedura, (1-6)-β-Dglucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-Dglucano de levedura) é conjugado a um veículo em uma ou mais posição(ões) O6 com respeito ao antíge- no. Em algumas modalidades, o antígeno é (1-4)-α-/(1-6)-β- Dglucano de levedura conjugado a BSA em uma posição C6.
[00011] Anticorpos da presente invenção não são limitados pelas espécies hospedeiras em que eles são elevados. Espécies hospedeiras podem ser rato, camundongo, cobaia, hamster, coelho, cabra, ovelha, galinha, burro, cavalo, bovino, canino, felino, porcino, símio, humano, ou qualquer outra espécie. Anticorpos da presente invenção não são limitados pelo regime de inoculação, método de preparação de antígeno, ou método de liberação de antígeno para elevar os anticorpos.Antígeno pode ser apresentado na presença ou ausência de agentes imune-estimulantes (por exemplo, adjuvantes), tampões, sais, solventes, compostos de realce de solubilidade, ou similar. As espécies hospedeiras podem ser imunizadas com o antígeno uma vez; duas vezes; três vezes; quatro vezes; cinco vezes, 5-10 vezes; 10-20 vezes; ou mais de 20 vezes. Anticorpos da presente invenção não são limitados por clonalidade (por exemplo, monoclonal, policlonal). Anticorpos podem ser utilizados na forma crua ou purificada. Anticorpos podem ser poli-específicos ou mono-específicos. Em modalidades preferidas, anticorpos são capazes de reconhecimento específico do antí- geno usado para elevá-los. Em algumas modalidades preferidas, anticorpos da presente invenção são capazes de reconhecimento específico de (1-4)-a-D-glucano/(1-6)-β-D-glucano extraído de paredes celulares de levedura (por exemplo, Saccharomyces Cerevisiae). Em algumas modalidades preferidas, anticorpos da presente invenção compreendem anticorpos policlonais. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais ou policlonais capazes de reconhecer (1-4)-α-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D- glucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos. Em algumas modalidades,composições de anticorpo da presente invenção ligam-se a parede celular de levedura (1-4)-α-D-glucano, porém não porções contendo (1-4)-α-D-glucano presentes em substâncias diferentes de parede celular de levedura, polímeros contendo (1-4)-a-D-glucano (por exemplo, parede celular de levedura (1-4)-a-D-glucano, parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos). Em algumas modalidades, composições de anticorpo da presente invenção ligam-se à parede celular de levedura (1-6)-β-D-glucano, porém não à porções contendo (1-6)-β-D-glucano presentes em substâncias diferentes de parede celular de levedura, polímeros contendo (1-6)-β-D-glucano (por exemplo, parede celular de levedura (1-6)-β-D-glucano, parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos). Em algumas modalidades, composições de anticorpo da presente invenção ligam-se à parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano, porém não à porções contendo (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano presentes em substâncias diferentes de parede celular de levedura (por exemplo, parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos).
[00012] Alguns métodos de detecção de antígeno da presente invenção compreendem métodos de imunodetecção. Em algumas modalidades preferidas, métodos de imunodetecção compreendem ELISA. Em algumas modalidades, um ELISA é conduzido usando uma amostra derivada de um material original a ser analisado (por exemplo, um produto de alimentação ou alimento; um gênero alimentício; um extrato dos mesmos) e um anticorpo primário (por exemplo, um anticorpo capaz de reconhecer um componente de parede celular de levedura; um anticorpo capaz de reconhecer um glucano de levedura; um anticorpo capaz de reconhecer (1-4)-«-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, e/ou (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura). Em algumas modalidades, o anticorpo é diretamente ligado a uma substância capaz de gerar um sinal detectável (por exemplo, uma substância cromogênica, uma substância fluorogênica, um isótopo radiorrotulado, etc.). Em algumas modalidades, o anticorpo diretamente ou indiretamente associa-se com outro agente capaz de gerar um sinal detectável (por exemplo, uma substância cromogênica, uma substância fluorogênica, um rádio rótulo, um isótopo, etc.).
[00013] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece kits para a detecção de um analisado (por exemplo, um antígeno, um componente de parede celular de levedura, um glucano de levedura, (1-4)-a-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, e/ou (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura) em uma amostra (por exemplo, um produto de alimentação ou alimento, um gênero alimentício, um extrato dos mesmos). Componentes de kits podem incluir, porém não são limitados a, reagentes, tampões de extração, solventes, detergentes, agentes de bloqueio, tubos, anticorpos, padrões, instruções, e quaisquer combinações dos mesmos.
[00014] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece serviços em que informação a cerca da concentração de um analisado (por exemplo, um antígeno, um componente de parede celular de levedura, um glucano de levedura, (1-4)-a-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, e/ou (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura) é obtida para um material original a ser analisado (por exemplo, um produto de alimentação ou alimento, um gênero alimentício, um extrato dos mesmos). Em algumas modalidades, a análise é conduzida por um usuário final (por exemplo, um fazendeiro, um dono de gado, manipulador de gado, um criador de gado, um dono de animal de companhia, um manipulador de animal de companhia, um criador de animal de companhia, um veterinário, um fabricante de produto de alimento ou alimentação, um distribuidor produto de alimento ou alimentação, funcionário regulador). Em algumas modalidades, amostra ou material original é submetido a um terceiro por um usuário final (por exemplo, um fazendeiro, um dono de gado, um manipulador de gado, um criador de gado, um dono de animal de companhia, um manipulador de animal de companhia, um criador de animal de companhia, um veterinário, um fabricante de produto de alimento ou alimentação, um distribuidor de produto de alimento ou alimentação, funcionário regulador) e o terceiro conduz a análise. Em algumas modalidades, o terceiro comunica a informação relativa aos resultados de análise para um usuário final (por exemplo, fazendeiro, um dono de gado, um manipulador de gado, um criador de gado, um dono de animal de companhia, um manipulador de animal de companhia, um criador de animal de companhia, um veterinário, um fabricante de produto de alimento ou alimentação, um distribuidor de produto de alimento ou alimentação, funcionário regulador). Em algumas modalidades, o terceiro transmite informação a cerca dos resultados da análise a uma quarto.
[00015] Modalidades adicionais serão aparentes a pessoas versadas na técnica relevante com base nos ensinos contidos aqui.
[00016] Figura 1 mostra um diagrama esquemático da produção das funções de glucano P1, P2, P3 e S1, S2, e S3 (veja, por exemplo, Exemplo 1).
[00017] Figura 2 mostra a resposta dos anti-soros de coelho originais e quatro sobrenadantes de anti-soros purificados por afinidade. Anti-soros purificados por afinidade foram obtidos a partir de separação de anticorpos específicos de β-(1,6)glucano (Gab 1-Gab4) para placas de micro cavidade revestidas com BSA (veja, por exemplo, Exemplo 3).
[00018] Figura 3 mostra uma curva de calibração construída com o uso de anticorpos de coelho policlonais anti(1-4)-α-/(1-6)-β-D- glucanoBSA purificados gerados usando métodos descritos aqui (veja, por exemplo, Exemplos 2 e 3).
[00019] Figura 4 mostra uma curva padrão méda de 5 ensaios realizados com 6 níveis de inclusão de MYCOSORB em material de alimentação de leiteria. O eixo y secundário está realçando o dia Dentro (% CV intra) e dia entre (% CV inter) precisões de repetibilidade para as curvas padrões.
[00020] Figura 5 mostra uma curva padrão média de 5 ensaios realizados com 6 níveis de inclusão de MYCOSORB em material de alimentação de galinha. O eixo y secundário está realçando o dia Dentro (% CV intra) e dia Entre (% CV inter) precisões de repetibilidade para as curvas padrões.
[00021] Figura 6 mostra uma curva padrão média de 5 ensaios realizados com 6 níveis de inclusão de MYCOSORB em material de alimentação de porco. O eixo y secundário está realçando o dia Dentro (% CV intra) e dia Entre (% CV inter) precisões repetibilidade para as curvas padrões.
[00022] Figura 7 mostra diferenças de leitura de densidade óptica média (ΔOD450) do produto interferindo subtraído do sinal de produto MYCOSORB obtido em alimentação de galinha para uma única distribuição de placa de microtítulo (Exemplo 7). Os produtos interferenciais foram adicionados a 50, 100, 200% (p/p) além do produto MYCOSORB (100%, 1,0 kg/T).
[00023] Figura 8 mostra diferenças de leitura de densidade óptica (ΔOD450) do produto interferindo subtraído do sinal de produto MYCOSORB obtido em alimentação de galinha para uma única distribuição de placa de microtítulo (Exemplo 7). Os produtos interferenciais foram adicionados a 50, 100, 200% (p/p) além do produto MYCOSORB (100%, 1,0 kg/T).
[00024] Figura 9 mostra resultados de ensaio de ELISA indicando reatividade cruzada de anticorpo monoclonal 513A161.1 em uma concentração de 1:100 (topo) ou 1:200 (base).
[00025] Figura 10 mostra resultados de ensaio de ELISA indicando reatividade cruzada de anticorpo monoclonal 513A161.1 em uma concentração de 1:500 (topo) ou 1:1000 (base).
[00026] Figura 11 mostra resultados de ensaio de ELISA indicando reatividade cruzada de anticorpo monoclonal 513A161.1 em uma concentração de 1:1500 (topo) ou 1:2000 (base).
[00027] Figura 12 mostra resultados de ensaio de ELISA indicando reatividade cruzada de anticorpo monoclonal 513A431.1 em uma concentração de 1:100 (topo) ou 1:200 (base).
[00028] Figura 13 mostra resultados de ensaio de ELISA indicando reatividade cruzada de anticorpo monoclonal 513A431.1 em uma concentração de 1:500 (topo) ou 1:1000 (base).
[00029] Figura 14 mostra resultados de ensaio de ELISA indicando reatividade cruzada de anticorpo monoclonal 513A431.1 em uma concentração de 1:1500 (topo) ou 1:2000 (base).
[00030] Figura 15 mostra leituras de absorvência de ensaio de ELISA médias e desvios padrões de três extratos de parede celular de levedura padrões semeados não diluídos ou diluídos 1:1 em PBS ou PBS + 3% leite seco sem gordura (Exemplo 6).
[00031] Figura 16 mostra um gráfico de curvas padrões de extrato de alimentação para microplaca de ELISA revestindo incubações de tempo e temperatura descritas no Exemplo 6.
[00032] Para facilitar um entendimento da presente invenção, vários termos e frases são definidas abaixo:
[00033] Quando aqui usado, os termos "peptídeo,""polipeptídeo" e "proteína" todos referem-se a uma sequência primária de aminoácidos que são ligados por “ligações de peptídeo” covalentes. Em geral, um peptídeo consiste em alguns aminoácidos, tipicamente de 2-50 amino- ácidos, e é mais curto do que uma proteína. O termo "polipeptídeo" abrange peptídeos e proteínas. Em algumas modalidades, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína é sintética, enquanto em outras modalidades, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína são recombinantes ou de ocorrência natural. Um peptídeo sintético é um peptídeo que é produzido por meios artificiais in vitro (isto é, não foi produzido in vivo).
[00034] O termo "glicoproteína(s)" ou “glicopeptídeo(s)” refere-se a uma proteína ou peptídeo que contêm um ou mais resíduos de carboidrato covalentemente ligados à cadeia de polipeptídeo. O termo “sele- noproteína(s)” ou “selenopeptídeo(s)” refere-se a uma proteína ou pep- tídeo que contêm um ou mais átomos de selênio. Tipicamente, átomos de selênio são incorporados em proteínas dentro de aminoácidos contendo selênio incluindo selenocisteína e selenometionina.
[00035] O termo “selenoglicoproteína(s),” “selenoglicopeptídeo (s)” ou “SGP(s)” refere-se a uma glicoproteína ou glicopeptídeo que incorporam um ou mais átomos de selênio. Tipicamente, “selenoglicoprote- ínas” compreendem um ou mais aminoácidos contendo selênio. “Sele- noglicoproteínas” podem compreender vários carboidrato em qualquer número de formas diferentes.
[00036] Os termos "amostra" e "espécime" são usados em seu sentido mais amplo e abrange amostras ou espécimes obtidas de qual- quer fonte. Quando aqui usado, o termo "amostra"é usado para se referir a amostras biológicas obtidas a partir de animais (incluindo humanos), e abrange fluidos, sólidos, tecidos, e gases. Em algumas modalidades desta invenção, amostras incluem amostras contendo matéria derivada de planta (silagem, grão, alimentação de gado processada, produtos de alimentação em estágios intermediários de fabricação). Entretanto, estes exemplos não serão interpretados como limitando os tipos de amostras que encontram uso com a presente invenção.
[00037] Quando aqui usado, o termo “levedura” e “células de levedura” refere-se a microorganismos eucarióticos classificados nos reino Fungos, tendo uma parede celular, membrana celular e componentes intracelulares. Leveduras não formam um agrupamento taxonômico ou filogenético específico. Atualmente cerca de 1.500 espécies são conhecidas;é calculado que apenas 1% de todas as espécies de levedura foi descrito. O termo "levedura"é frequentemente empregado como um sinônimo para S. cerevisiae,porém a diversidade filogenética de leveduras é mostrada pela sua colocação em ambas as divisões As- comycota e Basidiomycota. O termo “levedura” abrange levedura de cerveja, levedura de destiladores e leveduras de panificação. As leveduras de brotamento ("verdadeiras leveduras") são classificadas na ordem Saccharomycetales. A maioria das espécies de levedura reproduzem assexualmente brotando-se, embora algumas reproduzem por fissão binária. Leveduras são unicelulares, embora algumas espécies tornam-se multicelulares através da formação de um fio de células de brotamento conectadas conhecido como pseudohyphae, ou false hyphae. Tamanho de levedura pode variar grandemente dependendo das espécies, tipicamente medindo 3-4 μm em diâmetro, embora alguma levedura possa alcançar mais de 40 μm. Quando aqui usado, o termo “parede celular de levedura” da mesma forma chamado “YCW” refere-se à parede celular de um organismo de levedura que circunda a membrana plasmática e os componentes intracelulares da levedura. Parede de célula de levedura inclui igualmente a camada exterior (principalmente manana) e a camada interior (principalmente glucano e quitina) da parede celular de levedura. Uma função da parede celular é fornecer estrutura e proteger o interior de levedura (seu centro de atividade metabólica). Séries de reação de sinalização e reconhecimento ocorrem na parede celular de levedura. A composição de parede celular de levedura varia de cepa para cepa e de acordo com condições de crescimento de levedura.
[00038] Quando aqui usado, o termo “extrato de parede celular de levedura” refere-se à parede celular de levedura de levedura que foi rompida ou “lisada” (por exemplo, durante um estágio de ruptura e lise) e separada dos componentes intracelulares solúveis da célula de levedura.
[00039] Quando aqui usado, o termo p/p (peso/peso) refere-se à quantidade de uma determinada substância em uma composição em base de peso. Por exemplo, uma alimentação animal compreendendo 0.02% p/p de suplemento de alimentação dietético dos meios da invenção que a massa do suplemento de alimento dietético é 0,02% da massa total da alimentação animal (por exemplo, 200 gramas da composição de suplemento de alimentação dietética da invenção em 907.200 gramas de alimentação animal).
[00040] Quando aqui usado, o termo "purificado" ou "para purificar" refere-se à remoção de componentes de uma amostra. Por exemplo, paredes de célula de levedura ou extrato de parede celular de levedurassão purificados por remoção de componentes de parede celular de não levedura (por exemplo, membrana plasmática e/ou componentes intracelulares de levedura); eles são da mesma forma purificados pela remoção de contaminantes ou agentes diferentes de parede celular de levedura. A remoção de componentes de parede celular de não leve- dura e/ou contaminantes de parede celular de não levedura resultada em um aumento no percentual de parede celular de levedura ou componentes dos mesmos em uma amostra. Ao nível molecular, o termo “purificado” refere-se a moléculas (por exemplo, carboidratos, glicopro- teínas) que são removidas de seu ambiente natural, isoladas ou separadas. Um "carboidrato isolado" pode portanto ser um carboidrato purificado.Moléculas "substancialmente purificadas"são pelo menos 60% livres, preferivelmente pelo menos 75% livres, e mais preferivelmente pelo menos 90% livres de outros componentes com que elas estão naturalmente associadas. Quando aqui usado, o termo "purificado" ou "para purificar" refere-se à remoção de contaminantes de uma amostra. A remoção de proteínas de contaminação resulta em um aumento no percentual de polipeptídeo de interesse na amostra. Além disso, poli- peptídeos recombinantes (por exemplo, glicoproteínas) são expressados em ou purificados de células de planta, bacterianas, de levedura, ou hospedeiras de mamífero e os polipeptídeos são purificados pela remoção de proteínas de célula hospedeiro; o percentual de polipeptí- deos recombinantes é desse modo aumentado na amostra. Quando aqui usado, o termo “animal” refere-se aqueles do reino Animalia. Isto inclui, porém não é limitado a gado, animais de fazenda, animais domésticos, animais de companhia ou de estimação, animais marinhos e de água doce, e animais silvestres.
[00041] Quando aqui usado o termo, “gado” da mesma forma chamado como “espécies de gado” e da mesma forma referido a “gado doméstico” e da mesma forma referido como “animai comercialmente criados” refere-se a um animal domesticado intencionalmente criado em uma fixação agrícola ou aquicultura para produzir alimento ou fibra, ou para seu trabalho ou companhia.
[00042] Quando aqui usado, os termos “suplemento de comida” “suplemento dietético” “composição de suplemento dietético” e similar referem-se a um produto de alimento formulado como um suplemento dietético ou nutricional a ser usado como parte de uma dieta, por exemplo como uma adição a alimentação animal. Composições de suplementodietético exemplares são descritas aqui.
[00043] Quando aqui usado, o termo "kit"é usado em referência a uma combinação de reagentes e outros materiais. É contemplado que o kit pode incluir reagentes tal como soluções de extração, anticorpos, e reagentes de detecção. Não é pretendido que o termo "kit" seja limitado a uma combinação particular de reagentes e/ou outros materiais.
[00044] Quando aqui usado, o termo "tóxico"refere-se a quaisquer efeitos danosos ou prejudiciais em um indivíduo, uma célula, ou um tecido quando comparado à mesma célula ou tecido antes da administração do toxicante.
