JPS63146789A - 変異ヒトプロウロキナ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトプロウロキナーゼ（以下ヒトＰＵＫ）を
分子構造的に修飾してなる変異ヒ）ＰＵＫ、その製造方
法、該変異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、該Ｄ　
Ｎ　Ａ配列の組み込まれたプラスミド、および該プラス
ミドによって形質転換された形質転換体に関する。さら
に詳しくは、遺伝子レベルにおいて特定遺伝子の全領域
もしくはその一部を欠失、または咳全領域もしくは一部
を他のアミノ酸残基で置換させ、該遺伝子を組み換えＤ
ＮＡ技術を応用して発現させることからなる変異ヒトＰ
ＵＫを提供する一連の技術に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする問題点〕従来、線
維素溶解酵素としてはウロキナーゼが著名である。この
ものは、従来人尿および人腎細胞の培養液から精製され
ていたが、近年ＤＮＡ組み換え技術による生産も可能と
なった（特開昭６０−１８０５９１号明細書）、シかし
、本薬剤は大量に用いると、凝固・″４１Ａ溶諸因子の
分解並びに活性化を惹起し、出血傾向を誘起する欠点を
有している。他方、本発明者らは、人腎細胞によって産
生されるヒトウロキナーゼの不活性型前駆物質ＰＵＫ（
特開昭６０−６２９８１号明細書、　Ｊ、Ｒｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２６０．１２３７７（１９８５）　ｌ］
が、ウロキナーゼと異なり出血傾向を惹起することなく
血栓を溶解することを既に見出している（Ｃｅｌｌ　５
ｔｒｕｃ、Ｆｕｎｃ、、１０゜１５１（１９８５）　）
。

このヒトＰＵＫは、３つの機能ドメイン（ｄｏ−ｍａｉ
ｎ）　、すなわち、エピダーマルグロースファクター（
ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　、
以下ｒＥ、ＧＦと略称する。）ドメイン、クリングル（
ｋｒｉｎｇｌｅ）　　ドメイン、酵素活性ドメインから
構成されζいる（Ｉｌｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ
、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、、　３６３．１１
５５（１９８２）　）　。

ところが、本物質はウロキナーゼと同様血中での半減期
が短いため、血栓を溶解する目的のためには、比較的大
量に用いなければならないという問題点がある。

本発明の目的は、ヒトＰＵＫよりも血中半減期が長く、
しかもヒ）ＰＵＫと同様出血傾向の極めて低い線維製熔
解ＩＪ素、その製造方法、当該線維素溶解酵素をコード
するＤ　Ｎ　Ａ配列、該ＤＮＡ配列の組み込まれたプラ
スミド、形質転換体を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる目的を達成するために本発明者らは種々研究を重
ねて来たところ、ヒ）ＰＵＫのＥＧＦドメインの全領域
またはその一部が欠失あるいは他のアミノ酸残基で置換
されている組み換え変異ヒトＰＵＫはヒトＰＵＫよりも
皿中半裁期が長（、しかもヒ）ＰＵＫと同様出血１頃向
の極めて低いことを見出した。

即ち、本発明はヒトＰＵＫのＦ、　ＣＦドメインの全領
域もしくはその一部を欠失、または該全領域もしくはそ
の一部を他のアミノ酸残基で置換されている変異ヒトＰ
ＵＫ、当該変異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、当
ｔｚ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列が組み込まれたプラスミド、当該
プラスミドによって形質転換された宿主および前記変異
ヒ）ＰＵＫの製造方法に関する。

ところで、ヒトＰＵＫの４１１アミノ酸残基のうら、Ｎ
末のセリンより４９番目のスレオニンまでがｒＥ、ＣＦ
Ｆドメイン報告されている（Ｒｉｃｃｉｏ。

＾、　ｅＬ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　　Ｒ
ｅｓ、、　１３．２７５９−２７７１（１９８５））　
、そこで本発明は、このＥＧＦドメインの全領域もしく
はその一部が欠失、または該ドメインの全領域もしくは
その一部を他のアミノ酸残基で置換された変異ヒトＰＵ
Ｋを生産する一連の技術を提供するものである。

ＥＧＦドメインをコードする領域の欠失領域の好適な例
として、Ａｓｎ　　（アスパラギン）　（１０）〜Ｃｙ
ｓ（システィン）　　（４２）　、Ａｓｎ　　（１０）
　〜＾ｓｐ　　（アスパラギン酸）　　（４５）、Ａｓ
ｎ　　（１０）〜Ｔｈｒ　　（スレオニン）　　（４９
）において行った。

これは、Ｃｙｓ（４２）　〜Ｔｈｒ（４９）の領域が疎
水−視水一疎水と変化に富んでいることがら、立体構造
の変化を考慮して作製したものである。

欠失処理には、プロティンエンジニアリングとして知ら
れる方法が広く利用できるが、たとえば５ｉｔｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　（部位指定削除）法
（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　１１．１６
４５　（１９８３）　］　、５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　（部位特異的変異）法、
制限酵素処理と合成遺伝子の利用による方法等がある。

欠失処理された変異ＰＵＫは、発現ベクター系に挿入し
て、発現用宿主・ベクター系を構築する。

宿主・ベクター系は一般に宿主細胞とコンバーチプルな
種から由来するレプリコンと制御配列を有するプラスミ
ドベクターと、この宿主を組み合わせて使用する。ベク
ターは一般に復製部位を有しており、又形質転換細胞中
で表現型のｉ！ｆ択が可能となるマーカーの配列を有し
ている。例えば大腸菌は通常ｐＢＲ３２２を用いて形質
転換されるが、このプラスミドは大腸菌株由来である［
Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔａｌ、　Ｇｅｎｅ、　　２．９５
（１９７７）］　、　ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性
及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を持っているので形
質転換した細胞を検出する簡単な方法を与える。　ｐＢ
Ｒ３２２プラスミドや、他の微生物プラスミドは微生物
体が利用できて、それが支配する蛋白質を発現させるこ
とが可能なプロモーターを有するか、あるいはプロモー
ター配列を挿入しである０Ｍｉみ換えＤＮＡの構成に通
常使われるプロモーターとしてはβ−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎ
ｇ　ｅｔａｔ、Ｎａｔｕｒｅ、　２７５．６１５　　（
１９７８）　；　Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　１９Ｂ、　１０５６　　（１９７
７）　；　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２８１．５４４　（１９７９）　・］
あるいはトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　８．４０５７　　
（１９７９）　；　ヨーロッパ特許出願公開第００３６
７７６号明細書〕がある。これらは最も一般的に使われ
ているが、他の微生物プロモーターも発見され、使用さ
れている。それらの塩基配列の詳細も発表されており研
究者はそれらをプラスミドベクターに機能的に導入する
ことが可能である（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｔ
、　Ｃｅ１ｌ、　２０＋２６９　　（１９８０）　）。

そして宿主としては、大腸菌ＨＢｌｏｔ−ＧＣＣ株、Ｃ
６００株、Ｗ３１１０株などが用いられる。酵母ベクタ
ーにおける適当なプロモーターとして３−ホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター（ｌｌｉｔｚ
ｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｔｓ、、　２５５．２０７３
　　（１９６８）　）や他の解糖系酵素（Ｈｅｓｓ　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｊ、＾ｄｖ、、　Ｅｎｚｙｍｅ　　−Ｒｅ
ｇ、。

ユ、　　１４９　（１９６Ｂ）　　；　ｌ１ｏｌｌａｎ
ｄ　ｅｔ　ａｌ、　　［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ。

１７、４９００　（１９７Ｂ）　）であるエノラーゼ、
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ
ＡＰ−ＤＨ）　、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸ムタ
ーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ
の様な酵素のプロモーターである。これらの中でも、小
型化ＣＡＰ−Ｄ　Ｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター
は有用である。適当な発現ベクターを作製する場合、こ
れらの遺伝子に存在する転写終結配列も又発現したい遺
伝子の３゛側に挿入し、ｍＲＮＡのポリＡ化と転写終結
が生じる様にする。増殖条件により、転写の制御ができ
る様な利点を有するプロモーターとして、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ，酸性ホスファタ
ーゼ、あるいは窒素代謝に関連した分解酵素、前述のグ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ある
いはマルトースやガラクトースを使用するのに関連した
酵素のプロモーターも使える。酵母のコンバーチプルプ
ロモーター、復製起点及び転写終結配列を含むすべての
プラスミドベクターが使える。そして宿主としては、ハ
胚ｈａｒｏｍ匹胚］ｙ見伏畦肥ＧＲＦＩ８株、Ａ３２２
株などを用いる。

さらに枯草菌の分泌発現ベクターとしては、プラスミド
ｐＵＩ３１１０の復製起点をもち、かつ、α−アミラー
ゼ遺伝子のプロモーター、シグナルペプチド、ターミー
享−ターを有するプラスミドが利用でき、この宿主とし
ては旦、朋工蝕、旦。

５ａｂｔｉｌｉｓなどが使用できる。近年を推動物の細
胞を培養して（Ｍｌ培養）増やすことがルーチン化して
いる。［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　ｅｄｉｔ
ｏｒｓ　（１９７３）　］宿主細胞株として有用な例と
してＶＥＲＯ，ｌ１ｅＬａ細胞、Ｃｈｉ−ｎｅｓｅ　ｈ
ａａ＋５ｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　（ＣＩＩＯ）　ｃｅｌｌ
　１ｉｎｅ、　Ｗ１３８＋ＢＩＩＫ、ＣＯ５−７，ＭＤ
ＣＫ　ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ、　Ｃ１２７，ＩＩＫ［；、
　ｈｕｍａｎｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅなどが
ある。これらの細胞の発現ベクターは通常、複製起点、
発現する予定の遺伝子上流に位置するプロモーター、リ
ポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリ人付加
部位、転写終結配列ををする。

