CN108918849A - 快速检测药材中的黄曲霉毒素的方法和所用的试纸卡 - Google Patents

Abstract

本发明涉及快速检测药材中的黄曲霉毒素的方法和所用的试纸卡。该方法包括如下步骤：提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡；样品用乙腈溶液提取，过NH2/C18柱净化样品，过C18柱二次净化样品测定：移取样品提取液，点于胶体金试纸卡上，在45℃条件下恒温孵育，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。本发明方法可以在5分钟检测出结果，这种方法可以准确定量检测各种根及根茎类中药材。本发明所提供的试纸卡具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、检测结果准确、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。此外，本发明方法回收率高、检测结果可以长时间保存。

Description

快速检测药材中的黄曲霉毒素的方法和所用的试纸卡

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别是属于医药检测技术领域，涉及一种快速检测中药材中的黄曲霉毒素特别是其总量的方法，以及该方法所用的试纸卡，特别地，本发明涉及一种采用胶体金试纸卡来快速检测中药材中黄曲霉毒素的量特别是其总量的方法。本发明方法呈现优异的技术效果。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。AFT 由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物，是自然界中已发现的理化性质最稳定的一类毒素。已知的AFT有20多种，常见的有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2，其中黄曲霉毒素B类和G类具有很强的肝毒性，尤其 B1的毒性最强，也是致癌性最强的一种物质，在1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等农作物。

黄曲霉毒素不仅广泛存在于玉米、麦类、稻谷等农产品以及坚果、花生等多种食用植物中，也存在于中药等药用植物中。中药材材种类繁多，种植地区广泛，多数药材在生产、加工、贮藏、运输的过程中，很容易发生霉变而被黄曲霉毒素污染。有学者在对中药黄曲霉毒素的污染情况进行调研时发现，中药材、饮片及中成药被黄曲霉毒素污染的情况十分普遍。因其剧毒和强致癌性，且对于其污染预防研究的薄弱，黄曲霉毒素成为国内外政府和消费者监管与关注重点。针对农产品及食品，我国及世界各国就其污染问题采取控制措施，即设置严格的限量标准来保障农产品质量安全。而相较之下，对于中药中的污染控制甚为薄弱。《中国药典》(2015版)开始对远志等19种药材及其饮片品种项下增加黄曲霉毒素检查项目。药典限量为黄曲霉毒素B1不得过5μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量不得过10μg/kg。其他中药材及饮片均未控制尚未有标准对其黄曲霉毒素的限量进行规定。根及根茎类中药为中药中品种种类最多的一类，《中国药典》(2015年版)中根及根茎类中药占收载药材饮片数量的近1/3。其次，根及根茎类中药原植物长期接触土壤、水和腐殖质，并且含有糖类、粘液质、淀粉、蛋白质及油类等成分增加了其感染黄曲霉毒素的风险。另外如远志等饮片的特殊炮制方法，需要水中长时间浸泡等也增加了霉变感染黄曲霉毒素的可能。所以对于根及根茎类中药安全性的监管和黄曲霉毒素污染的控制势在必行。尤其是中成药建立高灵敏度的黄曲霉毒素测定方法有着迫切的需求。

目前，对黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析法、质谱法、免疫亲和荧光法等。高效液相色谱法灵敏度高、分离能力强、特异性好等，但有些样品需要作彻底有效的前处理，不适合于大批量样品的检测，并且设备仪器昂贵，不易普及。酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、可定量、对样品纯度要求不高等优点，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。胶体金免疫层析法与酶联免疫法相比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于进行现场快速筛选。

现有技术公开了一些检测某些食品或粮食中的黄曲霉毒素。例如，CN107688087A(201710763310.2，深圳)公开了一种黄曲霉毒素M1的检测凝胶柱及黄曲霉毒素M1的检测方法，黄曲霉毒素M1的检测凝胶柱包括空心柱以及填充在空心柱内的检测层和质控层。检测时，将待测样品和化学发光标记物标记的黄曲霉毒素M1酶标抗原加入到该黄曲霉毒素M1的检测凝胶柱中并流经检测层和质控层。待测样品和化学发光标记物标记的黄曲霉毒素M1酶标抗原两者共同竞争检测层中的黄曲霉毒素M1单克隆抗体，根据检测层的颜色和质控层的颜色判断待测样品中是否含有黄曲霉毒素M1。据信上述黄曲霉毒素M1的检测凝胶柱携带方便，快速、灵敏的检测待测样品中是否含有黄曲霉毒素M1，适合现场大量本的快速检测。

