NO175066B - DNA-konstruksjon, plasmid og fremgangsmåte for ekspresjon av faktor VII og IX aktiviteter i pattedyrceller - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en DNA konstruksjon,

hvor nukleotidsekvensen i det minste delvis koder for faktor VII, et rekombinant plasmid med evne til integrering i pattedyrs-vertscellers DNA, pattedyrceller transformert med dette,

og en fremgangsmåte for fremstilling av et protein med biologisk aktivitet i blodkoagulering bevirket av faktor Vila.

Blodkoagulering er en prosess som består av et komplekst samvirke av forskjellige blodkomponenter eller faktorer som eventuelt gir opphav til en fibrinklump. Generelt er blod-komponentene som deltar i det som har vært kalt koagulerings "kaskaden" proenzymer eller zymogener, enzymatisk inaktive proteiner som overføres til proteolytiske enzymer ved påvirkning av en aktivator, i seg selv en aktivert klumpningsfaktor. Koaguleringsfaktorer som har gjennomgått en slik omdannelse kalles generelt "aktiverte faktorer" og er betegnet ved tillegg av en lav "a" (f.eks. Vila) etterpå.

Det er to separate systemer som kan bevirke blodkoagulering og derved delta i normal hemostase. Disse systemer har vært kalt indre og utenforliggende koaguleringsbaner. Den indre bane vedrører slike reaksjoner som fører til trombindannelse gjennom anvendelse av faktorer som bare foreligger i plasma.

Et mellomtrinn i den iboende bane er aktiveringen av faktor IX til faktor IXa, en reaksjon katalysert av faktor Xla og kalsiumioner. Faktor IXa deltar da i aktiveringen av faktor X i nærvær av faktor Villa, fosfolipid og kalsiumioner. Den utvendige bane innbefatter plasmafaktorer samt komponenter som foreligger i vevsekstrakter. Faktor VII, et av proenzymene som er nevnt ovenfor, deltar i den indre bane av blodkoagulering ved å overføre (etter aktivering til Vila) faktor X til Xa i nærvær av vevfaktor og kalsiumioner. Faktor Xa overfører så igjen protrombin til trombin i nærvær av faktor Va, kalsiumioner og fosfolipid. På grunn av aktiveringen av faktor X til faktor Xa deles et trinn av både den indre og utvendige bane, faktor Vila kan brukes for behandling av pasienter med mangel av eller inhibitorer for faktor VIII (Thomas, U.S.patent 4.382.083).

Det foreligger også indikasjoner på at faktor Vila kan delta i den indre bane også (Zur og Nemerson, J. Biol. Chem. 253: 2203-2209, 1978) ved å spille en rolle i aktiveringen av faktor IX.

Eksperimentell analyse har vist at humanfaktor VII er et enkjedet glycoprotein med en molekylvekt på ca. 50.000 dalton.

I denne form sirkulerer faktoren i blodet som et inaktivt zymogen. Aktivering av faktor VII til Vila kan katalyseres av flere forskjellige plasmaproteaser såsom faktor Xlla. Aktivering av faktor VII fører til dannelsen av to polypeptid kjeder, en tung kjede (Mr = 28.000) og en lett kjede (kr = 17.000) holdt sammen av minst en disulfidbinding. Faktor VII kan også aktiveres til Vila in vitro, f.eks. ved metoden som er beskrevet av Thomas i US patent nr. 4.456.591.

Faktor IX sirkulerer i blodet som et enkjedet forstadium med molekylvekt 57.000 og overføres_til en aktiv serinprotease (faktor IXa) etter spaltning med faktor Xla i nærvær av faktor VIII. Faktor IXa består av en kort kjede og en lang kjede med molekylvekter henholdsvis 16.000 og 29.000.

Nåværende behandlingspraksis for pasienter med koagulerings-forstyrrelser (f.eks. mangler på faktor VIII og IX) medfører generelt erstatningsterapi med kryoprecipitat eller andre fraksjoner av humant plasma som inneholder anrikede mengder av en spesiell faktor. Disse preparater er tidligere oppnådd fra sammenslått human plasma, selv om fremstillingen av kryoprecipi-tater krever anvendelse av en relativ stor mengde human plasma som utgangsmateriale.

Terapeutiske anvendelser av faktor VII er be-

handling av individer med mangel på faktor VII, samt faktor VIII-og faktor IX-manglende befolkninger, og individer med

Von Willebrands sykdom. Særlig individer som mottar faktorer VIII og IX i erstatningsterapi, utvikler ofte antistoffer mot disse proteiner. Vedvarende behandling blir for vanskelig på grunn av at disse antistoffer er tilstede. Pasienter som lider av dette problemet behandles normalt med aktivert protrombin kompleks som er kjent å bestå av en blanding av aktive og inaktive klumpningsproteiner innbefattet faktor Vila. Videre viser nyere undersøkelser at små mengder (40-50 mikrogram) injisert faktor Vila er effektiv ved behandling av alvorlig vedvarende blødningstilfeller hos faktor VIII fattig pasienter med store mengder antistoff i blodet sitt (Hedner og Kisiel,

J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983).

På grunn av de forskjellige plasmakilder som brukes i fremstillingen av kryoprecipitatene, er det vanskelig å undersøke preparatene for å sikre at de er fri for virusinnblanding. F.eks. viser nesten alle recipienter av kryoprecipitat et positivt resultat gulsot. Nyere rapporter har også vist at noen blødere som får kreopresipitat har utviklet tilegnet immun-mangelsystem (AIDS). I tillegg er rensningen av store mengder av disse faktorer ekstremt vanskelig og kostbar.

Følgelig foreligger et behov på området for en fremgangsmåte ved fremstillingen av relativt store mengder rene preparater av faktorene Vila og faktor IX. Foreliggende oppfinnelse oppfyller dette behov ved anvendelse av rekombinant DNA teknologi, som med hell unngår problemet viruskontanimasjon og samtidig gir en vedvarende og homogen kilde for aktiv faktor Vila for å behandle faktor VIII og faktor IX manglende pasienter og individer med Von Willebrands sykdom, samt gir en kilde til renset faktor IX for bruk i erstatningsterapi.

I henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter en DNA konstruksjon en første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område, koblet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens, hvilken andre sekvens koder for et katalytisk område for serin-proteaseaktivitet av faktor Vila, idet de sammenkoblede sekvenser koder for et protein som etter aktivering har samme eller i det vesentlige samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor Vila. Den første nukleotidsekvens kan i det vesentlige være tilsvarende, et gen som koder for faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C, protrombin eller protein S. Videre kan det første nukleotid også kode for et lederpeptid tilsvarende respektive gen.

Spesielt kan den første nukleotidsekvens stamme fra et genomisk klon eller cDNA-klon for faktor VII, og kan kode for lederpeptidet og amino-endedelen av faktor VII. Den første nukleotidsekvens kan også inneholde et dobbeltkjedet oligonukleotid. En spesielt foretrukket første nukleotidsekvens er den som koder for lederpeptidet og amino-endedelen av faktor

IX.

I tillegg omfatter foreliggende oppfinnelse rekombinante plasmider som er istand til integrering i pattedyrsverts-cellers DNA. Plasmidene inneholder ifølge oppfinnelsen en promotor etterfulgt nedstrøms av ovenfor nevnte DNA-konstruksjon. Dette kan medføre et sett RNA spleisingspunkter, idet RNA spleisingspunktene nedstrøms etterfølges av en nukleotidsekvens som koder for i det minste delvis faktor VII. Nukleotidsekvensen omfatter en første nukleotidsekvens som koder for kalsiumbindende område knyttet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens. Den andre nukleotidsekvens koder for et katalytisk område for serinproteaseaktiviteten til faktor Vila. De sammenknyttede sekvenser koder for et protein som etter aktivering har i det vesentlige samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor Vila. Nukleotidsekvensen etterfølges så nedstrøms av et polyadenyleringssignal.

Videre kan RNA spleisingspunktene nedstrøms etterfølges av en nukleotidsekvens som koder i det minste delvis for faktor IX. Nukleotidsekvensen omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område knyttet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens. Den andre nukleotidsekvens koder for et katalytisk område for serinproteaseaktiviteten til faktor IX. De sammenknyttede sekvenser koder for et protein med hovedsakelig samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor IX. Nukleotidsekvensen følges så nedstrøms av et polyadenyleringssignal.

Dertil omfatter oppfinnelsen pattedyrceller som er stabilt transformert for å produsere et protein med hovedsakelig den samme biologiske aktivitet etter aktivering som faktor Vila. Cellene transformeres med en DNA konstruksjon inneholdende en nukleotidsekvens som i det minste delvis koder for faktor VII. Nukleotidseksevensene omfatter enn første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område knyttet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for en første sekvens. Den andre nukleotidsekvens koder for et katalytisk område for serinproteaseaktiviteten til faktor Vila. De sammenkoblede sekvenser koder for et protein som, etter aktivering, har hovedsakelig den samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor Vila.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen beskriver pattedyrceller som er stabilt transfektert til å produsere protein med hovedsakelig den samme biologiske aktivitet som faktor IX. Cellene transfekteres med en DNA-konstruksjon som inneholder en nukleotidsekvens som koder for i det minste delvis faktor IX. Nukleotidsekvensen omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område knyttet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens. Den andre nukleotidsekvens koder for et katalytisk område for serinproteaseaktiviteten til faktor IX. De sammenkoblede sekvenser koder for et protein med hovedsakelig den samme biologiske aktivitet for blodkoagulering som faktor IX.

Foreliggende oppfinnelse gir videre en fremgangsmåte for å fremstille et protein med biologisk aktivitet for blod-koagulasjon som bevirkes av faktor Vila ved å frembringe en pattedyrvertscelle som inneholder en DNA-konstruksjon som inneholder en nukleotidsekvens som koder i det minste delvis for faktor VII. Nukleotidsekvensen omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område knyttet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens. Den andre sekvens koder for et katalytisk område for serinproteaseaktiviteten til faktor Vila. De sammenkoblede sekvenser koder for et protein som etter aktivering har hovedsakelig den samme biologiske aktivitet for blodkoagulering som faktor Vila. Deretter dyrkes pattedyrsverten i et passende medium, og proteinproduktet som er kodet for av DNA-konstruksjonen og fremstilt av pattedyrvertscellen isoleres. Proteinproduktet aktiveres så til et protein som har den samme eller i det vesentlige samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor Vila.

Derunder omfatter oppfinnelsen fremstilling av et protein med biologisk aktivitet i blodkoagulering bevirket av faktor

IX. Fremgangsmåten omfatter etablering av en pattedyrvertscelle som inneholder en DNA-konstruksjon som inneholder en nukleotidsekvens som koder i det minste delvis for faktor IX. Nukleotidsekvensen omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område knyttet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens. Den andre nukleotidsekvens koder for et katalytisk område for serinproteaseaktiviteten til faktor IX. De sammenkoblede sekvenser koder for et protein med hovedsakelig samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor IX. Pattedyrvertscellen dyrkes så i et passende medium, og proteinproduktet som kodes for av pattedyrvertscellen isoleres. Proteinproduktet fremstilt ved metodene som er beskrevet ovenfor er også omfattet.

Videre kan med fordel en DNA-konstruksjon omfatte en DNA-sekvens som koder for faktor VII. I en foretrukket utførel-sesform omfatter DNA-sekvensen cDNA-sekvensen i fig. lb fra bp 36 til bp 1433. I en annen foretrukket utførelsesform omfatter DNA-sekvensen cDNA-sekvensen på fig. lb fra bp 36 til bp 99, etterfulgt nedstrøms av sekvensen fra bp 166 til bp 1433. Rekombinante plasmider som er istand til integrering i patte-dyrvertscellers DNA omfattende DNA-sekvensene beskrevet umiddelbart ovenfor, er også omfattet.

Pattedyrceller som er stabilt transfektert med et rekombinant plasmid omfattende en DNA-sekvens som koder for faktor VII er også omfattet. I foretrukne utførelsesformer omfatter DNA-sekvensen cDNA-sekvensen på fig. lb fra bp 36 til bp 1433, eller cDNA-sekvensen på fig. lb fra bp 36 til bp 99 etterfulgt nedstrøms av sekvensen fra bp 166 til 1433.

En fremgangsmåte for å fremstille et protein med biologisk aktivitet i blodkoagulering bevirket av faktor Vila ved å etablere en pattedyrvertscelle som inneholder en DNA-konstruksjon som beskrevet ovenfor er også omfattet. Pattedyr-vertscellen dyrkes så i et egnet medium, og proteinproduktet som DNA-konstruksjonen koder for, isoleres. Proteinproduktet aktiveres så til å gi faktor Vila.

Andre aspekter av oppfinnelsen vil bli klare etter henviF-ning til den følgende detaljerte beskrivelse av vedlagte teg-ninger.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. la illustrerer den partielle faktor VII cDNA sekvens som fremstilles ved å koble deler av cDNA klonene XVII2115 og AVII1923. Fig. lb illustrerer faktor VII cDNA sekvensen av AVII2463. Pilene viser delesjonsgraden i sekvensen AVII565. Tallene over sekvensen angir aminosyrer. Tall under angir nukleotider. Fig. 2a illustrerer aminosyresekvensen til aminoendeområdene av flere klumpningsfaktorer. Fig. 2b illustrerer en sammenligning av aminosyresekvensen til faktor VII oppnådd fra proteinsekvensering med den som kodes av cDNA'et. Fig. 3 illustrerer koblingen av faktor IX ledersekvenser til en sekvens som koder for et samstemmighets-kalsiumbindingsområde. Fig. 4 illustrerer koblingen av faktor IX-samstemmighets-sekvenshybridene til et partielt faktor VII cDNA som gir en i-rairane kodesekvens. Fig. 5 illustrerer konstruksjonen av et plasmid som inneholder en kodesekvens for ét faktor IX/faktor VII fusjonsprotein. Fig. 6 illustrerer ekspresjonsvektoren FIX/VII/pD2. Brukte symboler er Ad2 MLP, den vesentlige sLste promotor fra adenovirus 2; Ll-3, adenovirus 2 tripartit ledersekvensene; 5'ss, 5<1> spleisingspunkt; 3' ss, 3' spleisingspunkt, og pA, det siste polyadenyleringssignal fra SV40. Fig. 7 illustrerer nukleotidsekvensen av en faktor IX/ faktor VII cDNA fusjon. Fig. 8 illustrerer ekspresjonsvektor pM7135. Anvendte symboler er E, SV40 forsterker; ori, 0-1 kartenhetene Ad 5; pA, det tidlige polyadenyleringssignal fra SV40; A, delesjonsområdet av pBR322 "gift" sekvensene; og andre symboler som beskrevet for fig. 6. Fig. 9 illustrerer subkloningen av 2463bp faktor VII cDNA. Fig. 10 illustrerer subkloningen av 565bp faktor VII cDNA.

Fig. 11 illustrerer koblingen av 5<1> enden av pVH565 og

3' delen av pVH246 3 i pUC18 som gir pVH2397.

Fig. 12 illustrerer konstruksjonen av ekspresjonsplasmidene

FVII(246 3)/pDX og FVII(565+2463)/pDX. pA betegner polyadenyleringssignalet fra SV40 i tidlig eller sen orientering, som beskrevet i eksempel 9. Andre symboler er som beskrevet for fig.8.

Før oppfinnelsen forklares kan det være nyttig for å forstå den å angi definisjoner av visse uttrykk som skal brukes heretter .

Komplementær DNA eller cDNA: Et DNA molekyl eller en sekvens som er blitt syntetisert enzymatisk fra sekvensene som foreligger i en mRNA-mal.

