JPH0361482A - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

五五上立１亘犬里 この発明は、新規な組織プラスよノーゲン活性化因子に
関するものであり、より詳しくは、プラスミノーゲンを
、血栓のフィブリン網目構造を崩壊させて可溶性生成物
を生ぜしめるプラスミンへ転換させる強い活性をもち、
従って血栓溶解剤として有用な、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子、それのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ　、それの製造法およびそれを含有する医薬組成物
に関するものである。 来の技術およびこの発明が解決しようとする■ 天然のヒト「組織プラスミノーゲン活性化因子」　（以
下ｒ　ｔ−ＰＡＪという）の全アミノ酸配列および構造
ならびにヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ）に由来する
それをコードするＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術によ
って既に明らかにされている［Ｎａｔｕｒｅ　３０１．
２１４（１９８３）参照］、天然ｔ−ＰＡは、単一のジ
スルフィド結合で結合される重鎮および軽鎖の２娘形態
にプラスミンによって転換されるところの単鎖セリンプ
ロテアーゼである。軽鎖（Ｌ）はプロテアーゼドメイン
であり、従ってこの酵素の活性部位を含んでいる。重量
（Ｈ）はフィンガードメイン（Ｆ）、成長因子ドメイン
（Ｅ）および３つのジスフィト結合をもつ２つのクリン
グル（すなわちクリングル１およびクリングル２ドメイ
ン：に、ｊ３よびに２）を有する６従って、天然のｔ−
ＰＡは５つの機能性ドメインＦ５Ｅ　、Ｋ　Ｉ　、Ｋ　
２およびＬからなる［ヨーロッパ特許出願公開公報第０
１９８９２０号およびＰｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．４６７０（１９８
８）参照コ。 天然ｊ−ＰＡは不安定であり、生体内半減期は極めて短
い（ｆｆｆｉにもよるが約１−８分）、その半減期を延
長するための天然ｔ−ＰＡの修飾に関する種々の研究の
結果、この発明の発明者らは、天然ｔ−ＰＡのフィンガ
ードメインのアミノ酸配列の一部をフィブロネクチンの
Ｉ型アミノ酸配列の一部またはそれを修飾したアミノ酸
配列によって置換ることによって、生体内で天然のｔ−
ＰＡよりもより安定な新規ｔ−ＦＡを製出することに成
功した。 亀旦旦盪盈１主１妻遇 それゆえ、この発明は、天然ｔ−ＰＡのフィンガードメ
インのアミノ酸配列の一部がフィブロネクチンの工型ア
ミノ酸配列の一部またはそれの修飾されたアミノ酸配列
によって置換されていること茫よって天然ｔ−Ｐ八と相
異する新規ｔ−ＰＡを提供する。 天然ｔ−ＰＡのフィンガードメインのアくノ酸配列の好
ましい一部としては、天然ｔ−Ｐ＾のアミノ酸配列Ａｒ
ｇ’　−Ｔｙｒ３３の全部または一部を挙げることがで
きる。 フィブロネクチンのＩ型アミノ酸配列の好ましい一部と
しては、天然のヒトまたはウシフィブロネクチンのＩ型
アミノ酸配列［たとえばＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃ１．ＵＳＡ　、　８０゜１３７−１４１　（１
９８３）およびＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　４．１７５５
−１７５９（１９８５）参照コを挙げることができる。 それの修飾されたアミノ酸配列としては、Ｉ型アミノ酸
配列のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸を他のアミ
ノ酸で置換することおよび／またはＩ型アミノ酸配列の
構成アミノ酸の１つ以上を欠失させることによって修飾
したアミノ酸配列を挙げることができる。 この明細書においては、天然または新規ｔ−Ｐ＾の構成
アミノ酸の番号付けは、ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃａ　）ら
が提案した番号付け［Ｎａｔｕｒｅ　３０１．２１４（
１９８３）参照コに従うものとし、たとえばＴｙｒ２は
、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２位のチロシンを意味
する。 この発明の新規ｔ−ＰＡの好ましい例は、次のアミノ酸
配列によって表わすできる： Ｒ１−Ａ２−１−　Ｒ２−Ａ３４−８２７　　　　　　
　＜　Ｉ　）（式中、Ｒ１は５ｅｒ−またはＧｌｙＡｌ
ａＡｒｇＳｅｒ−１Ｒ２は一５ｅｒＡｓｐＬｙｓＴｙｒ
ＴｈｒＡｓｎＴｂｒＴｙｒＡｒｇＶａｌＧ１ｙＡｓｐＴ
ｈｒＴｙｒＧ１ｕＡｒｇＰｒｏＬｙｓＡｓｐＳｅｒＭｅ
ｔＩ　１ｅＴｒｐＧ１ｕ−または −ＰｈｅＡｓｐＬｙｓＴｙｒＴｈｒＧ１ｙＡｓｎＴｈｒ
ＴｙｒＡｒｇＶａｌＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＧ１ｕＡ
ｒｇＰｒｏＬｙｓＡｓｐＳｅｒＭｅｔＩ　１ｅＴｒｐＡ
ｓｐ−１Ａ２−６は天然ｔ−ＰＡのＴｙｒ　２−Ｃｙｓ
　’と同じアミノ酸配列、 Ａ３４−８２７は天然ｔ−ＰＡのＣｙｓ　”−Ｐｒｏ″
２７と同じアよ）酸配列である。） この明細書においては、便宜上、該新規ｔ−ｐ＾につい
て次のコード名を使用する： ＦＰＡ 上記アくノ酸配列（Ｉ）において、 Ｒ１がＳｅｒ　− Ｒ２が一５ｅｒＡｓｐＬｙｓＴｙｒＴｈｒＡｓｎＴｈｒ
ＴｙｒＡｒｇＶａｌＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＧｌｕＡ
ｒｇＰｒｏＬｙｓＡｓｐＳｅｒＭｅｔＩ　ｌｅ丁ｒｐＧ
Ｉｕ−であり、 Ａ２−６およびＡ３４−５２７は各々上記定義の通りで
ある。 この発明の新規ｔ−Ｐ八は、組換えＤＮＡ技術およびポ
リペプチド合成によって製造される。 すなわち、この発明の新規なｔ−ＰＡは、該新規ｔ−ｐ
＾のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる発現
ベクターで形質転換した宿主細胞を培地に培養し、培養
物から該新規ｔ−ＰＡを採取することによって製造でき
る。 上記製造法の詳細を以下に説明する。 宿主細胞は、微生物［細菌（たとえば、大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｌｓ）　、等）、酵母（たとえばパン
酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖ＋５ｉ
ａｅ）　、等コ、動物細胞糸および培養植物細胞を包含
しつる。微生物の好ましい例としては、細菌、とくにエ
シェリヒア属は属する菌株（たとえばＥ、　ｃｏｌｉ　
ＨＢＩＯＩ　ＡＴＣＣ３３８９４、Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｈ
ＢＩＯＩ−１６ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８７２゜旦、ｃｏｌ
ｉ　　２９４　　ＡＴＣＣ３１４４６，互、ジ８ユＺ　
　１７７６　　ＡＴＣＣ３１５３７、等）、酵母、とく
にサツカロマイセス属に属する菌株［たとえばＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｆｓｉａｅ　ＣＲＦ　［
１（ヨーロッパ特許出願公開公報第０２２５２８６号参
照）］、動物細胞糸［例えばマウス上９２９細胞、チャ
イニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞等］な
どが含まれる。 細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターは、通常、少なくともプロモーター、開始コ
ドン、新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
　、終止コドン、ターよネーター領域および自己複製可
能ユニットから構成されるのが通常であり、酵母や動物
細胞を宿主ｍ胞として用いる場合には、発現ベクターは
少なくともプロモーター、開始コドン、シグナル・ペプ
チドおよび新規ｔ−ＰＡのアよノ酸配列をコードするＤ
ＮＡならびに終止コドンから構成されるのが好ましく、
さらにエンハンサ−配列、天然ｔ−ＰＡの５゛−および
３°−非コード領域、スプライシング・ジャンクション
、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を発現ベ
クターに挿入することもできる。 好ましいプロモーターとしては、慣用のプロモーター［
たとえば、大腸菌用のＰＬ−プロモーターおよびｔｒｐ
−プロモーター、パン酵母用のＴＲＰ　ｌ遺伝子ＡＤ）
ＩＩまたはＡＤ［Ｉ遺伝子および酸性ホスファターゼ（
ＰＨ０５）遺伝子のプロモーター、噴孔動物細胞用の）
ＩＴＬＶ−プロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロ
モーター、ＬＴＲ−プロモーター、ｖウス・メタロチオ
ネインＩ　（ＭＭＴ）−プロモーターおよびワタシニア
ープロモーター等］が挙げられる。 好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン（ＡＴＧ
）が挙げられる。 シグナル・ペプチドとしては、天然ｔ−ＰＡなどのシグ
ナル・ペプチドが挙げられる。 シグナル・ペプチドまたは新規ｔ−ｐへのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡは、たとえば、ＤＮＡ合成装置を用
いての部分または全ＤＮＡ合成および／または形質転換
体［たとえばＥ、　ｃｏｌｉ　ＬＥ　３９２λ４（ｐＴ
ＰＡ２１）、　　Ｅ、　　ｃｏｉｌ　　ＪＡ　　２２１
　　（ｐＴＰＡ２５）ＡＴＣＣ３９８０８，Ｅ、　　ｃ