[00045] Quando aqui usado, o termo “secagem por congelamento” e o termo “liofilização” e o termo “criodessecação” refere-se à remoção de um solvente de matéria em um estado congelado por sublimação. Isto é realizado congelando o material a ser secado sob seu ponto eutético e em seguida fornecendo o calor latente de sublimação. Controle preciso de entrada de calor permite secagem do estado congelado sem derreter produto novamente. Na aplicação prática, o processo é acelerado e precisamente controlado sob condições de pressão reduzidas.
[00046] Quando aqui usado, o termo “pó de fluxo livre seco” refere- se a um pó seco d fluxo livre, por exemplo um pó que pode ser derramado a partir de um recipiente, bolsa, vaso etc sem obstáculo de aglomerações grandes.
[00047] Quando aqui usado, o termo “moagem” refere-se a reduzir tamanho de partícula por impacto, cisalhamento, ou atrito.
[00048] Quando aqui usado, o termo “lavagem” refere-se à remoção ou limpeza (por exemplo, usando qualquer tipo de soluto (por exemplo água destilada, tampão, ou solvente) ou mistura) de impurezas ou componente indesejado solúvel de uma preparação (por exemplo, um extrato de parede celular de levedura pode ser lavado para remover componentes de parede celular de não levedura da amostra; uma cavidade de uma placa de microtítulo pode ser lavada para remover componentes de não ligação ou não especificamente ligação).
[00049] Os termos "anticorpo" ou "imunoglobulina" referem-se a proteínas que ligam-se um antígeno específico. Imunoglobulinas incluem,porém não são limitadas a, anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, e humanizados, Fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab')2, e inclui imunoglobulinas das seguintes classes: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE, e imunoglobulinas segregadas (sIg). Imunoglobulinas geralmente compreendem duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves. Entretanto, os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" da mesma forma abrange anticorpos de cadeia simples e anticorpos de duas cadeias. Anticorpos podem ser produzidos por quaisquer das metodologias conhecidas (Veja, por exemplo, Current Protocols in Immunology (1998) John Wiley e Sons, Inc., N.Y.).
[00050] O termo "antígeno"refere-se a um carboidrato, proteína, glicoproteína, lipoproteína, lipídio ou outra substância que é rativa com um anticorpo específico para uma porção da molécula.
[00051] Quando aqui usado, o termo "analisado" refere-se a um átomo, uma molécula, um agrupamento de átomos e/ou moléculas, uma substância, ou componente químico. Um analisado, por si só não pode ser medido, bastante, aspectos ou propriedades (físicas, químicas,biológicas, etc.) do analisado pode ser determinado usando um procedimento analítico, tal como HPLC ou NMR. Por exemplo, alguém não pode medir um “cadeira” (analisado-componente) por si só, porém, a altura, largura, etc. de uma cadeira pode ser medida. Igualmente, alguém não pode medir um micotoxina porém pode medir o sinal de micotoxina (por exemplo, sinal cromogênico, sinal de fluorescência) que está relacionado a sua concentração.
[00052] Os termos "imunoprecipitado,"“imunopurificação,” e "purificação de afinidade," e variações gramaticais tal como verbos e adjetivos, referem-se ao uso de um anticorpo para separar seu antígeno ou uma porção do mesmo de uma mistura de outras moléculas.
[00053] O termo “imunodetecção” e variações gramaticais refere-se ao uso de um anticorpo para identificar a presença de um antígeno ou uma porção do mesmo de uma mistura de outras moléculas.
[00054] O termo "manchamento" refere-se a como qualquer número de processos conhecidos aqueles no campo que é usado para melhor visualizar, distinguir ou identificar um componente(s) específico e/ou característica(s) de um material (por exemplo, amostra, amostra de alimentação, extração de amostra de alimentação, célula, células).
[00055] O termo "imunofluorescência"refere-se a uma técnica de manchamento usada para identificar, marcar, rotular, visualizar ou tornar facilmente aparente por procedimentos conhecidos aqueles praticados na técnica, onde um ligante (normalmente um anticorpo) é ligado a um receptor (normalmente um antígeno) e tal ligante, se um anticorpo,é conjugado a uma molécula fluorescente, ou o ligante é em seguida ligado por um anticorpo específico ao ligante, e o referido anticorpoé conjugado a uma molécula fluorescente, onde a referida molécula fluorescente pode ser visualizada com o instrumento apropriado (por exemplo, um microscópio fluorescente).
[00056] O termo "determinante antigênico"refere-se àquela porção de um antígeno (por exemplo, um epítopo) que entra em contato contato com um anticorpo particular. Quando uma proteína ou fragmento de uma proteína é usado para imunizar um animal hospedeiro, numerosasregiões da proteína podem induzir a produção de anticorpos que especificamente ligam-se a uma determinada região ou estrutura tridimensional na proteína; estas regiões ou estruturas são da mesma forma referidas como determinantes antigênicos. Um determinante an- tigênico pode competir com o antígeno intacto (o "imunógeno"usado para extrair a resposta imune) para ligar-se a um anticorpo.
[00057] Quando aqui usado, o termo “imunoensaio” refere-se a um teste qualitativo ou quantitativo pretendido permitir detecção de um antígeno em uma amostra. Imunoensaios tipicamente utilizam anticorpos de reconhecimento de antígeno. O anticorpo de reconhecimento de antígeno pode ser diretamente ou indiretamente acoplado a uma etapa de visualização, tal como um marcador ou enzima cromogênico ou fluorogênico. Exemplos de imunoensaios incluem porém não são limitados a ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (“ELISA”), testes de fluxo laterais, mancha do oeste, ensaios com base em micro- partícula (por exemplo, ensaios de Luminex®), imunoensaios magnéticos, manchas de ponto, imunoensaios de enzima (EIA), radioimuno- ensaio (RIA), imunoensaios quimioluminescentes (CLIA), contando imunoensaios (CIA), e similar. Imunoensaios podem ser competitivos ou não competitivos.
[00058] Quando aqui usado, o termo “ensaio imunoabsorvente ligado a enzima” ou “ELISA,” às vezes referido como um “ensaio sanduíche,” refere-se a um tipo específico de imunoensaio. Tipicamente, uma quantidade desconhecida de antígeno é absorvida ou imobilizada em uma superfície sólida e exposto a um anticorpo capaz de reconhecer isto. A quantidade de anticorpo ligado é geralmente determinada através de ligações diretas ou indiretas a uma enzima fluorogênica ou cromogênica. Tipos de ELISAs incluem porém não são limitados a ELISA direto, ELISA indireto, ELISA sanduíche, ELISA competitivo, e ELISA reverso. Quando aqui usado, o termo "ELISA" refere-se a ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ou EIA). Numerosos métodos de ELISA e aplicações são conhecidos na técnica, e são descritos em muitas referências (veja, por exemplo, Crowther, "Ensaio Imunoabsor- vente Ligado a Enzima (ELISA)," em Molecular Biomethods Handbook, Rapley e outro (eds.), pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. (1998); Harlow e Pista (eds.), Antibodies: A Laboratoty Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Ausubel e outro (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)). Além disso, há numerosos sistemas de testes de ELISA comercialmente disponível. Quando aqui usado, os termos “alimento,” “gêneros alimentícios,” “alimentação,” “produto de alimentação,” “gênerosalimentícios” e similar referem-se a qualquer material(s) que é(são) consumido(s) (por exemplo, por um animal), que contribui energia e/ou nutrientes à dieta. Exemplos incluem, porém não são limitados a, Ração Misturada Total (TMR), forragem(ns), pelota(s), concentrado(s), pré-mistura(s) co-produto(s), grão(s), grão(s) destilador(es), melados, fibra(s), alimentador(es) de gado, capim, forragem, semente(s), folhas, farinha, solúvel(is), e suplemento(s). Gêneros alimentícios não são limitados pela sua forma física. Gêneros alimentícios podem ser pro-cessados a tamanho de partícula menor lascado, cortado, fundamen-tado,moído, ou similar); feito na forma líquida (por exemplo, extraído, fervido, concentrado, convertido a xarope ou outra forma viscosa); ou processado em tamanho maior (por exemplo, embalado, consolidado, comprimido, ou formado em formas compostas, por exemplo, pelotas, blocos, quadrados, flocos, e similar).
[00059] Quando aqui usado, quando usado como um substantivo, um “aditivo” ou “suplemento” refere-se a uma substância ou coisa que é adicionada ou de outra maneira incluída em outra substância ou coisa. Além disso, quando aqui usado, quando usado como um substantivo, as palavras “aditivo” ou “suplemento” podem ser usadas alternadamente quando referenciando “aditivos” ou “suplementos” que são misturados em alimentação animal antes de ser alimentado a um animal.
[00060] Quando aqui usado, o termo “glucano” refere-se a qualquer polímero de carboidrato contendo glicose. Em algumas modalidades, glucanos são polímeros de D-glicose sem limitação em grau de poli- merização, associação covalente ou não covalente com outros polímeros, ou composição de carboidrato exata. Ao longo do comprimento de um polímero de glucano, unidades de D-glicose podem participar em a-ligações, e—ligações ou ambas a— e e—ligações
[00061] Quando aqui usado, o termo “carboidrato” é usado para referenciar um composto orgânico com a fórmula geral Cm(H2O)n. Um carboidrato consiste apenas em um carbono, um hidrogênio e um átomo de oxigênio pelo qual o hidrogênio e átomos de oxigênio estão em 2:1 de relação de átomo.
[00062] Quando aqui usado, o termo "sinal" é usado geralmente em referência a qualquer processo detectável que indica que uma reação ocorreu, por exemplo, ligação de anticorpo a antígeno. É contemplado que sinais na forma de radioatividade, produtos/reagentes fluorimétri- cos ou colorimétricos todos encontram uso com a presente invenção. Em várias modalidades da presente invenção, o sinal é avaliado qualitativamente, enquanto em modalidades alternativas, o sinal é avaliado quantitativamente.
[00063] Quando aqui usado, o termo "suporte sólido" é usado em referência a qualquer material sólido ou estacionário ao qual reagentes tais como anticorpos, antígenos, e outros componentes de teste são ligados. Por exemplo, em um método de ELISA, as cavidades de placas de microtítulo fornecem suportes sólidos. Outros exemplos de suportes sólidos incluem lâminas de microscópio, lamínulas, contas, partículas, frascos de cultura de célula, bem como muitos outros artigos adequados.
[00064] Os termos "ligação específica" e "especificamente ligando" quando usados em referência à interação entre um anticorpo e um an- tígeno descrevem uma interação que é dependente na presença de uma estrutura particular (isto é, o determinante antigênico ou epítopo) no antígeno. Em outras palavras, o anticorpo reconhece e liga-se a uma estrutura de proteína única ao antígeno, em vez de ligar-se a todas as proteínas em geral (isto é, ligação não específica).
[00065] Parede celular de levedura (YCW) compreende uma estrutura complexa que inclui dois componentes de polissacarídeos principais: (1^2)(1^3)(1 ^6)-α-D-manana, e (1^3)(1-6)-β-D-glucano. Estes polissacarídeos são conectados às proteínas de YCW através de ligações de O- e N-glicosidila, como discutido em uma revisão recentemente publicada (Lesage e outro (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343; aqui incorporada por referência em sua totalidade). Em uma escala industrial, YCW é tipicamente separada, ou extraída a partir de organismos de levedura lisados por centrifugação e lavando como relatado por D.A. Howes e K.E. Newman (veja, por exemplo, Patente US No. 6.045.834; aqui incorporado por referência em sua totalidade). Neste estágio, YCW não é solúvel em água. Tratamento enzi- mático e químico subsequente do YCW primário modifica a estrutura de polissacarídeos e proteínas, desse modo tornando estes componentes de YCW pelo menos parcialmente solúvel em água e em dime- til sulfóxido “DMSO.” A composição das partes solúveis e insolúveis do produto depende das condições do processo.
[00066] Imunoensaios compreendem técnicas analíticas sensíveis que encontram uso com tal complexo, misturas não-homogêneas. Em algumas modalidades de método da presente invenção, anticorpos de um animal que foi imunizado com um antígeno contendo (1-6)-β-D- glucano de levedura que interconecta tudos os componentes estruturais principais da parede celular (veja, Kollár e outro (1997) J. Biol. Chem. 272:17762-17775; aqui incorporado por referência em sua totalidade) reconhece estes polissacarídeos, permitindo estabelecimento de imu- noensaios robusto e sensível. Em algumas modalidades da presente invenção, um imunoensaio quantitativo (ELISA) permite análise de um aditivo nutricional derivado de YCW, MYCOSORB (ALLTECH, Inc.), em amostras de alimentação animal. Um ensaio para (1-6)-β-D-glucano de YCW é muito específico em quantificação de YCW, porque ((1-6)- β-D-glucano é muito raro entre carboidratos de planta. Portanto, anticorpos dirigidos contra estes polissacarídeos de YCW não significativamente interagem com polissacarídeos de planta presente em alimentação animal, garantindo baixo antecedente de ensaio.
[00067] Adicionalmente, algumas modalidades da presente invenção da mesma forma fornecem métodos para: 1) separação de um (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano solúvel a partir de parede celular de levedura (veja, Kwiatkowski e outro (2009) J. Instit. Brew. 115:1031, e Arvindekar e outro (2002) Yeast 19:131-139, cada qual aqui incorporado por referência em sua totalidade), por exemplo, como um antígeno para preparação de anticorpos reconhecendo (1-4)-α-/(1-6)-β-D- glucano de levedura; oxidação destes grupos hidroxila de polissacarí- deos na posição C6 de anéis de glicopiranose com reagente de Pfiz- ner-Moffat (veja, Pfizner e outro (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027; aqui incorporado por referência em sua totalidade) para os converter em grupo aldeído (veja, Zekovic e outro (2006) Chem. Papers 60:243248; aqui incorporado por referência em sua totalidade); e o uso desta forma oxidada de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano na reação de amina- ção redutiva (veja, Abdel-Magid e outro (1996) J. Org. Chem. 61:38493862; aqui incorporado por referência em sua totalidade) com os resíduos de lisina de albumina de soro bovino (BSA), para produzir um conjugado de polissacarídeo-proteína. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para separação e purificação (por exemplo, usando troca iônica, DEAE celulose e tampões de Na2HPO4 de resistência iônica diferente) de conjugado de (1-4)-α-/(1-6)-β-D- glucano-BSA, que é usado como um imunógeno solúvel em imunização animal (por exemplo, coelho) (veja, Howard e outro (2001) Basic Methods em Antibody Production e Characterization, CRC Press, pp. 11-18 e 31-50). Em algumas modalidades, a presente invenção fornecemétodos para preparação de resina de fase de afinidade revestida por BSA (veja, Matejtschuk (1997) Affinity Separations: a Practical Approach, Oxford University Press) e seu uso em absorção de anticorpos específicos de BSA de soros de coelho contendo ambos anticorpos específicos de BSA e específicos de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano. Em algumas modalidades da presente invenção, métodos para conjugação de polissacarídeos para proteínas encontram uso na produção de vacinas humanas e animais, tal como métodos preservam a estrutura original dos polissacarídeos e não modificam seu fim de redução como métodos de conjugação típicos fazem (veja, Pat U.S. No. 6.596.861; aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[00068] Glucanos são prevalecentes entre polissacarídeos de parede celular de Saccharomyces cerevisiae (veja, Kwiatkowski e outro (2009) J. Instit. Brew. 115:151-158). Os papéis de (1^3)-β-D-glucano em manutenção de forma e rigidez de parede celular de levedura (veja, Klis e outro (2006) Yeast 23:185-202; Lesage e outro (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:317-343; cada qual aqui incorporado por referência em sua totalidade) e o (1-6)-β-D-glucano como um polissacarídeos que liga-se juntos a todos os polissacarídeos de parede celular são documentados (veja, Aimaniada e outro (2009) J. Biol. Chem. 284:13401-13412; Kollár e outro (1997) o J. Biol. Chem. 272:17762-1777; Klis e outro (2002) FEMS Microbiology Rev. 26:239-256; cada qual incorporado por referência em sua totalidade). A presença de (1-4)-a-D-glucano semelhante a glicogênio solúvel e insolúvel nas células de S. cerevisiae crescidos aerobiamente foi frequentemente mencionado na literatura de levedura precoce (veja, Gunja-Smith e outro (1974) Biochem. Biophys. Res. Com. 56:588-592; Grba e outro (1975) Appl. Microbiol. Biotechnol. 2:29-37; cada qual aqui incorporado por referência em sua totalidade), e duas formas de glicogênio sintase foram identificadas (veja, Gunja-Smith e outro (1977) J. Bacteriol. 130:818-825; Rothman-Denes e outro (1970) PNAS 66:967-974; cada qual aqui incorporado por referência em sua totalidade). Glicogênio é o carboidrato de reserva de energia acumulado por S. cerevisiae, que pode ser mobilizado durante períodos de falta de alimentação de levedura.É um polímero de α-D-glucose com um peso molecular de ~108 e uma estrutura ramificada com 10-14 resíduos de α-D-glucose ligados por 1-4 ligações (veja, Aklujkar e outro (2008) J. Instit. Brew. 114:205-208; Boulton e outro (2001) The Biochemistry of Fermentation. In: Brewing Yeast and Fermentation, Blackwell Science, Iowa, pp. 8992; cada qual incorporado aqui por referência em sua totalidade).
[00069] O teor de (1 ^4)-«-D-glucano na parede celular de levedura pode variar tão pouco quanto 1% (veja, Lille e outro (1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394) para tanto quanto 29% (veja, Sedmak e outro, Ped. Pat. U.S. No. 2006/0263415; aqui incorporado por referência em sua totalidade) do peso seco, dependendo do estado nutricional das células, do método de isolamento, das condições ambientais e do tempo que as células foram colhidas (veja, Lille e outro (1980) J. Bacteriol. 143:1384-1394). As células de levedura de cervejeiro industrialmente produzidas (veja, Sedmak e outro, Ped. De Pat. U.S. No. 2006/0263415; aqui incorporado por referência em sua totalidade) contiveram glucanos em uma concentração de peso seco de 28,9% (d.w.) que incluiu 12,4% d.w. de (1-4)-a-D-glucano. Quando estas células foram tratadas com protease alcalina, o componente de parede celular insolúvel em água conteve 54,5% de d.w. de glucanos e mais do que metade do peso de (1-4)-a-D-glucano (29,2% d.w.).
