CN112881697A - 一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法 - Google Patents

一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法，其中该方法采用一种密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条进行孵育及读数，具体还涉及一种中药材及饮片中黄曲霉毒素含量的测算方法，该测算方法能够稳定检测多种黄曲霉毒素含量。本发明提供的方法使不同种类中药材及饮片中黄曲霉毒素在使用不同批次的抗原或抗体检测中保持稳定结合，批间和批内变异系数均小于10％。本发明方法的检测结果十分稳定，且准确度和灵敏度高。

Description

一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法
技术领域
本发明涉及黄曲霉毒素检测的领域，尤其是涉及一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法。
背景技术
黄曲霉毒素(AFLA)是黄曲霉和寄生曲霉等产生的有毒的次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和代谢物M1和M2。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物，是目前已知真菌毒素中毒性最强的，可引起肝脏的急慢性损害，同时还对肾脏等其他多种组织器官造成严重损害，并具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强。在食品或药品中，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2通常是共存的，且后三种黄曲霉毒素也对人体健康有危害作用，如致癌性、致畸性等。黄曲霉毒素分布广泛，中药中的种子、果实、粮谷类、发酵类、动物类、油性成分多的中药材容易产生黄曲霉毒素，且在采收、加工、储存以及销售各过程中都很容易被污染。多篇调查结果表明，国内中药材黄曲霉毒素污染普遍，污染率在82％～100％，污染水平在0.12～202.00μg·kg－1，其中陈皮、麦冬、当归、薏苡仁、胖大海、神曲等药材污染报道较多。2019年全国中药材种植面积约7000万亩，中药工业总产值达到8000亿元。中医药在此次抗击新冠肺炎疫情过程中发挥了巨大的作用，临床总有效率达到90％以上。因此，中药材质量安全问题不容忽视。
黄曲霉毒素的检测方法主要包括仪器方法、酶联免疫法(ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器方法包括高效液相色谱法、液质联用等，此类方法准确度、灵敏度和精密度高，但是需要昂贵的仪器和试剂，检测成本较高、耗时长、操作复杂，对操作人员的技术水平要求高，在实际应用过程中有很大的限制性，不适宜现场快速检测；酶联免疫法(ELISA)特异性好，灵敏度高，但操作步骤繁琐，检测时间通常为30-120分钟，并且存在基质效应，样品前处理复杂，只能应用于实验室，随着胶体金试纸条的广泛应用，该方法的应用越来越少。而胶体金试纸条法操作简单，检测速度快，特异性和灵敏度高，成本低，非常适用于基层、企业进行现场快速筛查。但是传统的胶体金试纸条在使用时，需要撕开包装，使得试纸暴露在空气中，出现以下问题：首先，试纸与试剂的反应过程暴露在空气中，不仅会发生氧化反应，而且随着反应的进行，样品会发生挥发，使样品体积发生变化，从而降低检测数据的准确度。其次，试纸条暴露于空气中，容易使试纸条受潮，导致试纸条失效。另外，试纸条的检测区域(T线和C线区域)易被污染，一旦手指触碰到检测区域，会影响结果判读，需要重新检测；黄曲霉毒素本身没有免疫原性，不能单独激发动物免疫系统产生抗体，因此需要与大分子载体蛋白进行偶联，获得人工免疫抗原，导致黄曲霉毒素的抗原制备过程比较复杂。相应的，黄曲霉毒素的高效特异性抗体的制备工序也很繁杂。目前，即使是同一来源的用于黄曲霉毒素检测的抗原/抗体，不同生产批次间也普遍存在免疫结合的不稳定性。这就导致了检测人员采用不同批次的抗体或抗原检测黄曲霉毒素含量时获得的结果相差较大。因此，亟需一种能够稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的方法。