ｏｌｔ　　ＪＡ　　２２１　　（ｐＴＰＡ１０２）ＡＴ
ＣＣ３９８１０゜Ｅ、ｃｏｌｉＪＡ　　２２１　　（ｐ
ＴＰＡ１０２）　　（Ｌｙｓ　　２７７−ＩＩｓ）ＡＴ
ＣＣ３９８１１、Ｅ、ｃａｌｆ　　ＪＭ　　１０９　　
（ｐ５１）１）　　ＦＥＲＭ　　Ｐ−９７７４゜Ｅ、　
ｃｏｌｉ　　ＪＭ　１０９　（ｐＮ５３）　ＦＥＲＭ　
Ｐ−９７７５］　から得られる適当なベクター［たとえ
ば、ｐＴＰ八２へ、ｐ丁ＰＡ２５、　ｐＴＰ＾１０２　
　、　　ｐＴＰＡ１０２（Ｌｙｓ　　２７７　−１１ｅ
）、ｐ５１）１．　ｐＮ５３］　に挿入された天然また
は変異ｔ−ＰＡをコードする完全なりＮＡ配列の適当な
酵素（たとえは、制限酵素、アルカリホスファターゼ、
ポリヌクレオチド・キナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ
ポリメラーゼ等）による処理のごとき常法によって調製
できる。この発明の好ましい実施態様においては、新規
ｔ−Ｐ＾をコードするＤＮＡの調製を、ウエズル（Ｗｅ
ｌｌｓ）らが５ｃｉｅｎｃｅ　２３３，６５９−６６３
　（１９８Ｂ）に記載しているカセット変異誘発および
／またはフリック（Ｆｒ１ｔｚ）がＤＮＡクローニング
Ｉ、１５１（１９８５）、ＩＲＬブレスに記載している
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって行うことが
できる。 終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たとえ
ばＴＡＧ　、　ＴＧＡ　、等）が挙げられる。ターミネ
ータ−領域としては、天然または合成のターミネータ−
（たとえば、合成ｆｄファージターミネーター１等）が
挙げられる。 自己複製可能ユニットとしては、それに属する全ＤＮ＾
を宿主細胞中で自己複製しうるＤＮＡ配列で、天然のプ
ラスミド、人工的に修飾したプラスミド（たとえば、天
然プラスミドから調製したＤＮＡ断片）および合成プラ
スミドが挙げられる。 このプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細
胞とする場合に例えばプラスミドｐＢＲ３２２またはそ
の人工修飾体（ｐＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によ
って得られたＤＮＡ断片）が挙げられ、酵母を宿主細胞
とする場合に例えば酵母２μプラスミドまたは酵母染色
体ＤＮＡが挙げられ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場
合に例えばプラスミド、ｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＡＴＣＣ３７
１９８、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣ（：３７
１４５　、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎａｏ　　Ａ
Ｔｆｌ：Ｃ３７２２４、プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ　Ａ
ＴＣＣ３７１４９が挙げられる。 エンハンサ−配列としては、例えばＳＶ４０のエンハン
サ−配列（７２ｂ、ｐ、）が挙げられる。 ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリア
デニル化部位が挙げられる。 スプライシング・ジャンクションとしては、例えば　Ｓ
Ｖ４０のスプライシング・ジャンクションが挙げられる
。 プロモーター、開始コドン、新規ｔ−Ｐ＾のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネータ
−領域は、適当な自己複製可能ユニット（プラスミド）
と共に、上流から下流に連続的に環状に、所望により適
当なりＮＡ断片（例えばリンカ−１他の制限部位、等）
を用いて、常法（例えば制限酵素による消化、Ｔ４ＤＮ
＾リガーゼを用いたライゲーション）により連結して、
発現ベクターを２製できる。噴孔動物細胞株を宿主とし
て用いる場合には、エンハンサ−配列、プロモーター天
然ｔ−ＰＡのｃＤＮＡの５゛−非コード領域、開始コド
ン、シグナル・ペプチドおよび新規ｔ−ＰＡのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ　、終止コドン、３゛−非コー
ド領域、スプライシング・ジャンクションおよびポリア
デニル化部位を上記の手法で適当な自己複製可能ユニッ
トに上流から下流に連続的にかつ環状に連結して発現ベ
クターを調製してもよい。 その発現ベクターを宿主細胞に導入する。導入は常法［
たとえば、形質転換（トランスフェクションを含む）、
マイクロインジェクション等、］によって実施でき、形
質転換体が得られる。 この発明の製法における新規ｔ−ＰＡの製造のためには
、このようにして得た発現ベクター含有形質転換体を水
性培地に培養する。 培地は、炭素源（たとえば、グルコース、グリセリン、
マンニトール、フラクトース、ラクトース、等）および
無機または有機の窒素源（たとえば、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス
、ポリペプトン、バクトドリブトン、牛肉エキス、等）
を含有する。 所望により、他の成分［たとえば、無機塩類（たとえば
、重燐酸ナトリウムまたはカリウム、燐酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム）、ビタミン類（たとえば、ビタミンＢ１）、抗生
物ＸＣたとえば、アンピシリン、カナマイシン）、等］
を培地に加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、ウシ
胎児血清および抗生物質を添加したダルベツコの改良イ
ーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）がしばしば用いられる
。 形質転換体（トランスフエクタントを含む）の培養は、
一般に、ｐ）１５．５〜８．５（好ましくはｐＨ７〜７
．５）、１８〜４０℃（好ましく、は２５〜３８℃）で
５〜５０時間にわたって実施すればよい。 このようにして生産された新規ｔ−ＰＡが培養物の溶液
画分中に存在するときには、培養物の濾過または遠心分
離によって培養濾液（上澄液）を得て、これから、天然
または合成の蛋白質の精製、単離に一般的に用いられて
いる通りの常法（たとえば、透析、ゲル濾過、抗−ｔ−
ｐ＾モノクローナル抗体を用いるアフィニチイ・カラム
クロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いるカラムクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、等）に
より精製、単離できる。生産された新規ｔ−ＰＡが培養
形質転換体の細胞中に存在するときは、細胞を濾過また
は遠心分離によって集め、細胞壁および／または細胞膜
を、たとえば、超音波および／またはりゾチームによる
処理により破壊して、デブリスとする。デブリスは適当
な水溶液（たとえば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウ
ム塩水溶液）に溶解でき、その溶液から、上述したよう
な常法により新規ｔ−ＰＡを精製することができる。 大腸菌で製造した新規ｔ−ＰＡはリホールドする必要が
ある。リホールディングは常法じよって行うことができ
る。 この発明の新規ｔ−ｐ＾は、血管疾患（たとえば、心筋
梗塞、卒中、心臓発作、肺塞栓症、等）の治療のための
血栓溶解剤として有用である。この発明の新規ｔ−ＰＡ
は、医薬として許容しう、る担体と混合して、注入剤の
ごとき医薬製剤の形で、ヒトを含めた哺乳動物に非経口
的に投与できる。 医薬として許容できる担体は、ペプチドまたは蛋白Ｘ（
たとえば、血清アルブミン、等）を含有する医薬組成物
の調製に慣用されている種々の有機または無機の担体材
料を包含しつる。 この発明の新規ｔ−Ｐ＾の投与量は、疾患の種類、患者
の体重および／または年令、さらに投与経路の種類のご
とき種々の因子に応じて変動するが、この発明の新規ｔ
−ｐ＾の最適投与量は、通常、注射または注入の場合は
０．１〜ｔｏｍｇ／ｋｇ／日の範囲内から選択される。 上記の一日量は数時間ごとに分割して患者に与えてもよ
い。 以下の実施例はこの発明を説明するためのものであって
、それらに限定されるものではない。 実施例中、使用した酵素（たとえば、制限酵素、アルカ
リホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガー
ゼ等）は全て市販のものであり、それら酵素の使用条件
は、たとえば市販の酵素に添付されている説明書を参照
すれば、当業者にとっては自明のところである。 東旌更ユ バクテリオファージラムダシャロン（ｃｈａｒｏｎ）４
＾のＥｃｏＲＩ部位にクローン化したヒトＤＮＡの部分
消化物を含有するヒトジェノムライブラリ−［Ｔ、マニ
アティス（ＭａｎｉａＨｓ）から人手可能、Ｍａｎｉａ
ｔｌｓら、Ｃｅ１ｌ　１５．８８７−７０１　（１９７
８）参照］を、３２Ｐニツクトランスレーシヨンによっ
て得られるＤＮＡプローブを用いて、プラークハイブリ
ダイゼーション［Ｗａｈｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　７６、３６８３−３６８７　（１９７９）参照
］によりスクリーニングした。プラスミドｐＴＰＡ１０
２　（Ｌｙｓ２７７−１ｉｅ）［それを含有する形質転
換株Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１　（ｐＴＰＡ１０２）
（ＬｙＳ２７７−１１ｅ）＾ＴＧＣ３９８１１から単離
できる変異ｔ−ＰＡ（Ｌｙｓ２７７−１１ｅ）発現ベク
ター。ＰｃＴ国際公開第ＷＯ３６１０１５３８号参照］
