JP6616286B2 - 調節可能な遺伝子発現 - Google Patents
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Description
本発明は、調節可能な遺伝子発現構築物及び該調節可能な遺伝子発現構築物をｉｎ ｖｉｖｏ選択手順に用いる方法に関する。
生体触媒は、化学反応を活性化するか又は化学反応の速度を加速することができる生物学的に産生される触媒である。生体触媒作用は化学産業、特に紙、皮革、個人医療及び洗剤産業においてますます重要なツールとなっている（非特許文献１）。生体触媒は全細胞系及び単離酵素を含み得る。単離酵素は概して、工業用酵素及び生物変換酵素に分類される。
生体触媒酵素は有機合成プロセスにおいてより一層重要な役割を果たしている。医薬品中間体からバルクケミカルに及ぶますます多くの工業製品が、１つ又は複数の生体触媒工程を含むプロセスによって製造されており、重要なバイオテクノロジーに基づく化学産業の出現が予想される。
生体触媒に基づく化学産業の継続的な成功は、良好な全プロセス効率及び低い生産コストを可能にする生体触媒のアベイラビリティの増大に依存する。これには、実用的なプロセス条件下で所望の生物変換に必要な活性及び安定性を示す細胞系及び／又は酵素の連続的な開発が必要となる。
生体触媒作用に重点を置いた研究センターが近年普及しつつある学界、並びにますます多くの新しいバイオテクノロジー会社並びに既存の製薬会社及び化学会社が現在新たな生体触媒を開発している産業界の両方において、これらの基準を満たす酵素を発見又は開発するために多くの努力が注がれている。
原則として生物圏で利用可能な生体触媒多様性は膨大である。この自然多様性は例えばＤＮＡシャッフリング、指向進化又は部位特異的突然変異誘発法を用いて研究室内で合成的に拡張することができる。酵素発見及び最適化の戦略は概してこれらの資源のスクリーニングに基づく。工業用酵素並びに化学品及び医薬品の大規模生産用の生体触媒を含む適用される全ての生体触媒は、自然界の多数の微生物の広範な持続的スクリーニングによって発見されている（非特許文献２）。しかしながら、この巨大なプールにおける所望の生体触媒の発見には現在、新たな生体触媒の開発を制限する時間のかかる高コストのスクリーニング法が利用されている。
生体触媒を作製する改良法が明らかに必要とされている。新たな最適化生体触媒の作製の合理的再設計は極めて困難である。幾つかの例が存在するが（非特許文献３）、その寄与は依然として僅かである。新たな最適化生体触媒を作製するために既存の酵素の再設計も行われているが、限られた成功しか収めていない（非特許文献４）。しかしながら、かかるアプローチは未だ初期段階であり、いずれ有意義なものになることが判明するであろう。
酵素発見の初期段階には通例、研究室での利用可能な微生物培養物のスクリーニングが含まれる。しかしながら、満たされない複雑な栄養要求又は共生的相互依存性のために自然界の全微生物の１％未満しか現行の研究室における手順によって培養することができないと推定される（非特許文献５）。
環境ＤＮＡの単離、クローニング及び組み換え発現を可能にする技法によって、培養不可能な生物に由来する酵素の活性に基づくスクリーニングが可能となった（非特許文献６）。手順全体は４つの主な工程に従う：
１．天然基質からのＤＮＡの抽出。
２．ライブラリーの目的に応じたサイズへのＤＮＡの断片化。発現に基づくスクリーニングについては通例１ｋｂ〜１２０ｋｂが使用され、プラスミド、フォスミド、コスミド、ファージ及びＢＡＣ等のベクターにクローニングされる。
３．機能的スクリーニング／選択戦略のために遺伝子ライブラリーを代理宿主にクローニングし、メタゲノム発現ライブラリーを構築する。
４．独自の挿入断片を有する細胞のライブラリーをスクリーニング／選択によって評価する。
１．天然基質からのＤＮＡの抽出。
２．ライブラリーの目的に応じたサイズへのＤＮＡの断片化。発現に基づくスクリーニングについては通例１ｋｂ〜１２０ｋｂが使用され、プラスミド、フォスミド、コスミド、ファージ及びＢＡＣ等のベクターにクローニングされる。
３．機能的スクリーニング／選択戦略のために遺伝子ライブラリーを代理宿主にクローニングし、メタゲノム発現ライブラリーを構築する。
４．独自の挿入断片を有する細胞のライブラリーをスクリーニング／選択によって評価する。
この手順により１０６〜１０１０変異体のメタゲノムライブラリーが生成し、所望の生体触媒を産生する微生物が存在する可能性が大いに高まる。しかしながら、解決すべき問題は、このように巨大な変異体ライブラリーを所望の生体触媒についてどのように首尾よく容易にスクリーニングするかということである。
酵素の同定についてのライブラリー評価
活性に基づくスクリーニングについては、概してハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）及びｉｎ ｖｉｖｏ選択という２つのライブラリー評価の選択肢がある。
活性に基づくスクリーニングについては、概してハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）及びｉｎ ｖｉｖｏ選択という２つのライブラリー評価の選択肢がある。
Aharoni et al（非特許文献７）は、対象の酵素による蛍光原基質又は発色基質の分光学的に異なる生成物への変換を含む、適合したアッセイを用いて酵素活性を可視化するＨＴＳ法を開示している。
Leemhuis et al（非特許文献８）はＦＡＣＳ、細胞小滴（cells in droplets）、細胞表層提示及び超ハイスループット能のｉｎ ｖｉｔｒｏコンパートメント化を含む様々なＨＴＳ法を概説している。かかる技法は高レベルの偽陽性結果をもたらすことが見出されている（非特許文献９）。
ＨＴＳ法を用いることの重大な欠点は、かかるスクリーニング法では多くの場合、個々のライブラリーを各々別個に試験する必要があることであり、この方法が高コストの自動化に依存することが多いことを意味する。
Sommer, Dantas & Church （非特許文献１０、非特許文献１１）は、抗生物質耐性遺伝子等の耐性／解毒遺伝子及び成長阻害剤に対する耐性を増大する遺伝子についてメタゲノムをスクリーニングするｉｎ ｖｉｖｏ選択法を開示している。Steele, Jaeger, Daniel & Streit（非特許文献１２）はｉｎ ｖｉｖｏ選択法を概説している。
概してｉｎ ｖｉｖｏ選択法では、発現される酵素が宿主細胞の成長阻害条件での成長を可能にする等の大きな生物学的利点を宿主細胞に対してもたらす必要がある。
特許文献１（ETHZ、２００５年）は、生成物誘導性発現系及び生体触媒発現系を含む宿主細胞を準備し、該宿主細胞を成長阻害条件で成長させることによって基質から生成物への化学反応を触媒することが可能な生体触媒を候補生体触媒群から選択するｉｎ ｖｉｖｏ方法を開示している。所望の生体触媒を含有する細胞は生成物への基質の化学変換をもたらし、該生成物は生成物誘導性発現系に結合し、その発現により成長阻害条件での増殖、ひいては該生体触媒の選択が可能となる。この系は小さな細胞集団（約１０５細胞）には効果的であるが、より大きな集団にはあまり効果的でなく、約１０６細胞を含むライブラリーでは１０％〜３０％の偽陽性が観察される。
Yang et al.（非特許文献１３）は、宿主細胞集団の中で高レベルのリシンを産生しない細胞から高レベルのリシンを産生する細胞を選択するためにリシンに結合する合成リボスイッチを使用する方法を開示している。
特許文献２は、自己蛍光タンパク質の発現がアプタマー結合代謝産物の細胞内濃度に依存する、リボスイッチに操作可能に（operatively）連結した自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む遺伝子組み換え細胞を開示している。
Gallivan（非特許文献１４）は、テオフィリンの存在下で抗生物質耐性をコードするコード領域の翻訳を活性化する合成リボスイッチを使用する方法を提供しており、該リボスイッチを保有する細胞の増殖を可能にしている。突然変異リボスイッチを含有する１００万倍大きい細胞のプールからのテオフィリンに対する特定のリガンド特異性による上記合成リボスイッチを保有する細胞の選択が実証された。同様の方法が特許文献３（Gallivan、２０１２年）に開示されている。
上で引用される技術の選択手順を、基質を細胞外空間から細胞内空間へと輸送する化合物である輸送体化合物を検出するために更に開発することができることが想定され得る。生成物誘導性選択系は、該生成物（受動細胞拡散に不活性）を細胞外空間から細胞内へと輸送する化合物の選択に使用され得る。細胞外空間から細胞内空間への受動拡散に不活性の基質は、該基質を必要とするｉｎ ｖｉｖｏ生化学合成を操作する場合に問題がある可能性があり、したがって細胞膜を介して特定の基質（「生成物」）を輸送する輸送体化合物をコードする遺伝子を選択する方法を提供することは細胞工学に有益であると分かる。
本発明を目的とする開発作業では、Gallivan（特許文献３）により開示される方法が、潜在的にリボスイッチが「リーキー（leaky）」である（コード領域がテオフィリンの非存在下であっても発現される）ために顕著なレベルの偽陽性結果をもたらすことが見出された。
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このため本発明の目的は、生体触媒及び／又は輸送体化合物（及びその遺伝子）のｉｎ ｖｉｖｏ選択にリボスイッチ調節機構を用いる汎用系を提供することであり、該系は迅速であり、コスト効率がよく、無視することができるレベルの偽陽性結果を確実に維持しながらハイスループットモードで使用することができる。
本発明は今回、本明細書で「一次モジュレーター化合物」と総称される生体触媒及び／又は輸送体化合物についての、その存在が該一次モジュレーター化合物の存在に依存するエフェクター化合物の宿主細胞における存在によって制御される調節可能な遺伝子発現構築物を用いる改良されたｉｎ ｖｉｖｏ選択手順に関し、ここで上記一次モジュレーター化合物は上記エフェクター化合物の作用を変調することが可能な機能的分子である。本明細書に記載の同じエフェクター化合物に結合する２つ以上のリボスイッチを含む多重調節選択系の使用は、該調節選択系及び上記一次モジュレーター化合物を含む宿主細胞に対する高い選択性を維持した上で偽陽性結果のレベルを無視することができるレベルへと低減する。
第１の態様において、本発明は、核酸分子を含む調節可能な遺伝子発現構築物であって、
前記核酸分子が２つ以上の調節配列を含み、該調節配列の各々がエフェクター化合物に応答するリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、該リボスイッチの各々がそれぞれのコード領域に操作可能に連結し、
各コード領域がそれぞれの成長調節化合物の作用を変調するそれぞれのモジュレーター化合物をコードし、
各調節配列中のリボスイッチが同じエフェクター化合物に応答して、そのそれぞれのモジュレーター化合物の発現を誘発するように選択される、調節可能な遺伝子発現構築物に関する。
前記核酸分子が２つ以上の調節配列を含み、該調節配列の各々がエフェクター化合物に応答するリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、該リボスイッチの各々がそれぞれのコード領域に操作可能に連結し、
各コード領域がそれぞれの成長調節化合物の作用を変調するそれぞれのモジュレーター化合物をコードし、
各調節配列中のリボスイッチが同じエフェクター化合物に応答して、そのそれぞれのモジュレーター化合物の発現を誘発するように選択される、調節可能な遺伝子発現構築物に関する。
本発明の好ましい実施の形態では、上記の調節可能な遺伝子発現構築物は、プラスミド、エピソームＤＮＡ又は染色体ＤＮＡであり得るが、これらに限定されない核酸分子を含む。
本発明の好ましい実施の形態では、上記の調節可能な遺伝子発現構築物は、２つ以上の核酸分子を含み、各核酸分子が少なくとも１つの調節配列を含む。
