DK174413B1

DK174413B1 - Vævsplasminogenaktivator, DNA til kodning deraf, rekombinant vektor, transformant, samt fremgangsmåde til fremstilling af en vævsplasminogenaktivator

Info

Publication number: DK174413B1
Application number: DK198804319A
Authority: DK
Inventors: Mineo Niwa; Yoshimasa Saito; Hitoshi Sasaki; Masako Hayashi; Jouji Notani; Masakuzu Kobayashi
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co
Priority date: 1987-08-03
Filing date: 1988-08-02
Publication date: 2003-02-17
Also published as: CA1341458C; AU623340B2; US5840533A; JP2561708B2; DE3850531T2; KR890003952A; IL87276A; KR970001237B1; JP2606620B2; AU2036188A; EP0302456B1; JP2570633B2; EP0302456A1; JPH08228773A; DE3850531D1; DK431988D0; ATE108206T1; JPH07163346A; ES2056082T3; IL87276A0

Description

i DK 174413 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt vævsplasminogenak-tivatorT Især angår den en hidtil ukendt vævsplasminogenaktivator, som har stærk aktivitet med hensyn til at omdanne plasminogen til plasmin, der nedbryder fibrinnetværket i blodkoageler og danner 5 opløselige produkter, og den kan derfor anvendes som thrombolytisk middel; opfindelsen angår også en DNA-sekvens, der koder for aktivatorens amlnosyresekvens, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt et farmaceutisk præparat, der omfatter den.

Hele aminosyresekvensen og strukturen af en nativ human "vævsplasrai-10 nogenaktivator" (i det følgende betegnet "t-PA") og en DNA-sekvens, der koder for den, og som er afledt af en human melanomcelle (Bowes), er blevet opklaret ved rekombinant DNA-teknologi [jfr. Nature 301, 214 (1983)].

Den native t-PA, som fås ved ekspression af DNA, der koder for den 15 native t-PA's aminosyresekvens, i E. coli, kan imidlertid næppe genfoldes, hvorfor man kun kan isolere en umådelig lille mængde af den aktive t-PA fra de dyrkede E. coli-celler.

Ud fra resultaterne af forskellige undersøgelser er det lykkedes for nærværende opfindere at fremstille hidtil ukendt t-PA, som er godt 20 genfoldet, selv i en form af det resulterende produkt, der er vundet fra E. coli-celler, hvilket giver en aktiv t-PA, som har en længere halveringstid og en stærkere thrombolytisk aktivitet end den native t-PA.

Den hidtil ukendte t-PA ifølge den foreliggende opfindelse kan vises 25 ved nedenstående aminosyresekvens (I) som den primære struktur.

DK 174413 B1 2 180 190 R-GluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGlySerAlaTyrArgGlyThrHisSer 200 210

LeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetlleLeuIleGlyLysVal 220 230

TyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArg 240 250

AsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrp 260 270

GluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLetiArgGln Y

277 280 290 -X-GlyGlyLeuPheAXaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlalle 300 310

PheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlylleLeuIleSer 320 330

SerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeu 340 350

ThrVallleLeuGlyArgThrTyrArgValValProGluGluGluGluGlnLysPheGlu 360 370

ValGluLysTyrlleValHisLysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAspIleAla 380 390

LeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAlaGlnGluSerSerValValArgThr 400 410

ValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGly 420 430

TyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSerGluArgLeuLysGluAlaHisVal 440 450

ArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAsp 460 470

AsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAla 480 490

CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuVal 500 510

GlyllelleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspValProGlyValTyrThrLys 520 527

ValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMetArgPro DK 174413 B1 92 3 100 hvor R er Ser- eller CysTyrGluAspGlnGlylleSerTyrArgGlyThrTrp 110 120

SerThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLys 130 140

ProTyrSerGlyArgArgProAspAlalleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCys 150 160

ArgAsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSer 170 174

SerGluPheCysSerThrProAlaCysSer- X er -Lys-, -Ile- eller en binding, og 5 Y er -TyrSerGlnProGlnPheArglle-, -TyrSerGlnProGlnPheAspIle-, -TyrSerGlnProIleProArgSer- eller -ThrLeuArgProArgPheLyslle-, [Nummereringen af t-PA's aminosyresekvenser er som beskrevet i Nature 301, 217 (1983).] 10 1 ovenstående aminosyresekvens kan Asn^®\ Asn^® og Asn^® være glycosyleret afhængigt af arten af værtscellens omgivelser under fremgangsmåden til fremstilling deraf ved rekombinant DNA-teknologi. 1 nærværende beskrivelse anvendes følgende forkortelser hensigtsmæssigt for de hidtil ukendte t-PA'er ifølge den foreliggende op-13 findelse.

TTktPA

I ovenstående aminosyresekvens (I) er R Ser-, X er -Lys-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPheArglle-.

TTltPA

20 I ovenstående aminosyresekvens (I) er R Ser-, X er -Ile-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPheArglle-.

DK 174413 B1 4

TQitPA

I ovenstående aminosyresekvens (I) er R resterne mærket Cys^ til Ser174- i den native t-PA, X er -Ile-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPhe-Arglle-.

5 TQkcPA

qo I ovenstående aminosyresekvens (I) er R resterne mærket Cys3^ til Ser^·7^- i den native t-PA, X er -Lys-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPhe-Arglle-.

STTktPA

10 I ovenstående aminosyresekvens (I) er R Ser-, X er -Lys-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPheAspIle-.

STQktPA

I ovenstående aminosyresekvens (I) er R resterne mærket Cys^ til Ser^7^- i den native t-PA, X er -Lys-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPhe-15 Asplle-.

STQitPA

I ovenstående aminosyresekvens (I) er R resterne mærket Cys^ til Ser*7^- i den native t-PA, X er -Ile-, og Y er -TyrSerGlnProGlnPhe-Asplle-.

20 chTTtPA

I ovenstående aminosyresekvens (I) er R Ser*, X er en binding, og Y er -TyrSerGlnProIleProArgSer-.

5 DK 174413 B1

uTTCPA

I ovenstående aminosycesekvens (I) er R Ser-, X er -Lys-, og Y er -ThrLeuArgProArgPheLysIle-.

Den native t-PA er en enkeltkædet serinprotease, som omdannes til en S 2-kædet form, tunge og lette kæder, der er forbundet via en enkelt disulfidbinding med plasmin. Den lette kæde (L) er et proteaseområde og indeholder derfor enzymets aktive sted. Den tunge kæde (H) har et fingerområde (F) (der har homologl med fibronektin), et vækstfaktor-område (E) (som er homologt med epidermal vækstfaktor) og to kringler 10 (dvs. kringle 1- og kringle 2-område; og 1¾) med tredobbelte disulfidbindinger. Den native t-PA består således af fem funktionelle områder: F, E, Kj_, K2 og L [jfr. EP 0196920 og Proc. Jtetl. Acad. Sci.

USA 83. 4670(1986)J.

Den hidtil ukendte t-PA ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles ved rekombinant DMA-teknologi og polypeptidsyntese.

Den hidtil ukendte t-PA ifølge den foreliggende opfindelse kan således fremstilles ved dyrkning af en værtscelle, der er transformeret DK 174413 B1 6 med en ekspressionsvektor, som omfatter DNA, der koder for den hidtil ukendte t-PA's aminosyresekvens, i et nsringsmedium, hvorefter den hidtil ukendte c-PA isoleres fra dyrkningsvssken.

Ovenstående fremgangsmåde forklares nsmere i det følgende.

5 Værtscellen kan omfatte en mikroorganisme [bakterier (fx Escherichia coli, Bacillus subtills, etc.), gær (fx Saccharomyces cerevisiae, etc.)], dyrkede menneske· og dyreceller (fx CHO-celler, L929-celler, etc.) og dyrkede planteceller. Foretrukne eksempler på mikroorganismen kan omfatte bakterier, især en stamme, der tilhører slægten 10 Escherichia (fx E, coli HB101 ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM

BP-1872, E. coli 294 ATCC 31446, E. coli χ 1776 ATCC 31537, etc.), gær, dyrecellelinjer (fx muse-L929-celler, ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler), etc.) og lignende.

Når der anvendes en bakterie, især E. coli, som værtscelle, omfatter 15 ekspressionsvektoren sædvanligvis i det mindste et promotor-operator- område, en initieringskodon, DNA, der koder for den hidtil ukendte t-PA's aminosyresekvens, en termineringskodon, et terminatorområde og en replikerbar enhed. Når der som værtscelle anvendes gær eller en dyrecelle, består ekspressionsvektoren fortrinsvis af i det mindste 20 promotor, initieringskodon, DNA, der koder for signalpeptidets og den hidtil ukendte t-PA's aminosyresekvens, og termineringskodon, og eventuelt er der også i ekspressionsvektoren indsat en enhancerse-kvens, et 5'- og 3'-ikke-kodende område af den native t-PA, splejsningsforbindelsessteder, et polyadenyleringssted og en replikerbar 25 enhed.

