CN1877332A

CN1877332A - 一种检测赭曲霉毒素a的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN1877332A
Application number: CN 200610088261
Authority: CN
Inventors: 张莲芬; 金坚; 许赣荣; 许泓瑜
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2006-07-06
Filing date: 2006-07-06
Publication date: 2006-12-13

Abstract

一种检测赭曲霉毒素A的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于对粮食，饲料及其食品中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。本试剂盒采用ELISA检测OTA，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有OTA－BSA，加入OTA标准或样品，再加入OTA抗体。游离的OTA与微孔板上的OTA－BSA竞争OTA抗体，没有连接的OTA抗体被洗涤除去，加入HRP－羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的HRP－羊抗兔抗体被洗涤除去。加显色液、终止液后，用酶标仪测定其吸光度，吸光度的值与样品中的OTA浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中OTA的含量。本试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到1ng/ml以上。

Description

一种检测赭曲霉毒素A的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法

技术领域

一种检测赭曲霉毒素A的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于对粮食，饲料及其食品中赭曲霉毒素A(简称OTA)含量的检测。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)是真菌曲霉ochraceous和几种Penicillium真菌产生的一种毒素。OTA已经被证明对动物及人的肾产生损害，也是一种致癌物质，霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食，油料作物以及发酵食品等引起，而且霉菌毒素中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等。OTA在大多数谷物中均可分离到，包括大麦、小麦、燕麦、玉米、咖啡豆等，以这些谷物作为饲料的家禽也会受到污染，因此为了保障人们的健康，开展食品中OTA的卫生检测研究是很有必要的。

第56次FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)会议对OTA进行了危险性评价，得出的结论是体内和体外试验显示OTA都具有遗传毒性，考虑到小麦、大麦和黑麦等谷物是摄入OTA主要的食物品种，决定制定这些食物中OTA的限量标准，会议认为这些食物及其制品中OTA限量为5μg/kg。到目前为止，已有11个国家制定了食品(1-50μg/kg)和饲料(100-1000μg/kg)中的OTA的限量标准，主要是欧洲国家，我国尚无粮食中的OTA限量标准。

因而作为国际食品安全评价机构的JECFA很少能得到我国的污染监测和暴露量评估数据，使我们始终处于被动地位。另外对于食品、农副土特产品、保健品等出口到欧盟市场，其检验检疫必须符合有关OTA、黄曲霉、污染农药等食品安全规定的要求，在这方面我国产品的出口已遭受了很多的损失，而且进口方面，也迫切要求建立一个完善、方便的检测手段。因此，尽快建立高灵敏的OTA的检测，积极开展OTA的研究是当务之急。

目前赭曲霉毒素A的测定方法有多种，如：薄层色谱法TLC(灵敏度为10μg/ml)，高效液相色谱法HPLC(灵敏度为10μg/ml)，免疫荧光染色法(灵敏度0.025μg/ml)，但由于费时，灵敏度低，仪器设备昂贵，操作复杂且不适用于大批量样品的检测等缺点，已被逐步淘汰。酶联免疫分析法(ELISA)，由于其特异性强，灵敏度高，操作简便，不需直接接触毒素，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。尽管如此，国内在OTA-ELISA方法到试剂盒的转化中技术不成熟，检测的灵敏度和试剂的稳定性还无法达到要求，致使无法实际应用，所以目前为止没有一个国产的OTA-ELISA试剂盒面市。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测赭曲霉毒素A的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，用于对粮食，饲料及其食品中OTA含量的检测。

本发明的技术方案：该检测OTA的试剂盒是由1、96或48孔包被板，2、赭曲霉毒素A标准品，3、赭曲霉毒素A的抗体冻干品，4、酶标记的羊抗兔抗体冻干品，5、洗涤液，6、显色液A，7、显色液B，8、终止液所组成。

所述的酶标记的羊抗兔抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗兔抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的Tris-HCl缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液。

本发明主要采用酶联免疫分析法(ELISA)来检测OTA。采用ELISA的技术主要有两个方面：第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，OTA-ELISA试剂盒的制备。

检测赭曲霉毒素A的酶联免疫分析试剂盒的制备详见实施例1。

测定方法为：测定的基础是标记免疫反应。取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入OTA抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液，在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的OTA含量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到1ng/ml以上。

附图说明

图1：检测赭曲霉毒素A的试剂盒示意图。1、96或48孔包被板，2、赭曲霉毒素A标准品，3、赭曲霉毒素A的抗体冻干品，4、酶标记的羊抗兔抗体冻干品，5、洗涤液，6、显色液A，7、显色液B，8、终止液。

图2：OTA-ELISA标准曲线图。

具体实施方式

实施例1制备试剂盒和检测玉米样品

OTA是典型的半抗原，故在免疫反应中具有反应原性，但需与大分子物质结合后才有免疫原性，OTA中的羧基为活性基团，可与蛋白质的氨基结合。因此可用碳二亚胺法，使OTA与大分子蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)结合，以合成的OTA-KLH作为人工合成的免疫抗原进行动物免疫。

OTA-KLH抗原的制备：

1用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解1-2mg OTA；

2用1ml的0.13mol/L NaHCO₃偶联缓冲液溶解1-2mg KLH载体蛋白；

3.取0.4-0.8mg OTA的溶液加到KLH的溶液中；

4.溶解2-4mg碳二亚胺(EDC)于1mL双蒸水，并取50-100μl加入到上述混合液中，室温作用2小时(避光)；

5.离心后取上清液上柱(Sephadex G-25)分离，进行紫外扫描检测。

多克隆赭曲霉毒素A抗体冻干品的制备：

1.选取4周大的，体重约1.5Kg的健康新西兰大白兔。OTA是一种半抗原，将OTA和KLH相连接作为抗原。

2.油包水抗原乳化剂的制备：用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合2mgOTA-KLH，用匀浆器混合2小时。将制好的乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中，以油滴状态能完整地停留在水面上，而不扩散，表明是稳定的。