目前用于胶体金免疫层析快速检测的定量分析模式主要有T线值法、T/T0法、T/(T+C)法和T/C法等。这些方法均是通过检测3-6个浓度的标准品，根据T线和C线的发光强度，计算出T/(T+C)或T/C值，以获得数值和标准品浓度绘制标准曲线。检测结果受样品基质和反应环境的影响非常大，并且对于每批次试纸条均需要输入标准曲线。因此，开发一种不受样品基质影响、结果准确的测算方法非常必要。
发明内容
为了克服现有方法的不足，本发明一方面提供一种能够稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的免疫试纸快速检测方法。
还有，本发明还另外提供一种改良的提取中药样品中黄曲霉毒素的方法，从而在后续检测中尽多地消除本底。
此外，为了克服上述不足，提高检测准确度，本发明还提供一种密封封闭式真菌毒素检测试纸条，所述密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条的外壳上具有向外凸出的放置腔，其与试纸条主体一端的海绵垫配合使用，放置腔一端是由外向内倾斜的内腔，具有导流作用；该试纸条可以使试纸条在检测过程中处于真空或接近真空状态，有效消除空气等的干扰，使检测结果更加稳定。
此外，为了克服上述不足，提高检测准确度，本发明还提供了一种中药材及饮片中黄曲霉毒素含量的测算方法，该方法内置于仪器的程序中，不受样品基质影响，结果准确。
所述中药可以为药材、饮片或中药制剂。
本发明所检测的黄曲霉毒素可以是黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的总量，即黄曲霉毒素的总量，或黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2任一的含量，取决于试纸条所采用的抗体类型。
所述抗体可以是黄曲霉毒素特异性单克隆抗体或多克隆抗体
本发明通过单独或联合运用多种技术手段实现了对黄曲霉毒素含量的准确、稳定的定量检测，并适用于多种检测情境。而且，本发明还对多因素进行了优化，获得了最佳的检测效果。
一方面，为了避免中药里辅料和色素等对后续测定黄曲霉毒素含量时形成干扰，本发明采用如下的针对中药材、饮片及中药制剂的样品处理方法如下：
a)称取粉末样品至离心管中，加入甲醇，振荡；
b)室温下离心；
c)取上清液至干净离心管中，干燥；
d)加入去离子水涡旋，再加入氯仿振荡，室温下离心；
e)取下层氯仿液至离心管中，干燥，加入烷烃涡旋，再加入磷酸盐缓冲液涡旋，室温下离心，取下层液，即得。
所述干燥可以采用任何干燥方式，比如烘干、氮气干燥等。
所述烷烃可以采用直链饱和脂肪烃类，例如己烷。
所述方法获得的中药样品液能有效去除本底，在黄曲霉素含量的测定中极大地减少了非目标物质对检测结果的干扰。
另一方面，稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的方法如下：
f)移取处理后的样品液至试纸条的样品垫；
g)将试纸条放入孵育器；
h)将孵育器在特定的温度下孵育；
i)取出试纸条，并将其放入对应的读数仪中读取结果。
所述孵育器为任何合适的孵育容器。
所述读数仪为任何合适的试纸条读数仪。
优选的，所述样品液为300±15μL。
优选的，步骤h)中，所述特定的温度为高于37℃，可以为45℃-50℃，更优选50℃。
优选的，步骤h)中，孵育的时间为3-5min。
本发明提供的一种密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条，具体采用如下的技术方案：包括外壳底壳，所述外壳底壳的顶部嵌入式设置有外壳顶壳，所述外壳顶壳的底部固定有试纸条主体，所述试纸条主体一端固定连接有海绵垫，所述试纸条主体的另一端涂覆有颜色识别涂层，所述外壳底壳开设放置腔一，用于放置所述试纸条主体；所述放置腔一内腔一侧带有导流甬道，所述导流甬道内腔向其一端开设有放置腔二，所述放置腔二与所述试纸条主体一端固定连接的所述海绵垫相配合封闭连接；所述放置腔二是由外向内倾斜的内腔，所述放置腔二中心内腔由外向内设置有导流斜坡，所述导流斜坡的倾斜角度为20-25°。所述外壳顶壳四角设置多个固定凸起，所述外壳底壳相应位置处均开设有与固定凸起相适配的固定凸起卡槽。
