JP2675202B2 - オキシドリダクターゼの製造法 - Google Patents

オキシドリダクターゼの製造法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はオキシドリダクターゼの微生物に
よる製造法に係わる。
【０００２】電子受容体として酸素を使用するオキシド
リダクターゼは漂白組成物や洗剤組成物に使用するのに
適した酵素であり、洗浄又は漂白工程中、漂白剤例えば
Ｈ2 Ｏ2 をその場で生成するのに使用できる。例えば、
−ＧＢ−ＰＳ第1,225,713 号（コルゲート・パルモリ
ブ社）、グルコースとグルコースオキシダーゼの混合物
その他の成分を乾燥粉末洗剤組成物に使用することが記
述されている。
【０００３】−ＤＥ−ＰＡ第2,557,623 号（ヘンケル
＆シイー社）、Ｃ1 〜Ｃ3 アルカノールとアルカノール
オキシダーゼ、又はガラクトースとガラクトース・オキ
シダーゼ、又は尿酸とウラトキシダーゼおよびその他の
成分を漂白性を有する乾燥洗剤組成物として使用するこ
とが記述されている。
【０００４】−ＧＢ−ＰＡ第2,101,167 号（ユニリー
バー社）、Ｃ1 〜Ｃ4 アルカノールとＣ1 〜Ｃ4アルカ
ノールオキシダーゼを液体ブリーチとして又は洗剤組成
物として使用することが記述されている。
【０００５】上記アルカノールと酵素は、組成物が水で
希釈するか又は十分の酸素と接触するまで、実質上の反
応は呈し得ない。
【０００６】今まで、天然のオキシダーゼ／酵素は低コ
ストで製造することができないので、洗剤等の大規模の
工業的用途に不向きであった。更に、オキシダーゼ／酵
素は洗剤や漂白剤に使用した場合、非生理的条件下で作
用させねばならない。さらには洗剤組成物に使用するの
に使われてきた天然のオキシダーゼは天然のカタラーゼ
を伴ない、生成したパーオキシサイドを殆ど直ぐに分解
するので、有効な漂白効果は得られない。したがって、
製造条件下で使用しかつ洗剤や漂白製品の使用に一層適
するオキシダーゼ／酵素の需要がある。
【０００７】これらのオキシダーゼを経済的に有利に製
造するために、細胞タンパク質の20％まで（ファン・デ
イケン等、1976）のＨ．ポリモーファのアルコールオキ
シダーゼのように、発酵方法でこれらの酵素の収率を上
げる必要がある。
【０００８】高量の酵素産生新規微生物を見つけること
又は改良された性質を有する新規オキシダーゼ酵素を見
出す方法はあらゆる種類の微生物をチェックして適切な
オキシダーゼを単離すること、ついでそのパーオキサイ
ド生性能をチェックし、製造条件下および洗剤と漂白製
品の使用条件下のその安定性をチェックすることであ
る。いつの日か適当な酵素が見つかるであろうという望
みがあったが、成功は予見できず、多分非常に低いもの
であろう。
【０００９】別の方法は、これらのオキシダーゼを生成
する天然の微生物を古典的遺伝技術により交雑する試行
錯誤方法を適用することであり、一層生産的な微生物又
は一層適切な酵素を見出すことを期待したが、成功はま
た低かった。
【００１０】高収率でおよび／又はカタラーゼの生成を
伴なわずおよび／または貯蔵や使用中例えば漂白組成物
や洗剤組成物にて改良された性質を有するオキシダーゼ
酵素の調製方法の需要が明らかに存在する。試行錯誤に
よる問題は次の方法により克服することができる。すな
わち、適当な条件下で微生物を培養し、望ましくは酵素
を濃縮し、濃縮した酵素を公知方法により集取してオキ
シダーゼ酵素を製造する方法において、組換えＤＮＡ技
術により得そしてオキシダーゼ酵素を産生し得る微生物
を使用することを特徴とする方法である。
【００１１】オキシダーゼの製造法に使用するのに適す
る微生物は組換えＤＮＡ技術により得ることができる
が、特定の微生物又は微生物群にて構造遺伝子の発現を
調節する１種以上の他のＤＮＡ配列と共に、オキシダー
ゼをコードするＤＮＡ配列（所謂構造遺伝子）により微
生物を形質転換させ、当該配列を含むエピソームベクタ
ーを導入するかあるいは微生物の染色体に組みこみ可能
なＤＮＡ配列を備えた配列を含むベクターによる。
【００１２】５′−および３′−制御側面領域と共に
Ｈ．ポリモーファ由来のアルコールオキシダーゼ（ＥＣ
1.1.3.13 ）をコードする構造遺伝子の決定は、本発明
の範囲を限定するものではないが、本発明の例として記
述する。本発明の精神は、グリセロールオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ等
のその他のオキシダーゼのＤＮＡ配列を単離すること、
ＤＮＡ配列又はその修飾を微生物のゲノムに又は微生物
を形質転換するのに使うエピソームベクターに加えるこ
とおよびこうして得られた形質転換微生物の培養、なら
びに漂白組成にこの酵素を使用することにも適用可能で
ある。
【００１３】使用する微生物はバチルス属の如きバクテ
リアやカビも可能であるが、技術的かつ経済的理由から
酵母を使うのが望ましい。特に、カビ又は酵母はアスペ
ルギルス属、カンジダ属、ゲオトリカム属、ハンセヌラ
属、レンジト属、ナドソニア属、ピチア属、ポリア属、
ポリポラス属、サッカロミセス属、スポロボロミセス
属、トルロプシス属、トリコスポロン属およびゼンデラ
属から選択でき、特にアスペルギルス（Ａ）・ジャポニ
カス、Ａ．ニガー、Ａ．オリゼー、カンジダ・ボイジ
ニ、Ｈ．ポリモーファ、ピチア・パストリスおよびクロ
ッケラ・ｓｐ．2201から選択することができる。後者の
名称は特にＣ．ボイジニの代りに使う。
【００１４】多くのＣ1 資化性酵母は過去１０年間単離
されており、ハンセヌラ・ポリモーファやカンジダ・ボ
イジニについては、メタノール代謝が広く研究されてき
た（ビーンハイス等、1983）。
【００１５】この代謝の第１工程はメタノールがＭＯＸ
により触媒されて、ホルムアルデヒドとＨ2 Ｏ2 に酸化
される。ホルムアルデヒドは更にホルムアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼおよび蟻酸デヒトロゲナーゼの作用により
酸化される。Ｈ2 Ｏ2 はカタラーゼにより分解されて水
と酸素になる。
【００１６】別の形では、メタノールは細胞物質に同化
される。ホルムアルデヒドに転換後、この生成物はキシ
ルロースモノリン酸塩経路を介して炭水化物に固定され
る。ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）はこ
の同化工程上重要な役割をしている。
【００１７】ＭＯＸ、蟻酸デヒドロゲナーゼ、ホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＤＨＡＳおよびカタラーゼ
の出現は例えば 0.5％グルコースで、グルコース抑制を
受ける。しかし、ＭＯＸの合成は、これらの条件下でま
だ十分に抑制される（ロッゲンキャンプ等、1984）、Ｄ
ＨＡＳの合成とは反対に、低濃度グルコース（ 0.1％）
における生育により活性化される。
【００１８】調節、すなわち当該ポリペプチドの遺伝子
をスイッチオン又はオフにする可能性が望ましい。と言
うのは、必要な時、糖蜜の如き適当な基質を選択して、
バイオマスの生産を可能にし、また必要に応じ、メタノ
ール又はメタノールと他の炭素源混合物を使って、目的
のポリペプチドを生産することができるからである。メ
タノールはやや廉価な基質であるから、ポリペプチトの
生産は非常に経済的に行なうことができる。
【００１９】メタノールで生育させてアルコールオキシ
ダーゼ（ＭＯＸ）をコードする遺伝子の活性化後、大き
なミクロボディすなわちペルオキシソームが生成され
る。グルコース生育細胞はほんの僅かのペルオキシソー
ムを含むが、内部容量の８０％までの細胞が活性化状態
でペルオキシソームに置き換る。メタノールがホルムア
ルデヒドとＨ2 Ｏ2 に転換しかつＨ2 Ｏ2 の分解はこれ
らのペルオキシソームにおいておきることが分ったが、
更にホルムアルデヒドの酸化又は同化は大概の場合、細
胞質にておきる。このプロセスは有毒生成物の、いくつ
かの細胞プロセスの強力な同等活性化の、およびこのプ
ロセスに包含される少なくとも２つの酵素の選択的トラ
ンスロケーションの区画分けの完全な例である。
【００２０】メタノール代謝に関与する殆どの酵素は精
製かつ特性化される（サーム，1977、ビストリック等、
1981）。特に、メタノールオキシダーゼ（ＥＣ 1.1.3.1
3 ）は詳細に説明された。それは約７４KdのＭｒ値を有
する同一モノマーから成るオクタマーでありかつ置換基
としてＦＡＤをを含む。今まで、分裂可能なトランスロ
ケーションのシグナル配列は検出されていない。生体内
および試験管内合成物による電気泳動研究（ロアおよび
ブローベル、1983）又はミクロソーム膜の存在下の試験
管内合成（ロッゲンキャンプ等、1984）から結論され
た。
【００２１】活性化条件下で、２０％までの細胞タンパ
ク質がＭＯＸから成る。
【００２２】材料および方法 ａ）微生物および培養条件 ハンセヌラ・ポリモーファＣＢＳ 4732 はジェイ・ピー
・ディケン博士（デルフト工業大学、オランダ）から入
手した。細胞は３００mlの最小培地を含有する１l エル
レンマイヤーフラスコにて３７℃生育させ（ビーンハイ
ス等、1978）、指示通り 0.5％（ｖ／ｖ）メタノール又
は 0.5％（ｖ／ｖ）エタノールを補充した。ファージラ
ムダＬ47.1およびＰ２溶原性大腸菌Ｋ１２株Ｑ 364はピ
ー・ファン・デル・エルセン博士（アムステルダム大
学、オランダ）から入手し、上述通り増殖させた（ロー
ネンおよびブラマー、1980）。
【００２３】大腸菌Ｋ１２株ＢＨＢ2600、ＢＨＢ2688お
よびＢＨＢ2690（ホーン、1979）はエム・ファン・モン
タグ博士（ゲント大学、ベルギー）から入手したが、大
腸菌Ｋ１２株ＪＭ 101、7118およびＭ１３誘導Ｍ１３mp
８，９，１８および１９はベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ社（ゲイサーズバーグ、メリーランド、米国）
から入手した。
【００２４】ｂ）酵 素 使用したすべての酵素はアマーシャム・インタナショナ
ル社、英国から入手したが、α−ヘリカーゼはファーム
・インダストリイ、フランスから入手した。酵素培養は
製造者の指示通りに行なった。ＡＴＰ：ＲＮＡアデニル
トランスフェラーゼはイーデセン等（1982）の記述通り
に精製した。
【００２５】ｃ）他の材料 ［35Ｓ］メチオニン、［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−32
Ｐ］ｄＮＴＰ′ｓ、［α−32Ｐ］ＡＴＰおよび［γ−32
Ｐ］ＡＴＰはアマーシャム・インタナショナル社、英国
から入手した。
【００２６】ニトロベンジルオキシ−メチル（ＮＢＭ）
紙はシュライアーおよびシュールから入手し、製造者の
指示通りジアゾ型（ＤＢＭ）に転換した。
【００２７】ニトロセルロースフィルター（ＨＡＴＦ
型）はミルポアから入手した。
【００２８】ＲＮＡ単離、分画化および分析 Ｈ．ポリモーファはメタノール又はエノタールの存在下
中間対数段階まで生育させた。この細胞は、１０mMトリ
ス−ＨＣｌ pＨ８、５mM ＭｇＣｌ2 、１％ＮａＣｌ、
６％パラ−アミノサリチル酸、１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）および５％フェノール含有バッファーに
て、16,000 psiのフレンチプレスで繰り返し加圧して破
砕した。ポリアデニール化ＲＮＡの精製は上述通り（イ
ーデン等、1982）、続いて行なった。１ｇ細胞から４mg
の全ＲＮＡと0.1 mgポリアデニール化ＲＮＡを得た。全
ＲＮＡはポリアデニール化ＲＮＡの４μｇ試料はＡＴ
Ｐ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼおよび［α−32
Ｐ］ＡＴＰでその３′−末端をラベルし、ついで７Ｍ尿
素含有 2.5％ポリアクリルアミドゲルで分別した（イー
デン等、1982）。特異的ｍＲＮＡフラクションの分取単
離については、４０μｇポリアデニール化ＲＮＡをラベ
ルしたポリアデニール化ＲＮＡ４μｇと混合し、変性ポ
リアクリルアミドゲルで分別した。放射性2.4Kb ＲＮＡ
クラスをゲルスライスから溶離し、ついで２０℃ＳＷ６
０ローターを使ってベックマン遠心分離機にて24,000 r
ev／分で１５時間、１００mM ＮａＣｌ、１０mMトリス
−ＨＣｌ pＨ 7.5、１mM ＥＤＴＡおよび 0.1％ＳＤＳ
にて５〜３０％グリセロール勾配で遠心分離して不純物
を除いた。放射性フラクションを集め、エタノールで沈
澱させた。ポリアデニール化ＲＮＡはプリカーサーとし
て［35Ｓ］メチオニンを使い、ペルハムとジャクソン
（1976）により、ウサギ網赤血球リセート中試験管内に
て翻訳させた。翻訳産物はバレリオ等（1983）に記述さ
れたＭＯＸ抗血清で免疫沈降させた。
【００２９】ｃＤＮＡ合成 ポリアクリルアミドゲルから単離したＲＮＡフラクショ
ン 1／3 は逆転写酵素で放射性ｃＤＮＡを得るために使
用した（イーデン等、1982）。高放射活性（3,000 Ci／
mM以上）の［α−32Ｐ］ｄＡＴＰおよび［α−32Ｐ］ｄ
