JP2592444B2 - ポリペプチドの製造法 - Google Patents

ポリペプチドの製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオキシドリダクターゼの微生物による製造
法、漂白剤および／又は洗剤組成物にこれらの酵素を使
用すること、およびオキシドリダクターゼおよび任意に
はジヒドロキシアセトンシンターゼ酵素、およびハンセ
ヌラ（H.）・ポリモーフアアルコールオキシダーゼおよ
び／又はジヒドロキシアセトンシンターゼ調節配列をコ
ードするDNA配列により形質転換された微生物に関し、
この微生物は本方法に適切に使用できる。
電子受容体として酵素を使用するオキシドリダクター
ゼは漂白組成物や洗剤組成物に使用するのに適した酵素
であり、洗浄又は漂白工程中、漂白剤例えばH2O2をその
場で生成するのに使用できる。例えば、 −GB-PS第1,225,713号（コルゲート・パルモリブ社）、
グルコースとグルコースオキシダーゼの混合物その他の
成分を乾燥粉末洗剤組成物に使用することが記述されて
いる。
−DE-PA第2,557,623号（ヘンケル＆シイー社）、C1-C3
アルカノールとアルカノールオキシダーゼ、又はガラク
トースとガラクトース・オキシダーゼ、又は尿酸とウラ
トキシダーゼおよびその他の成分を漂白性を有する乾燥
洗剤組成物として使用することが記述されている。
−GB-PA第2,101,167号（ユニリーバー社）、C1〜C4アル
カノールとC1〜C4アルカノールオキシダーゼを液体ブリ
ーチとして又は洗剤組成物として使用することが記述さ
れている。
上記アルカノールと酵素は、組成物が水で稀釈するか
又は十分の酸素と接触するまで、実質上の反応は呈し得
ない。
今まで、天然のオキシダーゼ／酵素は低コストで製造
することができないので、洗剤等の大規模の工業的用途
に不向きであつた。更に、オキシダーゼ／酵素は洗剤や
漂白剤に使用した場合、非生理的条件下で作用させねば
ならない。さらには洗剤組成物に使用するのに使われて
きた天然のオキシダーゼは天然のカタラーゼを伴ない、
生成したパーオキサイドを殆んど直ぐに分解するので、
有効な漂白効果は得られない。したがつて、製造条件下
で使用しかつ洗剤や漂白製品の使用に一層適するオキシ
ダーゼ／酵素の需要がある。
これらのオキシダーゼを経済的に有利に製造するため
に、細胞タン白質の20％まで（フアン・デイケン等、19
76）のＨ・ポリモーフアのアルコールオキシダーゼのよ
うに、発酵方法でこれらの酵素の収率を上げる必要があ
る。
高量の酵素産生新規微生物を見つけること又は改良さ
れた性質を有する新規オキシダーゼ酵素を見出す方法は
あらゆる種類の微生物をチエツクして適切なオキシダー
ゼを単離すること、ついでそのパーオキサイド生成能を
チエツクし、製造条件下および洗剤と漂白製品の使用条
件下のその安定性をチエツクすることである。いつの日
か適当な酵素が見つかるであろうという望みがあつた
が、成功は予見できず、多分非常に低いものであろう。
別の方法は、これらのオキシダーゼを生成する天然の
微生物を古典的遺伝技術により交雑する試行錯誤方法を
適用することであり、一層生産的な微生物又は一層適切
な酵素を見出すことを期待したが、成功はまた低かつ
た。
高収率でおよび／又はカタラーゼの生成を伴なわずお
よび／または貯蔵や使用中例えば漂白組成物や洗剤組成
物にて改良された性質を有するオキシダーゼ酵素の調製
方法の需要が明かに存在する。試行錯誤による問題は次
の方法により克服することができる。すなわち、適当な
条件下で微生物を培養し、望ましくは酵素を濃縮し、濃
縮した酵素を公知方法により集取してオキシダーゼ酵素
を製造する方法において、組換えDNA技術により得そし
てオキシダーゼ酵素を産生し得る微生物を使用すること
を特徴とする方法である。
オキシダーゼの製造法に使用するのに適する微生物は
組換えDNA技術により得ることができるが、特定の微生
物又は微生物群にて構造遺伝子の発現を調節する１種以
上の他のDNA配列と共に、オキシダーゼをコードするDNA
配列（所謂構造遺伝子）により微生物を形質転換させ、
当該配列を含むエピソームベクターを導入するかあるい
は微生物の染色体に組みこみ可能なDNA配列を備えた配
列を含むベクターによる。
５′−および３′−制御側面領域と共にＨ・ポリモー
フア由来のアルコールオキシダーゼ（EC1.1.3.13）をコ
ードする構造遺伝子の決定は、本発明の範囲を限定する
ものではないが、本発明の例として記述する。本発明の
精神は、グリセロールオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ等のその他のオキシ
ダーゼのDNA配列を単離すること、DNA配列又はその修飾
を微生物のゲノムに又は微生物を形質転換するのに使う
エピソームベクターに加えることおよびこうして得られ
た形質転換微生物の培養、ならびに漂白組成にこの酵素
を使用することにも適用可能である。
使用する微生物はバチルス属の如きバクテリアやカビ
も可能であるが、技術的かつ経済的理由から酵母を使う
のが望ましい。特に、カビ又は酵母はアスペルギルス
属、カンジダ属、ゲオトリカム属、ハンセヌラ属、レン
ジト属、ナドソニア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラ
ス属、サツカロミセス属、スポロポロミセス属、トルロ
プシス属、トリコスポロン属およびゼンデラ属から選択
でき、特にアスペルギルス（Ａ）・ジヤポニカス、Ａ・
ニガー、Ａ・オリゼー、カンジダ・ボイジニ、Ｈ・ポリ
モーフア、ピチア・パストリスおよびクロツケラ・sp.2
201から選択することができる。後者の名称は特にＣ・
ボイジニの代りに使う。
多くのC1質化性酵母は過去10年間単離されており、ハ
ンセヌラ・ポリモーフアやカンジダ・ボイジニについて
は、メタノール代謝が広く研究されてきた（ビーンハイ
ス等、1983）。
この代謝の第１工程はメタノールがMOXにより触媒さ
れて、ホルムアルデヒドとH2O2に酸化される。ホルムア
ルデヒドは更にホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼおよ
び蟻酸デヒドロゲナーゼの作用により酸化される。H2O2
はカタラーゼにより分解されて水と酸素になる。
別の形では、メタノールは細胞物質に同化される。ホ
ルムアルデヒドに転換後、この生成物はキシルロースモ
ノリン酸塩経路を介して炭水化物に固定される。ジヒド
ロキシアセトンシンターゼ（DHAS）はこの同化工程上重
要な役割をしている。
MOX、蟻酸デヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、DHASおよびカタラーゼの出現は例えば0.
5％グルコースで、グルコース抑制を受ける。しかし、M
OXの合成は、これらの条件下でまだ十分に抑制される
（ロツゲンキヤンプ等、1984）、DHASの合成とは反対
に、低濃度グルコース（0.1％）における生育により活
性化される。
調節、すなわち当該ポリペプチドの遺伝子をスイツチ
オン又はオフにする可能性が望ましい。と言うのは、必
要な時、糖蜜の如き適当な基質を選択して、バイオマス
の生産を可能にし、また必要に応じ、メタノール又はメ
タノールと他の炭素源混合物を使つて、目的のポリペプ
チドを生産することができるからである。メタノールは
やゝ廉価な基質であるから、ポリペプチドの生産は非常
に経済的に行なうことができる。
メタノールで生育させてアルコールオキシダーゼ（MO
X）をコードする遺伝子の活性化後、大きなミクロボデ
イすなわちペルオキシソームが生成される。グルコース
生育細胞はほんの僅かのペルオキシソームを含むが、内
部要量の80％までの細胞が活性化状態でペルオキシソー
ムに置き換る。メタノールがホルムアルデヒドとH2O2に
転換しかつH2O2の分解はこれらのペルオキシソームにお
いておきることが分つたが、更にホルムアルデヒドの酸
化又は同化は大概の場合、細胞質にておきる。このプロ
セスは有毒生成物の、いくつかの細胞プロセスの強力な
同等活性化の、およびこのプロセスに包含される少なく
とも２つの酵素の選択的トランスロケーシヨンの区画分
けの完全な例である。
メタノール代謝に関与する殆んどの酵素は精製かつ特
性化される（サーム,1977、ビストリツク等、1981）。
特に、メタノールオキシダーゼ（EC1,1,3,13）は詳細に
研究された。それは約74KdのMr値を有する同一モノマー
から成るオクタマーでありかつ置換基としてFADを含
む。今まで、分裂可能なトランスロケーシヨンのシグナ
ル配列は検出されていない。生体内および試験管内合成
物による電気泳動研究（ロアおよびブローベル、1983）
又はミクロソーム膜の存在下の試験管内合成（ロツゲン
キヤンプ等、1984）から結論された。
活性化条件下で、20％までの細胞タン白質がMOXから
成る。
材料および方法 ａ）微生物および培養条件 ハンセヌラ・ポリモーフアCBS4732はジエイ・ピー・
デイケン博士（デルフト工業大学、オランダ）から入手
した。細胞は300mlの最小培地を含有する１エルレン
マイヤーフラスコにて37℃生育させ（ビーンハイス等、
1978）、指示通り、0.5％（v/v）メタノール又は0.5％
（v/v）エタノールを補充した。フアージラムダL47.1お
よびP2溶原性大腸菌K12株Q364はピー・フアン・デル・
エルセン博士（アムステルダム大学、オランダ）から入
手し、上述通り増殖させた（ローネンおよびブラマー、
1980）。
大腸菌K12株BHB2600、BHB2688およびBHB2690（ホー
ン、1979）はエム・フアン・モンタグ博士（ゲント大
学、ベルギー）から入手したが、大腸菌K12株JM101、71
