JP2000342275A - 担子菌由来プロモーター活性を有するｄｎａ断片および該プロモーター活性の調節下での外来遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 担子菌等の宿主において有用ポリペプチドを
大量に生産させるためのプロモーター、このプロモータ
ーを含む宿主・ベクター系、ならびに該系を利用する有
用ポリペプチドの大量発現生産方法を提供する。 【解決手段】 担子菌由来のras遺伝子プロモーター領
域およびpriA遺伝子プロモーター領域からなる群から選
択される担子菌由来プロモーター領域を含むベクターで
形質転換されたアラゲカワラタケ（Coriolus hirsutu
s）宿主細胞に関する。特に、担子菌由来のプロモータ
ー領域がシイタケ由来のrasおよびpriA遺伝子プロモー
ター領域、ならびに、アラゲカワラタケ由来のras遺伝
子プロモーター領域であることを特徴とする。この宿主
細胞はリグニン分解酵素の高生産に利用することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、担子菌特にアラゲ
カワラタケ（Coriolus hirsutus）およびシイタケ（Len
tinus edodes）から得られたプロモーター活性を有する
ＤＮＡ断片の、リグニン分解酵素等の有用ポリペプチド
の製造への利用に関する。具体的には、本発明は、アラ
ゲカワラタケ由来のrasプロモーター領域またはシイタ
ケ由来のrasもしくはpriAプロモーター領域を含むベク
ターで形質転換されたアラゲカワラタケ宿主細胞、なら
びに、この宿主細胞を利用して有用ポリペプチドを製造
する方法に関する。

【０００２】本発明によって、これまで生産が困難とさ
れてきたリグニン分解酵素等のポリペプチドを本発明の
宿主・ベクター系、特に担子菌宿主・ベクター系を用い
て遺伝子組換えにより安定的にかつ大量に供給すること
ができる。

【０００３】

【従来の技術】従来から、木材パルプの製造は、木材を
化学的に処理して製造する方法が広く行われているが、
環境問題等の面から、木材等のリグノセルロース物質に
白色腐朽菌を接種、培養することによってリグニンを分
解し、セルロースパルプを製造する試みがなされている
（特開昭50-46903号公報）。しかしながら、この方法で
用いる白色腐朽菌は共存する炭水化物をも分解してしま
い、またセルラーゼ欠損変異株を用いた場合には、本来
のリグニン分解力が弱まってしまうこと等の問題点があ
り、実用化されるに至っていない。

【０００４】このような問題点を解決するために、白色
腐朽菌のリグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作
用させ、リグニンのみを選択的に分解させようとする試
みがなされている（Science,221，661 (1983)）。この
報告は、主としてリグニンモデル化合物を基質としたも
のであるが、世界で最初にリグニン分解酵素を単離、精
製したものである。この酵素はファネロケーテ・クリソ
スポリウム（Phanerochaete chrysosporium）が生産す
る菌体外酵素であり、主な特徴は至適ｐＨが3.0である
こと、鉄含有酵素であること、分子量が41,000〜42,000
であること、酵素作用に過酸化水素が必要であること、
リグニンモデル化合物の４位のフェノール性水酸基がメ
トキシル基になった化合物に対して作用することが確認
されていること等である。この酵素はリグニンパーオキ
シダーゼであり、複数のアイソザイムの存在が知られて
いる（FEBS Lett., 169, 247 (1984)）。リグニンパー
オキシダーゼはその他カワラタケ、ヤケイロタケ等多く
の木材腐朽菌から見い出され、一部のものは精製されて
いる。

【０００５】一方、アラゲカワラタケ、カイガラタケが
生産するリグニン分解酵素（特開昭62-220190号公報、
特開昭62-220189号公報）も知られているが、これらは
フェノールオキシダーゼであり、主な特徴は至適ｐＨが
4.5であること、銅含有酵素であること、分子量が約63,
000または、約65,000であること、等電点が3.5付近であ
ること、酵素作用に酸素が必要であること、リグニンモ
デル化合物の４位のフェノール性水酸基がメトキシル基
になった化合物に対しては作用せずフェノール性のリグ
ニンモデルに対して作用すること等である。

【０００６】また、マンガンパーオキシダーゼも代表的
なリグニン分解酵素の一つであり、分子量が46,000以下
であること、鉄含有酵素であると推定されていること、
酵素作用に過酸化水素が必要であること、酵素反応がMn
(II)依存性であること、リグニンモデル化合物の４位の
フェノール性水酸基がメトキシル基になった化合物に対
しては作用せず、フェノール性のリグニンモデルに対し
て作用することが確認されていること等が主な特徴であ
り、リグニンパーオキシダーゼとは全く性質の異なる酵
素である。

【０００７】現在まで、組換えＤＮＡ技術を用いて多様
なポリペプチドを産生する系は大腸菌（E.coli）を中心
とする宿主系を用いて行なわれている。しかしながら、
大腸菌（E.coli）は宿主として適さない場合が多い。例
えば、大腸菌（E.coli）において、ヒトなど高等生物由
来の有用なポリペプチドを生産させる場合、活性型酵素
タンパク質として生産されないこと、また目的ポリペプ
チド以外にも多数の毒性物質を産生し、目的産物の精製
が非常に困難となる等の問題点がある。これらの問題点
を解決する手段として下等真核生物の酵母を宿主として
生産する方法が盛んに研究されているが、生産性が低い
という問題点が新たに生じている。そこで、ポリペプチ
ド産生のため、より高等生物である真核生物としてアス
ペルギルス（Aspergillus）属などの糸状菌、またファ
ネロカエテ（Phanerochaete）属やコリオラス（Coriolu
s）属などの担子菌を宿主とした形質転換系が開発さ
れ、リグニン分解酵素生産が検討されている。

【０００８】担子菌類は真核生物に属するが、酵母より
も動物細胞に近縁であると考えられている（T.L.Smith,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,7063(1989)）。リグニン分
解力が強いアラゲカワラタケはコリオラス属に属する担
子菌類であり、本発明者らによりその宿主・ベクター系
が開発され、組換えＤＮＡ技術を用いて、これまで困難
とされていたリグニンパーオキシダーゼ生産に成功して
いる（特開平６−０５４６９１号公報）。しかしながら
用いるプロモーター領域はアミノ酸合成系酵素遺伝子で
あるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子
（以下「OCT遺伝子」という）やリグニン分解に関与す
るフェノールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域で
あるため、生産性が低く野性株IFO4917株をリグニンパ
ーオキシダーゼ生産用培地（低炭素・低窒素源）で生産
した時と同程度であり、また目的酵素が二次代謝産物と
して得られるため遺伝子発現に時間を要するなどの問題
点があった。さらに、他の生物種、例えば糸状菌などの
遺伝子組換えによる酵素タンパク質生産系に供されてい
るプロモーターが担子菌では機能しないことが報告され
ている（A.Lorna,et.al.,Curr.Genet.,16,35(1989)）。
また、アスペルギラス・ニデュランス（Aspergillus ni
dulans）由来のArgB遺伝子もアラゲカワラタケでは機能
しなかった（A. Tsukamoto, et al.,USP5362640）。

【０００９】そこで本発明者らは構成的に発現するアラ
ゲカワラタケ由来のグリセルアルデハイド−３−りん酸
脱水素酵素（GPD）遺伝子プロモーターを取得し、アラ
ゲカワラタケからクローニングされた高温誘導リグニン
パーオキシダーゼ遺伝子（特開平5-260978号公報）又は
マンガンパーオキシダーゼ遺伝子（特開平8-308581号公
報）のシグナルペプチドを含む構造遺伝子を連結し、オ
ルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損アラゲカ
ワラタケ変異株へ移入することにより、リグニンパーオ
キシダーゼ高生産株及びマンガンパーオキシダーゼ高生
産株を取得することに成功した（特開平9-47289号公
報）。しかしながら、上記の技術提案にも拘らず、さら
に強力な転写活性を有しかつ有用ポリペプチドの高発現
を可能にするプロモーターに対する関心が高まってい
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下にお
いて、本発明者らは、担子菌宿主・ベクター系に注目
し、この系で機能する種々のプロモーターを探索してき
た。したがって、本発明の目的は、担子菌等の宿主にお
いて有用ポリペプチドを大量に生産させるためのプロモ
ーターを提供することである。本発明の別の目的は、該
プロモーターを含む宿主・ベクター系、ならびに該系を
利用する有用ポリペプチドの大量発現生産方法を提供す
ることである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、構成的に
発現する、アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus）の
ras遺伝子、シイタケ由来のras遺伝子およびシイタケ子
実体原基形成時に高発現するpriA遺伝子に着目し、アラ
ゲカワラタケまたはシイタケ染色体ＤＮＡ制限酵素断片
からras遺伝子もしくはpriA遺伝子をコードするＤＮＡ
断片をクローン化し、この遺伝子の上流に存在するプロ
モーター領域を配列決定し、このプロモーター領域が宿
主・ベクター系、特にアラゲカワラタケ宿主・ベクター
系、において有用ポリペプチドをコードする遺伝子の発
現に有効であることを初めて見出した。さらにプロモー
ター領域の下流に、アラゲカワラタケからクローニング
されたマンガンパーオキシダーゼ遺伝子、高温誘導リグ
ニンパーオキシダーゼ遺伝子（特開平５−２６０９７８
号公報）又はラッカーゼ遺伝子のシグナルペプチドを含
む構造遺伝子を連結し、OCT欠損アラゲカワラタケ変異
株に移入することにより、強力なリグニン分解能を有す
るマンガンパーオキシダーゼ、リグニンパーオキシダー
ゼ又はラッカーゼ高生産株を取得することに成功し、本
発明を完成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明は以下のように要約され
る。 （1）担子菌由来のras遺伝子プロモーター領域およびpr
iA遺伝子プロモーター領域からなる群から選択される担
子菌由来プロモーター領域を含むベクターで形質転換さ
れたアラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus）宿主細
胞。 （2）ras遺伝子プロモーター領域がシイタケまたはアラ
ゲカワラタケ由来である、上記（1）に記載の宿主細
胞。 （3）priA遺伝子プロモーター領域がシイタケ由来であ
る、上記（1）に記載のアラゲカワラタケ宿主細胞。 （4）上記ベクターにおいて、有用ポリペプチドをコー
ドする遺伝子が前記プロモーター領域の下流に転写可能
に結合されている、上記（1）に記載のアラゲカワラタ
ケ宿主細胞。 （5）上記有用ポリペプチドをコードする遺伝子が、マ
ンガンパーオキシダーゼ遺伝子、リグニンパーオキシダ
ーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子などのリグニン分解
酵素遺伝子である、上記（3）に記載のアラゲカワラタ
ケ宿主細胞。