ＣＴＰを使って、高分子量ｃＤＮＡ 20000 cpmをヒト胎
盤リボヌクレアーゼインヒビターの存在下４２℃で１時
間生成させた。
【００３０】ＤＮＡ単離 １０ｇのＨ．ポリモーファ細胞を１Ｍソルビトールで洗
い、１００ml 1.2Ｍソルビトール、１０mM ＥＤＴＡ、
および１００mMクエン酸 pＨ 5.8にて再懸濁させ、それ
に１００μl β−メルカプトエタノールを加えた。細胞
を５００mgα−ヘリカーゼで３０℃／１時間培養してス
フェロプラスト化した。スフェロプラストはソルバール
ＧＳＡローターにて 4,000 rev／分で遠心分離して集
め、４０ml２０mMトリス−ＨＣl ｐＨ８、５０mM ＥＤ
ＴＡに再懸濁させ、2.5％ＳＤＳを加えて分解した。不
完全に分解した細胞はソルバールＳＳ３４ローターにて
20,000 rev／分で３０分間ペレット化し、そしてＤＮＡ
は６０Tiローターを使ってベックマン遠心機中35,000 r
ev／分で４８時間ＣｓＣｌ−臭化エチジウム密度勾配を
使って遠心分離して粘稠な上澄液から単離した。２mgの
ＤＮＡは平均長さ３０Kbで単離した。
【００３１】ファージラムダＬ47.1におけるクローンバ
ンクの調製 １５０μg Ｈ．ポリモーファＤＮＡを部分的にＳａｕ３
ＡＩで消化し、SW２５ローター中23,000 rev／分で２２
時間１M ＮａＣｌ、２０mMトリス−ＨＣｌ pＨ８および
５mM ＥＤＴＡにて１０〜４０％ショ糖勾配で沈降させ
た。勾配物を分画化し、フラクション試料はＴＢＥバッ
ファー（８９mMトリス、８９mMホウ酸、2.5 mM ＥＤＴ
Ａ）中 0.6％アガロースゲルで分別した。
【００３２】５〜２０KbのＤＮＡを含むフラクションを
集め、ＤＮＡはエタノールで沈澱させた。ファージラム
ダＬ47.1を生育し、そのＤＮＡはリーデボアー等（198
4）の記述により単離した。そのＤＮＡをＢａｍＨＩで
消化し、アームはマニアティス等（1982）の記述により
酢酸カリウム勾配で遠心分離して単離した。こうして得
られた２μｇファージラムダＤＮＡアームと 0.5μｇＳ
ａｕ３ＡＩ消化Ｈ．ポリモーファＤＮＡを連結し、ホー
ン（1979）のプロトコールを使って試験管内でパッケー
ジした。ファージは１４cmペトリ皿当り20,000 pfuのプ
ラーク密度まで大腸菌株Ｑ３６４にブレートした。プラ
ークはニトロセルロースフィルター（ベントンとデイビ
ス、1977）にブロットし、そのブロットは上記のように
単離した放射性ｃＤＮＡプローブとハイブリッドさせ
た。ハイブリッド条件はリーデボアー等（1984）に記載
と同じであり、ハイブリッドするプラークはオートラジ
オグラフィにより検出した。
【００３３】アルコールオキシダーゼ（ＭＯＸ）の単離
および部分的アミノ酸配列の分析 メタノールで生育させたＨ．ポリモーファ細胞を超音波
により分解し、細胞片は遠心分離により除いた。ＭＯＸ
含有タンパク質フラクションは（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 沈澱
により単離した（４０〜６０％飽和）。沈澱物を透析
後、ＭＯＸはイオン交換クロマトグラフィ（ＤＥＡＥ−
セファロース）およびゲル濾過（セファクリンＳ−４０
０）によりカタラーゼその他のタンパク質から分別し
た。ＭＯＸに対する抗体は完全および不完全フロインド
アジュバント（デイフュ、米国）を使う常法によりウサ
ギにて生成させた。過蟻酸で処理したアルコールオキシ
ダーゼの配列分析はベックマンのシークエネーターで行
なった。残渣の同定はＨＰＬＣで行なった。アミノ酸組
成は標準法を使い、ニンヒドリンで染色させて、クロマ
スペックアナライザー（ランク、ヒルガー、英国）で測
定した。カルボキシ末端アミノ酸はアンブラー（1972）
の記述により測定した。
【００３４】デオキシオリゴヌクレオチドの化学合成 デオキシオリゴヌクレオチドはホスファイト技術（マッ
チュシとカルーサズ、1981）を使って、バイオサーチＳ
ＡＭＩジーンマシーンで合成した。それをＴＢＥ中１６
％又は２０％ポリアクリルアミドゲルで精製した。
【００３５】デオキシオリゴヌクレオチドプローブとの
ハイブリッド デオキシオリゴヌクレオチドをＴ4 −ポリヌクレオチド
キナーゼおよび［γ−32Ｐ］ＡＴＰでラベルした。得ら
れたＭＯＸクローンのＤＮＡは各種制限酵素で消化し、
１％アガロースゲルで分別し、ＤＢＭ紙にブロットし
た。ハイブリッド化はウォーレース等（1981）の記述に
より行なった。
【００３６】ＤＮＡ配列分析 完全ＭＯＸ遺伝子を含むクローン４（例１参照）から、
いくつかのサブクローンを標準技術により、ファージＭ
１３mp−８、−９又はＭ１３mp−１８、−１９誘導物に
て作った。２つのオリエンテーションでクローンした小
さいサブクローン（0.5 Kb未満）は両側から直接シーク
エンスした。２つのオリエンテーションでクローンした
大きなサブクローンから、エクソヌクレアーゼＢａｌ 3
1 消化法（第１図参照）により配列データを得た。両ク
ローン化オリエンテーションの各々について、ＲＦＭ１
３ＤＮＡは、望ましくはインサートの中心でのみ分解す
る制限酵素で消化する。続いて、クローンの両オリエン
テーションをこのユニークな部位で切断し、各種時間間
隔でエクソヌクレアーゼＢａｌ 31 で消化した。約１０
０〜１５０ヌクレオチドが各間隔で除かれるように、培
養時間と条件を選んだ。ついで、配列反応がＭ１３誘導
物にてプライムする位置近くにある制限部位を認識する
制限酵素で各フラクションを消化した。Ｔ4 −ポリメラ
ーゼおよびすべてのｄＮＴＰ′ｓで培養して平滑末端と
し、全ミックスを希釈条件下で連結して、内部ＲＦ分子
を形成させる。全連結ミックスは大腸菌株ＪＭ 101〜71
18に形質転換させるのに使った各時間間隔から、いくつ
かのプラークを拾い出し、サンガーのシーケンスプロト
コール（ビギン等、1983）の最近記述された変法を使っ
て配列決定した。
【００３７】栄養要求変異体の単離 ＬＥＵ−１（ＣＢＳ7171）はβ−イソプロピルマレート
デヒドロゲナーゼ活性を欠くＨ．ポリモーファ株ＮＣＹ
Ｃ 495の栄養要求体である。この変異株の単離はグリー
スン等（1984）により記載された。
【００３８】ＬＲ９（ＣＢＳ7172）はオロチジン５′−
デカルボキシラーゼ活性を欠く、Ｈ．ポリモーファＡＴ
ＣＣ 34438の栄養要求株である。
【００３９】単離のために、この酵母の最適生育温度で
ある３７℃の代りに、３０℃で全操作を行なった。酵母
細胞は３％エチルメタンスルホネートで２時間突然変異
させた（フィンク、1970）。反応は６％チオ硫酸ナトリ
ウム（最終濃度）で止め、溶液を更に１０分培養した。
突然変異細胞を一度Ｈ2 Ｏで洗い、分離のためにウラシ
ルを補給したＹＥＰＤ又はＹＮＢで２日培養し、ウラシ
ル−栄養要求体を増やし、ついで窒素源のないＭＭで１
５時間培養を行なった。最後に、１０μｇ抗生物質／ml
の濃度を含むＭＭにて１２時間ナイスタチン強化を行な
った。処理した細胞は 200μｇウラシル／mlおよび0.8m
g ５−フロロオロチン酸を含むＹＮＢプレートで培養し
た（ボーク等、1984）。通常１０6 細胞を単一プレート
で培養した。培養３日後に耐性コロニーを取り出し、レ
プリカをＹＮＢプレートで２度培養して栄養要求株を樹
立させた。栄養要求変異株から、ｕｒａ- 細胞を単離し
た。別法として、 1.5×１０6 酵母細胞は、 200μｇウ
ラシルと0.8mg ５−フロロオロチン酸を補給したＹＮＢ
液体培地１mlにて培養させた。２日間の培養後、処理細
胞をウラシル含有ＹＮＢで平板培養し、レプリカは２度
ＹＮＢで平板培養し、上記の通り分析した。このような
耐性変異株はサッカロミセス・セレビシエのＵＲＡ３又
はＵＲＡ５座に影響を与えたウラシル要求株であること
が分った（エフ・ラクルート、私信）。試験したＨ．ポ
リモーファの約６００耐性コロニーの内、５２がウラシ
ル表現型を示した。Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３とＵＲＡ
５変異はオロチジン５′−デカルボキシラーゼとオロチ
ジン５′−リン酸塩ピロホスホリラーゼをそれぞれ欠く
（ジョーンズとフィンク、1982）から、Ｈ．ポリモーフ
ァの生成ウラシル栄養要求株は両方の酵素活性について
調べた（リーベルマン等、1955）。２つの酵素のいずれ
かに影響を与えた変異株が見つかった（表Ｉ）、それら
をそれぞれＯｄｃｌとＯｐｐｌ変異株と名付けた。Ｏｄ
ｃｌ変異株は低復帰頻度を示し（表 II ）、相補により
形質転換の目的のために適している。
【００４０】Ｈ．ポリモーファ由来の自律性複製配列
（ＨＡＲＳ）の単離 Ｈ．ポリモーファ由来の染色体ＤＮＡをＳａl Ｉ又はＢ
ａm ＨＩで一部消化し、組みこみプラスミドＹＩｐ５の
単一Ｓａl ＩとＢａm ＨＩ部位にそれぞれ連結させた。
大腸菌 490をアンピシリン耐性に形質転換するために、
この連結混合物を使用した。ＹＩｐ５は選択マーカーと
してＵＲＡ３遺伝子を含む組みこみプラスミドである
（スチンチコーム等、1980）。
【００４１】Ｈ．ポリモーファＳａl Ｉクローンのプラ
スミドプールはＨ．ポリモーファ変異株ＬＲ９を形質転
換するのに使用した。全体に２７の形質転換体を得、β
−ラクタマーゼ試験で陽性であった。これらのすべてか
ら、大腸菌 490を酵母ミニリセートと共に形質転換後プ
ラスミドを回収した。プラスミドの制限分析によれば、
殆どのインサートは同じパターンを示した。それぞれ
0.4と0.6 Kbのインサートを含む、２つの異なったプラ
スミド、pHARS １とpHARS ２は更に研究用に使用した
（第２図）。ポリエチレングリコールで処理した完全の
細胞の形質転換操作を使って、ＤＮＡ１μｇ当り約 500
〜1,500 の形質転換体の頻度で、両プラスミドはＨ．ポ
リモーファ変異株ＬＲ９を形質転換させる。大腸菌プラ
スミド処方物から回収したpHARS １とpHARS ２で再形質
転換後Ｈ．ポリモーファ形質転換体のサザーン分析は予
期したプラスミドバンドを示し、ウラシルプロトロフィ
の原因として、ＵＲＡ３遺伝子の組みこみを排除する。
したがって、ＡＲＳ１様ＨＡＲＳ配列（スチンチコーム
等、1982）はＨ．ポリモーファの自律的複製を行なうと
結論する。ＨＡＲＳ１もＨＡＲＳ２もＳ．セレビシエで
は自律的複製はできなかった。ＨＡＲＳ１は第３図に示
すように、完全に配列を決定された。
【００４２】Ｈ．ポリモーファにおけるプラスミドコピ
ー数の評価 ＡＲＳ配列又はＨＡＲＳ配列によりＨ．ポリモーファに
自律的複製を与えるプラスミドのコピー数はサザンブロ
ット分析により評価した（第４図）。比較のために、５
〜１０個のコピー数／細胞（ストルール等、1979）を有
するＳ．セレビシエのプラスミドＹＲＰ１７（第４図、
レーン６、７）および細胞当り約３０〜５０のコピーを
有するＳ．セレビシエの高コピー数プラスミドｐＲＢ５
８（第４図、レーン４、５）を使った。ＹＲＰ１７はＵ
ＲＡ３−含有酵母プラスミドであり、ＡＲＳ配列は（ス
チンチコーム等、1982）を有するが、ｐＲＢ５８はＵＲ
Ａ３遺伝子を含有する２μｍ誘導体である（カールソン
とボトスタイン、1982）。ｐＢＲ３２２の２つの組みこ
みコピーを有するクルイベロミセス・ラクチス形質転換
体はコントロールとして使用した（第４図、レーン２、
３）。オートラジオグラムの染色度が示すところでは、
Ｈ．ポリモーファのプラスミドＹＲＰ１７はＳ．セレビ
シエのコピー数と実質的に同じであるが、プラスミドｐ
ＨＡＲ−１とｐＨＡＲＳ−２はＳ．セレビシエのｐＢＲ
５８のように細胞当り約３０〜４０のコピー範囲である
コピー数を示す。このことはＨＡＲＳ配列の自律的に複
製する性質を再度証明するものである。
【００４３】形質転換操作 いくつかのプロトコールを使用した。
【００４４】ａ） Ｈ．ポリモーファ株ＬＥＵ−１はベ
ッグズ（1978）の方法を使って形質転換させた。菌株は
激しく空気をおくり乍ら３７℃で、 0.5のＯＤ600 まで
５００ml ＹＥＰＤ液体培地に生育させた。細胞を採
り、２０ml蒸留水で洗い、２０mlの1.2 Ｍソルビトー
ル、２５mM ＥＤＴＡ pＨ 8.0、150 mM ＤＴＴに再懸
濁させ、室温で１５分培養した。細胞を遠心分離により
集め、２０ml 1.2Ｍソルビトール、0.01Ｍ ＥＤＴＡ、
0.1Ｍクエン酸ナトリウム pＨ 5.8および２％v/v β−
グルクロンダーゼ溶液（シグマ1500000 ユニット／ml）
にとり、３７℃で 105分培養した。１時間後、β−グル
クロニダーゼの最終濃度を４％v/v にした。形質転換の
ために、プロトプラスト３mlを７mlの氷冷 1.2Ｍソルビ
トール、１０mMトリス−ＨＣｌ pＨ７に添加した。プロ
トプラストを2000 rpmで５分間遠心分離により採取し、
氷冷ソルビトールバッファーで３度洗った。洗った細胞
を氷上 0.2ml 1.2Ｍソルビトール、１０mM ＣａＣ
ｌ2、１０mMトリス−ＨＣｌ pＨ７に再懸濁させた。２
μｇのＹＥＰ１３ ＤＮＡ−Ｓ．セレビシエのＬＥＵ２
遺伝子および２ミクロン−Ｏｒｉ（ブローチ等、1979）
から成る自律的複製Ｓ．セレビシエプラスミド−を細胞
１００mlに加え、室温で培養した。２０％ＰＥＧ４０
０、１０mM ＣａＣｌ2 、１０mMトリス−塩酸 pＨ 7.5