Promotor-operatørområdet omfatter promotor, operator og Shine-Dalgar-no (SD)-sekvens (fx AAGG, etc.). Eksempler på promotor-operatorom-rådet kan omfatte konventionelt anvendte promotor-operatorområder (fx lactose-operon, PL-promotor, trp-promotor, etc.), og promotoren til 30 ekspression af den hidtil ukendte t-PA i pattedyrceller kan omfatte HTLV-promotor, SV40 tidlig eller sen promotor, LTR-prorootor, muse-metallothionein I(MMT)-promotor og vacciniapromotor.

En foretrukken Initieringskodon kan omfatte en methioninkodon (ATG).

7 DK 174413 B1

Det DNA, der koder for et signalpeptid, kan omfatte det DNA, der koder for et signalpeptid fra t-PA.

Det DNA, der koder for signalpeptidets eller den hidtil ukendte t-PA's aminosyresekvens, kan fremstilles på konventionel måde såsom 5 ved hel eller delvis DNA'syntese under anvendelse af et DNA-syntese-apparat og/eller behandling af den komplette DNA-sekvens, der koder for nativ eller muteret t-PA, indsat i en hensigtsmæssig vektor (fx pTPA21, pTPA25, pTPAl02, p5lH, pN53, pST112, etc.), der kan fås fra en transformant [fx E. coli LE 392A+ (pTPA21), E. coli JA 221 10 (pTPA25) ATCC 39808, E. coli JA 221 (PTPA102) (Lys 277 -♦ Ile) ATCC 39811, E. coli JMl09(p51H) FERM P-9774, E. coli JM109(pN53) FERM P-9775, E. coli DH-l(pST112) FERM BP-1966, etc.] eller et genom på konventionel måde (fx skæring med restriktionsenzym, dephosphory-lering med bakteriel alkalisk phosphatase, ligering under anvendelse 15 af T4-DNA-ligase).

Termineringskodonen eller -kodonerne kan omfatte konventionelt anvendte termineringskodoner (fx TAG, TGA, etc.).

Terminatorområdet kan indeholde naturlige eller syntetiske termina-torer (fx syntetisk fd-fagterminator, etc.). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Den replikerbare enhed er en DNA-sekvens, som er i stand til at 2 replikere hele den DNA-sekvens, der herer dertil, i værtscellerne, og 3 den kan omfatte et naturligt plasmid, et kunstigt modificeret plasmid 4 (fx et DNA-fragment, der er fremstillet af et naturligt plasmid) og 5 et syntetisk plasmid, og foretrukne eksempler på plasmidet kan om- 6 fatte plasmidet pBR322 eller kunstige modifikationer deraf (et DNA- 7 fragment vundet ved hensigtsmæssig restriktionsenzymbehandling af 8 p£R322) for E. coli og plasmidet pRSVneo ATCC 37198, plasmidet 9 pSV2dhfr ATCC 37145, plasmidet pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plasmidet 10 pSV2neo ATCC 37149 for pattedyrceller.

11

Enhancersekvensen kan omfatte enhancersekvensen (på 72 bp) fra SV40.

Polyadenyleringsstedet kan omfatte polyadenyleringsstedet fra SV40.

DK 174413 B1 8

Splejsningsforbindelsesstedet kan omfatte splejsningsforbindelses -stedet fra SV40.

Promotor-operatørområdet, initieringskodonen, DNA'et, der koder for den hidtil ukendte t-PA's aminosyresekvens, termineringskodonen eller 5 -kodonerne og terminatorområdet kan konsekutivt og cirkulært tilsammen være forbundet med en passende replikerbar enhed (plasmid), om ønsket under anvendelse af ét eller flere passende DNA-fragmenter (fx linker, et andet restriktionssted, etc.) på konventionel måde (fx skæring med restriktionsenzym, phosphorylering under anvendelse af 10 T4-polynukleotidkinase, ligering under anvendelse af T4-DNA-ligase) til dannelse af en ekspressionsvektor. Når der som værtscelle anvendes en pattedyrcellelinje, er det muligt, at enhancersekvensen, promotoren, det 5*-ikke-kodende område af cDNA'et for den native t-PA, initieringskodonen, DNA, der koder for signalpeptidets og den 15 hidtil ukendte t-PA's aminosyresekvenser, termineringskodonen eller -kodonerne, det 3'-ikke-kodende område, splejsningsforbindelsesstederne og polyadenyleringsstedet tilsammen er konsekutivt og cirkulært forbundet med en passende replikerbar enhed på den ovenfor beskrevne måde.

20 Ekspressionsvektoren kan indsættes i en værtscelle. Indsætningen kan udføres på konventionel måde (fx transformation, herunder transfek-tion, mikroinjektion, etc.), hvilket giver en transformant, herunder en transfektant.

Til fremstilling af den hidtil ukendte t-PA ved fremgangsmåden Ifølge 25 den foreliggende opfindelse dyrkes den således vundne transformant, der omfatter ekspressionsvektoren, i et næringsmedium.

Nsringsmediet indeholder én eller flere carbonkilder (fx glucose, glycerol, mannitol, fructose, lactose, etc.) og én eller flere uorganiske eller organiske nitrogenkilder (fx ammoniumsulfat, ammonium-30 chlorid, caseinhydrolysat, gærekstrakt, polypepton, bactotrypton, kødekstrakter, etc.). Om ønsket kan der til mediet sættes andre næringskilder [fx uorganiske salte (fx natrium- eller kaliumhydro-genphosphat, dikaliumhydrogenphosphat, magnesiumchlorld, magnesium- 9 DK 174413 B1 sulfat, calciumchlorid), vitaminer (fx vitamin Bl), antibiotika (fx ampicillin), etc.]. Til dyrkning af pattedyrceller anvendes ofte Dulbecco's modificerede Eagle's minimale essentielle medium (DMEM) beriget med føtal kalveserum og et antibiotikum.

5 Dyrkningen af transformanter kan generelt udføres ved pH 5,5-8,5 (fortrinsvis pH 7-7,5) og ved 18-40"C (fortrinsvis 25-38eC) i 5-50 timer.

Når der som værtscelle anvendes en bakterie såsom E. coli, findes den således producerede hidtil ukendte t-PA generelt i cellerne af de 10 dyrkede transformanter, og cellerne opsamles ved filtrering eller centrifugering, hvorefter deres cellevæg og/eiler cellemembran nedbrydes på konventionel måde (fx behandling med overlydsbølger og/el-ler lysozym, etc.), hvilket giver cellerester. Fra resterne kan den hidtil ukendte t-PA oprenses og isoleres på en konventionel måde, 15 der generelt anvendes til oprensning og isolering af naturlige eller syntetiske proteiner [fx opløsning af protein i et hensigtsmæssigt opløsningsmiddel (fx 8M vandig urea, 6K vandige guanidiumsalte, etc.), dialyse, gelfiltrering, søjlechromatografi, højtryksvæskechro-matografi, etc.]. Når der som værtscelle anvendes en pattedyrcelle, 20 findes den producerede hidtil ukendte t-PA generelt i dyrkningsopløsningen. Kulturfiltratet (supematanten) fås ved filtrering eller centrifugering af dyrkningsvæsken. Fra kulturfiltratet kan den hidtil ukendte t-PA oprenses på konventionel måde som eksemplificeret ovenfor.

25 Det kan være nødvendigt at isolere den aktive t-PA fra bakteriecel-lerester 1 ovenstående tilfælde. Til genfoldning af den således producerede hidtil ukendte t-PA benyttes der fortrinsvis en dialyse-metode, som omfatter, at en guanidin- eller ureaopløsning af den hidtil ukendte t-PA dialyseres i nærværelse af reduceret glutathion 30 (GSH) og oxideret glutathion (GSSG) 1 den samme koncentration af glutathioner inden for og uden for den semipermeable membran ved 4-40eC i 2-60 timer. Ved denne metode er koncentrationen af glutathioner fortrinsvis over 2 mM, og forholdet mellem reduceret glutathion og oxideret glutathion er fortrinsvis 10:1. Endvidere kan glutathio-35 neme være erstattet med cystein og cystin ved denne metode. Denne DK 174413 B1 10 metode kan fortrinsvis anvendes til genfoldning af al den t-PA, herunder nativ t-PA, der er produceret ved rekomblnant DNA-teknologi.

Den hidtil ukendte t-PA ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes som thrombolytisk middel til behandling af vaskulære sygdomme S (fx myocardieinfarkt, slagtilfælde, hjerteanfald, pulmonar emboli, dyb venethrombose, perifer arterieokklusion, etc.). Den hidtil ukendte t-PA Ifølge den foreliggende opfindelse i blanding med farmaceutisk acceptable bærere kan administreres parenteralt til pattedyr, herunder mennesker, i form af et farmaceutisk præparat såsom ved 10 infusion.

De farmaceutisk acceptable bærere kan omfatte forskellige organiske eller uorganiske bærermaterialer, der konventionelt benyttes ved fremstilling af farmaceutiske præparater, herunder et peptid eller protein (fx serumalbumin, etc.).

15 Dosen af den hidtil ukendte t-PA ifølge den foreliggende opfindelse skal varieres afhængigt af forskellige faktorer såsom sygdommens art, patientens vægt og/eller alder og desuden administrationsvejen.

