KR19990082479A

KR19990082479A - 트롬빈 억제제에 대한 해독제인 트롬빈 돌연변이 단백질

Info

Publication number: KR19990082479A
Application number: KR1019980706212A
Authority: KR
Inventors: 마르틴 라디취; 토마스 프리드리히; 클라우스 볼쉬바일러; 마르틴 쉬미트; 한스 볼프강 회프켄; 위르겐 쉬베덴; 클라우스 뤼브자멘
Original assignee: 스타르크, 카르크; 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-11
Publication date: 1999-11-25
Also published as: BR9707280A; NO983677L; ZA971107B; CN1211280A; JPH11512621A; NO983677D0; IL125077A0; DE19605126A1; WO1997029198A1; US6060300A; CO4600682A1; CA2245546A1; CZ247798A3; EP0880591A1; HUP9900574A2; HRP970077A2; AR005797A1; AU1768497A

Abstract

본 발명은 (a) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 558번 위치에 존재하며, 주변 서열 Tyr-Gly-Phe에 위치하는 Gly이 Ala으로 치환되고, (b) (b1) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 363번 위치에 존재하며, 주변 서열 Ala-His-Cys에 위치하는 His 잔기, (b2) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 419번 위치에 존재하며, 주변 서열 Arg-Asp-Ile에 위치하는 Asp 잔기, (b3) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 525번 위치에 존재하며, 주변 서열 Asp-Ser-Gly에 위치하는 Ser 잔기 중의 적어도 하나의 잔기가 치환 또는 결실되어 천연 트롬빈과 상이한 서열을 갖는 트롬빈 돌연변이 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이들 돌연변이 단백질의 해독제로서 사용된다.

Description

트롬빈 억제제에 대한 해독제인 트롬빈 돌연변이 단백질

본 발명은 신규한 트롬빈 돌연변이 단백질, 이들의 제조 방법 및 트롬빈 억제제에 대한 해독제로서 이들의 용도에 관한 것이다.

직접적으로 트롬빈 억제 작용을 하는 항응고제가 항혈전치료에서 중요성이 점차 증가하고 있다. 항응고제를 광범위한 용도로 사용하기 위한 필수 전제 조건은, 과다투여의 경우에 그 효과를 중화시킬 수 있어야 한다는 것이다. 즉, 과다투여시 분해가 잘 일어나지 않고 배설이 늦춰지면 복막, 심낭 및 늑막의 부위에서 출혈 등과 같은 위협적인 출혈 부작용이 일어나기 때문에 이를 억제할 수 있어야 한다. 헤파린에 대해서는 사용할 프로타민 술페이트, 폴리라이신 및 혈소판 인자 4의 형태로 사용할 수 있는 해독제가 있지만, 현재 트롬빈 억제제를 중화시키기 위해 사용할 적당한 인체용 해독제는 없는 상황이다.

각종 해독제 원리는 문헌에 기재되어 있다. 파리드 (Fareed)는 히루딘을 중화시킬 물질로서 오토플렉스 (autoplex) 산물 또는 FEIBA 등의 활성화된 혈장 성분을 제안했지만, 이들의 활성이 트롬보플라스틴과 유사하기 때문에, 중화에 적합하지 않다 (Fareed, Fed. Proc. 3 (1989) A 328; Walenga Sem. Thromb. Hemost. 15 (1989) 316-333).

문헌 (Markwardt, Thrombosis Research 74 (1994) 1-23)에는 트롬빈 및 트롬빈 유도체를 사용하는 것이 기재되어 있다. 그 예로는 트롬빈, 트롬빈-2-마크로글로불린 복합체 및 메이조트롬빈 (meizothrombin) 등이 있다. DFP-트롬빈 또는 벤조일-트롬빈과 같은 화학적으로 불활성화된 트롬빈을 히루딘 중화용으로 사용하는 것이 문헌 (Markwardt, Pharmazie, 44 (1989) 648-649)에 기재되어 있다.

그러나, 이들 생성물은 응고 활성 및 히루딘에 대한 친화성이 1000 배까지 낮기 때문에 인체용 해독제로 사용하기에는 부적합하다 (F. Doyle, Methods Enzymol; 222권, 299쪽 이하 참조; Moriata, Methods Enzymol, 80권, 303쪽 이하 참조; Stone 등, Biochemstry 26 (1987) 4617-4624; Markwardt, Pharmazie, 44 (1989) 648-649).

사람의 프로트롬빈은 공지되어 있으며, 문헌 (Friezner 등, Biochemistry, 22 (1983) 2087-2097)에 기재되어 있다. 사람의 프로트롬빈의 아미노산 서열은 서열 14에 나타냈다. 사람의 트롬빈 서열의 번호를 매기는 상기 방법은 여러 문헌에서 발견할 수 있으며, 다른 지시가 없는한 서열 14에 나타낸 번호 체계를 이하에서 사용한다.

유전공학적으로 변형되어 효소 활성을 잃은 트롬빈은 문헌 (Lentz 등, JBC 266, No. 15, 9598-9604)에 기재되어 있다. 이것은 촉매작용에 필수적인 205번 위치의 세린 잔기가 알라닌으로 치환되어 생긴, 효소 활성을 잃은 트롬빈 변이체로서 합성 기질 및 천연 기질 피브리노겐에 대한 절단 활성은 없지만 (Lentz 등, JBC 266, No. 15, 9598-9604) 트롬빈 억제제인 단질아르기닌-N-(3-에틸-1,5-펜탄디일)아미드에 대한 결합 친화성이 낮다.

문헌 (Stone 등, Biochemistry 30, 6392-6397)에는 천연 트롬빈 변이체 킥 II (Qick II)가 개시되어 있다. 킥 II는 238번 위치 (서열 14의 558번 위치)가 천연 트롬빈과 다르다. 이 경우에는, 천연 트롬빈의 238번 잔기인 글리신이 소수성 잔기인 발린으로 돌연변이가 일어난다. 효소의 P1 주머니에서 이런 작은 치환은 피브리노겐의 절단 속도를 뚜렷히 감소시키며 (본래 활성의 2 %), 동시에 저분자량 기질 및 히루딘 둘다와의 결합율을 극적으로 감소시킨다. 스톤 (Stone)은 히루딘에 대한 돌연변이 단백질의 결합 상수가 1000배 이상으로 악화된다는 것으로 입증했으며, 이런 현상에 관해 움푹패인 결합 위치 (binding cavity)의 입체장애 및 활성 중심 주변의 재배열을 그 원인으로 설명했다.

