CN103113877B - 一种检测水中微囊藻毒素-lr的荧光探针 - Google Patents
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Abstract
一种检测微囊藻毒素-LR的荧光探针，属于分子生物学与微生物学领域，其荧光探针是：以MC-LR为靶标，采用噬菌体表面随机展示十二肽库筛选出与MC-LR特异结合的重组噬菌体，通过提取重组噬菌体的单链DNA 进行测序及序列比对，获得了一条MC-LR特异性亲和配体序列：His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn-Asp-Gln，后通过固相多肽合成与荧光标记获得与MC-LR特异性结合的荧光探针FITC-Acp-His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn-Asp-Gln。本发明的有益效果是：1、为MC-LR的特异性识别、含量检测提供了一种全新的“工具”。2、该荧光配体肽探针既可以定性地鉴别MC-LR，也可以定量地检测样品中MC-LR的含量。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与微生物学领域，涉及利用噬菌体表面随机展示肽库筛选出一条与微囊藻毒素-LR特异性亲和的配体序列，用人工固相合成法合成该配体，并对其进行荧光标记制备成一种检测微囊藻毒素-LR的荧光探针。
背景技术
微囊藻毒素（Microcystins，MCs）为有害的蓝藻水华释放的一类具有强烈促癌作用的肝毒素，被MCs污染的饮用水和水产品，给人类健康带来了巨大威胁。其中，微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，MC-LR）是MCs中毒性最强的一种，是对公共饮水安全存在潜在威胁的生物毒素。
研究表明MC-LR可引起家禽、家畜及野生动物死亡。且饮用水中低剂量的该毒素就可引起人的肝脏损伤，促进肝癌的发生。这使MC-LR污染水体成为一个重要的公共卫生问题。在水体污染日益严重的今天，其污染已对人类健康带来极大的威胁与隐患。
如何快速、准确、特异的检测到MC-LR是保护水质和人类健康的关键，也是我们一直研究的热点和焦点。目前检测MC-LR的方法主要有生物测定法、化学分析法与免疫测定法三种。前两种方法或由于成本高、周期长、对技术要求高；或由于实验步骤复杂，仪器昂贵、前处理费时、不能现场检测等受到局限，因此，目前主要的检测方法是免疫测定，包括酶联免疫和蛋白磷酸抑制分析等。免疫测定的核心技术就是MC-LR抗体的制备，但MC-LR单克隆抗体的制备比较繁琐，且费用昂贵。若通过某种较为简便的方法获得MC-LR的特异性亲和配体，用以替代其单克隆抗体，则更具有实际应用价值。
噬菌体展示技术是一项高新技术，采用此技术对某一目标蛋白质进行筛选，即可筛选出与目标蛋白质特异结合的亲和配体。目前，噬菌体展示技术已成为探索受体与配体之间相互作用的有力工具，对蛋白质分子相互作用识别的研究、新型疫苗的研制以及肿瘤治疗等研究领域都起到了积极的推动作用。近年来，应用此技术对生物大分子物质亲和配体的筛选也成为新的研究热点。
发明内容
本发明的目的是：提供一种检测水中微囊藻毒素-LR的荧光探针，利用噬菌体展示技术筛选MC-LR特异性亲和配体并获得配体序列，该序列经人工合成及荧光素标记获得的多肽荧光探针可与MC-LR特异性结合，代替MC-LR单克隆抗体应用于免疫检测中。
本发明的荧光探针是：以MC-LR为靶标，采用噬菌体表面随机展示十二肽库筛选出与MC-LR特异结合的重组噬菌体，通过提取重组噬菌体的单链DNA (ssDNA) 进行测序及序列比对，获得了一条MC-LR特异性亲和配体序列：
His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn-Asp-Gln。后通过固相多肽合成与荧光标记获得与MC-LR特异性结合的荧光探针FITC-Acp-His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn-Asp-Gln（见附图所示）。
本发明在制备配体肽荧光探针的基础上，构建了一种检测MC-LR的荧光探针检测系统。用待测水样包被荧光酶标板，加入40μg/mL荧光探针，该探针可与MC-LR特异性结合，随后用适宜的缓冲液洗去未结合的荧光探针，用荧光酶标仪检测其荧光强度，此时的荧光强度严格受到待测水样中MC-LR含量的控制。
本发明的构建方法是：
1、特异性亲和配体的筛选（筛选包括非特异性洗脱和特异性洗脱）
（1）第一轮非特异性洗脱
a 、将制备的MC-LR用0.1mol/L、 pH 8.6的NaHCO3溶液配制成100μg/ml的MC-LR溶液。向无菌的聚苯乙烯培养皿（60×15mm）中加入1ml的该溶液进行包被，反复小心旋转直至培养皿表面完全湿润。完成后将培养皿放入铺有湿纱布的塑料盒中4℃孵育12小时以上。
b、孵育12小时后倒掉培养皿中的包被液，并在经紫外照射过的滤纸上用力拍甩除去残留的包被液。除去残液后，向培养皿中加入2ml的封阻液，于4℃条件下封闭作用1hr以上。
c、封闭过后，按照b中所述的方法除去封阻液。然后用TBST（TBS+0.1%[v/v]Tween-20）缓冲液快速冲洗培养皿6次。每次都要小心旋转以使培养皿的底部及边缘均有被洗到，随后倒掉缓冲液，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的缓冲液。进行该操作时动作要快，以避免培养皿表面干燥。
d、用TBST缓冲液冲洗过后，向培养皿中加入1ml的TBST溶液，再加入2×1011个/mL的噬菌体（即10μg的原始文库），于室温条件下温和摇动1hr。
e、充分反应后，倒出未结合的噬菌体，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的液体。
f、按照c中所述的方法用TBST缓冲液冲洗培养皿10次，每次冲洗后拍甩残留的TBST缓冲液时都要换滤纸以防止交叉污染。
g、冲洗完后向培养皿中加入1mL的非特异性缓冲液即0.2mol/L 的Glycine-HCl（pH2.2）（含有1mg/ml BSA），用来洗脱可与MC-LR特异性结合的噬菌体，于室温条件下温和摇动1hr，反应过后将培养皿中的洗脱液吸出放入已灭菌的微量离心管中。然后向微量离心管中加入150μl的1mol/L的 Tris-HCl（pH 9.1）溶液中和上述洗脱液。中和后的溶液即为第一轮非特异性洗脱物。
（2）第一轮洗脱物滴度测定
