JPH08511951A

JPH08511951A - グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼを発現するｈａｎｓｅｎｕｌａの微生物形質転換体

Info

Publication number: JPH08511951A
Application number: JP7503558A
Authority: JP
Inventors: デイビツド・レロイアントン，; ロバートデイコジモ，; ウルリケ・マグダレネダーレムス，; ゲルト・ヨハンゲリツセン，; ズビグニユウ・アロイジージヤノウイツツ，; ミヒヤエルピオンテク，
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-29
Publication date: 1996-12-17
Also published as: WO1995001443A1; BR9407342A; AU7316294A; ZA944777B; EP0706572B1; EP0706572A1

Abstract

(57)【要約】本発明はグリコール酸オキシダーゼを生産するように、場合によってはカタラーゼも生産するように遺伝子工学的に操作されたハンセニューラ（Hansenula）株に関し、これはグリコール酸をグリオキシル酸に転換する生物触媒として役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼを発現する HANSENULAの微生物形質転換体発明の背景１．発明の分野本発明は酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼを発現する新規な微生物形質転換体に関する。より詳細には本発明は、酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼの発現をコードするＤＮＡ断片を含み、そして場合によっては酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼの生産のためのカタラーゼおよび、場合によって酵素的に活性な異型カタラーゼに対する異型遺伝子で形質転換されてもよいハンセニューラ(Hansenula)メチロトローフ性酵母種を培養することに関する。２．関連技術の記載：グリオキシル酸は、様々な農薬、医薬品および香水の製造に重要な中間体である。典型的なグリオキシル酸の工業的生産には、酸化化学または電気化学的手段のいずれかが使用される。電気化学的製造には、グリオキシル酸を生成するために蓚酸の還元またはグリオキサールの陰極での酸化のいずれかが関与し、一方化学的酸化には一般的にHNO₃のような強酸の存在下でのグリオキサールの酸化が関与する。これらの工業的方法の結果、種々の毒性の酸および重金属を含有する廃棄蒸気が生成される。毒性廃棄物の生成にまつわる大衆の関心の増大は度重なる政府の規制と結び付き、経費のかからない、しかも環境に受け入れられることができる別のグリオキシル酸の生産法に関する探求のはずみとなった。そのような有力な方法の１つは、米国特許第5,219,745号明細書に記載されているようなグリコール酸オキシダーゼによるグリコール酸の酸化が関与する、微生物が媒介する酵素的触媒である。グリコール酸および酸素を水溶液中で、かつアミン緩衝液および２つの酵素触媒（グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼ）の存在下で反応させた。この方法は、カタラーゼ（フォーメート生産の原因である副産物の過酸化水素を破壊するため）、ならびにグリオキシレートと酸化-耐性N-置換ヘミアミナールおよび／またはイミンと複合体を形成できるアミン添加物（さらなる酸化を制限する）の両方を使用することの相乗効果を実証した。グリオキシル酸およびアミノメチルホスホン酸(AMPA)の混合物を調製するための関連方法は、米国特許第5,135,860号明細書に記載された。米国特許第5,180,846号明細書では、生成したグリオキシル酸およびAMPAの混合物が、N-（ホスホノメチル）グリシン、発生後の植物に有害な物質および除草剤を製造するために使用された。グリコール酸オキシダーゼは、緑葉植物および哺乳類細胞を含む様々な起源から入手できる酵素である。N.E.Tolbertら(J.Biol.Chem.,(1949)181:905)は、初めてタバコの葉から抽出した酵素を報告し、これは中間体グリオキシル酸の生成を介してグリコール酸のギ酸およびＣＯ₂への酸化を触媒した。同様に、K.E．Ri chardsonおよびN.E.Tolbert(J.Biol.Chem.,(1961)236:1280)は、タバコ、砂糖大根、フダンソウ、ホウレンソウまたはラット肝臓から単離した酵素を使用して、グリコール酸のグリオキシル酸へのグリコール酸オキシダーゼ-触媒酸化中に、蓚酸の生成を報告した。C.O.Clagett、N.E.TolbertおよびR.H.Burris(J.Biol.Chem.,(194 9)78:977)は、グリコール酸と酸素を使用したグリコール酸オキシダーゼの触媒酸化のための最適pHは約7.8−8.6であり、そして最適温度は35-40℃であると報告した。最近の組換えＤＮＡ法の進歩により、ホウレンソウの酵素をコードするｃＤＮＡの単離（Volokitaら、J.Biol.Chem.,(1987)262(33):15825)と組み合わせて、別の経済的な酵素源として役立てることを目的とした微生物株の構築が可能となった。今日まで、工業的な応用での異型タンパク質の発現に選択される宿主生物は大腸菌であった。しかし、場合によっては大腸菌が適当でない宿主である可能性もある。例えば、大腸菌は発現した酵素の活性を妨害するかもしれない多くのタンパク質分解性因子を含み、そしてさらに精製を必要とする毒性の発熱物質を生産するかもしれない。これらの、ならびに他の考察は活性酵素を生産するための別の宿主、特に酵母への関心を増大させる。