CN105021593B - 一种基于足点域和杂交链式反应测定t‑2毒素的方法 - Google Patents
一种基于足点域和杂交链式反应测定t‑2毒素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学发光检测技术领域。当含T‑2毒素样品加入到Seq.16/DNA1修饰的磁珠溶液中时，T‑2毒素与Seq.16作用，将DNA1释放下来，磁性分离后将含DNA1的清夜加入倒发卡DNA2修饰的磁珠溶液中，DNA1的3’端与DNA2的5’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA1未杂交的部分与DNA2双链部分继续进行杂交反应，将DNA2的发卡结构打开，并形成新的双链DNA。再加入FITC标记发卡DNA H1和H2后，在光二极管照射作用下产生化学发光，根据化学发光信号强弱实现T‑2毒素的测定。该方法具有高灵敏度，低成本，操作简单等特点。
Description
技术领域
本发明属于化学发光技术领域，具体为一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法。
背景技术
T-2毒素是由多种真菌，主要是三线镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物(trichothecenes，TS)之一。它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大。迄今还没有对T-2毒素中毒的特异性防治办法。目前唯一有效的预防办法是避免接触或减少接触。近年来T-2毒素测定方法主要有：气相色谱法(李德安,周宏博,李群伟,孟宪清.气相色谱仪宽口径毛细管柱检测谷物中T-2毒素方法.中国地方病学杂志,Chinese Jouranl of Cndemiology,2000年01期,69-70)；胶体金免疫层析法(徐小婧,王俊平,王霄雪,谈超,王硕,张燕.T-2毒素胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制.食品研究与开发,Food Research and Development,2013年17期,96-99)固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用法(赵艳华，林妮妮，郭磊，陈佳，刘万卉，谢剑炜.固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用技术检测大鼠血浆中T-2毒素及其主要代谢产物.分析化学,Chinese Journalof Analytical Chemistry,2012年12期,1852-1858)；表面等离子共振法(Meneely JP,Sulyok M,Baumgartner S,Krska R,Elliott CT.A rapid optical immunoassay for thescreening of T-2 and HT-2 toxin in cereals and maize-based babyfood.Talanta.2010,81(1-2):630-636)；荧光法(Lippolis V,Pascale M,Maragos CM,Visconti A.Improvement of detection sensitivity of T-2 and HT-2 toxins usingdifferent fluorescent labeling reagents by high-performance liquidchromatography.Talanta.2008,74(5):1476-1483)；液相-质谱联用技术(Sun Y,Zhang G,Zhao H,Zheng J,Hu F,Fang B.Liquid chromatography-tandem mass spectrometrymethod for toxicokinetics,tissue distribution,and excretion studies of T-2toxin and its major metabolites in pigs.J Chromatogr B.2014,958:75-82)等。
但是，这些方法的各有其缺点，本发明利用磁珠为载体，以FITC为标记物，利用足点域和杂交链式反应为原理，以光致化学发光为检测方法，实现了T-2毒素的测定，具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
发明内容
本发明目的是提供一种简单而灵敏的测定T-2毒素的方法，利用磁珠为载体，以FITC为标记物，利用足点域和杂交链式反应为原理，以光致化学发光为检测方法，实现了T-2毒素的测定。
技术方案
一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法，其特征在于用磁珠为载体，以FITC为标记物，利用足点域和杂交链式反应为原理，以光致化学发光为检测方法，实现了T-2毒素的测定，测定步骤如下：
(1)取10μL链霉亲和素修饰磁珠至1mL离心管中，并用100μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中；发卡DNA在使用之前在95℃条件下孵化2min，然后逐步降温至室温备用；
(2)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液，然后加入10μL 1.0×10-5M生物素化的Seq.16，并在37℃下振荡反应1h，然后，再加入10μL 1.0×10-5MDNA1，得到Seq.16/DNA1修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；
(3)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液，然后加入10μL 1.0×10-5M的DNA2，并在37℃下振荡反应1h，得到发卡DNA2修饰的磁珠，用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；
(4)在100μL含有Seq.16/DNA1修饰的磁珠溶液中加入T-2毒素的样品溶液100μL，在37℃下振荡反应，T-2毒素与Seq.16作用，使得DNA1脱离Seq.16/DNA1修饰的磁珠表面，1h后，磁性分离，取含DNA1的清液加到100μL发卡DNA2修饰的磁珠溶液中，37℃下振荡反应，DNA1的3’端与DNA2的5’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA1未杂交的部分与DNA2双链部分继续进行杂交反应，将DNA2的发卡结构打开，并形成新的双链DNA。1h后，加入100μL 1.0×10-7M FITC-H1和1.0×10-7M FITC-H2的溶液，并在37℃振荡反应1h；然后，进行磁性分离，除去清液后，将磁珠用100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液清洗两遍，然后分散于100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液中；取200μL pH 11.3浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得50μL磁珠溶液；打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，测定化学发光强度，根据化学发光强度实现目标物的测定。
本发明的化学试剂优选分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
本发明的检测物为T-2毒素(北京泰乐祺科技有限公司).