の２３２ｂｐ黒Ｉ−±Ｔ断片をプローブとして用いるこ
とにより、６Ｘ１０’プラークのスクリーニングから、
３種の重なり合う組換え体λ１８＾１、入１９Ａ２およ
びλ２１Ａ２を単離した。ｔ−ＰＡ遺伝子の転写開始部
位および５°−非コード配列を含むファージを、ＩＬｒ
ａ、するために、ｔ−ＰＡ遺伝子の５°　−非コード配
列を含むλ１９八２からの１．５　Ｋｂ脆Ｒ１−輪Ｈ１
断片をプローブとして、２回目のブラ〜クハイプリダイ
ゼーシランを行った。このハイブリダイゼーションによ
り、ｔ−Ｐへ遺伝子の最初の二つのエキソンを含有する
λ１３２　Ａｌおよびλ１１０　Ａｌを得た。挿入ＤＮ
Ａ配列のマツピング制限酵素解析によって行い、それら
のＤＮＡ配列をＭ１３シーケンシングキット（アマ−ジ
ャム）を用いるジデオキシヌクレオチドチェーンターミ
ネーション法によって部分的に決定した。 それらの挿入ＤＮＡの配列およびマツピングは、発表さ
れているｔ−ＰＡジェノムクローン［Ｄｅｇｅｎら、Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１．６９７２−８９８
５　　（１９８８）］と一致することがわかった。 メラノーマ （黒色Ｉｌり 細胞培養からの全ＲＮへ を （：ｈｉｒｇｗＩｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１
８　、　５２９４　　（１９７９）　　の報告と実質的
に同様にして抽出した。ヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅ
ｓ）を、３％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清および１０　ｍＭ
　ＨＥＰＳを補ったダルベツコの改良イーグル最小必須
培地（ＤＭＥＭ）　４００ｍｕをそれぞれ入れた１０本
の回転びんの中で、コンフルエントな！＃層となるまで
培養した。　ｔ−ｐ＾を盛んに生産するために、ヒトメ
ラノーマ細胞を、プロテアーゼ阻害剤のアプロチニン６
６６μｇを含むＤＭＥＭ各４００ｍｊ２中で１８時間培
養した。細胞を遠心分離によって集め、６Ｍイソチオシ
アン酸グアニジウム、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ
７，０）、０．１　Ｍ２−メルカプトエタノールおよび
０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウムの５０１
１１１に再懸濁した。細胞をホモジナイゼーションによ
って分散させた。ホモジネートを、ベックマン５Ｗ５Ｑ
、Ｉポリアロマ−管に入れたＱ、ｌ　Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐ
）ｌ　７．５）中の５，７Ｍ塩化セシウムのクツション
３　　ｍｕの上へ載せ、３０、ＯＯＱｒｐｍ　、　２０
℃で１２時間遠心分離した。 上澄みを捨て、ＲＮＡべ１ノツトを水１０℃に溶かした
。０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ）Ｉ　５．２１お
よび２．５容のエタノールを加えて、ＲＮＡを沈澱させ
た。オリゴ−ｄＴセルロースカラムクロマトグラフィー
を用いて、全ＲＮへ調製物からｍＲＮＡを精製した［Ａ
ｖｉｖら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　８９．１４０８（１９７２）参照コ。４ＸＩ０９細
胞からの代表的な収量は、全ＲＮＡ的１１ｍｇ、ポリ（
Ａ）プラス０ＩＲＮＡ約９００　μｇであった。 このポリ（Ａ）　プラスｍＲＮ＾を、５°　−ブライマ
ー伸長法［Ｌａｗｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、９．６１０３−１ｉ１１４　（１９８１）参照
コによる二本鎖ｃＤＮＡの調製に用いた。＋ｎＲＮＡ　
１８０μｇと配列５°　−ＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ
ＧＡ−３°を有するブライマー５μｇを、０．１Ｍ　Ｋ
Ｃｌ２００μ℃中、９０℃で５分間加熱し、つぎにゆっ
くり４２℃まで冷却した。アニールしたｍＲＮＡを用い
、５０ｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，３）、　１０ｍＭ
　ＪＣｈ　　、　　１０ｍＭＤＴＴ　、　　４ｍＭ　　
ビロリン酸ナトリウムおよび各１ｍＭの４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、　ｄＴ
ＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ）の４００μ℃中で逆転
写酵素２００車位を用いて、第一のｃＤＮＡ！真を４２
℃で６０分間にわたり合成した。混合物を、２０ＩＩＩ
Ｍトリスー　ＨＣＩ　（ｐｕ７．ｓ）、５　ｎ＋Ｍ　Ｍ
ｇＣｌ２．１０１１Ｍ　（ＮＨ４）　２５０４．１００
ｍＭ　ＭＣＩ　、０．１８ｍＭ　ＮＡＤ。 ５０　ｕ　ｇ／　ｒａｉｌ　Ｆ３ＳＡ２’ｔｍｌｌ中で
１０本位／国２のＲＮａｓｅ　Ｈ、５０ＲＬ位／ｍ角の
ＤＮＡポリメラーゼＩおよび５０本位／ｍ℃の大腸菌［
）ＮＡ　リガーゼにより、１２℃で１時間、２２℃で１
時間処理した。 反応混合物に７４　ＤＮＡポリメラーゼ１５単位を加え
た。３７℃で１０分間インキニーベートしたのち、反応
混合物をフェノール／クロロホルムで１回抽出し、水溶
液を１客の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび４容のエタノー
ルで沈澱させた。二本鎖ｃＤＮＡを、２００　ｍＭカコ
ジル酸カリウム、２５ｒＢＭトリスーＨＣｌ　（ｐ＋＋
　６．９）、１　ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　０．１＋ｎＭ　
ＤＴＴ　、　１ｍＭ　　ＣＯＣｌ２２００μ２中、ター
ミナルトランスフェラーゼ１０！＃位を用いて、３７℃
で３０分間にわたり、デオキシ　（Ｃ）残基で伸長させ
た。反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
水溶液を０．１客の３Ｍ酢酸ナトリウム（９８５，２）
および２容量のエタノールで沈澱させた。テイルのつい
たｃＤＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
　　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。 ０．１５Ｍ　ＮａＣ１６００μＪ２中、５８℃で１時間
にわたり、デオキシ（Ｇ）テイルつきｐｕｃ９　（ファ
ルマシア）　６６０ｎｇとアニールした。アニールした
［１Ｎ八を用いて、コンピーテントな旦、　ｃｏｌｉ　
Ｄ）１１を形質転換した。アンピシリン耐性表現型とし
て約１７．Ｇｏ。 の形質転換株を得た。この５″−ブライマー伸長ｃＤＮ
Ａライブラリーを、３２Ｐニツクトランスレーシヨンに
よって得られたＤＮＡプローブによりコロニーハイブリ
ダイゼーション（Ｇｒｕｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）２．　３９１
ｉ１−３９８５　（１９７５）　　参照］によりスクリ
ーニングした。　　ＬＬ９Ａ２からの１．５ｋｂ　Ｅｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をプローブとして、陽性のハイ
ブリダイゼーションシグナルを与えた８コロニー中の一
つから、ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの５°−非コード配列お
よびシグナル配列を含有するプラスミドｐＭＩ　２００
を単離した。９ＭＩ２００のｃＤＮＡ挿入断片は、長さ
が約１７０ｂｐで、ジデオキシヌクレオチドチェーンタ
ーミネーション法に・よってＤＮＡの塩基配列を決定し
た（そのｃＤＮ＾ＤＮＡ第４図に示す）。 実施例３ 旦、ｃｏｌｌ　　ＪＡ２２１　（ｐＴＰＡ１０２）（Ｌ
ｙｓ２７７−１１ｅ）八ＴＣＣ３９８１１の斜面培養の
１白金耳を、５０μｇ／　ｍｊ２のアンピシリンを含有
するＬ−ブロスｉｆに接種し、３７℃で、６００ｒ＋ｍ
での光学密度（ｏ、’ｏ、）が約０．６吸収単位となる
まで、振盪しながらインキュベートした。０．ｐ、が約
０．６となったとき、培地にクロラムフェニコール粉末
を最終濃度ｌＯｏμｇ／　ｍｊ２となるよう添加し、イ
ンキュベーションを一夜続行した。 Ｂ、プラスミドＴＰＡ１０２　Ｌ　５２７７−１１ｅ）
のｉｓ実施例３Ａで得た培養ブロスからＥ、　ｃａｌｌ
　ＪＡ２２１　（ｐＴＰＡ１０２）　（Ｌｙｓ２７７−
１１ｅ）の細胞を集めた。 細胞は４０００ｇ　、　４℃で１０分間の遠心分離によ
って集め、上澄液は捨てた。細胞ベレットを、５ｍｇ／
ｌｌ１１のりゾチームを含有する溶液１（５０ｍＭグル
コース、２５ｍＭ）−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、
１０ｍＭＥＤＴＡを含有する水溶液）２０ｍｊ２に再懸
濁し、室温で５分間放置した。つぎに、リゾチーム処理
細胞に溶液２　（０，２Ｎ　ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ
を含有する水溶液）４０ｍｉを加え、倒置により溶液を
おだやかに混合した。混合物を氷上に１０分間放置した
。 氷酢酸１１．５　ｍｌＬと水２８．５　ｍＩＬを５Ｍ酢
酸カリウム溶液（ｐＨ４，８）　　６０　ｍｌＬに加え
て調製した水冷酢酸緩衝液３０ｍ１を上で得た混合物に
加え、倒置により混合した。溶液を氷上に１０分間放置
し、ト≧−・セイコーＮｏ、　４８−Ｉ！　（またはそ
れの等個物）中、２０．ＯＯＯｒｐｍ　、　４℃で２０
分間遠心分離した。宿主ＤＮＡとデブリスが管底にベレ
ットを形成した。上澄液約７２ｍ１ｌを回収し、イソプ