の溶液 0.5mlを加え、全体の混合物を室温で２分間培養
した。細胞を短時間（５秒）遠心分離で高速度にセット
したＭＳＧマイクロフェージに集め、 0.1 ml ＹＥＰＤ
1.2ＭソルビトールｐＨ7.0 に再懸濁させ、室温で１５
分培養した。細胞は、２％ディフコ寒天、２％グルコー
ス、0.67％ディフコ酵母窒素塩基およびＬ−アデニンヘ
ミサルフェート、メチオニン、ウラシル、ヒスチジン、
トリプトファン、リジンおよび 1.2Ｍソルビトールの各
々を２０mg／ｌ含有するプレートに拡げて表面に直接培
養した。Ｌｅｖ+ 形質転換体は３７℃で５日培養した
後、５０コロニー／μｇ ＤＮＡの頻度で生じたが、Ｄ
ＮＡを添加しない場合は形質転換体は生じない。
【００４５】ｂ） 別法として、Ｈ．ポリモーファＬＥ
Ｕ−１をダス等（1984）の方法を使って、ＹＥＰ１３で
形質転換させた。指数的に生育する細胞を0.4 のＯＤ
600 まで生育させ、ＴＥバッファー（５０mMトリス−Ｈ
Ｃｌ pＨ 8.0、１mM ＥＤＴＡ）にて洗い、２０mlＴＥ
バッファーに再懸濁させた。0.5 ml細胞を３０℃で１時
間0.5 ml 0.2Ｍ ＬｉＣｌで培養した。これらの細胞１
００mlに、２０mlＴＥバッファー中４μｇＹＥＰ１３を
加え、その試料を更に３０分間３０℃で培養した。等容
量の７０％v/v ＰＥＧ 4000 を加え、混合物３０℃で１
時間培養し、続いて４２℃で５分間培養した。１mlの水
を加えた後、細胞を上記ａ）のように短時間遠心分離で
集め、２度水で洗い、0.1ml ＹＥＰＤ 1.2Ｍソルビトー
ルに再懸濁させ、室温で１５分培養した。細胞は上記の
通り平板培養した。Ｌｅｕ+ 形質転換体は３０／μｇ
ＤＮＡの頻度で生じる。
【００４６】ｃ） Ｈ．ポリモーファＵＲＡ変異株ＬＲ
９は選択マーカーとしてＳ．セルビシエのＵＲＡ３遺伝
子およびＳ．セレビシエの自律的複製配列（ＡＲＳ）を
含むブラスミド、ＹＲＰ１７で形質転換させた（スチン
チコーム等、1982）。ベッグズ（1978）のプロトプラス
ト方法を使って、２〜５形質転換体／μｇ ＤＮＡを得
た。イトー等（1983）のＬｉＳＯ4を使って、この数を
１５〜２０形質転換体／μｇ ＤＮＡまで拡げた。しか
し、最良の方法は、ＰＥＧ4000で処理した完全細胞を使
う、クレベ等（1983）の方法であった。３００までの形
質転換体がＤＮＡμｇ当り得られた。ＬｉＳＯ4 法なら
びにクレベ法は３７℃で行なった。
【００４７】ベクターの自律的複製によるＨ．ポリモー
ファの形質転換には２つの特徴がある：（１）ウラシル
+ 表現型の不安定性。形質転換体をＹＥＰＤで１０世代
生育させた後、９９％以上が選択培地で生育する能力を
失った（表 II ）。（２）自律的複製は大腸菌を酵母ミ
ニリセート形質転換しかつＨ．ポリモーファの再形質転
換により更に確かめられた。続くサザン分析により、期
待したプラスミドの存在を示した。
【００４８】Ｈ．ポリモーファＬＲ９はｐＲＢ５８で又
はｐＨＨ８５で形質転換することができず、全２ミクロ
ン環状ＤＮＡ（ホレンバーグ、1982）をプラスミドＹＩ
Ｐ５のアンピシリン遺伝子のＰｓｔＩ部位に挿入して構
築される。ＨＡＲＳ１又はＨＡＲＳ２のＤＮＡ配列を含
むＹＩＰ５はクレベのプロトコールを使って、ＤＮＡμ
ｇ当り 500〜1500の形質転換体の頻度でＨ．ポリモーフ
ァＬＲ９に移した。したがって、形質転換頻度は、Ｓ．
セレビシエのＹＲＰ１７における異種構造ＡＲＳ１を使
う、上記よりも２〜５倍高い。同様に、形質転換体中の
ＨＡＲＳプラスミドの安定性はＡＲＳ１プラスミドより
僅かに高い（表 II ）。
【００４９】Ｓ．セレビシエ由来のＵＲＡ３遺伝子を組
みこむことによるＨ．ポリモーファの形質転換 Ｓ．セレビシエのＵＲＡ３遺伝子は、Ｈ．ポリモーファ
の染色体ＤＮＡに対しニック翻訳したＹＩｐ５プラスミ
ドＤＮＡのサザンハイブリッドにより示されるように、
Ｈ．ポリモーファのＯＤＣ遺伝子に対し類似性を示さな
い。したがって、Ｈ．ポリモーファゲノムのランダム部
位へのＵＲＡ３遺伝子の低頻度組み込みを予期しなけれ
ばならなかった。変異体ＬＲ９を組みこみベクターＹＩ
ｐ５で形質転換すると、ポリエチレングリコール法を使
うＹＮＢプレートでは３０〜４０コロニー／μｇ ＤＮ
Ａとなったが、Ｓ．セレビシエ変異体ＹＮＮ２７の形質
転換のためにＹＩｐ５を使う対照実験では形質転換体は
得られなかった。３８個の形質転換体の分析では、非選
択的培地で生育させた後、４つの安定な組み込み体を示
した。組みこみについては更にサザン分析（第５図）に
より証明した。
【００５０】ＵＲＡ３遺伝子をＨ．ポリモーファの染色
体ＤＮＡに組みこむ第２の操作は、プラスミドpHARS １
を有する形質転換体から安定なＵｒａ+ 形質転換体を増
やして行った。形質転換体はｍｌ当り１０9 細胞密度ま
で液体ＹＥＰＤ中で生育させた。５×１０6 細胞を含む
試料を使って、新しい培地１００mlに接種し、そしてml
当り１０9 の細胞密度まで生育させた。約１００世代に
なるまでこの操作を繰り返した。変異株ＬＲ９の復帰率
（renersion rate）は２×１０-9でありかつ１０世代当
りのプラスミドロス頻度はpHARS １形質転換体で９７％
であるから、１００世代後のＵｒａ+ 細胞の主部分は組
みこみ体であるべきである。試験したＵｒａ+ コロニー
は、ＵＲＡ３遺伝子の組みこみを示す安定なＵｒａ+ 表
現型を維持することを示した。このことは更にサザンブ
ロット分析により確認された。更に、組みこみ頻度は５
×１０-6であることをこれらのデータは示している。
【００５１】例 １ ハンセヌラ、ポリモーファ由来のアルコールオキシダー
ゼ（ＭＯＸ）の遺伝子のクローニングポリアデニール化ＲＮＡの特性 メタノールで生育させた細胞から単離した、全体のＲＮ
Ａとポリアデニール化ＲＮＡはその３′−末端で、ＡＴ
Ｐ：ＲＮＡアデニルトランスフェラーゼでラベルし、変
性ポリアクリルアミドゲルで分別した（第６図）。ｒＲ
ＮＡは別にして、２群のＲＮＡはそれぞれ長さ１Kbと
２．３Kbで、ポリアデニール化ＲＮＡレーンにみられ
る。これらのＲＮＡ群はエタノール生育細胞のポリアデ
ニール化ＲＮＡにみられない（結果は示してない）か
ら、メタノールで生育させて活性化した遺伝子の転写で
あることは明らかである。2.3 Kb群は非翻訳配列の長さ
により、700 から800 のアミノ酸のタンパク質をコード
しうる。同様に、１Kb群は 250〜300 アミノ酸のタンパ
ク質をコードする。メタノールで生育させて活性化され
かつ 700〜800 のアミノ酸鎖を有する酵素は大概ＭＯＸ
（カトー等、1976；ロアとブローベル、1983）とＤＨＡ
Ｓ（ビストリック等、1981）である。 250〜300 アミノ
酸範囲における活性化酵素は多分ホルムアルデヒドと蟻
酸デヒドロゲナーセゼ（シュッテ等、1976）である。ポ
リアデニール化ＲＮＡは網赤血球細胞のない翻訳系にお
ける試験管内翻訳により更に特徴づけられた。２μl の
ポリアデニール化ＲＮＡ指向タンパク混合物を１０％Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルで直接分別し、一方残りの
１８μｌはＭＯＸに対する抗血清で免疫沈降させた（第
７図）。夫々７８Kd、７４Kd、５８Kd、４２Kd、３９Kd
および３６Kdの分子量を有する６つの強いバンドが全体
のタンパク混合物で優位を占めている。本質的に、同一
分子量はメタノール生育Ｍ、ポリモーファ細胞由来の全
体の細胞抽出物において、ロアとブローペル（1983）に
より見出された。
【００５２】７４Kdタンパク質は取敢えずＭＯＸのモノ
マーに、５８Kdタンパク質はカタラーゼのモノマーに、
そして３９Kdと３６Kdのタンパク質は夫々ホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼと蟻酸デヒドロゲナーゼのモノマ
ーに当てることができる。78Kdポリペプチドは多分ＤＨ
ＡＳであり、４２Kdポリペプチドは未同定のままであ
る。免疫−沈降後、両方の高分子量タンパク質はＭＯＸ
抗血清と反応する。
【００５３】ＭＯＸ遺伝子のクローニング メタノールで生育させて誘導した２．３Kb ｍＲＮＡ群
は明らかに少なくとも２つのポリペプチドをコードする
が、ハイブリッド化によるＨ．ポリモーファクローンバ
ンクをスクリーニングするのに良好な候補と思えた。部
分的にＳａｎ３ＡＩ消化Ｈ．ポリモーファＤＮＡの５〜
２０KbフラクションはファージラムダＬ47.1でクローン
した。
【００５４】インサートＤＮＡμｇ当り、300,000 プラ
ークが得られたが、背景は１：1000未満であった。約2
0,000のプラークを含む２つのベントンデイビスブロッ
トはｍＲＮＡ誘導ｃＤＮＡブローブの15,000 cpmとハイ
ブリッドした。オートラジオグラフ３週間後、約４０〜
５０のハイブリッド性プラークが検出できた。すべての
プラークを取り出し、５つを低密度で平板培養しそして
ｃＤＮＡプローブで第２のハイブリッド化により精製し
た。４つから、単一ハイブリッドプラーク（１，３，
４，５）ＤＮＡを単離した。インサートの長さは８〜１
３Kbであった。
【００５５】有機合成ＤＮＡプローブを使うハイブリッ
ド選択 精製ＭＯＸのアミノ末端の３０アミノ酸の配列を測定し
た（第８図）。Ｓ．セレビシエの最も豊富なコドンを使
って、１４塩基の配列をこのタンパク質配列の部分から
誘導できた。不明確は唯一である。第４図に示した両プ
ローブを合成した。両プローブには、ＥｃｏＲＩ部位が
存在する。ＤＢＭブロットは制限酵素ＢａｎＨＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ／Ｈｉｎｄ III、Ｍｉｎｄ III／ＳａｌＩおよび
ＰｓｔＩ／ＳａｌＩで消化したＭＯＸクローンのＤＮＡ
から作り、 1.5％アガロースゲルで分別した。このブロ
ットを放射線ラベルしたプローブの混合物とハイブリッ
ドした後、クローン１、４および５はハイブリッドした
が、クローン３はしなかった。第９図のＨｉｎｄ III／
ＳａｌＩブロットに示す。しかし、このプローブはこれ
らのクローンのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 消化ＤＮＡと
ハイブリッドしなかった（結果示さず）。ＥｃｏＲＩ部
位はプローブに存在するから、クローン中のハイブリッ
ド性ＤＮＡはこの酵素によっても切断されよう。結局、
ハイブリッド化オーバラップは非常に小さくなったの
で、安定なハイブリッドを生成しない。 制限地図と配列分析 制限酵素消化物を比較しかつ交差ハイブリッド化実験に
より、クローン１、４および５は同一のＤＮＡストレッ
チをカバーした。
【００５６】このクローン化ＤＮＡのストレッチの性質
を明確に樹立するために、クローン４のインサートを詳
細に分析した。アミノ末端プローブとのハイブリッド化
によれば、完全ＭＯＸ遺伝子（約２Kb）が存在し、２Kb
配列上流と３．５Kb下流を含む（第１０図）ことを示し
た。
【００５７】最終のＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列分析
は、アミノ酸配列分析により測定した様に、ＭＯＸのア
ミノ末端に相当するヌクレオチド配列を明らかにした。
【００５８】配列分析について、いくつかの断片を第１
０図に示すように、２つのオリエンテーションで夫々Ｍ
１３mp８／Ｍ１３mp９又は１３mp１８／Ｍ１３mp１９に
てサブクローンした。０．５Kbより小さいクローンは両
側から直接シーケンスした。より大きいクローンはクロ
ーン化断片の中央に位置するユニークな制限部位で切断
し、「材料と方法」に記述したエクソヌクレアーゼＢａ
ｌ３１消化サブクローンを生成した。特異的オリゴヌク
レオチドプライマーを使って、サブクローン化に使う制
限部位周囲の配列および明白な配列測定のできない配列
は、全配列をカバーする５．５Kb ＢａｍＨＩ／Ｓａｃ
Ｉサブクローンを使って、もう一度シーケンスした。完
全なヌクレオチド配列は第１１Ａと１１Ｂ図に示す。
【００５９】この配列は６６４アミノ酸のタンパク質を
コードしうる2046ヌクレオチドの開放読み取り枠を含
む。開放読み取り枠の最後のコドンはＰｈｅをコード
し、精製ＭＯＸのカルボキシ末端と一致している。この
タンパク質をコードするＤＮＡ配列由来のアミノ酸組成
および精製ＭＯＸのアミノ酸組成は事実上同一である
（表III ）。唯一の重要な差異はセリンとスレオニン残
基を含むことであり、それらは周知通り測定するのが難
しい。
【００６０】タンパク質の計算分子量は74,050ドルトン
であり、ＭＯＸの７４Kdの分子量とよく一致する（ポリ
アクリルアミド／ＳＤＳゲルで測定）。
【００６１】コドンの使用頻度 表IVには、ＭＯＸのコドン使用頻度が示されている。選
択的数のコドンを使う傾向が明らかである。
【００６２】例 ２ プラスミド、ｐＵＲ 3105 の構築、それにより抗生物質
Ｇ418 に耐性を示すネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼをコードする遺伝子がＭＯＸレギュロンの管理下で
染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。