CN104422686A(201310397266.X，蓝农谷)公开了一种测定黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤： (1)待用液1的制备(2)待用液2的制备(3)制备HRP(辣根过氧化物酶)修饰的R1(4)制备 HRP修饰的R2(5)黄曲霉毒素的检测。红色罗丹明B既不会引起浓度淬灭，也不会导致光强不足。云母粉末的加入使草酸酯发光体系的发光寿命显著延长。三联吡啶钌和化学发光具有检测灵敏度高、线性范围宽等优点，能够更加有效的检测黄曲霉毒素。本发明具有更低的毒性、更高的闪点和更低的蒸气压这些优良特性。通过检测液态奶中黄曲霉毒素的含量，并利用加标回收率法得到回收率在 98.4％-100.4％，表明此方法在测定黄曲霉毒素时具有良好的准确度。

CN106290889A(201610679285.5，广东)公开了一种黄曲霉毒素B1的检测方法，包括以下步骤：前处理：以提取溶液对待测样品进行提取，随后加入稀释液，得到待检溶液；所述提取溶液为体积百分浓度为40％-100％的甲醇水溶液和/或乙腈，所述稀释液为水或缓冲盐水溶液；检测：取所述待检溶液，加入到包被了黄曲霉毒素B1抗原的酶标板上，再加入黄曲霉毒素B1抗体溶液，温育，加入辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗进行酶活性的放大，洗板，加入底物显色剂、终止液，然后以酶标仪测定吸光度值，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。据信该检测方法避免了氮吹等前处理步骤，具有步骤简单，稳定性好的优点，能够快速检出黄曲酶毒素B1的残留量。

CN106872619A(201710272829.0，博泰)公开了黄曲霉毒素的测定方法，其创新点在于：包括以下步骤：1)称取样品，加入乙腈-水的提取液搅拌45分钟，其中乙腈和水的体积比为20:12，然后用定性滤纸过滤；2)样品测定：色谱条件为：液相色谱柱Agilent SB C-18(25cm×4.6mm)；流动相：体积百分比为85％的乙腈和15％的水；柱温：45℃，进样量：25mL；流速：1.0mL/min；取8mL提取过滤液至多功能净化柱，净化柱的收集池内转移2mL净化液到衍生瓶中，60℃下氮吹后，加500mL正己烷和100mL三氯乙酸混匀，45s后于56℃烘箱衍生15min，室温下干燥后以500uL水-乙腈溶解，混匀后全部进自动进样瓶中，测定。据信该发明的检测方法操作简单，快速，结果精确可靠；污染少，安全性高，减少对操作人员和环境的污染；检测成本较低，易于推广。

CN108051520A(201711345652.9，健牛)针对普洱茶中共存物质对黄曲霉毒素B1测定有严重干扰的难题，制备了两种对黄曲霉毒素B1有特异性吸附，又对干扰物质起到净化作用的功能性磁性纳米材料，在使用时采用两种材料的混合物，将吸附及净化同时完成，结合高效液相色谱-荧光检测器进行普洱茶中黄曲霉毒素B1测定，有准确的测定结果，将建立的方法与HPLC-MS/MS比对，结果一致。据信该发明方法制备的功能性磁性四氧化三铁纳米粒子充分利用了聚多巴胺对黄曲霉毒素B1的强吸附作用，阳离子表面活性剂CTAB好的分散作用，多巴胺制备的CQDs表面的亲水作用，使用两种功能性磁性纳米材料的混合物对普洱茶中AFB1既有净化又有吸附的双重作用。由于制备材料为纳米级，材料用量少，只需几毫克，成本低廉，检测时间短，只需几分钟，这些特点都本发明所用的技术在普洱茶中黄曲霉毒素B1测定中具有巨大的优势。