酵母は大腸菌および他の細菌に優る、工業的応用に対する幾つかの利点を提供する。酵母は細菌よりも一般的に高い密度で生育し、容易に連続発酵法に適用できる。酵母宿主のさらなる利点には、酸化的リン酸化のような多くの重要な生物学的機能がオルガネラの中に位置し、したがって生物の外来酵素産物の過剰発現の悪影響にさらされないかもしれない。さらに、酵母はグリコシル化がポリペプチド生成物の生物活性に重要な場合に、発現したポリペプチド生成物のグリコシル化を行うことができることも考えられる。グリコール酸オキシダーゼを生産する能力があるにもかかわらず、今日まで使用されている典型的な微生物宿主は不活性酵素を生産するか、あるいは極めてわずかなレベルの生産といういずれかを不十分に行ってきた。初期のデータでは大腸菌は酵素をコードする遺伝子を発現しうる状態で導入した後に、酵素的に活性な状態のグリコール酸オキシダーゼを生産することはできないと示されたが(Macherouxら、Biochemistry(1991)30:4612を参照にされたい)、その後、この宿主中でT7 RNAポリメラーゼプロモーターを使用して活性酵素を大変わずかではあるが発現できることが示された(Macherouxら、Biochem.Biophys.,( 1992),Acta,1132:11-16)。サッカロミセス(Saccharomyces)属を含む様々な真菌種から活性なグリコール酸オキシダーゼの発現を行うことができたが(Macheroux ら、同上(1991))；これらの宿主は工業的に有用であると思われるよりもはるかに低いレベルの酵素を生産できるだけであった。カタラーゼ(例えばEC1.11.1.6)は自然に広く存在する酵素であり、そしてほとんどすべての好気生物に見いだされる。カタラーゼはオキシダーゼ酵素により、または分子酸素の反応のいずれかにより生成した過酸化水素を不均化する機能をもつ。反応は次のとおり：２Ｈ₂Ｏ₂→２Ｈ₂Ｏ＋Ｏ₂ 真核生物では、カタラーゼはしばしば少なくとも２つの形で存在する：サイトソル性およびペルオキシソーム性；例えばサッカロミセスセルビシエ(Saccharom yces cerevisiae)ではこれらの２つの形態はそれぞれカタラーゼＴ(CTT1遺伝子産物、Spevak.W.ら、Mol.Cell Biol.,(1983)、3:1545)およびカタラーゼＡ(CTA1 遺伝子産物、Cohenら、Mol.Gen.Genet.,(1985),200:74-79)である。カタラーゼＡおよびカタラーゼＴは、天然のサッカロミセスセルビシエプロモーターの制御下でハンセニューラポリモルファ(Hansenula polymorpha)中で活性に発現されると報告されたが、カタラーゼＡだけがカタラーゼ欠損ペルオキシソームを機能的に相補することが判明した(HansenおよびRoggenkamp、Eur.J.Biochem.,(1989),184:1 73-179)。発明の要約本発明は酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼを発現させるためのＤＮＡ融合物を提供し、この融合物はグリコール酸オキシダーゼ遺伝子をコードする第二ＤＮＡ断片に操作可能かつ発現できるように連結したハンセニューラ種由来の適当なプロモーターをコードする第一ＤＮＡ断片を含んで成る。本発明は酵素的に活性な異型カタラーゼを発現させるためのＤＮＡ融合物も提供し、この融合物はカタラーゼ遺伝子をコードする第二ＤＮＡ断片に操作可能かつ発現できるように連結したハンセニューラ株由来の適当なプロモーターをコードする第一ＤＮＡ断片を含んで成る。本発明はさらに酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼを発現させるために、形質転換したハンセニューラ宿主酵母を提供し、ここで形質転換したハンセニューラ宿主酵母はグリコール酸オキシダーゼを発現できる異型ＤＮＡ融合物を含む。好ましくは形質転換したハンセニューラ宿主酵母は、内因性カタラーゼ遺伝子も発現できる。本発明の１つの特別な態様では、酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼと一緒にヘテロロガスに生産される酵素的に活性なカタラーゼを同時に発現する、二重に形質転換されたハンセニューラポリモルファを提供する。好ましくは二重に形質転換されたハンセニューラ宿主酵母は、アミノメチルホスホン酸により阻害されないように選択した外来のカタラーゼ遺伝子を発現できる。さらに特別な態様では、ホウレンソウグリコール酸オキシダーゼまたはその活性な変更体をコードする異型ＤＮＡを使用する。すべての態様において、異型ＤＮＡは宿主染色体に安定に組込まれる。本発明は酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼを生産する方法も提供し、その方法は、酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼをコードする異型ＤＮＡ構築物を含む形質転換したハンセニューラ株を培養し、そして該酵母の成長をグリコール酸オキシダーゼの最大生産に適するような条件下で維持する工程を含んで成る。場合によっては外来のカタラーゼが上記グリコール酸オキシダーゼと一緒に発現される方法も提供する。図面、配列表および生物寄託に関する簡単な説明第１図はホウレンソウグリコール酸オキシダーゼのアミノ酸配列を具体的に記載する（配列番号１）。第２図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpFPMT130発現ベクターを具体的に記載する。第３図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpRB発現ベクターを具体的に記載する。第４図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpFMDGO発現ベクターを具体的に記載する。