通过采用上述技术方案，在实际使用时，相比于传统的试纸检测，该试纸条处于密封状态，在检测时能够避免与空气接触减少产生氧化反应，而且能够保证液体与试纸的充分反应，在读数仪读数的时候，可以提高检测数据的准确性，而且根据不同颜色的区分，也能够对黄曲霉毒素总量或黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2任一的含量进行检测。
通过采用上述技术方案，通过固定凸起和固定凸起卡槽的配合使用，当外壳顶壳盖合在外壳底壳上时，固定凸起会嵌入到固定凸起卡槽的内腔进行固定，保证外壳底壳和外壳顶壳的闭合密封性，从而检测数值的准确性。
优选的，放置腔二内腔的右侧设置有导流斜坡，导流斜坡的倾斜角度为20°。
优选的，放置腔一内腔的深度大于导流甬道内腔的深度，放置腔一内腔的宽度与导流甬道内腔的宽度相同。
优选的，放置腔二内腔的深度大于放置腔一内腔的深度，放置腔二内腔的宽度大于导流甬道内腔的宽度。
优选的，海绵垫右端约六分之一的部分通过粘粘剂固定在试纸条主体上，海绵垫左端约六分之五的部分向下垂落约25°。
优选的，外壳顶壳的左侧设置有固定粘粘端，外壳顶壳和固定粘粘端的连接处设置有压痕，固定粘粘端的底部通过粘粘胶固定连接在外壳底壳上。
优选的，外壳底壳和外壳顶壳均为透明材料制成的塑料外壳。
优选的，所述海绵垫的材质为复合纤维素、聚氨酯、聚酯、聚醚或聚乙烯醇，优选为复合纤维素；所述海绵垫的孔隙大小为10-60PPI，优选为30PPI；所述海绵垫的硬度为20D-60D，优选为40D。
本发明提供的一种中药材及饮片中黄曲霉毒素含量的测算方法，具体包括如下步骤：
步骤1理论光反射度测算；
步骤2标准曲线矩阵的构建；
步骤3样品中黄曲霉毒素的测算。
优选的，所述步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1实际光反射度的测算
用读数仪分别测定T1线、T2线和C线上各128个位点的光反射度，根据T1线、T2线和C线上128个位点的光反射度测算出实际光反射度，实际光反射度的测算公式如下：
Figure BDA0002895385830000061
式中，I实际为实际光反射度，IC为C线上位点的光反射度，IT1为T1线上位点的光反射度，IT2为T2线上位点的光反射度；
步骤1.2光补偿校正因子获得
所述光补偿校正因子基于试纸条为密封包装，使实际测出的光反射度与理论光反射度有偏差，因此需要采用光补偿校正因子进行光补偿。
利用读数仪测得光补偿校正系数fFn和pFn，进而计算得到光补偿校正因子Dn，所述读数仪内有由7个光源组成的复合光源，受试纸条密封包装和光源的角度的影响，每个光源测定的数据不同，所述光补偿校正因子Dn的计算公式如下：
Dn＝fFn+pFn
式中，Dn为光补偿校正因子，fFn为由直射光反射偏差造成的光补偿校正系数，pFn为由散射光反射偏差造成的光补偿校正系数，n为1，2，3，4，5，6，7；
步骤1.3理论光反射度测算
所述理论光反射度的测算公式如下：
Figure BDA0002895385830000062
优选的，所述步骤2具体包括以下步骤：
标准曲线矩阵的构建包括建立多组标准曲线，采用HPLC-MS/MS检测不同基质类型、不同黄曲霉毒素浓度的实际样品，同时采用本发明提供的密封封闭式真菌毒素检测试纸条检测相同的样品，并采用读数仪测定理论光反射度。根据获得的理论光反射度和黄曲霉毒素的浓度，构建如下所示标准曲线矩阵：
Figure BDA0002895385830000071
式中：C为用于制作标准曲线的样品中黄曲霉毒素的含量，I为理论光反射度，I的单位为坎德拉，A为校准系数，B为常数矩阵，i为样品种类，j为样品浓度；
优选的，所述步骤3具体包括以下步骤：
样品中黄曲霉毒素的测算，包括标准曲线的校准系数，根据标准曲线矩阵，可获得标准曲线的校准系数Aij和标准曲线的常数矩阵Bij；
Y＝I×ΣAij+ΣBij
式中，Y为待测样品中黄曲霉毒素的浓度，I为待测样品的理论光反射度，A为由标准曲线矩阵计算获得的校准系数，B为由标准曲线矩阵计算获得的常数矩阵，不同标准曲线的B可能不同，因此Bij也可能不同，在一个实施例中，I可以是待测样品的实际光反射度。