CN103134924A(201110381284.X，艾科瑞思)公开了一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，属于酶联免疫吸附分析(ELISA)技术领域，用于对粮食，饲料及其食品中黄曲霉毒素B1(简称AFB1)含量的检测。一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，包括盒体和盒内的一块24孔AFB1包被反应板，一个反应盖板，13瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，一个冰袋，一个框架，一份说明书，一包吸水纸，2支一次性滴管和一份质检报告，其特征在于：包被反应板是采用24孔试剂板作为固相载体，13瓶试剂分别6 瓶AFB1标准品溶液、酶标抗原、酶标抗原稀释缓冲液、浓缩洗涤液、样品稀释液、底物液、显色液、终止液，下凹瓶位共16个。据信该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.1ng/ml 以上。

CN103175874A(201310053018.3，上海)公开了一种黄曲霉毒素B1的检测方法，绘制标准曲线：将黄曲霉毒素B1样品与有机溶剂共孵育，配置成不同浓度的黄曲霉毒素B1标准品，在标准品中分别加入阻抗溶液；用多壁碳纳米管/离子液体/抗体修饰电极测得阻抗溶液中不同AFB1浓度的相应的阻抗值，绘制标准曲线；将待测样品提纯后与有机溶剂共孵育，配成待测样品溶液，然后再加入阻抗溶液，用预处理过的修饰电极测得阻抗溶液的阻抗值，再根据标准曲线，计算待测样品中AFB1的浓度。据信该发明检测黄曲霉毒素B1的时间短，检测步骤精简、检测仪器简单、待测样品前处理也比较简单。而且本检测方法的选择性好、响应速度快、灵敏度高、检测范围宽。

CN103675270A(201310624253.1，鼎晟)公开了一种快速筛选黄曲霉毒素的检验法，该方法用胶体金标记抗黄曲霉毒素B1(AFB1)单克隆抗体作为分析探针，AFB1完全抗原AFB1-O-BSA偶联物作为竞争抗原，以羊抗鼠抗体作为控制抗体，进行AFB1的检测分析。利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行定性或半定量检测。据信该检测方法特异性强，灵敏度高于市销的同类产品，可用于食品中、农产品中黄曲霉毒素的快速检测，对今后免疫分析方法和生物传感器的研究起到一定的作用。

CN103954714A(201410001661.6，南通)公开了一种黄曲霉毒素的测定方法，包括以下步骤：1) 称取样品，加入乙腈-水的提取液搅拌30分钟，其中乙腈和水的体积比为84:16，然后用定性滤纸过滤； 2)样品测定：色谱条件为：液相色谱柱AgilentSBC-18(25cm×4.6mm)；流动相：体积百分比为85％的乙腈和15％的水；柱温：30℃，进样量：25mL；流速：1.0mL/min；取8mL提取过滤液至多功能净化柱，净化柱的收集池内转移2mL净化液到衍生瓶中，60℃下氮吹后，加200mL正己烷和100mL三氯乙酸混匀，30s后于40℃烘箱衍生15min，室温下干燥后以200uL水-乙腈溶解，混匀后全部进自动进样瓶中，测定。据信该发明的检测方法操作简单，快速，结果精确可靠；污染少，安全性高，减少对操作人员和环境的污染；检测成本较低，易于推广。

CN104914196A(201510344861.6，梧州)公开了一种食品中黄曲霉毒素的测定方法，旨在提供一种检测成本低，检测时间短的食品中黄曲霉毒素的测定方法；其技术要点：测试品提取净化，精密称取粉碎均质后的样品2.0g，置50ml离心管中，加入乙腈4ml，旋涡混合4min，在4000转/min下离心 4min，精密量取上清液1ml，置子含200mg HC-C18+25mg PSA预混合弹头净化管中，旋涡混合3min， 15000转/min超高速离心10min，取上清液过0.2微米滤膜置液相进样瓶中，即得；将提取净化后的样品分别取2μl进入高效液相色谱仪-光化学衍生仪加荧光检测器检测。

上述方法均不具备大批量、快速、现场检测的要求。现有技术公开了一些使用胶体金免疫层析法来检测某些食品或粮食中的黄曲霉毒素或者涉及此方法中使用的试纸卡。例如，CN202903794U (201220379937.0，勤邦)公开了一种检测黄曲霉毒素B1残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。据信该发明试纸卡样品吸收垫可以将检测液体充分吸收，与结合物释放垫上喷涂的金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差，操作简便快速、结果显示形象直观准确、成本低，灵敏度高。