本発明の好ましい実施の形態では、上記リボスイッチは、自然発生リボスイッチ、キメラリボスイッチ、改変リボスイッチ、合成リボスイッチ又は組み換えリボスイッチであり得るが、これらに限定されない。
別の態様において、本発明は、エフェクター化合物の作用を変調する少なくとも１つの一次モジュレーター化合物をコードする遺伝コード配列をｉｎ ｖｉｖｏで選択する方法であって、前記一次モジュレーター化合物を潜在的に発現するＤＮＡフラグメントのライブラリーを発現する宿主微生物の発現ライブラリーを、各々通常は該微生物の増殖を防ぐことが可能な少なくとも２つの成長調節化合物の存在下で成長させることと、増殖する前記ライブラリー中の微生物を選択することとを含み、
前記一次モジュレーター化合物が、
前記エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらし、該基質が前記微生物に供給されるか、又は、
前記エフェクター化合物を前記微生物に輸送し、
前記宿主微生物が調節可能な遺伝子発現構築物を含み、該調節可能な遺伝子発現構築物が核酸分子を含み、該核酸分子が少なくとも２つの調節配列を含み、該調節配列が各々それぞれのコード領域に操作可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、各リボスイッチが前記エフェクター化合物の存在に応答してそのそれぞれのコード領域の発現を調節し、各コード領域がそれぞれの前記成長調節化合物の作用を変調するそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードし、それにより所望の一次モジュレーター化合物を産生する前記ライブラリー中の微生物を前記少なくとも２つの成長調節化合物の存在下で増殖させることが可能である、方法に関する。
前記一次モジュレーター化合物が、
前記エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらし、該基質が前記微生物に供給されるか、又は、
前記エフェクター化合物を前記微生物に輸送し、
前記宿主微生物が調節可能な遺伝子発現構築物を含み、該調節可能な遺伝子発現構築物が核酸分子を含み、該核酸分子が少なくとも２つの調節配列を含み、該調節配列が各々それぞれのコード領域に操作可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、各リボスイッチが前記エフェクター化合物の存在に応答してそのそれぞれのコード領域の発現を調節し、各コード領域がそれぞれの前記成長調節化合物の作用を変調するそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードし、それにより所望の一次モジュレーター化合物を産生する前記ライブラリー中の微生物を前記少なくとも２つの成長調節化合物の存在下で増殖させることが可能である、方法に関する。
好ましい実施の形態では、前記宿主微生物の発現ライブラリーが潜在的一次モジュレーター化合物群を産生する多数の宿主細胞を含み、該多数の宿主細胞が、
本質的に各々の宿主細胞が少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードするクローニングされた核酸フラグメント又は突然変異した未変性ゲノムを含む単一細胞型の細胞のライブラリーであるか、又は、
本質的に各々の宿主細胞が少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする未変性核酸フラグメントを含む異なる細胞型の細胞である。
本質的に各々の宿主細胞が少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードするクローニングされた核酸フラグメント又は突然変異した未変性ゲノムを含む単一細胞型の細胞のライブラリーであるか、又は、
本質的に各々の宿主細胞が少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする未変性核酸フラグメントを含む異なる細胞型の細胞である。
別の好ましい実施の形態では、前記宿主微生物を、各々の操作可能に連結したコード領域が１つの抗生物質化合物に対する耐性をコードするように、各々の抗生物質化合物に対する耐性が操作可能に連結したコード領域の各々にコードされる前記成長調節化合物として少なくとも２つの抗生物質化合物を含む成長培地中で前記基質と接触させる。前記コード領域が抗生物質耐性をもたらすそれぞれの酵素をコードすることが好ましい。
別の好ましい実施の形態では、前記宿主微生物が、各々が多段階化学変換反応の少なくとも１つの反応を触媒することが可能な少なくとも２つの一次モジュレーター化合物をコードする１つ又は複数の核酸分子を含み、前記化学変換反応の少なくとも１つにより前記エフェクター化合物が生成する。
更に別の好ましい実施の形態では、前記微生物宿主細胞が少なくとも２つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする１つ又は複数の核酸分子を含み、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物が前記エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらし、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物が前記基質を前記微生物内に輸送する。
別の態様において、本発明は、潜在的一次モジュレーター化合物群の中から一次モジュレーター化合物を選択する方法に使用するのに好適な微生物宿主細胞のライブラリーであって、該宿主細胞が各々、
ａ）少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする少なくとも１つの核酸分子であって、該一次モジュレーター化合物が、
前記エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらし、該基質が前記微生物に供給されるか、又は、
前記エフェクター化合物を前記微生物に輸送する、少なくとも１つの核酸分子と、
ｂ）少なくとも２つ以上の調節配列をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物であって、該調節配列の各々が、それぞれの成長調節化合物の作用を変調するそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードするそれぞれのコード領域に操作可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、各リボスイッチがエフェクター化合物の存在に応答してそのそれぞれのコード領域の発現を調節する、少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物と、
を含む、微生物宿主細胞のライブラリーに関する。
ａ）少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする少なくとも１つの核酸分子であって、該一次モジュレーター化合物が、
前記エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらし、該基質が前記微生物に供給されるか、又は、
前記エフェクター化合物を前記微生物に輸送する、少なくとも１つの核酸分子と、
ｂ）少なくとも２つ以上の調節配列をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物であって、該調節配列の各々が、それぞれの成長調節化合物の作用を変調するそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードするそれぞれのコード領域に操作可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、各リボスイッチがエフェクター化合物の存在に応答してそのそれぞれのコード領域の発現を調節する、少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物と、
を含む、微生物宿主細胞のライブラリーに関する。
別の態様において、本発明は、微生物宿主細胞であって、該宿主細胞が少なくとも１つの本明細書に記載の調節可能な遺伝子発現構築物と、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物をコードする少なくとも１つの核酸分子とを含み、該一次モジュレーター化合物が、
エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらすか、又は、
細胞外空間から細胞内空間へと化合物を輸送し、輸送体化合物が前記基質又は前記エフェクター化合物である、微生物宿主細胞に関する。
エフェクター化合物への基質の化学変換をもたらすか、又は、
細胞外空間から細胞内空間へと化合物を輸送し、輸送体化合物が前記基質又は前記エフェクター化合物である、微生物宿主細胞に関する。
最後の態様において、本発明は、一次モジュレーター化合物産生株を作製する方法であって、本明細書に記載の方法に従って選択された遺伝コード配列（単数又は複数）を遺伝子導入法によって微生物宿主細胞に導入することにより産生株を作製し、該産生株が前記一次モジュレーター化合物（単数又は複数）を産生する、方法に関する。
定義
「エフェクター化合物」は本明細書で使用される場合、リボスイッチに結合し、該リボスイッチのコンフォメーション変化を引き起こすことにより、そのそれぞれのコード領域の発現を調節する化合物を指す。
「エフェクター化合物」は本明細書で使用される場合、リボスイッチに結合し、該リボスイッチのコンフォメーション変化を引き起こすことにより、そのそれぞれのコード領域の発現を調節する化合物を指す。
「一次モジュレーター化合物」は本明細書で使用される場合、エフェクター化合物の作用を変調する化合物を指し、ここで該一次モジュレーター化合物はエフェクター化合物への基質の化学変換をもたらすか、又は該エフェクター化合物を微生物内に輸送する。
「二次モジュレーター化合物」は本明細書で使用される場合、成長調節化合物の作用を変調する化合物を指す。
「成長調節化合物」は本明細書で使用される場合、該成長調節化合物の存在下の細胞が増殖することのないよう細胞成長を抑制する化合物を指す。
「クローニング」はＤＮＡをベクターに挿入した後、それを安定した細胞系の一部として確立するプロセスと称される。
「発現ベクター」という用語は本明細書で使用される場合、特定の核酸配列を標的細胞に導入し、発現させるために使用されるＤＮＡ分子を指す。発現ベクターが細胞内に入ると、核酸配列によってコードされる潜在的一次モジュレーター化合物が細胞の転写及び翻訳機構によって産生される。これらの発現ベクターとしては概して、コードされる特異的な遺伝子の核酸（すなわち候補生体触媒及び／又は検出遺伝子の核酸）に操作可能に連結した調節要素が挙げられる。「転写」はＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型上でのＲＮＡの合成を指す。「翻訳」はｍＲＮＡ鋳型上でのタンパク質の合成を指す。核酸は別の核酸配列と機能的に関係する位置にある場合に「操作可能に連結している」。例えば、リボスイッチはコード配列の翻訳に影響を及ぼす場合に該配列に操作可能に連結している。
本発明を、添付の図面を参照して更に記載及び説明する。
以下に本明細書に記載される選択法の作業の更なる詳細を提示する。
基本的な系のレイアウト
一般的アプローチは、エフェクター化合物の作用を変調する一次モジュレーター化合物を含む宿主細胞の存在を、いずれも該エフェクター化合物を認識する２つ以上のリボスイッチを用いて検出することである。各リボスイッチは細胞に生存能を与えるコード領域の発現を制御する。宿主細胞において発現する自然耐性の可能性を顕著に低減することから、少なくとも２つのリボスイッチの使用が本方法を成功させるために不可欠である。