【００１３】（6）上記（1）に記載のアラゲカワラタケ
宿主細胞を培地に培養し、生成した有用ポリペプチドを
回収することを含む、有用ポリペプチドの製造方法。 （7）有用ポリペプチドが、マンガンパーオキシダーゼ
遺伝子、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子およびラッカ
ーゼ遺伝子などのリグニン分解酵素遺伝子である、上記
（6）に記載の方法。 （8）アラゲカワラタケ由来のras遺伝子プロモーター領
域を含む単離されたＤＮＡ断片。 （9）配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するか、
または、該ヌクレオチド配列に相補的な配列にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有しかつ
プロモーター活性を有する、上記（8）に記載のＤＮＡ
断片。 （10）有用ポリペプチドをコードする遺伝子と上記
（8）に記載のＤＮＡ断片とを含み、該遺伝子が転写可
能に該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ。

【００１４】（11）上記有用ポリペプチドをコードする
遺伝子が、マンガンパーオキシダーゼ遺伝子、リグニン
パーオキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子などの
リグニン分解酵素遺伝子である、上記（10）に記載の組
換えＤＮＡ。 （12）アラゲカワラタケ由来のras遺伝子プロモーター
配列とそのras遺伝子配列とを含み、配列番号２に示す
ヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。 （13）上記（8）に記載のＤＮＡ断片または上記（10）
に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。 （14）上記（13）に記載のベクターによって形質転換さ
れた宿主細胞。 （15）担子菌である、上記（14）に記載の宿主細胞。 （16）担子菌がアラゲカワラタケである、上記（15）に
記載の宿主細胞。 （17）上記（13）に記載の宿主細胞を培地に培養し、生
成した有用ポリペプチドを回収することを含む、有用ポ
リペプチドの製造方法。 （18）有用ポリペプチドが、マンガンパーオキシダー
ゼ、リグニンパーオキシダーゼおよびラッカーゼなどの
リグニン分解酵素遺伝子である、上記（17）に記載の方
法。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、第1の態様において、アラゲカワラタケ由来
のrasプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を提供する。
本発明のＤＮＡ断片は以下のような手順で得ることがで
きる。

【００１６】アラゲカワラタケ（例えばIFO4917株）か
ら、Yeltonらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
1,1470(1984)）等、通常の染色体ＤＮＡの抽出法に準じ
て染色体ＤＮＡを調製し、得られた染色体ＤＮＡをＳａ
ｕ３ＡＩ等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を行な
った後、ショ糖密度勾配超遠心法で分画して10ｋｂｐ〜
25ｋｂｐのＤＮＡ断片を得る。同じ付着末端を生じさせ
る制限酵素で処理したファージＤＮＡに、上記で得られ
たＤＮＡ断片を挿入して染色体遺伝子ライブラリーを作
製する。ファージＤＮＡとしてはＥＭＢＬ３（A-M, Fri
shauf et al., J.Mol. Biol. 170,827(1983)）、λファ
ージＤＮＡなどを用いることができる。挿入後、in vit
roでパッケージングを行ない、染色体ＤＮＡライブラリ
ーとする。またサブクローニングにはpUC18（C. Yanisc
h-Perron, et al., Gene,33, 103(1985)）等のプラスミ
ドを用いることができる。クローニングベクターは、上
記例示のものに制限されず、市販されるか、文献記載の
公知のものが使用できる。次いで、得られた染色体遺伝
子ライブラリーから、他生物種から単離されているras
遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて作製した合成ＤＮ
Ａプローブを用いるプラーク・ハイブリダイゼーション
によってras遺伝子とプロモーター領域をともに含むク
ローンを選択する。選択したクローンから目的の遺伝子
を含むＤＮＡ断片を単離し、制限酵素地図の作成および
配列決定を行う。

【００１７】配列決定は、上記のras染色体遺伝子を含
む断片を適当なクローニングベクター（例えばpUC19等
のpUC系ベクター）に挿入し、Sangerらの方法（Proc. N
atl.Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)）によって行う
ことができる。

【００１８】上記の手順により、図５に示される制限酵
素地図、および配列番号２に示すヌクレオチド配列が決
定された。この配列を有する遺伝子は、アラゲカワラタ
ケ由来のras遺伝子およびその上流にras遺伝子プロモー
ター領域を含む３４９７bpからなるゲノム遺伝子であ
る。配列中、プロモーター領域はヌクレオチド番号１〜
１３６２（配列番号１）に存在し、ヌクレオチド番号１
０４５〜１０４９にTATAA、９７７〜９８１にCCAAAが認
められる。一方、ras遺伝子は、ヌクレオチド番号１３
６３〜２４１９に存在し、7個のエキソンと6個のイント
ロン（介在配列）によって構成されている。具体的に
は、エキソン１は１３６３〜１３７１、イントロン１は
１３７２〜１４２５、エキソン２は１４２６〜１４６
５、イントロン２は１４６６〜１５１７、エキソン３は
１５１８〜１５９２、イントロン３は１５９３〜１７１
７、エキソン４は１７１８〜１８００、イントロン４は
１８０１〜１８６１、エキソン５は１８６２〜２０５
５、イントロン５は２０５６〜２１１３、エキソン６は
２１１４〜２２４０、イントロン６は２２４１〜２２９
６、エキソン７は２２９７〜２４１９にそれぞれ存在し
ている。さらにヌクレオチド番号２４２０〜３４９７は
ターミネーターを含む３'非翻訳領域である。配列の解
析から、アラゲカワラタケras蛋白質は配列番号３に示
されるアミノ酸配列を有し２１３アミノ酸からなること
がわかった。

【００１９】アラゲカワラタケ由来ras遺伝子/プロモー
ター配列を含むゲノム遺伝子断片（配列番号２）を保有
する大腸菌形質転換株Escherichia coli DH5α/pCHRAS
は、平成11年3月30日付で工業技術院生命工学工業技術
研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託さ
れ受託番号FERM P-17352が与えられたが、平成12年１月
20日付けでブダペスト条約の規定下に国際寄託に移管さ
れ受託番号FERM BP-7001が与えられた。この寄託株に含
まれる配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する
ＤＮＡは、本発明の範囲に包含される。

【００２０】ras遺伝子プロモーター領域を含むＤＮＡ
断片は、上記のras染色体遺伝子を含む断片からPCR（ポ
リメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。PCR
のためのプライマーとしては、配列番号１に示されるヌ
クレオチド配列およびその相補的配列に基づく約10〜50
塩基、好ましくは約15〜30塩基からなる配列をセンスプ
ライマー、アンチセンスプライマーとして用いることが
できる。例えば配列番号５に示すセンスプライマー、配
列番号６に示すアンチセンスプライマーを使用すること
ができる（実施例11参照）。

【００２１】本発明における「プロモーター配列」また
は「プロモーター領域」は、構造遺伝子の転写を調節す
る機能を有するものであり、真核生物のプロモーター内
で実質的に保存されている機能的塩基配列モティーフ
（TATA,CCAA,GCボックスなど）を少なくとも含む。従っ
て、配列番号１に示すヌクレオチド配列はそのようなプ
ロモーター配列の1つの具体例であり、プロモーター活
性を有する限り、該ヌクレオチド配列に相補的な配列に
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、
あるいは該ヌクレオチド配列において1個または複数の
ヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異または改変を
含む配列も本発明の範囲内である。このような変異また
は改変は、配列番号１に示すヌクレオチド配列を基にオ
リゴヌクレオチド部位特異的突然変異法やカセット変異
法などの周知の部位特異的突然変異技術（例えばShort
protocols In Molecular Biology, Third Edition, Joh
n Wiley & Sons, Inc.）を用いて実施可能である。