Den optimale dosis af den hidtil ukendte t-PA ifølge den foreliggende opfindelse vælges sædvanligvis fra et dosisområde på 0,1-10 mg/kg/dag 20 ved injektion eller ved infusion.

Den samlede daglige mængde, der er nævnt ovenfor, kan gives til patienten delt over flere timer.

Mono- (eller di- eller tri)mer (af oligonukleotider) kan fx fremstilles ved Hiroses metode [jfr. Tanpakushitsu Kakusan Kohso 25, 255 25 (1980)], og kobling kan fx udføres på cellulose- eller polystyrenpo lymer ved en phosphotriestermetode [jfr. Nucleic Acid Research 10, 1755 (1982)].

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under henvisning til tegningen, på hvilken 30 fig. 1 viser konstruktion og kloning af plasmidet pHVBB, fig. 2 konstruktion og kloning af plasmidet pCLiPAxtrp, 11 DK 174413 B1 fig. 3 DNA-sekvensen af Bglll DNA-fragment (1974 bp), fig. 4 konstruktion og kloning af plasmidet pCLiPAAxtrp, fig. 5 konstruktion og kloning af plasmidet pTQiPAAtrp, fig. 6 konstruktion og kloning af plasmidet pTA9004, 5 fig. 7 konstruktion og kloning af plasmidet pTTkPAAtrp, fig. 8 DNA-sekvensen af EcoRI DNA-fragment (472 bp), fig. 9 konstruktion og kloning af plasmidet pTTiPAAtrp, fig. 10 konstruktion og kloning af plasmidet pTQkPAAtrp, fig. 11 konstruktion og kloning af plasmidet pMH9003, 10 fig. 12 konstruktion og kloning af plasmidet pSTTktrp, fig. 13 konstruktion og kloning af plasmidet pZY, fig. 14 konstruktion og kloning af plasmidet pSTQitrp, fig. 15 konstruktion og kloning af plasmidet pSTQktrp, fig. 16 konstruktion og kloning af plasmidet pMH9006, 15 fig. 17 konstruktion og kloning af plasmidet pthTTtrp, fig. 18 konstruktion og kloning af plasmidet pMH9007, fig. 19 konstruktion og kloning af plasmidet puTTtrp, fig. 20 konstruktion og kloning af plasmidet pSTll8, fig. 21 cDNA-sekvensen af en nativ t-PA i pST112, 20 fig. 22 konstruktion og kloning af plasmidet pmTQkll8, fig. 23 konstruktion og kloning af plasmidet pmTQkll2, fig. 24 konstruktion og kloning af plasmidet pHS9006, fig. 25 konstruktion og kloning af plasmidet pHS3020, fig. 26 konstruktion og kloning af plasmidet pmTTk, 25 fig. 27 konstruktion og kloning af plasmidet pMH3025, fig. 28 konstruktion og kloning af plasmidet pmSTTk, fig. 29 DNA-sekvensen af det kodende område i pTTkPAAtrp, fig. 30 DNA-sekvensen af det kodende område i pTTiPAAtrp, fig. 31 DNA-sekvensen af det kodende område i pTQkPAAtrp, 30 fig- 32 DNA-sekvensen af det kodende område i pTQiPAAtrp, fig. 33 DNA-sekvensen af det kodende område i pSTTktrp, fig. 34 DNA-sekvensen af det kodende område i pSTQktrp, fig. 35 DNA-sekvensen af det kodende område i pSTQitrp, fig. 36 DNA-sekvensen af det kodende område i puTTtrp, 35 fig. 37 DNA-sekvensen af det kodende område i pthTTtrp, fig. 38 DNA-sekvensen af det kodende område i pmTQkll2, fig. 39 DNA-sekvensen af det kodende område i pmTTk, og fig. 40 DNA-sekvensen af det kodende område i pmSTTk.

DK 174413 B1 12

Opfindelsen belyses nemere ved nedenstående, ikke*begr*nsende eksempler.

De i eksemplerne anvendte enzymer (fx restriktionsenzymer, bakteriel alkalisk phosphatase, T4-DNA-ligase) er alle kommercielt tilgangeli-5 ge, og betingelser for brug af enzymerne er tydelige for fagfolk, idet der fx henvises til forskrifter, der er vedlagt kommercielt forhandlede enzymer.

EKSEMPEL 1

Syntese af oligonukleotider 10 Følgende oligonukleotider blev fremstillet på konventionel måde som beskrevet ovenfor.

1) Til pHVBB

(Hindlll) (EcoRV) (Bglll) (BamHI)

LysLeuGlnAspIleGlOGlyArgSer —HP10-^-HP7-

AGCTTCAGGATATCGAAGGT^GATCTG

AGTCCTATAGCTTCCATCTAGACCTAG K-HP11—-HP 9-

HP10; AG-CTT-CAG-GAT

HP7 ; ATC-GAA-GGT-AGA-TCT-G

HP11; C-GAT-ATC-CTG-A

HP9 ; GA-TCC-AGA-TCT-ACC-TT

13 DK 174413 B1 2) Til pTQiPAAtrp og pTQkPAAtrp (Clal) fMetCys1TyrGlu (Avail) j4—HP23——HP 2 4—

CGATAAAATGTGTTATGAG TATTTTACACAATACTCCTG U-Hp 2 — HP 2 6 J

HP23; C-GAT-AAA-AT HP24; G-TGT-TAT-GAG HP25; ACA-CAT-TTT-AT HP26; GTC-CTC-ATA

Cys^· i TQitPA eller TQktPA svarer til Cys^ i den native t-PA, der er 5 beskrevet i Nature 301, 214 (1983).

3) Til pTTkPAAtrp og pTTiPAAtrp (Clal) ^MetSer1 (Ddel) j 4-HP31-=>| CGATAAAATGTC TATTTTACAGACT l*~HP32--Å

HP31; C-GAT-AAA-ATG-TC HP32? TC-AGA-CAT-TTT-AT

Ser* i TTktPA eller TTitPA svarer til Ser^·^ i den native t-PA, der 10 er beskrevet i Nature 301, 214 (1983).

DK 174413 B1 EKSEMPEL 2 14

Konstruktion og kloning af plasmldet pHVBB (som vist 1 fig. 1)

Oligodeoxyribonukleotiderne HP7 og HP11 (0,2 nmol af hver; se eksempel 1-(1)) blev phosphoryleret i 20 μΐ af en ligeringsbuffer (1 mM 5 ATP, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 20 mM dithiothreitol, 1 mM spermidin, 50 pg/ml bovint serumalbumin) med 2,5 enheder T4-polynu-kleotidkinase {Takara Shuzo) ved 37^0 il time. Efter varmeinaktivering af enzymet blev der til reaktionsblandingen sat de andre oligodeoxyribonukleo tider HP10 og HP9 (0,4 tmol af hver), 1 μΐ 20 mM ATP 10 og 900 enheder T4-DNA-ligase (Takara Shuzo). Den resulterende blanding blev inkuberet ved 15*C i 30 minutter, hvilket gav et råt 27 bp langt DMA-fragment.

På den anden side blev pCLaHtrp3t (en ekspressionsvektor for a-hANP, hvis fremstilling er beskrevet i EP 0206769) skåret med BamHI og 15 Hindlll. Det resulterende 4137 bp lange DNA-fragment blev Isoleret ved 0.8X agarosegelelektroforese og ligeret til det rå 27 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1 [jfr. T. Maniatis et al.,

Molecular Cloning, s. 505 (1982), Cold Spring Harbor Laboratory (New 20 York)]. Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid, pHVBB (4164 bp), isoleret og karakteriseret ved skæring med restriktionsendonukleaser (Bglll, EcoRV, PstI, Hindlll og BamHI).

EKSEMPEL 3 25 Konstruktion og kloning af plasmidet pCLLPAxtrp (som vist i fig. 2) pHVBB blev skåret med Bglll. Det resulterende 4164 bp lange lineære DNA blev inkuberet med bakteriel alkalisk phosphatase (Takara Shuzo) i 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) ved 37eC i 1 time for at dephosphorylere DNA'ets begge 5'-ender. Det resulterende DNA blev isoleret ved 5X 30 polyacrylamidgelelektroforese (PAGE).

15 DK 174413 B1 På den anden side blev pTPAl02 (Lys277 -+ He) [en ekspressionsvektor for mute ret t-PA (Lys277 -· Ile), en transformant omfattende samme, E. coli JA 221 (pTPA102) (Lys277 -♦ Ile) ATCC 39811] skåret med Bglll, og et 1974 bp langt DNA-fragment (hvis DNA-sekvens er vist i fig. 3) 5 blev isoleret. Fragmentet blev ligeret til det 4164 bp lange Bglll DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Efter transformation af E. coli MM294 ATCC 33625 blev der vundet en ampicillinresistent transformant, som barer det ønskede plasmid, pCLiPAxtrp (6138 bp), og i hvilken det 1974 bp lange t-PA-gen var Indsat i retning med uret 10 nedstrøms for peptid-CLa-genet. pCLiPAxtrp blev karakteriseret ved skæring med restriktionsendonukleaser (Pvull, EcoRl og Bglll).