一般的アプローチは、エフェクター化合物の作用を変調する一次モジュレーター化合物を含む宿主細胞の存在を、いずれも該エフェクター化合物を認識する２つ以上のリボスイッチを用いて検出することである。各リボスイッチは細胞に生存能を与えるコード領域の発現を制御する。宿主細胞において発現する自然耐性の可能性を顕著に低減することから、少なくとも２つのリボスイッチの使用が本方法を成功させるために不可欠である。
エフェクター化合物の検出と選択的条件下での生存とを組み合わせることで、系により成長と一次モジュレーター化合物の細胞内形成とが関連付けられる。
リボスイッチ
リボスイッチは発現させるＲＮＡ分子の発現制御要素であり、エフェクター化合物が結合するとコンフォメーション状態を変化させる。リボスイッチは通例、標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）及び遺伝的制御に影響を与える別のドメイン（発現プラットホームドメイン）という２つの別個のドメインに分けることができる。これら２つのドメイン間の動的相互作用が遺伝子発現の制御をもたらす。
リボスイッチは発現させるＲＮＡ分子の発現制御要素であり、エフェクター化合物が結合するとコンフォメーション状態を変化させる。リボスイッチは通例、標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）及び遺伝的制御に影響を与える別のドメイン（発現プラットホームドメイン）という２つの別個のドメインに分けることができる。これら２つのドメイン間の動的相互作用が遺伝子発現の制御をもたらす。
リボスイッチはＯＦＦ及びＯＮという２つの異なるモードで機能する。
ＯＦＦリボスイッチ（本明細書で使用される「ネガティブ選択」）は、エフェクター化合物がアプタマードメインに結合すると遺伝子発現を遮断するリボスイッチである（すなわちコンフォメーション変化によってリボソーム結合部位が遮蔽され、関連遺伝子の発現が不可能になる）。
ＯＮリボスイッチ（本明細書で使用される「ポジティブ選択」）は、エフェクター化合物がアプタマードメインに結合すると遺伝子発現を可能にするリボスイッチである（すなわちコンフォメーション変化によってリボソーム結合部位が露出し、関連遺伝子の発現が可能となる）。
本明細書におけるリボスイッチの「スイッチング」は、エフェクター化合物がリボスイッチに結合する際のリボスイッチの状態の変化を指す。エフェクター化合物は、リボスイッチのスイッチングをもたらし得る分子（複数の場合もあり）及び／又は化合物（複数の場合もあり）である。これには、リボスイッチのスイッチングを引き起こす天然又は正常エフェクター化合物、及びリボスイッチのスイッチングを引き起こすことができる他の化合物が含まれる。
本発明に使用されるリボスイッチは概して、任意の供給源に由来することができ、自然発生リボスイッチ、キメラリボスイッチ、改変リボスイッチ及び組み換えリボスイッチが挙げられる。リボスイッチは米国特許出願公開第２００５／００５３９５１号、米国特許第６，８３１，１７１号、国際公開第２００６／０５５３５１号、米国仮特許出願第６０／６２５８６４号、米国特許出願公開第２００９／０３０５２５３号、欧州特許出願公開第２３２２５３５号及び国際公開第２０１１／０８８０７６号（いずれもリボスイッチ及びその機能の記載について、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
リボスイッチは、所望のエフェクター化合物について特定の結合を有し、リボスイッチが該エフェクター化合物に応答することにより、上記宿主細胞がその存在下で増殖するように選択可能である必要がある。リボスイッチ及び／又はリボスイッチを活性化する化合物をスクリーニング及び選択する方法は当該技術分野で、例えば米国特許出願公開第２００９／０３０５２５３号及び米国特許出願公開第２０１３／０００４９８０号、欧州特許出願公開第２３２２５３５号及び国際公開第２０１１／０８８０７６号（いずれもリボスイッチをスクリーニング及び選択する方法について、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に見ることができる。
コード領域
本明細書で使用される場合、「コード領域」は二次モジュレーター化合物をコードし、以下のいずれかに関する：
ポジティブ選択：その発現により成長調節化合物の作用を、任意に該成長調節化合物を化学的に変化させることによって、成長調節化合物が上記コード配列を含む宿主生物の成長を阻害することのないよう変調する化合物（単数又は複数）が産生される遺伝子及び／又は核酸配列。かかる化学的変化は毒性若しくは成長阻害化合物の化学的不活性化、又は修飾された炭素供給源が栄養要求性微生物によって利用され得るような炭素供給源の化学修飾であり得るが、これに限定されない。
ネガティブ選択：その発現により、非細胞毒性化合物を該化合物が細胞の成長を阻害する細胞毒性（すなわち成長調節化合物）となるように化学的に変化させることができる化合物（単数又は複数）が産生される遺伝子及び／又は核酸配列。
本明細書で使用される場合、「コード領域」は二次モジュレーター化合物をコードし、以下のいずれかに関する：
ポジティブ選択：その発現により成長調節化合物の作用を、任意に該成長調節化合物を化学的に変化させることによって、成長調節化合物が上記コード配列を含む宿主生物の成長を阻害することのないよう変調する化合物（単数又は複数）が産生される遺伝子及び／又は核酸配列。かかる化学的変化は毒性若しくは成長阻害化合物の化学的不活性化、又は修飾された炭素供給源が栄養要求性微生物によって利用され得るような炭素供給源の化学修飾であり得るが、これに限定されない。
ネガティブ選択：その発現により、非細胞毒性化合物を該化合物が細胞の成長を阻害する細胞毒性（すなわち成長調節化合物）となるように化学的に変化させることができる化合物（単数又は複数）が産生される遺伝子及び／又は核酸配列。
本発明におけるコード領域はリボスイッチに操作可能に連結する。コード領域の目的は、エフェクター化合物がリボスイッチのアプタマーに結合することでリボスイッチの変化が起こり、それにより起こるそのそれぞれのコード領域の発現の変化により細胞の成長が可能となることに基づき、一次モジュレーター化合物を含有する１つ又は複数の宿主細胞の選択を可能にすることである。
本明細書に記載される調節可能な遺伝子発現構築物中の各々の独立したコード領域は、各二次モジュレーター化合物が異なる成長調節化合物に対して作用するように異なる二次モジュレーター化合物をコードする。
当該技術分野で既知の広範な遺伝子が本発明でコード領域として使用するのに好適である。ポジティブ選択については、かかる遺伝子として抗生物質耐性の遺伝子、宿主細胞における栄養要求性を補う遺伝子、及び同じ遺伝子を含有又は発現しない宿主細胞の成長を許容しない特定の条件下での成長を可能にする他の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。かかる条件としては、宿主細胞が考え得る様々なＣ供給源を利用することができないこと、成長培地における毒性化学物質、タンパク質毒素又は毒性金属の存在が挙げられるが、これらに限定されない。ネガティブ選択については、かかる遺伝子としてＵＲＡ３（その発現が５−フルオロオロチン酸の存在下で致死的である）及びＳａｃＢ（その発現がスクロースの存在下で致死的である）が挙げられるが、これらに限定されない。
生体触媒
「生体触媒」という用語は、生成物への基質の化学変換をもたらす一次モジュレーター化合物を指すために本明細書で使用され、該生成物はエフェクター化合物であり得る。「生体触媒」の産生は図３に示され、経路ＡではクローニングされたＤＮＡフラグメント１が発現され、一次モジュレーター化合物２が産生し、これが基質３をエフェクター化合物４へと変換する。
「生体触媒」という用語は、生成物への基質の化学変換をもたらす一次モジュレーター化合物を指すために本明細書で使用され、該生成物はエフェクター化合物であり得る。「生体触媒」の産生は図３に示され、経路ＡではクローニングされたＤＮＡフラグメント１が発現され、一次モジュレーター化合物２が産生し、これが基質３をエフェクター化合物４へと変換する。
多くの場合、生体触媒は酵素であるが、酵素の複合体、酵素と補因子との組合せ、生体触媒ＲＮＡ分子等であってもよい。この用語は糖、オリゴ糖、多糖若しくは脂肪酸、脂質、ステロイド並びに他の化学的置換基及び化合物の共有結合又は非共有結合によって修飾される可能性のあるタンパク質の形態、核酸の形態、又は幾つかのかかる化合物の組合せの形態という化合物（複数の場合もあり）の全形態を包含することを意図する。概して、本発明の方法を用いて選択された後、生体触媒の本質が初めに確立又は評価され得る。
本発明の方法において生体触媒が選択される潜在的生体触媒群は、核酸分子ライブラリーの形態で非常に適切に準備される。かかる核酸分子は生体触媒自体をコードする以外にはるかに多くの情報を含み得る。しかしながら、これは考え得る選択にとって重大ではない。「ライブラリー」は、好適な供給源生物に由来する全ＤＮＡを制限酵素又は超音波処理で消化し、フラグメントをベクターにクローニングすることで、各々異なるＤＮＡフラグメントがクローニングされた多くの異なる組み換えベクターを作製することによって作成することができる。多くの異なる組み換えベクターの集合によって「ライブラリー」が形成される。ライブラリーは当業者が利用可能な任意の方法、例えばショットガンクローニングによって作成され得る。「ショットガンクローニング」は、クローニングの出発点として生物の全ゲノムを使用することを指す。代替的には、ＤＮＡ／ＲＮＡを環境から単離し、多くの異なる生物に由来し得る何千もの異なる遺伝子を得ることができる。かかる核酸材料の集合はメタゲノムと称される。その対極として、例えばＤＮＡ相同性、以前のスクリーニング実験又は市販のライブラリーに基づいて、所望の生体触媒をコードすることが予想される遺伝子のみを含有する特定のライブラリーを構築することができる。ショットガンクローニング法によって構築されるライブラリーは、数千（微生物）から数十万（高等真核生物又は微生物メタゲノム）の異なる組み換えプラスミドを含有し得るが、僅か１つ又は数個しか対象の配列を含まない。真核生物に由来するライブラリーのサイズを低減するために、ｃＤＮＡライブラリーを作成することが有利な場合がある。タンパク質コード領域は概して真核生物の全ゲノムサイズの僅か数パーセントを占め、真核細胞は概してその遺伝子の一部しか発現しないため、逆転写酵素を用いた細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの作製及びｃＤＮＡライブラリーへのそのクローニングにより、最も関心の持たれる生物のゲノムの部分（発現されるタンパク質コード配列）のみを含むサイズの低減したライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーの構築は当業者によく知られている。他のライブラリーのタイプとしては、ｉ）単一の親遺伝子の突然変異（定方向又はランダム）、ｉｉ）幾つかの親遺伝子の組み換え（例えば遺伝子シャッフリングによって作成されるライブラリー）、ｉｉｉ）それらの組合せによって得られるライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
「ライブラリー」は遺伝子のライブラリー又は生物のライブラリーであり得る。
ライブラリーが生物のライブラリーである場合、宿主が既に所望の生体触媒活性を有することもあり、本発明の目的は改良された生体触媒を開発することである。潜在的生体触媒群は潜在的に生体触媒活性のある細菌細胞の混合群、すなわち例えば土壌又は水サンプルから単離された異なる株の細胞の形態で与えられる場合もあり、最良の株を選択するためにこの細胞に調節可能な遺伝子発現構築物を添加する。「最良の株」という用語は、上記の調節可能な遺伝子発現構築物を含み、成長阻害条件で生存することができる任意の株として規定される。