a、接ER2738单菌落于10ml已灭菌的 LB液体培养基中，于全温振荡培养箱中37℃、175rpm的条件下培养，培养至对数中期（OD600=0.5）。
b、将第一轮洗脱物用已灭菌LB液体培养基在超净工作台内进行10倍梯度系列的稀释。同时在37℃生化培养箱中温育LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度要准备一个平板备用。
c、将顶层琼脂放置于微波炉中融化，然后在超净工作台内分成3ml等份置于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度需要一份，分装完后放置在45℃干燥箱中保温备用。
d、当ER2738菌液培养到对数中期时取出，分成200μl等份存于已灭菌的微量离心管中，每个噬菌体稀释度准备一管ER2738培养物。然后分别往每管ER2738培养物中加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速颠倒混匀，于室温条件下温育1-5min。
e、将感染噬菌体的ER2738培养物分别加入到45℃条件下保温的顶层琼脂中，一次添加一管，快速颠倒混匀，注意不要摇出气泡，然后立即倾注于已在37℃生化培养箱中预温过的LB/IPTG/Xgal平板上，在琼脂凝固前适当倾斜或轻轻摇晃平板使顶层琼脂均匀铺开。待平板冷却5min后，倒置于37℃生化培养箱中培养12小时以上。
f、检查平板，挑选有～102个噬菌斑（即蓝斑）的平板并计算平板上的噬菌斑数。然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
g、确定滴度后，计算噬菌体第一轮洗脱物中噬菌体的量和第一轮非特异性筛选的回收率。
（3）第一轮洗脱物扩增
a、接ER2738单菌落于已灭菌的LB-Tet液体培养基中，然后放置在全温振荡培养箱中37℃，175rpm条件下培养12小时以上。后将ER2738培养物以1:100的比例稀释于20ml的 LB液体培养基中（用250ml三角瓶装），然后往锥形瓶中加入第一轮洗脱物。混匀后，于全温振荡培养箱中37℃剧烈摇动培养5hr。
b、将培养后的ER2738培养物转移至已灭菌的离心管中，在4℃、10000rpm的条件下离心10min，然后将上清液转入另一已灭菌的离心管中，再用同样的条件重复离心一次。随后将上清液上部的80%的溶液转入一新的已灭菌的离心管中，然后加入1/6容积的PEG/NaCl溶液，4℃条件下沉淀12小时以上。
c、取沉淀12小时以上的溶液于4℃、10000rpm的条件下离心15min，弃去上清液，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液。
d、向沉淀物中加入1ml 的TBS溶液，使沉淀物重悬，然后将重悬液转移至已灭菌的微量离心管中，4℃条件下离心5min使溶液中残余的细胞沉淀下来。将上清液转移至新的已灭菌的微量离心管中，然后用1/6体积的PEG/NaCl溶液再沉淀。于冰上孵育1hr。
e、冰浴过后，在4℃、10000rpm的条件下离心10min，弃去上清，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液。随后将沉淀物重悬于200μl TBS（含0.02% NaN3）溶液中。离心1min，沉淀溶液中任何残余的不溶物。将上清转移至新的已灭菌的微量离心管中。此即为扩增后的洗脱物，记为一扩洗脱物。
（4）一扩洗脱物的滴度测定
根据（2）中所述的方法对一扩洗脱物进行滴度测定，然后计算一扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第二轮筛选中噬菌体的加入量。若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定。
（5）第二轮非特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用一扩洗脱物中相当于2×1011pfu的噬菌体的量重复步骤d～g。另外，在清洗步骤中使用的TBST缓冲溶液中的Tween-20的浓度要增至0.5%（v/v），将最后得到的洗脱液记为第二轮洗脱物。
（6）第二轮洗脱物的滴度测定
根据（2）中所述方法对第二轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第二轮洗脱物中噬菌体的量和第二轮非特异性筛选的回收率。
（7）第二轮洗脱物的扩增
根据（3）中所述方法对第二轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为二扩洗脱物。
（8）二扩洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算二扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第三轮筛选中噬菌体的加入量。若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定。
（9）第三轮特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用二扩洗脱物中相当于2×1011个/mL的噬菌体的量重复步骤d～f，步骤g中的非特异性洗脱液用1ml 10μg/ml的MC-LR单克隆抗体配制的溶液（用TBS溶液配制）替换，进行特异性洗脱，最后收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第三轮洗脱物，清洗步骤中的TBST缓冲溶液中Tween-20的含量仍然为0.5%（v/v）。
（10）第三轮洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对第三轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第三轮洗脱物中噬菌体的量和第三轮特异性筛选的回收率，同时将有～102个噬菌斑（即蓝斑）的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用。
（11）第三轮洗脱物的扩增
根据（3）中所述方法对第三轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为三扩洗脱物。
（12）三扩洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算三扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第四轮筛选中噬菌体的加入量。若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定。