현재까지 개시된 트롬빈 돌연변이 단백질은 트롬빈 억제제에 대한 이들의 친화성이 너무 작거나 피브리노겐에 대한 이들의 결합 및 효소 활성이 너무 높기 때문에, 트롬빈 억제제를 위한 해독제로서 부적합하다.

본 발명의 목적은 효소로서 실질적으로 불활성화되고 트롬빈 억제제에 결합할 뿐아니라 천연 기질 피브리노겐에도 비변형 트롬빈에 비해 낮은 친화도로 결합하는 신규한 트롬빈 돌연변이 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 (a) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 558번 위치에 존재하며, 주변 서열 Tyr-Gly-Phe에 위치하는 Gly이 Ala으로 치환되고, (b) (b1) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 363번 위치에 존재하며, 주변 서열 Ala-His-Cys에 위치하는 His 잔기, (b2) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 419번 위치에 존재하며, 주변 서열 Arg-Asp-Ile에 위치하는 Asp 잔기, (b3) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 525번 위치에 존재하며, 주변 서열 Asp-Ser-Gly에 위치하는 Ser 잔기 중의 적어도 하나의 잔기가 치환 또는 결실되어 천연 트롬빈과 상이한 서열을 갖는 트롬빈 돌연변이 단백질을 통해 상기한 목적을 달성할 수 있다는 것을 발견했다.

이 신규 트롬빈 돌연변이 단백질은 사람 및 영장류, 소, 돼지, 개, 고양이, 생쥐, 쥐 등의 다른 포유동물의 트롬빈 등과 같이 공지되어 있는 천연 트롬빈으로부터 제조할 수 있다. 천연 트롬빈이란 트롬빈 활성을 갖는 것으로서 생명체에서 자연적으로 발생한 폴리펩티드 서열을 의미한다.

트롬빈 돌연변이 단백질은 이황화결합으로 연결된 2개의 분자쇄 (A 및 B 쇄) 뿐만 아니라, B 쇄 또는 B 쇄의 일부, 바람직하게는 N- 및(또는) C-말단이 절단된 B 쇄로만 이루어진 예비트롬빈 또는 단백질과 같은 단쇄 형태의 분자를 모두 의미한다. 본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질에게 있어서, 트롬빈 억제제 결합과 관련된 활성이 존재한다는 것은 결정적으로 중요하다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 또한 트롬빈 단백질 가수분해의 공지 산물, 예를 들면 β-트롬빈, γ-트롬빈, ω-트롬빈, 또는 트롬빈 전구체 (예: 프로트롬빈, 프로트롬빈 중간체 또는 다른 메이조트롬빈)로부터 출발하여 제조될 수 있으며, 이들은 그후 예를 들면 에키스 카리나투스 (Echis carinatus) 또는 다른 옥시라누스 스쿠텔라투스 (Oxyranus scutellatus) 뱀의 독액 성분인 인자 Xa를 사용한 적합한 절단 방법에 의해 활성 트롬빈 분자로 전환될 수 있다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 히루딘, 히루딘 유도체 또는 다른 트롬빈 억제제를 중화시키기에 적합하다.

유전공학적인 제조 방법이 바람직한데, 이 방법에서는 트롬빈 돌연변이 단백질에 적합한 유전자를 제조하고, 이 유전자를 적합한 숙주 생명체에서 발현시킨다.

신규한 트롬빈 돌연변이 단백질은 적어도 두 가지 점에서 천연 트롬빈의 서열과 다른데, 첫번째 차이점은 글리신 잔기가 알라닌 잔기에 의해 대체되었다는 것이다. 이 치환 위치는 처음의 천연 트롬빈의 기원에 따라 다르지만, 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)에서는 558번 위치에 있으며 주변 서열이 Tyr-Gly-Phe인 곳에 위치하는 글리신이다.

두번째 서열상의 차이는 프로테아제 트롬빈의 촉매 3인조를 형성하는 3개의 위치 (His, Asp, Ser) 중 하나의 아미노산 잔기가 치환 또는 결실되었다는 것이다. 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)에서, 이들 위치는 His가 363, Asp가 419 및 Ser이 525이다. 사람의 것이 아닌 다른 트롬빈에서는, 이들 위치가 분자의 전체 길이에 따라서 어느 정도 바뀔 수 있다. 특정 아미노산의 전후에 있는 아미노산 잔기, 즉 주변 서열은 트롬빈에서 보존되지만, 주변 서열을 근거로 특정 아미노산 잔기의 정확한 위치를 용이하게 정립할 수 있다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 또한 촉매 3인조 상에 여러 변이 (결실 또는 치환)를 가질 수 있다. 바람직한 것은 촉매 3인조 상에 단 하나의 변이가 있는 트롬빈 돌연변이 단백질이다.

바람직한 변이는 촉매 3인조의 아미노산의 치환을 수반하는 것이다. 히스티딘 잔기는 극성 또는 소수성 아미노산, 특히 Phe, Tyr, Ala 또는 Val으로 치환되는 것이 바람직하다. 아스파르테이트 잔기는 바람직하게는 다른 극성 아미노산, 예를 들면 Gln 또는 Asn으로 치환된다.

특히 바람직한 트롬빈 돌연변이 단백질은 세린 잔기가 바뀐 것이며, 구체적으로는 세린이 히드록시 관능기가 없는 아미노산, 특히 세린과 유사한 체적의 아미노산으로 치환된 것이다. Ser이 Ala으로 치환된 것이 특히 바람직하다.

이들 트롬빈 돌연변이 단백질의 활성은 이 분자에 다른 변이를 유발시킴으로써 더 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 생체내 활성의 존속 기간을 가능한한 연장시키기 위해 단백질 가수분해 안정성을 향상시키는 것을 추가로 생각할 수 있다. 이를 위해 예를 들면 염기성 잔기 Arg 393, Lys 465, Arg 390 또는 Arg 382 (서열 14)를 다른 비염기성 아미노산으로 치환할 수 있다.

본 발명은 또한 상기의 트롬빈 돌연변이 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열에 관한 것이다. 이들은 폴리펩티드 서열을 유전자 코드에 따라서 상응하는 DNA 서열로 역으로 번역해서 용이하게 결정할 수 있다. 필요한 숙주 유기체에서 발현을 개선시킬 수 있는 코돈이 바람직하게 사용된다.

핵산 서열은 천연 트롬빈 유전자 서열에 위치지정 돌연변이를 유발시키거나 또는 DNA 합성에 의해 완전히 합성하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 히루딘, 히루딘 유도체 및 저분자량 트롬빈 억제제 등과 같은 트롬빈 억제제를 위한 해독제로서 특히 적합하다.

