CN111394291A

CN111394291A - 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产l-谷氨酸的方法

Info

Publication number: CN111394291A
Application number: CN202010227468.XA
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 乔郅钠; 徐美娟; 龙梦飞; 杨套伟; 张显; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN111394291B

Abstract

本发明公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L‑谷氨酸的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种可低产L‑丙氨酸、L‑酪氨酸、L‑缬氨酸、L‑胱氨酸和L‑甲硫氨酸等副产物的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19‑cg2115，将此菌株接种至5‑L发酵罐中发酵48h所获得的发酵液中L‑丙氨酸、L‑酪氨酸、L‑缬氨酸、L‑胱氨酸和L‑甲硫氨酸的含量分别仅有0.15g/L、0.185g/L、0.369g/L、0.02g/L和0.277g/L，分别较野生型谷氨酸棒杆菌G01降低了98.1％、96.1％、86.1％、99.4％和91.4％。

Description

一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

L-谷氨酸是一种酸性氨基酸，其在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。医学上，L-谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷和改善儿童智力发育。食品工业上，L-谷氨酸主要作为味精用于增鲜。

过去，常常通过蛋白水解法和化学合成法生产L-谷氨酸，但是，由于蛋白水解法具有操作复杂、费时费力、成本高和产量低等缺陷，化学合成法存在严重的环境污染问题，因此，现改用环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产的微生物发酵法生产L-谷氨酸。

然而，现有的微生物发酵法也存在一定的缺陷，其中，副产物多所造成的下游分离纯化困难就是限制L-谷氨酸的工业化生产进程做主要的缺陷之一，例如，斯晗等人将谷氨酸棒杆菌S9114接种至发酵培养基中发酵36h所获得的发酵液中L-谷氨酸的产量仅有36.7g/L，而副产物L-丙氨酸的产量却高达3g/L(具体可见参考文献：斯晗.产γ-氨基丁酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及相关分解酶的研究[D].江南大学硕士学位论文)。

因此，急需找到一种可低产/不产L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸等副产物的L-谷氨酸生产菌株以克服现有微生物发酵法缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可低产L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸等副产物的重组谷氨酸棒杆菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，表达编码转录调控因子cg2115的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述转录调控因子cg2115的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码转录调控因子cg2115的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为宿主，以pXMJ19质粒、pJYW-4质粒、pEC-XK99E质粒或pDXW-10质粒为载体表达编码转录调控因子cg2115的基因。

本发明还提供了一种发酵生产L-谷氨酸的方法，所述方法为先将上述重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-谷氨酸的发酵液，然后将含有L-谷氨酸的发酵液进行分离，获得L-谷氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为28～31℃、转速为500～600rpm、pH为7.0～7.2。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为600rpm、pH为7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/L、三水合磷酸氢二钾1.0～1.5g/L、七水合硫酸镁0.2～0.6g/L、玉米浆2.5～5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005～0.008g/L、一水合硫酸锰0.005～0.008g/L以及尿素5.5～7.0g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L、一水合硫酸锰0.005g/L以及尿素7.0g/L。

本发明还提供了上述重组谷氨酸棒杆菌或上述方法在生产L-谷氨酸中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可低产L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸等副产物的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115，将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115接种至5-L发酵罐中发酵48h所获得的发酵液中L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸的含量分别仅有0.15g/L、0.185g/L、0.369g/L、0.02g/L和0.277g/L，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)G01降低了98.1％、96.1％、86.1％、99.4％和91.4％，因此，利用此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115发酵生产L-谷氨酸具有副产物少，下游分离纯化简单的优势。

(2)本发明提供了一种糖酸转化率高的重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115，将此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115接种至5-L发酵罐中发酵生产L-谷氨酸的糖酸转化率高达54.9％，因此，利用此重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115发酵生产L-谷氨酸具有成本低的优势。

附图说明

图1：C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115菌株转化子的PCR验证结果；其中，M：10000bp核酸Marker，泳道1～2：cg2115基因片段。

图2：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的细胞破碎上清液的凝胶电泳图；其中，M：蛋白Marker，1：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01，2：重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115。