【００６３】プラスミドＹＥＰ１３、ＹＲＰ１７、pHAR
S １又はpHARS ２で形質転換したＨ．ポリモーファ細胞
は不安定でかつ非選択的条件下生育10世代後既にその l
eu+ 又はｕｒａ+ 表現型を失った。安定な形質転換体を
得るためかつＭＯＸプロモーターを試験するために、プ
ラスミドｐＵＲ 3105 が構築するが、ネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯR ）はＭＯＸレギ
ュロンの直接管理下になる。ＮＥＯR 遺伝子の最初のＡ
ＴＧがＭＯＸレギュロンの１．５Kbに結合するように、
構築される。このような大きなレギュロン断片のクロー
ニングは必要であり、レギュロンの−1000領域を含まな
い短い断片は余り有効でないからである。
【００６４】ＮＥＯR 遺伝子は、最初のＡＴＧの下流３
５bpからＴＧＡ翻訳停止コドン下流240 bpまでに位置す
るトランスポソンＴｎ５由来の１．１Kb Ｘｍａ III−
ＳａｌＩ断片として単離した。複雑な連結混合物を避け
るために、最初のｐＵＲ3101を構築し（第１２Ａ図）、
これはＭＯＸレギュロンのはるか上流ＳａｌＩ−Ｘｍａ
III （−1510から−1128）断片とＭ１３mp９にサブクロ
ーンしたＮＥＯR 遺伝子の融合である。他のプラスミド
ｐＵＲ 3102 が構築され、全ＭＯＸレギュロンを殆どカ
バーするＭＯＸ遺伝子の１．５Kb ＳａｌＩ−ＨｇｉＡ
Ｉ断片はＭＯＸ−ＮＥＯR アダプター（第１２Ｂ図）配
列に連結されかつＭ１３−mp９にてクローンされる。こ
のプラスミドの１．２Kb ＸｍａIII 断片はｐＵＲ 310
1 のＸｍａIII 部位にクローンされ、ｐＵＲ 3103 とな
り、これはＭＯＸレギュロンとＮＥＯR 遺伝子（第１２
ｃ図）の正確な融合である。オリエンテーションはＨｇ
ｉＡＩとＳａｌＩの切断によりチェックする。ラムダ−
ＭＯＸ−４クローンから、ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片をサ
ブクローンし、構造ＭＯＸ遺伝子（894 位）のＳａｌＩ
部位から、構造ＭＯＸ遺伝子（3259位）のはるか下流の
ＳａｃＩ部位まで達する（第１０図）。このＭ１３mp１
９サブクローンはｐＵＲ 3104 と呼ぶ。プラスミドｐＵ
Ｒ 3105 はｐＵＲ 3103 由来の２．７Kb ＳａｌＩ断片
をｐＵＲ 3104 のＳａｌＩ部位に直接連結して得る。オ
リエンテーションはＳｍａＩとＳａｃＩの切断により試
験した。
【００６５】このプラスミドをＨｉｎｄIII とＳａｃＩ
で切断しかつこの切断プラスミドをＨ．ポリモーファに
形質転換させた後、Ｇ418 耐性コロニーが見つかり、多
くの世代の間非選択的条件下で生育させてその耐性を失
わなかった。
【００６６】例 ３ ｐＵＲ 3004 の構築、それによりＤ−アミノ酸オキシダ
ーゼをコードする遺伝子はＭＯＸ−レギュロンの管理下
Ｈ．ポリモーファの染色体に移動する。
【００６７】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＡＯ）はメ
チル栄養性（methylotrephic）Ｈ．ポリモーファが非常
に適している製造のためのオキシドリダクターゼの一例
である。ＭＯＸ様オキシダーゼである酵素は、メタノー
ル又はメタノールと炭素源としての発酵糖および単一窒
素源としてのＤ−アミノ酸の混合物に生育中誘導される
酵母のペルオキシソームに転座される。これらの条件下
で、細胞は生成するＨ2 Ｏ2 から保護される。別法とし
て、ＡＡＯがＭＯＸ−又はＤＡＳ−レギュロンの管理下
にある場合、Ｈ2 Ｏ2 を生成することなく、ＡＡＯを製
造することができる。ＡＡＯの製造は培地中メタノール
の存在により誘導される。
【００６８】ＡＡＯ酵素のアミノ酸配列は公表され（ロ
ンチ等、1981）、完全な遺伝子はホスファイト技術（マ
チュチとカルサーズ、1981）を使って合成される。この
遺伝子は、ＭＯＸ遺伝子の配列から誘導されるように、
Ｈ．ポリモーファの最適コドンが使われる様に構築され
る。更に、いくつかのユニークな制限部位はアミノ酸配
列を変えずに導入され、合成中のサブクローン化を容易
にする。ＤＮＡ配列に第１３図に示す。この遺伝子は長
さ約５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで合成され
る。オリゴヌクレオチドは１６％ポリアクリルアミドゲ
ルで精製する。サブクローンを生成するオリゴヌクレオ
チドはリガーゼバッファー（マニアティス等、1982）に
一緒に添加され、湯煎中７０℃に加熱する。湯煎をゆっ
くり１６℃に冷却し、Ｔ4 −リガーゼを加える。連結２
時間後、ＤＮＡを１．５％アガロースゲルで分別し、予
期された長さを有する断片をゲルから単離する。断片の
末端に位置する各制限部位で切断したＭ１３mp１８ベク
ターにてサブクローンする。この遺伝子を夫々ＳａｌＩ
−ＨｉｎｄIII （３９〜３４６位）、ＨｉｎｄIII−Ｘ
ｍａＩ（３４６〜５８９位）、ＸｍａＩ−ＫｐｎＩ（５
８９〜７２１位）およびＫｐｎＩ−ＳａｌＩ（７２１〜
１０４４位）の４サブクローンにてこのようにサブクロ
ーンする。ＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII およびＨｉｎｄIII
−ＸｍａＩサブクローン、およびＸｍａＩ−ＫｐｎＩと
ＫｐｎＩ−ＳａｌＩサブクローンをＳａｌＩ−ＸｍａＩ
切断Ｍ１３mp１８における２つのＳａｌＩ−ＸｍａＩサ
ブクローンと連結する。これらの２つのサブクローンを
ＳａｌＩ切断Ｍ１３mp８に連結して、ｐＵＲ 3001 （第
１３、１４Ａ図）を得る。全配列は改良サンガージデオ
キシシーケンス技術（ビギン等、1983）を使って、ヌク
レオチド配列の測定により確認する。
【００６９】ＡＡＯ遺伝子を含有する組みこみプラスミ
ドの構築は第１４Ａ、Ｂ図に示す。殆ど完全なＡＡＯ遺
伝子は、ユニークなｐＵＲ 3104 のＳａｌＩ部位（第１
４Ａ図）において、ｐＵＲ 3001 のＡＡＯ遺伝子−含有
ＳａｌＩ断片を挿入して、ＭＯＸ末端領域の上流におい
て、ｐＵＲ 3002 を得る。オリエンテーションはＨｉｎ
ｄIII で切断してチェックする。ＭＯＸプロモーター領
域はｐＵＲ 3102 由来の１．４Kb ＳａｌＩ−ＨｇｉＡ
Ｉ断片（第１４Ａ図）として単離する。ついでこの断片
を、ＨｇｉＡＩ−ＳａｌＩ ＭＯＸ−ＡＡＯアダプター
の存在下部分的ＳａｌＩ−消化ｐＵＲ 3002 （第１４Ａ
図）に連結して、ｐＵＲ 3002のＡＡＯ遺伝子上流にお
く。生成したプラスミドｐＵＲ 3003 ののオリエンテー
ションはＨｉｎｄIII で切断して再度チェックする。こ
のプラスミドは、ＳａｃＩで切断しかつＨ．ポリモーフ
ァ細胞に形質転換した後、ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。形
質転換体は、インジューサーとしてメタノールの存在下
窒素源としてｏ−アミノ酸に生育する能力により選択す
る。
【００７０】ＡＡＯ遺伝子含有細胞の選択は単純でない
ので、別の選択マーカーを導入する。結局、Ｓ．セレビ
シェＬＥＵ２遺伝子は構造ＡＡＯ遺伝子とＭＯＸターミ
ネーター間に組みこむ。この構築のために、プラスミド
ｐＵＲＳ５２８−０３を使う。このプラスミドはヨーロ
ッパ特許出願第96910 号に記載のｐＵＲＹ５２８−０３
から誘導する。構築は第１４ｃ図に示す。ｐＵＲＹ５２
８−０３の欠損カルボキシ末端ＬＥＵ２遺伝子配列はpY
eleu 10 由来の完全カルボキシ末端ＬＥＵ２遺伝子配列
（ラトキンとカーボン、1977）と置換し、大腸菌ｌａｃ
−ｌａｃレギュロンを除いた。続いて、ＬＥＵ２遺伝子
を含有するｐＵＲＳ５２８−０３のＨｐａＩ−ＳａｌＩ
断片を、ＡＡＯ構造遺伝子とＭＯＸターミネーター間に
あるｐＵＲ 3003 のＳａｌＩ部位に挿入平滑末端とす
る。生成プラスミドｐＵＲ 3004 のオリエンテーション
はＳａｌＩとＳａｃＩで切断してチェックすることがで
きる。ＳａｃＩ−切断プラスミドをＨ．ポリモーファｌ
ｅｕ- 変異体に形質転換した後、ｐＵＲ 3004 はＨ．ポ
リモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。選択した
ｌｅｕ+ 形質転換体はＡＡＯ遺伝子と共に、染色体ＭＯ
Ｘ遺伝子に組みこむ。
【００７１】例 ４ ｐＵＲ 3204 、ｐＵＲ 3205 、ｐＵＲ 3210 およびｐＵ
Ｒ 3211 の構築、それにより小ペプチドホルモン、ヒト
成長放出因子を、染色体ＭＯＸ遺伝子（ｐＵＲ3203 、
ｐＵＲ 3204）に組みこむか、又はＨＡＲＳ１−含有プ
ラスミド（ｐＵＲ 3205 ）に組みこむか、又はＭＯＸ構
造遺伝子（ｐＵＲ 3209 、ｐＵＲ 3210およびｐＵＲ 32
11 ）に融合して、ＭＯＸ−レギュロンの管理下発現さ
せる。
【００７２】ヒト成長ホルモン放出因子（ＨＧＲＦ）は
脳下垂体由来のヒト成長ホルモンの分泌を活性化する、
小さい４４アミノ酸ペプチドである。ＨＧＲＦは男子の
垂体小人症の診断や治療に使用可能である。ＨＧＲＦは
多くの種の成長ホルモン刺激を誘発することが分ってい
るから、動物の成長を刺激しかつミルクの生産を増大す
ることにより、ＨＧＲＦは獣医方面にも使用できる（ク
ーデ等、1984）。ヒト由来のＨＧＲＦを得るのは難しい
が、遺伝子をクローンしかつ適当な宿主体に移すバイオ
テクノロジィの方法により非常によく製造できた。Ｈ．
ポリモーファによるペプチドホルモンの一般的生産例と
して、ＨＧＲＦの遺伝子がＨ．ポリモーファの最適コド
ンに合成され、いくつかの方法で発現される。
【００７３】ｐＵＲ 3204 とｐＵＲ 3205 の構築のため
に、タンパク質のカルボキシ末端部分をコードする遺伝
子断片は長さ約５０ヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーで
合成され、ＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ切断Ｍ１３mp１８の
ＨｉｎｄIII −ＳａｌＩ断片としてサブクローンし、ｐ
ＵＲ 3201 （第１５、１６Ａ図）を得る。このＨｉｎｄ
III −ＳａｌＩ断片断片はついでＨｉｎｄIII −Ｓａｌ
Ｉ切断ｐＵＲ3104 （第１６Ａ図）のＭＯＸターミネー
ター上流に挿入され、ｐＵＲ3202 を得る。ＭＯＸプロ
モーターは、ＭＯＸ−プロモーターとＨＧＲＦ遺伝子
（第１５、１６Ａ図）間にＨｇｉＡＩ−ＨｉｎｄIII ア
ダプターを使って、ＨｉｎｄIII 切断ｐＵＲ 3202 にｐ
ＵＲ 3102 （第１６Ａ図）由来のＳａｌＩ−ＨｇｉＡＩ
ＭＯＸ−プロモーター断片を挿入して、ＨＧＲＦ遺伝
子の前に挿入する。生成プラスミドｐＵＲ 3203 のオリ
エンテーションはＳａｌＩとＨｇｉＡＩで切断してチェ
ックする。ＳａｃＩ切断プスラミドの形質転換後、ｐＵ
Ｒ 3203 はＨ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組
みこむ。形質転換体は免疫活性について選択する。ｐＵ
Ｒ 3203 はＳａｌＩで切断して、ＬＥＵ２遺伝子を含む
ｐＵＲ５２８−０３（第１６Ｂ図）のＳａｌＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片を挿入する。この遺伝子のｐＵＲ 3204における
オリエンテーションはＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩで切断
してチェックする。ＳａｃＩ切断プラスミド（第１６Ｂ
図）をｌｅｕ- Ｈ．ポリモーファ変異体に形質転換した
後、ｐＵＲ 3204 は染色体Ｈ．ポリモーファＭＯＸ遺伝
子に組みこむ。ｌｅｕ- 形質転換体について選択する。
Ｈ．ポリモーファにて自律的に複製しかつＨＧＲＦ遺伝
子を含むｐＵＲ 3205 と呼ぶプラスミドは、ＭＯＸ−プ
ロモーターとターミネーター間に挿入したＨＧＲＦ遺伝
子を含有する、ｐＵＲ 3203 のＥｃｏＲＩ、部分的Ｈｉ
ｎｄIII 切断４Kb断片を部分的ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲ
Ｉ切断 pHARS１（第２、１６ｃ図）に挿入して得る。ｐ
ＵＲ 3205 の構築はＨｉｎｄIIIで切断してチェックす
る。
【００７４】微生物によりＨＧＲＦとして小ペプチドの
生産は酵素分解（板倉等、1977）の結果、しばしば不安
定である。タンパク様ＭＯＸに対する融合、およびその
後のペルオキシソームへの移行により分解を防ぐことが
できた。したがって、ＭＯＸ構造遺伝子の1775位（アミ
ノ酸 591、第１０図、第１１図）のユニークＫｐｎＩ部
位にＨＧＲＦ遺伝子を挿入することを決定した。ＨＧＲ
Ｆ遺伝子は長さ５０ヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーに
再度合成されるが、Ｍ１３mp１９の完全ＨＧＲＦ構造遺
伝子としてクローンされる２つのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄII
I サブクローンはＫｐｎＩ（プラスミドｐＵＲ 3206 、
第１７図、第１６Ｄ図）で切断した。更に、２７位のＨ