共にライブラリー又は潜在的生体触媒群を形成する個々の遺伝子は、プラスミド又は染色体ＤＮＡ若しくはエピソームＤＮＡにコードされ得る。
共にライブラリー又は潜在的生体触媒群を形成する遺伝子は構成的に発現され得るか、又は誘導性発現ベクター上に存在し得るが、この場合、考え得る様々な操作可能に連結した調節要素の１つを介した活性化の結果として発現される。実際には生体触媒発現が誘導される方法及び可能性は限定されない。発現は構成的である場合があり、既知若しくは未知の未変性調節因子の制御下であるか、又は特異的に設計された誘導系の制御下のライブラリーの一部であり得る。生体触媒遺伝子（複数の場合もあり）が発現される方法にかかわらず、発現が宿主細胞の増殖を可能にするのに十分であるのが好ましい。
上記の態様の更なる好ましい実施形態では、少なくとも１つの微生物宿主細胞は、各々が多段階化学変換反応の少なくとも１つの反応を触媒することが可能な少なくとも２つの潜在的生体触媒をコードする１つ（又は複数の）核酸分子を含み得る。或る潜在的生体触媒によって触媒される反応の生成物が別の潜在的生体触媒によって触媒される反応の基質であり、上記生成物の少なくとも１つがリボスイッチのスイッチングのエフェクター化合物であるのが好ましい。このようにして、完全な生化学的経路を明らかにし、各反応段階に特異的な生体触媒を選択することができる。別の実施形態では、様々な潜在的生体触媒をコードする核酸分子は別個の発現系で与えることができ、各々の発現系が別個の潜在的生体触媒の発現を促進する。また、このようにして多段階化学変換反応をもたらすことができる。
宿主生物自体は、基質が最終中間化合物へと変換され、該最終中間化合物が続いて潜在的生体触媒によって所望の生成物へと変換される多段階反応を触媒する酵素及び任意の補因子を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。最終中間化合物は、宿主細胞に固有の利用可能な酵素又は一連の酵素によって生成される宿主細胞中の天然中間体であり得る。代替的には潜在的生体触媒は、リボスイッチのスイッチングのエフェクター化合物であっても又はそうでなくてもよく、提示の条件下で宿主生物において天然にコードされ、発現する（すなわち利用可能な）酵素によって生成物へと変換され得る中間化合物を生成することができる。このため、潜在的生体触媒は必ずしも多段階反応プロセスの最終反応を触媒する必要はない。このような場合、かかる多段階系におけるリボスイッチのスイッチングのエフェクター化合物の形成に寄与する宿主細胞に存在する酵素系は、同様に調節可能な遺伝子発現構築物自体をコードするプラスミドＤＮＡを含み得る宿主細胞の染色体ＤＮＡ又はエピソームＤＮＡにコードされ得ることに留意されたい。このため、生成物形成へと最終反応を潜在的に触媒することとは別に、本明細書で規定される潜在的生体触媒は、多段階反応プロセスの考え得る一連の反応において、最終的に（おそらくは付加的な反応段階を介して）求められている生成物の産生をもたらす、求められている反応である重要な反応も触媒することができる。
このため宿主生物は、各々が多段階化学変換反応の少なくとも１つの反応を触媒することが可能な少なくとも２つの生体触媒をコードする１つ又は複数の核酸分子を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。
上記の態様の更に別の好ましい実施形態では、生体触媒を含むとして同定される任意の宿主細胞は、宿主ゲノムのゲノム編集によって生体触媒活性が増大していても、又は増大していなくてもよい。ゲノム編集の方法は当業者に既知であり、多重ゲノム編集（ＭＡＧＥ）、突然変異誘発株、化学突然変異誘発、ゲノムシャッフリング及びゲノム合成が挙げられるが、これらに限定されない。
上記の態様の更に別の好ましい実施形態では、生成物の産生レベルの増大が宿主細胞の早死をもたらさらないような、より高濃度の所望の生成物中で存在する宿主細胞（単数又は複数）を同定するために選択法を用いることができる。
化学変換反応は、生体触媒による活性化又は加速の利益を得る任意の化学反応であり得る。潜在的生体触媒によって触媒され得る反応のタイプとしては、主要な酵素クラス及びサブクラス：オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼの各々によって触媒される反応が挙げられるが、これらに限定されない。
輸送体化合物
「輸送体化合物」という用語は、エフェクター化合物を宿主微生物内に輸送する一次モジュレーター化合物を指すために本明細書で使用される。「輸送体化合物」の産生は図３に示され、経路ＢではクローニングされたＤＮＡフラグメント１が発現され、一次モジュレーター化合物５が産生し、これがエフェクター化合物４を宿主細胞内に輸送する。
「輸送体化合物」という用語は、エフェクター化合物を宿主微生物内に輸送する一次モジュレーター化合物を指すために本明細書で使用される。「輸送体化合物」の産生は図３に示され、経路ＢではクローニングされたＤＮＡフラグメント１が発現され、一次モジュレーター化合物５が産生し、これがエフェクター化合物４を宿主細胞内に輸送する。
多くの場合、輸送体化合物は酵素であるが、酵素の複合体、酵素と補因子との組合せ、ＲＮＡ分子等であってもよい。この用語は糖、オリゴ糖、多糖若しくは脂肪酸、脂質、ステロイド並びに他の化学的置換基及び化合物の共有結合又は非共有結合によって修飾される可能性のあるタンパク質の形態、核酸の形態、又は幾つかのかかる化合物の組合せの形態という化合物（複数の場合もあり）の全形態を包含することを意図する。概して、本発明の方法を用いて選択された後、輸送体化合物の本質が初めに確立又は評価され得る。
本発明の方法において輸送体化合物が選択される潜在的輸送体化合物群は、核酸分子ライブラリーの形態で非常に適切に準備される。かかる核酸分子は輸送体化合物自体をコードする以外にはるかに多くの情報を含み得る。しかしながら、これは考え得る選択にとって重大ではない。「ライブラリー」は、好適な供給源生物に由来する全ＤＮＡを制限酵素又は超音波処理で消化し、フラグメントをベクターにクローニングすることで、各々異なるＤＮＡフラグメントがクローニングされた多くの異なる組み換えベクターを作製することによって作成することができる。多くの異なる組み換えベクターの集合によって「ライブラリー」が形成される。ライブラリーは当業者が利用可能な任意の方法、例えばショットガンクローニングによって作成され得る。「ショットガンクローニング」は、クローニングの出発点として生物の全ゲノムを使用することを指す。代替的には、ＤＮＡ／ＲＮＡを環境から単離し、多くの異なる生物に由来し得る何千もの異なる遺伝子を得ることができる。かかる核酸材料の集合はメタゲノムと称される。その対極として、例えばＤＮＡ相同性、以前のスクリーニング実験又は市販のライブラリーに基づいて、所望の輸送体化合物をコードすることが予想される遺伝子のみを含有する特定のライブラリーを構築することができる。ショットガンクローニング法によって構築されるライブラリーは、数千（微生物）から数十万（高等真核生物又は微生物メタゲノム）の異なる組み換えプラスミドを含有し得るが、僅か１つ又は数個しか対象の配列を含まない。真核生物に由来するライブラリーのサイズを低減するために、ｃＤＮＡライブラリーを作成することが有利な場合がある。タンパク質コード領域は概して真核生物の全ゲノムサイズの僅か数パーセントを占め、真核細胞は概してその遺伝子の一部しか発現しないため、逆転写酵素を用いた細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの作製及びｃＤＮＡライブラリーへのそのクローニングにより、最も関心の持たれる生物のゲノムの部分（発現されるタンパク質コード配列）のみを含むサイズの低減したライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーの構築は当業者によく知られている。他のライブラリーのタイプとしては、ｉ）単一の親遺伝子の突然変異（定方向又はランダム）、ｉｉ）幾つかの親遺伝子の組み換え（例えば遺伝子シャッフリングによって作成されるライブラリー）、ｉｉｉ）それらの組合せによって得られるライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。
「ライブラリー」は遺伝子のライブラリー又は生物のライブラリーであり得る。
共にライブラリー又は潜在的輸送体化合物群を形成する個々の遺伝子は、プラスミド又は染色体ＤＮＡ若しくはエピソームＤＮＡにコードされ得る。
共にライブラリー又は潜在的輸送体化合物群を形成する遺伝子は構成的に発現され得るか、又は誘導性発現ベクター上に存在し得るが、この場合、考え得る様々な操作可能に連結した調節要素の１つを介した活性化の結果として発現される。実際には輸送体化合物発現が誘導される方法及び可能性は限定されない。発現は構成的である場合があり、既知若しくは未知の未変性調節因子の制御下であるか、又は特異的に設計された誘導系の制御下のライブラリーの一部であり得る。輸送体化合物遺伝子（複数の場合もあり）が発現される方法にかかわらず、発現が宿主細胞の増殖を可能にするのに十分であるのが好ましい。
上記の態様の好ましい実施形態では、少なくとも１つの微生物宿主細胞は、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物が（本明細書で使用される）生体触媒であり、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物が輸送体化合物である少なくとも２つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする１つ（又は複数の）核酸分子を含むことができ、上記生体触媒によって触媒される反応の基質が上記輸送体化合物によって細胞内に輸送される。
宿主細胞
本発明の宿主細胞は、潜在的一次モジュレーター化合物群及び必要な調節遺伝子発現構築物の構成要素の発現に必要とされる細胞の転写及び翻訳機構を提供することが可能な任意の宿主細胞であり得る。
本発明の宿主細胞は、潜在的一次モジュレーター化合物群及び必要な調節遺伝子発現構築物の構成要素の発現に必要とされる細胞の転写及び翻訳機構を提供することが可能な任意の宿主細胞であり得る。
宿主細胞は原核微生物若しくは真核微生物等の微生物、植物細胞又は動物細胞系であり得るが、これらに限定されない。好適な原核生物として古細菌及び細菌の両方が挙げられる。好適な真核微生物としては、酵母細胞、真菌又は原生生物細胞が挙げられる。好適な動物細胞系は例えば昆虫細胞系、又は鳥類、爬虫類及び魚類の細胞であるが、哺乳動物（ヒトを含む）の細胞系を使用してもよい。
基質
「基質」という用語は本明細書で使用される場合、「生体触媒」により触媒される反応における反応物、すなわち一次モジュレーター化合物の活性部位と相互作用し、生成物、好ましくは直接エフェクター化合物へと変換される化学化合物を指す。
「基質」という用語は本明細書で使用される場合、「生体触媒」により触媒される反応における反応物、すなわち一次モジュレーター化合物の活性部位と相互作用し、生成物、好ましくは直接エフェクター化合物へと変換される化学化合物を指す。
基質は別の細胞内生体触媒反応又は反応系列の生成物であっても又はそうでなくてもよく、該反応は宿主細胞中に存在する遺伝物質にコードされる生体触媒によって行われる。
細胞の外部環境に添加された基質を潜在的生体触媒と接触させるために、宿主細胞は細胞膜を介して基質を輸送し、基質を取り込む特殊な又は一般的な取り込み系を含み得る。しかしながら、細胞膜を介した細胞内環境への基質の単純拡散も想定されるため、これは不可欠ではない。細胞膜を介した基質輸送は基質自体の化学特性（例えば疎水性、イオン性）及び宿主細胞膜の透過性に応じて異なる。「生体触媒」が或る特定の細胞コンパートメントで産生される場合、生成物への変換が起こり得るように基質が該「生体触媒」と直接物理的に接触することができることが不可欠であることに留意されたい。