本发明所述光反射度是指：当光源照射到试纸条上，部分光被吸收，部分光被反射，测得的反射光的强度为光反射度；所述光补偿校正系数fFn和pFn均可由读数仪直接测得；所述标准曲线矩阵是指由一组标准曲线组成的矩阵；所述样品基质是指中药材，包括远志、胖大海、陈皮等。
有益效果
1.本发明首次发现当免疫结合温度高于37℃、尤其在45℃-50℃时，竟然能消除不同批次抗原/抗体的差异，使采用不同批次抗原/抗体在免疫试纸条上测量的结果高度稳定、一致。
2.本发明提供的黄曲霉毒素含量的检测方法可以使抗原/抗体特异性结合更稳定，不同批次间、同批次内的变异系数小，稳定性高。
3.本发明提供了一种密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条，这种试纸条采用封闭式设计，可以保证试纸条的储存和使用中处于真空或接近真空状态，最大程度地减少了空气等对检测的影响。
4.本发明还提供了一种能定量计算中药材及饮片中黄曲霉毒素浓度的方法，与现有方法相比，本发明提供的方法消除了样品基质、外包装和操作环境等造成的影响，而且可以将标准曲线内置于仪器中，不同批次试纸条不需要输入标准曲线，结果准确。
附图说明
图1为试纸条整体结构图；
图2为试纸条外壳底壳和外壳顶壳立体展开图；
图3为试纸条外壳底壳和外壳顶壳主视图；
图4为试纸条外壳底壳的主视图；
附图标记说明：1、外壳底壳；2、外壳顶壳；3、固定粘粘端；4、压痕；5、固定凸起；6、固定凸起卡槽；7、放置腔一；8、导流甬道；9、放置腔二；10、导流斜坡；11、试纸条主体；12、海绵垫；13、颜色识别涂层。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的，任何带有七个光源、128位点的读数仪均可实现，优选为Rosa-CM Analyzer读数仪。
实施例1中药材、饮片及中药制剂样品处理方法
样品处理方法具体示例如下：
1>称取粉末样品约2.0g至50ml离心管中，加入20ml甲醇，振荡5分钟；
2>室温(如20-25℃)下以每分钟3000转离心5分钟；
3>取2ml上清液至10ml干净离心管中，于50-60℃干燥；
4>加入2ml去离子水涡旋30秒，再加入6ml氯仿振荡2分钟，室温下以每分钟3000转离心5分钟；
5>取下层氯仿液3ml至10ml离心管中，50-60℃干燥，加入lml正己烷涡旋30秒，再加入2ml磷酸盐缓冲液涡旋1分钟，室温下以每分钟3000转离心5分钟，取下层液，即得。
实施例2稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的免疫试纸快速检测方法：
a)移取处理后的样品液300±15μL至试纸条的样品垫；
b)将试纸条放入孵育器；
c)将孵育器在45℃-50℃(更优选50℃)下孵育3-5min；
d)取出试纸条，并将其放入对应的读数仪中读取结果。
实施例3稳定不同批次抗体或抗原的检测结果的关键因素的确定
发明人出乎意料地发现，特定的免疫结合温度竟然能够使不同批次的抗体/抗原对黄曲霉毒素含量的检测结果准确而稳定。以检测加标陈皮样品为例，加标浓度为5μg/kg，每个样品分别采用3个批次的黄曲霉毒素总含量的抗原/抗体组合，孵育时间为3-5分钟，结果见表1。
表1不同孵育温度的检测结果
Figure BDA0002895385830000091
由表1可见，当孵育温度为45℃-50℃时，三个批次差别最小，表明在该温度下，各批次的检测结果最接近。而且，45℃-50℃时，回收率非常高，均接近100％，这是出乎意料的结果。
因为通常，免疫试纸条检测法都在常温或室温下进行，此时免疫结合能够正常发生，并能够满足免疫快速检测的要求，因此，技术人员在研究如何保证不同批次抗原抗体检测结果的稳定性时，几乎忽略了温度的因素。而且，即便是出于提高抗原/抗体特异性结合的效率考虑，基于动物或人体内的温度通常为37℃左右，研究人员也会很自然地模仿并设置体内温度环境下进行免疫结合实验，并认为37℃是最佳的结合温度。但是，没有人预料到，对于检测黄曲霉毒素总量或黄曲霉毒素B1的含量而言，免疫结合温度高于37℃、尤其在45℃-50℃时，竟然能消除不同批次抗原/抗体的差异，使采用不同批次抗原/抗体在免疫试纸条上测量的结果高度稳定、一致。
实施例4本发明方法在同批次抗原/抗体内检测结果的稳定性