ＧＲＦの内部メチオニンをコードするＡＴＧトリプレッ
ト（（クーデ等、1984）（ＤＮＡ配列の８２位）はシス
テインをコードするＴＧＴトリプレットに転換される。
このことはＨＧＲＦ活性を本質的に変えず、ＣＮＢｒ切
断（板倉等、1977）により融合タンパク質由来のＨＧＲ
Ｆの切断を容易にする。ファージラムダＭＯＸ−４（第
１０図）から、ＳｐｈＩ（−４９１位）−ＫｐｎＩ断片
を単離し、ＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ切断Ｍ１３mp１９に挿入
され、ｐＵＲ 3207を得る。ｐＵＲ 3206 をＫｐｎＩで
切断し、ＨＧＲＦ遺伝子をｐＵＲ 3207 のＫｐｎＩ部位
に挿入し、ｐＵＲ 3208 を得る。オリエンテーションは
ｐＵＲ 3208の単一ストランドＤＮＡで直接配列分析に
よりチェックする。続いて、ユニークＫｐｎＩ部位から
ＳａｃＩ部位まで、ＭＯＸ遺伝子の下流部分はファージ
ラムダＭＯＸ−４由来の１．５Kb断片として単離し、Ｓ
ａｃＩ−部分的ＫｐｎＩ切断ｐＵＲ 3208 に挿入する。
生成プラスミドｐＵＲ 3209 のオリエンテーションはＫ
ｐｎＩで消化してチェックする。ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ切
断プラスミドの形質転換後、ｐＵＲ 3209 はＨ．ポリモ
ーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。免疫活性に関
する選択をする。
【００７５】このＭＯＸ−ＨＧＲＦ融合遺伝子は、部分
的ＨｉｎｄIII 、部分的ＥｃｏＲＩ切断ｐＵＲ 3209 由
来の全融合遺伝子を単離してｐＨＡＲＳＩに、ＥｃｏＲ
Ｉ部分的ＨｉｎｄIII 切断ｐＨＡＲＳＩに挿入される。
この結果がｐＵＲ 3210 が得られ、形質転換後Ｈ．ポリ
モーファにて複製する（第１６Ｅ図）。別法として、ｐ
ＵＲＳ５２８−０３のＬＥＵ２−含有ＳａｌＩ−Ｈｐａ
Ｉ断片を、ｐＵＲ3209の部分的ＫｐｎＩ切断後、コード
したタンパク質のカルボキシ末端にある、ＨＧＲＦ遺伝
子の平滑末端ＫｐｎＩ部位に挿入する。生成プラスミド
ｐＵＲ 3211 は、ＳａｃＩ、ＳｐｄＩ切断プラスミドの
形質転換後（第１６Ｆ図）、Ｈ．ポリモーファの染色体
ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。
【００７６】考 察 開放読み取り枠の長さから、精製ＭＯＸとＤＮＡ由来タ
ンパク質配列のアミノ酸組成の類似性から、および同一
の３０Ｎ−末端アミノ酸から、Ｈ．ポリモーファ由来の
ＭＯＸの完全遺伝子をクローンした。その計算分子量は
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで測定した分子量とよく
一致する。コード配列とは別に、1200ｂｐ以上は５′−
と３′−非コード領域からシーケンスし、コード配列の
上流ＳａｌＩ部位からＳａｃＩ部位下流まで達する。遺
伝子は介在配列で妨害されないようである。
【００７７】タンパク質はプリカーサーの形で転写され
ない。分子量の測定により、Ｎ−末端シグナル配列はロ
アとブローベル（1983）又はロッゲンカンプ等（1984）
の初期研究では検出出来なかった。類似の実験では、ラ
ット肝臓のパーオキシソマール酵素ウリカーゼ（ゴール
ドマンとブローベル、1978）およびカタラーゼ（ゴール
ドマンとブローベル、1978；ロビーとラザロウ、1978）
は切断可能なＮ−末端シグナルペプチドを含まないこと
が示唆された。しかし、これらの著者により論究されて
いる様に、タンパク分解的劣化はこのようなシグナル配
列の検出の欠如を説明するものである。
【００７８】本発明者の配列結果がはっきり証明するこ
とは、このタンパク質をパーオキシソームに転座するた
めに、切断可能なＮ−末端シグナル配列は必要でない。
このような転座シグナルは、オボアルブミンの場合のよ
うに（リンガッパ等、1979）、成熟タンパク質の内部配
列に十分位置しうる。タンパク質配列の検査はアミノ酸
配列 GlyXGlyYZGly （アミノ酸１３−１８）を示し、Ｆ
ＡＤ−（フラビンアデニンジヌクレオチド）−含有酵素
（ロンチ等、1981）に特長的である。
【００７９】上記のＭＯＸ遺伝子の単離はＭＯＸをコー
ドするＤＮＡ配列およびＭＯＸ酵素のアミノ酸配列の測
定方法を示すものである。
【００８０】同様に、他のオキシダーゼ酵素に属するＤ
ＮＡ配列とアミノ酸配列を単離しかつ測定することがで
きる。ＭＯＸ遺伝子配列知識を利用して、アルコールオ
キシダーゼをコードする遺伝子又は他のオキシダーゼを
もコードする遺伝子の単離を容易にする。酵素の性質と
構造を比較することにより、構造の働きと活性の関係を
多分確立することができる。部位指向突然変異生成とし
て、タンパクコード配列の短縮化又は伸長化、相当する
ポリペプチドを修飾して、改良された性質、例えばアル
カリ安定性の増大を有するオキシダーゼ、又は洗剤製品
と一層相容性の基質を必要とするオキシダーゼを選択す
る方法も適用しうる。Ｈ．ポリモーファ由来のＭＯＸの
構造遺伝子の単離と特性化以外に、Ｈ．ポリモーファ由
来のＤＨＡＳの構造遺伝子の単離と特性化を同じように
行なった。
【００８１】ＤＡＳのＤＮＡ配列は第１８Ａ−１８Ｃ図
に示す。制限地図は第１９図に示す。ＤＡＳのＤＮＡ配
列から計算したアミノ酸組成は精製ＤＨＡＳの加水分解
後に測定したアミノ酸組成と一致している様であった。
ＤＨＡＳ酵素はホルムアルデヒドとキシルロースモノホ
スフェートからのジヒドロキシアセトンの合成を触媒す
る。この反応はメタノール−同化反応（ビーンハイス
等、1983）において重要な役割を演じている。
【００８２】前に記述した様に、ＭＯＸとＤＨＡＳの合
成はグルコースリプレッションに供する。 0.5％(v/v)
メタノールの代りに基質としてグルコース／メタノール
混合物を用いる場合、高レベルのＭＯＸが得られること
が分った。前者の条件下では、後者の条件の２０％と比
較して、３０％までの細胞タンパク質はＭＯＸから成
る。
【００８３】ＭＯＸとＤＡＳのレギュロンには、グルコ
ースによるリプレッション／活性又はメタノールによる
誘導の調節に決定的役割を演じる配列が存在せねばなら
ないと考えられた。したがって、ある相同関係が予期さ
れる。
【００８４】双方共配列 CTATAAATAを有する、「ＴＡＴ
Ａ−ボックス」の著しい相同性が見出された。ＭＯＸと
ＤＡＳレギュロンの上流に近い領域には他の相同性は見
出されなかった。期待に反して、両レギュロンの詳細な
研究は、翻訳開始コドンの約１０００ bp 上流領域にＭ
ＯＸとＤＡＳのレギュロンの顕著な相同性を示した。Ｍ
ＯＸのレギュロンにおいて６５bpの実際上完全な連続領
域は、いくつかの非相同性領域（第２０図）により散在
されている。ＤＡＳレギュロンの１３９ bp 領域に相同
している。類似の相同性は両遺伝子の任意の他の領域に
みられない。すなわち、その上流と下流の配列を含めて
長さ４Kbにわたってみられない。これらの相同配列はグ
ルコースやメタノールにより両遺伝子の調節の役割を有
することが示唆されている。ＭＯＸの構造遺伝子のＡＴ
Ｇの上流の最初の５００ bp をレギュロンとして含有す
るベクターによる形質転換の研究は次の点を示した。即
ち、この短くなったＭＯＸ−レギュロンはインディケー
ター遺伝子β−ラクタマーゼの比較的低発現をおこし
た。インディケーター遺伝子は容易にスコアできる性質
をもった酵母を供する遺伝子であり、例えば抗生物質Ｇ
418 に耐性を示すネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼの遺伝子又はロイシンノ如き栄養要求マーカーであ
る。
【００８５】ＭＯＸとＤＡＳ遺伝子のはるか上流の相同
領域が各種妨害を有するという事実、およびＤＡＳが
0.1グルコースで抑制されかつＭＯＸが抑制されないと
いう事実は、これらの相同領域がグルコースによるリプ
レッション／活性化にとっておよび／又はメタノールの
存在下発現の誘導にとって重要であることを示唆してい
る。この仮定は実際正しいことが分った。したがって、
これらの相同領域の有無は特定の用途に重要である。例
えば、若しＭＯＸ遺伝子の−1052から−987 領域又はＤ
ＡＳ遺伝子の−1076から−937 領域がメタノールによる
ＭＯＸ又はＤＡＳの誘導に重要であるならば、これらの
領域の存在はＭＯＸ又はＤＡＳの発現にとっておよび／
又はメタノールによる他の酵素の誘導にとって重要であ
る。他の例はグルコースによるリプレッションを避ける
ためにその領域を除くことであり、炭素源としてグルコ
ースを有するＭＯＸおよび／又はＤＡＳ調節領域の影響
下ＭＯＸやＤＨＡＳ以外のタンパク質をコードする遺伝
子の発現に必要である。
【００８６】本発明の一特徴は、Ｈ．ポリモーファ由来
のＭＯＸおよびＤＨＡＳをコードする構造遺伝子の単離
および完全な特性化に関する。更に、Ｈ．ポリモーファ
におけるＭＯＸやＤＨＡＳの生合成を調節するＤＮＡ配
列、特にレギュロンやターミネーターの単離と特性化に
関する。
【００８７】更に、Ｈ．ポリモーファＣＢＳ 4732 以外
のＨ．ポリモーファ菌株、又はＨ．ポリモーファ以外の
ハンセヌラ種、又はハンセヌラ以外の酵母、又はカビ又
はＨ．ポリモーファＣＢＳ 4732 由来のＭＯＸ遺伝子の
強力なレギュロンおよびターミネーターをもつ高級ユー
カリオートから派生するアルコールオキシダーゼその他
のオキシダーゼをコードする遺伝子の組み合わせに関す
る。これらの組み合わせはとりわけＨ．ポリモーファ又
は関連種由来の自律的複製配列又はセントロマーを含む
ミニクロモソーム、および任意には選択マーカーとテロ
マーを有するベクターにおくことができる。これらの組
み合わせはＨ．ポリモーファの染色体ＤＮＡに組みこむ
こともできる。
【００８８】更に、強力なレギュロン又はその一部およ
びＭＯＸおよび／又はＤＡＳのターミネーターおよび部
位方向突然変異生成又は他の方法により、アルコールオ
キシダーゼその他のオキシダーゼをコードする変化した
構造遺伝子の組み合わせに関する。これらの変化した構
造遺伝子はミニクロモソーム中エピソームベクターに組
み入れ、又はＨ．ポリモーファ、Ｈ．ウィンゲイ、Ｈ．
アノマラおよびＳ．セレビシエその他の酵母の染色体に
組みこむことができる。
【００８９】これ以外に、本発明はオキシダーゼ以外の
タンパク質をコードする構造遺伝子とＨ．ポリモーファ
のＭＯＸおよび／又はＤＡＳ遺伝子のレギュロンおよび
ターミネーターとの組み合わせに関する。
【００９０】本発明の非常に重要でかつ望ましい態様
は、微生物を適当な条件下で培養して、任意にはポリペ
プチドを濃縮しそして公知方法で集取する。タンパク質
又は酵素の如きポリペプチドの製造法において、組み換
えＤＮＡ技術により得られかつこのポリペプチドをコー
ドする構造遺伝子を含む微生物を使い、プロモーターお
よびＨ．ポリモーファＣＢＳ 4732 のＭＯＸ遺伝子の−
1052から−987 領域、又はＨ．ポリモーファＣＢＳ 473
2のＤＡＳ遺伝子の−1076から−937 領域、又は他のメ
チロトローフ型カビ又は酵母の相当する領域、又はこれ
らの任意の領域の有効的修飾を含むレギュロンのコント
ロール下にこの発現を行なう、上記方法である。
【００９１】驚くべきことは、第２０図に示されかつこ
こにＭＯＸとＤＡＳ遺伝子の−1000領域として言及され
ている当該領域は構造遺伝子の発現に非常に重要である
ということが本発明により見出された。この領域を除い
たＭＯＸレギュロンを含む組み換え体で行なった実験は
低レベルの発現を示した。したがって、このような−10
00領域又はその有効な修飾（即ちこの領域機能の有為な
欠損をおこさない任意の修飾）を含むレギュロンを使う
と、比較的高量の目的ポリペプチドを製造することがで
きる。
【００９２】本発明方法の望ましい態様は、当該構造遺
伝子が遺伝子産物を微生物宿主のパーオキシソームすな
わち均等のミクロボディに転座させるのに包含されるア
ミノ酸配列をコードする１種以上のＤＮＡ配列を供した
点で特徴がある。生成したポリペプチドをパーオキシソ
ームすなわち均等のミクロボディに転座させると、その
安定性を改善し、高収率を得る。ある種のポリペプチド
特にオキシダーゼでは、このような転座は微生物宿主の
生存のためには肝要である。即ち、微生物宿主細胞がオ
キシダーゼの基質で生育する場合に生成する過酸化水素
の毒性効果から宿主を守ることである。もしこのオキシ
ダーゼが製造法に使用する微生物の宿主において機能的
であるアドレスシグナルを含まないならば、宿主特異的
アドレスシグナルをコードする配列を有する構造遺伝子
を供すべきであって、例えばこの様な配列を加えるか又
はこれらと遺伝子の最初のアドレス配列と置換する。融
合パートナーが適切なアドレスシグナルを有する融合ポ
リペプチドの生産は別の可能性である。メチロトローフ
型酵母をこの製造に使う場合には、ＤＮＡ配列はパーオ
キシソームまたはミクロボディにＭＯＸ転座させるＭＯ
Ｘ遺伝子又はその一部から成ることが望ましい。
【００９３】最後に、本発明の特徴はＨ．ポリモーファ
由来のＭＯＸを他の酵母において合成することに関す
る。
【００９４】アルコールオキシダーゼ産生能を有する若