（13）第四轮特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用三扩洗脱物中相当于2×1011pfu的噬菌体的量重复步骤d～f，步骤g中的洗脱液用1ml 8μg/ml的MC-LR单克隆抗体配制的溶液（用TBS溶液配制）代替，进行特异性洗脱，最后收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第四轮洗脱物，清洗步骤中TBST缓冲溶液中的Tween-20的含量同样为0.5%（v/v）。
（14）第四轮洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对第四轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第四轮洗脱物中噬菌体的量和第四轮特异性筛选的回收率，同时将有～102个噬菌斑（即蓝斑）的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用。
2、重组噬菌体DNA的提取及目标序列的确定
从4℃冰箱中保存的第三轮和第四轮洗脱物滴度测定平板中各随机挑选20个蓝斑进行扩增，然后对这些噬菌体分别进行ssDNA提取，实验步骤如下：
（1）取扩增后的噬菌体溶液各200μL至已灭菌的微量离心管中，分别加入等体容积量的Tris饱和酚，随后将微量离心管温和振荡2min。振荡完后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min。
（2）离心后将上层水相转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入100μL的Tris饱和酚和100μL的氯仿-异戊醇溶液（容积比为24:1），随后将微量离心管温和振荡2min。振荡完后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min。
（3）离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入200μL的氯仿-异戊醇溶液（容积比为24:1），随后将微量离心管温和振荡2min。然后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min。
（4）离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中并记下容积，同时加入1/8容积的NaAc（pH 4.6）和500μL的冷乙醇（已于-20℃预冷），然后在-20℃的条件下沉淀1hr。
（5）1hr后取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心5min，用微量移液枪吸去上清液。往沉淀中加入500μL的70%冷乙醇（已于-20℃预冷），然后再在-20℃的条件下重沉淀1hr。
（6）重沉淀后取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心20min，用微量移液枪迅速吸去上清液。将微量离心管放置在室温条件下等待乙醇挥发干净，然后往微量离心管中加入10μL的TE溶液使沉淀复溶，此即为噬菌体的ssDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送样测序。
（7）通过观察比对所有的序列，最终获得了一条MC-LR特异性亲和配体序列。
3、MC-LR荧光探针的制备
（1）反应器硅烷化12小时以上，然后用无水乙醇淋洗4~5次。
（2）将0.1 mmol的Rink Amide树脂用DMF溶液浸泡30min使其溶胀。
（3）加入两倍容积的DEP进行脱保护，时间为20min，然后用DMF淋洗6次。
（4）从C端到N端进行合成。取一定量的待合成序列中的第一个氨基酸衍生物、BOP和HOBT同时加入到Rink Amide树脂中，然后加入一定量的NMM和DMF反应2 hr。
（5）反应2hr后用DMF淋洗6次，再进行脱保护，DMF淋洗6次，添加氨基酸衍生物等，即重复步骤（4）和（5），其中（5）中的氨基酸衍生物按待合成序列中的氨基酸顺序依次添加，如此循环直至待合成序列中的所有氨基酸按顺序添加完毕。
（6）FITC标记：如先前氨基酸的添加方式进行合成，在多肽的N端连上6-氨基己酸（Acp）作为手臂。即Acp的羧基与肽链N端的组氨酸形成一个肽键，然后在手臂的N端进行FITC荧光素的标记。
（7）完成后，用甲醇淋洗6次，然后真空干燥12小时以上。
（8）用裂解液进行切割，将合成品从树脂上裂解下来，然后真空干燥获得FITC标记的MC-LR荧光探针粗品。
（9）荧光探针粗品经HPLC分离、纯化，HPLC条件为：
柱温：室温；检测波长：220nm；流动相A：含有0.1%TFA的乙腈溶液；流动相B：含有0.1%的水；梯度洗脱：25min内25%乙腈~50%乙腈。
（10）收集目的馏分，收集完全后用旋转蒸发仪蒸去溶液中的乙腈，然后将浓缩后的溶液经冷冻干燥获得配体肽荧光探针纯品。
（11）荧光探针纯品通过质谱仪测定分子量。分子量测定正确后即获得配体肽荧光探针。序列为：FITC-Acp-His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn- Asp-Gln。
4、建立荧光探针标准检测曲线
（1）用NaHCO3溶液将标准MC-LR分别配制成0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、5μg/mL的溶液，然后取不同浓度的MC-LR溶液各200 μL包被96孔板，同时用NaHCO3溶液包被三个孔，每孔添加200μL作为阴性对照。4℃包被12小时以上。
（2）除去多余包被液，往包被孔中加满封阻液，阴性对照孔也要进行封闭，在4℃条件下封闭2hr。
（3）除去封阻液，然后用TBST溶液洗板6次，每次倒完溶液后均要在干净的滤纸上拍净残留在包被孔中的溶液，此步骤动作要快避免包被孔干燥影响结果。
（4）往包被孔中加入200μL荧光探针溶液（荧光探针用TBS溶液配制成40μg/mL的溶液），于室温条件下避光振荡1hr（阴性对照孔也添加荧光探针溶液）。
（5）反应后除去孔中未结合的荧光探针，用TBST溶液洗板6次，如步骤（3）中所述。
（6）往孔中加入200μL的TBST溶液，然后利用多功能微孔检测仪在520nm条件下测定荧光吸收值，建立标准检测曲线。