生成物化合物の調製のために求められている生体触媒変換反応に使用される初期基質は概して、民間の供給業者から入手可能であるか、又は当業者に既知の方法によって調製することができる。
ポジティブ選択
ポジティブ選択が機能する一般的機構を図４に示す。図４には２つの調節配列のうち１つしか示していないことに注意する。非結合形態のリボスイッチＡはその関連リボスイッチ結合部位（ＲＢＳ）６を遮蔽する。これによりコード領域７の発現は不可能となり、二次モジュレーター化合物８は成長調節化合物９の作用の変調に利用可能でなく、したがって細胞は増殖することができない。エフェクター化合物４が結合したリボスイッチＢは、ＲＢＳが露出するようなコンフォメーション変化を受ける。これによりＲＢＳがリボソームに結合し、コード領域７の発現が可能となり、二次モジュレーター化合物８が発現される。二次モジュレーター化合物８の発現により、成長調節化合物９の作用が変調され、該成長調節化合物９が非成長阻害化合物１０となり、細胞が増殖する。
ポジティブ選択が機能する一般的機構を図４に示す。図４には２つの調節配列のうち１つしか示していないことに注意する。非結合形態のリボスイッチＡはその関連リボスイッチ結合部位（ＲＢＳ）６を遮蔽する。これによりコード領域７の発現は不可能となり、二次モジュレーター化合物８は成長調節化合物９の作用の変調に利用可能でなく、したがって細胞は増殖することができない。エフェクター化合物４が結合したリボスイッチＢは、ＲＢＳが露出するようなコンフォメーション変化を受ける。これによりＲＢＳがリボソームに結合し、コード領域７の発現が可能となり、二次モジュレーター化合物８が発現される。二次モジュレーター化合物８の発現により、成長調節化合物９の作用が変調され、該成長調節化合物９が非成長阻害化合物１０となり、細胞が増殖する。
好ましい実施形態では、ポジティブ選択機構によって一次モジュレーター化合物を検出する方法は本質的に以下のように行うことができる。
各々が所望の一次モジュレーター化合物（単数又は複数）をコードし得るＤＮＡフラグメント（単数又は複数）を含み、各々が本明細書に記載される調節可能な遺伝子発現構築物を備える多数の微生物宿主細胞を準備するが、この場合、各々のリボスイッチが「ＯＮ」リボスイッチであり、各々の操作可能に連結したコード領域が抗生物質耐性を与える二次モジュレーター化合物をコードし、その発現によりそれぞれの抗生物質を不活性化することが可能な酵素が産生される。
宿主細胞を、抗生物質耐性遺伝子を発現することできない細胞の成長を阻害するのに十分なレベルで必須成長栄養素及び２つの抗生物質化合物を含む成長培地に導入する。
成長培地は、リボスイッチを切り替える／活性化することができるエフェクター化合物（単数又は複数）に変換され得るか、又はそれ自体がエフェクター化合物（単数又は複数）であり得る試験基質（複数の場合もあり）を含んでいてもよい。成長培地は、その発現が誘導性である場合に宿主細胞において１つ又は複数の生体触媒の発現を開始する１つ又は複数の誘導因子化合物を更に含み得る。１つ又は複数の一次モジュレーター化合物発現系の誘導は連続的である必要はなく、その発現が必要とされる限りにおいて不連続であってもよい。
好適な一次モジュレーター化合物を発現する細胞は抗生物質による成長阻害を克服し、増殖し始めるが、残りの細胞の成長は抗生物質化合物によって阻害されたままである。
成長培地の組成は宿主細胞の要件によって決まる。成長培地中の成長調節化合物の濃度は各々概して１μＭ〜１Ｍの範囲である。当業者は好適な濃度を容易に決定することができる。宿主細胞を用いる方法は概して宿主細胞に特異的な温度で行われ、微生物の場合は約２０℃〜３７℃の範囲であり得る。
別の好ましい実施形態では、ポジティブ選択機構によって一次モジュレーター化合物を検出する方法は上記のように行うことができるが、但し上記コード領域の１つが宿主細胞における栄養要求性を補う遺伝子であり、該遺伝子の発現によって成長培地中の非必須成長化合物を上記栄養要求性宿主細胞によって利用され得る必須成長化合物へと変換する二次モジュレーター化合物が産生され、これにより上記宿主細胞が増殖する。宿主細胞におけるかかる栄養要求性を補う遺伝子の例は、トレオニンシンターゼ酵素をコードする大腸菌（E. coli）ｔｈｒＣ遺伝子である。該酵素はＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンをＬ−トレオニンへと変換する。ｔｈｒＣ遺伝子が発現されない場合、宿主細胞はＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンをＬ−トレオニンへと変換しないため、細胞はＯ−ホスホ−Ｌ−ホモセリンの存在下であっても増殖することができない。
ネガティブ選択
ネガティブ選択が機能する一般的機構を図５に示す。図５には２つの調節配列のうち１つしか示していないことに注意する。非結合形態のリボスイッチＡはそのＲＢＳ６が露出しており、結果としてそのコード領域７を発現し、二次モジュレーター化合物８を形成することができる。二次モジュレーター化合物８は非細胞毒性化合物１０を成長調節化合物９へと変換し、細胞は増殖することができない。エフェクター化合物４が結合したリボスイッチＢは、ＲＢＳ６が遮蔽されるようなコンフォメーション変化を受ける。これによりコード領域７の発現が不可能となり、結果として二次モジュレーター化合物８の産生が停止する。二次モジュレーター化合物８の非存在下では、非成長阻害化合物１０は成長調節化合物９へと変換されず、細胞が増殖する。
ネガティブ選択が機能する一般的機構を図５に示す。図５には２つの調節配列のうち１つしか示していないことに注意する。非結合形態のリボスイッチＡはそのＲＢＳ６が露出しており、結果としてそのコード領域７を発現し、二次モジュレーター化合物８を形成することができる。二次モジュレーター化合物８は非細胞毒性化合物１０を成長調節化合物９へと変換し、細胞は増殖することができない。エフェクター化合物４が結合したリボスイッチＢは、ＲＢＳ６が遮蔽されるようなコンフォメーション変化を受ける。これによりコード領域７の発現が不可能となり、結果として二次モジュレーター化合物８の産生が停止する。二次モジュレーター化合物８の非存在下では、非成長阻害化合物１０は成長調節化合物９へと変換されず、細胞が増殖する。
好ましい実施形態では、ネガティブ選択機構によって一次モジュレーター化合物を検出する方法は本質的に以下のように行うことができる。
各々が所望の一次モジュレーター化合物（単数又は複数）をコードし得るＤＮＡフラグメント（単数又は複数）を含み、各々が本明細書に記載される調節可能な遺伝子発現構築物を備える多数の微生物宿主細胞を準備するが、この場合、各々のリボスイッチが「ＯＦＦ」リボスイッチであり、各々の操作可能に連結したコード領域が二次モジュレーター化合物をコードし、その発現により非細胞毒性化合物を成長調節化合物へと変換する酵素が産生される。
宿主細胞を、必須成長栄養素及び上記二次モジュレーター化合物によって成長調節化合物へと変換されることが可能な非細胞毒性化合物を含む成長培地に導入する。
成長培地は、リボスイッチを切り替える／活性化することができるエフェクター化合物（単数又は複数）に変換され得るか、又はそれ自体がエフェクター化合物（単数又は複数）であり得る試験基質（複数の場合もあり）を含んでいてもよい。成長培地は、その発現が誘導性である場合に宿主細胞において１つ又は複数の生体触媒の発現を開始する１つ又は複数の誘導因子化合物を更に含み得る。１つ又は複数の一次モジュレーター化合物発現系の誘導は連続的である必要はなく、その発現が必要とされる限りにおいて不連続であってもよい。
好適な一次モジュレーター化合物を発現する細胞はコード領域の発現に起因する成長抑制の克服を開始する。
成長培地の組成は宿主細胞の要件によって決まる。成長培地中の非細胞毒性化合物の濃度は各々概して１μＭ〜１Ｍの範囲である。当業者は好適な濃度を容易に決定することができる。宿主細胞を用いる方法は概して宿主細胞に特異的な温度で行われ、微生物の場合は約２０℃〜３７℃の範囲であり得る。
ポジティブ選択及びネガティブ選択
一次モジュレーター化合物が選択された後、該一次モジュレーター化合物を当該技術分野で既知の方法によって単離し、任意に精製することができる。代替的には、一次モジュレーター化合物をコードする選択された遺伝コード配列を当該技術分野で既知の遺伝子導入法によって微生物宿主細胞に導入し、それにより産生株を作製する。「産生株」という用語は、一次モジュレーター化合物が高レベルで産生される宿主細胞を意味する。産生株は一次モジュレーター化合物を細胞内に産生するか、又は該一次モジュレーター化合物を任意に融合タンパク質として分泌することができる。一次モジュレーター化合物は、任意に細胞の除去後に成長培地から単離することができる。一次モジュレーター化合物の精製等の付加的な処理が必要な場合もある。
一次モジュレーター化合物が選択された後、該一次モジュレーター化合物を当該技術分野で既知の方法によって単離し、任意に精製することができる。代替的には、一次モジュレーター化合物をコードする選択された遺伝コード配列を当該技術分野で既知の遺伝子導入法によって微生物宿主細胞に導入し、それにより産生株を作製する。「産生株」という用語は、一次モジュレーター化合物が高レベルで産生される宿主細胞を意味する。産生株は一次モジュレーター化合物を細胞内に産生するか、又は該一次モジュレーター化合物を任意に融合タンパク質として分泌することができる。一次モジュレーター化合物は、任意に細胞の除去後に成長培地から単離することができる。一次モジュレーター化合物の精製等の付加的な処理が必要な場合もある。
一次モジュレーター化合物が生体触媒である場合、単に好適な反応条件下で基質を変換させることによって所望の生成物を製造する方法に使用することができる。変換は概して生体触媒及び１つ又は複数の基質、必要に応じて生体触媒変換反応の補因子を含む反応混合物中で、任意に緩衝剤、キレート剤、イオン、又は酵素の適切なコンフォメーションのフォールディングを支持する還元化合物等の付加的な化合物の存在下で行われる。
所望の生成物への基質の生体内変換は、透過化細胞、静止細胞、成長細胞又はこれらの組合せを生体触媒として使用することによって行うことができる。生体内変換は粗細胞抽出物を生体触媒として使用することによって行うことができる。生体触媒は不水溶性担体若しくは支持体系の上又はその中で固定化され得る。生体内変換は水性媒体中で行うことができる。生体内変換は固相、水相、有機相又は気相の２つ以上を含み得る多相媒体中で行うこともできる。酵素の特徴及び純度に応じて十分な時間で生体内変換反応を進行させた後、生成物（単数又は複数）及び残存基質（単数又は複数）及び補因子を反応混合物から回収してもよい。反応条件は概して酵素反応の最適温度に応じて異なる。回収後に生成物、残存基質及び補因子を当該技術分野で既知の方法によって更に精製してもよい。
材料及び概論
プラスミドＤＮＡ及びＰＣＲ産物を、それぞれＱＩＡｐｒｅｐ（商標） Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ及びＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標） ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Qiagenから購入）を用いて精製した。ＧｅｎｅＪＥＴ（商標） Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Fermentasから購入）を用いてゲル抽出を行った。カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、キサンチン及び本明細書で使用される全抗生物質はSigma-Aldrichから購入した。合成オリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologiesから購入した。以下の実施例では大腸菌（Escherichia coli）Ｄｈ１０Ｂ宿主細胞を用い、培養実験を０．１ｇ／Ｌのロイシン及び微量金属（当該技術分野で既知であり、多数の供給業者から入手可能である）を添加したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）又はＭ９最少培地中で行った。全ての株を１５％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液中、−８０℃で維持した。以前に記載されるように（非特許文献１５、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、ＵＳＥＲクローニングを用いてプラスミド操作を行った。構築された全ベクターの配列をＤＮＡシークエンシング（Macrogen（The Netherlands）又はBeckman Coulter（UK）によって行われるシークエンシング）によって検証した。