第５図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpRBGO発現ベクターを具体的に記載する。第６図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpHK2発現ベクターを具体的に記載する。第７図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpHCTKm2発現ベクターを具体的に記載する。第８図はそれぞれの成分および制限部位を示すプラスミドpRBCATT発現ベクターを具体的に記載する。出願人は、“特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標準的表示に関する規則(Rules for the Standard Representation of Nucleotide and Ami no Acid Sequences in Patent Applications)”(欧州特許庁長官の決定に対する添付書類ＩおよびII、OJ EPO 12/1992に対する追補No.2にて公開)に従って配列番号１に関する配列表を提出した。この配列は第１図に対応する。出願人はブタペスト条約に基づき以下の生物寄託を行った：本明細書で使用するように、“NRRL”名とは米国、イリノイ州61604、ペオリア、ユニバーシティー通り、1815Nの米国農務省、北部地域調査研究所、アグリカルチュラルリサーチサービスカルチャーコレクションを言う。発明の詳細な説明本発明はハンセニューラ属の酵母により工業的に有用な量で生産される、酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼ(GO)の生産に関する。 “ハンセニューラ株”という用語の使用において、この用語はメチルトローフ性ハンセニューラ酵母と同じまたは類似として分類される任意の種を包含する用語であるべきで、そして宿主をハンセニューラ属の種と呼ぶことを妨げないが、メチルトローフ性酵母の分類がより適当な基準であると思われる。これは制限するわけではなく、ハンセニューラポリモルファ、ハンセニューラアウグスタ(Hans enula augusta)、ハンセニューラアノマーラ(Hansenula anomala)、ハンセニューラカプスラータ(Hansenula capsulata)、ハンセニューラサターナス(Hansen ula saturnus)およびハンセニューラウィンゲイ(Hansenula wingei)を例として含む。本発明の目的のために、“酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼ”という語は、従来設計のアッセイにより測定されるようなグリコレートをグリオキシレートに転換できる状態の任意のグリコール酸オキシダーゼ（すなわち、グリコール酸をグリオキシル酸に転換する）を言う。またさらにこの語は、グリコレートからグリオキシレートへの反応を触媒するように、酵素が単離され、そしてリホールドされなければならない封入体のような泡中に含まれる酵素も包含すると理解されるべきである。さらに本発明の目的のために、“工業的に有用な量” とは、経済的に可能な細胞単位あたりの特別なタンパク質の濃度の生産を言う。したがって本発明のグリコール酸オキシダーゼは天然に存在する酵素の任意の状態に相当する構造を有するか、または上記定義のような酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼが保持されるならば、遺伝的に工作した変更構造を有してもよい。天然に存在するグリコール酸オキシダーゼの状態には、例えばホウレンソウ−生産グリコール酸オキシダーゼがある。本明細書の図１に示すように、ホウレンソウのグリコール酸オキシダーゼは、その成熟状態で、示した配列（配列番号１）のように整列した369アミノ酸から成る。本発明の好適態様により、グリコール酸オキシダーゼはホウレンソウのグリコール酸オキシダーゼまたは酵素的に活性なホウレンソウのグリコール酸オキシダーゼの変異体、例えば酵素の酵素的に活性な断片、または保存的アミノ酸置換を使用して１つ以上のアミノ酸が置き換わった類似体、またはペルオキシソームの蓄積を支配する酵素領域が欠損している変異体である（例えばMacher ouxら、同上(1991)を参照にされたい）。アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)、サッカロミセスセルビシエ（カタラーゼＴ）、ハンセニューラポリモルファ、ピチアパストリス(Pichia pa storis )およびウシ肝臓は現在、グリコール酸/AMPA混合物の酸化中に生成する過酸化水素の分解に関する触媒としてそれぞれ研究され、そしてこれまでに報告されていないエイチ．ポリモルファ、ピー．パストリスおよびウシ肝臓由来のカタラーゼのAMPAによる可逆的阻害が見いだされた。この阻害はどのような可溶性カタラーゼ、固定化カタラーゼまたはカタラーゼ含有全細胞触媒を使用するかにかかわらず生じる。内因性のカタラーゼがAMPAにより阻害される微生物細胞形質転換体（例えば、エイチ．ポリモルファ形質転換体）を触媒として使用する、グリコール酸／AMPA 反応混合物に対する阻害耐性カタラーゼ源をさらに加えることの代替として、微生物形質転換体（これは外因性の酵素、グリコール酸オキシダーゼを発現する）をAMPAに阻害されないさらなる外因性カタラーゼ（例えば、エス．セルビシエ由来のカタラーゼＴ）を発現するように再度工作した。この微生物細胞“二重”形質転換体を、AMPAにより阻害されない添加カタラーゼの不在で使用することにより、AMPAにより阻害されるカタラーゼをもつ微生物細胞“単回”形質転換体（すなわち外因性グリコール酸オキシダーゼおよび内因性カタラーゼ）で得たものと比較した時、グリオキシレートの収量が有意に上昇し、そしてフォーメートの生成が減少した。