CN 206177962U(201621220034.2，快捷康)公开了一种黄曲霉毒素B1胶体金法免疫层析试纸卡，包括由底座和面盖嵌合连在一起的塑料盒体，所述塑料盒体内封装有用于检测的试纸条；所述试纸条包括底板及依次设置在底板上紧密相连的样品垫、金标垫、反应膜、吸水垫；所述塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的反应膜位置相对应；其特征在于：所述反应膜具有包被有黄曲霉毒素B1检测溶液印制的检测线和包被羊抗鼠IgG 溶液印制的质控线，其中检测线位于靠近样品垫的一侧；所述金标垫上灌注有黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金标记物；所述底板边缘处向上凸起形成环形结构的隔水环，所述隔水环的内边缘分别与样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫相连，且隔水环顶面的高度高于样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫的高度。据信该申请通过隔水环将试纸条上反应区域限定在一定范围，有助于检测样品与反应剂的反应融合，使得两者之间融合更加充分，提高了检测的精确性。

CN 105467115A(201510789180.0，南昌)公开了一种检测黄曲霉毒素M1免疫层析胶体金试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜(NC)、吸水垫和PVC背衬；硝酸纤维素膜黏附在PVC背衬上，样品垫和吸水垫分别黏附在硝酸纤维素膜上的两端；硝酸纤维素膜上依次分布样品垫、检测线T1、检测线T2、质控线、吸水垫；检测线T1上固定的是1号抗原，浓度为0.15mg/mL；所述1号抗原为：黄曲霉毒素B1与BSA摩尔偶联比25:1偶联物；检测线T2上固定的是2号抗原，浓度为0.8mg/mL；所述2 号抗原为：黄曲霉毒素B1与BSA摩尔偶联比40:1偶联物；质控线上喷涂的是羊(兔)抗鼠IgG，浓度为2.5mg/mL。据信该发明采用一步法间接竞争免疫层析技术快速检测牛奶中黄曲霉毒素M1残留是否符合欧盟限量标准(小于0.05ng/mL)和中国(美国等其他国家)限量标准(小于0.5ng/mL)的胶体金试纸条，灵敏度可达0.05ng/mL。

CN205506834U(201620012472.3，美正)公开了一种快速检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的胶体金试纸，由背板(1)、吸水板(2)、硝酸纤维素膜(3)、样品吸液板(4)、微孔试剂(8)组成；所述硝酸纤维素膜(3)叠放在背板1的中部上面；所述吸水板(2)叠放在背板(1)的其中一端的端头部分上面，所述样品吸液板(4)叠放在背板(1)的另一端的端头部分上面；所述硝酸纤维素膜(3)两端分别与吸水板(2) 和样品吸液板(4)相交叠，且所述硝酸纤维素膜(3)位于吸水板(2)和样品吸液板(4)的下方；从所述硝酸纤维素膜(3)靠近样品吸液板(4)的那一端开始，依次设置T2试验线(6)、T1试验线(5)、和一条控制线 (7)；所述T1试验线(5)和T2试验线(6)分别由黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被；所述控制线(7)由羊抗鼠多克隆抗体包被；所述微孔试剂(8)为冻干后的胶体金标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮单克隆抗体。据信该发明在传统的胶体金免疫层析试纸基础上进行了改进，将胶体金标记抗体复合物直接冻干于微孔中，使得检测过程中待测样本与金标抗体充分反应，提高检测灵敏度，可经济、快速地检测粮食和饲料样品中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮残留。

上述胶体金试纸卡具备基本上相同的结构并且所用的原理相同，特别是例如CN105467115A和 CN205506834U所记载的，是一类比较常用的试纸卡，并且这类试纸卡通常可以从市场上获得，例如可以是从BIOSHOME获得的ROSA FAST5黄曲霉毒素(定量)快速检测条(产品货号 LF-AFQ-FAST5-100K，参见，例如，http://www.bioshome.cn/detail-45-80.html)；或者例如可以是从艾瑞德获得的黄曲霉毒素胶体金快速检测试纸卡(参见，例如，http://www.ardbio.cn/Product/2195842246. html)。