ロパツール０，６容量を加え、混合し、室温で１５分間
放置した。１１．ＯＱＯｇ　、室温で１５分間遠心分離
してプラスミドＤＮＡを集めた。上澄みを捨て、−ＤＮ
Ａベレットを室温で７０％エタノールで洗い、デカント
した。ベレットを真空デシケータ−中で乾燥し、ＴＥ＃
Ｅ？夜［１０ｍＭトリス−）ＩＣ１（ｐＨ７，５）　　
および１ｍＭ　　ＥＤＴＡ］　８　ｍｌＬに再懸濁した
。 そのＤＮＡ溶液にＣｓ０１８ｇを加えた。ｔｏｍｇ／ｍ
ｆＬの臭化エチジウム水溶液をＣｓＣ１−ＤＮＡ溶液の
各１０１ＱＪ！に加えた。溶液の最終密度は約１．５５
ｇ／ｒｎＪｌ、臭化エチジウム濃度は約６００μｇ　／
ｍｌｌであった。溶液をベックマンＶＴｉ６５遠心分離
管に移し、頂部まで満たし、シールし、５０．ＯＱＯｒ
ｐｍ　。 ２０℃で１２時間遠心分離した。遠心後、通常光で二つ
のＤＮＡバンドが見えた。＃２１皮下注射針つきの注射
器を遠心管の側面ぞいに挿入して、下方のＤＮＡバンド
を回収した。回収したＤＮＡ溶液は５ＭＮａＣｌ飽和イ
ソプロパツールで数回抽出して臭化エチジウムを除去し
た。　ＴＥ１１衝液に対しての透析により［：ｓＣｌを
除去した０、プラスミドｐＴＰＡ１０２（Ｌｙｓ２７７
−ＩＬｅ）約１ｍｇが得られ。これを４℃で保存した。 実施例４ 車離 プラスミドｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７−１１ｅ）
約ｓｏμｇを、１００ｍＭ　Ｎａ１ｌ、　　５０　ｍＭ
）−リス−）ＩＣＩ（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．７ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる制限
緩衝液Ａ１００μ℃中、制限酵素出Ｉ＋３０！＃位によ
り、３７℃で２時間消化した。　ＤＮＡをエタノール沈
澱により濃縮し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動
した。１９７４ｂｐのＢｄ　ＩＩ断片（そのＤＮＡ配列
を第４図に示す）を実施例５＾と同様にして可視化し、
回収した。 Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　ＤＨＩの形
　転速 プラス４１９Ｍ１２００約０．６μｇを制限酵素緩衝液
Ａ４０μ℃中で出Ｈ３０単位により３７℃で２時間消化
して、線状ＤＮＡを調整した。線状化したプラスミドを
、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下に２．５容量のエタ
ノールで沈殿させ、遠心分離によりＤＮＡを集めた。Ｄ
ＮＡベレットを、水９４μ１５アルカリホスファターゼ
液（２５０車位／１ａｉｌ：宝酒製株式会社）１μ℃お
よび１Ｍトリス−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）　　５μ℃中に
再懸濁し、３７℃に１時装置いた。ＤＮＡを、フェノー
ルとクロロホルムの（１：１）混合物およびクロロホル
ムとイソアミルアルコールの（２４：１）混合物とで抽
出後、エタノールで沈澱させ、水２０μ℃中に再懸濁し
た。この脱リン酸化ｐＭＩ　２００７　ｕｆＬ　（約２
００ｎｇ）を１９７４ｂｐ　出１１断片２μ、＋２（約
１０１００ｎ、５×ライゲーシヨン１１衝液［３３０ｍ
Ｍ　）−リス−）ｔＣＩ　（ｐ）１７．５）、３３　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｈ、５０＋ｎＭ２−メルカプトエタノール、
２．５ｍＭ　ＡＴＰＩ　３　ｕ　Ｉｔ、Ｔ４［ＩＮＡ　
リガーゼ１μ立および水２μ℃に加えた。この反応混合
物を１４℃で一夜インキエベートした。 実施例５０と同様にして、ライゲーション混合物により
Ｅ、　ｃａｌｆ　ＤＨＩを形質転換し、生じたＥ、　ｃ
ｏｌｉ　Ｄ）Ｉｆ（ｐＭＩ　２０５）形質転換体をそれ
らノアンピシリン耐性表現型およびそれらのプラスミド
ＤＮＡの数種の制限酵素による分析によって同定した。 形質転換体の一つから、実施例３と同様にして、プラス
ミドｐＭＩ　２０５を単離した。 東Δ里亙 プラスミド５Ｔ１０４の構築 Ａ　、　　Ｒ５Ｖｎｅｏ　Ｈｌｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨ
Ｉ　　片のプラスミドｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＡＴＣＣＮｏ、
　３７１９８約１３μｇを、制限緩衝液＾５０μぶ中、
制限酵素■庭Ｉ１１３０単位および制限酵素Ｂａｍ　Ｈ
Ｉ　３　ＱＪＩＬ位により、３７℃で２時間消化した。 消化したプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で泳
動し、ゲルを臭化エチジウムで染色し、長波ＵＶ光で可
視化した。大きい■ｎｄｌｌｌ　−Ｂａｎ　Ｈ１制制限
片を切り出し、−８０℃で２０分間凍結した。凍結融解
法（Ｔｈｕｒｉｎｇら、１９７５年、＾ｎａ１．　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、６６、２１３参照）によりＤＮＡ溶液を回
収し、２，５容量のエタノール−０，３Ｍ酢酸ナトリウ
ムで沈澱させ、遠心分離によりＤＮＡを採取した。ペレ
ットを真空中で乾燥し、乾燥蒸留水２０μ℃中に再懸濁
させた。 Ｂ、プラスミド　Ｍ１２０５の約２．１ｋｂ　）Ｉｉｎ
ｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩ断片の単離 プラス４１９ＭＩ２０５約３０μｇを、制限緩衝液Ａ中
制限酵素■■Ｉ１１および±）ＩＩ各３０単位により３
７℃で完全に消化した。これにより、大きさが２．７ｋ
ｂと２．１ｋｂの二つのＤＮＡ断片が生じた。１％アガ
ロースゲルへかけるに先立ち、ＤＮＡをエタノールで沈
澱させた。約２．１ｋｂの旧ｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩ
バンドを、実施例５Ａと同様にして可視化し、切り出し
、回収した。 Ｃ，ライゲーション 実施例５Ａおよび５８で得た上記断片各駒１１００ｎを
、６６ＩＩＭトリスー）ＩＣＩ　（ｐｉ（７，５）、６
．６ｍＭ　ＭｇＣｈ。 １０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび０．５ｍＭ＾
ＴＰを含有する反応混合物２０μＡ中、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（３５０，０００１−位／ｍ２：宝酒造株式会社）
１μ℃を用いて、室温で４時間ライゲートした。 Ｄ、Ｌ二速Ｕ」生硬上１−激（吐及 生じたライゲーション混合物を用いて、Ｖ。 Ｓｉｍａｎｉｓ、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ第１巻、ＩＲ
Ｌブレス、オックスフォード、ワシントン特別行政区（
１９８５）の形質転換法と同様にしで、アンピシリン５
０μｇ／ｌａｉ含有しプレート（１％バタトトリブトン
、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．
５％寒天、ｐＨ７，５）上で、Ｅ、　ｃｏｌｔ　１（Ｂ
ＩＯＩを形質転換した。 形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型ならび
に２．Ｏｋｂ　ＬＬＬ　ＩＩ断片の存在を含めてのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素切断パターンの分析によって同
定した。生じた細胞を用いて実施例３と同様にして、プ
ラスよドＩ）ＳＴ１０４を単離した。 墓 プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣＮｏ、３７１４
５約５０μｇを、制限緩衝液Ａ１００μｌ中、制限酵素
部ＩＩおよび１３ａｍＨＩ各３０単位を用いて、３７℃
で２時間完全に消化した。エタノール沈澱によりＤＮＡ
を濃縮し、１％アガロースゲルで電気泳動した。約０，
９ｋｂの断片を実施例５Ａと同様にして可視化し、回収
した。 Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ
の４盪 プラスミドｐｓＴ１０４約０．６μｇを、制限緩衝液Ａ
４０μ℃中、３０＄位の論）ＩＩにより３７℃で２時間
消化して、線状ＤＮＡを調製した。線状化プラスミドを
２，５容のエタノールと０．３Ｍ酢酸ナトリウムで沈澱
させ遠心分′離によりＤＮＡを採取した。 ＤＮＡベレットを水９４μ℃、アルカリホスファターゼ
溶液（２５０単位／ｍｆＬ；宝酒造株式会社）１μぶお
よび１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）　　５μ互中
に再懸濁し、３７℃に！時装置いた。［ｌＮＡを、フェ
ノールとクロロホルムの（１：１）混合物およびクロロ
ホルムとイソアミルアルコールの（２４：１）混合物と
で抽出後、エタノールで沈澱させ、水２０μ角中に再懸
濁した。この脱リン酸化ｐｓＴ１０４７　ｕ　１１　（
約２００ｎｇ）を、実施例６＾で得た凪！■−輪旧断片
２μ角（約１０１００ｎ、５×ライゲーシヨン）Ｉ漬液
（ＡＴＰ含有）３μ℃、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ１μ℃
および水２μぶの混合物に加えた。この反応混合物を１
４℃で一部インキユベートした。 実施例５Ｄと同様にして、ライゲーション混合物により
Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩを形質転換し、生じた形貿
転換体旦、竺且ＨＢＩＯＩ　（１）ＳＴ１０５）をそれ
らのアンピシリン耐性表現型ならびにそれらのプラスミ
ドＤＮＡの旧ｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ制限酵素分析によ