本发明的检测对象是：水中MC-LR，样品检测浓度范围为0.04μg/mL~5μg/mL。
本发明的有益效果是：
1、为MC-LR的特异性识别、含量检测提供了一种全新的“工具”。
2、该荧光配体肽探针既可以定性地鉴别MC-LR，也可以定量地检测样品中MC-LR的含量。
附图说明
附图1：MC-LR特异性亲和的荧光配体肽结构图。
附图2：MC-LR特异性亲和的荧光配体肽高效液相色谱图。
附图3；MC-LR特异性亲和的荧光配体肽质谱图。
附图4：采用ELISA荧光检测法建立的工作曲线图。
具体实施方式
实施例1
用MC-LR标准品建立荧光探针标准检测曲线
1、特异性亲和配体的筛选（筛选包括非特异性洗脱和特异性洗脱）
（1）第一轮非特异性洗脱
a 、将制备的MC-LR用0.1mol/L、 pH 8.6的NaHCO3溶液配制成100μg/ml的MC-LR溶液。向无菌的聚苯乙烯培养皿（60×15mm）中加入1ml的该溶液进行包被，反复小心旋转直至培养皿表面完全湿润。完成后将培养皿放入铺有湿纱布的塑料盒中4℃孵育12小时以上。
b、孵育12小时后倒掉培养皿中的包被液，并在经紫外照射过的滤纸上用力拍甩除去残留的包被液。除去残液后，向培养皿中加入2ml的封阻液，于4℃条件下封闭作用1hr以上。
c、封闭过后，按照b中所述的方法除去封阻液。然后用TBST（TBS+0.1%[v/v]Tween-20）缓冲液快速冲洗培养皿6次。每次都要小心旋转以使培养皿的底部及边缘均有被洗到，随后倒掉缓冲液，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的缓冲液。进行该操作时动作要快，以避免培养皿表面干燥。
d、用TBST缓冲液冲洗过后，向培养皿中加入1ml的TBST溶液，再加入2×1011个/mL的噬菌体（即10μg的原始文库），于室温条件下温和摇动1hr。
e、充分反应后，倒出未结合的噬菌体，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的液体。
f、按照c中所述的方法用TBST缓冲液冲洗培养皿10次，每次冲洗后拍甩残留的TBST缓冲液时都要换滤纸以防止交叉污染。
g、冲洗完后向培养皿中加入1mL的非特异性缓冲液即0.2mol/L 的Glycine-HCl（pH2.2）（含有1mg/ml BSA），用来洗脱可与MC-LR特异性结合的噬菌体，于室温条件下温和摇动1hr，反应过后将培养皿中的洗脱液吸出放入已灭菌的微量离心管中。然后向微量离心管中加入150μl的1mol/L的 Tris-HCl（pH 9.1）溶液中和上述洗脱液。中和后的溶液即为第一轮非特异性洗脱物。
（2）第一轮洗脱物滴度测定
a、接ER2738单菌落于10ml已灭菌的 LB液体培养基中，于全温振荡培养箱中37℃、175rpm的条件下培养，培养至对数中期（OD600=0.5）。
b、将第一轮洗脱物用已灭菌LB液体培养基在超净工作台内进行10倍梯度系列的稀释。同时在37℃生化培养箱中温育LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度要准备一个平板备用。
c、将顶层琼脂放置于微波炉中融化，然后在超净工作台内分成3ml等份置于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度需要一份，分装完后放置在45℃干燥箱中保温备用。
d、当ER2738菌液培养到对数中期时取出，分成200μl等份存于已灭菌的微量离心管中，每个噬菌体稀释度准备一管ER2738培养物。然后分别往每管ER2738培养物中加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速颠倒混匀，于室温条件下温育1-5min。
e、将感染噬菌体的ER2738培养物分别加入到45℃条件下保温的顶层琼脂中，一次添加一管，快速颠倒混匀，注意不要摇出气泡，然后立即倾注于已在37℃生化培养箱中预温过的LB/IPTG/Xgal平板上，在琼脂凝固前适当倾斜或轻轻摇晃平板使顶层琼脂均匀铺开。待平板冷却5min后，倒置于37℃生化培养箱中培养12小时以上。
f、检查平板，挑选有～102个噬菌斑（即蓝斑）的平板并计算平板上的噬菌斑数。然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
g、确定滴度后，计算噬菌体第一轮洗脱物中噬菌体的量和第一轮非特异性筛选的回收率。
（3）第一轮洗脱物扩增
a、接ER2738单菌落于已灭菌的LB-Tet液体培养基中，然后放置在全温振荡培养箱中37℃，175rpm条件下培养12小时以上。后将ER2738培养物以1:100的比例稀释于20ml的 LB液体培养基中（用250ml三角瓶装），然后往锥形瓶中加入第一轮洗脱物。混匀后，于全温振荡培养箱中37℃剧烈摇动培养5hr。
b、将培养后的ER2738培养物转移至已灭菌的离心管中，在4℃、10000rpm的条件下离心10min，然后将上清液转入另一已灭菌的离心管中，再用同样的条件重复离心一次。随后将上清液上部的80%的溶液转入一新的已灭菌的离心管中，然后加入1/6容积的PEG/NaCl溶液，4℃条件下沉淀12小时以上。
c、取沉淀12小时以上的溶液于4℃、10000rpm的条件下离心15min，弃去上清液，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液。
d、向沉淀物中加入1ml 的TBS溶液，使沉淀物重悬，然后将重悬液转移至已灭菌的微量离心管中，4℃条件下离心5min使溶液中残余的细胞沉淀下来。将上清液转移至新的已灭菌的微量离心管中，然后用1/6体积的PEG/NaCl溶液再沉淀。于冰上孵育1hr。
e、冰浴过后，在4℃、10000rpm的条件下离心10min，弃去上清，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液。随后将沉淀物重悬于200μl TBS（含0.02% NaN3）溶液中。离心1min，沉淀溶液中任何残余的不溶物。将上清转移至新的已灭菌的微量离心管中。此即为扩增后的洗脱物，记为一扩洗脱物。
（4）一扩洗脱物的滴度测定
根据（2）中所述的方法对一扩洗脱物进行滴度测定，然后计算一扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011pfu的第二轮筛选中噬菌体的加入量。若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定。
