CZ247798A3 - Thrombinové mutace a jejich použití - Google Patents
Thrombinové mutace a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ247798A3 CZ247798A3 CZ982477A CZ247798A CZ247798A3 CZ 247798 A3 CZ247798 A3 CZ 247798A3 CZ 982477 A CZ982477 A CZ 982477A CZ 247798 A CZ247798 A CZ 247798A CZ 247798 A3 CZ247798 A3 CZ 247798A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- thrombin
- seq
- mutations
- asp
- gly
- Prior art date
Links
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims abstract description 84
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 64
- 239000000729 antidote Substances 0.000 claims abstract description 10
- NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N Tyr-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NOOMDULIORCDNF-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims abstract description 4
- ANGAOPNEPIDLPO-XVYDVKMFSA-N Ala-His-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N ANGAOPNEPIDLPO-XVYDVKMFSA-N 0.000 claims abstract description 3
- JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N Arg-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N 0.000 claims abstract description 3
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 28
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 claims description 19
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 claims description 19
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 claims description 15
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 abstract description 9
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 abstract 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 34
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 34
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 34
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 23
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 23
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 11
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 5
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YDMBNDUHUNWWRP-VJBWXMMDSA-N (2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]piperidine-2-carboxamide Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 YDMBNDUHUNWWRP-VJBWXMMDSA-N 0.000 description 2
- XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N Arg-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O XNSKSTRGQIPTSE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 101100425522 Caenorhabditis elegans mys-1 gene Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 2
- 229920002266 Pluriol® Polymers 0.000 description 2
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 MFEVVAXTBZELLL-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108010071286 prethrombins Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- QIFCKXCILLESCU-XHVFSLISSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-[[(1s)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 QIFCKXCILLESCU-XHVFSLISSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N Ala-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GORKKVHIBWAQHM-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N Arg-Asp Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N Arg-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N NGTYEHIRESTSRX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102100039339 Atrial natriuretic peptide receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710102163 Atrial natriuretic peptide receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100042788 Caenorhabditis elegans him-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100315624 Caenorhabditis elegans tyr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001397173 Kali <angiosperm> Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010080798 N(alpha)-(2-naphthylsulfonylglycyl)-4-amidinophenylalanine piperidide Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- NTUPOKHATNSWCY-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NTUPOKHATNSWCY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010039286 S 2238 Proteins 0.000 description 1
- LZLREEUGSYITMX-JQWIXIFHSA-N Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LZLREEUGSYITMX-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- YUPVPKZBKCLFLT-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Val Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N)O YUPVPKZBKCLFLT-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 125000000043 benzamido group Chemical group [H]N([*])C(=O)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000720 eyelash Anatomy 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081985 glycyl-cystinyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 histidine amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000021190 leftovers Nutrition 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 108010047113 phenylalanyl-leucyl-glutamyl-glutamyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 210000004224 pleura Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 239000003869 thrombin derivative Substances 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N valinyl-arginine Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IBIDRSSEHFLGSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
T h r o m b i n o v e ,m u t a c tec h n j k v
P ř e α 1 ožeň y v v n a i s z s e t y k á n o v e t h ro m bí n o ve m u t a i a j e j í ho použití jako a n t i ď o t p r o i n h i b i t o r y t hr o rnb i n u .
D o s a v a d n i s t a v t e c h n i k v
Antikoagulantv. které působí na principu thrombinove inhibice, získávají pro antithrombozovou praxi na významu, Naléhavým předpokladem pro široké použití antikoagulantů je možnost neutralizovat působení při předávkováni, při rušivém odbourávaní nebo dlouhodobém oddělovaní. aby se tak znemožnily hrozivé vedlejší účinky. jako například krvácení v oblasti oeritonea, perikardu a pleora. Zatímco u heparinu s protamineíranem, polvlysinem a plate letovým faktorem jsou k di sdozic i č t vř i vvsoce účinné a n t i do t v . dosud chybí ant i do t vhodný p r o in h i b i torů.
použití na lidech. k neutralizaci thrombinových literatuře jsou popsaný různé principy anti dotů.
| Jako p r in ci p | k | neutrál i z a c | i | h i r a d | inu dis |
| aktivovované p | 1 a z ma t | ické f r a k c | e . | i ako | napři k1 |
| preparáty nebo | FE I BA | . Z důvodu | a k t | i v i t y | p o d o b n é |
| však pro neutra | 1 i z a c i | nevhodné. | V i z | F a r | sed, F e d |
| A 328, Walenqa | Sem. Thromb. Herno | st . | 19 8 9 , | 15, 316 |
číslo 1
Markwardt popisuje v Thrombosis Research. svazek 74. str. 1 až 23, 1994 použití t hr omb inů a thrombinových derivátů. Příkladem t hr o mb in-2 -mak r o g 1 o b u 1 i nové proto jsou thrombin, komplexy a mei z othrombin. Je také popsáno pro neutralizaci hirudinu použití chemicky inaktivních thrombinů, jako například DFP-thrombinu nebo benzoyl-thrombinu • · • · • · · · « • · « • ♦ · · • · ·· k · · • · · · · • · · « • · · « • * · · ·· ·· • · · ► · ·· » · » «
I · · « ·· ·· lidech z důvodu : k h i r u dinu nevhod; str. 299, M o r i a t a Stone a k o 1 e k t i
| 1989, 44 | 0 | 4 8 až | 6' 4 9 ; | |||||
| y vsak | ISO | u i a k o | a n t i d o t | O Γ 0 | O 0 u ž i | ti | n a | |
| c í a k 11 v | i t y | a až | 10 0 0 k r a | t íne n | 3 i | a f | í n | i t ě |
| . D o v 1 e | v M | e t h o d s | E n z ymo1 . | 6 v a z | e R | 2 2 | o d | |
| Methods | E n z | ymo i , | s v a z e k 8 0 | , o d | s t | r „ | 3 | 0 3 . |
| i o c h e m i s | t r y | 1 9 8 | 7 . 2 6, | 4 6 1 7 | a ž | 4 6 | 24 , | |
| 44, 1989 | .. ‘qí | t r , 6 4 | 8 až 649) |
Humánní prothrombín je známý a je popsán Freiznerem a kolektiv (Biochemis t. ry. svazek 22. 19 8 3 , str. 2087 až 2097 ) . Použití aminové kyseliny u humánního prothrombinu je uvedeno také v SE O ID č: 14. V literatuře se nachází různé údaje o thrombinu, přičemž, když není uvedeno nic jiného, po užívá jí se údaje zejména z SE O ID č: 14.
Genovým inaktivní t h r o m b i n svazek 266, č.
inženýrstvím vyrobitelný, enzymaticky je popsán Le n t zem (Lentz a kole k t i v, . J BC, 15. str. 9598 až 9604). Dochází zde k enzymaticky inaktivní thrombinové variante, která nemá žádnou inhibitoru
| t i c k v m | substrát ům | a přírodní mu | |
| 1 e k 11 v, | J8C . | s va z e | k 266, číslo |
| nižší vazební | afin | i t u vzhledem | |
| d a n s y i | a r g i n i | n-N-( | 3 -e t hv 1 -1 ,5 -·- |
| k u n a | pozici | 205 | (pozice 525 |
| t a 1yz u | za alanin. | ||
| ( B i o c h a | mistr y | , s va | zek 30. 6392 |
k thrombinovému oráče S t o n e a
| až 6397) j | e známá | přírodní | va r i | a n t a t h r o m b i n u | q u i c k II. |
| Thrombin qui | c k II se | o d 1 i š u i e | od p ř | (rodního t h r o m b i | nu pouze na |
| poloze 238 ( | poloha | 558 v SEQ | ID č : | 14), Zde je mutován oproti | |
| hydr o f o bn i mu | z b y t k u | va1 i nu g1yc i no vy | zbytek 238, vvs | k,yt u i ící se | |
| v přírodním | t hro mb i | nu. Tato | nepatrná změna vede k: | e zřetelně | |
| redukované | štěpí ci | skupí ně | p r o f | i b r i n o g e n (2 % | stávající |
• · · · » 4 4 » 4 444 • 4 4 « * · · 1 • · 4 4 ·· ·· • · 4 • ·· » 4 4 « » · 4 a • · · ·
4· · 4
44 • •44 · • 4 «
4 4 4
| a k t i v i t v’) | a | 5 | o u č a s n e k d r a s t i c k é | minimai | izaci | v a z b y | rovněž |
| n i z k o mo l e | kula | r n | i c h s u b s t. r a t ů . i a k o ž | t a k é | h i r | u d i n u | S tone |
| ukazuje. | Ž. Θ | v | a z e b n í k o n s t a n t a p r o | h i r u d i | n t é | to m u t | a c e se |
| z horši 1 a | 0 V i | c e | n e ž 1 0 0 0 a v y s v ě t 1 u i e | tento | výs l e | d e k s t e | r i c k ý m |
| b 1 o k o v a n i | m v a | Z 0 | bnich ka p e s. i a ko ž tak | e κ o n r | o r rnn i | r e o r g a n i z a c í | |
| okol i akt | i vn i | ho | centra. |
Dosud známé thrombinové mutace nejsou jako antidot pro thrombinové inhibitory vhodné, poněvadž mají malou afinitu k thrombinovým inhibitorům nebo velkou vaznost a enzymatickou aktivitu vzhledem k fibrinoaenu.
ř.ř e drně t........vynalezu
Existuje proto úkol připravit nové thrombinové mutace, které jsou více enzymaticky inaktivní, mají dobrou vazbu fchrombi nových inhibitorů a současně váží přírodní substrát f i br i nogen s menší afinitou než nemodifikovaný t hr o mb i n.