[00070] Em 2002, Arvindekar e Patil (veja, Arvindekar e outro (2002) Yeast 19:131-139; aqui incorporado por referência em sua totalidade) propôs uma explicação para a presença da fração insolúvel que foi definida pelos outros como glicogênio de levedura “difícil de lavar” (veja, Fleet e outro. (1976) J. Gen. Microbiol. 94:180-192; aqui incorporado por referência em sua totalidade) dentro da parede celular de levedura, com base em sua constatação que (1-4)-α-D-glucano é covalente- mente ligado a (1-6)-β-D-glucano. Entretanto, isto estava em discórdia com o papel de 1997 publicado por Kollar e co-workers (veja, Kollár e outro (1997) J. Biol. Chem. 272:17762-17775; aqui incorporado por referência em sua totalidade) e com trabalho publicado por Ai- maniada e co-workers (veja, Aimaniada e outro (2009) o J. Biol. Chem. 184:13401-13412; aqui incorporado por referência em sua totalidade) no papel e a estrutura do (1-6)-β-D-glucano dentro da parede celular de levedura. Notavelmente, as constatações de Arvindekar e Patil requereram verificação estrutural, como os autores trabalharam com frações de minuto de uma hidrólise enzimática da parede celular de levedura e não usaram NMR para a quantificação ou tarefas estruturais para seus produtos separados. Em experiências conduzidas durante o curso de modalidades em desenvolvimento da invenção, métodos de separação em grande escala foram desenvolvidos para isolamento de polissacarídeos de (1-4)-α-D-glucano/(1-6)-β-D-glucano misturado de parede celular de S. cerevisiae, e a estrutura deste produto foi estabelecida usando espectroscopia de NMR.
[00071] Alimentação animal é qualquer gênero alimentício que é usado especificamente para alimentar gado domesticado (por exemplo, gado, cabras, ovelha, cavalos, aves domésticas, búfalo, alpaca, lha- mas, burros, mulas, coelhos, galinhas, gansos, perus, e porcos). Alimentações animais frequentemente incluem feno, palha, silagem, ali mentações comprimidas e peletizadas, óleos e rações misturadas, e da mesma forma grãos germinados e legumes. A indústria de alimentação animal mundial consumiu 635 milhões de toneladas de alimento em 2006, com uma taxa de crescimento anual de cerca de 2%. O uso de terra agrícola para cultivar alimentação em vez de alimento humano poder ser controversa; alguns tipos de alimentação, tal como milho (milho), podem da mesma forma servir como alimento humano, enquanto outros tais como grama não podem. Além de fornecer uma fonte de energia a animais, alimentações animais da mesma forma fornecem nutrientes (por exemplo selênio) utilizado pelo corpo. Alimentações animais são frequentemente misturadas com suplementos e/ou aditivos (por exemplo, MYCOSORB) antes de ser alimentadas a um animal.
[00072] A invenção fornece métodos para detecção de substâncias em amostras, tais métodos compreendendo ensaios de imunodetec- ção ou imunoensaios. Um imunoensaio (ensaio de imunodetecção, método de imunodetecção) envolve uso de um anticorpo para a detecção (visualização, identificação qualitativa, detecção quantitativa) de uma substância (por exemplo, antígeno) ao qual o anticorpo liga-se. Um antígeno reconhecido por um anticorpo pode ser uma macromolé- cula ou um fragmento do mesmo (por exemplo, polímero, carboidrato, glicoproteína, proteína, porção ou monômeros dos mesmos). Por exemplo, alguns métodos da presente invenção encontram uso na detecção de glucanos de parede celular de levedura (por exemplo, (1-4)-α-D-glucano, (1-6)-β-D-glucano, e/ou (1-4)-α-/(1-6)-β-D- glucano).
[00073] Numeroso imunoensaios encontram uso na detecção qualitativa ou quantitativa de substâncias (por exemplo, substâncias encontradas em baixa concentração, substâncias presentes em misturas complexas, substâncias de carboidrato, (1-4)-«-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura). Tipos de imunoensaios incluem porém não são limitados a ensaios imunoabsorventes ligados a enzima (ELISA), testes de fluxo laterais, mancha do oeste, ensaios com base em micropartícula (por exemplo, ensaio Luminex®), imunoensaios magnéticos, manchas de ponto, imunoensaios de enzima (EIA), radioimunoensaio (RIA), imuno- ensaios quimioluminescentes (CLIA), contando imunoensaios (CIA), e similar (veja, por exemplo, Wild e outro (2005) “The Immunoassay Handbook, 3aEd.”, Elsevier Ltd., Oxford, UK). Imunoensaios pode ser competitivos ou não competitivos.
[00074] Ensaio Imunoabsorvente ligado a enzima, “ELISA.” foi usado como uma ferramenta diagnóstica em medicina e patologia de planta, bem como um cheque de controle de qualidade em várias indústrias. Em um exemplo de um ELISA típico inclui uma molécula de sonda que é primeiro imobilizada em uma microplaca de poliestireno ou outra superfície. Logo agente de bloqueio tal como BSA é aplicado e incubado. Uma amostra biológica ou outra contendo uma molécula alvo específica (frequentemente uma proteína) de concentração desconhecida é feita entrar em contato com a molécula de sonda imobilizada. Se presente, a molécula alvo é capturada pela sonda proporcionalmente à concentração da molécula alvo. Logo, a superfície é tipicamente lavada com uma solução de detergente moderada para remover qualquer molécula que não são especificamente ligadas. Logo, uma molécula adicional, tal como um segundo anticorpo, é aplicada para formar um complexo de “sanduíche” com a sonda de captura, molécula alvo, e sonda detectora rotulada. A segunda molécula é frequentemente referida como uma sonda detectora ou anticorpo detector, e é geralmente covalentemente ligada a uma enzima, hapteno, ou outra molécula de rotulagem.
[00075] Depois que uma etapa de lavagem final a placa é desenvolvida adicionando-se um conjugado que liga-se ao anticorpo detector rotulado e contém um substrato enzimático, reagente de detecção fluorescentemente rotulado, ou uma variedade de outros repórteres. O repórter produz um sinal detectável proporcional à quantidade de antí- geno alvo na amostra. Tipicamente, ELISAs são lidos usando uma leitora de placa colorimétrica ou fluorescente e resultam em uma única medida de analisado alvo por cavidade. Outras variantes do ensaio de ELISA incluem porém não são limitados a ELISA indireto, competitivo, ou reverso (veja, por exemplo, Crowther e outro (2008) “The ELISA Guidebook, 2aEd.”, Humana Press).
[00076] Em muitos casos, ELISAs são realizados em microplacas feitas para emparelhar um formato padronizado que permite processamento por meio de um instrumento automatizado. Estes padrões são estabelecidos pela Society of Biomolecular Sciences (SBS) e são conhecidos como padrões de SBS. De acordo com padrões de SBS, a “pegada” para uma placa de multicavidade é aproximadamente 85 mm x 125 mm com cavidades localizadas em um formato de posições especificadas dependendo do número total de cavidades. O American National Standards Institute (ANSI) publicou os Padrões de SBS para microplacas como: “Footprint Dimensions” (ANSI/SBS 1-2004), “Height Dimensions” (ANSI/SBS 2-2004), “Bottom Outside Flange Dimensions” (ANSI/SBS 3-2004) e “Well Positions” (ANSI/SBS 4-2004). Geralmente, usuários de ELISA empregam 96-cavidade em uma única placa. Alter-nadamente, quando menos do que 96 cavidades são necessárias em um ensaio, até doze “tiras” de 8 cavidades podem ser empregadas tal que apenas uma porção das 96 cavidade são usadas de cada vez.
[00077] Em algumas modalidades, um programa de análise com base em computador é usado para traduzir os dados crus gerados por um ensaio (por exemplo, imunoensaio, ELISA) (por exemplo, a presença, ausência, ou quantidade de um antígeno) (por exemplo, (1-4)- a-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, (1-4)-a- /(1-6)-β-D-glucano de levedura) em dados de valor pré-dito para um usuário final (por exemplo, um gado ou criador de animal de companhia ou manipulador, um veterinário, um fazendeiro, um consumidor). O usuário final pode acessar os dados pré-ditos usando quaisquer meios adequados. Desse modo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece o outro benefício que o usuário final, que não é provável ser treinado em análise de imunoensaio, não necessita entender os dados crus. O dados são apresentados diretamente ao usuário final em sua forma mais útil. O usuário final é em seguida capaz de imediatamente utilizar a informação para aperfeiçoar o cuidado do indivíduo (por exemplo, gado ou animal de cmpanhia).
[00078] A presente invenção contempla qualquer método capaz de receber, processar, e transmitir a informação pertencendo a amostras para e de laboratórios conduzindo os ensaios. Por exemplo, em algumas modalidades da presente invenção, uma amostra (por exemplo, uma amostra de alimentação, um extrato de amostra de alimentação) é obtida e submetida a um serviço de perfilamento (por exemplo, laboratório etc.), localizado em qualquer parte do mundo (por exemplo, em um emparelhando rural do que de ou diferente do país onde o indivíduo reside ou onde a informação é ultimamente usada) para gerar dados crus. O usuário final pode ter a amostra (por exemplo, extrato de alimentação) obtido por um terceiro e enviou ao centro de perfilamento, ou indivíduos podem coletar a amostra elas mesmas e diretamente enviar a um centro de perfilamento. Onde a amostra compreende informação previamente determinada, a informação podem ser diretamente enviada ao serviço de perfilamento pelo usuário final (por exemplo, um cartão de informação contendo a informação pode ser digitalizada por um computador e os dados transmitidos a um computador do centro de perfilamento usando sistemas de comunicação eletrônicos). Uma vez recebido pelo serviço de perfilamento, a amostra é processada e um perfil é produzido (por exemplo, teor de antígeno), específico para a informação diagnóstica ou prognóstica desejada para o usuário final.
[00079] O dados de perfil são em seguida preparados em um formato adequado para interpretação por um usuário final. Por exemplo, em vez de fornecer dados crus, o formato preparado pode representar uma avaliação de risco (por exemplo, probabilidade de antígeno estando presente) para o usuário final, juntamente com recomendações para opções de cuidado de gado particulares. Os dados podem ser exibidos ao usuário final por qualquer método adequado. Por exemplo, em algumas modalidades, o serviço de perfilamento gera um relatório que pode ser impresso para o usuário final (por exemplo, no ponto de contato, no ponto de cuidado de gado) ou exibido ao usuário final em um monitor de computador.
[00080] Em algumas modalidades, a informação é primeiro analisada ao ponto de cuidado de gado ou em uma facilidade regional. O dados crus são em seguida enviados a uma facilidade de processamento central para outra análise e/ou para converter os dados crus a informação útil para um usuário final ou outra parte interessada. A facilidade de processamento central fornece a vantagem de privacidade (todos os dados são armazenados em uma facilidade central com protocolos de segurança uniforme), velocidade, e uniformidade de análise de dados. A facilidade de processamento central pode em seguida controlar o destino dos dados seguindo comunicação ao usuário final. Por exemplo, usando um sistema de comunicação eletrônico, a facilidade central pode fornecer dados ao usuário final.
[00081] Em algumas modalidades, o usuário final é capaz de diretamente acessar os dados usando o sistema de comunicação eletrônico. O usuário final pode buscar aconselhamento com base nos resultados. Em algumas modalidades, os dados são usados para uso de pesquisa. Por exemplo, os dados podem ser usados para também aperfeiçoar um regime nutricional para gado ou animais de companhia. Composições &Kits
[00082] Composições para uso (por exemplo, suficiente para, necessáriopara, ou útil para) nos métodos de algumas modalidades da presente invenção incluem reagentes para detectar a presença ou ausência de antígenos específicos (por exemplo, (1-4)-«-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-D- glucano de levedura). Quaisquer destas composições, sozinhas ou em combinação com outras composições da presente invenção, podem ser fornecidas na forma de um kit. Kits podem também compreender controles apropriado e/ou reagentes de detecção.
[00083] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições (por exemplo, antígenos) que encontram uso na análise (por exemplo, análise imunológica; para preparação de anticorpo) de substâncias de parede celular de levedura. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para: separação de um (1-4)- α-/(1-6)-β-D-glucano solúvel de parede celular de levedura (veja, Kwiatkowski e outro (2009) J. Instit. Brew. 115:1031; Arvindekar e outro (2002) Yeast 19:131-139; cada qual incorporado por referência em sua totalidade) como um antígeno para (1-6)-β-D-glucano de levedura; oxidação destes grupos hidroxila de polissacarídeos na posição C6 de anéis de glicopiranose com reagente de Pfizner-Moffat (veja, Pfizner e outro (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027; aqui incorporado por referência em sua totalidade) para os converter em grupos aldeído (veja, Zekovic e outro (2006) Chem. Papers 60:243-248; aqui incorporado por referência em sua totalidade); e o uso desta forma oxidada de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano na aminação redutiva (veja, Abdel-Magid e outro (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862; aqui incorporado por referência em sua totalidade) reação com os resíduos de lisina de um veículo (por exemplo, uma proteína de veículo, por exemplo, BSA), para produzir um conjugado de veículo de polissacarídeos. Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à aplicação de técnicas de separação (por exemplo, troca iônica, DEAE celulose e tampões de Na2HPO4 de resistência iônica diferente) em separação de antígeno puro (por exemplo, conjugado de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucanoBSA ), que é usado como um imunógeno solúvel para imunização de um animal (por exemplo, de um coelho) (veja, Howard e outro (2001) “Basic Methods in Antibody Production and Charactrization”, CRC Press, pp. 11-18 e 31-50). Em algumas modalidades, a presente invenção da mesma forma refere-se a preparação de fase de afinidade revestida por BSA (veja, Matejtschuk (1997) “Affinity Separations: A Pratical Approach”, Oxford University Press) e seu uso em absorção de anticorposespecíficos de veículo (por exemplo, específico BSA) anticorpos de anti-soros (por exemplo, soros de coelho) contendo ambos os anticorpos em veículo (por exemplo, BSA) e antígeno (por exemplo, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano), desse modo facilitando especificidade da preparação de anticorpo resultante. Métodos para conjugação de polissacarídeos para veículos (por exemplo, veículos de proteína, por exemplo, BSA) em algumas modalidades da presente invenção encontram uso na produção de vacinas humanas e animais, como tal métodos preservam estrutura de polissacarídeos, em vez de causar modificações de redução final como métodos de conjugação típicos (veja, Moreau e outro, Pat. U.S. No. 6.596.861; aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[00084] Antigenicidade fraca de poli- ou oligossacarídeos frequentemente requer modificação antes de seu uso como antígenos. Em algumas modalidades da presente invenção, métodos sintéticos foram desenvolvidos em que antígenos de polissacarídeos (contendo (1-6)- β-D-glucano) foram conjugados em veículo (por exemplo, veículo de proteína, por exemplo, BSA) originando ou derivado de espécies animais diferentes do que as espécies usadas para imunização (veja, Howard e outro (2001) “Basic Methods in Antibody Production and Characterization”, CRC Press, pp. 11-18 and 31-50; Matejtschuk (1997) “Affinity Separations: A Practical Approach”, Oxford University Press). Embora a presente invenção não esteja limitada pela natureza ou tipo de veículo usado, BSA é vantajoso por causa de sua disponibilidade comercial e a presença de cinco resíduos de lisina, cada com um único grupo amino livre que pode ser conjugado a poli- ou oligossacarí- deos por uma variedade de métodos químicos (veja, Abdel-Magid e outro (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862; Lees e outro (1996) Vaccine 14:190-198; Pawlowski e outro (1999) Vaccine 17:1474-1483; cada qual incorporado por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades preferidas, a porção de carboidrato do antígeno e do veículo a ser usado em conjugação são solúveis em água. Em algumas modalidades, reduzir grupos aldeído finais da porção de carboidrato do antí- geno (por exemplo, polissacarídeo (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano) não são utilizados para conjugação direta a veículo (por exemplo, BSA), porque desse modo substancialmente mudariam a estrutura e capacidade de ligação do antígeno de polissacarídeo. Em algumas modali-dades, a presente invenção permite estrutura maximamente preservada da porção de carboidrato através da aplicação de um anidrido acé- tico/dimetilsulfóxido sistema (Ac2O/DMSO) (veja, Zekovic e outro (2006) Chem. Papers 60:243-248; aqui incorporado por referência em sua totalidade) para oxidação nas posições diferentes de C3.
[00085] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para uso de componentes de parede celular de levedura (por exemplo, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano solúvel de parede celular de Saccharomyces cerevisiae) na síntese de antígeno (por exemplo, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucanoBSA (Albumina de Soro Bovino)) conjugado para ser usado na produção de anticorpos (por exemplo, anticorpos policlonais). Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição imunogênica compreendendo (1-4)-α-/(1-6)-β-D- glucano e/ou um conjugado (por exemplo, conjugado de açúcar ou proteína) compreendendo o mesmo. Em algumas modalidades, composiçõesde anticorpo da presente invenção encontram uso em detecçãode produtos de parede celular de levedura em amostras de interesse (por exemplo, amostras de alimentação de animais ou derivados, frações, ou extratos dos mesmos). Em algumas modalidades, composiçõesda presente invenção são extraídas a partir de material enriquecido por glucano ou produto enriquecido por glucano (GEM, ALLTECH, Inc., Nicholasville, KY, USA), por exemplo, por extração ácida (veja, Kwiatkowski e outro (2009) J. Instit. Brew. 115:1031; aqui incorporado por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, oxidação moderada de polissacarídeo (por exemplo, (1-4)-a- /(1-6)-β-D-glucano) na posição de C-6 dos anéis de glicopiranose usando dimetilsulfóxido (DMSO)/anidrido acético (Ac2O) mistura (veja, Pfizner e outro (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:3027; aqui incorporado por referência em sua totalidade) converte grupos C-6 hidroximetileno (CH2OH) nos grupos aldeído (CH=O) (veja, Zekovic e outro (20060 Chem. Papers 60:243-248; aqui incorporado por referência em sua totalidade), e faz uma forma oxidada de antígeno (por exemplo, (1-4)- α-/(1-6)-β-D-glucano) capaz entrar em aminação redutiva com veículo (por exemplo, BSA) (veja, Moreau e outro, Pat. U.S. No. 6.596.861; Abdel-Magid e outro (1996) J. Org. Chem. 61:3849-3862; cada qual aqui incorporado por referência em sua totalidade).