然而，某些中药在测定黄曲霉毒素之前的样品处理过程中，由于中药材成分复杂，可能影响测定的结果，因此在样品处理过程中需要除去一些干扰检测的杂质。

虽然现有技术详细公开了可以用于黄曲霉毒素检测用的胶体金试纸条并且甚至市面上已有成品，然而，在针对一些中药材进行黄曲霉毒素定性甚至定量检测时，并不能直接适用，特别是可能存在一些影响检测的杂质存在于中药材中。因此，本领域仍然期待有新的方法来检测中药材特别是某些根茎类中药材中黄曲霉毒素的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的中药材中黄曲霉毒素残留的检测试纸卡(本领域通常亦可称为试纸条，试纸卡和试纸条二者在本发明中可替换使用)。特别是，本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的中药材中黄曲霉毒素残留的检测试纸卡以及用此类试纸卡检测根茎类中药材中黄曲霉毒素的方法。并且，出于这些目的，还需要克服检测过程中出现的杂质干扰。已经出人意料地发现使用本发明方法能够有效的实现某些药材的黄曲霉毒素定性甚至定量检测。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种检测药材中黄曲霉毒素的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入4～8毫升体积份(例如6毫升体积份)的80～90％(例如85％)乙腈溶液至样品中，涡旋提取1～3分钟；静置1分钟后2000-5000rpm(例如3000-4000rpm)离心3～8分钟(例如5min)，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱(例如Grace- Alltech的Adsorbosphere NH2柱)，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液)中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品100～300μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在 45℃条件下恒温孵育4-6分钟，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

根据本发明第一方面的方法，其中所述药材是根茎类药材。

根据本发明第一方面的方法，其中所述药材是根茎类药材，选自：大黄、丹参、黄连。

根据本发明第一方面的方法，其中所述胶体金试纸卡用于定量测定黄曲霉毒素，包括：样品垫(亦可称为吸收垫或样品吸收垫，其例如可以是海绵材质)、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC背衬；硝酸纤维素膜黏附在PVC背衬上，样品垫和吸水垫分别黏附在硝酸纤维素膜上的两端；硝酸纤维素膜上依次分布样品垫、检测线T1、检测线T2、质控线、吸水垫。如此，吸收垫可以控制样品在层析反应过程中的流速；反应膜上有两条检测线和1条质控线，通过三条色带进行定量检测，检测条色带结果可以保存一年；5分钟可以定量检测出样品中黄曲霉毒素的含量。这种设计是现有技术公知的并且已有商品销售。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2a)中，所述80～90％(例如85％)乙腈溶液是指用磷酸盐缓冲液配制的含乙腈80～90％(例如85％)浓度的溶液。在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液(包括配制乙腈溶液所用的，以及步骤(2d)所用的)是磷酸根离子浓度为10～25mmol/L且pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2a)中，3000-4000rpm离心4～6min。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2a)中，还向乙腈溶液中添加氯化钠。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2a)中，还向乙腈溶液中添加氯化钠，以待检药材或其饮片的粉末每2克重量份计，氯化钠的量为0.1～0.4克重量份，例如0.2～0.3克重量份，例如0.25克重量份。

本发明步骤(3)中，用读数仪对检测条进行读数是胶体金试纸读取试验结果的常规操作方式。

根据本发明第一方面的方法，其中试纸卡检测样品中黄曲霉毒素含量范围为0-150μg/kg。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2a)中，还向乙腈溶液中添加无水硫酸钠。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2a)中，还向乙腈溶液中添加无水硫酸钠，以待检药材或其饮片的粉末每2克重量份计，无水硫酸钠的量为0.05～0.3克重量份，例如0.1～0.2克重量份，例如0.15克重量份。