DNA konstruksjon: Et DNA molekyl eller et klon av et slikt molekyl, enten enkel-eller dobbelt-kjedet, som kan isoleres i partiell form fra et naturlig forekommende gel eller som er blitt modifisert til inneholde segmenter av DNA som er kombinert eller forskjøvet på en måte som ellers ikke ville foreligge i naturen.

Plasmid eller vektor: En DNA konstruksjon som inneholder genetisk informasjon som kan sørge for sin replikering ved inn-settelse i en vertscelle. Et plasmid inneholder generelt minst en genesekvens som skal uttrykkes i vertscellen samt sekvenser som muliggjør slik genekspresjon innbefattet promotorer og transskripsjonsbegynnelsespunkter. Det kan være et lineært eller sirkulært lukket molekyl.

Koblet: DNA sekvenser sies å være koblet når 5<*> og 3' endene av en sekvens er festet ved fosfodiesterbindinger til 3' og 5' endene, henholdsvis av en tilstøtende sekvens. Kobling kan oppnås ved metoder såsom ligering av stumpe eller heftende ender, ved syntese av koblede sekvenser gjennom cDNA kloning, eller ved fjerning av mellomliggende sekvenser ved en rettet mutageneseprosess.

Lederpeptid: En aminosyresekvens som opptrer ved aminoenden til noen proteiner og generelt spaltes fra proteinet under etterfølgende behandling og utskillelse. Lederpeptidet omfatter sekvenser som sender proteinet i cellens sekresjonsbane. ^rukt her kan uttrykket "leder peptid" også bety en del av den naturlig forekommende lederpeptid.

Domene: En tredimensjonal, selvsammensettende anordning

av spesifikke aminosyrer i et proteinmolekyl som inneholder alle eller deler av de strukturelle elementer som er nødvendig for noe av dette proteinets biologiske aktivitet.

Biologisk aktivitet: En funksjon eller sett av funksjoner som utøves av et molekyl i en biologisk sammenheng (dvs. i en organisme eller en in vitro faksimile) . Biologiske aktiviteter og proteiner kan deles i katalytiske og effektor aktiviteter. Katalytiske aktiviteter av klumpingsfaktorer innbefatter generelt aktiveringen av andre faktorer gjennom den spesifikke spalting av forstadier. Effektor aktiviteter innbefatter spesifikk binding av det biologiske aktive molekyl til kalsium eller andre små molekyler, til makromolekyler såsom proteiner eller til celler. Effektor aktivitet hjelper hyppig eller er vesentlig for katalytisk aktivitet under fysiologiske betingel-ser. Katalytiske og effektor aktitiveteter kan i noen tilfeller ligge innenfor det samme domene av et protein.

For faktor Vila er biologisk aktivitet karakterisert ved bevirkning av blodkoagulering gjennom den utvendige bane. Faktor Vila aktiverer faktor X til faktor Xa som igjen overfører protrombin til trombin og derved igangsetter dannelsen av en fibrinklump. På grunn av at aktiveringen av faktor X er felles for både utvendige og innvendige baner av blodkoagulering, kan faktor Vila brukes til å behandle individer som i høy grad mangler faktor IX, faktor VIII eller Von Willebrand faktor aktiviteter.

Den biologiske aktivitet av faktor IX er karakterisert ved bevirkning av blodkoagulering gjennom den indre bane. Faktor IX aktiveres til faktor IXa av faktor Xla. Faktor IXa aktiverer så. faktor X til faktor Xa i nærvær av faktor Villa, fosfolipid og kalsiumioner. Faktor Xa virker så i overføringen av protrombin til trombin ved å igangsette dannelsen av en fibrinklump.

Som ovenfor angitt er isoleringen av faktor VII fra human plasma en tidkrevende og kostbar prosess, da faktoren er et sjeldent protein som bare er tilstede i en konsentrasjon på ca. 300 mikrogram pr. liter blod. I tillegg er det vanskelig å skille fra protrombin, faktor IX og faktor X og er ømfintlig for proteolytisk angrep under rensning (Kisiel og McMullen, ibid). Selvom enkeltkjedet human faktor VII er blitt renset frem til homogenitet (Kisiel og McMullen, ibid), er de publiserte rensemetoder generelt begrenset av lavt utbytte og/eller sammenblanding med andre koaguleringsfaktorer.

Faktorene VII og IX fremstilles i leveren og krever vitamin K for biosyntesen sin. Vitamin K er nødvendig for dannelsen av spesifikke gamma-karboksyglutaminsyrerester i faktorene. Disse uvanlige aminosyrerester som dannes ved en etter-translaterings-modifikasjon, bindes til kalsiumioner og er ansvarlige for proteinets samvirke med fosforlipid vesiklene. I tillegg inneholder faktorene VII og IX hver en 3-hydroksy-aspartinsyrerest som også dannes etter at proteinet er blitt translatert. Imid-lertid er denne aminosyrerestens rolle ikke kjent.

Med kjennskap til at aktivitetene for faktor VII og IX avhenger av etter-translasjonsmodifikasjoner som innbefatter gamma-karboksylering av spesifikke glutaminsyrerester, og også kan avhenge av hydroksyleringen av en spesifikk aspartinsyrerest, er det usannsynlig at et aktivt produkt kunne fremstilles ved kloning og ekspresjon av faktor VII og IX i en mikro-organisme .

Følgelig gir foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til fremstilling av et protein med biologisk aktivitet for blod-koagulering bevirket av faktor Vila ved bruk av stabile om-dannede pattedyrceller. I tillegg gir foreliggende oppfinnelse også en fremgangsmåte for fremstilling av et protein med biologisk aktivitet i blodkoagulering bevirket av faktor IX.

Som ovenfor angitt krever faktor VII og IX vitamin K for biosyntesen sin. I tillegg krever også plasma proteinene protrombin, faktor X, protein C og protein S vitamin K for sin biosyntese. De aminoterminale deler av disse proteiner som inneholder gamma-karboksyglutaminsyrerester er homologe i begge aminosyresekvenser og i biologisk funksjon (fig. 2a). Videre bestemmer de karboksyterminale deler av faktor VII, protrombin, faktor IX-, faktor X og protein C deres spesifikke serinprotease-funksjoner.

Faktor VII er et plasmasporprotein, og mRNA'et som koder for faktor VII antas å være sjeldent. Følgelig forblir rensing av faktor VII fra plasma i tilstrekkelig mengder til å mulig-gjøre utstrakt sekvensanalyse og karakterisering vanskelig. Nedbryting av faktor VII under rensning, selv i nærvær av proteaseinhibitorer, ble registrert av Kisiel og McMullen (ibid). På grunn av disse vanskeligheter er faktor VII dårlig karakterisert sammenlignet med andre mer utbredte bestanddeler i blod-

koaguleringssystemet. Arbeidet til Kisiel og McMullen (ibid)

ga faktisk bare sekvensinformasjon for 10 rester av hver kjede i faktor VII, og i hver sekvens var identifikasjonen av to rester tentativ. Partielle aminosyresekvensdata for kveg-faktor VII har også blitt publisert (DiScipio et al., ibid).

Den antatte sjeldenhet av faktor VII mRNA er tilskrevet mangelen på kjennskap til faktor VII genet. Hellet med kon-vensjonelle cDNA kloningsteknikker avhenger av en tilstrekkelig mengde mRNA for bruk som mal. For tidlig avslutning av revers transskripsjon fører til dannelse av cDNA kloner som mangler 5' enden, og denne tilstand forverres av lave mRNA nivåer. Forskjellige strategier for cDNA kloning av lite utbredt bud-bringer et blitt utviklet (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), men en mangel på kjennskap til aminosyresekvensen til det interessante produkt gjør det umulig å forutsi DNA sekvensen og konstruere tilsvarende oligonukleotid-prober. Selvom det kan være relativt likefrem å fremstille et partielt cDNA klon av et gen som koder for et sjeldent protein ved å anvende disse avanserte strategier, er det fortsatt ytterst vanskelig å oppnå cDNA kloner med full lengde av gener som koder for sjeldne proteiner såsom faktor VII.

Sammenlignet med faktor VII, er faktor IX et relativt utbredt protein, og sekvensen til et cDNA klon fra det menneske-lige faktor IX gen er kjent (Kurachi og Davie, Proe. Nati.

Acad. Sei. USA 79: 6461-6464, 1982; og Anson et al., EMBO J. 3: 1053-1060, 1984). Strukturen til faktor IX genet er blitt karakterisert, og aminosyresekvensen til proteinet er blitt bestemt på basis av den kjente nukleotidsekvens. Noen protein--sekvensdata er også blitt publisert for mennesker- og kveg-faktor IX og sekvensen analysert (DiScipio et al., ibid). Aminoendedelen av proteinet inneholder 12 glutaminsyrerester som overføres i A-karboksyglutaminsyre (Gla) rester i det ferdige protein. Spaltningspunktene som inngår i aktiveringen

av faktor IX er også blitt identifisert (Kurachi og Davie, ibid). En sekvens ved 5 * enden av faktor IX-cDNA klonet koder for et signalpeptid som er typisk for slike som finnes i de fleste utskilte proteiner (Kurachi og Davie, ibid). Ekspresjonen av faktor IX genet ved rekombinante DNA metoder er ikke tidligere

rapportert.

På grunn av vanskeligheten med å oppnå et cDNA klon fra faktor VII genet med full lengde, ble tre nye forsøk foretatt på å frembringe 5' enden av kodesekvensen innbefattende områder som koder for lederpeptidet. Ifølge den første metode kobles et partielt cDNA klon for faktor VII til et fragment som koder for lederpeptidet og 5' delen av faktor IX. Dette forsøk er basert på den observasjon at aminoendedelene av de to molekyler er ansvarlige for kalsiumbindingsaktiviteten til de respektive proteiner, og oppdagelsen at kalsiumbindingsaktiviteten til faktor IX kan erstatte den i faktor VII. Det resulterende polypeptid bibeholder den biologiske aktiviteten til autentisk faktor VII fordi de spesifikke serinprotease aktivitetene til koaguleringsfaktorene sitter i de karboksyterminale områder av molekylene. Det andre prinsippet kombinerer det partielle cDNA klon med en DNA sekvens som koder for lederen og aminoterminale områder av faktor VII. De partielle cDNA og aminosyresekvenser av faktor VII som her er beskrevet gjør det mulig å gjennomgå et genomisk DNA bibliotek eller cDNA bibliotek etter kloner omfattende 5' delen av faktor VII genet. Det tredje prinsipp innbefatter kobling av det partielle cDNA klon til hybrid-kodingssekvensene som omfatter et cDNA fragment som koder for lederpeptidet i faktor IX og et syntetisk gensegment som koder for et samstemmighets-kalsiumbindingsdomene eller en forven-

tet aminoterminal sekvens for faktor VII. Kodesekvensen for aminoenden av faktor VII ble fastslått ved tidligere ikke-publiserte aminosyresekvensdata som her beskrives. Samstemmighetssekvensen ble utledet fra faktor VII data og publiserte sekvensdata for andre vitamin K-avhengige plasmaproteiner.

I overensstemmelse med prinsippet som er beskrevet ovenfor for utplukking av kloner omfattende 5<1> delen av faktor VII genet greide oppfinnerne med hell å oppnå et korrekt cDNA med full lengde som er regnet for ekspresjon.

Blant cDNA klonene som ble dannet, inneholdt et klon kalt "XVII2463" den største faktor VII cDNA innskudd. Den ble funnet å inneholde hele kodesekvensen for faktor VII . Dette klonet inneholdt et 35 nukleotids 5' ikke-translatert område, 180 nukleotider som koder for en 60 -aminosyre^-leder, 1218 nukleotider som koder for det ferdige protein med 406 aminosyrer, et stoppkodon, 1026 nukleotider av 3' utranslatert sekvens, og en 20 basers poly(A) hale (som begynner i posisjon 2463). Dette cDNA har nå blitt sekvensbestemt i sin helhet på begge kjeder. En sammenligning av det med to cDNA innsatser isolert tidligere fra klonene AVII2115 og XVII1923, viste at XVII2463 inneholder på et eneste EcoRI fragment en faktor VII cDNA som koder for faktor VII leder og ferdige proteinsekvenser.

Et andre klon, AVII565, ble isolert som inneholdt en cDNA

innsats som var identisk med cDNA'et i klon AVII2463 fra nukleotid 9 til nukleotid 638, bortsett fra at det manglet nukleotider 100 til 165 (fig. lb). Ved sammenligning av cDNA<*>ene med faktor VII-genomisk DNA, tilsvarer sekvensmanglene nøyaktig et eksonlignende område. Derfor er to faktor VII cDNA1 er fremstilt som synes å reflektere alternative mRNA spleisings forløp.

Lederen som kodes for av AVII2463 er eksepsjonelt lang

(60 aminosyrer) og har en meget forskjellig hydrofobisitetsprofil sammenlignet med faktor IX, protein C og protrombin. Denne leder inneholder to "mets", i stillingene -60 og -26. Igangsettelsen begynner sannsynligvis ved det første met, da

et hydrofobt område, typisk for signalpeptider, følge met'et i posisjon -60, men ikke metet i -26. Det er interessant at den manglende sekvens i AVII565 som nøyaktig tilsvarer et eksonlignende område i det genomiske klon fører til en 38 aminosyreleder med et hydrofobisitets-mønster som er mer analogt med faktor IX, protein C og protrombin.

Siden det da ikke var klart om noen av lederne som er beskrevet ovenfor var autentiske, prøvde man et ytterligere prinsipp for å analysere 5' endesekvensen. i korthet medførte

dette prinsipp konstruksjon og utplukning av et humant genomisk DNA bibliotek, og identifiseringen av genomiske kloner omfattende faktor VII genesekvenser. 5<1> delen av genomsekvensen ble så koblet til cDNA'et for å konstruere et klon med full lengde.

I en ytterligere konstruksjon ble et 5' merket faktor VII cDNA fragment av ÅVII565 som inneholder hele lederen og 29 aminosyrer av den ferdige kodesekvens ligert til et fragment av cDNA'et til AVII2463 (inneholdende resten av det ferdige protein og 3'-ikke-translaterte sekvenser). Denne "565-2463" sekvens koder for en full-lengde faktor VII cDNA sekvens som et enkelt EcoRI fragment.

De ovenfor beskrevne DNA sekvenser innsettes så i egnet ekspresjonsvektor som igjen brukes til å transfektere en pattedyrscellelinje. Ekpresjonsvektorer for bruk under utførelsen av foreliggende oppfinnelse vil omfatte en promotor som er i stand til å dirigere transkripsjon av et fremmed gen i en transfektert pattedyrscelle. Virale promotorer foretrekkes på grunn av deres effektivitet ved dirigering av transskripsjon. En spesielt foretrukket slik promotor er den hovedsakelige :siste promotor fra adenovirus 2. Slike ekspresjonsvektorer vil også inneholde et sett RNA spleisepunkter som befinner seg nedstrøms fra promotoren og oppstrøms fra innsetningspunktet for et gen som koder for et protein med biologisk aktivitet for blodkoagulering. Foretrukne RNA spleisepunktsekvenser kan oppnås fra adenovirus og/eller immunoglobulin gener. Ekspresjonsvektorene inneholder også et polyadenyleringssignal som befinner seg ned-strøms for innsetningspunktet. Virale polyadenyleringssignaler foretrekkes, såsom tidlig eller sene polyadenyleringssignaler fra SV40 eller polyadenyleringssignalet fra adenovirus 5:EIb området. I en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter ekspresjonsvektoren også en viral ledersekvens såsom adenovirus 2 tripartitt leder som befinner seg mellom promotoren og RNA spleisingspunktene. Foretrukne vektorer kan også inneholde forsterkersekvenser såsom SV40 forsterkeren.