Předmětem vynalezu jsou thrombinové mutace, které mají oproti přírodnímu thrombinu následující sekvenční rozdíly:
a) výměna gly po ala, přičemž se gly nachází v sekvenčním okolí tyr-gly-phe a v přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID č : 14) obsazuje pozici 558,
b) alespoň výměna nebo vynechání následujících zbytků, b1) his. ktere se naléza v sekvenčním okolí ala-his-cys a v přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID č: 14) obsazuje pozici 363, b2) asp, které se nalézá v sekvenčním okolí arg-asp-ile a v přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID č: 14) obsazuje • ·
I · · « » · ·· ··· · 4 • · 4 • · · · ·· ·· » · · » · · · · • · · 1 • · · <
·· ·· • · » · · 4 > · ·· » · · 4 » · · 4 • · · · aso-ser-glv a v b3 ) ser. které se nalézá v s ek venč η ím okol p ř i r o d η í rn h u m a η η í m p r o t h r o m b i n u (SEQ ID č : 14) ob s a z u i pozici 525,
Nové thrombinové mutace se mohou vyrobit na základě při rodních t hr o mb i η ú, i a ko j sou thrombi ny z lidí a ji nýc h savců, například primátů, hovězího dobytka, prasat, psa. kočky myši a potkana. Přírodním thrombinem se rozumí polypetidová sekvence, která je charakterizována thrombinovou aktivitou a do organismu vstupuje přírodní cesto u.
Thrombi novými mutacemi se nerozumí přemostěné dvouřetězové molekuly (řetěz A jednořetěz ové molekuly jako prethrombin nebo řetězu B nebo částí řetězu B a/nebo C- terminálem je rozhodující, :
| jen d i s u1 | f i d e m |
| B) , nýbrž | také |
| o r o t e i n y, | které |
| přednostně | z B |
| Pro thromb | i no vé |
| j s 0 u ú č | i η n é . |
sestávají jen řetězů zkrácených Nmutace podle vynálezu respektive je k dispozici vazba thrombinového inhibitoru.
Thrombinové mutace se mohou vyrobit také na základě produktů proteolýzy t h r o m b i n u, například B-thrombin, μ-thrombin, w-thrombin nebo předstupně thrombino, jako prothrombin prothrombinovy meziprodukt nebo také meizothromfoiny, které se potom mohou vhodnými štěpnými metodami, například pomocí faktoru Xa, frakcemi hadího jednu z e c h i s carinatus nebo také oxyranus scutellatas převést na aktivní molekuly thrombinu.
Thrombinové mutace podle vynálezu jsou vhodné k neutralizaci hirud i nu, hirudí nových derivátů nebo jiných thrombi nových inhibitorů.
·· «·
I 4 4 · » 4 44 • · ·· ft 4 4 • · · · · ·· 44 • 4 44
44
I 4 4 « » 4 44
444 4 «
4 «
4· 44
| P ř | e d n o s t n i | i e | v v r o fc a ρ o rn o c | í g e n o v e h o i n ž e n v | r s t | V i . P ř i | |
| k te r é se | vyrobí g | e n | o d p o v í d a i í c í | pro | t h r o ni b i n o v o u | m u t a c i | |
| a t e n t o g e n | 5Θ £ Xpf i | rn u i | e d o v h o d n é h o | h o s t i t | e l s k ě h o o r | g a n | i s rn u . |
| No | ve t h r o m b i | nove mutace | ma i i | o p r o t. i | p ř í | rodní m u | |
| t hro mb i n u | dvě odliš | nos | t i , p ř i č e m ž | p r v η í | o d 1 i š n o s t í | j e | záměna |
| g 1 yc i n o ve ho | z b y t k u a | 1 a n | inovým zbytkem. Poloha záměny | i e | závisíá | ||
| na vstupu | pří rod n | í ho | výchozí ho | t h r o m b i | nu. Jedná | se ale |
o glycinovou polohu, která se nachází v okolí tyr-gly-phe a která má v přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID č: 14) polohu 558.
Druhá sekvenční odlišnost je buď záměna nebo vynechání zbytku aminové kyseliny na jedné ze tří poloh (his, asp, ser), které tvoří katalytické triády proteázy thrombinu. Těmito polohami jsou u přírodních humánních prothrombinu (SEO ID 6: 14) polohy 363 pro his, 419 pro asp a 525 pro ser. U jiných nehumanních thrombinu mohou v závislosti na délce molekuly, aminové kyseliny před a za příslušnou aminovou kyselinou však je u thrombinu konzervováno, a je proto snadno možné, že přesná poloha zbytku příslušné aminové kyseliny je sekvenčního okolí .
být tyto polohy posunuty Okolí, to znamená u zbytku ; t a n o ve na pomoc i
Thrombinové mutace podle vynálezu katalytické triádě také více změn, tj. substutici. Přednostní jsou thrombinové mutace, katalytické triádě jednotlivé změny.
mohou mí t na vynechání neb o které ma i í na
Přednostní zrněny jsou takové, u substituce aminových kyselin katalytické h i s t i d i n u jsou přednostní hydrofobních aminových kyselin, zbytek, například subst i tuce
A sparta t o v ý nichž se pro v á d í triády. Pro zbytky polárních nebo ejrnéna phe, tyr, ala nebo val .. gin nebo asn, se přednostně ·· ·· · ·
Β · · ·· • · · 1 • · · ·· ·· ·· > · ·· ·· ·· > · · ·
I · ·· ··· · · • · « ·· ·· s u bs t i t u u i e pomo c i d a i s í c h polárních a m i n o výc h kyselin
| 2 | e jmen a př ed n o s t n í | i s o u t h r o m b i | n o v | ť~ | m u t a c e , u | n i | c h ž s e |
| mění seri | n o v ý z b y t e k , z e | jrnena subsu | t u c | i | serin u | a m i | n o v ý m i |
| k vsel i n a m i | ktere nemají | žádné hydro | x v t | 0 V' | é s k u p i n v | , z | e i mé n a |
| takové, k | teré mají podobné prostorové | US | p o ř a d á n i | j a k | o ser . | ||
| 2 e jména je | přednostní s u b s t i | . t u c e s e r p o | a .1 a |
Thrombinové mutace se mohou dále
1eoš it ve ve účinnosti dalšími změnami molekuly. Tak je například možné se dále zlepši proteolytická stabilita,. například k umožněni delší doby působeni. K tomu se mohou zaměnit například bazické zbytky arg 393. lys 465. arg 330 nebo arg 382 (SEO ID č: 14) za jiné nebazické aminové kyseliny.
Dalším předmětem vynálezu jsou sekvence kyseliny nukleové. zejména DNA sekvence, které se kódují pro popsané thrombinové mutace. Tyto lze snadno zjistit pomocí zpětného převodu po 1 ype pt i do vé sekvence na odpovídající DNA sekvenci podle genetického k ódu. Přednostně se používají takové kódy,, které vedou v požadovaném hostitelském organismu k dobré expresi.
místně
Sekvence nukleové specifické geneze kyseliny mohou vycházet buď Domoci přírodntch thrombi nových sekvenci nebo se také mohou vyrobit zcela syntetické pomocí DNA syntézy.
Thrombinové mutace podle vynálezu jsou vhodné zvláště jako a n t i d o t. pro thrombinové inhibitory jako h i r u d i η , hirudinove deriváty a nízkomolekulární thrombinové inhibitory.
H i r u d i n y gelu, sestává ,j í c í jsou proteiny prvotně izolované z krevního z 65 aminových kyselin, které se vyznačují extrémně vysokou afinitou k thrombinu (ki
0~ 1 2 mo 1 / 1 ) a ·· ·· > · · «
I · ·· • · · · • · <
·· ··
I ·· • · • ··· • · <
·· ·· ► · · · • · ·· • · · « • · · · ·· ··
| v vnikají | ' c í | s e 1 e k t i v |
| u k a z u j e | j a k | při exp |
| prvotně | i z o 1 | o v a n ýc h |
| m u táce | a | také i z |
| hirudin ů m s | e k v e n č n í |
ridinů s e zís k a i í ta k é pocet n é h i ru d ino vé irud i n v, k t eré ma j i oproti př t rod n ím mě n y . Z a h i r u d i n y .jsou proto vedle př í rodníc h hiru d i n u c ha pa ny také takové hirudiny, které nesou jednu nebo vice sekvenčních směna z hi rudo medicinalis na hirudin a mají alespoň stejně velkou afinitu k thrombinu.
Hirudiny jsou lehce přístupné pomocí metod genové techniky. Jejich poločas rozpadu činí u lidi 45 minut.
Také rno d i f i ko vá n a jsou známé deriváty hirudinu Domoci chemické modifikace u kterých byla farmakoki netiká hurudinu. Merkwardt popisuje konjugáty dextranu a hirudin u s prodlouženou 557199 jsou působení.
s dlouhou viz. např
Ve dobou
WO dobou působeni. známé polymerové WO 9515183 jsou působení. 9504823.
Z E P 345616, EP 502962 a E P k o n j u g a t y s dlouhou dob o u popsány hydrofobní deriváty
Rovněž jsou známé h i r ud i n-d i me r y Další thromb i no vé inhibitotry jsou nízkomolekalární thrombinové inhibitory. které jsou například známé z EP 236164. DE 2801478, EP 293881 nebo EP 185390.
thrombi nové inhibitory vvrobené d e s u1f á t o -h i rudí n y, hirudinové i s o u rekombi nantně mutace, hirudiny modfifikováné polymerem, PEG-hirud iny, hydrofobní hirudinu s prodlouženou například dextran-hirudiny, de r i va t i z o va ne dobou působení t r o mb i n y použít k antagonizaci h i r u d i s i η ΰ, hirudiny a mutace Dále se mohou nové zkrácených hirudinu a rovněž d i 1 č í c h hirudinových analogů odvozených od hirudinu a sekvencí.
ako například j e h o nebo
C termina 1 izovaného hi rudinpeptitu. Neutralizovat se mohou také jiné peptidické thrombinové inhibitory, které například byly popsány z organismů sajících krev a potom byly vyrobeny genovým ·· ·· • · · • ·· ( · · «
I · · « ·· ·· ·· «· • · • ··· ·· ·· ( · · · > · ·· ··· · · • · · ·· ·· in žernv r s t v i m a použity k t h e r a p i i i n f e 51 i n .
i a k o n a d ř í k 1 a d r h o d n i n
Pří k1 a d e m neutr a i i z o va t e i ný ch thro m fa ίn o v y ch inhibitorů jsou také syntetické, přednostně nizkomolekulární thrombinové inhibitory. jako například deriváty tripeptidu d-phe-pro-arg, NAPAP, deriváty kyseliny boronové, arginalů nebo benzamido vyc h derivátů. Použití jako ant i dot podle vynalezu je aplikovatelné na všechny uvedené thrombinové inhibitory.