[00086] Métodos de conjugação da presente invenção, por exemplo, compreendendo ativação de polissacarídeo em C6-OH, fornece estrutura original completamente conservada da porção de polissacarídeo, e portanto é vantajoso para preparação de antígeno. Métodos alternativos de ativação de poli- ou oligossacarídeo incluindo porém não limitado a oxidação de periodato (veja, Hay e outro (1973) Methods Carb. Chem. 5:357-370; aqui incorporado por referência em sua totalidade) ou ativação de CDAP (veja, Lees e outro (1996) Vaccine 14:190-198) produziu polissacarídeos substancialmente modificados, comprometendo sua utilidade como antígenos.
[00087] Outro aspecto da invenção é um método de preparar uma globulina imune para uso em ensaios para detectar componentes de parede celular de levedura (por exemplo, (1-4)-«-D-glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura) compreendendo as etapas de imunizar um indivíduo com um componente de parede celular de levedura (por exemplo, (1-4)-a-D- glucano de levedura, (1-6)-β-D-glucano de levedura, (1-4)-a- /(1-6)-β-D-glucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano-BSA, ou outros fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos) e isolando imuno globulina do recipiente. Uma imuno globulina preparada por este método é um outro aspecto da invenção.
[00088] Inóculos para produção de anticorpo policlonal são tipicamente preparados dispersando-se a composição antigênica em um diluente fisioloicamente tolerável tal como solução salina ou outros adjuvantes para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imu- noestimuladora de inóculo é administrada a um indivíduo e o indivíduo inoculado é em seguida mantido durante um tempo suficiente para a composição antigênica para induzir anticorpos protetores.
[00089] Os anticorpos podem ser isolados à extensão desejada por técnicas bem conhecidas tal como cromatografia de afinidade (veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies; a Laboratoty Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratoty Press).
[00090] Anticorpos incluem preparações de anti-soro de uma variedade de animais geralmente usados (por exemplo cabras, primatas, coelhos, burros, suínos, cavalos, cobaias, ratos ou homem). Os animaissão sangrados e soro recuperados.
[00091] Uma imuno globulina produzida de acordo com a presente invenção pode incluir anticorpos totais, fragmentos de anticorpo ou sub- fragmentos. Anticorpos podem ser imunoglobulinas totais de qualquer classe por exemplo IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade dual para dois ou mais antígenos da invenção. Eles podem da mesma forma ser fragmentos por exemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv e similar incluindo fragmentos híbridos.
[00092] Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas usando métodos conhecidos na técnica para produzir anticorpos de única cadeia que especificamente ligam-se a um antígeno particular. Anticorpos com especificidade relacionada, porém de composição idiotípica distinta, pode ser gerado por embaralhamento de cadeia de bibliotecas de imunoglobina combinatoriais aleatórias (veja, por exemplo, Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 23, 1991).
[00093] Anticorpos de única cadeia da mesma forma podem ser construídos usando um método de amplificação de DNA, tal como PCR, usando cDNA de hibridoma como um modelo (veja, por exemplo, Thirion e outro, 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Anticorpos de única cadeia podem ser mono- ou biespecíficos, e podem ser bivalentes ou tetravalentes. Construção de anticorpos de única cadeia tetravalentes, biespecíficos, por exemplo, em Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. Construção de anticorpos de única cadeia bivalentes, biespecíficos é ensinada, por exemplo, em Mallender & Voss, 1994, J., Biol. Chem. 269, 199-206.
[00094] Uma sequência de nucleotídeo codificando um anticorpo de única cadeia pode ser construída usando síntese de nucleotídeo manual ou automatizada, clonada em um construtor de expressão usando métodos recombinantes padrões de DNA, e introduzidos em uma célula para expressar a sequência de codificação, como descrito abaixo. Alternativamente, anticorpos de única cadeia podem ser produzidos diretamente usando, por exemplo, tecnologia de fago filamentosa (veja, por exemplo, Verhaar e outro, 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls e outro, 1993, J., Immunol. Meth. 165, 81-91).
[00095] Anticorpos que especificamente ligam-se a um antígeno particular podem da mesma forma ser produzidos in vivo induzindo produção na população de linfócito ou avaliando-se bibliotecas de imunoglobulina ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos como descrito na literatura (veja, por exemplo, Orlandi e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 3837, 1989; Winter e outro, Nature 349, 293 299, 1991).
[00096] Anticorpos quiméricos podem ser construídos como descrito em WO 93/03151. Proteínas de ligação que são derivadas de imunoglobulinas e que são multivalentes e multiespecíficas, tal como os "dianticorpos" descritos em WO 94/13804, da mesma forma podem ser preparados. Anticorpos podem ser purificados bem por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser purificados por afinidade por passagem em uma coluna a qual o antígeno relevanteé ligado. Os anticorpos ligados podem em seguida ser eluídos da coluna usando um tampão com uma alta concentração de sal.
[00097] Uma composição imunogênica da invenção pode ser administrada a um indivíduo que em seguida age como uma fonte de imuno globulina, produzida em resposta a desafio da composição imunogêni- ca específica. Um indivíduo desse modo tratado doaria plasma do qual hiperimuno globulina seria obtida por meio de metodologia de fracionamento de plasma convencional.
[00098] Composições da presente invenção incluem porém não são limitadas a anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou poli- clonais) que podem ser imunoglobulinas totais de qualquer classe (por exemplo IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quiméricos) ou anticorposhíbridos com especificidade para dois ou mais antígenos da invenção. Eles podem da mesma forma ser fragmentos por exemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv e similar incluindo fragmentos híbridos.
[00099] Métodos de preparar anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Veja, por exemplo, Kohler e Milstein 1975 Nature 256; 495; Harlow e Lane, Antobodies; a Laboratory Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratory Press). Alternativamente, fragmentos de Fv monoclonais podem ser obtidos avaliando-se uma biblioteca de exibição de fago adequada (Veja, por exemplo, Vaughan TJ e outro 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Anticorpos monoclonais podem ser humanizados ou parcialmente humanizados por métodos conhecidos.
[000100] Em algumas modalidades da presente invenção, composições de anticorpos são capazes de reconhecer antígenos de parede celular de levedura (por exemplo, anticorpos monoclonais ou policlo- nais capazes de reconhecer (1-4)-α-D-glucano de levedura, (1-6)-β- D-glucano de levedura, (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de levedura, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos). Em algumas mo-dalidades,composições de anticorpo da presente invenção ligam-se a parede celular de levedura (1-4)-α-D-glucano, porém não porções contendo (1-4)-α-D-glucano presentes em substâncias diferentes de parede celular de levedura polímeros contendo (1-4)-a-D-glucano (por exemplo, parede celular de levedura (1-4)-a-D-glucano, parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos). Em algumas modalidades, composições de anticorpo da presente invenção ligam-se a parede celular de levedura (1-6)-β-D-glucano, porém não porções contendo (1-6)- β-D-glucano presentes em substâncias diferentes de parede celular de levedura polímeros contendo (1-6)-β-D-glucano (por exemplo, parede celular de levedura (1-6)-β-D-glucano, parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos). Em algumas modalidades, composições de anticorpo da presente invenção ligam-se a parede celular de levedura (1-4)-a- /(1-6)-β-D-glucano, porém não porções contendo (1-4)-α-/(1-6)-β- D-glucano presentes em substâncias diferente de parede celular de levedura (por exemplo, parede celular de levedura (1-4)-α-/(1-6)-β- D-glucano, ou fragmentos, variantes, ou conjugados dos mesmos).
[000101] Os seguintes exemplos são fornecidos para demonstrar e também ilustrar certas modalidades preferidas e aspectos da presente invenção e não serão interpretado como limitando o escopo dos mesmos. Exemplo 1
[000102] Extração de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano de β-glucano de parede celular de levedura de Saccharomyces cerevisiae de grau de alimento
[000103] Um (1-6)-β-D-glucano de grau industrial (ALL-BGY, ALLTECH, Inc., Nicholasville, KY, USA) produzido a partir de S. cere- visiae por um tratamento enzimático/alcalino/térmico foi lavado quatro vezes com água desionizada para remover quaisquer resíduos solúveis. Depois de secagem por congelamento, “material enriquecido por glucano” (“GEM”) foi obtido.
[000104] Figura 1 ilustra a preparação das várias frações. Digestão ácida de glucano de parede celular de levedura foi realizada como descrito em Kwiatkowski e outro (2009) J. Instit. Brew. 115:151-158; aqui incorporado por referência em sua totalidade. “Material enriquecido por glucano” (“GEM”) (70 g) foi submetido a hidrólise com 700 mL de 100 mM de HCl (pH 2,2) a 80°C durante 6 horas. Depois deste tempo, a mistura foi centrifugada em 13.500 x g/l0°C/10 min e sobrenadante foi coletado. A pelota foi extraída duas vezes com 150 ml de água desionizada e liofilizada, produzindo 57,9 g de um produto amorfo branco (P1).
[000105] As duas lavagens foram combinadas com o sobrenadante original e neutralizadas em pH 7,0 com 2N de NaOH. O precipitado que formou-se foi coletado (pelota P1/7) da centrifugação (1,82 g depois da liofilização) e o sobrenadante foi concentrado em um volume de 450 ml usando um evaporador giratório a vácuo Buchi em uma temperatura de 37°C. Esta solução foi também concentrada usando 5 kDa de dispositivos de centrifugação de ultra-filtração AMICON 15 (Millipore Corporation, Delaware USA). O concentrado (~150 mL) foi lavado por centrifugação duas vezes com dois volumes iguais de água desionizada, usando os mesmos dispositivos de ultra filtração, para remover sal e os componentes de baixo peso molecular resultando na hidrólise de ácido. O concentrado lavado (S1) foi liofilizado, produzindo 7,5 g de produto amorfo branco. Uma parte da pelota P1 foi submetida a uma segunda extração usando a mesma relação de reagentes e condições como na primeira extração de 0,1N de HCl. Estes produtos foram liofilizados para produzir P2 e S2. A segunda extração com 0,1N de HCl não produziu um precipitado depois que o sobrenadante foi neutralizado. Uma parte da pelota P2 foi submetida a uma terceira extração usando a mesma relação de reagentes e condições como na primeira extração de 0,1N de HCl e os produtos foram liofilizados para produzir P3 e S3. A terceira extração com 0,1N de HCl não produziu um precipitado depois que o sobrenadante foi neutralizado. A composição de carboidrato e a estrutura de polissacarídeo das frações solúveis e não-solúveis das extrações de 0,1N de HCl foram estabelecidas usando espectroscopia de 1H NMR. A manose e teor de glicose nas amostras foram analisados usando análise de composição de H2SO4- HPLC (veja, Brinca e outro (1998) Yeast 14:1297-1306; aqui incorporado por referência em sua totalidade). Uma quantidade calculada de teor de proteína foi calculada usando análise de combustão de LECO e multiplicando-se o teor de nitrogênio por um fator de 6,25.
[000106] Quinhentos e oitenta miligramas de glucano ‘solúvel’ foram colocados em um frasconete de vidro de 22 ml equipado com um bastão de agitação magnético e parado com um septo de borracha. Neste fras- conete, 10ml de DMSO anidroso e 110μl de anidrido acético foram adicionados usando uma seringa de vidro, em temperatura ambiente e sob agitação. A suspensão de glucano dissolveu completamente dentro de 4 horas de agitação a 20°C. Agitação da mistura foi continuada durante 24 horas, depois de que a mistura de reação foi diluída com 40ml de água. A solução clara resultante foi concentrada usando um dispositivo de centrifugação de ultra-filtração 30 kDa Amicon®15 e o resíduo no filtro foi lavado cinco vezes com 12 ml de água desionizada cada, para separar e purificar o produto de oxidação de solventes e reagentes. Todas as centrifugações foram feitas a 4.750 x g/30 min/l0°C. O resíduo final no filtro foi coletado e secado por congelamento produzindo 502 mg do (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano oxidado na forma de um pó branco. O pro-duto foi parcialmente solúvel em água e completamente solúvel em DMSO.
[000107] Encontrada para glucano oxidado: C-40,05%; H-6,61%. Calculado para C6H8O5 x H2O: C-40,48%; H-5,66%
[000108] Uma amostra de 412 mg de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano oxidado foi dissolvida em 20 ml de água desionizada e foi combinada com uma solução de 256 mg de BSA em 2 ml de água desionizada sob agitação magnética. A mistura foi em seguida tratada com 60 mg de cianoboroidreto de sódio sólido. O frasconete de reação foi parado com um septo de borracha, e a mistura foi agitada a 20°C durante 24 horas. Depois deste tempo, 100 mg de boroidreto de sódio foram adicionados e a mistura foi agitada durante 22 horas adicionais. A soluçãoclara foi em seguida filtrada por dispositivo de centrifugação de ultra filtração 30 kDa Amicon®15 a 4.750 x g/30 min/10°C. O resíduo foi lavado no filtro quatro vezes com 12 ml de água cada e o concen-trado final foi liofilizado, produzindo 573 mg de um pó branco.
[000109] Uma solução de 400 mg do conjugado cru em 5 ml de 5 mM de Na2HPO4 foi introduzida no topo de uma coluna cromatografia de vidro de 2 x 55cm contendo 50 g de DEAE Celulose em 5mM de Na2HPO4. Na2HPO4 em várias concentrações foi usado para eluição de: 40,1 mg de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucano (220 ml, 5 mM); 132,3 mg de conjugado de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucanoBSA puro (280 ml, 55 mM); e 96,7 mg de BSA (80 ml, 100 mM). Solução de conjugado de (1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucanoBSA pura foi concentrada em um volume de 2 ml usando um dispositivo de centrifugação de ultra filtração 30 kDa AMICON15, lavada com água desionizada e liofilizada, produzin- do 132,3 mg (24,4% de rendimento total) de produto semelhante a pó branco. Eletroforese em gel produziu uma ampla faixa revelada usando-se manchamento Comassie Blue e PAS, com um centro a ~170 kDa. Nenhum BSA livre ou quaisquer outras impurezas foram detectadas nos eletroforegramas. Análise elementar C 40,11%, H 6,23%, N 3,06%, (20,44% em p de BSA). A relação calculadade β-glucano : BSA é 4:1.
[000110] Dez mg de antígeno conjugado por BSA preparado como descrito no Exemplo 2 foram liofilizados, armazenados a 4°C, e usados para imunização de três coelhos (200 μg de antígeno por imunização). O protocolo de imunização foi como listado na Tabela 1. Tabela 1. Protocolo de imunização para geração de anticorpos policlo- nais anti(1-4)-α-/(1-6)-β-D-glucanoBSA em coelhos.
[000111] Um grama de Agarose ativada por Epóxi (Sigma E 6632) foi suspensa em uma solução de 2,68 g de BSA (SIGMA A2153) em 27 ml de 10 mM de Na2HPO4 e a mistura foi agitada durante 4 horas a 4°C em um banho de gelo-água. Depois deste tempo, a mistura foi centrifugada a 2500 x g/5 min/io°C e a pelota foi lavada e centrifugada mais quatro vezes com 30 ml de 100 mM de Na2HPO4/0,05% em p de NaN3 cada.
[000112] A pelota da última centrifugação da fase de afinidade revestida por BSA (descrita supra) foi suspensa na solução de 750 μl dos soros (coletadas do coelho que foi imunizado com o conjugado de glucano- BSA ‘solúvel’) em 20 ml de 10 mM de Na2HPO4/0,05% em p de NaN3 e caiu 2 h em temperatura ambiente e em seguida centrifugada a 1500 x g/5 min/io°C. O sobrenadante foi coletado e a pelota lavada mais três vezes com 20 ml do mesmo tampão, resultando na coleção de mais três sobrenadantes. Os sobrenadantes foram examinados quanto a especificidade para BSA e glucano ‘solúvel’ como apresentado na Figura 2. O primeiro e o segundo sobrenadantes, que contiveram quantidade signi- ficante de anticorpos, foram agrupados juntos e concentrados em um volume de 2,5 ml por centrifugação a 5000 x g/5 min/10°C usando um Dispositivo de Filtro de Centrífuga 10 kDa AMICON Ultra-15. O concentrado foi lavado no filtro com 10 mM de Na2HPO4/0,05%em p NaN3 e diluído em a um volume de 6 ml (6 g) com o mesmo tampão. Esta solução a 1:800 diluição ‘anticorpos purificados por afinidade’ foi usada no ensaio de ELISA para MYCOSORB em alimentação animal. A curva de calibra- ção obtida é apresentada na Figura 3.
[000113] Apenas reagentes de grau analítico reconhecido foram usados, a menos que de outra maneira especificado, e água desionizada ou desmineralizada ou pureza equivalente de água (18.2 MQ/cm a 25 °C).