咄乳動物細胞を使用する場合、発現ベクター上の制御機
能はウィルス由来であることが多い。例えば、一般的に
使われるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス、
２、あるいは最も多用されているシミアンウィルス４０
　　（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期
及び後期プロモーターは特に有用である。というのはこ
れらはＳＶ４０の複製起点を含む断片として容易にウィ
ルスから得られるからである。　　［Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ
　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ。

２７３、１１３　（１９７８）コウィルスのｌｌ１ｎｄ
ｌ［１部位から複製起点中のＢｇ１１部位までの約２５
０ｂｐを含む断片も使用できる。更に目的とする遺伝子
に関連したプロモーターや制御配列（エンハンサ−）も
宿主とコンバーチプルならば使用できる。

動物細胞発現ベクターに用いるプロモーター・エンハン
サ−としては、ＳＶ４０初期遺伝子又は後期遺伝子のプ
ロモーター・エンハンサ−やアデノウィルスメジャーレ
ート・プロモーター領域、グロブリンエンハンサ−・プ
ロモーター領域、ＲＮＡウィルスのＬＴＲ，メタロチオ
ネインプロモーターｗＩ域、β−アクチンプロモーター
などが使用できる。複製起点はＳ　Ｖ、４０や他のウィ
ルス（ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）由来の
ものをベクターに組み込んでもよいし、宿主細胞染色体
の複製機構を用いてもよい。ベクターが宿主細胞の染色
体に組み込まれるならば後者で十分である。また、これ
以外の高生産系として、ＤＨＦ　Ｒ遺伝子を利用した遺
伝子の増幅系を用いることが可能である。以上、具体的
な例を挙げて説明した本発明は、以上に例として述べた
宿王細胞ヘクター・発現系に限定して解釈されるべきで
はない。

本発明においては、例えば好適な具体例として、ＳＶ４
０初朋プロモーター領域の下流に変異ヒトＰＵＫをコー
ドする遺伝子を挿入して、動物細胞用発現ベクターを構
築した。これらを例えば、ＣＯ３７細胞あるいはＣＨＯ
Ｋ　＋細胞に導入して形質転換させた。本実験系では、
５０〜３００１０／−１／日の変異ヒトＰＵＫを産生ず
るクローンを得た。

変異ヒ）ＰＬＩＫの精製は、既知のヒトＰＵＫの精製法
に準じておこなうことができる（特開昭６Ｏ−６２９８
１）、本発明では、精製にはＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　　６Ｂ、　　ａｎｔｉ−ＵＫ　　ＩｇＧ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　４Ｂ＋　　ｐ−ａｍｉｎｏ−
ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂの
カラムクロマトグラフィーを併用したが、特にＣｈｅｌ
ａｔｊｎｇＳｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂは粗精製に、ａｎ
ｔｉ−ＬＩＫ　ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂは高度
精製に、さらにｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ
−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂは混入活性型ウロキナーゼ
の除去に各々有効である。

かくして得られた産生物を解析したところ、ＰＵＫ活性
においては変異型及び非変異型で全く差はなく、変異型
ＰＵＫは、分子盟約４５，０００ノ一本鎖型のプロエン
ザイムであり、プラスミン処理により完全に活性型に変
喚した。さらにこの変異ヒ）Ｐ［ＪＫの血中半減期を人
腎細胞由来ＰＵＫ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、
　２６０．１２３７７　（１９８５）　）のそれと比較
したところ、変異ヒトプロウロキナーゼの血中半減期の
ほうが有意に長かった。

〔実施例〕

実施例１： （動物細胞における発現へフタ−の作製）動物細胞にお
いてヒ）ＰＵＫを効率よく分泌生産できる発現ベクター
ｐ　５Ｖ−Ｇ１−ｐ　ｒ　ｅ　ＵＫを作製した（第２図
）。このベクターでは、ＳＶ４０の初期遺伝子エンへン
サー・プロモーター領域の下流にヒトＰＵＫｃＤＮＡが
挿入され、さらにその下流には、ＳＶ４０の転写終結領
域がおかれている（第３図）。

なお、ＰＵＫ　　ｃＤＮＡのクローニングおよびその塩
基配列、またｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫプラスミドの作
製方法等については先の特許出願（特開昭６０−１８０
５９１、欧州特許出願公開第１５４２７２号）に準じた
。

（Ｍｌ　３ｍｐ　１８ＲＦプラスミドへのｐｒｅ［ＪＫ
ｃＤＮＡの挿入） 部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕＬ
ａｇｅｎｅｓｉｓ）法を用いてヒトＰＵＫ遺伝子上に新
たなユニーク制限酵素部位を設けるために、まずプラス
ミＬｐＳＶ−Ｇｌ−ｐ　ｒ　ｅＵＫのＫｐｎｌ断片（ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ：をＭ１３ｍｐ１８ＲＦプラスミドへ導
入したく第４図）。

まず、ｐｓＶ−ｃ、−ｐｒｅＵＫプラスミド１０μｇを
制限酵素Ｋｐｎｌ　　３０単位（ｕｎｉｔｓ）を用い、
３７℃で完全に消化した。このＤＮＡを１％アガロース
ゲル電気沫勅にかけ、ゲルより１．７ｋｂＫｐｎ＋断片
を回収したくこれらの手法は全てＴ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ″、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）に従った〕。次に、Ｍ
ｌ　３ｍｐ　ｌ　８ＲＦプラスミドｈｕｇを３単位のＫ
ｐｎｌで完全に消化し、その後、牛腸由来アルカリフォ
スファターゼ（Ｃａｌｆ　１ｎｔｅｓｔ４ｎａｌ　ａｌ
ｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ＞（Ｃ［Ｐ）を用
い、５′末端脱リン酸化を行った。そして、このＭｌ３
−Ｋｐｎｌ消化プラスミドと、先に調製したＵＫ　１．
７ｋｂＫ　ｐ　ｎ！断片とを混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（Ｉｉｇａｓｅ）３０単位を加えリゲーション（ｌ　ｉ
ｇａＬｉｏｎ）反応を行った（上記Ｔ、　ＭａｎｉａＬ
ｉｓ等の方法）。反応終了後、このＤＮＡを用い大腸菌
ＪＭ１０５株を形質転換した。

〔部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を用いたＤＮＡ塩基置換〕

部位特異的変異の方法は、Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ等〔
ＤＮＡ、　　３．４７９．（１９８４））　、及び−ｅ
ｌｆｓ、　Ｊ、Ａ等ＣＧｅｎｅ、　３４．３１５　（１
９８５））の方法に従って行った。

まず、Ｍｌ３−ＵＫＩＲＦプラスミド（図４）を含む大
腸菌ＪＭ１０５形質転換体より、１木鎮ＤＮＡを調製し
た。この操作はＳａｎｇｅｒ＋　Ｆ−等ＣＪ、　Ｍｏ＋
、　［１ｊｏ１．、１４３．１６１　（１９８０））の
方法に従った０次に、この一本積Ｍ１３−ＵＫＩＤＮＡ
（ＳＳ−Ｍｌ３−ＵＫＩ）１０μｇとＭｌ　３ｍｐ１８
Ｋｐｎｌ消化断片１０．ｕｇとを混ぜ、１００℃、２分
間加熱後、徐々に６５℃まで温度を下げ、ＳＳ　・Ｍｌ
　３−ＵＫＩとＭｌ　３ｍｐ　ｌ　８−Ｋｐｎｌのマイ
ナス鎖とをアニーリングさせた後、水中にて急冷した。

その後、このＤＮＡを０．８％アガロースゲルにかけ、
目的の二本鎖開Ｎ　（ｏｐｅｎ　ｃｉｒ−ｃｕｌａｒ）
型ＤＮＡ部分のＤＮＡ　　Ｍｌ３−ＵＫＩ−ＯＣ（第５
図）を回収した。

次に、塩基置換を行うため、２種類のオリゴヌクレオチ
ドを合成した。３ａｃ１部位導入用変異プライマーＣプ
ライマー１）〕またはＮｄｅ１部位導入用変異ブライマ
ー〔ブライマーｉｉ）　）ともに２２＋ｍｅｒ　２ｂａ
ｓｅミスマツチ　（ｍｉｓｍａｔｃｈ）のヌクレオチド
を合成した（表３）。

Ｔ　４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ
を用い、上述の２種類のオリコヌクレオチドブライマー
の５′末端をリン酸化した後、これら２種類のプライマ
ー各１００ｐｓ＋ｏｌ　と、Ｍｌ３　　ＬＩＫｌｏｃＤ
ＮＡ　　ｌｐｍｏｌとをアニーリング緩衝液（２０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５
０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、、１　ｍＭ　　ＤＴＴ、　ｐｌ
＋７．５）中に加えた。５５℃、１０分間加熱した後、
室温に２０分間放置し、プラスミドと２種類のプライマ
ーとをアニーリングさせた。次に等容量のｐｏｌ、Ｉ／
リゲーション１１ｔｆｉ液　（２０ｍＭ　　Ｔｒ　　ｉ
　　ｓ　　　［（Ｃｊ！、　　ｌ　０ｍＭＭｇＣ６２、
ｌ　ＯｍＭ　　　ＤＴＴ、、ｐＨ７，５，０，５１ｄＮ
ＴＰｓ、　１ｍＭ　ｒＡＴＰ、１０単位　Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ、５単位　旦、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅラージ断片（ｌａｒｇｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）
）を加え、１５℃、８時間反応させ、次にこの反応液を
用い、大腸菌ＪＭ１０５株を形質転換した（第６図）。

数多くの形質転換体の中から、ヒトＰＬＩＫ遺伝子中に
５ａｃｋ、及びＮｄｅ１部位が導入されたプラスミドＭ
１３〜ＬＩＫ２ＲＦを有する株をＪＡ訳するため、変異
プライマー（ｍｕＬａｇｅｎｅｓｉｓ　ｐｒｉＩＩＩｅ
ｒ）をハイブリダイゼーシコンブ四−ブ（ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａＬｉｏｎｐｒｏｂｅ）とした、プラークハイブリ
ダイゼーンヨン（ｐｌａｑｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ）を行った。