向阴性陈皮样品中添加总黄曲霉毒素标准品，加标浓度为1.25ng/g、2.5ng/g，使用本发明所述方法进行样品提取和检测，在48℃下孵育，每个浓度5次重复，结果取平均值。准确度＝检测结果/实际浓度×100％。结果见表2。
表2同批次抗原/抗体内检测结果的稳定性
Figure BDA0002895385830000101
由表2可见，本发明试剂盒的准确度为100.34％～100.62％之间。每个浓度的5次重复间的变异系数(CV值)为0.58-2.05％。结果表明，该试剂盒准确度高，批内变异系数小，检测结果稳定性高。
实施例5不同批次抗原/抗体检测结果的稳定性
用本发明所述方法检测陈皮加标样品(共3个浓度)，使用3批次抗原/抗体，每个浓度做5个平行，在48℃下孵育，结果取平均值，检测结果见表3。
表3不同批次抗原/抗体检测结果的稳定性
Figure BDA0002895385830000111
由表3可见，本发明试剂盒检测陈皮加标的3个浓度的变异系数为0.82-2.71％，稳定性非常好。
实施例6本发明方法的检测限
使用本发明所述方法，在45℃下孵育，分别检测20份阴性陈皮、柏子仁、大枣和僵蚕样品中的黄曲霉毒素总量，计算平均值(AVG)和标准偏差(SD)，再按照AVG加上3倍SD计算检测限(LOD)，AVG加上10倍SD计算定量限(LOQ)。检测结果见表4。
表4本发明方法的检测限
Figure BDA0002895385830000112
Figure BDA0002895385830000121
经计算，陈皮、柏子仁、大枣和僵蚕的检测限均为0.01μg/kg，定量限为0.02-0.03μg/kg。可见，本发明方法的灵敏度也很高。
实施例7密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条
结合图1-图4，本发明实施例公开一种密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条，包括外壳底壳1，外壳底壳1的顶部嵌入式设置有外壳顶壳2，外壳顶壳2底部右侧的前端和后端均固定连接有固定凸起5，外壳底壳1顶部右侧的前端和后端均开设有与固定凸起5相适配的固定凸起卡槽6，外壳顶壳2的底部固定安装有试纸条主体11，试纸条主体11底部的右侧固定连接有海绵垫12，试纸条主体11的左端涂覆有颜色识别涂层13，外壳底壳1顶部的左侧开设放置腔一7，放置腔一7内腔的右侧开设有导流甬道8，导流甬道8内腔的右侧开设有放置腔二9，通过固定凸起5和固定凸起卡槽6的配合使用，当外壳顶壳2盖合在外壳底壳1上时，固定凸起5会嵌入到固定凸起卡槽6的内腔进行固定，保证外壳底壳1和外壳顶壳2的闭合密封性，从而检测数值的准确性，放置腔二9内腔的右侧设置有导流斜坡10，导流斜坡10的倾斜角度为二十度，放置腔一7内腔的深度大于导流甬道8内腔的深度，放置腔一7内腔的宽度与导流甬道8内腔的宽度相同，放置腔二9内腔的深度大于放置腔一7内腔的深度，放置腔二9内腔的宽度大于导流甬道8内腔的宽度，海绵垫12右端约六分之一的部分通过粘粘剂固定在试纸条主体11上，海绵垫12左端约六分之五的部分向下垂落约二十五度，外壳顶壳2的左侧设置有固定粘粘端3，外壳顶壳2和固定粘粘端3的连接处设置有压痕4，固定粘粘端3的底部通过粘粘胶固定连接在外壳底壳1上，外壳底壳1和外壳顶壳2均为透明材料制成的塑料外壳。
在实际使用时，使用者将外壳顶壳2的右端向上撕开，使得外壳顶壳2的右端与外壳底壳1分离，撕开外壳顶壳2的右端直至漏出放置腔二9，进而放置腔二9内的试纸条主体11则会漏出，需要说明的是，放置腔二9在暴露前，是处于密封状态的，不需要全部撕开，只要撕开一个口子即可，以避免撕开过多漏气，影响后期的检测数据准确度，然后使用者通过撕开的口子往放置腔二9内滴入检测试剂，滴入的试剂会浸湿试纸条主体11左端的颜色识别涂层13，然后再将外壳顶壳2的右端黏在外壳底壳1的右端上，进行密封，尽量保证放置腔一7、导流甬道8和放置腔二9的密封性，以保证检测数据的准确度，然后再将外壳底壳1和外壳顶壳2插入到检测仪上，进行检测，相比于传统的试纸检测，该试纸条处于密封状态，在检测时能够避免与空气接触减少产生氧化反应，而且能够保证液体与试纸的充分反应，在读数仪读数的时候，可以保证检测数据的准确性，需要说明的是，颜色的设置，是为了使得机器能够识别测定不同霉素的信号，只需要将有颜色的一面插入机器的正侧面，即可测定霉素的种类，而且放置腔二9的设置，与黄色海绵垫12相配合，能够促进进液，快速吸收处理液，并且放置腔二9的内腔是设置有导流斜坡10的，也能够实现促进液体快速流动的作用。