（5）第二轮非特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用一扩洗脱物中相当于2×1011个/mL的噬菌体的量重复步骤d～g。另外，在清洗步骤中使用的TBST缓冲溶液中的Tween-20的浓度要增至0.5%（v/v），将最后得到的洗脱液记为第二轮洗脱物。
（6）第二轮洗脱物的滴度测定
根据（2）中所述方法对第二轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第二轮洗脱物中噬菌体的量和第二轮非特异性筛选的回收率。
（7）第二轮洗脱物的扩增
根据（3）中所述方法对第二轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为二扩洗脱物。
（8）二扩洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算二扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第三轮筛选中噬菌体的加入量。若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定。
（9）第三轮特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用二扩洗脱物中相当于2×1011pfu的噬菌体的量重复步骤d～f，步骤g中的非特异性洗脱液用1ml 10μg/ml的MC-LR单克隆抗体配制的溶液（用TBS溶液配制）替换，进行特异性洗脱，最后收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第三轮洗脱物，清洗步骤中的TBST缓冲溶液中Tween-20的含量仍然为0.5%（v/v）。
（10）第三轮洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对第三轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第三轮洗脱物中噬菌体的量和第三轮特异性筛选的回收率，同时将有～102个噬菌斑（即蓝斑）的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用。
（11）第三轮洗脱物的扩增
根据（3）中所述方法对第三轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为三扩洗脱物。
（12）三扩洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算三扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第四轮筛选中噬菌体的加入量。若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定。
（13）第四轮特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用三扩洗脱物中相当于2×1011pfu的噬菌体的量重复步骤d～f，步骤g中的洗脱液用1ml 8μg/ml的MC-LR单克隆抗体配制的溶液（用TBS溶液配制）代替，进行特异性洗脱，最后收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第四轮洗脱物，清洗步骤中TBST缓冲溶液中的Tween-20的含量同样为0.5%（v/v）。
（14）第四轮洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对第四轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第四轮洗脱物中噬菌体的量和第四轮特异性筛选的回收率，同时将有～102个噬菌斑（即蓝斑）的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用。
2、重组噬菌体DNA的提取及目标序列的确定
从4℃冰箱中保存的第三轮和第四轮洗脱物滴度测定平板中各随机挑选20个蓝斑进行扩增，然后对这些噬菌体分别进行ssDNA提取，实验步骤如下：
（1）取扩增后的噬菌体溶液各200μL至已灭菌的微量离心管中，分别加入等体容积量的Tris饱和酚，随后将微量离心管温和振荡2min。振荡完后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min。
（2）离心后将上层水相转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入100μL的Tris饱和酚和100μL的氯仿-异戊醇溶液（容积比为24:1），随后将微量离心管温和振荡2min。振荡完后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min。
（3）离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入200μL的氯仿-异戊醇溶液（容积比为24:1），随后将微量离心管温和振荡2min。然后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min。
（4）离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中并记下容积，同时加入1/8容积的NaAc（pH 4.6）和500μL的冷乙醇（已于-20℃预冷），然后在-20℃的条件下沉淀1hr。
（5）1hr后取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心5min，用微量移液枪吸去上清液。往沉淀中加入500μL的70%冷乙醇（已于-20℃预冷），然后再在-20℃的条件下重沉淀1hr。
（6）重沉淀后取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心20min，用微量移液枪迅速吸去上清液。将微量离心管放置在室温条件下等待乙醇挥发干净，然后往微量离心管中加入10μL的TE溶液使沉淀复溶，此即为噬菌体的ssDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送样测序。
（7）通过观察比对所有的序列，最终获得了一条MC-LR特异性亲和配体序列。
3、MC-LR荧光探针的制备
（1）反应器硅烷化12小时以上，然后用无水乙醇淋洗4~5次。
（2）将0.1 mmol的Rink Amide树脂用DMF溶液浸泡30min使其溶胀。
（3）加入两倍容积的DEP进行脱保护，时间为20min，然后用DMF淋洗6次。