【００２２】ここで「ストリンジェントな条件」とは、
配列番号１に示すヌクレオチド配列との相同性が７０％
以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以
上、特に９５％以上である変異体または改変体配列とハ
イブリダイゼーション可能である条件を指す。通常、ハ
イブリダイゼーション条件は温度、イオン強度等の因子
を考慮して決定されるが、温度が高いほど、またイオン
強度が低いほどストリンジェンシィが高まることが知ら
れている。具体的な条件はイオン強度が６×SSCかつハ
イブリダイゼーション温度が68℃である。

【００２３】本発明は、第2の態様において、有用ポリ
ペプチドをコードする遺伝子と、上記に規定したコリオ
ラス属アラゲカワラタケ由来のras遺伝子プロモーター
配列を含むＤＮＡ断片とを含み、該遺伝子が転写可能な
ように該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡを
提供する。

【００２４】本明細書中「転写可能に」とは、宿主内で
プロモーターの作用下で上記遺伝子のmRNAへの転写が起
こることを意味する。有用ポリペプチドをコードする遺
伝子は、プロモーター配列を含むＤＮＡ断片の下流に結
合され、プロモーターの作動によりmRNAに転写される。
有用ポリペプチドをコードする遺伝子としては、特に限
定されることなくあらゆる遺伝子を使用することがで
き、例えばマンガンパーオキシダーゼ遺伝子、リグニン
パーオキシダーゼ遺伝子、ラッカーゼ遺伝子などのリグ
ニン分解酵素遺伝子があげられる。これらの遺伝子は、
ジーンバンクに登録される配列、文献記載の配列等に基
いて周知のゲノムクローニングまたはｃＤＮＡクローニ
ング法やPCR法によって取得可能である。あるいは、寄
託されている遺伝子については、分譲請求により入手可
能なものを利用することができる。プロモーター配列を
含むＤＮＡ断片と有用ポリペプチドをコードする遺伝子
とは、必要に応じて制限部位の導入、平滑末端化または
付着末端化後、適当なＤＮＡリガーゼを用いて連結する
ことができる。クローニング、連結反応、PCR等を含む
組換えＤＮＡ技術は、例えばJ. Sambrook et al., Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, Second Editio
n, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989やShor
t Protocols In Molecular Biology, Third Edition, A
Compendium ofMethods from Current Protocols in Mo
lecular Biology, John Wiley & Sons,Inc.に記載され
るものを利用することができる。

【００２５】本発明は、第3の態様において、上記定義
のＤＮＡ断片または組換えＤＮＡを含むベクターを提供
する。ベクターの種類は特に限定されないが、このベク
ターによって形質転換される宿主の種類に応じて選択さ
れる。ベクターとしては、原核または真核生物宿主細胞
において自律複製可能または染色体中に相同組換え可能
なベクターを使用することができる、プラスミド、ファ
ージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクター
は、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリ
リンカー、エンハンサー、リボソーム結合部位などを適
宜含むことができる。細菌、真菌、酵母、動物、植物な
どの原核および真核生物用の種々のベクターが市販され
ているか、あるいは、文献等に記載されており、これら
を利用して本発明のＤＮＡ断片または組換えＤＮＡをベ
クターに導入することができる。ＤＮＡ導入は、例えば
J. Sambrookら（上記）に記載される技術を使用して実
施することができる。

【００２６】本発明はさらに、第4の態様において、上
記に規定するベクターによって形質転換された宿主細胞
を提供する。ここで宿主細胞は、担子菌、真菌類、酵母
類を含む菌類、他の真核細胞（例えば動物細胞、植物細
胞、昆虫細胞、藻類など）、原核細胞（例えば細菌、藍
藻）から選択され、構造遺伝子の発現においてプロモー
ター活性を発揮できるならばいずれの宿主細胞も使用可
能である。好ましい宿主細胞は、担子菌アラゲカワラタ
ケである。形質転換法としては、塩化カルシウム/PEG
法、リン酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロ
ポレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト
法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法などを
例示できるが、これらに限定されない。後述の実施例で
は担子菌アラゲカワラタケを宿主とする発現例が記載さ
れており、アラゲカワラタケのオルニチンカルバモイル
トランスフェラーゼ（OCT）活性を欠損している栄養要
求性変異株OJI-1078（受託番号FERMBP-4210）が宿主と
して使用されている。

【００２７】本発明は、第5の態様において、上記の形
質転換宿主細胞を培地に培養し、生成した有用ポリペプ
チドを回収することを含む、有用ポリペプチドの製造方
法を提供する。ポリペプチドは、シグナルペプチドとの
融合形態で発現・翻訳されるときには分泌形態で産生さ
れ、この場合には培地からポリペプチドを直接単離する
ことができるが、一方、ポリペプチドが非分泌形態で産
生されるときには細胞を分離し、超音波処理、ホモゲナ
イジング等の処理により細胞を破壊して抽出液を得、こ
の抽出液からポリペプチドを単離することができる。単
離・精製は、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限
外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル
濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動、クロマトフォーカシングなどの方法を単独にまたは
組み合わせて行うことができる。

【００２８】例えば、本発明のプロモーター領域の下流
にマンガンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分又はリグニ
ンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分又はラッカーゼ遺伝
子部分を連結し、組換えＤＮＡ技術によりマンガンパー
オキシダーゼ又はリグニンパーオキシダーゼ又はラッカ
ーゼを大量に生産することができる。アラゲカワラタケ
由来マンガンパーオキシダーゼｃＤＮＡ遺伝子を含む大
腸菌組換え株JM109/pBSMPOC1（特開平8−308581号公
報）はFERM P-14932として、またマンガンパーオキシダ
ーゼ染色体遺伝子を含む大腸菌組換え株JM109/pBSMPOG1
（特開平8−308581号公報）はFERM P-14933として、高
温誘導リグニンパーオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組
換えE. coli XL-1 blue/pBSLPOG7（特開平5−260978号
公報）はFERM P-12683として、またラッカーゼ（別称：
フェノールオキシダーゼ）遺伝子を含む大腸菌組換え株
（特公平7−46995号公報；特公平6−85717号公報）はFE
RM BP-2793（染色体遺伝子）、FERM P-10055 (cDNA)お
よびFERM P―10061(cDNA)として、それぞれ工業技術院
生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−
１−３）に寄託されている。

【００２９】本発明は、第6の態様において、担子菌由
来のras遺伝子プロモーター領域およびpriA遺伝子プロ
モーター領域からなる群から選択される担子菌由来プロ
モーター領域を含むベクターで形質転換されたアラゲカ
ワラタケ宿主細胞を提供する。

【００３０】本発明の実施態様において、ras遺伝子プ
ロモーター領域はシイタケまたはアラゲカワラタケ由来
であり、またpriA遺伝子プロモーター領域はシイタケ由
来である。アラゲカワラタケ由来ras遺伝子プロモータ
ー領域は上記のようにして得ることができる。またシイ
タケ由来ras遺伝子プロモーター領域はFEMS Microbiolo
gy Letters, 92, 147 (1992)に準じて、ならびにシイタ
ケ由来priA遺伝子プロモーター領域はGene, 114, 173
(1992)に準じてシイタケ (例えば生物系特定産業技術研
究推進機構（http://www.brain,go.jp）MAFF-430002株)
から取得することができる。

【００３１】本発明においては、上記ベクター中、有用
ポリペプチドをコードする遺伝子が上記プロモーター領
域の下流に転写可能に結合される場合、そのベクターで
形質転換して得られるアラゲカワラタケ形質転換株は適
当な培地に培養することによって該ポリペプチドを高生
産することができる。このような有用ポリペプチドとし
ては、マンガンパーオキシダーゼ、リグニンパーオキシ
ダーゼおよびラッカーゼなどのリグニン分解酵素であ
る。

【００３２】上述したように、本発明によって、マンガ
ンパーオキシダーゼ、リグニンパーオキシダーゼ、ラッ
カーゼなどのリグニン分解酵素を生産する担子菌、特に
高リグニン分解能を有するアラゲカワラタケ形質転換株
が提供される。本発明のこの形質転換株はリグニンに作
用して、これを低分子化または分解する性質を有するた
め、木材等のリグノセルロース材料を原料とする紙パル
プ製造工程における種々の工程で利用できる。また木材
の糖化において、糖化の前段の処理としてリグニンを分
解することによって、セルラーゼ作用を高めるというい
わゆるセルロース系バイオマス利用の分野にも適用でき
る。