实施例8不同材质的海绵检测结果的稳定性
用本发明所述方法检测陈皮加标样品，加标浓度为2.5ng/g，其中试纸条的样品垫选用不同材质的海绵，每种材质做5个平行，在45℃下孵育，结果取平均值，检测结果见表5。
表5不同材质的海绵检测结果的稳定性
Figure BDA0002895385830000141
由表5可见，当海绵垫材质为复合纤维素时，平均准确度为100.8％，变异系数为1.01％；当海绵垫材质为聚氨酯时，平均准确度为90.4％，变异系数为13.89％；当海绵垫材质为聚酯时，平均准确度为88.00％，变异系数为15.13％；当海绵垫材质为聚氨酯时，平均准确度为89.52％，变异系数为11.87％；当海绵垫材质为聚氨酯时，平均准确度为90.16％，变异系数为13.77％。当材质为复合纤维素时，准确度最高，变异系数最低，因此，选择复合纤维素作为海绵垫的最佳材质。
实施例9不同孔隙度的海绵检测结果的稳定性
用本发明所述方法检测陈皮加标样品，加标浓度为2.5ng/g，其中试纸条的样品垫选用不同孔隙度的海绵，每种孔隙度做5个平行，在45℃下孵育，结果取平均值，检测结果见表6。
表6不同孔隙度的海绵检测结果的稳定性
Figure BDA0002895385830000151
由表6可见，当孔隙大小为30PPI时，准确度最高，为99.36％，变异系数最小，为4.54％。因此选择30PPI作为海绵垫的最佳孔径。
实施例10不同硬度的海绵检测结果的稳定性
用本发明所述方法检测陈皮加标样品，加标浓度为2.5ng/g，其中试纸条的样品垫选用不同硬度的海绵，每种硬度做5个平行，在45℃下孵育，结果取平均值，检测结果见表7。
表7不同硬度的海绵检测结果的稳定性
Figure BDA0002895385830000152
Figure BDA0002895385830000161
由表7可见，当海绵硬度为40D时，准确度最高，为99.84％，变异系数最小，为2.36％。因此选择40D作为海绵垫的最佳硬度。
实施例11实际光反射度和理论光反射度对检测结果的影响
分别采用理论光反射度和实际光反射度测算西洋参饮片中的黄曲霉毒素，同时采用HPLC-MS/MS法确认西洋参饮片中黄曲霉毒素的含量，每个检测做3个平行，结果取平均值，检测结果见表8。
表8不同反射度测算方法检测结果对比
Figure BDA0002895385830000162
由表8可见，根据理论光反射度测算的结果准确度为95.92-101.69％，平均准确度为99.55％，变异校准系数(CV％)为1.27-4.98％，平均变异校准系数为2.68％；根据实际光反射度测算的结果准确度为87.07-84.08％，平均准确度为89.50％，变异校准系数(CV％)为9.89-14.85％，平均变异校准系数为12.03％。因此，根据理论光反射度测算结果的准确度和变异校准系数均优于实际光反射度。
实施例12本发明所述测算方法与常规测算方法的准确度和变异校准系数
分别采用本发明所述测算方法和两线法中的T/C法测算西洋参饮片中的黄曲霉毒素，同时采用HPLC-MS/MS法确认西洋参饮片中黄曲霉毒素的含量，每个检测做3个平行，结果取平均值，检测结果见表9。
表9不同测算方法检测结果对比
Figure BDA0002895385830000171
由表9可见，根据本发明所述测算方法测算的结果准确度为97.44-106.29％，平均准确度为100.91％，变异校准系数(CV％)为1.89-4.56％，平均变异校准系数为2.86％；根据两线法测算的结果准确度为68.55-76.36％，平均准确度为72.04％，变异校准系数(CV％)为22.15-35.37％，平均变异校准系数为28.39％。因此，根据本发明所述测算方法测算结果的准确度和变异校准系数均优于两线法。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (9)

1.一种稳定检测黄曲霉毒素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)移取处理后的样品液至试纸条的样品垫；
b)将试纸条放入孵育器；
c)将孵育器在45-50℃的温度下孵育；
