CN111849848B

CN111849848B - 一种抗噬菌体的大肠杆菌底盘细胞的构建及应用

Info

Publication number: CN111849848B
Application number: CN202010715301.8A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 尤甲甲; 潘学玮; 徐美娟; 杨套伟; 张显; 王雅玲; 易敢峰; 付维来
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: CN111849848A

Abstract

本发明公开了一种抗噬菌体的大肠杆菌底盘细胞的构建及应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌BL21中过表达LysR家族转录调控因子YafC编码基因yafC，显著提高了大肠杆菌抗噬菌体能力；进一步利用本发明选育得到的抗噬菌体大肠杆菌BL21构建γ‑氨基丁酸(GABA)生产菌株BL21‑pET28a(+)‑YafC‑Gad，并用于生物转化生产γ‑氨基丁酸发现，整个发酵进程中不再存在噬菌体感染的风险，且重组菌株GABA的产量高达278.3±16.8g/L，摩尔转化率达98.4±0.3％。

Description

一种抗噬菌体的大肠杆菌底盘细胞的构建及应用

技术领域

本发明涉及一种抗噬菌体的大肠杆菌底盘细胞的构建及应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

发酵工业作为生物技术产业化的重要环节之一，随着我国加大对生物技术产业的关注以及国民对生物技术产品需求的日益增加，以氨基酸、有机酸、维生素等产品为代表的发酵工业总产值已位居世界前列。然而，在传统发酵工业和现代工业生物制造体系的过程中，噬菌体一直伴随着发酵工业，并威胁发酵过程的安全性，长期以来对发酵企业造成了巨大的经济损失。以常见工业微生物大肠杆菌为例，其已被广泛应用于生物技术产业的多个领域，并已发展成为包括1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、琥珀酸、苏氨酸和青蒿素等在内化学品、生物材料、药物及其中间体的生物合成的重要平台微生物。

大肠杆菌感染噬菌体后，过去通常采用甲醛熏蒸、管道灭菌或菌种轮换等措施来保证生产的持续性，但这些应对策略不仅耗时长、要求严格、成本高，而且效果差，无法从根本上解决噬菌体感染的问题。因此，选育高效的抗噬菌体工业大肠杆菌底盘细胞，对解决发酵工业噬菌体感染具有重要意义。

发明内容

为解决目前存在的问题，本发明在大肠杆菌中过表达噬菌体抗性基因yafC以提高大肠杆菌耐受噬菌体感染；所述蛋白YafC为大肠杆菌底盘细胞抗噬菌体蛋白，蛋白YafC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白YafC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种底盘细胞，所述重组菌过表达基因yafC。

在本发明的一种实施方式中，基因yafC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述底盘细胞为真核或原核细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述底盘细胞为大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

在本发明的一种实施方式中，所述底盘细胞以pET系列、pGEX系列、pEZZ18载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET28a(+)、pET21a、pET32a、pET-22b(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述pGEX系列包括pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pET系列、pGEX系列、pEZZ18载体为出发载体。

本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因在提高大肠杆菌抗噬菌体能力中的应用。

在本发明的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因在大肠杆菌中过表达。

本发明提供了一种提高大肠杆菌抗噬菌体能力的方法，所述方法为在大肠杆菌中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因，或向大肠杆菌转入所述表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

本发明还保护所述重组菌，或所述表达载体，或提高大肠杆菌抗噬菌体能力的方法在生产目的产物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

在本发明的一种实施方式中，将与目的产物生产相关的基因连接至表达载体，再将表达载体转入宿主细胞中得到重组菌，再将重组菌加入发酵体系。

在本发明的一种实施方式中，所述目的产物为γ-氨基丁酸；与目的产物为γ-氨基丁酸生产相关的基因gad(谷氨酸脱羧酶编码基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基成分：葡萄糖5～15g/L，大豆蛋白胨10～15g/L，酵母膏10～15g/L，玉米浆10～15g/L，尿素2～5g/L，K₂HPO₄4～6g/L，KH₂PO₄3～6g/L，MgSO₄1～2g/L，NaCl 3～6g/L和L-谷氨酸钠2～5g/L。

有益效果：

(1)本发明通过在大肠杆菌底盘细胞BL21中过表达噬菌体抗性基因yafC，显著提高了大肠杆菌底盘细胞BL21抗噬菌体能力；将利用本发明的方法制备得到的抗噬菌体大肠杆菌底盘细胞在转化合成γ-氨基丁酸的过程中，不再存在污染噬菌体的问题。

(2)本发明通过在大肠杆菌底盘细胞BL21中过表达噬菌体抗性基因yafC，得到了高效抗噬菌体大肠杆菌底盘细胞；将本发明的抗噬菌体大肠杆菌底盘细胞用于转化L-谷氨酸合成γ-氨基丁酸的进程中，不但解决了噬菌体污染的问题，而且重组菌株γ-氨基丁酸(GABA)的产量高达278.3±16.8g/L，摩尔转化率达98.4±0.3％。

(3)利用本发明的方法得到的抗噬菌体底盘细胞耐受噬菌体感染效果好，且不会对大肠杆菌本身的生长造成影响，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1为Spotting assay验证yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC耐受噬菌体感染。

图2为噬菌体作用于野生型菌株BL21及yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC抑菌曲线的测定。

具体实施方式

下述实施例中涉及的pET28a(+)质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心.