EKSEMPEL 4

Konstruktion og kloning af plasmidet pCLiPAhxtrp (som vist i fig. 4) pCLiPAxtrp blev skåret med BamHI og SacI, og det resulterende 5388 bp 15 lange DNA-fragment blev Isoleret. På den anden side blev pCLiPAxtrp skåret med Sau3AI og Sacl. Det resulterende 389 bp lange DNA-fragment blev ligeret til det 5388 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicillinresistente trans formante r blev det 20 ønskede plasmid pCLiPAAxtrp (5777 bp) isoleret, og det blev karakteriseret ved skæring med restriktionsendonukleaser (Clal, EcoRl,

Xhol, Narl og Sacl).

EKSEMPEL 5

Konstruktion og kloning af plasmidet pTQLPAAtrp (som vist i fig. 5) 25 Ovennævnte pTPA102 (Lys277 -* Ile) blev skåret med Avail og Bbel, en isoschizomer af Narl, hvilket gav en 4 nukleotider lang enkeltstren-get kohæsiv terminal, og det resulterende 50 bp lange DNA-fragment, som koder for Asp^S - Ala^7- af nativ t-PA, blev isoleret. På den anden side blev et syntetisk 19 bp langt Clal-Avall DNA-fragment 30 fremstillet ud fra HP23, HP24, HP25 og HP26 (se eksempel 1) under DK 174413 B1 16 anvendelse af T4-polynukleotidkinase og T4-DNA-ligase. Det blev ligeret til det 50 bp lange DNA-fragment med T4-DNA-ligase til konstruktion af det 69 bp lange Clal-Bbel DNA-fragment.

pCLiPAAxtrp blev lineariseret ved partiel skæring med Bbel. Det 5 resulterende 5777 bp lange DNA-fragment blev skåret med Clal, og et 5149 bp langt DNA-fragment blev isoleret. Det blev ligeret til det 69 bp lange Clal-Bbel DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicillinresistente transformanter vandtes det ønskede plasmid 10 pTQiPAAtrp (5218 bp), som blev karakteriseret ved skæring med re-striktionsendonukleaser.

E. coli HB101-16 [HB101 <recA+, supE+, htpRl6(am), tetr) FERM P-9502] blev transformeret med pTQiPAAtrp, hvilket gav en transformant, E. coli HB101-16 (pTQiPAAtrp).

15 EKSEMPEL 6

Konstruktion og kloning af plasmldet pTA9004 (som vist i fig. 6) pCLiPAAxtrp blev skåret med Ddel og EcoRl, og der blev isoleret et 91 bp langt DNA-fragment, som koder for Glu^5 . χΓρ204 ^ nativ t-PA.

Det resulterende DNA blev ligeret til oligodeoxyribonukleotideme 20 HP31 og HP32 (se eksempel 1-(3)) under anvendelse af T4-polynukleo-tidkinase og T4-DNA-ligase. Det resulterende 103 bp lange Clal-EcoRl DNA-fragment blev ligeret til det 4397 bp lange Clal-EcoRl-fragment fra pCLiPAAxtrp i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicil-25 linresistente transformanter vandtes det ønskede plasmid pTA9004 (4500 bp).

DK 174413 B1 EKSEMPEL 7 17

Konstruktion og kloning af plasmidet pTTkPAEtrp (som vist i fig. 7) pTA9004 blev skåret ned EcoRi, og det resulterende DNA-fragment (4500 bp) blev dephosphoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase. På den 5 anden side blev pTPA21, som omfatter den komplette cDNA-sekvens, der koder for den native t-PA, og en del af det 3 · - ikke -kodende område, skåret med EcoRi, og der blev isoleret et 472 bp langt DNA-fragment, som koder for Asn^5 - Lys^^ i nativ t-PA (hvis DNA-sekvens er vist i fig. 8). Det resulterende DNA-fragment blev ligeret til det dephos-10 phorylerede 4500 bp lange EcoRI DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pTTkPAAtrp (4972 bp) isoleret. E. coli HB101-16 blev transformeret med pTTkPAAtrp, hvilket gav en transformant, E. coli 15 HB101-16 (pTTkPAAtrp).

EKSEMPEL 8

Konstruktion og kloning af plasmidet pTTiPAAtrp (som vist i fig. 9) pTA9004 blev skåret med EcoRi, og det resulterende DNA blev dephos-phoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase. På den anden side blev 20 pTPAl02 (Lys^?? -» Ile) som nævnt ovenfor skåret med EcoRi, og der blev isoleret et 472 bp langt DNA-fragment, som koder for Asn^O^ -LyS361 £ muteret t-PA (Lys^? ·* Ile). Det resulterende DNA-fragment blev ligeret til det dephosphory lerede 4500 bp lange EcoRi DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt 25 til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pTTiPAAtrp (4972 bp) isoleret. E. coli HB101-16 blev transformeret med pTTiPAAtrp, hvilket gav en transformant, E. coli HB101-16 (pTTiPAAtrp).

EKSEMPEL 9 DK 174413 B1 18

Ekspression og isolering

En enkelt koloni af E. coli HB101-16 (pTTkPAAtrp) blev lnokuleret til 5 ml steriliseret LA-væske indeholdende 10 g bactotrypton, 5 g 5 gærekstrakt, 5 g NaCl, 50 pg/ml ampicillln (pH 7,2-7,4) i et reagensglas og inkuberet ved 37“C i 8 timer under omrystning. Dyrknings-væsken blev sat til 100 ml steriliseret frisk 1A-væske 1 en kolbe og inkuberet ved 37®C i 15 timer under omrystning. En portion (20 ml) af den resulterende væske blev sat til 400 ml steriliseret M9CA-væske 10 indeholdende 25 pg/ral ampicillln, og den blendede væske blev inkuberet ved 37°C. Når væskens A^qq nåede ca. 0,6, blev der til væsken sat β-indolacrylsyre til en slutkoncentration på 10 pg/ml. Den resulterende væske blev inkuberet ved 37®C i 3 timer og centrifugeret ved 4®C, 8900 x g i 10 minutter. De høstede celler blev suspenderet i 15 100 ral 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) indeholdende 5 oiM. EDTA og behandlet med 50 mg lysozym ved 4®C i 1 time. Den resulterende blanding blev homogeniseret 1 en Biotron-blender og centrifugeret ved 4®C, 8900 x g i 30 minutter. Pelleteme blev vasket med 100 ml 50% vandig glycerol og opløst i 800 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) indeholdende 8M urea. Til 20 ureaopløsningen sattes 480 mg GSH (Kojin) og 96 mg GSSG (Kojin). Den resulterende blanding blev dialyseret to gange mod 16 liter af en bufferopløsning (pH 9,5) indeholdende 20 mM eddikesyre, 40 mM ammoniak, 2 mM GSH og 0,2 mM GSSG ved 4*C i 15 timer. Efter centrifugering af blandingen blev supernatanten analyseret ved følgende fibrin-25 pladeassay. Fibrinpladeassayet (FPA) blev udført ved metoden Ifølge T. Astrup og S. Mullertz, Arch. Biochem. Biophys. 40, 346-351 (1952) med mindre modifikationer. En fibrinplade blev fremstillet ved blanding af 5 ml 1,2% human plasminogenrigt fibrinogen (Green - Cross) i 100 mM phosphatbuffer (pH 7,2) med 5 ml thrombin (Mochida, 50 enhe-30 der) i den samme buffer, efterfulgt af henstand ved stuetemperatur i 1 time. Testopløsningen eller human nativ t-PA (WHO-standard) (10 μΐ af hver) blev inkuberet ved 37®C i 18 timer. Idet human nativ t-PA blev anvendt som standard, blev prøvernes aktiviteter beregnet ud fra arealet af lysezoneme. Det fremgår af resultatet af assayet, at 35 t-PA-aktiviteten af den supernatant, der indeholdt TTkPA, var 2,3 x 10* ID nativ t-PA/liter.

EKSEMPEL 10 DK 174413 B1 19

Ekspression og isolering

En enkelt koloni af E. coll HB101-16 (pTTiPAAtrp) blev dyrket, og TTitPA blev Isoleret fra den resulterende dyrkningsvsske på 1 det 5 væsentlige samme måde som beskrevet 1 eksempel 9. t-PA-aktiviteten af den resulterende supernatant, der Indeholdt TTitPA, var 2,0 x 10^ IU nativ t-PA/liter.

EKSEMPEL 11

Ekspression og isolering 10 En enkelt koloni af E. coll HBlOl-16 (pTQiPAAtrp) blev dyrket, og TQitPA blev isoleret fra den resulterende dyrknlngsvsske på i det vcsentlige samme måde som beskrevet 1 eksempel 9. t-PA-aktiviteten af den resulterende supernatant, der indeholdt TQitPA, var 2,0 x 10^ IU nativ t-PA/liter.