[000114] Reagentes e preparação de soluções de reagente foram como segue: • Ácido clorídrico, 12,1 N; HCl • Ácido Clorídrico diluído, 1 N; HCl: 41,3 ml HCl 121 N foi lentamente adicionado a 400 ml de água desionizada e misturado com uma barra de agitação em uma placa de agitação até resfriar. A solu ção foi transferida em um frasco volumétrico de 500 ml e trazida em volume com água desionizada, em seguida armazenada em temperatura ambiente. • Dimetil sulfóxido: DMSO usado foi pureza alta, adequado para espectrofotometria, cromatografia líquida e cromatografia de gás. • Reagente de extração: Para preparar reagente de extração, 900 ml de DMSO foi misturado com 98,75 ml de água desioniza- da e 1,25 ml de HCl 12,1N. A solução foi misturada com uma barra de agitação em uma placa de agitação em velocidade média e temperatura ambiente, em seguida armazenada a 20°C ou acima. • Cloreto de sódio (“NaCl”) • Cloreto de potássio (“KCl”) • hidrogeno fosfato dissódico (“Na2HPO4”) • Diidrogêno fosfato de potássio (“KH2PO4”) • Solução Salina de Tampão de Fosfato (“PBS”) 10X: Para preparar 10X de PBS, 80,0 g de cloreto de sódio [NaCl], 2,0 g cloreto de potássio [KCl], 14,2 g de hidrogeno fosfato dissódico [Na2HPO4] e 2,4 g diidrogeno fosfato de potássio [KH2PO4] foram misturados com aproximadamente 800 ml de água desionizada. A solução foi agitada usando uma barra de agitação em uma placa de agitação até que sólidos foram completamente dissolvidos. A solução foi transferida em um frasco volumétrico de 1000 ml e trazida em volume com água desioni- zada, em seguida armazenada em temperatura ambiente ou a 2-8 °C. O tempo de armazenamento máximo foi 6 meses a 2-8 °C como um líquido não diluído. A solução foi aquecida em temperatura ambiente antes do uso. • PBS diluído, 1X: Para preparar 1X de PBS, 1 volume de PBS, 10X foi diluído com 9 volumes de água desionizada. A diluição foi misturada usando uma barra de agitação em placa de agitação em velocidade média e temperatura ambiente. O tempo de armazenamen- to máximo foi um dia. • Polissorbato 20 • Solução Salina Tamponada de Fosfato, 0,01 M com 0,05 % de Polissorbato 20, pH 7,4: Para preparar, os teores de uma bolsa foi dissolvido em 1000 ml de água desionizada. A solução foi agitada em uma placa de agitação até que completamente dissolveu, em seguida armazenada em temperatura ambiente ou a 2-8 °C. O tempo de armazenamento máximo foi 6 meses a 2-8 °C como um líquidonão diluído. A solução foi aquecida em temperatura ambiente antes do uso. • Leite sem gordura seco • Leite sem gordura seco, 3 % (p/v) em PBS, reagente 1X BLOCK: Para preparar reagente 1X Block, leite seco foi completamente dissolvido em 1X PBS antes do uso. Um volume de 10 ml foi necessáriopara cada placa para bloquear. O tempo de armazenamento máximo foi um dia. • Anticorpos Policlonais de Coelho; anticorpo primário (Soluçãode Anticorpo #1): Anticorpos purificados por afinidade preparados como descrito aqui. Armazenado a -80 °C até o uso. • Solução de anticorpo policlonal de coelho diluída: Diluída a 1:Xi em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #1 a Xi μl de PBS, 1X. Um volume de 10 ml de solução foi necessário para cada placa de microtítulo. Solução de anticorpo diluída foi bem misturada antes do uso, e anticorpo diluído em excesso foi descartado. O tempo de armazenamento máximo foi um dia. • IgG anti-coelho de Cabra AffiniPure conjugado por Peroxidase (H+L); anticorpo secundário HRP, Ref. #111-035-045 (Jackson ImmunoResearch, PA, USA - Antibody Solution #2): Reidratado com 1,5 ml de água desionizada e centrifugado até obter uma solução completamente clara. Armazenado em alíquotas de 10 μl a- 80 °C até o uso. O tempo de armazenamento máximo foi 6 semanas a 2-8 °C como um líquido não diluído. • Anticorpo anti-coelho de cabra diluído: Diluído a 1:Yi em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #2 apara Yi μl PBS, 1X. Solução de anticorpo diluída foi bem misturada antes do uso, e anticorpo diluído em excesso foi descartado. O tempo de armazenamentomáximo foi um dia. • Substrato TMB Microwell Peroxidase Reversa SureBlue: O volume necessário foi redispensado em garrafas Nalgene HDPE e LDPE ambarinas apenas. O substrato foi aquecido em temperatura ambiente antes do uso. A tampa foi mantida fechada firmemente, protegido de luz. Substrato em excesso foi descartado, e o reagente foi armazenado a 2-8°C. O tempo de armazenamento máximo foi 24 meses de data de fabricação quando armazenado a 8°C. • Amostra de matéria prima MYCOSORB; batelada Ref. #285965 (ALLTECH, Inc., KY, USA): Uma amostra homogênea de MYCOSORB foi usada. • Diluição de MYCOSORB em gêneros alimentícios: 20 g do material de alimentação foram misturados com quantidades crescentes de produto de MYCOSORB (0,01; 0,02; 0,08; 0,10; 0,12 g) em uma garrafa de centrífuga de 250 ml em três réplicas para gerar uma curva padrão. A garrafa foi agitada em uma agitadora orbital a 400 rpm durante 1 hora. A precisão para pesar os materiais de alimentação igualados ± 0,025 g e para o produto de MYCOSORB, ± 0,005 g. • Batelada grande de MYCOSORB diluído em gêneros ali-mentícios: Uma amostra grande de produto de MYCOSORB diluído em alimentação foi preparada usando 1,2 g de produto e 300 g do material de alimentação em um recipiente de 1000 ml. A garrafa foi agitada em uma agitadora orbital a 400 rpm durante 1 hora. A concentração final de produto de MYCOSORB no material de alimentação foi 4,0 kg/T. 20,0 g da mistura de alimentação-produto de batelada grande de 300,0 g homogeneizada foi transferida em uma garrafa de centrífuga de 250 ml. A transferência foi repetidas mais 9 vezes para obter 10 amostras de réplica. A mistura foi com intermitência agitada entre cada 3 alíquotas preparadas para evitar a sedimentação de produto à base da garrafa. A precisão para pesar os materiais de alimentação igualados ± 0,025 g e o produto de MYCOSORB, ± 0,005 g. • Diluição de quantidade de MYCOSORB desconhecido em gêneros alimentícios: Uma amostra desconhecida foi preparada transferindo-se uma quantidade desconhecida de produto de MYCOSORB e 20,0 g (± 0,025 g) do material de alimentação para cada uma de cinco garrafas de centrífuga de 250 ml. A garrafa foi agitada em uma agitadora orbital a 400 rpm durante 1 hora. Preparação de amostra da curva padrão para a(s) amostra(s) foi completada simultaneamente. Formulação de amostra
[000115] Três materiais de alimentação (veja Tabela 4, Tabela 5, e Tabela 6) foram usados para validar o ensaio. A formulação de material de alimentação foi selecionada de acordo com as composições que podem ser encontradas na técnica. O tamanho de amostra foi um total de 15 kg de material de alimentação que foi cuidadosamente homogeneizado antes de ser enviado ao laboratório. A amostra foi armazenada a 2-8°C durante o período de estudo total.
[000116] A homogeneidade da diluição do produto de MYCOSORB no material de alimentação foi verificada preparando-se uma batelada grande de produto de MYCOSORB diluído em alimentação em uma concentração de intermediário de produto na alimentação de 4.0 kg/T. A amostra foi dividida em 10 sub-amostras e foi também extraída de acordo com o procedimento de extração e seguido pela determinação do coeficiente de variação para a detecção do produto por meios do ensaio de ELISA quatro vezes para cada uma das 10 amostras.
[000117] A preparação de amostra padrão foi feita como descrito aqui e é apresentada na Tabela 2, com o produto de MYCOSORB a ser testado. Neste caso, o produto de matéria prima inicial foi referenciada como declarado aqui. As amostras desconhecidas foram preparadas de acordo com como descrito supra. Nenhuma moagem da amostra de alimentação foi requerida antes de realizar o procedimento de extração, (isto da mesma forma teria sido o caso se o material de alimentação fosse fornecido sob uma forma peletizada). Foi constatado que moagem do material de alimentação podem afetar a segurança final do ensaio. Tabela 2. Etapas de diluição de produto de MYCOSORB para curva padrão.
a Fator de diluição expressado em quilogramas de produto de MYCOSORB por tonelada de material de alimentação b Faixa de alimentação = ± 0,025 g, c Faixa de produto MYCOSORB = ± 0,005 g d Onde C é uma quantidade de MYCOSORB desconhecido em gêneros alimentícios
[000118] Os grupos totais de garrafas foram agitados em uma agitadora orbital a 400 rpm durante 1 hora. Três garrafas de cada vez foram removidas e um volume de 80 ml de reagente de extração foi adicionado a cada garrafa usando um dispensador volumétrico de topo de garrafa. Garrafas foram tampadas. Todas as amostras foram agitadas à mão para garantir mistura total com o reagente de extração. As gar- rafas foram colocadas em um banho de água termoestatisticamente mantido a 80 °C durante 1 hora, tendo certeza que a solução de alimentação foi completamente submersa. Depois da incubação as garrafas foram removidas do banho de água e o teor das garrafas misturados com varas (marca registrada NALGENE) usando um agitador de laboratório de alto torque. A mistura foi completamente homogeneizada. Uma vara limpa foi usada para cada nível de inclusão de MYCOSORB e para cada amostra(s) desconhecida(s). As garrafas foram substituídas no banho de água termoestatisticamente mantido a 80°C durante 1 hora. Depois da incubação, as garrafas foram removidas do banho de água e 80 ml de água desionizada foi adicionado a cada garrafa, usando um dispensador volumétrico de topo de garrafa, e em seguida garrafas foram tampadas. As garrafas foram agitadas à mão até completamente misturadas; varas de marca registrada NALGENE com o agitador de laboratório de alto torque foram usadas quando necessário. As garrafas foram centrifugadas a 8.000 g durante 10 minutos. Usando pipetas de vidro, aproximadamente 10 ml do so- brenadante foram transferidos em tubos estéreis de centrífuga de 15 ml. Os tubos foram centrifugados a 4.000 g durante 10 minutos e transferidos em novos tubos estéreis de centrífuga de 15 ml, adequadamente rotulados, decantando-se. Os tubos foram armazenados a - 20°C durante a noite até que usado para ensaio de ELISA.
[000119] O substrato de TMB Microwell Peroxidase Reserva SureBlue foi usado para ativar uma reação colorimétrica através da reação com o anticorpo secundário de HRP diluído, também reagindo com o próprio anticorpo primário diluído especificamente reagindo com o substrato de interesse extraído do produto de MYCOSORB diluído, que é imobilizado na placa de microtítulo. A reação colorimétrica foi ultimamente parada depois de 20 minutos usando HCl, 1N e a leitura de absorvência foi rea- lizada em uma leitora de placa em um comprimento de onda de 450 nm. Portanto, esboços feitos do material de alimentação apenas foram medidos para contabilizar possível variação colorimétrica vindo da matriz de alimentação determinando um sinal antecedente no espectrofotôme- tro. Para cálculo, os valores de esboço foram subtraídos dos valores de absorvência obtidos para cada amostra.
[000120] As amostras previamente extraídas armazenadas durante a noite foram descongeladas e aquecidas em temperatura ambiente. As amostras foram vortexadas para garantir amostra homogênea antes do uso em ELISA para revestir cavidades de placas de microtítulo.
[000121] Para cada réplica de amostra, 100 μl do sobrenadante foram transferidos a cada de 3 cavidades em, uma placa de microtítulo de 96 cavidades como apresentado na Tabela 3. Uma distribuição ale- atorizada das amostras na placa poderia ser realizada em laboratório equipado com um dispensador de cavidade de microtítulo robotizado programado. As amostras de curva padrões e réplicas de amostra foram tudas distribuídas em uma única placa (isto é todas 0 kg/T réplicas de amostra foram semeadas através de linha/coluna E1 a F10). As amostras de réplica de MYCOSORB desconhecidas foram distribuídas na mesma placa (isto é semeado através de fila/coluna A11 a C12). As placas de microtítulo foram seladas com película adesiva de micropla- ca e incubadas a 37°C durante 1 hora. Depois da incubação, a solução em cada cavidade da placa de microtítulo foi removida e substituída por 250 μl de PBS, 1X durante uma única lavagem. A operação foi repetida um total de mais 2 vezes. Cada cavidade da placa de microtítu- lo foi bloqueada com 100 μl de leite sem gordura diluído em solução de PBS e incubada em temperatura ambiente durante 1 hora. Depois da incubação a solução em cada cavidade foi removida e substituída por 250 μl de PBS, 1X durante uma única lavagem, seguido por 250 μl de PBS contendo polissorbato 20, 0,05% durante 2 lavagens.
[000122] Um volume de 100 μl do anticorpo primário diluído foi adicionado a cada cavidade. A placa de microtítulo foi incubada em temperatura ambiente durante 1 hora. Depois da incubação a solução em cada cavidade da placa de microtítulo foi removida e substituída por 250 μl de PBS, 1X contendo Polissorbato 20, 0,05% durante 3 lavagens.
[000123] Um volume de 100 μl do anticorpo secundário diluído foi adicionado a cada cavidade. A placa de microtítulo foi incubada em temperatura ambiente durante 1 hora. Depois da incubação a solução em cada cavidade da placa de microtítulo foi removida e substituída por 250 μl de PBS, 1X contendo Polissorbato 20, 0,05% durante 3 lavagens.
[000124] Um volume de 100 μl de Substrato de TMB, pré-aquecido em temperatura ambiente, foi adicionado a cada cavidade e a placa de microtítulo foi incubada durante 20 minutos em temperatura ambiente. Depois de exatamente 20 minutos com o substrato de TMB, um volume de 100 μl de HCl, 1N foi imediatamente adicionado a cada cavidade para parar o desenvolvimento colorimétrico. Cada placa de microtí- tulo foi lida em uma leitora de placa de microtítulo a 450 nm. Tabela 3 . Distribuição de grupo de amostra na placa de microtítulo.
* Onde C é um nível de produto de MYCOSORB desconhecido da inclusão em gêneros alimentícios ** refere-se a Tabela 2 para identificação de grupo de amostra Exclusão de dados de réplicas
[000125] Análise de dados estatística foi necessária para garantir que todas as réplicas foram similares, excluindo aqueles que não passam o Teste Q do Dixon e em seguida consequentemente identificado como discrepantes de acordo com a definição
onde R é a faixa de todos os pontos de dados; xa é o discrepante suspeito; xb é o ponto de dados mais próximo a xa. Se Qcalculado > Qtabela em seguida rejeita o ponto questionável em um intervalo de confiança de 95%.
[000126] Curvas de calibração foram usadas para a quantificação. Elas são construídas para cada matriz de alimentação usando pelo menos cinco níveis (incluindo zero) na faixa de funcionamento do produto como declarado no Council Directive 96/23. A média das três réplicas de absorvências de cavidade a OD450 para cada grupo de amostra foi calculada. A média das dez réplicas de absorvências de cavidade a OD450 para cada amostra de alimentação em branco foi calculada. Uma curva padrão ou curva de calibração foram em seguida feitas com a di-ferençaΔ OD450 (grupo de amostra OD450 - alimentação em branco OD450) obtido na ordenada e as faixas de concentração de produto de MYCOSORB diferentes, 0,5, 1,0, 4,0, 5,0, 6,0 kg/T na abscissa.
[000127] O coeficiente de regressão e a equação dos níveis de inclusão plotados contra absorvência de OD450 foi calculado de acordo com uma regressão linear usando a melhor linha de ajuste, Δ OD450 = Ax (MYCOSORB) depois da correção dos valores pelo valor em branco médio. A faixa de aceitabilidade e o linearidade da curva de calibração foram validados por um coeficiente de correlação (r2) valor superior a 0,95. A equação correspondente da curva foi em seguida usada para determinar o nível de inclusão de produto de MYCOSORB na amos- tra(s) desconhecida(s) solucionando-se a equação correspondente.
[000128] Deveria um coeficiente de correlação acima r2 > 0,95 ser encontrado com a curva padrão, a equação correspondente da curva corrigida F(x) = Ax, (subtraído do sinal antecedente e interceptando o zero) é em seguida usado para determinar o nível de inclusão de produto de MYCOSORB na amostra(s) desconhecida(s). A média das dez réplicas em OD450 para o nível de inclusão desconhecido (C) de produto de MYCOSORB é calculado. A média obtida é subtraída da média das dez réplicas de absorvências de cavidade em OD450 para a amostra de alimentação em branco previamente calculada. O valor médio de OD450 é em seguida usado para solucionar a equação da curva corrigida F-1(yC), onde yC = AxC:
onde yc é a média obtida de OD450 para a amostra desconhecida (C) menos o OD450 do esboço, xc é o nível de inclusão correspondente de produto de MYCOSORB, e A é o declive da curva padrão, em kg/T OD450.
[000129] O Limite de Detecção (LD = 3o esboço) e Limite de Quantificação (LQ = 10o esboço) foram medidos de acordo com a nomenclatura de IUPAC e determinado como Δ OD450.
[000130] O Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) foram determinados da análise de esboço de matriz e calculados em concentração da regressão de revestimento corrigida do valorde OD450 antecedente médio por meios da curva de calibração F(x) = Ax solucionado como seguido de acordo com:
I onde LD é a concentra ção detectável mínima de produto ou Limite de Detecção; LQ é a concentração quantificável mínima de produto ou Limite de Quantificação.
[000131] O coeficiente de variação de homogeneidade (RSD H = CV H) foi definido como o coeficiente médio de variação de 10 réplicas independentes obtidas da mesma amostra no mesmo dia, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método.
[000132] A precisão de intra-repetibilidade (RSDintra = CVintra) foi definida como o coeficiente médio de variação das repetições obtidas da mesma amostra no mesmo dia para o mesmo ciclo, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método.
[000133] A precisão de inter-repetibilidade (RSDInter = CVInter) é o coeficiente médio de variação de resultados independentes obtidos da mesma amostra em dias diferentes durante ciclos diferentes, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método.
[000134] A precisão avalia a dispersão (ou proximidade) do acordo entre medidas sucessivas da mesma quantidade. A dispersão em um grupo de medidas é normalmente expressada em termos do desvio padrão. A precisão foi desse modo calculada do desvio padrão de uma única experiência individual em um único nível de inclusão obtido da mesma amostra no mesmo dia, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método; do desvio padrão comparando cada ciclo individual, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método de acordo com a fórmula:
onde GTotai é o desvio padrão do grupo total de experiências, Sintra é o desvio padrão de uma única experiência individual, winter é o desvio padrão entre experiências múltiplas, e n é o número de réplicas.