下述实施例中涉及的大肠杆菌BL21购自北纳生物，产品编号为BNCC353806。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.0。

发酵培养基：10g/L葡萄糖、12g/L大豆蛋白胨、12g/L酵母膏、12g/L玉米浆、3g/L尿素、4.35g/L K₂HPO₄、3.4g/L KH₂PO₄、1.2g/L MgSO₄、5g/L NaCl、3g/LL-谷氨酸钠，pH7.0。

测定发酵液中的γ-氨基丁酸含量：检测方法参照田灵芝.高效转化生产γ-氨基丁酸重组大肠杆菌构建及其条件优化[D].江南大学,2012。

实施例1：yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC的构建

具体步骤如下：

(1)根据大肠杆菌BL21噬菌体抗性蛋白YafC编码基因yafC核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)设计引物YafC-F和YafC-R，以大肠杆菌BL21基因组DNA为模板，扩增得到同时含有yafC基因序列的DNA片段，将该DNA片段与pET28a(+)质粒经BamHI酶和EcoRI酶酶切酶连后进行连接，得到重组质粒pET28a(+)-YafC；将重组质粒pET28a(+)-YafC转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中，将转化液涂布于含100μg/mL卡那抗性的LB平板，在37℃培养至长出单菌落；挑取单菌落至含100μg/mL卡那抗性的LB液体培养基，在37℃、200rpm培养8～12h，利用质粒提取试剂盒提取菌液中的质粒，将质粒经PCR验证，并送去测序，验证正确的为阳性转化子，即为重组菌株BL21/pET28a(+)-YafC。

YafC-F：CGCGGATCCATGAAAGCCACGTCGGAAGAACT(SEQ ID NO.3)；

YafC-R：CGCGAATTCTTAAGCCTCTCTGACAGCTCCTCC(SEQ ID NO.4)。

实施例2：yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC耐受噬菌体敏感性的验证

具体步骤如下：

将过夜培养的野生型菌株BL21，及实施例1中得到的yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃、180rpm培养至对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)后，分别通过spotting assay和噬菌体作用于两株菌抑菌曲线的测定，以验证yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC抗噬菌体能力。

spotting assay具体操作步骤：将过夜培养(16h)的野生型大肠杆菌BL21及yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC分别接种于新鲜的液体LB培养集中，37℃、180rpm培养至对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.8)，而后分别吸取200μL BL21及BL21/pET28a(+)-YafC菌落于3mL半固体LB培养基中，混匀，倒至底层固体LB培养基中。待上层培养基凝固后，吸取1μL噬菌体phi21裂解液点于半固体培养基中央，于37℃，静置培养24h后，通过观察平板，分析噬菌体作用于野生型大肠杆菌BL21及yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC的敏感性。如图2所示，菌株BL21因为其不抗噬菌体，噬菌体将其裂解，而在平板中央添加噬菌体的位置形成了透明圈；而由于菌株BL21/pET28a(+)-YafC的抗噬菌体能力，因而其不会被噬菌体裂解，使得菌株能正常生长。

为测定噬菌体作用下野生型大肠杆菌BL21及yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC的抑菌曲线，控制感染复数(MOI)＝0或10，在培养至对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)的上述菌液中加入适量的大肠杆菌噬菌体phi21，在37℃、180rpm条件下培养噬菌体及其宿主细胞混合物，每隔30min，收集样品并测定OD₆₀₀，绘制得到噬菌体作用下，野生型大肠杆菌BL21及yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC的生长曲线。

结果显示，通过测定大肠杆菌噬菌体phi21作用于野生型菌株BL21及yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC的敏感性发现，噬菌体作用于野生型菌株BL21可形成清晰的透明圈，而作用于yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC不形成透明圈(图1)，说明yafC过表达菌株可高效耐受噬菌体感染，该结果与噬菌体phi21作用于野生型菌株BL21时，BL21的生长受到严重抑制，而作用于yafC过表达菌株BL21/pET28a(+)-YafC时，菌体生长基本与野生型的正常生长结果一致(图2)。