히루딘은 본래 거머리에서 단리된 단백질로서, 65 개의 아미노산으로 이루어지며, 트롬빈에 대한 친화도가 매우 높고 (K_i= 10^-12몰/ℓ), 트롬빈에 대한 선택도가 우수하다. 히루딘은 동물 실험 및 사람에게서 모두 활성을 보이는 것으로 입증되었다. 처음부터 단리된 히루딘 이외에도, 천연 히루딘과 비교할 때 서열이 변형된 많은 히루딘 돌연변이 단백질 및 이소히루딘이 있다. 따라서, 히루딘이란 천연 히루딘 뿐만 아니라 히루도 메디시날리스 (Hirudo medicinalis)에서 얻은 히루딘과 비교할 때 하나 이상의 서열 변형이 있지만 트롬빈에 대한 적어도 동일한 정도의 높은 친화도가 있는 히루딘도 의미한다.

히루딘은 유전공학적 방법으로 용이하게 얻을 수 있다. 인체에서 이들의 반감기는 약 45분이다.

화학적 변형으로 인해 히루딘의 약물동력학이 변형된 히루딘 유도체도 공지되어 있다. 마르크바르트 (Markwardt)는 활성 존속 기간이 연장된 텍스트란과 히루딘의 접합체를 기재하고 있다. 유럽특허 EP 345616, EP 502962 및 EP 557199에는 활성이 오래 유지되는 중합체 접합체가 개시되어 있다. 국제특허공보 WO 9515183에는 활성이 오래 유지되는 소수성 히루딘 유도체가 기재되어 있다. 저장형태 및 활성이 오래 유지되는 히루딘 이량체 (WO 9504823)도 공지되어 있다. 또다른 트롬빈 억제제는 저분자량 트롬빈 억제제이며, 이들은 유럽특허 EP 236164, 독일특허 DE 2801478, 유럽특허 EP 293881 또는 EP 185390에 개시되어 있다.

또다른 트롬빈 억제제는 재조합 데술파토히루딘, 히루딘 돌연변이 단백질, 덱스트란-히루딘 및 PEG-히루딘과 같은 중합체-수식 히루딘, 소수성 히루딘 유도체 및 활성 존속 기간이 연장된 히루딘 돌연변이 단백질이다. 신규 트롬빈은 또한 히루딘신, 말단이 절단된 히루딘, 및 히룰로그 또는 C-말단 히루딘 펩티드와 같은 히루딘 및 그 서열 일부에서 유래된 히루딘 유사체에 대해 길항작용하도록 사용할 수 있다. 또한 예를 들면 혈액을 빨아내는 생명체로부터 설명되고 로드니인, 인페스틴과 같은 유전공학적 제조 후에 치료용으로 사용되는 다른 트롬빈-억제성 펩티드를 중화시키는 것도 가능하다.

중화될 수 있는 트롬빈 억제제의 예는 트리펩티드 D-Phe-Pro-Arg의 유도체, NAPAP, 붕소산 유도체, 아르기날 또는 벤즈아미딘 유도체 등과 같은 합성된, 바람직하게는 저분자량 트롬빈 억제제를 중화시킬 수 있다. 본 발명에 따른 해독제로서의 용도는 상기의 모든 트롬빈 억제제에 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 지금까지 밝혀진 트롬빈 억제제 중화용 물질들보다 트롬빈 억제제를 더 잘 중화시킨다. 본 발명에 따른 트롬빈은 과다투여의 경우에도 사용상 안전하기 때문에 응급 상황에서 트롬빈 억제제를 신속하고 효과적으로 중화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 것은 정맥내 투여이다. 본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 적절하다면 연속 주입으로 투여할 수도 있다. 투여되는 불활성 트롬빈의 양은 예를 들면 과다투여의 정도, 체중, 선택된 투여 형태에 따라 달라진다. 과다투여의 정도는 적당한 시험을 통해 트롬빈 투여 전 또는 투여 동안 숙련가에 의해 결정될 것이다.

본 발명에 따른 트롬빈 돌연변이 단백질은 유전공학 방법으로 제조할 수 있다. 트롬빈 돌연변이 단백질을 단백질 가수분해 활성을 통해 유리시킬 수 있도록 트롬빈 돌연변이 단백질의 전구체 형태 (프로트롬빈과 유사)를 유전공학적으로 제조하는 것이 바람직하다.

또다른 바람직한 제조 형태, 구체적으로는 B 쇄로만 이루어진 트롬빈 돌연변이 단백질을 위한 제조 형태는 본 발명에 따라 변형된 B 쇄 코딩 유전자를 미생물내에서, 바람직하게는 대장균과 같은 박테리아에서 발현시키는 것이다.

생성되는 발현 산물은 적합하다면, 활성 트롬빈 돌연변이 단백질 분자를 얻기 위한, 당업계의 숙련가에게 익숙한 방법으로 재생될 수 있어야 한다. 박테리아에서 B 쇄를 발현시키면, 사람의 천연 트롬빈에서 S-S 결합을 형성하는 Cys 잔기가 다른 아미노산 잔기, 예를 들면 Ser 또는 Ala로 치환되는 것이 유리한 것으로 나타났다.

다음의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

프로트롬빈을 문헌 (Degen 등, Biochemie 22 (1983) 2087-97)에 따라 사람의 간 cDNA 은행으로부터 클로닝했다.

본 발명에 따른 돌연변이 단백질은 트롬빈의 일부분에 겨냥된 (targeted) 돌연변이를 일으켜 제조했다.

<실시예 1>

Ala 558-프로트롬빈의 제조

사람의 프로트롬빈의 위치 558 (서열 14)의 아미노산인 글리신을 위한 코돈인 GGC를 Ala를 위한 코돈인 GCC로 겨냥된 돌연변이를 일으켰다.

이를 위해, 올리고뉴클레오타이드 서열 5를 유전자의 센스 방향으로 합성하고, 여기에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 6을 적합한 뉴클레오타이드를 교환하면서 안티센스 방향으로 합성했다. 올리고뉴클레오타이드 서열 1을 프로트롬빈 유전자의 5' 말단을 따라 센스 방향으로 합성했다. 그것의 5' 말단에 EcoR1 제한 절단 위치를 위한 서열을 추가로 부착했다. 올리고뉴클레오타이드 서열 2를 프로트롬빈 유전자의 3' 말단을 따라 안티센스 방향으로 합성했고, 그것의 5' 말단에 EcoR1 제한 절단 위치를 위한 서열을 마찬가지로 부착했다.

