CN102033130A - 酶联免疫检测试剂盒及检测样品中t-2毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有T-2毒素抗原的酶标板、酶标记物、T-2毒素特异性抗体、浓度已知的多个T-2毒素标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液和复溶液；其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。本发明还提供使用上述试剂盒检测样品中T-2毒素的方法。本发明提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对T-2毒素具有较高的检测特异性。

Description

酶联免疫检测试剂盒及检测样品中T-2毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒及检测样品中T-2毒素的方法。

背景技术

T-2毒素(T-2toxin)是单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)之一，T-2毒素是一种倍半萜烯化合物，学名为4β-1，5-二乙酰氧基-8α-(3-甲基丁酰氧基)-3α-羧基-12，13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为C₂₄H₃₄O₉，分子量为466.22。

T-2毒素的毒性强烈，可由多种真菌产生。T-2毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业构成了较大危害。T-2毒素可引起机体过氧化损伤，还具有致畸性和弱致癌性。此外，T-2毒素可能还与我国某些地区的大骨节病、食管癌和克山病的高发病率有关。

目前检测T-2毒素的方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、放射免疫法和质谱分析法等。上述方法各有优缺点，但主要存在的问题是对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测，因此，限制了这些方法的应用。

因此，开发一种不受检测设备的限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的检测T-2毒素的方法存在的对设备的依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的缺点，提供一种不受检测设备的限制并且能够实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的酶联免疫检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种检测样品中T-2毒素的方法。

为了实现本发明的第一个发明目的，本发明提供了一种酶联免疫检测试剂盒，其中，该试剂盒包括：

(1)包被有T-2毒素抗原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)T-2毒素特异性抗体；

(4)T-2毒素标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)洗涤液；

(8)复溶液；

其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。

为了实现本发明的另一个目的，本发明还提供了一种检测样品中T-2毒素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)对样品进行处理：用样品提取溶液对样品进行提取，然后用所述复溶液溶液进行稀释，得到样品溶液；

(2)用上述的本发明的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果：制作T-2毒素标准品的标准曲线图，从该标准曲线上读出样品溶液中T-2毒素的浓度。

本发明提供的试剂盒对检测设备的依赖性低，其中所使用的酶标板体积小、携带方便、含有大量的孔，并且本发明的试剂盒中所使用的各溶液以工作液或浓缩液形式提供，可以直接使用或简单稀释后使用，非常方便，同时使用本发明的试剂盒的检测结果准确度高、可重复性高，检测方法简单易行，因此本发明的试剂盒能够实现对大批量的样品进行快速检测。并且本发明的试剂盒中所使用的T-2毒素特异性抗体能够与T-2毒素发生特异性的结合反应，同时与其它T-2毒素结构类似物的交叉反应率则很低，从而大大地提高了检测的特异性和灵敏性。

由此可见，本发明提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对T-2毒素具有较高的检测特异性。

附图说明

图1为实施例3中的T-2毒素标准品溶液的标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包括：

(1)包被有T-2毒素抗原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)T-2毒素特异性抗体；

(4)T-2毒素标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)洗涤液；

(8)复溶液；

其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的。对于制备小分子的抗体，人工抗原的合成是关键的一步，抗原的质量直接决定着抗体的效价和特异性。T-2毒素是小分子吡啶化合物，分子量仅为466.22，本身并不具备免疫原性，为半抗原，同时，没有可供偶联的化学基团，必须进行分子改造，使其连接上带有活性基团的有机分子，之后再与载体蛋白偶联才具有免疫原性。T-2毒素分子结构中用于连接的位点对抗体的生成及其特异性起着决定性作用。通常情况下，离连接位点最远的部分引起最强的抗体应答，即“免疫优势”。抗体的特异性是这些位点决定的。本发明将T-2毒素的C-3位置作为引入带有活性基团的有机分子的位点，从而实现进一步与蛋白质的连接。常用的带有活性基团的有机分子主要是琥珀酸酐(HS)、戊二酸酐(HG)或者甲基肟(CMO)，本发明优选琥珀酸酐。

所述将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联的方法包括：

(1)在蒸汽搅拌的条件下，使T-2毒素与琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反应3-6小时；具体为，相对于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量为150-300mg，吡啶的用量为0.4-0.8mL；

(2)将步骤(1)所得的产物在氮气条件下旋转蒸干，用1-2mL氯仿、石油醚或二氯甲烷重新溶解，以水洗涤3-6次，之后将产物旋转蒸干；

(3)将步骤(2)的产物称取10-15mg，用N，N-二甲基甲酰胺溶解、搅拌，之后加入20-25mg牛血清白蛋白(BSA)，搅拌。之后称取15-20mg的碳二亚胺(EDPC)溶解于10-15mL水中，逐滴加入上述溶液中。室温反应18-24小时，之后用0.01-0.1M磷酸盐缓冲液透析3-6天，得到T-2毒素抗原。