【００３３】

【実施例】以下に本発明を実施例をもって、さらに詳し
く説明するが、本発明の範囲はその実施例に限定される
ものではない。 実施例１シイタケ由来ras遺伝子プロモーターを含むアラゲカワ
ラタケ由来マンガンパーオキシダーゼ遺伝子の発現ベク
ターの構築 シイタケ由来ras遺伝子プロモーター領域（2.5kb）、な
らびにpriA遺伝子ターミネーター領域（1.2kb）を含む
プラスミドpLC1（6.4kb）（K. Ogawa et al., Appl. Mi
crobiol. Biotechnol. (1998) 49:285-289）を制限酵素
BamHI（宝酒造社製、日本）で切断し、当該BamHIサイト
へアラゲカワラタケ由来マンガンパーオキシダーゼｃＤ
ＮＡ遺伝子を順方向で連結し、マンガンパーオキシダー
ゼ遺伝子発現ベクターとし、pLC1MPと命名した（図
１）。

【００３４】実施例２シイタケ由来priA遺伝子プロモーターを含むアラゲカワ
ラタケ由来マンガンパーオキシダーゼ遺伝子の発現ベク
ターの構築 シイタケ由来priA遺伝子プロモーター（0.4kb）、なら
びにpriA遺伝子ターミネーター（1.2kb）を含むプラス
ミドpLC2（5.6kb）（K. Ogawa et al., Appl. Microbio
l. Biotechnol. (1998) 49:285-289）を制限酵素BamHI
（宝酒造社製、日本）で切断し、当該BamHIサイトへア
ラゲカワラタケ由来マンガンパーオキシダーゼcDNA遺伝
子を順方向で連結し、マンガンパーオキシダーゼ遺伝子
発現ベクターとし、pLC2MPと命名した（図２）。

【００３５】実施例３アラゲカワラタケ形質転換法 下記の（ａ）〜（ｃ）の操作を行い、下記の（ｄ）およ
び（ｅ）により形質転換体を得ることができた。 （ａ）一核菌糸培養 直径6mm前後のガラスビーズを約30個入れた500ml容の三
角フラスコにSMY培地（シュークロース１％、麦芽エキ
ス１％、酵母エキス0.4％）100mlを分注して滅菌後、ア
ラゲカワラタケOJI-1078株の平板寒天培地から直径5mm
の寒天片をコルクボーラーで打ち抜きＳＭＹ培地へ植菌
し、28℃で７日間静置培養した（前培養）。

【００３６】但し、菌糸を細分化するために、１日に１
〜２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにSMY
培地200mlを分注し、さらに回転子をいれ、滅菌後、前
培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径30μｍ）で濾集し、
28℃で静置培養した。なお、スターラーで１日２時間撹
拌することにより菌糸を細分化した。この培養を４日間
行った。

【００３７】（ｂ）プロトプラストの調製 上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径30μｍ）で
濾集し、浸透圧調節溶液で（0.5M MgSO₄、50mMマレイン
酸バッファー（pH 5.6））で洗浄した。次に湿菌体100m
gあたり1mlの細胞壁溶解酵素液に懸濁し、緩やかに振盪
しながら28℃で４時間インキュベートしてプロトプラス
トを遊離させた。細胞壁溶解酵素としては次の市販酵素
製剤を組み合わせて使用した。即ち、セルラーゼ・オノ
ズカ（cellulase Onozuka RS）（ヤクルト社製、日本）
5mg、ヤタラーゼ（Yatalase）（宝酒造社製、日本）10m
gを上記浸透圧調節溶液1mlに溶解して酵素液として用い
た。

【００３８】（ｃ）プロトプラストの精製 上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径30μｍ）で
菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高める
ため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロト
プラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得られ
たプロトプラスト懸濁液を遠心分離（1,000×g、５分
間）し、上清を除去し、4mlの１Ｍシュークロース（20m
M MOPS緩衝液(pH 6.4)）で再懸濁後、遠心操作を繰り返
し、上記１Ｍシュークロース溶液で２回洗浄した。沈殿
物に１Ｍソルビトール溶液（20mMMES (pH 6.4)）に40mM
塩化カルシウムを加えた溶液500μlに懸濁し、プロトプ
ラスト溶液とした。この溶液を４℃で保存した。プロト
プラスト濃度は血球計算盤を用いて直接検鏡により求め
た。すべての遠心操作はスウィングローターで1,000×
g、５分間、室温下で行った。

【００３９】（ｄ）形質転換−１ 10⁶個/100μl濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、
実施例１で作製したプラスミドpLC1MPを10μgならびに
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ染色体遺伝
子を含むpUCR1を１μg、同時に添加し、30分間氷冷し
た。次に、液量に対し等量のPEG溶液（50％ PEG3400、2
0mM MES (pH 6.4)）を加え、30分間氷冷した。次に、0.
5M シュークロースおよびロイシンを含む最小軟寒天培
地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレ
ートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。

【００４０】（ｅ）形質転換−２ 10⁶個/100μl濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、
実施例２で作製したプラスミドpLC2MPを10μgならびに
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ染色体遺伝
子を含むpUCR1を１μg、同時に添加し、30分間氷冷し
た。次に、液量に対し等量のPEG溶液（50％ PEG3400、2
0mM MES (pH 6.4)）を加え、30分間氷冷した。次に、0.
5M シュークロースおよびロイシンを含む最小軟寒天培
地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレ
ートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。

【００４１】実施例４形質転換体によるリグニンの脱色・分解 10mgのリグニン（東京化成工業社製、日本）と2.5mgのM
nCl₂を含むMYG液体培地（１％マルトエキス、0.4％酵母
エキス、0.4％グルコース、pH 5.6）10mlへ実施例３で
得られた形質転換体を植菌し、30℃で振盪培養を行っ
た。なお、対照として宿主株OJI-1078株を同じ培地へ植
菌し、同様に振盪培養を行った。リグニンの分解は芳香
環の開裂を示す275nmの吸収の減少を指標として測定し
た。また、吸光度480nmの減少を指標としてリグニンの
脱色を測定した。10mgのリグニンを含むMYG液体培地10m
lの吸光度は275nmで27.15また480nmで2.19であった。な
お、これらの値を培養開始時として100％とした。

【００４２】その結果、ras遺伝子プロモーター領域を
用いたマンガンパーオキシダーゼ発現用形質転換体は培
養開始１６日後に対照となる宿主に対して、約３倍リグ
ニンの分解・脱色が向上していた。またpriA遺伝子プロ
モーター領域を用いたマンガンパーオキシダーゼ発現用
形質転換体では培養開始１２日後に宿主に対して約４倍
リグニンの分解・脱色を示した。

【００４３】実施例５形質転換体によるマンガンパーオキシダーゼの生産 上記実施例３で得られた形質転換株を500ml容の三角フ
ラスコに50mlのグルコース・ペプトン液体培地（グルコ
ース20g/l、ペプトン5g/l、酵母エキス2g/l、KH₂PO₄・7H
₂O 0.5g/l、MnSO₄・5H₂O 48mg/l、リン酸でpH 5.0に調
整）に50mm²の寒天片を５個接種し、28℃で６日間、振
盪下で培養した。６日後、得られる培養液を遠心分離
し、その上清を得た。

【００４４】酵素活性は0.5M マロン酸ナトリウム緩衝
液（pH 5.5）50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素５
μl、1mM MnSO₄ 100μlを充分に混合し、反応の結果生
じるMn(III)マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時間
を追って記録することにより行い、上記培養上清中にMn
(III)マロン酸複合体を酵素活性が培養開始６日目でpLC
1MPの場合、5μmol/ml/minで認められた。またpLC2MPの
場合には4μmol/ml/minで認められた。ここで酵素活性
単位は１分間にMn(III)マロン酸複合体1μmol増加させ
る活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した
供与ＤＮＡを含まないOJI-1078株の培養上清には本活性
は認められなかった。

【００４５】実施例６シイタケ由来ras遺伝子プロモーターを含むアラゲカワ
ラタケ由来ラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築 シイタケ由来ras遺伝子プロモーター領域（2.5kb）、な
らびにpriA遺伝子ターミネーター領域（1.2kb）を含む
プラスミドpLC1（6.4kb）を制限酵素BamHI（宝酒造社
製）で切断し、当該BamHIサイトへアラゲカワラタケ由
来ラッカーゼcDNA遺伝子（寄託番号 FERM P-10055）を
順方向で連結し、ラッカーゼ遺伝子発現ベクターとし、
pLC1LACと命名した（図３）。

【００４６】実施例７シイタケ由来priA遺伝子プロモーターを含むアラゲカワ
ラタケ由来ラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの構築 シイタケ由来priA遺伝子プロモーター（0.4kb）、なら
びにpriA遺伝子ターミネーター（1.2kb）を含むプラス
ミドpLC2（5.6kb）を制限酵素BamHI（宝酒造社製）で切
断し、当該BamHIサイトへアラゲカワラタケ由来ラッカ
ーゼcDNA遺伝子（寄託番号 FERM P-10055）を順方向で
連結し、ラッカーゼ遺伝子発現ベクターとし、pLC2LAC
と命名した（図４）。