3.免疫兔子及抗赭曲霉毒素A抗体冻干品的制备：先将兔子背部的毛小心剪去，然后取600μL制备好的油包水抗原乳化剂，多位点地进行皮下注射，使抗原能缓慢扩散，每隔1～2周免疫一次，共需六次，在免疫3～4次后，从兔子的耳缘静脉抽血约1ml，离心10min后，得血清可进行鉴定。合格后稀释至适当浓度，按需分装，冻干备用。

包被板固相抗原制备：

将OTA-BSA用50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加150μl含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

试剂的配制：

(1)标准品赭曲霉毒素A：(0ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，)，从OTA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水体积比为3.5∶6.5。

(2)抗赭曲霉毒素A抗体冻干品的制备见上述。

(3)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体冻干品(HRP-羊抗兔抗体)：市售，珠海百奥生物科技有限公司生产。

(4)洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN₃的50mmol/LTris-HCl pH7.8。

(5)显色液A：0.2MNa₂HPO₄ 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml和30％的H₂O₂50ml。

(6)显色液B：称取5mg四甲基联苯二胺(TMB)加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。

(7)终止液：2mol/L的H₂SO₄。

每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1)1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有OTA-BSA。

(2)6×OTA标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为：0，0.5，1，5，20，50ng/ml。

(3)1×OTA抗体冻干品，用时5ml蒸馏水溶解。

(4)1×HRP-羊抗兔抗体冻干品，用时10ml蒸馏水溶解。

(5)1×洗涤液：30ml，用时以蒸馏水1∶25稀释。

(6)1×显色液A：10ml。

(7)1×显色液B：10ml。

(8)1×终止液：10ml。

实验室应自备的试剂

甲醇。

70％甲醇溶液：30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70％甲醇溶液。

蒸馏水或去离子水。

测定之前注意事项

1.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。

2.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3.如果样品量大建议使用多通道移液器。

4.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。

5.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。

具体检测步骤如下：

先将样品进行处理：将玉米样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5ml(甲醇∶水体积比为7∶3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1ml滤液用1ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用，稀释后的样品中的甲醇与水的实际体积比为3.5∶6.5，与标准品赭曲霉毒素A中甲醇与水的体积比相同。

取OTA-BSA板条，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加50μl OTA抗体，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，37℃振荡0.5小时，洗涤液洗三次，加100μl HRP-羊抗兔抗体，37℃振荡0.5小时，用洗涤液洗六次，加50μl显色液A、50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液测量吸光度，从标准曲线计算样品中的OTA含量。见表1，该例的样品浓度为0.5ng/ml。

表1

OTA标准点
OTA标准点								OTA浓度(ng/ml)	0	0.5	1	5	20	50	玉米样品
吸光度(OD₄₅₀)	1.82	1.61	1.45	1.01	0.58	0.21	1.62	OTA浓度(ng/ml)	0	0.5	1	5	20	50	玉米样品

实施例2

试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测大麦样品。

具体检测步骤如下：

先将大麦样品进行处理：将大麦样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5ml(甲醇∶水＝7∶3)。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1ml滤液用1ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。

取OTA-BSA板条，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加50μl OTA抗体，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，37℃振荡0.5小时，洗涤液洗三次，加100μl HRP-羊抗兔抗体，37℃振荡0.5小时，用洗涤液洗六次，加50μl显色液A、50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液测量吸光度，从标准曲线计算样品中的OTA含量。见表2，该例的样品浓度为1.0ng/ml。

表2

OTA标准点
OTA标准点								OTA浓度(ng/ml)	0	0.5	1	5	20	50	大麦样品
吸光度(OD₄₅₀)	1.82	1.61	1.45	1.01	0.58	0.21	1.43	OTA浓度(ng/ml)	0	0.5	1	5	20	50	大麦样品

Claims

1.一种检测赭曲霉毒素A的酶联免疫分析试剂盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，赭曲霉毒素A标准品(2)，抗赭曲霉毒素A的抗体冻干品(3)，酶标记的羊抗兔抗体冻干品(4)，洗涤液(5)，显色液A(6)，显色液B(7)和终止液(8)所组成；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μl含3g/L BSA的上述Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的赭曲霉毒素A标准品(2)，从OTA纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水体积比为3.5∶6.5，共6瓶，OTA浓度分别为：0ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，20ng/ml，50ng/ml。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的赭曲霉毒素A的抗体冻干品(3)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合2mgOTA-KLH，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μl制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清合格后稀释、分装、冻干备用。

5.一种用权利要求1所述的试剂盒检测赭曲霉毒素A的方法，其特征是取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入OTA抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液，在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的OTA含量。

6.根据权利要求5所述的检测赭曲霉毒素A的方法，其操作为：取包被有OTA-BSA的微孔包被板，加入50μl的OTA标准或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl抗OTA抗体，37℃振荡0.5小时，洗涤液洗三次，加100μl HRP-羊抗兔抗体，37℃振荡0.5小时，用洗涤液洗六次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度，从标准曲线计算样品中的OTA含量。

7.根据权利要求6所述的检测赭曲霉毒素A的方法，其中的样品处理方法为：将谷物样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入提取液12.5ml，提取液为甲醇∶水体积比为7∶3，加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸，取1ml滤液用1ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。