DNA从北京赛百盛基因技术有限公司获得。它们的核苷酸序列如下：
Seq.16:5’-biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATC CTG TAT ATC AAG CAT CGC GTGTTT ACA CAT GCG AGA GGT GAA GAC TCG AAG T-3’
DNA1:5’-GGA TCA CAG GAT CAA GCT TC-3’；
DNA2：5’-GAA GCT TGA TCC TGT GAT CCT AGC ACC TAG ATC GAC GTA GGC TAGGAT CAC AGG AT-3’；
FITC-H1：5’-FITC-GCT AGG ATC ACA GGA TGT GTG TCC AGT GCA AAA TCC TGTGAT CCT AGC CTA CGT CGA TCT AGG T-3’；
FITC-H2:5’-TTT GCA CTG GAC ACA CAT CCT GTG ATC CTA GCA CCT AGA TCGACG TAG GCT AGG ATC ACA GGA T-FITC-3’。
本发明的磁珠为浓度为25mg/mL、粒径为100nm链霉亲和素修饰磁珠溶液(天津倍思乐色谱技术开发中心)。
本发明的Tris-HCl缓冲溶液配置方法：取50mL 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液，然后用1mol/L盐酸调节pH至8.0，最后加蒸馏水至100mL。
本发明的0.2M pH7.4磷酸缓冲溶液的配制方法：称取0.2g KH2PO4、2.9gNa2HPO4·12H2O溶解于1L水中。
本发明的化学发光测定选用化学发光分析仪(西安瑞迈仪器有限公司，西安，中国)。
本发明的酸度计选用pHS-3D型数显酸度计(上海精科雷磁仪器厂)。
本发明的离心机选用Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)。
本发明的pH测量选用PHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)。
本发明的搅拌器选用79-1磁力加热搅拌器(山东省鄄城新华电热仪器厂)。
本发明的天平选用分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
本发明的振荡孵育选用THZ-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)。
本发明的显著效果
本发明研究了不同浓度T-2毒素与发光强度之间的关系，得到了检测T-2毒素的标准曲线，线性范围及线性方程。当T-2毒素的浓度在7nM-290nM之间时，随着T-2毒素浓度的变化，化学发光强度有明显变化，其线性方程为是ICL＝6.2881x-101.57(ICL是体系的化学发光强度；x是T-2毒素的浓度，nM；n＝12，n表示同一浓度测定次数)，线性相关系数R＝0.996，检测限是3.2nM。
该测定方法的精密度通过对浓度为30nM的T-2毒素进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差为4.5％，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
附图说明
图1.测定T-2毒素方法原理图。
图2.T-2毒素标准曲线，横坐标是T-2毒素浓度，单位是nM，纵坐标ICL是体系的化学发光强度。
具体实施方式
按照技术方案的步骤(1)至(5)得到T-2毒素标准曲线见图2，其中T-2毒素是从北京义翘神州有限公司(北京，中国)购买。DNA序列由赛百盛基因技术有限公司(上海，中国)合成。实验所用其他试剂均为分析纯，并且不用对其进一步纯化可以直接使用。
根据发明的方法对T-2毒素含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为96.0–102.2％，测定结果见表1，本发明的方法在T-2毒素检测中具有精密度高的特点。
表1.样品分析测定结果
| 编号 | 含量a,b | 标准样品加入量 | 测得量 | 回收率(％) |
| 1 | -c | 10.0 | 9.8 | 98.0 |
| 2 | 12.7 | 10.0 | 23.1 | 104.0 |
| 3 | 23.7 | 10.0 | 33.9 | 102.0 |
a7次测量结果
b单位：nM
c未检出
Claims (2)
1.一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法，包括以下步骤：
(1)取10μL链霉亲和素修饰磁珠至1mL离心管中，并用100μL pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散到100μL的Tris-HCl缓冲溶液中；发卡DNA在使用之前在95℃条件下孵化2min，然后逐步降温至室温备用；
(2)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液，然后加入10μL 1.0×10-5M生物素化的Seq.16，并在37℃下振荡反应1h，然后，再加入10μL 1.0×10-5MDNA1，得到Seq.16/DNA1修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；