AMPAが存在する中でグリコレートからグリオキシレートへの酵素的転換のためには、異型カタラーゼはAMPAによる阻害の欠失により選択されるものと考えられる。限定されるものでないが、これらにはサッカロミセスセルビシエ由来のカタラーゼＴ、アスペルギウスニガー由来のカタラーゼ等がある。サッカロミセスセルビシエ由来のカタラーゼＴを使用することが好ましいが、AMPAが不在の中でグリコレートからグリオキシレートへの酵素的転換のためには、任意の適合性のある異型カタラーゼが本発明の目的に有用であると考える。メチルトローフ性酵母ハンセニューラポリモルファは、異型タンパク質を発現するために開発された(Roggenkampら、Mol.Gen.Genetics,(1986),202:302;Hol lenbergおよびJanowicz、欧州特許出願公開第0299108号明細書(1987))。異なる環境でも生活しうるメチルトローフとして、この酵母種は、メタノールを唯一のエネルギーおよび炭素源として使用することができ；他の可能な炭素源はグルコースまたはグリセロールである。メタノールを培養培地に添加すると、メタノール代謝の鍵となる酵素が強く発現する。この発現は転写レベルで調節される。これらの鍵となる酵素、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD;すなわちFMDH)およびメタノールオキシダーゼ(MOX)の遺伝子は、クローン化され、そして特徴が決定された(Ledeboerら、Nucl eic Acids Res.,(1985),13:3060;Janowiczら、Nucleic Acids Res.,(1985),13:2 043;HollenbergおよびJanowicz、同上(1987))。これらの鍵となる酵素のプロモーターは、炭素源としてグルコースを使用して抑制され、グリセロールを使用して低下し、そしてメタノールを使用して誘導される。これらの遺伝子のプロモーター要素は、異型遺伝子発現のために使用できる。したがって、それらは組換え体ハンセニューラポリモルファ株の作成のための発現ベクターの成分である。標準的な発現ベクターはプロモーター(例えば制限するわけではないが、FMD-プロモーター、MOX-プロモーター等)と一般的な任意のターミネーター(ここでも限定されるものでないが、例としてMOX-ターミネーター配列等)の間に組込まれた外来遺伝子のコーディング配列を持つ。さらに、ベクターは選択マーカーおよびHARS1(ハンセニューラ自律的複製配列)を、適当なエイチ．ポリモルファ中での選択および増殖のために含み、そして細菌の複製起源(ori)およびアンピシリン-耐性(amp)遺伝子を大腸菌中での増殖および選択のために含んでいる(Gellissenら、Biotech Adv.(1992),10,179:Gellissenら、T ibtech,(1992),10,413)。取り込み後、異型ＤＮＡは宿主ゲノムに安定に組込まれる。形質転換の結果、頭から尾に整列した組込みＤＮＡのコピー数が変化している様々な株を生じる。この発現カセットの安定な多量化組込みにより、ハンセニューラポリモルファは数種のタンパク質を固定した比率で同時−発現するための理想的な宿主となる (Janowiczら、Yeast,(1991),7:431)。グリコール酸オキシダーゼまたはカタラーゼをハンセニューラ中で発現させるための発現カセットの構築は、当該技術分野で周知の方法により行うことができる。グリコール酸オキシダーゼ遺伝子（またはカタラーゼ遺伝子）の起源は、染色体ＤＮＡまたはこの遺伝子を含む既に構築されているベクターのいずれかであることができる。一般的に、すでに存在しているベクターからグリコール酸オキシダーゼ遺伝子を単離することが最も好ましい。5'および3'末端の両方が便利な制限部位に結合しているグリコール酸オキシダーゼ遺伝子も好ましい。適当なグリコール酸オキシダーゼ遺伝子を含む任意のベクターまたはプラスミドを使用できるが、本発明の目的にはプラスミドpDA-PCR#1が最も好ましい。pDA-PCR#1はアスペルギルス形質転換プラスミドpTAwtS-GOD由来のものである。より特別には、pTAwtS-GODはホウレンソウグリコール酸オキシダーゼ遺伝子をアスペルギルスニダランス（Aspergillus nidulans）alcAプロモーターの制御下に有し、5'末端がBglII部位に、そして3'末端がEcoRI部位に結合している。pTAwtS-GOD中のグリコール酸オキシダーゼ遺伝子は従来のＰＣＲ法により、一端をXbaI部位に、そして反対の端をEcoRI部位に組込まれるプライマーを使用して増幅される。ＰＣＲ断片はBluescriptプラスミド（ストラタジーン：stratage ne、ラジョラ、カリフォルニア州）のXbaIおよびEcoRI部位の間に連結され、プラスミドpDA-PCR#1を生成する。グリコール酸オキシダーゼタンパク質をコードする単離ＤＮＡは、場合によっては、適当なハンセニューラ形質転換ベクター中にクローン化する目的で、周知技術により増幅されてもよい。増幅のための任意の方法を使用でき、それにはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)またはリガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)があるが、ＰＣＲが最も好ましい。増幅したグリコール酸オキシダーゼＤＮＡを次に適当なハンセニューラ形質転換ベクター中にクローン化する。ベクターがグリコール酸オキシダーゼ遺伝子を駆動できるプロモーターを含み、かつプロモーターが下流にグリコール酸オキシダーゼ遺伝子を含む制限部位に匹敵する制限部位を含んでいる、多くの形質転換ベクターが適当である。第２および第３図に詳細に記載されているpFPMT130またはpRBを含む、任意の適当な形質転換ベクターを使用できる。