って同定した。形質転換体の一つから、実施例３と同様
にして、プラスミドｐｓ７１０５を単離した。 Ｃ，５Ｔ１０５　Ｎａｒｌ　−５ａｃ工断　の単離プラ
スミドｐｓＴ１０５約１０μｇを、１９ＩＩＩＭトリス
ーＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｂ、１
　ｍＭ　ＤＴＴを含有する制限１１　ｆｆｉ液Ｃ３０ｕ
ｊ！中、制限酵素Ｍａｒ１　２０単位および５ａｃｌｌ
ＯＩＬ位により、３７℃で完全消化した。消化プラスミ
ドＤＮＡを１％アガロースゲルで泳動し、臭化エチジウ
ムでゲルを染色し、ＤＮＡバンドを長波Ｕｖ先光下可視
化した。大きいＮａｒＩ−５ａｃ工断片を切り出し、実
施例５Ａと同様にして回収した。 Ｄ、プラスミドＴＰＡ２１の約０．９ｋｂ　Ｎａｒｌ−
５ａｃ工断片のＳ離 天然ｔ−ＰＡと３°−非コード領域の一部とをコードす
るＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＴＰＡ２１約１０μ
ｇを、制限緩衝液Ｃ中、制限酵素Ｎａｒ１２０単位およ
び５ａｃ１１０単位により、３７℃で完全消化した。エ
タノール沈澱によりＤＮＡを濃縮したのち、１％アガロ
ースゲルにかけた。実施例５Ａと同様にして、約０．９
ｋｂのＮａｒＩ　−５ａｃＩバンドを可視化し、切り出
し、回収した。（ＮａｒＩ　−５ａｃ工断片のＤＮＡ配
列を第８図に示す）。 Ｅ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ
の虹携 実施例６Ｃおよび６Ｄで得た上記断片の各々約１１００
ｎを、反応混合物ＺＪｔｌＬ中で、Ｔ　４　ＤＩＩＩＡ
リガーゼ（３５０，０００単位／ｍＡ；宝酒造株式会社
）により室温で４時間ライゲートした。ライゲーション
混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、Ｅ、　ｃｏ
ｌｔ　）ＩＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、そ
れらのアンピシリン耐性ならびにプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析により同定した。得られた細胞を用いて、実
施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１０５Ｎを単離
した。 実施例７ Ａ、プラスミド５Ｔ１０６の構築 ｐｓＴ１０５Ｎ　２０μｇを、制限緩衝ン夜へ５０μｍ
中、制限酵素１５単位により、ゲル電気泳動分析によっ
て調べたときに部分消化のみを達成するべく予備インキ
ュベーション後、３７℃で４分間消化した。エタノール
沈澱によってＤＮＡを濃縮し、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，
６ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐｉ（７，９）、６ｍＭＭｇ
Ｃ１２，６ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび１０
０　ｌｔｇ／　ｍＩｌのＢＳＡを含有する制限酵素Ｓ　
ａ　ｌ　Ｉ　ｉＪｉ　？ｌｊ液５０μ℃に再懸濁し、そ
こへ２０４位の５ａｉｌを加えた。３０℃で２時間反応
を行った。ＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮し、３０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）、５０　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１１ＬＩｌｋ４　ＺｎＣｌ２および５％グリセロール
を含有するマングビーンヌクレアーゼ緩衝液に再懸濁し
た。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、
フェノールとクロロホルムとの（１：１）混合物、クロ
ロホルムとイソアミルアルコールとの（２４：１）混合
物で抽出後、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させ、水２
０μ文に再懸濁した。 実施例７Ａで得た上記ＤＮＡ断片約５０ｎｇを、６６１
１ＩＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ　
ＭｇＣｈ　、１０［１１Ｍ　２−メルカプトエタノール
および０．５ｍＭ　　ＡＴＰを含有する反応混合物２０
μ℃中、リガーゼ（宝酒造株式会社）３５０単位を用い
、室温で４時間自己ライゲートさせた。 Ｃ，Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩの汗≦　転換上記ライ
ゲーション混合物を用い、実施例５Ｄと同様にして、Ｅ
、　ｃｏｌｔ　ＨＢｌｏｌを形質転換した。 形質転換混合物をアンピシリン５０μｇ／　１ＩｌｌＬ
含有しプレートにブレーティングした。形質転換体をそ
れらのアンピシリン耐性表現型ならびにそれらのプラス
ミドの生１ｌ−５ａｌｔ制限酵素分析によって同定した
。それら形質転換体の一つから、実施例３と同様（して
、プラスミドｐｓＴ１０６を単離した。 １ヱ」ユ（ｌ置北 プラスくドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏＡＴＣＣＮ　ｏ　
、　３７２２４約ｉ　μｇを、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ　１５
衝液（１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，８ｍＭ）−リス−ＭＣ
Ｉ、ｐＨ７，９，６ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ）５０μｉ中、
制限酵素ＢａｍＨ１１０単位により３７℃で完全消化し
た。ＢａｍＨＩ消化ｐ　ｄ　Ｂ　Ｐ　Ｖ　−Ｍ　Ｍ　Ｔ
　ｎ　ｅ　Ｏをエタノールで沈殿させ、水２０μｉ中に
再懸濁した。 上記実施例８Ａで得たＤＮＡ約ｏ、ｉμｇを実施例５Ｃ
と同様にして自己ライゲートさせた。ライゲーション混
合物を用いて、実施例５Ｄと同様にしてＥ、ｃｏｌｉ　
　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、それらの
アンピシリン耐性表現型およびプラスミドＤＮＡの制限
分析によって同定した。 形質転換体の形質転換体の一つから、実施例３と同様に
して、プラスミドｐＭＭＴｎｅｏを単離した。 実施例９ プラスミド　５Ｔ１１２の構築 プラス主ドｐＭＭＴｎｅｏ約５μｇを、ＢｇｌＩＩ　ｋ
ｌｉ衝液漬液　５０ｍＭ−ＮａＣ１，１０ｍＭｆ−リス
−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１２、１０
ｍＭ２−メルカプトエタノール）１００Ａｔｌ中、制限
酵素１５単ＩＩ　５０単位により３７℃で完全消化した
。ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。 Ｂ、８１１１末端のクレノー平滑末端化上記実施例９Ａ
で得たｐＭＭＴｎｅｏのＢｇＩ１１消化産物を、５０ｃ
Ｍ）−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，２）、１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＳＯ４，０，１ｍＭ　　ＤＴＴ、　５０μｇ／ｍ１Ｂ
ｓＡ、　０．５＋ｎＭ　　ｄ　　Ａ　　Ｔ　　Ｐ　　Ｏ
，５ｍＭｄＧＴＰ、０．５　ｍＭ　　ｄＣＴＰおよび０
．５　ｍＭＴ　Ｔ　Ｐの混合物中ＤＮＡポリメラーゼエ
クレノー断片１単位により平滑末端化した。反応混合物
を２０℃で３０分間インキュベートし、つぎに酵素の熱
不活化によって反応を停止した。ＤＮＡをエタノール沈
澱により回収した。 上記実施例９Ｂで得たＤＮＡを、制限緩衝液Ａ５０μｌ
中、制限酵素ＢａｍＨＩ３０ＪＬ位により３７℃で１時
間消化した。エタノール沈澱によってＤＮＡを濃縮し、
４．３ｋｂの断片を実施例５Ａと同様にして単離、回収
した。 Ｄ、約３．０　ｋｂｔ−ＰＡ　　ｃＤＮ＾ＤＮＡ　の単
離プラスミドｐｓＴ１０６約１０μｇを、Ｈｉ　ｎ　ｄ
　ＩＩＩ緩衝液（６０Ｉ！ＩＭ　　ＮａＣ１，７ＩＩＩ
ＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ
）２００μｍ中、制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌ　１０
０単位により３７℃で完全消化した。ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、実施例９Ｂと同様にして平滑末端化した
。 エタノール沈澱によってＤＮＡを回収し、ＢａｍＨＩ緩
衝液５０μｌ中に再懸濁し、制限酵素ＢａｍＨＩ２０単
位により３７℃で１時間消化した。ＤＮＡをエタノール
沈澱によって濃縮し、約３．０ｋｂの断片を実施例５Ａ
と同様にしてｉｓ。 回収した。 Ｅ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　　ＨＢ　１
’Ｏ１ニ韮」（

【盪 上記実施例９Ｃおよび９Ｄで得た断片の各々約１１００
ｎを、反応混合物２０μｍ中゛、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１
７５単位を用いて室温で４時間ライゲートした。ライゲ
ージ自ン混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、旦
、■ｌｉ　　ＨＢ　１０１を形質転換した。形質転換体
を、それらのアンピシリン耐性表現型およびプラスミド
ＤＮＡの制限酵素による分析によって同定した。得られ