15 EKSEMPEL 12

Oprensning af TTktPA

Alle procedurer blev udført i et koldt rum (ved 4-6"C). Plasminogen-aktivatoren, TTktPA renatureret i supematanten, blev isoleret og oprenset som følger: 20 I første trin blev en supernatant, der var fremstillet af 20 liter af en dyrkningsvæske, som var vundet på lignende måde som beskrevet i eksempel 9 {TTktPA total aktivitet: 3,4 x 10^ IU nativ t-PA (WHO)] blev sat på en benzamidin-Sepharose-søjle [1,6 cm x 3 cm; p-amino-benzamidin var bundet covalent til CH Sepharose 4B (Pharmacia) ved 25 carbodiimidmetoden, der er beskrevet i litteraturen: Las Holmberg et DK 174413 B1 20 al., BBA 445, 215-222 (1976)] ekvilibreret med 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) Indeholdende 1 M NaCl og 0.01X (vol/vol) Tween 80 og blev derpå vasket med samme buffer. Plasminogenaktivatoren blev elueret med 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) indeholdende 1 H arginin og 0,012 (vol/vol) 5 Tween 80.

I nmste trin blev puljede aktive fraktioner sat på en IgG-koblet Sepharose (FTP 1163)-sejle (1,6 cm x 3 cm) [monoklonalt anti-t-PA-antistof: FTP 1163 (Tsutomu Kaizu et al., Thrombosis Research 40, 91-99 (1985) blev koblet til CNBr-aktiveret Sepharose 4B i henhold til 10 fabrikantens instruktioner] »kvilibreret med 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0).

Søjlen blev vasket med 0,1 H Tris-HCl (pH 8,0) indeholdende 1 M NaCl, 0,012 (vol/vol) Tween 80 og Aprotinin (10 KlU/ml, Sigma). Eluering blev udført med 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5) indeholdende 0,5 M NaCl, 0,012 Tween 80 og Aprotinin (10 KIU/ml).

15 I det sidste trin blev puljede aktive fraktioner fra IgG-Sepharose (FTP 1163)-søjlen dialyseret mod 1 liter 0,01 M phosphatbuffer (pH 7,4) indeholdende 1,6 M KSCN og 0,012 (vol/vol) Tween 80. Den dialyserede opløsning blev koncentreret til ca. 2 ml ved dialyse mod fast polyethylenglycol 20.000. Det vundne koncentrat blev gelfiltreret på 20 Sephacryl S200HR (Pharmacia, 1,6 cm x 90 cm) i 0,01 M phosphatbuffer (pH 7,4) indeholdende 1,6 M KSCN og 0,012 (vol/vol) Tween 80. De puljede aktive fraktioner blev koncentreret til ca. 10 ml ved dialyse mod fast polyethylenglycol 20.000, og koncentratet blev derpå dialyseret mod 0,1 M ammoniumhydrogencarbonat indeholdende 0,15 M NaCl og 25 0,012 (vol/vol) Tween 80, hvilket gav et dialysat indeholdende op renset TTktPA (3,4 mg, 7,35 x 10^ IU nativ t-PA (WH0)/mg*protein).

Den oprensede TTktPA har følgende karakteristika.

(i) Analytisk SDS-PAGE

En 152 polyacrylamidgel blev fremstillet ved Laemmli-metoden (U.K.

30 Laemmli, Nature (London) 227, 680-685 (1970)). Gelen blev farvet med sølv (H.M. Poehling et al., Electrophoresis 2, 141 (1981)).

21 DK 174413 B1 Således oprenset TTfctPA vandrer ved SDS-PAGE som et enkelt bånd ved 35 kD under reducerende betingelser og 32 kD under lkke-reducerende betingelser, hvorimod materiale inkuberet med plasmin-Sepharose (Per Uallin et al., BBA 719, 318-328 (1982)) gav to bånd ved 30 kD (pro-5 teaseområde) og 13,5 kD (kringleområde) i nærværelse af reduktions-middel og kun ét bånd ved 32 kD i fravær af reduktionsmiddel.

(ii) HPLC

Oprenset TTktPA blev sat på en (4,6 mm x 75 mm) Ultrapore RPSC-søjle (Beckman, USA). Eluering blev udført med en lineær gradient af aceto-10 nitril (10-60% (vol/vol)) i 0,1% (vol/vol) trifluoreddikesyre ved en strømningshastighed på 1,0 ml/minut i løbet af 30 minutter.

I dette system blev TTktPA elueret som en enkelt større art ved en acetonitrilkoncentration på ca. 36,5% (vol/vol).

(iii) N-terminal sekvensanalyse 15 Oprenset enkeltkædet TTktPA blev reduceret og carboxymethyleret, afsaltet på HPLC (Ultrapore RPSC-søjle), koncentreret i en Speed Vac Concentrator (Savant) og analyseret under anvendelse af en gasfase-sequencer, model 370A (Applied Biosystem), Den således vundne TTktPA*s N-terminale aminosyresekvens var som følger: 20 SerGluGlyAsn- EKSEMPEL 13

Konstruktion og kloning af plasmidet pTQkPAAtrp (som vist i fig. 10)

Plasmidet pTQiPAåtrp blev skåret med EcoRl. Reaktionsblandingen blev dephosphoryleret med bakteriel alkalisk phosphatase, og det resul-25 terende 4744 bp lange DNA-fragment blev isoleret. På den anden side blev plasmidet pTPA21 skåret med EcoRl, og det resulterende 472 bp lange DNA-fragment blev isoleret. Det 472 bp lange DNA-fragment blev ligeret til det 4744 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA- DK 174413 B1 22 ligase, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. c oli DH-1. Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pTQkPAAtrp isoleret og karakteriseret ved restrik« tionskortlagning. E. c oli ΗΒ101Ί6 blev transformeret aed plasmidet 5 pTQkPAdtrp, hvilken gav en transformant, E. coli HB101-16 (pTQkPAdtrp).

EKSEMPEL 14

Syntese af oligonukleotider Følgende oligonukleotider blev fremstillet på konventionel måde som 10 beskrevet ovenfor.

1) Linkersekvens for pSTTktrp og pSTQktrp (Ddel) (EcoRV) (Stul) 266 270 275

LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheAspIleLysGlyGly _ SKI (4Oner) _^ TGAGACAGTACAGCCAGCCACAGTTTGATATCAAAGGAGG CTGTCATGTCGGTCGGTGTCAAACTATAGTTTCCTCC _SK2 (37mer) 2) Linkersekvens for pSTQitrp 15 (Ddel) (EcoRV) (Stul) 266 270 275

LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheAspIlelleGlyGly |f BP56 (40mer) ^ TGAGACAGTACAGCCAGCCACAGTTTGATATCATAGGAGG CTGTCATGTCGGTC GGTGTCAAACTATAGTATC CTCC tø_HP57 (37mer)_ 23 DK 174413 B1 3) Linkersekvens for pthTTtrp (Ddel) (Bqlll) (Stul) 266 275

LeuArgGlnTyrSerGlnProIleProArgSerGlyGly gP60 (37mer) J

TGAGACAGTACAGCCAGCCAATTCCTAGATCTGGAGG CTGTCATGTCGGTCGGTTAAGGATCTAGACCTCC HP6I (34mer)_ 4) Linkersekvens for puTTtrp 5 (Ddel) (SacII) 266 275

LeuArqGlnThrLeuArqProArqPheLys ^_EP58 (29mer) jj

TGAGACAGACTCTGCGTCCGCGGTTCAAA CTGTCTGAGACGCAGGCGCCAAGTTT ^_HP59 (26mer)_J

Tal over aminosyrerne henviser cil stillingerne i den native t-PA son beskrevet af Pennies et al., Nature 301, 214-221, 1983.

EKSEMPEL 15 10 Konstruktion og kloning af plasmidet pHH9003 (soa vist i fig. 11)

Plasmidet pTA9004 blev skåret ned EcoRI og Stul, og det resulterende 4329 bp lange DNA-fragment blev isoleret. DNA-fragmentet blev ligeret til de syntetiske ollgodeoxyribomikleotider SKI og SK2 under anvendelse af T4-polynukleotidkinase og T4-DNA-ligase. Reaktionsblandingen 15 blev behandlet med EcoRI for at rekonstruere den kohasive ende skåret med EcoRI, og det resulterende EcoRI-Ddel DNA-fragment (4367 bp) blev ligeret til det 184 bp lange EcoRl-Ddel DNA-fragment, som koder for Asn^®^ - Leu^66 i den native t-PA, og som var vundet fra plasmidet DK 174413 B1 24 pCLiPAAxtrp, I nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicillin-resistente transformanter blev det enskede plasmid pMH9003 isoleret og karakteriseret ved skæring med restriktionsendonukleaser.

5 EKSEMPEL 16

Konstruktion og kloning af plasm idet pSTTktrp (som vist i fig. 12)

Plasmldet pHH9003 blev skåret med Stul, og det resulterende Defragment (4551 bp) blev dephosphoryleret med kalvetarmsphosphatase (Pharmacia AB). Derimod blev plasmldet pCLiPAAxtrp skåret med Stul, 10 og det resulterende 419 bp lange DNA-fragment, der koder for Gly^^ -Ala^® i nativ t-PA, blev isoleret. Det resulterende DNA-fragment blev ligeret til det 4551 bp lange Stul DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicilllnresistente transformanter blev 15 det ønskede plasmid pSTTktrp isoleret og karakteriseret ved skæring med restriktionsendonukleaser. E. coli HB101-16 blev transformeret med plasmldet pSTTktrp, hvilket gav en transformant, E. coli HB101-16 (pSTTktrp).