18およびM13誘導M13mp8,9,18および19はベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ社（ゲイサーズバーグ、メリーラ
ンド、米国）から入手した。
ｂ）酵素 使用したすべての酵素はアマーシヤム・インタナシヨ
ナル社、英国から入手したが、α−ヘリカーゼはフアー
ム・インダストリイ、フランスから入手した。酵素培養
は製造者の指示通りに行なつた。ATP:RNAアデニルトラ
ンスフエラーゼはイーデン等（1982）の記述通りに精製
した。
ｃ）他の材料 〔35S〕メチオニン、〔α−35S〕dATP、〔α−32P〕d
NTP′ｓ、〔α−32P〕ATPおよび〔γ−32P〕ATPはアマ
ーシヤム・インタナシヨナル社、英国から入手した。
ニトロベンジルオキシ−メチル（MBM）紙はシユライ
アーおよびシユールから入手し、製造者の指示通りジア
ゾ形（DBM）に転換した。
ニトロセルロースフイルター（HATF型）はミリポアか
ら入手した。
RNA単離、分画化および分析 H.ポリモーフアはメタノール又はエタノールの存在下
中間対数段階まで生育させた。この細胞は、10mMトリス
−HCl pH8、5mM MgCl2、１％NaCl、６％パラ−アミノサ
リチル酸、１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および
５％フエノール含有バツフアーにて、16,000psiのフレ
ンチプレスで繰り返えし加圧して破砕した。ポリアデニ
ール化RNAの精製は上述通り（イーデン等、1982）、続
いて行なつた。1g細胞から4mgの全RNAと0.1mgポリアデ
ニール化RNAを得た。全RNA又はポリアデニール化RNAの
４μｇ試料はATP:RNAアデニルトランスフエラーゼおよ
び〔α−32P〕ATPでその３′−末端をラベルし、ついで
7M尿素含有2.5％ポリアクリルアミドゲルで分別した
（イーデン等、1982）。特異的mRNAフラクシヨンの分取
単離については、40μｇポリアデニール化RNAをラベル
したポリアデニール化RNA4μｇと混合し、変性ポリアク
リルアミドゲルで分別した。放射性2.4Kb RNAクラスを
ゲルスライスから溶離し、ついで20℃SW60ローターを使
つてベツクマン遠心分離機にて24,000rev/分で15時間、
100mM NaCl、10mMトリス−HCl pH7.5、1mM EDTAおよび
0.1％SDSにて5-30％グリセロール勾配で遠心分離して不
純物を除いた。放射性フラクシヨンを集め、エタノール
で沈澱させた。ポリアデニール化RNAはプリカーサーと
して〔35S〕メチオニンを使い、ペルハムとジヤクソン
（1976）により、ウサギ網赤血球リセート中試験管内に
て翻訳させた。翻訳産物はバレリオ等（1983）に記述さ
れたMOX抗血清で免疫沈降させた。
cDNA合成 ポリアクリルアミドゲルから単離したRNAフラクシヨ
ン1/3は逆転写酵素で放射性cDNAを得るために使用した
（イーデン等、1982）。高放射活性（3,000ci/mM以上）
の〔α−32P〕dATPおよび〔α−32P〕dCTPを使つて、高
分子量cDNA20000cpmをヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒ
ビターの存在下42℃で１時間生成させた。
DNA単離 10gのH.ポリモーフア細胞を1Mソルビトールで洗い、1
00ml 1.2Mソルビトール、10mM EDTA、および100mMクエ
ン酸pH5.8にて再懸濁させ、それに100μｌβ−メルカプ
トエタノールを加えた。細胞を500mgα−ヘリカーゼで3
0℃/1時間培養してスフエロプラスト化した。スフエロ
プラストはソルバールGSAローターにて4,000rev/分で遠
心分離して集め、40ml20mMトリス−HCl pH8、50mM EDTA
に再懸濁させ、2.5％SDSを加えて分離した。不完全に分
解した細胞はソルバールSS34ローターにて20,000rev/分
で30分間ペレツト化し、そしてDNAは60Tiローターを使
つてベツクマン遠心機中35,000rev/分で48時間CsCl−臭
化エチジウム密度勾配を使つて遠心分離して粘稠な上澄
液から単離した。2mgのDNAは平均長さ30Kbで単離した。
フアージラムダL47.1におけるクローンバンクの調製 150μgH.ポリモーフアDNAを部分的にSau3AIで消化
し、SW25ローター中23,000rev/分で22時間1M NaCl、20m
Mトリス−HCl pH8および5mM EDTAにて10-40％シヨ糖勾
配で沈降させた。勾配物を分画化し、フラクシヨン試料
はTBEバツフアー（89mMトリス、89mMホウ酸、2.5mM EDT
A）中0.6％アガロースゲルで分別した。
5-20KbのDNAを含むフラクシヨンを集め、DNAはエタノ
ールで沈澱させた。フアージラムダL47.1を生育し、そ
のDNAはリーデボアー等（1984）の記述により単離し
た。そのDNAをBamHIで消化し、アームはマニアテイス等
（1982）の記述により酢酸カリウム勾配で遠心分離して
単離した。こうして得られた２μｇフアージラムダDNA
アームと0.5μg Sau3AI消化H.ポリモーフアDNAを連結
し、ホーン（1979）のプロトコールを使つて試験管内で
パツケージした。フアージは14cmペトリ皿当り20,000pf
uのプラーク密度まで大腸菌株Q364にプレートした。プ
ラークはニトロセルロースフイルター（ベントンとデイ
ビス、1977）にブロツトし、そのブロツトは上記のよう
に単離した放射性cDNAプローブとハイブリツドさせた。
ハイブリツド条件はリーデボアー等（1984）に記載と同
じであり、ハイブリツドするプラークはオートラジオグ
ラフイにより検出した。
アルコールオキシダーゼ（MOX）の単離および部分的ア
ミノ酸配列の分析 メタノールで生育させたH.ポリモーフア細胞を超音波
により分解し、細胞片は遠心分離により除いた。MOX含
有タン白質フラクシヨンは(NH4)2SO4沈澱により単離し
た（40-60％飽和）。沈澱物を透析後、MOXはイオン交換
クロマトグラフイ（DEAE−セフアロース）およびゲル濾
過（セフアクリンS-400）によりカタラーゼその他のタ
ン白質から分別した。MOXに対する抗体は完全および不
完全フロインドアジユバント（デイフユ、米国）を使う
常法によりウサギにて生成させた。過蟻酸で処理したア
ルコールオキシダーゼの配列分析はベツクマンのシーク
エネーターで行なつた。残渣の同定はHPLCで行なつた。
アミノ酸組成は標準法を使い、ニンヒドリンで染色させ
て、クロマスペツクアナライザー（ランク、ヒルガー、
英国）で測定した。カルボキシ末端アミノ酸はアンブラ
ー（1972）の記述により測定した。
デオキシオリゴヌクレオチドの化学合成 デオキシオリゴヌクレオチドはホスフアイト技術（マ
ツチユシとカルーサズ、1981）を使つて、バイオサーチ
SAMIジーンマシーンで合成した。それをTBE中16％又は2
0％ポリアクリルアミドゲルで精製した。
デオキシオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリツド デオキシオリゴヌクレオチドをT4−ポリヌクレオチド
キナーゼおよび〔γ−32P〕ATPでラベルした。得られた
MOXクローンのDNAは各種制限酵素で消化し、１％アガロ
ースゲルで分別し、DBM紙にブロツトした。ハイブリツ
ド化はウオレース等（1981）の記述により行なつた。
DNA配列分析 完全MOX遺伝子を含むクローン４（例１参照）から、
いくつかのサブクローンを標準技術により、フアージM1
3mp-8、−９又はM13mp-18、−19誘導物にて作つた。２
つのオリエンテーシヨンでクローンした小さいサブクロ
ーン（0.5Kb未満）は両側から直接シークエンスした。
２つのオリエンテーシヨンでクローンした大きなサブク
ローンから、エクソヌクレアーゼBal31消化法（第１図
参照）により配列データを得た。両クローン化オリエン
テーシヨンの各々について、RFM13DNAは、望ましくはイ
ンサートの中心でのみ分解する制限酵素で消化する。続
いて、クローンの両オリエンテーシヨンをこのユニーク
な部位で切断し、各種時間間隔でエクソヌクレアーゼBa
l31で消化した。約100-150ヌクレオチドが各間隔で除か
れるように、培養時間と条件を選んだ。ついで、配列反
応がM13誘導物にてプライムする位置近くにある制限部
位を認識する制限酵素で各フラクシヨンを消化した。T4
−ポリメラーゼおよびすべてのdNTP′ｓで培養して平滑
末端とし、全ミツクスを稀釈条件下で連結して、内部RF
分子の形成させる。全連結ミツクスは大腸菌株JM101-71
18に形質転換させるのに使つた。各時間間隔から、いく
つかのプラークを捨い出し、サンガーのシーケンスプロ
トコール（ビギン等、1983）の最近記述された変法を使
つて配列決定した。
栄養要求変異体の単離 LEU-1（CBS7171）はβ−イソプロピルマレートデヒド
ロゲナーゼ活性を欠くH.ポリモーフア株NCYC495の栄養
要求体である。この変異株の単離はグリースン等（198
4）により記載された。
LR9（CBS7172）はオロチジン５′−デカルボキシラー
ゼ活性を欠く、H.ポリモーフアATCC34438の栄養要求株
である。
単離のために、この酵母の最適生育温度である37℃の
代りに、30℃で全操作を行なつた。酵母細胞は３％エチ
ルメタンスルホネートで２時間突然変異させた（フイン
ク、1970）。反応は６％チオ硫酸ナトリウム（最終濃
度）で止め、溶液を更に10分培養した。突然変異細胞を
一度H2Oで洗い、分離のためにウラシルを補給したYEPD
又はYNBで２日培養し、ウラシル−栄養要求体を増や