Thrombinové mutace thrombinové inhibitory lépe k neutralizaci thrombi nových podle vynálezu neutralizují než dosud popsané principy inhibitorů. Trombinv podle vynálezu jsou z hlediska použiti při předávkování bezpečné a umožňují proto v situacích naléhavé potřeby a rychlou a účinnou neutralizaci thrombinových inhibitorů.
Thrombinové mutace podle vynálezu jsou k dipozici ve vhodné formě subkutanní, Intravenozní pro parenterální aplikaci, to znamená pro intra mu skulám í nebo intravenozní aplikací, aplikace je přednostní . Eventuálně se mohou thrombinové mutanty aplikovat také jako trvalá infuze. Množství poskytovaného inaktivního thrombinu se volí například podle rozsahu předávkování, tělesné váhy a zvolené formy poskytování. Rozsah předávkování se může zjistit odborníkem před nebo ta k é během použití thrombinu pomocí vhodného testu.
Thrombinové mutace jsou vyrob i tel né pomocí metod genového inženýrství . Přednostní je výroba předběžné formy thrombinové mutace genovým inženýrstvím, analogicky jako prothrombin, ze které Droteolitické aktivace.
se thrombinové mutace uvolní pomocí
Dalším přednostním výrobním způsobem především pro ·· » « • · ··
I · · • · ··· • · · 1 • · · 4 ·· ·· ·· » · · · > · ·· ··· · « • · I ♦ · ·· thrombinové mutace, které sestávají z B-řs-tězu. je exprese genů pro B-řetězy změněné podle vynálezu v mikroorganismech, přednostně v ba k t e r i ich i a k o E. coli.
Získaný produkt exprese musí podle okolností odborník k získání činných molekul thrombinové mutace běžnými metodami renaturovat. Při ex pres i B-ř etěz u v bakteriích se tak é jevila jako výhodná záměna cys-zbytku humánních thrombinech k S-S aminových kvselin. například ser nebo ala který přispívá v přírodních přemostění. za jiné zbytky
.......pro.y e ci e nj vvn ále z u
N ásledující příklady slouží vynálezu, aniž ho však omezují.
k dalšímu objasnění
Prothrombin byl klonován podle publikace Degen a kolektiv. Biochemie 1983, 22, strana 2087 až 2097 z lidských jater c D N A bankou.
Cílenou genezí mutace v thrombinové části byla vyrobena mutace podle vynálezu.
Příklad........1
Výroba Ala 558 prothrombinu.
Cílenou genezí mutace se mutoval kodon GGC pro aminové
| kyseliny (a | s ) g 1 | l yc i n | v poloze | 558 | (SEQ ID č: | 14) humánního |
| prothrombinu | na | kodon | GCC pro as | ala. |
K tomu byly směru genu a k němu 6 v protismys1 ovém o 1 i gonuk1eot i d komolementární směru s yn t e t i s mys 1 o vé rn SEQ ID č : výměno u
SEQ ID NO:5 ve o 1 igonekleotid z o vány příslušou ·· ·· » · · « » · ·· ·· • · · · • · ·· • 4« · 4 • · « ·· ·· ·· » · « » · · · · » · · 4 » · · 4 »· ·· ·· ·· nukleotidů. Podle 5 konce prothrombingu byl syntetizován ve konec p ri a a v n e e c o R. 1 . P o d 1 e 3 s mys 1 o ve m s mě ru o 1 i g o n u kIeot id SEO ID č : 1 . Tímto bv1 a na 5 p ři po ien a s e kve nc e pro místo restrikéni ho ř e z u konce prothrombingu byl v protismyslovém směru syntetizován ologonukleotid SEO ID NO:2 a tímto byla na 5 konec rovněž p ř i po ) en a sekvence pro místo restrikčního řezu eco R.1 .
| S | 50 ng humánní | ho | prothrombinu c D N A | jako zák1 a dní ho | ||
| materiálu | a | 5 0 pmo1 o 1 i go | s u | SEQ ID | č: 5 a SEO | ID č: 2 byla po |
| pří dávku | 2nM dNTPs. po 1 | vme r o vé ho | regulátoru | a pf u-po1vme r ů | ||
| (stratagenu) | provedena PCR. | r e a k c e s | 35 cykly za | 1 rn i n . p ř i 9 4 | ||
| 0 C, 2 min. | při 55 0 C | a | 3 min | při 7 2 0 C. | Příslušně byla | |
| provedena | ‘5 © | s t e j n ý m z á k 1 a | dn | í m mater | i á 1 e rn a o 1 i | gosem SE 0 I D č : |
| 6 a SEQ | I D | č: 1 druhá PCR. | reakce. | Oba takto | vznikající DNA | |
| f r a grne n t y | by 1y vyč i š t ě ny | podle s | tandardn í ho | předpisu (PCR | ||
| p u r i f i c a t | i o n | k i t , 0 u i a g e n | H i 1 d e n ) | . 0,1 pmo1 | obou fragmentů |
byly dány dohromady, byly ohřívány po dobu 5 min. na 95 °C k docílení denaturace a 1 hodinu udržovány k renaturaci. K docílení zcela zdvojeného p r o v a z c e DNA bylo po přídavku 2 ηM dNTPs, polymerového regulátoru a pfu polymerů provedeno 10
| cyklů po | 1 min. a | př i | 94 0 C a 5 min. při | 7 2 0 C | K r o | Z š | i ř e n i |
| úplného f | r a grne n t u | bylo | k usazenině pro da 1š | i P C R | reakce | př | i dáno |
| 5 0 pmo1 | vně ležíc | i h o o | 1 i gosu SEQ ID č : 1 | a SEQ | ID č : | a p o | |
| o p ě t o v něm | přidav k u | pf u | polymeru bylo provedeno | 35 cykl | ů | po 1 | |
| min. při | 9 4 0 C, 2 | m i n | při 55 0 C a 3 rn i | n .. při | 7 2 0 C | Takt o |
vyrobený prothrombi n cDNA se záměnou gly po ala v poloze 558 byl čištěn podle i t a n d ardnih o postupu, dořezán r e s t r i k č n í endonukleazou eco R 1 a klonován T4-ligázou podle standardních předpis ů na vektor B i o t e c h E u r o p e GmbH.
sekvencováno.
pUC 18 řezaný rovněž v eco R.l (Pharmacia Freiburgi. Ke kontrole bylo DMA
Příklad 2
4 • ·
-1144 ·· » · 9 ft 9 999
9 » « » « ·· » · ·· • · 4 9 <
| V v r o ba a 1 a | 5 ? 5 . | 1 a 5 5 3 p | i f; t h r o m b i n u | |||
| C i | 1 e n o u | m u t a č n t | q e n e z i | b v i k o d o n A G T | p r o a s s e r | |
| v o olo z e 5 2 | 5 ( SE( | 3 I D č : | i 4 | ) humá ηo i ho prothr omb i nu | m u t o v a η n a | |
| k o d o n tí C T o | r o a s | ala a k | od | o n G 6 C | p ro a s g1y v polo | ze 558 (SEQ |
| ID č:14) na | kodon | 6 C C p r o | a | s ala. | ||
| K | tomu | byl a | n a | bázi | pr o t hr o mb i no vé | mutace DMA |
| z příkladu | 1 a | o 1 i g o | SE | 0 ID | č : 3 s odpovídaj | ící výměnou |
| nukleotidů | na a 1 č | i v polo | z e | 525 ve smyslu genu a r | o v n ě ž oligo | |
| SEQ ID č: | 2 provedena PC | R | reakce. | P o d m í n k y z k o u š e k | o d p o v í d a i i |
podmínkám v příkladu 1. Druhá PCR reakce byla provedena s oligo
| SEQ ID | č : 4 , | komplementárním s | SEQ ID č: 3, a s | 0 ] | ligo SEQ ID | |
| č : 1 . | Ta k t o | d o c í leně | DNA | fragmenty byly | denaturovány. | |
| h y b r i d i s | ovány. | doplněny na | d VO j i | t ý p r o v a z e c a pot | o rn | byla podle |
| p ř í k 1 a d u | 1 provedena další | ' PCR | reakce s vně lež | í c í | m o 1 i qosem | |
| SEQ ID č | : 1 a | SEQ ID č: 2. |
Takto vyrobená prothrombin-motace cDNA byla čištěna., dořezána eco R1, klonována na vektor pUC 18 a ke kontrole sekvencována.
Přiklad.......3
Výroba ala 363. ala 558 prothrombinu
Cílenou mutační genezí byl kodon A 6 T pro as his v poloze 363 (SEQ ID č: 14) humánního prothrombinu mutován na kodon GC A pro as ala a codon G6C pro as g1y v poloze 558 (SE O ID č: 14) na kodon GCC p r o as a 1 a.
| K | t o mu | byla | na báz | |
| z příkladu | 1 | a | oligo | SEQ ID |
| n u k 1 e o t i d ů | na | a 1 | a v p o 1 | . o z e 3 6 3 |
prothrombinové mutace DMA ó: 10 s odpovídající výměnou ve smyslu genu a rovněž oligo « ·· .5 E 0 ID ·· ·»
B · · » · · · · » · · ·
B · · « ·· ·*
I · · ·
B · ··
B · · « t · · « ·«
I * · « í · ·· • · · « « • · « ·· ·· pr o ve den a P CR re a k e e . Po dm ί n kv p o d m ί n k a m v p ř i k 1 a d u 1 D r u h á P C R r s a k c e b y l a S E 0 ID c : 11, k o m ρ l e m e n t a r n i m s S E 0 I D č : 10 , ó : 1 . T a k t o d o c i i e n & D N A f r a g m e n t y b hybridi so vány, doplněny na dvojitý p r o v a z e c příkladu 1 p r o v e d e n a da 1s t P C R r e akce s vn ě SEQ ID č: 1 a SEQ ID č : 2.
z k o u š s k od o o '! i d a j í p r o v a d e n a s o I i g o a s oligo SE O ID y ! y d e n a t u r o v a n y, a potom byla p o d1e ležícím o 1 i σ o s em
| Takto | vyrobená prothromb | i n-mutáce c DNA | byla | č i š t é n a . | |
| dořezána ec | o R1 | , k1 ono vána na | v e k tor p U C 18a | k e | k o n t role |
| sekvenco vá na | |||||
| Přiklad 4 | |||||
| Výroba asn 4 | 1 9 r | ala 558 o r o t h r o mb i | n u | ||
| Cí 1 | e no u | mutační g e n e z í | byl kodon G A C | pro | as as p |
v poloze 419 (SEQ ID č: 14) humánního prothrombinu mutován na kodo n 6CA pro as asn a kodon G6C pro as g 1 y v poloze 558 (SEQ ID č: 14) na kodon GCC pro as ala.
| K | to mu byla | na b á z | i | prothrombi nové | mutace DNA | |
| z příkladu | 1 | a oligo | SEQ ID | č : | 12 s odpovídá | jící výměnou |
| nukleotid ů | n a | asn v ρ o 1 o | ze 4 19 | ve | smyslu genu a | rovněž oligo |
| SEQ ID č: | 2 p | r o ve d e na P C | R r e a k c | Podmínky zkouše | k o d p o v i d a j í | |
| podmínkám v | př | i k1 adu 1 . Druhá PC | R r e | akce byla p r o v e | děna s o 1 i go | |
| SEQ ID č: 1 | 3 . | k o m p 1 e m e n t a | r n i m s | SEQ | ID č: 12, a s | oligo SEQ ID |
č : 1 . Takto docílené DNA fragmenty byly de na tu r o vány, hybridisovány, doplněny na dvojitý provazec a potom byla podle příkladu 1 provedena další PCR reakce s vně ležícím oligosem SEQ ID č: 1 a SEQ ID č: 2.