在本发明描述的方法步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

尽管黄曲霉毒素有多种是一系列化学结构类似的化合物，例如包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2等等，然而本发明方法能够定量的测定黄曲霉毒素的总量。本发明的黄曲霉毒素快速定量检测卡采用侧流向免疫分析技术分析样品中黄曲霉毒素。将黄曲霉毒素B1单克隆抗体与胶体金颗粒在弱碱条件下通过静电吸附作用牢固结合在一起，由于这种结合是静电结合，所以不影响黄曲霉毒素B1单克隆抗体的活性。加入样品提取液，如果样品中含有黄曲霉毒素，样品液体在流动过程中，样品中的黄曲霉毒素与黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金结合形成复合物，样品中的黄曲霉毒素和包被在T1和T2线的黄曲霉毒素B1-载体蛋白偶联物竞争结合黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金，样品中黄曲霉毒素残留越多，形成复合物越多， T1和T2线包被的黄曲霉毒素-载体蛋白偶联物就结合的越少，在T1和T2线富集的胶体金颗粒就少，形成的色带颜色就浅，反之色带颜色越深；结合了样品毒素的黄曲霉毒素B1单克隆抗体-胶体金形成的复合物随着液体沿反应膜向吸水纸的方向流动，到达质控线C线被二抗捕获，形成肉眼可见的色带，复合物越多，在质控线C线被二抗捕获的就越多，形成的色带颜色就越深，反之色带颜色越浅。根据色带颜色通过读数仪来判读待测液中黄曲霉毒素的含量。本发明的黄曲霉毒素快速定量检测卡能够检测样品中黄曲霉毒素含量范围为0-150ug/kg。已经发现，本发明方法的一个独特性在于使用特殊的提取试剂，即，使用乙腈-磷酸盐缓冲液的混合液提取才有效；具体地说，本发明人在补充试验即补充试验A中，参照实施例1的方法，不同的仅仅是将提取溶剂乙腈-磷酸盐缓冲液改为等量的乙腈、磷酸盐缓冲液、70％甲醇、70％乙醇，结果显示改用这四种溶剂后全部药材的加标回收率均小于70％，均在43～66％范围内，表明虽然是改用其它常规溶剂，却无法获得良好的回收率结果。尽管实施例1～实施例5试验中的回收率较高，达80％～120％，基本上能达到本领域通常要求的程度，本领域技术人员仍然期待能够更有效的提高回收率，以确保测定结果的准确性；已经出人意料地发现，当向提取溶剂(乙腈-磷酸盐缓冲液)中添加少许氯化钠时，可以更有效的改善回收率；具体地说，本发明人在补充试验即补充试验B中，参照实施例1～实施例3的方法，不同的仅仅是在提取溶剂中还分别添加0.25克氯化钠(以每2克药材计)、0.1克氯化钠(以每2克药材计)、0.4克氯化钠(以每2克药材计)时，这些添加了氯化钠的试验中加样回收率达到94～103％，明显地优于实施例1～实施例3的结果；此外，补充添加了氯化钠的试验中未见其它指标异常。本发明实施例1～实施例5以及上述补充试验B所进行的三个试验中，经45℃恒温孵育后的试纸条，在室温密封条件下放置2周后，重新测定，结果基本无变化(均在初始值的97～102％范围内)；但是在室温继续放置后，已经发现随着放置时间的延长，再在读数仪上测定时测定结果会随着放置时间延长而降低，例如放置时间达2月和4月后，各种药材中黄曲霉毒素含量与0月测定结果相比会降至0月结果的88～92％范围以及81～86％范围，继续放置还有进一步降低的趋势；已经出人意料地发现，在提取样品时的提取液中补充添加少许无水硫酸钠后能够显著延长试验试纸条结果的保存期；具体地说，在本发明实施例1～实施例5以及上述补充试验B所进行的三个试验基础上，在提取液中补充添加0.15、0.3或0.05重量份无水硫酸钠(以每2重量份药材计)；经45℃恒温孵育后的试纸条，在室温密封条件下放置0、1、3、6、12月后，测定黄曲霉毒素，全部测定时间测得结果基本无变化，各试样的各月结果均在其初始0月结果的95～102％范围内，未发现有随着放置时间的延长而呈现黄曲霉毒素读取含量降低的趋势；此外，补充添加了无水硫酸钠的试验中未见其它指标异常。根据上述各种试验特别是结合补充试验的结果可见，本发明人已经出人意料地发现，当在提取液中添加适量氯化钠后能够有效地改善测定方法的回收率；并且，当在提取液中添加适量无水硫酸钠后能够提高试纸条保存测定结果的稳定性。与现有技术相比，本发明的优势在于：本发明具有检测速度快、灵敏度高、安全性较高、成本低廉及对操作人员专业要求不高等优点，可应用于实验室和现场的残留检测，有利于提高食品安全检验工作的效率与准确率。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明制备本发明产品的方法。