制限断片は基本ベクターpF PMT130(第２図を参照にされたい)のマルチクローニング部位に、EcoRIおよびBam HＩ部位を挿入のために使用してクローン化される。第２シリーズは、選択マーカーとしてのクロラムフェニコール耐性配列を含むpRBベクターで構築する（第３図）。新たに生成したプラスミドＤＮＡの制限処理、連結、増殖および単離は Maniatisら、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（Molecul ar Cloning:a laboratory manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1982)に従う。ｃＤＮＡ配列の挿入は発現ベクターpFMDGOおよびpRBGO(第４および５図)を生成する。エイチ．ポリモルファの形質転換上記記載のベクターを、オロチジン5'リン酸デヒドロゲナーゼが欠損しているコンピテントなエイチ．ポリモルファ細胞RB11株(ura^-)を形質転換するために使用する。栄養要求RB11株は、基本的にRoggenkampら、同上、1986に記載されたように生成する。この株のコンピテント細胞は確立された方法(Dohmenら、Yeast(1 991),7,691)に従い以下のように作成する：10mLの酵母培地(YPD；すなわち、酵母、ペプトンおよびグルコース)に細胞を接種し、そして37℃で一晩培養する。このカルチャーを続いて200mLのYPDを接種するために使用する。細胞を37℃でOD₆₀₀ が0.6 から1.0の間になるまで培養する。細胞を遠心により回収し、室温で100mLの溶液 A(1Mソルビトール、10mMビシンpH8.35、3％エチレングリコール)で洗浄し、そして次に4mLのこの溶液Aに再懸濁する；11μLのジメチルスルフォキシド(DMSO)を加え、そしてコンピテント細胞を-70℃で保存する。形質転換のために、10μgのプラスミドＤＮＡおよび100μlの冷0.1M CaCl₂を凍結細胞アリコートに加える；迅速に解凍後、1.0mLの溶液B(40％PEG 3350、200 mMビシンpH8.35)を加え、そして形質転換混合物を37℃で１時間インキューベーションする。続いて、細胞を1mLの溶液C(150mM NaCl、10mMビシンpH8.35)で洗浄し、そして200mLに再懸濁する。この懸濁液を選択寒天プレート（酵母窒素塩基( YNB)-グルコース）にまく。プレートを37℃で3−5日インキューベーションする。異型ＤＮＡの多量化コピーを有する有糸分裂的に安定な株の生成発生したプレートからのコロニーを、3mLのYNBグルコースを接種するために使用し、そして37℃で培養する。完全に成長したカルチャーの50μLアリコートを、別の3mLカルチャーに接種するために使用する。この方法を40世代繰り返す。この継代中、プラスミドＤＮＡはゲノムに組込まれる。続いて3mLのYPD（非−選択培地）を接種し、そして37℃で培養する。希釈したアリコートのプレーティングでは、選択および非−選択寒天プレートにまいた時に同一数のコロニーを生じるはずである。グリコール酸オキシダーゼ(GO)を発現する組換え株の同定組換えGOの発現のために、細胞を抑制または誘導条件下で培養しなければならない。継代した形質転換体を3mLのYNB（1％グリセロールを補充）を接種するために使用した。成長２日後、細胞を3mLのYNB（1％メタノールを補充）に移した。さらに１日誘導した後、細胞を遠心により回収し(8 00×gで5分間)、そして粗抽出物から調製した試料中のGO活性を測定した。粗抽出物から調製回収した細胞を600mLの抽出用緩衝液（1mMジチオスレイトール(DTT):0.1mMフラビンモノヌクレオチド(FMN)、10mMフェノールメチルスルホニルフルオリド(PM SF)、10％DMSO、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8.3中）に再懸濁する。細胞をガラスビーズ(直径0.45-0.5mm)で5分間破壊し、30秒ごとに固体CO₂で冷却する。細胞の破片を遠心で除去する(15000×gで15分間、4℃)。GO活性の測定 GO含量について5-20mLの粗抽出物は、Sodaら、Agr.Biol.Chem.,(1973),37(6): 1393を変更した分光光度的アッセイでグリオキシル酸生成を定量することにより分析した。GO-発現株中に組込まれた異型ＤＮＡのコピー数の測定組込まれた異型ＤＮＡのコピー数をGellissenら、同上(1992)により概説されたように測定する。ＤＮＡ決定のために、ＤＮＡを様々な形質転換体および非形質転換宿主RB11から単離する。単離したＤＮＡをAsp718/SalIで制限処理し、ニトロセルロースに移し、そして³²P-標識EcoRI/Asp718断片にハイブリダイズさせる。この結果、本来の単一コピーFMD/GO遺伝子融合体および異型FMDプロモーター/GO遺伝子融合体について、同様な電気泳動的位置で２つのシグナルを生じる。ＤＮＡ希釈で、コピー数は異型断片のシグナルの強度を本来の単一コピーの対照の強度と比較して推定する。GO生産株の性質形質転換した株を継代し、そしてGO含量を記載のように分析した。続いてスクリーニングの結果は、形質転換に関してpFMDGOおよびpRBGOを使用して得られた。グリコール酸オキシダーゼタンパク質はウエスタンブロット分析により検出でき、あるいはグリコール酸オキシダーゼ活性は分光光度的アッセイにより検出できる。最も好適であるのは、Sodaら、同上(1973)に記載された方法である。このアッセイは、グリコール酸オキシダーゼが触媒するグリコレートの酸化により生成したグリオキシレートを測定し、これは該グリオキシレートとグリシンおよび o-アミノベンズアルデヒドとが反応することにより440nmに最大吸収を有する黄色い複合体を形成することによる。またハンセニューラ株は内因性カタラーゼを生産する能力も評価された。