在本发明的试剂盒中，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体，该抗体的制备方法如下：

(1)动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(T-2毒素半抗原与牛血清白蛋白的偶联物)每次的免疫剂量为30-100μg/只，优选40-60μg/只。首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，第6次免疫后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；

(2)细胞融合与克隆化：取上述免疫后Balb/c小鼠的脾细胞，按5-12∶1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1-5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，可在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

(4)单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5-1mL/只，14天后腹腔注射杂交瘤细胞3-12×10⁵个/只，10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-70℃保存；

(5)可将腹水在35-40℃下烘干得到抗体冻干粉，放入-70℃保存；

本发明的试剂盒中，所述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备方法包括：

(1)用包被缓冲液将T-2毒素抗原稀释成0.05-0.2μg/mL浓度的抗原稀释液；

(2)向酶标板的各孔中加入100-150μL步骤(1)得到的抗原稀释液，35-40℃下放置2-4小时，去除包被缓冲液，用洗涤液洗涤2-5次，每次15-30秒，干燥；

(3)向酶标板的各孔中加入200-300μL的封闭液，35-40℃下放置2-3小时，除去酶标板各孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

在上述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被缓冲液为pH值9-10、0.01-0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；封闭液为含有5-6重量‰明胶的0.01-0.05mol/L磷酸盐缓冲液。包被T-2毒素抗原的酶标板的材质可以为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯或硅橡胶。因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，吸附抗原后不会影响抗原的免疫活性，且所制成的板的孔底透明度高、平整，从而使测量的空白值较低，因此，本发明中包被T-2毒素抗原的酶标板优选为聚苯乙烯制成的酶标板。

以上方法制备的酶标板具有很好的稳定性，酶标板的相关技术参数均在正常范围。

在本发明的试剂盒中，所述酶标记物为过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，该羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫而得到的。所述酶标记的羊抗鼠抗抗体是通过将过氧化物酶采用过碘酸钠法或戊二醛法与所述羊抗鼠抗抗体偶联并纯化提取而制得的。

本发明的试剂盒中，所述洗涤液为4-8重量‰吐温-20的0.01-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述复溶液为0.01-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述终止液为0.1-2mol/L的硫酸。为了使本发明的试剂盒的体积更小，携带更方便，在本发明的试剂盒中所述洗涤液和所述复溶液可以以浓缩溶液的形式提供，在使用前用去离子水稀释为上述浓度。所述底物显色液为含有A物质和B物质的水溶液，所述A物质为过氧化氢和/或过氧化脲，所述B物质为邻苯二胺、四甲基联苯胺和四甲基联苯胺硫酸盐中的一种或几种；所述A物质的含量为底物显色液的总重量的1-2重量％，所述B物质的含量为0.5-2mol/L。

本发明的试剂盒中，T-2毒素标准品溶液包括以下7个浓度梯度的T-2毒素溶液：0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL和20ng/mL。

本发明的试剂盒的检测原理：将T-2毒素C-3位衍生物与牛血清白蛋白偶联得到的T-2毒素抗原包被于酶标板上，加入待测样品或T-2毒素标准品，然后加T-2毒素特异性抗体，待测样品中的T-2毒素或T-2毒素标准品与酶标板上包被的T-2毒素抗原竞争T-2毒素特异性抗体。将未结合在酶标板上的T-2毒素特异性抗体洗掉，再加入酶标记抗抗体以结合剩余的T-2毒素特异性抗体，加入显色液显色后终止，测定酶标板各孔的吸光度值，该值与样品中T-2毒素的含量呈负相关，与根据T-2毒素标准品制作的标准曲线比较即可得出样品中T-2毒素的浓度。

本发明还提供了一种检测样品中T-2毒素的方法，该方法包括以下步骤：

(1)对样品进行处理：

将样品与样品提取溶液以1∶2-10的重量比混合，搅拌5-20分钟，过滤，取30-100μL滤液加入4-20倍重量的复溶液，得到样品溶液；其中，所述的样品提取溶液为50-80体积％的甲醇水溶液。