EKSEMPEL 17 20 Konstruktion og kloning af plasmidet pZY (som vist i fig. 13)

Plasmldet pTQiPAAtrp blev skåret med EcoRI og Stul, og det resulterende 4575 bp lange DNA-fragment blev isoleret. DNA-fragmentet blev ligeret til de syntetiske ollgodeoxyribonukleotider HP56 og HP57 under anvendelse af T4-polynukleotidkinase og T4-DNA-ligase. Reak-25 tionsblandingen blev behandlet med EcoRI for at rekonstruere den kohæsive ende skåret med EcoRI, og det resulterende EcoRI-Ddel DNA-fragment (4613 bp) blev ligeret til det 184 bp lange EcoRI-Ddel DNA-fragment , der koder for Asn^®·* - Leu^® i nativ t-PA, og som var fremstillet ud fra plasmidet pCLiPAAxtrp, i nærværelse af T4-DNA-30 ligase.

25 DK 174413 B1

Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1.

Fra én af de ampicil linresis ten te transformant er blev det ønskede plasmid pZY isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlægning.

EKSEMPEL 18 5 Konstruktion og kloning af plasmidet pSTQitrp (soa vist i flg. 14)

Plasmidet pZY blev skåret med Stul, og det resulterende DNA-fragment (6797 bp) blev dephosphoryleret med kalvetarmsphosphatase. Derimod blev plasmidet pCLiPAAxtrp skåret med Stul, og det resulterende 419 bp lange DMA-fragment, der koder for Gly^V . Ala^l^ £ nativ t-PA, 10 blev isoleret. Det 419 bp lange DNA-fragment blev ligeret til det 4797 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligerings-blandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-l. Fra én af de ampicillinresistente trans formenter blev det ønskede plasmid pSTQitrp isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlægning. E.

15 c oli HB101-16 blev transformeret med plasmidet pSTQitrp, hvilket gav en transformant, E. coli HB101-16 (pSTQitrp).

EKSEMPEL 19

Konstruktion og kloning af plasmidet pSTQktrp (som vist i fig. 15)

Plasmidet pSTTktrp blev skåret med Clal og EcoRV, og det resulterende 20 4656 bp lange DNA-fragment blev Isoleret. Derimod blev plasmidet pSTQitrp skåret med Clal og EcoRV, og det 560 bp lange DNA-fragment, der koder for Cys^ - Asp^·®^ i STQltPA, blev isoleret. Det resulterende DNA-fragment blev ligeret til det 4656 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at 25 transformere E. coli DH-1.

Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pSTQktrp isoleret og karakteriseret ved restriktionskort· DK 174413 B1 26 lægning. E. coli HBlOl-16 blev transformeret ned pSTQktrp, hvilket gav en transformant, E. coli HBlOl-16 (pSTQktrp).

EKSEMPEL 20

Konstruktion og kloning af plasmidet pHH9006 (som vist i fig. 16) 5 Plasmidet pTA9004 blev skåret med Stul og EcoRI, og det resulterende 4329 bp lange DNA-fragment blev isoleret. DNA-fragmentet blev ligeret til de syntetiske oligodeoxyribonukleotider HP60 og HP61 under anvendelse af T4-polynukleotidkinase og T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev skåret med EcoRI for at regenerere den kohæsive ende 10 skåret med EcoRI, og det resulterende EcoRI-Ddel DNA-fragment (4364 bp) blev ligeret til det 184 bp lange EcoRI-Ddel DNA-fragment, der koder for Asn^®^ - Leu^®** i nativ t-PA, og som var fremstillet fra plasmidet pCLiPAAxtrp. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1. Fra én af de ampicillinresistente transfor-15 manter blev det ønskede plasmid pMH9006 isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlægning.

EKSEMPEL 21

Konstruktion og kloning af pthTTtrp (som vist i fig. 17)

Plasmidet pMH9006 blev skåret med Stul, og det resulterende linear!-20 serede DNA-fragment (4548 bp) blev dephosphoryleret med kalvetarms· phosphatase. Derimod blev plasmidet pCLiPAAxtrp skåret med Stul, og det 419 bp lange DNA-fragment, der koder for Gly^® - Ala^^ i nativ t-PA, blev isoleret. Det resulterende DNA-fragment blev ligeret til det 4548 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Lige-25 ringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1.

Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pthTTtrp isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlægning. E. coli HBlOl-16 blev transformeret med plasmidet pthTTtrp, hvilket gav en transformant, E. coli HBlOl-16 (pthTTtrp).

27 DK 174413 B1 EKSEMPEL 22

Konstruktion og kloning af p lasmide c pHH9007 (som vist i fig. 18)

Plasmidet pMH9003 blev skåret med EcoRI og EcoRV, og det 4340 bp lange DNA-fragment blev Isoleret. Det resulterende DMA-fragment blev 3 ligeret til de syntetiske oligodeoxyribonukleotider HP58 og HP59 ved anvendelse af T4-polynukleotidkinase og T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev behandlet med EcoRI for at regenerere den kohæs ive terminal skåret med EcoRI.

Det resulterende DNA-fragment (4367 bp) blev ligeret til det 184 bp 10 lange EcoRI-Ddel DNA-fragment, der var vundet fra plasmidet pCLiPAAxtrp, i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1.

Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pMH9007 Isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlæg-15 ning.

EKSEMPEL 23

Konstruktion og kloning af plasmidet puTTtrp (som vist i fig. 19)

Plasmidet pMH9007 blev skåret med Stul, og det resulterende lineari-serede DNA-fragment (4551 bp) blev dephosphoryleret med kalvetarms· 20 phosphatase. Derimod blev plasmidet pCLiPAAxtrp skåret med Stul, og det resulterende 419 bp lange DNA-fragment blev isoleret. Det 419 bp lange DNA-fragment blev ligeret med det 4551 bp lange DNA-fragment i nærværelse af T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli DH-1.

25 Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid puTTtrp isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlæg- DK 174413 B1 28 ning. E. coli HB101-16 blev transformeret med plasmidet puTTtrp, hvilket gav en transformant, E. coli HB101-16 (puTTtrp).

EKSEMPEL 24

Ekspression og isolering 5 E. coli HB101-16 (pTQkPAAtrp) blev dyrket, og TQktPA blev Isoleret fra den resulterende dyrkningsveske på i det væsentlige samme måde som beskrevet i eksempel 9. t-PA-aktiviteten af den resulterende supernatant, der indeholdt TQktPA, var 7,7 x 10^ 1U nativ t*PA/liter.

EKSEMPEL 25 10 Ekspression og isolering E. coli HB101-16 (pSTTktrp), E. coli HB101-16 (pSTQktrp), E. coli HB101-16 (pSTQitrp), E. coli HB101-16 (pthTTtrp) og E. coli HB101-16 (puTTtrp) blev anvendt til ekspression af hidtil ukendte t-PA'er.

Dyrkning af bakterierne blev udført på i det væsentlige samme måde 15 som beskrevet i eksempel 9. De cellepelleter, der blev vundet fra den resulterende dyrkningsvæske (200 ml), blev suspenderet i 20 ml 10 mM phosphatbufret saltopløsning (pH 8,0) og sonikeret ved 4®C i 1 minut.

Efter centrifugering ved 15.000 omdr./minut i 20 minutter ved 4*C blev de resulterende pelleter suspenderet i 20 ml Triton X-100-op-20 løsning (0,5X Triton X-100, 8X saccharose, 50 mM EDTA, 10 mM Tris-HC1 (pH 8,0) og sonikeret ved 4'C i 1 minut. Suspensionen blev centrifugeret ved 15.000 omdr./minut i 20 minutter. De resulterende pelleter blev vasket successivt med 20 ml 50X vandig glycerol og 20 ml iskold ethanol og opløst i 20 ml 8M ureaopløsning indeholdende 25 8M urea, 20 mM eddikesyre, 40 mM ammoniumhydroxid, 0,4 mM cystein og 0,04 mM cystin (pH 9,5) ved sonikering.

Efter centrifugering ved 15.000 omdr./minut i 20 minutter blev super-natanten fortyndet til A280-0.1 (absorbans ved 280 nm) med 8M ureaop-løsningen. Den resulterende opløsning blev dialyseret mod et 10 gange 29 DK 174413 B1 så stort volumen vandig opløsning Indeholdende 20 mM eddikesyre, AO mM ammoniumhydroxid, 0,4 mM cystein og 0,04 mM cystin (pH 9,5) ved stuetemperatur i 15 timer. 1 ovenstående procedure blev hvert af dialysateme, der indeholdt de hidtil ukendte t-PA'er, STTktPA, 5 STQktPA, STQitPA, thTTtPA eller uTTtPA, vundet fra dyrkningsvasken af henholdsvis E. coli HB101-16 (pSTTktrp), E. coli HB101-16 (pSTQktrp), E. coli HB101-16 (pSTQitrp), E. coli HB101-16 (pthTTtrp) og £. coli HB101-16 (puTTtrp). Hvert af de resulterende dialysater blev underkastet fibrinpladeassayet som beskrevet i eksempel 9. Resultaterne 10 fremgår af nedenstående tabel.

