CN105137084B - 一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，涉及葡聚糖。1)酶标反应板的包被；2)酶标反应板的封闭；3)加检测样品；4)加酶标二抗；5)加底物显色；6)终止反应；7)OD值的测定。杂交瘤细胞株D9保藏编号为CCTCC NO：C2010107。基于抗葡聚糖单克隆抗体建立的夹心酶联免疫吸附测定方法，可定量检测样本中的葡聚糖，具有特异性强、灵敏度高、快速简便易于操作、对仪器的要求低等优点，更能适应大规模样品检测的需要。
Description
技术领域
本发明涉及葡聚糖，特别是涉及一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法。
背景技术
葡聚糖，又名右旋糖酐，由数个葡萄糖分子聚合而成，具有较高的分子量，葡萄糖残基之间主要以α-1,6键连接，支链主要有1,2键，1,3键，1,4键等。葡聚糖可由蔗糖溶液中污染的细菌的葡聚糖蔗糖酶催化下产生：蔗糖→葡聚糖+果糖。葡聚糖从结构上可以分为α型和β型：前者常见于细菌分解蔗糖产生，后者具有生理活性，存在于真菌细胞壁中。(1.范瑞梅，范家恒.葡聚糖的免疫作用及研究进展.甘蔗糖业，2006，(6)：38-41)
近年来，由于葡聚糖在医学和食品工业上的应用不断增多，有关葡聚糖的检测也引起了人们的关注，针对葡聚糖含量的检测在方法上有了很大的发展，已经建立起了多种检测方法，但是由于免疫学方法自身的诸多优点，使其很快在葡聚糖的检测上得到了重视。
发明内容
本发明的目的是提供具有特异性强、灵敏度高、快速简便、易于操作、对仪器的要求低等优点，可用于对不同样品中的葡聚糖进行定量检测的一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法。
本发明包括以下步骤：
1)酶标反应板的包被，具体方法为：取葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞株D9包被96孔酶标板，100μL/孔，同时设置阴性对照孔和空白孔，4℃过夜；
2)酶标反应板的封闭，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加封闭液，37℃孵育；
3)加检测样品，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入Dextran 2000标准品或样品溶液，100μL/孔，同时设标准品零值孔、阴性孔，每个样品设3个复孔，37℃反应；
4)加酶标二抗，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入D24酶标抗体，37℃温育；
5)加底物显色，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入显色OPD溶液，37℃温育；
6)终止反应，具体方法为：每孔加入50μL H2SO4溶液终止反应；
7)OD值的测定，具体方法为：用酶标仪测定，以空白孔调零，在A490波长测定样品和阴性对照的OD值，完成葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定。
在步骤1)中，所述葡聚糖的质量浓度可为2.5μg/mL，所述杂交瘤细胞株D9已于2010年12月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2010107；所述包被的包被液可采用摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸盐缓冲液，pH 9.6。
在步骤2)中，所述洗涤剂可采用pH 7.2的PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间可为90s；所述封闭液可采用10mM的PBS溶液，含2％BSA；所述封闭液的加入量可为每孔加封闭液200μL；所述孵育的时间可为2h。
在步骤3)中，所述洗涤剂可采用PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间可为90s；所述反应的时间可为1h。
在步骤4)中，所述洗涤剂可采用PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间可为90s；所述D24酶标抗体可采用1∶8000的D24酶标抗体，1∶8000的D24酶标抗体可通过改良的高碘酸氧化法制备；加入D24酶标抗体的量可为100μL/孔；所述温育的时间可为45min。
在步骤5)中，所述洗涤剂可采用PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间可为90s；所述加入显色OPD溶液的量可为50μL/孔；所述温育的时间可为10min。