ｌブレート当た！／）２００から３００個のプラークを
ニトロセルロースフィルタ− ニトロセルロースフィルターは、大ｎＢ　菌Ｊ　Ｍ　１
０５の一夜培養液を１００倍に希釈した溶液に５分間浸
し、その後、風乾したものを用いた。このフィルターを
８７Ｊ天にプラーク面が上になるようにしてのせ、３７
℃に一夜放置した。次に、Ｍａｎｉａｔｉｓ。

τ等の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１’ｏｎｉｎｇ＋
　１９８２）に従い、ファージＤＮＡを固定した。この
フィルターをＺｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ等（ＤＮＡ、３．
４７９、（１９８４））が用いた方法に従い、前ハイブ
リダイゼーシヨン（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
）、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼ
ーションプローブとして５′末端を（ｒ−Ｐ）ＡＴＰで
標識した２種類の変異プライマーを用いた。各プローブ
を用い、ハイブリダイゼーションした後、６ＸＳＳＣに
て洗浄した。洗浄の温度を２５℃、４８℃、５６℃、６
４℃と上げていくと、変異をおこしたＤＮＡはハイブリ
ダイズ（１＋ｙｂｒｉｄｉｚｅ）　したままだが、野性
（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）型は５６℃以下で洗い落とされ
た。

約１　、０００プラークについてハイブリダイゼーショ
ンスクリーニン（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を行った結果、
６４℃の洗浄（ｗａｓｈ）でも２種類のプローブどちら
にもハイブリダイズしていたクローンが７つ得られた。

この７クローンをＺｏｌｌｅｒ、　Ｍ、　Ｊ等（ＤＮＡ
Ｓ３．４７９　（１９８４））の方法に従いプラーク精
製を行った。

各プラークをＴＥで希釈した後、大腸菌ＪＭ１０５培養
液とともに１１寒天壇地にまいた。そして、各クローン
についてｌＯプラークをドツトハイブリダイゼーション
（Ｄｏｔ　ｈｙｂｒｉｄｔｚａｔｉｏｎ）　　シた。こ
のハイブリダイゼーションにも２種類の変異プライマー
をプローブとして用いた。次にドツトハイブリダイゼー
ションで得られた陽性（ｐｏｓｉｔｉνｅ）クローンの
ＤＮＡ塩基配列を決定した。ＤＮＡ塩基配列の決定はＳ
ａｎｇｅｒ等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ：ＵＳＡ　、　７４１．５４６３　（１９７７）
　）のディデオキン（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いた。そ
の結果、５ａｃｌとＮｄｅ１部位が導入されたクローン
が５つ得られた。このクローンのＲＦプラスミドをＭ１
３−ＵＫ２ＲＦと名付けたく第６図）。

（ＥＧＦドメイン欠失変異ヒトＰＵＫの発現ベクター作
製） Ｍ１３−ＵＫ２ＲＦプラスミド５．ｃ＋ｇをＫｐｎ１２
０単位を用い、消化した。一方、ｐＳＶＧ。

プラスミドのＮｄｅ１部位をフィーリングイン（ｆｉｌ
ｌｉｎｇ　ｉｎ）することによって壊した後、このプラ
スミドＩμｇをＫｐｎ１３単位を用いて消化した。次に
、これら両ＤＮＡを混ぜ、１０単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて、リゲーンヨン反応を行った。このＤ　Ｎ　
Ａ　？ｇ液を用い、大腸菌１１８１０１株を形質転換し
た。この形質転換体（Ａｐ’）より目的の３ａｃｌ、Ｎ
ｄｅ１部位をもつプラスミドｐＳＶ−ＵＫＩＯ（第１図
）を有するクローンＪＩＢ１０１／ｐ　５Ｖ−ＵＫ　１
０を得ることができた。

次にブーｙスミドｐ　５Ｖ−ＵＫ　１０を用い、Ａｓｎ
−１０からＡｓｐ−４５までの３６アミノ酸を除去した
変異ヒトＰＵＫの発現ヘクター作製を試みた。ｐＳＶ−
ＵＫＩＯを制限酵素５ａｃｌとＮｄｅｌとで消化すると
、ヒトＰＵＫのＮ末より４番目のロイシンから５０番目
のシスティンまでが除去されたものができる（表４Ａ）
。そこで両末端がＳ　ａ　ｃ　ｌ　−、Ｎ　ｄ　ｅ　＋
消化末端となりかつ旧ｓ−５から５ｅｔ−９さらにＬｙ
ｓ−４６からＣｙｓ−５０をコードするオリゴヌクレオ
チド（表４Ｂ）を合成した。

合成した３１ｍｅｒと３７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
を各５０ｐｍｏｌずつ混合し、７０℃で加熱後、室温に
２０分間放置しアニーリングさせた。このＤＮＡとプラ
スミドｐ　５Ｖ−ＵＫ　Ｉ　Ｏの５ａｃｌ、Ｎｄｅｌ消
化断面ｌμｇとを混ぜ、Ｔ４ＤＮＡ３０単位を用い、リ
ゲーションした。その結果、ヒトＰＵＫのＮ末より１０
番目のアスパラギンから４５番目のアスパラギン酸まで
が除去され、かつこの変異ヒトＰＵＫを動物細胞で発現
させることができるベクターｐＳＶ−ＵＫＩＩが作製で
きた（第７図）。

同様の方法を用い、ヒトＰＵＫのＬｅｕ−４からＣｙｓ
−５０の間を種々な形（アミノ酸の欠失、挿入、置換）
に変換し、これら変異ヒ）ＰＵＫの発現ベクターを作製
した。

（ヒトＰＵＫクリングルドメインの誘導体作製）上述と
同様の部位特異的変異の方法により、ＡＴＡ　（Ｉ　ｌ
　ｅ−４４）をＡＴＣに変換した。その結果＋１ｅ−４
４からＡｓｐ−４５をコードするＤＮＡ塩基頌域にＣ１
ａ＋制限酵素部位をもつ発現ベクターｐＳＶ−ＩＪＫ５
０を作製した（第８図）。

ｐＳＶ−ＵＫ５０をＣＩａＩとＢｇｌｌｌ、またはＣ１
ａｌとＢａ１Ｉ、ＢｇｌＩＩとＢａ１ｌで消化し、この
部位に先程と同様に、種々の合成オリゴヌクレオチドを
挿入し、クリングルドメインの変異ヒトＰＵＫ発現ベク
ターを作製した。

（動物細胞における変異ヒ）ＰＵＫの生産）種々の変異
ヒトＰＵＫ発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣
細胞（ＣＨＯ−に、　、ＡＴＣＣＣＣＬ６１）の染色体
上に導入した。宿主特異マーカー（Ｄｏｍｉｎａｎｔ　
５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍａｒｋｅｒ）　としてｐＳＶ−
Ｇ１−Ｎｅ　ｏ　　を用いた。ｐＳＶ−Ｇｌ−Ｎｅｏ　
　の作製および変異ヒトＰＵＫ発現ベクターとのＣＨＯ
Ｋｌ細胞への共感束（ｃｏ−ｔｒａｎｓ−ｆｅｃＬｉｏ
ｎ）およびクローニング方法は特開昭６０−１８０５９
１号明細書に記載の方法に準した。

次にプラスミドｐｓｖ−ＵＫＩ　１　　（Ａｓｎ　−１
０からＡｓｐ−４５を欠失）をもって形質転換されたク
ローンＣＨＯ−ＵＫＩＩ株を培養し、その培養上清中の
プラスミノーゲンアクチヘーター活性を調べた。まずフ
ィブリン寒天平板アッセイにかけたところ培養上清に活
性が認められ、また抗しトウロキナーゼ抗体によりその
活性が中和された。

さらにスクリーニングによって変異ヒトＰＵＫ物質の産
生量の高いと思われるＣＨＯ−ＵＫ　１１−７株を得た
。このクローンの培養上清を用いて、産生された変異ヒ
トＰＵＫ蛋白の性状を検討した。

（ＣＩｌ○−ＵＫＩＩ−７細胞株によって産生される変
異ヒトＰＵＫの精製村よびその性状）５％牛脂児血清を
含むｌｌａｍ’ｓ　Ｆ　　１２培ｔ（ｊ４５ｍｌ中に懸
濁したＣＨＯ−ＬＩＫＩＩ〜７細胞を、２５ｄの培養フ
ラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　１２５１００）に５Ｘ１０Ｓ
ｃｅｌｌｓ　／フラスコで植え込み、３日間培養後、Ｃ
ｏｎｆｌｕｅｎＬになった時点で牛胎児血清を含まない
上記培養液で数置洗浄した。以後、アプロチニン（ａｐ
ｒｏＬｉｎｉｎ）（１０Ｋ　Ｔ　Ｕ／ｍｌ）及び０．１
％ヒト血清アルブミンを含むＩＩａ＋＊’　ｓ　Ｆ　−
１２培地を維持培地として用い、２〜３日毎に培養液を
交換した。本無血清培養上清１１から、変異ヒトＴ’Ｕ
Ｋの精製を行った。培養上清にＩ　Ｎ　ＨＣＩ！を添加
し、ｐＨを５．５に補正した後、０．１６　Ｍリン酸ナ
トリウム／ｐｌ＋　５．５に懸濁したＣＭ−セフアゾ７
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−５０Ｃファルマシア（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）社製、乾燥重量１．５ｇに相当する
量〕を投入し、４℃下、２時間攪拌した。ゲルをガラス
フィルター上に回収し、０．１６　Ｍリン酸ナトリウム
／　ｐＨ５，５で洗浄後、２．５Ｘ１０ｃｍ＋のカラム
に充填し、Ｏ，１６Ｍリン酸ナトリウム／　ｐＨ８，５
で溶出した。フィブリン寒天平板（ｆｉｂｒｉｎ−ａｇ
ａｒ　ｐｌａｔｅ）　　（Ｊ、ｃｅｌｌＢｉｏｌ、　９
４．６３１（１９８２））上フィブリン熔解活性を有す
る溶出活性画分を抗ウロキナーゼポリクローナル抗体〔
本抗体はＤＥＡＥアフィゲルブルー（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
　Ｂｌｕｅ）、ｐ−アミノヘンズアミジンーセファロー
スあるいはリジンセファロースに通すことによりプロテ
アーゼ活性を除去しである）を固定したセファロース４
Ｂ（ゲル容１９ｍ１）を充填した！、５ＸＩＯｃｓのカ
ラムに注入した。０．５　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｊ！　／　
０．１　Ｍリン酸ナトリウム／　ｐｉｔ　７．０で抗体
カラムを洗浄後、０、２　Ｍグリシン−１１ｃｆ１０．
５Ｍ　　Ｎａ　Ｃｆｆ１／ｐＨ２，５で溶出した。フィ
ブリン寒天子板上、フィブリン溶解活性を有する活性画
分を回収し、これにＩＭＴｒｉｓ水＞８　？＆を滴下す
ることにより、ｐＨを７．０に補正し、以下の性状分析
に供した。

■　分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２２７．６８０　（１９７０））を用いて、Ｃ
ＨＯ−ＵＫＩＩ−７細胞由来の変異ヒ）　’Ｐ　Ｕ　Ｋ
の分子量を測定したところ、非還元のみならず還元条件
下でも同一の分子量約４，５万ダルトンであった。上記
結果はＣＨＯ−ＵＫ　１１−７細胞由来の変異ヒトＰＬ
ＩＫは分子量約４，５万ダルトンを有する一本鎮構造を
とっていることを示した。

■　酵素感受性 ウロキナーゼ活性測定用合成基質Ｓ−２４４４（Ｋａｂ
ｉ社製）に対するアミド分解能を測定することにより、
ＣＨＯ−ＵＫ　ｌ　１−７細胞由来の変異ヒトＰＵＫの
ウロキナーゼ活性を測定した。なお対照として人尿ウロ
キナーゼを用いた。ＣＨＯ−ＵＫＩＩ−７細胞由来の変
異ヒトＰＵＫ、もしくは人尿ウロキナーゼｌμｇ／ｍｌ
を含む０．０５ＭＴｒ　１ｓ−Ｆ（Ｃｊ！１０．０３８
ＭＮａＣｆｆ１１０．２％［３Ｓ　Ａ／ａｌ１８．８／
ｇ液を調製し、これに各濃度のプラスミンを３７℃下１
時間作用させた後に発現されるウロキナーゼ活性を、合
成基質Ｓ−２４４４を用いて測定した（Ｊ、　Ｒｉｏｔ
、　Ｃｈｅｍ、、　２６０．１２３７７（１９８５））
、ＣＨＯ−ＵＫＩ　ｌ−７細胞由来の変異ヒトＰＵＫは
、それ自身はウロキナーゼ活性を示さなかった。しかし
、プラスミン処理をすることによりウロキナーゼ活性を
発現したく表５）０本酵素活性は抗ウロキナーゼポリク
ローナル抗体により失活された。このことから、ＣＨＯ
−ＵＫＩＩ−７細胞由来の変異ヒ）ＰＵＫはプラスミン
によってウロキナーゼ活性を発現する不活性型酵素であ
ることが判明した。

■　血中半Ｉ＆期 ＣＨＯ−ＵＫＩｍ−７細胞由来の変異ヒトＰｕｔＫと人
腎細胞由来Ｐ　Ｕ　Ｋ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅＩ
ｍ、、　２６０゜１２３７７（１９８５）　）の血中半
減期をラットにおいて比較した。ラットをエーテル麻酔
後、その頚動脈にカニユーレを挿入した。尾静脈に　１
標識ＣＨ○−ＵＫＩＩ−７細胞由来の変異ヒトＰＵＫも
しくは人腎細胞由来ＰＵＫＩＯ６ｃｐｍ投与後、頚動脈
に挿入したカニユーレから血液を経時的に一部採取し、
ラット血液に含まれる放射活性をガンマカウンターを用
いて測定した。ラット血中の放射活性の減衰曲線から求
めたＣｌｌ０−ＵＫ　ｌ　１−７１！１胞由来の変異ヒ
トＰＵＫの一次血中半′ｏＪｉ朋は約１０分であり、他
方対照の人腎細胞由来のヒ）ＰＵＫのそれ（約４分）よ
りも有意に長かった。

実施例２ （ＥＧＦドメイン欠失変異ヒ）ＰｔＪＫ遺伝子の作製）
Ａｓｎ−１０”Ｃｙｓ−４２とＡｓｎ−１０〜Ａｓｐ−
４５とへ５ｎ−１０−Ｔｈｒ−４９の３種類のＥＧＦド
メイン領域を除去したヒトＰＵＫの発現ベクターを作製
した。ヒトＰＬＪＫ遺伝子からのＥＧＦドメインコーデ
ィング領域の除去方法、及びそれらの動物細胞における
発現ベクターの構築方法の概略を図９に示した。

ヒトＰＵＫ遺伝子からのＥＧＦドメインコーディング領
域の近傍にあるＮｃｏｌとＴａｑ　１部位を利用し、こ
れらの領域の除去を試みた。まずヒ１−ＰｔＪＫ発現ヘ
クターｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫを１ｌｉｎｄｉＩＩと
Ｔａｑｌで消化し、Ｎ末から１０番目のＡｓｎまでのコ
ーディング領域を含む部分ヒ１−ＰＵＫ遺伝子フラグメ
ントを取り出し、これをプラスミドｐＢＲ３２２に挿入
してプラスミドｐＵＩ＋１を作製した。次に、ヒトＰＵ
ＫのＡｓｎ−５４からＮｅｔ−６７の領域をコードし、
かつ両末端がＣ１ａｌ及びＥｃｏＲ１部位である合成遺
伝子を作り、これをプラスミドルＵ旧に挿入することに
より、プラスミドｐ　Ｕ　ＩＩ　２を作製した。また、
この合成遺伝子上には特異的な制限酵素であるＳｆｉ１
部位を設けた。

合成遺伝子上のＳｆｉ［部位だけを含むＢａｍＨＩ　−
ＥｃｏＲ１フラグメントをＢＬＵＩＥＳＣＲＩＢＥプラ
スミドに挿入して、プラスミドｐ　［１＋１３を作製し
た。このｐＨｌ＋３の５ｆｉｌ−Ｃｌａｌ部位に、Ｃｙ
ｓ５０〜Ｇｌｙ−５３とＬｙｓ−４６〜Ｇｌｙ−５３と
Ｇｌｕ−４３〜Ｇｌｙ−５３をコードし、かつ両末端が
Ｃ１ａ＋およびＳｆｉ１部位である３種類の合成遺伝子
を挿入することにより、ＥＧＦドメイン領域が除去され
た部分ヒトＰＵＫ（Ｎ末〜Ｍｅｔ−６７）遺伝子を有す
る３種類のプラスミドｐＵＩ＋４〜６を作製した。次に
これらのＥＧＦドメインを除去した領域を発現ベクター
に組み込むため、まずｐ１１１１４〜６のＢａｍＨＩ−
ＮｃｏｌフラグメントとｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵにの１
ｌｉｎｄ　ｍ−Ｂａｍ旧を連結した。その後、これらの
フラグメントをｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵにの１ｌｉｎｄ
　ｍ　−Ｎｃｏｌ　ＺＪ［域に挿入して、３種類のＥＧ
Ｆドメイン欠失変異ヒトＰＵＫ用発現ヘククーｐＵＩ＋
７〜９を作製した。これら発現ベクター作製の詳細を以
下に述べる。

なお本実施例においてＤＮＡの制限酵素による消化は、
特に記さない限り１．３７℃−夜の反応にて行った。ア
ルカリ変性法（ｍｉｎｉ−ｐｒｅρ）により調製したＤ
ＮＡの消化は、１μｇのＤＮＡ当り５ｕｎｉｔｓの制限
酵素を用いて行った。各制限酵素のｂｕｆｆｅｒ組成に
ついては各々のメーカー指定に準じた。又リゲーション
はＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔｓ　　（タカラ酒
造）を用い、Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘ、２により１６
℃、１〜２時間反応した。

Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘ、２ ＯＮＡ　　ｆｒａｇｍｅｎｔ　　　　　　　　５．０μ
　！　　　（５００ｎｇ　　）−、フタ−ＤＮＡ　　　
　　２．５μｌ　　（２５０ｎｇ　）ｂｕｆｆｅｒ　Ａ
　　　　　　６０．０μ１ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ　　　　　
　７．５．ＬＩ　＋７５．０μｍ さらに塩基配列の決定は、アルカリ変性法により得たプ
ラスミドを用いて、Ｄｉｄｅｏｘｙ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ法によりＤＮＡの塩基配列を決定した。

（イ）オリゴヌクレオチドの合成 自動ＤＮＡ合成機を用いて９種類のオリゴヌクレオチド
を合成した。その内１つは、シーフェンス用プライマー
として利用し、残りは全て合成遺伝子として用いた。合
成したオリゴヌクレオチドは脱保護処理後、変性ゲル電
気泳動にかけ分離・精製した。精製したオリゴヌクレオ
チドの一部をとり、その５′末を”Ｐ標識して、その純
度を調べた。その結果、いずれの大きさのオリゴヌクレ
オチドも単一のバンドとしてみられた。

（ロ）アニーリング 互いに相補な配列をもつ合成オリゴヌクレオチドを以下
の条件でアニーリングし、４種類の合成遺伝子を作製し
た。このアニーリング反応は、ＲｅａｃｔＩｏｎ　ｍｉ
ｘ、１により７５℃で１０分間加熱後、３時間かけて２
０℃まで徐冷することにより行った。

Ｒｅａｃｔｉｏｎ　　ｍｉｘ、１ オリゴヌクレオチドａ　　　１０μｌ　　（１００ｐｍ
ｏｌ　）オリゴヌクレオチドｂ　　　１０．Ｌｌｌ　　
（］ＯＯｐｍｏｌ　）１０　ｘ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　＊
　　　　　３μｍ再蒸溜水　　　　　　　　７μｍ ３０μ！ １０　ｘ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ　＊ １００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ、　ｐＨ７，６５ｆｆ
ｉＭ　ＭｇＣｌ２ ｊｊ　ｐでそれぞれ５″末端を標識した５６−ｍａｒと
５４−ｍａｒのオリゴヌクレオチドを等モル混合し、７
５℃から２０℃に徐冷した後、電気泳動にかけ、そのア
ニーリング状態を調べた。その結果、フリーの一本ｔＮ
　Ｄ　Ｎ　Ａはほとんど存在せず、大半が二本鎖型とな
っていた。そこで、他のオリゴヌクレオチドも同様の条
件でアニーリングして部分遺伝子を作製し、種々のプラ
スミドへ挿入した。

（ハ）プラスミドｐ　Ｕ　Ｈ１〜３の作製プラスミドｐ
ＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵに上には、Ｔａｑ　１部位が多数
存在し、１回の制限酵素処理では、ＥＧＦドメイン近傍
のＴａｑ　１部位だけを切断することは困難である。そ
こでまずこのＴａｑ１部位を含むＤＮＡフラグメントを
取り出した。ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫを制限酵素１１
ｉｎｄ［［ＩとＢｇｌＤで消化し、アガロースゲル電気
泳動によりそのＤＮＡを調べた。泳動後ゲルよりＥＧＦ
ドメインコーディング領域を含む１．１ｋｂのＤＮＡフ
ラグメントをゲルから切り出し、そのＤＮＡを回収した
。次に、このフラグメントをＴａｑｌで部分消化し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。目的の７６０
ｂｐのバンドの存在を６′伍認した後、このＤＮＡフラ
グメントを回収した。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２をｔｌｉｎｄＨＩとＣ１
ａｌで消化し、４．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た
。そしてこのＤＮＡと先に調製した７６０ｂｐ　１ｌｉ
ｎｄｌｌｌ−Ｔａｑｌ　　ＤＮＡフラグメントをリゲー
シゴンした。このリゲーションにより、７６０ｂｐフラ
グメントの３°末端上に存在するＴａ４１部位は、Ｃｌ
ａｌ部位へと変換した。

反応後、この溶液を用いて大腸菌ＨＢＩＯＩ株をトラン
スフオームした。得られたトランスフォーマント２４株
より調製したＤＮＡをそれぞれＣ１ａ！及びＮｃｏ　Ｉ
で消化した。目的のプラスミドルＵ旧（図９）であれば
、Ｃ１ａ　［及びＮｃｏｌで共に−か所でのみ切断され
る。？ｉｉ気泳動にかけ調べたところ、６クローンが目
的のプラスミドであった。

ごのｐＵｌｌｌを［！ｃｏＲＩ　とＣ１ａｌで消化し、
アガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルより約５．０ｋ
ｂのＤＮＡフラグメントを回収し、このＤＮＡと（イ）
、（ロ）で調製した５６−＋ｗｅｒと５４−ｍａｒの合
成オリゴヌクレオチドのアニーリング産物とをリゲーシ
ョンした。そして、この反応液を用い、大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉをトランスフオームした。得られたトランスフォーマ
ント２０株よりＤＮＡを調製して、このＤＮＡをＮｃｏ
ｌ及びＥｃｏＲＩ　とｔｌｉｎｄｌ［Ｉで消化した。目
的プラスミドｐＵ１１２であれば、Ｎｃｏｌ消化により
約７００ｂｐのＤＮＡフラグメントが、またＥｃｏＲＩ
　とｌ１ｉｎｄｌｌｒの消化により、約８１０ｂｐのＤ
ＮＡフラグメントが生じる。泳動の結果、４クローンが
目的のプラスミドであった。

次にｐＨｌ＋２にはＳ目１部位が２か所隣接して存在す
ることから、合成遺伝子由来の５ｆｉ１部位を含むＢａ
ｌ１旧−ＥｃｏＲＩ　フラグメントを他のへフタ−へ移
した。まず、ｐＨｌ＋２をｕａｍｌｌｌ　とＥｃｏＲＩ
を用いて消化した。これをポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、ゲルより３３０ｂｐのＤＮＡフラグメント
を切取り、エレクトロエリューションにてＤＮＡを回収
した。

一方、プラスミドｎ１．１ＩＥｓｃＲＩ８Ｅ　（ＶＥＣ
ＴＯＲＣＬＯＮＩＮＧＳＹＳＴＥＭＳ製）をＢａｄｌ　
とＥｃｏＲＩで消化し、得られた約３．１ｋｂのＤＮＡ
フラグメントと先に調製した３３０ｂｐのＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ　フラグメントとをリゲーノヨンした。そし
て、この反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０５株をトラン
スフオームした。得られたトランスフォーマントより１
２株を選びそのＤＮＡを調製しＳｆｉｌ及びＣＩａ［で
消化した。目的のプラスミドｐｌＪＨ３であれば、５ｆ
ｉｌ及びＣ１ａｌで共に−か所でのみ切断される。電気
泳動の結果、８クローンが目的のプラスミドを有してい
た。

（ニ）プラスミドｐＵＨ４〜９の作製 プラスミドρＵＨ３のＣ１ａｌ−Ｓｆｉｌ　’ｐＭ域に
３種類の合成遺伝子をそれぞれ挿入することにより、Ｅ
ＧＦドメインを除去したヒ１−ＰＵＫの部分遺伝子を存
するプラスミド９１１１１４〜６の作製を試みた。先ず
、ρｕ１１３をＣ１ａｌと５ｆｉｌで消化し、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、エレクトロエリューションにて
約３．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを回収した。このフ
ラグメントと３種類の合成遺伝子とをそれぞれリゲーシ
ョンした。これらの反応液を用いて、大腸菌３１０５株
をトランスフオームした。得られたトランスフォーマン
トからそれぞれ１０株ずつ選び、ＤＮＡを調製した後、
Ｂａａ＋ＩＩＩ　とＥｃｏＲＩ　で消化した。

目的のプラスミドｐＵ８４〜６であれば、制限酵素消化
により、ｐＵＨ４では３６０ｂｐのフラグメントが、ま
たｐＨｌ＋５では３５０ｂｐが、ｐＨｌ＋６では３４０
ｂｐのフラグメントが生じる。アクリルアミドゲル電気
泳動の結果、ｐＵＨ４を２り０−７、ｐＨｌ＋５を２ク
ロー７、ｐｌＪｌ＋６を３クローン得ることができた。

そこで、これらのプラスミドを用いて、ＥＧＦドメイン
領域のＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、それぞれ
予定していた領域が除去されており、またその他のアミ
ノ酸配列に−よ変化がなかっ次に、これらｐ　Ｕ　Ｉ＋
　４〜６のプラスミドよりそれぞれＳＶ４０初朋遺初子
遺伝子プロモーター領域Ｆドメイン欠失変異ヒトＰＵＫ
の部分遺伝子を切り出し、動物細胞用ヒトＰＵＫ発現ヘ
ククーｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅｌｌＫへの導入を試みた。

ｐＵ旧〜６をそれぞれＮｃｏｌで切断後ＣＩＰ処理をお
こない、５°末端を脱リン酸化した。次に、これらのＤ
ＮＡをＢａｍ１ｌｌで消化した後ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、ｐＵＨ４からは３６０ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを、ｐＬｌｌ＋５からは３５０ｂｐ　、　
ｐＵＨ６からは３４０ｂｐ　（７）ＤＮＡ７ラグメント
を切り出し、エレクトロエリューションにてＤＮＡを回
収した。さらにこのＤＮＡと別途調製したプラスミドｐ
ＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅｔｌＫの４００ｂｐ　Ｂａ＋ｗ旧−
旧ｎｄ［［［フラグメントとをリゲーションし、反応終
了後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

一方、ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅｌｌＫを旧ｎｄｌｕとＮｃ
ｏ　Ｉで消化し、電気泳動にかけた。ゲルから約４．２
ｋｂのＤＮＡフラグメントを切り出し、エレクトロエリ
ューションにてＤ　Ｎ　Ａを回収した。そして、上述の
３種類のリデーソヨンサンプルそれぞれと、この４．２
ｋｂ１１ｉｎｄ　ｍ　−Ｎｃｏｌ　Ｄ　Ｎへフラグメン
トを再びリゲーションした。各反応液を用いて、大腸菌
ＩＩ　Ｂ　１０１株をトランスフオームした。各反応液
から得られたトランスフォーマントより托株ずつ選んで
Ｄ　Ｎ　Ａを抽出し、各ＤＮＡを旧ｎｄｍ及びｌｌ１ｎ
ｄ［Ｉとｌ１ｇ１ｌｌでｔ白化した。目的のプラスミド
ルＵ）１７〜９であれば、１１ｉｎｄｌｌｌ消化からは
約４．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが、また１１ｉｎｄ
ｌｌｌとＢｇｌ■との消化からは約１．０ｋｂのフラグ
メントがみられる。電気泳動の結果、ｐＨｌ＋７が３り
ｌ：ｌ−７、ｐＨｌ＋８が３クローン、ｐＨｌ＋９が５
クローン得られた。そこで各プラスミドごとに１クロー
ンずつ選んで、それぞれのプラスミドを大量調製し、さ
らに詳しくそれらの構造を分析した（表６）。その結果
、種々の制限酵素消化により得られるフラグメントの大
きさは、予想値と完全に一致した。このようにして、３
種類のＥＣＦドメイン欠失変異ヒトＰＵＫ用発現ベクタ
ーｐＵＩＩ７〜９を作製した。

上記の制限酵素処理断片の測定から、ＥＧＦドメイン以
外の部分には大きな欠失はないと考えられる。また、除
去した部分付近をシーフェンスしたところ、塩基配列に
変化はなかった。以上のことから、目的領域以外の箇所
には、欠失や変異は起こっていないと推定される。

（ホ）ＣＯ３７細胞によるＥＧＦドメイン欠失変異ヒト
ＰＵＫの生産 ｐＬ１１１７〜９の３種類の発現ヘクター各々２０μｇ
をそれぞれＣＯ５７細胞（３ｘ　１０６ｃａｌ　Ｉｓ）
に導入して、各発現産物の活性及び生産量を調べた（表
７）。

ＤＮＡを導入後、ＣＯＳ細胞は１０％ＦＣ５（ＧＩＢＣ
□ンを含むＤ−ＭＩＥＭ　　（日永製薬）およびｌＯに
１０７ｍ１のアプロチニン（ＳＩＧＭＡ　）を含む無血
・清培地で培養して、それぞれ７２時間後にサンプリン
グし、フィブリン寒天平板法によりプラスミノーゲンア
クチベータ活性を、またＲＰＩＩＡ　ａｓｓａｙ法によ
りその抗原量を調べた。その結果、各クローン共に血清
の有無にかかわらず約２００１υ／ｍｌの産生量を示し
、また生物活性値と抗原量から換算した活性値との間に
大差がなかった。以上のことから、ＥＣＦドメインを除
去してもプラスミノーゲンアクチベータ活性の発現には
影響がでないことが示唆された。

（へ）ＥＧＦドメイン欠失変異ヒトＰＬＪＫ発現ベクタ
ーのＣＨＯ細胞への導入 ３種類の変異ヒトＰＵＫ発現ベクターｐＵＨ７〜９をＣ
ｌｌ０　Ｋｌ細胞（＾ＴＣＣ，ＣＣＬ６１　）に導入し
た。

プラスミドｐＵＩ＋７〜９をＤＮＡ−リン酸カルシウム
沈澱法にてｐＳＶ−Ｇｌ−ｎｅｏと共にＣｌｌ０　Ｋｌ
細胞に導入した後、６４１８耐性コロニーを含む培地中
で培養した。

得られたＧ４１８耐性コロニーをそれぞれクローニング
シリンダー法で９６穴プレートへと移した。各プラスミ
ドの導入効率は、ｐＨｌ＋７が１．２ｘｌｏ−”　（ｃ
ｏｌｏ−ｎｉｅｓ／μｇ　／ｄｉｓｈ）　、ｐＵＩ１８
が３．２ｘｌＯ−’　（ｃｏｌｏｎｉｅｓ／μｇ　／ｄ
ｉｓｈ）　、ｐυ１１９が３．９ｘｌＯ−”　（ｃｏｌ
ｏｎｉｅｓ／μｇ　／ｄｉｓｈ）であり、３プラスミド
の間に大きな差はなかった。

次に、トランスフェクションにより得られたＧ４１８耐
性コロニーの９６穴プレート培養上清中のＰｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　’（Ｐ　Ａ）活性を
フィブリン寒天平板法で調べた。各プラスミドごとに約
１３０クローンのＰＡ産生量を調べたところ、２５［Ｕ
／ｍ１以上の産生を示したクローンがｐ　Ｕ　１１７で
は１０クローン、ｐ　Ｕ　Ｉｔ　８では８クローン、ｐ
　Ｕ　Ｉｔ　９では１６クローン得られた。特にｐＨｌ
＋９では１００［１１／ｍ１以上の高産生を示すものも
得られた。しかし、９６穴プレート中では、各クローン
の増殖状態に差があり、正確な産生量の比較はできなか
った。そこで、これらクローンを５ｃａｌｅ−ｕｐＬ、
産生量を比較した。各クローンともに１０％ＦＣＳを含
むｌｌａｍ’ｓ　Ｆ１２培地で培養し、ｃｏｎｆｌｕｅ
ｎｔになった状態での産生量を調べた。その結果、ｐＵ
Ｈ７のトランスフェクションからは、最高約１００１υ
／ｍＩ／ｄａｙの産生量を示すクローン＋１７−２株が
、またｐＨｌ＋９からは、約１３０１［１／ｍｌ／ｄａ
ｙの産生量を示すクローンＵ９−２５株が得られたが、
ｐＨｌ＋８からは、３０１１［１／ｍｌ／ｄａｙの産生
量のクロー７０８〜６５株が得られなかった。また、こ
れらクローンの培養上清中のＰＡ活性は、全て抗ウロキ
ナーゼポリクロナール抗体で完全に中和された。３種類
の変異ヒトＰＵＫ高産生株１７−２．　Ｕ３−６５．１
１９−２５をしばら（培養を続け、産生量の変化を調べ
たところ、υ９−２５株は約１か月間その産生量に変化
はなかった。これらの高産生株について、再スクリーニ
ングをおこなった結果、Ｕ７−２株からは２２２１０　
／’ｍｌ／１ｌａｙの高産生を示すクローンＬＩ７−２
−２３株が、０８−６５株からは５２１０　／　ｍｌ　
／　ｄａｙの産生を示すクローン０８−６５−３４株が
、［９−２５株からは、２００１１Ｊ／ｍｌ／ｄａｙの
高産生を示すクローン１１９−２５−６株が得られた。

また、これら再スクリーニングにより得られた株は全て
、約１か月間の継代後も産生量の低下はみられなかった
。

（ト）培養方法 Ｃ−６８−５３細胞及び変異ヒ）ＰＩＪＫを産生ずるＣ
Ｈ○細胞は、Ｆｅ２を１０％含むｌｌａｍ’ｓ　Ｆ１２
１！？地で継代した。性状分析用、活性測定用として以
下のような培養を行った。まず、Ｆｅ２を１０％含むＩ
ｌａｍ″５Ｆ１２培地でｃｏｎｆ　１ｕｅｎ　Ｌになる
まで細胞を増殖させ、次に血清を含まない同培地で２〜
３回細胞をよく洗浄し、血２ｇ成分をできる限り除いた
。その後、血清を含まない同培地及び１％ＦＣ３を含む
同培地で２〜３日間維持培養した。また、プロテアーゼ
阻害剤を添加する場合は、アプロチニンをｌ０ＫＩＵ／
　ｍ　ｌになるように加えた。培養終了後、培養上・清
をとり、遠心（３，００Ｏｒｐｍ、　５分間９ロ立０５
１’−２１１３卓上遠心機）にかけ、使用直前まで一４
０℃で凍結保存した。

各変異ヒトＰｔＪＫ産生Ｃ１１０細胞株の無血清培養に
おける培地及び添加剤の効果を調べる実験は、以下の方
法で行った。ｐｃｓを５％含むｌｌａｍ’５Ｆ１２培地
、Ｆ１２−ＭＷ培地（ｌｌａｍ’ｓ　Ｆ１２とＭｏｄｉ
ｆｉｅｄ　Ｗａｙｍｏｕｔｈの混合培地）、旧ＴＣ培地
に各細胞を１！！濁し、７５ｃｍ２フラスコ当り、２ｘ
１０６の細胞を植え込んだ。培養２日後、各無血清培地
で３回洗浄した後、各種添加剤を含む無血イ・ｕ培養液
を２５ｍ　ｌフラスコに注入した。以後、２日毎に新鮮
な培養液に交換した。

（チ）変異ヒトＰＵＫの性状分析 各細胞を（Ｈ（ＩｕｅｎＬになるまで増殖させた後、１
％ＦＣ３を含む培地、無血清培地、無血清培地に更にア
プロチニンを添加した培地の３種類を用いて維持培養し
、そしてこれらの培養上清をＦｉｂｒｉｎａｕ　ｔｏｇ
ｒａｐｈｙにかけた。その結果、全変異ヒトＰＵＫ産生
株の培養上清から分子量４５，０００付近にＰＡ活性を
示すバンドがみられた。また、無血清培養の上清からは
、分子ｆｆ１４５，０００付近にのみバンドがみられた
が、１％ＦＣ５存在下で培養した上清からは、僅かでは
あるが低分子を示すハンドと高分子複合体を示すバンド
がみられた。

次に、上述と同し培養上２Ｋを用いてＷｅｓ　ｔｅｒｎ
Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。各培養上清をそれぞれＳＯ
３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、その後抗
ウロキナーゼポリクロナール抗体を用いてＨｅｓ　ｔｅ
ｒｎ旧ｏｔｔｉｎｇ解析した。その結果、ロアー２．０
８−６５．　Ｌ１９−２５株の培養上清からは、主に分
子、５１４５．０００付近に抗体と反応するバンドがみ
られた。また、還元処理をおこなっても、これらのバン
ドの低分子側への移行は認められなかった。一方、天然
型ヒ１−ＰＵＫの産生細胞であるＣ−６８−５３の培養
上清がらば、分子１５０，０００付近に還元、非還元と
もに単一のバンドがみられ、尿由来の高分子型ウロキナ
ーゼがらは非還元時には分子１５０，０００、還元時に
は分子Ｌｔ３３．０００のところに単一のバンドがみら
れた。

以上の結果、ＣＨＯ細胞より産生された３種類の変異ヒ
１−ＰＵＫは、全て分子量約４５，０００の一本鎖型と
して産生されていることが判明した。また、天然型ヒト
ＰＵＫとの分子量約５．０００の差は、除去したＥＧＦ
ドメインａ域のアミノ酸数（約４０個）から換算される
分子量の値と一致した。

無血清培養及びｌＯ％ＦＣ３を含む培養の各培養上清を
用いてＦｉｂｒｉｎ−ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ法により、
ＰＡ活性を、ＲＰＨＡ法によりその抗原量を調べた。そ
の結果、各クローンともに血清の有無にかかわらず、生
物活性値と抗原量から換算した活性値との間に大差はな
かった（表８）。

以上のことから、ＥＧＦドメインを除いてもＰＡ活性の
発現には影響がでないことが示唆された。

次に、ＣＨＯ細胞より産生された３種類の変異ヒトＰＵ
Ｋがプロエンザイムであるが、またプラスミンにより天
然型ヒトＰＵＫと同様の活性化が起こるかについて調べ
た（表９）。その結果、各クローンともにプラスミン未
処理の場合は、ウロキナーゼ活性が検出できなかった。

さらに、天然型ヒトＰＵＫの活性化と同条件のプラスミ
ン処理により、全クローンともフィブリン寒天平板法で
得られた活性値と同程度にまでウロキナーゼ活性が上界
した。

以上のことから、これら変異ヒ）ＰＵＫは全てプロエン
ザイムとして産生され、さらに、天然型ヒトＰＵＫと同
条件のプラスミン処理で充分活性型に変換されることが
判明した。

（す）精製方法 ＣｈｅｌａＬｉｎｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ（１０
０ｍｌ）を２．５ｘ２０ｃｍのカラムに充填して５００
ｍ　ｌの０．０５Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｎａ０１１．　ｐ）！
８．０．５００ｍ１（７）ｌ１２０　テｌｌｉ次洗浄後
、５００ｎ＋１　＋７）０．０３５ＭＺｎＣ＋２　、ｐ
Ｈ４，２を注入してＺｎ”＋イオンをゲルに結合させた
。未結合Ｚｎ’＋イオンを１（ｚＯで洗い流した後、カ
ラムは０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＩ、　ＩＭ　Ｎａ
Ｃ１，ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（ＩＯＫＩＵ／ｍｌ）、　　
０．０１　　％Ｔｗｅｅｎ　８０＋　　ｐＨ７，５（ｂ
ｕｆｆｅｒ八）で平衡化した。次いで変異ヒトＰＵＫを
産生するＣＨ○細胞の無血清培養上清を、ペリスタポン
プを用いて流速２００ｍ１／ｈｒ　（４０ｍｌ／ｈｒ／
ｃｍ２）でカラムにン主人した。Ｓ式料をチャージした
カラムは一旦ｂｕｆｆｅｒ　Ａで洗浄したのち、ｂｕｆ
ｆｅｒ　Ａ、　１２０ｍ１と０．０５Ｍ　１ｍ１ｄａｚ
ｏｌｅを含むｂｕｆＩｅｒ＾、　１２０ｍ１　から成る
１ｍ１ｄａｚｏｌｅの直線濃度勾配により、変異ヒトＰ
ＩノＫを溶出した。同様の実験をＣｈｅｌａＬｉｎｇ　
５ｅ−ｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｃｏｌｕ
ｍｎ　（１００ｍｌ、２．５ｘ２０ｃｍ）を用いても行
った。但し、この場合、カラムへの変異ヒ）ＰｔＪＫを
産生ずるＣＨ○細胞の培養上清の注入流速は４００ｍ１
／ｈｒ　（８０ｍｌ／ｈｒ／ｃｍ２）とした。

次に、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ
　ｃｏｌｕｍｎ溶出活性画分を、ａｎｔｉ−ロＫ　Ｉｇ
Ｇ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｃｏｌｕｍｎ　（８ｍ
ｌ。

１．５ｘ４ｃｍ）に注入した。このカラムを０．５Ｍ　
ＮａＣｌ。

０、ＩＭ　　ｓｏｄｉｕｍ　　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、　
　０．０１　　％　Ｔｗｅｅｎ　　８０＋　　ｐＨ７，
０で洗浄した後、変異ヒトＰｔＪＫを０．５Ｍ　ＮａＣ
１゜０．２Ｍ　ｇｌｙｃｉｎｅ−１１ｃＩ、０．０１　
％Ｔｗｅｅｎ　８０．　ｐＨ２，５で溶出した。溶出活
性画分は固型Ｔｒｔｓを加え、ｐｌ＋を７．０に補正後
、更にｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−５ｅｐ
ｈａｒ−ｏｓｅ　６Ｂ　ｃｏｌｕｍｎ　　（２０１１１
１，５Ｘ１０ＣＩｌ＋　）に注入した。このカラムを０
．４Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，１Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ。

０、Ｏ１％Ｔｗｅｅｎ　８０．　ｐＨ７，０で洗浄した
のち、０．４ＭＮａＣ１，０，ＩＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａ
ＣｅｔａＬｅ＋　０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０＋ｐｌ＋
４．０で吸着物質を溶出した。この操作により、変異ヒ
）ＰｔＪＫは非喋若両分に回収された。

以上により、比活性２１１Ｕ／Ａ２ｔｏの無血清培地中
の変異ヒトＰＵＫは比活性６．９ｘｌＯ４Ｉｌｌ／八ユ
９Ｑにまで精製され、その精製度は２，４１１倍で回収
率は７１％であった。

（ヌ）変異ヒトプロウロキナーゼのアミノ酸配列Ｕ７−
２細胞株（プラスミドｐＵ１１７を導入したＣ（１０に
１細胞株）　、Ｏ８−６５−３４８ＪＢ胞株（プラスミ
ドｐＵｌ＋８を導入したＣｌｌ０　ＸＩ細胞株）および
ｆ１９−２５細胞株（プラスミドｐＵｌ！９を導入した
Ｃｌｌ０　Ｋｌ細胞株）の産生ずる各種変異ヒｌ−Ｐ　
Ｕ　Ｋのアミノ末端領域のアミノ酸配列を気相プロテイ
ンシークエンサーを用いて明らかにし、それを人腎細胞
由来ＰＵＫのアミノ酸配列（Ｋａｓａｉ、　Ｓ、、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｗ、　２６０
゜１２３８２　　（１９８５）　）と比較した（表１）
。

その結果、Ｏ７−２細胞株、１１８−６５〜３４細胞株
および１９−２５細胞株由来変異ヒトＰＵＫは、人腎細
胞由来ＰＵＫの＾５ｎ−１０−Ｃｙｓ−４２，Ａｓｎ−
１０−八５ｐ−４５およびＡｓｎ−１Ｏ−Ｔｈｒ−４９
の領域をそれぞれ欠失していることが判明した。さらに
これら変異ヒ１−ＰＵＫの分子量は約４５，０００であ
り、人腎細胞由来ＰＵＫの分子量約５０．０００よりも
約ｓ、ｏｏｏ小さかった。この分子量差は変異し）ＰＵ
Ｋの欠失アミノ酸数３３−４０と一敗した。以上の結果
からも、Ａｓｎ−１Ｏ−Ｔｈｒ−４９の領域以外には欠
失、変異などが起こっていないと推定される。

ｆル）血中半減期 実施例１に阜して同様に本実施例で得られた変異ヒｌ−
＋）　Ｕ　Ｋの血中半減期をもとめたところ、下記の通
りであった。

血中半減！ｌｌ１（分） 人腎細胞由来Ｐ　Ｕ　Ｋ　　　　　　　　　　１．６３
±０，０５Ａｓｎ−１０−Ｃｙｓ−４２’ＡＭ域欠失変
異Ｐ　Ｕ　Ｋ　　　８．２４±１．４６八５ｎ−１０−
Ａｓｐ−４５領域欠失変異Ｐ　Ｕ　Ｋ　　　６．２５±
０．３２八５ｎ−１０−Ｔｈｒ−４９Ｈ域欠失変異ＰＵ
Ｋ　　　７．１３±０．３３上の結果から、ＥＧＦドメ
イン領域を欠失じた変異ヒトＰＩＪＫは人腎細胞由来Ｐ
ＵＫよりも血中半減期が長いことがわかった。同様な結
果をウサギにおいても得た。これらの結果はＰＵＫ分子
中のＥＧＦドメイン領域はＰｔＪＫの体内での消長に大
きく関与していることを示唆する。さろに上記結果はＥ
ＧＦドメイン領域に存在するアミノ酸残基を他のアミノ
酸残基で置換することにより、ＰＵＫ分子中のＥＧＦド
メインの機能を…なった変異ヒ）ＰＵＫについても血中
半減期の延長が期待されることを示唆する。

実施例３〜５ 図１０　（大腸菌用変異ヒトＰＬＩＫ（Ａｓロー１０〜
八５ｐ−４５欠失）発現ベクターの作製）、図１１　（
枯草菌用変異ヒ）ＰＵＫ分泌発現ベクターの作製〕、お
よび図１２　（酵母用変異ヒ）ＰＵＫ発現発現ツクター
製〕に示したように、各々大腸菌用変異ヒ）ＰＵＫ　（
Ａｓｎ（１０）　〜Ａｓｐ（４５）欠失１発現用ベクタ
ー、枯草菌用発現ベクター、酵母用発現ベクターを作製
した。

なお、プラスミンによる活性化反応は、０．４ＣＩ／　
ｍ　Ｉのプラスミン濃度で３７℃下３０分間の加温によ
りおこなった。まず、プラスミン未処理及び処理サンプ
ル１００μにアプロチニン（２Ｘ１０’ＫＩＩＩ／ｍｌ
）　　５ＰＩｔを添加して活性化に用いたプラスミンを
失活させた。続いてｂｕｆｆｅｒ　Ａ　（０，０５Ｍ　
Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ。

０．０３８−ＮａＣ１，０，２％ＢＳＡ、　１１１１８
．８）６９５　ｄとＳ−２４４４水ン容ン１Ｎ　（１，
５ｍｇ／ｍｌ）　１００ＰＪを力■え、４０５ｎｍに於
ける吸光度変化を測定した。既知濃度の尿由来ウロキナ
ーゼ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　　ＧＣ
Ｃ，１＋１５０１Ｕ／ａｍｐｏｌｅ）の吸光度変化値と
比較することにより、各サンプルのウロキナーゼ活性値
を求めた。

〔作用・効果〕

本発明により、八５ｎ−１０＝Ｃｙｓ−４２の３３アミ
ノ酸の中に、血中半減期（主として肝細胞への取り込み
）に関与する領域〈アミノ酸配列）があると示唆された
。

この領域は、構造からみて八５ｎ−１０＝Ｃｙｓ−１９
とＶａｔ−２（１−Ａｓｎ−３２とＣｙｓ−３３〜Ｃｙ
ｓ−４２の３つの部分に分けることができる。＾５ｎ−
１０〜Ｃｙｓ−４２のＣｈｏｕ　ａｎｄＦａｓｍａｎ法
による２次構造分析および、この領域とホモロジーがあ
るエピダーマルグロースファクター　（ＥＧＦ）とその
レセプターとの結合に関する報告（Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ
＋　Ｍ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、　８１．７３６３．
　　（１９８４）　）等から、肝細胞への取り込みに関
係する領域はＶａｔ−２０〜Ｃｙｓ−４２の中にあると
考えられる。更に、＾５ｎ−１０〜Ｃｙｓ−４２のなか
でＣｙｓ−３３〜Ｃｙｓ−４２だけが親水性の筒いアミ
ノ酸領域であること、またエピダーマルグロースファク
ターのアミノ酸配列の中でこのＣｙｓ−３３〜Ｃｙｓ−
４２部分とホモロノーが高い領域（Ｃｙｓ−３３〜Ｃｙ
ｓ−４２）が、エピダーマルグロースファクターレセプ
ターとの親和性（結合）に関与しているという報告（Ｎ
ｅ５ｔｏｒ、　Ｊ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ
ｃｈ６ｍ。

［１ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１２
９．２２６　（１９８５）　）等から、このヒトプロウ
ロキナーゼのＣｙｓ−３３〜Ｃｙｓ−４２部分が肝細胞
への取り込みに関与していると推定される。

それゆえ、本発明においては、ヒトＰＵＫのＶａ　ｌ　
−２０〜Ｃｙｓ−４２の全領域もしくはその一部を欠失
、またはその一部を他のアミノ酸残基で置換されている
変異ヒトＰＵＫ、およびそれをコードするＤＮＡ配列、
ヒトＰＵＫのＣｙｓ−３３〜Ｃｙｓ−４２の全領域もし
くはその一部を欠失、またはその一部を他のアミノ酸残
基で置換されている変異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ
配列も又好適な対象となりうる。

本発明によりウロキナーゼの１ｊ；１駆体型の生理的倉
入を有した変異ヒ）Ｐ［ＪＫを提供可能にし、しかも該
変異ヒトＰＵＫは、既知ヒトＰＵＫ、ウロキナーゼに比
して血中内事滅朋を有意に延長可能とするものである。

このため本発明は、より理想的な綿維素溶解酵素を提供
するものであり、医療分野への大きな効果が１υＩ持さ
れる。

（以下余白） 賂く　： ＞　（Ｊ　　　、Ｊ　０　　　　！ロ　　＞＜　　　ｅ
）コ←−１！　　　＜←　　　−く　　−ｑ　　■（１
）←！！　　　＞ｕ　　　　１ｊ（Ｊ　　　ＬＩＩＪ　
　　　−Ｌ）（／ｌｄ　　　１．Ｑｌ−１：Ｉ＋Ｌｌ　
　　ｌｊｄ　　　　−ｕ８１＋＜＞ロ　　　−ロ　　α
口　　　く←−く　　υ←　　　ｃ５■　　くυ　　　
〉口αυ　　　α１ぺ　　　　　〉０く　　　α０　　
　　　α←（イ）ω　　工ω　　　−ｃ５＞＜＝ωψ←
　　１−＋　（Ｌｌ　ｕ　　　←←　　　←く工０　−
一　　　田υ　　田←　　　くυψく　　−ロ　　　＝
←　　８＋：←　　　−０ぺｃ５Ｌ＋口　　　山上　　
山上　　　く０脩＜：一 表１０ 人賢細胞山来ＰＵＫ；５ｅｒ−八５ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−１１ｉｓ−Ｇｉｎ−シミｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−へ５ｎ
−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ１７−２１１ｆ胞株山来変異
Ｐ　Ｕ　Ｋ　；　５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ｌ
ｌｉｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｕ８−６
５−３４ｔａＤ株由来変異Ｐ　Ｕ　Ｋ　；　５ｅｒ−Ａ
ｉｎ−Ｇｌｕ４．ｅｕ−１１ｉｓ−Ｇｌｎ−シミｌ−Ｐ
ｒｏ−５ｅｔ−Ｌ１９−２５細胞株由来変異ＰＵＫ；５
ｅｒ−＾５ｎ−Ｇｌｕ−１．ｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−人腎細胞由来Ｐ　Ｕ　Ｋ　；　
Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ４’
ｈｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｉｌｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇ
ｌｕυ７４７４細胞来変異ＰＵＫ；　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　−ＧｌｕｌｌＢ
−６５−３４細胞株由来変異ＰＵＫ　；Ｌｔ９−２５細
胞株由来変異ＰＵＫ； 本をイ＃己したアミノ酸残基は気相フ゛ロティンソーク
エンサーにより同定できなかった。

−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＧＩｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
Ｖａｌ−５ｅｒ４＝ｎ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｃ−５ａ
ｒ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｉｆｉｓ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ化ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−１１ｉｓ　ｒ’１１
ｃｍＴｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−１＋１ｅ−＾５ｐ−Ｌｙ
ｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓｌ−ＩＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−・
・・−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−＊−Ｔｙｒ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−八５ｎ−Ｇｌｙ−１１ｉｓ−・一本−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−ｌｌｉｓ−
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−・・・

【図面の簡単な説明】

第１図は、新しい制限酵素部位をもつヒトＰＵＫの発現
ベクターｐｓｌ−ＵＫＩＯの作製を示し、第２図は、ｐ
ＳＶ−Ｇｌ　−ｐｒｅＵＫの制限酵素地図を示し、第３
図は、ｐＳＶ−Ｇ（−ｐｒｅＩＪＫのｐｒｅＵＫｃＤＮ
Ａ近辺構造を示し、第４図は、ｐｒｅＵＫｃＤＮＡ断片
のＭｌ　３ｍｐ　１８ＲＦプラスミドへの挿入を示し、
第５図は開環プラスミドＭｌ　３−ＵＫＩ−ＱＣの作製
を示し、第６図はヒ）ＰＵＫ遺伝子への３ａｃ１部位と
Ｎｄｅ１部位の導入工程を示し、第７図は、変異ＰＵＫ
発現ベクターｐＳＶ−ＵＫＩＩの構造を示し、第８図は
プラスミドｐＳＶ−ＵＫ５０の制限酵素地図を示し、第
９図はｐＵＨ７〜９の調製工程を示し、第１０図は大腸
菌用、第１１図は枯草菌用、第１２図は酵母用の発現ベ
クターを各々示す。 第２図　ｐ　ＳＶ−Ｃｒ、−ｐｙｅｔＪｋのＰＩＦＪ鴇
５ｅｅｒ第３図ＰＳＶ−Ｃｒ、−ＰｒｅＬＬＫのＰＹｅ
−ＬＩＫｃＤＮＡ　）ｉｉ’ｌ　ｉａ！Ｓに　スアライ
シー／フ゛　シ゛インフシコンＳＳ　：　シク゛ナル　
ヅーフェンス 四Ｑ　：　ノンコーチ゛４〉グ　リーレ゛７ン↓Ｋｐｎ
Ｉ　　ダインを又シクン 第１図 新しい？Ｉ７’固色丙４ト弊＜ｒｒｔ、いヒトＰｕべの
発現べ゛ゲター ｐｓＶ二ｕＫ；ｆｏのｔ下！ 第θ図プラスミドｐＳＶ−ＬＪＫ５０めも１１服閾毛ｓ
ｅ６實ｉわＡ（１）からり弓′く ↓殆ジ敞シｉン ↓ ２ｒ９回（３）　ｌ＝っ弓′く 第９図（２） 合成オリゴヌクレオナト ＣＹＳ　ＴＹＲＧＬＵ　ＧＬＹ ＬＹＳ　　ＳＥＲＬＹＳ　Ｔｌ（ＲＣＹＳ　　ＴＹＲＧ
ＬＵ　ＧＬＹＧＬＵ　工ＬＥ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＳＥＲ
ＬＹＳ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＹＲＧＬＵ　ＧＬＹＣ１ａ工 ２番９図（２）や・ら　っ孜 ”　　　　　　　０１（ １１ｉｎｄｌｌｌ　　　　　　［ｌａ＋ｕＨＩ　　［ｌ
ａ＋ｎ１ｌｌ　　　　　　　Ｎｃａ１１０■Ｉ−−Ｕぜ ソ７−シコン 第９図（３） 拶 区 Ｏ 社 ξＳ弓象 −Ｊ′−３ダε（市正吉（自発〕 昭和６２年５月２ｓ口

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   ァクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ
   ｔｏｒ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域もしくはそ
   の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
   アミノ酸残基で置換されている変異ヒトプロウロキナー
   ゼ。
2. （２）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   ァクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒａｃ
   ｔｏｒ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域もしくはそ
   の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
   アミノ酸残基で置換されている変異ヒトプロウロキナー
   ゼをコードするＤＮＡ配列。
3. （３）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   ァクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ
   ｔｏｒ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域もしくはそ
   の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
   アミノ酸残基で置換されている変異ヒトプロウロキナー
   ゼをコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミド。
4. （４）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   ァクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ
   ｔｏｒ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域もしくはそ
   の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
   アミノ酸残基で置換されている変異ヒトプロウロキナー
   ゼをコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミドに
   よって形質転換された宿主。
5. （５）宿主が動物細胞である特許請求の範囲第（４）項
   記載の宿主。
6. （６）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   ァクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ
   ｔｏｒ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）の全領域もしくはそ
   の一部を欠失、または該全領域もしくはその一部を他の
   アミノ酸残基で置換されている変異ヒトプロウロキナー
   ゼをコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミドに
   よって形質転換された宿主を発現させることからなる変
   異ヒトプロウロキナーゼの製造方法。