[000135] A comparação do desvio padrão foi obtida da análise de variância (ANOVA de único sentido) usando um teste F (valor = 0,05) entre a variância dos meios de grupo e a média das variâncias de intra-grupo. Precisão
[000136] A precisão é a proximidade de consentimento que pode ser encontrado entre resultados de teste e o valor de referência aceito do produto sendo medido. A precisão foi desse modo avaliada da medida da recuperação expressa como percentis. A recuperação representa neste respeito, a proporção da quantidade presente em ou analisado misturado que é extraído e disponível para medida. A influência é a diferença entre os resultados de teste e um valor de referência aceito (concentração reforçada do analisado). Os cálculos foram realizados de acordo com as fórmulas:
onde Xc é a concen- tração medida em amostra reforçada; Xb é a concentração medida em amostra não reforçada (esboço); XTH é a concentração teórica.
[000137] Testes foram realizados no Center for Animal Nutrigenomics e Applied Animal Nutrition a ALLTECH, Inc., KY, USA em uma formulação de alimentação de leiteria, uma formulação de alimentação de galinha e uma formulação de alimentação de porco e material de alimentação mis-turado com níveis diferentes de inclusão do produto de MYCOSORB. A descrição total da formulação de alimentação é incluída infra.
[000138] O material de alimentação foi formulado por Coralis Vern (Vern sur Seiche, France, Ref. , #111605) sob o nome de fórmula “Spirit Lait 2L5” (Tabela 4). O tamanho de amostra foi um total de 15 kg de material de alimentação que foi cuidadosamente homogeneizado antes de ser enviado ao laboratório. A amostra foi armazenada a 2-8 °C durante o período de estudo total. O material de alimentação de leiteria foi fornecido sob forma peletizada. Nenhuma moagem da amostra de alimentação foi requerida antes de realizar o procedimento de extração. Tabela 4. Formulação de alimentação de leiteria usou para a validação do método.
deiramente digerível no intestino delgado. Cada alimentação contribui a síntese de proteína microbiana ambas pelo nitrogênio degradável (PDIMN) e a energia disponível fornece aos microorganismos de rume (PDIME). O valor de cada alimentação é determinada diretamente pela soma de PDIA e PDIM considerando as duas seguintes equações: (1) PDIN = PDIA + PDIMN e (2) PDIE = PDIA + PDIME.
[000139] O material de alimentação foi formulado na Coldstream University de Kentucky, um Alliance Research Group entre a Universidade de Kentucky e ALLTECH, Inc., KY,USA. (Tabela 5). A preparação foi feita de acordo com composições encontradas na técnica e pode ser generalizado às formulações geralmente encontradas na União européia, América do Norte, América Latina, etc. O tamanho de amostra foi um total de 15 kg de material de alimentação que foi cuidadosamente homogeneizado antes de ser enviado ao laboratório. A amostra foi armazenada a 2-8 °C durante o período de estudo total. Tabela 5 . Formulação de alimentação de galinha usada para a valida- ção do método.
a Vitamina fornecida por dieta de kg: 2200 IU vitamina A; 720 ICU vi- tamina D3; 27 IU vitamina E; 0,91 mg de vitamina K3 (2-metil-1,4- naftoquinona); 2 mg de tiamina; 8 mg de riboflavina; 55 mg de niacina; 18 mg de pantotenato de Ca; 5 mg de vitamina B6 (piridoxinas); 0,221 mg de biotina; 1 mg de ácido fólico; 478 mg de colina; 28 μg de vitamina B12 (cianocobalamina).
[000140] O material de alimentação foi formulado na Coldstream University of Kentucky, um Alliance Research Group entre a Universidade de Kentucky e ALLTECH, Inc., KY, USA (Tabela 6). A preparação foi feita de acordo com composições encontradas na técnica e que pode ser generalizada às formulações geralmente encontradas na União européia, América do Norte, América Latina, etc. O tamanho de amostra foi um total de 15 kg de material de alimentação que foi cuidadosamente homogeneizado antes de ser enviado ao laboratório. A amostra foi armazenada a 2-8°C durante o período de estudo total. Tabela 6 . Formulação de alimentação de porco usada para a validação do método.
[000141] Testes foram realizados no Centro para Animal Nutrigeno- mics e Applied Animal Nutrition em ALLTECH, Inc., KY, USA em um tipo europeu sólido de formulação de alimentação de leiteria misturada com cinco concentrações diferentes de produto de MYCOSORB.
[000142] Os materiais de alimentação de leiteria individualmente mis-turados com 0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 5,0; 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB foram analisados bem como uma amostra do mesmo material de alimentação de leiteria misturado com um nível desconhecido de produto de MYCOSORB quando distribuído em uma mesma placa de micro-título.
[000143] A validação foi realizada para determinar as características de um ensaio de ELISA desenvolvido para a análise específica do produto de MYCOSORB e substitutos, como um procedimento de ponto final de rastreabilidade para o propósito de localizar o produto em gêneros alimentícios complexos.
[000144] Seis níveis de um produto de MYCOSORB foram usados para a validação correspondendo à faixa de funcionamento de nível de inclusão (0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 5,0; 6,0 kg/T) misturado para a amostra de alimentação.
[000145] Solução de anticorpo policlonal de coelho diluída: a diluição de anticorpo primária foi adaptada de acordo com os níveis antecedentes. Os anticorpos foram desse modo diluídos a 1:2.500 em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #1 a 1,2 ml de PBS, 1X. Um volume de 10 ml de solução foi necessário para cada placa de microtítulo.
[000146] Anticorpo anti-coelho de cabra diluído: a diluição de anticor-posecundária foi adaptada de acordo com os níveis antecedentes. Os anticorpos foram desse modo diluídos em 1:20,000 em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #2 a 20,0 ml PBS, 1X.
[000147] A verificação de homogeneidade da amostra foi obtida para um nível mediano de inclusão de produto de MYCOSORB (4,0 kg/T) no plano experimental. O ensaio para este nível particular foi repetido 5 vezes em 10 amostras individuais usando 4 réplicas cada.
[000148] De acordo com os valores calculados encontrados detalhados na Tabela 7, o CVH foi 4,53%. Tabela 7 . Avaliação de homogeneidade em uma única concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado para um tipo europeu de dieta para leiteria avaliada através do procedimento de ELISA para 5 ciclos em 10 preparações de amostra individuais analisadas em 4 réplicas.
Calibração
[000149] A calibração do ensaio foi realizada na alimentação misturada com concentração de amostra padrão conhecida como descrito aqui e na faixa 0,0 a 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB. Um ajuste de curva linear, y = Ax, foi usado para definir a relação entre concentração e resposta (OD450). A curva padrão média de 5 ciclos é mostra- da na Figura 4.
[000150] A Linearidade das curvas padrões foi avaliada do cálculo do coeficiente de regressão de acordo com a equação dos níveis de inclusão plotados contra absorvência de OD450 usando a melhor linha de ajus-teinterceptando em zero Δ OD450 = Ax(MYCOSORB) depois da subtração do esboço, A linearidade da curva padrão é verificada com um coeficiente de valor de correlação encontrado acima r 2> 0,95, Tabela 8. Tabela 8 . Linearidade das curvas padrões.
* O erro quadrado médio é definir em modelos de regressões lineares como: 
onde ei = yi - Ayi; y é o valor de y experimen talmente medido; Ay é o valor teórico pela concentração de Xi esperada de produto de MYCOSORB.
[000151] A repetibilidade é uma medida da variância interna pela avaliação do desvio padrão de repetibilidade. A avaliação da repetibili- dade dentro da repetição de um ciclo foi obtida da mesma amostra no mesmo dia para o mesmo ciclo, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção dentro de um ciclo, CVintra (Tabela 9). A avaliação da repetibilidade entre ciclos diferentes foi obtida da mesma amostra a dias diferentes durante ciclos diferentes, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção entre ciclos, CV Inter Tabela 10).
[000152] Os resultados mostram que as curvas padrões obtidas no mesmo dia e em dias diferentes tem pouca variabilidade, com uma precisão de intra-dia média de 5,70% e uma precisão de entre-dia de 7,86% quando aplicado a uma faixa de funcionamento de curva padrão entre 0,0 e 6,0 kg/T. A precisão total foi 8,28% (Tabela 11). Tabela 9. Precisão de repetibilidade intra-ciclo para construção de cur-vapadrão.
Tabela 10 . Precisão de repetibilidade entre-ciclo para construção de curva padrão. 
Tabela 11 . Precisão total para construção de curva de padrão. 
LD e LQ (sensibilidade)
[000153] Os valores de LD e LQ são informados na Tabela 12. Os va- lores de LQ encontrados estavam abaixo da taxa de inclusão indicada mínima de 2 kg/T do produto de MYCOSORB, permitindo sua quantifi-cação em material de alimentação. Limite de Detecção LD = 0,501 ± 0,103 kg/T Limite de quantificaçãoLQ = 1,800 ± 0,389 kg/T Tabela 12 . Determinação de LD e LQ.
[000154] Precisão foi medida de 5 experiências independentes com-preendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada qual para a concentração de 4,0kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. A concentração final para cada amostra foi calculada de acordo com a equação expressa suprausando os valores observados obtidos para o cálculo de homogeneidade (Tabela 13). Em seguida a precisão média foi calculada da precisão calculada obtida para todos os ciclos e comparada à quantidade de concentração reforçada de 4,0kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. Os cálculos foram realizados de acordo com as equações determinadas supra.
[000155] O resultados mostram que a avaliação de recuperação res-pondeu por uma sobrestimação de 21% do teor real do material de alimentação em concentração reforçada de produto de MYCOSORB (Tabela 14). Tabela 13 . Exatidão e precisão medidas de 5 experiências independentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação.
Tabela 14 . Recuperação total medida da média de 5 experiências in-dependentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. 
[000156] Testes foram realizados no Centro para Animal Nutrigeno- mics and Applied Animal Nutrition em ALLTECH, Inc., KY, USA em uma formulação de alimentação de galinha sólida com cinco concentrações diferentes de produto de MYCOSORB.
[000157] Os materiais de alimentação de galinha individualmente misturados com 0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 5,0; 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB foram analisados bem como uma amostra do mesmo material de alimentação de galinha misturado com um nível desconhecido de produto de MYCOSORB quando distribuído em uma mesma placa de micro-título.
[000158] A validação foi realizada para determinar as características de um ensaio de ELISA desenvolvido para a análise do produto de MYCOSORB e substitutos, como um procedimento de ponto final de qualidade para o propósito de localizar o produto mencionado preco-cemente em gêneros alimentícios complexos.
[000159] Seis níveis de um produto de MYCOSORB (Ref. #285965) foram usados para a validação correspondendo à faixa de funcionamento de nível de inclusão (0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 5,0; 6,0 kg/T) misturado a amostra de alimentação.
[000160] Solução de anticorpo policlonal de coelho diluída: a diluição de anticorpo primária foi adaptada de acordo com os níveis antecedentes. Os anticorpos foram desse modo diluídos a 1:7,500 em PBS adicionando-se 1μl de solution de anticorpo #1 (4,15) a 7,5 ml de PBS, 1X. Um volume de 10 ml de solução foi necessário para cada placa de microtítulo.
[000161] Anticorpo de anti-coelho de cabra diluído: a diluição de an-ticorposecundária foi adaptada de acordo com os níveis antecedentes. Os anticorpos foram desse modo diluídos a 1:30,000 em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #2 em 30,0 ml PBS, 1X.
[000162] A verificação de homogeneidade da amostra foi obtida para um nível mediano de inclusão de produto de MYCOSORB (4,0 kg/T) no plano experimental. O ensaio para este nível particular foi repetido 5 vezes em 10 amostras individuais usando 4 réplicas cada (Tabela 15). Table15 . Avaliação de homogeneidade em uma única concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado a material de alimentação de galinha avaliado pelo procedimento de ELISA durante 5 ciclos em 10 preparações de amostra individuais analisadas em 4 réplicas.
[000163] A calibração do ensaio foi realizada na alimentação mistu- rada com concentração de amostra de padrão conhecida e na faixa 0,0 a 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB, ajuste de curva linear A, y = Ax, foi usado para definir a relação entre concentração e resposta (OD450), A curva padrão média de 5 ciclos foi compilada na Figura 5. Linearidade
[000164] A linearidade das curvas padrões foi avaliada do cálculo do coeficiente de regressão de acordo com a equação dos níveis de inclusão plotados contra absorvência de OD450 usando a melhor linha de ajuste interceptando em zero, Δ OD450 = Ax (MYCOSORB) depois da subtração do esboço, A linearidade da curva padrão é verificado com um coeficiente de valor de correlação encontrado acima r 2> 0,95. O coeficiente de regressão calculado para cada curva de ciclo padrões e para a curva de ciclo padrão medida é relatado na Tabela 16. Tabela 16 . Linearidade das curvas padrões no material de alimentação de galinha.
* O erro quadrado médio é definir em modelos de regressões lineares como: 
onde = y i -^y i; y i é o valor de y experimentalmente medido; ^y i é o valor teórico pela concentração de x i esperada de produto de MYCOSORB.
[000165] A repetibilidade é uma medida da variância interna pela avaliação do desvio padrão de repetibilidade. A avaliação da repetibilidade dentro da repetição de um ciclo foi obtida da mesma amostra no mesmo dia para o mesmo ciclo, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção dentro de um ciclo, CV intra (Tabela 17). A avaliação da repetibilidade entre ciclos diferentes foi obtida da mesma amostra em dias diferentes durante ciclos diferentes, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção entre ciclos, CV Inter (Tabela 18).
[000166] Os resultados mostram que as curvas padrões obtidas no mesmo dia e em dias diferentes tem pouca variabilidade, com uma precisão intra-dia média de 6,00%. Entretanto, a diferença entre amostras foi mais pronunciada com uma precisão entre-dia de 21,52% e uma precisão total de 21,75% (Tabela 19) quando aplicado a uma faixa de funcionamento de curva padrão entre 0,0 e 6,0 kg/T. Tabela 17. Precisão de repetibilidade intra-ciclo para construção de curva de padrão.
Tabela 18. Precisão entre-ciclo de repetibilidade para construção de curva de padrão. 
Tabela 19. Precisão total para construção de curva padrão. 
LD e LQ (sensibilidade)
[000167] Os valores de LD e LQ são informados n Tabela 20. Os valores de LQ encontrados estão abaixo da taxa de inclusão indicada do produto de MYCOSORB permitindo sua quantificação em material de alimentação. Limite de detecção LD = 0,547 ± 0,237 kg/T. Limite de quantificaçãoLQ = 1,864 ± 0,806 kg/T. Tabela 20. Determinação de LD e LQ em material de alimentação de Galinha.
[000168] Precisão foi medida a partir de 5 experiências independentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. A concentração final para cada amostra foi calculada como descrito aqui usando os valores observados obtidos para o cálculo de homogeneidade (Tabela 21). Em seguida a precisão média foi calculada a partir da precisão calculada obtida para todos os ciclos e comparada à quantidade de concentração reforçada de 4,0kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. Os cálculos foram realizados de acordo com as equações determinadas aqui.
[000169] Os resultados mostram que a recuperação respondeu por um sobrestimação de 18% do teor real do material de alimentação em concentração reforçada de produto de MYCOSORB (Tabela 22). Tabela 21 . Exatidão e precisão medida de 5 experiências independentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclos em 4 réplicas cada para a 4,0 kg/T concentração de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação.
Tabela 22 . Recuperação total medida da média de 5 experiências in-dependentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. 
[000170] Testes foram realizados no Centro para Aniaml Nutrigeno- mics e Applied Animal Nutrition ALLTECH, Inc., KY, USA em uma formulação de alimentação de porco sólida com cinco concentrações diferentes de produto de MYCOSORB.
[000171] Os materiais de alimentação de porco individualmente misturados com 0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 5,0; 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB foram analisados bem como uma amostra do mesmo material de alimentação de porco misturado com um nível desconhecido de produto de MYCOSORB quando distribuído em uma mesma placa de micro-título.
[000172] A validação foi realizada para determinar as características de um ensaio de ELISA desenvolvidas para a análise do produto de MYCOSORB e substitutos, como um procedimento de ponto final de qualidade para o propósito de localizar o produto em gêneros alimentícios complexos.
[000173] Seis níveis de um produto de MYCOSORB foram usados para a validação correspondendo à faixa de funcionamento de nível de inclusão (com 0,0; 0,5; 1,0; 4,0; 5,0; 6,0 kg/T) misturado a amostra de alimentação.
[000174] Solução de anticorpo policlonal de coelho diluída: a diluição de anticorpo primária foi adaptada de acordo com os níveis antecedentes. Os anticorpos foram desse modo diluídos em 1:3.500 em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #1 em 3,5 ml de PBS, 1X. Um volume de 10 ml de solução foi necessária para cada placa de mi- crotítulo.
[000175] Anticorpo anti-coelho de cabra diluído: a diluição de anticorpo secundária foi adaptada de acordo com os níveis antecedentes. Os anticorpos foram desse modo diluídos em 1:30,000 em PBS adicionando-se 1 μl de solução de anticorpo #2 em 30,0 ml de PBS, 1X. H
[000176] A verificação de homogeneidade da amostra foi obtida para um nível mediano de inclusão de produto de MYCOSORB (4,0 kg/T) no plano experimental. O ensaio para este nível particular foi repetido 5 vezes em 10 amostras individuais usando 4 réplicas cada (Tabela 23). Tabela 23 . Avaliação de homogeneidade em uma única concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado a material de alimen-tação de porco avaliado pelo procedimento de ELISA durante 5 ciclos em 10 preparações de amostra individuais analisadas em 4 réplicas.
[000177] A calibração do ensaio foi realizada na mistura de alimentação com concentração de amostra de padrão conhecida e na faixa 0,0 a 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB, Um ajuste de curva linear, y = Ax com grupo de interceptação a zero, foi usado para definir a relação entre concentração e resposta (OD450), A curva padrão média de 5 ciclos foi compilada na Figura 6.
[000178] A linearidade das curvas padrões foi avaliada a partir do cálculo do coeficiente de regressão de acordo com a equação dos níveis de inclusão plotados contra absorvência de OD450 usando a melhor linha de ajuste, a melhor interceptação de linha de ajuste em zero Δ OD450 = Ax(MYCOSORB) depois da subtração do esboço. O linearidade da curva padrão é verificada com um coeficiente de valor de correlação encontrado acima r2> 0,95, O coeficiente de regressão calculado para cada curva de ciclo padrão e para a curva de ciclo padrão calculada é informado na Tabela 24. Tabela 24. Linearidade das curvas padrões no material de alimentação de porco.