2 nM dNTP, 중합효소 완충액 및 Pfu 중합효소 (Stratagene)를 첨가하고, 주형으로서 사람 프로트롬빈 cDNA 50 ng 및 올리고뉴클레오타이드 서열 5 및 서열 2를 각각 50 pmol 사용하여 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 3 분을 1 주기로 하여 35 주기의 PCR 반응을 수행했다. 이와 대응되게, 동일한 주형 및 올리고뉴클레오타이드 서열 6 및 서열 1을 사용하여 제2 PCR 반응을 수행했다. 이런 식으로 제조된 두가지 DNA 단편을 표준 프로토콜 (PCR 정제 키트, Quiagen, Hilden)로 정제했다. 두 단편을 각각 0.1 pmol씩 혼합하고, 5 분 동안 95 ℃에서 가열시켜 변성시키고, 재생 (renaturation)을 위해 1 시간 동안 실온에 놓아두었다. 완벽한 DNA 이중 가닥을 얻기 위해, 2 nM dNTP, 중합효소 완충액 및 Pfu 중합효소를 첨가한 후, 94 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 5 분 동안씩을 1 주기로 하여 10 주기를 수행했다. 전체 길이 단편을 증폭시키기 위해, 바깥쪽 올리고뉴클레오타이드 서열 1 및 서열 2를 각각 50 pmol을 첨가했고, 한번더 Pfu 중합효소를 첨가한 후, 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 3 분을 1 주기로 하여 35 주기의 PCR를 한번더 수행했다. 이런 식으로 제조된 558번 위치에서 Gly가 Ala로 치환된 돌연변이 프로트롬빈 cDNA를 표준 프로토콜로 정제한 후, 제한 엔도뉴클레아제 EcoR1으로 절단하고, T4 리가아제를 사용하여 표준 프로토콜을 따라서, 사전에 EcoR1으로 절단시켜 놓은 벡터 pUC18 (Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg)로 클로닝했다. DNA를 서열분석하여 검사했다.

<실시예 2>

Ala 525, Ala 558 프로트롬빈의 제조

사람의 프로트롬빈의 525번 위치 (서열 14)의 아미노산인 Ser을 위한 코돈 AGT를 Ala를 위한 코돈인 CGT로, 558번 위치 (서열 14)의 아미노산인 글리신을 위한 코돈인 GGC를 Ala를 위한 코돈인 GCC로 겨냥된 돌연변이를 일으켰다.

이를 위해, 실시예 1에서 얻은 프로트롬빈 돌연변이 단백질 DNA 및 525번에 Ala를 위한 적당한 뉴클레오타이드로 치환한 올리고뉴클레오타이드 서열 3을 기초로 센스 방향으로, 서열 2의 올리고뉴클레오타이드 (3'-말단 프로트롬빈)를 사용해 PCR을 수행했다. 실험 조건은 실시예 1에서와 같았다. 서열 3에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 4 및 올리고뉴클레오타이드 서열 1 (5'-말단 프로트롬빈)을 사용하여 제2 PCR을 수행했다. 이런 식으로 얻은 DNA 단편을 변성시키고, 혼성화시키고, 빈자리를 채워 이중 가닥을 형성한 후, 바깥쪽 올리고뉴클레오타이드 서열 1 및 서열 2를 사용하여 실시예 1에 따라 PCR을 한번더 수행했다.

이렇게 제조된 프로트롬빈 돌연변이 단백질 cDNA를 정제한 후, EcoR1으로 자르고, 벡터 pUC18로 클로닝하고, 검증하기 위해 서열분석을 했다.

<실시예 3>

Ala 363, Ala 558 프로트롬빈의 제조

사람의 프로트롬빈의 363번 위치 (서열 14)의 His를 지정하는 AGT 코돈을 Ala를 지정하는 코돈인 GCA로, 558번 위치 (서열 14)의 Gly를 지정하는 코돈인 GGC를 Ala를 지정하는 코돈인 GCC로 겨냥된 돌연변이를 유발시켰다.

이를 위해, 실시예 1에서 얻은 프로트롬빈 돌연변이 단백질 DNA 및 363번에 Ala를 위한 적당한 뉴클레오타이드로 치환한 올리고뉴클레오타이드 서열 10을 기초로 센스 방향으로, 서열 2의 올리고뉴클레오타이드 (3'-말단 프로트롬빈)를 사용해 PCR을 수행했다. 실험 조건은 실시예 1에서와 같았다. 서열 10에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 11 및 올리고뉴클레오타이드 서열 1 (5'-말단 프로트롬빈)을 사용하여 제2 PCR을 수행했다. 이런 식으로 얻은 DNA 단편을 변성시키고, 혼성화시키고, 빈자리를 채워 이중 가닥을 형성한 후, 바깥쪽 올리고뉴클레오타이드 서열 1 및 서열 2를 사용하여 실시예 1에 따라 PCR을 한번더 수행했다.

<실시예 4>

Asn 419, Ala 558 프로트롬빈의 제조

사람의 프로트롬빈의 419번 위치 (서열 14)의 Asp를 지정하는 GAC 코돈을 Asn을 지정하는 코돈인 CGA로, 558번 위치 (서열 14)의 Gly를 지정하는 코돈인 GGC를 Ala를 지정하는 코돈인 GCC로 겨냥된 돌연변이를 유발시켰다.

이를 위해, 실시예 1에서 얻은 프로트롬빈 돌연변이 단백질 DNA 및 419번에 Asn을 위한 적당한 뉴클레오타이드로 치환한 올리고뉴클레오타이드 서열 12를 기초로 센스 방향으로, 서열 2의 올리고뉴클레오타이드 (3'-말단 프로트롬빈)를 사용해 PCR을 수행했다. 실험 조건은 실시예 1에서와 같았다. 서열 12에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 13 및 올리고뉴클레오타이드 서열 1 (5'-말단 프로트롬빈)을 사용하여 제2 PCR을 수행했다. 이런 식으로 얻은 DNA 단편을 변성시키고, 혼성화시키고, 빈자리를 채워 이중 가닥을 형성한 후, 바깥쪽 올리고뉴클레오타이드 서열 1 및 서열 2를 사용하여 실시예 1에 따라 PCR을 한번더 수행했다.

<실시예 5>

Ala 525 프로트롬빈의 제조

사람의 프로트롬빈의 525번 위치 (서열 14)의 Ser를 지정하는 AGT 코돈을 Ala를 지정하는 코돈인 GCT로 겨냥된 돌연변이를 유발시켰다.