し、ついで窒素源のないMMで15時間培養を行なつた。最
後に、10μｇ抗生物質/mlの濃度を含むMMにて12時間ナ
イスタチン強化を行なつた。処理した細胞は200μｇウ
ラシル/mlおよび0.8mg5−フロロオロチン酸を含むYNBプ
レートで培養した（ボーク等、1984）。通常106細胞を
単一プレートで培養した。培養３日後に耐性コロニーを
取り出し、レプリカをYNBプレートで２度培養して栄養
要求株を樹立させた。栄養要求変異株から、ura-細胞を
単離した。別法として、1.5×106酵母細胞は、200μｇ
ウラシルと0.8mg5−フロロオロチン酸を補給したYNB液
体培地1mlにて培養させた。２日間の培養後、処理細胞
をウラシル含有YNBで平板培養し、レプリカは２度YNBで
平板培養し、上記の通り分析した。このような耐性変異
株はサツカロミセス・セレビシエのURA3又はURA5座に影
響を与えたウラシル要求株であることが分つた（エフ・
ラクルート、私信）。試験したH.ポリモーフアの約600
耐性コロニーの内、52がウラシル表現型を示した。S.セ
レビシエのURA3とURA5変異はオロチジン５′−デカルボ
キシラーゼとオロチジン５′−リン酸塩ピロホスホリラ
ーゼをそれぞれ欠く（ジヨーンズとフインク、1982）か
ら、H.ポリモーフアの生成ウラシル栄養要求株は両方の
酵素活性について調べた（リーベルマン等、1955）。２
つの酵素のいずれかに影響を与えた変異株が見つかつた
（表Ｉ）。それらをそれぞれOdclとOppl変異株と名付け
た。Odcl変異株は低復帰頻度を示し（表II）、相補によ
り形質転換の目的のために適している。
H.ポリモーフア由来の自律性復製配列（HARS）の単離 H.ポリモーフア由来の染色体DNAをSal I又はBam HIで
一部消化し、組みこみプラスミドYIp5の単一Sal IとBam
HI部位にそれぞれ連結させた。大腸菌490をアンピシリ
ン耐性に形質転換するために、この連結混合物を使用し
た。YIp5は選択マーカーとしてURA3遺伝子を含む組みこ
みプラスミドである（スチンチコーム等、1980）。
H.ポリモーフアSal Iクローンのプラスミドプールは
H.ポリモーフア変異株LR9を形質転換するのに使用し
た。全体に27の形質転換体を得、β−ラクタマーゼ試験
で陽性であつた。これらのすべてから、大腸菌490を酵
母ミニリセートと共に形質転換後プラスミドを回収し
た。プラスミドの制限分析によれば、殆んどのインサー
トは同じパターンを示した。それぞれ0.4と0.6Kbのイン
サートを含む、２つの異なつたプラスミドpHARS1とpHAR
S2は更に研究用に使用した（第２図）。ポリエチレング
リコールで処理した完全の細胞の形質転換操作を使つ
て、DNA1μｇ当り約500-1,500の形質転換体の頻度で、
両プラスミドはH.ポリモーフア変異株LR9を形質転換さ
せる。大腸菌プラスミド処方物から回収したpHARS1とpH
ARS2で再形質転換後H.ポリモーフア形質転換体のサザー
ン分析は予期したプラスミドバンドを示し、ウラシルプ
ロトロフイの原因として、URA3遺伝子の組みこみを排除
する。したがつて、ARS1様HARS配列（スチンチコーム
等、1982）はH.ポリモーフアの自律的復製を行なうと結
論する。HARS1もHARS2もS.セレビシエでは自律的復製は
できなかつた。HARS1は第３図に示すように、完全に配
列を決定された。
H.ポリモーフアにおけるプラスミドコピー数の評価 ARS配列又はHARS配列によりH.ポリモーフアに自律的
復製を与えるプラスミドのコピー数はサザンブロツト分
析により評価した（第４図）。比較のために、５〜10個
のコピー数／細胞（ストルール等、1979）を有するS.セ
レビシエのプラスミドYRP17（第４図、レーン６、７）
および細胞当り約30-50のコピーを有するS.セレビシエ
の高コピー数プラスミドpRB58（第４図、レーン４、
５）を使つた。YRP17はURA3−含有酵母プラスミドであ
り、ARS配列（スチンチコーム等、1982）を有するが、p
RB58はURA3遺伝子を含有する２μｍ誘導体である（カー
ルソンとボトスタイン、1982）。pBR pBR322の２つの組
みこみコピーを有するクルイベロミセス・ラクチス形質
転換体はコントロールとして使用した（第４図、レーン
２、３）。オートラジオグラムの染色度が示すところで
は、H.ポリモーフアのプラスミドYRP17はS.セレビシエ
のコピー数と実質的に同じであるが、プラスミドpHAR-1
とpHARS-2はS.セレビシエのpBR58のように細胞当り約30
-40のコピー範囲であるコピー数を示す。このことはHAR
S配列の自律的に復製する性質を再度証明するものであ
る。
形質転換操作 いくつかのプロトコールを使用した。
ａ）H.ポリモーフア株LEU-1はベツグズ（1978）の方法
を使つて形質転換させた。菌株は激しく空気をおくり乍
ら37℃ｃ、0.5のOD600まで500ml YEPD液体培地に生育さ
せた。細胞を採り、20ml蒸留水で洗い、20mlの1.2Mソル
ビトール、25mM EDTA pH8.0、150mM DTTに再懸濁させ、
室温で15分培養した。細胞を遠心分離により集め、20ml
1.2Mソルビトール、0.01M EDTA、0.1Mクエン酸ナトリ
ウムpH5.8および２％v/vβ−グルクロンダーゼ溶液（シ
グマ1500000ユニツト/ml）にとり、37℃で105分培養し
た。１時間後、β−グルクロニダーゼの最終濃度を４％
v/vにした。形質転換のために、プロトプラスト3mlを7m
lの氷冷1.2Mソルビトール、10mMトリス−HCl pH7に添加
した。プロトプラストを2000rpmで５分間遠心分離によ
り採取し、氷冷ソルビトールバツフアーで３度洗つた。
洗つた細胞を氷上0.2ml 1.2Mソルビトール、10mM CaC
l2、10mMトリス−HCl pH7に再懸濁させた。２μｇのYEP
13DNA-S.セレビシエのLEU2遺伝子および２ミクロン−Or
i（ブローチ等、1979）から成る自律的復製S.セレビシ
エプラスミドーを細胞100mlに加え、室温で培養した。2
0％PEG400、10mM CaCl2、10mMトリス−塩酸pH7.5の溶液
0.5mlを加え、全体の混合物を室温で２分間培養した。
細胞を短時間（５秒）遠心分離で高速度にセツトしたMS
Gマイクロフエージに集め、0.1ml YEPD 1.2Mソルビトー
ルpH7.0に再懸濁させ、室温で15分培養した。細胞は、
２％デイフコ寒天、２％グルコース、0.67％デイフコ酵
母窒素塩基およびＬ−アデニンヘミサルフエート、メチ
オニン、ウラシル、ヒスチジン、トリプトフアン、リジ
ンおよび1.2Mソルビトールの各々を20mg/l含有するプレ
ートに拡げて表面に直接培養した。Lev+形質転換体は37
℃で５日培養した後、50コロニー／μg DNAの頻度で生
じたが、DNAを添加しない場合は形質転換体は生じな
い。
ｂ）別法として、H.ポリモーフアLEU-1をダス等（198
4）の方法を使つて、YEP13で形質転換させた。指数的に
生育する細胞を0.4のOD600まで生育させ、TEバツフアー
（50mMトリス−HCl pH8.0、1mM EDTA）にて洗い、20ml
TEバツフアーに再懸濁させた。0.5ml細胞を30℃で１時
間0.5ml 0.2M LiClで培養した。これらの細胞100mlに、
20ml TEバツフアー中４μg YEP13を加え、その試料を更
に30分間30℃で培養した。等容量の70％v/v PEG4000を
加え、混合物を30℃で１時間培養し、続いて42℃で５分
間培養した。1mlの水を加えた後、細胞を上記ａ）のよ
うに短時間遠心分離で集め、２度水で洗い、0.1ml YEPD
1.2Mソルビトールに再懸濁させ、室温で15分培養した。
細胞は上記の通り平板培養した。Leu+形質転換体は30/
μg DNAの頻度で生じる。
ｃ）H.ポリモーフアURA変異株LR9は選択マーカーとして
S.セレビシエのURA3遺伝子およびS.セレビシエの自律的
復製配列（ARS）を含むプラスミド、YRP17で形質転換さ
せた（ステイチコーム等、1982）。ベツグズ（1978）の
プロトプラスト方法を使つて、２−５形質転換体／μg
DNAを得た。イトー等（1983）のLiSO4を使つて、この数
を15-20形質転換体／μg DNAまで拡げた。しかし、最良
の方法は、PEG4000で処理した完全細胞を使う、クレベ
等（1983）の方法であつた。300までの形質転換体がDNA
μｇ当り得られた。LiSO4法ならびにクレベ法は37℃で
行なつた。
ベクターの自律的復製によるH.ポリモーフアの形質転
換には２つの特長がある：（１）ウラシル＋表現型の不
安定性。形質転換体をYEPDで10世代生育させた後、99％
以上が選択培地で生育する能力を失なつた（表II）。
（２）自律的復製は大腸菌を酵母ミニリセートで形質転
換しかつH.ポリモーフアの再形質転換により更に確かめ
られた。続くサザン分析により、期待したプラスミドの
存在を示した。
H.ポリモーフアLR9はpRB58で又はpHH85で形質転換す
ることができず、全２ミクロン環状DNA（ホレンバー
グ、1982）をプラスミドYIP5のアンピシリン遺伝子のPs
t I部位に挿入して構築される。HARS1又はHARS2のDNA配
列を含むYIP5はクレベのプロトコールを使つて、DNA μ
ｇ当り500-1500の形質転換体の頻度でH.ポリモーフアLR
9に移した。したがつて、形質転換頻度は、S.セレビシ
エのYRP17における異種構造ARS1を使う、上記よりも２
−５倍高い。同様に、形質転換体中のHARSプラスミドの
安定性はARS1プラスミドより僅かに高い（表II）。
S.セレビシエ由来のURA3遺伝子を組みこむことによるH.
