CN103969431A - 一种用于隐蔽态t-2毒素富集净化的免疫磁珠的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于隐蔽态T-2毒素富集净化的免疫磁珠的制备及应用,它是以羧基磁珠为载体,抗T-2毒素母核多克隆抗体为识别中间体,经过活化-偶联-洗涤-封阻的过程制备出抗T-2毒素母核多克隆抗体免疫磁珠,在合适的缓冲液中于一定条件下孵育可以高效捕捉、富集检测样本中的隐蔽态T-2毒素。该方法特异性强,高效快速,操作简单,价格低廉,不需要大型仪器和特殊培训的专业操作人员,样品不需要特殊前处理,可广泛应用于食品、饲料及动物机体内隐蔽态T-2毒素的富集分离与检测。
Description
技术领域
本发明涉及隐蔽态T-2毒素(Masked T-2 toxin)样本的净化处理工艺,具体涉及一种用于净化隐蔽态T-2毒素样本的免疫磁珠及其制备、应用方法。
背景技术
免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic bead-based separation, IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagnetic bead, IMB)既可结合活性蛋白质抗体,又可被磁铁吸引,经过处理后,可将抗体结合在磁珠上,使之成为抗体的载体,磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后,则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物,这种复合物在磁力作用下,发生力学移动,使复合物与其它物质分离,而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(IMB)是一个平台,凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用,并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来IMB 以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中,显示出良好的开发应用前景。
在分离真菌毒素方面,IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素。传统的真菌毒素净化方法,存在很大的安全问题,不仅需要使用大量的有毒有机溶剂进行提取检测,而且纯化过程操作比较繁琐,需要操作者实时操作,带来了很大的安全隐患;同时,传统的纯化方法对样品的粗提要求较高,以免疫亲和柱为例,亲和柱很容易因为样品颗粒较大而造成堵塞,纯化前需过0.2或0.45 μm的滤膜,这些因素也导致了以免疫亲和柱进行纯化,毒素的回收率较低。而以免疫磁珠进行纯化,却可避免这些问题。IMB对目的毒素的富集具有明显的特点,高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构。与常规方法相比,IMS不需要多加纯化步骤去除杂质,可直接对真菌毒素产生富集分离纯化的效果,并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别隐蔽态真菌毒素上的特征基团,从而减少漏检,减少安全隐患。
近年来,免疫磁珠技术对真菌毒素分离的研究主要集中在黄曲霉毒素上,如酱油和植物油内黄曲霉毒素B1的富集检测。根据免疫磁珠的制备原理,首先要制备这些毒素的单克隆抗体或多克隆抗体,然后将抗体与磁珠偶联,从而对真菌毒素进行分离。因此,免疫磁珠的分离效果(准确度和灵敏度)直接受到抗体纯度的影响。本发明提及的隐蔽态T-2毒素免疫磁珠制备的原理是利用暴露了T-2毒素母核的抗原免疫新西兰种兔子,五次加强免疫制备得到的T-2毒素母核抗体,具有可特异性识别T-2毒素母核能力,因此T-2毒素母核抗体能够识别具有母核结构的隐蔽态T-2毒素。将T-2毒素母核抗体与磁珠偶联制成免疫磁珠便可以用于分离隐蔽态T-2毒素。同时,磁珠的制备及纯化的技术现已成熟,为高质量低成本的免疫磁珠制备提供了条件。
中国专利,公开号: CN102426229A,一种用于富集金黄色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制备方法及应用,它是以磁珠为载体,人IgG为识别中间体,经过活化-偶联-洗涤-封阻的过程制备出人IgG免疫磁珠,在合适的缓冲液中于一定条件下孵育可以高效捕捉、富集检测样本中的金黄色葡萄球菌。该方法能富集并检测金黄色葡萄球菌,但是不能用于检测T-2毒素。
目前,虽有利用免疫磁珠富集分离黄曲霉毒素的报道,但是免疫磁珠在T-2毒素上的应用,特别是在隐蔽态T-2毒素上的应用却未见报道。本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可用于富集隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠的制备工艺及富集应用条件进行了优化,大大提高了对隐蔽态T-2毒素的富集能力和检测灵敏度,同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点,将其应用于食品、饲料和对虾中的隐蔽态T-2毒素的分离与富集,可以进一步提高快速检测隐蔽态T-2毒素的效率。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足,提供一种用于隐蔽态T-2毒素富集净化的免疫磁珠的制备、应用方法,以解决隐蔽态T-2毒素样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。磁珠经过适量活化剂(EDC-NHS组合)处理后与T-2毒素母核抗体在合适的条件下进行偶联,制成T-2毒素母核抗体免疫磁珠,将T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入待测经过前处理的样品中,在一定的条件下捕获隐蔽态T-2毒素。
为实现上述发明目的,本发明采取的技术方案是:
以500nm粒径的羧基磁珠为载体,羧基磁珠末端具有有反应活性的羧基(可与蛋白质反应)基团,在经适量活化剂(EDC-NHS组合)处理后,活化磁珠可与抗T-2毒素母核的多克隆抗体进行偶联,制备成能够富集隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠;
一种制备上述免疫磁珠的具体方法为:
(1)清洗:分别取0.4mg羧基磁珠于2 mL离心管中,500 μL PBT(0.02 mo1/L,pH 7.4,含0.05%吐温-20)洗2次,洗涤后用250 μL PB 缓冲液(0.02 mo1/L,pH 7.4)超声分散重悬;
(2)活化:分别加入250 μL 用PB缓冲液(0.02 mo1/L,pH 7.4)配制的 EDC和NHS,37 ℃活化2h,保持悬浮状态;
(3)偶联:磁分离,吸去上清液,同上PBT缓冲液洗涤三次,超声重悬。再分别将200 μg的T-2毒素母核抗体加入到已活化磁珠中,37 ℃偶联3h,15 r/min旋转保持悬浮状态;
(4)封闭:磁分离,取出上清液(上清液中的蛋白含量待检),加入100 μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液,37 ℃封闭2h,保持悬浮状态;
(5)保存:同上PBT洗涤磁珠3次,磁分离,弃上清液,用250 μL PB缓冲液(0.02 mo1/L,pH 7.4,含0.02% NaN3和0.5% BSA)重悬,存于4 ℃。
上述步骤中所述活化剂:EDC和NHS,浓度均为1-5 mg/mL,用活化缓冲液溶解,添加顺序为先加入EDC,混匀后加入NHS,震荡均匀;
上述制备免疫磁珠的方法中,偶联缓冲液优选pH 7.4,0.02 mo1/L的PB缓冲液;洗涤液优选含0.05% Tween-20的pH 7.4,0.02 mo1/L的PBT缓冲液;活化剂以PB缓冲液配制;封闭液优选以PB缓冲液配制的5% BSA溶液;
基于上述免疫磁珠的富集净化隐蔽态T-2毒素富样本的方法,包括以下步骤:
(1)样本中隐蔽态T-2毒素的提取
取样本溶于甲醇,充分提取,提取液经过浓缩过滤后以PB缓冲液稀释;
(2)将上述步骤制得的免疫磁珠,磁分离,弃上清,加入捕获缓冲液,满足最大限度捕获样品中的隐蔽态T-2毒素;轻摇重悬,磁分离,弃上清;加入稀释后的隐蔽态T-2毒素样本,旋转重悬,37 ℃下,旋转捕获2 h;免疫磁珠捕获隐蔽态T-2毒素完成后,再经磁分离,从而实现隐蔽态T-2毒素样本的富集净化;去除磁分离后的上清,沉淀即为捕获了隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠;
本步骤中采用的捕获缓冲液优选为pH 7.4,0.02 mo1/L的含甲醇10%的PB缓冲液;
(3)免疫磁珠的洗脱
步骤(2)中得到的免疫磁珠中加入洗脱液进行洗脱,室温震荡,磁性分离,上清即为富集净化后的隐蔽态T-2毒素样本;
上述步骤中,免疫磁珠富集净化隐蔽态T-2毒素的最佳反应条件为,37 ℃下,pH 7.4,
0.02 mo1/L的含甲醇10%的PB缓冲液中旋转捕获2 h;
上述步骤中,洗脱液采用无水甲醇,免疫磁珠在洗脱液中的浓度采用5-20 mg/mL;室温震荡1-3分钟为宜;
偶联缓冲液采用pH 7.4,0.02 mo1/L的含甲醇10%的PB缓冲液,洗涤液采用含0.05% Tween-20的pH 7.4,0.02 mo1/L的PBT缓冲液。
本发明相对于现有技术的有益效果是:
本发明首次将活化剂(EDC和NHS)活化后的磁珠应用于T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备,根据具有母核结构的隐蔽态T-2毒素与免疫磁珠上T-2毒素母核抗体特异性结合的原理富集隐蔽态T-2毒素,特异性强,高效快速,提高了隐蔽态T-2毒素的净化效率。目前羧基磁珠的制备已经商品化,纯度高,性能稳定,成本低廉;制备出的免疫磁珠稳定性好,分离效率高,价格低。本发明采用的方法可以在很短的时间内将样品中的隐蔽态T-2毒素富集。利用T-2毒素母核抗体免疫磁珠富集隐蔽态T-2毒素,避免了常规有机溶剂提取方法中隐蔽态T-2毒素逃避分离纯化与检测的危害,并且本身与磁场力学相结合应用,无需进行提取后的纯化步骤,操作简便可行。本发明用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法操作简单,不需要大型仪器和特殊培训的专业人员,样品不需要特殊前处理,可广泛应用于食品、饲料以及动物机体内隐蔽态T-2毒素的富集分离。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明,这些实施例仅用来说明本发明,并不限制本发明的范围,本发明具体实施方式是通过制备和应用两方面进行实施的。
实施例1
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠,反复三次,每次间隔3分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各250 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔3分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔3分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育2小时,置于保存缓冲液中4℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集;
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
以无菌吸管吸取2 mL液体类食品样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,充分混匀,制成样品匀液。将免疫磁珠加入合适浓度的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时,作用完毕后,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,留待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
实施例2
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠反复三次,每次间隔4分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各200 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔4分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔4分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育2小时,置于保存缓冲液中4 ℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集;