在步骤6)中，所述H2SO4溶液的摩尔浓度可为2mol/L。
本发明基于抗葡聚糖单克隆抗体建立的夹心酶联免疫吸附测定(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)方法，可定量检测样本中的葡聚糖，具有特异性强、灵敏度高、快速简便易于操作、对仪器的要求低等优点，更能适应大规模样品检测的需要。
附图说明
图1为抗体纯化SDS-PAGE电泳鉴定。
图2为酶标抗体效价测定。
图3为不同株抗体ELISA实验。
图4为抗体与酶标抗体棋盘滴定实验。
图5为ELISA标准曲线及线性范围。
图6为抗体稳定性比较。
图7为抗体特异性鉴定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：葡聚糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立
1、材料
1.1抗葡聚糖单克隆抗体
抗葡聚糖单克隆抗体D9为高效的杂交瘤细胞分泌的，制备方法见第2.2节。
1.2主要试剂及仪器
Dextran标准品Pharmacia公司；rProtein A填料SepharoseTM；辣根过氧化物酶(HRP)购自Sigma公司；BSA，OVA购自Sigma公司；OPD购自Sigma公司，高碘酸钠购自上海生工；硼氢化钠购自上海生工；包被板条购自JET公司；BSA购自Sigma公司；其它常规化学试剂均为国产分析纯试剂。
2、方法
2.1葡聚糖检测试剂标准品配制
称取1g Dextran 2000，用磷酸盐缓冲液(pH7.2，0.01mol/L PBS)稀释到1000mL，得到浓度为1000μg/mL的母液，再按实验要求用PBS将母液稀释得到各种浓度。
2.2抗体的制备与纯化鉴定
采用腹水法制备抗体。石蜡油注射到小鼠腹腔，0.5mL/只，1～2周后每只小鼠腹腔注射2×106个杂交瘤细胞，注射细胞10～15d后，收集小鼠腹水，3000r/min离心10min，弃油脂，收集中间澄清腹水，备用。采用亲和层析法纯化抗体，依照rProtein A试剂说明书进行纯化，Lowry法检测抗体蛋白浓度，SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度，间接ELISA测定抗体效价。选择效价最高的抗体进行酶标。
2.3抗体的酶标与效价测定
采用高碘酸氧化法标酶，步骤如下：
(1)称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中；
(2)加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20min；
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；
(4)加0.2M pH9.6碳酸盐缓冲液，使醛化的HRP的pH升高到9.0～9.6，然后立即加入10mg葡聚糖抗体，室温避光轻轻搅拌2h；
(5)加0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，置4℃2h；
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h；
(8)3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中；
(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PBS缓冲液透析，换液4～6次，10,000rpm离心30min取上清液，加等量甘油，分装，-20℃保存；
(10)以Dextran 40-OVA为包被抗原，直接ELISA法检测酶标抗体的效价。
2.4捕获抗体的确定
将纯化的抗体按5μg/mL分别包被微孔板，每孔100μL，4℃，过夜；加入1μg/mL的Dextran 2000标准品100μL/孔，37℃反应1h；加入倍比稀释的葡聚糖酶标抗体100μL/孔，PBST洗板。OPD显色，H2SO4终止，酶联检测仪测OD490nm值。依据反应曲线和P/N值(阳性与阴性OD值比值)，确定最佳检测抗体。
2.5捕获抗体包被浓度和酶标抗体工作浓度的确定
采用棋盘滴定法，方法如下：
(1)分别将抗体于浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.312μg/mL，100μL/孔包被微孔板，4℃包被过夜；
(2)以含有2％BSA的PBS 37℃封闭2h；
(3)加入1μg/mL的Dextran 2000标准品100μL/孔，37℃反应1h；
(4)加入不同稀释倍数的葡聚糖酶标抗体，37℃反应45min；
(5)OPD显色，H2SO4终止，酶联检测仪测OD490nm值。依据反应曲线及P/N值，确定最佳抗体组合、抗体包被浓度及酶标抗体工作浓度。
2.6双抗体夹心ELISA方法最适反应条件的确定