实施例1：检测药材中黄曲霉毒素总量的方法

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡(本实施例直接应用商品化的ROSA FAST5黄曲霉毒素定量快速检测条，货号LF-AFQ-FAST5-100K，品牌bioshome)；该LF-AFQ-FAST5-100K包括：样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和PVC背衬；硝酸纤维素膜黏附在PVC背衬上，样品垫和吸水垫分别黏附在硝酸纤维素膜上的两端；硝酸纤维素膜上依次分布样品垫、检测线T1、检测线 T2、质控线、吸水垫；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入6毫升体积份的85％乙腈溶液 (其用磷酸根离子浓度为15mmol/L且pH值为7.5的磷酸盐缓冲液配)至样品中，涡旋提取2分钟；静置1分钟后3500rpm离心5分钟，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱(例如Grace-Alltech的 Adsorbosphere NH2柱)，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压 C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液(与步骤(2a)所述缓冲液相同的配方))中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品200μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在45℃条件下恒温孵育(本实施例直接应用商品化的45℃孵育器，货号LF-INC4-8-45D，品牌bioshome)5分钟，用读数仪(本实施例直接应用商品化的Rosa-M Reader读数仪，货号LF-ROSAREADER-MNB，品牌bioshome)对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

在上述试验过程中，孵育器和读数仪是本领域一种常规的装置，选择范围广，还可以有诸多商品化产品可直接使用。使用本实施例方法检测如下药材：大黄、丹参、黄连各自一批或多批。

测定过程中，每个样品至少做6次检测，结果见表1。

表1：黄曲霉毒素中药材样品检测结果表

加标回收率检测实验：选取具有代表性的、检测结果小于2ppb的样品作为本底样品进行加标，每种药材加标3个浓度：2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg，每个浓度做6次检测。大黄的加标检测结果均在86～115％范围内；对丹参和黄连的测定结果亦均在80～120％范围内。

由上述结果可知：用本发明定量检测中药材中黄曲霉毒素含量，在进行样品筛选和加标实验的情况下，样品检测结果准确，回收率良好，且操作简单，处理时间较短，成本较低，且有机溶剂用量少，更具优势。

实施例2：检测药材中黄曲霉毒素总量的方法

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入4毫升体积份的90％乙腈溶液 (其用磷酸根离子浓度为12mmol/L且pH值为7.8的磷酸盐缓冲液配)至样品中，涡旋提取3分钟；静置1分钟后2000rpm离心8分钟，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱(例如Grace-Alltech的 Adsorbosphere NH2柱)，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压 C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液)中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品100μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在45℃条件下恒温孵育6分钟，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

试验中的其余条件同实施例1。使用本实施例方法检测如下药材：大黄、丹参、黄连各自一批或多批。本实施例的测定结果与实施例1的结果基本相同。

实施例3：检测药材中黄曲霉毒素总量的方法

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入8毫升体积份80％乙腈溶液(其用磷酸根离子浓度为20mmol/L且pH值为7.3的磷酸盐缓冲液配)至样品中，涡旋提取1分钟；静置 1分钟后5000rpm离心3分钟，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱(例如Grace-Alltech的 Adsorbosphere NH2柱)，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压 C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液)中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品300μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在45℃条件下恒温孵育4分钟，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

试验中的其余条件同实施例1。使用本实施例方法检测如下药材：大黄、丹参、黄连各自一批或多批。本实施例的测定结果与实施例1的结果基本相同。

实施例4：检测药材中黄曲霉毒素总量的方法

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡(本实施例试纸卡参照CN105467115A之[0038]至 [0066]记载的方法制备)；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入5毫升体积份的88％乙腈溶液 (其用磷酸根离子浓度为25mmol/L且pH值为7.0的磷酸盐缓冲液配)至样品中，涡旋提取2分钟；静置1分钟后3000rpm离心6min，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱(例如Grace-Alltech的 Adsorbosphere NH2柱)，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压 C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液)中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品150μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在45℃条件下恒温孵育5分钟，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

试验中的其余条件同实施例1。使用本实施例方法检测如下药材：大黄、丹参、黄连各自一批或多批。本实施例的测定结果与实施例1的结果基本相同。

实施例5：检测药材中黄曲霉毒素总量的方法

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡(本实施例试纸卡采用华安麦科公司市售的黄曲霉毒素胶体金快速检测试纸卡http://www.magnech.com)；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入7毫升体积份85％乙腈溶液(其用磷酸根离子浓度为10mmol/L且pH值为8.0的磷酸盐缓冲液配)至样品中，涡旋提取2分钟；静置 1分钟后4000rpm离心4min，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱(例如Grace-Alltech的 Adsorbosphere NH2柱)，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至NH2/C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压 NH2/C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的NH2/C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液)中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品250μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在45℃条件下恒温孵育5分钟，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