(2)用上述本发明的试剂盒进行检测：

a.向所述酶标板的各孔中加入50-100μL所述T-2毒素标准品溶液或步骤(1)得到的所述样品溶液，然后加入等量的所述T-2毒素特异性抗体的工作液，盖板膜盖板后混匀，于35-40℃反应30-90分钟；

b.除去孔内液体，用洗涤液洗3-5次，每次使用洗涤液200-500μL，每次间隔10秒，然后拍干；

c.向各孔加入所述酶标记物的工作液100-150μL，盖板膜盖板后于35-40℃反应30-60分钟，然后除去孔内液体，按步骤b的方法洗涤；

d.向各孔加入所述底物显色液100-200μL，轻轻振荡混匀，35-40℃下避光显色10-30分钟；

e.向各孔加入所述终止液50-100μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于波长450/630nm检测，测定每孔的吸光度值。

在该检测的方法中，所述T-2毒素特异性抗体的工作液为将所述T-2毒素特异性抗体用抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0.02-0.5μg/mL的溶液；所述酶标记物的工作液为将所述酶标记物用抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0.01-0.25μg/mL的溶液；所述抗体工作稀释液为pH 7.4-9.5、含有0.1-1重量％牛血清和5-6重量‰的0.01-0.05mol/L磷酸盐缓冲液。

(3)分析检测结果：

以T-2毒素标准品的百分吸光率相对于其浓度作标准曲线，在该标准曲线上读出样品溶液的百分吸光率所对应的T-2毒素的浓度，乘以步骤(1)中所述稀释的倍数即得到样品中的T-2毒素的浓度；其中，所述百分吸光率的计算公式为：

百分吸光率(％)＝B/B₀×100％

B为T-2毒素标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值

B₀为0ng/mL的T-2毒素标准品溶液的平均吸光度值

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。

本发明提供的试剂盒对检测设备的依赖性低，其中所使用的酶标板体积小、携带方便、含有大量的孔(通常每板含有96个孔)，并且本发明的试剂盒中所使用的各溶液以工作液或浓缩液形式提供，可以直接使用或简单稀释后使用，非常方便，同时使用本发明的试剂盒的检测结果准确度高、可重复性高，检测方法简单易行，因此本发明的试剂盒能够实现对大批量的样品进行快速检测。并且本发明的试剂盒中所使用的T-2毒素特异性抗体能够与T-2毒素发生特异性的结合反应，同时与其它T-2毒素结构类似物的交叉反应率则很低，从而大大地提高了检测的特异性和灵敏性。

由此可见，本发明提供的试剂盒和检测方法具有不受检测设备的限制并且能够实现对大批量的T-2毒素样品进行快速检测的优点，同时对T-2毒素具有较高的检测特异性。

以下用实施例和实验例来详细说明本发明，但不是用来限制本发明的范围。

实施例

实施例1检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒组分的制备

1.T-2毒素抗原的合成

采用衍生物法合成T-2毒素半抗原(T-2毒素的C-3位琥珀酸酐衍生物)，再将该T-2毒素半抗原通过与碳二亚胺反应与牛血清白蛋白载体进行偶联得到。

具体制备过程为：

(1)15mg的T-2毒素与溶解于0.8mL吡啶中，然后添加300mg的琥珀酸酐，反应4小时；

(2)将步骤(1)所得的产物在氮气条件下旋转蒸干，用2mL氯仿重新溶解，以水洗涤5次，之后将产物旋转蒸干；

(3)将步骤(2)的产物称取15mg，用N，N-二甲基甲酰胺溶解、搅拌，之后加入25mg，牛血清白蛋白(BSA)，搅拌之后称取20mg的碳二亚胺(EDPC)溶解于15mL水中，逐滴加入上述溶液中；

(4)室温反应24小时，之后用0.1M磷酸盐缓冲液透析3天，得到T-2毒素抗原，-70℃保存。

2.T-2毒素鼠单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

采用Balb/c小鼠(购自军事医学科学院)作为免疫动物，以T-2毒素免疫原(Sigma公司)，每次的免疫剂量为50μg/只，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂(Sigma公司)混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂(Sigma公司)混合乳化，加强免疫一次，第6次免疫后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞(购自中国农业大学)融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)单克隆抗体的制备与纯化

采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵个/只，10天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-70℃保存。

3.包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备

(1)用包被缓冲液将上述制备的T-2毒素抗原稀释成0.1μg/mL浓度的抗原稀释液；

(2)向酶标板的各孔中加入100μL步骤(1)得到的抗原稀释液，37℃下放置2小时，去除包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，干燥；

(3)向酶标板的各孔中加入200μL的封闭液(5重量‰的明胶的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)，37℃下放置2小时，除去酶标板各孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

实施例2本发明的检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测T-2毒素的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)实施例1中的包被有T-2毒素抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体作为酶标记物；