【００４７】実施例８ラッカーゼ高生産株の培養 実施例３記載の方法により実施例６ならびに７で得られ
たラッカーゼ遺伝子発現ベクターをアラゲカワラタケ宿
主細胞1078株へ導入し、得られた形質転換体を500ml容
の三角フラスコに50mlのグルコース・ペプトン液体培地
（グルコース30g/l、ペプトン10g/l、KH₂PO₄ 1.5g/l、M
gSO₄・7H₂O 0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、CuSO₄・5H₂O 10
0mg/l、リン酸でpH 5.0に調整）に50mm²の寒天片を５個
接種し、28℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得
られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。

【００４８】酵素活性は１M酢酸ナトリウム緩衝液（pH
4.0）50μl、5mM 2,2'-azino-bis(3-ethilbenzthiazoli
ne-6-sulfonate)(ABTS)50μl、酵素液400μlを加え、反
応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時
間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に
酵素活性がpLC1LACの場合、培養開始５日目で34ユニッ
ト/mlで認められた。またpLC2LACの場合には培養開始５
日目で26ユニット/ml認められた。ここで酵素活性単位
は１分間に１μmolのABTSを酸化するのに必要とされる
酵素量と定義する。一方、同条件下で培養した供与ＤＮ
Ａを含まないOJI-1078株の培養上清にはわずか５ユニッ
ト/mlしか認められなかった。

【００４９】実施例９染色体遺伝子ライブラリーの作製 アラゲカワラタケ（IFO4917株）の平板寒天培養から直
径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グルコ
ース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン0.
5％、酵母エキス0.2％、KH₂PO₄ 0.1％、MgSO4・7H₂O 0.0
5%、りん酸でpH4.5に調整）200mlに植菌し、28℃で７日
間回転振盪培養を行なった。菌体を集菌後、１Ｌの滅菌
水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。

【００５０】この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕し
た。粉砕した菌体を遠心管に移し、溶菌緩衝液（100mM
トリス（pH 8）、100mM EDTA、100mM NaCl、さらにプロ
テイナーゼＫを100μg/mlとなるように添加）10mlを加
え、55℃で３時間インキュベートした。インキュベート
後、フェノール処理、クロロホルム処理を行ない、水層
部分にエタノールを徐々に添加しＤＮＡが析出したとこ
ろで染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液に懸濁した。

【００５１】得られた染色体ＤＮＡ100μgを制限酵素Sa
u3AIで部分分解し、５〜２０％ショ糖密度勾配超遠心分
離（30,000rpm，18時間）により分画し、20〜40ｋｂｐ
断片区分を集めた。この断片区分を東洋紡社製ファージ
λＥＭＢＬ３−BamHIアームにT4DNAリガーゼを用いて連
結し、得られたファージＤＮＡをSTRATAGENE社製ギガパ
ックゴールドを用いてパッケージング後、大腸菌P2392
株に感染せしめ染色体ＤＮＡライブラリーとした。

【００５２】実施例10染色体遺伝子ライブラリーからのras遺伝子の単離 上記染色体ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダ
イゼーションによりオルニチンカルバモイルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むクローンの選抜を行なった。この
一連の操作は常法［Sambrookら著、”Molecular Cloning
A LaboratoryManual/2nd Edition(1989)］によった。
プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは次
の配列を持つ合成オリゴマー： 配列番号4: 5'-CA(T/C)TT(T/C)GIGA(T/C)GA(A/G)TA(T/
C)GA-3' を³²Ｐで放射能標識したものである。

【００５３】その結果、約40,000個のプラークの中から
４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クロ
ーンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡ
を各種制限酵素で消化し、上記の合成ＤＮＡを用いてサ
ザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、制
限酵素BamHIで消化して得られた断片中に単一のＤＮＡ
バンドとして3.5ｋｂｐにハイブリダイズするクローン
が認められた。

【００５４】上記ＤＮＡ断片3.5ｋｂｐをアガロースゲ
ル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターpUC19のB
amHIサイトにサブクローン化し、大腸菌JM109株へ形質
転換した。サブクローン化したＤＮＡを大量に調製し、
超遠心操作（50,000rpm，16hrs，15℃）で精製し、塩基
配列を決定した。塩基配列の決定はUnited States Bioc
hemical社製のシーケナーゼキットを用いて行った。

【００５５】塩基配列を配列番号２に示す。その結果、
上記塩基配列の範囲内においてアラゲカワラタケ由来ra
s遺伝子は６つのイントロンにより分断されていた。ま
た、塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、これまで
報告されているras遺伝子と高い類似性が認められた。
上記アミノ酸配列を配列番号３に示す。

【００５６】なお、得られたアラゲカワラタケ由来ras
遺伝子を含む大腸菌形質転換株E.coli DH5α/pCHRASは
工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東
１−１−３）に受託番号FERM BP-7001 (平成11年３月30
日寄託のFERM P-17352より平成12年１月20日に国際寄託
に移管された。)としてブダペスト条約の規定下に国際
寄託されている。

【００５７】実施例11ras遺伝子制御領域に支配されるOCT構造遺伝子の連結 担子菌アラゲカワラタケ用のOCT発現選択マーカー用プ
ラスミドpCHRPRGはras遺伝子のプロモーター領域の下流
にOCT染色体遺伝子（特開平６−０５４６９１号公報；F
ERM BP-4201）の構造遺伝子領域を連結し、本来のOCT遺
伝子からプロモーター領域を置換した選択マーカー遺伝
子とした。

【００５８】アラゲカワラタケ由来ras遺伝子プロモー
ター領域を含むプラスミドpCHRASから以下に示す２つの
プライマーを用いてPCR法により、アラゲカワラタケ由
来ras遺伝子プロモーター領域を含むＤＮＡ断片をBamHI
〜NcoI断片1.4kbpとして増幅し、pUC18のSmaIサイトへT
4 DNAリガーゼを用いて連結し、プラスミドpCHRPを得
た。 プライマー−１：5'-GGATCCCGCTATACCGAAAGG-3'（配列
番号５） プライマー−２：5'-CCATGGCTGTATGGCGGAGG-3'（配列番
号６） 得られたプラスミドpCHRPを制限酵素NcoI(宝酒造社製)
で消化後、発現ベクターとした。

【００５９】一方、OCTの成熟型酵素をコードしている
遺伝子領域を取り出すため、プラスミドpUCR1（特開平
６−０５４６９１号公報；FERM BP-4201）を制限酵素Nc
oIで切断し、約2.5kbpのＤＮＡ断片を得た。上記２種類
のＤＮＡ断片を混合して、T4DNAリガーゼで連結した
後、大腸菌JM109株の形質転換を行い、アンピシリン耐
性の形質転換株の中からOCT遺伝子が順方向で挿入され
ているプラスミドを単離し、これをpCHRPRGと命名した
（図６）。

【００６０】実施例12アラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus）形質転換法 実施例３の(a)〜(c)と同様にして得られた10⁶個／100μ
l濃度のプロトプラスト溶液100μlに対し、実施例11で
作製したプラスミドpCHRPRG２μgを添加し、30分間氷冷
した。つぎに、液量に対し等量のPEG溶液（50％ PEG340
0、20mM MES (pH6.4)）を加え、30分間氷冷した。つぎ
に、0.5Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟
寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上
記プレートを28℃で数日間培養を行ない、形質転換体を
得た。この時における形質転換効率は300コロニー/μg
形質転換ＤＮＡであった。なお、プラスミドベクターpU
C18だけのＤＮＡ供与体を用いた対照実験では形質転換
体は全く得られなかった。

【００６１】実施例13アラゲカワラタケ由来ras遺伝子プロモーターによるア
ラゲカワラタケ由来マンガンパーオキシダーゼ遺伝子の
発現ベクターの構築 アラゲカワラタケ由来ras遺伝子プロモーター領域を含
むプラスミドpCHRASから以下に示す２つのプライマーを
用いてPCR法により、プロモーター領域をBamHI〜NcoI断
片1.4kbpとして増幅し、pUC18のSmaIサイトへT4DNAリガ
ーゼを用いて連結し、プラスミドpCHRPを得た。

【００６２】プライマー−１：5'-GGATCCCGCTATACCGAAA
G-3'（配列番号5） プライマー−２：5'-CCATGGCTGTATGGCGGAGG-3'（配列番
号6） 得られたプラスミドpCHRPを制限酵素NcoIならびにEcoRI
（宝酒造社製、日本）で消化後、発現ベクターとした。

【００６３】次に、アラゲカワラタケ由来マンガンパー
オキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpBSMPOG1（寄託番
号FERM P-14933）を以下に示す２つのプライマーを用い
てPCR法によりマンガンパーオキシダーゼ構造遺伝子部
分NcoI〜EcoRI約2.2ｋｂ断片を増幅する。 プライマー１：5'-CCATGGCTTTCAAGACACTCG-3'（配列番
号7） プライマー２：5'-GAATTCGCATGTAGGTCCGCG-3'（配列番
号8）

【００６４】得られたPCR断片をIn Vitrogen社製のTA c
loning kitを用いて挿入し、pTAMPとした。次に、得ら
れたpTAMPを制限酵素NcoIならびにEcoRIで消化し、約2.
2ｋｂを切り出し、上記pCHRPのNcoI、EcoRIサイトへ挿
入し、プラスミドpCHRPMPを得た（図７）。