[000179] O erro quadrado médio é definir em modelos de regressões II n 2 lineares como:
onde θ- = yi - Ayi; yi é o valor de y experimentalmente medido; Ayi é o valor teórico pela concentração de xi esperada de produto de MYCOSORB. Repetibilidade
[000180] A repetibilidade é uma medida da variância interna pela avaliação do desvio padrão de repetibilidade. A avaliação da repetibili- dade dentro da repetição de um ciclo foi obtida da mesma amostra no mesmo dia para o mesmo ciclo, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção dentro de um ciclo, C intra (Tabela 25). A avaliação da repetibilidade entre ciclos diferentes foi obtida da mesma amostra em dias diferentes durante ciclos diferentes, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção entre ciclos, CV Inter (Tabela 26).
[000181] Os resultados mostram que as curvas padrões obtidas no mesmo dia e em dias diferentes tem pouca variabilidade, com uma precisão entre-dia média de 7% e uma precisão intra-dia de 20% quando aplicado em uma faixa de funcionamento de curva padrão entre 00 e 6,0 kg/T. Tabela 25. Precisão de repetibilidade intra-ciclo para cosntrução de curva padrão.
Tabela 26. Precisão de repetibilidade entre-ciclo para construção de curva padrão. 
Tabela 27. Precisão total para construção de curva padrão. 
L D e L Q (sensibilidade)
[000182] Valores de LD e LQ são informados na Tabela 28. Os valores de LQ encontrados estão abaixo da taxa de inclusão indicada do produto de MYCOSORB, permitindo sua quantificação em material de alimentação. Limite de detecçãoLD = 0,403 ± 0,150 kg/T Limite de quantificaçãoLQ = 1,363 ± 0,498 kg/T Tabela 28. Determinação de L D e L Q em material de alimentação de Porco.
[000183] Precisão foi medida a partir de 5 experiências independentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. A concentração final para cada amostra foi calculada como descrito aqui usando os valores observados obtidos para o cálculo de homogeneidade (Tabela 29). Em seguida a precisão média foi calculada da precisão calculada obtida para todos os ciclos e comparada à quantidade de concentração reforçada de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. Os cálculos foram realizados de acordo com as equações descritas aqui.
[000184] Os resultados mostram que a avaliação de recuperação respondeu por um sobrestimação de 20% do real teor do material de alimentação em concentração reforçada de produto de MYCOSORB (Tabela 30). Tabela 29. Exatidão e precisão medidas a partir de 5 experiências in-dependentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação.
Tabela 30. Recuperação total medida a partir da média de 5 experiências independentes compreendendo 10 amostras independentes cada e ciclo em 4 réplicas cada para a concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. 
[000185] O ELISA em ensaio de alimentação para detecção de MYCOSORB foi realizado em matrizes de galinha e porco, e verificado em um laboratório independente e comparado aos resultados de validação. O ensaio foi verificado em Alimetrics, Ltd., Koskelontie 19B, Espoo, Finland.
[000186] A calibração do ensaio foi realizada em 2 dias diferentes na alimentação misturada com concentração de amostra de padrão conhecida na faixa 0,0 a 6,0 kg/T de produto de MYCOSORB. Um ajuste de curva linear com y = Ax com grupo de interceptação a zero foi usado para definir a relação entre concentração e resposta (OD450) em gêneros alimentícios de porco e em gêneros alimentícios de galinha. Absorvência e calibração resultante diferiram significativamente entre ciclos diferentes; entretanto, as concentrações absolutas para as amostras conhecidas e cegas permanecem o mesmo.
[000187] A linearidade das curvas padrões foi avaliada do cálculo do coeficiente de regressão de acordo com a equação dos níveis de inclusão plotados contra absorvência de OD450 usando a melhor linha de ajuste, a melhor linha de ajuste interceptando em zero Δ OD450 = Ax(MYCOSORB) depois da subtração do esboço. A linearidade da curva padrão é verificada com um coeficiente de valor de correlação encontrado acima de r2> 0,95, O coeficiente de correlação variou de 0,991 a 0,994 (Tabela 31). Tabela 31. Linearidade das curvas padrões em material de alimentação de galinha e porco.
[000188] O erro quadrado médio é definir em modelos de regressões I 2 .meares como:
, onde = = = yi -Ayi; yi é o valor de y medido experimentalmente; Ayi é o valor teórico pela concentração de xi esperada de produto de MYCOSORB. LD e LQ (sensibilidade)
[000189] Os valores de LD e LQ foram determinados em uma matriz de ácido clorídrico a 40%. Estimativa dos respectivos valores de LD e LQ foram respectivamente de 0,35 e 1,20 kg/T de MYCOSORB misturado ao gêneros alimentícios de galinha e de 0,27 e 0,91 kg/T de MYCOSORB misturado aos gêneros alimentícios de porco (Tabela 32 e Tabela 33, respectivamente). Tabela 32. Resultados obtidos nas amostras de esboço em dois ciclos separados realizados em um dia de intervalo e realizado pelo laborató- rio de verificação no gêneros alimentícios de galinha.
Tabela 33. Resultados obtdos nas amostras de esboço em dois ciclos separados realizados a um dia de intervalo e realizado pelo laboratório de verificação no gêneros alimentícios de porco. 
[000190] Exatidão foi medida a partir de 2 experiências independentes compreendendo 6 réplicas cada em uma concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação. A precisão média foi calculada a partir da exatidão calculada obtida para todos os ci- clos e comparada à quantidade de concentração reforçada de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação.
[000191] Os valores obtidos conheceram os critérios para igualmente exatidão e precisão, como segue.
[000192] A avaliação da repetibilidade dentro da repetição de um ciclo foi obtida da mesma amostra no mesmo dia para o mesmo ciclo, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção dentro de um ciclo, CV intra. A avaliação da repetibilidade entre ciclos diferentes foi obtida da mesma amostra em dias diferentes durante ciclos diferentes, do mesmo técnico, com o mesmo equipamento e método para representar a variação da detecção entre ciclos, CV Inter.
[000193] Os valores obtidos conheceram os critérios para exatidão e precisão, como segue para as matrizes de galinha e porco (Tabela 34 e Tabela 35). Tabela 34. Exatidão e precisão medida de 6 testes de réplica realizados em 2 dias separados usando amostras conhecidas (4,0 kg/T) de produto de MYCOSORB misturado para o material de alimentação de galinha.
Tabela 35. Exatidão e precisão medida de 6 testes de réplica realizados em 2 dias separados usando amostras conhecidas (4,0 kg/T) de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação de porco. 
[000194] Exatidão foi medida de 2 experiências independentes com-preendendo 3 réplicas cada em uma concentração de 4,0 kg/T de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação em um teste cego. Os valores obtidos conheceram os critérios para ambas exatidãoe precisão, como segue (Tabela 36 e Tabela 37). Tabela 36 . Exatidão e precisão medida de 3 testes de réplica realizados em amostras desconhecidas (4,0 kg/T) de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação de galinha.
Tabela 37. Exatidão e precisão medida a partir de 3 testes de réplica realizados em amostras desconhecidas (4,0 kg/T) de produto de MYCOSORB misturado ao material de alimentação de porco. 
[000195] A análise de robustez avalia a capacidade do método de medida para resistir a mudanças em resultados quando submetidos a mudanças secundárias em variáveis de procedimento e ambientais.
[000196] A estabilidade do ensaio de ELISA foi investigada mudando-se a diluição de anticorpo primária e secundária, a estabilidade do anticorpo primário, mudando-se a distribuição das amostras diferentes a ser testadas nas placas de microtítulo (única placa contendo todas as amostras a ser medidas e compreendendo o esboço, os padrões e a amostra desconhecido vs. placas de microtítulo múltiplas compreendendo mais repetições por amostra analisadas porém onde esboço, padrões e desconhecido estão em placas de microtítulo diferentes). Tabela 38 relata as variações e mostra que resultados são consistentes, ainda com as mudanças realizadas, indicando uma robustez forte do teste especialmente em variação em diluições de anticorpo. Tabela 38 . Testes de robustez. Condições padrões são mostradas em negrito. Dez por cento de alterações são da mesma forma realçados se encontrados.
[000197] Dezessete compostos foram testados em uma concentra- ção de 50 μg/ml em PBS para determinar reatividade cruzada por anti-corpos monoclonais elevados contra conjugado de (1-4)-α-D- glucano/(1-6)-β-D-glucano-BSA de levedura.
[000198] Compostos testados foram: amido-batata solúvel, amido- arroz, amido-trigo, amido-milho, BSA, glicogênio (de coelho), glicogê- nio (de ostra), glicogênio (bovino), Manana, Laminarina, Zimosina A, Maltrina QD, glucano da levedura de Leiteria, (1^3)-β-D-glucano de Eug. gracilis, Torula levedura, Ycw02 misturador de conta (fração de parede celular de levedura - preparação de misturador de conta), β glucan de cevada.
[000199] Extrato de parede celular de levedura (08FS001 batelada #MYCOSORB) e o antígeno de (1-4)-α-D-glucano/(1-6)-β-D- glucanoBSA usado para elevar anticorpo monoclonal foram da mesma forma testados em concentrações de 1 μg/ml, 2 μg/ml e 5 μg/ml. Ambos os anticorpos monoclonais (513A161.1 e 513A431.1) foram analisados na seguinte faixa de diluições: 1:100, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:1500 e 1:2000. Placas de microtítulo de Nunc de Noventa-seis cavidades com o Lot#0702013 foram usadas. As placas foram revestidas com 100 μl/cavidade de composto e agitado tocando-se 8-10 vezes com pontas do dedo. As placas foram revestidas com fita de selamen- to e incubadas durante 1 hora a 37° C. Solução foi removida e placas foram lavadas 3 vezes com 200 μl de PBS por lavagem usando uma pipeta de multi-canal. Placas foram tocadas 8-10 vezes com pontas dos dedos antes de remover cada solução de lavagem. Entre lavagens, fluido em excesso foi removido tocando-se a placa em toalhas de papel. Para bloquear, 100μl/cavidade 3% de leite (não centrifugado) foi adicionado. Placas foram incubadas 1 hora em temperatura ambiente. Solução de bloqueio foi removida e cavidades foram lavadas com 1 x 200 μl de PBS, 2 x 200 μl de PBS + 0,05% de polissorbato 20. Placas foram agitadas tocando-se 8-10 vezes com pontas do dedo antes da remoção de cada solução de lavagem. Entre lavagens, fluido em excesso foi removido tocando a placa em toalhas de papel.
[000200] 100μl de cada diluição de soros apropriados foram adicio nados por cavidade. PBS (100 μl/cavidade) foi usado para cavidades de esboço. A placa foi incubada, revestida, durante 1 hora em temperatura ambiente. Solução foi removida e caviddaes foram lavadas 3 vezes com 200 μl de PBS + 0,05% de polissorbato 20 cada. A placa foi tampada 8-10 vezes com pontas do dedo para agitar antes da remoção de cada lavagem. Entre lavagens, fluido em excesso foi removido tocando-se a placa em toalhas de papel. Cem μl do anticorpo secundário (1:10,000 anti-camundongo de cabra, IgG-peroxidase conjugado) foi adicionado por cavidade. A placa foi incubada, revestida, durante 1 hora em temperatura ambiente. Solução foi removida e cavidades foram lavadas 3 vezes com 200 μl por lavagem PBS + 0,05% de polis- sorbateo 20. A placa foi tocada 8-10 vezes com pontas dos dedos para agitar antes da remoção de cada lavagem. Entre lavagens, fluido em excesso foi removido tocando-se a placa em toalhas de papel.
[000201] 100 μl temperatura ambiente substrato de TMB foi adicio nado por cavidade. Depois de 5 minutos, a reação foi parada bem com 100 μl por cavidade de 1N de HCl. Bases de placa foram limpas de impressões digitais, e depois de uma agitação de 10 segundos, absor- vência a 450 nm foi lida usando uma leitora de placa de microtítulo. Resultados
[000202] Gráficos em barra de dados de ELISA são mostrados nas Figuras 9-14. Igualmente 513A161.1 e 513A431.1 reagiu muito robus-tamente com o antígeno 499-73-3 em uma concentração tão baixa quanto 1 μg/ml, com 2 μg/ml produzindo a leitura de absorvência mais forte. Os anticorpos foram da mesma forma capazes de reconhecer 08FS001 em concentrações variando de 1 μg/ml a 5 μg/ml, com a leitura de absorvência mais forte a 5 ug/ml. Entretanto, a absorvência foi significativamente menor para 08FS001 do que para antígeno 499-733. Anticorpo 513A161.1 Laminarina reconhecida e reagida significativamente com isto, porém 513A431.1 não fez. Ambos os anticorpos tiveram uma leitura de absorvência muito forte para Zimosina A que foi similar e às vezes mais forte do que a absorvência vista com o antíge- no 499-73-3. Surpreendentemente, os anticorpos mostraram reação cruzada significante com Zimosina A, Maltrina QD, glucano do levedura de padeiro, (1^3)-β-D-glucano de Eug. gracilis,levedura de Torula e pelota misturadora de conta ycw-02, limitando seu uso para ensaios de ELISA quantitativos.
[000203] Tentativas para usar anticorpo monoclonal 513A161.1 (Exemplo 5) para detectar antígeno extraído de alimentação em ensaios de ELISA quantitativos resultaram em baixas leituras de absorvên- cia. Para determinar se diluindo os anticorpos em 3% de leite ao invés de PBS afetou leituras de absorvência (por exemplo, causando bloqueio excessivo quando em combinação com componentes de extrato de alimentação), o seguinte protocolo foi realizado:
[000204] Extrato de parede celular de levedura (MYCOSORB batelada #08FS001) extratos foram submetidos a processo de extração químico como discutido no exemplo 4 por meios de uma solução contendo 0,5% de HCl. Ensaios de ELISA foram conduzidos como descrito no Exemplo 5, usando anticorpo monoclonal 513A161 em uma diluição de 1:400 como anticorpo primário e anticorpo IgG-HRP anti camundongo de cabra (1:10,000) diluído em PBS ou 3% de leite como anticorpo secundário. Placas de microtítulo foram revestidas com extrato de parede celular de levedura a 100 μl/cavidade ou com extrato 1:1 diluído em PBS a 200 μl/cavidade.
[000205] Resultados mostrados na Figura 15 estabeleceram que um ligeiro porém efeito estatisticamente insignificante de diluente de anticorpo foi observado. Adicionalmente, tentativas para usar o anticorpo de monoclonal para detectar antígeno em padrões de alimento extraídos com 0,5% de HCl as triplicatas resultaram em grande variabilidade em leituras entre réplicas, desvios padrões grandes, e leituras de ab- sorvência inflados.
[000206] Tentativas para usar anticorpo monoclonal 513A161.1 (Exemplo 5) para detectar antígeno extraído de alimentação em ensaios de ELISA quantitativos resultaram em leituras de baixa absorvência. Para aumentar as leituras de absorvência do ELISA usando anticorpo monoclonal de camundongo 513A161.1, a seguinte experiência foi realizada para determinar se mudando o tempo e temperatura do antígeno revestindo etapa de incubação melhoraria detecção de antígeno extraído de alimentação sem aumentar ligação antecedente/não específica.
[000207] O protocolo consistiu em conduzir extração de alimentação como descrito acima para gerar amostras de análise. As alíquotas de amostra foram revestidas na placa imediatamente ou armazenadas durante a noite a -25°C. Preparação de amostra foi repetida 3 vezes para gerar extrações triplicadas. Uma curva padrão de seis pontos (0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,8, 2,4 kg/T) foi preparada usando antígeno em preparações de alimentação de galinha. Placas foram revestidas com curva padrão de extrato de alimentação e permitida incubar a 4°C durante a noite (estacionário), 4°C durante a noite (agitação), ou 37°C durante 1 hora (estacionário). Ensaios de ELISA foram conduzidos como descrito no Exemplo 5 usando anticorpo monoclonal 513A161.1 em uma diluição de 1:400 preparada em 3% de leite como anticorpo primário e anticorpo IgG-HRP anti camundongo de cabra (1:10,000) diluído em 3% de leite como anticorpo secundário. Incubação de substrato ocorreu durante 30 minutos, e absorvência a 450 nm foi determinada.
[000208] Resultados mostrados na Figura 16 indicam que mudando o tempo e temperatura em que o antígeno foi revestido sobre a placa não aumentou a absorvência em uma faixa ideal e da mesma forma não afetaram a linearidade da curva padrão. Além disso, antecedente foi aumentado independentemente de tempo de incubação.
[000209] Para determinar o grau de interferência, um grupo de ensaios foi realizado usando o material de alimentação de galinha descrito aqui sem e com produto de MYCOSORB (Ref. #285965) presente a 1 kg/T, este último sendo sem ou com várias proporções de possíveis produtos de interferência (50%, 100%, que 200% comparam a nível de inclusão de produto de MYCOSORB, p/p) pertencendo aos carboidratos ou produtos laterais encontrados em formulações de alimentação. Neste respeito, os seguintes produtos foram investigados e foram testados para avaliar seu impacto na detecção do produto de MYCOSORB pela aqui metodologia exata: • Amilose (amido de batata): (1-4):(1-6)-α-D-glucanos com uma relação 30:1. • Maltodextrinas e sólidos de xarope de milho: carboidratos facilmente digeríveis feitos de amido de milho natural, polímero de dextrose. • Glicogênio (de fígado bovino, tipo IX): (1-4):(1-6)-α-D- glucanos com uma relação 10:1. • Laminarina (de Laminaria digitata): (1^3):β(1-6)-β-D- glucanos com uma relação 3:1. • Destilador Grãos Secos; subprodutos da produção de bi- oetanol de milho. • Star® Pasteur Champagne Active Dry Wine Yeast (de Saccharomyces bayanus): levedura e parede celular de levedura (car-boidratoscomplexos feitos de (1^3):β(1-6)-β-D-glucanos, (1-4):(1-6)-α-D-polimanose ligados a proteínas, (1^2):(1-4)-β- Nacetilglucosmamina).