ポリモーフアの形質転換 S.セレビシエのURA3遺伝子は、H.ポリモーフアの染色
体DNAに対しニツク翻訳したYIp5プラスミドDNAのサザン
ハイブリツドにより示されるように、H.ポリモーフアの
ODC遺伝子に対し類似性を示さない。したがつて、H.ポ
リモーフアゲノムのランダム部位へのURA3遺伝子の低頻
度組み込みを予期しなければならなかつた。変異体LR9
を組みこみベクターYIp5で形質転換すると、ポリエチレ
ングリコール法を使うYNBプレートでは30-40コロニー／
μg DNAとなつたが、S.セレビシエ変異体YNN27の形質転
換のためにYIp5を使う対照実験では形質転換体は得られ
なかつた。38個の形質転換体の分析では、非選択的培地
で生育させた後、４つの安定な組み込み体を示した。組
みこみについては更にサザン分析（第５図）により証明
した。
URA3遺伝子をH.ポリモーフアの染色体DNAに組みこむ
第２の操作は、プラスミドpHARS1を有する形質転換体か
ら安定なUra+形質転換体を増やして行なつた。形質転換
体はml当り109細胞密度まで液体YEPD中で生育させた。
５×106細胞を含む試料を使つて、新しい培地100mlに接
種し、そしてml当り109の細胞密度まで生育させた。約1
00世代になるまでこの操作を繰り返えした。変異株LR9
の復帰率（renersion rate）は２×10-9でありかつ10世
代当りのプラスミドロス頻度はpHARS1形質転換体で97％
であるから、100世代後のUra+細胞の主部分は組みこみ
体であるべきである。試験したUra+コロニーは、URA3遺
伝子の組みこみを示す安定なUra+表現型を維持すること
を示した。このことは更にサザンブロツト分析により確
認された。更に、組みこみ頻度は５×10-6であることを
これらのデータは示している。
例１ ハンセヌラ、ポリモーフア由来のアルコールオキシダー
ゼ（MOX）の遺伝子のクローニング ポリアデニール化RNAの特性 メタノールで生育させた細胞から単離した、全体のRN
Aとポリアデニール化RNAはその３′−末端で、ATP:RNA
アデニルトランスフエラーゼでラベルし、変性ポリアク
リルアミドゲルで分別した（第６図）。rRNAは別にし
て、２群のRNAはそれぞれ長さ1Kbと2.3Kbで、ポリアデ
ニール化RNAレーンにみられる。これらのRNA群はエタノ
ール生育細胞のポリアデニール化RNAにみられない（結
果は示してない）から、メタノールで生育させて活性化
した遺伝子の転写であることは明らかである。2.3Kb群
は非翻訳配列の長さにより、700から800のアミノ酸のタ
ン白質をコードしうる。同様に、1Kb群は250〜300アミ
ノ酸のタン白質をコードする。メタノールで生育させて
活性化されかつ700-800のアミノ酸鎖を有する酵素は大
概MOX（カトー等、1976;ロアとブローベル、1983）とDH
AS（ビストリツク等、1981）である。250〜300アミノ酸
範囲における活性化酵素は多分ホルムアルデヒドと蟻酸
デヒドロゲナーゼ（シユツテ等、1976）である。ポリア
デニール化RNAは網赤血球細胞のない翻訳系における試
験管内翻訳により更に特徴づけられた。２μｌのポリア
デニール化RNA指向タン白混合物を10％SDSポリアクリル
アミドゲルで直接分別し、一方残りの18μｌはMOXに対
する抗血清で免疫沈降させた（第７図）。夫々78Kd、74
Kd、58Kd、42Kd、39Kdおよび36Kdの分子量を有する６つ
の強いバンドが全体のタン白混合物で優位を占めてい
る。本質的に、同一分子量はメタノール生育Ｍ、ポリモ
ーフア細胞由来の全体の細胞抽出物において、ロアとブ
ローベル（1983）により見出された。
74Kdタン白質は取敢えずMOXのモノマーに、58Kdタン
白質はカタラーゼのモノマーに、そして39Kdと36Kdのタ
ン白質は夫々ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼと蟻酸
デヒドロゲナーゼのモノマーに当てることができる。78
Kdポリペプチドは多分DHASであり、42Kdポリペプチドは
未同定のまゝである。免疫−沈降後、両方の高分子量タ
ン白質はMOX抗血清と反応する。
MOX遺伝子のクローニング メタノールで生育させて誘導した2.3Kb mRNA群は明か
に少なくとも２つのポリペプチドをコードするが、ハイ
ブリツド化によるH.ポリモーフアクローンバンクをスク
リーニングするのに良好な候補と思えた。部分的にSan3
AI消化H.ポリモーフアDNAの５〜20Kbフラクシヨンはフ
アージラムダL47.1でクローンした。
インサートDNA μｇ当り、300,000プラークが得られ
たが、背景は1:1000未満であつた。約20,000のプラーク
を含む２つのベントンデイビスブロツトはmRNA誘導cDNA
プローブの15,000cpmとハイブリツドした。オートラジ
オグラフ３週間後、約40〜50のハイブリツド性プラーク
が検出できた。すべてのプラークを取り出し、５つを低
密度で平板培養しそしてcDNAプローブで第２のハイブリ
ツド化により精製した。４つから、単一ハイブリツドプ
ラーク（1,3,4,5）DNAを単離した。インサートの長さは
８〜13Kbであつた。
有機合成DNAプローブを使うハイブリツド選択 精製MOXのアミノ末端の30アミノ酸の配列を測定した
（第８図）。S.セレビシエの最も豊富なコドンを使つ
て、14塩基の配列をこのタン白配列の部分から誘導でき
た。不明確は唯一つである。第４図に示した両プローブ
を合成した。両プローブには、EcoRI部位が存在する。D
BMブロツトは制限酵素BanHI、EcoRI/HindIII、MindIII/
SalIおよびPstI/SalIで消化したMOXクローンのDNAから
作り、1.5％アガロースゲルで分別した。このブロツト
を放射線ラベルしたプローブの混合物とハイブリツドし
た後、クローン１、４および５はハイブリツドしたが、
クローン３はしなかつた。第９図のHindIII/SalIブロツ
トに示す。しかし、このプローブはこれらのクローンの
EcoRI/HindIII消化DNAとハイブリツドしなかつた（結果
示さず）。EcoRI部位はプローブに存在するから、クロ
ーン中のハイブリツド性DNAはこの酵素によつても切断
されよう。結局、ハイブリツド化オーバラツプは非常に
小さくなつたので、安定なハイブリツドを生成しない。
制限地図と配列分析 制限酵素消化物を比較しかつ交差ハイブリツド化実験
により、クローン１、４および５は同一のDNAストレツ
チをカバーした。
このクローン化DNAのストレツチの性質を明確に樹立
するために、クローン４のインサートを詳細に分析し
た。アミノ末端プローブとのハイブリツド化によれば、
完全MOX遺伝子（約2Kb）が存在し、2Kb配列上流と3.5Kb
下流を含む（第10図）ことを示した。
最小のEcoRI断片のDNA配列分析は、アミノ酸配列分析
により測定した様に、MOXのアミノ末端に相当するヌク
レオチド配列を明らかにした。
配列分析について、いくつかの断片を第10図に示すよ
うに、２つのオリエンテーシヨンで夫々M13mp8/M13mp9
又は13mp18/M13mp19にてサブクローンした。0.5Kbより
小さいクローンは両側から直接シーケンスした。より大
きいクローンはクローン化断片の中央に位置するユニー
クな制限部位で切断し、「材料と方法」に記述したエク
ソヌクレアーゼBal31消化サブクローンを生成した。特
異的オリゴヌクレオチドプライマーを使つて、サブクロ
ーン化に使う制限部位周囲の配列および明白な配列測定
のできない配列は、全配列をカバーする5.5Kb BamHI/Sa
cIサブクローンを使つて、もう一度シーケンスした。完
全なヌクレオチド配列は第11Aと11B図に示す。
この配列は664アミノ酸のタン白質をコードしうる204
6ヌクレオチドの開口読み取り枠を含む。開口読み取り
枠の最後のコドンはPheをコードし、精製MOXのカルボキ
シ末端と一致している。このタン白質をコードするDNA
配列由来のアミノ酸組成および精製MOXのアミノ酸組成
は事実上同一である（表III）。唯一の重要な差異はセ
リンとスレオニン残基を含むことであり、それらは周知
通り測定するのが難しい。
タン白質の計算分子量は74,050ドルトンであり、MOX
の74Kdの分子量とよく一致する（ポリアクリルアミド/S
DSゲルで測定）。
コドンの使用頻度 表IVには、MOXのコドン使用頻度が示されている。選
択的数のコドンを使う傾向が明らかである。
例２ プラスミド、pUR3105の構築、それにより抗生物質G418
に耐性を示すネオマイシンホスホトランスエラーゼをコ
ードする遺伝子がMOXレギユロンの管理下で染色体MOX遺
伝子に組みこむ。
プラスミドYEP13、YRP17、pHARS1又はpHARS2で形質転
換したＨ、ポリモーフア細胞は不安定でかつ非選択的条
件下生育10世代後既にそのleu+又はura+表現型を失なつ
た。安定な形質転換体を得るためかつMOXプロモーター
を試験するために、プラスミドpUR3105が構築するが、
ネオマイシンホストランスフエラーゼ遺伝子（NEOR）は
MOXレギユロンの直接管理下になる。NEOR遺伝子の最初
のATGがMOXレギユロンの1.5Kbに結合するように、構築
される。このような大きなレギユロン断片のクローニン
グは必要であり、レギユロンの−1000領域を含まない短
かい断片は余り有効でないからである。
NEOR遺伝子は、最初のATGの下流35bpからTGA翻訳停止
コドン下流240bpまでに位置するトランスポソンTn5由来
の1.1Kb XmaIII-SalI断片として単離した。複雑な連結
混合物を避けるために、最初のpUR3101を構築し（第12A
図）、これはMOXレギユロンのはるか上流SalI-XmaIII
（−1510から−1128）断片とM13mp9にサブクローンした