(3)实施例1中制备的T-2毒素鼠单克隆抗体；

(4)T-2毒素标准品溶液7瓶，浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和20.0ng/mL；

(5)底物显色液为过氧化氢与四甲基联苯胺(TMB)的混合溶液；

(6)终止液为2mol/L的硫酸溶液；

(7)洗涤液为含有5重量‰吐温-20的0.02mol/L磷酸盐缓冲液；

(8)抗体工作稀释液为pH值8.2、含有0.5重量％牛血清和5重量‰明胶的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

(9)复溶液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

实施例3样品中T-2毒素残留的检测

1.谷物、饲料、食品等样品的前处理方法

5g粉碎的样品与25mL 70体积％的甲醇水溶液(70/30(V/V))；在磁力搅拌器上搅动10min；用滤纸过滤进行提取；取50μL滤液或是悬浮液加入300μL复溶液，得到样品溶液，用于下面的检测。

2.用实施例2组建的试剂盒进行检测

使用本发明的试剂盒检测样品中T-2毒素含量的方法包括：

(1)从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20-25℃)放置30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(2)取出需要数量的酶标板微孔及框架；

(3)编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；

(4)加标准品或样本50μL/孔到酶标板上各自的微孔中，然后加抗体工作液(0.1μg/mL)，50μL/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。37℃环境中反应45min。

(5)除去孔内液体，用洗涤液(250μL/孔)洗板4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。

(6)每孔加入酶标记物工作液(0.05μg/mL)，100μL/孔，盖板膜盖板后置37℃环境中反应35min。然后除去孔内液体，按步骤(6)用洗涤液充分洗涤。

(7)显色：每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。

(8)测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于波长450/630nm检测，测定每孔的吸光度值。

3.定量分析

(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即

百分吸光率(％)＝B/B₀×100％

B为T-2毒素标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值

B₀为0ng/mL的T-2毒素标准品溶液的平均吸光度值

(2)标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率(％)为纵坐标，以T-2毒素标准品浓度(ng/mL)为横坐标，绘制标准曲线图(见图1)。

将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其相对应的稀释倍数即为样本中T-2毒素实际浓度。

实验例1本发明的试剂盒中标准品的精密度试验

从每批制备的酶标板中，各抽出10个微孔，测定0μg/L标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次，计算变异系数CV％，结果如表1所示。

表1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											A批	5.4	6.7	5.8	6.7	8.7	8.4	7.8	8.8	5.8	6.0
B批	6.8	5.7	8.4	5.5	8.4	5.1	6.9	8.1	8.8	8.7
											C批	8.7	8.2	8.0	5.7	8.4	6.2	6.3	6.7	6.0	5.8

如表1所示，变异系数(CV％)范围在5.4％-8.9％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。

实验例2使用本发明的试剂盒检测样本的可重复性试验

将50μg/L浓度的T-2毒素分别添加到大米、玉米、鸡饲料样品中，分别取三个不同批次的如实施例2中组建的试剂盒，每种样品重复测量5次，分别计算变异系数(表2)。

表2

结果表明大米、玉米、鸡饲料样本的变异系数均低于20％，符合了变异系数小于25％的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。

实验例3本发明的试剂盒中T-2毒素抗体的特异性：

特异性是指抗体对待测物的识别能力，强调抗体与待测物间结合反应的专一性和对结构相近或相关物质的区分能力。特异性取决于待测物与其他物质的交叉反应。在竞争分析中，不同物质的交叉反应率可用如下公式计算：

交叉反应率(％)＝IC₅₀(竞争物)/IC₅₀(待测物)×100％

IC₅₀表示抑制50％抗原抗体结合时的物质浓度。零标准品的吸光度值代表100％的活性。

抑制率(IC)＝竞争物或待测物的OD(630nm/450nm)值/零标准品组OD(630nm/450nm)值×100，分别以竞争物或待测物(T-2毒素)浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作抑制曲线，在曲线上抑制率为50％所对应的物质浓度即为该竞争物或待测物的IC₅₀。

本发明的试剂盒中的T-2毒素抗体与HT-2毒素、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒M1、呕吐毒素、赭曲霉毒素A的交叉反应率见表3。

表3

药物名称	交叉反应率(％)
		T-2毒素	100
HT-2毒素	＜0.1
		黄曲霉B1	＜0.1
黄曲霉M1	＜0.1
		呕吐毒素	＜0.1

赭曲霉毒素A

＜0.1

结果表明，本发明的试剂盒中的T-2毒素抗体对T-2毒素特异性强，而与其它结构类似的毒素的交叉反应率很低。

实验例4本发明的试剂盒的准确度试验

取两个浓度的T-2毒素标准品溶液，分别为50μg/kg和100μg/kg，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做3个平行，分别计算回收率，结果见表4。