た細胞を用いて、実施例３と同様にして、プラスミドｐ
ＳＴ１１２を単離した。 プラスよドｐｓＴ１１２約５μｇを、制限緩衝７１Ａ５
０μｌ中、制限酵素ＢａｍＨＩおよび５ａｌＩ各２０各
位０Ｑ全に二重消化した。フェノール−クロロホルム抽
出後、エタノールでＤＮＡを沈殿させた。ＢａｍＨＩ−
３ａｉｌ消化産物を、実施例９Ｂと同様にして、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩクレノー断片２単位によって平滑末端化
した。 ＤＮＡをエタノール沈澱によって回収した。平滑末端化
ＤＮＡ約１１００ｎを、実施例５Ｃと同様にして自己ラ
イゲートさせた。ライゲーション混合物を用いて、実施
例５Ｄと同様にして、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩを形質転
換した。形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現
型およびプラスくドＤＮＡの制限酵素による分析によっ
て同定した。形質転換体の一つから、実施例３と同様に
して、プラスミドｐｓＴ１１８をｓｉｔ、た。 プラスミドｐＵｃ９　（ファルマシアＰ−Ｌパイオケミ
カルズ）約２μｇを、５０ｍＭＮａＣ１１０ｍＭ）−リ
ス−ＭＣＩ　　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１２お
よび７ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含有する制限
緩衝液２０μｍ中、制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩによ
り３７℃で消化して、線状ＤＮＡをＬＩＪした。線状化
プラスミドを０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下に２．５
容量のエタノールで沈澱させ、ＤＮＡを遠心分離によっ
て採取した。ＤＮＡペレットをニックトランスレーショ
ン１１　ｆｆｒｆｉ（５０ｍＭ）−リスＨＣ１，ｐＨ７
，２，１０ａ＋ＭＭｇＳＯ，，０，１ｍＭ　　ＤＴＴ、
　　５０　　μ　ｇ／ｍ１ＢＳＡ）４０μｌに再懸濁し
、そこへ各ｄＮＴＰ（５ｍＭ　　ｄＡＴＰ、−ｄＴＴＰ
、ｄＣＴＰ。 ｄＧＴＰ）１μｌと［ｌＮＡポリメラーゼＩクレノー断
片１単位とを加えた０反応を２０℃で３０分間実施し、
６５℃、１０分間の熱処理により停止させた。平滑末端
化したＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｌｌｌＤＮＡをエタノール沈澱
により回収した。　１エユＩＩリンカ−（５″−ＣＡＧ
ＡＴＣＴＧ−３’　、宝酒造株式会社製）１μｇを、７
０ＩＩＩＭトリスーＭＣＩ　　（ＰＨ７，６）、１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２，５ｍＭ　　ＤＴＴ、０．５　ｍＭＡ
ＴＰの２０μｌ中、ポリヌクレオチドキナーゼにューイ
ングランドバイオラブズ）２０単位を用いてリン酸化し
た。リン酸化ｎ±ＩＩリンカ−１０μｇと上記平滑末端
化したＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片１μｇを、反応混合
物２０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３５０単位を用い
てライゲートした。ライゲーション混合物を用いて実施
例５Ｄと同様にして旦、笠貝ＨＢＩＯＩを形質転換した
。形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型およ
び制限酵素分析により同定した。形質転換体から、実施
例３と同様にして、プラスミドｐｓＴＯ２を単離した。 プラスミドｐｓＴＯ２約５μｇを、５ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ　　（ｐＨ７，１）、５ｍＭ　　ＭｇＣｌｘ　、２ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＳＡを含有
するＢｂｅ　Ｉ緩衝液５０μｌ中、制限酵素Ｂｂｅ　Ｉ
　２０単位により、３７℃で完全消化した。ＤＮＡをエ
タノール沈澱により回収し、制限緩衝液Ａ５０μｌに再
懸濁し、制限酵素Ｕユ１１１０車位により３７℃で完全
消化した。消化したプラスミドＤＮＡを１％アガロース
ゲルで泳動させ、大きいＢｂｅｌ−８ｇｌ１２バンドを
、実施例５Ａと同様にして切り出し、回収した。 Ｂ、プラスミド　５Ｔ１０６の約３３０ｂＢ　ｂ　ｅ　
Ｉ　−Ｂ　　Ｉ　１１断　の単離プラスミドｐｓＴ１０
６約２０Ｊを、ＢｂｅＩ緩衝液１００μ濫中、制限酵素
Ｂｂｅ　Ｉ　２０単位により３７℃完全消化した。エタ
ノール沈澱によってＤＮＡを回収し２、制限緩衝液Ａ１
００μｌに再懸濁し、制限酵素Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩ　２０
　＊位により３７℃で完全消化した。　ＤＮＡをエタノ
ール沈澱により濃縮してから、１．５％アガロースゲル
にかけた。約３３０ｂｐのＢ　ｂ　ｅ　Ｉ　−見工土Ｉ
Ｉバンドを、実施例５Ａと同様にして可視化し、切り出
し、回収した。 上記実施例１２Ａおよび１２Ｂに記載の各ＤＮＡ断片約
ｔｏｏｎｇずつを、２０μｍの反応混合物で、Ｔ４ＤＮ
＾リガーゼ（３５Ｑ、０００　Ｊｌ、位／ｍｌ；宝酒造
株式会社）０．５μｌを用いて室温で４時間かけてライ
ゲートした。ライゲーション混合物を用いて、実施例５
Ｄと同様にして、Ｅ　、　ｃｏｌｉ、ＨＢ１０１を形質
転換した。形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表
現型およびプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同
定した。得られた細胞を用いて、実施例３と同様にして
、プラスミドｐｓＴ１０７を！＃離した。 ｐｓＴ１０７約２０μｇを、１００　ｍＭ。 ＮａＣ１１０ｍＭトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭ　　Ｍｇｃｉ２．１０ｍＭ　　２−メルカプトエタ
ノールを含有する５ｓｐＩ緩衝液１００ｔ１１中、制限
酵素主上上１４０単位により、ゲル電気泳動分析により
調べるとき部分消化のみが達成されるよう予備インキュ
ーベーションののち、３７℃で５分間消化した。ＤＮＡ
をエタノール沈澱により濃縮し、１％アガロースゲルに
て泳動させた。 ｐｓＴ１０７の約２．８ｋｂ断片を、実施例５Ａと同様
にして切り出し、回収した。回収したＤＮＡを、制限緩
衝液Ｂ１００μｌ中、制限酵素ＰｓｔＩにより３７℃で
完全消化した。ＤＮＡを工作ノール沈澱により濃縮した
のち、１％アガロースゲルにかけた。約２．７ｋｂ　　
互王上Ｉ−ＰｓｔＩバンドを、実施例５Ａと同様にして
切り出し、回収した。 Ｂ、ｍＴＰＡ２　　ＰｓｔＩ−５ｓｐＩ断片の構築フィ
ンガードメイン領域中のｍＴＰＡ２と名付けた７２７−
および７６マーを、Ａ　Ｂ　Ｓ　３８０　Ａ　　ＤＮＡ
シンセサイザー（アブライドバイオシステムズ社、８５
０リンカンセンタードライブ、フォスター市、ＣＡ９４
４Ｃ４）を用いて合成した。上記合成デオキシスクレオ
チドの各々約１１００ｎを、６６ＩＩＩＭトリスーＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ　２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ　　ＡＴＰ
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５！＃位を含有す
る反応液２０μｌ中で、３７℃にて１時間リン酸化した
。 各々の反応混合物を合わせ、９５℃で５分間加熱し、水
浴上て２時間かけてゆっくりと室温まで冷却して、両頭
をアニーリングさせて、次式のｍＴＰＡ２断片を得た： ７２７　−：　　　　　５’−ＧＣＧＡＣＡ人ＧＴＡＴ
ＡＣＴＡＡＣ人ＣＴＴＡＣＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡ
ＣＴＴＡＴＧＡＧＣ７６マー＝３°−ＡＣＧＴＣＧＣＴ
ＧＴＴＣＡＴ人ＴＧＡＴＴＧＴＧ入ＡＴＧＧＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＴＧＴＧ：ｕＴＡｃＴｃＧＣＡＧＧＡｍＣｒＧ
人ＧＧＴＡＣＴＡＧＡＣＣＣＴＴ人−５゜上記の実施例
１３Ａおよび１３Ｂに記載した断片の各々約１１００ｎ
ずつを、反応混合物２０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３５０，０００単位／ｍｌ；宝酒造株式会社）０．５
μｍを用い、室温で４時間ライゲートした。ライゲーシ
ョン混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、Ｅ、■
１１　　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、そ
れらのアンピシリン耐性表現型およびプラスミドＯＮへ
の制限酵素の解析により同定した。得られた細胞を用い
、実施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１０９を単
離した。 犬迦艷’１　ｔ工 ｍＴＰＡ２含有哨乳　物　　ベクター　Ｓ　Ｔ　１２０
の構築 プラスミドｐｓＴ１１８約１０μｇを、Ｂｂｅｌ緩衝液
５０μｌ中、制限酵素Ｂｂｅ１２０単位により３７℃で
完全消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、
制限緩衝液Ａ５０μｌ＆：再懸濁し、制限酵素、ＬＬＬ
Ｉ■２０単位で完全消化した。消化したプラスミド［１
ｌｌｌＡを１％アガロースゲルにて泳動させ、大きいＢ