图3：C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115菌株第一轮同源重组转化子的PCR验证结果；其中，M：10000bp核酸Marker，泳道1：C.glutamicum G01中含敲除同源臂和完整cg2115基因的片段，泳道2～4：最上面条带为C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115菌株中含敲除同源臂和完整cg2115基因的片段，最下面条带为C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115菌株中含敲除同源臂和部分cg2115基因的片段。

图4：C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115菌株第二轮同源重组转化子的PCR验证结果；其中，M：10000bp核酸Marker，泳道1：C.glutamicum G01中含敲除同源臂和完整cg2115基因的片段，泳道2～4：C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115菌株中含敲除同源臂和部分cg2115基因的片段。

图5：不同谷氨酸棒杆菌发酵获得的发酵液中各氨基酸的含量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的pK18mobsacB质粒以及pXMJ19质粒购自优宝生物；下述实施例中涉及的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01记载于文献“Efficient one-step preparation ofγ-aminobutyric acid from glucose withoutan exogenous cofactor by the designed Corynebacterium glutamicum”中，保藏编号为CCTCC No:M 2013418(谷氨酸棒杆菌G01已进行过保藏，无需再次进行专利程序上的保藏)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

LBG液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖。

LBG固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、5g/L葡萄糖、琼脂粉15g/L。

种子培养基：25g/L葡萄糖、1.5g/L K₂HPO₄·3H₂0、0.6g/LMgSO₄、30g/L玉米浆、2.5g/L尿素、0.005g/L FeSO₄.·7H₂O、0.005g/L MnSO₄·4H₂O，pH为7.0。

发酵培养基：葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L、一水合硫酸锰0.005g/L、尿素7.0g/L，pH为7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

葡萄糖含量、L-谷氨酸含量和糖酸转化率的测定：采用Bio-SBA生物分析仪分析发酵液中葡萄糖和L-谷氨酸的含量，吸取25μL的标准液SBA进行标定，标定结束，取1mL发酵液进行稀释后，吸取25μL稀释后的发酵液进行测定，记录数据；

糖酸转化率的计算公式如下：

式中：η：糖酸转化率；C_L-谷氨酸：发酵结束后发酵罐中L-谷氨酸的浓度，g/L；C₀：初糖浓度，g/L；C_葡萄糖：发酵结束后发酵罐中葡萄糖浓度，g/L；V₁：消耗80％葡萄糖溶液的体积，L；V：下罐前发酵液体积，L。

菌体浓度的测定：使用UV-2000Z紫外可见分光光度计测定在600nm处的吸光值。

L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-甘氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸和L-脯氨酸含量的测定：采用HPLC法(OPA和FMOC-Cl联用的自动衍生化法)测定，流动相A(pH7.2)：27.6mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃(体积比为500：0.11：2.5)；流动相B(pH7.2)：80.9mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈(体积比为1：2：2)；使用Agilent Hypersil ODS柱(5μm，4.0mm×250mm)进行梯度洗脱；具体洗脱程序为：0min，8％B；17min，50％B；20.1min，100％B；24.0min，0％B；流动相流速为1.0mL/min；柱温为40℃；除L-脯氨酸以262nm检测，其余氨基酸的检测波长均为338nm；氨基酸含量采用外标法进行定量。

实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建

具体步骤如下：

1、重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115的构建

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的基因组为模板，以pXMJ19-cg2115-F、pXMJ19-cg2115-R为引物进行PCR扩增，得到核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的编码转录调控因子cg2115(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的基因；将此编码转录调控因子cg2115的基因与pXMJ19质粒经限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1氯霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证(并送苏州金唯智有限公司进行测序分析)，验证正确即获得转化成功的重组质粒pXMJ19-cg2115；其中，引物如下：

pXMJ19-cg2115-F:GAAACAGAATTAATTAAGCTTAAAGGAGGGAAATCATGTACGCAGAGGAGCGCCGTCGACAGATT(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)；

pXMJ19-cg2115-R:CAAAACAGCCAAGCTGAATTCTTATTCTGCAATCACAACTTCTACATCGCGTTCTCGCAACTGC(氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)。