表4

结果表明大米、玉米添加的回收率在85.0％-109.7％之间，饲料添加回收率在79.4％-107.9％之间。

Claims (10)

1.一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

(1)包被有T-2毒素抗原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)T-2毒素特异性抗体；

(4)浓度已知的多个T-2毒素标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)洗涤液；

(8)复溶液；

其中，所述T-2毒素抗原是通过将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联得到的，所述T-2毒素特异性抗体为使用所述T-2毒素抗原获得的鼠源单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述将T-2毒素的C-3位衍生物与牛血清白蛋白进行偶联的方法包括：

(1)在蒸汽搅拌的条件下，使T-2毒素与琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟在吡啶中反应3-6小时，相对于10-15mg的T-2毒素，琥珀酸酐、戊二酸酐或甲基肟的用量为150-300mg，吡啶的用量为0.4-0.8mL；

(2)分离步骤(1)所得的产物，用1-2mL氯仿、石油醚或二氯甲烷重新溶解，再以水洗涤；

(3)分离步骤(2)所得的产物，取10-15mg该产物用N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入20-25mg牛血清白蛋白；将含15-20mg碳二亚胺的水溶液逐滴加入上述溶液中，室温反应18-24小时，然后分离得到T-2毒素抗原。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述酶标记物为过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体，该羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对山羊进行免疫而得到的。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述洗涤液为4-8重量‰吐温-20的0.01-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述复溶液为0.01-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述终止液为0.1-2mol/L的硫酸溶液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述底物显色液为含有A物质和B物质的水溶液，所述A物质为过氧化氢和/或过氧化脲，所述B物质为邻苯二胺、四甲基联苯胺和四甲基联苯胺硫酸盐中的一种或几种；所述A物质的含量为所述底物显色液总重量的1-2重量％，所述B物质的含量为0.5-2mol/L。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述包被有T-2毒素抗原的酶标板的制备方法包括：

(1)用包被缓冲液将T-2毒素抗原稀释成0.05-0.2μg/mL浓度的抗原稀释液；

(2)向酶标板的各孔中加入100-150μL步骤(1)得到的抗原稀释液，35-40℃下放置2-4小时，去除包被缓冲液，用所述洗涤液洗涤；

(3)向酶标板的各孔中加入200-300μL的封闭液，35-40℃下放置2-3小时，然后干燥并用铝膜真空密封。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述包被缓冲液为pH值9-10、浓度为0.01-0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有5-6重量‰的明胶的0.01-0.05mol/L磷酸盐缓冲液。

8.一种检测样品中T-2毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)对样品进行处理：用样品提取溶液对样品进行提取，然后用所述复溶液进行稀释，得到样品溶液；

(2)用权利要求1-7中的任意一项所述的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果：制作T-2毒素标准品的标准曲线图，从该标准曲线上读出样品溶液中T-2毒素的浓度。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)中所述的对样品进行处理的方法包括：将样品与样品提取溶液以1∶2-20的重量比混合，搅拌5-20分钟，过滤，取30-100μL滤液加入4-20倍重量的复溶液，得到样品溶液；其中，所述的样品提取溶液为50-80体积％的甲醇水溶液。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(2)中所述的检测的方法包括依次进行的下列步骤：

a.向所述酶标板的各孔中加入50-100μL所述T-2毒素标准品溶液或步骤(1)得到的所述样品溶液，然后加入等量的所述T-2毒素特异性抗体的工作液，盖板膜盖板后混匀，于35-40℃反应30-90分钟；

b.除去孔内液体，用洗涤液洗3-5次，拍干；

c.向各孔加入所述酶标记物的工作液100-150μL，盖板膜盖板后于35-40℃反应30-60分钟，除去孔内液体，用洗涤液洗3-5次，拍干；

d.向各孔加入所述底物显色液100-200μL，轻轻振荡混匀，35-40℃下避光显色10-30分钟；

e.向各孔加入所述终止液50-100μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于波长450/630nm检测，测定每孔的吸光度值；

所述T-2毒素特异性抗体的工作液为将所述T-2毒素特异性抗体用抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0.02-0.5μg/mL的溶液；所述酶标记物的工作液为将所述酶标记物用抗体工作稀释液稀释到蛋白浓度为0.01-0.25μg/mL的溶液；所述抗体工作稀释液为pH 7.4-9.5、含有0.1-1重量％牛血清和5-6重量‰明胶的0.01-0.05mol/L磷酸盐缓冲液。

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