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
称取2 g半固体类食品待测样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1~2分钟,制成样品匀液。将T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入经处理的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,留待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
实施例3
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠反复三次,每次间隔5分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各180 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔4分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔5分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育2小时,置于保存缓冲液中4 ℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集。
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
称取2 g固体类食品待测样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1~2分钟,制成样品匀液。将T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入经处理的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,留待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
实施例4
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠反复三次,每次间隔3分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各220 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育1.5小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔3分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2.5小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔4分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育1.5小时,置于保存缓冲液中4 ℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集;
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
以无菌吸管吸取2 mL液体类饲料待测样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,充分混匀,制成样品匀液。将免疫磁珠加入合适浓度的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时。作用完毕后,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,留待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
实施例5
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠反复三次,每次间隔4分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各250 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔4分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔4分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育3小时,置于保存缓冲液中4 ℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集;
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
称取2g半固体类饲料待测样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1~2分钟,充分混匀,制成样品匀液。将免疫磁珠加入合适浓度的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时,作用完毕后,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
实施例6
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠反复三次,每次间隔4分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各180 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔4分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔4分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育2小时,置于保存缓冲液中4 ℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集;
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
称取2 g固体类饲料待测样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1~2分钟,充分混匀,制成样品匀液。将免疫磁珠加入合适浓度的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时。作用完毕后,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,留待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
实施例7
一、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备:
1.取磁珠放入离心管中,加入活化缓冲液洗涤磁珠反复三次,每次间隔3分钟,除去活化缓冲液后加入活化剂EDC和NHS各150 μL,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,进行磁珠活化;
2.用偶联缓冲液洗涤磁珠三遍,每次间隔3分钟,加入T-2毒素母核抗体,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育3小时,制备成T-2毒素母核抗体免疫磁珠;
3.用洗涤缓冲液洗涤免疫磁珠反复三次,每次间隔3分钟。用封阻缓冲液于37 ℃重悬旋转孵育2小时,置于保存缓冲液中4 ℃保存待用;
4.按照国标法的样品前处理方法处理样品,取T-2毒素母核抗体免疫磁珠加入样品中,混匀,于37 ℃重悬旋转孵育2小时,使得免疫磁珠与样品充分接触,于磁力架上对隐蔽态T-2毒素进行富集。
二、抗T-2毒素母核抗体免疫磁珠对样品中隐蔽态T-2毒素富集的应用:
将待检对虾样品匀浆并冻干制成粉末,称取2 g对虾粉末样品至20 mL磷酸盐缓冲液(含10%甲醇)中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1~2分钟,充分混匀,制成样品匀液。将免疫磁珠加入合适浓度的样品中,充分混匀后于37 ℃孵育2小时,作用完毕后,置于磁力架上捕获磁珠,除去上清液,以无水甲醇解离出免疫磁珠上的隐蔽态T-2毒素,将得到的甲醇洗脱液氮吹浓缩,所得样即为纯化后的隐蔽态T-2毒素(样品冻存,留待利用LC-MS/MS和ELISA对隐蔽态T-2毒素进行鉴定检测)。
Claims (10)
1.一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:以500nm粒径的羧基磁珠为载体,羧基磁珠末端具有有反应活性的羧基基团,在经适量活化剂EDC-NHS组合处理后,活化磁珠可与抗T-2毒素母核的多克隆抗体进行偶联,制备成能够富集隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠;
具体方法为:
(1)清洗: 分别取0.4mg羧基磁珠于2mL离心管中,500μL PBT洗2次,洗涤后用250μL PB 缓冲液超声分散重悬;
(2)活化: 分别加入250μL 用PB缓冲液配制的活化剂 EDC和NHS,37 ℃活化2h,保持悬浮状态;
(3)偶联: 磁分离,吸去上清液,同上PBT缓冲液洗涤三次,超声重悬,再分别将200μg的T-2毒素母核抗体加入到已活化磁珠中,37 ℃偶联3h,15r/min旋转保持悬浮状态;
(4)封闭: 磁分离,取出上清液,加入100μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液,37 ℃封闭2h,保持悬浮状态;
(5)保存: 用PBT洗涤磁珠3次,磁分离,弃上清液,用250μL PB重悬,存于4 ℃。
2.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的PBT浓度为0.02 mo1/L,pH 7.4,含0.05%吐温-20。
3.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的PB 缓冲液浓度为0.02 mo1/L,pH 7.4。
4.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的活化剂EDC和NHS,浓度均为1-5 mg/mL,用活化缓冲液PB溶解,添加顺序为先加入EDC,混匀后加入NHS,震荡均匀。
5.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的偶联所用的偶联缓冲液为pH 7.0~7.6 ,0.01~0.1 mo1/L的PB缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的PBT缓冲液为含0.05% Tween-20的pH 7.0~7.6 ,0.01~0.1 mo1/L的缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的封闭液为以PB缓冲液配制5%BSA溶液或5%脱脂奶。
8.根据权利要求1所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的免疫磁珠的富集净化隐蔽态T-2毒素富样本的方法,包括以下步骤:
(1)样本中隐蔽态T-2毒素的提取
取样本溶于甲醇,充分提取,提取液经过浓缩过滤后以PB缓冲液稀释;
(2)将上述步骤制得的免疫磁珠,磁分离,弃上清,加入捕获缓冲液,满足最大限度捕获样品中的隐蔽态T-2毒素;轻摇重悬,磁分离,弃上清;加入稀释后的隐蔽态T-2毒素样本,旋转重悬,37℃下,旋转捕获2h;免疫磁珠捕获隐蔽态T-2毒素完成后,再经磁分离,从而实现隐蔽态T-2毒素样本的富集净化;去除磁分离后的上清,沉淀即为捕获了隐蔽态T-2毒素的免疫磁珠;
(3)免疫磁珠的洗脱
步骤(2)中得到的免疫磁珠中加入洗脱液进行洗脱,室温震荡,磁性分离,上清即为富集净化后的隐蔽态T-2毒素样本。
9.根据权利要求8所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述的捕获缓冲液为pH 7.4 ,0.02 mo1/L的含甲醇10%的PB缓冲液。
10.根据权利要求8所述的一种用于隐蔽态T-2毒素富集的T-2毒素母核抗体免疫磁珠的制备方法,其特征在于:所述洗脱液采用无水甲醇,浓度为5-20 mg/mL,洗脱后在室温下震荡1-3分钟。
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