カタラーゼ生産の評価のためには、形質転換したハンセニューラポリモルファRB11を上記のように成長させ、そして酵素的に活性なカタラーゼ（すなわち従来の設計のアッセイで測定するような過酸化水素の任意の不均化）について分析した。カタラーゼ活性を測定する幾つかの方法を利用でき、例えばBeersら、J.Biol.Chem .,(1952),195:133がある。以下の実施例は本発明をより完全に、そしてさらに個々の観点を説明するために与えるものである。そのために、ハンセニューラポリモルファはハンセニューラ属の宿主の説明を目的として採用し、そして同様に特定の遺伝コードおよび配列源を様々な目的で説明のためにのみ使用する。このように、実施例は非限定的なものであり、本発明を説明することを意味し、どのようにも不当に制限されることを意味していない。実施例１ pDA-PCR#1で見いだしたGO遺伝子(これはアルペルギルス形質転換プラスミドpT AwtS-GOD由来)を、EcoRIおよびBamHＩで切り出した。より詳細には、pTAwtS-GOD はホウレンソウグリコール酸オキシダーゼ遺伝子をアルペルギルスニデュランスalcAプロモーターの制御下に含み、そして5'末端がBglII部位に、そして3'末端がEcoRI部位に結合している。pTAwtS-GOD中のグリコール酸オキシダーゼ遺伝子を、従来のPCR法により、一端がXbaI部位に、そして反対の端がEcoRI部位に組込まれるプライマーを使用して増幅する。PCR断片をBluescriptプラスミド（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州）中のXbaIおよびEcoRI部位に連結して、プラスミドpDA-PCR#1を生成する。この方法に関するより詳細な説明は、同時係属中の、そして同時に受理された米国特許出願第USSN 08/085,488;PCT 号明細書を参照にされたい。これらは引用により参考目的として本明細書に編入する。制限処理断片を基本ベクターpFPMT130(第２図参照)のマルチクローニング部位に、EcoRIおよびBamHＩ部位を挿入のために使用してクローン化した。この新たに生成したプラスミドＤＮＡの制限処理および連結、増殖および単離は、Maniat isら、同上(1982)に記載されたような標準的方法に従った。ｃＤＮＡ配列の挿入により発現ベクターpFMDGO（第４図）を生成した。実施例２第２シリーズは、選択マーカーとしてクロラムフェニコール耐性配列を含んでいるpRBベクター中に構築した(第３図)。pDA-PCR#1中に見いだされたGO遺伝子は、EcoRIおよびBamHＩを使用して切り出した。制限処理断片をベクターpRBの(第３図)多クローニング部位に、EcoRIおよびBamHＩ部位を挿入のために使用してクローン化した。この新たに生成したプラスミドＤＮＡの制限処理および連結、増殖および単離は、Maniatisら、同上(1982)に記載されたような標準的方法に従った。ｃＤＮＡ配列の挿入により発現ベクターpRBGO(第５図)を生成した。実施例３エイチ．ポリモルファのpFMDGOでの形質転換ベクターpFMDGOをコンピテントなエイチ．ポリモルファ細胞RB11株(オルチジン5'リン酸デヒドロゲナーゼ欠損:ura^-)を形質転換するために使用した。栄養要求性RB11株を、基本的にはRoggenkampら、同上(1986)により記載されたように生成した。この株のコンピテント細胞を確立された手法により(Dohmenら、同上(19 91))以下のように生成した：10mLの酵母培地(YPD)を細胞で接種し、そして37℃ で一晩培養した。このカルチャーを続いて200mLのYPDを接種するために使用した。細胞を37℃でOD₆₀₀が0.6から1.0になるまで成長させた。細胞を遠心で回収し、室温で100mLの溶液A(1Mソルビトール、10mMビシンpH8.35、3％エチレングリコール)で洗浄し、そして4mLのこの溶液Aに再懸濁した；11μLのDMSOを加え、そしてコンピテント細胞を-70℃で保存した。形質転換のために、10μgのプラスミドＤＮＡおよび100mLの冷0.1M CaCl₂を凍結細胞アリコートに加えた；迅速に解凍後、1.0mLの溶液B(40％PEG 3350、200mM ビシンpH8.35)を加え、そして形質転換混合物を37℃で１時間インキューベーションした。続いて、細胞を1mLの溶液C(150mM NaCl、10mMビシンpH8.35)で洗浄し、そして200μLに再懸濁した。この懸濁液を選択寒天プレート（YNB-グルコース）にまいた。プレートを 37℃で3−5日インキューベーションした。異型ＤＮＡの多量化コピーを有する有糸分裂的に安定な株を継代安定化により生成した。発生したプレートからのコロニーを、3mLのYNBグルコースを接種するために使用し、そして37℃で培養した。完全に成長したカルチャーの50μLアリコートを、別の3mLカルチャーに接種するために使用した。この方法を40世代繰り返す。この継代中、プラスミドＤＮＡがゲノムに組込まれた。続いて3mLのYPD （非−選択培地）を接種し、そして37℃で培養した。継代安定化した細胞の希釈アリコートでは、選択および非−選択寒天プレートにまいた時に同一数のコロニーを生じた。継代した形質転換体を3mLのYNB（1％グリセロールを補充）を接種するために使用した。成長２日後、細胞を3mLのYNB（1％メタノールを補充）に移した。さらに１日誘導した後、細胞を遠心により回収した(800×gで5分間)。回収細胞を6 00mLの抽出用緩衝液(1mM DTT、0.1mM FMN、10mM PMSF、10％ DMSO、リン酸ナトリウム緩衝液pH8.3中）に再懸濁した。細胞をガラスビーズ(直径0.45-0.5mn)で5 分間破壊し、30秒ごとに固体CO₂で冷却する。細胞の破片を遠心で除去する(1500 0×gで15分間、4℃)。