2.6.1抗原包被方式的选择
分别用4℃过夜，37℃，1h和2h方式包被抗体，2％BSA封闭后，加入1μg/mL的Dextran2000标准品100μL/孔，同时设立阴性孔，进行夹心ELISA检测，根据P/N值选择合适的包被方式。
2.6.2封闭剂的选择
以最佳包被方式包被抗体，分别用0.5％明胶、5％脱脂奶粉、2％BSA封闭微孔板，37℃温箱封闭2h，其余同夹心ELISA方法，根据P/N值选择合适的封闭剂。
2.6.3酶标二抗作用时间
根据已经确定的反应条件，将酶标抗体的孵育时间分别设为30min、45min和1h，其他步骤同上述夹心ELISA，根据P/N值选择合适的作用时间。
2.6.4底物作用时间的选择
根据已经确定的ELISA反应条件，将底物作用时间选择37℃温育5min、10min、15min，根据P/N值选择最佳的底物作用时间。
2.7夹心ELISA反应体系特性研究
2.7.1标准曲线的建立
选择确立的最佳抗体，按最佳包被浓度包被微孔板，封闭，洗涤后，加入Dextran 2000标准品，用优化的夹心ELISA方法进行实验，以Dextran 2000标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制标准曲线，并根据曲线的具体情况选择最佳的拟合模型。
2.7.2标准品回收率
选取某一Dextran 2000标准品浓度，加入高、中、低3个浓度的Dextran 2000标准品，进行夹心ELISA实验，读取OD值，根据曲线方程获得各加标浓度Dextran 2000标准品测量值，用测量值除以理论值(已知值)，即可得Dextran 2000标准品加标回收率，检测ELISA方法的准确性。
2.7.3最低检测限
做标准曲线的同时，随机选择12个孔做零Dextran 2000标准品孔，进行夹心ELISA试验，求所得12个OD值的平均值(A0)和标准差(SD)，在标准曲线上对应(A0+2SD)的Dextran 2000标准品浓度即为此方法的最低检测限，即该系统的灵敏度。
2.7.4变异系数
2.7.4.1批内重复性试验
取同批次包被的微孔条，对不同浓度的Dextran 2000标准品进行平行测定3次，记录OD值，计算变异系数，考察批内变异系数。
2.7.4.2批间重复性试验
取不同包被日期的包被条，对不同浓度的Dextran 2000标准品进行平行测定3次，记录OD值，计算变异系数，考察批间变异系数。
2.7.5稳定性
同批次包被的包被条，分别在4℃、-20℃保存180d，用Dextran 2000标准品进行夹心ELISA检测，记录OD值，绘制标准曲线。分析不同保存条件下抗体的稳定性。
2.7.6特异性鉴定
用确立的抗体包被微孔板，封闭，洗涤后加入从1000ng/mL开始倍比稀释的Dextran 2000标准品、β-葡聚糖、淀粉、蔗糖、白糖、葡萄糖100μL/孔，37℃反应45min，PBST洗涤后加入最佳浓度稀释的酶标抗体，37℃反应45min，洗涤后加入OPD底显色，H2SO4终止反应，酶联检测仪测定OD490nm值，以P/N≥2.1为阳性，考察抗体ELISA反应的特异性。
3、结果
3.1抗体的制备与纯化鉴定
选取4株杂交瘤细胞(D9，D24，D27，D29)制备腹水，腹水经rProteinA亲和柱纯化，得到2个蛋白峰，SDS-PAGE结果显示重、轻链两条蛋白带，相对分子质量分别为55KDa和25KDa(图1)，其纯度可达95％以上。经蛋白分光光度计测定，纯化的抗体蛋白浓度分别为1.72mg/mL、2.13mg/mL，1.2mg/mL、1.85mg/mL。间接ELISA方法测定表明，纯化的抗体效价分别为1.28×106、2.56×106、5.12×105、1.28×106。
3.2酶标抗体活性测定
以浓度为5μg/mL的Dextran 40-OVA为包被抗原，直接ELISA法检测酶标抗体的效价。结果表明OD值随着酶标抗体的稀释度变大而变小，当酶标抗体的稀释度为1∶64000时其OD均值为0.419(P＝0.419，N＝0.085，P/N≥2.1)，表明D24酶标抗体(D24-HRP)效价大于105，具有较强的抗原结合活性与酶活性(图2)。
3.3捕获抗体的确定
ELISA实验结果显示，在同样包被浓度(5μg/mL)下，D9抗体和D24酶标抗体配对所产生的OD值最高，P/N值最大，因此确立D9抗体为最佳捕获抗体(图3)。
3.4捕获抗体包被浓度和酶标抗体工作浓度的确定
棋盘滴定实验结果显示，随着D9抗体包被浓度的增加，OD值呈上升趋势，当包被浓度为2.5μg/mL，OD值随着包被浓度的增加变化不明显，表明包被抗体趋于饱和。而D24酶标抗体稀释度为1∶8000时P/N值最高(P/N＝24.66，P＝1.608，N＝0.065)。因此确立D9抗体包被浓度为2.5μg/mL，D24酶标抗体稀释度为1∶8000(图4)。
3.5夹心ELISA体系的优化
3.5.1抗原包被方式的选择