(3)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液，然后加入10μL 1.0×10-5M的DNA2，并在37℃下振荡反应1h，得到发卡DNA2修饰的磁珠，用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；
(4)在100μL含有Seq.16/DNA1修饰的磁珠溶液中加入T-2毒素的样品溶液100μL，在37℃下振荡反应，T-2毒素与Seq.16作用，使得DNA1脱离Seq.16/DNA1修饰的磁珠表面，1h后，磁性分离，取含DNA1的清液加到100μL发卡DNA2修饰的磁珠溶液中，37℃下振荡反应，DNA1的3’端与DNA2的5’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA1未杂交的部分与DNA2双链部分继续进行杂交反应，将DNA2的发卡结构打开，并形成新的双链DNA，1h后，加入100μL 1.0×10-7M FITC-H1和1.0×10-7M FITC-H2的溶液，并在37℃振荡反应1h；然后，进行磁性分离，除去清液后，将磁珠用100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液清洗两遍，然后分散于100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液中；取200μL pH 11.3浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得50μL磁珠溶液；打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，测定化学发光强度，根据化学发光强度实现目标物的测定。
2.权利要求1的一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素的方法，其特征在于所述的DNA部分序列如下：
Seq.16:5’-biotin-CAG CTC AGA AGC TTG ATC CTG TAT ATC AAG CAT CGC GTG TTTACA CAT GCG AGA GGT GAA GAC TCG AAG T-3’
DNA1:5’-GGA TCA CAG GAT CAA GCT TC-3’；
DNA2：5’-GAA GCT TGA TCC TGT GAT CCT AGC ACC TAG ATC GAC GTA GGC TAG GATCAC AGG AT-3’；
FITC-H1：5’-FITC-GCT AGG ATC ACA GGA TGT GTG TCC AGT GCA AAA TCC TGT GATCCT AGC CTA CGT CGA TCT AGG T-3’；
FITC-H2:5’-TTT GCA CTG GAC ACA CAT CCT GTG ATC CTA GCA CCT AGA TCG ACGTAG GCT AGG ATC ACA GGA T-FITC-3’。
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Effective date of registration: 20190912 Address after: 510000 Room 1013, 81 Kefeng Road, Lianhe Street, Guangzhou High-tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Patentee after: Guangzhou Fangwei Information Technology Co., Ltd. Address before: 266000 Shandong province Qingdao City, Zhengzhou Road No. 53, Qingdao University of Science & Technology Co-patentee before: Jiangnan University Patentee before: Qingdao University of Science & Technology |
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Effective date of registration: 20201113 Address after: No. 40, Suzhou Road, Yushan high tech Industrial Park, Changshu, Suzhou, Jiangsu Province, 215500 Patentee after: Changshu on the Road Business Incubator Co., Ltd Address before: 510000 Room 1013, 81 Kefeng Road, Lianhe Street, Guangzhou High-tech Industrial Development Zone, Guangdong Province Patentee before: Guangzhou Fangwei Information Technology Co.,Ltd. |
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