干の微生物を以下に挙げる。
【００９５】 アルコールオキシダーゼを産生する酵母 （リーおよびコマガタによる分類、1980） グループ１ カンジダ・ボイジニ グループ２ａ ハンセヌラ・フィロデンドラ ピチア・リンドネリ トルロプシス・ネモデンドラ 〃 ・ピナス 〃 ・ソノレンシス グループ２ｂ カンジダ・カリオシリグニコラ ハンセヌラ・グルコチマ 〃 ・ヘンリチ 〃 ・ミヌタ 〃 ・ノンフェルメンタス 〃 ・ポリモーファ 〃 ・ウイッケルハミ ピチア・ピナス 〃 ・トレハロフィラ グループ２ｃ カンジダ・サクシフィラ トルロプシス・ニトラトフィア グループ３ ピチア・セロビオサ グループ４ ハンセヌラ・カプスラタ ピチア・パストリス トルロプシス・モリシアナ アルコールオキシダーゼを産生するカビ レンジト・トラベア ポリポラス・ベルシカラー 〃 ・オブツサス ポリア・コンチグア アルコールオキシダーゼ以外のオキシダーゼの中で最も
興味のあるものは：− グリセロールオキシダーゼ− アルデヒドオキシダーゼ− アミンオキシダーゼ− アリールアルコールオキシダーゼ− アミノ酸オキシダーゼ− グルコースオキシダーゼ− ガラクトースオキシダーゼ− ソルボースオキシダーゼ− 尿酸オキシダーゼ− クロロパーオキシダーゼ；および− キサンチンオキシダーゼ。
【００９６】Ｈ．ポリモーファ由来のＭＯＸおよびＤＡ
Ｓ遺伝子の強力なレギュロンやターミネーターとオキシ
ダーゼの構造遺伝子との組み合わせは、特定の宿主又は
宿主群に構造遺伝子を複製できる、例えばＨ．ポリモー
フヌァ由来の配列又はセントロマー（およびテロマー）
を、Ｈ．ポリモーファおよび関連の酵母又はその他の微
生物に移行しうる適切なベクターに自律的複製する。
【００９７】既述したＨ．ポリモーファ変異株ＬＥＵ−
１とＬＲ９は夫々ＣＢＳに 7171 と7172の番号で寄託さ
れている。
【００９８】以下に文献、表、図面を説明する。
【００９９】 表 Ｉ ￣￣￣￣￣ 生育にウラシルを必要とするＨ．ポリモーファ中のオロチジン ５′−リン酸塩デカルボキシラーゼおよびオロチジン５′− リン酸塩ピロホスホリラーゼの活性 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 活 性 （％）a オロチジン５′− オロチジン５′− 菌株／表現型 転換率 リン酸塩デカルボ リン酸塩ピロホス キシラーゼ ホリラーゼ ￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣ 野 生 型 − 100 100 ＬＲ 9／odcl ＜ 2×109 ＜ 1 106 ＭＲ 7／odcl 6×107 ＜ 1 71 ＮＭ 8／odcl 3×108 ＜ 1 105 CLK 55／oppl 測定せず 90 ＜ 1 CLK 68／oppl 〃 82 ＜ 1 YNN 27／ura 3 〃 0 ￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣ 後期対数期まで菌株をＹＥＰＤで生育させた。細胞の抽
出はブラウンホモジナイザーを使って、ガラスビーズで
行なった。タンパク質は２８０nmで光学密度により評価
した。
【０１００】ａ）野生型活性率として表わした。
【０１０１】 表 ＩＩ ￣￣￣￣￣ Ｈ．ポリモーファのウラシル要求株の形質転換 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 形質転換 株 プラスミド 形質転換 安定性b ＤＮＡの 頻 度a （％） 状態 ￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣ ＬＲ９ ＹＲＰ１７ 2.2×102 ＜1 自律的複製 ＬＲ９ ｐＨＡＲＳ１ 1.5×103 2 自律的複製 ＬＲ９ ｐＨＡＲＳ２ 4.6×102 1.5 自律的複製 ＬＲ９ ＹＩＰ５ 3（38）c 105 組みこみ ＬＲ９ ｐＲＢ５８ ０ − − ＬＲ９ ｐＨＨ８５ ０ − − ＹＮＮ２７ Ｙ１Ｐ５ ０ − − ￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣ ａ）ＤＮＡμｇ当りの全数として表わす。ポリエチレン
グリコールで処理した完全細胞は「材料と方法」で記述
したように形質転換用に使用した。 ｂ）１０世代間ＹＥＰＤで生育させた後、残存ウラシル
原栄養体率として表わす。
【０１０２】ｃ）（）内の数字は遊離プラスミドＹＩＰ
５含有ミニコロニーの量を示す。
【０１０３】 表 III ￣￣￣￣￣ ＭＯＸのアミノ酸組成 アミノ酸 ＤＮＡ配列 加水分解物 a) ＰＨＥ ３１ ３２ ＬＥＵ ４７ ４９ ＩＬＥ ３４ ３４ ＭＥＴ １２ １１ ＶＡＬ ４２ ４３ ＳＥＲ ４３ ３３ a) ＰＲＯ ４３ ４２ ＴＨＲ ４４ ３８ ＡＬＡ ４７ ５０ ＴＹＲ ２７ ２７ ＨＩＳ １９ ２１ ＧＬＮ １３ ＧＬＵ ３６ ］５１ ＡＳＮ ３２ ＡＳＰ ５０ ］８４ ＬＹＳ ３５ ３８ ＣＹＳ １３ １２ ＴＲＰ １０ −b) ＡＲＧ ３６ ３６ ＧＬＹ ５０ ５３ ａ）加水分解は２４時間行なった ｂ）測定せず 表 IV ￣￣￣￣￣ Ｓ．セレビシエ、Ｈ．ポリモーファおよび大腸菌の望ましい コドン使用頻度の比較 サッカロミセス ハンセヌラ 大腸菌 ＭＯＸ ＡＬＡ ＧＣＵ，ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ使用せず 不明 ＳＥＲ ＵＣＵ，ＵＣＣ ＵＣＣ，ＵＣＧ ＵＣＵ，ＵＣＣ ＴＨＲ ＡＣＵ，ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＵ，ＡＣＣ ＶＡＬ ＧＵＵ，ＧＵＣ ＧＵＡ使用せず ＧＵＵ，ＧＵＡ 不明 ＩＬＥ ＡＵＵ，ＡＵＣ ＡＵＣ，ＡＵＵ ＡＵＣ ＡＳＰ ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＰＨＥ ＵＵＣ ＵＵＣ ＵＵＣ ＴＹＲ ＵＡＣ ＵＡＣ ＵＡＣ ＣＹＳ ＵＧＵ 不明 不明 ＡＳＮ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ ＨＩＳ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＬＵ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＬＹ ＧＧＵ ＧＧＣは実際上 ＧＧＵ，ＧＧＣ 使用せず 不明 ＧＬＮ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＬＹＳ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＰＲＯ ＣＣＡ ＣＣＵ，ＣＣＡ ＣＣＧ ＬＥＵ ＵＵＧ ＣＵＧ，ＣＵＣ ＣＵＧ ＡＲＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＧＵ引用例 １． ＧＢ−ＰＳ1,225,713 号（コルゲート・パルモリ
ブ・カンパニィ、1971年３月２４日公告、優先日1968年
４月１９日）。
【０１０４】２． ＤＥ−ＰＡ2,557,623 号（ヘンケル
＆シー社、1977年６月３０日公開、優先日1975年１２月
２０日）。
【０１０５】３． ＧＢ−ＰＡ2,101,167 号（ユニリー
バー・ビー・エル・シー、1983年１月１２日公開、優先
日1981年７月７日）。
【０１０６】４． ファン・ディケン・ジェイ・ビー、
オットー・アールおよびハーダー・ダブリュー（197
6）、アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジィ １
１１、１３７〜１４４。
【０１０７】５． ビーンハイス・エム、ファン・ディ
ケン・ジェイ・ピーおよびハーダー・ダブリュー（１９
８３）、アドバンシズ・イン・マイクロバイアル・フィ
ジオロジィ、ローズ・エイチ、ガレス・モリス・ジェイ
およびテンペスト・ディー・ダブリュー著、第２４巻、
１〜８２、アカデミック・ブレス、ニューヨーク。
【０１０８】６． ロッゲンカンプ・アール、ヤノヴィ
ッツ・ゼット、スタニコフスキィ・ビーおよびホレンバ
ーグ・シー・ビー（１９８４）、モレキュラー・ジーン
・ジェネティックス １９４、４８９〜４９３。
【０１０９】７． サーム、エイチ（１９７７）、アド
バンシズ・イン・マイクロバイオロジック・エンジニア
リング、ゴース・ティー・ケイ、フィーヒター・エイお
よびブレイクブラウ・エヌ著、第６巻、７７〜１０３、
スプリンガー・フェルラーグ、ベルリン。
【０１１０】８． ビストリック・エル・ブイ、ソコロ
フ・エイ・ピーおよびトロチエンコ・ワイ・エイ（１９
８１）、ＦＥＢＳレターズ、１３２、３２４〜３２８。
【０１１１】９． ロア・エムおよびブローベル・ジィ
ー（１９８３）、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミイ・サイエンス、ＵＳＡ、８０、６８７２
〜６８７６。
【０１１２】10． ビーハイス・エム、ファン・ディケ
ン・ジェイ・ピー、ピロン、エス・エイ・エフおよびハ
ーダー・ダブリュー（１９７８）、アーカイブス・オブ
・マイクロバイオロジィ、１１７、１９５３〜１６３。
【０１１３】11． ローネン・ダブリュ・エイ・エムお
よびブラマー、ダブリュー・ジィー（１９８０）、ジー
ン、２０、２４９〜２５９。
【０１１４】12． ホーン・ビー（１９７９）、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジィ、ウー・アール著、第６８
巻、２９９〜３０９、アカデミックプレス、ニューヨー
ク。
【０１１５】13． イーデンス・エル、ヘスリンガ・エ
ル、クロック・エル、リーデボアー・エイ・エム、マー
ト・ジェイ、トーネン・エム・ワイ、ビッサー・シィー
およびベリップス・シィー・ティー（１９８２）、ジー
ン、１８、１〜１２。 14． ペルハム・エイチ・アール・ビーおよびジャクソ
ン・アール・ジェイ（１９７６）、エアロープ・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリィ、６７、２４７〜２５
７。
【０１１６】15． バレリオ・ディー、ダイベンスタイ
ン・エム・ジェイ・シー、メーラ・カン・ピー、ギュー
ツ・ファン・ケッセル・エイ、ドロールド・エイおよび
ファン・デル・エブ・エイ・ジェイ（１９８３）、ジー
ン、２５、 ２３１〜２４０。
【０１１７】16． リーデボアー・エイ・エム、ベリッ
プス・シィー・ティー、およびデッカー・ピー・エム・
エム（１９８４）、ジーン、３０、２３〜３２。
【０１１８】17． マニアティス・ティー、フリッチ・
イー・エフおよびサムブルック・ジェイ（１９８２）、
モレキュラー・クローニング、２７８頁、コールド−ス
プリング・ハーバー・ラボラトリイ版、ニューヨーク。
【０１１９】18． ベントン・ダブリュー・ディーおよ
びディビス・アール・ダブリュー（１９７７）、サイエ
ンス １９６、１８０〜１８２。
【０１２０】19． アンブラー・アール・ビー（１９７
２）、メソッズ・イン・エンザイモロジィ、第２５巻、
２６２〜２７２、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク。 20． マッチュシ・エム・ディーおよびカルサーズ・エ
ム・エイチ（１９８１）、ジャーナル・オブ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサイエティ １０３、３１８５〜３１
９１。
【０１２１】21． ウォレス・アール・ビー、ジョンソ
ン・エム・ジェイ、ヒロセ・ティー、ミヤケ・ティー、
カワシマ・イー・エイチおよびイタクラ・ケイ（１９８
１）、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ ９、８７
９〜８９４。
【０１２２】22． ビギン・エム・ディー、ギブソン・
ティー・ジェイおよびホン・ジー・エフ（１９８３）、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミィ・サ
イエンス、ＵＳＡ ８０、３９６３〜３９６５。
【０１２３】23． グリーソン・エム・エイ、ウェイツ
・エム・ジェイおよびサドベリー・ピー・イー（１９８
４）、Ｃ1 化合物に対する微生物の生育、クローフォー
ド・アール・エルおよびハンソン・アール・エス、エイ
・エス・エム出版、ワシントン、２２８〜２３５。
【０１２４】24． フィング・ジー・ディー（１９７
０）、メソッズ・イン・エンザイモロジィ、テイバー・
エイチおよびテイバー・シー・ダブリュー著、第１７
巻、５９〜７８、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク。
【０１２５】25． ボーク・ジェイ・ディー、ラックラ
ウト・エフおよびフィンク・ジー・ディー（１９８
４）、モレキュラー・ジーン・ジェネティック１９７、
３４５〜３４６。
【０１２６】26． ジョーンズ・イー・ダブリューおよ
びフィンク・ジー・ディー（１９８２）、コールド・ス
プリング・ハーバー・モノグル・シリーズ、 １１Ｂ、
１８１〜２９９。