d)取出试纸条，并将其放入对应的读数仪中读取结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育温度优选为50℃。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品为中药样品，例如中药材、饮片或中药制剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述中药样品在检测前经过如下处理：
e)称取粉末样品至离心管中，加入甲醇，振荡；
f)室温下离心；
g)取上清液至干净离心管中，干燥；
h)加入去离子水涡旋，再加入氯仿振荡，室温下离心；
i)取下层氯仿液至离心管中，干燥，加入烷烃涡旋，再加入磷酸盐缓冲液涡旋，室温下离心，取下层液，即得。
5.本发明还提供了一种密封封闭式黄曲霉毒素检测试纸条，其特征在于，包括外壳底壳(1)，所述外壳底壳(1)的顶部嵌入式设置有外壳顶壳(2)，所述外壳顶壳(2)的底部固定有试纸条主体(11)，所述试纸条主体(11)一端固定连接有海绵垫(12)，所述试纸条主体(11)的另一端涂覆有颜色识别涂层(13)，所述外壳底壳(1)开设放置腔一(7)，用于放置所述试纸条主体(11)；所述放置腔一(7)内腔一侧带有导流甬道(8)，所述导流甬道(8)内腔向其一端开设有放置腔二(9)，所述放置腔二(9)与所述试纸条主体(11)一端固定连接的所述海绵垫(12)相配合封闭连接；所述放置腔二(9)是由外向内倾斜的内腔，所述放置腔二(9)中心内腔由外向内设置有导流斜坡(10)。
6.根据权利要求4所述的中药材及饮片中黄曲霉毒素含量的测算方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1理论光反射度测算；
步骤2标准曲线矩阵的构建；
步骤3样品中黄曲霉毒素的测算。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1具体包括以下步骤：
步骤1.1实际光反射度的测算
用读数仪分别测定T1线、T2线和C线上各128个位点的光反射度，根据T1线、T2线和C线上128个位点的光反射度测算出实际光反射度，实际光反射度的测算公式如下：
Figure FDA0002895385820000021
式中，I实际为实际光反射度，IC为C线上位点的光反射度，IT1为T1线上位点的光反射度，IT2为T2线上位点的光反射度；
步骤1.2光补偿校正因子获得
利用读数仪测得光补偿校正系数fFn和pFn，进而计算得到光补偿校正因子Dn，所述读数仪内有由7个光源组成的复合光源，所述光补偿校正因子Dn的计算公式如下：
Dn＝fFn+pFn
式中，Dn为光补偿校正因子，fFn为由直射光反射偏差造成的光补偿校正系数，pFn为由散射光反射偏差造成的光补偿校正系数，n＝1,2，……，7；
步骤1.3理论光反射度测算
所述理论光反射度的测算公式如下：
Figure FDA0002895385820000022
式中，I理论为理论光反射度。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2具体包括以下步骤：
标准曲线矩阵的构建包括建立多组标准曲线，采用HPLC-MS/MS检测不同基质类型、不同黄曲霉毒素浓度的实际样品，同时采用如权利要求5所述的试纸条检测相同的样品，并采用读数仪测算理论光反射度，根据获得的理论光反射度和黄曲霉毒素的浓度，构建如下所示标准曲线矩阵：
Figure FDA0002895385820000031
式中：C为用于制作标准曲线的样品中黄曲霉毒素的含量，I为理论光反射度，I的单位为坎德拉，A为校准系数，B为常数矩阵，i为样品种类，j为样品浓度。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3具体包括以下步骤：
样品中黄曲霉毒素的测算，包括标准曲线的校准系数，根据标准曲线矩阵，可获得标准曲线的校准系数Aij和标准曲线的常数矩阵Bij；
Y＝I×∑Aij+∑Bij
式中，Y为待测样品中黄曲霉毒素的浓度，I为待测样品的理论光反射度，A为由标准曲线矩阵计算获得的校准系数，B为由标准曲线矩阵计算获得的常数矩阵。
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