Klonede DNA sekvenser kan så innføres i dyrkede pattedyrceller ved kalsiumfosfatbevirket transfeksjon. (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Et presipitat dannes fra DNA'et og kalsiumfosfatet, og dette presipitat tilføres cellene. En del av cellene tar opp DNA"et og holder det inne i cellen i flere dager. En liten del av cellene (typisk 10 -4) integrerer DNA'et stabilt i genomet. For å iden-tifisere disse stabile integranter, innføres et gen som gir en selekterbar fenotype (en selekterbar markør) generelt sammen med det interessante gen. Foretrukne selekterbare markører er gener som gir resistens mot droger såsom G-418 og metotreksat. Selekterbare markører kan innføres i cellen på et separat plasmid på samme tid som det interessante gen eller de kan innføres på det samme plasmid. En foretrukket selekterbar markør er genet for resistens mot drogen G-418, som bæres på plasmidet pKO-neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341, 1982). Det kan også være en fordel å tilsette ytterligere DNA kjent som "bærer DNA" til blandingen som innføres i cellene. Etter at cellene har tatt opp DNA<1>et, får de vokse i et tidsrom, typisk 1-2 dager, for å begynne å uttrykke det interessante gen. Drogeseleksjonen anvendes så for å selektere for veksten av celler som uttrykker den selekterbare markør på stabil måte. Kloner av slike celler kan utplukkes etter ekspresjon av proteinet av interesse.

Faktor VII og faktor IX fremstilt av de transfekterte celler kan fjernes fra cellekulturmediet ved adsorpsjon til barium--citrat. Brukt medium blandes med natriumcitrat og bariumklorid, og fellingen oppsamles. Det utfelte materialet kan så måles med hensyn til nærvær av den tilsvarende klumpingsfaktor. Videre kan rensing oppnås ved immunoadsorpsjon. Det foretrekkes at immunoadsorpsjonkolonnen omfatter et høyspesifitets-monoklonalt antistoff. Alternativt kan rensing av bariumcitrat utfelt materiale utføres ved mer vanlige biokjemiske metoder eller ved

HPLC.

Overføring av enkelt-kjedet faktor VII til aktiv to-kjedet faktor Vila kan utføres ved å bruke faktor Xlla som beskrevet av Hedner og Kisiel (J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983) eller ved andre proteaser med trypsin-lignende spesifitet (Kisiel og Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983).

Sammenfattet gir foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved fremstilling av proteiner med aktiviteten til vitamin K-avhengige blodkoaguleringsfaktorer ved bruk av transfekterte pattedyrsceller. Genesekvenser som koder for de spesifikke ; serinproteasedomener av koaguleringsfaktorene isoleres fra cDNA bibliotek. Sekvenser som koder for lederpeptider og kalsium-bindingsdomener isoleres fra cDNA eller genomiske biblioteker eller konstrueres fra syntetiserte oligonukleotider. Sekvensene kobles så i en tilsvarende ekspresjonsvektor, slik at de koder for et protein med den ønskede biologiske aktivitet i blodkoagulering. Den resulterende vektor og et plasmid som inneholder en drogeresistens markør co-transfekteres i tilsvarende pattedyrsvevkulturceller. Transfekterte celler kan så selekteres ved tilsetning av den tilsvarende droge såsom G-418. Proteinproduktene renses så fra cellevekstmediene og måles med hensyn til biologiske aktivitet i en blodkoaguleringsmåling og for immunologisk kryss-reaktivitet ved bruk av antistoffer fremstilt mot autentiske human klumpningsfaktorer.

For å sammenfatte eksemplene som følger, vedrører eksempel

1 kloningen av en cDNA sekvens med full lengde for faktor VII. Eksempel 2 vedrører en partiell aminosyresekvens av human faktor VII som inneholder sekvensen med ca. 30 aminosyrer ved aminoenden. Eksempel 3 beskriver konstruksjon og utprøving av et humant genomisk DNA bibliotek og identifisering av genomiske kloner omfattende faktor VII genesekvenser. Eksempel 4 beskriver konstruksjonen av to hybridgenesegmenter, som hver omfatter et cDNA fragment som koder for lederpeptidet til faktor VII og et syntetisert dobbeltkjedet fragment som koder for et samstemmighets-kalsiumbindingsområde. Hybridsekvensene kobles så til partielle cDNA kloner av faktor VII. Ved å bruke in vitro mutagenese ble samstemmighetssekvensen så forandret til å

stemme overens med proteinsekvensdata for faktor VIT. Eksempel 5 beskriver konstruksjonen av en genesekvens som koder for et fusjonsprotein omfattende kalsiumbindingsområde til faktor IX

og det spesifikke serinproteaseområdet til faktor VII. Eksempel 6 beskriver konstruksjonen av vektoren pD2 for bruk ved ekspresjon av proteiner med biologisk aktivitet for blodkoagulering i transfektertepattedyrsceller. Genefunksjonen som er beskrevet i eksempel 5 uttrykkes ved bruk av denne vektor. Eksempel 7 beskriver bruken av vektor pD2 til å uttrykke et gen for faktor IX i en transfektert pattedyrscellelinje. Eksempel 8 beskriver konstruksjonen av vektoren pM7135, som inneholder DNA sekvenser som koder for et primært translasjonsprodukt og omfattende ledersekvensen av faktor IX sammensmeltet med faktor VII. Denne vektor kan brukes til å produsere et protein med aktiviteten til faktor VII i en transfektert pattedyrscellelinje. Eksempel 9 beskriver ekspresjonen av faktor VII ved bruk av cDNA sekvensene, og ekspresjon av faktor VII fra en genomisk-cDNA hybrid sekvens.

De følgende eksempler er gitt som illustrering av oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Restriksjonsenzymene erholdtes fra Bethesda Research Laboratories (BRL) og New England Biolabs og ble brukt som angitt av fabrikanten med mindre annet er angitt. Oligonukleotider ble syntetisert på en Applied Biosystems Model 380 A DNA syntetisator og renset ved polyakrylamidgelelektroforese på denaturerende geler. E. coli celler ble transformert som beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). M13 og pUC klo-ningsvektorer og vertsstammer erholdtes av BRL. Faktor VII ble fremstilt fra human plasma som beskrevet av Kisiel og McMullen (ibid).

Eksempel 1: Kloning av et partielt faktor VII cDNA.

A. Konstruksjon av et human lever cDNA bibliotek.

Et cDNA bibliotek ble fremstilt fra human lever mRNA ved fremgangsmåten til Chandra et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80: 1845-1848, 1983. cDNA preparatet ble sedimentert gjennom en alkalisk sukrose gradient (Monahan et al., Biochemistry 15: 223-233, 1976) og fraksjoner som inneholder typer av større enn ca. 1000 nukleotider ble slått sammen. Det første kjedepreparat ble gjort dobbeltkjedet ved bruk av revers transskriptase (Chandra et al., 1983), behandlet med Sl nuklease og de reste-rende innbyrdes forskjøvne ender fylt i ved bruk av DNA polymerase I (Klenow Fragment) i nærvær av alle fire deoksyribo-nukleotid trifosfater (Maniatis et al., Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Det stumpendede cDNA ble behandlet med Eco RI metylase og ligert til fosforylert Eco RI bindere ved bruk av T. DNA ligase (Maniatis et al., ibid). Det ligerte DNA preparat ble uttømmen-de spaltet med Eco RI for å fjerne overskudd bindersekvenser og større dobbelt-kjedede DNA<*>er enn ca. 1000 basepar i lengde ble renset ved nøytral sukrosegradient sentrifugering (Maniatis et al., ibid). Opprinnelig Agtll DNA ble ligert til conkate-mere, spaltet fullstendig med Eco RI, og de 5' terminale fos-fater ble fjernet ved behandling med bakteriell alkalisk fosfatase. Det sammenslåtte menneskelever cDNA ble ligert med fag DNA'et, pakket in vitro (Maniatis et al., ibid), og brukt til å infisere E. coli Y1088 (Young og Davis, Science, 222: 778-782, 1983). Ca. 14 x 10 primære fagplaquer ble dannet i dette biblioteket satt sammen av syv biblioteker på - 2 x 10 plaquer hver. Mer enn 90% av disse var rekombinanter som inneholdt human DNA innsatser basert på deres mangel på 8-galakto-sidaseaktivitet og karakterisert ved 20 statistiske kloner av Eco RI spaltning etterfulgt av agarosegel elektroforese. cDNA biblioteket i form av fagpartiklene ble renset ved cesium klorid gradientsentrifugering og lagret i SM buffer (Maniatis et al., ibid).

B. Søking av menneskelever cDNA biblioteket etter faktor VII kloner.

Human lever ekspresjons cDNA biblioteket som er beskrevet ovenfor ble søkt etter spesifikt antigen (Young og Davis, ibid)

125

ved bruk av I-merket monoklonalt faktor VII antistoff fremstilt ved metoden til Brown et al. (J. Biol.Chem. 225: 4980-4 983, 1980) ved bruk av renset faktor VII. Søking av 6 x IO<6 >fagplaquer ga et isolat kalt XVII2115, som ga en posisitiv reaksjon med antistoffet.

Fagklonet XVII2115 ble prøvet mot to andre antifaktor VII monoklonale antistoffer og et polyklonalt kanin antistoff mot faktor VII. Isolatet XVII2115 ga en positiv reaksjon på alle disse antifaktor VII antistoffer.

DNA ble fremstilt fra et platelysat (Maniatis et al., pp. 65-66, 1982) av XVII2115. Spalting av dette DNA med Eco RI frigjorde et innskuddpå 2139 basepar. Denne innsats ble subklonet i M13 fagvektorer (Messing, Meth. in Enzymology-101: 20-77, 1983; og Norrander et al., Gene 26: 101-106, 1983) for kjedeavslutnings-dideoksy-DNA sekvensering (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74: 5463-5476, 1977). Dette cDNA innskudd inneholder Pst I punkter i stillingene 214, 839 og 1205 (kalt Pst Ia, Pst Ib og Pst Ic, henholdsvis i fig. la) og et Sma I punkt i stilling 611. De følgende M13 maler ble sekvensbestemt.

1) Full-lengde (2139 baser) Eco Ria -> Eco RIb fragment i

M13mpl8 (kalt klon F7-1);

2) Pst Ia -> Eco Ria 214 base-fragment i Ml3mpl9 (F7-2):,

3) Pst Ia - > Pst Ib 625 base-fragment i Ml3mpl8 (F7-3) ; 4) Pst lb - > Pst la 625 base-fragment i M13mpl8 (F7-7) ; 5) Sma I -> Pst lb 228 base-fragment i M13mpl0 (F7-8); 6) Pst lb -> Pst Ic 366 base-fragment i Ml3mpl8 (F7-9); 7) Pst Ic -> Pst Ib 366 base-fragment i M13mpl8 (F7-10);

8) Pst Ic -> Eco RIb 930 base-fragment i Ml3mpl9 (F7-11); og

9) Eco RIb -> Eco Ria full-lengde fragment i M13mpl8 (F7-12)

(restriksjonspunkt betegnelser refererer til fig. la).

Dataene bekreftet sekvensen på begge kjeder for 91% av kodeområdet og 15% av det 3' ikke-kodende området og ga enkelt-kjede-sekvensinformasjon for de gjenværende 9% av kodeområdet og 85% av ikke-kodeområdet.

Sammenligning av den antatte aminosyresekvens ut fra cDNA sekvensen med de kjente aminosyresekvensdata fra Kisiel og McMullen (Thrombosis Research 22: 375, 1981) og aminosyresekvensen som er vist nedenunder (eksempel 2) viste en anomali som kunne forklares ved mangelen på tre nukleotider i DNA sekvensen nær stilling 400. For å oppnå ytterligere sekvensdata ble XVII2115 spaltet med Eco RI, og faktor VII kodefragmentet ble innsatt i pUC 13 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982;

og Messing, ibid) som var blitt spaltet med Eco RI. Det resulterende rekombinante plasmid kalt pUCVH2115, ble spaltet med Xba I som kapper i stilling 328. Den spaltede prøve ble delt

32

i to halvdeler: halvdelen ble merket med a P dCTP og DNA polymerase I (Klenow fragment)(Englund, P.T., J. Mol. Bio. 66: 209,

32

1972); den andre halvdel ble merket med y P ATP og polynukleotid kinase (Chaconas et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 66: 962, 1975). De merkede plasmider ble så kuttet på nytt med Pst I og ga 113 og 509 baseparfragmenter. Begge kjeder av hver av disse ble sekvensbestemt ved metoden til Maxam og Gilbert (Meth. in Enzymology 74: 560, 1980). 113 Baseparfragmenter ble sekvensbestemt i sin helhet og 210 basepar av 509 baseparfragmenter ble sekvensbestemt. Disse sekvenser viste tre ytterligere baser

(en C og to G<*>er) som ga DNA sekvensdatene i overensstemmelse med proteinsekvensdataene og viste at de tidligere unormale resultater stammer fra kompresjoner på sekvensbestemmelses-delen på grunn av sekundær struktur inneholdende G'er og C'er. Sekvensen til de siste 9% av kodeområdet for begge kjeder ble også bekreftet.

Videre analyse av sekvensen til pUCVII2115 innsatsen bekreftet at en dal av dette klonede fragment kodet for en sekvens på II aminosyrer som var kjent for å være ved spaltingspunktet av faktor VII (Kisiel og McMullen, Thrombosis Research 22: 375, 1981). Sammenligning av denne sekvens med faktor IX (Davie et al., ibid) og faktor X (Leytus et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81: 3699-3702, 1984) aminosyresekvenser tydet på at klonet inneholdt sekvensen for faktor VII som begynner ved (omtrentlig) nukleotider som koder for aminosyre 36 av det ferdige faktor VII protein og fortsetter gjennom ca. 1000 kodende og 1100 ikke-kodende nukleotider og poly A sekvens. I tillegg ble det funnet at dette klonet hadde rammeskift mutasjoner i 3' kodedelen.

For å oppnå det korrekte 3' kodeområdet ble alle 14 millioner kloner fra de syv Xgtll cDNA biblioteket undersøkt ved plaquehybridisering (Benton og David,- Science 196: 180-181, 1977) med hakk-translatert cDNA fra XVII2115 (Maniatis et al., pp. 109-112, 1982).

Syv positive isolater ble så avsøkt ved dideoksy sekvensbestemmelse av pUC plasmider hvori cDNA innsatsene var blitt subklonet (Wallace et al., Gene 16: 21, 1981). Xgtll klonene ble spaltet med Eco RI og faktor VII fragmentene ble satt inn i pUC13 som var blitt spaltet med Eco RI. Alle unntatt et av disse ble funnet å starte i en stilling tilsvarende base 212 av innsatsen i XVII2115; det eneste unntak bestod bare av 3' ikke-kode sekvensen. En av klonene som startet i base 212 ble selektert for analyse og ble kalt klon pUCVII1923.

Fordi analyse av pUCVH2115 tydet på rammeskift mutasjoner mellom stillingene 657 og 815 ble pUCVII1923 først analysert i dette området ved Maxam-Gilbert sekvensbestemmelse. Plasmid pUCVII1923 ble spaltet med Nar I (stilling 779 i fig. la). Det

32

kappede DNA ble merket med a P dCTP ved bruk av DNA polymerase I (Klenow fragment) og deretter spaltet med Ava I (som spalter ved samme punkt som Sma I i fig. I) og Taq I (punkt ved 1059) og ga et Nar I-Ava I 166 bp fragment bg et 200 bp Nar I-Taq I fragment. Hvert av disse ble sekvensbestemt. En C som mi.ngler i pUCVII2115 ble funnet i stilling 697 og en annen C som også mangler i pUCVH2115 ble funnet i stilling 798.