NEOR遺伝子の融合である。他のプラスミドpUR3102が構
築され、全MOXレギユロンを殆んどカバーするMOX遺伝子
の1.5Kb SalI-HgiAI断片はMOX-NEORアダプター（第12B
図）配列に連結されかつM13-mp9にてクローンされる。
このプラスミドの1.2Kb XmaIII断片はpUR3101のXmaIII
部位にクローンされ、pUR3103となり、これはMOXレギユ
ロンとNEOR遺伝子（第12c図）の正確な融合である。オ
リエンテーシヨンはHgiAIとSalIの切断によりチエツク
する。ラムダーMOX-4クローンから、SalI-SacI断片をサ
ブクローンし、構造MOX遺伝子（894位）のSalI部位か
ら、構造MOX遺伝子（3259位）のはるか下流のSacI部位
まで達する（第10図）。このM13mp19サブクローンはpUR
3104と呼ぶ。プラスミドpUR3105はpUR3103由来の2.7Kb
SalI断片をpUR3104のSalI部位に直接連結して得る。オ
リエンテーシヨンはSmaIとSacIの切断により試験した。
このプラスミドをHindIIIとSacIで切断しかつこの切
断プラスミドをＨ、ポリモーフアに形質転換させた後、
G418耐性コロニーが見つかり、多くの世代の間非選択的
条件下で生育させてその耐性を失なわなかつた。
例３ pUR3004の構築、それによりＤ−アミノ酸オキシダーゼ
をコードする遺伝子はMOX−レギユロンの管理下Ｈ、ポ
リモーフアの染色体に移動する。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（AAO）はメチル栄養性（m
ethylotrephic）H.ポリモーフアが非常に適している製
造のためのオキシドリダクターゼの一例である。MOX様
オキシダーゼである酵素は、メタノール又はメタノール
と炭素源としての発酵糖および単一窒素源としてのＤ−
アミノ酸の混合物に生育中誘導される酵母のペルオキシ
ソームに転座される。これらの条件下で、細胞は生成す
るH2O2から保護される。別法として、AAOがMOX−又はジ
ヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（DAS）−レギユ
ロンの管理下にある場合、H2O2を生成することなく、AA
Oを製造することができる。AAOの製造は培地中メタノー
ルの存在により誘導される。
AAO酵素のアミノ酸配列は公表され（ロンチ等、198
1）、完全な遺伝子はホスフアイト技術（マチユチとカ
ルサーズ、1981）を使つて合成される。この遺伝子は、
MOX遺伝子の配列から誘導されるように、H.ポリモーフ
アの最適コドンが使われる様に構築される。更に、いく
つかのユニークな制限部位はアミノ酸配列を変えずに導
入され、合成中のサブクローン化を容易にする。DNA配
列に第13図に示す。この遺伝子は長さ約50ヌクレオチド
のオリゴヌクレオチドで合成される。オリゴヌクレオチ
ドは16％ポリアクリルアミドゲルで精製する。サブクロ
ーンを生成するオリゴヌクレオチドはリガーゼバツフア
ー（マニアテイス等、1982）に一緒に添加され、湯煎中
70℃に加熱する。湯煎をゆつくり16℃に冷却し、T4−リ
ガーゼを加える。連結２時間後、DNAを1.5％アガロース
ゲルで分別し、予期された長さを有する断片をゲルから
単離する。断片の末端に位置する各制限部位で切断した
M13mp18ベクターにてサブクローンする。この遺伝子を
夫々SalI-HindIII（39-346位）、HindIII-XmaI（346-58
9位）XmaI-KpnI（589-721位）およびKpnI-SalI（721-10
44位）の４サブクローンにてこのようにサブクローンす
る。SalI-HindIIIおよびHindIII-XmaIサブクローン、お
よびXmaI-KpnIとKpnI-SalIサブクローンをSalI-XmaI切
断M13mp18における２つのSalI-XmaIサブクローンと連結
する。これらの２つのサブクローンをSalI切断M13mp8に
連結して、pUR3001（第13、14A図）を得る。全配列は改
良サンガージデオキシシーケンス技術（ビギン等、198
3）を使つて、ヌクレオチド配列の測定により確認す
る。
AAO遺伝子を含有する組みこみプラスミドの構築は14
A、Ｂ図に示す。殆んど完全なAAO遺伝子は、ユニークな
pUR3104のSalI部位（第14A図）において、pUR3001のAAO
遺伝子−含有SalI断片を挿入して、MOX末端領域の上流
において、pUR3002を得る。オリエンテーシヨンはHindI
IIで切断してチエツクする。MOXプロモーター領域はpUR
3102由来の1.4Kb SalI-HgiAI断片（第14A図）として単
離する。ついでこの断片を、HgiAI-SalI MOX-AAOアダプ
ターの存在下部分的SalI−消化pUR3002（第14A図）に連
結して、pUR3002のAAO遺伝子上流におく。生成したプラ
スミドpUR3003のオリエンテーシヨンはHindIIIで切断し
て再度チエツクする。このプラスミドは、SacIで切断し
かつH.ポリモーフア細胞に形質転換した後、MOX遺伝子
に組みこむ。形質転換体は、インジユーサーとしてメタ
ノールの存在下窒素源としてＯ−アミノ酸に生育する能
力により選択する。
AAO遺伝子含有細胞の選択は単純でないので、別の選
択マーカーを導入する。結局、S.セレビシエLEU2遺伝子
は構造AAO遺伝子とMOXターミネーター間に組みこむ。こ
の構築のために、プラスミドpURS528-03を使う。このプ
ラスミドはヨーロツパ特許出願第96910号に記載のpURY5
28-03から誘導する。構築は第14c図に示す。pURY528-03
の欠損カルボキシ末端LEU2遺伝子配列はpYeleu10由来の
完全カルボキシ末端LEU2遺伝子配列（ラトキンとカーボ
ン、1977）と置換し、大腸菌lac-lacレギユロンを除い
た。続いて、LEU2遺伝子を含有するpURS528-03のHpaI-S
alI断片を、AAO構造遺伝子とMOXターミネーター間にあ
るpUR3003のSalI部位に挿入平滑末端とする。生成プラ
スミドpUR3004のオリエンテーシヨンはSalIとSacIで切
断してチエツクすることができる。SacI−切断プラスミ
ドをH.ポリモーフアleu-変異体に形質転換した後、pUR3
004はH.ポリモーフアの染色体MOX遺伝子に組みこむ。選
択したleu+形質転換体はAAO遺伝子と共に、染色体MOX遺
伝子に組みこむ。
例４ pUR3204、pUR3205、pUR3210およびpUR3211の構築、それ
により小ペプチドホルモン、ヒト成長放出因子を、染色
体MOX遺伝子（pUR3203、pUR3204）に組みこむか、又はH
ARS1−含有プラスミド（pUR3205）に組みこむか、又はM
OX構造遺伝子（pUR3209、pUR3210およびpUR3211）に融
合して、MOX−レギユロンの管理下発現させる。
ヒト成長ホルモン放出因子（HGRF）は脳下垂体由来の
ヒト成長ホルモンの分泌を活性化する、小さい44アミノ
酸ペプチドである。HGRFは男子の垂体小人症の診断や治
療に使用可能である。HGRFは多くの種の成長ホルモン刺
激を誘発することが分つているから、動物の成長を刺激
しかつミルクの生産を増大することにより、HGRFは獣医
方面にも使用できる（クーデ等、1984）。ヒト由来のHG
RFを得るのは難しいが、遺伝子をクローンしかつ適当な
宿主体に移すバイオテクノロジイの方法により非常によ
く製造できた。H.ポリモーフアによるペプチドホルモン
の一般的生産例として、HGRFの遺伝子がH.ポリモーフア
の最適コドンに合成され、いくつかの方法で発現され
る。
pUR3204とpUR3205の構築のために、タン白質のカルボ
キシ末端部分をコードする遺伝子断片は長さ約50ヌクレ
オチドのDNAオリゴマーで合成され、HindIII-SalI切断M
13mp18のHindIII-SalI断片としてサブクローンし、pUR3
201（第15、16A図）を得る。このHindIII-SalI断片はつ
いでHindIII-SalI切断pUR3104（第16A図）のMOXターミ
ネーター上流に挿入され、pUR3202を得る。MOXプロモー
ターは、MOX−プロモーターとHGRF遺伝子（第15、16A
図）間にHgiAI-HindIIIアダプターを使つて、HindIII切
断pUR3202にpUR3102（第16A図）由来のSalI-HgiAI MOX
−プロモーター断片を挿入して、HGRF遺伝子の前に挿入
する。生成プラスミドpUR3203のオリエンテーシヨンはS
alIとHgiAIで切断してチエツクする。SacI切断プラスミ
ドの形質転換後、pUR3203はH.ポリモーフアの染色体MOX
遺伝子に組みこむ。形質転換体は免疫活性について選択
する。pUR3203はSalIで切断して、LEU2遺伝子を含むpUR
528-03（第16B図）のSalI-HpaI断片を挿入する。この遺
伝子のpUR3204におけるオリエンテーシヨンはHindIIIと
EcoRIで切断してチエツクする。SacI切断プラスミド
（第16B図）をleu- H.ポリモーフア変異体に形質転換し
た後、pUR3204は染色体H.ポリモーフアMOX遺伝子に組み
こむ。leu+形質転換体について選択。H.ポリモーフアに
て自律的に複製しかつHGRF遺伝子を含むpUR3205と呼ぶ
プラスミドは、MOX−プロモーターとターミネーター間
に挿入したHGRF遺伝子を含有する、pUR3203のEcoRI、部
分的HindIII切断4Kb断片を部分的HindIII-EcoRI切断pHA
RS1（第２、16C図）に挿入して得る。pUR3205の構築はH
indIIIで切断してチエツクする。
微生物によりHGRFとして小ペプチドの生産は酵素分解
（板倉等、1977）の結果、しばしば不安定である。タン