Hidtil ukendt t-PA Aktivitet indeholdt i dialysatet (IU natlv t-PA/liter) STTktPA 1,1 x 105 15 STQktPA 2,3 x 104 STQitPA 2,3 x 104 thTTtPA 3,7 x 104 uTTtPA ikke detekteret *) 20 *) uTTtPA kan være en proenzym-lignende prouroklnase. Selv om den var inaktiv i fibrinpladeassayet, blev den produceret i en mængde på 29 pg/liter af dyrkningsvæsken, hvilket blev analyseret ved enzym-immunoassay.

EKSEMPEL 26 25 Bestemmelse af de hidtil ukendte t-EA'ers molekylvagt

Molekylvægten af de hidtil ukendte t-PA'er, der blev fremstillet ifølge ovenstående eksempler, blev bestemt ved SDS-PAGE-analyse under anvendelse af markørproteiner (94.000, 67.000, 45.000, 30.000 og 14.400 dalton). Resultaterne fremgår af nedenstående tabel.

DK 174413 B1 30

De hidtil ukendte t-PA'er Molekylvægt (dalton) TTktPA ca. 38.000 TTitPA ca. 38.000 5 TQitPA ca. 45.000 TQktPA ca. 45.000 STTktPA ca. 38.000 STQktPA ca. 45.000 STQitPA ca. 45.000 10 thTTtPA ca. 38.000 uTTtPA ca. 38.000 EKSEMPEL 27

Identifikation af DNA-sekvens 15 Ekspressionsvektorer blev karakteriseret og identificeret ved restriktionskortlægning efterfulgt af partiel DNA-sekventering ved dideoxyribonukleotid-kædetermlneringsmetoden [A.J.H. Smith, Hath.

Enzym. 65, 560-580 (1980)] anvendt på dobbeltstrenget DNA.

Plasmidet pTTkPAAtrp (2 pg i 16 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) - 1 mM 20 EDTA) blev behandlet med 2 mM EDTA (2 pi) og 2N NaOH (2 μΐ) ved stuetemperatur i 5 minutter. Til den resulterende blanding sattes 5 M ammoniumacetat (8 pi) og EtOH (100 pi). Blandingen blev afkølet ved -80eC i 30 minutter og centrifugeret ved 12.000 omdr./minut i 5 minutter. Efter kassering af supematanten blev præcipitater vasket 25 med iskold 70X vandig EtOH og tørret i vakuum, hvilket gav det denaturerede plasmid.

Plasmidet blev sammenføjet med en syntetisk oligodeoxyribonukleotid-primer (5'-ATATTCTGAAATGAGCTGT, svarende til fra -55. til ca. -37. stilling i tryptophan-promotoren, 5 ng) i 40 mM Tris-HCl (pH 7,5) -30 20 mM MgCl2 - 50 mM NaCl ved 65eC i 15 minutter, efterfulgt af for sigtig afkøling til stuetemperatur i løbet af 30 minutter. Sekven-teringsreaktionen blev udført med T7-polymerase (Sequenase, United 31 DK 174413 B1

States Biochemical Corp) og -^S-dATP (Amersham) 1 henhold til S.

Tabor og C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54, 4767-4771 (1987). Den bestemte sekvens (ca. 150 baser fra prioeren, dvs. 35 baser i tryptophan-promotoren og 115 baser i den N-terminale kodende 5 sekvens af TTktPA) var identisk med den forventede sekvens.

DNA-sekventeringen af pTQkPAAtrp blev udført på lignende måde som beskrevet ovenfor.

DNA-sekventeringen af pSTTkPAtrp, pthTTtrp og puTTtrp blev udført på lignende måde som beskrevet ovenfor bortset fra, at der blev anvendt 10 et syntetisk oligodeoxyribonukleotid (5' -CTCCGGGCGACCTCCTGTG, komplementært med DNA-sekvensen for His^7 - dy302 nativ t-PA).

EKSEMPEL 28

Identifikation af aminosyresekvens

Oprenset STTktPA, som var oprenset fra det 1 eksempel 25 vundne 15 dialysat, der omfattede STTktPA, ved en oprensningsmetode som beskrevet i eksempel 12, blev opløst i 8M urea - 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) - 1.5X 5-mercaptoethanol og behandlet med monoiodeddikesyre til carboxymethylering af SH-gruppen i Cys-rester. Den resulterende carboxymethylerede STTktPA blev oprenset ved præparativ HPLC under 20 anvendelse af C0SM0S1L 50^-300 (4,6 mm φ x 50 mm, Nakaral Tesque) og sekventeret ved hjælp af en gasfase-sequencer 470A (Applied Biosystems Inc.). Prøvens N-terminale sekvens var Ser-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp-Cys-Tyr-Phe-Gly-Asn-Gly-Ser-Ala-Tyr, hvilket var identisk med den forventede sekvens.

25 EKSEMPEL 29

Konstruktion og kloning af pSTll8 (som vist i fig. 20)

Plasmidet pST112 [en ekspressionsvektor for en nativ t-PA, der kan isoleres fra en transformant, som omfatter samme, E. coli DH-1 FERM

DK 174413 B1 32 BP-1966; den komplette cDNA-sekvens for en nativ t-PA i pSTH2 er vist 1 fig. 21] blev skåret med BamHl og Sall.

Det store DNA blev Isoleret og enderne gjort stumpe med DNA-polymera-se I (Klenow-fragment). Det resulterende DNA-fragment blev selvlige-5 ret med T4-DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coll HB101. Fra én af de ampicillinresistente transfor-manter blev det ønskede plasmid pST118 isoleret og karakteriseret ved restriktionskortlægning.

EKSEMPEL 30 10 Konstruktion og kloning af pniTQkll2 (som vist i fig. 22 og 23)

Plasmidet pST118 blev skåret med Bglll og Bbel. Det store DNA-frag-ment blev isoleret og ligeret til syntetiske Bglll-Avall DNA'er (5'-GATCTTGCTACGAG og 5'-GTCCTCGTAGCAA; hver oligomer blev phosphory-leret med T4-polynukleotidkinase (Takara Suzo)), der koder for Arg' 15 Ser^· Cys92 Tyr Glu, og Avall-Bbel DNA, der koder for Asp95 - Gly110 i nativ t-PA fra pST118 med T4-DNA-ligase (Takara Suzo).

Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coll DH-1.

Fra én af de ampicillinresistente transformanter blev det ønskede plasmid pmTQkll8 isoleret og karakteriseret ved restriktionskort-20 lægning.

På den anden side blev plasmidet pST112 skåret med Bglll og Xmal. Det store DNA-fragment blev isoleret og ligeret til det 1253 bp lange Bglll-Xmal DNA-fragment, der koder for Arg'* - Val507 fra pmTQkll8, med T4-DNA-ligase, hvilket gav pmTQkll2, en ekspressionsvektor for 25 mTQktPA i pattedyrceller.

33 DK 174413 B1 EKSEMPEL 31

Konstruktion og kloning af pniTTk (som vist i fig. 24, 25 og 26)

pTTkPAAtrp blev skåret fuldstændigt med Clal og EcoRI. Det store Defragment blev isoleret og ligeret til Clal-Ddel syntetiske DNA'er 5 (5'-CGATAAAATGGGTCCTAGATC og 5'-TCAGATCTAGGACCCATTTTAT; hvert DNA

blev phosphoryleret med T4-polynukleotidkinase) omfattende et Bglll-restriktionssted og et 91 bp langt Ddel-EcoRI DNA-fragment, der koder for Glu*-^ - Trp^®4 fra pTTkPAAtrp, med T4-DNA-ligase, hvilket gav pHS9006. pTTkPAAtrp blev skåret med EcoRI (partielt) og Apal. Det 10 78 bp lange DNA-fragment blev isoleret og ligeret til et 4,1 kb langt

EcoRI-Apal DNA-fragment fra pHS9006, hvilket gav pHS3020, der koder for Arg"*· plus Ser*·^ - Pro^7.

pHS3020 blev skåret med Bglll og Smal. Det lille DNA-fragment, der koder for Arg"*· plus Ser*·^ - Pro®®®, blev isoleret og ligeret til 15 det store Bglll-Smal DNA-fragment fra pmTQkll2, hvilket gav pmTTk, en ekspressionsvektor for TTktPA i pattedyrceller.

EKSEMPEL 32

Konstruktion og kloning af pmSJTk (som vist 1 fig. 27 og 28) pHS9006 blev skåret med EcoRI. Det store DNA-fragment blev isoleret, 20 dephosphoryleret med kalvetarmsphosphatase (Pharmacia) og ligeret til det 472 bp lange EcoRI DNA-fragment, der koder for Asn^®® - Asp^?® .