Takto vyrobená prothrombinová mutace c D N A byla čištěna. dořezána eco R1, klonována na vektor pUC 18 a ke • · • · • · • · • · ·· ·· ··· • · • · ·· ·· ·· • 4 4 · • · ·· • · · · 9 · · · ·«* ·· ·· «· • · · ·
4 44 • ···· · • · · ·· »*
| k o n t r o | 1e se k ven | c o v á n a . | |||
| P ř i k J s | d......5 | ||||
| V v r o b a | a i a 5 2 5 | o r o t h i o m o < n o | |||
| C í 1 e n o | u mutační | genezí bvl kodon AGT pro | a s | ser | |
| v po 1 o | z e 5 2 5 ( | SEQ ID č: 14 | ) humánního prothrombino mut | o v á | n na |
| k o d o n | GCT pro a | s ala. | |||
| K tom u | byla na ba z | i prothrombinové mutace DNA | a o | i i go | |
| SEQ ID | č: 3 s | odpoví d a j í c i | výměnou nukleotidů na ala v | pe- | loze |
| 525 ve | s mys 1 u | g e n u a r o v n | ě ž oligo SEQ ID č: 2 provede | ří a | P C R. |
| r e a k c e . | Druhá P | C R r e a k c e | b y 1 a p r o· v e d e n a s | o 1 i g o S E 0 I D | NO: 4 , |
| kompl e rne nt á r n í m | s SEQ ID | N 0: 3 , a s oligo | SEQ ID NO: 1 .. | Takto | |
| d o, c i 1 e n é | DNA | fragment y | byly denaturovany, hybridisovány, | ||
| d o p 1 n ě n y | n as a v o | jitý p r o v a | z e c a p o t o m b y 1 a | prove d e n a d a 1s | í P C R |
| reakce s | vn ě lež | í c í m o 1 i g o | sem SEQ ID NO:1 a | SEQ ID NO:2. | |
| Takto | vyr o be na | pr o t hr o mb i no vá | mutace cDNA | byla | |
| čištěna. | do pr o f i | 1 o v á n a e c ci | R 1 . klonována na | vektor pUC 18 | a k e |
| k o n t r o 1 e | sekvencována. | ||||
| Příklad | 6 | ||||
| Konstrukce exp | r e s n i c h v | ektorů pro humánní prothromb | i π o v é | ||
| m u t a c e | |||||
| K sekrecní re ko m bi n a č n i exp r esi | v CHO přísa | v n ý c h |
| b u n k á c h | bylo | na 5 | konci c h | mutovaného pr o thrombi nu cDNAs (viz.. |
| p ř(klad | 1 a | ž 5 ) p ř | i p o j e n o | sekreční vedeni sekvence humánního |
| t P A g e n u | ( P | e η n i c a | a kol e k t | iv. Nátuře 30 1, 2 14 až 22 1, 1983 ).. |
| Když se | vy | c h á z i | z tPA | cDNA bylo tPA sekreční vedení cDNA |
| ro z š í ře no na | b a z i | PCR reak | c e syntetickými oligonukleotidy SEQ | |
| I 0 č : 9 | ( 5 ' | konec | t P A v e d e | ní a eco SI místo) a rovněž SEQ ID |
• · • · • · • · · · • ·
- 14 ·· ·· ···· · • · · · · · • · ·· ·· ··
| č : 8 | (3 konec | t P A v e d e n í , 5 | k o n e c | prothrombin u) . | 0 1 | i g e m 3 E 0 |
| I D č | : 7 k o· mole | m e n t a r ním s S E 0 | í D č | : 8 a SEO ID | č : | 2 b y 1 v |
| r o z š i | ř e n y f r a g m e n t y p r o t h r o rn b i n | o v e m u t | ace. Fragmenty | t P | A v e d e n í | |
| b y 1 y | p ř i d a n y k | fragmentům oro | t h r o m b i | n o v e mutace. V | s á | z k a b y 1 a |
| d e n a t | urována, | hybridizována a | d o p i n | é na na dvojit | ý | pr o vazec |
a dalš ί P C R r e a kc í s oligonakleotidy SEQ ID č: 9 a S E O ID č: 2 byla vyrobena tPA prothrombinová mutace DNAs. Tato látka byla řezána eco R. 1 , klonována na pUC 18 a ke kontrole sekvencována.
K expresi do CHO buněk byla tato DNAs vyříznuta z pUC
| 18, i | , z o 1 o v á n a a | vpravena | do mís t a | řezu e c | o R. 1 vektoru | pc | DNA3 |
| n e o ( | Invitrogen, | S a n D i e g o | USA) . | T r a n k r i | pce prothrombi | n u | cDNA |
| j e v | tomto vektoru pod kontrolou | s i t né ho | c yt o me ga 1 i e v i | r u s | oro- | ||
| motoru. Selekce | na transf | i k o van é | buňky se | provádí pomoci | g e n u |
odolného proti neomycinu, ležícího v plasmidu, který dovoluje růst jen kolonií rezistentních ke 6 418.
Před transfekcí byly odpovídající DNAs, které byly určeny pro expresi do CHO buněk, linearizovány restrikčním enzymem pvul, precipovány a sterilně absorbovány v 10 mM trispufru.
Příklad 7
Exprese prothrombinových mutaci v buňkách savců
DNA expresních vektorů buňkách transf i kována 1 i pofektaminem (firma Gibco. Life GmbH, Diese1strasse 5, 76334 Eggstein, SRN, č.
Techno1ogi es 530-8324SA)
Použité buňky byly CHO-K1 (ATCC CCL 61)
293 (ATCC CRL 1573).
2x10s buněk bylo nasyceno v kalíšek kulitivační desky 6-well. Př transfekce. K tomu byly buňky .jednou ml růstového í š t. í den byla vvprány v médiu média na provedena bez séra.
• · • · • · •· ·· ·· ·· ···· · · · · ···· · ··· · ··· • · ··· ·· ·· ··· · · ··· ···· ··· 99 · · ·· · * ·· · ·
T ransfekce lipofektaminem byl a f i r my Gibco (Focus (19 9 3 ) . 15.
obsahoval 1 μ m DNA a 6 μ rn 1 i p o v celkem 1000 μ rn b u n ě č n é h o k u l t hodinové inkubaci při 37 °C by a buňky s normálním růstovým med inkubují přes noc.
| p i·' o v e d e n | a pod | 1 e úd a | iů výrobní |
| 3 , 7 3 | až 7 | 8). Kaž | d ý kalí š sk |
| e k t a rn i n u | e r ý byl | a p 1 i k o vá n | |
| v a č n i h o | mé d i | a bez s | éra . Po 6 |
| O 0 d S 8 t O | t r a n | s f e k t a č | ní médium |
| e m ( vč e t | n ě t e | 1 e c t h o | sera. F S C) |
Přechodná exprese prothromfainových mutací do buněk 293
Buňky 293 jsou udržovaný v DMEM médiu (Gibco č. 41965) a 10 % FCS (Bíowhittaker č. 14601 B) .
provedena. jak je exprese provedena Promega č shora popsáno.
kotransfekce s
E 1 7 1 1 ) . 0,2 μ g prothrombi no ve mutace bylo
Transfekce byla Přitom byla ke zvýšení plasmidem pAdVantage (firma pAdVantage-DNA a 0,8 μ g DNA transfi kováno ve vektoru exprese pcDNAS, jak je shora uvedeno. První den po transfekci bylo odsáto médium obsahující sérum a nahrazeno mediem bez séra (bez fenolové červeně). Třetí den po transfekci byla odebrána buněčná kultura a uložena až k provedení testu při -20 0 C.
Přiklad 9
Stabilní exprese prothrombi nové mutace v
CHO-K1 buňkách
Transfekce byla provedena, jak jsou udržovány a
21331-020) rozštěpeny
Současně a 1 0 takže byla chovány v DMEM/F12 v % F CS. První den po bylo odsáto 20 až 100 zahájena selektáce je shora popsáno. CHO poměru 1:1 (Gibco č. transfekci byly buňky 10 cm Petři ho misek, rekombíno váných buněk • · • · • · • ·
4 » I
4 > · · · ·
Β 4 · 4 4 » 4 4 4
4 4<· zpracováním G4 13 (firma Gibco. 1200 pg/ml v médiu). Získané >·' ez i stent ni kol o n i e s e j edno t i pomocí c 1 on i ng cy 1 i nder “ me t ody a P o k u1ti v a ci s a p r o v ě ř i d o s ožeň í dost a t e č n é h o p o č t u b u n é k pro exp r esi o dpovt da jic i thro mb i nové mut ac e. K t o m u b y1 o médi um odsáto z konfluentních buněk a nahrazeno čerstvým médiem bez sera. Po upiynutí pevné doby, například 24 hodin. 48 hodin, byl odebrán inkubovaný přebytek buněčných kultur a testován pomocí ELISA na ρ ř í t o mno s t pr o t hr o mb i nu.