白様MOXに対する融合、およびその後のペルオキシソー
ムへの移行により分解を防ぐことができた。したがつ
て、MOX構造遺伝子の1775位（アミノ酸591、第10図、第
11図）のユニークKpnI部位にHGRF遺伝子を挿入すること
を決定した。HGRF遺伝子は長さ50ヌクレオチドのDNAオ
リゴマーに再度合成されるが、M13mp19の完全HGRF構造
遺伝子としてクローンされる２つのKpnI-HindIIIサブク
ローンはKpnI（プラスミドpUR3206、第17図、第16D図）
で切断した。更に、27位のHGRFの内部メチオニンをコー
ドするATGトリプレツト（クーデ等、1984）（DNA配列の
82位）はシステインをコードするTGTトリプレツトに転
換される。このことはHGRF活性を本質的に変えず、CNBr
切断（板倉等、1977）により融合タン白質由来のHGRFの
切断を容易にする。フアージラムダMOX-4（第10図）か
ら、SphI（−491位）−KpnI断片を単離し、SphI-KpnI切
断M13mp19に挿入され、pUR3207を得る。pUR3206をKpnI
で切断し、HGRF遺伝子をpUR3207のKpnI部位に挿入し、 pUR3208を得る。オリエンテーシヨンはpUR3208の単一ス
トランドDNAで直接配列分析によりチエツクする。続い
て、ユニークKpnI部位からSacI部位まで、MOX遺伝子の
下流部分はフアージラムダMOX-4由来の1.5kb断片として
単離し、SacI−部分的KpnI切断pUR3208に挿入する。生
成プラスミドpUR3209のオリエンテーシヨンはKpnIで消
化してチエツクする。SacI、SphI切断プラスミドの形質
転換後、pUR3209はH.ポリモーフアの染色体MOX遺伝子に
組みこむ。免疫活性に関する選択。
このMOX-HGRF融合遺伝子は、部分的HindIII、部分的E
coRI切断pUR3209由来の全融合遺伝子を単離してpHARSI
に、EcoRI部分的HindIII切断pHARSIに挿入される。この
結果がpUR3210が得られ、形質転換後H.ポリモーフアに
て復製する（第16E図）。別法として、pURS528-03のLEU
2-含有SalI-HpaI断片を、pUR3209の部分的KpnI切断後、
コードしたタン白質のカルボキシ末端にある、HGRF遺伝
子の平滑末端KpnI部位に挿入する。生成プラスミドpUR3
211は、SacI、SpdI切断プラスミドの形質転換後（第16F
図）、H.ポリモーフアの染色体MOX遺伝子に組みこむ。
考察 開口読み取り枠の長さから、精製MOXとDNA由来タン白
配列のアミノ酸組成の類似性から、および同一の30N−
末端アミノ酸から、H.ポリモーフア由来のMOXの完全遺
伝子をクローンした。その計算分子量はSDSポリアクリ
ルアミドゲルで測定した分子量とよく一致する。コード
配列とは別に、1200bp以上は５′−と３′−非コード領
域からシーケンスし、コード配列の上流SalI部位からSa
cI部位下流まで達する。遺伝子は介在配列で妨害されな
いようである。
タン白質はプリカーサーの形で転写されない。分子量
の測定により、Ｎ−末端シグナル配列はロアとブローベ
ル（1983）又はロツゲンカンプ等（1984）の初期研究で
は検出出来なかつた。類似の実験では、ラツト肝臓のパ
ーオキシソマール酵素ウリカーゼ（ゴールドマンとブロ
ーベル、1978）およびカタラーゼ（ゴールドマンとブロ
ーベル、1978;ロビーとラザロウ、1978）は切断可能な
Ｎ−末端シグナルペプチドを含まないことが示唆され
た。しかし、これらの著者により論究されている様に、
タン白分解的劣化はこのようなシグナル配列の検出の欠
如を説明するものである。
本発明者の配列結果がはつきり証明することは、この
タン白質をパーオキシソームに転座するために、切断可
能なＮ−末端シグナル配列は必要でない。このような転
座シグナルは、オボアルブミンの場合のように（リンガ
ツパ等、1979）、成熟タン白質の内部配列に十分位置し
うる。タン白質配列の検査はアミノ酸配列GlyXGlyYZGly
（アミノ酸13-18）を示し、FAD−（フラビンアデニンジ
ヌクレオチド）−含有酵素（ロンチ等、1981）に特長的
である。
上記のMOX遺伝子の単離はMOXをコードするDNA配列お
よびMOX酵素のアミノ酸配列の測定方法を示すものであ
る。
同様に、他のオキシダーゼ酵素に属するDNA配列とア
ミノ酸配列を単離しかつ測定することができる。MOX遺
伝子配列の知識を利用して、アルコールオキシダーゼを
コードする遺伝子又は他のオキシダーゼをもコードする
遺伝子の単離を容易にする。酵素の性質と構造を比較す
ることにより、構造の働きと活性の関係を多分確立する
ことができる。部位指向突然変異生成として、タン白コ
ード配列の短縮化又は伸長化、相当するポリペプチドを
修飾して、改良された性質、例えばアルカリ安定性の増
大を有するオキシダーゼ、又は洗剤製品と一層相溶性の
基質を必要とするオキシダーゼを選択する方法も適用し
うる。H.ポリモーフア由来のMOXの構造遺伝子の単離と
特性化以外に、H.ポリモーフア由来のDHASの構造遺伝子
の単離と特性化を同じように行なつた。
DASのDNA配列は第18A-18C図に示す。制限地図は第19
図に示す。DASのDNA配列から計算したアミノ酸組成は精
製DHASの加水分解後に測定したアミノ酸組成と一致して
いる様であつた。DHAS酵素はホルムアルデヒドとキシル
ロースモノホスフエートからのジヒドロキシアセトンの
合成を触媒する。この反応はメタノール−同化反応（ビ
ーンハイス等、1983）において重要な役割を演じてい
る。
前に記述した様に、MOXとDHASの合成はグルコールリ
プレツシヨンに供する。0.5％（v/v）メタノールの代り
に基質としてグルコール／メタノール混合物を用いる場
合、高レベルのMOXが得られることが分つた。前に条件
下では、後者の条件の20％と比較して、30％までの細胞
タン白質はMOXから成る。
MOXとDASのレギユロンには、グルコースによるリプレ
ツシヨン／活性又はメタノールによる誘導の調節に決定
的役割を演じる配列が存在せねばならないと考えられ
た。したがつて、ある相同関係が予期される。
双方共配列CTATAAATAを有する、「TATA−ボツクス」
の著しい相同性が見出された。MOXとDASレギユロンの上
流に近い領域には他の相同性は見出されなかつた。期待
に反して、両レギユロンの詳細な研究は、翻訳開始コド
ンの約1000bp上流領域にMOXとDASのレギユロンの顕著な
相同性を示した。MOXのレギユロンにおいて65bpの実際
上完全な連続領域は、いくつかの非相同性領域（第20
図）により散在されている、DASレギユロンの139bp領域
に相同している。類似の相同性は両遺伝子の任意の他の
領域にみられない。すなわち、その上流と下流の配列を
含めて長さ4Kbにわたつてみられない。これらの相同配
列はグルコースやメタノールによる両遺伝子の調節の役
割を有することが示唆されている。MOXの構造遺伝子のA
TGの上流の最初の500bpをレギユロンとして含有するベ
クターによる形質転換の研究は次の点を示した。即ち、
この短かくなつたMOX−レギユロンはインデイケーター
遺伝子β−ラクタマーゼの比較的低発現をおこした。イ
ンデイケーター遺伝子は容易にスコアできる性質をもつ
た酵母を供する遺伝子であり、例えば抗生物質G418に耐
性を示すネオマイシンホスホトランスフエラーゼの遺伝
子又はロイシンの如き栄養要求マーカーである。
MOXとDAS遺伝子のはるか上流の相同領域が各種妨害を
有するという事実、およびDASが0.1グルコースで抑制さ
れかつMOXが抑制されないという事実は、これらの相同
領域がグルコースによるリプレツシヨン／活性化にとつ
ておよび／又はメタノールの存在下発現の誘導にとつて
重要であることを示唆している。この仮定は実際正しい
ことが分つた。したがつて、これらの相同領域の有無は
特定の用途に重要である。例えば、若しMOX遺伝子の−1
052から−987領域又はDAS遺伝子の−1076から−937領域
がメタノールによるMOX又はDASの誘導に重要であるなら
ば、これらの領域の存在はMOX又はDASの発現にとつてお
よび／又はメタノールによる他の酵素の誘導にとつて重
要である。他の例はグルコースによるリプレツシヨンを
避けるためにその領域を除くことであり、炭素源として
グルコースを有するMOXおよび／又はDAS調節領域の影響
下MOXやDHAS以外のタン白質をコードする遺伝子の発現
に必要である。
本発明の一特徴は、H.ポリモーフア由来のMOXおよびD
HASをコードする構造遺伝子の単離および完全な特性化
に関する。更に、H.ポリモーフアにおけるMOXやDHASの
生合成を調節するDNA配列、特にレギユロンやターミネ
ーターの単離と特性化に関する。
更に、H.ポリモーフアCBS4732以外のH.ポリモーフア
菌株、又はH.ポリモーフア以外のハンセヌラ種、又はハ
ンセヌラ以外の酵母、又はカビ又はH.ポリモーフアCBS4
732由来のMOX遺伝子の強力なレギユロンおよびターミネ
ーターをもつ高級ユーカリオートから派生するアルコー
ルオキシダーゼその他のオキシダーゼをコードする遺伝
子の組み合わせに関する。これらの組み合わせはとりわ
けH.ポリモーフア又は関連種由来の自律的復製配列又は
セントロマーを含むミニクロモソーム、および任意には
選択マーカーとテロマーを有するベクターにおくことが
できる。これらの組み合わせはH.ポリモーフアの染色体
DNAに組みこむこともできる。
更に、強力なレギユロン又はその一部およびMOXおよ
び／又はDASのターミネーターおよび部位方向突然変異
生成又は他の方法により、アルコールオキシダーゼその
他のオキシダーゼをコードする変化した構造遺伝子の組
み合わせに関する。これらの変化した構造遺伝子はミニ
クロモソーム中エピソームベクターに組み入れ、又はH.