将重组质粒pXMJ19-cg2115电转谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，得到转化产物；将转化产物涂布于含50μg·mL^-1氯霉素的LBG固体培养基，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子进行PCR验证(验证结果见图1)，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115。

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为对照，将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115的转化子在含50μg·mL^-1氯霉素的LBG固体培养基上划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到单菌落；

挑取单菌落接种至10mL LBG液体培养基中，于30℃、180r/min培养24h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)的接种量转接至50mL LBG液体培养基，于30℃、180r/min培养5d后，在LBG液体培养基中添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于30℃、180rpm下诱导表达12h，得到发酵液；将发酵液4℃下离心20min后收集菌体；将菌体用PBS缓冲液(0.1mol/L、pH7.4)洗涤两次后重悬于PBS缓冲液至OD₆₀₀＝5，得到重悬液；将重悬液利用超声破碎仪破碎，得到细胞破碎液；将细胞破碎液4℃下离心20min后收集上清，得到细胞破碎上清液；对细胞破碎上清液进行SDS-PAGE分析(分析结果见图2)。

由图2可知，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115确实可表达转录调控因子cg2115。

2、重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115的构建

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01的基因组为模板，分别以cg2115-1/cg2115-2和cg2115-3/cg2115-4为引物进行PCR扩增，得到得到两个大小为600bp的上下游同源臂片段cg2115-L(氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)和cg2115-R(氨基酸序列如SEQ ID No.6所示)；以cg2115-1/cg2115-4为引物，以cg2115-L和cg2115-R为模板进行融合PCR，得到基因内部缺失片段Δcg2115；将基因内部缺失片段Δcg2115与pK18mobsacB质粒经限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证(并送苏州金唯智有限公司进行测序分析)，验证正确即获得转化成功的重组质粒pK18-Δcg2115；其中，引物如下：

cg2115-1:CTATGACATGATTACGAATTCTGTTGTTCGTTCCCAGCCGGTC(氨基酸序列如SEQID No.7所示)；

cg2115-2:CCCATCCACTAAACTTAAACACTGCAGTGACATCGAATCGGC(氨基酸序列如SEQID No.8所示)；

cg2115-3:TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGAATCAGCGATATCGATGTGGT(氨基酸序列如SEQID No.9所示)；

cg2115-4:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTACCAGTTGCTGCGATAGCTACC(氨基酸序列如SEQID No.10所示)。

将重组质粒pK18-Δcg2115电转谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，得到转化产物；将转化产物涂布于含50μg·mL^-1卡那霉素的LBG固体培养基，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子进行PCR验证(验证结果见图3)；将验证正确的转化子转接至含10g/L蔗糖的LBG液体培养基，于30℃、180rpm下摇床培养36h，得到菌液；将菌液在LBG固体培养基上进行划线，于30℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；将转化子进行PCR验证(验证结果见图4)，验证正确即获得重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicumG01/pK18-Δcg2115。

实施例4：L-谷氨酸的生产

具体步骤如下：

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为对照，分别将重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115和重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115的单菌落接种至10mL种子培养基中，于30℃、180r/min培养24h，得到一级种子液；将一级种子液全部转接入200mL种子培养基中，于30℃、180r/min培养18h，得到二级种子液；将二级种子液全部转接入含有2L发酵培养基的5L发酵罐中，于温度为30℃、转速为600r/min的条件下发酵48h，获得发酵液；发酵过程中，通过流加浓度为50％(v/v)的氨水维持发酵培养基的pH为7.0，通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液维持发酵培养基中葡萄糖的浓度不低于30g/L。

发酵过程中，间隔6h检测发酵液中的L-谷氨酸的产量以及除L-谷氨酸以外其他氨基酸的产量(检测结果见图5)，检测结果如下：

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为93.53g/L，糖酸转化率为45.2％，L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸的产量分别为7.96g/L、4.79g/L、3.22g/L、3.08g/L和2.66g/L。

重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pXMJ19-cg2115发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为87.65g/L，糖酸转化率高达54.9％，L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸的产量分别仅有0.15g/L、0.185g/L、0.369g/L、0.02g/L和0.277g/L，分别较野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01降低了98.1％、96.1％、86.1％、99.4％和91.4％。