Získané rekombinované buňky byly částečně k nárůstu exprese klonovány jednocením na mikrotitračnich destičkách.
různých nádobách pro F C S. Následně byly séra/F12-med i um 21765-029, směs dvou, případné změna média k odebrání mutaci prothrombinu. U až 10
K připravení dostatečného množství přebytku buněčné kultury bez sera byly dobře exprimerované CHO buňky pěstovány v kultury až ke ko nf 1 uenc i do média s 10 1¾ buňky prány PBS a inkabovány DMEM bez (DMEM: 6 ibco-Nr. 1 1880-028, F12: Gibco c.
sestává ze stejných objemových podílů). Po třech dnech nastala přebytku buněčné kultury obsahující tohoto druhu by se mohlo odebírat z nádoby pro kultury krát. Různé odběry z různých nádob pro kultury přitom byly k dosažení akceptovalného objemu pro čištění jednoceny.
Přiklad 10
Důkaz exprese rekombinované oothrombinové mutace
Buňky, které vytvářejí prothrombin a ve kterých vzniká médium buněčné kultury, byly testovány na přítomnost rekombinovaného prothrombinu tím, že přebytek buněčné kultury v knfluentních buňkách byl prověřován na přítomnost prothrombinu pomocí ELISA nebo podle štěpení prothrombini na thrombinovou aktivitu, případně thrombinový antigen.
• · • ·· · ·· · · ·· < • ···· · ··· · ··· • ·· · · · · · · · · · · · 1
Κ t ο rn ti b y l o d e b i r a n p o r ů 2 n ě d louh o π d o b u p ř e b y t e k buněčné kultury bez sé.ra. Štěpeni prothrcmbtRU přítomného v ořebvtku buněčné kutturv bvl dosažen Domoci snake './enom (firma
8 8 μ l z k o u š k y !’ p ř s b y t e fc b u něč né k u i t u r y bez s é r .3 nebo pr o · t hr o mb i n )
3 μΐ snake venom ( 0 , 2 mg/ml ve vodě i
0 μΐ pufru (1M NaCl, 100 mM CaCl?, 200 mM tris pH 7,4)
100 μΐ vody
Štěpná vsázka byla 4 b m i n u t. i n k u b o v á n a při teplotě
Následně byl v různých testech charakterizován vznikající thrombi n.
P,ř,í „klad.........1 1
Důkaz prothrombi no vé mutace a thrombinové mutace pomocí ELISA
ELISA ke stanovení prothrombi nu a thrombinu byla provedena podle následujícího schématu:
- mikrotitrační destičky byly převrstveny 0.1 ml/well anitithrombinová protilátka, 5 μ g / m 1 0.05 M
NaHCOz, pH 9,.2, 16 hodin/4 °C.
- nasycení 1 ž; BSA/pbs, 0,3 ml/well, 0.5 až 1 hodina/teplota o k o 1 i
- 3x praní 0,05 % tween 20,/PBS
- 11 standardních zředění humáního prothrombi nu (Calbiochem
605195, 3, 159 NIH U/mg), začíná 10ng/ml 0,1 % BSA/0,05 % tween 20,/PBS ve dvou krocích, souběžně s tím zředěni stanovovaných zkoušek.. 0,1 ml/well, 2 až • · · · · · · · · · * • ···· · ··· · · β · • 4 · ·· · · · · · · · · · · ···· · · · · · · · «*· ·· «« · · ·· · *
-IQ -
| 4 hodin | y/teplota okolí | ||||||
| - práni | j a k je s h o r a | u v e d e | n o | ||||
| -· 0 , 1 rn | i /we 1 1 | b i o t i | n y l ové | a n í | i t hr o mbi no v | s a n t i 1 á t k y | 1 : 2 0 0 . |
| zředěno | v 0, 1 | BSA./ | 0,05 a | t W Θ 6 | n 20/PB5. 2 | až 4 hodiny/ | t e p 1 o t a |
| o k o 1 í | |||||||
| - praní | ) a k j | e s h o r a | u v e d a | n o | |||
| - 0 , 1 | m 1 ,/ w e 1 | 1 střep | t a v i d i | n o v é h o | p e r o x i d a s o | ve ho komp1e xu | ( B . M .. |
| 1089153 | ) , zře | děno 1 : | 10 0 0 0 | v 0 , 1 | % ESA./0.0 5 | % tween 20/ | PBS, 3 0 |
minut ./teplota okolí
- praní jak je shora uvedeno
- 0,1 ml/well peroxidaso veho substrátu
- reakce k o n č i 0,1 rn 1 / w e 1 1 2 M Hz S 0<i
- měření absorpce při 450 nm
Peroxydasový substrát: 0,1 ml TMB roztoku (42mM TMB v DMSO) a 10 ml substrátového pufru (0,1 M octanu sodného pH 4,9) míchání, potom přídavek 14.7 pl 3% Hz 0?
Příklad.......1.2
Výroba antilátky proti humánnímu thrombinu
| k r á | líci | K jak | indukci polyklonálních následuje: | anti | látek byly | i mu n i z o vá n y | ||
| 1 . | den | 200 | pg humánního | t hr o mb i nu | v | 0,5 | ml PBS./ | ko mp1e t n í ho |
| F r e u n d s | Ad j uvant (S i | qrna F588 1) | ||||||
| 1 4 . | den | 2 00 | pg hu ma η n i ho | t hr o mb i n u | v 0. | 5 ml | PBS./ i | n k o mp1e t n í ho |
| F r e u n ď s | Ad j u van t ( S i | gma F5506) | ||||||
| 28 . | den | 2 00 | pg humánní ho | t hr o mb i n u | v 0 , | 5 ml | PBS/ i | nkompletního |
| F r s u n ď s | Ad j uvant | |||||||
| 42 . | den | 200 | pg humanní ho | thrombinu v | 0,5 | mL | PBS |
Ssdm dní po poslední imunizaci byl proveden odběr krve
- 1 9 ·· ·· « · · · • · · fl • · · · • · · * · r: v k r á ) i k a ..
C i a t ě n i p o i y k i o n a 1 n i c h a n t i i a t s !· sera by i o provedeno pomoci proteinu Pharmacia) s výtěžkem 65 mg IgG/10 m b y1y proti látky d i a i y z o v βny 0,0 5 M p o tom 2 hodí n v, p ř i teplotě oko 1 i o r κ r a 1 i k a
z. i s k a n e h <
| s e p h a r 0 | za | ( p 0 d i | e v ý r 0 b c e |
| s é r a . P | ř e d | b i 0 t | i n v 1 i z a c i |
| a H C Cy , | d.H | 9 , 0 | (2x2 1), |
| řs ba vá n | p ř | í d a v k | e m 2 0 0 μ i |
| 03189, | 1 | mg / m 1 | H.? O) n a |
| b y i y 3 | k. r | á t d i | a 1 y t 0 v á n y |
proti P B S ískaným i protilátkami byl vytvořen sanduich ELISA:
převrstveny 0,1 ml/well qH 9.2. 16 (Calbiochem
- mikrotitrační destičky jsou antithrombínové protilátky 5 pg/l v 0.05 M NaCO· hodin/4 °C
- nasyceni 1 % BS A, 0.3 ml/well, 0,5 hodin/teplota ok o 1 i
- 3x praní 0,05 £ tween 20./PBS
- 11 stardadnich zředěni humánního thrombinn
605195), začínajících 10 ng/ml 0,1 BSA/PBS/0,05 % tween 20 ve dvou krocích, souběžné s tím zředění stanovovaných zkoušek, 01 ml/well, 2 hodíny/pokojová teplota
- praní, j a k je s h o r a u v e deno
- 0,1 ml/well biotinylové antithrombínové protilátky 1:200 se zředí v 1 % BSA/PBS/0,05 % tween 20. 2 hodίny/pokojová teplota
- praní, jak je shora uvedeno
- 0,1 ml/well straptavi di nového 10 8 9 15 3), zředěno '1:10000 na 0,1 minut/teptota okolí
- 0,1 ml/well peroxidasového substrátu ~ reakce se zastaví 0,1 ml/weil 2M Hg SO4
- meření absorbce (OD) při 450 nm.
peroxidasového komplexu (B.M. % BSA/PBS/0,05 X tween 20, 30
Na vyobrazeni je znázorněna absorpce (OD) proti • · · · • · · · • · · · · · • · · 9 9 9
9 9 9 · • 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9 · · · · 4 • · · 9 9 9 9
9 9 9999 4 • · · · 9 4
9 9 9 9 9 9 9 thr o m b i n o v é k o n c e n t r a 1
P e r o x i da s o v v s u b s t r a t : o r o m i c h á n o ml T Μ B r o z t o k <42 mři v DMSO) a 10 mí sabstratoweho pufru <0.1 M octanu s o d n e h o . p H 4 . 9 ) . p o t o m p ř t d a v g k I 4 , 7 μ m 3 % H? Cm .
Důkaz prothrombinové mutace a thrombinové mutace pomocí ELISA
ELISA ke stanovení prothrombi nu a thrombinu byla provedena podle následujícího schématu:
- mikrotitrační destičky jsou převrstveny 0,1 ml/well ant i thrombi nové antilátky, 5 μα/1 v 0,05 M NaHCOs , pH 9,2, 16 h o d i n / 4 0 C
..... nasyceni 1 % BSA/PBS, 0.3 ml/well, 0,5 až 1 hodina ./teplota o k o 1 i
- 3x praní 0,05 % tween 20/PBS
- 11 stanrdadních zředění humánního thrombinu (Calbiochem 605195, 3,159 NIH U/rng), začínajících 10 ng/ml 0,1 % BSA/0,05 % tween 20/PBS ve dvou krocích. souběžně s tím zředění stanovovaných zkoušek. 0 1 ml/well, 2 až 4 hod iny/pokojová teplot a
- praní, jak je shoř a uv eden o
- 0,1 ml/well biotinylového antithrombinové protilátky 1:200 se zředí v 1 % BSA/PBS/0,05 % tween 20, 2 až 4 hod iny/pokojová t e p 1 o t a
- p r a ní, jak je shoř a u v e d e n o
- 0,1 ml/well straptavidinového peroxidasového komplexu (B..M. 10 89153), zředěno 1:1000 0 v 0,1 % BSA/0,0 5 tween 20/PBS, 30 minut/teplota okolí
- praní, jak je shora uvedeno
- 0,1 ml/well peroxidasového substrátu
- reakce se zastaví 0,1 ml/well 2M H? SΟμ meření absorbce (OD) při 450 nm.
