JPH01104167A - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮１」ぼりｔ１立野 ２、）発明は、新規４組織ブ、８．ッーゲッ活性　　　
３化因子に関するものである。詳細には、プラスミノー
ゲンを、血栓のフィブリン網目構造を崩壊さ　　　」せ
て可溶性生成物を生ぜしめるプラスミンへ転　　　置換
させる強い活性をもち、血栓溶解剤として有用な、新規
な組織プラスミノーゲン活性化因子、それのアミノ酸配
列を一一ドするＤＮＡ、それの製造　　に法およびそれ
を含有する医薬組成物に関するものである。　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ｄ来の　　およびこ
の　明が　決しようとする司天然のヒト「組織プラスミ
ノーゲン活性化因子。

（以下’　ｔ−ＦＡ　、、という）の全アミノ厳配列お
よび構造ならびにヒトメラノーマ細ｆｍ　（Ｂｏｗｅｓ
　）　Ｇ、：　由来するそれをフードするＤＮＡ配列は
、組換えＤＮＡ技術によって既に明らかにされている［
Ｎａｔｕｒｅ　３０１゜≧１４　（１９８３）参照］。

しかしながら、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸配列を犬膓腸で
発現させて得られた天然ｔ−ＰＡはりホールディングが
困難で、従って、培養大腸菌細胞からは油虫なｔ−ＰＡ
は極めて少量しか回収できない。

明の　成および この発明の発明者らは、種々研究の結果、たとし、組換
大腸菌細胞から得たものであってもよくノホールディン
グされる活性なｔ−ＰＡを与え、天然−ＰＡよりも長い
半減期を呈いさらに血栓溶解油ｔも優れた新規ｔ−ＰＡ
を創製することに成功した。

この発明の新規ｔ−ＰＡは、その一次構造としての（の
アミノ酸配列（Ｉ）によって表わすことができる． Ｒ−ＧｌｕＧｌｙＡｓｎｓａｒＡｓｐＣｙｓ＋ＴｙｒＰ
ｈｅＧ１ｙＡｓｎＧｌｙＳ　ｅｒＡｌａＴｙｒＡｒｇＧ
ｌｙＴｈｒＨｉｓＳｅｒＬｅｕＴｈｒＧ１ｕＳｅｒＧｌ
ｙＡｌａｓ＠ｒｃｙｓＬｅｕＰｒｏＴｒｐＡｓｎｓｅｒ
ＭａｔＩ１ｅＬｅｕ工１ａＧｌｙＬｙｓＶａｌＴｙｒＴ
ｈｒＡｌａＧ１ｎＡｓｎＰｒｏｓｅｒＡ１ａＧｌｎＡｌ
ａＬｅｕＧ１ｙＬａｕＧ１ｙＬｙｓＨｉｓＡｓｎＴｙｚ
ｃｙｓＡｒｑ．Ａｓ　ｎＰｒｏＡｓｐＧｌｙＡｇｐＡｌ
ａＬｙｓＰｒｏＴｒｐｃｙｓＨｉｓＶａｌＬｅｕＬｙｓ
ＡｓｎＡｒｇＡｒｇＬａｕＴｈｒＴｒｐ２６０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２フσＶａｌＧ１ｕＬｙｓＴｙｒ工１ａＶａｌＨｉｇ
ＬｙｓＧｌｕＰｈｅＡｓｐＡｓｐＡｓｐＴｈｒＴｙｒＡ
ｓｐＡ１ｉｎＡｓｐ工ｌｓＡｌａＬａｕｌ，ａｕＧｌｒ
＋ＬｅｕＬｙＳＳｅｒＡｓｐｓａｒＳｓｒＡｒｑＣｙｓ
ＡｌａＧ１ｎＧ１ｕｓ＠ｒＳｅｒＶａｌＶａＩＡｔｑＴ
ｈｒＶａＩｃｙｓＬｅｕＰｒｏＰｒｏＡｌａＡｓｐＬｅ
ｕＧ１ｎＬａｕＰｒｏＡｓｐＴｒｐＴｈｒＧ１ｕｃｙｓ
Ｇ１ｕＬｅｕｓｅｒＧｌｙ４２０　　　　　　　　　　
　　　４３ＧＴｙｒＧ１ｙＬｙｓＨ１ｓＧ１ｕＡＬａｉ
Ｌ＠ｕＳｅｒＰｒｏＰｈａτｙｒＳａｒＧ１ｕＡｒｇＬ
ａｕＬｙｓＧｌｕＡ１ａＨｉｓＶａｌＡｒｇＬａｕＴｙ
ｒＰｒｏＳｅｒＳｅｒＡｒｇＣｙｓＴｈｒｓｅｒＧ１ｎ
Ｈｉｓｆ，＠ｕＬｅｕＡｓｎＡｒｑτｈｒＶａｌＴｈｒ
Ａｓｐ４６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　４フＯＡｓｎＭｅｔＬｅｕＣｙｓＡ
１ａＧｌｙＡｓｐＴｈｒＡｒ＋％ｓｒＧｌｙＧ１ｙＰｒ
ｏσｉｎＡ１ａＡｓｎＬａｕＨｉｇＡｓｐＡｌａＣｙｓ
Ｇ１ｎＧｌｙＡｓｐＳｅｒＧ１ｙＧｌｙＰｒａＬｅｕＶ
ａ　ｌｃｙｓ　ＬａｕＡｇｎＡｓ　ｐＧ　ｌｙＡｒｇＭ
ｅｔＴｈｒＬｓｕＶａ　ｌＧｌｙＩｌｅ　Ｘ　１ｅＳｅ
ｒＴｒｐＧｌｙＬａｕＧｌｙＣｙ　ｓＧ１ｙＧｌｎＬｙ
ｓＡｓ　ｐＶａｌＰｒｏＧ　ｌｙＶａｉＴｙｒＴｈｒＬ
ｙ　ｓＶａｌＴｈｒＡｓｎＴｙｒＬｅｕＡｓｐＴｒｐ工
１ｅＡｒｇＡｓｐＡｓｎＭａ七ＡｒｑＰ．ｒｏ（式中、
ＲはＳｅｔ−または ＣｙｇＴｙｒＧ１ｕＪＶｐＧｌｎＧｌｙＩ　ｌｅＳａｒ
ＴｙｒＡｒｑＧ１ｙＴｈｒＴｒｐＳａｒＴｈｒＡｌａＧ
１ｕＳ＠ｒＧｌｙＡｌａＧ１ｕＣｙｓＴｈｒＡｓｎ？ｒ
ｐＡｓｎＳａｒＳｅｒＡｌａＬｅｕＡｌａＧｉｎＬｙｓ
’　ＰｒＯＴｙｒｆ３＠１：Ｇｌｙ社ｑｋｒｑＰｒＯＡ
ｍｐｋＬａ工１ａＡｒｇＬｅｕＧｌｙＬｅｕＧ１ｙＡｓ
ｎＦＩＬｓＡｓｎＴｙｒＣｙｓＸは−Ｌｙｓ−、一Ｉ１
＠−または結合手であり、Ｙは−ＴｙｒＳｓｒＧｌｎＰ
ｒｏＧ１ｎｐｈｅＡｒｇ工１＠＋，　−ＴｙｒｊｅｒＧ
１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈｅＡｓｐｘｌｅ＋，−ＴｙｒＳｅ
ｒＧｌｎＰｒｏ工１＠ＰｒｏＡｒｇｓｅｒ−會タハ−Ｔ
ｈｒＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｈｅＬｙｓｘｌａ−で
ある） 上記アミノ酸配列におイテ、Ａ，ｎ１８４、ＡＳｎ２１
８およびＡ，０４４８は、組換えＤＮＡ技術における宿
主細胞の種類に応じてグリコシル化されたものが製造で
きるが、そのようなｔ−ＦＡもこの発明の範囲に包含さ
れる． なお、この明細書において、ｔ−ＦＡのアミノ酸配列の
番号付けは、特に断わり書きのな！／）限り、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３０１．　２１７　（１９８３）に記載されてい
る天然のｔ−ＰＡの番号付けに従う．例えばＡ，ｎ１８
４は天然のｔ−ＦＡのアミノ酸配列における第１８４番
目のアミノ酸であるアスパラギンを意味する． この明細書においては、便宜上この発明の新ｔ−ＦＡに
ついて次のコード名を使用する．ＴＴｋｔＰＡ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがＳｅｔ一であり
、Ｘが−Ｌｙｓ一であり、Ｙが −　ＴｙｒＳａｒＧ１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈｅＡｒｇＩ１
ｅ−であるｔ−ＰＡを意味する． ＴＴｉｔＰＡ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがＳｉｒ−であり
、Ｘが一Ｉ１ａ−であり、Ｙが −　ＴｙｒＳｅｒＧ１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈｅＡｒｇＩＬ
ｇ−であるｔ−ＰＡを意味する． Ｋ旦ハ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然ｔ−ＰＡの
ＣｙＳ９２からＳｅｒ１７４−までからなる残基であり
、Ｘが−Ｉ１ａ−であり、Ｙが −　ＩｙｒＳｅｒＧ１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈａＡｒｇＩ１
ａ−であるｔ−ＦＡを意味する． 臭止り猶 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然ｔＰＡのＣ
ｙｓ９２からＳｅｒ１７４−までからなる残基であり、
Ｘが−Ｌｙｓ−であり、Ｙが −　ＴｙｒＳｅｒＧ１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈｅＡｒｇＩ１
ａ−であるｔ−ＰＡを意味する． ＳＴＴｋｔＰＡ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがＳｉｒ一であり
、Ｘが−Ｌｙｓ一であり、Ｙが 一ＩｙｒＳａｒＧ１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈ＠ＡｓｐＩ１ｃ
−であるｔ−ＰＡを意味する． ｇ堡坐ハ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然ｔＰＡのＣ
ｙｓ　　からＳｅｒ１７４−までからなる残基であり、
Ｘが−Ｌｙｓ一であり、Ｙが　゛ −工ｙｒＳｅｒＧ１ｎＰｒｏＧ１ｎＰｈｅＡｓｐＩ　ｌ
ａ−であるｔ−ＰＡを意味する． 酊交匹ハ 上記アミノ酸配列（Ｉ＞において、Ｒが天然ｔＰＡのＣ
ｙｓ　　から５ｅｒ１７４−までからなる残基であり、
Ｘが一１１＠−であり、Ｙが −ＴｙｒＳｅｒＧｌｎＰｒｏＧｌｎＰｈａＡｓｐｌｌｅ
−であるｔ−ＰＡを意味する。

ｔｈＴＩｔＰＡ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが５ａｒ−であり
、Ｘが結合手であり、Ｙが −ＴｙｒＳａｒＧｌｎＰｒｏＺｌｅＰｒｏＡｒｇＳｅｒ
−である−−ＰＡを意味する。

ＴＴｔＰＡ 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが５ａｒ−であり
、Ｘが−Ｌｙｓ−であり、Ｙが 一τｈｒＬｅｕＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｈｅＬｙｓＩ　ｌ
ｅ−であるｔ−ＰＡを意味する。

天然のｔ−ＰＡは、単一のジスルフィド結合で結合され
るＨおよびＬ鎖の２鎖形態にプラスミンによって転換さ
れるところの単鎖セリンプロテアーゼである。軽鎖（Ｌ
）はプロテアーゼドメインであり、従ってこの酵素の活
性部位を含んでいる。重鎮（Ｈ）はフィンガードメイン
（Ｆ）（フィブロネクチン対して相同性をもつ）、成長
因子ドメイン（Ｅ）〈表皮成長因子と相同性）および３
つのジスルフィド結合をもつ２つのクリングル（すなわ
ちクリングル１およびクリングル２ドメイン；Ｋ　およ
びに２）を有する。従って、天然のｔ−ＰＡは５つの機
能性ドメインＦ、Ｅ、に１、Ｋ２およびＬからなる［ヨ
ーロッパ特許出願公開公報第０１９６９２０号およびＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
　８３．４６７０（１９８６）参照コ。

それゆえ、この発明は、 （１）フィンガードメインおよび成長因子ドメインを欠
く、グリコジル化されていないｔ−ＰＡおよび（２）　
フィンガードメインおよび成長因子ドメインを欠さ、ヒ
トおよび動物起源の他の蛋白質を本質的に含まない一−
ＰＡ をも提供するものであることを理解されたい。

上に定義したｔ−ＰＡは、天然ｔ−ＰＡのＨ鎖のクリン
グル１およびクリングル２ドメインおよびＬ鎖からなる
ｔ−ＰＡならびに該ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の欠失また
は置換によって調製されたｔ−ＰＡ　（たとえば、天然
ｔ−ＰＡのＨ鎖のクリングル２ドメインとＬ鎖とからな
るｔ−ＰＡ、　Ｌｙｓ２７７が工１ｅ２７７で置換きれ
ており、および／またはＡｒｇ２７５がＧ１ｙ２７５、
Ｇ１ｕ２７５、Ａｓｐ２７５等で置換されている上に例
示したｔ−ＰＡ　）を包含する。

この発明の新規ｔ−ＰＡは、組換えＤＮＡ技術およびポ
リペプチド合成によって製造される。

すなわち、この発明の新規なｔ−ＰＡは、該新規１−Ｐ
Ａのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる発現
ベクターで形質転換した宿主細胞を培地に培養し、培養
物から該新規ｔ−ＰＡを採取することによって製造でき
る。

上記製造法の詳細を以下に説明する。

宿主細胞は、微生物［細菌（たとえば、大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）、枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）、等）、酵母（たとえばパ
ン酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃａｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　）、等コ、培養ヒト細胞および培養動物細胞
（たとえばＣＩＯ細胞、Ｌ９２９細胞、等）および培養
植物細胞を包含しうる。微生物の好ましい例は細菌、と
くにエシェリヒア属に属する菌株（たとえば≧、　ｅｏ
ｌｉ　ＨＢＩＯＩＡＴＣＣ３３６９４，ｇ、　ｃｏｌｉ
　ＨＢＩＯＩ−１６ＦＥＲＭ　ＢＰ（８７２゜Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　　２９４　ＡＴＣＣ３１４４６，Ｅ、ｃｏｌｉ　
Ｘ　　１７７６　ＡｌＣＣ３１５３７、等）パン酵母、
動物細胞（例えばマウスＬ９２９細胞、チャイニーズ・
ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞等）などが含まれ
る。

細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターは、通常、少なくともプロモーター・オペレ
ーター領域、開始フドン、新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列
をフードするＤＮＡ、終止フドン、ターミネータ−領域
および自己複製可能ユニットから構成されるの示通常で
あり、酵母や動物細胞を宿主細胞として用いる場合には
、発現ベクターは少なくともプロモーター領域、開始コ
ドン、シグナル・ペプチドおよび新規ｔ−ＰＡのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡならびに終止フドンから構成
きれるのが好ましく、さらにエンハンサ−配列、天然ｔ
−ｐＡの５′−および３′−非コード領域、スプライシ
ング・ジャンクション、ポリアデニル化部位および自己
複製可能単位を挿入することもできる。

ブロモ−クー・オペレーター領域は、プロモーター、オ
ペレーターおよびシャインーダルガーノ（ＳＤ）配列（
たとえばＡＡＧＧ、等）からなり、プロモーター・オペ
レーター領域の例としては、慣用のプロモーター・オペ
レーター領域（たとえば、ラクトースオペロン、ＰＬ−
プロモーター、ｔｒｐ　−プロモーター、等）が挙げら
れ、哺乳動物細胞における新規ｔ−ＰＡの発現のための
プロモーター領域としては、ＨＩＬＶ−プロモーター、
ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＬＴＲ−プロモ
ーター、マウス・メタロチオネインＩ（ＭＨＩ）−プロ
モーターおよびワタシニアープロモーター等が挙げられ
る。

好ましい開始コドンはメチオニンコドン（ＡＩＧ）が挙
げられる。

シグナル・ペプチドをフードするＤＮＡとしてはｔ−Ｐ
ＡをコードするＤＮＡが挙げられる。

新規ｔ−ＰＡまたはシグナル・ペプチドのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは、たとえば、ＤＮＡ合成装置を用
いての部分または全ＤＮＡ合成あるいは形質転換体［た
とえば≧１羽晶ＬＥ　３９ｚａｊ　　（ｐＴＰＡ２１）
。

≧、虹晶ＪＡ　２２１　（ｐＴＰＡ２５）　ＡＴＣＣ３
９８０８，互、臼其ＪＡ　２２１　（ｐＴＰＡ１０２）
　（Ｌｙｓ　２７７−１１ａ）　ＡＴＣＣ３９８１１旦
、臼旦ＪＭ　１０９　（ｐ５１Ｈ）　ＦＥＲＭ　Ｐ−９
７７４，≧、臼旦ＪＭ　１０９（ｐＮ５３）　ＦＥＲＭ
　Ｐ−９７７５、互、臼旦ＤＨ−１（ｐｓＴ１１２）　
ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９６６等］から得られるベクター［
たとえば、ｐτＰＡ２１、ｐＴＰＡ２５、ｐτＰＡ１０
２（Ｌｙｓ　２７７　→ｌ１ｅ）、　ｐ５１Ｈ，ｐｓＴ
１１２等コに挿入された天然または変異ｔ−ＦＡをコー
ドする完全なりＮＡ配列またはゲノムの常法による処理
（たとえば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスフ
ァターゼによる脱燐酸、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いたラ
イゲーション）によって調製することができる。

終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たとえ
ばＴＡＧ％ＴＧＡ、等）が挙げられる。

ターミネータ−領域としては、天然または合成のターミ
ネータ−（たとえば、合成ｆｄファージターミネーター
１等）が挙げられる。

自己複製可能ユニットとしては、それに属する全ＤＮＡ
を宿主細胞中で自己複製しうるＤＮＡ配列で、天然のプ
ラスミド、人工的に修飾したプラスミド（たとえば、天
然プラスミドから調製したＤＮＡ断片）および合成プラ
スミドが挙げられる。このプラスミドの好ましい例とし
ては、大腸菌を宿主細胞とする場合に例えばプラスミド
ｐＢＲ３２２またはその人工修飾体（ｐＢＲ３２２の適
当な制限酵素処理によって得られたＤＮＡ断片）が挙げ
られ、動物細胞を宿主細胞とする場合に例えばプラスミ
ド、ｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＡｌＣＣ３７１９８、プラスミド
ｐｓＶ２ｄｈｆｒ　ＡｌＣＣ３７１４５、プラスミドｐ
ｄＢＰＶ−ｔ１ＭＩｎｅｏ　ＡＴＣＣ３７２２４、プラ
スミドｐｓＶ２ｎａｏ　ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられ
る。

エンハンサ−配列としては、例えば５Ｖ４Ｇのエンハン
サ−配列が挙げられる。

ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリア
デニル化部位が挙げられる。

スプライシング・ジャンクションとしては、例えばＳＶ
４０のスプライシング・ジャンクシ５ンが挙げられる。

プロモーター−オペレーター領域、開始コドン、新規ｔ
−ＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ　１終止フド
ンおよびターミネータ−領域は、適当な自己複製可能ユ
ニット（プラスミド）と共に、連続的に環状に、所望に
より適当なりＮＡ断片（例えば、リンカ−１他の制限部
位、等）を用いて、常法（例えば、制限酵素による消化
、τ４ボリヌクレチドキナーゼを用いた燐酸化、τ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いたライゲーション）により連結して
、発現ベクターを調製でき、哺乳動物細胞を宿主として
用いる場合には、エンハンサ−配列、プロモーター領域
、天然ｔ−ＰＡの５′−非コード領域、開始コドン、シ
グナル−ペプチドおよび新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ、終止コドン、３′　−非コード領域
、スプライシング・ジャンクシ５ンおよびポリアデニル
化部位を上記慣用の手法で適当な自己複製可能ユニット
に連続的にかつ環状に連結して発現ベクターを調製して
もよい。

その発現ベクターを宿主細胞に導入する。導入は常法（
たとえば、形質転換、マイクロインジエクション、等）
によって実施でき、形質転換体が得られる。

この発明の製法における新規ｔ−ＰＡの製造のためには
、このようにして得た発現ベクター含有形質転換体を培
地に培養する。

培地は、炭素源（たとえば、グルツース、グリセリン、
マンニトール、フルクトース、ラクトース、等）および
無機または有機の窒素源（たとえば、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス
、ポリペプトン、バタトトリプトン、牛肉エキス、等）
を含有する。

所望により、他の成分［たとえば、無機塩類（たとえば
、重燐酸ナトリウムまたはカリウム、燐酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム）、ビタミン類（たとえば、ビタミンＢ１）、抗生
物質（たとえば、アンピシリン）、等コを培地に加えて
もよい。

形質転換体の培養は、一般に、ｐＨ５，５〜８，５（好
ましくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０℃（好ましくは
四〜３８℃）で、５〜５０時間にわたって実施すればよ
い。

大腸菌のような細菌を宿主細胞として用いる場合には、
製造された新規ｔ−ＰＡは、通常、培養形質転換体細胞
中に存在するので、細胞を濾過または遠心分離によって
集め、細胞壁および／または細胞膜を常法（たとえば、
超音波および／またはリゾチームによる処理、等）によ
り破壊して、デブリスとする。このデブリスから、新規
ｔ−ＰＡを、天然または合成の蛋白質の精製、単離に一
般的に用いられている通りの常法［たとえば、適当な溶
媒（たとえば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウム塩水
溶液、等）による蛋白質の溶解、透析、ゲルｉｄ過、カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
、等］により精製、単離でき、動物細胞を宿主細胞とし
て用いる場合には、製造された新規ｔ−ＰＡは通常、培
養液中に存在するので、培養濾液（上澄液）を濾過また
は遠心により培養物から得て、これから上述したような
常法により精製することができる。

このようにして製造した新規ｔ−ＦＡのりホールディン
グのためには、新規ｔ−ＰＡのグアニジンまたは尿素溶
液を、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型グル
タチオン（Ｇ５５Ｇ　）の存在下に、半透膜の内側およ
び外側のグルタチオン濃度を同じにして、４〜４０℃で
２〜６０時間透析することからなる透析法を採用するの
が好ましい、この方法では、グルタチオン濃度は２ｍＭ
以上であることが好ましく、還元型グルタチオンと酸化
型グルタチオンの比率は１０：１とするのが好ましい、
なお、この方法では、両グルタチオンをシスティンおよ
びシスチンで置き換えることができる。これらの方法は
、組換えＤＮＡ技術により製造された、天然１−ＰＡを
含む全てのｔ−ＰＡのりホールディングのために好まし
く使用できる。

この発明の新規ｔ−ＰＡは、血管疾患（たとえば、心筋
便室、卒中、心臓発作、肺璽栓症、深部静脈血栓症、末
梢動脈閉室、等）の治療のための血栓溶解剤として有用
である。この発明の新規ｔ−ＰＡは、医薬として許容し
うる担体と混合して、注入剤のごとき医薬製剤の形で、
ヒトを含めた哺乳動物に非経口的に投与できる。

医薬として許容できる担体は、ペプチドまたは蛋白質（
たとえば、血清アルブミン、等）を含有する医薬組成物
の調製に慣用されている種々の有機または無機の担体材
料を包含しうる。

この発明の新規ｔ−ＰＡの投与量は、疾患の種類、患者
の体重および／または年令、さらに投与経路の種類のご
とき種々の因子に応じて変動するが、この発明の新規ｔ
−ＦＡの最適投与量は、通常、注射または注入の場合は
０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の中から選択される。

上記の一日量は、数時間ごとに分割して患者に与えても
よい。

（オリゴヌクレオチドの）モノ（またはジ、またはトリ
）マーは、たとえば広瀬の方法［蛋白質核酸酵素２５．
２５５（１９８０）参照］により調製でき、カップリン
グは、たとえばセルロースまたはポリスチレンポリマー
上で燐酸トリエステル法［ヌクレイツク・アシッズ・リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
）　！、　１６９１（１９８１）、同誌１０．１７５５
（１９ｇ２）参照コによって実施できる。

以下の実施例はこの発明をきらに詳細に説明するための
ものであって、それらに限定されるものではない。

実施例中、使用した酵素（たとえば、制限酵素、細菌ア
ルカリホスファターゼ、　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等）は全
て市販のものであり、それら酵素の使用条件は、たとえ
ば市販の酵素に添付されている説明書を参照すれば、当
業者にとっては自明のところである。

一施例１（オリコ゛ヌクレオチドの合成下記オリゴヌク
レオチド類を、上記のごとく常法により、調製した。

Ｌ）　ｐＨＶＢＢ用： ＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡ’ｒＣＧＡＡＧＧＴＡＧＡＴ
ＣＴＧＨＰ１０ｉＡＧ−ＣＴＩ−ＣＡＧ−ＣＡＩＨＰ７
　　；ＡＴＣ−ＧＡＡ−ＧＧＴ−ＡＧＡ−ＴＣＩ−ＧＨ
ＰＩＩ；Ｃ−ＧＡニーＡＴＣ−ＣＴＧ−ＡＨＰ９　　；
ＧＡ−τＣＣ−ＡＧＡ−τＣτ−ＡＣＣ−Ｔ丁２）　ｐ
ＴＱｉＰＡΔｔｒｐおよびｐＩＱｋＰＡΔｔｒｐ用：１
←ＨＰ２３−）ｌ←ＨＰ２４→ ＣＧＡＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＡＧＨＰ２３ｉｃ
−ＧＡｒ−ＡＡＡ−ＡＴ ＨＰ２４ｉＧ−ＴＧＴ（Ａ丁−ＧＡＧ ＨＰ２５；ＡＣＡ−ＣＡＩ−ＴＴＴ−Ａ工ＨＰ２６：Ｇ
ＴＣ−ＣＴＣ−ＡＴＡ ＴＱｉｔＰＡまたはＴＱｋｔＰＡのＣｙｓｌ　　は、ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒａ）　３０１．２１４　（１９８
３）に報告されている天然ｔ−ＰＡのＣｙｓ９２に対応
している。

３）　９ＴＴｋＰＡ△ｔｒｐおよびｐＴＴｉＰＡΔｔｒ
ｐ用：ＣＧＡＴＡＡＡＡＴＧＴＣ ＨＦ３１；Ｃ−ＧＡＴ−ＡＡＡ−ＡＩＧ−ＴＣＨＰ３２
；ＴＣ−ＡＧＡ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−ＡＴＴＴｋｔＰＡま
たはＴＴｉｔＰＡのＳｅｒ’は、ネイチャー３０１゜２
１４　（１９８３）に報告されている天然ｔ−ＰＡの５
ｅｒ１７４に対応している。

（第１図に図示） オリゴデオキシリボヌクレオチドＨＰ７およびＰｌｌ（
各０．２ナノモル　実施例１−（１）参照）を、ライゲ
ーション緩衝液（１ｍＭ　ＡＹＰ、　５０ｍＭ　トリス
−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．
　２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン、
　５Ｑ＜／ｍｌ）ウシ血清アルブミン）　２０Ｓ中で、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（全酒造）２．５単位を
用いて、３７°Ｃで１時間燐酸化した。熱による酵素不
活性化ののち、反応混合物にイ也のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドＨＰ　１０およびＨＦ２（各０．４ナノモ
ル）、２０ｍＭ　ＡＴＰ　１縛およびＴ４　ＤＮＡリガ
ーゼ（全酒造）９００単位を加えた、得られた混合物を
１５℃で３０分間加温して、粗製の２７ｂｐＤＮＡ断片
を得た。

他方、ｐＣＬａＨｔｒｐ３ｔ　（α−ｈＡＮＰのための
発現ベクター、その調製法は、例えばヨーロッパ特許出
願公開公報第０２０６７６９号に記載されている）をＬ
！！！肛および）Ｉｉｎｄｌ［［により消化した。生じ
た４１３７ｂｐ　ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル
電気泳動により単離し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下
に、前記２７ｂｐ　ＤＮＡ断片に連結した。ライゲーシ
ョン混合物を用いて≧。

ｃｏｌｉ　ＤＩ−Ｉ　Ｃマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）　、　Ｔ、ほか、モレキュラークローニング（Ｍｏ
ｌａｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）　、ページ５０５（１
９８２）　、　　＝＋−ルドスプリングハーバーラボラ
トリーにューヨーク）参照コを形質転換した。アンピシ
リン耐性形質転換体ノーツから、所望のプ５ｒｘミドｐ
ＨＶＢＢ（４１６４ｂｐ）をＳ離し、制限酵素印ｍｌ」
、妙ＲＶ、均匹！、現」ｄ■およびＢａｍＨＩ　）消化
によって特性を確認した。

（第２図に図示） ｐＨＶＢＢをもＩｍにより消化した。生じた４１６４ｂ
ｐ線状ＤＮＡを、２００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ
８，０）中で、細菌アルカリホスファターゼ（全酒造）
とともに３７＠ｃで１時間加温して、該ＤＮＡの両５′
末端を脱燐酸した。生じたＤＮＡを５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ　’）により単離した。

他方、ｐＴＰＡ１０２（Ｌｙｓ　　＝　ｌ１ｅ）［変異
ｔ−ＰＡ（Ｌｙｓ”→ＩＩｅ）のための発現ベクター、
これを含有する形質転換体はＥ、、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２
２１　（ｐＴＰＡ１０２）　（Ｌｙｓ２７７−　ｌ１ｅ
）　ＡＴＣＣ３９８１１コをｍπにより消化し、１９７
４ｂｐのＤＮＡ断片（そのＤＮＡ配列は第３図に示きれ
ている）を単離した。この断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼの存在下に４１６４ｂｐ　ＤＮＡ断片に連結した＊　
Ｅ、、　ｃｏｌｉＭＭ２９４　ＡＴＣＣ３３６２５を形
質転換後、ペプチドＣＬａ遺伝子の下流に時計の針の回
転方向に１９７４　ｂｐのｔ−ＦＡ遺伝子が挿入きれた
所望のプラスミドｐＣＬｉＰＡｘｔｒｐ（６１３８ｂｐ
）を担持するアンピシリン抵抗性形質転換体を得た。ｐ
ｃＬｉＰＡｘｔｒｐを、制限エンドヌクレアーゼ（ハｒ
ｕｌＩ　、　ＥｃｏＲＩおよびＩＩ［）消化により特性
決定した。

（第４図に図示） ｐＣＬｉＰＡｘｔｒｐを９ａｍＨＩおよびＳａｃ　Ｉに
より消化し、生じた５３８８ｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。他方、ｐｃＬｉＰＡｘｔｒｐを５ａｕ３ＡＩおよび
５ａｃ　Ｉで消化した。生じた３８９ｂｐのＤＮＡ断片
を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下に、５３８８ｂｐの
ＤＮＡ断片に連結した。ライゲーション混合物を用いて
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＩ　−１を形質転換した。アンピシ
リン抵抗性形質転換体の一つから、所望のプラスミドｐ
ＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐ　（５７７７ｂｐ　）を単離し、
制限エンドヌクレアーゼ（Ｃ１ａ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ
。

Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｎａｒ　Ｉおよび５ａｃＩ）消化によ
り特性決定した。

施例５　プラスミドＴｉＰＡｔｒの構　およびクローニ
ング） （第５図に図示） 上記のｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７−”　Ｉｌｅ　
）をＡｖａ　Ｉ［およびａｂｅＩ（４ヌクレオチド長の
単鎖粘着末端を生じるＮａｒ　Ｉのイソシゾマー）で消
化し、生じた５０ｂｐの、天然ｔ−ＰＡのＡｓｐ９５−
　Ａ１，１１１をフードするＤＩＩＩＡ断片を単離した
。他方、ＨＰ２３、ＨＰ２４、ＨＰ２５およびＰ２６（
実施例１参照）からＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよ
びｒ４　ＤＮＡリガーゼを用いて１９ｂｐの合成Ｃ１ａ
　Ｉ−公１ａ　ＩＩ　ＤＮＡ断片を調製した。これを、
Ｔ４諏Ａリガーゼを用いて、５０ｂｐＤＮＡ断片に連結
して、６９ｂｐのＣ１ａＩ　−Ｂｌ想Ｉ　ＤＮＡ断片を
構築した。

ｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐを、Ｂｂｅ　Ｉによる部分消化
によって線状化した。生じた５７７７ｂｐのＤＮＡ断片
をＣ１ａ　Ｉで消化し、５１４９ｂｐのＤＮＡ断片を単
離した。これを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下に、６
９ｂｐの由！−伽！ＤＮＡ断片に連結した。ライゲーシ
ョン混合物を用イテＥ、、　ｃｏｌｉ　ＤＩ　−１を形
質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つから
、所望のプラスミドｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ（５２１８ｂ
ｐ　）を得て、これを制限エンドヌクレアーゼ消化によ
って特性決定した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ−１６［：ＨＢＩＯＩ（ｒ
ｅｃＡ　、　肥四−回居は厖μ畦、聾ど　）　ＦＥＲＭ
　ＢＰ−１８７２をｐＴＱｉＰＡΔｔ１により形質転換
して、形質転換体互、弘旦ＨＢＩＯＩ−１６（ｐＴＱｉ
ＰＡΔｔｒｐ　）を得た。

°施例６（プラスミドＴＡ９００４の構　およびクロー
ニング） （第６図に図示） ｐｃＬｉＰＡΔｘｔｒｐを毀損■および瞼ＲＩにより消
化し、天然ｔ−ＰＡのＧ１ｕ１７５−　Ｔｒｐ２０４を
コードする９１ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。得られた
ＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＩ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドＨＢ３１およびＨＢ３２（実施例１−（３）参照）に
連結した。生じた１０３ｂｐ０＞Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｅｃｏ
ＲＩ　ＤＮＡ断片を、Ｉ４ＤＮＡリガーゼの存在下に、
ｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐの４３９７ｂｐ　Ｃ１ａ　Ｉ　
−Ｅｃ。

Ｒ１断片に連結した。ライゲーション混合物を用いて、
Ｅ−、ｃｏ旦ＤＨ−１を形質転換した。アンピシリン抵
抗性形質転換体の一つから、所望のプラスミドｐｌＡ９
００４　（４５００ｂｐ　）を得た。

（第７図に図式） ｐＴＡ９００４を独ＲＩで消化し、生じたＤＮＡ断片（
４５００ｂｐ）を細菌アルカリホスファターゼを月いて
脱燐酸した。他方、天然ｔ−ＦＡをコードする完全なｃ
ＤＮＡ配列および３′−非コード領域の一部を含むプラ
スミドｐＴＰＡ２１をＥｃｏＲＩで消化し、天然ｔ−Ｐ
ＡのＡｓｎ２０５−Ｌｙｓ３６１をコードする４７２ｂ
ｐのＤＮＡ断片（そのＤＮＡ配列は第８図に示されてい
る）を単離した。得られたＤＮＡ断片を、Ｉ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下に、脱燐酸した４５００ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ　ＤＮＡ断片に連結した。ライゲーション混合物を用
いてＥ−、ｃｏｌｉ　ＤＨ−１を形質転換した。アンピ
シリン抵抗性形質転換体の一つから、所望のプラスミド
ｐＴＴｋＰＡΔｔｒｐ（４９７２ｂｐ）を単離した。≧
、臼其ＨＢＩＯＩ−１６をｐＴＴｋＰＡΔｔｒｐで形質
転換して、形質転換体Ｅ−，ｃｏｌｉ　１（Ｂｌｏｔ−
ｔｓ（ｐτＴｋＰＡΔｔｒｐ　）を得た。

（第９図に図示） ｐＴＡ９００４をＥｃｏＲＩにより消化し、得られたＤ
ＮＡを細菌アルカリホスファターゼを用いて脱燐酸した
。他方、上述のｐＴＰＡ１０２（Ｌｙｓ２７７−”　ｌ
１ｅ）をＥｃｏ　ＲＩで消化し、変異ｔ−ＰＡ　（Ｌｙ
ｓ　　−１１ａ　）のＡｓｎ２０５−Ｌ、３６１をコー
ドする４７２ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。

得られたＤＮＡ断片を、Ｉ４ＤＮＡリガーゼの存在下に
、脱燐酸した４５００ｂｐのＥｃｏＲＩＤＮＡ断片に連
結した。ライゲーション混合物を用いて互、　ｃｏｌｉ
　ＤＨ−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転
換体の一つから、所望のプラスミドｐＴＴｉＰＡΔｔｒ
ｐ（４９７２ｂｐ）を単離した。互、竺１ｉ　ＨＢＩＯ
Ｉ　−１６をｐＴＩｉＰＡΔｔ１で形質転換して、形質
転換体匹、臼１ｉ　ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐＴＴｉＰＡ
Δｔｒｐ　）を得た。

流側９（および単離 Ｅ、、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ−１６（ｐＴＴｋＰＡΔ
ｔ−ｒｐ）ノ単一コロニーを、試験管中の、バットトリ
プト２１０ｇ１酵母エキス５　ｇ、　ＮａＣｌ３　ｇ、
アンピシリン５Ｑ４／ｍＱを滅菌ＬＡ培地（ｐＨ７，２
−７，４）　ＳｍＱ中へ接種し、振とう条件下に３７℃
で８時間加温した。培養物を、フラスコ中の新鮮な滅菌
ＬＡ培地１００ｍ１ｌに加え、振とう条件下に３７℃で
１５時間加温した。得られた培養物の一部（２０１１Ｑ
　）を、２５ｘ／ｍＱｃ７）アンピシリンを含有する滅
菌Ｍ９ＣＡ培地４００誠に加え、３７℃で加温した。培
養物のＡ６ｏｏがおよそ０．６に達したとき、培養物に
β−インドールアクリル酸を最終濃度ｔａｘ／ｍｌとな
るように添加した。得られたブロスを３７℃で３時間加
温し、４℃、８．９００Ｘ　ｇで１０分間遠心分離した
。集めた細胞を、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリ
ス−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　Ｌｏｏｍに懸濁し、４℃
で５０ｍｇのりゾチームで１時間処理した。得られた混
合物をバイオトロン（Ｂｉｏｔｒｏｎ　）プレンダーに
よりホモジナイズし、４℃、８，９００Ｘ　ｇで３０分
間遠心分離した。ペレットを５０％グリセロール水溶液
１００−で洗い、８Ｍ尿素含有１０ｍＭトリスー）ＩＣ
Ｉ（ｐＨ８，０）　８００１１１１１に溶解した。この
尿素溶液に、ＧＳＨ（具入）　４８０ｍｇおよびＧ５５
Ｇ　（具入）　９６ｍｇを加えた。生じた混合物を、２
０ｍＭ酢酸、４０ｍＭアンモニア、２　ｍＭ　ＧＳＲお
よび０．２ｍＭ　Ｇ５５Ｇを含有する緩衝液（ｐＨ９，
５）　１６Ｎに対して２回、４℃で１５時間透析した。

混合物を遠心分離後、上澄液を、次のフィブリンブレー
トアッセイによって検定した。フィブリンプレートアッ
セイ（ＦＰＡ）は、アストルプーミュラーツ法［Ａｓｔ
ｒｕｐ　１．　　と　Ｍｉｉｌｌａｒｔｚ　Ｓ、　＋　
　アーカイヴズ・才ブ・バイオケミストリ・アンド・バ
イオフィジックス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、）並３４６−３５１　（１９５２）　］
に従い、これを僅かに変法して実施した。１００ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７，２）中の１．２％ヒトプラスミノー
ゲン・リッチ・プラスミノーゲン（ミドリ十字）溶液５
１を同じ緩衝液中のトロンビン（持出、５０単位）溶液
５１ｆｌＩｌと混合し、室温で１時間放置することによ
り、フィブリンプレートを調製した。検体溶液またはヒ
ト天然上−ＰＡ（賢ＨＯ標準品）（各１０４）を３７℃
で１８時間インキュベートした。ヒト天然ｔ−ＰＡを標
準として、試料の活性を溶解帯域の面積から計算した。

アッセイの結果、ＩＴｋＰＡを含有する上澄液のｔ−Ｐ
Ａ活性は、２．３Ｘ　１０５ＩＵ　（天然ｔ−ＰＡの）
＃であった。

施　１０　　　　および単 Ｅ、、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ−ｔ６（ｐτＴｉＰＡΔ
ｔｒｐ　）の単一フａニーを、実施例９に記載したのと
実質的に同様にして培養し、得られた培養物からＩτ１
ｔＰＡを単離した。得られたＴＴｉｔＰＡ含有上澄液の
ｔ−ＰＡ活性は２．０Ｘ１０’ＩＵ（天然ｔ−ＰＡの）
／１であった。

実施例１１（現および単離 昌、９旦ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ　
）の単一コロニーを、実施例９に記載したのと実質的に
同様にして、培養し、得られた培養物からＴＱｉｔＰＡ
を単離した。得られたＴＱｉＴＰＡ含有上澄み液ｔ−Ｐ
Ａ活性は２、　ＯＸ　１０’ＩＵ（天然ｔ−ＰＡの）／
ｊ２であった。

流側１２ＴＴｋｔＰＡの精製 全ての操作を冷室（４−６℃）で行った。プラスミノー
ゲン活性化因子、リホールディグきれた上澄液中のＴＴ
ｋｔＰＡ、を次のようにして単離、精製した。

第一工程では、実施例９に記載した方法と同様にして得
た培養物２０リツトルから調製した上澄液［全ｍｔｐＡ
ｇ性：　３．４Ｘ　ｔｏ６ＩＵ（天然ｔ−ｐＡ（ｗＨｏ
　）の）］を、Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌおよび０．０１％（ｖ
／ｖ）　トウィーン（Ｔｗｅｅｎ　）　８０を含有する
０、０５Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）により平衡化
したベンズアミジン・セファロース・カラム［１，６ｃ
ｍＸ　３　ａｍ　；文献：ラス・ホルムバーブ（Ｌ、ａ
ｓ　）ｌｏｌｍｂｅｒｇ　）ら、ＢＢＡ、　４４５．２
１５−２２２（１９７Ｂ）記載のカルボジイミド法によ
ってｐ−アミノベンズアミジンを共役結合によりＣｌセ
ファロース４Ｂ（ファルマシア）に結合させたコにかけ
、同じ緩衝液で洗浄した。プラスミノーゲン活性化因子
を、１Ｍアルギニンおよび０．０１％（Ｖ／Ｖ）のトウ
ィーン８０を含有する０、０５Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ
８，０）で溶出した。

次の工程では、プールした活性画分を、０．１Ｍトリス
−）ＩＣＩ　（ｐＨ８，０）で平衡化したＩｇＧ結合セ
ファｏ−ス（ＦＴＰ１１６３　）カラム（１６ｃｍＸ　
３　ａｍ）　［モノクローナル抗ｔ−ＰＡ抗体：　ＦＴ
Ｐ１１６３（カイズ・ットムら、トロンボ−シス・リサ
ーチ（ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲａｓｅａｒｃｈ、　４０
．９ｌ−９９（１９８５）を、メーカーの指示に従って
、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させた］にか
けた、カラムを、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，０，０１％（ｖ／
ｖ）トウィーン８０およびアプロチニン（ＩＯＫＩＵＺ
戚、シグマ）を含有する０、１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐ
Ｈ８，０）で洗浄した。Ｒ１出は、０．５Ｍ　ＮａＣ１
，０，０１％トウィーン８０およびアプロチニン（ｌ０
ＫＩＵ／＋１１１１　）金含有する０、１Ｍグリシン−
ＨＣｌ　（ｐ）１２．　ｓ　）を用いて行った。

最後の工程では、ＩｇＧセファロース（ＦＴＰ　１１６
３）カラムから得てプールした活性画分を、Ｌ６ＭＫＳ
ＣＮおよび０．０１％（ｖ／ｖ）トウィーン８０を含有
する０、０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）１リツトルに
対して透析した。透析した溶液を、固体ポリエチレング
リコール２０．０００に対する透析によって約２賊に濃
縮した。得（れた濃縮物を、１．６Ｍ　ＫＳＣＮおよび
０．０１％（ｖ／ｖ）トウィーン８０を含有する０、　
０１　Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）中、セファクリル５
２００　ＨＲ（ファルマシア、１．６ｃｍＸ　９０ｃｍ
）でゲル濾過した。

プールした活性画分を、固体ポリエチレングリコール２
０．０００に対する透析によって約ＩＱｍＱに濃縮し、
濃縮物をついで、０．１５Ｍ　ＮａＣ１および０．０１
％（Ｖ／Ｖ））、ウィーン８０を含有する０、１Ｍ重炭
酸アンモニウムに対して透析し、精製ＴＴｋｔＰＡ（３
，４ｍｇ。

７、３５Ｘ　１０５ＩＵ（天然ｔ−ＰＡ　（ＷＨＯ）の
）／ｍｇ蛋白質）を含有する透析物を得た。

精製したＴＴｋｔＰＡは次の特性を有する：（ｉ　）　
　ＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析 ラエムうの方法［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ、ネイチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　（ロンドン）　２２７．６８
０−６８５　（１９７０）　］に従って、１５％ポリア
クリルアミドゲルを調製した。このゲルを銀染色した［
ベーリング（Ｈ。

Ｍ、Ｐｏｅｈｌｉｎｇ）ら、エレクトロフォレシス（Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　、　　Ｋ、　　ｔ４
ｔ　　（１９８１）コ。

コノヨウニシテ精製さｔｔ、　ｔ’＝　ＴＴｋｔＰＡは
、５ＤＳ−ＰＡＧＥに際して、還元条件下では３５にド
ルトンのところに単一のバンドとして、非還元的条件下
では３２にドルトンのところに単一バンドとして、それ
ぞれ泳動する。一方、プラスミンセファロース［バー・
つオリン（Ｐｅｒ　Ｗａｌｌｉｎ　）ら、ＢＢＡ、　７
１９．３１８−３２８　（１９８２）］と共に加温した
試料は、還元剤の存在下では３０にドルトン（プロテア
ーゼドメイン）および１３．５　ｋドルトン（クリング
ルドメイン）のところに２つのバンドを生じ、還元剤不
在下では３２にドルトンのところに単一のバンドを与え
た。

（ｉ　）　ＨＰＬＣ 精製ｒＴｋｔＰＡを（４，６ｍｍＸ７５ｍｍ）ウルトラ
ボアＲＰＳＣカラム（ベックマン、米国）にかけた、溶
出は、０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸中のアセト
ニトリルの線状勾配（１０−６０％（ｖ／ｖ）　）を用
い、流速１．Ｑｍｌｌ／分で３０分間にわたって行った
。

この系では、　ＴＴｋｔＰＡは、アセトニトリル濃度お
よそ３６．５％（Ｖ／Ｖ）で単一の主要種として溶出き
れた。

（ｉ）Ｎ末端配列分析 精製−末鎖τＴｋｔＰＡを還元し、カルボキシメチル化
し、　ＨＰＬＣ（ウルトラボアＲＰＳＣ）カラムで脱塩
し、スピード・ヴアク（５ｐｅａｄ　Ｖａｃ）濃縮装置
（サヴアント（Ｓａｖａｎｔ）　）で濃縮し、３７０Ａ
型気相シーケンサ−（アプライドバイオシステム）を用
いて分析した。　ＴＩｋｔＰＡのＮ末端アミノ酸配列は
次の通りであった。

５ａｒＧ１ｕＧ１ｙＡｓｎ　− （第１０図に図示） プラスミドｐｒＱｉＰＡΔｔｒｐをＥｃｏＲＩで消化し
た。反応混合物を細菌アルカリホスファターゼを用いて
脱燐酸し、生じた４７４４ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離した
。

他方、プラスミドｐＴＰＡ２１をＥｃｏＲＩで消化し、
生じた４　７２ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。この４７
２ｂｐ　ＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下に
、４７４４ｂｐ　ＤＮＡ断片に連結し、ライゲーション
混合物を用いて≧。

９旦ＤＨ−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性の形
質転換体の一つから、所望のプラスミドｐＴＱｋＰＡΔ
ｔｒｐを単離し、制限マツピングにより特性決定をした
。≧、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ−１６をプラスミーｐＴ
ＱｋＰＡΔｔｒｐで形質転換して、形質転換株旦、臼旦
ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐｒＱｋＰＡΔｔｒｐ　）を得た
。

施　１４　　オリゴヌクレオチドの合成上記した通りの
常法により、下記オリゴヌクレオチドを調製した。

１）　ｐｓＴＴｋｔｒｐおよびｐＳＴＱｋｔｒｐ用のリ
ンケージ配列：（ＤｄｅＩ）　　　　　　　　　　　　
（ＥｃｏＲＶ）　　　（ＳｔｕＩ）ＴＧＡＧＡＣＡＧＴ
ＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴＴＧＡＴＡＩＣＡＡ
ＡＧＧＡＧＧｌ←−ｍ−−５Ｋ２　（３７ｍａｒ）−一
一一→１２）　ｐｓＴＱｉｔｒｐ用のリンケージ配列（
Ｄｄｅ　Ｉ）　　　　　　　　　　　（ＥｃｏＲＶ）　
　　（Ｓｔｕ　Ｉ）２６６　　　　２７０　　　　　　
２７５・ＴＧＡＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣ
ＡＧＴＴＴＧＡＴＡｒＣＡＴＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡ
ＴＧＴＣＧＧＴＣＧＧＴＧＴＣＡＡＡＣ１’ＡＴＡＧＴ
ＡＴＣＣｒＣＣ１←−ＨＰ５７　（３７ｍａｒ）　−一
１３）　ｐｔｈＴＴｔｒｐ用のリンケージ配列（Ｄｄｅ
Ｉ）　　　　　　　　　　　（Ｂｇｌｌ［）　　（Ｓｔ
ｕＩ）１←−−ＨＰ６１　（３４ｍａｒ）−ｍ−→４）
　Ｉ）ｕＴＴｔｒｐ用のリンケージ配列（以性Ｉ）　　
　　　　（５ａｃｆｆ）ｒＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＣＩＧ
ＣＧＴＣＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡアミノ酸上方の番号は
、ペニカ（Ｐｅｎｎ１ｃａ　）らロネイチャーと■、　
２１４−２２１　（１９８３）］の報告している天然ｔ
−ＰＡでの位置を示している。

１施例１５（プラスミドＭＨ９００３の構築およびり三
二三ヱＵ （第１１図に図示） プラスミドｐＴＡ９００４をＥｃｏＲＩおよび５ｔｕ　
Ｉで消化し、生じた４３２９ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離し
た。このＤＮＡ断片を、τ４ポリヌタレオチドキナーゼ
およびＩ４ＤＮＡリガーゼを用いて、合成オリゴデオキ
シリボヌクレオチドＳＫ１およびＳＫ２に連結した。反
応混合物をＥｃｏＲＩで処理して、ＥｃｏＲＩ消化粘着
末端を再構築し、生じた瞼ＲＩ−睡Ｉ　ＤＮＡ断片（４
３６７ｂｐ）を、Ｉ４　ＤＮＡリガーゼの存在下に、プ
ラスミドｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐから得た天然ｔ−ＦＡ
のＡｓｎ２０５−Ｌｅｕ２６６をコードする１８４ｂｐ
のＥｃｏＲＩ　−Ｄｄｅ　Ｉ　　ＤＮＡ断片に連結した
。ライゲーション混合物を用いて旦、９旦ＤＨ−１を形
質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つか
ら、所望のプラスミドｐＭＨ９００３を単離し、制限エ
ンドヌクレアーゼ消化によって特性決定した。

Ｘ五皿長（プラスミド５ＴＴｋｔｒの　　およびクロー
ニング） （第１２図に図示） プラスミドｐＭＨ９００３をＳｔｕ　Ｉで消化し、生じ
たＤＮＡ断片（４５５１ｂｐ）をコウシ腸ホスファター
ゼ（ファルマシアＡＢ）により脱燐酸した。他方、プラ
スミドｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐを油■で消化し、生じた
、天然セーＰＡのＧ１ｙ２７９１　Ａ１ａ４１９をコー
ドする４１９　ｂｐ（７）ＤＮＡ断片を単離した。得ら
れたＤＮＡ断片を、Ｉ４ＤＮＡリガーゼの存在下に、４
５５１ｂｐのＳｔｕ　Ｉ　ＤＮＡ断片に連結した。ライ
ゲーション混合物を用いて≧、江旦ＤＨ−１を形質転換
した。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望
のプラスミドｐｓＴＴｋｔ　ｒｐを単離し、制限エンド
ヌクレアーゼ消化により特性決定した。≧、　ｃｏｌｉ
　ＨＢＩＯＩ−１６をプラスミドｐｓＴＴｋｔｒｐで形
質転換し、て、形質転換株旦、臼晶ＨＢＩＯＩ　−１６
（ｐｓＴＴｋｔｒｐ　）を得た。

、１７　　プラスミドＺＹの　　およびクローニ（第１
３図に図示） プラスミドＩ）ＴＱｉＰＡΔｔｒｐをＥｃｏＲＩおよび
５ｔｕ　Ｉで消化し、生じた４５７５ｂｐのＤＮＡ断片
を単離した。このＤＮＡ断片を、τ４ポリヌクレオチド
キナーゼおよびＩ４ＤＮＡリガーゼを用いて、合成オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドＨＰ５６およびＨＰ５７と
連結した。反応混合物をＥｃｏＲＩで処理して、Ｅｃｏ
ＲＩ消化粘着末端を再構築し、生じた瞼ＲＩ−魅独Ｉ　
ＤＮＡ断片（４６１３ｂｐ）を、Ｉ４ＤＮＡリガーゼの
存在下に、プラスミドｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐから調製
した、天然ｔ−ＰＡのＡｓｎ２０５−Ｌｅｕ２６６をコ
ードする１８４　ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｄｄｅ　Ｉ　Ｄ
ＮＡ断片に連結した。

ライゲーション混合物を用いて互、９旦ＤＢ−１を形質
転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから
、所望のプラスミドｐＺＹを単離し、制限マツピングに
より特性決定した。

実施例１８（プラスミド５Ｔｉｔｒの構築およびクロー
ニング） （第１４図に図示） プラスミドｐＺＹをＳｔｕ　Ｉで消化し、生じたＤＮＡ
断片（４７９７ｂｐ）をコウシ腸ホスファターゼにより
脱燐酸した。他方、プラスミドｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐ
を江ｌで消化し、生じた、天然ｔ−ＰＡのＧ１ｙ２７９
−Ａ１ａ４１９をコードする４１９ｂｐのＤＮＡ断片を
単離した。

４１９ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在
下に、４７９７ｂｐのＤＮＡ断片に連結した。このライ
ゲーション混合物を用いて≧、　ｃｏｌｉ　ＤＩ　−１
を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つ
から、所望のプラスミドｐｓＩＱｉｔｒｐを単離し、制
限マツピングにより特性決定した。　Ｅ−、ｃｏｌｉ　
ＨＢＩＯＩ−１６をプラスミドｐｓＴＱｉｔｒｐで形質
転換して、形質転換株旦、四旦ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐ
ｓＴＱｉｔｒｐ　）を得た。

（第１５図に図示） プラスミドｐｓＴＴｋｔｒｐをＣ１ａ　ＩおよびＥｃｏ
ＲＶで消化し、生した４６５６　ｂｐ　ＤＮＡ断片を単
離した。他方、プラスミドｐｓＴＱｉｔｒｐをＣ１ａ　
ＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、５ＴＱｉｔＰＡのＣｙｓ
ｌ　　−Ａｓｐ１８４をフードする５６０ｂｐのＤＮＡ
断片を単離した。得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下に、４６５６ｂｐのＤＮＡ断片に連結し
た。このライゲーション混合物を用いて、Ｅ。

竺具ＤＩ−１を形質転換した。

アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから、所望のプ
ラスミドｐｓＴＱｋｔｒｐを単離し、制限マツピングに
より特性決定した。≧、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　−１
６をｐｓＴＱｋｔｒｐで形質転換して、形質転換株ＨＢ
ＩＯＩ−１６（ｐｓＴＱｋｔｒｐ　）を得た。

（第１６図に図示） プラスミドｐＴＡ９００４をＳｔｕ　ＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化し、生じた４３２９ｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。このＤＮＡ断片を、　Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼおよびｒ４ＤＮＡリガーゼを用いて、合成オリゴデオ
キシリボヌクレオチドＨＰ６０およびＨＰ６１に連結し
た。このライゲーション混合物をＥｃｏＲＩで処理して
、独肛消化粘着末端を再生し、生じたＥｃｏＲＩ　−Ｄ
ｄｅ　Ｉ　ＤＮＡ断片（４３６４ｂｐ）を、プラスミド
ｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐから調製した、天然ｔ−ＰＡ（
７）Ａｓｎ２０５−　Ｌｅｕ２６６をコードするｔｇａ
ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｄｄａ　Ｉ　　ＤＮＡ断片に連結
した。このライゲーション混合物を用いて昌、部具ＤＨ
−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換株の
一つから、所望のプラスミドｐＭＨ９００６を単離し、
制限マツピングによって特性決定した。

−流側２１（ｔｈＴＴｔｒの構　およびクローニング（
第１７図に図示） プラスミドｐＭＨ９００６を５ｔｕ　Ｉで消化し、生じ
た線状化ＤＮＡ断片（４５４８ｂｐ　）をフウシ膓ホス
プアターゼにより脱燐酸した。他方、プラスミドｐｃＬ
ｉＰＡΔｘｔｒｐを５ｔｕ　Ｉで消化し、天然ｔ−ＰＡ
のＧ１ｙ２７９−Ａ１ａ４１９をコードする４１９ｂｐ
のＤＮＡ断片を単離した。

得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼの存在下
に、４５４８　ｂｐのＤＮＡを断片に連結した。ライゲ
ーション混合物を用いて≧、　ｃｏｌｉ　ＤＢ　−１を
形質転換した。

アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望のプラ
スミドｐｔｈＴＩｔｒｐを単離し、制限マツピングによ
って特性決定した。≧、製旦ＨＢＩＯＩ　−１６をプラ
スミドｐｔｈｌＴｔｒｐで形質転換し、形質転換株Ｅ。

部具ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐｔｈＩＴｔｒｐ　）を得た
。

−流側２２プラスミドＭＨ９００７の　　およヒクロー
ニング） （第１８図に図示） プラスミドｐＭＨ９００３をＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲ
Ｖで消化し、４３４０　ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。

得られたＤＮＡ断片を、τ４ポリヌクレオチドキナーゼ
およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、合成オリゴデオキ
シリボヌクレオチドＨＰ５８およびＨＰ５９と連結した
。ライゲーション混合−物をＥｃｏＲＩで処理してＥｃ
ｏＲＩ消化粘着末端を再生きせた。

得られたＤＮＡ断片（４３６７ｂｐ）を、ＴＪＤＮＡリ
ガーゼの存在下に、プラスミドｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐ
から得た１ｇ４　ｂｐのＥｃｏＲｉ　−Ｄｄｅ　Ｉ　Ｄ
ＮＡ断片と連結した。ライゲーション混合物を用いて≧
、ｃｏｌｉＤト１を形質転換した。

アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから、所望のプ
ラスミドｐＭＨ９００７を単離し、制限マツピングによ
って特性決定した。

Ｌ流側２３（プラスミドｕＴＴｔｒの構築およびクロー
三上！ユ （第１９図に図示） プラスミドｐＭＨ９００７を５ｔｕ　Ｉで消化し、生じ
た線状化ＤＮＡ断片（４５５１ｂｐ）をコウシ腸ホスフ
ァターゼにより脱燐酸した。他方、プラスミドｐＣＬｉ
ＰＡムｘｔｒｐを５ｔｕ　Ｉで消化し、生じた４１９　
ｂｐの断片を単離した。４１９　ｂｐ　ＤＮＡ断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下に、４５５１　ｂｐ　ＤＮ
Ａ断片と結合した。このライゲーション混合物を用いて
≧、　ｃｏｌｉ　ＤＨ−１を形質転換した。

アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望のプラ
スミドｐ　ｕＩＴｔｒｐを単離し、制限マツピングによ
り特性決定した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　−１６
ヲフラスミドｐｕＩＴｔｒｐにより形質転換して、形質
転換株Ｅ−，ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐｕＴＴ
ｔｒｐ）を得た。

−施イ２４（および単離 Ｅ−、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ−１６（ｐＴＱｋＰＡΔｔ
ｒｐ　）を、実施例９に記載したのと実質的に同様にし
て、培養し、得られた培養物からＴＱｋｔＰＡを単離し
た。得られたＴＱｋｔＰＡ含有上澄液のｔ−ＰＡ活性は
、天然ｔ−ＦＡとして７、７Ｘ　１０’　ＩＵ／　１で
あった。

施　２５　　　　および単 新規ｔ−ＰＡ類発現のため、≧、虹旦ＨＢＩＯＩ　−１
６（ｐｓＩＴｋｔｒｐ　）、互、９旦ＨＢＩＯＩ　−１
６（ｐｓＴＱｋｔｒｐ　）、旦、臼旦ＨＢＩＯＩ　−１
６（ｐｓＴＱｉｔｒｐ　）、Ｅ−、ｃｏ旦ＨＢ１０１−
１６　（ｐｔｈＴＴｔｒｐ、）およびＥ−、ｃｏｌｉ　
ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐｕＴＴｔｒｐ　）を用いた。こ
れらの細菌の培養は、実施例９に記載したのと実質的に
同様にして行った。得られた培養物（２００ｍ１１　）
から得た細胞ベレットを１０ｍＭ燐酸緩衝食塩水（ｐＨ
８，０）２０−に懸濁し、４℃で１分間超音波処理した
。１５．００Ｏｒｐｍ。

４°Ｃで２０分間遠心分離したのち、得られたベレット
をトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ　−１００溶液（０
，５％トリトンＸ　−１００，８％シュークロース、５
０ｍＭＥＤＩＡ　。

１０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０）　２０−に懸濁
し、４℃で１分間超音波処理した。懸濁液を１５．００
０ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られたベレットを
、５０％グリセロール水溶液２０ｍ１ｌおよび水冷エタ
ノール２０ＩｎＩｌで順次洗浄し、８Ｍ床素、２０ｍＭ
酢酸、４０ｍＭ水酸化アンモニウム、０．４ｍＭシステ
ィンおよび０．０４ｍＭシスチンを含有する８ＭＪ！素
溶液（ｐＨ９，５）２０ｍ１１に、超音波処理により溶
解した。

１５、ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心分離後、上澄液を８
Ｍ尿素溶液でＡ　２８０＝　０．１　（２８０ｎｍでの
吸光度）まで希釈した。得られた溶液を、２０ｍＭ酢酸
、４０ｍＭ水酸化アンモニウム、０．４ｍＭシスティン
および０．０４ｍＭシスチンを含有する水溶液（ｐＨ９
，５）の１０倍量に対して室温で１５時間透析した。上
記操作において、新規−−ＰＡ、すなわち５ＴＴｋｔＰ
Ａ、　５ＴＱｋｔＰＡ。

５ＴＱｉｔＰＡ、　ｔｈＴＴｔＰＡまたはｕＴＴｔＰＡ
を含有する各透析物をそれぞれ≧、臼部具ＢＩＯＩ　−
１６（ｐｓＴＴｋｔｒｐ　）、互、９旦ＨＢＩＯＩ　−
１６（ｐｓＴＱｋｔｒｐ　）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩ
ＯＩ−１６（ｐｓＴＱｉｔｒｐ　）、≧、臼部具ＢＩＯ
Ｉ　−１６（ｐｔｈＴＴｔｒｐ　）またはＥ、　ｃｏｌ
ｉ　ＨＢＩＯＩ　−１６（ｐｕＴＴｔｒｐ）の培養物か
ら得た。得られた透析物の各々をそれぞれ、実施例９に
記載のフィブリンプレートアッセイに付した。結果を次
表に示す。

５ＴＴｋｔＰＡ　　　　　　　　　１．１　ｘ　１０５
ＳＴＱｋＰＡ　　　　　　　　　２．３　Ｘ　１０’５
ＴＱｉｔＰＡ　　　　　　　　　２．３　Ｘ　１０’ｔ
ｈＩＴｔＰＡ　　　　　　　　　　３．７　Ｘ　１０’
ｕＴＴｔＰＡ　　　　　　　　　　　検出されず率）亭
）ｕＴＴｔＰＡはプロウロ・キナーゼのような酵素前駆
体であるのかもしれない、それはブイプリンプレートア
ッセイでは不活性であったが、酵素免疫アッセイで分析
したところでは、培養液１！当り２９（の割合で生産さ
れた。

施　！　　の　子量り 上記の実施例で生産された新規ｔ−ＰＡの分子量を、マ
ーカー蛋白質（９４，０００，６７、Ｇｏｏ、　４５，
０００゜３０．０００．１４，４００ドルトン）を用い
たＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析によって測定した。

結果を次表に示す。

ＴＴｋｔＰＡ　　　　　　　約３８．０００Ｔ工１ｔＰ
Ａ　　　　　　　約３８．０００ＴＱｉｔＰＡ　　　　
　　　約４５，０００ＴＱｋｔＰＡ　　　　　　　約４
５．０００ＳＴＩｋｔＰＡ　　　　　　約３８．０００
ＳＴＱｋｔＰＡ　　　　　　約４５．０００５ＴＱｉｔ
ＰＡ　　　　　　約４５．０００ｔｈＩＴｔＰＡ　　　
　　　約３８．０００ｕＴＴｔＰＡ　　　　　　　約３
８．０００発現ベクターは二本鎖ＤＮＡに適用きれるジ
デオキシリボヌクレオチド鎖ターミネーション法［スミ
ス（Ｓｍ１ｔｈ）　、　Ａ、　Ｊ、　Ｈ，メソッド・才
ブ・エンザイモロジー（Ｍａｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　）
第６５巻第５６０〜５８０頁（１９８０年）］による部
分ＤＮＡ配列決定に続く制限マツピングにより特性決定
ならびに同定が行なわれた。

プラスミドｐｒＴｋＰＡΔｔｒｐ　［２Ｍ＆　、　１０
ｍＭ　トリス・ＭＣＩ　（ｐＨ７，４）　−１ｍＭＥＤ
ＴＡ　１６４中）、２　ｍＭＥＤＴＡ（２縛）および２
　Ｎ　Ｎａ０Ｈ（２Ｉｔ　）で５分間室温で処理した。

得られた混合物に５Ｍ酢酸アンモニア（８縛）およびＥ
ｔＯＨ（１００ｍ　）を加えた。混合物を一８０’Ｃで
３０分間冷却し、１２．０ＯＯｒｐ＋ｎテ５分間遠心分
離した。上澄液を除去した後沈澱を水冷７０％エタノー
ル水で洗浄し、減圧乾燥して変性プラスミドを得た。

プ’７スミドを４０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，
５）　−２０ｍＭＭｇＣ１２−５０ｍＭ　ＮａＣ１中合
成オリゴデオキシリボヌクレオチド・プライマー　＜　
５　’　−ＡＩＡＴＴＣＴＧＡＡＡＩＧＡＧＣＴＧＴ　
トリプトファン・プロモーターの−５５〜−３７位に相
当５ｎｇ）と６５℃で１５分間アニールし、次いで３０
分間を要して室温まで徐々に冷却した。配列決定反応は
τ７ボリメラーゼ（シークエナーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓ
ｅ　）、米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、　）
および−３５５−ｄＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）を
用いて、Ｔａｂｏｒ、　Ｓ、およびＲｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ、　Ｃ，Ｃ，の方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ｏｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４．４７６７−４７７１　
（１９８７）　］に従って行なった。決定した配列（ブ
ライマー、すなわちトリプトファン・プロモーター中の
３５塩基およびＴＴｋｔＰＡのＮ末端フード配列１１５
塩基からなる約１５０塩基）は期待された配列と一致し
た。

ｐＴＱｋＰＡΔｔｒｐのＤＮＡ配列決定も上記と同様な
方法で行なわれた。

ｐｓＴＴｋＰＡｔｒｐ、　ｐｔｈＴＴｔｒｐおよびｐｕ
ＴＴｔｒｐのＤＮＡ配列決定も合成デオキシオリゴヌク
レオチド（５′−ｆＪＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＩＣＣＴＧ
ＩＧ、天然ｔＰＡ（７）　Ｈｉｓ２９７−　Ｇｌｙ”２
に対応するＤＮＡ配列に相補的である）を用いた以外は
上記と同様にして行なった。

２８（アミノ　配列の同 実施例２５で得た５ＴＴｋｔＰＡを含む透析物から実施
例１２に記載された精製法と同様にして精製されたＳτ
τｋｔＰＡを８Ｍ尿素−５０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）　−１，５％　β−メルカプトエタノールに
溶解し、Ｃｙ！ｌ残基のＳＨ基のカルボキシメチル化の
ためにモノヨード酢酸で処理した。得られたカルボキシ
メ　チル化されたＳ１’ＴｋｔＰＡは　　Ｃ０５Ｍ０５
ＩＬ　　　５　Ｃ４−３００（４，６ｍｍφＸ　５０ｍ
ｍ、　ＮａＫａｒａｉ　Ｔｅ５ｑｕｅ）を用いる調整用
ＨＰＬＣにより精製され、気相シークエンサー４７ＯＡ
　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｃ）に
より配列決定された。その結果、５ＴＴｋｔＰＡのＮ−
末端配列はＳｅ　ｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｎ−５ａ
ｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈａ−Ｇ　１ｙ−Ａｓ
　ｎ−Ｇｌｙ−５ａｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒであり、期待さ
れた配列と一致した。

施イ２９（ＳＴ１１８の　　とクローニング）（第２０
図に図示） プラスミドｐＳτ１１２［それを含有する形質転換体で
あるＥ、、　ｃｏｌｉ　ＤＩ　−Ｉ　ＦＥＲＭ　ＢＰ−
１９６６から単離でき、ｐｓＴ１１２における天然ｔ−
ＰＡのｃＤＮＡ配列は第２１図に示きれている］を３ａ
ｍＨＩとＳａｌ　Ｉで消化した。

大きいＤＮＡ断片を単離し、　ＤＮＡポリメラーゼＩ（
フレノウ断片）で平滑末端とする。得られるＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼで自己ライゲートし、ライゲーシ
ョン混合物で旦、部具ＨＢＩＯＩを形質転換したアンピ
シリン抵抗性形質転換体の一つから、目的のプラスミド
ｐＳτ１１８を得てマツピングにより特性決定をした。

゛箱列３０（ｍＴ　ｋｌ１２の構　とクローニング）（
第２２図および第２３図に図示） プラスミドｐｓＴ１１８をシｌｆｆおよびＢｂｅ　Ｉで
消化した。大きいＤＮＡ断片を単離し、Ａｒｇ−ＩＳｉ
ｒ’　　Ｃｙｓ９２Ｔｙｒ　Ｇｌｕをフードする合成り
Ｑ　ＩＩ　−Ａｖａ　Ｉ［ＤＮＡ断片［５’　−ＧＡＩ
ＣＩＩＧＣＴＡＣＧＡＧ　ａｎｄ　５　’　−ＧＴＣＣ
ＴＣＧＴＡＧＣＡＡ。

各オリゴマーはＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（宝酒
造）によりリン酸化したコとｐｓＴ　１１Ｂから得られ
た天然ｔ−ＰＡのＡｓｐ９５−Ｇｌｙｌｌｏをコードす
るＡｖａ■−独Ｉ　　ＤＮＡ断片とをＴ　４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造）により結合した。

ライゲーション混合物を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ−
１を形質転換し、アンピシリン抵抗性形質転換体の一つ
から目的とするプラスミドｐｍｒＱｋｌ１８を単離し、
制限マツピングにより特性決定をした。

他方、プラスミドｐｓＴ１１２をＩＩ［とＸｍａ　Ｉで
消化し、大きいＤＮＡ断片を車離し、これとｐｍＴＱｋ
ｌ１８から得たＡｒｇ−１−ｙ、１５０７をコードする
１２５３　ｂｐ　Ｂ１已■−Ｘｍａ　Ｉ　ＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートし、補乳動物
細胞におけるｍＴＱｋｔＰＡの発現ベクターであるｐｍ
ＴＱｋｌ１２を得た。

施　３１ｍＴＴＫの　　とクローニング（第２４ｒＭ、
第２５図オヨび第２６ｒｌＡ　ニｒ５Ｍ　示）ｐＴＴｋ
ＰＡΔｔｒｐをＣ１ａ　ＩとＥｃｏＲＩで完全に消化し
、得られた大きいＤＮＡ断片を単離し、これとＢｇＩ　
ＩＩ制限酵素部位を含むＣ１ａ　Ｉ　−Ｄｄｅ　Ｉ合成
りＮＡ断片（５’　−ＣＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＴＣＣ
ＴＡＧＡＴＣおよび５′−ＴＣＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＣ
ＣＣＡＴＴＴＩＡ工、各ＤＮＡはＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼによりリン酸化された）とｐＩＴｈＰＡΔｔｒ
ｐから得られたＧｌｕ１７５−τｒｐ２０４をコードす
る瞼！−ジ逓ＲＩ　ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
により結合してプラスミドｐＨ５９００６を得る。

ｐＴＴｋＰＡΔｔｒｐをＥｃｏＲＩ　（部分消化）とＡ
ｐａ　Ｉで消化して７８１ｂｐ　ＤＮＡ断片を単離し、
ｐＨ５９００６から得られた４、　１ｋｂｐの彫巴ＲＩ
−但岬Ｉ　　ＤＮＡ断片とライゲートし、Ａｒｇ″″１
と５ｅｒ１７４−Ｐｒｏ５２７をコードするプラスミ　
ドｐＨ５３０２０を得た。

プラスミド３０２０をＢＩＬＴＩおよびＳｍａ　Ｉで消
化し、Ａｒｇ””と５ｅｒ１７４−Ｐｒｏ５０８をコー
ドする小さいＤＮＡ断片を単離し、ｐｍＴＱｋｌ１２か
ら得たＩＮ　−Ｓｍａ　Ｉの大きいＤＮＡ断片とライゲ
ートしてＩＴｋｔＰＡの動物細胞のための発現ベクター
であるｐｍＴＴＫを得た。

ｊｌＩ３２　　ｍ５ＴＴｋの　　とクローニングプラス
ミドｐＨ５９００６をＥｃｏＲＩで消化し、大きいＤＮ
Ａ断片を車離し、フウシ膓ホスプアターゼ（ファルマシ
ア）で脱リン酸化し、ｐｓＴＴｋΔｔｒｐから得たＡｓ
ｎ２０５−Ｌｙｓ３６１をコードする　４７２ｂｐ　Ｅ
ｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片にライゲートしてプラスミドｐＭ
Ｈ３０２５を得る。

プラスミドｐＭＨ３０２５をＩＩおよび５ｍａ　Ｉで消
化し、小さいＤＮＡ断片を単離し、ｐｍ！Ｑｋｌ１２か
ら得られたＢｇｌ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉの大きいＤＮＡ断
片とライゲートして動物細胞における５ＴＴｋｔＰＡの
発現ベクターであるプラスミドｐｍｓＴＴｋを得た。

Ｌ−９２９細胞系がこの実施例で用いられるが、Ｌ　−
９２９細胞はＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１として入手できる。

このｗＩ胞をカナマイシンと１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血
清を含むＤＭＥＭ中３７℃で５％ＣＯ２条件下で維持し
た。この細胞を形質転換の前日１０ｃｍのペトリ皿につ
き５×１０５細胞数の細胞濃度でプレートした。培地は
形質転換３時間前に交換した。２つの１０ｃｍペトリ皿
を各形質転換に用いた。

Ｌ」旦皮藍二１１ プラスミドＤＮＡを用いてゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ　）
　法［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇｌ［、１４３（１９８５
）、　ＩＲＬｐｒｅｓｓ　］と同様にしてリン酸カルシ
ウム技術によりＬ　−９２９細胞を形質転換した。

発現プラスミド（ｐｍＴＱｋｌ１２．　ｐｍＴＴｋまた
はｐｍｓＴＴｋ）３０（とプラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　
ＡＴＣＣＮｏ、　３７１４９３　ＨＥを２　Ｍ　ＣａＣ
１ｚ　（１８６ｍ　）と水（１，３１１１１１）に加え
た。ＤＮＡ溶液（１，５戚）を２　Ｘ　ＨＢＳ（１，６
３％塩化ナトリウム、１．１９％Ｈｅｐｅｓ＋　０．０
４％ＮａｚＨＰＯ４，ｐＨ７−１２）　（１，５戚）に
滴下した。混合物を細胞に接触させる前に室温で３０分
間放置した。

Ｃ１細　のトランスフェクション ＤＮＡ溶液（０，６ｍ１Ｆ＞を徐々に攪拌しながらＬ−
９２９Ｍｉ胞のｌ　０ｃｒｎペトリ皿に加え、３７℃で
Ｃｏ２気流中１８時間加温した。１０％ＦＣ５を含む完
全な新鮮成育培地を次に加え、細胞をＣＯ□気流中３７
℃で２４時間加温した。細胞をトリプシン処理し、３０
０＜／ｍＱのジエネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、　
Ｇ４１８　）および１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭからな
る選択培地中で１＝１０のサブ力ルチュアをした。ホス
ホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ’遺伝子産物）を発現す
る細胞が選択培地中で生存し、コロニーを形成すること
ができる。

培地を３−４日ごとに交換し、コロニーヲ１２−１４日
後に単離した。０４１８抵抗性コロニーを小シリンダー
中おだやかなトリプシン処理により採取し、培養塊にな
るまで増殖させ、変異ｔ−ＰＡの選択のための試験をし
た。細胞を直径１．７ｃｍの３ｒｎＱの培地を入れたマ
ルチ・ウェル・プレート皿中で３×１０５細胞数になる
まで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。細
胞をｏ、　０４ｍＭ　ＺｎＳＯ４，１ｍＭ酪酸ナトリウ
ム、２％ＦＣ５を含む、ＤＭＥＭからなる誘導培養培地
（１１１１１１）中で培養し、培地中の変異ｔ−ＰＡの
活性を５２２５１を用いる間接吸光分析法［ｒｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３１．４２７　（１９８
３）コにより確認した。

寄託のために≧、　　ｃｏｌｉ　ＤＨ１はプラスミドｐ
ｍＴＱｋｌ１２、ｐｍｒＴｋまたはｐｍｓＴＴｋを用い
て常法により形質転換された。

上記実施例で得られた下記微生物は工業技術院微生物工
業技術研究所にそれぞれプダベスト条約に基づく国際寄
託されており、下記の寄託番号がそれぞれ付されている
。

聚−皇−１亙丘亙ｊ

【図面の簡単な説明】

第１ｒＩＡは、プラスミドｐＨＶＢＢの構築およびクロ
ーニングを示す。 第２１１Ａは、プラスミドｐｃＬｉＰＡｘｔｒｐｃ７）
構築およびクローニングを示す。 第３図は、Ｂｇｌｌ［ＤＮＡ断片＜　１９７４　ｂｐ）
のＤＮＡ配列を示す。 第４図は、プラスミドｐＣＬｉＰＡΔｘｔｒｐの構築お
よびクローニングを示す。 第５図は、プラスミドｐτＱｉＰＡΔｔｒｐの構築およ
びクローニングを示す。 第６図は、プラスミドｐＴＡ９００４の構築およびクロ
ーニングを示す。 第７図は、プラスミドｐＴＴｋＰＡΔｔｒｐの構築およ
びクローニングを示す。 第８図は、ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片（４７２ｂｐ）のＤ
ＮＡ配列を示す。 第９図は、ｐＴｆｆｉＰＡΔｔｒｐの構築およびクロー
ニングを示す。 第１０図は、プラスミドｐｌＱｋＰＡΔｔｒｐの構築お
よびクローニングを示す。 第１１図は、プラスミドｐＭＨ９００３の構築およびク
ローニングを示す。 第１２図は、プラスミドｐｓＴＴｋｔｒｐの構築および
クローニングを示す。 第１３図は、プラスミドｐｚＹの構築およびクローニン
グを示す。 第１４図は、プラスミドｐｓＴＱｉｔｒｐの構築および
クローニングを示す。 第１５図は、プラスミドｐｓＴＱｋｔｒｐの構築および
クローニングを示す。 第１６図は、゛プラスミドｐＭＨ９００６の構築および
クローニングを示す。 第１７図は、プラスミドｐｔｈＴＴｔｒｐの構築および
クローニングを示す。 第１８図は、プラスミドｐＭＨ９００７の構築およびク
ローニングを示す。 第１９図は、プラスミドｐｕＴｒｔｒｐの構築およびク
ローニングを示す。 第２０図は、プラスミドｐｓＴ１１８の構築とクローニ
ングを示す。 第２１図は、ｐｓτ１１２における天然ｔ−ＰＡのｃＤ
ＮＡ配列を示す。 第２２図は、プラスミドｐｍＴＱｋｌ１８の構築とクロ
ーニングを示す。 第２３図は、プラスミドｐｍＴＱｋｌ１２の構築とクロ
ーニングを示す。 第２４図は、プラスミドｐＨ５９００６の構築とクロー
ニングを示す。 第２５図は、プラスミドｐｉ（５３０２０の構築とクロ
ーニングを示す。 第２６図は、プラスミドルｍ工τにの構築とクローニン
グを示す。 第２７図は、プラスミドｐＭＨ３０２５の構築とクロー
ニングを示す。 第２８図は、プラスミドｐｍｓＴＴｋの構築とクローニ
ングを示す。 第２９図は、ｐＴＴｋＰＡΔｔｒｐのコード領域のＤＮ
Ａ配列を示す。 第３０図は、ｐＴＴｉＰＡΔｔｒｐのコード領域のＤＮ
Ａ配列を示す。 第３１図は、ｐＴＱｋＰＡΔｔｒｐのコード領域のＤＮ
Ａ配列を示す。 第３２図は、ｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐのコード領域のＤＮ
Ａ配列を示す。 第３３図は、ｐｓＴＴｋｔｒｐのコード領域のＤＮＡ配
列を示す。 第３４図は、ｐＳＴＱｋｔｒｐのコード領域のＤＮＡ配
列を示す。 第３５図は、ｐｓＴＱｉｔｒｐのコード領域のＤＮＡ配
列を示す。 第３６図は、ｐｕＴＴｔｒｐのコード領域のＤＮＡ配列
を示す。 第３７図は、ｐｔｈτＴｔｒｐのコード領域のＤＮＡ配
列を示す。 第３８図は、ｐｍＴＱｋｌ１２のコード領域のＤＮＡ配
列を示す。 第３９図は、ｐｍＩＴｋのコード領域のＤＮＡ配列を示
す。 第４０図は、ｐｍｓＴＴｋのコード領域のＤＮＡ配列を
示す。 ｐＨｖＢＢ 第１図 ＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＣＡ
ＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡ
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ｙｒＳｅｒＧ１ｕＡｒｇＬｅｕＬｙｓＧｌｕＡｌａＨｉ
ｓ優先権主張　　６１９８７年１１月１３日［相］イギ
リス（ＧＢ）■手　続　ネ甫　正　書く方　式〉 ＼ス １、事件の表示 昭和６３年特許願第１９２３２０号 ２、発明の名称 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子３、補正をする
者 事件との関係特許出願人 大阪市東区道修町４丁目３番地 （５２４）藤沢薬品工業株式会社 代表者藤澤友吉部 ４、代理人 〒５３２ 大阪市淀用区加島２丁目１番６号　　　　　、−５藤沢
薬品工業株式会社大阪工場内　　　　゛イ＼５、補正命
令の日付 昭和６３年１０月５日 （発送臼：昭和６３年１０月２５日） ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 願書に最初に添付した図面（企図）の浄書・別紙のとお
り（内容に変更なし） 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）一次構造としての下記アミノ酸配列（ I ）：【ア
   ミノ酸配列があります】 （式中、ＲはＳｅｒ−または 【アミノ酸配列があります】 であり、 Ｘは−Ｌｙｓ−、−Ｉｌｅ−または結合手であり、Ｙは 【アミノ酸配列があります】 または【アミノ酸配列があります】 である） で示され、 上記アミノ酸配列において、Ａｓｎ＾１＾３＾４、Ａｓ
   ｎ＾２＾１＾８およびＡｓｎ＾４＾４＾８はグリコシル
   化されていてもよい組織プラスミノーゲン活性化因子。 ２）グリコシル化されていない特許請求の範囲第１項記
   載の組織プラスミノーゲン活性化因子。 ３）ＲがＳｅｒ−であり、ＸがＬｙｓ−でありＹが−Ｔ
   ｙｒＳｅｒＧｌｎＰｒｏＧｌｎＰｈｅＡｓｐＩｌｅ−で
   ある特許請求の範囲第１項記載の組織プラスミノーゲン
   活性化因子。 ４）グリコシル化されていない特許請求の範囲第３項記
   載の組織プラスミノーゲン活性化因子。 ５）特許請求の範囲第１）項で定義したアミノ酸配列（
   I ）をコードするＤＮＡ。 ６）特許請求の範囲第１）項で定義したアミノ酸配列（
   I ）をコードするＤＮＡを含有する組換えベクター。 ７）特許請求の範囲第１）項で定義したアミノ酸配列（
   I ）をコードするＤＮＡの発現ベクターを含有する形
   質転換体。 ８）特許請求の範囲第１）項で定義したアミノ酸配列（
   I ）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形
   質転換された宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物
   よりｔ−ＰＡを採取することを特徴とする、特許請求の
   範囲第１）項記載の組織プラスミノーゲン活性化因子の
   製造法。 ９）特許請求の範囲第１）項記載の組織プラスミノーゲ
   ン活性化因子を含有する医薬組成物。 １０）ヒトおよび動物起源の他の蛋白質を本質的に含有
   しない、フィンガードメインおよび成長因子ドメインを
   欠く組織プラスミノーゲン活性化因子。 １１）グリコシル化されていない、フィンガードメイン
   および成長因子ドメインを欠く組織プラスミノーゲン活
   性化因子。 １２）天然のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のＬ
   鎖およびＨ鎖のクリングル２ドメインに相当する部分か
   らなっており、ヒトおよび動物起源の他の蛋白質を本質
   的に含まない組織プラスミノーゲン活性化因子。 １３）天然のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のＬ
   鎖およびＨ鎖のクリングル２ドメインに相当する部分か
   らなっており、グリコシル化されていない組織プラスミ
   ノーゲン活性化因子。 １４）天然のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のア
   ミノ酸配列の２７５番目のアルギニンがアスパラギンに
   より置換されている特許請求の範囲第１）項記載の組織
   プラスミノーゲン活性化因子。