重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum G01/pK18-Δcg2115发酵获得的发酵液中L-谷氨酸的产量为96.38g/L，糖酸转化率仅有22.5％，L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸的产量分别为11.4g/L、0.22g/L、2.537g/L、0.019g/L和0.0103g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 1

Met Tyr Ala Glu Glu Arg Arg Arg Gln Ile Ala Ser Leu Thr Ala Val

1 5 10 15

Glu Gly Arg Val Asn Val Thr Glu Leu Ala Gly Arg Phe Asp Val Thr

20 25 30

Ala Glu Thr Ile Arg Arg Asp Leu Ala Val Leu Asp Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val His Arg Val His Gly Gly Ala Val Ala Thr Gln Ser Phe Gln Thr

50 55 60

Thr Glu Leu Ser Leu Asp Thr Arg Phe Arg Ser Ala Ser Ser Ala Lys

65 70 75 80

Tyr Ser Ile Ala Lys Ala Ala Met Gln Phe Leu Pro Ala Glu His Gly

85 90 95

Gly Leu Phe Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Thr Ala Leu Ala Asp Leu

100 105 110

Ile Ser Glu His Pro Ser Ser Lys Gln Trp Ser Ile Val Thr Asn Cys

115 120 125

Leu Pro Ile Ala Leu Asn Leu Ala Asn Ala Gly Leu Asp Asp Val Gln

130 135 140

Leu Leu Gly Gly Ser Val Arg Ala Ile Thr Gln Ala Val Val Gly Asp

145 150 155 160

Thr Ala Leu Arg Thr Leu Ala Leu Met Arg Ala Asp Val Val Phe Ile

165 170 175

Gly Thr Asn Ala Leu Thr Leu Asp His Gly Leu Ser Thr Ala Asp Ser

180 185 190

Gln Glu Ala Ala Met Lys Ser Ala Met Ile Thr Asn Ala His Lys Val

195 200 205

Val Val Leu Cys Asp Ser Thr Lys Met Gly Thr Asp Tyr Leu Val Ser

210 215 220

Phe Gly Ala Ile Ser Asp Ile Asp Val Val Val Thr Asp Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ala Ser Phe Val Glu Gln Leu Arg Glu Arg Asp Val Glu Val Val

245 250 255

Ile Ala Glu

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 2

atgtacgcag aggagcgccg tcgacagatt gcctcattaa cggcagttga gggacgtgta 60

aatgtcacag aattagcggg ccgattcgat gtcactgcag agacgattcg acgagacctt 120

gcggtgctag accgcgaggg aattgttcac cgcgttcacg gtggcgcagt agccacccaa 180

tctttccaaa ccacagagtt gagcttggat actcgtttca ggtctgcatc gtcagcaaag 240

tactccattg ccaaggcagc gatgcagttc ctgcccgctg agcatggcgg actgttcctc 300

gatgcgggaa ctactgttac tgctttggcc gatctcattt ctgagcatcc tagctccaag 360

cagtggtcga tcgtgaccaa ctgcctcccc atcgcactta atctggccaa cgccgggctt 420

gatgatgtcc agctgcttgg aggaagcgtt cgcgcgatca cccaggctgt tgtgggtgac 480

actgcgcttc gtactctcgc gctgatgcgt gcggatgtag tgttcatcgg caccaacgcg 540

ttgacgttgg atcacggatt gtctacggcc gattcccaag aggctgccat gaaatctgcg 600

atgatcacca acgcccacaa ggtggtggtg ttgtgtgact ccaccaagat gggcaccgac 660

tacctcgtga gctttggcgc aatcagcgat atcgatgtgg tggtcaccga tgcgggtgca 720

ccagcaagtt tcgttgagca gttgcgagaa cgcgatgtag aagttgtgat tgcagaataa 780

<210> 3

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaacagaat taattaagct taaaggaggg aaatcatgta cgcagaggag cgccgtcgac 60

agatt 65

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caaaacagcc aagctgaatt cttattctgc aatcacaact tctacatcgc gttctcgcaa 60