　ｂ　ｅ　Ｉ　−Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩ断片を、実施例５Ａ
と同様にして切り出し、回収した。 プラスミドｐ　Ｓ　Ｔ　１０９約１０μｇを、ＢｂｅＩ
緩衝液５０μｌ中、制限酵素Ｂｂｅｒ２０ＪＬ位により
３７℃で完全消化した。　ＤＮＡをエタノール沈澱によ
り回収し、制限Ｍ荷液Ａ５０μｌに再懸濁し、制限酵素
ＬＬＬＩ■２０単位により３７℃で完全消化した。　Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱により濃縮したのち、１．５％ア
ガロースゲルにかけた。約３３０ｂｐのＩＬ工ＩＩ　−
Ｂ　ｂ　ｅ　Ｉバンドを、実施例５Ａと同様にして可視
化し、切り出し、回収した。 上記の実施例１４Ａおよび１４Ｂで得たＤＮＡ断片を各
々約１１００ｎずつを、２０μｌの反応混合物中、Ｔ４
ＤＮ＾リガーゼ１７５単位を用いて、Ｎ？にで４時間ラ
イゲートした。ライゲーション混合物を用いて、実施例
５Ｄと同様にしてＥ。 ｃｏｌｉ　　ＨＢ　１０１を形質転換した。形質転換体
をそれらのアンピシリン耐性表現型およびプラスミドＤ
Ｎへの制限酵素分析により同定した。得られた細胞を用
いて、実施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１２０
を単離した。 Ａ、細胞の調製 Ｌ−９２９細胞系培養物がこの実施例で用いられるが、
Ｌ−９２９細胞はＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１として入手でき
る。この細胞をカナマイシンと１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児
血清を含むＤＭＥＭ中３７℃で５％Ｃ０２条件下で維持
した。この細胞を形質転換の前日１０ｃｍのベトリ皿１
個につき５Ｘ１０’ｍ胞数の細胞濃度でプレートし、形
質転換日に５０−６０％コンフルエンシーを得た。培地
は形質転換３時間前に交換した。２つの１０ｃｍベトリ
皿を各形質転換に用いた。 Ｂ、ＤＮＡ溶液の調製 プラスミドＤＮＡを用いてゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）法
［ＤＮＡ　ＣＩｏｎＩｎｇ　ＩＩ　、　１４３　　（１
９８５）、　ＩＲＬｐｒｅｓｓｌ　　と同様にしてリン
酸カルシウム手法によりＬ−９２９細胞を形質転換した
。 発現プラスｑド（ｐｓＴｌ　２０）３０／ｌｊｇとプラ
スミドｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｎ　ｅ　ｏ　　Ａ　Ｔ　ＣＣＮ
　ｏ　、３７１４９３ｕｇを２Ｍ　　ＣａＣｌ２１８６
μｍと水１．３＋ｎｌに加えた。ＤＮＡ溶液１．５　ｍ
ｌを２ＸＨＢＳ（１，８３％ＮａＣ１，１，１９％ＨＥ
　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　０．０４％Ｎ　ａ　。 ＨＰ　Ｏ４，Ｐ　Ｈ７，１２）　１．５ｍｌにバブリン
グしながら滴下した。混合物を細胞に接触させる前に室
温で３０分間放置した。 Ｃ１細　のトランスフェクション 実施例１５Ｂで調製したＤＮＡ溶液０．８Ｑ１１をゆる
く攪拌しながらＬ−９２９細胞の１０ｃｍペトリ皿に加
え、３７℃でＣＯ２気流中１８時間加温した。細胞をＤ
ＭＥＭで２回洗った。１０％ＦＣＳを含む完全な新鮮成
育培地を次に加え、細胞をＣＯ２気流中３７℃で２４時
間加温した。細胞をトリプシン処理し、３００μｇ／ｌ
１ｌｌのジエネテイシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ４１
８）および１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭからなる選択培
地中で１：１０のサブカルチュアをした。 ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ＋′遺伝子産物）を
発現する細胞が選択培地中で生存し、コロニを形成する
ことができる。培地を３−４日ごとに交換し、コロニー
を１２−１４日後に単離した。 ０４１８耐性コロニーを小シリンダー中おだやかなトリ
プシン処理埋により採取し、培養塊になるまで増殖させ
、変異ｔ−ｐ＾の分泌について試験した。 細胞を直径１．７ｃｍの３ｍｌの培地を入れたマルチ・
ウェル・プレート皿中で約３　Ｘ　１０’細胞数になる
まで増殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。細
胞を０．４　ｍＭ　　Ｚ　ｎ　Ｓ　０４．１　ｍＭ酪酸
ナトリウム、２％ＦＣ３を含む、ＤＭＥＭからなる誘導
培養培地ｆｍｌ中３７℃で２４時間培養し、培地中の変
異ｔ−Ｐｉ　Ｓ　２２５１を用いる間接吸光分析法［Ｔ
ｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３１，４２７（
１９８３）参照］により定量した。 実施例１５で得たプラスミドｐｓＴ１２０含有Ｌ−９２
９クローンの培養ブロスから変異蛋白質ｆＦＰＡを精製
した。変異蛋白質精製の最初の工程は、モノクローナル
抗ｔ−Ｐへ抗体結合セファロース４Ｂカラム（１，６ｃ
ｍ＋　ｘ　３ｃｍ）　［メーカーの指示に従い、モノク
ローナル抗ｔ−ＰＡ抗体（その調製法は、たとえばカイ
ズ・ットムらＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ　
４０．９ｌ−９９（１９８５）に開示されている）をＣ
ＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させた］でのアフ
ィニティクロマトグラフィーであった。 カラム（０，７ｘ　２．５ｃｍ）を、０．０１％トウィ
ーン８０およびｌ０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含有
する０、１Ｍ１−リス−ＨＣｌ平衡化した。培養ブロス
を通し、カラムを１０カラム容量の平衡化Ｍ荷液で洗っ
た。脱着は、０．０１％トウィーン８０および１０ＫＩ
Ｕ／ｍｌのアプロチニンを含有する０、１　Ｍ塩酸グリ
シン（ｐ　Ｈ２，５）で行った。脱着両分を直ちにＩＭ
Ｉ−リス−ＭＣＩ（ｐＨ９，０）で中和し、ｔ−ＰＡ活
性を含むものをプールした。精製の次の工程は、０．１
５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ１、０，００５％トウィーン８０お
よびｌ０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含有する０、０
５Ｍ　トリス−ＨＣＩ（ＰＨ８，０）で平衡化したベン
ズアミジンセファロース４Ｂ（ファルマシア）カラム（
０，４５Ｘ　３　ｃｍ）でのアフィニティクロマトグラ
フィーであった。第一工程でプールした画分をヘンズア
ミジンセファロースカラムにかけた。カラムを、ＬＭ　
　Ｎ　　ａ　Ｃｌ　　　０．００５　　％トゥイーン８
０および１０ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニンを含有する０
、０５Ｍ　）−リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ８，０）１０カ
ラム容量で洗い、１Ｍアルギニンを含有する洗浄用緩衝
液を用いて行った。ｔ−ＰＡ活性含有画分をプールし、
０．１　Ｍ　　（ＮＨ４）２　ＣＯ３、０，１５Ｍ　　
ＮａＣ１，０，０５％トゥイーン８０に対して透析した
。この操作での変異蛋白質の収量をローリ−法によって
求めた。 結果を法要に示す。 変異ｔ−ＰＡであるｆＦＰＡのプラスミノーゲン活性化
因子活性を、間接吸光分析法［Ｔｈｒｏｍ　−ｂｏｓｉ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３１．４２７（１９８３）参照
コによって求めた。すなわち、各変異ｔ−ＰＡの種々量
を、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１％（Ｖ／Ｖ
）　トリトンＸ−１００を含有する５０ｍＭトリス−Ｍ
ＣＩ　（ｐＨ８，８）中でＷｉｍａｎらの方法［ＣＣ１
１ｎＪｈ１．Ａｃｔａ１２７、２７９（１９８３）参照
］により調製した。０゜２μＭヒトプラスミノーゲン（
ミドリ十字、大阪）０．９ｍＭ　　Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ　−ニトロアニリド・２ＨＣ１（Ｓ−
２２５１、ＢＡＣＨＥＭ）および７０μｇ／ｍｌの可溶
化フィブリンの混合物に加えた。反応混合物を３７℃で
３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー
（タイターチック・マルチスキャン、フローラボラトリ
ーズ社、米国）を用いて、活性化因子なしのブランクと
対照して、４０５ｎｉでの吸光度を測定した。天然ｔ−
Ｐ八（国際標準（ＷＨＯ）］の標標準線を参照して、変
異ｔ−Ｐ＾のプラスよノーゲン活性化因子活性［ｔ−Ｐ
Ａの国際単位（ＩＵ）］を求めた。 変異ｔ−ＰＡの蛋白質濃度をローリ−法によって求めた
。結果を次表に示す。 Ｂ、　　　ｔ−ＰＡの半゛　に関する生　　　験ａ）址
豊 動物：全ての実験は、ネンブタール（５０ｍｇ／　ｋｇ
、　ｉ、ｐ　、　）で麻酔した雄性スプラグドーリ−ラ
ット（２２０−２４５ｇ　）を用いて行った。 ｔ−［’Ａ　：ヒトメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ　）細胞培
養培地から実施例１６と同様にして天然ｔ−ｐＡ（Ｊｌ
ｆｆｌ、〉８０％）を精製した。組換え変異ｔ−ＰＡ（
ｆＦＰＡ）は実施例１６で得た。 その他の材料：アプロチニン（ベーリンガー・マンハイ
ム社）、ヘパリン（和光純薬工業、日本）。 ｂ）友迭： 食塩水充填カニユーレを試験動物の大腿静脈に挿入して
、ｔ−ＰＡ　（１００μｇ／ｋｇ）を注射した。試験動