【００６５】実施例14マンガンパーオキシダーゼを高分泌生産するアラゲカワ
ラタケ形質転換体の作製 実施例13で得たpCHRPMPを用いてアルギニン要求性アラ
ゲカワラタケ（OJI-1078株）を形質転換する場合、選択
マーカーとしてアラゲカワラタケ由来のOCT遺伝子保持
するプラスミド（pUCR1）を同時に導入すること（ＰＥ
Ｇ法もしくはエレクトロポーレーション法など）により
形質転換体pCHRPMP/OJI-1078を得た。ここで、形質転換
に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状
に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができた。
以下に形質転換条件を記す。

【００６６】約10⁶個/100μl濃度のプロトプラスト溶液
を100μlに対し実施例13で作製したプラスミド２μｇを
環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーと
してpUCR1を0.2μｇ添加し、30分間氷冷した。

【００６７】次に、等量のPEG溶液（50％ PEG3400、20m
M MES (pH 6.4)）を加え、30分間氷冷した。0.5Mシュー
クロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１
％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを28℃
で４日間培養を行ない、形質転換体を得た。さらに上記
形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマンガンパ
ーオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていること
をサザンハイブリダイゼーションにより確認した。

【００６８】実施例15形質転換体によるマンガンパーオキシダーゼの生産 上記実施例14で得られた形質転換株を500ml容の三角フ
ラスコに50mlのグルコース・ペプトン液体培地（グルコ
ース30g/l、ペプトン10g/l、KH₂PO₄ 1.5g/l、MgSO₄・7H₂
O 0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、MnSO₄・5H₂O 48mg/l、リ
ン酸でpH 5.0に調整）に50mm²の寒天片を５個接種し、2
8℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られる培
養液を遠心分離し、その上清を得た。

【００６９】酵素活性は0.5Ｍマロン酸ナトリウム緩衝
液（pH 5.5）50μl、酵素液345μl、10mM過酸化水素5μ
l、1mM MnSO₄ 100μlを充分に混合し、反応の結果生じ
るＭｎ（III）マロン酸複合体の270nmの吸光度増加を時
間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に
Ｍｎ（III）マロン酸複合体を酵素活性が培養開始６日
目で６μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここで酵
素活性単位は１分間にＭｎ（III）マロン酸複合体１μ
ｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条
件下で培養した供与ＤＮＡを含まないOJI-1078株の培養
上清には本活性は認められなかった。

【００７０】実施例16アラゲカワラタケ由来ras遺伝子プロモーターを含むア
ラゲカワラタケ由来ラッカーゼ遺伝子の発現ベクターの
構築 実施例13で得られたプラスミドpCHRPMPを制限酵素NcoI
（宝酒造社製、日本）で消化後、Klenow fragmentを用
いて平滑化する。その後、制限酵素EcoRIで消化し、発
現ベクター部分とする。

【００７１】次に、アラゲカワラタケ由来ラッカーゼ遺
伝子を含むプラスミドOJ-POG-E1（寄託番号FERM BP-279
3）を以下に示す２つのプライマーを用いてPCR法により
増幅する。 プライマー１：5'-CTCGAGGTTCCAGTCTCTG-3'（配列番号
9） プライマー２：5'-GAATTCCCGGGGACGTATACG-3'（配列番
号10） 得られたPCR断片を上記のTA-cloning ベクターへ導入
し、プラスミドpTALACを得た。

【００７２】プラスミドpTALACを制限酵素XhoIで消化
後、修飾酵素klenow fragmentを用いて平滑化する。そ
の後、制限酵素EcoRIで消化し、ラッカーゼ構造遺伝子
部分を得、上記処理したras発現ベクターpCHRPへ導入し
た。得られたプラスミドをpCHRPLACと命名した（図8）.

【００７３】実施例17ラッカーゼを高分泌生産するアラゲカワラタケ形質転換
体の作製 実施例16 で得たpCHRPLACを用いてアルギニン要求性ア
ラゲカワラタケ（OJI-1078株）を形質転換する場合、選
択マーカーとしてアラゲカワラタケ由来のOCT遺伝子保
持するプラスミド（pUCR1）を同時に導入すること（Ｐ
ＥＧ法もしくはエレクトロポーレーション法など）によ
り形質転換体pCHRPLAC/OJI-1078を得た。ここで、形質
転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直
鎖状に拘らず、目的とする形質転換体を得ることができ
た。以下に形質転換条件を記す。

【００７４】約10⁶個/100μl濃度のプロトプラスト溶液
を100μlに対し実施例８で作製したプラスミド２μｇを
環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーと
してpUCR1を0.2μｇ添加し、30分間氷冷した。

【００７５】次に、等量のＰＥＧ溶液（50％ PEG3400、
20mM MOPS (pH 6.4)）を加え、30分間氷冷した。0.5 Ｍ
シュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地
（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレー
トを28℃で４日間培養を行ない、形質転換体を得た。さ
らに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするマ
ンガンパーオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれて
いることをサザンハイブリダイゼーションにより確認し
た。

【００７６】実施例18形質転換体によるラッカーゼの生産 上記実施例17 で得られた形質転換株を500ml容の三角フ
ラスコに50mlのグルコース・ペプトン液体培地（グルコ
ース30g/l、ペプトン10g/l、KH₂PO₄ 1.5g/l、MgSO₄・7H₂
O 0.5g/l、塩酸チアミン2mg/l、CuSO₄・5H₂O 100mg/l、
リン酸でpH 5.0に調整）に50mm²の寒天片を５個接種
し、28℃で６日間、振盪下で培養した。６日後、得られ
る培養液を遠心分離し、その上清を得た。

【００７７】酵素活性は１M酢酸ナトリウム緩衝液（pH
4.0）50μl、5mM 2,2'-azino-bis(3-ethilbenzthiazoli
ne-6-sulfonate)(ABTS)50μl、酵素液400μlを加え、反
応の結果生じるABTSの酸化物を420nmの吸光度増加を時
間を追って記録することにより行い、上記培養上清中に
酵素活性が培養開始５日目で40ユニット／ｍＬで認めら
れた。ここで酵素活性単位は１分間に１μmolのABTSを
酸化するのに必要とされる酵素量と定義する。一方、同
条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないOJI-1078株の培
養上清にはわずか５ユニット/mlしか認められなかっ
た。

【００７８】

【発明の効果】本発明は、アラゲカワラタケで機能する
新規なプロモーター領域を提供するものであり、遺伝子
組換えによる酵素の大量生産が困難とされてきたリグニ
ン分解酵素の生産を可能とするものである。特に本発明
の高リグニン分能を有する形質転換体アラゲカワラタケ
は、リグニンに作用して、これを低分子化または分解す
る性質を有するため、木材等のリグノセルロース材料を
原料とする紙パルプ製造工程における種々の工程、すな
わちパルプ化工程、パルプ漂白工程、排水処理工程等の
リグニンを低分子化または分解する工程に利用できるも
のである。さらに木材の糖化において、糖化の前段の処
理としてリグニンを分解することによって、セルラーゼ
作用を高めるといういわゆるセルロース系バイオマス利
用の分野にも適用できるものである。

【００７９】当業者は、上記の説明を参照して、特許請
求の範囲に記載された発明の範囲内およびその均等の範
囲内で種々の変更および変形が可能であることを理解す
るであろう。本発明は、そのような変更および変形も包
含するものとする。