Resten av sekvensen til kodeområdet fra pUCVII1923 ble vist å være riktig ved sekvensbestemmelse ved dideoksy metoden på et M13 subklon av hele innsatsen av pUCVII1923. Lac primeren ZC87 (tabell 1) ble brukt til å sekvensbestemme fra posisjon 212

(fig. la) til 512; primer ZC218 (CTCTGCCTGCCGAAC) ble brukt til å sekvensbestemme fra 715 til 1140 og primeren ZC217 (ATGAGAA-GCGCACGAAG) ble brukt for å sekvensbestemme fra 720 til 350.

Da pUCVII2115 innsatsen er korrekt fra posisjon 13 (posisjonene 1-12 inneholder en kunstig binder) til 695 og pUVCII1923 er korrekt fra posisjon 212 til enden, ble de to spleiset sammen og ga et korrekt molekyl fra posisjon 13 (fig. la) til enden.

Et hensiktsmessig brukt punkt for denne spleising er Xba I punktet i posisjon 328. Sekvensen av det riktige spleisede molekyl er vist i fig. la.

Fordi et faktor VII klon med full lengde var vanskelig å oppnå ved cDNA kloning, ble tre strategier anvendt for å få

den manglende kodesekvens og de nødvendige oppstrøms behandlings-og signalsekvenser. Den første strategi var å oppnå den nødven-dige sekvens fra et genomisk menneske DNA bibliotek eller ved ytterligere undersøkelser av cDNA biblioteker. Det andre prinsipp var å syntetisere den nødvendige 5' kodingssekvens basert på aminosyresekvensdata for faktor VII (eksempel 2) og de publiserte sekvenser for genene som koder for vitamin K-avhengige klumpningsfaktorer (Kurachi og Davie, ibid; og Davie et al., ibid), og koble dette til en del av preprosekvensen av faktor IX. Den tredje strategi baserer seg på den funksjonelle homo-logien til aminoendeområdene av faktor VII og faktor IX. Det ble konstruert en sekvens som omfattet kodingsområdene for lederen og aminoendedelen av faktor IX. Denne ble så sammenført i riktig orientering med det partielle faktor VII cDNA.

For å oppnå DNA sekvenser som omfatter hele DNA sekvensen til faktor VII, ble et forsøk foretatt på å isolere den gjenværende 5' DNA sekvens. Dette ble utført ved å anvende det 5<* >terminale 0,3 kb EcoRI-Xbal fragment fra cDNA innsatsen av A.VII2115 for å undersøke et cDNA bibliotek omfattende 2 x 10 fager. Dette bibliotek ble konstruert ved bruk av poly(A) mRNA fra Hepij2 celler etter tilpasning av metoden til Gubler og Hoffman (Gene 25: 263-269, 1983). RNA ble reverst transskribert og ga første kjede cDNA etterfulgt av andre kjede syntese ved bruk av DNA polymerase I og RNase H. Etter EcoRI metylering og gjennomløp av en sefarose 6B kolonne, ble DNA endene avstum-pet med T^DNA polymerase. EcoRI bindere ble tilsatt og overskudd hindere ble fjernet ved spaltning med EcoRI og kromato-grafi på sefarose CL 2B. DNA'et i det tomme volum ble samlet og ligert til Xgtll som var blitt spaltet med Eco RI og behandlet med kalvetarmsfosfatase. DNA'et ble pakket og infisert i E. coli Y1088. Flere positiver ble påvist, og EcoRI fragmentene ble så subklonet i Ml3 fagvektorer for dideoksy sekvensbestemmelse ved bruk av enten M13 universal primer eller faktor VII spesifikke oligonukleotider.

Fra disse fikk man tre nye cDNA kloner av faktor VII, og deres sekvenser ble bestemt fullstendig. Den største av disse cDNA'er fra et klon kalt XVII246 3, ble funnet å inneholde hele kodesekvensen for faktor VII. Dette klon inneholdt et 35 nukleotid 5<1> ikke-translatert område, 180 nukleotider som koder for en 60 aminosyreleder, 1218 nukleotider som koder for det ferdige protein med 406 aminosyrer, et stoppkodon, 1026 nukleotider av 3' ikke-translatert sekvens, og en 20 basers poly(A)hale (som begynner ved posisjon 246 3). Dette cDNA har nå blitt sekvensbestemt i sin helhet på begge kjeder. En sammenligning av det med to cDNA'er isolert tidligere fra klonene XVII2115 og XVII1923 viste at klon XVII246 3 inneholder ytterligere 321 nukleotider oppstrøms for innsatsen i XVII2115 og 519 nukleotider oppstrøms for innsatsen i XVII1923. De overlappende faktor VII sekvenser av XVII246 3 og disse to tidligere cDNA'er stemmer overens, bortsett fra at cDNA fra XVII2463 ikke inneholder enkeltbasedelesjoner ved posisjonene 1005 og 1106, som ble påvist i cDNA'et av XVII2115. Således inneholder XVII2463 et eneste EcoRI fragment, et faktor VII cDNA som koder for faktor VII leder og ferdig proteinsekvenser.

Et ytterligere cDNA, XVII565, ble isolert og funnet å inneholde 5<1> terminale faktor VII sekvenser, men var avskåret i kodesekvensene. Dets 5' endekart ved nukleotid 9 (fig. lb).

Sammenlignet med XVII2463 med full lengde ble XVII565 funnet å mangle en sekvens som svarer til et eksonlignende område i ledersekvensen. Basene 100-165 mangler i XVII565 (fig. lb). De manglende sekvenser tilsvarer nøyaktig et eksonlignende område ved sammenligning med genomiske sekvensdata (som beskrevet i eksempel III). Således kan XVII565 strukturen være en følge av alternative spleisingsforløp i ledersekvensen.

Lederen som kodes av XVII2463 er eksepsjonelt lang (60 aminosyrer) og har en meget forskjellig hydrofobisitetsprofil sammenlignet med faktor IX, protein C og protrombin. Denne leder inneholder to mets i stillingene -60 og -26. Oppstarting begynner sannsynligvis ved det første met , da et hydrofobt område som er typisk for signalpeptider følger metten ved stilling -60, men ikke met'en ved -26. Det er interessant at de manglende sekvenser i AVII565, som nøyaktig tilsvarer et eksonlignende område i det genomiske klon, fører til en 38 aminosyre leder med et hydrofobisitetsmønster som er mer analogt de ovenfor nevnte proteiner.

Eksempel 2: Aminosyresekvens av human faktor VII

Oppklaringen av aminosyresekvensen til human faktor VII var ønsket for å bekrefte identiteten av antatte cDNA kloner, underbygge sekvensen av faktor VII cDNA, gi informasjon som muliggjør syntese av spesifikke oligonukleotidprober for å undersøke cDNA og genomiske biblioteker etter kloner som inneholder 5' sekvensen, og å konstruere et syntetisk fragment som koder for den aminoterminale del av faktor VII. Selvom begren-sede aminosyresekvenser forelå fra Kisiel og McMullen (ibid), trengtes mer informasjon.

Renset human faktor Vila (Kisiel og McMullen, ibid) ble redusert og karboksymetylert ved fremgangsmåten til Crestfield et al., J. Biol. Chem. 238: 622, 1963. De korte og lange polypeptidkjeder av karboksymetylert faktor Vila ble adskilt ved HPLC på en Micro Pak C18 reversfasekolonne (Varian Corp.) ved å danne en gradient av 0,1% TFA i destillert vann (A) og 0. 1% TFA i acetonitril (B) fra 0-40% B i 5 minutter, 40-80% B

i 25 minutter og 80-100% B i 5 minutter. Ca. 300 picomol av hver peptidkjede ble analysert ved automatisert Edman nedbrytning ved bruk av gassfase protein sekvensanalysator (Applied Biosystems, Inc.). 18 og 29 rester ble identifisert ved aminoendene av de korte og lange polypeptidkjeder henholdsvis. Aminoender.ekvensen til den lange kjede av faktor Vila var i overensstemmelse med det som ble kodet av cDNA klon pUCVII2115 (fig. 2b). Aminosyrerester betegnes på fig. 2a og 2b med en bokstavskode som følger: A, alanin; C, cystein; D, aspartin-syre; E, glutaminsyre; F, fenylalanin; G, glycin; H, histidin; 1, isoleucin; K, lysin; L, leucin; M, metionin; N, asparagin; P, prolin; Q, glutamin; R, arginin; S, serine; T, treonin;

V, valin; W, tryptofan; Y, tyrosin; X angir en ukjent rest

og x angir at Gla resten (y) ble tillagt homologi med strukturen til andre kjente klumpingsfaktorer og ved mangel på enhver annen fenyltiohydantoin-aminosyre i disse stillinger. Gapene (-) er plassert for å gi den beste innretning mellom sekvensene. I tillegg viste informasjonen at aminosyrene i stillingene 5 og var lysiner og ikke treonin og arginin, henholdsvis som tidligere angitt (Kisiel og McMullen, ibid). Sekvensanalysene av den korte kjede i faktor Vila, som stammer fra aminoendeområdet til faktor VII, er avkortet med ca. 6 rester for å overlappe med strukturen som kodes for av 5' enden av cDNA klon pUCVIl2115.

For å oppnå ytterligere sekvensdata ble to nanomol av den korte karboksymetylerte kjede spaltet i 12 timer med kveg-kymotropsin (1:100 vektforhold, enzym: substrat) i 0,1 M ammo-nium bikarbonat, pH 7,8, ved 37°C. De dannede fragmenter ble renset ved HPLC på en Micro Pak C18 reverse fasekolonne ved bruk av de ovennevnte løsningsmidler i en gradient av 0-30%

B i 5 minutter, 30-60% B i 25 minutter og 60-80% B i 10 minutter. Peptidene ble identifisert ved sin U.V. absorpsjon ved 220 og 280 nm. Frysetørkede peptider (ca. 1 nanomol hver) ble analysert ved Edman nedbrytning. Resultatene (fig. 2b) bekreftet meget av cDNA sekvensen i det tilsvarende området av klon PUCVII2115. Tilsammen ble 113 av 152 rester (75%) av den korte peptidkjeden til faktor VIIaidentifisert. Denne sekvens er identisk med den som kodes for av den kjente cDNA struktur. Indirekte beviser tyder på at Asn 145 er et punkt for karbohyd-rat tilknytning.

Eksempel 3: Kloning av den genomiske faktor VII sekvens.

Som et forsøk på å få 5' endesekvensen som mangler i cDNA'et ble et lambda fag bibliotek inneholdende human fetal lever DNA (Lawn et al., cell 15: 1157-1174)undersøkt med hakk-translatert faktor VII cDNA. En del av det genomiske bibliotek ble plettert på E. coli LE392 (ATCC 33572) og ga tilsammen 7,2 x IO<6> plaquer (Maniatis et al., ibid, pp. 320-321). Fag-plaquene ble adsorbert fra platene på nitrocellulose og hybridisert med <32>P-merket cDNA ifølge fremgangsmåten til Benton og Davis (Science 196: 180, 1977). Åtte kloner ble oppnådd og plaque renset.

Ved å bruke et DNA fragment (Eco RIa-Xba I, fig. 1) fra 5' enden av faktor VII cDNA (XVII2115) og standard teknikker (Maniatis et al., ibid) ble slike genomiske kloner som inneholdt 5<*> endesekvenser identifisert. Disse fager ble kalt 7ml, 7m2 og 7m3. DNA ble fremstilt fra disse rekombinante fager og foreløpig restriksjonsendonukleasekart utledet. Fag 7ml, som ga det sterkeste hybridiseringssignal, ble brukt til å fremstille et mer utstrakt restriksjonskart og å plassere Eco RI-Xba I cDNA sekvensene på dette kart ved Southern blotting (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975).

For å bestemme om fag 7ml inneholdt DNA sekvensene som koder for de aminoterminale aminosyrer i faktor VII proteinet, ble Southern blots av fag DNA restriksjonsspaltninger hybridisert med blandinger av oligonukleotider hvis sekvenser var utledet fra faktor VII aminoterminale aminosyresekvenser. Oligonukleotidene ZC188, ZC360 og ZC401 (tabell 1) ble radioaktivt merket med T4 polynukleotid kinase og hybridisert til fag DNA blots ved noen få grader Celsius under deres Tm (Wallace, R. B., et al., Nuc. Acids Res. 6: 3543-3557, 1979). Resultatene av denne analysen viste at et 3,7 kb Sst I fragment av 7ml inneholdt sekvenser som hybridiserte til disse oligonukleotider. Dette Sst I fragment ble subklonet i Ml3 for DNA sekvensanalyse. Oppnådde resultater ved bruk av ZC360 som sekvenseringsprimer viste et område ca. 60 nukleotider langt som tilsvarte de aminoterminale proteinsekvensdata.

Da genomisk klon 7ml ble kjent å inneholde 7kb sekvenser oppstrøms for exon 2, ble dette klon forventet å kode for faktor VII 5' ikke-translaterte sekvenser, og ledersekvenser opptil aminosyreposisjon -17. For å bekrefte at exon 1 ble kodet innenfor genomisk klon 7ml, ble ledersekvensinformasjonen fra klonene XVII2463 og XVII565 brukt til å konstruere oligonukleotidene ZC528 og ZC529 (vist nedenunder).

Disse ble brukt til å undersøke 7ml DNA, og et subklon, 7SD, ble funnet som hybridiserte til begge oligonukleotider. Exon 1 ble funnet å være sammensatt av to exoniske sekvenser: exon la, som hybridiserte til ZC528 (tilsvarende nukleotider 1 til 30

i XVII2463), og exon lb, som hybridiserte til ZC528 (tilsvarende nukleotider 119 til 148 i XVII2463). Intronsekvensen som flankerer begge exoner la og lb er blitt sekvensbestemt: la inneholder en samstemmighets spleisedonorsekvens ved 3' enden av exonet og lb er flankert på hver ende med en samstemmighets spleiseakseptor (oppstrøms for lb) eller donor (nedstrøms for lb) sekvens. Posisjonen til exon la i det genomiske klon 7ml er nøyaktig kartlagt, mens tilsvarende for exon lb er kartlagt innenfor et definert område. Exon lb sekvenser foreligger i XVII246 3, mens XVII565 viser seg å stamme fra RNA spleiset mellom exon la og exon 2 og lager utvendig sløyfe av lb exon sekvensen.

En rekke 7ml subkloner i pUC og Ml3 vektorer ble fremstilt for å lette sekvensbestemmelsen av gjenværende exoner. Tilsvarende oligonukleotider konstruert fra cDNA sekvensene, som svarer til exonene 1 til og med 7, ble brukt til å sekvensbestemme alle unntatt siste exon. Den genomiske sekvens tilsvarer nøyaktig cDNA sekvensene gjennom disse områder. I tillegg er intron/exon grensene for exonene 1 til 7 blitt bestemt, og de fleste er nå nøyaktig kartlagt innenfor klon 7ml. Intron-størrelser og posisjon i faktor VII genet er oppført i tabell 2.

Fag 7ml var kjent å mangle faktor VII 3' enden som inneholder exon 8. For å oppnå disse sekvenser ble et 12-13 Kb-anriket Barn HI bibliotek i XL47.1 (Loenen og Brammer, Gene 10: 249, 1980; Maniatis, et al., ibid.), utledet fra humane primære hudfibroblastceller undersøkt med hakk-translaterte faktor VII cDNA Pstl fragmenter (tilsvarende sekvenser i exon 7 og 3' ikke-translaterte sekvenser). Et klon kalt 7DC1 ble påvist med begge prober. Etterfølgende restriksjonsendonuklease og Southern blot analyse fastslo at klonet 7DC1 overlapper med og strekker seg ca. 3 Kb forbi enden av klonet 7ml, og at det inneholder exon 8. 3,9 Kb (Xbal-BamHI) fragmentet fra 7DC1 DNA som inneholder exon 8 ble subklonet i M13 og sekvensanalyse ble utført ved bruk av komplementære oligonukleotider til dets 5' og 3' ender. Hele exonsekvensen foreligger i dette klon.