试验中的其余条件同实施例1。使用本实施例方法检测如下药材：大黄、丹参、黄连各自一批或多批。本实施例的测定结果与实施例1的结果基本相同。

在本发明中，提及的术语“克重量份”或“毫升体积份”或其它类似术语时，既可以是指具体的重量 (克)或者体积(毫升)，亦可以指以此比例的任意倍数值；例如实施例5步骤(2a)中，待检药材或其饮片的粉末2克重量份，既可以是2克(此时后续操作中的82％乙腈溶液量就是加7毫升)，亦可以是2克的倍数例如3倍即6克(此时后续操作中的乙腈量就是加21毫升)。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.检测药材中黄曲霉毒素的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提供用于检测黄曲霉毒素的胶体金试纸卡；

(2)样品提取：

(2a)取待检药材或其饮片的粉末2克重量份，放入样品管中，加入4～8毫升体积份(例如6毫升体积份)的80～90％(例如85％)乙腈溶液至样品中，涡旋提取1～3分钟；静置1分钟后2000-5000rpm(例如3000-4000rpm)离心3～8分钟(例如5min)，移取2毫升体积份上清液至NH2/C18柱，过柱净化样品上清液，收集至干净试管；

(2b)移取3毫升体积份甲醇至NH2/C18柱，安装注射器装配，过柱弃去；移取3毫升体积份去离子水或蒸馏水至C18柱，安装注射器装配，过柱弃去，得经清洗的C18柱；

(2c)移取1.5毫升体积份步骤(2a)所得净化后的样品上清液至15毫升体积份离心管中，用10毫升体积份去离子水或蒸馏水稀释，混合；移取稀释样品至注射器，过NH2/C18柱，过柱液体弃去；加5毫升体积份去离子水或蒸馏水至离心管中，用于冲洗，转移至注射器，过柱弃去；用注射器或洗耳球按压C18柱顶部，使残留液体过柱，弃去废液；

(2d)移取1毫升体积份甲醇至经步骤(2c)处理的NH2/C18柱，过柱并收集二次净化样液至小离心管；移取100微升体积份二次净化样液，加入至提前准备的小离心管(内含1ml磷酸盐缓冲液)中，加盖，混合，作为提取液样品，待检；

(3)样品测定：移取步骤(2)所得提取液样品100～300μl，点于胶体金试纸卡上(样品垫部位)，在45℃条件下恒温孵育4-6分钟，用读数仪对检测条进行读数测定，并根据上样量和样品稀释倍数计算药材中的黄曲霉毒素含量。

2.根据权利要求1的方法，其中所述药材是根茎类药材。

3.根据权利要求1的方法，其中所述药材是根茎类药材，选自：大黄、丹参、黄连。

4.根据权利要求1的方法，其中所述胶体金试纸卡用于定量测定黄曲霉毒素，包括：样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；硝酸纤维素膜黏附在PVC背衬上，样品垫和吸水垫分别黏附在硝酸纤维素膜上的两端；硝酸纤维素膜上依次分布样品垫、检测线T1、检测线T2、质控线、吸水垫。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2a)中，所述80～90％(例如85％)乙腈溶液是指用磷酸盐缓冲液配制的含乙腈80～90％(例如85％)浓度的溶液。

6.根据权利要求1的方法，所述磷酸盐缓冲液(包括配制乙腈溶液所用的，以及步骤(2d)所用的)是磷酸根离子浓度为10～25mmol/L且pH值为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(2a)中，3000-4000rpm离心4～6min。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(2a)中，还向乙腈溶液中添加氯化钠；例如，以待检药材或其饮片的粉末每2克重量份计，氯化钠的量为0.1～0.4克重量份，例如0.2～0.3克重量份，例如0.25克重量份。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤(2a)中，还向乙腈溶液中添加无水硫酸钠；例如，以待检药材或其饮片的粉末每2克重量份计，无水硫酸钠的量为0.05～0.3克重量份，例如0.1～0.2克重量份，例如0.15克重量份。

10.根据权利要求1的方法，其中试纸卡检测样品中黄曲霉毒素含量范围为0-150μg/kg。