プラスミドＤＮＡ及びＰＣＲ産物を、それぞれＱＩＡｐｒｅｐ（商標） Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ及びＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標） ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Qiagenから購入）を用いて精製した。ＧｅｎｅＪＥＴ（商標） Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Fermentasから購入）を用いてゲル抽出を行った。カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、キサンチン及び本明細書で使用される全抗生物質はSigma-Aldrichから購入した。合成オリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologiesから購入した。以下の実施例では大腸菌（Escherichia coli）Ｄｈ１０Ｂ宿主細胞を用い、培養実験を０．１ｇ／Ｌのロイシン及び微量金属（当該技術分野で既知であり、多数の供給業者から入手可能である）を添加したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）又はＭ９最少培地中で行った。全ての株を１５％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液中、−８０℃で維持した。以前に記載されるように（非特許文献１５、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、ＵＳＥＲクローニングを用いてプラスミド操作を行った。構築された全ベクターの配列をＤＮＡシークエンシング（Macrogen（The Netherlands）又はBeckman Coulter（UK）によって行われるシークエンシング）によって検証した。
使用するプライマー
ＵＳＥＲクローニングにおいては下線の配列を除去し、一本鎖オーバーハングを生成する。
ＵＳＥＲクローニングにおいては下線の配列を除去し、一本鎖オーバーハングを生成する。
エレクトロコンピテント大腸菌細胞の作製
以下に、以下の実施例で使用されるエレクトロコンピテント細胞を作製する手順を概説する：（１）単一大腸菌コロニーを１０ｍＬのＬＢ培地に播種する；（２）振盪しながら３７℃で一晩インキュベートする；（３）０．５ｍＬ〜１ｍＬの培養物を２５０ｍＬの新鮮ＬＢ媒地に移す；（４）３７℃で３時間〜４時間（ＯＤ６００が０．４にほぼ等しくなるまで）インキュベートする；（５）細胞を氷／水浴内で１５分間冷却する；（６）細胞を遠心分離（５分間〜１０分間、４０００ｒｐｍ、２℃、チューブ１本当たり１８５ｇ〜１９０ｇの総重量）によって回収する；（７）水で２回洗浄し、細胞を遠心分離（５分間〜１０分間、４０００ｒｐｍ、２℃、チューブ１本当たり１８５ｇ〜１９０ｇの総重量）によって回収する；（８）最終容量が１ｍＬ〜２ｍＬとなるまで水を添加する；（９）細胞を氷冷エッペンドルフチューブに分取する（各５０／１００μＬ）。
以下に、以下の実施例で使用されるエレクトロコンピテント細胞を作製する手順を概説する：（１）単一大腸菌コロニーを１０ｍＬのＬＢ培地に播種する；（２）振盪しながら３７℃で一晩インキュベートする；（３）０．５ｍＬ〜１ｍＬの培養物を２５０ｍＬの新鮮ＬＢ媒地に移す；（４）３７℃で３時間〜４時間（ＯＤ６００が０．４にほぼ等しくなるまで）インキュベートする；（５）細胞を氷／水浴内で１５分間冷却する；（６）細胞を遠心分離（５分間〜１０分間、４０００ｒｐｍ、２℃、チューブ１本当たり１８５ｇ〜１９０ｇの総重量）によって回収する；（７）水で２回洗浄し、細胞を遠心分離（５分間〜１０分間、４０００ｒｐｍ、２℃、チューブ１本当たり１８５ｇ〜１９０ｇの総重量）によって回収する；（８）最終容量が１ｍＬ〜２ｍＬとなるまで水を添加する；（９）細胞を氷冷エッペンドルフチューブに分取する（各５０／１００μＬ）。
エレクトロコンピテント大腸菌細胞のエレクトロポレーション
以下に、以下の実施例で使用されるエレクトロコンピテント大腸菌細胞のエレクトロポレーション手順を概説する：（１）エレクトロポレーション前にキュベットを氷上に２０分間置く；（２）２ｍＬの予め温めたＳＯＣ培地の入ったファルコンチューブを準備する；（３）エレクトロコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍する；（４）１μＬ〜２μＬ（４００ｎｇ以下）のＤＮＡを各サンプルに添加する；（５）細胞／ＤＮＡ混合物をキュベットに移す；（６）２．５ｋＶでエレクトロポレーションを行う；（７）エレクトロポレーションの直後に細胞を予め温めたＳＯＣ培地に懸濁する；（８）３７℃で表現型発現を行う（２００ｒｐｍで最低１時間）；（９）１μＬの回復細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ／寒天プレートにプレーティングし、形質転換の成功を決定する；（１０）ＳＯＣ培地を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する９ｍＬのＬＢ液体培地に移す。静止期まで成長させる。
以下に、以下の実施例で使用されるエレクトロコンピテント大腸菌細胞のエレクトロポレーション手順を概説する：（１）エレクトロポレーション前にキュベットを氷上に２０分間置く；（２）２ｍＬの予め温めたＳＯＣ培地の入ったファルコンチューブを準備する；（３）エレクトロコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍する；（４）１μＬ〜２μＬ（４００ｎｇ以下）のＤＮＡを各サンプルに添加する；（５）細胞／ＤＮＡ混合物をキュベットに移す；（６）２．５ｋＶでエレクトロポレーションを行う；（７）エレクトロポレーションの直後に細胞を予め温めたＳＯＣ培地に懸濁する；（８）３７℃で表現型発現を行う（２００ｒｐｍで最低１時間）；（９）１μＬの回復細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ／寒天プレートにプレーティングし、形質転換の成功を決定する；（１０）ＳＯＣ培地を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する９ｍＬのＬＢ液体培地に移す。静止期まで成長させる。
実施例１．二重リボスイッチ選択ベクターｐＧＥＢＯ５．１の構築
ｐＧＥＢＯ５．１は第二世代選択ベクターｐＧＥＢＯ４．１に基づく第三世代選択ベクターであり、ｐＧＥＢＯ４．１は第一世代選択ベクターｐＧＥＢＯ４に基づく。ｐＧＥＢＯ４は「リボスイッチプラットホーム」を含有するベクターｐＧＥＢＯ２を含む。
ｐＧＥＢＯ５．１は第二世代選択ベクターｐＧＥＢＯ４．１に基づく第三世代選択ベクターであり、ｐＧＥＢＯ４．１は第一世代選択ベクターｐＧＥＢＯ４に基づく。ｐＧＥＢＯ４は「リボスイッチプラットホーム」を含有するベクターｐＧＥＢＯ２を含む。
ｐＧＥＢＯ２の構築：「リボスイッチプラットホーム」を構成する２２１塩基対のＤＮＡ配列（図１）はIntegrated DNA Technologiesによって人工的に合成され、ｐＧＥＢＯ２を生じるｐＩＤＴＳＭＡＲＴベクターで送達された。リボスイッチプラットホームに加えて、フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）配列（５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１９））がリボスイッチに対して５’に含まれていた。
ｐＧＥＢＯ４の構築：ｐＧＥＢＯ４は以下の３つのＰＣＲ産物の環状ＵＳＥＲ融合によって作製した：（１）プライマーＧＥＢＯ４／５（フォワード／リバース）を用いてｐＧＥＢＯ２から増幅したＦＲＴ−リボスイッチプラットホーム；（２）プライマーＧＥＢＯ６／２を用いてｐＳＫＤ３１４（Gallivan, 2004）から増幅したクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）を含有する領域、ｐＭＢ１複製起点（ｏｒｉ）及びａｍｐＲ（アンピシリン選択マーカー）；並びに（３）プライマーＧＥＢＯ１／３を用いてｐＢＲ３２２（非特許文献１６）から増幅したｔｅｔＲ（テトラサイクリン選択マーカー）。プライマーは、この３つのフラグメントが（１）−（２）−（３）の順で切れ目なく環状に融合するように設計した。フラグメント（２）及び（３）の融合により最終構築物中の（２）と（３）との間に完全ＦＲＴ配列が生じるように、プライマーＧＥＢＯ２及びＧＥＢＯ１は各々がプライマー尾部にＦＲＴ配列の一部を含んでいた。このようにして、リコンビニアリング（Schlake & Bode, 1994）による最終的な除去／交換のためにｔｅｔＲに２つのＦＲＴ部位を隣接させる。
ｐＧＥＢＯ４．１の構築：ｐＧＥＢＯ４．１は以下の３つのフラグメントの環状融合によって作製した：（１）プライマーＧＥＢＯ４２／４３を用いてｐＧＥＢＯ４から増幅したリボスイッチプラットホーム、ｃａｔ；（２）プライマーＧＥＢＯ ４４／４５を用いてｐＡＣＹＣ１８４（非特許文献１７）から増幅したｐ１５Ａ ｏｒｉ；並びに（３）プライマーＧＥＢＯ４６／４７を用いてｐＳＬＹ４７（Lemire et al.、未発表、詳細は要求により出願人から利用可能である）から増幅したａｍｐＲ及びｓｐｅｃＲ。フラグメントを（１）−（２）−（３）の順に環状ＵＳＥＲ融合した。
ｐＧＥＢＯ５．１の構築：ｐＧＥＢＯ５．１は、どちらもｐＧＥＢＯ４．１から増幅した以下の２つのフラグメントの環状ＵＳＥＲ融合によって作製した：（１）プライマーＧＥＢＯ７３／７４を用いてリボスイッチプラットホーム（プロモーターから開始コドンまで）；及び（２）プライマーＧＥＢＯ７７／７２を用いて５’ＵＴＲ及びｓｐｅｃＲのプロモーターを除外した完全ｐＧＥＢＯ４．１骨格。（１）及び（２）の融合により、ｓｐｅｃＲ発現を制御するために付加的なリボスイッチプラットホームが一方向に融合した新たなベクターが得られた（図２を参照されたい）。
実施例２．単一及び二重選択系における自然耐性の決定
ｐＧＥＢＯ５．１を、当業者に既知の標準方法を用いて大腸菌Ｄｈ１０Ｂ細胞に形質転換した（ＥｃｐＧＥＢＯ５．１の形成）。二重選択系によって自然耐性の問題が解決されるか否かを試験するために、スペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地で最大１．３×１０８個のＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞のプレーティングを１０反復で行った（「二重選択」）。対照として、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）又はスペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）のみを含有するプレートでのプレーティング（「単一選択」）を各々三連で行った（表１を参照されたい）。各プレートを７２時間インキュベートした。二重選択の１０個のプレートにおいて、インキュベーションの最初の４８時間でコロニーは観察されなかった。２４時間のインキュベーションにおいて、クロラムフェニコールのみを含有する３個のプレートの各々で多数のコロニーが生じ、スペクチノマイシンのみを含有するプレートでも同様であった。自然耐性は１．３×１０８個の細胞をプレーティングした場合の二重選択系で７２時間のインキュベーション後においてのみ観察され、単一選択系では自然耐性は全ての細胞密度で短時間に観察された。したがって、１つの抗生物質に自然耐性を与える単一突然変異の確率が顕著である一方で、両方の抗生物質に自然耐性を与える同時二重突然変異の確率は事実上無であると考えられる。このため、自然耐性の結果としての偽陽性のレベルは二重選択系の使用によって事実上ゼロにまで低減する。