Eksempel 4: Faktor IX- faktor VII- hybrid gener inneholdende en syntetisert kodingssekvens.

A. Konstruksjon av en hybrid faktor IX leder-syntetisk faktor VII 5' kodende sekvens.

Det andre alternativ for å oppnå den 5' kodende sekvens for faktor VII var syntese av et tilsvarende dobbelt-kjedet fragment ved bruk av en nukleotid sekvens som var forutsagt på grunnlag av aminoendene-aminosyresekvensen til faktor VII, aminosyre-sekvensene til andre vitamin K-avhengige klumpningsfaktorer,

og de kjente nukleotidsekvenser fra andre vitamin K-avhengige klumpningsfaktorgener (Kurachi og Davie, ibid; Anson et al., EMBO J. 3: 1053-1060, 1984; og Davie et al., ibid). For å få de

nødvendige utskillelses- og behandlingssignaler for utskillelse av en ferdig faktor VII analog, ble dette syntetiske fragment (samstemmighetssekvensene) koblet til en av to ledersekvenser som stammet fra et faktor IX cDNA klon. Denne strategi er vist i fig. 3.

Et cDNA som koder for human faktor IX ble fremstilt fra et bibliotek laget med mRNA fra menneskelever (Kurachi og Davie, ibid). Faktor IX sekvensene ble isolert fra pBR322 vektoren

ved spaltning med Pst I og ble innsatt i Pst I punktet av pUC13. Dette plasmid ble kalt FIX-pUC13. For å fjerne det G-rike området som forelå ved 5 * enden av faktor IX innsatsen som et resultat av cDNA kloning, anvendtes en syntetisk oligonukleotid-adaptor i stedet for 5<*> enden av det klonede fragment. Oligonukleotider ZC212 og ZC213 (tabell 1) ble syntetisert og tilkoblet og ga en 22 basepar overlapping, fragmentene ble fylt opp og kappet med tilsvarende restriksjons endonukleaser, og det resulterende fragment ble koblet til faktor IX sekvensen.

For å konstruere adaptoren ble 100 pmol av ZC212 og ZC213 hver frysetørket og gjenoppslemmet i 10 ul 10x kinase/ligase buffer (600 mM Tris pH 8,9, 100 mM MgCl2, 100 nM DTT) pluss 86 yl H20. Koblingsreaksjonen ble kjørt ved 65°C i 10 minutter. Blandingen ble langsomt avkjølt til romtemperatur og satt på is. Denne blandingen ble tilsatt 4 yl 2,5 mM dNTP blanding og 1 yl

(8 enheter) T4 DNA polymerase. Reaksjonen fikk forløpe 45 minutter ved 14°C. Ti yl 5 M NH40Ac ble deretter tilsatt, og DNA'et ble ekstrahert 1 gang med fenol/CHCl3, to ganger med CHCl^ og ble felt med etanol. DNA'et ble sentrifugert og gjenoppslemmet i 100 yl medium salt buffer (Maniatis et al., ibid, s.100 ) spaltet med 9 enheter Pst I og 8 enheter Cfo I og ekstrahert som ovenfor.

Den modifiserte faktor IX sekvens ble så konstruert ved

å kombinere 0,16 pmol av det syntetiske Pst I-Cfo I adaptor fragment, 0,14 pmol av et 1,4 kb Cfo I-Bam HI faktor IX fragment fra FIX-pUCl3, og 0,14 pmol av et 2,7 kb Barn HI-Pst I pUC13 vektor fragment i en 20 <y>l reaksjonsblanding 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mMDTT og 0,9 enheter T4 ligaser. Reaksjonsblandingen ble inkubert 3 timer ved romtemperatur og brukt til å transformere kompetente E. coli JM83 (Messing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH Publication No. 79-99,

2, nr. 2, 43-48, 1979). Cellene ble plettert med 50 yl av 2% X-gal (5 brom-4-klor-3-indolyl-g-D-galaktosid) på L-medium inneholdende 40 yg/ml ampicillin og inkubert ved 37°C natten over. Hvite kolonier ble plukket på en annen plate inneholdende ampicillin og dyrket ved 37°C natten over. Koloniene ble plottet på Whatman 540 papir og papiret forberedt for hybridisering ifølge fremgangsmåten til Wallace et al. (Gene 16: 21, 19 81), unntatt at inkuberingen natten over på kloramfenikolplater ble utelatt. Papirene ble inkubert ved 44°C i to timer i 0,9 M NaCl, 0,09M Tris-HCl pH 7,5, 6 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40,

150 yg/ml E. coli tRNA. Papirene ble undersøkt med <32>P-merket ZC235 (tabell 1), en 14-mer som er spesifikk for den forandrede 5' endesekvens. Hybridisering med 1-2 x 10^ cpm pr. filter ble utført ved 44°C i forhybridiseringsbufferen natten over. Filtrene ble så vasket tre ganger i 6 x SSC, 0,1% SDS ved 4°C og 3 ganger i 2 x SSC, 0,1% SDS ved 44°C og eksponert på røntgen-film. To positive kloner ble oppnådd. En av disse kloner ble kalt FIX (-G) -> pUC13.

For å bekrefte sekvensen av det forandrede området til faktor IX delen av FIX(-G) -> pUC13 konstruksjonen, ble dideoksy sekvensbestemmelse utført direkte på pUC plasmidet ved bruk av BRL revers primer ved anvendelse av metoden til Wallace et al., 1981 (ibid) ved bruk av en primer som var endemerket med poly-32

nukleotid kinase og y P ATP ved fremgangsmåten til Chaconas et al. (ibid). Sekvensen var som forventet.

Det resulterende rekombinante plasmid inneholder tre Hae III spaltningspunkter, det første i stilling 39 i faktor IX sekvensen (nummereringen bygger på den publiserte sekvensen til Anson et al.(ibid), som begynner ved første ATG), den andre ved posisjon 130, og en tredje i pUC13 polybinderen. Punktet 130

er et enkelt basepar oppstrøms fra kodonene for Lys-Arg behand-lingspunktet til prepro faktor IX molekyler. I de siste faktor IX-faktor VII hybridkonstruksjoner, ble faktor IX ledersekvensen som sluttet ved posisjon 39 eller 130 koblet til et syntetisk dobbelt-kjedet fragment omfattende den forutsagte samstemmighets-frekvens og de siste tre kodoner av faktor IX ledersekvensen.

Det syntetiske samstemmighetsfragment ble fremstilt ved å koble oligonukleotidene ZC286-ZC289 (tabell 1) og danne et dobbelt-kjedet fragment. Et hundre pmol av hvert oligonukleotid ble frysetørket og gjenoppslemmet i 20 ul lx kinase buffer og inkubert natten over ved 4°C; og deretter oppvarmet ved 65°C i 10 minutter. To pøler ble laget ved å bruke de kinasebehandlede oligonukleotider. Pøl 1 inneholdt ZC286 + ZC287; pøl 2 inneholdt ZC288 + ZC289. De sammenslåtte par ble koblet 10 minutter ved 65°C, deretter avkjølt til romtemperatur over et tidsrom på to timer og plassert på is i 30 minutter.

Det modifiserte faktor IX fragment ble fjernet fra

FIX(-G) -> pUC13 som et Hind III-Eco RI fragment. Ca. 20 ug plasmid ble spaltet med 30 enheter av Hind III og Eco RI hver i 100 ul Hind III buffer (BRL) inneholdende 4 ug RNase A ved 37°C natten over. Reaksjonen ble avsluttet ved å oppvarme ved 65°C i 10 minutter, og vektoren og faktor IX fragmentene ble elektroforisert på en 1% agarosegel og renset ved elektroeluering. Faktor IX fragmentet ble utfelt med etanol, gjenoppslemmet i buffer inneholdende 400 ng/ulRNase A, og spaltet med 9 enheter Hae III natten over ved 37°C. Hind III-Hae III 39 basepar faktor IX fragmentet ble isolert fra dette spaltnings-produkt ved elektroforese på en 1,5% agarosegel etterfulgt av elektroeluering. For å oppnå Hind III-Hae III 130 basepar faktor IX fragmentet, ble FIX-pUC13 spaltet med Eco RI og Hind III og faktor IX fragmentet isolert som ovenfor, ca. 3 ug av dette Hind III-Eco RI fragment ble spaltet med 6 enheter Hae III ved 37°C og alikvoter ble fjernet med 5 minutters mellomrom over 30 minutter til en løsning inneholdende 50 mM EDTA. Ali-kvotene ble slått sammen og Hind III-Hae III 130 basepar fragmentet ble renset ved elektroforese på en 5% akrylamidgel etterfulgt av elektroeluering.

De endelige faktor IX-samstemmighetssekvens hybrider ble fremstiltved å skjøte i en firedelt ligering oligonukleotid-pølene 1 og 2, faktor IX Hind III-Hae III (39 eller 130 basepar) og pUC13 Hind III-Eco RI. De resulterende plasmider ble brukt til å transformere E. coli HB101 (ATCC 33694). Kolonier ble undersøkt ved spaltning av DNA med Eco RI og Hind III. Sekvensen som omfatter den 39 basepars faktor IX sekvens koblet tilden syntetiske samstemmighetssekvens kalles heretter mini-FIX-FVII. Plasmidet som inneholder denne konstruksjonen ble kalt ■ pM7200(-C). Sekvensen som omfattet 130 basepars faktor IX sekvensen koblet til den syntetiske samstemmighetssekvens kalles maxi-FIX-FVII. Plasmidet som inneholder denne konstruksjon ble kalt pM7100(-C). Samstemmighetssekvensen koder for et polypeptid omfattende aminosyresekvensen Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-Gla-Gla-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-Gla-Arg-Gla-Cys-Lys-Gla-Gln-Cys-Ser-Phe-Gla-Gla-Ala-Arg-Gla-Ile-Phe-Gla-Gly-Leu-Asn-Arg-Thr-Lys-Leu.

B. Kobling av faktor IX-samstemmighetssekvens hybrid fragment til faktor VII cDNA klon.

Faktor IX-samstemmighetssekvens hybridene (enten mini eller maxi) ble knyttet til 5' delen av faktor VII cDNA og vektoren pUC13 i en tredelt ligering (fig. 4 og 5). Vektorfragmentet ble fremstilt ved å spalte 6 ug pUC13 med 10 enheter av Xba I og Hind III hver i Hind III buffer inneholdende RNase A (400 ng/<y>l). Mini-FIX-FVII fragmentet ble fremstilt ved å spalte 2 ug pM7200(-C) med 10 enheter hver av Hind III og Eco RI som ovenfor. Maxi-FIX-FVII fragmentet ble lignende fremstilt fra pM7100(-C). 5' Delen av faktor VII cDNA ble fremstilt fra et plasmid (PUCG705) omfattende Eco RI-Xba I 5' fragmentet av pUCVII2115 subklonet i pUC13 ved spaltning med Xba I og Eco RI. Spaltnin-ger ble utført ved 37°C i 2 timer, og produktene ble skilt ved elektroforese på en 1,5% agarosegel. De ønskede fragmenter ble elektroeluert, ekstrahert med fenol/CHCl^ og CHCl^ og utfelt med etanol. De tre fragmenter, pUC13/Xba I-Hind III, faktor IX-faktor VII (mini eller maxi)/Hind III-Eco RI, og 5" faktor VIl/Eco RI-Xba I ble så ligert i 20 yl ligase buffer inneholdende 2 <y>l 20 mM ATP og 0,9 enheter T4 DNA ligase natten over ved 4°C. Koloniene ble undersøkt ved restriksjonsanalyse med Hind III og Xba I. De rekombinante plasmider som inneholdt mini- og maxi-FIX-FVII sekvensene ble kalt pM7200 og henholdsvis pM7100 (fig. 4).

På grunn av bindetilsetningen som brukes ved fremstillingen av faktor VII cDNA måtte modifikasjoner foretas i fusjonssekven-sene for å få riktige kodesekvenser i ramme. Både mini- og maxi-fusjoner inneholder et Eco RI punkt ved skjøten mellom faktor IX-samstemmighetssekvens hybrid og faktor VII cDNA som er en artifakt av cDNA kloningsprosessen. I tillegg krever mini-fusjonen tilsetning av en C for å forandre sekvensen ved Hae III 51 3' 5 • 3 •

punktet fra AGGCCA til AGGCCCA og fastslå den korrekte leseramme nedstrøms for denne sekvens. Disse korreksjoner ble foretatt ved oligonukleotidrettet punktspesifikk mutagenese,

i det vesentlige som beskrevet for to-primer metoden av Zoller og Smith (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). Mini-FIX-FVII fragmentet ble fjernet fra pM7200 ved spalting med Hind III og Xba I og innsatt i M13mpl9. Maxi-FIX-FVII fragmentet ble renset fra pM7100 og subklonet på lignende måte. De mutagene primere ZC333 og ZC336 (se tabell 1) ble brukt til å fjerne Eco RI punktet og henholdsvis baseinnsatsen. I begge tilfeller ble den universale primer ZC87 brukt som den andre primer. De mutagene primere ble fosforylert ved å kombinere 40 pmol primer og 60 pmol ATP med 1 enhet T^ DNA kinase natten over ved 60°C. For å fjerne Eco RI punktet fra maxi-FIX-FVII hybridet, ble 1 ug av den M13 enkelt-kjedede mal kombinert med 20 pmol hver av ZC333 og ZC87 i et samlet volum på 10 VI. Primerne ble skjøtt til malen i 10 minutter ved 6 5°C, avkjølt til romtemperatur i 5 minutter, og deretter plassert på is i 5 minutter. Primeren ble forlenget ved bruk av DNA polymerase I (Klenow fragment). For å fjerne Eco RI punktet og korrigere leserammen i mini-FIX-FVII hybridet, ble 1 ug av den tilsvarende M13 enkelt-kjedede mal kombinert med 20 pmol hver av ZC333, ZC336 og ZC87. Skjøte-og primer-forlengelsesreaksjoner ble utført som beskrevet ovenfor. Plaquehevelser ble undersøkt med <32>P-merket primer

(ZC333 eller ZC336) ved 60°C og sekvensene bekreftet ved dideoksy sekvensbestemmelse. Resulterende konstruksjoner omfattende maxi- og mini-FIX-FVII sekvensene ble kalt henholdsvis pM7111

og pM7211.

Samstemmighetssekvensen inneholder flere områder som ikke er i overensstemmelse med proteinsekvensdata oppnådd for faktor VII (fig. 2). For å fremstille en sekvens som koder for et polypeptid med større homologi med den aminoterminale del av faktor VII, ble samstemmighetssekvensen endret ved oligonukleotidrettet punktspesifikk mutagenese. De foretatte forandringer var innsetningen av Leu ^ posisjon 8, erstatning med Ile i stedet for Lys i posisjon 18 (tallene refererer til aminosyreposi-sjonen etter innsatsen i posisjon 8), Asn i stedet for Ala i posisjon 26 og sekvensen Ala-Ser-Asp i stedet for Gly-Leu-Asn i stillingene 32-34 (basert på foreløpige aminosyresekvensdata).

Sekvensforandringene i stillingene 8 og 18 ble foretatt

ved bruk av pM7111 (følekjede) som mal. Primerne ZC352

51 3' S1

( CCC AGG TCT CAG CTC CTC CAG ) og ZC353 ( CTG CTC CTC CTT

ACA CTC TCT 3 1) ble skj øtt til malen og forlenget som beskrevet ovenfor. Det resulterende fagklon ble kalt pM7114. Sekvensen av innsatsen i pM7114 ble bekreftet ved dieoksy sekvensbestemmelse .