【０１２７】27． リーベルマン・アイ、コーンバーグ
・エイおよびシムス・イー・エス（１９５５）、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ ２１５、
４０３〜４１５。
【０１２８】28． スティンクコーム・ディー・ティ
ー、トマス・エム、ケリー・ジェイ、セルカー・イーお
よびディビス・アール・ダブリュー（１９８０）、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミック・サ
イエンス、ＵＳＡ ７７、４５５９〜４５６３。
【０１２９】29． スティンクコーム・ディー・ティ
ー、マン・シー、およびディビス・アール・ダブリュー
（１９８２）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジイ １５８、１５７〜１７９。
【０１３０】30． ストラール・ケイ、スティンクコー
ム・ディー・ティー、シェラー・エスおよびディビス・
アール・ダブリュー（１９７９）、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス、ＵＳ
Ａ ７６、１０３５〜１０３９。
【０１３１】31． カールソン・エムおよびボトスタイ
ン・ディー（１９８２）、セル ２８、１４５〜１５
４。
【０１３２】32． ベッグズ・ジェイ・ディー（１９７
８）、ネイチャー２７５、１０４〜１０９。
【０１３３】33． ブローチ・ジェイ・アール、ストラ
ンサーン・ジェイ・エスおよびヒックス・ジェイ・ビー
（１９７９）、ジーン ８、１２１〜１３３。
【０１３４】34． ダス・エス、ケラーマン・イーおよ
びホレンバーグ・シー・ピー（１９８４）、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジィ １５８、１１６５〜１１６
７。
【０１３５】35． イトー・エイチ、フクダ・ワイ、ム
ラタ・ケイおよびキムラ・エイ（１９８３）、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジィ １５３、１６３〜１６
８。 36． クレーベ・アール・ジェイ、ハリス・ジェイ・ブ
イ、シャープ・ゼット・ディーおよびダグラス・エム、
ジー（１９８３）、ジーン ２５、３３３〜３４１。
【０１３６】37． ホレンバーグ・シー・ピー（１９８
２）、カレント・トピックス、マイクロバイオロジカル
・イムノロジィ ９６、１１９〜１４４。
【０１３７】38． カトー・エヌ、オーモリ・ワイ、タ
ニ・ワイおよびオガタ・ケイ（１９７６）、ユーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリイ ６４、３
４１〜３５０。
【０１３８】39． シュッテ・エイチ、フロスドルフ・
ジェイ、サーム・エイチおよびクラ・エム・アール（１
９７６）、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリイ ６２、１５１〜１６０。
【０１３９】40． ロンチ・エス、ミンチオテイ・エ
ル、ガリアノ・エム、カーティ・ビー、スエンソン・ア
ール・ピー、ウィリアムス・シー・エイチおよびマセイ
・ブイ（１９８１）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリイ２５７、８８２４／８８３０。
【０１４０】41． ラトキン・ピーおよびカーボン・ジ
ェイ（１９７７）、プロシーディング・オブ・ナショナ
ル・アカデミック・サイエンス、ＵＳＡ ７４、４８７
〜４９１。
【０１４１】42． クーデ・エフ・エックス、ジアズ・
ジェイ、モアー・エム、ロスカム・ダブリューおよびロ
ンクッチ・アール（１９８４）、トレンズ・イン・バイ
オテクノロジィ ２、８３〜８８。
【０１４２】43． イタクラ・ケイ、ヒロセ・ティー、
クリー・アール、リッグズ・エイ・ディー、ヘインカー
・エイチ・エル、ボリバー・エフおよびボイアー・エイ
チ・ダブリュー（１９７７）、サイエンス １９８、１
０５６〜１０６３。
【０１４３】44． ゴールドマン・ビー・エムおよびブ
ローベル・ジィー（１９７８）、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス、ＵＳＡ
７５、５０６６〜５０７０。
【０１４４】45． ロビー・エムおよびラザロー・ピー
・ビー（１９７８）、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミック・サイエンスＵＳＡ７５、４３４
４〜４３４８。
【０１４５】46． リンガッパ・ブィ・アール、リンガ
ッパ・ジェイ・アールおよびブローベル・ジィー（１９
７９）、ネイチャー ２８１、１１７〜１２１。
【０１４６】47． ワトソン・ジェイ・ディー、ツーズ
・ジェイおよびフルツ・ディー・ティー（１９８３）、
組換えＤＮＡ、短期コース、１７８頁、フリーマン・ア
ンド・カンパニー発行、ニューヨーク。
【０１４７】48． リー・ジェイ・ディーおよびコマガ
タ・ケイ（１９８０）、ジャーナル・オブ・ジェネティ
ック・アプライド・マイクロバイオロジィ２６、１３３
〜１５８。
【図面の簡単な説明】
【図１】特異的ＭＯＸサブクローンのシークエンス化に
使用するエクソヌクレアーゼＢａｌ 31 消化方法。Ｍ１
３mp−８又は−９、−１８又は−１９にてサブクローン
した断片Ｘ−Ｙをユニークな制限Ｚ部位で切断する。Ｄ
ＮＡ分子は時間依存性エクソヌクレアーゼＢａｌ 31 消
化に供する。Ｍ１３シークエンスプライマー近くに位置
するＤＮＡ断片は制限酵素Ｙを使って除く。末端はＴ4
−ＤＮＡポリメラーゼで培養して平滑末端とし、ついで
分子内的に連結させる。ファージプラークを形質転換後
取り上げ、断片をＸ部位の方向でＺ部位からシーケンス
する。逆転複数クローニング部位を有するＭ１３誘導体
を使って、断片をＸ部位の方向にＺ部位からシーケンス
する。
【図２】同上。
【図３】ＨＡＲＳ断片をＹ１ｐ５の単一ＳａｌＩ部位に
挿入して誘導したｐＨＡＲＳプラスミドの整列。
【図４】ＨＡＲＳ−１断片の完全ヌクレオチド配列。
【図５】Ｈ．ポリモーファ形質転換体のサザーンハイブ
リッドによるコピー数の評価。各プローブ８および１８
mlの試料を電気泳動にかけた。レーン１はＨｉｎｄIII
とＥｃｏＲＩで消化したファージラムダＤＮＡである。
レーン２，３はＨｉｎｄIII （エム・レイネン、ケイ・
ブロイニッヒおよびシー・ピー・ホレンバーグ、未公
表）で消化した組みこみプラスミドの２つのコピーを含
むＫ・ラクティスの形質転換体である。レーン４〜７は
ＥｃｏＲＩで消化したｐＲＢ（４−５）とＹＲＰ１７
（６−７）でそれぞれ形質転換させたＹＮＮ２７；レー
ン８，９はＥｃｏＲＩで消化したＹＲＰ１７で形質転換
させたＬＲ９；レーン１０，１１はＨｉｎｄIII で消化
したpHARS ２で形質転換したＬＲ９；レーン１２，１３
はＥｃｏＲＩで消化したpHARS １で形質転換したＬＲ９
である。
【図６】プラスミドＹＩｐ５の組みこみにより形質転換
されたＨ．ポリモーファ変異株ＬＲ９由来のＤＮＡのサ
ザーンブロットのオートラジオグラム。レーン１はＨｉ
ｎｄIII とＥｃｏＲＩ双方で消化したファージラムダＤ
ＮＡ；レーン２は未消化の pHARS−１；レーン３，５お
よび６，７は２つの異なる形質転換体由来のＤＮＡを示
す。レーン３は未消化；レーン４はＥｃｏＲＩで消化；
レーン５はＰｖｕＩＩで消化；レーン６はＥｃｏＲＩで
消化；レーン７はＰｖｕＩＩで消化；レーン８はＥｃｏ
ＲＩで消化；レーン８はＥｃｏＲＩで消化したプラスミ
ドＹＩｐ５。ニック翻訳したＹＩｐ５はハイブリッドプ
ローブとして使用した。
【図７】オリゴ（αＴ）セルロースについて一度精製
（レーンＡ）又は二度精製（レーンＢ）した、Ｈ．ポリ
モーファ由来の32Ｐ−ラベルしたＲＮＡの電気泳動。電
気泳動は変性７Ｍ尿素 2.5％ポリアクリルアミドゲルに
ついて行なった。酵母ｒＲＮＡ′ｓの位置およびそれぞ
れの分子量は１８ｓと２５ｓにより示されている。レー
ンＢに見られる2.3 kbバンドはｃＤＮＡプローブに転換
し、ついでＨ．ポリモーファクローンバンクからＭＯＸ
とＤＨＡＳを単離するのに使った（Ｆｉｇ．６）。メタ
ノール活性他Ｈ．ポリモーファｍＲＮＡをウサギ網赤血
球リセートで試験管内翻訳した後に得た35Ｓ−ラベルし
たタンパク質。全リセート（レーンＡ）２μｌ又はＭＯ
Ｘ特異的抗血清（レーンＢ）を使う残存１８μｌの免疫
沈降物を11.5％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分別
した。公知の分子量を有するタンパク混合物はマーカー
として使用した（Ｆｉｇ．７）。
【図８】ベックマン シーケネーターで測定した、精製
ＭＯＸのＮ−末端配列。サッカロミセス所望コドンを使
って、配列Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐか
ら誘導しうる２つのプローブ。
【図９】ＨｉｎｄIII ／ＳａｌＩ切断ＭＯＸクローンの
ＤＢＭブロットのハイブリッド化。このＤＮＡを 1.5％
アガロースゲル（第９Ａ図）で分別し、ブロットをＭＯ
Ｘ−由来合成ＤＮＡプローブ混合物にハイブリッドした
（第８図）。クローン１，４および５の唯一のバンド
は、第９Ａ図の矢印に示すように、ハイブリッドする
（第９Ｂ図）。レーンＭ：分子量マーカー、レーンＡ，
Ｂ，ＣおよびＤ：夫々クローン１，３，４および５。レ
ーンＥ：ラムダＬ47.1。
【図１０】ＭＯＸクローン４の制限地図。ＭＯＸ遺伝子
のサブクローン化およびシークエンス化に使用した適当
な制限部位のみを示してある。構造ＭＯＸ配列および作
ったＭ１３サブクローンを含む開放読み取り枠を表わ
す。使用した制限部位：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、ＥI ＝Ｅｃｏ
ＲＩ、ＥV ＝ＥｃｏＲＶ、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｓｌ＝Ｓａｌ
Ｉ、Ｓｃ＝ＳａｃＩ、Ｓｔ＝ＳｔｕＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄII
I 、Ｓｐ＝ＳｐｈＩ、Ｋ＝ＫｐｎＩ、Ｈｇ＝ＨｇｉＡｌ
およびＸ＝ＸｍａＩ。
【図１１】ＭＯＸ構造遺伝子のヌクレオチド配列および
その５′−および３′−フランキング配列。
【図１２】同上。
【図１３】同上。
【図１４】同上。
【図１５】同上。
【図１６】同上。
【図１７】同上。
【図１８】同上。
【図１９】ネオマイシンホスホトランスフェラーゼが遺
伝子に組みこむことによるプラスミドｐＵＲ 3105 の構
築。
【図２０】同上。
【図２１】プロモーターＭＯＸ−ネオマイシンホスホト
ランスフェラーゼアダプター断片。
【図２２】図１９と同じ。
【図２３】図１９と同じ。
【図２４】公表されたアミノ酸配列から誘導される。Ａ
ＡＯ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子は約５０ヌクレオ
チド長さのオリゴヌクレオチド中Ｈ．ポリモーファの最
適コドンに合成する。サブクローンのために使用する制
限部位を示す。ＨｇｉＡＩ−ＳａｌＩ断片は構造ＡＡＯ
遺伝子とＭＯＸプロモーター間のアダプターを形成す
る。翻訳開始コドン（ｍｅｔ）と停止コドン（＊＊＊）
を示す。構造配列は１〜１０４４であり、ＭＯＸプロモ
ーターは−３４〜−１である。
【図２５】同上。
【図２６】同上。
【図２７】ｐＵＲ 3003 の構築、それによりＡＡＯ遺伝
子はＨ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこ
む。ＡＡＯ遺伝子の活性に関する選択。
【図２８】同上。
【図２９】ｐＵＲ 3004 の構築、それによりＡＡＯ遺伝
子はＨ．ポリモーファｌｅｕ- 誘導体の染色体ＭＯＸ遺
伝子に組みこむ。ｌｅｕ+ についての選択。
【図３０】同上。
【図３１】ｐＵＲＳ５２８−０３の構築。ｐＣＲ１配列
の除去および二重ｌａｃＵＶ５プロモーターにより、こ
のプラスミドはｐＵＲＹ５２８−０３より約2.2 kb短
い。
【図３２】同上。
【図３３】公表されたアミノ酸配列から誘導した、ＨＧ
ＲＦ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子は約５０ヌクレオ
チド長さのオリゴヌクレオチドにおけるＨ．ポリモーフ
ァの最適コドンに合成する。ＨｇｉＡＩ、ＨｉｎｄIII
およびＳａｌＩ部位はサブクローニングのために使用す
る。ＨｇｉＡＩ−ＨｉｎｄIII 断片は構造ＨＧＲＦ遺伝
子とＭＯＸプロモーター間のアダプターを形成する。翻
訳開始コドン（ｍｅｔ）と停止コドン（＊＊＊）を示
す。構造配列は１〜１４０であり、ＭＯＸプロモーター
は−３４〜−１である。
【図３４】ｐＵＲ 3203 の構築、それによりＨＧＲＦを
コードする遺伝子はＨ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺
伝子に組みこむ。ＨＧＲＦの免疫活性に対する選択。
【図３５】同上。
【図３６】ｐＵＲ 3204 の構築、それによりＨＧＲＦを