（4）从C端到N端进行合成。取一定量的待合成序列中的第一个氨基酸衍生物、BOP和HOBT同时加入到Rink Amide树脂中，然后加入一定量的NMM和DMF反应2 hr。
（5）反应2hr后用DMF淋洗6次，再进行脱保护，DMF淋洗6次，添加氨基酸衍生物等，即重复步骤（4）和（5），其中（5）中的氨基酸衍生物按待合成序列中的氨基酸顺序依次添加，如此循环直至待合成序列中的所有氨基酸按顺序添加完毕。
（6）FITC标记：如先前氨基酸的添加方式进行合成，在多肽的N端连上6-氨基己酸（Acp）作为手臂。即Acp的羧基与肽链N端的组氨酸形成一个肽键，然后在手臂的N端进行FITC荧光素的标记。
（7）完成后，用甲醇淋洗6次，然后真空干燥12小时以上。
（8）用裂解液进行切割，将合成品从树脂上裂解下来，然后真空干燥获得FITC标记的MC-LR荧光探针粗品。
（9）荧光探针粗品经HPLC分离、纯化，HPLC条件为：
柱温：室温；检测波长：220nm；流动相A：含有0.1%TFA的乙腈溶液；流动相B：含有0.1%的水；梯度洗脱：25min内25%乙腈~50%乙腈。
（10）收集目的馏分，收集完全后用旋转蒸发仪蒸去溶液中的乙腈，然后将浓缩后的溶液经冷冻干燥获得配体肽荧光探针纯品。
（11）荧光探针纯品通过质谱仪测定分子量。分子量测定正确后即获得配体肽荧光探针。序列为：FITC-Acp-His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn- Asp-Gln。
4、建立荧光探针标准检测曲线
（1）用NaHCO3溶液将标准MC-LR分别配制成0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、5μg/mL的溶液，然后取不同浓度的MC-LR溶液各200 μL包被96孔板，同时用NaHCO3溶液包被三个孔，每孔添加200μL作为阴性对照。4℃包被12小时以上。
（2）除去多余包被液，往包被孔中加满封阻液，阴性对照孔也要进行封闭，在4℃条件下封闭2hr。
（3）除去封阻液，然后用TBST溶液洗板6次，每次倒完溶液后均要在干净的滤纸上拍净残留在包被孔中的溶液，此步骤动作要快避免包被孔干燥影响结果。
（4）往包被孔中加入200μL荧光探针溶液（荧光探针用TBS溶液配制成40μg/mL的溶液），于室温条件下避光振荡1hr（阴性对照孔也添加荧光探针溶液）。
（5）反应后除去孔中未结合的荧光探针，用TBST溶液洗板6次，如步骤（3）中所述。
（6）往孔中加入200μL的TBST溶液，然后利用多功能微孔检测仪在520nm条件下测定荧光吸收值，建立标准检测曲线。
表1.荧光检测结果
MC-LR准品检测范围为0.04μg/mL~5μg/mL，检测的荧光强度与MC-LR浓度符合曲线：y=3420.5x+4923.6，R2 = 0.9984。
Claims (2)
1.一种检测水中微囊藻毒素-LR的荧光探针，其荧光探针是：
以MC-LR为靶标，采用噬菌体表面随机展示十二肽库筛选出与MC-LR特异结合的重组噬菌体，通过提取重组噬菌体的单链DNA 进行测序及序列比对，获得了一条MC-LR特异性亲和配体序列：
His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn-Asp-Gln，后通过固相多肽合成与荧光标记获得与MC-LR特异性结合的荧光探针FITC-Acp-His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn-Asp-Gln。
2.如权利要求1所述的一种检测水中微囊藻毒素-LR的荧光探针的构建方法，其构建方法是：
Ⅰ、特异性亲和配体的筛选
（1）第一轮非特异性洗脱
a 、将制备的MC-LR用0.1mol/L、 pH 8.6的NaHCO3溶液配制成100μg/ml的MC-LR溶液；向无菌的聚苯乙烯培养皿中加入1ml的该溶液进行包被，反复小心旋转直至培养皿表面完全湿润；完成后将培养皿放入铺有湿纱布的塑料盒中4℃孵育12小时以上；
b、孵育12小时后倒掉培养皿中的包被液，并在经紫外照射过的滤纸上用力拍甩除去残留的包被液；除去残液后，向培养皿中加入2ml的封阻液，于4℃条件下封闭作用1hr以上；
c、封闭过后，按照b中所述的方法除去封阻液，然后用0.1%[v/v]Tween-20的TBST缓冲液快速冲洗培养皿6次；每次都要小心旋转以使培养皿的底部及边缘均有被洗到，随后倒掉缓冲液，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的缓冲液；进行该操作时动作要快，以避免培养皿表面干燥；
d、用TBST缓冲液冲洗过后，向培养皿中加入1ml的TBST溶液，再加入2×1011个/mL的噬菌体，于室温条件下温和摇动1hr；
e、充分反应后，倒出未结合的噬菌体，并在经紫外照射过的滤纸上拍干净残留在培养皿内的液体；
f、按照c中所述的方法用TBST缓冲液冲洗培养皿10次，每次冲洗后拍甩残留的TBST缓冲液时都要换滤纸以防止交叉污染；
g、冲洗完后向培养皿中加入1mL的非特异性缓冲液即0.2mol/L 的pH2.2的Glycine-HCl，用来洗脱可与MC-LR特异性结合的噬菌体，于室温条件下温和摇动1hr，反应过后将培养皿中的洗脱液吸出放入已灭菌的微量离心管中，然后向微量离心管中加入150μl的1mol/L的pH 9.1的Tris-HCl溶液中和上述洗脱液，中和后的溶液即为第一轮非特异性洗脱物；
（2）第一轮洗脱物滴度测定
a、接ER2738单菌落于10ml已灭菌的 LB液体培养基中，于全温振荡培养箱中37℃、175rpm的条件下培养，培养至对数中期OD600=0.5；
b、将第一轮洗脱物用已灭菌LB液体培养基在超净工作台内进行10倍梯度系列的稀释，同时在37℃生化培养箱中温育LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度要准备一个平板备用；
c、将顶层琼脂放置于微波炉中融化，然后在超净工作台内分成3ml等份置于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度需要一份，分装完后放置在45℃干燥箱中保温备用；
d、当ER2738菌液培养到对数中期时取出，分成200μl等份存于已灭菌的微量离心管中，每个噬菌体稀释度准备一管ER2738培养物，然后分别往每管ER2738培养物中加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速颠倒混匀，于室温条件下温育1-5min；