På lignende måte ble forandringene i posisjonen 26-34 foretatt på pM7114 malen (følekjede) ved bruk av den mutagene

5'

primer ZC366 ( CAG CTT CGT CCT GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG

31

GGC CTC CTC GAA ) og ZC87 (tabell 1) som andre primer. Den resulterende konstruksjonen ble kalt pM7115. Sekvensen av hele 550 bp innsatsen i Ml3 vektoren ble bestemt ved dideoksy sekvensbestemmelse og funnet å være korrekt.

Eksempel 5: Konstruksjon av faktor IX- faktor VII cDNA fusjon.

Faktor IX-faktor VII cDNA fusjonen ble fremstilt ved å anvende faktor IX cDNA fremstilt fra et menneskelever cDNA bibliotek som beskrevet av Kurachi og Davie (ibid) og faktor VII cDNA sekvensen beskrevet i eksempel 1.

Det valgte fusjonspunkt for hybridproteinet var mellom aminosyre +38 (treonin) i faktor IX og det første lysin kodet av faktor VII cDNA sekvensen. Et slikt protein ville kodes for av en sekvens bestående av de første 252 bp av faktor IX cDNA sekvensen og hele pUCVII2115 faktor VII cDNA sekvensen unntatt de første tc kodoner. For å konstruere denne hybridsekvensen ble faktor IX sekvensen først fusjonert med pUCVH2115 ved bruk av de vanlige restriksjonspunkter. Denne fusjonen førte til plasmidet FIX/VII/12 (beskrevet nedenfor) som inneholder de første 310 bp av faktor IX cDNA koblet til hele faktor VII cDNA sekvensen. For å oppnå den nøyaktige ønskede skjøt for hybridproteinet ble forstyrrende basepar fjernet ved oligonukleotidrettet mutagenese.

Kobling av faktor IX cDNA sekvensen til faktor VII cDNA sekvensen ble utført ved å ligere et 0,3 kb Hind III-Aha III fragment av FIX (-G) -<>> pUC13 (eksempel 4) til et 4,7 kb Sma I-Hind III fragment fra pUCVII2115 (fig. 5). Hind III-Aha III fragmentet ble fremstilt ved å spalte 3 yg FIX(-G) -> pUC13 med 40 enheter Hind III i 40 yl medium saltbuffer (Maniatis et al., ibid ) ved 37°C i 4 timer. Volumet ble så øket til 100 yl medium saltbuffer, og 5 enheter Aha III ble tilsatt og 37°C inkuberingen fortsatte i 18 timer. DNA fragmentene ble skilt ved elektroforese i 1% agarose og 0,3 kb båndet isolert som beskrevet ovenfor. En Sma I partiell spaltning av pUCVII2115 ble oppnådd ved å inkubere 3 ug pUCVII2115 ved 25°C i 1 time med 4,8 enheter Sma I i et reaksjonsvolum på 30 yl. Reaksjonen ble stoppet ved en 15-minutters inkubasjon ved 65°C. Prøven ble så ekstrahert en gang med samme volum fenol og etanol utfelt.

Fellingen ble oppsamlet ved en 10-minutts mikrofugespinning, renset med 70% etanol og lufttørket. DNA'et ble gjenoppløst i 30 yl medium saltbuffer og spaltet med 30 enheter Hind III ved 37°C i 3 timer. DNA<1>et ble underkastet elektroforese i 0,7% agarose, og 4,7 kb Hind III-Sma I fragment isolert som beskrevet ovenfor. Ekvimolare mengder av de to fragmenter (0,048 pmol) ble ligert i en 10 yl reaksjonsblanding inneholdende 50 mM Tris-CH1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP, og 3 enheter T4

DNA ligase ved 14 C i 3,5 timer og deretter brukt til å transformere kompetente E. coli RRI (ATCC 31343). Cellene ble dyrket på ampicillinplater og 12 av de resulterende kolonier ble under-søkt ved restriksjonsenzymspaltning for nærvær av den ønskede plasmid konstruksjon. DNA fra koloni 12 (FIX/VII/12) ga det forventede restriksjonsenzymspaltningsmønster og ble brukt i det neste trinn av hybridgenekonstruksjonen.

Den oligonukleotidrettede mutageneseprosedyre ble utført

på en enkjedet DNA mal. Således var det nødvendig å klone de fusjonerte faktor IX/faktor VII sekvenser i M13mpl9. For å oppnå et tilstrekkelig lite DNA fragment, ble et 640 bp Hind III-Xba I fragment isolert fra FIX/VII/12. Dette fragment inneholder 310 bp av 5' enden til faktor IX cDNA og 330 bp av faktor VII sekvensen. Vektoren ble fremstilt ved å spalte 1 yg av M13mpl9 RF DNA med 20 enheter Hind III og 20 enheter Xba I i 40 yl medium saltbuffer ved 37°C i 18 timer. DNA'et ble underkastet elektroforese i .1,2% agarose, og det lineære 6,4 kb fragment isolert fra gelen som beskrevet ovenfor. Fem yg FIX/VII/12 DNA ble spaltet med 10 enheter Xba I i 40 yl medium saltbuffer ved 37°C i 18 timer. 20 Enheter Hind III ble tilsatt og spaltningen fortsatte ved 37°C i 7 ytterligere timer.

De resulterende fragmenter ble skilt ved elektroforese i 1,2% agarose og 640 bp fragmentet eluert som ovenfor. Ti ng linæari-sert Ml3mpl9 og 1 ng av 640 bp fragmentet ble ligert ved 14°C i 1 time og deretter brukt til å transformere kompetente E. coli JM101 (Messing, Meth. in Enzymology, ibid). Cellene ble plettert med X-gal og IPTG (Messing, Meth. in Enzymology, ibid) og åtte lyseblå plaquer ble utplukket og brukt til å infisere 2,5 ml kulturer av E. coli JM10 3 på AgQQ = 0,3. Etter 18 timers vekst ved 37°C ble cellene høstet ved sentrifugering i en klinisk sentrifuge ved romtemperatur, og 20 yl av supernatanten som inneholder Ml3 fagen ble blandet med 10 yg/1 etidiumbromid.

Ved sammenligning med kjente standarder hadde hver av de åtte kloner en innsats på omtrent den riktige størrelse. Enkelt-kjedet DNA ble så fremstilt ved 1,5 ml av supernatanten som beskrevet av Messing (Meth. in Enzymology, ibid). Denne konstruksjonen ble så sekvensbestemt ved dideoksy metoden ved bruk av

oligonukleotidet ZC87 som en primer for å bekrefte at innset-ningsskjøten var korrekt. En av de korrekte kloner (#4) ble brukt som en mal i oligonukleotidrettet mutagenese for å fremstille en funksjonell faktor IX-faktor VII fusjon.

Oligonukleotidet ZC249, en 20-mer bestående av 10 bp av den ønskede faktor IX sekvens og 10 bp av den ønskede faktor VII sekvens (tabell 1) ble brukt som mutagen primer. Oligonukleotidet ZC87, som hybridiserer til M31mpl9 sekvensen, ble brukt som den andre primer.

Mutagenese metoden som ble brukt var modifisert fra Zoller og Smith (ibid). For koblingsreaksjonen ble 20 pmol ZC249 fosforylert ved å inkubere natten over ved 4°C i 20 yl 60 mM Tris-HCl pH 8,9, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 enhet T4 kinase. Reaksjonen ble stoppet ved inkubering ved 65°C i 15 minutter, og prøven ble frysetørket. Et pmol enkelt-kjedet klon #4 mal og 20 pmol ZC87 ble tilsatt i 10 yl koblingsbuffer (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 10 mM DTT). Prøven ble oppvarmet til 65°C i 10 minutter, inkubert ved romtemperatur i 5 minutter og så plassert på is. Ti yl av den føl-gende løsning ble fremstilt ny og satt til prøven: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM dNTPs, 1 mM ATP, 0,15 enheter/yl T4 DNA ligase, 0,25 enheter/yl E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment). Reaksjonsblandingen ble så inkubert ved 15°C i 3 timer og prøven brukt til å transformere kompetente E. coli JM101 (Messing, Meth. in Enzymology, ibid).

De resulterende plaquer ble løftet på nitrocellulose og 32

undersøkt med hensyn til hybridisering til P-merket ZC249. Tørre BA85 filtere (Schliecher & Schuell, 0,45 ym) ble lagt på agarplaten og fagen fikk absorbere i 5 minutter. Filtrene ble fjernet og fikk tørke i 5 minutter, ble plassert på Whatman 3 MM papir, mettet i 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl i 5 minutter, luft-tørket i 3 minutter, plassert på Whatman papir, mettet i 1 M Tris-HCl pH 8, 1,5 M NaCl i 5 minutter, og lufttørket i 3 minutter. Tris-HCl trinnet ble gjentatt og filtrene ble renset i 100 ml 6 x SSC i 2 minutter ved romtemperatur. Etter lufttør-king ble filtrene varmet ved 80°C i to timer og forhybridisert ved 47°C (Tm-4°Cav ZC249) natten over i 6,7 x SSC pH 6,5, 2 mg/ml E. coli tRNA, og 0,2% BSA, Ficoll og polyvinylpyrolidin hver.

Etter forhybridiseringstrinnet ble filtrene inkubert med 2,5 x IO<6> cpm/filter merket ZC249 i den samme SSC hybridiserings-buffer ved 47°C natten over. Etter hybridisering ble filtrene vasket 3 ganger, 5-10 minutter hver, ved romtemperatur i 6 x SSC og eksponert på røntgenfilm. Antatte positive plaquer ble re-plettert og undersøkt som ovenfor. Enkelte plaquer ble så plukket ut og enkelt-kjedet DNA ble fremstilt og sekvensbestemt ved bruk av ZC275 som en primer. Oligonukleotidet ZC275 tilsvarer en sekvens 40 bp i 5' retningen av ZC249 på den samme kjede (tabell 1).

Fire positive plaquer ble identifisert. Hele innsatsen i M13mpl9 for et klon (FIX/VII-9) ble sekvensbestemt ved dideoksy metoden ved bruk av oligonukleotidene ZC87 og ZC275 og funnet å være korrekte. Den bekreftede sekvens er representert ved basene 1-56 7 i fig. 7. RF DNA fra dette klon ble så brukt for slutt-trinnet i konstruksjonen av det hybride gen.

Tre fragmenter ble brukt til å lage sluttkonstruksjonen: 0,6 kb Hind III-Xba I fragmentet fra FIX/VII-9 inneholdende de fusjonerte IX/VII sekvenser; et 1,7 kb Xba I-Bam HI faktor VII cDNA fragment fra pUCVII192 3; og et 2,7 kb Barn HI-Hind III fragment av pUC13. Tre yg FIX/VII-9 (RF DNA) ble spaltet ved 37°C

i 6 timer med 45 enheter Xba I i et volum 50 yl. DNA'et ble utfelt med etanol, gjenoppslemmet og spaltet ved 37°C i 4 timer med 50 enheter Hind III. Prøven ble underkastet elektroforese i 1% agarose og 0,6 kb båndet elektroeluert på NA45 papir (Schliecher & Schuell). DNA1 et ble eluert fra papiret med 1,5

M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, ImM EDTA, fenolekstrahert og utfelt med etanol.

For å oppnå den gjenværende faktor VII cDNA sekvens, ble

5 ug pUCVII1923 spaltet ved 37°C i 3 timer med 36 enheter Xba I i 40 Ul medium saltbuffer. Så ble 8 ul 10x høysaltbuffer, 28 yl H-jO og 4 ul (40 enheter) Barn HI tilsatt og reaksjonsblandingen inkubert ved 37 C i 3 timer. DNA fragmentene ble separert ved elektroforese i 1% agarose og 1,7 kb fragmentet isolert som beskrevet ovenfor.

Vektor fragmentet ble fremstilt ved å spalte 1 ug pUCl3 med 10 enheter Hind III i 20 ul medium saltbuffer ved 37°C i 1 time. To ul av 10x høysaltbuffer og 10 enheter Barn HI ble så tilsatt, og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere 2 timer. DNA'et ble renset på en 1% agarosegel som beskrevet ovenfor.

Ekvimolare mengder (ca. 0,56 pmol) av de tre fragmenter ble ligert ved romtemperatur i 45 minutter i 10 ul 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP og 3 enheter T4 DNA ligase. Reaksjonsblandingen ble brukt til å transformere kompetente E. coli JM8 3. Cellene ble plettert på medium inneholdende 40 Ug/ml ampicillin med 50 ul 2% X-gal tilsatt hver plate. DNA ble fremstilt fra 7 hvite kolonier og så undersøkt ved restriksjonsenzymspaltning. Et av klonene som gir det riktige mønster ble kalt FIX/VII -<>> pUC13.

Eksempel 6: Ekspresjonen av biologiske faktor VII- analoge.

Pattedyrcelle-ekspresjonsvektoren pD2 ble valgt for ekspresjon av FIX/VII genet i transfekterte dyreceller. Det ble konstruert fra plasmid pDHFR-III (Berkner og Sharp, Nuc. Acids Res. 13: 841-857, 1985) på følgende måte, Pst I punktet som støter mot DHFR cDNA i pDHFR III ble overført til et Barn HI punkt ved vanlig binding (Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D., og Itakura, K., Science 196: 177-180, 1977).

pDHFR III DNA ble inkubert med 10 mM Tris pH 7,6, 5 mM 6-MSH,

6 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 2,5 enheter Pst I i 10 minutter ved 37°C, etterfulgt av fenolekstraksjonen og etanolutfelling. De Pst I heftende ender ble gjort stumpe ved bruk av T^ DNA polymerase. Etter fenolekstraksjonen og dialyse mot 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,3 M NaCl, ble DNA'et etanolutfelt. DNA'et ble gjenoppslemmet i 20 ul 1,4 mM ATP, 50 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol og deretter inkubert med 5 ng T. polynukleotid kinasebehandlet Barn HI bindere (New England Biolabs) og 200 enheter T4 polynukleotidligase i 12 timer ved 12°C, etterfulgt av fenolekstraksjon og etanolutfelling. DNA'et ble spaltet med 90 enheter Barn HI ved 37°C i 1 time, etterfulgt av elektroforese gjennom en 1,4% agarosegel. 4,9 kb DNA fragmentet (tilsvarende pDHFR III DNA som mangler DHFR cDNA og SV40 polyadenyleringssignalet) ble elektroeluert og resirkularisert med polynukleotidligase og deretter transformert til E. coli HB101. Ampicillin-sensitive kolonier ble undersøkt ved rask prepanalyse (Birnboim, H.C., og Doly, J., Nucleic Acids Research 7: 1513-1523, 1979) og det tilsvarende klon ble dyrket opp til å gi et plasmid DNA preparat i stor skala. Det resulterende plasmid ble spaltet med 20 enheter Barn HI og behandlet med 2,5 yg kalvetarm fosfatase og elektroforesebehandlet på en 1,4% agarosegel. Femogtyve yg pSV40 (et klon av SV40 DNA innsatt i Barn HI punktet av pBR322) ble spaltet med 25 enheter Bel I i 1 time ved 50°C, etterfulgt av tilsetning av 25 enheter Barn HI, og inkuberingen fortsatte i 1 time ved 37°C. Dette DNA ble deretter elektroforesebehandlet på en 1,4% agarosegel. Den Barn HI-kappede vektor (dvs. den som mangler polyadenyleringssignaler) ble skjøtt til SV40 DNA fragmentet (0,14 til 0,19 kartenheter (Tooze, J., ed., "DNA Tumor Viruses, Molecular Biology of Tumor Viruses")) inneholdende det sene polyadenyleringssignalet ved inkubering av de gelrensede fragmenter (0,1 yg hver) i 20 yl 50 mM Tris pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol, 1,4 mM ATP og 100 enheter T^ polynukleotid ligase i 4 timer ved 12°C, etterfulgt av transformering i E. coli RRl. Positive kolonier ble identifisert ved rask prepanalyse, og et plasmidpreparat i stor skala av det riktige DNA, pD2, ble fremstilt.