【００８０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> OJI PAPER CO., LTD. <120> DNA fragments with basidiomycetous-derived promoter activity, and expression of foreign genes under regulation of the promoter activity <130> P00-0117 <140> <141> <150> JP 11-36367 <151> 15-FEB-1999 <150> JP 11-93777 <151> 31-MAR-1999 <160> 10 <170> PatentIn Version 2.0 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Coriolus hirsutus <400> 1 ggatccgcta taccgaaagg ccgcgacgtc ctacacatgt cagtcaagag aacatgatgg 60 gcgtcatgtg gacagccgag ctgaggatgt attgcgcgag ggtgttcatc gagctgcgcg 120 tttccgagaa ctgctgtaga acggacgagg agcttcgaga ggggctgcga tggtgggaaa 180 tatctttccg gcggttttgg aagggccatt aagagcagag agatgcccgt ccaggacagg 240 gaaggtcggg tgcggactgt ggagcatccg cctgcgatcc tacatgagac cgggggcgag 300 acggacatct gggaaaggaa tgacatgcag ggaccgtgag aggatataca tgaatggtgg 360 tggtagacat accacgatgc tgggaacact atccgtgatg ttctcgcttg caccagaaag 420 gactgcaggt ggggagcaat cgcgccgaca ggtggcgtgc tatgcagaac cgcggcagtc 480 tcgacagcac cttacctctt ggacgtatca ctcacagtcc tctcggccct tcagatccaa 540 tcgatcccgt agtaacgtgc gtcatctagg agtggaaggt tggttgaccg acctgacaag 600 acataaccgg atgcccattc ggaaggctcg gggggccaag cgacctccgt gtatgatcgc 660 atgctatagc tcgacgtcgg gccgatagcg gcgcaaatca gagcaccgaa tgatgaagca 720 tctgagggaa gatcattgca tgagccatcc tgaacaggtt cgcaacgcgt ctgggaacga 780 gatgccatgc tgctacggtg atcctgatga agcacagccc gagatgcttg gtgctggacc 840 ccattggaag ctgctcgact tccttgtatg ataatcggtc tacatttctc gaccacagtt 900 gcgcatccgc ggtcagctga catcgaaggg gagcagtagt acagttggtg agctctcggg 960 ccttcgcggc gcattgccaa agacaccacc gaatattgcg aggccttgcg cagcgcgatg 1020 tggctaaata tgccagagca gctgtataag ggccctgtga ctcaccatgc gagaactgcg 1080 atatgtggct gtcagataat gcgatatacg agtcggagcg gaggcggaac tggggctggt 1140 agggactcta cttattgcgg taccggtcag aggatggcag cgttcagtga caagtcgcga 1200 agcgccgggc gcgagtattt ggctatgttt gcggcgcggt gtgttccaat agagggcgct 1260 tccacgtctt aattcccctg tcctcctcga cggatcacct ctcctccctc ccattcccgc 1320 ccttcaaata cccccctcca cctcctcctc cgccatacag cc 1362 <210> 2 <211> 3497 <212> DNA <213> Coriolus hirsutus <220> <221> exon 1 <222> (1363)to(1371) <220> <221> intron 1 <222> (1372)to(1425) <220> <221> exon 2 <222> (1426)to(1465) <220> <221> intron 2 <222> (1466)to(1517) <220> <221> exon 3 <222> (1518)to(1592) <220> <221> intron 3 <222> (1593)to(1717) <220> <221> exon 4 <222> (1718)to(1800) <220> <221> intron 4 <222> (1801)to(1861) <220> <221> exon 5 <222> (1862)to(2055) <220> <221> intron 5 <222> (2056)to(2113) <220> <221> exon 6 <222> (2114)to(2240) <220> <221> intron 6 <222> (2241)to(2296) <220> <221> exon 7 <222> (2297)to(2419) <400> 2 ggatccgcta taccgaaagg ccgcgacgtc ctacacatgt cagtcaagag aacatgatgg 60 gcgtcatgtg gacagccgag ctgaggatgt attgcgcgag ggtgttcatc gagctgcgcg 120 tttccgagaa ctgctgtaga acggacgagg agcttcgaga ggggctgcga tggtgggaaa 180 tatctttccg gcggttttgg aagggccatt aagagcagag agatgcccgt ccaggacagg 240 gaaggtcggg tgcggactgt ggagcatccg cctgcgatcc tacatgagac cgggggcgag 300 acggacatct gggaaaggaa tgacatgcag ggaccgtgag aggatataca tgaatggtgg 360 tggtagacat accacgatgc tgggaacact atccgtgatg ttctcgcttg caccagaaag 420 gactgcaggt ggggagcaat cgcgccgaca ggtggcgtgc tatgcagaac cgcggcagtc 480 tcgacagcac cttacctctt ggacgtatca ctcacagtcc tctcggccct tcagatccaa 540 tcgatcccgt agtaacgtgc gtcatctagg agtggaaggt tggttgaccg acctgacaag 600 acataaccgg atgcccattc ggaaggctcg gggggccaag cgacctccgt gtatgatcgc 660 atgctatagc tcgacgtcgg gccgatagcg gcgcaaatca gagcaccgaa tgatgaagca 720 tctgagggaa gatcattgca tgagccatcc tgaacaggtt cgcaacgcgt ctgggaacga 780 gatgccatgc tgctacggtg atcctgatga agcacagccc gagatgcttg gtgctggacc 840 ccattggaag ctgctcgact tccttgtatg ataatcggtc tacatttctc gaccacagtt 900 gcgcatccgc ggtcagctga catcgaaggg gagcagtagt acagttggtg agctctcggg 960 ccttcgcggc gcattgccaa agacaccacc gaatattgcg aggccttgcg cagcgcgatg 1020 tggctaaata tgccagagca gctgtataag ggccctgtga ctcaccatgc gagaactgcg 1080 atatgtggct gtcagataat gcgatatacg agtcggagcg gaggcggaac tggggctggt 1140 agggactcta cttattgcgg taccggtcag aggatggcag cgttcagtga caagtcgcga 1200 agcgccgggc gcgagtattt ggctatgttt gcggcgcggt gtgttccaat agagggcgct 1260 tccacgtctt aattcccctg tcctcctcga cggatcacct ctcctccctc ccattcccgc 1320 ccttcaaata cccccctcca cctcctcctc cgccatacag ccatgtccag ggtgcgtaca 1380 ccgacacacg gcgctgtcag ctatcctgac gcctgcgcag tcccagttct tgcgcgagta 1440 caagcttgtc gtcgtcggcg gtggtggtca gttccccggc tcgctagcat cccggactcg 1500 tctcacgcgt cctttcaggt gtcggcaagt ccgcactcac tatccagttc atccagagtc 1560 acttcgtgga cgagtatgac cctaccatcg aaggtgtgta cctgttcctg acgctctcgc 1620 ccacgtcgtc tcccgcttgc gaccatgccg catggccgag acgtcttgcg ttcccgcgaa 1680 gctttcccat ggtacgcgtg ctcacggcac ctcttacaga ctcgtaccgt aagcaatgcg 1740 tgattgacga tgaggtcgcg ctcctcgacg tcttggatac cgctggccag gaggaatacg 1800 ggtgcgtcta tcctctacac tccgttttct cgcctctcac aacgtttgtt tgcgccgtgc 1860 agtgcgatgc gtgagcagta catgcgcacg ggggagggct tcctgctggt ctactccatc 1920 acttcgcgca actcgttcga ggaaatcagc acgttccatc agcagatcct acgcgtaaag 1980 gaccaggact cgttcccggt catcgtcgtc gcaaacaagt gcgacttgga gtacgagcgg 2040 caggtgggaa tgaatggtac gttcacctcc ccacccttgc tcggtagact gcgtgtgctg 2100 actaagtgtg tgcgccgtgc agagggccgt gatctcgcga agcacttcgg ctgcaagttc 2160 atcgagactt cggcgaagaa ccgcatcaac gtcgacgagg cgttcagtca gctcgtccgc 2220 gagatccgga agtacaacaa ggttcgttcg ccacaatttg ccgttaccac aggctccagt 2280 acttacctct cccgcaggag caacaaaccg gacgtccggg cgtgcagccc agcgcaccta 2340 gcgcccctgg cgtgtacggc aacgaaaagg gacacccaga cgacggcgcg ggcggatgct 2400 gtggctgcgt tgtcgcgtaa ccgtcccatc cctcctccct tccttcatcg tttcttttcc 2460 atcggtttgg gctcttcctg cgtaccccgt tcttctcgtc ctgccacacc ctcatcgtcg 2520 ccattgcccg tcgtcactgc cagttctccc ccggatatca agatgtctct catctcccgc 2580 tgctgttctg tttttatgta ttccttactc ttctgcgctc gtctgtccgt ctgaacatca 2640 tacctcgtgc ctagttcgcg ccgttggtgt gcgttctctg tttgtgactg tcggcattta 2700 ctgtccctac tcgttcgtcc cgattgattg ctgctgttca ttggattgac ggccgaatca 2760 aacatataga ggctttgagc cagagtcaaa ttatgatttg actagactag tgagaaagca 2820 gatttcgaca ccaccccgtt cgttgatcaa ggactgagta tggcgatacc tggtatggat 2880 cagctcaagg attcttgtgc ttgttgtata cagcgccatg tcaagcactc agtttgttct 2940 cgcacgtgcc ttggcctggg tcattccgag aatccatcca ctgtcgcagg atctacgtct 3000 gccgccgcat gcatgccagt cccgaggcgg ctgaagtctg aggctctgag cagcccaact 3060 acagcctaac tgctggctag tacgtgagtc tgtcccaaga cattattcgc tctattacag 3120 cacactgacc ttcgctttga acagctcctt gcgactatat aggcaccgat gtgcctccgc 3180 cacagagcac tacactcagg aagccacgct gtcaaggaat gcgcacatga tagtccgaga 3240 agcgcatggc gctacgcgga atgggcacca agtgtccgcg tcaggtttgg tctggcattc 3300 ttctgatctt cccccgggct gaccgcaggt ggcccagatg cttgtttgtc ggcgctataa 3360 agtaggtgga cccgagtttc tcccagtctt tcgtaggtgg gcgactcgct acacagtcag 3420 aagagtacga catcctatgt agggctacaa cgactgccaa aacggaggct gtaagtgagg 3480 ctcacggatt cggatcc 3497 <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Coriolus hirsutus <400> 3 Met Ser Arg Phe Leu Arg Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ile Gln Phe Ile Gln Ser His Phe 20 25 30 Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Cys 35 40 45 Val Ile Asp Asp Glu Val Ala Leu Leu Asp Val Leu Asp Thr Ala Gly 50 55 60 Gln Glu Glu Tyr Gly Ala Met Arg Glu Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu 65 70 75 80 Gly Phe Leu Leu Val Tyr Ser Ile Thr Ser Arg Asn Ser Phe Glu Glu 85 90 95 Ile Ser Thr Phe His Gln Gln Ile Leu Arg Val Lys Asp Gln Asp Ser 100 105 110 Phe Pro Val Ile Val Val Ala Asn Lys Cys Asp Leu Glu Tyr Glu Arg 115 120 125 Gln Val Gly Met Asn Glu Gly Arg Asp Leu Ala Lys His Phe Gly Cys 130 135 140 Lys Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys Asn Arg Ile Asn Val Asp Glu Ala 145 150 155 160 Phe Ser Gln Leu Val Arg Glu Ile Arg Lys Tyr Asn Lys Glu Gln Gln 165 170 175 Thr Gly Arg Pro Gly Val Gln Pro Ser Ala Pro Ser Ala Pro Gly Val 180 185 190 Tyr Gly Asn Glu Lys Gly His Pro Asp Asp Gly Ala Gly Gly Cys Cys 195 200 205 Gly Cys Val Val Ala 210 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a probe for screening clones containing a ras gene f rom Coriolus hirsutus strain IFO4917. <220> <223> The base "i" designates inosine. <400> 4 cayttygtig aygartayga 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for synthesizing a 1.4 kbp BamHI-NcoI fragm ent containing the ras gene promoter region from Coriolus hirsutus stra in IFO4917 by PCR. <400> 5 ggatcccgct ataccgaaag g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for synthesizing a 1.4 kbp BamHI-NcoI frag ment containing the ras gene promoter region from Coriolus hirsutus stra in IFO4917 by PCR. <400> 6 ccatggctgt atggcggagg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for synthesizing a 2.2 kbp NcoI-EcoRI fragm ent containing manganese peroxidase structural gene region from Coriolus hirsutus strain IFO4917 by PCR. <400> 7 ccatggcttt caagacactc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for synthesizing a 2.2 kbp NcoI-EcoRI frag ment containing manganese peroxidase structural gene region from Coriolu s hirsutus strain IFO4917 by PCR. <400> 8 gaattcgcat gtaggtccgc g 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for synthesizing a 2.4 kbp NcoI-EcoRI fragm ent containing laccase structural gene region from Coriolus hirsutus str ain IFO4917 by PCR. <400> 9 ctcgaggttc cagtctctg 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a primer for synthesizing a 2.4 kbp NcoI-EcoRI fragm ent containing laccase structural gene region from Coriolus hirsutus str ain IFO4917 by PCR. <400> 10 gaattcccgg ggacgtatac g 21