物の左頚動脈にポリエチレンチューブを挿入し、これに
はヘパリン（１００４位／ｍｌ）を満たしておき、ｔ−
ｐへ注射前後１．２．３．５．７．１ｏ、１５および２
０分に、酢酸ナトリウム（３，２％、Ｗ／Ｖ）２０μｌ
およびアプロチニン（８０００Ｋ　Ｉ　Ｕ　／ｍｌ）　
　５０μ工を入れたポリエチレン管に血液試料（２００
μｌ）を採取した。血液試料を１０，０００ｒｐｍで２
分間遠心分離して、血漿を回収した。血漿中のｔ−ｐ＾
レベルをｔ−ＰＡ用ＥＬＩＳＡ［たとえば、カイズら、
　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　　Ｒｅｓ、４０゜９１　（１
９８５１参照］を利用して測定した。 Ｃ）致玉： 結果を次表に示す。 上記実施例で得た発現プラスミドｐｓＴ１２０をＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　　ＨＢ　１０１に挿入し
、得られた下記の形質転換株を、ブダペスト条約に基く
国際寄託機関の一つである日本国３０５茨城県つくば市
谷田部町東１丁目１−３工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）に１９８８年６月２３日に寄託ずみである
。 旦叉監亘旦　　　　　　　　　　　も里１±Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｌａ　ｃａｌｆ　ＨＢＩＯＩ（ｐｓＴ１２０）
　　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９１９４、図面の簡単な説明 第１図は、新規トＰ＾発現ベクターの構築を示す。 第２図は、プラスミドｐＭＩ２００の制限部位・機能地
図を示す。 第３図は、プラスミドｐＭＩ　２００のｃ　ＤＮＡ挿入
断片のＤＮＡ配列を示す。 第４図は、プラスミドｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７
−１１ｅ）のＢｇｌｌｌＤＮ＾断片（１９７４ｂｐ）の
ＤＮＡ配列を示す。 ＄５図は、プラスミドｐＭＩ２０５の制限部位・機能地
図を示す。 第６図は、プラスミドｐｓＴ１０４の制限部位・機能地
図を示す。 第７図は、プラスミドｐｓＴ１０５の制限部位・機能地
図を示す。 第８図は、Ｎａｒｌ−３ａｃ ｋｂｐ）のＤＮＡ配列を示す。 第９図は、プラスミドＰｓＴｔ 位・機能地図を示す。′ 第１０図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１１図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１２図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１３図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１４図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１５図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１６図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 第１７図は、ブラスミ 位・機能地図を示す。 ドｐｓＴＯ２の制限部 ドｐｓＴ１２０の制限部 ドｐｓｒｔ ドｐＭＭＴｎｅ。 ドｐｓＴ１ ドｐｓ”ｒｔ ドｐｓ”ｒｉ ドｐｓＴ１ ■ 断片 （〜０．９ ５Ｎの制限部 ６の制限部 の制限部 ２の制限部 ８の制限部 ７の制限部 ９の制限部 第１８図は、第１７図に示したｆＦＰＡをコードする変
異ｔ−ＰＡ　　ｃ　ＤＮＡのＤＮＡ配列および相当する
アミノ酸配列を示す。 第１ 図（１） 土Ｅχ、１０ Ｍｌ　図（２） 第１ 図（３゛） 第３図 ＧＣＡＧＴＧＴ丁ＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣ（：ＡＧ
ＧＡ八八Ｔへへ八Ｔ’へＣＣＣＧ八ａｌへ　Ｖａｌ　ｐ
ｈ＠ｖａｌ　　ｓｅ＋　ｐＩｏ　ｓ９ｒ　ｇｌｎ　　ｇ
ｌｕ　　ＩＩｓ　４ｕｓ　　ａｌａ　ａ＋ｇ第′４図（
１） 第４図（２） 第４図（３） ＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ
ＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＴ＾〔へＧ
ＧＡＧＡＧＧＧＡＡ、ＧへＧＴＧＣへＴＴＴＴＣＣＣＡ
ＧＡＴＡ（：Ｔ丁ＣＣＣ＾丁丁ＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴ
ＣＡＧＧＡＣ丁子ＧＧＴＣＴＧＡＴＴ丁ＣＡＧＧ人ＴＡ
ＣＴＣＴＧＴＣ人ＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡ丁ＧＡＡ丁
ＧＣＡＣＡＣＴＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＧＩＩ；ＡＡＴＧ
ＣＣ丁ＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＣＡ
ＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＧＣ丁＾＾＾ＧＣＣＣ
ＡＡＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧ丁ＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣ
ＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣＣＡＣ＾＾＾＾Ａ
ＴＧＡＡＡ、ＧＣ八へＧ丁ＣＴＣ＾八へＡＧＴ八へ＾八
へ人人ＡＣ（勾１ｎ） 八ＡＧＡ　−３ 第８図（２） Ｐｒｏ＾ｆｉｐＴｒｐＴｈｒｌｊｌｕに７１ｕｌｕ１０ ３関Ｉ 第１８図（１） ５　’−ＴＴＡＡＧＧＧＡＣ（ｉｃＴＧＴＧＡＡＧｃ八
ＡＴｃ八ｒｇｃｌＹＴｈｒＨ１ｓｓｅｒＬａｕＴｈｒｏ
ｌｕｓｅｒＧｌｙＡｌａｓｅｒｃｙｓＬａｕＰｒｏ丁ｒ
ｐ＾ｓｎｓ仁ｒｌイｅｔ第１８図（３） ＧＣ八へＧＴＣＴＣＡＡＴＡＯ↑ＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡ
ＡＧＡ　−３手続補正書 （自発） １、事件の表示 平成０１年特許願第１６３５９８号 ２、発明の名称 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 本１代 理 人 住 所 大阪市北区堂島２丁目３番７号 シシコーｅ′ル４０７ ５、補正の対象 図面 ６、補正の内容 第】図を別紙３１！１図に差し替えます。 第１図（１） 土ＦｘｌＯ ±Ｅｘ、、ｌＬ 詐１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）天然ｔ−ＰＡのフィンガードメインのアミノ酸配列
   の一部がフイブロネクチンの I 型アミノ酸配列の一部
   またはそれの修飾されたアミノ酸配列によって置換され
   ていることによって天然ｔ−ＰＡと相異するｔ−ＰＡ。 ２）下記アミノ酸配列をもつ請求項１記載のｔ−ＰＡ： Ｒ＾１−Ａ＾２＾−＾５−Ｒ＾２−Ａ＾３＾４＾−＾５
   ＾２＾７（ I ）（式中Ｒ＾１はＳｅｒ−またはＧｌｙ
   ＡｌａＡｒｇＳｅｒ−、Ｒ＾２は−ＳｅｒＡｓｐＬｙｓ
   ＴｙｒＴｈｒＡｓｎＴｈｒＴｙｒＡｒｇＶａｌＧｌｙＡ
   ｓｐＴｈｒＴｙｒＧｌｕＡｒｇＰｒｏＬｙｓＡｓｐＳｅ
   ｒＭｅｔＩｌｅＴｒｐＧｌｕ−または −ＰｈｅＡｓｐＬｙｓＴｙｒＴｈｒＧｌｙＡｓｎＴｈｒ
   ＴｙｒＡｒｇＶａｌＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＧｌｕＡ
   ｒｇＰｒｏＬｙｓＡｓｐＳｅｒＭｅｔＩｌｅＴｒｐＡｓ
   ｐ−、Ａ＾２＾−＾６は天然ｔ−ＰＡのＴｙｒ＾２−Ｃ
   ｙｓ＾５と同じアミノ酸配列、 Ａ＾３＾４＾−＾５＾２＾７は天然ｔ−ＰＡのＣｙｓ＾
   ３＾４−Ｐｒｏ＾５＾２＾７と同じアミノ酸配列である
   。） ３）Ｒ＾１がＳｅｒ−、 Ｒ＾２が−ＳｅｒＡｓｐＬｙｓＴｙｒＴｈｒＡｓｎＴｈ
   ｒＴｙｒＡｒｇＶａｌＧｌｙＡｓｐＴｈｒＴｙｒＧｌｕ
   ＡｒｇＰｒｏＬｙｓＡｓｐＳｅｒＭｅｔＩｌｅＴｒｐＧ
   ｌｕ−であり、 Ａ＾２＾−＾５およびＡ＾３＾４＾−＾５＾２＾７は各
   々請求項２で定義した通りである請求項２記載のｔ−Ｐ
   Ａ。 ４）請求項１で定義したｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコー
   ドするＤＮＡ。 ５）請求項２で定義したｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコー
   ドするＤＮＡ。 ６）請求項４で定義したＤＮＡを含有する発現ベクター
   。 ７）請求項５で定義したＤＮＡを含有する発現ベクタ−
   。 ８）請求項６で定義した発現ベクターによって形質転換
   された宿主細胞。 ９）請求項７で定義した発現ベクターによって形質転換
   された宿主細胞。 １０）請求項１のｔ−ＰＡをコードするＤＮＡを含有す
   る発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培地
   に培養し、生じたｔ−ＰＡを培養液から採取することを
   特徴とする、請求項１のｔ−ＰＡの製造法。 １１）請求項２のｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードする
   ＤＮＡを含有する発現ベクターによって形質転換された
   宿主細胞を培地に培養し、生じたｔ−ＰＡを培養液から
   採取することを特徴とする、請求項２のｔ−ＰＡの製造
   法。 １２）請求項１のｔ−ＰＡと医薬として許容しうる担体
   とを含有する医薬組成物。