For å fremstille faktor IX/VII ekspresjonskonstruksjonen, ble 1 yg pD2 spaltet ved 37°C i en time med 20 enheter Barn HI i 20 yl høysaltbuffer. Tyve yl 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA og 0,1 enhet kalvealkalisk fosfatase (Boeringer) ble så tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37°C i en time og stoppet ved oppvarming til 75°C i 10 minutter. Ti yg FIX/VII -> pUC13 ble spaltet ved 37°C i 2 timer med 150 enheter Barn HI i 150 yl høysaltbuffer. DNA fragmentene ble skilt ved elektroforese i 1,2% agarose og 2,3 kb fragmentet ble isolert. Ekvimolare mengder (0,015 pmol) av 2,3 kb Barn HI fragmentet og pD2 vektor fragmentet ble ligert ved 14°C i 2,5 timer som ovenfor. Reaksjonsblandingen ble brukt til å transformere E. coli RR1 celler, som så ble plettert på medium inneholdende 10 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA ble fremstilt fra 12 av de resulterende kolonier

og undersøkt med hensyn til restriksjonsenzymspaltning. En av klonene med det riktige enzymspaltningsmønster ble kalt FIX/VII/pD2 (fig. 6). E. coli RRl transformert med FIX/VII/pD2 er deponert hos ATCC under tilgjengelighetsnummer 53068.

Fremgangsmåten ble brukt til å transfektere hamsterunge-nyre (BHK) celler (fra American Type Culture Collection, tilgjengelighetsnummer CCL10) med FIX/VII/pD2 var lignende de publiserte metoder (f.eks. Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). BHK cellene ble dyrket ved 37°C, 5% CC^, i Dulbecco's medium (pluss 10% varme-inaktivert fetalt kalveserum og tilsatt glutamin og penicillin-streptomycin) i 60 mm vevskultur Petriskåler til en konfluens på 20%. Tilsammen 10 yg DNA ble brukt til å transfektere en 60 mm skål: 3,75 yg FIX/VII/pD2, 1,25 yg pKO-neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341, 1982) og 5 Ug laksesperm DNA. DNA'ene ble utfelt i 0,3 M NaOAc, 75% etanol, renset med 70% etanol og gjenoppløst i 20 <y>l 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. DNA'et ble kombinert med 440 <y>l H20 og 500 yl 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHP04, 12 mM dekstrose, 50 mM HEPES pH 7,12. Seksti yl 2 M CaCl2 ble tilsatt dråpevis til ovennevnte blanding, og løsningen fikk stå ved romtemperatur i 30 minutter. Løsningen ble så satt til cellene og cellene ble tilbakeført til 37°C i 4 timer. Mediet ble fjernet og 5 ml 20% DMSO i Dulbecco's med serum ble tilsatt i 2 minutter ved romtemperatur. Skålen ble så raskt vasket med 2 skift av medium og inkubert i nytt medium natten over. Fireogtyve timer etter at DNA'et var tilsatt, ble mediet fjernet og selektivt medium tilsatt (10 mg/ml G418, 498 yg/mg, Gibco, i Dulbecco's med serum). Etter 10 og 13 dager ble indi-viduelle kloner som representerte celler som hadde inkorporert pKO-neo genet og således var resistente mot G418 overført til 96-brønns (eller 24-brønns) plater og dyrket opp for protein-målinger.

Cellene ble dyrket i Dulbecco's pluss 10% fetalt kalveserum inneholdende 5 yg/ml vitamin K (Phytonadione, Merck). Mediet ble skilt fra cellene og celleavfallet ved sentrifugering og målt med hensyn til faktor VII polypeptid (ved ELISA) og biologisk aktivitet. Cellene ble fjernet fra platene med trypsin, vasket med friskt medium, sentrifugert og frosset ved -20°C. Celleklumpene ble så tint i PBS, sammenklumpet og gjenoppslemmet i PBS inneholdende 0,25% Triton X-100. Prøver ble fortynnet og målt med hensyn til polypeptid og aktivitet.

ELISA for faktor VII ble foretatt som følger. To hundre mikroliter av et monoklonalt antistoff mot human faktor VII

(5 yl/ml i 0,1 M Na2C03 pH 9,6) ble inkubert i hver brønn av en 96-brønns mikrotiter plate 2 timer ved 37°C. Brønnene ble så inkubert ved 220 yl 1% bovin serum albumin (BSA) og 0,05% Tween 20 i PBS pH 7,2 i to timer ved 37°C. Platene ble renset med H20, lufttørket og lagret ved 4°C. For å måle prøvene ble 20 0 yl prøver inkubert i en time ved romtemperatur i de antistoff belagte brønner. Brønnene ble så renset fire ganger med 200 yl PBS inneholdende 0,05% Tween 20. Brønnene ble deretter inkubert i en time ved romtemperatur med 200 yl av en IgG fraksjon av polyklonalt kanin antiserum mot faktor VII (5 yg/ml i PBS inneholdende 1% BSA og 0,05% Tween 20). Dette ble etterfulgt av inkubering med gjeite anti-kanin IgG koblet til alkalisk fosfatase. Brønnene ble så renset fire ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween 20. Brønnene ble tilsatt 200 yl p-nitrofenyl fosfat (30 mg) oppløst i dietanolamin buffer (96 ml pr. liter) pH 9,8 inneholdende 56 mg/l MgCl2. Enzym-reaksjonen ble foretatt ved 37 C og utviklingen av en gul farve ble kontrollert ved 405 nm ved bruk av en ELISA plate avleser. Resultater oppnådd for cellemedier er angitt i tabell 3.

Faktor VII-biologisk aktivitet ble målt ved ett-trinns-klumpningsmålingen beskrevet av Quick (Hemorragic Disease and Thrombosis, 2nd ed., Leat Febiger, Philadelphia, 1966). Resultater oppnådd for cellemedier er angitt i tabell 3.

Eksempel 7; Ekspresjon av faktor IX

Fjorten yg FIX(-G) -> pUC13 ble spaltet med 30 enheter Barn HI i 30 yl høysaltbuffer i 3 timer ved 37°C. DNA'et ble

så underkastet elektroforese i 1% agarose og 1,4 kb båndet som inneholdt faktor IX sekvensen ble isolert fra gelen.

Tre yg av vektoren pD2 ble spaltet med 30 enheter av Barn HI i 30 yl høysaltbuffer i 3 timer ved 37°C. DNA * et ble underkastet elektroforese i 1% agarose og det lineære 1,5 kb fragment isolert. DNA<1>et ble så behandlet med 0,12 enheter med alkalisk kalvefosfatase i 30 yl 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA i 30 minutter ved 37°C. Saltet ble justert til 0,3 M NaOAc og prøven ekstrahert to ganger med fenol, en gang med kloroform og DNA'et ble utfelt med etanol. Klumpen ble renset i 70% etanol, tørket og gjenoppløst i 20 yl 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. Ekvimolare mengder (0,02 pmol) av de to fragmenter ble ligert med 10 enheter T. DNA ligase som beskrevet ovenfor. Reaksjonsblandingen ble brukt til å transformere E. coli RR1 celler. DNA fra tolv av de resulterende ampicillin-resistente kolonier ble undersøkt med hensyn til restriksjonsenzymspaltning. En av klonene med 1,4 kb fragmentet innsatt i riktig orientering ble kalt FIX(-G)/pD2. E. coli RRl transformert med FIX(-G)/pD2 er deponert hos ATCC under tilgjengelighetsnummer 5 3067.

BHK celler ble ko-transfektert med FIX(-G)/pD2 og pKO-neo som beskrevet ovenfor. Medikamentresistente celler ble utvalgt og forbedredt for ELISA og aktivitetsmåling som beskrevet i eksempel 6.

Målingen for biologisk aktivitet er basert på faktor IX's evne til å redusere klumpningstiden av plasmaet fra faktor IX manglende pasienter til normal. Dette ble gjort som beskrevet av Proctor og Rapaport (Amer. J. Clin. Path. 36: 212, 1961). Resultatene er vist i tabell 4.

Mengden faktor IX polypeptid ble bestemt ved ELISA 1 Jet vesentlige som beskrevet i eksempel 6 ved bruk av polyklonale kanin antisera mot faktor IX. Etter inkuberingen av brønnene med de faktor IX-holdige prøver, ble brønnene renset og inkubert 1 time ved romtemperatur med 200 yl affinitetsrenset polyklonal kanin anti faktor IX konjugert med alkalisk fosfatase fortynnet 1:1000 i PBS inneholdende 1% BSA og 0,05% Tween 20. Brønnene ble så renset fire ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween 20, og en enzymsubstrat ble tilsatt som ovenfor. Inkuberinger ble kjørt ved 4°C natten over eller 37°C i 2 timer.

Som vist i tabell 4 utskilles 70-80% av faktor IX polypep-tidet i mediene, og ca. 50% av dette er biologisk aktivt.

Ingen faktor IX aktivitet ble påvist i celleklumpene.

Det høyeste aktivitetsnivået ble oppnådd ved å tilsette cellekulturmediet vitamin K (phytonadione, Merck) i konsentra-sjoner på 1-10 mg/ml.

Flere ytterligere analyser ble foretatt for å vise at cellene utskilte autentisk faktor IX. Prøver som inneholdt faktor IX aktivitet ifølge ovenfor nevnte bestemmelse ble inkubert med faktor VIII manglende plasma, men påvirket ikke klumpningstiden, hvilket viser at aktiviteten skyltes autentisk faktor IX istedet for et ikke-spesifikt klumpningsmiddel.

Denne konklusjonen ble videre bekreftet ved mangel på faktor

IX aktivitet fra prøvene med et spesifikt antistoff. 97-98%

Av faktor IX aktiviteten ble immunologisk utfelt fra celle-supernatanter med et polyklonalt kanin antistoff mot faktor IX. Dette antistoff utfelte også over 99% av faktor IX aktiviteten fra normalt plasma. Ingen faktor IX aktivitet ble fjernet fra supernatantene med polyklonalt kanin antistoff mot erytropoietin.

Eksempel 8: Konstruksjon av en ekspresjonsvektor for faktor VII.

En ekspresjonsvektor omfattende det syntetiske faktor VII

5' kodende område knyttet til det partielle faktor VII cDNA ble konstruert. Vektoren kalt pM7135 ble dannet ved å innsette faktor IX leder - 5' faktor VII sekvens fra pM7115, og 3' faktor VII sekvensen fra FIX/VII/pD2 i plasmid pD3, hvilket omfatter SV40 forsterkeren og adenovirus 2 hovedsakelig sene promotor

og tripartit leder.

Plasmid pD3 ble dannet fra plasmid pDHFRIII. Pst I punktet umiddelbart oppstrøms for DHFR sekvensen i pDHFRIII ble overført i et Bel I punkt ved spaltning av 10 yg plasmid med 5 enheter

Pst I i 10 minutter ved 37°C i 100 yl buffer A (10 mM Tris

pH 8, 10 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 7 mM B-MSH). DNA'et ble fenolekstrahert, EtOH utfelt og gjenoppslemmet i 40 yl buffer B

(50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCl2, 7 mM B-MSH) inneholdende 10 mM dCTP og 16 enheter T4 DNA polymerase og inkubert ved 12°C i 60 minutter. Etter EtOH utfelling ble DNA'et ligert til 2,5 yg kinasebehandlet Bel I bindere i 14 yl buffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP) inneholdende 400 enheter T4 polynukleotid ligaser i 12 timer ved 12°C. Etter fenolekstraksjon og EtOH utfelling, ble DNA'et gjenoppslemmet i 120 yl buffer D (75 mM KC1, 6 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT), spaltet med 80 enheter Bel I i 60 minutter ved 50°C, deretter elektroforesebehandlet gjennom agarose. Form III plasmid DNA (10 yg) ble isolert fra gelen og ligert i 10 yl buffer C som inneholdt 50 enheter T4 polynukleotid ligase i 2 timer ved 12°C og brukt til å transformere E. coli HB101. Positive kolonier ble identifisert ved rask DNA preprativ analyse, og plasmid DNA (kalt pDHFR') fremstilt fra positive kolonier ble transformert i dAM E. coli.

Plasmid pD2' ble så dannet ved å spalte pDHFR<1> (15 yg) og pSV40 (25 yg) i 100 yl buffer D med 25 enheter Bel I i 60 minutter ved 50°C, etterfulgt av tilsetning av 50 enheter Barn HI og ytterligere inkubering ved 37°C i 60 minutter. DNA fragmenter ble oppløst ved agarosegel elektroforese, og 4,9 kb pDHFR' fragmentet og 0,2 kb SV40 fragmentet ble isolert. Disse fragmenter (200 ng pDHFR<1> DNA og 100 ng SV40 DNA) ble inkubert i 10 yl buffer C inneholdende 100 enheter T4 polynukleotid ligase i 4 timer ved 12°C, og den resulterende konstruksjon (pD2') brukt til å transformere E. coli RRI.

Plasmid pD2<*> ble modifisert ved delesjon av de "giftige" sekvenser i pBR 322 området (Lusky og Botcham, Nature 293: 79-81, 1981). Plasmidene pD2' (6,6 yg) og pML-1 (Lusky og Botcham, ibid) (4 yg) ble inkubert i 50 yl buffer A med 10 enheter hver av Eco RI og Nru I i 2 timer ved 37°C, etterfulgt av agarosegel elektroforese. 1,7 kb pD2' fragment og 1,8 kb pML-1 fragmentet ble isolert og ligert sammen (50 ng hver) i 20 yl buffer C inneholdende 100 enheter T4 polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C, etterfulgt av transformering til E. coli HB101. Kolonier som inneholdt den ønskede konstruksjon (kalt A pD2) ble identifisert ved rask preprativ analyse. Ti yg ApD2 ble så spaltet med 20 enheter av Eco RI og Bgl II hver i 50 yl buffer A i 2 timer ved 37°C. DNA gjennomløp elektroforese på agarose, og det ønskede 2,8 kb fragment (fragment C) omfattende pBR322, 3' spleisingspunktet og poly A sekvensene ble isolert.

For å danne de gjenværende fragmenter' som ble brukt i konstruksjonen av pD3, ble pDHFRIII modifisert for å overføre Sac II (Sst II) punktet i enten et Hind III eller Kpn I punkt. Ti yg pDHFRIII ble spaltet med 20 enheter Sst II i 2 timer ved 37°C etterfulgt av fenolekstraksjon og etanolutfelling. Gjenoppslemmet DNA ble inkubert i 100 yl buffer B som inneholdt 10 mM dCTP og 16 enheter T4 DNA polymerase i 60 minutter ved 12°C, fenolekstrahert, dialysert og etanolutfelt. DNA (5 yg) ble ligert med 50 ng kinasebehandlet Hind III eller Kpn I hindere i 20 yl buffer C inneholdende 400 enheter T4 DNA ligase i 10 timer ved 12°C, fenolekstrahert og etanolutfelt. Etter gjen-oppslemming i 50 yl buffer A, ble de resulterende plasmider spaltet med 50 enheter Hind III eller Kpn I etter behov og underkastet elektrolyse gjennom agarose. Gel-isolert DNA

(250 ng) ble ligert i 30 yl buffer C inneholdende 400 enheter T4 DNA ligase i 4 timer ved 12°C og brukt til å transformere

E. coli RRI. De resulterende plasmider ble kalt pDHFRIII (Hind III) og pDHFRIII (Kpn I). Et 700 bp Kpn I-Bgl II fragment (fragment A) ble så renset fra pDHFRIII (Kpn I) ved spaltning med Bgl II og Kpn I etterfulgt av agarosegel elektroforese.