分别用4℃包被过夜、37℃包被1h、2h三种方式包被D9抗体，加入1μg/mL的Dextran2000标准品，D24酶标抗体1∶8000稀释，进行ELISA检测，结果见表1。从表1中可以看出，4℃包被过夜OD值最高，P/N最大，故采用4℃包被过夜。
表1不同包被方式的效果比较
3.5.2封闭剂的选择
分别用0.5％明胶、5％脱脂奶粉、2％BSA作为封闭液，进行夹心ELISA试验，结果见表2，3种封闭液的差别不大，因此选择P/N最大的2％BSA作为封闭液。
表2不同封闭剂的效果比较
3.5.3酶标抗体作用时间
根据已经确定的反应条件，将D24酶标抗体的反应时间分别设为37℃，30min、45min和1h，结果见表3，实验表明，D24酶标抗体反应时间为30min时，OD值较低，反应不完全；而反应1h后，阴性孔值偏高，因此，选择37℃，45min作为D24酶标抗体反应时间。
表3酶标抗体作用时间比较
3.5.4底物作用时间的选择
在夹心ELISA中取不同的底物作用时间看OD值变化，结果见表4。从表4中可以看出，在10min时P/N值最大，所以选择10min作为底物作用时间。
表4底物作用时间的效果比较
3.5.5夹心ELISA体系的建立
(1)将D9抗体以2.5μg/mL包被于微孔板，100μL/孔，4℃包被过夜；
(2)用pH 7.2的PBST洗涤5次，每次90s；
(3)2％BSA封闭，200μL/孔，37℃温育2h；
(4)用PBST洗涤5次，每次90s；
(5)Dextran 2000标准品或样品溶液100μL/孔，同时设标准品零值孔、阴性孔，每个样品设3个复孔、37℃反应1h；
(6)用PBST洗涤5次，每次90s；
(7)加入D24酶标抗体(二抗，1∶8000)，每孔100μL，37℃温育45min；
(8)用PBST洗涤5次，每次90s；
(9)加入OPD底物溶液，每孔50μL，37℃温育10min，每孔滴加50μL 2M H2SO4溶液终止反应，酶联检测仪测定OD490值。
3.6夹心ELISA反应体系特性研究
3.6.1标准曲线的建立
选择10个Dextran 2000标准品浓度，从1000ng/mL开始，依次倍比稀释，用已经建立的夹心ELISA方法检测，实验结果表明，D29抗体能有效与Dextran 2000标准品进行反应，葡聚糖浓度越高，OD值越大，并体现一定量效关系，结果见表5。以Dextran 2000标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制标准曲线，分析数据可得，OD值随葡聚糖浓度增加而增加，曲线在葡聚糖浓度为7.8ng/mL～500ng/mL范围内线性关系良好(图5)，相关系数R2＝0.9909，变异系数小于5％。
表5标准品的ELISA测定结果
3.6.2加标回收实验
在Dextran浓度为5ng/mL Dextran 2000标准品中，分别加入10ng/mL、100ng/mL、400ng/mL的Dextran 2000，进行夹心ELISA实验。结果(见表6)表明，3个添加水平的样品回收率范围为97.8％～108.3％，变异系数小于7％，表明该方法准确度较高，有较好的重复性。
表6加标回收实验结果
3.6.3最低检测限
做标准曲线的同时，随机选择12个孔做零Dextran 2000标准品进行夹心ELISA实验，所得12个孔OD值的平均值(A0)为0.065，标准差(SD)为0.006，见表7。在标准曲线上对应A0+2SD(0.077)的标准品浓度为6.34ng/mL，即此方法的最低检测限。
表7零标准品ELISA检测结果
3.6.4变异系数
3.6.4.1批内重复性试验
取同批次包被条9条，对线性范围内的Dextran 2000标准品进行平行测定3次，实验结果显示，各浓度标准品的变异系数在2.891％～11.93％之间，均小于15％，见表8，表明该方法有较好的重复性。
表8标准品的批内重复试验结果
3.6.4.2批间重复性试验
取3个不同包被日期的包被条，对不同浓度的Dextran 2000标准品进行平行测定3次，实验结果显示，线性范围内Dextran 2000标准品变异系数在2.574％～12.61％之间，均小于15％，见表9，表明该方法有较好的批间重复性。
表9标准品的批间重复试验结果
3.6.5稳定性
同批次包被的微孔条，分别在4℃、-20℃密封保存180d，用Dextran 2000标准品进行夹心ELISA检测，记录OD值，绘制标准曲线(图6)。实验结果表明，包被条置于4℃和-20℃保存180d没有明显差别；放置在4℃的OD值整体稍微偏低，线性相关系数较低。说明抗体具有较好的稳定性。
3.6.6特异性测定
夹心ELISA实验表明，包被的D9抗体与Dextran 2000有良好的反应性，随着Dextran2000浓度的增加，OD值呈规律增加，而加入从1000ng/mL开始倍比稀释的β-葡聚糖、淀粉、蔗糖、白糖、葡萄糖的孔，OD值并没有产生显著性的变化(图7)。说明D9抗体与这些糖类似物并不能发生反应，表明该抗体具有较强的特异性。