ポリモーフア、H.ウインゲイ、H.アノマラおよびS.セレ
ビシエその他の酵母の染色体に組みこむことができる。
これ以外に、本発明はオキシダーゼ以外のタン白質を
コードする構造遺伝子とH.ポリモーフアのMOXおよび／
又はDAS遺伝子のレギユロンおよびターミネーターとの
組み合わせに関する。
本発明の非常に重要でかつ望ましい態様は、微生物を
適当な条件下で培養して、任意にはポリペプチドを濃縮
しそして公知方法で集取する。タン白質又は酵素の如き
ポリペプチドの製造法において、組み換えDNA技術によ
り得られかつこのポリペプチドをコードする構造遺伝子
を含む微生物を使い、プロモーターおよびH.ポリモーフ
アCBS4732のMOX遺伝子の−1052から−987領域、又はH.
ポリモーフアCBS4732のDAS遺伝子の−1076から−937領
域、又は他のメチロトローフ型カビ又は酵母の相当する
領域、又はこれらの任意の領域の有効的修飾を含むレギ
ユロンのコントロール下にこの発現を行なう、上記方法
である。
驚くべきことは、第20図に示されかつこゝにMOXとDAS
遺伝子の−1000領域として言及されている当該領域は構
造遺伝子の発現に非常に重要であるということが本発明
により見出された。この領域を除いたMOXレギユロンを
含む組み換え体で行なつた実験は低レベルの発現を示し
た。したがつて、このような−1000領域又はその有効な
修飾（即ちこの領域機能の有意な欠損をおこさない任意
の修飾）を含むレギユロンを使うと、比較的高量の目的
ポリペプチドを製造することができる。
本発明方法の望ましい態様は、当該構造遺伝子が遺伝
子産物を微生物宿主のパーオキシソームすなわち均等の
ミクロボデイに転座させるのに包含されるアミノ酸配列
をコードする１種以上のDNA配列を供した点で特徴があ
る。生成したポリペプチドをパーオキシソームすなわち
均等のミクロボデイに転座させると、その安定性を改善
し、高収率を得る。ある種のポリペプチド特にオキシダ
ーゼでは、このような転座は微生物宿主の生存のために
は肝要である。即ち、微生物宿主細胞がオキシダーゼの
基質で生育する場合に生成する過酸化水素の毒性効果か
ら宿主を守ることである。もしこのオキシダーゼが製造
法に使用する微生物の宿主において機能的であるアドレ
スシグナルを含まないならば、宿主特異的アドレスシグ
ナルをコードする配列を有する構造遺伝子を供すべきで
あつて、例えばこの様な配列を加えるか又はこれらと遺
伝子の最初のアドレス配列と置換する。融合パートナー
が適切なアドレスシグナルを有する融合ポリペプチドの
生産は別の可能性である。メチロトローフ型酵母をこの
製造に使う場合には、DNA配列はパーオキシソーム又は
ミクロボデイにMOX転座させるMOX遺伝子又はその一部か
ら成ることが望ましい。
最後に、本発明の特徴はH.ポリモーフア由来のMOXを
他の酵母において合成することに関する。
アルコールオキシダーゼ産生能を有する若干の微生物
を以下に挙げる。
アルコールオキシダーゼを産生する酵母（リーおよび
コマガタによる分類、1980） グループ１ カンジダ・ボイジニ グループ2a ハンセヌラ・フイロデンドラ ピチア・リンドネリ トルロプシス・ネモデンドラ 〃 ・ピナス 〃 ・ソノレンシス グループ2b カンジダ・カリオシリグニコラ ハンセヌラ・グルコチマ 〃 ・ヘンリチ 〃 ・ミヌタ 〃 ・ノンフエルメンタス 〃 ・ポリモーフア 〃 ・ウイツケルハミ ピチア・ピナス 〃 ・トレハロフイラ グループ2c カンジタ・サクシフイラ トルロプシス・ニトラトフイア グループ３ ピチア・セロビオサ グループ４ ハンセヌラ・カプスラタ ピチア・パストリス トルロプシス・モリシアナ アルコールオキシダーゼを産生するカビ レンジト・トラベア ポリポラス・ベルシカラー 〃 ・オブツサス ポリア・コンチグア アルコールオキシダーゼ以外のオキシダーゼの中で最
も興味のあるものは： −グリセロールオキシダーゼ −アルデヒドオキシダーゼ −アミンオキシダーゼ −アリールアルコールオキシダーゼ −アミノ酸オキシダーゼ −グルコースオキシダーゼ −ガラクトースオキシダーゼ −ソルボースオキシダーゼ −尿酸オキシダーゼ −クロロパーオキシダーゼ；および −キサンチンオキシダーゼ。
H.ポリモーフア由来のMOXおよびDAS遺伝子の強力なレ
ギユロンやターミネーターとオキシダーゼの構造遺伝子
との組み合わせは、特定の宿主又は宿主群に構造遺伝子
を復製できる、例えばH.ポリモーフア由来の配列又はセ
ントロマー（およびテロマー）を、H.ポリモーフアおよ
び関連の酵母又はその他の微生物に移行しうる適切なベ
クターに自律的復製する。
既述したH.ポリモーフア変異株LEU-1とLR9は夫々CBS
に7171と7172の番号で寄託されている。
以下に文献、表、図面を説明する。
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【図面の簡単な説明】
第１図 特異的MOXサブクローンのシークエン化に使用
するエクソヌクレアーゼBal31消化方法。M13mp-8又は−
９、−18又は−19にてサブクローンした断片Ｘ−Ｙをユ
ニークな制限Ｚ部位で切断する。DNA分子は時間依存性
エクソヌクレアーゼBal31消化に供する。 M13シークエンスプライマー近くに位置するDNA断片は制
限酵素Ｙを使つて除く。末端はT4‐DNAポリメラーゼで
培養して平滑末端とし、ついで分子内的に連結させる。
フアージプラークを形質転換後取り上げ、断片をＸ部位
の方向でＺ部位からシーケンスする。逆転複数クローニ
ング部位を有するM13誘導体を使つて、断片をＸ部位の
方向にＺ部位からシーケンスする。 第２図 HARS断片をY1p5の単一SalI部位に挿入して誘導
したpHARSプラスミドの整列。 第３図 HARS-1断片の完全ヌクレオチド配列。 第４図 H.ポリモーフア形質転換体のサザーンハイブリ
ツドによるコピー数の評価。各プローブ８および18mlの
試料を電気泳動にかけた。レーン１はHindIIIとEcoRIで
消化したフアージラムダDNAである。レーン2,3はHindII
I（エム・レイネン、ケイ・ブロイニツヒおよびシー・
ピー・ホレンバーグ、未公表）で消化した組みこみプラ
スミドの２つのコピーを含むＫ・ラクテイスの形質転換
体である。レーン４−７はEcoRIで消化したpRB（４−
５）とYRP17（６−７）でそれぞれ形質転換させたYNN2
7;レーン8,9はEcoRIで消化したYRP17で形質転換させたL
R9;レーン10,11はHindIIIで消化したpHARS2で形質転換
したLR9;レーン12,13はEcoRIで消化したpHARS1で形質転
換したLR9である。 第５図 プラスミドYIp5の組みこみにより形質転換され
たH.ポリモーフア変異株LR9由来のDNAのサザーンブロツ
トのオートラジオグラム。レーン１はHindIIIとEcoRI双
方で消化したフアージラムダDNA;レーン２は未消化のpH
ARS-1;レーン3,5および6,7は２つの異なる形質転換体由
来のDNAを示す。レーン３は未消化；レーン４はEcoRIで
消化；レーン５はPvuIIで消化；レーン６はEcoRIで消
化；レーン７はPvuIIで消化；レーン８はEcoRIで消化；
レーン８はEcoRIで消化したプラスミドYIp5。ニツク翻
訳したYIp5はハイブリツドプローブとして使用した。 第６図 オリゴ（αＴ）セルロースについて一度精製
（レーンＡ）又は二度精製（レーンＢ）した、H.ポリモ
ーフア由来の32p−ラベルしたRNAの電気泳動。電気泳動
は変性7M尿素2.5％ポリアクリルアミドゲルについて行
なつた。酵母rRNA′ｓの位置およびそれぞれの分子量は
18Sと25Sにより示されている。レーンＢに見られる2.3k
bバンドはcDNAプローブに転換し、ついでH.ポリモーフ
アクローンバンクからMOXとDHASを単離するのに使つ
た。 第７図 メタノール活性他H.ポリモーフアmRNAをウサギ
網赤血球リセートで試験管内翻訳した後に得た35S−ラ
ベルしたタン白質。全リセート（レーンＡ）２μｌ又は
MOX特異的抗血性（レーンＢ）を使う残存18μｌの免疫
沈降物を11.5％SDS−ポアクリルアミドゲルで分別し
た。公知の分子量を有するタン白混合物はマーカーとし
て使用した。 第８図 ベツクマン シーケネーターで測定した、精製
MOXのＮ−末端配列。サツカロミセス所望コドンを使つ
て、配列Pro-Asp-Gln-Phe-Aspから誘導しうる２つのプ
ローブ。 第９図 HindIII/SalI切断MOXクローンのDBMブロツトの
ハイブリツド化。このDNAを1.5％アガロースゲル（第9A
図）で分別し、ブロツトをMOX−由来合成DNAプローブ混
合物にハイブリツドした（第８図）。クローン1,4およ
び５の唯一のバンドは、第9A図の矢印に示すように、ハ
イブリツドする（第9B図）。レーンM:分子量マーカー、
レーンA,B,CおよびD:夫々クローン1,3,4および５。レー
ンE:ラムダL47.1。 第10図 MOXクローン４の制限地図。MOX遺伝子のサブク
ローン化およびシークエンス化に使用した適当な制限部
位のみを示してある。構造MOX配列および作つたM13サブ
クローンを含む開口読み取り枠を表わす。使用した制限
部位:B＝BamHI、EI＝EcoRI、EV＝EcoRV、Ｐ＝PstI、Sl
＝SalI、Sc＝SacI、St＝StuI、Ｈ＝HindIII、Sp＝Sph
I、Ｋ＝KpnI、Hg＝HgiAlおよびＸ＝XmaI。 第11図A,B図 MOX構造遺伝子のヌクレオチド配列および