ｐＧＥＢＯ５．１を、当業者に既知の標準方法を用いて大腸菌Ｄｈ１０Ｂ細胞に形質転換した（ＥｃｐＧＥＢＯ５．１の形成）。二重選択系によって自然耐性の問題が解決されるか否かを試験するために、スペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地で最大１．３×１０８個のＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞のプレーティングを１０反復で行った（「二重選択」）。対照として、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）又はスペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）のみを含有するプレートでのプレーティング（「単一選択」）を各々三連で行った（表１を参照されたい）。各プレートを７２時間インキュベートした。二重選択の１０個のプレートにおいて、インキュベーションの最初の４８時間でコロニーは観察されなかった。２４時間のインキュベーションにおいて、クロラムフェニコールのみを含有する３個のプレートの各々で多数のコロニーが生じ、スペクチノマイシンのみを含有するプレートでも同様であった。自然耐性は１．３×１０８個の細胞をプレーティングした場合の二重選択系で７２時間のインキュベーション後においてのみ観察され、単一選択系では自然耐性は全ての細胞密度で短時間に観察された。したがって、１つの抗生物質に自然耐性を与える単一突然変異の確率が顕著である一方で、両方の抗生物質に自然耐性を与える同時二重突然変異の確率は事実上無であると考えられる。このため、自然耐性の結果としての偽陽性のレベルは二重選択系の使用によって事実上ゼロにまで低減する。
表１．「−」成長なし、「＋」単一コロニー（１〜１０００）、「＋＋」コンフルエント層。各選択系について三連で行った；ｘ，ｙ，ｚ：ｘ＝２４時間の成長、ｙ＝４８時間の成長、ｚ＝７２時間の成長。
実施例３．種々のキサンチンアルカロイドに対するＥｃｐＧＥＢＯ５．１の成長応答
４つの異なるキサンチンアルカロイドに対するＥｃｐＧＥＢＯ５．１の成長応答を、様々な濃度のキサンチン系の化合物：テオフィリン、キサンチン、テオブロミン及びカフェインによる選択アッセイを実験的に用いることによって決定した。
４つの異なるキサンチンアルカロイドに対するＥｃｐＧＥＢＯ５．１の成長応答を、様々な濃度のキサンチン系の化合物：テオフィリン、キサンチン、テオブロミン及びカフェインによる選択アッセイを実験的に用いることによって決定した。
手順：３００〜４００のコロニー形成単位を、アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）及び指定濃度のキサンチン系の化合物（以前に決定された（非特許文献１８）アプタマー領域（ｍＣＴＣ８−４アプタマー）とのキサンチンの解離定数（Ｋｄ）については表２を参照されたい）を含有するプレートにプレーティングした。選択なしはスペクチノマイシン及びクロラムフェニコールを含まないプレートを意味する。（＋）は成長が観察されたことを意味する。（−）は成長が観察されなかったことを意味する。（〜）は成長の低下が観察されたことを意味する。
表２−ｐＧＥＢＯ５．１におけるリボスイッチアプタマードメインの特異性評価。
これらの結果から、テオフィリンに特異的なリボスイッチアプタマードメインにより調節可能な遺伝子発現構築物を含有する細胞が、テオフィリンが成長培地中に存在する場合に選択条件下でのみ増殖することが示される。
キサンチンを含有する培地において成長が見られないことは、テオフィリンアプタマー領域とのキサンチンの解離定数（Ｋｄ＝８．５±０．４０μＭ）を考えると当初は驚くべきものであったが、下記で論考するように、これは細胞外環境から細胞内環境へのキサンチンの膜透過が見られないことに起因するものであった。
実施例４．リボスイッチ活性化遺伝子についてのメタゲノムライブラリーのリボスイッチに基づく機能的選択
５７ＳＤｂ０１（非特許文献１０）及び５７ＳＤｂ０３（非特許文献１０）はヒト糞便メタゲノムＤＮＡライブラリーであり、ＡＢ９５Ｄ０１は土壌メタゲノムＤＮＡライブラリーである。簡潔に述べると、各々のライブラリーは上述の環境からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを１ｋｂ〜３ｋｂのサイズに剪断し、このＤＮＡをｐＺＥ２１クローニングベクター（非特許文献１９；挿入断片を有しないクローニングベクター）にクローニングすることによって作成した。エレクトロコンピテントＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞は上記の方法を用いて調製した。３つのライブラリー５７ＳＤｂ０１、５７ＳＤｂ０３及びＡＢ９５Ｄ０１の各々に由来する４００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、並びに対照としての２ｎｇのｐＺＥ２１を、エレクトロコンピテントＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞に上記の方法を用いたエレクトロポレーションによって形質転換した。１ｍＬのＳＯＣ培地中、３７℃で１時間回復させた後、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する９ｍＬのＬＢ培地に培養物を移し、振盪しながら３７℃で静止期まで成長させた。各メタゲノムライブラリーについて、０．５〜１×１０８個の細胞に相当する５０μＬ及び１００μＬをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ／寒天（約２時間乾燥させた）プレートにプレーティングし、３７℃で６９時間インキュベートした。ＬＢ／寒天は微量のキサンチンを含有することも見出された。プレーティングしなかった残りの培養物は、後続のスクリーニングのために１５％グリセロール溶液中−８０℃に維持した。
５７ＳＤｂ０１（非特許文献１０）及び５７ＳＤｂ０３（非特許文献１０）はヒト糞便メタゲノムＤＮＡライブラリーであり、ＡＢ９５Ｄ０１は土壌メタゲノムＤＮＡライブラリーである。簡潔に述べると、各々のライブラリーは上述の環境からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを１ｋｂ〜３ｋｂのサイズに剪断し、このＤＮＡをｐＺＥ２１クローニングベクター（非特許文献１９；挿入断片を有しないクローニングベクター）にクローニングすることによって作成した。エレクトロコンピテントＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞は上記の方法を用いて調製した。３つのライブラリー５７ＳＤｂ０１、５７ＳＤｂ０３及びＡＢ９５Ｄ０１の各々に由来する４００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、並びに対照としての２ｎｇのｐＺＥ２１を、エレクトロコンピテントＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞に上記の方法を用いたエレクトロポレーションによって形質転換した。１ｍＬのＳＯＣ培地中、３７℃で１時間回復させた後、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する９ｍＬのＬＢ培地に培養物を移し、振盪しながら３７℃で静止期まで成長させた。各メタゲノムライブラリーについて、０．５〜１×１０８個の細胞に相当する５０μＬ及び１００μＬをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（８０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ／寒天（約２時間乾燥させた）プレートにプレーティングし、３７℃で６９時間インキュベートした。ＬＢ／寒天は微量のキサンチンを含有することも見出された。プレーティングしなかった残りの培養物は、後続のスクリーニングのために１５％グリセロール溶液中−８０℃に維持した。
３７℃で６９時間の後、４１個のコロニーがＡＢ９５Ｄ０１ライブラリーで形質転換したＥｃｐＧＥＢＯ５．１をプレーティングしたプレート上に現れ、３個のコロニーが５７ＳＤｂ０１ライブラリーで形質転換したＥｃｐＧＥＢＯ５．１をプレーティングしたプレート上に現れた。対照ベクターｐＺＥ２１又は５７ＳＤｂ０３ライブラリーで形質転換したＥｃｐＧＥＢＯ５．１細胞をプレーティングしたプレート上に６９時間後に現れたコロニーはゼロであった。選択されたクローンの耐性を確認するために、各コロニーを再度画線培養し（restreaked）、選択培地中で成長させた。感受性が高く、確認実験において成長しなかった５７ＳＤｂ０１ライブラリーから選択された２個のコロニーを除く全ての株について耐性を確認した。
各コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ媒体に播種し、３７℃で２０時間インキュベートした。選択されたコロニーの各々のメタゲノム挿入断片を、プライマーＧＥＢＯ２９／３１を用いてＳａｎｇｅｒシークエンシング（Beckman Coulter，UK）によって双方向でシークエンシングした。各々の読取り、低品質スコアデータ（０．０１５未満、不確定ヌクレオチド２超）及び配列マッチングについて、クローニングベクターｐＺＥ２１をトリミングし、ＣＬＣ ＤＮＡ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ６．１を用いる更なる分析のために除外した。各クローンの読み取り値の各対のアセンブリを同じソフトウェアを用いて行った。Ｂｌａｓｔｘを用いて、アセンブルした配列をＧｅｎＢａｎｋの非冗長タンパク質配列データベース（２０１３年１月１９日）と比較した。Ｂｌａｓｔｘは、６つ全てのフレームで翻訳されたヌクレオチドクエリーと６つ全てのフレームで翻訳された非冗長ヌクレオチドデータベースとの間の局所配列アラインメントを計算するものである。
これに基づいて、同定された各々のオープンリーディングフレームの機能を仮定した（下記表を参照されたい）。配列分析により、シュードモナス種のタンパク質と７９％の同一性を有する推定多剤輸送タンパク質をコードするＡＢ９５Ｄ０１ライブラリーに由来する同一のメタゲノム挿入断片配列を保有する３５個のクローンが同定された。別の挿入断片がセラチア・リクファシエンス（Serratia liquefaciens）のタンパク質と９９％の同一性を有する別の推定多剤排出タンパク質をコードすることが見出された。多剤輸送（export）がクロラムフェニコール及びスペクチノマイシンの両方を標的とする場合、これは二重選択を効果的に克服することができる機構の１つであり、したがってこれらの結果が期待された。
キサンチンペルメアーゼ（細胞膜を介してキサンチンを輸送する酵素）と高い類似性（９９％）を有する２つの配列が同定された。一方はＡＢ９５Ｄ０１土壌ライブラリーから選択されたクローンから見出され（配列番号２０）、一方は５７ＳＤｂ０１糞便ライブラリーから選択されたクローンから見出された（配列番号２１）。実施例３で言及するように、キサンチンはテオフィリンリボスイッチアプタマーと結合することが示されているが（ｋｄ＝８．５±０．４０μＭ）、以前は成長培地への１ｍＭキサンチンの添加は選択的条件下でのＥｃｐＧＥＢＯ５．１の成長を可能としなかった。おそらく、これはＥｃｐＧＥＢＯ５．１による低度のキサンチンの移入に起因するものであった。上述のように、ＬＢ培地（その中で選択実験が行われた）は微量のキサンチンを含有する。これを増殖細胞中のキサンチンペルメアーゼの存在と結びつけて考えると、キサンチンの細胞内濃度はリボスイッチを活性化するレベルまで上昇する可能性があるため、これが選択されたキサンチンペルメアーゼが選択時の成長を可能にする機構であると仮定された。
この仮説を調べるために、キサンチンを用いた及び用いない成長実験を行った。初めに、ゲノム又はｐＧＥＢＯ５．１アッセイプラスミドの任意のバックグラウンド突然変異の推定的寄与を排除するために、ＡＢ９５Ｄ０１土壌メタゲノムライブラリーから推定キサンチンペルメアーゼをコードするライブラリープラスミド（ｐＺＥ２１＿１Ｈ）を抽出し、ＥｃｐＧＥＢＯ５．１株に再形質転換した。ＬＢ培地中で株を試験する代わりに、キサンチン無含有Ｍ９最少培地を使用して規定のキサンチン濃度の影響を試験した。空クローニングベクターｐＺＥ２１で形質転換したＥｃｐＧＥＢＯ５．１株（ＥｃｐＧＥＢＯ５．１＋ｐＺＥ２１）を対照として使用した。両方の株を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ及びアンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加した３ｍｌのＭ９最少培地に播種し、一晩成長させた。翌日、新たな３ｍｌの培養物を同じ条件下で調製し、初期培養物から３０μｌを移すことで播種した。指数増殖期（６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が約０．５に達する時点）に、培養物を用いて様々な濃度のキサンチン（下記表）を含むマイクロタイタープレート内の２００μｌのＭ９最小選択培地に播種した。播種材料は各培養物の初期ＯＤ６００が正確に０．０１となるよう希釈した。マイクロタイタープレートをBiotekのＥＬｘ８０８ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒにおいて２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。１６時間後にＯＤ６００を測定し、各々のキサンチン濃度の３回の生物学的反復により平均及び標準偏差を算出した。クロラムフェニコール又はスペクチノマイシンを用いず、０ｍＭ〜１ｍＭの範囲のキサンチン濃度で成長させた場合、どちらの株もキサンチンの存在の影響を受けなかった。選択（クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ及びスペクチノマイシン８０μｇ／ｍｌ）を適用した場合、キサンチンペルメアーゼ含有プラスミド（ｐＺＥ２＿１Ｈ）を保有する株について、キサンチンを添加した場合にのみ成長が観察された（表３）。実験から、ＤＮＡ挿入断片がキサンチンペルメアーゼタンパク質をコードし、キサンチンの取込みの増大が選択的条件下での成長を可能にするという予測が確認される。
表３．様々なキサンチン濃度に対する成長応答
本実施例から、本明細書に記載される遺伝子選択系を用いてエフェクター化合物、本例ではキサンチンを細胞外空間から細胞質へと輸送する輸送体酵素をコードする遺伝子配列を膨大なメタゲノムライブラリーから選択することができることが明らかに実証される。
本発明が輸送体化合物の選択に限定されず、実施例４で実証されるように輸送体化合物を選択する方法を用いて生体触媒を選択することができることを理解されたい。
簡潔に述べると、前駆体化合物（すなわち、所望の生成物へと生体内変換される基質）を、上記のようにメタゲノムライブラリーで形質転換された調節可能な遺伝子発現構築物（例えばｐＧＥＢＯ５．１）を含むコンピテント細胞系に供給することができる。
その後に選択条件下で増殖する細胞を続いて選択し、シークエンシングして、リボスイッチアプタマー結合化合物（すなわち所望の生体内変換生成物）への前駆体化合物の変換をもたらす生体触媒をコードする遺伝子配列を含むものを決定することができる。
次いで、上記生体触媒活性を上記の輸送体化合物の検証プロセス（すなわち、細胞を上記前駆体の存在下及び非存在下で成長させ、細胞成長をモニタリングする）とほぼ同じ方法で検出することができる。
本明細書において他に明示的に指定のない限り、「又は（or）」という単語は条件の一方のみが満たされる必要がある演算子「排他的ＯＲ（exclusive or）」とは対照的に、規定の条件のいずれか又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子の意味で用いられる。「含む（comprising）」という単語は、「からなる（consisting of）」を意味するのではなく「含む（including）」という意味で用いられる。上に認められる全ての過去の教示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書中の任意の先に公開された文献は、その教示が本書の日付においてオーストラリア等で共通の一般知識であることを承認又は説明するものとみなされることを認めるものではない。
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Claims (9)
- エフェクター化合物の作用を変調する少なくとも１つの一次モジュレーター化合物をコードする遺伝コード配列をｉｎ ｖｉｖｏで選択する方法であって、前記一次モジュレーター化合物を潜在的にコードするＤＮＡフラグメントのライブラリーを発現する宿主微生物の発現ライブラリーを、各々通常は微生物の増殖を防ぐことが可能な少なくとも２つの成長調節化合物の存在下で成長させることと、増殖する前記ライブラリー中の前記微生物を選択することとを含み、
前記一次モジュレーター化合物が、
前記エフェクター化合物への基質からの化学変換をもたらし、該基質が前記微生物に供給されるか、又は、
前記エフェクター化合物を前記微生物に輸送し、
前記宿主微生物が調節可能な遺伝子発現構築物を含み、該調節可能な遺伝子発現構築物が核酸分子を含み、該核酸分子が少なくとも２つの調節配列を含み、該調節配列が各々それぞれのコード領域に操作可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、各リボスイッチが前記エフェクター化合物の存在に応答してそのそれぞれのコード領域の発現を調節し、各コード領域がそれぞれの前記成長調節化合物の作用を変調するそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードし、それにより所望の一次モジュレーター化合物を産生する前記ライブラリー中の前記微生物を前記少なくとも２つの成長調節化合物の存在下で増殖させることが可能である、方法。 - 前記宿主微生物の発現ライブラリーが潜在的一次モジュレーター化合物群を産生する多数の宿主細胞を含み、該多数の宿主細胞が、
本質的に各々の宿主細胞が少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードするクローニングされた核酸フラグメント又は突然変異したゲノムを含む単一細胞型の細胞のライブラリーであるか、又は、
本質的に各々の宿主細胞が少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする核酸フラグメントを含む異なる細胞型の細胞である、請求項１に記載の方法。 - 前記宿主微生物を抗生物質化合物からなる前記少なくとも２つの成長調節化合物を含む成長培地中で前記基質と接触させる、請求項１に記載の方法、
ただし、前記リボスイッチに連結したコード領域が、前記抗生物質化合物に対する抗生物質耐性をもたらすそれぞれの酵素をコードする。 - 前記発現ライブラリーの前記宿主微生物が、各々が多段階化学変換反応の少なくとも１つの反応を触媒することが可能な少なくとも２つの一次モジュレーター化合物をコードする１つ又は複数の核酸分子を含み、前記多段階化学変換反応の少なくとも１つにより前記エフェクター化合物の作用を変調する、請求項１に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーの微生物宿主細胞が少なくとも２つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする１つ又は複数の核酸分子を含み、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物が前記エフェクター化合物への基質からの化学変換をもたらし、少なくとも１つの一次モジュレーター化合物が前記基質を前記微生物内に輸送する、請求項１に記載の方法。
- 増殖する前記ライブラリー中の微生物から少なくとも１つの一次モジュレーター化合物をコードする前記遺伝コード配列を選択することと、
選択された前記遺伝コード配列を微生物宿主細胞に遺伝子導入法によって導入することにより産生株を作製することと、
を更に含み、
前記産生株が前記少なくとも１つの一次モジュレーター化合物を産生する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 潜在的一次モジュレーター化合物群の中から一次モジュレーター化合物を選択する方法に使用するのに好適な微生物宿主細胞のライブラリーであって、該微生物宿主細胞が各々、
少なくとも１つの潜在的一次モジュレーター化合物をコードする少なくとも１つの核酸分子であって、該一次モジュレーター化合物が、
エフェクター化合物への基質からの化学変換をもたらし、該基質が前記微生物宿主細胞に供給されるか、又は、
前記エフェクター化合物を前記微生物宿主細胞に輸送する、少なくとも１つの核酸分子と、
少なくとも２つ以上の調節配列をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物であって、該調節配列の各々が、それぞれの成長調節化合物の作用を変調するそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードするそれぞれのコード領域に操作可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、各リボスイッチが前記エフェクター化合物の存在に応答してそのそれぞれのコード領域の発現を調節する、少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物と、
を含む、微生物宿主細胞のライブラリー。 - 微生物宿主細胞であって、該微生物宿主細胞が少なくとも１つの調節可能な遺伝子発現構築物と、エフェクター化合物の作用を変調する少なくとも１つの一次モジュレーター化合物をコードする少なくとも１つの核酸分子とを含み、
前記調節可能な遺伝子発現構築物が２つ以上の調節配列を含み、
該調節配列の各々が前記エフェクター化合物に応答するリボスイッチを含むＲＮＡ分子をコードし、該リボスイッチの各々がそれぞれのコード領域に操作可能に連結し、
各コード領域が前記微生物宿主細胞に抗生物質耐性をもたらすそれぞれの二次モジュレーター化合物をコードし、
各前記調節配列中の前記リボスイッチが前記エフェクター化合物に応答して、そのそれぞれの前記二次モジュレーター化合物の発現を誘発し、
前記一次モジュレーター化合物が、
前記エフェクター化合物への基質からの化学変換をもたらすか、又は、
細胞外空間から細胞内空間へと化合物を輸送し、前記輸送された化合物が前記基質又は前記エフェクター化合物である、微生物宿主細胞。 - 前記微生物宿主細胞が細菌細胞、植物細胞、酵母細胞又は動物細胞である、請求項８に記載の微生物宿主細胞。
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