e、将感染噬菌体的ER2738培养物分别加入到45℃条件下保温的顶层琼脂中，一次添加一管，快速颠倒混匀，注意不要摇出气泡，然后立即倾注于已在37℃生化培养箱中预温过的LB/IPTG/Xgal平板上，在琼脂凝固前适当倾斜或轻轻摇晃平板使顶层琼脂均匀铺开；待平板冷却5min后，倒置于37℃生化培养箱中培养12小时以上；
f、检查平板，挑选有～102个蓝色噬菌斑的平板并计算平板上的噬菌斑数，然后用此数目乘以稀释倍数即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位；
g、确定滴度后，计算噬菌体第一轮洗脱物中噬菌体的量和第一轮非特异性筛选的回收率；
（3）第一轮洗脱物扩增
a、接ER2738单菌落于已灭菌的LB-Tet液体培养基中，然后放置在全温振荡培养箱中37℃，175rpm条件下培养12小时以上；后将ER2738培养物以1:100的比例稀释于20ml的 LB液体培养基中，然后往锥形瓶中加入第一轮洗脱物，混匀后，于全温振荡培养箱中37℃剧烈摇动培养5hr；
b、将培养后的ER2738培养物转移至已灭菌的离心管中，在4℃、10000rpm的条件下离心10min，然后将上清液转入另一已灭菌的离心管中，再用同样的条件重复离心一次，随后将上清液上部的80%的溶液转入一新的已灭菌的离心管中，然后加入1/6容积的PEG/NaCl溶液，4℃条件下沉淀12小时以上；
c、取沉淀12小时以上的溶液于4℃、10000rpm的条件下离心15min，弃去上清液，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液；
d、向沉淀物中加入1ml 的TBS溶液，使沉淀物重悬，然后将重悬液转移至已灭菌的微量离心管中，4℃条件下离心5min使溶液中残余的细胞沉淀下来，将上清液转移至新的已灭菌的微量离心管中，然后用1/6体积的PEG/NaCl溶液再沉淀，于冰上孵育1hr；
e、冰浴过后，在4℃、10000rpm的条件下离心10min，弃去上清，再短暂离心，然后用微量移液枪吸去残留的上清液，随后将沉淀物重悬于含0.02% NaN3的200μl TBS溶液中，离心1min，沉淀溶液中任何残余的不溶物，将上清转移至新的已灭菌的微量离心管中，此即为扩增后的洗脱物，记为一扩洗脱物；
（4）一扩洗脱物的滴度测定
根据（2）中所述的方法对一扩洗脱物进行滴度测定，然后计算一扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第二轮筛选中噬菌体的加入量，若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定；
（5）第二轮非特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用一扩洗脱物中相当于2×1011pfu的噬菌体的量重复步骤d～g；另外，在清洗步骤中使用的TBST缓冲溶液中的Tween-20的浓度要增至0.5%，将最后得到的洗脱液记为第二轮洗脱物；
（6）第二轮洗脱物的滴度测定
根据（2）中所述方法对第二轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第二轮洗脱物中噬菌体的量和第二轮非特异性筛选的回收率；
（7）第二轮洗脱物的扩增
根据（3）中所述方法对第二轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为二扩洗脱物；
（8）二扩洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算二扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第三轮筛选中噬菌体的加入量，若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定；
（9）第三轮特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用二扩洗脱物中相当于2×1011pfu的噬菌体的量重复步骤d～f，步骤g中的非特异性洗脱液用TBS溶液配制的1ml 10μg/ml的MC-LR单克隆抗体替换，进行特异性洗脱，最后收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第三轮洗脱物，清洗步骤中的TBST缓冲溶液中Tween-20的含量仍然为0.5%；
（10）第三轮洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对第三轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第三轮洗脱物中噬菌体的量和第三轮特异性筛选的回收率，同时将有～102个蓝色噬菌斑的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用；
（11）第三轮洗脱物的扩增
根据（3）中所述方法对第三轮洗脱物进行扩增，扩增后的洗脱物记为三扩洗脱物；
（12）三扩洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对二扩洗脱物进行滴度测定，然后计算三扩洗脱物中噬菌体的量并换算出相应于2×1011个/mL的第四轮筛选中噬菌体的加入量，若滴度太低，可再进行扩增、滴度测定；
（13）第四轮特异性洗脱
根据（1）中的步骤a～c包被一已灭菌的聚苯乙烯培养皿，用三扩洗脱物中相当于2×1011个/mL的噬菌体的量重复步骤d～f，步骤g中的洗脱液用TBS溶液配制的1ml 8μg/ml的MC-LR单克隆抗体代替，进行特异性洗脱，最后收集到的洗脱液不需要用Tris-HCl中和，即为第四轮洗脱物，清洗步骤中TBST缓冲溶液中的Tween-20的含量同样为0.5%；
（14）第四轮洗脱物滴度测定
根据（2）中所述方法对第四轮洗脱物进行滴度测定，确定滴度后计算第四轮洗脱物中噬菌体的量和第四轮特异性筛选的回收率，同时将有～102个蓝色噬菌斑的滴度测定平板于4℃冰箱存放留用；
Ⅱ、重组噬菌体DNA的提取及目标序列的确定
从4℃冰箱中保存的第三轮和第四轮洗脱物滴度测定平板中各随机挑选20个蓝斑进行扩增，然后对这些噬菌体分别进行ssDNA提取，实验步骤如下
（1）取扩增后的噬菌体溶液各200μL至已灭菌的微量离心管中，分别加入等体容积量的Tris饱和酚，随后将微量离心管温和振荡2min，振荡完后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min；
（2）离心后将上层水相转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入100μL的Tris饱和酚和100μL的容积比为24:1的氯仿-异戊醇溶液，随后将微量离心管温和振荡2min，振荡完后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min；
（3）离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中，同时加入200μL的容积比为24:1的氯仿-异戊醇溶液，随后将微量离心管温和振荡2min，然后，在4℃、12000rpm的条件下离心5min；
（4）离心后将上清液转移至另一已灭菌的微量离心管中并记下容积，同时加入1/8容积的pH 4.6的NaAc和500μL的冷乙醇，然后在-20℃的条件下沉淀1hr；
（5）1hr后取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心5min，用微量移液枪吸去上清液，往沉淀中加入500μL的70%冷乙醇，然后再在-20℃的条件下重沉淀1hr；
（6）重沉淀后取出微量离心管，在4℃、12000rpm的条件下离心20min，用微量移液枪迅速吸去上清液，将微量离心管放置在室温条件下等待乙醇挥发干净，然后往微量离心管中加入10μL的TE溶液使沉淀复溶，此即为噬菌体的ssDNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送样测序；
（7）通过观察比对所有的序列，最终获得了一条MC-LR特异性亲和配体序列；
Ⅲ、MC-LR荧光探针的制备
（1）反应器硅烷化12小时以上，然后用无水乙醇淋洗4~5次；
（2）将0.1 mmol的Rink Amide树脂用DMF溶液浸泡30min使其溶胀；
（3）加入两倍容积的DEP进行脱保护，时间为20min，然后用DMF淋洗6次；
（4）从C端到N端进行合成，取一定量的待合成序列中的第一个氨基酸衍生物、BOP和HOBT同时加入到Rink Amide树脂中，然后加入一定量的NMM和DMF反应2 hr；
（5）反应2hr后用DMF淋洗6次，再进行脱保护，DMF淋洗6次，添加氨基酸衍生物等，即重复步骤（4）和（5），其中（5）中的氨基酸衍生物按待合成序列中的氨基酸顺序依次添加，如此循环直至待合成序列中的所有氨基酸按顺序添加完毕；
（6）FITC标记，如先前氨基酸的添加方式进行合成，在多肽的N端连上6-氨基己酸Acp作为手臂，即Acp的羧基与肽链N端的组氨酸形成一个肽键，然后在手臂的N端进行FITC荧光素的标记；
（7）完成后，用甲醇淋洗6次，然后真空干燥12小时以上；
（8）用裂解液进行切割，将合成品从树脂上裂解下来，然后真空干燥获得FITC标记的MC-LR荧光探针粗品；
（9）荧光探针粗品经HPLC分离、纯化，HPLC条件为
柱温为室温，检测波长为220nm，流动相A为含有0.1%TFA的乙腈溶液，流动相B为含有0.1%的水，梯度洗脱为25min内25%乙腈~50%乙腈；
（10）收集目的馏分，收集完全后用旋转蒸发仪蒸去溶液中的乙腈，然后将浓缩后的溶液经冷冻干燥获得配体肽荧光探针纯品；
（11）荧光探针纯品通过质谱仪测定分子量，分子量测定正确后即获得配体肽荧光探针，序列为FITC-Acp-His-Phe-Phe-Lys-Trp-His-Thr-Arg-Thr-Asn- Asp-Gln；
Ⅳ、建立荧光探针标准检测曲线
（1）用NaHCO3溶液将标准MC-LR分别配制成0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL、5μg/mL的溶液，然后取不同浓度的MC-LR溶液各200 μL包被96孔板，同时用NaHCO3溶液包被三个孔，每孔添加200μL作为阴性对照，4℃包被12小时以上；
（2）除去多余包被液，往包被孔中加满封阻液，阴性对照孔也要进行封闭，在4℃条件下封闭2hr；
（3）除去封阻液，然后用TBST溶液洗板6次，每次倒完溶液后均要在干净的滤纸上拍净残留在包被孔中的溶液，此步骤动作要快避免包被孔干燥影响结果；
（4）往包被孔中加入200μL 的TBS溶液配制成的40μg/mL的荧光探针溶液，于室温条件下避光振荡1hr，阴性对照孔也添加荧光探针溶液；
（5）反应后除去孔中未结合的荧光探针，用TBST溶液洗板6次，如步骤（3）中所述；
（6）往孔中加入200μL的TBST溶液，然后利用多功能微孔检测仪在520nm条件下测定荧光吸收值，建立标准检测曲线。
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Families Citing this family (8)
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101093224A (zh) * | 2007-07-18 | 2007-12-26 | 清华大学 | 微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 |
| CN101382541A (zh) * | 2008-06-27 | 2009-03-11 | 江南大学 | 一种微囊藻毒素-lr的免疫荧光猝灭检测方法 |
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| KR100431586B1 (ko) * | 2002-03-25 | 2004-05-17 | 학교법인 한양학원 | 독소 생산 마이크로시스티스 검출방법 |
| WO2006101527A1 (en) * | 2005-03-21 | 2006-09-28 | Sensis Corporation | Methods and apparatuses for evaluating water samples |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101093224A (zh) * | 2007-07-18 | 2007-12-26 | 清华大学 | 微囊藻毒素酶联免疫检测试剂盒 |
| CN101382541A (zh) * | 2008-06-27 | 2009-03-11 | 江南大学 | 一种微囊藻毒素-lr的免疫荧光猝灭检测方法 |
| CN101624631A (zh) * | 2009-07-22 | 2010-01-13 | 苏州大学 | 一种现场快速定性定量检测铜绿微囊藻的方法 |
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