その５′−および３′−フランキング配列。 第12A,C図 ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺
伝がH.ポリモーフアの染色体MOX遺伝子に組みこむこと
によるプラスミドpUR3105の構築。 第12B図 プロモーターMOX−ネオマイシンホスホトラン
スフエラーゼアダプター断片。 第13図 公表されたアミノ酸配列から誘導される。AAO
遺伝子のDNA配列。この遺伝子は約50ヌクレオチド長さ
のオリゴヌクレオチド中H.ポリモーフアの最適コドンに
合成する。サブクローンのために使用する制限部位を示
す。HgiAI-SalI断片は構造AAO遺伝子とMOXプロモーター
間のアダプターを形成する。翻訳開始コドン（met）と
停止コドン（＊＊＊）を示す。構造配列は１〜1044であ
り、MOXプロモーターは−34〜−１である。 第14A図 pUR3003の構築、それによりAAO遺伝子はH.ポ
リモーフアの染色体MOX遺伝子に組みこむ。AAO遺伝子の
活性に関する選択。 第14B図 pUR3004の構築、それによりAAO遺伝子はH.ポ
リモーフアleu-誘導体の染色体MOX遺伝子に組みこむ。l
eu+についての選択。 第14C図 pURS528-03の構築。pCR1配列の除去および二
重lacUV5プロモーターにより、このプラスミドはpURY52
8-03より約2.2kb短かい。 第15図 公表されたアミノ酸配列から誘導した、HGRF遺
伝子のDNA配列。この遺伝子は約50ヌクレオチド長さの
オリゴヌクレオチドにおけるH.ポリモーフアの最適コド
ンに合成する。HgiAI、HindIIIおよびSalI部位はサブク
ローニングのために使用する。HgiAI-HindIII断片は構
造HGRF遺伝子とMOXプロモーター間のアダプターを形成
する。翻訳開始コドン（met）と停止コドン（＊＊＊）
を示す。構造配列は１〜140であり、MOXプロモーターは
−34〜−１である。 第16A図 pUR3203の構築、それによりHGRFをコードする
遺伝子はH.ポリモーフアの染色体MOX遺伝子に組みこ
む。HGRFの免疫活性に対する選択。 第16B図 pUR3204の構築、それによりHGRFをコードする
遺伝子はH.ポリモーフアleu-誘導体の染色体MOX遺伝子
に組みこむ。leu+について選択。 第16C図 pUR3205の構築、それによりHGRFをコードする
遺伝子は、H.ポリモーフアに自律的に復製するHARS-1−
含有プラスミドに挿入される。ura-変異株の形質転換体
により選択。 第16D図 pUR3209の構築、それによりHGRFをコードする
遺伝子は、構造MOX遺伝子に融合した、H.ポリモーフア
の染色体MOX遺伝子に組みこむ。HGRFはCNBr分解により
融合タン白質から切断する。HGRFの免疫活性に関する選
択。 第16E図 pUR3210の構築、それによりHGRFをコードする
遺伝子は、構造MOX遺伝子に融合したHARS-1−含有プラ
スミドに挿入される。第16C図のように選択。 第16F図 pUR3211の構築、それによりHGRFをコードする
遺伝子は、構造MOX遺伝子に融合した、H.ポリモーフアl
eu-誘導体の染色体MOX遺伝子に組みこむ。leu+について
選択。 第17図 公表されたアミノ酸配列から誘導された、HGRF
遺伝子のDNA配列。この遺伝子を第15図のように合成す
るが、構造MOX遺伝子のユニークなKpnI部位に挿入でき
るように構築する。したがつて、遺伝子の両側にKpnI部
位を供した。KpnI-HindIII断片はサブクローニング用に
用いた。合成はMOX酵素に対する融合産物としてであ
る。82位の内部met（ATG）はcys（TGT）に転換する。翻
訳開始（met）および停止（＊＊＊）コドンを示す。 第18A,B,C図 DAS構造遺伝子のヌクレオチド配列とその
５′−および３′−フランキング配列。 第19図 DAS−ラムダクローンの制限地図。唯一の適切
な制限部位を示すが、MOX遺伝子のサブクローンおよび
シーケンス化に用いた。構造DAS配列および作つたM13サ
ブクローンを含む開口読み取り枠が示されている。 第20図 DASとMOX遺伝子の−1000領域における同一配
列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:78） (72)発明者 ヤン マート オランダ国モンスター，モレンストラー ト ２ (72)発明者 コルネリス テオドルス ベリプス オランダ国マースルイス，ハゲドールン 18 (72)発明者 クリスチアン ビザー オランダ国カペル ア／ド イユセル ミノエセルフ 77 (72)発明者 ツビグニエブ アロイツイ ヤノウイク ツ ドイツ連邦共和国エルクラト‐ウンテル フエルトハウス，アダルベルト‐シユテ イフテル‐シユトラーセ 49 (72)発明者 コルネリス ペトルス ホレンベルグ ドイツ連邦共和国ドユツセルドルフ，シ ヨパン‐シユトラーセ ７ (56)参考文献 特開 昭55−50893（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−5093（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−180499（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−77889（ＪＰ，Ａ) Ｅ，Ｊ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．257 ［16］（1982）Ｐ．9872−9877 Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｂｎｏ ｌ．62［１］（1984）Ｐ．77−80

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】微生物がポリペプチドを産生する条件下で
    該微生物を培養し、任意にポリペプチドを濃縮しそして
    公知方法でそれを集取することにより、ポリペプチドを
    製造する方法において、このポリペプチドをコードする
    構造遺伝子を有する形質転換された微生物を使い、その
    構造遺伝子はレギュロンの調節下にあり、そのレギュロ
    ンはプロモーターとハンセヌラ・ポリモーファCBS4732
    のMOX遺伝子の少なくとも次の領域： T CGAAATTTTT GCCGTCGTCG TACAGTGTGA TGTCACCATC GAAT
    GTAATG AGCTGCAGCT TGCGA もしくはハンセヌラ・ポリモーファCBS4732のDAS遺伝子
    の少なくとも次の領域： TA GATATTTTCT GCCTCGTCGT ACTCAACTTT GAACTTCTGC AGC
    TTGTCCA GGCTCTTCTG TAACTGGTCT GTTTTCTCGG TGTGATGCT
    G CTCGGTCACC TGTCGCTCAA TCGCTTCGTA CTCGCTCTGC AGCT
    TCGA の少なくとも一方とから成り、該ポリペプチドをコード
    する構造遺伝子及びレギュロンはベクターによって該微
    生物に導入されることを特徴とする、上記ポリペプチド
    の製造方法。
  2. 【請求項２】プロモーターはハンセヌラ・ポリモーファ
    由来である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】微生物はカビ又は酵母である、特許請求の
    範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】カビ又は酵母はアスペルギルス属、カンジ
    ダ属、ジオトリカム属、ハンセヌラ属、レンジト属、ナ
    ドソニア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラス属、サッ
    カロミセス属、スポロボロミセス属、トルロプシス属、
    トリコスポラ属およびゼンデラ属から選択する、特許請
    求の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】カビ又は酵母はアスペルギルス・ジャポニ
    カス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリ
    ゼ、カンジダ・ボイジニ、ハンセヌラ・アノマラ、ハン
    セヌラ・ポリモーファ、ハンセヌラ・ウインゲイ、クロ
    ッケラsp.2201およびピチア・パストリスから選択す
    る、特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】微生物はハンセヌラ・ポリモーファであ
    る、特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】構造遺伝子は、遺伝子産物をペルオキシソ
    ームすなわち微生物宿主の均等ミクロボディにトランス
    ロケーションする１種以上のDNA配列を有する、特許請
    求の範囲第１項から第６項のいずれか一項に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】DNA配列はMOX遺伝子又はペルオキシソーム
    すなわちミクロボディにMOXトランスロケーションする
    その一部から成る、特許請求の範囲第７項記載の方法。
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