【００８１】

【配列表フリーテキスト】配列番号４： Coriolus hir
sutus IFO4917株由来のras遺伝子を含むクローンをスク
リーニングするためのプローブを示す。塩基「i」はイ
ノシンを示す。 配列番号５： PCRによってCoriolus hirsutus由来のra
s遺伝子プロモーター領域を含む1.4 kbp BamHI-NcoI断
片を合成するためのプライマーを示す。 配列番号６： PCRによってCoriolus hirsutus IFO4917
株由来のras遺伝子プロモーター領域を含む1.4 kbp Bam
HI-NcoI断片を合成するためのプライマーを示す。 配列番号７： PCRによってCoriolus hirsutus IFO4917
株由来のマンガンパーオキシダーゼ構造遺伝子領域を含
む2.2 kbp NcoI-EcoRI断片を合成するためのプライマー
を示す。 配列番号８： PCRによってCoriolus hirsutus IFO4917
株由来のマンガンパーオキシダーゼ構造遺伝子領域を含
む2.2 kbp NcoI-EcoRI断片を合成するためのプライマー
を示す。 配列番号９： PCRによってCoriolus hirsutus IFO4917
株由来のラッカーゼ構造遺伝子領域を含む2.4 kbp NcoI
-EcoRI断片を合成するためのプライマーを示す。 配列番号１０： PCRによってCoriolus hirsutus IFO49
17株由来のラッカーゼ構造遺伝子領域を含む2.4 kbp Nc
oI-EcoRI断片を合成するためのプライマーを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、シイタケras遺伝子プロモーター領域に
より発現調節が支配されたアラゲカワラタケ由来マンガ
ンパーオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpLC1MPを示
す。

【図２】図２は、シイタケpriA遺伝子プロモーター領域
により発現調節が支配されたアラゲカワラタケ由来マン
ガンパーオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpLC2MPを
示す。

【図３】図３は、シイタケras遺伝子プロモーター領域
により発現調節が支配されたアラゲカワラタケ由来ラッ
カーゼ遺伝子を含むプラスミドpLC1LACを示す。

【図４】図４は、シイタケpriA遺伝子プロモーター領域
により発現調節が支配されたアラゲカワラタケ由来ラッ
カーゼ遺伝子を含むプラスミドpLC2LACを示す。

【図５】図5は、アラゲカワラタケ由来ras遺伝子とその
プロモーター領域を含む部位の染色体上の制限酵素地図
を示す。

【図６】図6は、実施例11に示したアルギニン要求性ア
ラゲカワラタケ変異株の形質転換に使用されるプラスミ
ドpCHRPRGの構造を示す。

【図７】図7は、実施例13に記載されるマンガンパーオ
キシダーゼ発現ベクターpCHRPMPの構造を示す。

【図８】図8は、実施例16に記載されるラッカーゼ発現
ベクターpCHRPLACの構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担子菌由来のras遺伝子プロモーター領
   域およびpriA遺伝子プロモーター領域からなる群から選
   択される担子菌由来プロモーター領域を含むベクターで
   形質転換されたアラゲカワラタケ（Coriolus hirsutu
   s）宿主細胞。
2. 【請求項２】 ras遺伝子プロモーター領域がシイタケ
   またはアラゲカワラタケ由来である、請求項1記載の宿
   主細胞。
3. 【請求項３】 priA遺伝子プロモーター領域がシイタケ
   由来である、請求項１に記載のアラゲカワラタケ宿主細
   胞。
4. 【請求項４】 前記ベクターにおいて、有用ポリペプチ
   ドをコードする遺伝子が前記プロモーター領域の下流に
   転写可能に結合されている、請求項１に記載のアラゲカ
   ワラタケ宿主細胞。
5. 【請求項５】 前記有用ポリペプチドをコードする遺伝
   子が、マンガンパーオキシダーゼ遺伝子、リグニンパー
   オキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子などのリグ
   ニン分解酵素遺伝子である、請求項３に記載のアラゲカ
   ワラタケ宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項１記載のアラゲカワラタケ宿主細
   胞を培地に培養し、生成した有用ポリペプチドを回収す
   ることを含む、有用ポリペプチドの製造方法。
7. 【請求項７】 有用ポリペプチドが、マンガンパーオキ
   シダーゼ、リグニンパーオキシダーゼおよびラッカーゼ
   などのリグニン分解酵素である、請求項６に記載の方
   法。
8. 【請求項８】 アラゲカワラタケ由来のras遺伝子プロ
   モーター領域を含む単離されたＤＮＡ断片。
9. 【請求項９】 配列番号１に示すヌクレオチド配列を有
   するか、または、該ヌクレオチド配列に相補的な配列に
   ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を
   有しかつプロモーター活性を有する、請求項８に記載の
   ＤＮＡ断片。
10. 【請求項１０】 有用ポリペプチドをコードする遺伝子
    と請求項８記載のＤＮＡ断片とを含み、該遺伝子が転写
    可能に該ＤＮＡ断片に結合されている、組換えＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 前記有用ポリペプチドをコードする遺
    伝子が、マンガンパーオキシダーゼ遺伝子、リグニンパ
    ーオキシダーゼ遺伝子およびラッカーゼ遺伝子などのリ
    グニン分解酵素である、請求項10に記載の組換えＤＮ
    Ａ。
12. 【請求項１２】 アラゲカワラタケ由来のras遺伝子プ
    ロモーター配列とそのras遺伝子配列とを含み、配列番
    号２に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 請求項８記載のＤＮＡ断片または請求
    項10に記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
14. 【請求項１４】 請求項13記載のベクターによって形質
    転換された宿主細胞。
15. 【請求項１５】 担子菌である、請求項14に記載の宿主
    細胞。
16. 【請求項１６】 担子菌がアラゲカワラタケである、請
    求項15に記載の宿主細胞。
17. 【請求項１７】 請求項13記載の宿主細胞を培地に培養
    し、生成した有用ポリペプチドを回収することを含む、
    有用ポリペプチドの製造方法。
18. 【請求項１８】 有用ポリペプチドが、マンガンパーオ
    キシダーゼ、リグニンパーオキシダーゼおよびラッカー
    ゼなどのリグニン分解酵素である、請求項17に記載の方
    法。