グリコール酸オキシダーゼ活性を細胞溶解物から、o-アミノベンズアルデヒドおよびグリシン(Sodaら、同上、1973)を採用したGO酵素活性のための分光光度的アッセイ(440nmの吸収で)を使用して測定した。結果を表Ｉに表し、活性はタンパク質mgについて報告している。実施例４エイチ．ポリモルファのpRBGOによる形質転換ベクターpRBDGOはコンピテントなエイチ．ポリモルファ細胞RB11株を形質転換するために、本質的に実施例３に記載したように使用した。継代安定化およびグリコール酸オキシダーゼ活性のアッセイ後、以下のクローンを選択した：１つの株、11.11.126をさらにサブクローン化するために選択した。結果を表IIIに表す。実施例５組込まれたヘテロロガスＤＮＡのコピー数を、ハンセニューラポリモルファ GO1についてGellissenら、(同上、1992)に概説されているように測定した。ＤＮＡを形質転換体および非形質転換宿主RB11から単離した。単離したＤＮＡをAsp7 18/SalI で制限処理し、ニトロセルロースに移し、そして³²P-標識EcoRI/Asp718 断片にハイブリダイズさせた。この結果、本来の単一コピーFMD遺伝子および異型FMDプロモーター/GO遺伝子融合体について、同様な電気泳動的位置で２つのシグナルが生じた。ＤＮＡ希釈で、コピー数は異型断片のシグナルの強度を本来の単一コピー対照の強度と比較して推定した。測定ではハンセニューラポリモルファGO1が、組込まれたプラスミドの約30コピーを有することが判明した。この組換え株は有糸分裂で安定で、発酵中に変化しない。実施例６ CTT1についてプラスミドの発現は、実施例４に記載したGO発現ハンセニューラポリモルファGO1株の超形質転換のために設計した。基本的な発現ベクターは、ハンセニューラポリモルファGO1骨格からの超形質転換体を確認するためのさらなる優性選択マーカーとして、ADH1プロモーター／カナマイシン耐性融合体を持つ。このカナマイシン耐性遺伝子は大腸菌トランスポゾンTn5由来である。CTT1遺伝子は、本来のCTT1プロモーターに融合したCTT1コーディング配列を持つプラスミドpHCT-124(HansenおよびRoggenkamp、同上(1989))から得た。このプラスミドでのエイチ．ポリモルファ株の形質転換は、CTT1を発現する組換え株を生じると報告されている(HansenおよびRoggenkamp、同上(1989))。プラスミドpHK2(第６図)からのHindIII断片として得たADH1/カナマイシン耐性融合体をプラスミドpHCT-124に挿入し、ベクターpHCTKm2（第７図）を生成した。形質転換はハンセニューラポリモルファGO1株の細胞を宿主として使用することを除き、本質的に実施例３に概説した方法に従った。形質転換体の選択のためには、混合物をゲンタマイシン(G418硫酸塩:GIBCO、400μL中1.5mg、20mLの硬化寒天プレートの表面に適用)を含むYNBプレートにまいた。実施例７第二構築では、pHCT-124からのCTT1コーディング配列をM13ベクターにサブクローン化し、そして部位−特異的突然変異誘発法により突然変異させ、CTT1遺伝子のＡＴＧ開始およびＴＡＡ終止コドンを含むBglII制限部位を得た。このCTT1 遺伝子およびADH1/カナマイシン耐性融合体（実施例６に記載）をpRB（第３図）中に挿入した後、生成したベクターをpRBCATTと命名し、これを第４図に表す。これは実施例１のGO発現プラスミドについて記載したように、FMD-プロモーターおよびMOX-ターミネーター配列の間に挿入されたCTT1配列を含む。 pRBCATTでのハンセニューラポリモルファGO1の形質転換、ならびにGOおよびカタラーゼTを同時発現している株の同定は、本質的に実施例６に記載したとおりである。 GOおよびカタラーゼT活性を同時発現している継代クローンを、前記のようにプロモーターの誘導について、グリセロールそして次にメタノールを補充したYN Bで培養することにより同定した。全カタラーゼ活性（カタラーゼTに加えて内因性エイチ．ポリモルファカタラーゼ）は、二重形質転換体の抽出物を調製し、そして湿潤細胞の2-5mgの抽出物を磁気撹拌棒を含む3-mLの石英キュベットに入れ、そして次に2.0mLの16.7mMリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、続いて1.0mLの59mMの過酸化水素(16.7mMリン酸緩衝液、pH7.0中)を加え、そして240nm(ε＝39.4)吸収の経時的変化を測定しながら懸濁液を撹拌することにより測定した。微生物二重形質転換体のカタラーゼTおよび内因性カタラーゼ活性は、pH4.0でのこの方法により測定した活性を比較することにより、それぞれ定めた;pH4.0で内因性エイチ.ポリモルファカタラーゼはpH7.0での活性の7％を維持し、一方カタラーゼTはpH7.0でのその活性の60％を維持した。カタラーゼＴ活性は、エイチ.ポリモルファカタラーゼと比較した粗抽出物の未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の低移動度により推定できる。実施例３に記載したように調製したメタノール−誘導細胞からの粗抽出物は、Phastgel システム(ファルマシア:Pharmacia、スウェーデン）の7.5％の未変性ゲルで分離した。分離後、ゲルを緩やかに震盪されているH₂O₂(100μLの30％H₂O₂、100mLの水中)中で10分間インキューベーションした。溶液を捨て、ゲルを簡単に水中ですすいだ。ゲルを緩やかに撹拌しながら“Prussian Blue”溶液（新たに2％FeCl₃(Fe(CN)₆)の1:1混合物に調製)中でインキューベーションした。カタラーゼ活性は青色の背景の透明ゾーンで示される。透明ゾーンの相対的な大きさはカタラーゼ活性に関連する。プラスミドpRBC ATT 76を使用した時、GO発現に加えて、CTT1の発現レベルを変化させるクローンは、mgタンパク質あたりの酵素活性と置き換えて確認できた（表IVおよびＶ）。