LyS361 fra pSTTkAtrp, hvilket gav pMH3025. pMH3025 blev skåret med Bglll og Smal. Det lille DNA-fragment blev isoleret og ligeret til det store Bglll-Smal DNA-fragment fra pmTQkll2, hvilket gav pmSTTk, 25 en ekspressionsvektor for STTktPA i pattedyrceller.

DK 174413 B1 34 EKSEMPEL 33 Ekspression

Konstruktion af L-929-transformanter A. Fremstilling af cellerne 5 En kultur af L-929-cellelinjen blev anvendt i dette eksempel. L-929-celler kan dannes ud fra ATCC #CCL-1 og blev holdt i DMEM indeholdende kanamycin og 10X (vol/vol) føtal kalveserum ved 37"C 1 5X CO2.

Disse celler blev udpladet med en celletæthed på 5 x 10^ pr. 10 cm petriskål på dagen før transformationen, hvilket gav 50-6QX konfluens 10 på dagen for transformationen. Mediet blev udskiftet tre timer før transformationen. To 10 cm petriskåle med celler blev anvendt til hver transformation.

B. Fremstilling af DMA-opløsningen

Plasmid-DNA blev indført i L-929-celler under anvendelse af en cal-15 ciumphosphatteknik på lignende måde som det, der er beskrevet i Gorman, DNA Cloning II, 143 (1985), IRL Press. 1 pg af ekspressionsplasmidet (pmTQkll2, pmTTk eller pmSTTk) plus 3 pg af plasmidet pSV2neo ATCC nr. 37149 blev sat til 186 μΐ 2M CaClj og 1,3 ml vand. 1,5 ml af DNA-opløsningen blev derpå dråbevis sat til 20 1,5 ml 2 x HBS <1,63X NaCl, 1,19* Hepes, 0,04X Na2HP04, pH 7,12) under bobling. Blandingen lodes henstå i 30 minutter ved stuetemperatur, før den blev sat til cellerne.

C. Transfektion af cellerne 0,6 ml af DNA-opløsningen blev sat til en 10 cm petriskål med L-929-25 celler under forsigtig agitation og inkuberet ved 37“C i 18 timer i en CO2-inkubator. Cellerne blev vasket to gange med DMEM. Der blev derefter tilsat helt frisk vækstmedium indeholdende 10X FCS, og cellerne blev inkuberet ved 37“C i 24 timer i en CO2-inkubator. Cellerne 35 DK 174413 B1 blev trypsiniseret og subkultiveret 1:10 i selektivt medium bestående af DMEM indeholdende 300 pg/ml geneticin (G418) og 10X FCS.

Celler, der udtrykker phosphotransferase (neor-genprodukt), kan overleve i det selektive medium og danner kolonier. Mediet blev udskiftet 5 hver 3. eller 4. dag, og kolonier blev isoleret efter 12-14 dage.

G418-resistente kolonier blev taget op ved mild trypsinisering i små cylindere, dyrket til massekulturer og testet for udskillelse af muteret t-PA. Cellerne blev dyrket i multibrønde-pladeskåle med en diameter på 1,7 cm med 3 ml af mediet til 1 alt ca. 3 x 105 celler.

10 Mediet blev fjernet og vasket med PBS. Cellerne blev dyrket i 1 ml inducerbart dyrkningsmedium bestående af DMEM indeholdende 0,04 mM ZnSO^, 1 mM natriumbutylat og 2X FCS ved 379C i 24 timer, og aktiviteten af muteret t-PA i mediet blev bekræftet ved et indirekte spektrofotometrisk assay under anvendelse af det chromogene middel 15 S2251 [jfr. Thrombosis Research 31, 427 (1983)1.

E. coli DH-1 blev transformeret med plasmidet pmTQkll2, pmTTk eller pmSTTk til deponeringsformål på konventionel måde.

Følgende mikroorganismer, der er beskrevet i eksemplerne, er deponeret hos en internationalt anerkendt myndighed i henhold til Buda-20 pest-traktaten, Fermentation Research Institute, Agency of Industrial

Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan henholdsvis den 30. juli, 13. oktober og 5. november 1987 og 19. juli 1988, og har fået følgende deponeringsnumre: DK 174413 B1 36

Mikroorganisme Deponeringsnummer

Escherichia coli HB101-16 FERM BP-1872

Escherichia coli HB101-16 (pTTkPAAtrp) FERM BP-1871 5 Escherichia coli HB101-16 (pTTiPAAtrp) FERM BP-1869

Escherichia coli HB101-16 (pTQiPAAtrp) FERM BP-1870

Escherichia coli HB101-16 (pTQkPMtrp) FERM BP-1521

Escherichia coli HB101-16 (pSTTktrp) FERM BP-1517

Escherichia coli HB101-16 (pSTQitrp) FERM BP-1516 10 Escherichia coll HB101-16 (pSTQktrp) FERM BP-1518

Escherichia coli HB101-16 (pthTTtrp) FERM BP-1562

Escherichia coli HB101-16 (puTTtrp) FERM BP-1519

Escherichia coli DH-1 (pST112) FERM BP-1966

Escherichia coli DH-1 (pmTQkll2) FERM BP-1965 15 Escherichia coli DH-1 (pmTTk) FERM BP-1967

Escherichia coli DH-1 (pmSTTk) FERM BP-1964

Claims

37 DK 174413 B1

1. Vævsplasminogenaktivator, kendetegnet ved, at den har nedenstående aminosyresekvens (I) som sin primåre struktur: 180 190 R-GluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGlySerAlaTyrArgGlyThrHisSer 200 210 LeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsnSerMetlleLeuXleGlyLysVal 220 230 TyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGlyLeuGlyLysHisAsnTyrCysArg 240 250 AsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysKisValLeuLysAsnArgArgLeuThrTrp 260 270 GluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGlyLeuArgGln-Y- 277 280 290 -X-GlyGlyLeuPheAlaAspIleAlaSerHisProTrpGlnAlaAlalle 300 310 PheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPheLeuCysGlyGlylleLeuIleSer 320 330 SerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGlnGluArgPheProProHisHisLeu 340 350 ThrVallleLeuGlyArgThrTyrArgValValProGluGluGluGluGlnLysPheGlu 360 370 ValGluLysTyrlleValRisLysGluPheAspAspAspThrTyrAspAsnAsplleAla 380 390 LeuLeuGlnLéuLy sSer AspS er Ser ArgCy sAl aGlnGluSer S erValVa 1 Ar gThr 400 410 ValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAspTrpThrGluCysGluLeuSerGly 420 430 TyrGlyLysHisGlviAlaLeuSerProPheTyrSerGluArgLeviLysGluAlaHlsVal 440 450 ArgLeuTyrProSerSerArgCyeThrSerGlnHisLeuLeuAsnArgThrValThrAsp DK 174413 B1 38 460 470 AsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGlyProGlnAlaAsnLeuHisAspAla 480 490 CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeuAsnAspGlyArgMetThrLeuVal 500 510 GlyllelleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLysAspValProGlyValTyrThrLys 520 527 ValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMetArgPro 92 100 hvor R er Ser- eller CyeTyrGluAspGlnGlylleSerTyrArgGlyThrTrp 110 120 SerThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLys 130 140 ProTyrSerGlyArgArgProAspAlalleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCys 150 160 ArgAsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSer 170 174 SerGluPheCysSerThrProAlaCysSer- 5 X er -Lys-, -Ile- eller en binding, og y er -TyrSerGlnProGlnPheArglle-t -TyrSerGlnProGlnPheAsplle-, -TyrSerGlnProIleProArgSer- eller -ThrLeuArgProArgPheLysIle-. 10 og at Asn184, Asn218 og Asn448 i ovenstående aminosyresekvens kan vare glycosyleret.

2. Vævsplasminogenaktivator Ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den ikke er glycosyleret.

3. Vsvsplasminogenaktivator ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at R er Ser-, X er -Lys-, og Y er -Tyr-SerGlnProGlnPheAspIle-. 39 DK 174413 B1

4. Vævsplasminogenaktivator ifølge krav 2, kendetegnet ved, at R er Ser-, X er -Lys-, og Y er -Tyr-SerGlnProGlnPheAsplle-.

5. DNA, 5 kendetegnet ved, at det koder for en aminosyresekvens (1) som anført i krav 1.

6. Rekombinant vektor, kendetegnet ved, at den omfatter DNA, der koder for en aminosyresekvens (1) som anført i krav 1.

7. Transformant, kendetegnet ved, at den omfatter en ekspressionsvektor for en DNA-sekvens, der koder for en aminosyresekvens (1) som anført i krav 1.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af en vævsplasminogenaktivator 15 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en værtscelle, der er transformeret med en ekspressionsvektor, som omfatter DNA, der koder for en aminosyresekvens (1) som anført i krav 1, dyrkes i et næringsmedium, og at den resulterende t-PA isoleres fra dyrkningsvæsken.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en vævsplasminogenaktiva-tor ifølge krav 1 og én eller flere farmaceutisk acceptable bærere.