JPS6317693A - ヒト・カタラ−ゼ遺伝子、それを含むキメラｄｎａ及びそれを用いるカタラ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （本発明の目的） 本発明は、人間の薬剤として利用できるカタラーゼを製
造する技術にかかわる。

カタラーゼは生体内にひろく分布しており過酸化水素の
消去を行う。

活性化された卓球や好中球は大量の活性酸素を放出し、
これが白血球の殺菌作用を司どっていることも事実であ
るが、この大量の活性酸素はまた近傍のＭｉ織を破を員
し、炎症の原因となることも多（の実験結果が示してい
る。

生体内ではこの活性酸素は第１図に示すように２種類の
酵素、つまりスーパーオキシドデスムターゼ（Ｓｏｎ）
とカタラーゼ（ＣＡＴ）によって無害な水と酸素へと移
行するものと考えられている。

従ってＳＯＤとＣＡＴは抗炎症因子として生体内で重要
な作用を果たしているから、これらの酵素を抗炎症剤と
して開発する必要があり、このためにはヒト由来の純度
の高い製品を安定して供給する技術が必要とされる。

（従来の技術） カタラーゼは動物の臓器や微生物から抽出されたものが
入手可能であるが、これをヒトの薬剤とするには抗原性
の問題がある。

ヒト由来のこの酵素は今のところ入手が極めて困難であ
る。これをヒト赤血球やヒト肝臓より抽出するとすれば
極めて高価であり、また近年問題となっているエイズウ
ィルスや肝炎ウィルス等の混入の問題も解決しなければ
ならない。

従って前記の目的に合成する抗原性のない高純度の標品
を得るには遺伝子操作法によるものが望ましい。

（発明の概要） 本発明の概要は、ヒト肝細胞のカタラーゼｃＤＮＡライ
ブラリーを作成したこと、それを用いて新たにヒト・カ
タラーゼ遺伝子を同定したこと、更にその遺伝子を用い
て異種宿主に於いてヒト・カタラーゼ遺伝子を発現させ
てヒト・カタラーゼを作成したことである。

ＤＮ＾プローブとしたものは、コルネルーク（Ｋｏ−ｒ
ｎｅｌｕｋ）らのカタラーゼｃＤＮＡの部分配列（参考
文献１）に基づいて３３ケの塩基よりなるＤＮＡプロー
ブ、５’−ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＧＣＣＴＴＴ　Ｇ
ＧＣＴＡＣＴＴＴ　ＣＡＧ　ＧＴＣＡＣＡ−３’を化学
合成し、この末端を（ｊ２ｐ　〕でラベルして使用した
。

一方、クォータ（Ｋｗｏｋ）らの方法で肝細胞より抽出
したｍＲＮＡよりｃＤＮＡライブラリーを作製しく参考
文献２）、このライブラリーより上記プローブでカタラ
ーゼｃＤＮＡを同定した。

肝細胞は培養後ｄｉ（２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ）−ｐ
ｈｔｈａｌａｔｅを加え酵素活性を誘発したため、カタ
ラーゼのｍＲＮＡは約５倍に増巾していた。従って目的
とするコロニーの同定は比較的少数のクローンをスクリ
ーニングすることで可能であった。

全長を持つクローンを得るための配慮として、プローブ
は結合位置がＮ末端に近いものとし目的のクローン３株
を得た。

これらの内から最長のｃＤＮＡを持つクローンｐＣＤ−
Ｃａ　ｔ８９　（第４図にその構造を示した。）を更に
選びそのＤＮＡ配列を解析し、本発明を完成するに至っ
た。

ペプチドの発現には大腸菌、酵母及び動物細胞を宿主と
して用いた。

（実施例） カタラーゼｃＤＮＡのクローニング ヒト肝細胞のｃＤＮＡライブラリーをクォータ（Ｋｗ−
ｏｋ）らの方法で作製した。

我々の確立した肝細胞の培養系ｈ−Ｌｖ−１８１を誘発
１Ｊｄｉ（２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ）−ｐｈｔｈａｌ
ａｔｅによって処理した後、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ
）らの方法（参考文献３）によってｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。

各々のｍＲＮＡが全長のままｃＤＮＡにコピーされるよ
うにｎＲＮＡの分解防止と逆転写酵素の選択及びその反
応が最適におこなわれるよう注意、即ちｍＲＮＡの分解
を防止するためにはＲＮＡ５ｅ阻害剤を添加し又物理的
切断を防止するために極力剪断力を排除した。

またｃＤＮＡの合成には逆転写酵素を再精製して用い、
各々のステップをゲル電気泳動法によりモニターしてサ
イズのチェ７クを行ないながら進めた。

全長のｍＲＮＡ　（１８Ｓ−２８Ｓ）が同じ長さのｃＤ
ＮＡに転写されたことはゲル電気泳動法で確認して、ベ
クター　ｐｃＤへのクローン化を行った。

全ＤＮＡ配列はマクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ）の方法によって決定した。

クローン化されたｃＤＮＡのうち最長のものは、５゛末
端に約６８塩基よりなる非転写部位を有し、ＡＴＧ（Ｍ
ｅｔ）に始まるコーディング部位は５２７個めアミノ酸
をコードしている。また３゛末端は６２６個の塩基より
構成されていた。分泌シグナルはｍ　＜　ＡＴＧ（Ｍｅ
　ｔ）より始りＣＴＧ　（Ｌｅｕ）に終結するポリペプ
チドをコードしていた。

またシスティン（Ｃｙｓ）は分子内に僅かに３個で比較
的シンプルな立体構造を示唆しているが、自然のカタラ
ーゼが４量体とすればこれらのシスティン（Ｃｙｓ）が
どのようにその構造に関ヰしているのか興味深い。

アミノ酸配列はシュレーダー（Ｓｅｈｒｏｅｄｅｒ）　
ら（参考文献１３．１４　）の報告とは一部が異なって
いるが、コルネルーク（Ｋｏｒｎｅｌｕｋ）ら（参考文
献１）のものとは７６位以下は類似していた。

カタラーゼ遺伝子の発現 大腸菌の場合には」、製置の発現ベクターであるｐＫＫ
２３３−２と宿主細胞としてＲＢ７９１　（Ｉａｃ　Ｉ
Ｑ）を用いてカタラーゼの生産株を創製した。

まずプラスミドｐＣＤ−Ｃａ　ｔ８９　（第４図）より
、カタラーゼのｃＤＮＡ部位をＢａｍＨｒによる部分分
解によって切り出し約２．４００ｂｐのｃＤＮＡをゲル
電気泳動法によって部分精製した。

このＤＮＡに化学合成したリンカ−（第３図にその構造
を示した。）を加え、ｐＫＫ２３３−２ベクターのＮｃ
ｏ　Ｉサイトにリガーゼを用いて挿入した。

５゛末端にだけ上記リンカ−を結合するためｃＤＮＡと
のモル比は０．５とした。

このプラスミドｐＫＫ−ＣａＬ２５０　（第５図参照）
をＥ、ｃｏｌｉ　（ＲＢ７９１　（ｌａｃ　ＩＱ）　）
に形質転換した。

テトラサイクリン耐性のコロニー約１００ａのなかから
ＩＰＴＧ添加により開店性のカタラーゼ生産株を得た。

このような亮活性の菌株では閑体総クン白質量の１５〜
２０％がカタラーゼであると推定される（参考文献４）
。

細胞からポナベンチューラ（Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ）
　　らの方法（参考文献１２）で酵素の精製を行った。

即ち、遠心分離した菌体を０．３Ｍのショ糖溶液で洗っ
た後、０．１χのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え凍結溶
解の後ワーニングブレンダー（Ｗａｒｎｉｎｇ　ｂｌｅ
ｎｄｅｒ）で溶菌し、脱イオン化後ＤＥＡＥのクロマト
グラフィーで精製した。

活性分画にアンモニウムサルフェートを２９〜３０％飽
和させるとカタラーゼは沈澱したのでこの操作を２〜３
度くり返して、ｓ、ｏｏｏ倍以上の精製結果を得た。回
収率は約６５％であった。

分子量の分布はゲル電気泳動法によるとモノマー、ダイ
マー、トライマー及びテトラマーの各々があった。

分画した酵素は非常に安定で高活性であり、その活性値
を知ることは、５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７，
０）中に１，０００倍以上に希釈後、　２Ｈ２０□→２
Ｈ，０＋Ｏ□の反応におけるＨ、０□の減少度を２４０
ｎｍの吸収を測定することで可能であった。

大腸菌菌体中で作られたこの酵素は、家兎抗カタラーゼ
抗体と反応し、この場合の沈降線は１木であった。

このことより我々はこの酵素は、目的としたヒト肝細胞
由来のカタラーゼであったと結論した。

またこの酵素は、動物及び人体内ではポリエチレングリ
コール等に連結すると、さらに安定であった。リボソー
ム封入体は血中及び組織中で有効性を発蓮し数時間の半
減期を示した。

酵母における発現は、ＡＤＨプロモーターとαプロモー
ターを用いて発現させ、また動物細胞においては、５Ｖ
−４０とＭＭτプロモーターを用いて発現させ同様の結
果を得た。

参考文献 １、Ｋｏｒｎｅｌｕｋ、Ｒ，Ｇ、ｅｔａｌ、、Ｊ、ｏｆ
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９＋１３８１９（１９８
４）　。

２、Ｋｗｏｋ、　Ｓ、Ｃ，Ｍ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
２４．５！５６　（１９８５）　。

３’、Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐ、、
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、３゜２８０　（１９８
３）　。

４、ｄｅ　Ｂｏｅｒ、）１．Ａ、ｅｔａｌ、＋Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７８．２１　（１
９８３）　。

５、Ｖｉｅｒａ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、、
Ｇｅｎｅ　１９＋２５９（１９８２）６、Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ、Ｊ、ｅｔａｌ、、Ｐｌａｓｍｉｄ　６＋１１２（１
９８１）。

７、Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｊ、ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１−Ｂ
ｉｏｌ、１４８．１０７（１９８１）８、Ｇｅｎｔｊ、
Ｒ，ｅｔａｌ、＋Ｐｒｏｃ、ＮａＬ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　７Ｌ４９３６　（１９８１）　。

９、Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　　２７．１５１
（１９８４）。

１０．Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　　２７，１６
１（１９８４）。

１１、Ａｍｍａｎ、Ｅ、、ｅｔａｌ、、Ｇｅｎｅ　　２
５．１６７（１９８３）。

１２、Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ、Ｊｌ　Ａｒｃｈ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、。

１５０．６０６（１９７２）。

１３．５ｃｈｒｏｅｄｅｒ、Ｗ、Ａ、ｅｔａｌ、、Ａｒ
ｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、、２１４．
３９７（１９８２）。

１４．５ｃｈｒｏｅｄｅｒ、Ｗ、Ａ、ｅｔａｌ、、Ａｒ
ｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、、２１４．
４２２（１９８２）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ
）とカタラーゼ（ＣＡＴ）の゛活性酸素消去作用を説明
する図である。 第２図は、　ＣＡＴ　ｍＲＮＡの構造を示す図である。 このカタラーゼｍＲＮＡは２，２７５ケの塩基よりなり
６８ｂｐの非翻訳部が５°側に６２６ｂｐが３゛側に位
置している。酵素はＡＴＧ（Ｍｅｔ）に始まり、ＣＴＧ
　（Ｌｅｕ）で終結している。分子内に３ケのシスティ
ン（Ｃｙｓ）が有り、分子間結合に関与しているものと
考えられる。 第３図は、化学合成し、発現プラスミドの構築に用いた
リンカ−の塩基配列を示す図である。 第４図は、　ＣＡＴ　ｃＤＮＡのクローニングヘクター
の構造を示す図であり、ｐＣＤヘクターによるＣＡＴ　
ｃＤＮＡのクローン化プラスミドｐＣＤ−Ｃａｔ８９の
構造略図で各制限サイトとＡｍｐ”とＣＡＴの位置を示
す。 第５図は、カタラーゼ遺伝子の発現ベクターの構造を示
す図であり、発現ベクターｐＫＫ−２３２−２（４゜６
にｂ）によるヒト・カタラーゼｃＤＮＡ（ｈ　ＣＡＴ）
の発現プラスミド。Ｎｃｏ　Ｉサイトは合成リンカ−に
よって連結。形質転換後、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）
耐性コロニーの選択によった。プラスミドの全長は６．
９Ｋｂｐで宿主Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＢ７９１で安定に保
持されている。 特許出願人　　三井東圧化学株式会社 図　　　　面 第１図 第２図 第３図 ５’−ＣＡＩＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡ
ＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧ第　　４　　図 第　　５　　図 ｒａ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト・カタラーゼ遺伝子であって、次に示す１から
   ５２７までのアミノ酸をこの順序にコードしている次に
   示した塩基配列。 【遺伝子配列があります。】 ２、塩基配列が、特許請求の範囲第１項に記載の１から
   ５２７までのアミノ酸をその順序にコードする、特許請
   求の範囲第１項に記載の塩基配列と実質的に構造遺伝子
   として同じ機能を有するカタラーゼ遺伝子。 ３、ポリペプチドの発現に必要なキメラＤＮＡであって
   転写の下流方向へのオーダーが （ａ）プロモーター （ｂ）リボソーム結合部位 （ｃ）開始コドン （ｄ）ヒト・カタラーゼ遺伝子 （ｅ）転写ターミネーター を含んで成るもの。 ４、ヒト・カタラーゼ遺伝子が特許請求の範囲第１項又
   は第２項に記載の塩基配列であることを特徴とする特許
   請求の範囲第３項に記載のキメラＤＮＡ。 ５、微生物又は動物細胞において特許請求の範囲第３項
   に記載のキメラＤＮＡを用いて生産したカタラーゼ。 ６、ヒト・カタラーゼ遺伝子が特許請求の範囲第１項又
   は第２項に記載の塩基配列であることを特徴とする特許
   請求の範囲第５項に記載のカタラーゼ。