SV40 forsterkersekvensen ble innsatt i pDHFRIII (Hind III) som følger: 50 yg SV40 DNA ble inkubert i 120 yl buffer A med 50 enheter Hind III i 2 timer ved 37°C, og Hind III C SV40 fragmentet (5089-968 bp) ble gelrenset. Plasmid pDHFRIII (Hind III) (10 yg) ble behandlet med 250 ng kalvetarm fosfatase i 1 time ved 37°C, fenolekstrahert og etanolutfelt. Det lineæriser-te plasmid (50 ng) ble ligert 250 ng Hind III C SV40 i 16 yl buffer C i 3 timer ved 12<J>C ved bruk av 200 enheter T4 polynukleotid ligase og transformert i E. coli HB101. Et 700 basepars Eco RI-Kpn I fragment (fragment B) ble så isolert fra dette plasmidet.

For sluttkonstruksjonen av pD3 ble fragmentene A og B

(50 ng hver) ligert med 10 ng fragment C med 200 enheter T4 polynukleotid ligase i 4 timer ved 12°C, etterfulgt av trans-

feksjon av E. coli RRI. Positive kolonier ble påvist ved rask preprasjonsanalyse og en fremstilling av pD3 i stor skala ble foretatt.

Ekspresjonsvektor pM7135 ble deretter konstruert. Den replikative form av pM7115 ble spaltet med Barn HI og Xba I og 550 basepar fragmentet som omfattet faktor IX lederen og 5' faktor VII sekvensen ble gelrenset. Plasmid FIX/VII/pD2 ble spaltet med Xba I og Barn HI og 1700 bp fragmentet omfattende 3' delen av faktor VII cDNA ble gelrenset. Plasmidet pD3 ble spaltet med Bel I, behandlet med alkalisk kalvefosfatase og de tre fragmenter koblet i en trippel-legering. De resulterende konstruksjoner ble undersøkt med hensyn til nærvær av et 2000 basepar Xba I fragment. Et plasmid med den riktige orientering ble utvalgt og kalt pM7135 (fig. 8).

Eksempel 9: Ekspresjon av faktor VII fra cDNA kloner.

For å uttrykke faktor VII cDNA som inneholder en faktor

VII leder, ble DNA fra XVII2463 eller XVII565 og XVII2463

klonet i en ekspresjonsvektor inneholdende den Ad2 sene hoved-promotor, SV40 forsterkersekvenser, Ad2 tripartitlederen, et spleisingssett og SV40 polyadenyleringssignalet. Denne vektoren ble tilpasset slik at den inneholder en eneste EcoRI-.sekvens som punkt for cDNA innsetning. Ekpresjonen av sekvenser fra XVII246 3, som koder for en 60 aminosyre leder og fra XVII565 og XVII246 3, som mangler kodonene for aminosyrer fra -18 til -39

og således koder for en leder med 38 aminosyrer lengde ble under-søkt. Fordi strukturen til faktor VII lederen bare er blitt identifisert ved cDNA kloning, og på grunn av tvetydigheten ved å ha fått to forskjellige 5<1> terminale cDNA'er, konstruerte oppfinnerne også en genomisk cDNA faktor VII sekvens. 3' delen av XVII2463 (fra Bgl II punktet i exon 2 til EcoRI punktet bundet 3' til poly(A)halen) ble tilkoblet et subgenomisk fragment av klonet7ml som kodor for exoner la, lb og resten av exon 2. Dette subgenomiske fragment, rekonstruert som et EcoRI-Bglll 4,4 Kb fragment, ble tilkoblet XVII2463 cDNA og klonet i en pattedyrs ekspresjonsvektor.

Kort sagt, for å konstruere subklonene, ble faktor VII cDNA EcoRI fragmentet av XVII2463 klonet i EcoRI punktet av pUC18,

og kalt pVH246 3. På lignende måte ble EcoRI cDNA innsatsen av

AVII565 underklonet i pUC18 og kalt pVII565. Et hybrid mellom

5' delen av faktor VII sekvensen av klonet pVH565 og 3' seg-mentet av faktor VII DNA av pVII246 3 ble konstruert ved å klone det 5'-este EcoRI-Bgl II faktor VII fragment av pVH565 og Bgl II-Hind III faktor VIII fragmentet (Hind III punkt i poly-binder av pVH2463) i pVH2463 i pUC 18 spaltet med EcoRI og Hind III. Denne konstruksjonen ble kalt pVH2397. Innsatsene av pVH2463 og pVII2397 ble fjernet ved EcoRI spaltning og gelrenset for innsetning i pattedyrs ekspresjonsvektorer som beskrevet nedenunder.

A. Ekspresjon av faktor VII cDNA med full lengde.

Ekspresjonen av faktor VII ble oppnådd i vektor pDX. Denne vektoren ble utledet fra pD3 (beskrevet i eksempel 8 ovenfor) og pD3', en vektor identisk med pD3 unntatt at SV40 polyadenyleringssignalet (dvs. SV40 Barn HI (2533 bp) til Bell (2770bp) fragmentet ) er i den sene orientering. Således inneholder pD3' et Barn HI punkt som punkt for geneinnsetning.

For å danne pDX ble EcoRI punktet i pD3<*> overført i et Bel

I punkt ved Eco RI spaltning, inkubering med Sl nuklease og etterfølgende ligering med Bel I bindere. DNA ble fremstilt fra en positivt identifisert koloni, og 1,9 kb Xhol-Pstl fragmentet som inneholdt det endrede restriksjonspunkt ble fremstilt gjennom agarosegel elektroforese. I en andre modifisering ble Bel I-spaltet pD3 ligert med kinasebehandlede Eco RI-Bcl I adaptorer (konstruert fra oligonukleotider ZC 525, 5' GGAATTCT 3 1; for å danne et Eco RI punkt som posisjon for innsetning av ét gel i ekspresjonsvektoren. Positive kolonier ble identifisert ved restriksjonsendonuklease analyse, og DNA fra dette ble brukt til å isolere et 2,3 kb Xhol-Pstl fragment inneholdende det modifiserte restriksjonspunkt. De to ovenfor beskrevne DNA fragmenter ble inkubert sammen med T4 DNA ligase, transformert i E. coli HB101, og positive kolonier ble identifisert ved restriksjonsanalyse. Et preparat av slik DNA, kalt pDX, ble laget (fig. 12). Dette DNA ble spaltet med Eco RI og etterpå inkubert med kalvetarm fosfatase. Det rensede DNA ble så inkubert med T4 DNAligase og faktor VII Eco RI fragmentet fra pVII246 3, eller med faktor VII Eco RI cDNA fragmentet fra pVH2397. De resulterende kloner ble kalt FVII(2463)/pDX og FVII(565+2463)/pDX, henholdsvis

(fig. 12). Etter transformering i E. coli JM83 og etterfølgende

identifisering ved restriksjonsenzymanalyse, ble plasmid DNA fremstillinger foretatt og kontrollert ved utstrakt restriksjons-endonukleasespaltning. Plasmidene FVII(2463)/pDX og FVII(565+ 2463)/pDX har blitt deponert hos American Type Culture Collection og har fått tilgjengelighetsnummeret 40206 og henholdsvis 40205.

FVII(2463)/pDX og FVII(565+2463)/pDX (10 ug hver) ble

begge transfektert sammen med 10 ug laksespermbærer DNA i enten BHK tk~tl3 celler (Floros et al., Exper. Cell Res. 132: 215-233, 1981) eller COS celler ved bruk av standard kalsiumfosfat-utfelling. Etter transfeksjon ble cellene dyrket i det tilsvarende medium inneholdende 5 ug/ml vitamin K i to dager. På dette tidspunkt ble supernatanten målt for ELISA-positivt materiale ved bruk av et monoklonalt antistoff rettet mot faktor VII. Både FVII(2463)/pDX og FVII(565+2463)/pDX dirigerte produksjonen av faktor VII polypeptid som ble påvist i COS celle supernatan-ter, og faktor VII fra FVII(565+2463)pDX ble påvist i BHK celle supernatant. Sham-transfekterte BHK celler eller COS celler ga ikke påviselige mengder av faktor VII (tabell 5).

Kortvarig ekspresjon av faktor VII ble også prøvet i flere andre cellelinjer oppført i tabell 6.

Celler ble kotransfektert med 10 yg av enten FVII(246 3)/pDX eller FVII(565 + 2463)/pDX sammen med 1 yg av et plasmid omfattende kloramfenikol acetyl transacetylase genet (for å mulig-gjøre identifisering av kotransfekterte celler) og 10 yg laksesperm DNA. Blind-transfekterte celler ble brukt som kontroller. Brukte medier ble målt ved ELISA etter seks dager. Resultater er angitt i tabell 7.

FVII(246 3)/pDX (10 Ug) eller FVII(565+2463)/pDX (10 ug) ble ko-transfektert med 10 ug laksesperm DNA og 1 ug av et plasmid som koder for den resistente form av dihydrofolat reduktase (Simonsen og Levinson, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80: 2395-2499, 1983) i en pattedyrsekspresjonsvektor i BHK tk tl3 celler.

Etter to dager ble cellene spaltet 1:14 og plassert i selektive medier som inneholdt enten 250 nM eller 100 nM metotrexat (MTX) og 5 Ug/ml vitamin K (phytadione, Merck) . Etter to liker ble kolonier isolert og dyrket til 50-90% sammenløp. Supernatant-mediene ble så målt med hensyn til faktor VII polypeptid med ELISA. Av de 25 positive kloner ble 22 analysert videre. Cellene ble plettert ved 5 x 10 (gruppe I) eller 1 x 10 (gruppe II) i 10 cm skåler som inneholdt 5 ug/ml vitamin K, og enten

250 nM eller 1000 nM metotrexat. Fem dager senere ble de raskere voksende kloner (angitt med en stjerne i tabell 8) spaltet 1:2, og etter 24 timer ble mediene så forandretpå alle plater. 23 Timer (gruppe I) eller 20 timer (gruppe II) senere ble super-natantmediene høstet og celletellinger ble tatt for hvert klon. Mediene ble målt både med ELISA og med ett-trinns klumpings-målingen. Resultater er vist i tabell 8.

B. Ekspresjon av faktor VIII genomisk-cDNA hybrid.

En ekspresjonsvektor som inneholdt genomiske sekvenser som representerte faktor VII genomisk 5' endene og cDNA sekvenser fra faktor VII gen 3' enden ble fremstilt som følger. Tre subkloner av det genomiske plasmid 7 ml ble brukt til å rekonstrue-re 5' enden: 7Bam, 7SD og 7SE. Plasmid 7Bam er et 3,6 Kb EcoRI-Bam HI fragment som inneholder exon la, subklonet i pUC12. Et 0,7 Kb EcoRI-Xbal fragment som inneholder exon la ble isolert fra dette subklon og kalles fragment a. Plasmid 7SD er et 3,7 Kb Sstl fragment som inneholder exon lb underklonet i pUC18.

Et exon lb-holdig 3,1 Kb Xbal-Sstl fragment ble isolert fra dette subklon og kalles fragment b. Plasmid 7SE er et 3,9 Kb Sstl fragment som inneholder exoner 2-4 subklonet i Ml3mp 19. Et Sstl-Bgl II (0,6 Kb) fragment som inneholder 5' delen av exon 2 ble gelisolert og kalles fragment c. Resten av 3' faktor VII cDNA'et (fragment d) erholdtes som et 2 Kb Bglll-EcoRI fragment fra pUVH246 3. Fragmenter a-d ble ligert med EcoRI-spaltet og kalvetarm fosfatert pDX, og deretter transformert i E. coli JM83 eller HB101. Positive kolonier ble identifisert ved restriksjonsendonukleaseanalyse, og plasmid DNA ble fremstilt fra disse kolonier.

For ekspresjons faktor VII ko-transfekteres plasmid DNA'et i BHK eller COS celler som beskrevet ovenfor. Transfekterte celler dyrkes i vitamin K-holdig medium i 2 dager, og mediet måles med hensyn til faktor VII ved ELISA.

Fra det foregående vil man forstå at selvom spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen her er blitt beskrevet i illustrerende hensikt, kan forskjellige modifikasjoner foretas uten at man avviker fra oppfinnelsens idé og omfang. Følgelig er oppfinnelsen ikke begrenset av annet enn de etterfølgende krav.

Claims (15)

1. DNA konstruksjon, hvor nukleotidsekvensen i det minste delvis koder for faktor VII, karakterisert ved at nukleotidsekvensen omfatter en første nukleotidsekvens som koder for et kalsiumbindende område, koblet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens, hvilken andre sekvens koder for et katalytisk område for serin-proteaseaktivitet av faktor Vila, idet de sammenkoblede sekvenser koder for et protein som etter aktivering har samme eller i det vesentlige samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor Vila.

2. DNA konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at den første nukleotidsekvens i det vesentlige er som for et gen valgt fra gruppen bestående av gener som koder for faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C, protrombin og protein S.

3. DNA konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at den første nukleotid sekvens også koder for et lederpeptid.

4. DNA konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at den første nukleotidsekvens inneholder et syntetisert dobbeltkjedet oligo-nukleotid.

5. DNA konstruksjon ifølge krav 4, karakterisert ved at det syntetiserte dobbelt-kjedede oligonukleotid koder for hovedsakelig aminoendedelen av faktor VII.

6. DNA konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen koder for faktor VII.

7. DNA konstruksjon ifølge krav 6, karakterisert ved at minst en del av nukleotidsekvensen stammer fra et cDNA-klon eller genomisk klon av faktor VII.

8. DNA konstruksjon ifølge krav 6, karakterisert ved at den omfatter en første nukleotidsekvens som stammer fra et cDNA eller et genomisk klon av faktor VII koblet til en andre nukleotidsekvens plassert nedstrøms for den første sekvens, den andre sekvens stammer fra et cDNA klon av faktor VII, og de koblede sekvenser koder for et protein som etter aktivering har samme eller i det vesentlige samme biologiske aktivitet i blod-koagulering som faktor Vila.

9. DNA konstruksjon ifølge krav 6, karakterisert ved at nukleotidsekvensen omfatter cDNA-sekvensen på fig. lb fra bp 3 6 til 1433.

10. DNA konstruksjon ifølge krav 6, karakterisert ved at nukleotidsekvensen omfatter cDNA-sekvensen på fig. lb fra bp 36 til 99 etterfulgt nedstrøms av sekvensen fra bp 166 til bp 1433.

11. Rekombinant plasmid med evne til integrering i pattedyrsvertsceller DNA, karakterisert vedat plasmidet inneholder en promotor fulgt nedstrøms av en nukleotidsekvens ifølge hvert av de foregående krav 1-10, hvilken nukleotidsekvens nedstrøms følges av et polyadenyleringssignal.

12. Pattedyrceller, karakterisert ved at de er transformert med et rekombinant plasmid ifølge krav 11, og har evne til å uttrykke faktor VII.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein med biologisk aktivitet i blodkoagulering bevirket av faktor Vila, karakterisert ved at man frembringer en pattedyrvertscelle som inneholder en DNA konstruksjon ifølge hvert av de foregående krav 1-10; dyrker pattedyrvertscellen i et tilsvarende medium; isolerer proteinproduktet som kodes for av DNA konstruksjonen og er fremstilt av pattedyrvertscellen; og aktiverer proteinproduktet til et protein som har den samme eller i det vesentlige samme biologiske aktivitet i blodkoagulering som faktor Vila.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at man forsterker DNA konstruksjonen ved ko-transfeksjon av vertscellen med et gen som koder for dihydrofolat-reduktase, hvori det tilsvarende medium omfatter metotrexat.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at proteinproduktet aktiveres ved å omsette proteinet med et proteolytisk enzym valgt fra gruppen faktor Xlla, faktor IXa, kallikrein, faktor Xa og trombin.