이를 위해, 프로트롬빈 돌연변이 단백질 DNA 및 525번에 Ala를 위한 적당한 뉴클레오타이드로 치환한 올리고뉴클레오타이드 서열 3을 기초로 센스 방향으로, 서열 2의 올리고뉴클레오타이드 (3'-말단 프로트롬빈)를 사용해 PCR을 수행했다. 실험 조건은 실시예 1에서와 같았다. 서열 3에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 4 및 올리고뉴클레오타이드 서열 1 (5'-말단 프로트롬빈)을 사용하여 제2 PCR을 수행했다. 이런 식으로 얻은 DNA 단편을 변성시키고, 혼성화시키고, 빈자리를 채워 이중 가닥을 형성한 후, 바깥쪽 올리고뉴클레오타이드 서열 1 및 서열 2를 사용하여 실시예 1에 따라 PCR을 한번더 수행했다.

<실시예 6>

사람의 프로트롬빈 돌연변이 단백질을 위한 발현 벡터의 제작

CHO 포유동물 세포에서 분비성 재조합 발현을 위해, 사람의 tPA 유전자의 분비 리더 서열을 돌연변이가 일어난 프로트롬빈 cDNA (실시예 1 내지 5 참조)의 5' 말단에 부착했다 (Pennica 등, Nature 301 (1983) 214-221). tPA cDNA에서 출발하여, 합성 올리고뉴클레오타이드인 서열 9 (tPA 리더의 5' 말단 및 EcoR1 위치) 및 서열 8 (tPA 리더의 3' 말단 및 EcoR1 위치)를 사용하여 PCR을 통해 tPA 분비 리더 cDNA를 증폭시켰다. 돌연변이가 일어난 프로트롬빈 돌연변이 단백질 단편 각각을 서열 8에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열 7 및 서열 2를 사용하여 증폭시켰다. tPA 리더 단편을 적절한 프로트롬빈 돌연변이 단백질 단편에 붙였다. 혼합물을 변성시키고, 혼성화시키고, 빈자리를 채워 이중 가닥을 형성한 후, 올리고뉴클레오타이드 서열 9 및 서열 2를 사용하여 PCR를 한번더 수행하여 적절한 tPA 리더 프로트롬빈 돌연변이 단백질 DNA를 제조했다. 이들을 EcoR1으로 자르고, pUC18로 클로닝하고, 검증하기 위해 서열분석했다.

CHO 세포에서 발현시키기 위해, 이들 DNA를 pUC 18 벡터를 EcoR1으로 자르고, 단리하여 벡터 pc DNA3 네오 (Invitrogen, 미국 샌디애고)의 EcoR1 절단 위치로 삽입했다. 프로트롬빈 cDNA를 이 벡터의 강력한 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절하에 전사시켰다. G 418-저항성 콜로니만 증식할 수 있게 하는, 플라스미드내에 네오마이신 저항성 유전자를 이용해서 형질감염된 세포를 선별했다.

형질감염전에, CHO 세포에서 발현시키기에 적합한 DNA를 제한 효소 PvuI로 선형화하고, 침전시키고, 멸균 상태에서 10 mM의 트리스 완충액 (pH 8.5)에 용해시켰다.

<실시예 7>

포유동물 세포에서 프로트롬빈 돌연변이 단백질의 발현

리포펙타민 (Gibco 제품, Life Technologies GmbH; Dieselstrasse 5, 76334 Eggenstein, Germany; No. 530-8324SA)을 사용하여 발현 벡터의 DNA로 포유동물 세포를 형질감염시킨다.

6-웰 배양 플레이트의 각 웰당 증식 배지 3 ml에 2x10⁵세포/ml를 첨가했다. 형질감염은 다음날 수행했다. 이를 위해, 세포를 무혈청 배지로 한번 세척했다. 리포펙타민을 사용하여 제조업자 지브코 (Gibco)의 지시 (Focus 15 (1993) 73-78)에 따라서 형질감염을 수행했다. 각 웰에는 무혈청 세포 배양 배지 총 1000 ㎕내에 DNA 1 ㎍ 및 리포펙타민 6 ㎕이 함유되었다. 6 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시킨 후, 형질감염 배지를 빨아내고, 세포를 정상 증식 배지 (태송아지 혈청 함유, FCS)에서 밤새 인큐베이션시켰다.

<실시예 8>

293 세포에서 프로트롬빈 돌연변이 단백질의 일시적 발현

293 세포를 DMEM (Gibco No. 41965) + 10 % FCS (Biowhittaker No. 14601 B)에 놓아둔다.

형질감염을 상기한 바와 같이 수행했다. 이 경우에, 발현량을 증가시키기 위해, 플라스미드 pAdVantage (Promega No. E1711)와 함께 공동형질감염 (cotransfection)을 수행했다. pAdVantage DNA 0.2 ㎍ 및 발현 벡터 pcDNA3의 특정 프로트롬빈 돌연변이 단백질을 위한 DNA 0.8 ㎍으로 상기한 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염후 첫째날 혈청함유 배지를 빨아내고, 무혈청 배지로 바꿔주었다 (페놀 레드 무함유). 형질전환후 세번째 날에, 세포 배양 상층물을 제거하고 분석할 때까지 -20 ℃에 보관했다.

<실시예 9>

CHO-K1 세포에서 프로트롬빈 돌연변이 단백질의 안정한 발현

상기한 바와 같이 형질감염을 수행했다. CHO 세포를 DMEM/F12 = 1 : 1 (Gibco No. 21331-020) + 10 % FCS에 놓아두었다가 배양시켰다. 형질전환후 첫째날에, 세포를 6-웰 플레이트의 한 웰에서 20 내지 100개의 10 cm 페트리 접시상에 나누어 분포시켰다. 이와 동시에, G418 (Gibco 제품, 배지 중의 1200 ㎍/ml)로 처리하여 재조합 세포를 선별했다. 생성되는 저항성 콜로니를 클로닝 실린더 방법으로 단리하고, 추가 배양한 후, 세포 수가 적절한 수준이 되면, 적합한 트롬빈 돌연변이 단백질이 발현되었는지 조사했다. 이를 위해 전면 세포 (confluent cell)로부터 배지를 빨아내고, 새로운 무혈청 배지로 대체했다. 일정한 시간 예를 들면 24시간, 48 시간 후, 인큐베이션시킨 세포 배양 상층물을 제거하고, ELISA를 통해 프로트롬빈의 존재에 대해 분석했다.

몇몇 경우에서는 생성된 재조합 세포는 발현량을 증가시키는 마이크로타이터 플레이트에서 단리하여 클로닝했다.

무혈청 세포 배양 상층물의 충분한 양을 제공하기 위해, 양호한 발현량을 나타내는 CHO 세포를 각종 배양 용기에서 10 % FCS를 함유하는 배지내에서 전면을 차지하도록 (confluence) 배양시켰다. 그 다음 세포를 PBS로 세척하고 무혈청 DMEM/F12 (DMEM: Gibco No. 11880-028; F12: Gibco No. 21765-029: 혼합물은 동일한 용적비로 이루어짐)로 인큐베이션시켰다. 이런 목적으로 사용된 DMEM은 페놀 레드가 함유되어 있지 않은 것이었다. 이틀 및 3일 후, 배지를 바꿔주어 프로트롬빈 돌연변이 단백질을 함유하는 세포 배양 상층물을 회수했다. 이런 식으로 하나의 배양 용기에서 10회까지 회수가 가능했다. 상이한 배양 용기에서 회수한 것 여러개를 합하여 정제할 수 있는 부피를 유지했다.

<실시예 10>

재조합 프로트롬빈 돌연변이 단백질의 발현 검출

프로트롬빈을 발현하여 세포 배양 배지로 분비하는 세포를 분석하여 재조합 프로트롬빈의 존재 여부를 알아보았는데, 이를 위해 전면 세포로부터 얻은 세포 배양 상층물을 ELISA를 통해 프로트롬빈의 존재에 대해 또는 프로트롬빈의 절단후 트롬빈 활성 또는 트롬빈 항원에 대해 조사했다.

이를 위해, 무혈청 세포 배양 상층물을 배양 후 여러번 제거했다. 세포 배양 상층물에 존재하는 프로트롬빈은 뱀 독액 (Sigma, 촉매 No. V3129)을 사용해서 절단했다. 각 혼합물은 샘플 (무혈청 세포 배양 상층액 또는 프로트롬빈) 388 ㎕, 뱀 독액 (H₂O 중의 0.2 mg/ml) 63 ㎕, 완충액 (1 M NaCl; 100 mM CaCl₂; 200 mM 트리스 pH 7.4) 50 ㎕, H₂O 100 ㎕을 함유한다.

절단 혼합물을 실온에서 45 분 동안 인큐베이션시켰다.

생성된 트롬빈은 계속해서 각종 분석을 통해 특징을 분석했다.

<실시예 11>

ELISA에 의한 프로트롬빈 돌연변이 단백질 및 트롬빈 돌연변이 단백질의 검출

프로트롬빈 및 트롬빈의 확인을 위한 ELISA를 다음과 같이 수행했다.

- 한 웰당 0.1 ml의 항-트롬빈 항체 5 ㎍/ml 0.05 M로 마이크로타이터 플레이트를 코팅,

- 실온에서 0.5 내지 1 시간 동안 한 웰당 0.3 ml의 1 % BSA/PBS로 포화시킴,

- 0.05 % 트윈 (Tween) 20/ PBS로 3 회 세척하고,

- 10 ng/ml 0.1 % BSA/0.05 % 트윈 20/PBS를 이용한 사람의 트롬빈 (Calbiochem 605195; 3.159 NIH U/mg)의 11 개의 표준 2배 희석액, 이에 필적하는 확인할 샘플의 희석액 처리, 한 웰당 0.1 ml, 실온에서 2 내지 4 시간

- 상기한 바와 같이 세척,

- 한 웰당 0.1 ml의 바이오티닐화 항-트롬빈 항체 1 : 200, 0.1 % BSA/0.05 % 트윈 20/PBS, 실온에서 2 내지 4 시간,

- 상기한 바와 같이 세척,

- 0.1 % BSA/0.05 % 트윈 20/PBS로 1 : 10000으로 희석된 스트렙타비딘-퍼록시다제 복합체 (B.M. 1098153) 0.1 ml/웰 처리, 실온에서 30 분,

- 상기한 바와 같이 세척,

- 한 웰당 퍼록시다제 기질 0.1 ml 처리,

- 한 웰당 2 M H₂SO₄0.1 ml으로 반응 중단,

- 450 nm 흡광도 측정,

퍼록시다제 기질은 TMB 용액 (DMSO 중의 42 mM TMB) 0.1 ml 및 기질 완충액 (0.1 M 나트륨 아세테이트, pH 4.9) 10 ml를 혼합하고, 3 % H₂O₂14.7 ㎕를 첨가한 것이다.

<실시예 12>

사람의 트롬빈에 대한 항체의 제조

다클론 항체를 유도하기 위해, 토끼를 다음과 같이 접종했다.

1일 : PBS/완전 프로인드 보강제 (complete Freund's adjuvant) (Sigma F5881) 0.5 ml 중의 사람의 트롬빈 200 ㎍,

14일 : PBS/불완전 프로인드 보강제 (Sigma F5506) 0.5 ml 중의 사람의 트롬빈 200 ㎍,

28일 : PBS/불완전 프로인드 보강제 0.5 ml 중의 사람의 트롬빈 200 ㎍,

42일 : PBS 0.5 ml 중의 사람의 트롬빈 200 ㎍

마지막 접종한지 7일 후, 토끼의 귀 정맥에서 혈액을 채취했다.

단백질 A 세파로오즈 (Pharmacia 제조) 상에서 수집한 혈청으로부터 다클론 토끼 항체를 혈청 10 ml당 IgG 65 mg의 수율로 분리했다. 바이오티닐화 전에, 항체를 0.05 M NaHCO₃pH 9.0 (2 x 2 ℓ)로 투석시킨 후, 바이오틴 x NHS 에스테르 (Calbiochem 203189, 1 mg/ml H₂O) 200 ㎕를 항체 (2.4 mg/ml) 600 ㎕마다 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 진탕시켰다. 마지막으로 혼합물을 PBS에 대해 3회 투석시켰다.

얻은 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 제작했다.

- 한 웰당, 0.05 M NaHCO₃pH 9.2 중의 5 ㎍/ml 항-트롬빈 항체 0.1 ml으로 마이크로타이터 플레이트를 코팅, 4 ℃에서 16 시간,

- 한 웰당 1 % BSA 0.3 ml로 포화시킴, 실온에서 0.5 시간,

- 0.05 % 트윈 20/PBS로 3회 세척,

- 10 ng/ml 0.1 % BSA/PBS/0.05 % 트윈 20을 이용한 사람의 트롬빈 (Calbiochem 605195)의 11개의 표준 2배 희석액 처리, 이에 필적하는 확인할 샘플의 희석액 처리, 한 웰당 0.1 ml, 실온에서 2시간,

- 상기한 바와 같이 세척,

- 1 % BSA/PBS/0.05 % 트윈 20으로 1 : 200으로 희석된 바이오티닐화 항-트롬빈 항체 0.1 ml/웰 처리, 실온에서 2시간,

- 상기한 바와 같이 세척,

- 0.1 % BSA/PBS/0.05 % 트윈 20으로 1 : 10000으로 희석된 스트렙타비딘-퍼록시다제 복합체 (B.M. 1089153) 0.1 ml/웰 처리, 실온에서 30분,

- 퍼록시다제 기질 0.1 ml/웰 처리,

-한 웰당 2 M H₂SO₄0.1 ml으로 반응 중단,

- 450 nm에서 흡광도 (OD) 측정

흡광도 (OD)는 도 1에서 트롬빈 농도에 대한 그래프로 나타냈다.

퍼록시다제 기질은 TMB 용액 (DMSO 중의 42 mM) 0.1 ml 및 기질 완충액 (0.1 M 나트륨아세테이트 pH 4.9) 10 ml를 혼합한 후, 3 % H₂O₂14.7 ㎕을 첨가한 것이다.

프로트롬빈 및 트롬빈을 확인하기 위한 ELISA은 다음과 같은 과정으로 수행했다.

- 한 웰당 0.05 M NaHCO₃pH 9.2 중의 5 ㎍/ml 항-트롬빈 항체 0.1 ml으로 마이크로타이터 플레이트를 코팅, 4 ℃에서 16 시간,

- 한 웰당 1 % BSA/PBS 0.3 ml로 포화시킴, 실온에서 0.5 내지 1 시간,

- 0.05 % 트윈 20/PBS로 3회 세척,

- 10 ng/ml 0.1 % BSA/PBS/0.05 % 트윈 20을 사용한 사람의 트롬빈 (Calbiochem 605195)의 11개의 표준 2배 희석액, 이에 필적하는 확인할 샘플의 희석액 처리, 한 웰당 0.1 ml, 실온에서 2 내지 4시간,

- 상기한 바와 같이 세척,

- 0.1 % BSA/PBS/0.05 % 트윈 20으로 1 : 200으로 희석된 바이오티닐화 항-트롬빈 항체 0.1 ml/웰 처리, 실온에서 2 내지 4시간,

- 상기한 바와 같이 세척,

- 퍼록시다제 기질 0.1 ml/웰 처리,

- 한 웰당 2 M H₂SO₄0.1 ml으로 반응 중단,

- 450 nm에서 흡광도 (OD) 측정

<실시예 13a>

혈장으로부터 사람 트롬빈의 정제

사람의 프로트롬빈을 문헌 (Henrikson, Methods in Enzymology, 222권, 312-3279)에 기재된 바와 같이 시트레이트화된 사람의 혈장에서 정제했다. 프로트롬빈 절단 및 헤파린 크로마토그래피에 의한 트롬빈의 정제는 실시예 14 및 15에 지시한 바와 같이 일어났다. 트롬빈 함유 분획물을 S 2238을 사용하여 색유발성 (chromogenic) 트롬빈 분석을 통해 동정하고, 한외여과 (ultrafiltration)을 통해 1 mg/ml로 농축하고, PBS에 대해 투석여과시켰다.

색유발성 기질 S 2238을 사용한 트롬빈 활성의 결정

트롬빈 돌연변이 단백질의 활성을 트리펩티드의 절단을 통해 측정한다. 샘플 (트롬빈 0.5 U/ml, 각종 희석액 중의 절단된 프로트롬빈) 50 ㎕, H₂O 100 ㎕, S-2238 (H₂O 중의 1 mg/ml, Chromogenix, 스웨덴 Moelndal 소재) 50 ㎕과 같이 첨가하여 혼합물을 만든다.

혼합물을 10 내지 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시킨다. 그 다음 405 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고, 트롬빈의 양을 계량 그래프에서 0.01 내지 1 U/ml로부터 발견했다.

<실시예 13b>

음이온 교환 크로마토그래피에 의한 프로트롬빈 돌연변이 단백질의 정제

CHO 세포 배양물로부터 프로트롬빈 함유 세포 배양물 상층물 35 ℓ를 우선 4 ℃에서 한외여과를 통해 400 ml로 농축한 후 (SPS 400 멤브레인, Fresenius, 세인트 벤델), 전도도가 1.1 mS/cm일 때까지 10 mM 트리스 pH 7.5에 대해 투석여과시켰다. 그 다음 탈염 여액을 Q-세파로오즈 FF 칼럼 (5 cm 직경, 530 ml 부피) 상으로 6 ml/분의 유속으로 로딩하고, 칼럼을 출발 완충액 (20 mM 트리스/HCl pH 7.5)로 세척한 후, 계속해서 15 칼럼 용적에 걸쳐 400 mM NaCl로 구배를 일으켰다. 프로트롬빈 함유 분획물을 ELISA로 동정했다. 프로트롬빈 돌연변이 단백질은 280 mM NaCl로부터 전방으로 용출된다. 단백질 약 150 내지 200 mg이 이 칼럼에서 단리되었다.

<실시예 14>

프로트롬빈으로부터 트롬빈 돌연변이 단백질의 유리

아미콘 (Amicon) YM 30 (최종 부피 20 ml, 총 단백질 175 mg)에서 농축되고 Q-세파로오즈 크로마토그래피로 얻은 분획물을 20 mM 트리스/HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl 2 ℓ에 대해 투석하고, 절단을 위해 1 M CaCl₂, 20 mM 트리스 (pH 7.5)를 첨가하여 최종 농도를 10 mM로 조절했다. 옥시라누스 스쿠텔라투스 (Oxyranus scutellatus) 뱀의 독액 30 mg을 첨가한 후, 4 ℃에서 교반시켜 절단하고, 20 mM EGTA 용액 (pH 7.5) 2 ml을 첨가함으로써 12 시간 후 반응을 정지시켰다.

<실시예 15>

헤파린 크로마토그래피에 의한 트롬빈 돌연변이 단백질의 정제

실시예 14로부터 트롬빈 함유 절단 혼합물을 계속해서 헤파린-세파로오즈 칼럼 (14 cm x 1 cm, Pharmacia) 상으로 1 시간당 38 cm의 유속으로 로딩했다. 칼럼은 20 mM 인산나트륨, 0.1 M NaCl pH 7.5, 0.01 % 플루리올 F68 20 ml로 세척한 후, 600 mM NaCl, 20 mM 인산나트륨, pH 7.5, 0.01 % 플루리올 F68 150 ml로 선형 구배를 일으킨다. 그 다음 트롬빈 돌연변이 단백질을 ELISA로 검출한다. 이 돌연변이 단백질은 약 400 mM NaCl에서 용출한다. 돌연변이 단백질 30 내지 35 mg을 얻고, BSA (1 mg/ml)을 첨가한 후, PBS, 0.01 % 플루리올 F68에 대해 투석시키고, -20 ℃에서 보관했다.

<실시예 16>

시험관내 계에서 히루딘의 중화

불활성 재조합 트롬빈의 히루딘에 대한 해독 효과를 트롬빈 활성 분석을 통해 검출했다. 이는 히루딘을 분석할 트롬빈 돌연변이 단백질, 활성 트롬빈 및 S-2238과 함께 인큐베이션시켜 수행했다. 이 분석의 원리는 분석될 불활성 트롬빈에 의해 히루딘이 중화 (또는 경쟁)되는 것이며, 활성 트롬빈의 활성은 보다 높아질 것이다.

이를 위한 혼합물은 다음과 같이 얻는다.

히루딘 HL20 (1.5 U/ml) 100 ㎕, pH 7.5 TBS 중의 0.1 % BSA 및 트롬빈 돌연변이 단백질 (실시예 2에서 제조) 100 ㎕를 5 분 동안 실온에서 예비인큐베이션시켰다. 활성 트롬빈 (0.5 U/ml) 50 ㎕를 첨가한 후, S-2238 (H₂O 중의 1 mg/ml, Chromogenix, 스웨덴 Moelndal) 50 ㎕ 첨가하여 개시했다. 혼합물을 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 계속해서, 410 nm의 파장에서 흡광도를 측정했다. 불활성 트롬빈 돌연변이 단백질로 히루딘을 중화시키면 흡광도가 증가했다 (도 2).

<실시예 17>

개에서 PEG-히루딘의 중화

비글 개 (9.8 내지 13.5 kg)에게 10 mg/kg의 용량으로 PEG-히루딘을 피하 투여했다. PEG-히루딘 주사 후 180분이 지나서, 실시예 2에서 제조한 트롬빈 돌연변이 단백질 (Thrombinmut #3)을 50분에 걸쳐 20 g/kg의 용량으로 정맥내 주입으로 투여했다. 실험의 시작시 개의 앞다리 정맥에 구멍을 내어 혈액 샘플을 채취하고, 150분 후부터 6 시간에 걸쳐 샘플을 추가 채취했다. 혈장을 시트레이트화 혈액으로부터 20 분동안 2000 g으로 원심분리하여 얻고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 보관했다.

혈장 샘플에서 항트롬빈 활성을 문헌 (Spannagel 등, Blood Coagulation Fibrinolysis 2 (1991) 121-127)에 기재된 바와 같이 측정했다. 항응고제 활성 (aPTT)는 파트롬틴 시스템 (Pathromtin system) (Behring)을 사용하여 측정하다.

결과는 도 3에 요약되어 있다. 대조용 동물에서는 항트롬빈 활성이 PEG-히루딘의 투여 후에 급속하게 증가된 반면, 해독제로 처리된 동물에서는 항트롬빈 활성의 증가를 억제할 수 있었다 (도 3b). 해독제 주입을 완료한 후, PEG-히루딘 혈장 수준은 대조용 동물에 필적할만한 속도로 증가했다. 정성적으로 동일한 과정이 aPTT에서도 관찰되었다 (도 3a)

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인:

(A) 명칭: 바스프 악티엔게젤샤프트

(B) 거리: 칼-보쉬 스트라쎄 38

(C) 도시: 루드빅샤펜

(E) 국가: 독일

(F) 우편번호: 67056

(G) 전화번호: 0621/6048526

(H) 팩스: 0621/6043123

(I) 텔렉스: 1762175170

(ii) 발명의 명칭: 트롬빈 억제제에 대한 해독제인 트롬빈 돌연변이 단백질

(iii) 서열수: 14

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25 (EPA)

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 40 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 13에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: mRNA에 대한 cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티센스: 없음

(xi) 서열 설명:

(2) 서열 14에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 579 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(vi) 기원:

(A) 생명체: 사람

(xi) 서열 설명:

Claims

(a) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 558번 위치에 존재하며, 주변 서열 Tyr-Gly-Phe에 위치하는 Gly이 Ala으로 치환되고, (b) (b1) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 363번 위치에 존재하며, 주변 서열 Ala-His-Cys에 위치하는 His 잔기, (b2) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 419번 위치에 존재하며, 주변 서열 Arg-Asp-Ile에 위치하는 Asp 잔기, (b3) 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)의 525번 위치에 존재하며, 주변 서열 Asp-Ser-Gly에 위치하는 Ser 잔기 중의 적어도 하나의 잔기가 치환 또는 결실되어 천연 트롬빈과 상이한 서열을 갖는 트롬빈 돌연변이 단백질.
제1항에 있어서, (a) 558번 위치의 Gly이 Ala으로 치환되고, (b) (b1) 363번 위치의 His 잔기, (b2) 419번 위치의 Asp 잔기, (b3) 525번 위치의 Ser 잔기 중의 적어도 하나의 잔기가 치환 또는 결실되어 사람의 천연 프로트롬빈 (서열 14)과 상이한 서열을 갖는 트롬빈 돌연변이 단백질.
제2항에 있어서, 서열상의 차이 (b)가 525번 위치에서의 치환인 트롬빈 돌연변이 단백질.
제3항에 있어서, 서열상의 차이 (b)가 Ser이 Ala으로 치환된 것인 트롬빈 돌연변이 단백질.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 트롬빈 돌연변이 단백질을 코딩하는 핵산 서열.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 트롬빈 돌연변이 단백질의 혈액응고 교란 치료를 위한 용도.
제6항에 있어서, 트롬빈 억제제에 대한 해독제로서의 용도.
제7항에 있어서, 히루딘, 히루딘 돌연변이 단백질 또는 히루딘 유도체에 대한 해독제로서의 용도.
제8항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜로 수식된 히루딘 유도체에 대한 해독제로서의 용도.
제1 내지 4항 중 어느 한 항에 기재된 트롬빈 돌연변이 단백질 및 제약상 통상적인 보조제를 함유하는 트롬빈 억제제에 대한 해독제.