实施例2：蜂蜜样品中葡聚糖的定量检测
对收集的蜂蜜样品用夹心ELISA进行检测，平行测量3次后取其平均OD值，代入标准曲线方程，得到样品的葡聚糖含量测量值，结果表明，在5份蜂蜜样品中，2份检出葡聚糖，葡聚糖含量分别为2.06μg/g、7.39μg/g。对这两份样品进行加标回收实验，结果表明，样品回收率在91.28％～114.1％之间(见表10)。
表10蜂蜜样品加标回收实验
由表10表明，该夹心ELISA方法能够相对准确测定样品中的葡聚糖含量，证实夹心ELISA在临床上测定葡聚糖含量的可行性。
Claims (10)
1.一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于包括以下步骤：
1)酶标反应板的包被，具体方法为：取葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞株D9包被96孔酶标板，100μL/孔，同时设置阴性对照孔和空白孔，4℃过夜；所述杂交瘤细胞株D9已于2010年12月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：C2010107；
2)酶标反应板的封闭，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加封闭液，37℃孵育；
3)加检测样品，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入Dextran 2000标准品或样品溶液，100μL/孔，同时设标准品零值孔、阴性孔，每个样品设3个复孔，37℃反应；
4)加酶标二抗，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入D24酶标抗体，37℃温育；
5)加底物显色，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入显色OPD溶液，37℃温育；
6)终止反应，具体方法为：每孔加入50μL H2SO4溶液终止反应；
7)OD值的测定，具体方法为：用酶标仪测定，以空白孔调零，在A490波长测定样品和阴性对照的OD值，完成葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定。
2.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤1)中，所述葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞株D9的质量浓度为2.5μg/mL。
3.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤1)中，所述包被的包被液采用摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸盐缓冲液，pH 9.6。
4.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤2)中，所述洗涤剂采用pH 7.2的PBST，所述洗涤的次数为5次，每次洗涤的时间为90s。
5.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤2)中，所述封闭液采用10mM的PBS溶液，含2％BSA；所述封闭液的加入量为每孔加封闭液200μL；所述孵育的时间为2h。
6.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤3)、4)、5)中，所述洗涤剂采用PBST，所述洗涤的次数为5次，每次洗涤的时间为90s。
7.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤3)中，所述反应的时间为1h。
8.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤4)中，所述D24酶标抗体采用1∶8000的D24酶标抗体，1∶8000的D24酶标抗体通过改良的高碘酸氧化法制备；加入D24酶标抗体的量为100μL/孔；所述温育的时间为45min。
9.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤5)中，所述加入显色OPD溶液的量为50μL/孔；所述温育的时间为10min。
10.如权利要求1所述一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于在步骤6)中，所述H2SO4溶液的摩尔浓度为2mol/L。
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