ctgc 64

<210> 5

<211> 600

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 5

tgttgttcgt tcccagccgg tcgctgagca gggcgagttc gtcgcggcaa tgattgacgg 60

tgaagccacc gtgaaggaat tccacaagga ttcatctggc atctggctcc tgccacacaa 120

cgatacgttt gccccaattc ctgctgagaa tgcagaaatc atgggcaagg ttgtttccgt 180

gatgcgcaag ctttaagtcg cttttcaggt tcccgccaca gtatgtgttc tcacatatcg 240

tggcgggttt tgctttatat agccacattc gggggtaatc gggcaaataa gtttttgctg 300

atctagaaag tgagtttacc tgtgggtttt cgaaaattct gggccggaca atagaaaaac 360

gctgcccggt ttttttgatt gactcccgat ttcacccctc cgccggcaac caaatgaggc 420

ttttgggcgt tggacagtga gacaatgggt aagaaattcg gacatattta gtaaattggc 480

tttttgcttt aaggagtgac atgtacgcag aggagcgccg tcgacagatt gcctcattaa 540

cggcagttga gggacgtgta aatgtcacag aattagcggg ccgattcgat gtcactgcag 600

<210> 6

<211> 600

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 6

aatcagcgat atcgatgtgg tggtcaccga tgcgggtgca ccagcaagtt tcgttgagca 60

gttgcgagaa cgcgatgtag aagttgtgat tgcagaatga ttcttacagt cactgcaagt 120

ccgtatctgt tgagcaccaa tgagcttgac ggcaccatcg aaattggcga agcaaacaaa 180

atccggcagg tttccactgt tgccggtggt tttggcaccg gtgtggctgc caccttgttt 240

tatggcggca atgaaacttt tgcagttttt cccgctccag aaatctctca ttacatgcgc 300

ctggtgacgt ttgctgggtt gcctcatgaa attattccgg tggcaggtcc catccccatg 360

catttgacca tgcgtgatgc agagggcaat gagactaagt tcaaagactc ccccatgcct 420

ttggatgtgt cccagttggc aattcttcgt gatctagtgg tgcgtcgagc cgaagatgcc 480

gcgtgggtgt tgttgggtgg caatttgccg tctatcgcgc ctgctgcgtg gtttgtggat 540

gtggtgagat cacttcgctt gtaccaccct catgtgaagg tagctatcgc agcaactggt 600

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctatgacatg attacgaatt ctgttgttcg ttcccagccg gtc 43

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccatccact aaacttaaac actgcagtga catcgaatcg gc 42

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtttaagtt tagtggatgg gaatcagcga tatcgatgtg gt 42

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgacggcca gtgccaagct taccagttgc tgcgatagct acc 43

Claims

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌为宿主，表达编码转录调控因子cg2115的基因。

2.如权利要求1所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述转录调控因子cg2115的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述编码转录调控因子cg2115的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为宿主，以pXMJ19质粒、pJYW-4质粒、pEC-XK99E质粒或pDXW-10质粒为载体表达编码转录调控因子cg2115的基因。

5.一种发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有L-谷氨酸的发酵液，然后将含有L-谷氨酸的发酵液进行分离，获得L-谷氨酸。

6.如权利要求5所述的一种发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为28～31℃、转速为500～600rpm、pH为7.0～7.2。

7.如权利要求5或6所述的一种发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度为30℃、转速为600rpm、pH为7.0。

8.如权利要求5-7任一所述的一种发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖120～150g/L、三水合磷酸氢二钾1.0～1.5g/L、七水合硫酸镁0.2～0.6g/L、玉米浆2.5～5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005～0.008g/L、一水合硫酸锰0.005～0.008g/L以及尿素5.5～7.0g/L。

9.如权利要求5-8任一所述的一种发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖140g/L、三水合磷酸氢二钾1.5g/L、七水合硫酸镁0.6g/L、玉米浆5.0g/L、七水合硫酸亚铁0.005g/L、一水合硫酸锰0.005g/L以及尿素7.0g/L。

10.权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌或权利要求5-9任一所述的方法在生产L-谷氨酸中的应用。