[000210] Como mostrado na Figura 7 e Figura 8, a adição das diferenças entre os sinais obtidos com o produto de MYCOSORB e o produto de MYCOSORB misturados com 50, 100, 200% (w/w) de interferência, foram aproximadamente um valor de OD450 de 0. Os resultados respondem por uma falta de interferência e desse modo as propriedadesespecíficas do ensaio para a detecção de produto de MYCOSORB em matriz de alimentação complexa consistindo em carboidratos diferentes interferentes.
[000211] Resultados detalhados para cada interferente individual e limites do teste de ANOVA de um único sentido, para um intervalo de confiança de 95%, são determinados na Tabela 39 a Tabela 44 onde os valores médios de densidade óptica (450 nm) e diferenças entre amostras foram calculadas, bem como o desvio padrão e coeficiente de variação. A homogeneidade das variâncias dentro de cada interferente foi avaliada usando Levene, O'Brien, e Brown e testes de Forsythe. No caso de variância não constante, o método de ANOVA de um único sentido Kruskal-Willis não paramétrico foi usado, com uma transformação de classificação que resultou em testes mais robustos a não-normalidade, e resistência a discrepantes. As análises foram realizadas em placas separadas para cada concentração de interferente testada ou em uma única placa individual. Resultados idênticos foram obtidos para as duas preparações de placa. Tabela 39. Valores OD450 médios obtidos para produto de MYCOSORB quando misturados com 0, 50, 100, 200% (w/w) de ami- lose em alimentação de galinha. Diferenças entre valores foram anali- sadas por meios de ANOVA de um único sentido e testes estatísticos de comparação médios com um intervalo de confiança de 95%.
Tabela 40. Valores médios de OD450 obtidos para produto de MYCOSORB quando misturados com 0, 50, 100, 200% (w/w) de mal- todextrinas em alimentação de galinha. Diferenças entre valores foram analisadas por meios de ANOVA de um único sentido e testes estatís- ticos de comparação médios com um intervalo de confiança de 95%. 
Tabela 41 . Valores de OD450 médios obtidos para produto de MYCOSORB quando misturados com 0, 50, 100, 200% (w/w) de glico- gênio em alimentação de galinha. Diferenças entre valores foram ana-lisadas por meios de ANOVA de um único sentido e testes estatísticos de comparação médios com um intervalo de confiança de 95%. 
Tabela 42. Valores de OD450 médios obtidos para produto de MYCOSORB quando misturados com 0, 50, 100, 200% (w/w) de lami- narina em alimentação de galinha. Diferenças entre valores foram ana- lizadas por meios de testes estatísticos de comparação médios e ANOVA de um único sentido com um intervalo de confiança de 95%. 
Tabela 43 . Valores de OD450 médios obtidos para produto de MYCOSORB quando misturados com 0, 50, 100, 200% (w/w) de levedura de vinho RED STAR em alimentação de galinha. Diferenças entre valores foram analisadas por meios de ANOVA de um único sentido e testes estatísticos de comparação médios com um intervalo de confi- ança de 95%. 
Tabela 44. Valores de OD450 médios obtidos para produto de MYCOSORB quando misturados com 0, 50, 100, 200% (w/w) de grãos secos destilados em alimentação de galinha. Diferenças entre valores foram analisadas por meios de ANOVA de um único sentido e testes es- tatísticos de comparação médios com um intervalo de confiança de 95%. 
[000212] Todas as publicações e patentes mencionadas na especifi- cação acima estão aqui incorporadas por referência. Várias modifica- ções e variações do método descrito e sistema da invenção serão apa-rentesàqueles versados na técnica sem partir do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção foi descrita com relação a modalidades preferidas específicas, deveria ser entendido que a invenção como rei-vindicadonão deveria ser limitada indevidamente a tais modalidades específicas. Realmente, várias modificações dos modos descritos por realizar a invenção que são óbvios àqueles versados em química de carboidrato, microbiologia, alimentação animal e nutrição, imunologia, ou campos relacionados são pretendidos estar dentro do escopo das seguintes reivindicações.
Claims (3)
1. Método para detectar um componente da parede celular de levedura em uma amostra, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: - fornecer uma amostra de alimento ou ração selecionada do grupo que consiste em alimentação de gado, alimentação de animal de companhia, ração Misturada Total (TMR), forragem, pelota de alimentação, concentrado de alimentação, co-produto de pré-mistura de alimentação, grão, grão destilador, melados, fibra, forragem, grama, feno, núcleo, folhas, refeição, alimentação solúvel,e extratos dos mesmos, em que o método compreende ainda: - conduzir um ensaio que compreende o contato de um an-ticorpoprimário capaz de se ligar a um antigeno selecionado do grupo que consiste em (1 - 4) -α-D-glucano, (1 - 6) -β-D-glucano e (1 - 4) -α - / (1 - 6) -β-D-glucano à amostra sob condições tais que o anticorpo primário forma um complexo com o antígeno, se presente; e - usar um anticorpo secundário para detectar o complexo anticorpo primário-antígeno, em que a detecção do complexo anticorpo primário-antigeno fornece uma indicação da presença do componente da parede celular da levedura na amostra.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o método é CARACTERIZADO pela obtenção do extrato da amostra usando solvente orgânico e ácido.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o método é CARACTERIZADO pela obtenção do extrato da amostra usando dimetilsulfóxido e ácido clorídrico.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33499510P | 2010-05-14 | 2010-05-14 | |
| US61/334,995 | 2010-05-14 | ||
| PCT/US2011/036518 WO2011143613A1 (en) | 2010-05-14 | 2011-05-13 | Yeast cell wall components and detection thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112012030535A2 BR112012030535A2 (pt) | 2018-01-16 |
| BR112012030535B1 true BR112012030535B1 (pt) | 2021-06-01 |
Family
ID=44912110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112012030535-2A BR112012030535B1 (pt) | 2010-05-14 | 2011-05-13 | Método para detectar um componente da parede celular de levedura |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110281283A1 (pt) |
| EP (1) | EP2569632B1 (pt) |
| JP (1) | JP2013532276A (pt) |
| KR (1) | KR101440818B1 (pt) |
| CN (1) | CN102939537B (pt) |
| AU (1) | AU2011252840B2 (pt) |
| BR (1) | BR112012030535B1 (pt) |
| CA (1) | CA2798328A1 (pt) |
| CL (1) | CL2012003165A1 (pt) |
| CO (1) | CO6660470A2 (pt) |
| DK (1) | DK2569632T3 (pt) |
| EA (1) | EA201291091A1 (pt) |
| ES (1) | ES2691260T3 (pt) |
| IL (1) | IL222789A (pt) |
| MX (1) | MX2012013170A (pt) |
| MY (1) | MY173081A (pt) |
| NZ (2) | NZ603340A (pt) |
| PE (1) | PE20130526A1 (pt) |
| PL (1) | PL2569632T3 (pt) |
| PT (1) | PT2569632T (pt) |
| RS (1) | RS57937B1 (pt) |
| SG (1) | SG185485A1 (pt) |
| UA (1) | UA103283C2 (pt) |
| WO (1) | WO2011143613A1 (pt) |
| ZA (1) | ZA201208200B (pt) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6759506B2 (ja) | 2014-03-21 | 2020-09-23 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．Ｄｓｍ Ｉｐ Ａｓｓｅｔｓ Ｂ．Ｖ． | ラミナリペンタオース生成ベータ−１，３−グルカナーゼで酵母細胞壁を処理する方法 |
| EP3294750B1 (en) * | 2015-05-08 | 2023-10-25 | Waters Technologies Corporation | Composition and methods for extracting mycotoxins |
| CN105137084B (zh) * | 2015-08-20 | 2016-09-28 | 厦门大学 | 一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法 |
| JP6530846B1 (ja) * | 2018-10-09 | 2019-06-12 | アサヒグループホールディングス株式会社 | 免疫賦活剤及び感染予防方法 |
| CN114196216B (zh) * | 2021-12-27 | 2023-01-06 | 杭州靡特洛新材料科技有限公司 | 一种基于酒糟废弃物的全生物降解热塑水溶膜及其制备方法和应用 |
| CN117126753B (zh) * | 2023-10-26 | 2024-04-09 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 产多糖酿酒酵母及其在龙眼葡萄酒酿造中的应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2114950A1 (en) | 1991-08-10 | 1993-02-11 | Michael J. Embleton | Treatment of cell populations |
| CA2150262C (en) | 1992-12-04 | 2008-07-08 | Kaspar-Philipp Holliger | Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use |
| DK0664671T3 (da) * | 1993-08-06 | 2003-01-06 | Biotec Pharmacon Asa | Dyrefoder omfattende gærglucan |
| DE4402065A1 (de) * | 1994-01-25 | 1995-09-07 | Behringwerke Ag | Saccharomyces-spezifische Antigene und Antikörper, deren Herstellung und Verwendung |
| US6214337B1 (en) * | 1995-04-18 | 2001-04-10 | Biotec Asa | Animal feeds comprising yeast glucan |
| DE69832690T2 (de) * | 1998-04-17 | 2006-07-13 | Biotrex S.R.L. | Produkt auf Basis von Polysacchariden aus Backhefe und seine Verwendung als Additiv fur Backwaren |
| EP1234886A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | Universiteit van Amsterdam | A method for detecting beta-1,6-glucan synthase activity |
| GB0211118D0 (en) * | 2002-05-15 | 2002-06-26 | Polonelli Luciano | Vaccines |
| CA2543939C (en) * | 2003-10-31 | 2014-05-13 | Immunetics, Inc. | Rapid peptidoglycan-based assay for detection of bacterial contamination of platelets |
| US20050020490A1 (en) * | 2004-10-18 | 2005-01-27 | Progressive Bioactives Incorporated | A Method of Producing an Economical and Ecologically Sound Natural Immunobiotic Extract for Use as a Health Management Instrument and a Replacement for Growth Promotion Antibiotics in Livestock and Companion Animals. |
| US20080102486A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-01 | Horgan Karina A | Method for detection of yeast cell wall |
| US8933133B2 (en) * | 2006-12-14 | 2015-01-13 | Adm Alliance Nutrition, Inc. | Animal feeds containing polyols |
| JP5054425B2 (ja) * | 2007-05-07 | 2012-10-24 | 尚仁 大野 | 抗β−１，６−グルカン・モノクローナル抗体 |
| CN101353383B (zh) * | 2008-09-17 | 2010-12-08 | 山东京博控股发展有限公司 | 水溶性酵母β-葡聚糖及其制备方法 |
| CN101403749B (zh) * | 2008-11-17 | 2012-11-07 | 北京大学 | 通过葡聚糖特异性抗体辅助诊断自身免疫性疾病的试剂盒 |
-
2011
- 2011-05-13 EP EP11781379.0A patent/EP2569632B1/en active Active
- 2011-05-13 WO PCT/US2011/036518 patent/WO2011143613A1/en active Application Filing
- 2011-05-13 MX MX2012013170A patent/MX2012013170A/es unknown
- 2011-05-13 UA UAA201213087A patent/UA103283C2/ru unknown
- 2011-05-13 AU AU2011252840A patent/AU2011252840B2/en active Active
- 2011-05-13 NZ NZ603340A patent/NZ603340A/en unknown
- 2011-05-13 ES ES11781379.0T patent/ES2691260T3/es active Active
- 2011-05-13 NZ NZ623714A patent/NZ623714A/en unknown
- 2011-05-13 US US13/107,716 patent/US20110281283A1/en not_active Abandoned
- 2011-05-13 CA CA2798328A patent/CA2798328A1/en not_active Abandoned
- 2011-05-13 KR KR1020127032098A patent/KR101440818B1/ko active IP Right Grant
- 2011-05-13 BR BR112012030535-2A patent/BR112012030535B1/pt active IP Right Grant
- 2011-05-13 CN CN201180029236.2A patent/CN102939537B/zh active Active
- 2011-05-13 MY MYPI2012004906A patent/MY173081A/en unknown
- 2011-05-13 PL PL11781379T patent/PL2569632T3/pl unknown
- 2011-05-13 SG SG2012082491A patent/SG185485A1/en unknown
- 2011-05-13 PE PE2012002163A patent/PE20130526A1/es not_active Application Discontinuation
- 2011-05-13 RS RS20181309A patent/RS57937B1/sr unknown
- 2011-05-13 PT PT11781379T patent/PT2569632T/pt unknown
- 2011-05-13 EA EA201291091A patent/EA201291091A1/ru unknown
- 2011-05-13 DK DK11781379.0T patent/DK2569632T3/en active
- 2011-05-13 JP JP2013510349A patent/JP2013532276A/ja active Pending
-
2012
- 2012-10-31 ZA ZA2012/08200A patent/ZA201208200B/en unknown
- 2012-11-01 IL IL222789A patent/IL222789A/en active IP Right Grant
- 2012-11-12 CL CL2012003165A patent/CL2012003165A1/es unknown
- 2012-12-12 CO CO12225402A patent/CO6660470A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK2569632T3 (en) | 2018-11-19 |
| KR20130038863A (ko) | 2013-04-18 |
| CN102939537B (zh) | 2016-09-14 |
| NZ603340A (en) | 2014-04-30 |
| IL222789A (en) | 2016-09-29 |
| MX2012013170A (es) | 2013-01-17 |
| KR101440818B1 (ko) | 2014-11-03 |
| JP2013532276A (ja) | 2013-08-15 |
| CL2012003165A1 (es) | 2013-09-23 |
| SG185485A1 (en) | 2012-12-28 |
| PL2569632T3 (pl) | 2019-02-28 |
| PE20130526A1 (es) | 2013-05-05 |
| EP2569632A4 (en) | 2014-01-08 |
| WO2011143613A1 (en) | 2011-11-17 |
| RS57937B1 (sr) | 2019-01-31 |
| EP2569632A1 (en) | 2013-03-20 |
| CA2798328A1 (en) | 2011-11-17 |
| CO6660470A2 (es) | 2013-04-30 |
| IL222789A0 (en) | 2012-12-31 |
| CN102939537A (zh) | 2013-02-20 |
| PT2569632T (pt) | 2018-11-20 |
| ZA201208200B (en) | 2014-01-29 |
| BR112012030535A2 (pt) | 2018-01-16 |
| UA103283C2 (ru) | 2013-09-25 |
| AU2011252840B2 (en) | 2014-07-03 |
| ES2691260T3 (es) | 2018-11-26 |
| EP2569632B1 (en) | 2018-08-15 |
| EA201291091A1 (ru) | 2013-05-30 |
| NZ623714A (en) | 2015-10-30 |
| MY173081A (en) | 2019-12-25 |
| US20110281283A1 (en) | 2011-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0788605B1 (en) | Detection of antibodies to bacterial antigens by fluorescence polarization | |
| BR112012030535B1 (pt) | Método para detectar um componente da parede celular de levedura | |
| CN102955031A (zh) | 检测黄曲霉毒素b1药物的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN101581726B (zh) | 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒 | |
| AU2011252840A1 (en) | Yeast cell wall components and detection thereof | |
| CN102731615A (zh) | Prrsv的检测试剂和检测方法 | |
| BRPI0612666B1 (pt) | anticorpo monoclonal, suporte sólido, composição, linhagem de células de hibridoma, imunoensaios e kits para sua detecção e quantificação | |
| CN108614106A (zh) | 一种检测呕吐毒素及其乙酰化衍生物的时间分辨荧光免疫层析卡 | |
| CN101592660B (zh) | 布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒 | |
| CN104155450B (zh) | 梅毒螺旋体IgG抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒及其制备方法 | |
| Zhai et al. | Rapid detection of Vibrio parahaemolyticus using magnetic nanobead-based immunoseparation and quantum dot-based immunofluorescence | |
| CN102399753B (zh) | 一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体及免疫荧光检测方法 | |
| CN101315379A (zh) | 一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒及其应用 | |
| DE19842609C2 (de) | Salmonellenantigengemisch und Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen | |
| AU2014240251A1 (en) | Yeast cell wall components and detection thereof | |
| CN105372419B (zh) | 氯霉素半抗原和抗原的制备方法及其在量子点免疫荧光试剂盒中的应用 | |
| CN107436350B (zh) | 一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法 | |
| EP0101886A2 (de) | Antikörper gegen bakterielle Peptidoglycane, Verfahren zu ihrer Herstellung und Methoden zu ihrer quantitativen Bestimmung | |
| CN104155439B (zh) | 梅毒螺旋体总抗体生物素亲和素酶联免疫检测试剂盒的制备方法 | |
| Fischer et al. | An ELISA for the quantification of chicken immunoglobulin (IgY) in various liquid media | |
| CN103360335A (zh) | 呋喃唑酮代谢物半抗原及其制备方法和应用 | |
| CN108642057A (zh) | 利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法 | |
| CN113495140A (zh) | 一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法 | |
| Kvietkauskaite et al. | Evaluation of an ELISA for detection of antibodies to sendai virus in swine sera | |
| Wang | Development of Antibody-and Phage-Based Lateral Flow Test Strips for the Detection of the Bovine Meat and Bone Meal in Animal Feeds and the Bacillus anthracis Spores in Water and Foods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] |
Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS. |
|
| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] | ||
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 13/05/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |
|
| B25G | Requested change of headquarter approved |
Owner name: ALLTECH INC. (US) |
|
| B25C | Requirement related to requested transfer of rights |
Owner name: ALLTECH INC. (US) Free format text: A FIM DE ATENDER AS ANOTACOES DE LIMITACAO OU ONUS REQUERIDAS E NECESSARIO ESCLARECER A DIVERGENCIA ENTRE O ATUAL DEPOSITANTE ?ALLTECH, INC.? E O CONSTANTE NOS DOCUMENTOS DE LIMITACAO APRESENTADOS ?ALLTECH DO BRASIL AGROINDUSTRIAL LTDA.?, POIS, NOS DOCUMENTOS APRESENTADOS, QUEM SOFREU A LIMITACAO OU ONUS FOI ?ALLTECH DO BRASIL AGROINDUSTRIAL LTDA.? E O ATUAL DEPOSITANTE E ?ALLTECH, INC.?. |
|
| B25B | Requested transfer of rights rejected |
Owner name: ALLTECH INC. (US) Free format text: INDEFERIDA A ANOTACAO DE LIMITACAO OU ONUS CONTIDA NAS PETICOES 870200111217 DE01/09/2020, 87020011173 DE 02/09/2020 E 870220025076 DE 23/03/2022 DEVIDO A SOLICITACAO DAPETICAO 870220047386 DE 30/05/2022. |