实施例3：高效抗噬菌体底盘细胞BL21/pET28a(+)-YafC在γ-氨基丁酸全细胞转化进程中的应用

构建载体pET28a(+)-YafC-Gad：将如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，利用SacI和NotI酶酶切连接至重组质粒pET28a(+)-YafC，得到重组质粒pET28a(+)-YafC-Gad；将重组质粒pET28a(+)-YafC-Gad转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中，将转化液涂布于含100μg/mL卡那抗性的LB平板，在37℃培养至长出单菌落；挑取单菌落至含100μg/mL卡那抗性的LB液体培养基，在37℃、200rpm培养8～12h，利用胶回收试剂盒提取菌液中的质粒，将质粒经酶切验证，并送测序，验证正确的为阳性转化子，即为重组菌株BL21/pET28a(+)-YafC-Gad。

将重组菌株BL21/pET28a(+)-YafC-Gad在LB液体培养基中培养至OD₆₀₀为1.0，以3％的接种量接种至发酵培养基中。起初8h为温度37℃、转速200rpm、pH 7.0，8h后发酵条件为温度30℃、转速180rpm、pH 7.0，并加入1.5g/L乳糖诱导培养8h。6000rpm、10min离心收集细胞后，以L-谷氨酸为底物，全细胞转化生产γ-氨基丁酸。全细胞转化体系为：0.2mol/LpH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液、底物L-谷氨酸的量为50g/L，转化温度为37℃。

全细胞转化结束后，测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。结果表明，整个发酵进程中不再存在噬菌体感染的风险，且重组菌株γ-氨基丁酸(GABA)的产量高达278.3±16.8g/L，摩尔转化率达98.4±0.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种抗噬菌体的大肠杆菌底盘细胞的构建及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Ala Thr Ser Glu Glu Leu Ala Ile Phe Val Ser Val Val Glu

1 5 10 15

Ser Gly Ser Phe Ser Arg Ala Ala Glu Gln Leu Gly Gln Ala Asn Ser

20 25 30

Ala Val Ser Arg Ala Val Lys Lys Leu Glu Met Lys Leu Gly Val Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Arg Thr Thr Arg Gln Leu Ser Leu Thr Glu Glu Gly Glu

50 55 60

Arg Tyr Phe Arg Arg Val Gln Ser Ile Leu Gln Glu Met Ala Ala Ala

65 70 75 80

Glu Ser Glu Ile Met Glu Thr Arg Asn Thr Pro Arg Gly Leu Leu Arg

85 90 95

Ile Asp Ala Ala Thr Pro Val Val Leu His Phe Leu Met Pro Leu Ile

100 105 110

Lys Pro Phe Arg Glu Arg Tyr Pro Glu Val Thr Leu Ser Leu Val Ser

115 120 125

Ser Glu Thr Ile Ile Asn Leu Ile Glu Arg Lys Val Asp Val Ala Ile

130 135 140

Arg Ala Gly Thr Leu Thr Asp Ser Ser Leu Arg Ala Arg Pro Leu Phe

145 150 155 160

Asn Ser Tyr Arg Lys Ile Ile Ala Ser Pro Asp Tyr Ile Ser Arg Tyr

165 170 175

Gly Lys Pro Glu Thr Ile Asp Asp Leu Lys Gln His Ile Cys Leu Gly

180 185 190

Phe Thr Glu Pro Ala Ser Leu Asn Thr Trp Pro Ile Ala Arg Ser Asp

195 200 205

Gly Gln Leu His Glu Val Lys Tyr Gly Leu Ser Ser Asn Ser Gly Glu

210 215 220

Thr Leu Lys Gln Leu Cys Leu Ser Gly Asn Gly Ile Ala Cys Leu Ser

225 230 235 240

Asp Tyr Met Ile Asp Lys Glu Ile Ala Arg Gly Glu Leu Val Glu Leu

245 250 255

Met Ala Asp Lys Val Leu Pro Val Glu Met Pro Phe Ser Ala Val Tyr

260 265 270

Tyr Ser Asp Arg Ala Val Ser Thr Arg Ile Arg Ala Phe Ile Asp Phe

275 280 285

Leu Ser Glu His Val Lys Thr Ala Pro Gly Gly Ala Val Arg Glu Ala

290 295 300

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaagcca cgtcggaaga actcgccatt tttgtttcgg tcgtcgaaag cggcagcttt 60