実施例８有力なカタラーゼTレベルを有する株を、組込まれたCTT1発現カセット数について分析し、そして対応するコピー数を表VIに与える。コピー数の決定は、GO発現カセットのコピー数の決定法について記載した方法にほぼ従った。様々な単離物からのＤＮＡをAsp718で制限処理し、ニトロセルロースに移し、そして実施例５に記載したFMD-プロモータープローブとハイブリダイズさせた。さらに異型FMD-プロモーター/CTT1融合物からのシグナルが現れ、そのシグナルの強度は宿主について決定したFMD-プロモーター/GO融合物の3 0コピーに匹敵しうる。グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼを同時発現する、本発明のハンセニューラ宿主形質転換体は、グリコール酸（ヒドロキシ酢酸）からグリオキシル酸を製造するために有用である。それらは、グリコール酸およびAMPAの混合物からN-（ホスホノメチル）グリシン、発生後の植物に有害な物質および除草剤の酵素的転換のための触媒として、ならびにそれ自体が酵素源としても有用である。このように本発明をある程度特定して記載、そして例示してきたが、以下の請求の範囲はそのように制限することを意図せず、請求の範囲およびその均等物の各要素の用語に釣り合った範囲にあると考える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:78） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダーレムス，ウルリケ・マグダレネドイツ・デー―47807クレーフエルト・ユリヒヤーシユトラーセ68 (72)発明者ゲリツセン，ゲルト・ヨハンドイツ・デー―42489ブルフラート・リングシユトラーセ30 (72)発明者ジヤノウイツツ，ズビグニユウ・アロイジードイツ・デー―4006エルクラート・ミルラターベーク74 (72)発明者ピオンテク，ミヒヤエルドイツ・デー―45259エツセン・ハイジンガーシユトラーセ336

Claims

【特許請求の範囲】１．異型ＤＮＡが適当な調節配列要素に操作可能に連結したコーディング領域を含んで成り、そしてさらに異型ＤＮＡが宿主の染色体に安定に組込まれている、異型グリコール酸オキシダーゼまたは酵素的に活性なその変異体をコードする異型ＤＮＡを含んで成る、ハンセニューラ（Hansenula）形質転換体。２．さらに異型外因性カタラーゼまたは酵素的に活性なその変異体をコードする異型ＤＮＡを含んで成り、異型ＤＮＡが適当な調節配列要素に操作可能に連結したコーディング領域を含んで成り、そしてさらに異型ＤＮＡが宿主の染色体に安定に組込まれている、請求の範囲第１項に記載のハンセニューラ（Hansenula）株。３．上記異型ＤＮＡがホウレンソウグリコール酸オキシダーゼまたは酵素的に活性なその変異体をコードする、請求の範囲第１項に記載のハンセニューラ（Ha nsenula ）株。４．上記宿主が、ハンセニューラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ハンセニューラアウグスタ(Hansenula augusta)、ハンセニューラアノマーラ(Hans enula anomala)、ハンセニューラカプスラータ(Hansenula capsulata)、ハンセニューラサターナス(Hansenula saturnus)およびハンセニューラウィンゲイ(H ansenula wingei)から成る群から選択されるハンセニューラ(Hansenula)種である、請求の範囲第３項に記載のハンセニューラ（Hansenula）形質転換体。５．上記宿主がハンセニューラポリモルファ(Hansenula polymorpha)種であり、上記異型ＤＮＡがホウレンソウグリコール酸オキシダーゼをコードする請求の範囲第３項に記載のハンセニューラ（Hansenula）形質転換体。６．微生物ハンセニューラポリモルファ(Hansenula polymorpha)(NRRL Y-21065 )。７．微生物ハンセニューラポリモルファ(Hansenula polymorpha)(NRRL Y-21113 )。８．微生物ハンセニューラポリモルファ(Hansenula polymorpha)(NRRL Y-21114 )。９．上記外因性カタラーゼがアミノメチルホスホン酸により阻害されない、請求の範囲第２項に記載のハンセニューラ（Hansenula）形質転換体。１０．上記外因性カタラーゼがサッカロミセスセルビシエ(Saccharomyces cere visiae )カタラーゼTまたはアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)由来である、請求の範囲第９項に記載のハンセニューラ（Hansenula）形質転換体。１１．酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼの製造法であって、異型ＤＮＡが適当な調節配列要素に操作可能に連結したコーディング領域を含んで成り、そしてさらに異型ＤＮＡが宿主の染色体に安定に組込まれている、異型オキシダーゼまたは酵素的に活性なその変異体をコードする異型ＤＮＡを含んで成るハンセニューラ（Hansenula）形質転換体を培養する工程を含んで成る、上記方法。１２．酵素的に活性なグリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼの製造法であって、異型ＤＮＡが適当な調節配列要素に操作可能に連結したコーディング領域を含んで成り、そしてさらに異型ＤＮＡが宿主の染色体に安定に組込まれている、異型オキシダーゼまたは酵素的に活性なその変異体をコードする異型ＤＮＡおよび外因性カタラーゼまたは酵素的に活性なその変異体をコードするＤＮＡを含んで成る、ハンセニューラ（Hansenula）形質転換体を培養する工程を含んで成る、上記方法。