4 • 4 4 4 4 · · • 4444 4 444 4 4 · 4 » · » «·· 44 44 4444 4 ««44 4444 4 4 4 ·· 44 4 4 44 44 44
| P e r o x i d a s o v y s | u b s t r á t. : | p r o m i c h a n o 0 ,1 ml | TMĚ· roztoku | |
| (42 m M | TBM v DMSO) a | 10 ml substrátového pufru | (0,1 M o c t a n u | |
| sodného. | p H 4,9), potom | p ř í dávek | 14,7 μπι 3 % Hz O? . | |
| P ř í k 1 a d | 1 3a |
Čištění humánního thrombinu z krevní plazmy
Čištění humánního prothrombinu z humánní citratplazmy se provedlo iak popisuje HenriRson (Methods in Enzymology, svážel 222, str. 312 až 3279), Štěpení prothrombinu a čištění thrombinu se provádí heparinchromatografiί, jak je uvedeno v příkladu 14 a 15. Frakce obsahující thrombin byly zjišťovány pomocí chromogenní thrombinové zkoušky pomocí S 2238 a podrobeny ultrafiltraci na 1 mg/ml a dias filtraci pomocí PBS..
Stanovení thrombinové aktivity pomocí chromogenního substrátu S 2238
Aktivita thrombinové mutace tripeptidu. K tomu se postupuje podle pipetování:
se zjistí štěpením následujícího schématu μΐ zkoušky (thrombin 0,5 U/ml, různých zředěních)
0 μ 1 Hz O
0 μ 1 S-2238 (1 mg/ml v Hz O,
Švédsko).
nebo štěpený prothrombin v firma Chromogenix, Molndal,
Vsázky Nakonec se měří množství se z ji
U/ml .
se odstaví adsorpce při šťuje pomocí až 15 min. při teplotě 37 0 C. vlnové délce 405 nM a trombínové kalibrační křivky mezi 0,01 a 1 • · · · • · • · «
-99 Příklad 13b
Čištění prothrombi nové mutace pomocí chromatografie výměny a η i o n ů
5 1 přebytku.buněčné kultury, obsahující prothrombin, se nejprve koncentruje pomocí ultrafi 1trace při 4C (SPS 400 membrána. Fresenius, St. Wendel) na 400 ml a diafiltruje pomocí 10 mM tris pH 7,5 až vodivost činí 1,1 mS/cm. Demineralizovaný filtrát se potom umístí na FF sloupec 0 separace (průměr 5 cm, objem 530 ml) s průtokem 6 m1/m i η., sloupec se o mí vá pufrem (20 mM tris/HCl pH 7,5) a následně se vyvíjí s gradientem podle 400 mM NaCl přes 15 objemů sloupců. Frakce obsahující prothrombin se identifikují pomocí ELISA. Prothrombi nová mutace eluuje 280 mM NaCl. 2 tohoto sloupce se izoluje 150 až 200 mg proteinu.
P ři.k 1 ad........1.4.
Uvolnění thrombinové mutace z prothrombinu
Chromátoarafi cké frakce O separace koncentrující amicon YM 30 (20ml koncový objem, dial i zují 2 litry 20mM tris/HCl
175 mg celkového proteinu) se pH 7,5, 100 mM NaCl a pro
| štěpení se | pří d a v k e m | 1 M | CaCl2, 20 | mM tris | p H 7,5 nastaví | na |
| koncovou | koncentraci | 1 0 | mM. Po | př í da vku | 3 0 mg hadího jedu | |
| z oxyranus | scutellatus | s e | při 4 0 C z | a mí chání | štěpí a reakce | |
| po 12 hodinách ukončí | př í | davkem 2 | ml 20 mM | roztoku EGTA, | pH |
7.5.
Příklad 15
Čištění thrombinové mutace heparinovou chromatografií
Štěpená vsázka z příkladu 14, obsahující thrombin se • · • ·
7,5, se vyvine přes 150 ml mutace se potom zjišťují následně umístí na sloupec heparinové separace (14 cm x 1 cm, Pharmacia) s průtokem 38 cm,/hod. Po omytí sloupce 20 ml 20 mM fosforečnanu sodného, 0,1 Μ NaCl p H
0,01 ® pluriolu F68. Thrombinové pomocí ELISA. Mutace se eluují při 400 mM NaCl. Získalo se 30 až 35 mg mutace a po přídavku BSA (1 mg/ml) bylo dialyzováno pomocí PBS 0,01 % pluriolu F68 a bylo uloženo při
Příklad 16
Neutralizace hirudinu v in vitro systému
Antidotové působení inaktivních rekombinovaných thrombinů na hirudin bylo prokázáno v testu thrombinové aktivity. K tomu byly hirudin, testovaná thrombinové mutace, aktivní t hr o mb i n a S-2238 navzájem i nkubovány. Tento test spočívá v neutralizaci hirudinu pomocí testovaného inaktivního thr o mb i nu thrombinu z toho vyplývající vyšší aktivitě aktivního
K tomu bylo provedeno následující pipetační schéma:
100 μΐ hirudinu HL.20 (1,5 U/ml ) , případně 0,1 % BSA v TES pH 7,5 a 100 μ 1 thrombinové mutace (vyrobené v příkladu 2) bylo inkubováno po dobu 5 minut při teplotě okolí. Po přídavku 50 μΐ aktivního thrombinu (0,5 U/ml) byla přídavkem 50 μΐ S-2238 (1 mg/ml ve vodě. Firma Chromogenix, Mólndal, Švédsko) zahájena reakce. Vsázka byla odložena po do dobu 15 minut při teplotě 37 0 C. Následně byla : měřena absorpce při vlnové délce
410 nm. Neutralizace hirudinu inaktivní thrombinovou mutací vedla ke zvýšení absorbce.
Příklad 1?
- 24 • ft ·· ftft ftft ftft • ftft ···· ···· • ···· · ftftft · ftftft «··· ···· ·· • ft ftft ·· ·· · · ft·
| Neutrál i z a c e | PEG hirudinu v p s o v i . | |||||||
| Na | psy | rasy | b e a g 1 e | (9,8 | až 13, 5 kg) | by) | l a p 1 | i kován |
| s u b k u t a η η i P | EG hi | rudi n | v dávce 10 | mg/kg. 180 mi | n u t | po i | n i e k c i | |
| PEG hirudinu | byla | a p 1 i | kována | thrombinová mutace | vyrobená | podle | ||
| příkladu 2 | jako | i ntráveno z n i | i n f u | se s dávkován | í m | 2 0 g | /kg p o |
dobu 5 0 min. Krevní zkoušky byly psum odebrány punkc í v. brachialis na začátku experimentu a další zkoušky byly odebrány po 150 v časovém intervalu až 6 hodin. Z krevního citranu byla získána centrifugací 2000 g po dobu 20 min. plazma a byla uschována na analýzu při - 20 °C.
Ve zkouškách plazmy byly stanoveny antithrombi nové aktivity, jako popisuje Spannagel a kolektiv, Bio od Coagulation Fobri no 1ysis, 1991. 2, 121 až 127. Ant ikoagu1ační aktivita byla stanovena pomocí systému s pathromtinem (Behring).
Výsledky jsou shrnuty v tabulkové části. Tím, že v kontrolovaných zvířatech antithrombi nová aktivita po aplikaci PE6 hirudinu rapidně narůstá, může se ve zvířatech ošetřovaných antidotem zabránit antithrombi nové aktivitě. Po ukončeni antidotové infuze narůstá dále hladina PEG hirudinové plazmy srovnatelně s kontrolovanými zvířaty. Kvalitativně shodný průběh je pozorován také u aPTT.