agccgggcag cggaacaatt agggcaagca aactcagcgg taagccgggc ggtgaaaaag 120

ctggagatga aacttggcgt tagcctgctt aatcggacca cgcgacaact tagcctgacg 180

gaagaaggcg agcgttattt tcgtcgcgta cagtcaattt tgcaggagat ggcagcggca 240

gaatcagaaa ttatggagac gcgtaataca ccgcgtggac tgttacggat cgatgccgca 300

actccagtgg tgctgcactt tctgatgccg ttaattaagc ctttccgtga acgctatccg 360

gaagtcactt tgtcgctagt ctcctccgaa acgattatta atttgatcga aagaaaagtg 420

gatgtcgcga tacgcgctgg tacgttaacg gattccagct tacgtgccag gccgttattt 480

aacagttatc gaaaaattat cgcctccccc gattatattt cccgctacgg gaagccagaa 540

acgatcgacg atttaaagca acatatttgc ctgggattca ctgaacccgc ttccctcaat 600

acctggccga tagcccgtag cgatggacaa ttacatgagg tgaagtacgg tttgtcatcc 660

aatagtgggg aaacactgaa acagctttgc ctgagtggca acgggattgc gtgtttgtcc 720

gactacatga tcgacaaaga aatcgctcgc ggagaattgg tggagttaat ggcagataaa 780

gtgttgccag tggaaatgcc attcagtgcc gtctattaca gcgaccgtgc ggtaagtacg 840

cgcatccggg cttttatcga tttccttagc gagcatgtaa aaacagctcc cggaggagct 900

gtcagagagg cttaa 915

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgaaagccac gtcggaagaa ct 32

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgaattct taagcctctc tgacagctcc tcc 33

<210> 5

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcaatgt tatacggtaa acacaatcat gaagctgaag aatacttgga accagtcttt 60

ggtgcgcctt ctgaacaaca tgatcttcct aagtatcggt taccaaagca ttcattatcc 120

cctcgagaag ccgatcgctt agttcgtgat gaattattag atgaaggcaa ttcacgactg 180

aacctggcaa ctttttgtca gacctatatg gaacccgaag ccgttgaatt gatgaaggat 240

acgctggcta agaatgccat cgacaaatct gagtaccccc gcacggccga gattgaaaat 300

cggtgtgtga acattattgc caatctgtgg cacgcacctg atgacgaaca ctttacgggt 360

acctctacga ttggctcctc tgaagcttgt atgttaggcg gtttagcaat gaaattcgcc 420

tggcgtaaac gcgctcaagc ggcaggttta gatctgaatg cccatcgacc taacctcgtt 480

atttcggctg gctatcaagt ttgctgggaa aagttttgtg tctactggga cgttgacatg 540

cacgtggtcc caatggatga gcaacacatg gtccttgacg ttaaccacgt cttagactac 600

gtggacgaat acacaattgg tatcgtcggt atcatgggca tcacttatac cggtcaatat 660

gacgacctag ccgcactcga taaggtcgtt actcactaca atcatcagca tcccaaatta 720

ccagtctaca ttcacgttga cgcagcgtca ggtggcttct ataccccatt tattgagccg 780

caactcatct gggacttccg gttggctaac gtcgtttcga tcaacgcctc cgggcacaag 840

tacggtttag tttatcccgg ggtcggctgg gtcgtttggc gtgatcgtca gtttttaccg 900

ccagaattag tcttcaaagt tagttattta ggtggggagt tgccgacaat ggcgatcaac 960

ttctcacata gtgcagccca gctcattgga caatactata atttcattcg ctttggtatg 1020

gacggttacc gcgagattca aacaaagact cacgatgttg cccgctacct ggcagccgct 1080

ctggataaag ttggtgagtt taagatgatc aataacggac accaactccc cctgatttgt 1140

taccaactag ccccgcgcga agatcgtgaa tggacccttt atgatttatc ggatcgccta 1200

ttaatgaacg gttggcaagt accaacgtat cctttacctg ctaatctgga acaacaagtc 1260

atccaacgaa tcgtcgttcg ggctgacttt ggcatgaata tggcccacga tttcatggat 1320

gacctgacca aggctgtcca tgacttaaac cacgcccaca ttgtctatca tcatgacgcg 1380

gcacctaaga aatacggatt cacacactga 1410

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因在提高大肠杆菌抗噬菌体能力中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因在大肠杆菌中过表达。

3.一种提高大肠杆菌抗噬菌体能力的方法，其特征在于，在大肠杆菌中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示基因，或向大肠杆菌转入含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因的表达载体。

4.权利要求3所述方法在生产目的产物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将与目的产物生产相关的基因连接至表达载体，再将表达载体转入宿主细胞中得到重组菌，再将重组菌加入发酵体系。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目的产物为γ-氨基丁酸。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵体系中的发酵培养基成分：葡萄糖5~15 g/L，大豆蛋白胨10~15 g/L，酵母膏10~15 g/L，玉米浆10~15 g/L，尿素2~5 g/L，K₂HPO₄ 4~6 g/L，KH₂PO₄ 3~6 g/L，MgSO₄ 1~2 g/L，NaCl 3~6 g/L和L-谷氨酸钠2~5 g/L。