コードする遺伝子はＨ．ポリモーファｌｅｕ- 誘導体の
染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。ｌｅｕ+ について選
択。
【図３７】ｐＵＲ 3205 の構築、それによりＨＧＲＦを
コードする遺伝子は、Ｈ．ポリモーファに自律的に複製
するＨＡＲＳ−１−含有プラスミドに挿入される。ｕｒ
ａ- 変異株の形質転換体により選択。
【図３８】ｐＵＲ 3209 の構築、それによりＨＧＲＦを
コードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合した、
Ｈ．ポリモーファの染色体ＭＯＸ遺伝子に組みこむ。Ｈ
ＧＲＦはＣＮＢｒ分解により融合タンパク質から切断す
る。ＨＧＲＦの免疫活性に関する選択。
【図３９】同上。
【図４０】ｐＵＲ 3210 の構築、それによりＨＧＲＦを
コードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合したＨＡ
ＲＳ−１−含有プラスミドに挿入される。図３７のよう
に選択。
【図４１】ｐＵＲ 3211 の構築、それによりＨＧＲＦを
コードする遺伝子は、構造ＭＯＸ遺伝子に融合した、
Ｈ．ポリモーファｌｅｕ- 誘導体の染色体ＭＯＸ遺伝子
に組みこむ。ｌｅｕ+ について選択。
【図４２】公表されたアミノ酸配列から誘導された、Ｈ
ＧＲＦ遺伝子のＤＮＡ配列。この遺伝子を図３３のよう
に合成するが、構造ＭＯＸ遺伝子のユニークなＫｐｎＩ
部位に挿入できるように構築する。したがって、遺伝子
の両側にＫｐｎＩ部位を供した。ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄII
I 断片はサブクローニング用に用いた。合成はＭＯＸ酵
素に対する融合産物としてである。８２位の内部ｍｅｔ
（ＡＴＧ）はｃｙｓ（ＴＧＴ）に転換する。翻訳開始
（ｍｅｔ）および停止（＊＊＊）コドンを示す。
【図４３】ＤＡＳ構造遺伝子のヌクレオチド配列とその
５′−および３′−フランキング配列。
【図４４】同上。
【図４５】同上。
【図４６】同上。
【図４７】同上。
【図４８】同上。
【図４９】同上。
【図５０】同上。
【図５１】同上。
【図５２】ＤＡＳ−ラムダクローンの制限地図。唯一の
適切な制限部位を示すが、ＭＯＸ遺伝子のサブクローン
およびシーケンス化に用いた。構造ＤＡＳ配列および作
ったＭ１３サブクローンを含む開放読み取り枠が示され
ている。
【図５３】ＤＡＳとＭＯＸ遺伝子の−1000領域における
同一配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤン マート オランダ国モンスター，モレンストラー ト ２ (72)発明者 コルネリス テオドルス ベリプス オランダ国マースルイス，ハゲドールン 18 (72)発明者 クリスチアン ビザー オランダ国カペル ア／ド イユセル ミノエセルフ 77 (72)発明者 ツビグニエブ アロイツイ ヤノウイク ツ ドイツ連邦共和国エルクラト−ウンテル フエルトハウス，アダルベルト−シユテ イフテル−シユトラーセ 49 (72)発明者 コルネリス ペトルス ホレンベルグ ドイツ連邦共和国ドユツセルドルフ，シ ヨパン−シユトラーセ ７ (56)参考文献 特開 昭55−50893（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−5093（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−180499（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−77889（ＪＰ，Ａ) 欧州公開103887（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開66994（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開98533（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，257 （1982） Ｐ．9872−9877 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，257 （1982） Ｐ．8824−8830

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．適当な条件下で、組換えＤＮＡ技術により得た、下
    記のアミノ酸配列で示されるハンセヌラ・ポリモーファ
    由来メタノールオキシダーゼをコードするＤＮＡを保有
    するカビ又は酵母を培養し、任意には生成した酵素を濃
    縮し、次いでこの濃縮酵素を公知方法により集取するこ
    とから成り、カビ又は酵母が、アスペルギルス属、カン
    ジダ属、ゲオトリカム属、ハンセヌラ属、レンジト属、
    ナドソニア属、ピチア属、ポリア属、ポリポラス属、サ
    ッカロミセス属、スポロボロミセス属、トルロプシス
    属、トリコスポラ属およびゼンデラ属から成る群から選
    択される、ハンセヌラ・ポリモーファ由来メタノールオ
    キシダーゼの製造方法。 MET ALA ILE PRO ASP GLU PHE ASP ILE ILE VAL VAL GLY GLY GLY SER 1 5 10 15 THR GLY CYS CYS ILE ALA GLY ARG LEU ALA ASN LEU ASP ASP GLN ASN 20 25 30 LEU THR VAL ALA LEU ILE GLU GLY GLY GLU ASN ASN ILE ASN ASN PRO 35 40 45 TRP VAL TYR LEU PRO GLY VAL TYR PRO ARG ASN MET ARG LEU ASP SER 50 55 60 LYS THR ALA THR PHE TYR SER SER ARG PRO SER LYS ALA LEU ASN GLY 65 70 75 80 ARG ARG ALA ILE VAL PRO CYS ALA ASN ILE LEU GLY GLY GLY SER SER 85 90 95 ILE ASN PHE LEU MET TYR THR ARG ALA SER ALA SER ASP TYR ASP ASP 100 105 110 TRP GLU SER GLU GLY TRP SER THR ASP GLU LEU LEU PRO LEU ILE LYS 115 120 125 LYS ILE GLU THR TYR GLN ARG PRO CYS ASN ASN ARG ASP LEU HIS GLY 130 135 140 PHE ASP GLY PRO ILE LYS VAL SER PHE GLY ASN TYR THR TYR PRO THR 145 150 155 160 CYS GLN ASP PHE LEU ARG ALA ALA GLU SER GLN GLY ILE PRO VAL VAL 165 170 175 ASP ASP LEU GLU ASP PHE LYS THR SER HIS GLY ALA GLU HIS TRP LEU 180 185 190 LYS TRP ILE ASN ARG ASP LEU GLY ARG ARG SER ASP SER ALA HIS ALA 195 200 205 TYR VAL HIS PRO THR MET ARG ASN LYS GLN SER LEU PHE LEU ILE THR 210 215 220 SER THR LYS CYS ASP LYS VAL ILE ILE GLU ASP GLY LYS ALA VAL ALA 225 230 235 240 VAL ARG THR VAL PRO MET LYS PRO LEU ASN PRO LYS LYS PRO VAL SER 245 250 255 ARG THR PHE ARG ALA ARG LYS GLN ILE VAL ILE SER CYS GLY THR ILE 260 265 270 SER SER PRO LEU VAL LEU GLN ARG SER GLY ILE GLY ALA ALA HIS HIS 275 280 285 LEU ARG SER VAL GLY VAL LYS PRO ILE VAL ASP LEU PRO GLY VAL GLY 290 295 300 GLU ASN PHE GLN ASP HIS TYR CYS PHE PHE THR PRO TYR TYR VAL LYS 305 310 315 320 PRO ASP VAL PRO THR PHE ASP ASP PHE VAL ARG GLY ASP PRO VAL ALA 325 330 335 GLN LYS ALA ALA PHE ASP GLN TRP TYR SER ASN LYS ASP GLY PRO LEU 340 345 350 THR THR ASN GLY ILE GLU ALA GLY VAL LYS ILE ARG PRO THR GLU GLU 355 360 365 GLU LEU ALA THR ALA ASP GLU ASP PHE ARG ARG GLY TYR ALA GLU TYR 370 375 380 PHE GLU ASN LYS PRO ASP LYS PRO LEU MET HIS TYR SER VAL ILE SER 385 390 395 400 GLY PHE PHE GLY ASP HIS THR LYS ILE PRO ASN GLY LYS PHE MET THR 405 410 415 MET PHE HIS PHE LEU GLU TYR PRO PHE SER ARG GLY PHE VAL ARG ILE 420 425 430 THR SER ALA ASN PRO TYR ASP ALA PRO ASP PHE ASP PRO GLY PHE LEU 435 440 445 ASN ASP GLU ARG ASP LEU TRP PRO MET VAL TRP ALA TYR LYS LYS SER 450 455 460 ARG GLU THR ALA ARG ARG MET GLU SER PHE ALA GLY GLU VAL THR SER 465 470 475 480 HIS HIS PRO LEU PHE LYS VAL ASP SER PRO ALA ARG ALA ARG ASP LEU 485 490 495 ASP LEU GLU THR CYS SER ALA TYR ALA GLY PRO LYS HIS LEU THR ALA 500 505 510 ASN LEU TYR HIS GLY SER TRP THR VAL PRO ILE ASP LYS PRO THR PRO 515 520 525 LYS ASN ASP PHE HIS VAL THR SER ASN GLN VAL GLN LEU HIS SER ASP 530 535 540 ILE GLU TYR THR GLU GLU ASP ASP GLU ALA ILE VAL ASN TYR ILE LYS 545 550 555 560 GLU HIS THR GLU THR THR TRP HIS CYS LEU GLY THR CYS SER MET ALA 565 570 575 PRO ARG GLU GLY SER LYS ILE ALA PRO LYS GLY GLY VAL LEU ASP ALA 580 585 590 ARG LEU ASN VAL TYR GLY VAL GLN ASN LEU LYS VAL ALA ASP LEU SER 595 600 605 VAL CYS PRO ASP ASN VAL GLY CYS ASN THR TYR SER THR ALA LEU THR 610 615 620 ILE GLY GLU LYS ALA ALA THR LEU VAL ALA GLU ASP LEU GLY TYR SER 625 630 635 640 GLY SER ASP LEU ASP MET THR ILE PRO ASN PHE ARG LEU GLY THR TYR 645 650 655 GLU GLU THR GLY LEU ALA ARG PHE 660 ２．カビ又は酵母はアスペルギルス・ジャポニカス、ア
    スペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、カン
    ジダ・ボイジニ、ハンセヌラ・アノマラ、ハンセヌラ・
    ポリモーファ、ハンセヌラ・ウインゲイ、クローケラ・
    ｓｐ．2201およびピチア・パストリス種から選択する、
    請求項１記載の方法。 ３．カビ又は酵母は、ホルムアルデヒドからジヒドロキ
    シアセトンの生成を促進するジヒドロキシアセトンシン
    ターゼ酵素も産生し得る、請求項１又は２のいずれか１
    項に記載の方法。
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