• · · 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 9 99 9 9 99 • · · 9 · · 9 9 9 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
SEKVENČNÍ protokol (1) OBECNE INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL
| ( A) | JMÉNO | : BASF a , s . | |
| ( B) | ULICE | : Carl-Bosch-Strasse | 38 |
| ( C) | MI STO | : L u d w i g s h a f e n | |
| ( E ) | ZEMĚ : | Spolková republika | Ně me c ko |
| ( F ) | PSČ: | 67056 | |
| (G) | TELEFON: 0621/6048526 | ||
| ( H) | TELEFAX: 0621/6043123 | ||
| ( I ) | TELEX | : 1762175170 |
(i i) PŘIHLAŠOVANÝ NÁZEV: Nová thrombinové mutace a její použití jako a n t i d o t (iii) POČET SEKVENCI: 14
| TYP | POČÍTAČE | ||
| ( A) | NOSIČ DAT | : floppy disk | |
| ( B) | POČÍTAČ: | kompatibilní IBM | PC |
| (C) | PRACOVNÍ | SYSTÉM: PC-DOS./MS | -DOS |
| ( D) | SOFTWARE: | PatentIn Re 1ease | 1 . 0 |
(2) INFORMACE K SEQ ID č (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
| ( A) | DÉLKA: 33 báz | ických párů |
| ( B) | TYP: kyselina | nukleinová |
| (C) | TVAR PROVAZCE | : j e d n o t 1 i v |
| ( D) | TOPOLOGIE: li | n e á r n f |
(ii) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS • · • · ·
- 26 • · • · ·· • · · · · · · · · • · ·· ·· ·· · · (iii) HYPOTETICKY: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID c: 1:
GGGGGGGAAT TCGCCAACAC CTTCTTGGAG GAG (2) INFORMACE K SEQ ID č: 2:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 2:
GGGGGGGAAT TCCTACTCTC CAAACTGATC AAT (2) INFORMACE K SEQ ID č: 3:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS • · · ·
(iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEO ID č: 3:
GGATGCCTGT GAAGGTGACG CTGGGG6ACC CTTTGTCATG (2) INFORMACE K SEQ ID č: 4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
( A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jedotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEO ID č: 4:
CATGACAAAAG GGTCCCCCAG CGTCACCTTC ACAGGCATCC (2) INFORMACE K SEQ ID č: 5:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární
• · · · · · · • · · · ···· · • · · · · · «· ·· ·· · · (ii) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 5:
GACCGGGATG GGAAATATGC CTTCTACACA CATGTGTTCC (2) INFORMACE K SEQ ID č: 6:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 6:
G6AACACATG TGTGTAGAAG GCATATTTCC CATCCCGGTC (2) INFORMACE K SEQ ID č: 7:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 40 bázických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý ·· toto ·· β· ·· »·· ···· · · to · » ···· · to · to · · · · (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS ( i i i ) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 7:
TCCAT6CCCG ATTCAGACGC GCCAACACCT TCTTGGAGGA (2) INFORMACE K SEQ ID č: 8:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR. PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP' MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ANTISENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEO ID č: 8:
TCCTCCAAGA AGGTGTTGGC GCGTCTGAAT CGGGATGGA (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 27 bazických párů (2) INFORMACE K SEQ ID č: 9:
| (B) TYP: kyselina nuk 1e i nová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární | ||
| (i | 1 ) | TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS |
| ( i i | i ) | HYPOTETICKY: ne |
| ( i i | i ) | ANTISENSE: ne |
(xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 9:
GGGGGGGAAT TCGTAAGCA ATCATGG (2) INFORMACE K SEQ ID č: 10:
| SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA: (A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: kyselina nuklsinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární | |||
| TYP | MOLEKULY: | cDNS k mRNS | |
| HYPOTETICKY: | ne | ||
| ANTISENSE: ne | |||
| SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: | 1 0 |
CTCACCGCCG CCGCATGCCT CCTGTACCCG (2) INFORMACE K SEQ ID č: 11:
-31·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ···· • ···· · ··· · · · · • · · ··· · · · · ··· · · ···· · · · · ··· • · · · · · ·· · · ··
SEKVENČNÍ CHARAKTERIŠTIKA:
(A) DÉLKA: 30 bazických párů ( B) TYP: kyselina nuk 1s i no vá (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOP OLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ΑΝΤΙSENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 11
CGT6TACAGG AGGCACACGG CGGCGGTGAG (2) INFORMACE K SEQ ID č: 12:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 27 bazických párů ( 8) TYP: kyselina nukleinová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární (i i) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS (iii) HYPOTETICKY: ne (iii) ΑΝΤΙSENSE: ne (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 12:
GAACCTGGAC CGGAACATTG CCCTGAT
- 32 4 4 ·4
444 4444 4444
4444 4 444 4 444
4 · · · 4 44 44 444 · 4 · · 4 4444 444
| ( 2) | INFORMACE K SEO ID č: 13: |
| (i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA: (A) DÉLKA: 27 bazických páru (B) TYP: kyselina n uk1e i nová (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: lineární | |
| (i i) TYP MOLEKULY: cDNS k mRNS | |
| ( i | i i) HYPOTETICKY: ne |
| ( i | ii) ANTISENSE: ne |
(xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 13:
ATCAGGGCAA TGTTCCGGTC CA6GTTC (2) INFORMACE K SEQ ID č: 14:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:
(A) DÉLKA: 579 aminových kyselin (B) TYP: aminová kyselina (C) TVAR PROVAZCE: jednotlivý (D) TOPOLOGIE: 1 i neární
TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVOD VZNIKU:
(A) ORGANISMUS: homo sapiens (xi) SEKVENČNÍ POPIS: SEQ ID č: 14:
ala asn thr phe leu glu glu val arg lys gly asn leu glu arg glu ·· ··
I · · I
I · · · ·· · · « • 9 «
- 33 10 15
5 ·· ·· • · · I • · ··
| c y s | va 1 | g 1 u | g i u 20 | t hr | c ys | s e r | tyr | g 1 u 25 | g 1 u | a 1 a | phe | g 1 u | a 1 a 30 | l e u | g 1 u |
| s e r | ser | thr | a 1 a | t hr | 3 S p | va 1 | phe | trp | a 1 a | i ys | tyr | thr | a l a | o ys | g 1 u |
| 3 5 | 4 0 | 45 | |||||||||||||
| t h r | a 1 a | arg | thr | pro | arg | a s p | 1 ys | 1 e u | a 1 a | a 1 a | c ys | 1 e u | g i u | g i y | asn |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| c ys | a i a | g 1 u | g i y | 1 e u | g 1 y | t hr | asn | t yr | er g | g l y | h i s | va 1 | asn | i 1 e | t hr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| arg | ser | g i y | i 1 e | g 1 u | c ys | g 1 n | 1 e u | trp | arg | ser | arg | t yr | pro | h i s | 1 ys |
| 85 | 90 | 8 5 | |||||||||||||
| p r o | g 1 u | i 1 e | asn | ser | t hr | t hr | h i s | pro | g i y | a 1 a | asp | 1 e u | g 1 n | g 1 u | asn |
| 100 | 105 | 1 1 0 | |||||||||||||
| phe | g 1 u | arg | asn | pro | a s p | ser | ser | t hr | thr | g i y | pro | trp | c ys | tyr | thr |
| 1 1 5 | 120 | 125 | |||||||||||||
| t hr | a s p | pro | t hr | va 1 | arg | arg | g 1 n | g 1 u | c ys | ser | i 1 e | pro | va 1 | c .ys | g i y |
| 1 3 0 | 1 3 5 | 140 | |||||||||||||
| g 1 n | a s p | g 1 n | va 1 | thr | va 1 | ala | me t | thr | pro | arg | ser | g 1 u | g i y | ser | ser |
| 1 45 | 150 | 155 | 1 6 0 | ||||||||||||
| v a 1 | asn | 1 e u | ser | pro | pro | 1 e u | g i u | g 1 n | o v s | va 1 | pro | asp | arg | g 1 y | g 1 n |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| '3 1 n | t yr | g 1 n | g i y | arg | 1 e u | a 1 a | va 1 | t hr | thr | h i s | g i y | 1 e u | pro | cys | 1 e u |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| a 1 a | trp | a 1 a | ser | a 1 a | g 1 n | a 1 a | 1 ys | a 1 a | 1 e u | ser | i ys | h i s | g 1 n | asp | phe |
| 1 95 | 200 | 205 | |||||||||||||
| asn | ser | a 1 a | v a 1 | g 1 n | 1 e u | va 1 | g 1 u | asn | phe | c ys | arg | asn | pro | asp | g 1 y |
| 2 1 0 | 2 1 5 | 220 | |||||||||||||
| a s p | g 1 u | g 1 u | g t y | va 1 | trp | c ys | t yr | va 1 | a 1 a | g i y | i ys | pro | gi y | asp | phe |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| g l y | tyr | c ys | a s p | 1 e u | í3 3 Π | t yr | cys | g l u | g 1 u | a 1 a | va 1 | g l u | g 1 u | g 1 u | t hr |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| g i y | a s p | g 1 V | 1 e u | a s p | g 1 u | asp | ser | asp | arg | a 1 a | i 1 e | g 1 u | gi y | arg | thr |
260 265 270
99 » 9 9 «
I · · ·
9 9 4 • · « • 9 9 9
| a 1 a | thr | ser 2 7 5 | g 1 u | g 1 n | g 1 n | thr | phe 280 | phe | a s n | pro | a r g | thr 285 | phe | g i y | ser |
| g 1 y | g 1 u | a 1 a | asp | c ys | g i y | 1 e u | arg | pro | 1 e u | phe | g 1 u | i ys | 1 ys | s e r | 1 e u |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| g 1 u | asp | 1 ys | t hr | g 1 u | arg | g 1 u | 1 e u | 1 e u | g 1 u | ser | tyr | i 1 e | asp | 9 i y | a r g |
| 305 | 3 1 0 | 3 1 5 | 320 | ||||||||||||
| i 1 e | va 1 | g 1 u | g i y | ser | asp | a 1 a | g 1 u | i 1 e | g i y | me t | ser | pro | trp | g 1 n | va 1 |
| 32 5 | 330 | 335 | |||||||||||||
| me t | 1 e u | phe | arg | 1 ys | ser | pro | g 1 n | g 1 u | 1 e u | 1 e u | c ys | g i y | a 1 a | ser | 1 e u |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| i 1 e | ser | asp | arg | t r p | va 1 | 1 e u | thr | a 1 a | ala | h i s | c ys | 1 e u | 1 e u | t yr | p r o |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| pro | trp | asp | 1 ys | a s n | phe | t hr | g i u | a s n | asp | 1 e u | 1 e u | va 1 | arg | i 1 e | g i y |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| i ys | h i s | ser | arg | t hr | arg | t yr | g 1 u | arg | asn | i 1 e | g 1 u | i ys | i 1 e | ser | me t |
| 3 3 5 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| 1 e u | g 1 u | 1 ys | i 1 e | t yr | i 1 e | h i s | pro | arg | t yr | asn | trp | arg | g 1 u | asn | 1 e u |
| 405 | 4 1 0 | 4 1 5 | |||||||||||||
| 3 Sp | arg | asp | i 1 e | a 1 a | 1 e u | me t | i ys | 1 e u | i ys | 1 ys | pro | va 1 | a 1 a | phe | ser |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| asp | t yr | i 1 e | h i s | pro | va 1 | c ys | 1 e u | pro | asp | arg | g 1 u | thr | a 1 a | a 1 a | ser |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| 1 e u | 1 e u | g 1 n | a 1 a | g 1 y | tyr | 1 ys | g i y | arg | va 1 | t hr | g 1 y | trp | g i y | asn | 1 e u |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| 1 ys | g 1 u | t hr | trp | t hr | a 1 a | asn | va 1 | g i y | 1 ys | g 1 y | g 1 n | pro | ser | va 1 | 1 e u |
| 4 6 5 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| g 1 n | va i | va 1 | asn | 1 eu | pro | i 1 e | va 1 | g 1 u | arg | pro | va 1 | c ys | 1 ys | asp | ser |
| 4 85 | 490 | 495 | |||||||||||||
| t hr | arg | i 1 e | arg | i 1 e | t hr | asp | asn | me t | phe | c ys | a 1 a | g i y | t yr | 1 ys | pro |
| 500 | 505 | 5 1 0 | |||||||||||||
| asp | g 1 u | g 1 y | 1 ys | arg | g i y | asp | a 1 a | c ys | g 1 u | g i y | asp | ser | g i y | g l y | p r o |
| 5 1 5 | 520 | 525 | |||||||||||||
| phe | va 1 | me t | 1 ys | ser | pro | phe | asn | asn | arg | trp | tyr | g 1 n | me t | g i y | i .1 e |
530 535 540 ·· ·· ·· 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 99 9 999 9 999
99 999 99 99 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 99
-35 va 1 ser trp g1y 5 45 thr his val phe
P he g1y glu glu gly cys asp 550 arg leu lys lys 555 arg asp gly lys 5 5 5 trp i 1e gin 1ys 570
| tyr | g'y phe | t y r |
| 56 0 | ||
| va 1 | i i e a s p 575 | g 1 n |
JUDr. Petr KALENSKÝ advokát > , z lř /'^· +
SPOLEČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETEČKA ZELtNV ČVORČÍK KALENSKÝ A PARTNEŘI
120 00 Praha 2, Hálkova 2 Česká republika • · • · « 9
PATENTOVÉ ·· 99 ·· • · · ···· 9 9 9 9 • 9 999 9 999 9 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· 99 99 99 99 99
Claims (1)
1. Thrombinové mutace vyznačující se tím, že mají oproti přírodnímu thrombinu následující sekvenční odlišnosti:
a) výměna gly po ala, přičemž se gly nachází v sekvenčním okolí tyr-gly-phe a v přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID č: 14) obsazuje pozici 558,
b) alespoň výměna nebo vynechání následujících zbytků, b I ) his, které se nalézá v sekvenčním okolí ala-his-cys a v přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID č: 14) obsazuje pozici 363, b2) b3 ) asp, které se nalézá v sekvenčním okolí přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID pozici 419, sér, které se nalézá v sekvenčním okolí přírodním humánním prothrombinu (SEQ ID arg-asp-ile a v č : 14) obsazuje asp-ser-gly a v č: 14) obsazuje pozici 525.
Thrombinové mutace podle nároku 1, vyznačující se tím, že oproti přírodnímu humánnímu prothrombinu (SEQ ID č: 14) mají následující sekvenční odlišnosti:
a) výměna gly po ala na pozici 558 čí
b) alespoň jedna výměna nebo vynechání následujících z byt ků
Antidot pro thrombinové inhibitory, obsahující thrombinovou mutaci podle nároků 1 až 4 s farmaceuticky obvyklými pomocnými látkami.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19605126A DE19605126A1 (de) | 1996-02-12 | 1996-02-12 | Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ247798A3 true CZ247798A3 (cs) | 1999-03-17 |
Family
ID=7785198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ982477A CZ247798A3 (cs) | 1996-02-12 | 1997-02-11 | Thrombinové mutace a jejich použití |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6060300A (cs) |
| EP (1) | EP0880591A1 (cs) |
| JP (1) | JPH11512621A (cs) |
| KR (1) | KR19990082479A (cs) |
| CN (1) | CN1211280A (cs) |
| AR (1) | AR005797A1 (cs) |
| AU (1) | AU1768497A (cs) |
| BR (1) | BR9707280A (cs) |
| CA (1) | CA2245546A1 (cs) |
| CO (1) | CO4600682A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ247798A3 (cs) |
| DE (1) | DE19605126A1 (cs) |
| HR (1) | HRP970077A2 (cs) |
| HU (1) | HUP9900574A2 (cs) |
| IL (1) | IL125077A0 (cs) |
| NO (1) | NO983677D0 (cs) |
| WO (1) | WO1997029198A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA971107B (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000018933A (ko) * | 1998-09-07 | 2000-04-06 | 김승수 | 내피세포 성장억제 활성을 가지는 사람 프로트롬빈 크링글단백질 및 이를 암호하는 유전자 |
| GB2355161B (en) * | 1999-10-05 | 2001-09-12 | 3Com Corp | Network device incorporating selective compression of stored data packets |
| KR20020008471A (ko) * | 2000-07-20 | 2002-01-31 | 김승수 | 내피세포 성장 억제활성을 가지는 인간 프로트롬빈크링글, 그것의 재조합벡터 및 이를 발현하는 재조합 숙주 |
| EP2407561A3 (en) * | 2006-03-06 | 2012-05-30 | Humagene, Inc. | A method for the preparation of recombinant human fibrinogen |
| CN102559644B (zh) | 2007-09-28 | 2015-03-25 | 普托拉制药有限公司 | 用于因子xa抑制剂的解毒剂和其使用方法 |
| NZ592837A (en) | 2008-11-14 | 2012-10-26 | Portola Pharm Inc | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
| EP2414517B1 (en) | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| JP6163304B2 (ja) | 2009-07-15 | 2017-07-12 | ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 第Ｘａ因子インヒビターの解毒剤の単位用量処方物およびその使用方法 |
| EP2316931B1 (de) * | 2009-10-30 | 2016-12-28 | Senova Gesellschaft für Biowissenschaft und Technik mbH | Polymergekoppelte Peptidasen |
| TWI513466B (zh) | 2010-01-20 | 2015-12-21 | Boehringer Ingelheim Int | 抗凝血劑解毒劑 |
| AP2013007046A0 (en) | 2011-03-30 | 2013-08-31 | Boehringer Ingelheim Int | Anticoagulant antidotes |
| JP6640198B2 (ja) | 2014-05-26 | 2020-02-05 | アカデ−ミッシュ ズィーケンハウス ライデンＡｃａｄｅｍｉｓｃｈ Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ Ｌｅｉｄｅｎ | 出血治療のための止血促進タンパク質 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4203965A1 (de) * | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren |
-
1996
- 1996-02-12 DE DE19605126A patent/DE19605126A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-11 IL IL12507797A patent/IL125077A0/xx unknown
- 1997-02-11 KR KR1019980706212A patent/KR19990082479A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 WO PCT/EP1997/000612 patent/WO1997029198A1/de not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 BR BR9707280A patent/BR9707280A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 CZ CZ982477A patent/CZ247798A3/cs unknown
- 1997-02-11 CO CO97006960A patent/CO4600682A1/es unknown
- 1997-02-11 EP EP97903254A patent/EP0880591A1/de not_active Withdrawn
- 1997-02-11 AU AU17684/97A patent/AU1768497A/en not_active Abandoned
- 1997-02-11 CN CN97192210A patent/CN1211280A/zh active Pending
- 1997-02-11 HU HU9900574A patent/HUP9900574A2/hu unknown
- 1997-02-11 HR HR19605126.6A patent/HRP970077A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1997-02-11 ZA ZA971107A patent/ZA971107B/xx unknown
- 1997-02-11 JP JP9528173A patent/JPH11512621A/ja active Pending
- 1997-02-11 CA CA002245546A patent/CA2245546A1/en not_active Abandoned
- 1997-02-11 US US09/117,708 patent/US6060300A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-12 AR ARP970100548A patent/AR005797A1/es unknown
-
1998
- 1998-08-11 NO NO983677A patent/NO983677D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AR005797A1 (es) | 1999-07-14 |
| IL125077A0 (en) | 1999-01-26 |
| CO4600682A1 (es) | 1998-05-08 |
| HRP970077A2 (en) | 1998-04-30 |
| HUP9900574A2 (hu) | 1999-06-28 |
| US6060300A (en) | 2000-05-09 |
| AU1768497A (en) | 1997-08-28 |
| EP0880591A1 (de) | 1998-12-02 |
| CN1211280A (zh) | 1999-03-17 |
| ZA971107B (en) | 1998-08-11 |
| BR9707280A (pt) | 1999-07-20 |
| JPH11512621A (ja) | 1999-11-02 |
| KR19990082479A (ko) | 1999-11-25 |
| NO983677L (no) | 1998-08-11 |
| WO1997029198A1 (de) | 1997-08-14 |
| NO983677D0 (no) | 1998-08-11 |
| CA2245546A1 (en) | 1997-08-14 |
| DE19605126A1 (de) | 1997-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100537770C (zh) | 酶切范威尔邦德因子(vWF)的蛋白酶 | |
| CZ298298B6 (cs) | Analogy faktoru X s modifikovanými štepnými místyproteas, preparáty tyto látky obsahující, jejich použití a zpusob jejich výroby | |
| KR20010031370A (ko) | 변형된 비타민 ｋ-의존성 폴리펩티드 | |
| MX2011001351A (es) | Anticuerpos monoclonales contra el inhibidor de la via del factor tisular. | |
| NO175066B (no) | DNA-konstruksjon, plasmid og fremgangsmåte for ekspresjon av faktor VII og IX aktiviteter i pattedyrceller | |
| CZ286046B6 (cs) | Přípravky na bázi analogů erythropoietinu a způsoby jejich přípravy a farmaceutické přípravky s jejich obsahem | |
| JPH05508150A (ja) | 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 | |
| CZ247798A3 (cs) | Thrombinové mutace a jejich použití | |
| CZ298296B6 (cs) | Delecní mutanty faktoru X a jejich analogy | |
| KR100983878B1 (ko) | 유전자 재조합 기술에 의한 인간 트롬빈 제조 방법 | |
| JPH04505554A (ja) | 可溶性トロンボモジュリン類似体 | |
| RU2183214C2 (ru) | Природный и рекомбинантный ингибиторы тромбина, их получение и применение | |
| AU741798B2 (en) | Recombinant protein C and protein S variants | |
| WO2007040162A1 (ja) | 培養細胞による組換えヒトトロンビンの製造方法 | |
| Sinha et al. | Expression, purification, and characterization of inactive human coagulation factor Xa (Asn322Ala419) | |
| US20150337284A1 (en) | Factor ix variants | |
| JPH11341990A (ja) | 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法 | |
| BLOM et al. | Intracellular coupling of bikunin and the heavy chain of rat pre-α-inhibitor in COS-1 cells | |
| US8088372B2 (en) | Thrombin mutant | |
| Miyata et al. | Chemical cross-linking of activated coagulation factor VII with soluble tissue factor: calcium ions are not essential for full amidolytic activity of the factor VIIa-tissue factor complex after complex formation | |
| KR20000047835A (ko) | 혈액 응고 인자 및 ｐ-셀렉틴의 ｄｎａ 작제물 | |
| Stenberg | Expression and characterization of a recombinant human factor x/protein c chimeric protein | |
| Côté | Studies of structure-function relationships in two human coagulation proteins: factor XII and prothrombin | |
| CZ20004422A3 (cs) | Polypeptid lidský protein C | |
| MXPA99007768A (en) | Factor x analogues with a modified protease cleavage site |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |