CN86102644A - 哺乳动物细胞内因子ⅶ和ⅸ的活性表达 - Google Patents

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Abstract

本文揭示一种由哺乳动物宿主细胞产生对有因子Ⅶ或Ⅸ介入的凝血过程具有活性的蛋白的方法。宿主细胞被具有至少部分地为因Ⅶ或Ⅸ编码的核苷酸顺序的DNA所稳定地转染,该顺序包括一个编码钙束缚区的第一核苷酸顺序,它可以从染色体组克隆或因子Ⅶ的cDNA克隆诱导出;还包括给因子ⅦA或Ⅸ的丝氨酸底部酶活性编码催化区的第二顺序。联合顺序编码的蛋白质在凝血过程中具有与因子Ⅶa或Ⅸ实质上相同的生物学活性。

Description

一般地说,本发明与血液凝固因子有关,更准确地说,本发明与在血液凝固中有生物活性的蛋白质的表达有关。
血液凝固是一个各种血液成份或因子复杂的相互作用所组成的过程。这些成分或因子最终产生一个纤维性血块。一般地说,参与凝固,并被称为凝固“cascade”的血液成分是前酶,或酶元。酶原是一种在酶学上没有活性的蛋白质。在活化子的作用下,酶原转变成水解蛋白酶。活化子本身就是已活化的凝血因子。经历这样转化的凝血因子一般称为“被活化因子”,在它们标号的后下方再加上一个“a”,例如Ⅶa。
有两种系统能促进血液凝固和参加止血。这两种系统已被称作内在的和外在的凝血途径。内在途径指的是通过利用只存在血浆中的因子导致凝血酶形成的反应。内在途径中的中间环节是因子Ⅸ被活化成因子Ⅸa,该反应由又被因子Ⅺa和钙离子催化。在因子Ⅷa,磷脂和钙离子存在的情况下,因子Ⅸa又参与活化因子Ⅹ。外在途径包括血浆因子以及存在于组织提取液中的成分。因子Ⅶ,一种前面提到的酶元,参加到凝血的外在途径中,其作用是(当被活化成Ⅶa后)在组织因子和钙离子存在下把因子Ⅹ活化成Ⅹa。反过来,因子Ⅹa又转化凝血酶原成凝血酶,在因子Ⅴa钙离子和磷脂存在下。用于把因子Ⅹ活化成因子Ⅹa是由内在的和外在的途径共同承担的,因此,因子Ⅶa可被用来治疗因子Ⅷ缺乏或被阻滞的病人(Thomas,U.S.patent    4,382,083)。还有一些证据提出,因子Ⅶa可以参加内在途径,在活化因子Ⅸ中起作用。
实验分析揭示,人因子Ⅶ是单链的糖蛋白,分子量约50,000道尔顿。于是因子就以无活性的酶原形式循环在血液中。因子Ⅶ活化成因子Ⅶa可能被几种不同的血浆酶催化,如因子Ⅻa。因子Ⅶ的活化结果,形成两条多肽链,一个重链(分子量28,000)和一条轻链(分子量17,000)至少被一个二硫键把二链联在一起。因子Ⅶ可以在体外被活化成因子Ⅶa,例如Thomas(U.S.patent    No4,456,591)所揭示的方法。
因子Ⅸ作为一种单链底物,分子量57,000存在于血液循环中。在因子Ⅷ存在时,依靠Ⅶa的分裂,因子Ⅸ被转化成活化的丝氨酸蛋白酶(即因子Ⅸa)。因子Ⅸa是由一条轻链和一条重链组成的,分子量分别是16,000和29,000。
目前,对患凝血失调(即缺乏因子Ⅷ和Ⅸ)一般采用人血浆冷沉淀物或其它碎片,因为其中含有丰富的特异因子。虽然冷沉淀物制剂需要使用相当大量的人血浆作为最初材料,但该制剂还可以从库存的人血浆中得到。
在因子Ⅶ,因子Ⅷ和因子Ⅸ缺乏的人群中,利用因子Ⅶ来治疗显示出缺乏的病人。也利用因子Ⅶ来治疗有von    willebrand′s疾病的病人。更确切地说,在补充疗法中接受了因子Ⅷ和因子Ⅸ的病人多数对这些蛋白产生抗体。由于这些抗体的存在,继续治疗是极其困难的。经历这一问题的病人,通常利用活化的凝血酶元复合物进行治疗。已经知道,该复合物是活化的,未活化的凝血酶的混合物,其中包括因子Ⅶa。而且,最近的研究指出,对那些自己缺乏因子Ⅷ,并在血液中产生很高水平抗体的病人,注射少量(40-50μg)的因子Ⅶa对于控制他们严重的流血不止是有效的(Heder和Kisiel,J.clin.Invest.71∶1836-1841,1983)。
由于应用血浆冷沉淀物,需要传递血浆源,而要确保在传递过程中,血浆不被病毒污染是极困难的。例如,基本上所有冷沉淀物的容器对肝炎呈阳性反应。最近的报告还指出,某些血友病人,在接受冷沉淀物之后,已经产生了获得性免疫缺乏并发症(AIDS)。此外,这些因子的大量纯化是极其困难的,并且也是极其昂贵的。
因此,在工艺方面,需要一种方法,使它能够产生相当大量的纯的因子Ⅶa和因子Ⅸ制剂。现在的发明满足了这个要求,通过DNA重组技术,成功地消除了病毒污染问题,同时提供了有活性的Ⅶa因子成均质来源,来满足因子Ⅷ和因子Ⅸ缺乏的患者,以及患Von    Willebrand′s疾病的病人。而且还为补充疗法提供了纯化因子Ⅸ的来源。
简要的说,这一发明揭示了DNA的结构中有一核苷酸顺序至少部分地决定因子Ⅶ的密码。核苷酸顺序由第一顺序和第二顺序组成,第一核苷酸顺序编码的钙束缚区又联结由第一核苷酸顺序下游位置所决定的第二核苷酸顺序上。第二核苷酸顺序编码的催化区,控制因子Ⅶa丝氨酸蛋白酶的活性。联合顺序编码的蛋白质,经活化作用,在凝血方面,该种蛋白质具有与因子Ⅶa相同的生物活性。第一核苷酸顺序实质上可能是一个基因组,它编码了因子Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ,蛋白质C,凝血酶原,或蛋白质S的遗传密码。而且,第一核苷酸顺序也可能编码对应于各个基因的前导肽链。
尤其是,第一核苷酸顺序可以由基因组克隆或因子Ⅶ的cDNA克隆诱导出来,并且可能编码因子Ⅶ前导肽和氨基末端部位。第一核苷酸顺序可能包括一个双链寡核苷酸。特别优先的第一核苷酸顺序编码因子Ⅸ引导肽和氨基末端。
此外,这一发明揭露了,可以整合在哺乳动物宿主细胞中的重组的质粒。质粒之一包括一个启动子,下游接一套RNA剪接位点,RNA的剪接位点下连核苷酸顺序,该核苷酸顺序至少部分地编码因子Ⅶ密码。所说的核苷酸顺序包括第一核苷酸顺序,第一核苷酸顺序编码的钙束缚区联结到由第一核苷酸顺序下游的第二核苷酸顺序上。第二核苷酸顺序为因子Ⅶa丝氨酸蛋白酶活性编码催化区密码。联合顺序为蛋白质编码,经活化作用后,在凝血方面,该种蛋白质与因子Ⅶa有同样的生物活性。然后,核苷酸顺序下游接多聚腺核苷酸的信号。
与上面所讲的重组质粒相类似,本发明还揭示了第二质粒,第二质粒包括一个启动子,启动子下游连有一组RNA接点,RNA接点的下游又紧接核苷酸顺序,核苷酸顺序至少部分地编码了因子Ⅸ的密码。所说的核苷酸顺序是由第一核苷酸顺序组成的,第一核苷酸顺序编制钙束缚区,钙束缚区联结到第二核苷酸顺序上,第二核苷酸顺序是由第一核苷酸顺序的下游决定的。第二核苷酸顺序为因子Ⅸ的丝氨酸的活性编码了催化区的密码,联合顺序为蛋白质编码密码,在凝血方面该蛋白质在本质上与因子Ⅸ有相同的生物活性,核苷酸顺序向下又紧连着多聚腺核苷酸的信号。
该发明的第三个方面揭示了被稳定的转染产生蛋白质的哺乳动物的细胞,经活化后该蛋白质与因子Ⅶa有同样的生物活性,细胞被包含一个核苷酸顺序的DNA建造转染。该核苷酸顺序至少部分地编码了因子Ⅶ的密码。所说的核苷酸顺序包括一个第一核苷酸顺序,第一核苷酸编码了钙束缚区,钙束缚区又连到第二核苷酸顺序上,第二核苷酸顺序位于第一核苷酸下游。第二核苷酸顺序为因子Ⅶa的丝氨酸蛋白酶编码了催化区。联合的顺序又为蛋白质编码密码,该蛋白,经活化后,在血液凝固方面与因子Ⅶa有相同的生物活性。
本发明的另一方面揭示了稳定被转染的哺乳动物细胞,它能够产生一种蛋白质,该蛋白质与因子Ⅸ有相同的生物活性。被转染的细胞所具有的DNA的建造包含一个核苷酸顺序。这个核苷酸顺序至少决定了部分的因子Ⅸ的密码。所说的核苷酸顺序包括第一核苷酸顺序,第一核苷酸顺序编码钙束缚区,钙束缚区又连到第二核苷酸上去。第二核苷酸的顺序位于第一核苷酸的下游。第二核苷酸顺序为因子Ⅸ的丝氨酸蛋白酶活性编码了催化区。联合顺序编码了蛋白质密码。该蛋白质在血液凝固方面与因子Ⅸ有本质上相同的生物活性。
本发明进一步提供了一种方法,通过建立哺乳动物宿主细胞,使其DNA的建造至少部分地包含因子Ⅶ密码的核苷酸顺序,使动物宿主细胞产生一种对受因子Ⅶa调节的凝血具有生物活性的蛋白质。所说的核苷酸顺序包括第一核苷酸顺序。第一核苷酸顺序编码的钙束缚区又连到第二核苷酸顺序上。第二核苷酸顺序位于第一核苷酸顺序下游。第二核苷酸顺序给因子Ⅶa的丝氨酸蛋白酶活性编码了催化区。联合的顺序为蛋白质编码了密码。经活化后,在血液凝固方面该蛋白质与因子Ⅶa有相同的生物活性。接着哺乳动物宿主细胞在适当培养基中生长,由DNA建造所编码的和由哺乳动物宿主细胞所产生的蛋白质被分离出来。然后蛋白质产物被活化,产生因子Ⅶa。
本发明还有一个方面,就是揭示了一种产生对受因子Ⅸ调控的凝血方面具有生物活性的蛋白质的方法。该方法包括建立哺乳动物宿主细胞,宿主细胞含有DNA的建造,DNA的建造至少部分地包含有因子Ⅸ的密码核苷酸顺序。所说的核苷酸顺序包括第一核苷酸顺序,第一核苷酸顺序编码的钙束缚区连到第二核苷酸顺序上。第二核苷酸顺序位于第一核苷酸顺序的下游。第二核苷酸顺序为因子Ⅸ的丝氨酸蛋白酶活性编码催化区。联合的顺序又编码了蛋白质的密码。该蛋白质在血凝方面本质上与因子Ⅸ有相同的生物活性。接着哺乳动物宿主细胞在适当的培养基中生长。由哺乳动物宿主细胞所编码的蛋白质产物被分离出来。上面所述的方法产生的蛋白质产物也被揭示出来。
本发明还有另外一个方面,即揭示了由编码因子Ⅶ的DNA顺序组成的DNA建造。在优先选用的实施方案中,DNA的顺序包含有图1b的cDNA顺序,从bp36到bp1433,在另一个优先选用的实施例中,DNA的顺序包括图1b    cDNA顺序bp36到bp99,下游接着的顺序是从bp166到bp1433。含有刚刚在上面描述的DNA的顺序并能整合到哺乳动物宿主细胞内的DNA中的重组质粒也已被揭示出来。用含有编码因子Ⅶ的DNA序列的重组质粒稳定地转染的哺乳动物细胞也被揭示出来。在优先选用的实施方案中,DNA顺序含有图1b    cDNA顺序bp36到bp1433,或者是图1b    cDNA顺序的bp36到bp99,下游接着是从bp166到bp1433。
还揭示一种产生活性蛋白的方法。所产生的蛋白质对因子Ⅶa介入的凝血过程有生物活性。该蛋白质是由哺乳动物宿主细胞产生的,该细胞中具有上述的DNA建造。
然后,哺乳动物细胞宿主在适宜的培养基中生长,由DNA建造所编码的蛋白质被分离出来,于是,蛋白质分子被活化,产生因子Ⅶa。
本发明的其它方面参考下面的详细描述和所附的示意图将变得很明显。
图1a说明:cDNA克隆λⅦ2115和λⅦ1923的连结部位产生的部分的因子Ⅶ的c    DNA。
图1b说明λⅦ2463的因子Ⅶ的c    DNA。箭头指出λⅦ565顺序中缺失的范围。顺序上面的号码指的是氨基酸,下面的号码指的是核苷酸。
图2a表示若干种血凝因素的氨基末端区域的氨基酸顺序。
图2b表示由c    DNA编码决定的因子Ⅶ的氨基酸顺序与蛋白质顺序化得到的因子Ⅶ的氨基酸顺序的比较。
图3表明把因子Ⅸ前导肽顺序连结到为匹配的钙离子束缚区编码的顺序上。
图4表明因子Ⅸ的匹配的顺序的杂交种连接到部分因子Ⅶ的c    DNA上。产生了一个编码顺序框架。
图5表示包含有对于因子Ⅸ和因子Ⅶ融合的蛋白质密码顺序的质粒结构。
图6表明表达载体FⅨ/Ⅶ/PD2。所用的符号是Ad2MLP,是主要的,晚的启动子,来自腺病毒2;L1-3,腺病毒2三分前导顺序;5′ss5′是连接点;3′ss,3′是连接点,和PA,来自SV40的后期的多聚腺苷酸的符号。
图7表示因子Ⅸ和因子ⅦcDNA融合的核苷酸顺序。
图8表示表达载体PM7135。所用的符号是E,SV40增强因子;ori,0-1图连接到Ad5;PA,来自SV40早期的多聚核苷酸信号,△,μBR322中毒顺序的缺失区;而其他符号如图6所示。
图9表明2463bp的亚克隆,因子Ⅶ的c    DNA。
图10表明:565bp亚克隆,因子Ⅶ的c    DNA。
图11表明:pⅦ565的5′末端和在pUC18中,pⅦ2463的3′位置相连产生pⅦ2397。
图12表明:表达质粒FⅦ(2463)/pDX和FⅦ(565′2463)/pDX的构造。PA指的是在早期或晚期定向(如图9)时SV40的多聚腺核苷酸的信号。其它符号如图8描述。
在展示发明之前,理解一下至此所使用的若干术语的定义是有益的。
互补DNA或cDNA:一个DNA分子或顺序在酶学方面已按照mRNA模板中的顺序被合成。
DNA建造:一个DNA分子,或一个DNA分子的单克隆,单线的或双线的,可以是从天然存在的基因中分离出来的部分形式,或者变更为含有DNA的某些片段,这些DNA片段是以自然界不存在的方式联结和并列的。
质粒或载体:含有遗传信息的DNA建造,当插入宿主细胞时,就可以进行复制。一般地,一个质粒至少携带一个将要在宿主细胞中被表达的基因顺序,以及包括启动子和转录子的起始位置在内的使基因表达很容易进行的顺序。DNA分子可以是直线的,或者可能是紧密的环状分子。
联结:当DNA分子一个顺序的5′,3′末端借助磷酸二酯键,联结到邻近顺序相应的3′,5′末端时,DNA顺序的就被联结起来。通过cDNA克隆被联结顺序的合成,或通过定向诱导突变过程除去插入的顺序,以平端或粘性末端联结法成功地联在一起。
前导肽:出现在某些蛋白质氨基末端的氨基酸顺序,在其后发生的过程和分泌活动期间,该氨基酸顺序一般均从蛋白质分子切断下来。前导肽包括引导蛋白质进入到细胞分泌途径的顺序。在使用“Leader    piptide”这一术语时,可能还意味着一部分天然存在的前导肽。
区:Domain:蛋白质分子中特异氨基酸三维的自我组装排列,它含该种蛋白的某些生物活性所必需的全部的或部分的结构成分。
生物活性:一个分子在生物学范围(即在生物体内或体外复制)所执行的一种功能或多种功能。蛋白质的生物活性可以区分为催化活性和效应物活性。凝血因子的催化活性一般通过底物的特异性断裂涉及到其它因子的活化作用。效应物活性包括生物活性分子特异的连结钙或其小分子,或连到蛋白质大分子上,或连到细胞上。在生理条件下,效应物活性往往是或基本上是增强催化作用的活性。催化活性和效应物活性,在某些情况下可能位于蛋白质的同一区(domain)。
对于因子Ⅶa来说,生物活性是以通过外在途经介入到血凝过程中为特征的。因子Ⅶa活化因子Ⅹ变成因子Ⅹa,接着,因子Ⅹa把凝血酶原转变成凝血酶,因此开始形成纤维化血块。因为因子Ⅹ的活化是血凝过程的外在的和内在途径所共有,所以因子Ⅶa可被用来治疗因子Ⅸ、因子Ⅷ或Von    Willebrand因子活性严重缺失的患者。
因子Ⅸ的生物活性是以通过内在途径介入血凝过程为特征的。因子Ⅺa把因子Ⅸ活化成因子Ⅸa,然后,在因子Ⅷa,磷脂和钙离子存在的条件下,因子Ⅸa把因子Ⅹ活化成因子Ⅹa。因子Ⅹa起作用,把凝血酶原变成凝血酶,开始形成纤维性血块。
正象上述的那样,从人血浆中分离因子Ⅶ是一个耗费时间,价格昂贵的过程,因为因子Ⅶ是一种罕见的蛋白,每升血中仅有约300μg。而且,很难把凝血酶原,因子Ⅸ和因子Ⅹ分离开,在纯化期间,诸因子易受水解蛋白影响(Kisiel    and    Mc    Mullen,ibid)。虽然单链的人血因子Ⅶ已被纯化为均质(Kisel    andMc    Mulen,ibid),但已公开的纯化方法普遍地受到产量低和/或被其它血凝因子污染的限制。
因子Ⅶ和Ⅸ是在肝中产生的。在因子Ⅶ和Ⅸ的生物合成中需要维生素K。在因子合成中,形成特异的γ羧基谷氨酸残基时必须有维生素K。这些异常的氨基酸残基是由于转译后的变更产生的。它们束缚钙离子,并承但着蛋白质与磷脂囊的相互作用。还有,因子Ⅶ和Ⅸ,每个都有一个β-羟基天门冬氨酸残基。该残基也是在蛋白质被转译后形成的。然而,这一氨基酸的作用还不清楚。
给定的事实是,因子Ⅶ和因子Ⅸ的活性决定于被转译后的变形,包括特异的谷氨酸残基γ羧基化。因子Ⅶ和Ⅸ的活性可能也决定于特异的天门冬氨酸残基的羟基化。通过克隆化和因子Ⅶ和因子Ⅸ在微生物的表达来生产活性物质是不可能的。
因此,本发明提供了一种产生活性蛋白的方法,该蛋白质是稳定的被转染的哺乳动物细胞产生的。再者,本发明还提供了制备在由因子Ⅸ介入的凝血过程中具有生物活性的蛋白质的方法。
正如上面所述的那样,对于因子Ⅶ和因子Ⅸ的生物合成需要维生素K。而且,在血浆蛋白凝血酶元因子Ⅹ,蛋白质C、蛋白质S的生物合成中,也需要维生素K。这些蛋白质的氨基末端部分,都带有γ羧基谷氨酸残基,在氨基酸顺序和生物功能方面,它们都是相同的(图2a)。而且因子Ⅶ凝血酶元,因子Ⅸ,因子Ⅹ和蛋白C的羧基末端部分,决定了它们特异的丝氨酸蛋白酶功能。
因子Ⅶ是一种微量浆蛋白质,而且给因子Ⅶ编码的mRNA被认为是罕见的。因此,从足够量的血浆中,分离纯化因子Ⅶ来满足广泛的顺序分析和鉴定仍然是困难的。
Kisiel和Mc    Mullen(ibid)已经描述了因子Ⅶ在纯化过程中的降解,即使有蛋白酶存在。由于这些困难,与血液系统中存在的十分丰富的其它成分相比,对因子Ⅶ的特性所知甚少。的确Kisiel和Mc    Mullen的工作对于因子Ⅶ的每一个链的仅十个残基产生了顺序信息,并且在每一个顺序中,两个残基的鉴定是试验性的,对于牛因子Ⅶ部分氨基酸顺序资料也已公开(Discipio    et    al.,ibid)。
被认为是稀少的ⅦRNA已经对因子Ⅶ基因的了解做出了贡献,常规的cDNA克隆技术的成功取决于足够量的用做模板的mRNA。过早终止反转录产生了缺少5′端的cDNA克隆,并且这一条件被少量的mRNA所恶化。对于少量信息的cDNA克隆已经产生了几种对策(Maniatis    et    al.分子克隆:实验手册,Cold    Spring    Harbor    Laboratory,1982),但是,由于缺乏氨基酸顺序的知识,就不可能预言DNA的顺序,不可能设计那种适当的寡核苷酸探针,如果说当利用这种先进的策略获得编码罕见的蛋白质的基因的一个部分的cDNA克隆是比较容易的话,那么,要得到编码象因子Ⅶ的蛋白质基因的一个全长的cDNA克隆,仍然是极其困难的。
与因子Ⅶ相比,因子Ⅸ是比较丰盛的蛋白质。人的因子Ⅸ基因的cDNA顺序已经知道(Kurachi    and    Davie,Proc.Natl.Acad.sci.USA79∶6461-6464,1982;and    Anson    et    al.,EMBO    J.3∶1053-1060,1984)。因子Ⅸ基因的结构已被表示出来,蛋白质的氨基酸顺序,在已知的核苷酸顺序的基础上被定下来。在人和牛的因子Ⅸ和顺序分析方面,已经出版了若干蛋白质的顺序资料(Discipio    et    al.,ibid)。蛋白质的氨基末端部位携带有12个谷氨酸残基,在成熟的蛋白质中,谷氨酸残基被转化成γ-羧基谷氨酸残基(Gla),涉及到因子Ⅸ活化作用的断裂部位已经被鉴定(Kurachi    and    Davie,ibid)。在因子ⅨcDNA克隆的5′末端的顺序为信号肽编码,该肽是大量被分泌出来的蛋白质中一个典型(Kurachi    and    Davie,ibid)。到目前还没有报导通过重组DNA的方法表达因子Ⅸ的基因。
由于难以获得因子Ⅶ基因的全长cDNA克隆,采用三个新颖的方法,提供编码序列的5′末端,包括编码前导肽的区域。按照第一种方法,对于因子Ⅶ的部分cDNA克隆连到编码前导肽和因子Ⅸ的5′部分的片段上。这一方法的基础就是两个分子的氨基末端对相应的蛋白质束缚钙的活性承担责任,并且,因子Ⅶ的钙离子束缚活性可以代替因子Ⅶ的活性。由于血凝固子特异的丝氨酸蛋白酶活性存在于分子的羧基末端部位,作为结果而产生的多肽仍然保留真正因子Ⅶ的生物活性。第二种方法把部分的cDNA克隆与编码因子Ⅶ前导肽和氨基末端区域的顺序联合起来。这里所揭示的因子Ⅶ的部分cDNA和氨基酸顺序,对于因子Ⅶ的5′位组成的克隆,能够筛选出基因组DNA的基因库和cDNA的基因库。第三种方法把部分cDNA克隆联结到杂种上。杂种的编码顺序包括cDNA片段。该片段编码因子Ⅸ的前导肽顺序和合成基因片段,该片段又编码匹配的钙束缚区或者为因子Ⅶ编码一个预测氨基末端顺序。根据在这里揭示的前述尚未公开的氨基酸顺序的资料,已经为因子Ⅶ氨基末端建立了编码顺序。从因子Ⅶ的资料和已公开的资料中已诱导出其它决定维生素K的质粒蛋白匹配顺序。
与上述的方法相一致,为了筛选因子Ⅶ基因的5′位置所组成的克隆,发明者已经成功地获得了适合于表达的全长的正确cDNA。
在产生的cDNA克隆中,标记有“λⅦ2463”的克隆得到了因子Ⅶ大的cDNA插入片,发现其含有因子Ⅶ全部编码顺序。这一克隆包括一个5′未转译区的35核苷酸,为60氨基酸前导肽编码的180核苷酸,为406氨基酸成熟蛋白编码的1218核苷酸,一个停止密码子,3′未转译顺序的1026核苷酸和一个20碱性多聚腺嘌呤末尾(在2463位置处开始)。这一cDNA的两条线上全部被排出顺序。把它与早期从λⅦ2115和λⅧ923克隆中分离的两个cDNA插入段相比较揭示出,λⅦ2463在单一EcoRⅠ片段上具有因子Ⅶ前导肽和成熟蛋白质顺序编码的因子ⅦcDNA。
被分离出的第二克隆,λⅦ1565,有一个cDNA插入段被鉴定为与λⅦ2463克隆的cDNA从第9核苷酸到638号核苷酸是相同的,除了缺失100-165号核苷酸以外(图1b)。比较cDNAs与因子Ⅶ的基因组DNA,缺失的顺序精确地相应于一个类外显子区域。因此,已得到因子Ⅶ的两个cDNAs似乎反映了连接两顶的二者择一的mRNA。
由λⅦ2463编码的前导肽格外长(60个氨基酸)并且有一与因子Ⅸ,蛋白质C和凝血酶元相比较十分不同的疏水外形。这一前导肽在位点-60和-26处有两个接点。起点很可能开始于第一接点,因为疏水区,典型的信号肽,跟在位置-60的接点,而不是在位置-26的接点。有意义的是在λⅦ1565中缺失的顺序严格地相应于基因组克隆的类外显子,缺失的顺序又产生了38个氨基酸前导肽,具有疏水模式,十分类似于因子Ⅸ,蛋白质C,和凝血酶元。
由于当时还不知道上述的前导肽是否可靠,在努力分析5′端顺序时开始另一方法。简要的说,这一方法包括人体染色体组DNA基因库的建造和筛选,并包括鉴定由因子Ⅶ基因顺序所组成的染色体组克隆。染色体组顺序的5′位置按顺序连到建造全长克隆的cDNA上。
在另外一种建造中,λⅦ565的5′因子Ⅶ的cDNA片段含有所有的前导肽和29个成熟氨基酸顺序被连结到λⅦ2463的cDNA片段上,(带有成熟蛋白质和3′-未被转译顺序)。“565-2463”顺序编码全部因子Ⅶ的cDNA顺序作为单一的EcoRⅠ片段。
上述DNA顺序被插入到适当的载体,接着,载体被用于转染哺乳动物细胞系。在实行这一发明中所使用的表达载体要含有一个能够指导外来基因在被转染的哺乳动物细胞中转录的启动子。由于在指导转录中的效率,病毒启动子是优先的。一个特别优先的这种启动子就是来自腺病毒2号晚期主要启动子。这一表达载体也有一套RNA接点,位于启动子的下游和具有血凝生物活性的蛋白质编码基因插入部位的上游。优选的RNA接点顺序可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因中得到。表达载体还含有位于插入区下游的多聚腺核苷酸信号。病毒多聚腺核苷酸信号是优先的,如来自SV40的早期的或后期的多聚核苷酸信号,或来自腺病毒5∶E1b区的多聚核苷酸信号。在特别优选的实施方案中,表达载体还包括一个病毒前导肽顺序如腺病毒2号三分体前导肽,位于启动子和RNA连接区之间。优先的载体还可能包括增强因子顺序,例如SV40增强因子。
克隆的DNA顺序可被引入培养的哺乳动物细胞中,借助于磷酸钙调控的转染。(Wigler等cell    14:725,1978;Corsaro    and    Pearson,质体细胞遗传学Somatic    Cell    Genetics    7:605,1981;Graham    and    Van    der    Eb,病毒学Virology    52∶456,1973)DNA和磷酸钙形成沉淀,这种测定被用于细胞,部分细胞吸收DNA,并使DNA在细胞中维持数日,少量的细胞(典型的10)稳定地把DNA整合到染色体组中。为了鉴定这些稳定的整合,一个给出可选择表现型的(可选择的标记)基因一般与有益基因一起引入。优先的可选择的标记包括对药物有抗性的基因,如G-418和氨甲蝶呤。可选择的标记可以在有益基因被引入到细胞中在不同的或相同的质粒上被引入。一种优先选择的标记是对药物G-418有抗性的基因。该基因被携带在质粒pKO-neo上(Southern    and    Berg,J.mol.Appl.Genet.1∶327-341,1982)。加入附件DNA,称做“载体DNA”到混合物中,该混合物被引导到细胞中也可能是有利的。在细胞吸收了DNA之后,让它们生长一个时期,典型的是1-2天,就开始表达有益基因。在选择以稳定形式表达选择标记的生长细胞时,常采用药物筛选。对于有益蛋白质的表达可以筛选这些细胞的克隆。
由被转染的细胞产生的因子Ⅶ和因子Ⅸ可以从细胞培养基除去,用吸收到柠檬酸钡的方法。用过的培养基与柠檬酸钠,氯化钡收集的沉淀相混合。然后,被沉淀下来的物质可被用来测定适当凝血因子的存在。通过免疫吸收法,可以进一步纯化。优先的免疫吸收段包括高度特异的单克隆抗体。柠檬酸钡沉淀物的纯化或者采用常规的生物化学方法,杂环采用高性能的液相色谱法来完成。
如同Hedner和Kisiel(J.Clin.Invest.71∶1836-1841,1983)所描述那样,使用因子Ⅻa可以成功地把单链的因子Ⅶ转变成有活性的双链因子Ⅶa,或者使用具有象胰蛋白酶那样特异性的其它蛋白酶(Kisiel和Fujikawa,Bebring    Inst.Mitt.73∶29-42,1983)。
简要的说,本发明提供了产生活性蛋白的方法,利用被转染的哺乳动物细胞,产生的蛋白质具有维生素K决定血凝因子的活性。编码凝血因子特异丝氨酸蛋白酶区的基因顺序从cDNA的基因库中分离出来。编码前导肽和钙束缚区的顺序从cDNA或从染色体组基因库中分离出来,或者从合成寡核苷酸中建造。然后将顺序联结在表达载体上,以便编码蛋白质,使蛋白质具有在血凝过程中具有所期望的生物活性。作为结果的载体和含有药物抗性的质粒联合转染到适当的哺乳动物组织培养细胞中。这样,通过加入适当药物,如G-48,可选择被转染的细胞。然后蛋白质产物从细胞生长的培养基中提纯,并测定其在凝血试验中的生物活性,用大的真正凝血因子制备的抗体测定免疫学的交叉反应。
扼要介绍下述例子,例1揭示因子Ⅶ全部cDNA顺序的克隆。例2揭示人因子Ⅶ的部分氨基酸顺序,包括在氨基末端的约30个氨基酸的顺序。例3揭示一种人染色体组DNA基因库的结构和筛选,并且揭示了含有因子Ⅶ基因顺序的染色体组克隆的鉴定识别。例4揭示两种杂交基因片段的结构,每一杂交片段均包括一个cDNA片和一个合成的两线片段,cDNA片段编码因子Ⅸ的前导肽,合成双线片段编码同感钙束缚区。于是,杂交种的顺序被联结到因子Ⅶ的部分cDNA克隆上。由于利用体外产生突变,同感序列被改变为与因子Ⅶ蛋白质顺序资料相一致的序列。例5说明一种编码融合蛋白的基因顺序的建造。该蛋白包括因子Ⅸ的钙束缚区,和因子Ⅶ的特异丝氨酸蛋白酶区。例6说明了所使用的载体pD2建造,该载体用于表达蛋白,在被转染的哺乳动物细胞中产生,具有凝血的生物活性。例5中所述的基因融合就是剂用该载体表达的。例7说明利用载体pD2在被转染的哺乳动物细胞系中表达因子Ⅸ基因。例8说明了载体pM7135的结构,该载体携有DNA的顺序,编码初级转译产物,初级产物包括因子Ⅸ和因子Ⅶ融合后的前导肽顺序。这一载体可被用来在转染哺乳动物细胞系中生产具有因子Ⅶ活性的蛋白质。例9说明了使用cDNA顺序表达因子Ⅶ和从染色体组cDNA杂交种顺序中表达因子Ⅶ。
以下的实施例用于说明本发明,但不是为了限制。
实施例
限制性内切酶从Bethesda研究室(BRL)和新英格兰生物实验室得到,并且除非另作说明,限制性内切酶按制造者的说明使用。按照实用生物系统模式380    DNA合成器合成寡核苷酸,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法在变性凝胶上纯化寡核苷酸。正如Maniatis描述的那样转化大肠杆菌细胞(分子克隆:实验手册,Molecular    clonig:A    Laboratory    manual,cold    spring    Harbor    Laboratory,1982),从BRL研究室得到M13和pUC克隆载体和宿主菌株。像Kisiel和Mc    Mullen(ibid)描述的那样,从人血中制备因子Ⅶ。
实施例1    部分因子Ⅶc    DNA的克隆
A    人肝c    DNA基因库结构
采用Chandra    等人的方法,从人肝m    RNA制得一个cDNA基因库(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶1845-1848,1983)。通过碱式蔗糖梯度法(Monahan    etal.,Biochemistry.15∶223-233,1976)可沉降c    DNA制剂,含有1000以上核苷酸的物种分馏物被合并。利用反转录酶,用SI核酸酶处理,第一链制剂被制成双链制剂,(Chandra等1983),在四种脱氧核苷三磷酸全部存在的情况下,利用DNA多聚酶Ⅰ,残基摇晃端被充满。(Maniatis等,分子克隆:实验手册,Cold spring Harbor Laboratory 1982)用Eco RⅠ甲基酶处理平整末端的cDNA,并使用T4DNA连接的把c DNA平整末端连结到Eco RⅠ连接子上(maniatis等ibid)。连接的DNA制剂用Eco RⅠ彻底酶解,除去多余的连接子顺序。并且,在长度上大于1000个碱基对的双链DNA用中性蔗糖梯度离心法提纯(Manintis等ibid),本地的λgtll DNA被连结到核苷酸连环体上,用Eco RⅠ完全酶解,用细菌碱性磷酸酶处理除去5′末端磷酸。合并的人肝c DNA连结,体外包装(Maniatis etal.,ibid)用于感染大肠杆菌Y1088(Young和Davis,Science,222∶778-782,1983),在这个基因库中产生大约有14×106初级噬菌体斑,每个斑块由七个2×106基因库组成。其中90%以上的是重组的,含有人DNA的插入体,其根据是,在用Eco RⅠ酶解,经琼脂凝胶电泳后的特征以及发现有20个随机克隆缺失β-半乳糖苷酶活性。以噬菌体颗粒形式存在的cDNA基因库,经氯化铯梯度离心法提纯,SM缓冲液保存(maniatis等)。
B    为因子Ⅶ克隆筛选人肝c    DNA基因库
利用提纯的因子Ⅶ,用Brown等人的方法制备125Ⅰ标记的单克隆因子Ⅶ抗体,利用因子Ⅶ抗体,对前面所提到的人肝表达c DNA基因库筛选特异抗原(Young和Davis,ibid)。筛选6×106个噬菌体斑,鉴定出一个分离体,标号为λⅦ2155,其对抗体是阳性反应。
把噬菌体克隆λⅦ2115与其他两种抗因子Ⅶ的单克隆抗体和兔的对因子Ⅶ的多克隆抗体进行试验。分离物λⅦ2115对所有的抗因子Ⅶ的抗体都呈阳性反应。
从λⅦ2115的平皿溶解物中制备出DNA(Maniatis等pp65-66,1982)用Eco    RⅠ酶解该DNA释放出2139碱基对的插入物,该插入物被亚克隆到M13噬菌体载体(Messing,meth.in    Enzymology    101∶20-77,1983和Norrander等Gene26∶101-106,1983),其链末端为双脱氧DNA顺序(Sanger等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74∶5463-5476,1977),这一cDNA插入物在位置214,839和1205处相应的标记为Pst    Ⅰa,Pst    Ⅰb,Pst    Ⅰc,见图Ⅰa)有Pst1号接点,在位置611有Smal接点。M13模板顺序排列如下:
(1)在M13mp18中的全长(2139个碱基)Eco    R    Ⅰa→Eco    R    Ⅰb断片定名为克隆F7-1。
(2)在M13mp19(F7-2)中的Pst    Ⅰa→Eco    R    Ⅰa    214个碱基断片。
(3)在M13mp19(F7-3)中的Pst    Ⅰa→Pst    Ⅰb    625个碱基断片。
(4)在M13mp18(F7-7)中的Pst    Ⅰb→Pst    Ⅰa    625个碱基断片。
(5)在M13mp10(F7-8)中的Sma    Ⅰ→Pst    Ⅰb    228个碱基断片。
(6)在M13mp18(F7-9)中的Pst    Ⅰb→Pst    Ⅰc    366个碱基断片。
(7)在M13mp18(F7-10)中的Pst    Ⅰc→Pst    Ⅰb    366个碱基断片。
(8)在M13mp19(F7-11)中的Pst    Ⅰc→Eco    R    Ⅰb    930个碱基断片。
(9)在M13mp18(F7-12)中的Eco    R    Ⅰb→Eco    R    Ⅰa全部断片。
(限制性内切酶位置标号参考图Ⅰa)。
数据资料证明双链的91%编码和15%的3′无编码区,资料又给出一个单链顺序信息,9%仍是编码区,85%无编码区。
从c    DNA顺序预测的氨基酸顺序与Kisiel和Mc    Mullen的已知的氨基酸顺序资料(Thrombosis Research 22∶375,1981)及下面的氨基酸顺序(例2)的比较揭示出一种异常结构,这种异常结构可以被解释为在靠近位置400的DNA顺序中,缺失三个核苷酸。为了获得另外的顺序资料,用Eco RⅠ酶解λⅦ2115,因子Ⅶ编码断片被插入到已被用EcoRⅠ酶解的pUC13中(Vieira和Messing,Gene19∶259-268,1982;和Messing ibid)。作为结果的重组质粒,定名为pUCⅦ2115,用在位置328处切口的XbaⅠ酶解。被酶解的样品对半分开,一半用α32P-d CTP和DNA聚合酶Ⅰ标记(Klenow断片)(Englund,P.T.,J.Mol.Bio.66∶209,1972);另一半用γ32PATP和多核苷酸激活酶标记(Chaconas等,Biochem.Biophys.Res.Comm.66∶962,1975),然后,标记的质粒用Pst Ⅰ重切,产生113和509碱基对断片。这些断片的每个双链都按Maxam与Gilbert的方法编出顺序(Meth.in Enzymology 74∶560,1980)。对113碱基对片段全部排出顺序,509碱基对片段中的210碱基对也排出顺序。这些顺序揭示三个另外的碱基(一个C,两个G′),它们提出的DNA顺序资料与蛋白质顺序资料相一致,并指出由于涉及到G和C的次级结构,前面的异常结构起因于顺序凝胶上的压力。双链上编码压的最后9%的编码顺序也已被证实。
pUCⅦ2115插入物顺序的进一步分析证实,这一克隆片断的一部分,在因子Ⅶ断裂处编码11个已知氨基酸的顺序(Kisiel和Mc    Mullen,Thrombosis    Researeh    22∶375,1981)。把这一顺序与因子Ⅸ(Davie    etal.,ibid)因子Ⅹ(Leytus    etal.,Proc    Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶3699-3702,1984)相比较,氨基酸的顺序提示,该克隆具有因子Ⅶ的顺序,大约开始于为成熟的因子Ⅶ蛋白质的第36个氨基酸编码的核苷酸,并且继续约1000个编码的和1100个未编码的核苷酸和多聚腺核苷酸顺序。此外,还发现,该克隆在3′编码部位有移码突变。
为了获得正确的3′编码区,7个λgetⅡcDNA基因库的一千四百万克隆全都与λⅦ2115(Maniatis    etal.,pp.109-112,1092)切口转译的c    DNA进行斑块杂交实行筛选(Benton    and    David    Science    196∶180-181,1977)。
然后,用c    DNA插入片段已经被亚克隆到pUC中的质粒的双脱氧顺序来筛选出七个阳性分离物(Wallace    etal,Gene    16∶21,1981)。用Eco    RI酶解λgt11克隆,因子Ⅶ的断片插入到已被EcoRⅠ断裂的pUC13,除了一个例外,其余全部在相应于λⅦ2115插入片中碱基212的位置上开始,唯一的例外是仅含3′无编码顺序。一个在碱基212开始的克隆被挑选来进行分析,克隆定名为pUCⅦ1923。
由于p UCⅦ2115的分析指出,在位置657和815之间存在有移码突变,所以p UCⅦ1923是第一个利用Maxam-Gilbert顺序仪在这一区域被分析的。质粒p UCⅦ1923可被Nar Ⅰ(位置779,见图1a)酶解。由于使用DNA多聚酶I,切断的DNA被α32P-dCTP标记,接着,用AVa Ⅰ(在Sma断裂处相同的位置切断图1)和FagⅠ(在1059位置)酶解,产生一个Nar Ⅰ-AVa1 166bp的断片和一个200bp Nar Ⅰ-Fag Ⅰ的断片。其中的每一个都被排出顺序。还发现,在p UCⅦ2115中缺失的A.C.在697位置上,所缺失的另一个C在798位上。
按照p    UCⅦ1923整个插入片的M13亚克隆,采用双脱氧法筛选,已经表明p    UCⅦ1923编码区域其余顺序是正确的。引子Lac    ZC87(表1)习惯上顺序是位置212(图1a)到512,引子Zc18(CTCTGCCTGCCGAAC)习惯顺序是715-1140,而引子ZC17(ATGAGAAGCGCACGAAG)是720-350。既然p    UCⅦ2115插入片从位置13到695是正确的(位置1-12包括一个人为连接子),pUCⅦ1923从位置212到末端也是正确的,那么二者连结在一起,产生一个分子,位置从13到末端也是正确的。这一连接所利用的方便之点是在位置328的Xbal,图1a显示的是正确分子连接的顺序。由于全长的因子Ⅶ克隆是很难从c    DNA克隆中得到,因此,所采用的三种策略方法提供缺失编码顺序,必要的上游过程和信号顺序。第一策略应是从人染色体组DNA基因库中或通过另外筛选的c    DNA基因库得到所必要的顺序。第二种途径是合成必需的5′编码顺序,它是根据因子Ⅶ的氨基酸顺序资料(例2)和已公开的编码维生素K决定凝血因子的基因顺序(Kurachi    and    Davie,ibid;and    Davie    etal    ibid.),然后把合成的顺序连结到因子Ⅹ的部分前原顺序上。第三个策略依赖于因子Ⅶ和因子Ⅸ氨基末端区域功能的相同。所建造的顺序包括因子Ⅸ的前导肽和氨基末端部分的编码区域。因此,该顺序就以适当的取向与部分的因子Ⅶ的c    DNA融合。
为了得到包括因子Ⅶ的DNA的全部顺序的DNA顺序,试图分离保留的5′DNA顺序。实现这一任务是利用5′末端0.3 Kb Eco RⅠ-Xbal断片从λⅦ2115的c DNA插入物到筛选出由2×106个噬菌体组成的c DNA基因库,建造基因库是采用Gubler与Hoffman的方法,利用来自Hep G2细胞的多聚腺核苷酸m RNA(Gene 25∶263-269,1983),RNA被反转录,产生第一链c DNA,接着利用DNA多聚酶Ⅰ和RNA酶H合成第二链DNA。在Eco RⅠ甲基化,琼脂糖(6B)柱后,用T4DNA多聚酶使DNA的末端被变钝。加入EcoRⅠ连接子,用EcoRⅠ酶解法和在琼脂糖CL2B上层析除去多余的连接子。收集外水体积的DNA并联到已用EcoRⅠ酶解的λgtll上,并用小牛肠磷酸酶处理。分装DNA并感染引大肠杆菌E.Coli Y1088上。测定出有几个呈阳性,其后或者利用常用引子M13,或者利用因子Ⅶ的特异寡核苷酸,把EcoRⅠ片段亚克隆到M13噬菌体载体中,成为双脱氧顺序。
从此出发,得到了因子Ⅶ三种新的c    DNA克隆,它们的顺序已全部定下来。其中最大的c    DNA来自克隆λⅦ2463,具有全套的编码因子Ⅶ的顺序。该克隆包括5′末翻译区的35个核苷酸,为60个氨基酸前导子编码的180个核苷酸,为406个氨基酸成熟蛋白质边码的1218个核苷酸,一个停止密码子,3′未翻译顺序的1026核苷酸和20个多聚腺核苷酸碱基末尾(在2463位开始)。这一c    DNA的双链全都排出了顺序。与早期从λⅦ2115和λⅦ1923上分离的两种c    DNA相比较,揭示出,克隆λⅦ2463含有额外321核苷酸,其位于λⅦ2115插入区的上游,还有519额外核苷酸,其位于λⅦ1923插入片的上游。λⅦ2463因子Ⅶ顺序和前述两个c    DNA重叠的部分是相一致的,例外的是λⅦ2463的c    DNA在位置1005和1106上没有单个碱基缺少,在λⅦ2115的c    DNA上检出了该碱基缺少。于是,在单个EcoRⅠ片段上,λⅦ246有一个因子Ⅶc    DNA,它编码因子Ⅶ前导子和成熟蛋白顺序。
另一个c    DNA,λⅦ1565,被分离出来,并发现它具有5′末端的因子Ⅶ顺序,但是在编码顺序内被削断了,它的5′末端标在第九核苷酸上(图1b)。
与全长的λⅦ2463相比,λⅦ565缺少一个相对于前导顺序内类似外显示区的顺序。λⅦ565缺少碱基100-165(图1b)。通过比较染色体组顺序资料(如例3所述)缺失的顺序准确的对应于类似外显示区。这样,λⅦ565的结构可能是前导子顺序中选择连接的结果。
由λⅦ2463编码的前导子格外长(60个氨基酸),与因子Ⅸ,蛋白质C、凝血酶元相比,有一个十分不同的疏水外围。该前导子含有两个接点,位于-60和-26。起始端很可能从第一个接点开始,因为疏水区,典型的有信号的肽,跟在位置-60的接点,而不是跟在-60的接点处。有意义的是,在λⅦ565中缺失的顺序,它严格地对应于染色体组克隆的类外显子区,产生了38个氨基酸的前导子,具有十分类似于上述蛋白质的疏水模式。
实施例2:人因子Ⅶ的氨基酸顺序
为了确定假定的c    DNA克隆,即因子Ⅶc    DNA的基本顺序,提供信息合成特异寡核苷酸探针,筛选含有5′顺序克隆的c    DNA和染色体组基因库,建造编码因子Ⅶ的氨基末端部分的合成断片,人们期望着说明人因子Ⅶ的氨基酸顺序。尽管Kisiel和Mc    Mullen提供了有限的氨基酸顺序,但更多的信息是需要的。
用Crestifield等人的方法(J.Biol.Chem.238∶622-1963)还原和羧甲基化提纯的人因子Ⅶa。羧甲基化的因子Ⅶa的轻多钛链和重多肽链通过高效液相色谱(HPLC)被区分开。在微型的Pak    C18反相柱上(Varian    Corp.),在蒸馏水(A)和0.1%TFA的乙腈(B)溶液中产生一个0.1%TFA的梯度,5分钟在0-40%B液,25分钟在40-80%B液和5分钟在80%~100%的B液。通过自动的埃德曼降解利用气相蛋白顺序仪(由Biosystems,Inc提供)分析每条肽链的大约300微克分子。在轻、重肽链的氨基末端上分别鉴定了29和18个氨基残基。因子Ⅶa重链的末端顺序和c    DNA克隆p    UCⅦ2115(图2b)所编码的顺序是一致的。图2a和图2b中的氨基酸残基用单字母码标记如下:
A.丙氨酸;    C.半胱氨酸;
D.天冬氨酸;    E.谷氨酸;
F.苯丙氨酸;    G.甘氨酸;
H.组氨酸;    I.异亮氨酸;
K.赖氨酸;    L.亮氨酸;
M.甲硫氨酸;    N.天冬酰胺;
P.脯氨酸;    Q.谷氨酰胺;
R.精氨酸;    S.丝氨酸;
T.苏氨酸;    V.缬氨酸;
W.色氨酸;    Y.酪氨酸;
X.未知残基;
*Gla残基(λ)
星号*代表Gla残基(λ),该残基被指出是由于类似于其他已知的凝血因子的结构并且在该位置上缺乏任何其他苯异硫脲氨基酸。
空位(一)是在顺序中间提供一个最好单行。还有信息标明,在位置5和9的氨基酸相应的是赖氨酸,(而不是苏氨酸)和精氨酸,如前报告一样(Kisiel    and    Mc    Mullen,ibid)。因子Ⅶa的轻链来源于因子Ⅶ氨基末端区的顺序分析。
为了得到其它顺序资料,2毫微克分子的羧甲基化的轻链用牛胰凝乳蛋白酶酶解12小时(1∶100重量比,酶∶底物),0.1M NH4HCO3,PH7.8,温度37℃。产生的断片用高效液相色谱,在微型Pak C18反相柱上纯化,使用上述的溶液,使用5分钟0~30%B液,25分钟30~60%B液和10分钟60~80%的B液的梯度。用紫外光吸附法在220和280nm处鉴定肽。冷冻干燥的肽(每种约10-9克分子)用Edman降解进行分析。结果(图2b)证实了p UCⅦ2115克隆相应区域中c DNA的大部分顺序。总起来说,因子Ⅶa轻肽链的152个残基中的113个(占75%)被鉴定。该顺序与已知的c DNA结构所编码的顺序是相同的。间接的证据指出A Sn 145是碳水化合物的附着点。
实施例3    染色体组因子Ⅶ顺序的克隆
作为一种提供在c DNA中缺少5′末端顺序的方法,含有人胎儿肝DNA的噬菌体基因库λ(Lawn etal.,Cell 15∶1157-1174)可以用切口转译的因子Ⅶc DNA进行筛选。一部分染色体组基因库平皿培养大肠杆菌E.Coli LE392(ATCC33572)产生总共有7.2×106个斑块(Maniatis etal ibid,pp320-321)。噬菌体斑块从平皿中被吸收到硝化纤维素上并且按照Benton和Davis的步骤(Science 196∶180,1977)与32P标记的c DNA杂交。得到八个克隆和纯化斑块。
利用DNA片段(EcoRⅠa-XbaⅠ,图1)(来自因子Ⅶ的c    DNA(λⅦ2115)的5′末端)和标准化技术(Maniatis    etal,ibid),含有5′末端顺序的染色体组克隆被鉴定。这些噬菌体定名为7m1,7m2和7m3。从这些重组的噬菌体制备出DNA,并且得到初级限制性核酸内切酶图谱。噬菌体7m1,有最强的杂交信号,用来产生更广泛的限制性内切酶图,并且也用来以Southern吸印法将EcoRⅠ-Xba    Ⅰ的c    DNA顺序在图上定位。
为了判定噬菌体7m1是否具有编码因子Ⅶ蛋白质的氨基末端氨基酸的DNA顺序,噬菌体DNA限制性内切酶解的Southern吸印斑与低聚核苷酸混合物杂交,低聚核苷酸的顺序是从因子Ⅶ的氨基末端的氨基酸顺序演绎出的。寡核苷酸Zc188,Zc360和2    C401(表1)是用T多聚核苷酸激活酶进行放射性标记,并与噬菌体DNA班点在低于Tm的摄氏几度下杂交(Wallace,R.B.,etal,Nuc.Acids    Res.6∶3543-3557,1979)。该分析结果指出7ml的断片3.7Kb    sst    I含有与这些寡核苷酸杂交的顺序。这种sst    I的断片被亚克隆到MB中,进行DNA顺序分析。以ZC360作为顺序引子所得到的结果鉴定大约60个核苷酸长度的区域,该核苷酸顺序与氨基末端蛋白质顺序资料是一致的。
表1
寡核苷酸    顺序
ZC87    TCC    CAG    TCA    CGA    CGT
T    G    A
ZC188    GCC    GGG    CTCA    CTC    CTC    CA    GAA    GGC    GTTGG
C    A    G
ZC212    GAC    CTG    CAG    GAT    CCA    TGC    AGC    GCG    TGA    ACA    TGA
TCA    TGG
ZC213    GAG    GCC    TGG    TGA    TTC    TGC    CAT    GAT    CAT    GTT    CAC
GCG    CTG
ZC217    ATG    AGA    AGC    GCA    CGA    AG
ZC218    CTC    TGC    CTG    CCG    AAC
ZC235    GAT    CCA    TGC    AGC    GC
ZC249    AGA    ACA    GCT    TTG    TTC    TTT    CA
ZC275    GCC    CCC    ATT    CTG    GCA
ZC286    CCA    AAG    AGG    GCC    AAC    GCC    TTC    CTG    GAG    GAG    AGA
CCT    GGG    AGC    CTG    GAG    AGA    GAG    TGT    ATT    GAG    G
ZC287    AAT    ACA    CTC    TCT    CTC    CAG    GCT    CCC    AGG    TCT    CTC
CTC    CAG    GAA    GGC    GTT    GGC    CCT    CTT    TGG
ZC288    AGC    AGT    GTA    GCT    TCG    AGG    AGA    ACA    GAG    AGG    TTT
TCG    AGG    CCA    GCG    ACG
ZC289    AAT    TCG    TCG    CTG    GCC    TCG    AAA    ACC    TCT    CTG    TTC
TCC    TCG    AAG    CTA    CAC    TGC    TCC
ZC333    CAG    CTT    CGT    CCT    GTC    GCT    GGC    CTC
ZC336    CCT    CTT    TGG    GCC    TGG    TGA
C    C    C    C    G
ZC360    CA    TC    TC    TC    TT    CA
T    T    T    T    A
ZC401    CGT    AGC    GTT    CAG    GCC    CTC    GAA    GAT    CTC    GCG    GGC
CTC    CTC    GAA    GCT    ACA    C
既然已知染色体克隆7ml在外显子上游含有7kb,那么可以预期该克隆编码了因子Ⅶ5′未转译顺序和前导子的顺序,直到氨基酸位置-17。为了证实外显子1被编码在染色体组克隆7ml中,来自克隆λⅦ2463和λⅦ1565的前导子顺序信息用于设计寡核苷酸ZC28和ZC29(如下所示)。
ZC528
5′TCA    ACA    GGC    AGG    GGC    AGC    ACT
ZC529
5′TTC    CAC    GGC    ATG    TCC    CGT    GTT
ZC528
GCA    GAG    ATT3′ZC529
TCT    CCT    CCT3′
这些被用来探测7ml    DNA,并且发现亚克隆,7SD与上面的两种寡核苷酸杂交。外显子1被确认由两个外显顺序组成:外显子1a和1b。
外显子1a与ZC528杂交(相对应于λⅦ2463的1-30核苷酸),外显子1b与ZC28杂交(相对于λⅦ2463的119-148核苷酸)。在外显子1a和1b两侧面的内显子顺序已被排出。1a外显子3′末端有一个同感的连接供体顺序,而1b以同感的连接受体(1b的上游)或供体(1b的下游)顺序位于每个末端的两侧。外显子1a在染色体组克隆7ml中的位置已被精确地用图表示出来。而1b的位置也已经用图表示在一定的区域内。1b的顺序存在于λⅦ2463中,而λⅦ565似乎是从位于1a和2之间剪接的RNA中被诱导出来的。
载体pUC和M13中的各种7ml的亚克隆被制备出来以促进保留的外显子的顺序化。从c    DNA顺序中设计出的适宜的寡核苷酸相对应于外显子1至7,并且被用来排出除最后一个外显子以外的其它外显子的顺序。通过这些区域,染色体组顺序严格与c    DNA顺序相对应。
而且,对于释放位1-7来说,内/外显子的范围已经确定,目前大多数已用图精确地表示的克隆7ml中。在因子Ⅶ基因中,内显子的大小和位置列入表2。
表2
因子Ⅶ基因中内/外显子的连结
内显子    氨基酸位置    内显子大小(kb)
A    -39    >0.2
B    -17    >1.0
C    37/38    1.92
D    46    0.068
E    84    ~2
F    131    ~1
G    167/168    0.56
H    209    1.31
已经知道,噬菌体7ml缺少因子Ⅶ的3′-末端,包括外显子8。为了获得这些顺序,在λL47.1(由人皮肤原始成纤维细胞诱导的)中,12-13kb充实的BamH1基因库(Lenen    and    Brammer,Gene    10∶249,1980;Maniatis,etal,ibid),是从人皮肤初级成纤维细胞中衍生物的,是用两个切口转译的因子Ⅶc    DNA    Pst1断片进行探测的(对应于外显子7中的顺序和3′-末转译的顺序)。一个克隆,叫做7DCl,用这两种探针来测定。以后的限制性核酸内切酶和Sohthern吸印分析确定克隆7DCl与克隆7ml相重叠,7DCl延长到7ml末端外约3kb,并包含有一个外显子8。来自含有外显子8的7DCl    DNA的3.9kb(XbaI-BamH1)片段被亚克隆到M13中,利用与其5′和3′末端互补的寡核苷酸完成了顺序分析。全部外显子顺序都存在于该克隆中。
实施例4合成的编码顺序的因子Ⅸ和因子Ⅶ杂交基因
A    因子Ⅸ前导子-合成性因子Ⅶ5′编码序列的杂交体的建造
根据因子Ⅶ氨基末端氨基酸的顺序,其它的维生素K决定凝血因子的氨基酸顺序,以及已知的其它的维生素K决定凝血因子基因的核苷酸顺序(Kurachi    and    Davie,ibid,Anson    etal.,EMBOJ.3∶1053-1060,1984,and    Davie    etal,ibid),利用在上述基础上预测的核苷酸顺序,得到因子Ⅶ5′编码顺序的第二种方法就是合成适当的双链断片。为了给分泌成熟的因子Ⅶ的类似物提供必要的分泌和过程信息,该合成的断片(同感顺序)被连到由因子Ⅸc    DNA克隆诱导来的两条前导顺序中的一条上。图3给出该策略的大致轮廓。
编码人因子Ⅸ的c    DNA来自人肝m    RNA所产生的基因库(Kurachi    and    Davie,ibid)。因子Ⅸ顺序是利用Pst1酶解,从p    BR322载体中分离的,并且因子Ⅸ顺序又被插入到p    UC13的Pst1位置上。该质粒定名为FIX-pUC13。为了除去富G区(富G区是作为c    DNA克隆化的结果,存在于因子Ⅸ插入片的5′端),合成寡核苷酸的连接物用以代替5′端克隆断片。寡核苷酸ZC12和ZC13(表1)被合成,并复性以产生20碱基对的重迭,填充片断末端并利用适当的限制性内切酶切断它,而在为结果的片段被连到因子Ⅸ的顺序中。
为了建造连接物,把100微微摩尔的ZC12和ZC13冷冻干燥,再悬浮于10微升10倍蛋白激酶/连接酶缓冲液(600mM    Tris,PH8.0,100mM Mg Cl2,100mM DTT),加86ul的水,复性反应是在65℃下,10分钟,混合物慢慢凉到室温,再盖上冰。该混合物中再加入4μl 2.5mM dNTP液和1μl(8单位)T4DNA多聚酶。让反应在45℃下进行45分钟。然后加入10μl 5M的NH4OAC,用苯酚/CHCl3提取DNA一次,用CHCl3提取两次,再用乙醇沉淀DNA。DNA被离心,再悬浮于100μl温和的盐缓冲液中(Maniatis etal,ibid.p.100),用9单位的Pst1和8单位cfol酶解,并且照上述方法提取。
建造变更的因子Ⅸ的顺序联用下列试剂,0.16pM合成Pst1-cfoI连接物片段,0.14pM的1.4kb cfo Ⅰ-Bam HⅠ因子Ⅸ片段,来自FIX-pUC13;0.14pM2.7kb Bam HI-Pst ⅠpUC13载体片段于20μl缓冲液中(60mM Tris-HCl PH7.5,10m MMg Cl2,10mM DTT,和0.9单位T4连接酶)。室温下温育3小时,并转化感受态大肠杆菌JM83(Messing,Recombinant DNATechnical Bulletin,NiH,Publication No.79-99,2,No.2,43-48,1979)。细胞平皿培养在50μl2%X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)液体培养基(含有40 g/ml氨苄青霉素),37℃温育过夜。白色菌落被挑到另一含有氨苄青霉素的培养皿中,在37℃下生长,过夜。除了不用氯氨苯醇培养皿中过夜温育以外,该菌落被涂在Whatman540号纸上,按照Wallace等人的方法(Gene 16;21,1981),该纸为杂交用作准备。然后放在溶液(0.9M Na Cl,0.09M Tris-H1Cl PH7.5,6mM EDTA,0.5% Nonidet P-40,150 μg/ml E.Colit RNA)中培育两小时,44℃。探测该纸的是用32P标记的ZC235(表1),对改变5′末端顺序有特异性的14-mer,每张滤纸上有1-2×106cpm的杂交作用在杂交前缓冲过液,44℃。滤纸用6倍ssc,0.1%SDS,在4℃下洗三次,用2倍ssc,0.1%SDS,在44℃下,洗三次,对X-光胶片曝光。得到两株阳性克隆,其中之一定名为FIX(-G)→pUC13。
为了证实FIX(-G)→p UC13构造的因子Ⅸ的被改变的区域的顺序,应用Chaconas等人的方法,以多聚核苷酸激活酶和γ32P-ATP作为标记的引子末端,应用Wallace等人方法,使用BRL反引子,双脱氧直接排出p UC质粒的顺序。其顺序与预测的是一致的。
作为结果的重组质粒有三个HaeⅢ断裂点,第一点位于因子Ⅸ顺序的39位(根据Anson等人公开的顺序计数),以第一个ATP开始),第二断裂点是位点130。第三个位于p    UC13的多聚连接子内。位点130是早期前因子Ⅸ分子的Lys-Arg加工过程位点密码子上游的单碱基对。在因子Ⅸ-因子Ⅶ杂交体的最后建造中,因子Ⅸ的前导子顺序,在位置39或130处终结,被连到合成的双链段片上。该双链片段包括预测的同感顺序和因子Ⅸ前导子顺序的最后三个密码子。通过连结寡核苷酸ZC86-ZC89(表1)产生合成同感的片段,形成一个双链片段。取100微微摩尔的每种寡核苷酸,冷冻干燥,重悬浮在20μlⅨ激活酶缓冲液,4℃下培育过夜。然后在65℃加热10分钟。利用激活酶处理的寡核苷酸制得两种样品,样品1含有ZC286+ZC287;样品2含有ZC288+ZC289,这一对样品在65℃下复性10分钟,然后冷却到室温,两个小时后再置于冰上30分钟。
改变了的因子Ⅸ段片作为HindⅢ-EcoRⅠ片段从FIX(-G)→p    UC13中除去。取约20μg质粒用10μl含有4μgRNA酶A和30单位的HindⅢ和ERI的HindⅢ缓冲液酶解,37℃,过夜。在65℃加热10分钟终止反应,载体和因子Ⅸ片段在1%琼脂糖凝胶上电泳和电洗脱提纯。用乙醇沉淀因子Ⅸ片段,重悬浮在含有400ng/μl    RNA酶A的缓冲液中,用8单位的HaeⅢ酶解,37℃,过夜。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和后面的电洗脱,HindⅢ-HaeⅢ39个碱基对因子Ⅸ片段从酶解液中分离出来。欲得到HindⅢ-HaeⅢ130碱基对因子Ⅸ片段,用EcoRⅠ和HindⅢ酶解FIX-pUC13,按照上述方法分离因子Ⅸ片段。约3μg的这种HindⅢ-EcoRⅠ片段,用6单位的HaeⅢ酶解,37℃。等分样品以5分钟时间间隔,在30分钟内被转移到含有50mmEDTA的溶液中的小池中。借助于5%丙烯酰胺凝胶电泳和随后的电洗脱,HindⅢ-HaeⅢ130碱基对片段就被提纯。
通过四部分连结,即寡核苷酸样品1与样品2,因子ⅨHindⅢ-HaeⅢ(39个或130个碱基对)和pUC13HindⅢ-EcoRⅠ,最终的因子Ⅸ-同感顺序的杂交种被制备出来。作为结果的质粒用来转化大肠杆菌HB101(ATCC33694),使用EcoRⅠ和HindⅢ酶解DNA来筛选菌落。由联结到合成的同感顺序上的39个碱基对因子Ⅸ的顺序组成的顺序在下文中被称作mini-FIX-FVⅡ。含有该建造的质粒定名为pM7200(-C)。由联结到合成的同感顺序上的130碱基对的因子Ⅸ的顺序组成的顺序被称作Maxi-FIX-FⅦ。含有该建造的质粒定名为pM7100(-C)。同感的顺序编码的多肽包括的氨基酸顺序是:
Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-Gla-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-Gla-Arg-Gla-Cys-Lys-Gla-Gln-Cys-Ser-Phe-Gla-Gla-Ala-Arg-Gla-Ile-Phe-Gla-Gly-Leu-Asn-Arg-Thr-Lys-Leu。
B.因子Ⅸ-同感顺序的杂交片段与因子Ⅶc    DNA克隆的连结
因子Ⅶ-同感顺序的杂交种片段(或大的,或小的)被连到5′位因子Ⅶc    DNA上和以三部分联结的载体pUC13上(图4和5)。利用10单位的XbaⅠ和10单位的HindⅢ,在含有RNA酶(400ng/μl)的HindⅢ缓冲液中,酶解6μg的p    UC12,载体片段就产生出来。
mini-FⅨ-FⅦ片段的产生方法如上所述,用10单位的HindⅢ和10单位的EcoRⅠ酶解2μgpM7200(-C)。同样,maxi-FⅨ-FⅦ片段可以从pM7100(-C)中制得。因子Ⅶc    DNA的5′部分从质粒p    UCG705中制成。该质粒包括p    UCⅦ2115的EcoRⅠ-XbaⅠ5′片段,此片段借助于XbaⅠ和EcoRⅠ的酶解作用被亚克隆到p    UC13中。在37℃下,酶解两小时,产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离出来。电泳洗脱所需片段,苯酚/CHCl3和CHCl3提取,乙醇沉淀。三个片段即p UC13/XbaⅠ-HindⅢ,因子Ⅸ-因子Ⅶ(小片段或大片段)/HindⅢ-EcoRⅠ,和′5位因子Ⅶ/EcoRⅠ-XabⅠ,就被连结起来,其条件是在20μl含有2μl 20mMATP和0.9单位T4DNA连接酶的缓冲液中4℃培育,过夜。使用HindⅢ和XbaⅠ,通过限制性内切酶分析,菌落即被筛选。含有mini-和maxi-FⅨ-FⅦ顺序的重组质粒定名分别为pM7200和pM7111。(图4)。
由于在制备因子Ⅶc DNA过程中加入了连接子,所以为了产生正确的编码顺序框架,不得不在融合顺序中做些变更。大的和小融合在与因子Ⅸ同感顺序的杂交体和因子Ⅶ的c DNA之间的连结区都有一个EcoRⅠ位,这是一个人为产物。而且,小融合需要外加一个“C”来改变HaeⅢ位点的顺序即从“′5AGGCCA3′”变为“′5AGGCCCA3′”。并且确定了该顺序下游正确阅读框架。这一校正是寡核苷酸引导位点的特异突变完成的,基本与Zoller和Smith描述双引子方法一样(Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course,Cold Spring Harbor Laboratory,1983)。mini-FⅨ-FⅦ片段通过HindⅢ和XbaⅠ的酶解从pM7200中除去,然后被插入到M13mp19中。采用同样的方法,maix-FⅨ-FⅦ从pM7100中纯化和亚克隆化。突变引子ZC333和ZC336(表1)分别被用于除去EcoRⅠ位点和碱基插入片。在每一种场合,通用的引子ZC87被当为第二号引子。将40pM的引子,60pMATP与1单位T4DNA激活酶混合,60℃,过夜,突变引子被磷酸化。为了从maxi-FⅨ-FⅦ杂交体中除去EcoRⅠ,1μg的M13单链模板与20pM的ZC333和20pM的ZC87在总10μl的体积中结合。引子被复性成模板,65℃,10分钟,冷却到室温5分钟,然后放置在冰上5分钟。由于使用DNA多聚酶Ⅰ,因子被伸展。为了除去EcoRⅠ位点和校正mini-FⅨ-FⅦ杂交体中的解读框架,取1μg适当的M13单链模板ZC333,ZC336和ZC87各20pM相结合。复性和引子伸展反应均如上述进行。
32P标记的引子(ZC333或ZC336)筛选突起的斑块,60℃,并借助双脱氧顺序确定其顺序。作为结果所产生的含有maxi和mini-FⅨ-FⅦ顺序的建造分别定名为pM7111和pM7211。
同感顺序包含有几个手段,其顺序与从因子Ⅶ(图2)中得到的蛋白质顺序不一致。为了产生一种顺序,其编码的多聚核苷酸与因子Ⅶ氨基末端蛋白有更大的同质性,则通过寡核苷酸指导位点的特异突变来更改同感的顺序。其改变是在位点8插入亮氨酸Leu,位点18以异亮氨酸Ile取代赖氨酸Lys(数字是在位点8插入后氨基酸的位置),在26位是天冬氨酸Asn取代丙氨酸Ala,在位点32-34,以顺序Ala-Ser-Asp取代了顺序Gly-Leu-Asn(根据试验的氨基酸资料)。
位点8和18顺序的改变以pM7111(感觉链)作模板。引子ZC352(′5CCC    AGG    TCT    CAG    CTC    CTC    CAG3′)和ZC353(′5CTG    CTC    CTC    CTT    ACA    CTC    TCT3′)被复性为模板并伸展(方法同前)。所获的噬菌体克隆被定名为pM7114。pM7114中插入物的顺序通过双脱氧顺序来证实。
同样,在位点26-34上的改变,是利用突变因子ZC366(′5CAG    CTT    CGT    CCT    GTT    CAG    GCC    CTC    GAA    GAT    CTC    GCG    GGC    CTC    CTC    GAA3′)和作为第二引子的ZC87(表1)在pM7114模板(感觉链)上作出的。作为结果产生的建造定名为pM7115。M13载体上全部550bp的插入物顺序通过双脱氧顺序被确定下来并且发现是正确的。
实施例5:因子Ⅸ和因子Ⅶc    DNA融合建造
按照Kurachi和Davie(ibid)所述利用从人肝c    DNA基因库得来的因子Ⅸc    DNA和例1描述的因子Ⅶc    DNA顺序,已经制备出因子Ⅸ-因子Ⅶc    DNA的融合。
杂交蛋白选择的融合点位于因子Ⅸ38号氨基酸(苏氨酸)和被因子Ⅶc    DNA顺序编码的第一个赖氨酸之间。这些蛋白质将被由因子Ⅸ的c    DNA顺序前252bp和除了前2个密码子以外所有的p    UCⅦ2115因子Ⅶc    DNA顺序组成的顺序编码。为了建造这一杂交顺序,因子Ⅸ的顺序首先被并合到p    UCⅦ2115上,利用常规的限制性内切酶位点。这一融合的结果是质粒FⅨ/Ⅶ/12(如下所述),该质粒含有因子Ⅸc    DNA的前310bp,和与之相连结的因子Ⅶ的全部c    DNA顺序。为了得到杂交蛋白所满意的准确连结,用寡核苷酸定向突变除去插入的碱基对。
因子Ⅸc    DNA顺序连接到因子Ⅶc    DNA的顺序上是将FⅨ(-G)→p    UC13(例4)的0.3Kb    Hind    Ⅲ-AhaⅢ片段连结到来自p    UCⅦ2115的4.7kb    SmaⅠ-Hind    Ⅲ片段上(图5)。利用40单位的Hind    Ⅲ,在40μl温和盐缓冲液中37℃,4小时,酶解3    μg的FⅨ(G)→p    UC13来制备Hind    Ⅲ-Aha    Ⅲ片段。然后,缓冲液增加到100    μl加入5单位AhaⅢ,37℃继续温育18小时。利用1%的琼脂糖电泳,DNA断片被分离出来,0.3kb带也分离出来(方法同前)。p    UCⅦ2115的部分Smal消化作用是通过温育p    UCⅦ2115    3    μg,25℃一小时,48单位Smal,反应体积是30μl完成的。在65℃下,温育15分钟,反应停止。然后用等体积的苯酚提取,乙醇沉淀。
通过微型离心(microfuge spin)收集沉淀,用70%的乙醇冲洗,空气中凉干。DNA被再溶于30μl的温和盐缓冲液中,用30单位的Hind Ⅲ消化3小时,37℃。如上所述,DNA经0.7%琼脂糖电泳,0.47kb的Hind Ⅲ-Sma1断片被分离出来。等克分子量的两种断片(0.048pM)在10 νl反应液中被连接起来,该反应液含有50mM Tris-HCl PH7.5,10mM Mg Cl2,1mMDTT,1mMATP和3单位的T4DNA连接酶,14℃,3.5小时,然后用于转化感受态大肠杆菌E.Coli    RRI(ATCC31343),细胞生长在有氨苄青霉素的培养皿中,12个作为结果的菌落用限制性内切酶消化,被筛选出存在有所期望的质粒建造。来自12个克隆的(FⅨ/Ⅶ/12)的DNA给出预期的限制性内切酶消化模式,被用于杂交种基因建造的下一步。
在单链DNA模板上实现了寡核苷酸定向突变的步骤。这对把并合的因子Ⅸ/因子Ⅶ顺序克隆化到M13mp19中是必要的。为了得到方便的小的DNA断片,从FⅨ/Ⅶ/12中分离出640bp Hind Ⅲ-Xbal断片。该断片含有310bp′5末端因子Ⅸc DNA和330bp因子Ⅶ顺序。载体的制备方法是用20单位Hind Ⅲ和20单位Xbal在40μl温和缓冲液中,消化1μg M13mp19RFDNA,37℃,18小时。DNA经琼脂糖凝胶(1.2%)电泳,从凝胶中可以分离出6.4kb线形断片(方法同上)。5μg FⅨ/Ⅶ/12DNA用10单位XbaⅠ消化,在40μl温和缓冲液中,37℃,18小时。加入20单位Hind Ⅲ,在37℃下继续培养另外7小时。作为结果的断片从1.2%琼脂糖凝胶电泳中分离出,640bp断片被洗脱,方法同上。10ng线形化的M13mp19和lng640bp断片被连结起来,14℃,1小时,然后用于转化感受态大肠杆菌JM101(Messing,Meth,in Enzymology,ibid)。细胞平皿培养在X-gal和IPTG上(Messing,Meth,in Enzymology,ibid)m,8个鲜兰色菌斑被挑出,用来感染2.5ml大肠杆菌JM103 A600=0.3的培养物。37℃培养18小时之后,在室温下离心,获取大量细胞,含有M13噬菌体的上清液20μl,与10μg/溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡混合。通过与已知标准相比,8个克隆中的每一个都有一约正常大小的插入片。利用Messing描述的方法,从1.5ml的上清液中制备出单链DNA。然后,利用双脱氧法,排出这一建造的顺序,利用寡核苷酸ZC87作为引子,证实了插入片的连结是正确的。一个正确的克隆(#4)在寡核苷酸定向突变中作为模板去产生有功能性因子Ⅸ-因子Ⅶ的并
寡核苷酸ZC249,20mer,由期望的因子Ⅸ顺序的10bp和因子Ⅶ(表1)顺序的10bp组成,被用作致突变引子。寡核苷酸ZC87,其与M13mp19顺序杂交,被用作第二引子。
所使用的致突变步骤是对Zoller和Smith的工作变更的步骤。为了退火反应,20pM的ZC249被磷酸化,4℃,温育过夜,20 μl Tris-HCl 60mM,PH8.0,10mM Mg Cl2,1mM DTT,1mMATP,1单位T4激活酶。在65℃下培育15分钟,反应停止。样品冰冻干燥。1pM的单线克隆#4模板和20pM的ZC87被加入10 μl退火缓冲液中(200mMTris-HCl,PH7.5,100mM Mg Cl2,500mM Na Cl,10mMDTT)。样品被加热到65℃温育10分钟,室温下温育5分钟,然后放在冰上。新制备的下列溶液10微升加入样品中:20mMTris-HCl PH7.5,10mM Mg Cl2,10mMDTT,1mMdNTPs,1mMATP,0.15单位/微升T4DNA连结酶,0.25单位/μl大肠杆菌多聚酶Ⅰ(Klenow断片)。然后,15℃,温育3小时,样品用来转化感受态大肠杆菌JM101(Messing,Meth,in Enzymology)。
产生的斑块被挑选到硝化纤维素上,与32P标记的ZC249进行杂交,筛选。干的BA85滤纸(Schliecher & Schuell 0.45 μm)放在琼脂培养皿上,让噬菌体被吸收5分钟。滤纸移开,凉干5分钟,放在Whatman3mm纸上,浸透,0.5M Na OH,1.5M Na C15分钟,空气干燥5分钟,放在Whatman纸上,在1MTris-HCl PH8.0 1.5MNa Cl液中浸5分钟,空气干燥3分钟。重复浸Tris-HCl液这一步,滤纸在100ml6×sss液中洗5分钟,室温。开展干燥之后,滤纸放在80℃烘烤2小时,并在下面的预杂交缓冲液温育,过夜,47℃(Tm-4°,ZC249),6.7×sss PH6.5,2mg/ml大肠杆菌t RNA,0.2%(重量/体积)BSA,0.2%Ficoll,0.2%聚乙烯吡咯烷酮。
在预杂交步骤之后,被标记的ZC249滤纸放射强度2.5×106cpm,在同样的杂交缓冲液中培育,47℃过夜。杂交之后,滤纸用6×sss液洗三次,每次5分钟到10分钟,室温。然后对X-光胶片曝光。预想的阳性斑复原,然后被筛选,方法如前所述。挑出单个斑块,制备单线DNA,用ZC275作引子,被顺序化。寡核苷酸ZC275相当于同一线上ZC249′5方向上顺序40bp(表1)。
四个阳性斑块被鉴定。属于一个克隆(FⅨ/Ⅶ-9)在M13mp19上的全部插入片都被顺序化并判定是正确的,仍是利用寡核苷酸ZC87和ZC275的双脱氧法。被证实的顺序列在图7中为碱基1-567。来子该克隆的RF    DNA这时被用在杂交种基因建造的最后一步。
三个断片由于最后建造:0.6kb    Hind    Ⅲ-XbaⅠ断片,来自FⅨ/Ⅶ-9,含有并合的Ⅸ/Ⅶ顺序;1.7kb    XbaⅠ-Bam    HⅠ因子的c    DNA断片来自pUCⅦ1923;和2.7kb    Bam    H1-Hind    Ⅲ断片,来自p    UC13。用45单位的XbaⅠ在50μl体积内消化3μg的FⅨ/Ⅶ-9(RFRNA),37℃,6小时。用乙醇沉淀DNA,重悬浮,用50单位的HindⅢ消化4小时,37℃。样品经1%琼脂糖凝胶电泳,0.6kb段被电洗脱到NA45纸上(Schiecher    &    Schuell),用洗脱液把DNA从纸上洗脱,洗脱液含有:1.5M    Na    Cl,50mM    Tris-HCl    PH8,1mMEDTA。苯酚提取,乙醇沉淀。
为了得到保留因子Ⅶ    c    DNA顺序,用36单位的XbaⅠ,在40μl的温和缓冲液中消化5μg的p    UCⅦ1923,然后,加入10倍高盐缓冲液8μl,28μl水,4μl(40单位)的BamH1。在37℃温育下反应3小时。1%琼脂糖凝胶电泳分离DNA断片,1.7kb的断片被分离出来。方法如前所述。
用10单位的Hind    Ⅲ在20μl温和缓冲液中消化1μg的p    UC13,37℃,1小时,来制备载体断片。加入2μl10倍强盐缓冲液,10单位的BamH    Ⅰ,再培育2小时。DNA在1%琼脂糖凝胶上如上述被提纯。
等克分子量(约为0.56pM)的三种断片在室温下45分钟被连接起来。反应液是10μl 50mMTris-HCl PH7.5,10mMMg Cl2,1mM DTT,1mMATP和3单位T4DNA连结酶。反应混合物被用来转化感受态大肠杆菌JM83,细胞平皿培养,培养基中含有40μg/ml氨苄青霉素,每个平皿加有50μl2%X-半乳糖。自7个白色菌落中制备出DNA,然后用限制性内切酶消化,筛选。其中给出正确模式的克隆标号为FⅨ/Ⅶ→p UC13。
实施例6:具有生物活性的因子Ⅶ类似物的表达
采用哺乳类细胞的表达载体pD2来在转染的动物细胞中表达FⅨ/Ⅶ基因。它是由质粒pDHFR-Ⅲ以如下的方法合成的(参见Berkner和Sharp,Nuc.Acids.Res.B;841-857,1985)先以常规的连接法将p DHFRⅢ中与DHFR c DNA相毗连的PstⅠ位点转化成BamH Ⅰ(参见Scheller,R.H.Dickerson,R.E,Boyer,H.W;Riggs,A.D.,和Hakura,K.Science,196,177-180,1977)。把pDHFRⅢDNA与10mM的Tris(PH=7.6),6mMβ-MSH,6mM Na Cl,10mM Mg Cl2和2.5单位的PstⅠ在37℃保温10分钟,然后以苯酚抽提再用乙醇沉淀。用T4DNA聚合酶把PstⅠ粘性末端平整。在苯酚抽提并在10mMTris(PH8.0),1mMEDTA,0.3MNa Cl中透析后将DNA用乙醇沉淀。将沉淀出的DNA悬浮在20μl,1.4mMATP,50mMTris(PH7.6),10mMMg Cl2,1mM二硫苏糖醇中,然后与5ng的T4多聚核苷酸激酶处理了的BamⅢ连接剂(New England Biolab)和200单位的T4多聚核苷酸连接酶在12℃保温12小时,再由苯酚抽提和乙醇沉淀。用90单位的BamH Ⅰ在37℃将所得的DNA水解1小时,然后用1.4%的琼脂糖电泳。将4.9kb的DNA片段用电泳法洗脱下来,用多聚核苷酸连接酶再环化后转染到E Coli HB101中去(4.9kb片段相当于失去DHFRc    DNA和SV40腺苷多聚化信号的p    DHFRDNA)。以快速制剂分析法筛选对氨苄青霉素敏感的克隆(参见Birnboim,H.C.和Doly,J.Nucleic    Acid    Research.I,1513-1523,1979),把筛选出的克隆进行繁殖以制备大量的质粒DNA。
用200单位的BamH Ⅰ将所得质粒酶切,用25μg小牛肠磷酸酶处理在1.4%琼脂糖中电泳。用25单位的BclⅠ在50℃将25μg的p SV40(将SV40DNA插入p BR322 BamHⅠ位点的一种克隆)水解一小时后,加入25单位的BamH Ⅰ于37℃继续保温1小时。将该DNA在1.4%琼脂糖中电泳。将由BamH Ⅰ处理的载体(即缺少腺苷多聚化信号的)连接到包含腺苷多聚化信号的SV40片断(0.14~0.19图距单位)(参见Tooze,J.ed《DNA瘤病毒-瘤病毒的分子生物学》一书)上去,方法是将这些由电泳法纯化的片断(每种0.1μg)在50μl50mM的Tris(PH7.6)中,同10mM的Mg Cl2,1mM的二硫苏糖醇,1.4mM的ATP和100单位的多聚核苷酸连接酶在12℃保温4小时,然后将之转化到大肠杆菌RRI中。以快速制剂分析法筛选呈阳性反应的克隆,最后大量制备所需的DNA-pD2质粒。
因子Ⅸ/Ⅶ表达结构的合成方法如下:在20μl高盐缓冲液中将1μg的p    D2用20单位的BamH    Ⅰ在37℃水解1小时。然后加入20μl的10mMTris-HCl(PH8),1mMEDTA和0.1单位的小牛碱性磷酸酶(Boeringer)。在37℃继续保温1小时后升温至75℃并保持10分钟以终止反应。用150单位的BamHI在150μl的高盐缓冲液中将10μg的FⅨ/Ⅶ→p    UC13在37℃下水解2小时,以1.2%的琼脂糖电泳法分离2.3kb    DNA断片,将等摩尔量的(0.015pM)2.3kb    BamH    Ⅰ片断与p    D2载体片断,在14℃下保温2.5小时前述方法进行连接反应。将反应物用来转化E.Coli    RRl细胞,再将这些细胞在含有10μg/ml氨苄青霉素的培养基中培养。最后由所产生的12种克隆制备质粒DNA,并用限制酶解法进行筛选。其中一个具有相应的酶解图谱的克隆称为FⅨ/Ⅶ/pD2(图6)。由FⅨ/Ⅶ/pD2转化的大肠杆菌RR1现已保存在ATCC(编号53068)。
用来以FⅨ/Ⅶ/pD2转染幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)的与已发表的方法(例如:Wigler等Cell,14,725,1978;Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics,I,603,1981;Graham和Van der Eb,Virology,52,456,1973)很相似。在60mm的组织培养皿中把BHK细胞于37℃,5%的CO2下的Dulbecco培养基(添加10%热处理失活的胎牛血清,其中加有谷氨酰胺和青链霉素)中培养至20%聚集度。转染每个60mm培养皿共需10μg DNA,其中FⅨ/Ⅶ/pD23.75μg,pKO-neo 1.25μg(参见Southorn和Berg,J.Mol Appl Genet,1,327-341,1982)还有5μg鲑精DNA,将这些DNA用含0.3MNaOAc的75%乙醇沉淀,用70%乙醇洗后溶于20μl10mMTris-HCl(PH8)1mMEDTA之中。再将此DNA与440μl的水,500μl含280mMNaCl,1.5mMNaHPO4及12mM葡萄糖的50mMHEPES(PH7.12)相混合,在混合液上滴加60μl2M的Ca Cl2,在室温下静置30分钟。最后把该溶液加到细胞上并将细胞在37℃保温4小时。保温后除去培养基,在室温下把细胞用5ml含20%DMSO及血清的Dulbecco培养基处理2分钟。然后快速将培养皿用培养基洗二次。再在新培养基中培养过夜。在加入DNA24小时以后除去该培养基,插入选择培养基(在含血清的Dulbecco培养基中加入10mg/ml的G418和498μg/mg的Gibco)10至13天以后,将已结合进p KO-neo基因,因而对G418有抗性的单个克隆转移至96孔(或24孔)板中生长以作蛋白分析。
把细胞培养在添加了10%胎牛血清、含有5μg/ml维生素K的Dulbecco中(Phytonadione,Merck)。将细胞及其碎片与培养基离心分离后,用酶标记免疫吸附测定法分析因子Ⅶ多肽,并分析生物活性。用胰蛋白酶使细胞与培养板分离,再用新鲜的培养基冲洗,离心后在-20℃下冰冻。冰冻的细胞因在PBS中解冻,沉淀后重新悬浮在含有0.25%Triton    X-100的PBS中。将样品稀释后分析多肽及活性。
标记免疫吸附测定法分析因子Ⅶ的方法如下:
用96孔滴定板在每个孔中加入单克隆抗体与人类因子Ⅶ(5μl/ml,溶于0.1MNa2CO3,PH9.6)于37℃保温2小时。然后再加入220μl含0.1%牛血清清蛋白(BSA)和0.05%Tween 20的PBS(PH7.2)中于37℃继续保温2小时。最后用水冲洗孔板,空气干燥后于4℃保存。分析样品时,将200μl的样品加入敷有抗体的孔中于室温下保温1小时。然后用含有0.05%Tween 20的PBS冲洗4次,每次200μl。随后在孔中加入200μl家兔多克隆抗血清免疫球蛋白G组成和因子Ⅶ(5μl/ml,溶于含1%BSA和0.05%Tween 20的PBS中),在室温下再保温1小时。接着再与用碱性磷酸酶偶联的羊抗兔免疫球蛋白保温。用含有0.05%Tween的PBS冲洗4次后,在孔中加入200 μl对硝基苯磷酸盐(30mg)二乙醇胺缓冲液(每升含96ml)PH9.8,其中含有56mg/l的Mg Cl2。在37℃进行酶促作用,最后用酶标记免疫吸附分析板判读器在405nm处显示其黄颜色。所得结果见表3。
因子Ⅶ生物活性的分析是按Quick(《Hemorragic    Disease    and    Thrombosis》第2板,Leat    Febiger,Philadelphia,1966)描述的一步凝集分析法进行的,结果见表3。
表3:
(天)    细胞/ml    因子Ⅶ肽    因子Ⅶ活性
(X10-4) (ng/ml) (ng/ml)
1    2.9    25    6.0
2.7
2    1.9    47    15.9
2.8
3    1.96    160    93
2.26
4    4.71    550    300
4.14
5    8.79    725    531
11.28
6    5.1    975    600
8.4
实施例7:因子Ⅸ的表达
在37℃用30单位的溶于30μl高盐缓冲液的BamHⅠ将14μgFⅨ(-G)→p    UC13水解3小时。然后将DNA在1%的琼脂糖中电泳,并将含有因子Ⅸ序列的1.4kb组分分离出来。
因同样的条件(加30单位BamHⅠ溶于30μl高盐缓冲液,37℃,3小时)水解3μg载体p D2,水解DNA用1%琼脂糖电泳后将1.5kb断片分离出来。将之用0.12单位的,溶于30μl含1mMEDTA的10mMTris-HCl(PH8)中的小牛碱性磷酸酶在37℃下处理30分钟。将盐度调至0.3MNaOAC。然后将样品用苯酚抽提2次,氯仿抽提一次,再用乙醇沉淀DNA。沉淀物用70%的乙醇冲洗,干燥后重新溶解在20μl含1mMEDTA的10mMTris-HCl(PH8)中。把等摩尔量的(0.02pM)这两种片断用10单位的T4DNA连接酶按前述方法连接。用这种反应混合液转化大肠杆菌RR1细胞。从12种抗氨苄青霉素的克隆中,用限制酶解法筛选DNA。其中一个克隆含有按正确方向插入的1.4kb片断,称为FⅨ(-G)/pD2。用FⅨ(-G)/pD2转化的大肠杆菌RR1已保存在ATCC(编号53067)。
BHK细胞按前述方法由FⅨ(-G)pD2和pKO-neo联合转染。筛选抗药性的细胞用来进行酶标记免疫吸附分析和活性分析,方法见实施例6。
生物活性分析基于因子Ⅸ能把患有因子Ⅸ缺乏病人的血浆凝集时间缩短至正常水平。该分析按Proctor和Rapaport报导的方法进行(参见Amer.J.Clin.Path.36,212,1961)结果见表4。
表4
因子Ⅸ    因子Ⅸ    %活性
细胞数/ml    多肽(ng/ml)    活性(ng/ml)    蛋白质
天 (×10-4) 上清液 沉淀 上清液中 上清液中
1    1.65    -    -    -    -
2    2.66    57    20    27    50%
45    20    24
3    9.69    150    60    72    58%
120    60    84
4    14.79    475    160    198    50%
225    140    150
5    50.85    875    250    408    45%
1000    260    438
因子Ⅸ多肽的数量主要通过ELISA测定的正如在实施例6中所叙述的使用对因子Ⅸ多克隆兔抗血清。下面用含有因子Ⅸ样品的小室保温,小室洗净并且用200μl有亲合力的纯化的兔多克隆抗因子Ⅸ在室温保温一小时,多克隆抗因子Ⅸ是与碱性磷酸酶结合的,用含有1%BSA和0.05%吐温20的PBS稀释1∶1000。然后小室用含有0.05%吐温20的PBS洗4次,如上所述加酶底物。4℃过夜或37℃两小时继续保温。
如表4所表示,因子Ⅸ多肽的70-80%被分泌到介质中去,这个数量的约50%有生物活性。因子Ⅸ的活性在细胞的残余物中没有发现。
活性程度高是通过补充浓度为1-10mg/ml的维生素K(phytonadione,Merck)细胞培养介质得到的。
几种另外分析的完成证明细胞分泌真正的因子Ⅸ。按照上面的测定含有因子Ⅸ活性样品与缺乏因子Ⅷ的质粒保温不影响凝集时间,指出活性是由于真正的因子Ⅸ而不是非特异性的凝集剂。这个结论进一步得到证明是通过具有特异性抗体的样品因子Ⅸ活性的耗尽所证实。利用兔多克隆抗体对抗因子Ⅸ,因子Ⅸ活性的97-98%从细胞的上清液中被免疫沉淀出来。这个抗体也沉淀因子Ⅸ活性的99%以上,这部分是来自正常质粒。通过对红细胞生成的兔多克隆抗体的上清液中仍然有因子Ⅸ的活性。
实施例8:因子Ⅶ表达载体的构建
一个包含着合成因子Ⅶ5′编码区域与部分因子Ⅶc    DNA相连的表达载体被构建。载体叫做pM7135,是由pM7115插入因子Ⅸ的前导者-5′因子Ⅶ序列和由FⅨ/Ⅶ/pD2进入质粒pD3而产生的。pM7135包含SV40的增强子和腺病毒2后期主要启动子和三分裂体前导者。
由质粒p DHFRⅢ产生质粒p D3。在p DHFRⅢ中紧靠DHFR序列上游Pst Ⅰ位点被转变成一个Bcl位点,由10μg质粒与5单位Pst Ⅰ37℃10分钟在100μl缓冲液A(10mMTris PH8,10mMMg Cl2,6mMNa Cl,7mMβ-MSH)中消化。用苯酚提取DNA,乙醇沉淀,重悬浮在40μl缓冲液B(50mMTris PH8,7mMMg Cl2,7mMβ-MSH)中,含有10mMd CTP和16单位T4 DNA多聚酶,在12℃60分钟保温。接着乙醇沉淀,DNA被连接到2.5μg激酶Bcl Ⅰ上,在14μl缓冲液C(10mMTris PH8,10mMMg Cl2,1mMDTT,1.4mMATP)中连接起来,含有400单位T4多核苷酸连接酶,在12℃12小时。下面是苯酚提取和乙醇沉淀,DNA在120μl缓冲液D(75mMKCl,6mMTris PH7.5,10mMMg Cl2,1mMDTT)中重悬浮,用80单位Bcl Ⅰ60分钟50℃消化,然后通过琼脂糖电泳。Ⅲ形质粒DNA(10μg)从凝胶中分离出来,在含有50单位T4多(聚)核苷酸连接酶的10μl缓冲液C中连接两小时,12℃,并用来转化E.Coli HB101。通过快速DNA制剂的分析,阳性的克隆被鉴定出来,同时由阳性克隆所制备的质粒DNA(也叫做pDHFR′)被转化到d AME Coli。
然后质粒p    D2′通过在100μl缓冲液D与25单位Dcl    Ⅰ中,60分钟50℃切p    DHFR′(15μg)和p    SV40(25μg)而产生,接着另外增加50单位BamH    Ⅰ,同时在37℃保温60分钟。用琼脂凝胶电泳再分离DNA片段,4.9kbp    DHFR′断片和0.2kb    SV40断片得到分离。这些断片(200μg    p    DHFR′DNA和100μgSV40DNA)在含有100单位T4多核苷酸连接酶的10μl缓冲液C中保温4小时12℃,所得构建(pD2′)转化E′Coli    RRI。
质粒p    D2′通过在p    BR322区去掉“毒物”序列得到修饰(Lusky和Botcham,Nature293∶79-81,1981)。质粒p    D2′(6.6μg)和pML-1(Lusky和Botcham,同上文献)(4μg)在50μl缓冲液A中EcoRⅠ和NruⅠ各10单位,37℃保温两小时,随后用琼脂糖凝胶电泳。1.7kb    p    D2′断片和1.8kb    pML-1断片得到分离并且在含有100单位T4核苷酸连接酶在20μl缓冲液C中12℃两小时就连接在一起(每一个50ng)。随后转化到E    Coli    HB101中。
含有所要求的结构的克隆(叫做△pD2)通过制剂的迅速分析得到证明。然后用EcoRⅠ和Bg    ⅠⅡ各20单位消化10μg的pD2,50μl缓冲液A,2小时,37℃。DNA通过琼脂糖电泳,要求的2.8kb片断(片断C),包括p    BR322,3′剪接位点和多(聚)腺苷酸序列被分离出来。
为了产生剩余片断用于构建pD3,修筛pDHFRⅢ,把SacⅡ(SstⅡ)位点变换成一个HindⅢ或KpnⅠ位点。10μg    p    DHFRⅢ用20单位SstⅡ37℃消化两小时,接着用酚提取和乙醇沉淀。
重悬浮的DNA在含有10m    Md    CTP和16单位T4DNA多聚酶100μl缓冲液中,在60分钟12℃条件下保温,苯酚提取、透析、和乙醇沉淀。DNA(5μg)与50ng激酶Hind    Ⅲ或KpnⅠ的连接子在含有400单位T4DNA连接酶的20μl缓冲液C中,在12℃10小时条件下连接,苯酚提取和乙醇沉淀。在50μl缓冲液A中重悬浮后,得到的质粒用50单位HindⅢ或KpnⅠ消化,通过琼脂糖电泳。分离DNA(250ng)的凝胶在含有400单位T4DNA连接酶的30μl缓冲液C中连接4小时,在12℃条件下,并用于转化E.Coli    RRI。最后结果所得到的质粒被叫做p    DHFRⅢ(Hind    Ⅲ)和p    DHFRⅢ(KpnⅠ)。然后一个700bpKpnⅠ-BgⅠⅡ断片(断片A)通过用Bg    ⅠⅡ和KpnⅠ消化从p    DHFRⅢ(KpnⅠ)中纯化,接着进行琼脂糖凝胶电泳。
把SV40增强子序列插入到pDHFRⅢ(HindⅢ),方法如下:50微克SV40DNA在含有Hind    Ⅲ50个单位120微升缓冲液A中保温2小时,温度为37℃,然后,将Hind    Ⅲc    SV40断片(5089-968b    p)进行凝胶纯化。质粒p    DHFRⅢ(Hind    Ⅲ)(10微克)用250ng小牛肠磷酸酶在37℃下处理1小时,苯酚提取,乙醇沉淀。线性化的质粒(50ng)用250ng    Hind    Ⅲc    SV40在12℃、16微升缓冲液c中连结3小时,并使用200个单位的T4多聚核苷酸连接酶,然后转化到大肠杆菌HB101菌株中。一个含有700bp.EcoRⅠ-Kpn    Ⅰ的断片(断片B)从这个质粒中分离出来。
为了p D3的最后构建,可将A、B断片(各50ng,用200单位T4多聚核苷酸连接酶与10ngC断片在12℃下连结4小时,然后转染到大肠杆菌RRI菌株中。阳性克隆可由快速制备分析来检测,pD3大批量的制备就完成。
表达载体pM7135被构建。pM7115复制型用BamH    Ⅰ和Xba    Ⅰ消化,含有Ⅸ因子前导子和5′Ⅶ因子序列的550bp片断进行凝胶纯化。
质粒FⅨ/Ⅶ/pD2用Xba    Ⅰ和BamH    Ⅰ消化,含有Ⅶ因子c    DNA的3′部分的1700bp断片进行凝胶纯化。质粒p    D3用Bcl    Ⅰ消化,小牛碱性磷酸酶处理,且这三个片断以一种三联体的形式连接在一起,最后的构建可以一个2000bp    Xba    Ⅰ片断的存在为准进行筛选。具有正确定位的质粒被选择,图8中标号为pM7135。
实施例9:来自于c    DNA克隆的Ⅶ因子的表达
为了使含有Ⅶ因子前导子的Ⅶ因子cDNA得以表达,可将来源于λⅦ2463λ或Ⅶ565和λⅦ2463的DNA克隆到含有Ad2晚期主要启动子、SV40增强子序列、Ad2分成三部分体的前导子、一个拼接位点和SV40多聚核苷酸信号的一个表达载体中。这个载体很合适以至它包含一个作为c    DNA插入部位的独特的EcoRⅠ序列。来源于λⅦ2463、编码一个60个核苷酸前导子的表达序列和来源于λⅦ565和λⅦ2463、缺少-18至-39氨基酸的密码子编码一个长度为38氨基酸的前导子,对该表达进行了评价。因为因子Ⅶ前导子的结构已经且只能由c    DNA克隆来鉴定,且因为一种错读,这种错读是由于获得两种不同的5′末端c    DNA所引起的,所以本发明者们也建造了一种基因组-cDNA因子Ⅶ的序列。λⅦ2463的3′部分(从外显子2的BglⅡ部分到连结在3′端多聚腺核苷酸尾的EcoRⅠ部位)连到一个亚基因组断片,这个亚基因组断片是克隆7ml的,它编码外显子1a、1b和外显子2的剩余部分。这个亚基因组断片重建成一个EcoRⅠ-Bg    Ⅲ4.4kb的断片,与λⅦ2463c    DNA连接,然后在哺乳动物表达载体中克隆。
简单地讲,为了建立亚克隆,λⅦ2462的因子Ⅶc    DNA    EcoRⅠ断片被克隆在p    UC18的EcoRⅠ位点,且叫做p    Ⅶ2463。同样地,λⅦ565的EcoRⅠc    DNA插入序列被克隆到p    UC18中,且叫做pⅦ565。通过将pⅦ565的5′端EcoRⅠ-BglⅡ因子Ⅶ断片和pⅦ2463的BglⅡ-HindⅢ因子Ⅶ断片(pⅦ2463多聚连接物中的HindⅢ位点)克隆到被EcoRⅠ和HindⅢ消化过的p    UC18中,使pⅦ565克隆的因子Ⅶ的5′部分与pⅦ2463的因子Ⅶ的3′断片组成的杂合体被建立起来。这个构造物叫pⅦ2397。插入的pⅦ2463和pⅦ2397经EcoRⅠ的消化处理移出,经过凝胶纯化以便插入哺乳动物表达载体中,如下所述。
A全长因子Ⅶc    DNA的表达
因子Ⅶ的表达已经在载体p    DX中达到。这个载体是由p    D3(上述实施例8中已经描述)的p    D3′中衍生的,pD3′是一种载体,除了SV40多聚腺苷酸信号[从SV40    BamHI(2533bp)到Bcl    Ⅰ(2770bp)的断片]处于更晚的(更靠后)的方向外,其余与pD3相同。因此,pD3′包含一个BamHⅠ位点作为基因插入的位点。
要产生p    DX,pD3′中的EcoRⅠ位点被转化成BclⅠ位点,可通过EcoRⅠ切割,用S1核酸酶温育,然后用Bcl    Ⅰ连接物连接。DNA从阳性的克隆中制备得到,1.9kb.的Xho    Ⅰ断片含有变动的限制性内切酶切点,这个断片通过琼脂糖凝胶电泳制备。第二次修饰中,用BclⅠ切割的pD3与用激酶处理过的EcoRⅠ-BclⅠ受体(从寡聚核苷酸Zc525,5′GGAATTCT3′;和Zc526,5′GATCAG    AATTCC3′建造而成)连接;目的是产生一个EcoRⅠ切点作为一个基因插入表达载体的位置。阳性克隆通过限制性内切酶分析而识别,从中得到的DNA用来分离一个2.3kb.的Xho Ⅰ-Pst断片,这个断片包含修饰的限制性内切酶切点。以上描述的两个DNA断片与T4DNA连接酶一块温育,转化到大肠杆菌HB101菌株中,阳性克隆可用限制性内切酶分析。这样制备的DNA叫pDX(图12)。这个DNA用EcoRⅠ切割,然后与小牛肠磷酸酶一起温育。纯化的DNA然后与T4DNA连接酶和来自p Ⅶ2463的因子Ⅶc DNA断片或来自pⅦ2397的因子ⅦEcoRⅠ断片一起温育。最终的克隆分别叫FⅦ(2463)/pDX和FⅦ(565+2463)/pDX(图12)。当转化进入大肠杆菌JM83和以后的限制性酶的分析之后,质粒DNA制备得以完成,然后经过广谱的限制性内切酶消化处理来检验。质粒FⅦ(2463)/pDX和FⅦ(565+2463)/pDX已经由美国样板培养物收集中心保存,并且分别编号为40206和40205。
FⅦ(2463)/pDX和FⅦ(565+2463)/pDX(每种10微克),每种与10微克鲑精子携带DNA转染到BHKtk-t13细胞(Floros et al.,Exper.Cell Res.132∶215-223,1981)或COS细胞,用标准磷酸钙沉淀。转染后,细胞培养在适当的培养基中,培养两天,培养基中包含5微克/毫升维生素K。这一次细胞上清液用抗因子Ⅶ的单克隆抗体检验作为ELISA-阳性材料。不但FⅦ(2463)/pDX而且FⅦ(565+2463)/pDX指导因子Ⅶ多肽链的生产,这可以在COS细胞上清液中得以检测,来自FⅦ(565+2463)/pDX的因子Ⅶ在BHK细胞上清液中可以检测到。假转染的BHK细胞或COS细胞不产生可检测水平的因子Ⅶ。(表5)
表5
ELISA阳性材料
DNA    细胞系    细胞数    (ng/ml培养基)
FⅦ(2463)/pDX COS 2×10615
FⅦ(565+2463)/pDX COS 2×10612
对照 COS 2×106<2
FⅦ(2463)/pDX BHK 9×10662
FⅦ(565+2463)/pDX BHK 9×1066
对照 BHK 9×106<2
因子Ⅶ的短暂表达也可以在其他一些细胞系中检查到,这些细胞系列于表6。
表6
名称    说明    参考
(ATTC#)
1.大鼠Hep    Ⅰ    大鼠肝细胞瘤H4-Ⅱ-E-C3    CRL1600
2.大鼠Hep    Ⅱ    大鼠肝细胞瘤H4-Ⅱ-E    CRL1548
3.TCMK    小鼠肾,转化的SV40病毒,
TCMK-1    CCL139
4.人肺    转化的SV40病毒
WI-38    VA13,亚系2RA    CCL75.1
5.人肝细胞瘤    人肝
SK-HEP-1    HTB-52
6.Hep    G2    人肝细胞瘤,    HTB8065
7.小鼠肝    NCTC克隆1469    CC29.1
8.COS    转化的SV40CV-1
(猴子)细胞    CRL1650
9.BHK    幼仓鼠肾BHK-21(C-13)    CCL10
10.293    人胚胎肾/转化的Ad    CRL1573
11.DUKX CHO-DHFRsens(Urlaub和
Chasin,\\
PNAS(美
国)77∶4216
-4220,1980)
细胞用10微克FⅦ(2463)/pDX或FⅦ(565+2463)/pDX同1微克质粒联合转染,该在粒包含氯霉素乙酰转移酶基因(以鉴定联合转染的细胞)和10微克鲑精子DNA。假转染的细胞用作对照。用过的培养基6天后用ELISA法分析检测。结果见表7。
表7
细胞
数目    ELISA
样品 细胞系 质粒 ×10-6(ng/ml)
1    大鼠Hep    Ⅰ    MOCK    11.6    2.4
2    大鼠Hep    Ⅰ    FⅦ(565+2463)/pDX    7.0    2
3    大鼠Hep    Ⅰ    FⅦ(2463)/pDX    7.0    <2
4    大鼠Hep2    MOCK    13.0    <2
5    大鼠Hep2    FⅦ(565+2463)/pDX    18.4    <2
6    大鼠Hep2    FⅦ(2463)/pDX    14.6    <2
7    TCMK    MOCK    18.8    <2
8    TCMK    FⅦ(565+2463)/pDX    9.8    <2
9    TCMK    FⅦ(2463)/pDX    12.8    <2
10    人的肺    MOCK    7.2    <2
11    人的肺    FⅦ(565+2463)/pDX    3.4    16.5
12    人的肺    FⅦ(2463)/pDX    3.4    12.2
13    人肝细胞瘤    MOCK    13.0    <2
14    人肝细胞瘤    FⅦ(565+2463)/pDX    11.0    3.5
15    人肝细胞瘤    FⅦ(2463)/pDX    6.0    3.0
16    HepG2    MOCK    6.8    21
17    HepG2    FⅦ(565+2463)/pDX    6.0    45.5
18    HepG2    FⅦ(2463)/pDX    6.0    28
19    小鼠肝    MOCK    3.8    <2
20    小鼠肝    FⅦ(565+2463)/pDX    4.0    <2
21    小鼠肝    FⅦ(2463)/pDX    3.6    <2
22    COS    MOCK    5.6    <2
23    COS    FⅦ(565+2463)/pDX    5.6    15.5
24    COS    FⅦ(2463)/pDX    4.4    14.5
25 BHKtk-t13 MOCK 3.0 <2
26 BHKtk-t13 FⅦ(565+2463)/pDX 5.0 25
27 BHKtk-t13 FⅦ(2463)/pDX 4.0 22.5
28    293    MOCK    5.8    <2
29    293    FⅦ(565+2463)/pDX    6.2    94
30    293    FⅦ(2463)/pDX    8.2    100
31    DUKX    MOCK    11.6    <2
32    DUKX    FⅦ(565+2463)/pDX    13.0    <2
33    DUKX    FⅦ(2463)/pDX    13.6    <2
FⅦ(2463)/pDX(10μg)或FⅦ(565+2463)/pDX(10μg)与10μg鲑鱼精液DNA和1μg一个编码二氢叶酸还原酶抗性形式(Simonsen    and    Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci    USA80∶2495-2499,1983)的质粒,该质粒在哺乳动物表达的载体中,联合转染进到BHKtkt13细胞中。两天后,细胞被分裂1∶14并且放在所选择的介质中,此介质含250nM或1000nM氨甲蝶呤(MIX)和5μg/ml维生素K(Phytadione,Merck)。两星期后,克隆被分离并且生长到50-90%融合。然后通过ELISA测定上清液介质中因子Ⅶ多肽。25个阳性克隆中的22个进一步分析。细胞被放在5×104(组Ⅰ)或1×105(组Ⅱ)10厘米含有5μg/ml维生素K,250nM或1000nM氨甲蝶呤的平板上。五天后,生长最快的克隆(在表8中打星号λ)1∶2分裂,24小时后,在全部盘上介质被改变了。32小时(组Ⅰ)或20小时(组Ⅱ)后,悬浮的介质被获得了并且对每一个克隆的细胞计数。这个介质通过ELISA和一步凝集来测定。结果在表8中表示出来。
表8
组Ⅰ-23-小时测定
ELISA    凝集
细胞(pg/    ELISA
数量    细胞/    (ng/    (ng/    %
克隆 质粒 ×10-5天) ml) ml) 活性
B4-A1λ    FⅦ(565+2463)/pDX    2    6.5    130    206    158
B4-B1λ    FⅦ(565+2463)/pDX    27    1.9    513    360    70
B4-C1    FⅦ(565+2463)/pDX    16    2.5    393    480    122
B4-C2λ    FⅦ(565+2463)/pDX    9    <0.2    <20    21    -
B4-C3λ    FⅦ(565+2463)/pDX    52    1.5    800    910    114
B4-D1λ    FⅦ(565+2463)/pDX    27    2.0    553    570    103
B4-D2λ    FⅦ(565+2463)/pDX    13    1.2    150    154    103
B4-E1    FⅦ(565+2463)/pDX    39    2.2    870    1160    133
B4-E2λ    FⅦ(565+2463)/pDX    8    2.5    205    240    117
B4-E3    FⅦ(565+2463)/pDX    23    1.2    275    320    116
B4-E4    FⅦ(565+2463)/pDX    31    1.3    410    300    73
B3-5.3λ    FⅦ(565+2463)/pDX    5    8.2    410    290    70
表8续
组Ⅱ-20-小时测定
ELISA    凝集
细胞(pg/    ELISA
数量    细胞/    (ng/    (ng/    %
克隆 质粒 ×10-5天) ml) ml) 活性
B3-2.2    FⅦ(2463)/pDX    41    2.5    1043    500    48
B3-2.3    FⅦ(2463)/pDX    19    3.0    580    610    105
B3-3.2    FⅦ(2463)/pDX    13    1.5    197    216    110
B3-4.2    FⅦ(2463)/pDX    41    1.8    760    620    82
B3-5.1    FⅦ(2463)/pDX    14    3.3    460    400    87
B3-5.2    FⅦ(2463)/pDX    9    2.7    257    184    72
B6-D    FⅦ(2463)/pDX    54    3.0    1700    780    46
B6-E    FⅦ(2463)/pDX    101    1.6    1640    790    59
B6-G    FⅦ(2463)/pDX    31    5.7    1853    1080    58
B6-M    FⅦ(2463)/pDX    75    2.2    1743    940    54
B.因子Ⅶ基因组的c    DNA杂合体的表达
一个含有因子FⅦ基因组5′-终点的基因组序列和来源于因子Ⅶ基因3′-终点的c    DNA序列的表达载体可按下法制备。7ml基因组质粒的三个亚克隆被用作重建5′-终点:7    Bam、7    SD和7    SE。质粒7    Bam是包含外显子1a的一个3.6kb    EcoRⅠ-BamH    Ⅰ断片,亚克隆到p    VC12中。一个包含有外显子1a的0.7kb    EcoRⅠ-XbaⅠ断片可从上述亚克隆中分离出并叫做断片a。质粒7    SD是含有外显子1b的一个3.7kb    Sst    Ⅰ断片,亚克隆到p    UC18中。一个包含外显子1b的3.1kb    Xba    Ⅰ-Sst    Ⅰ断片可从上述亚克隆中分离出并叫做断片b。质粒7    SE是含有外显子2-4的3.9kb    Sst    Ⅰ断片,亚克隆到M13mp19中。一个含有外显子2的5′部分的Sst    Ⅰ-BglⅡ(0.6kb.)断片用凝胶分离并叫做断片C。3′-因子Ⅶc    DNA(断片d)的剩余物可从pUVⅡ2463中以一个2kb.BglⅡ-EcoRⅠ断片的形式获得。断片a-d用EcoRⅠ-Cleaved和小牛肠磷酸化p    DX连接,然后转化到大肠杆菌JM83或HB101中。阳性克隆用限制性内切酶分析鉴定,质粒DNA可由这些克隆中制备出。
为表达因子Ⅶ,质粒DNA可如前所述联合转染到BHK或COS细胞中,被转染的细胞在含维生素K的培养基中培养2天,培养基用ELISA法来测定因子Ⅶ。
从前面所述可以看出,尽管出于说明本发明的目的在此描述了优先实施方案,但在不背离本发明的精神和范围的情况下,各种修饰是可以做出的。因此,除了权利要求外,本发明不受其他有限制。

Claims (17)

1、一种DNA的建造,包括一个给蛋白编码的核苷酸顺序,该蛋白质经活化,在血凝方面,与因子Ⅶa有相同的或本质上相同的生物活性。
2、权利要求1的DNA建造,其中所说的核苷酸顺序至少为部分的因子Ⅶ编码,该核苷酸顺序包括第一条核苷酸顺序,第一核苷酸顺序编码钙束缚区,钙束缚区又连到第一核苷酸顺序下游位置的第二核苷酸顺序上,第二核苷酸顺序编码因子Ⅶa丝氨酸蛋白酶活性的催化区,联合顺序编码蛋白质,该蛋白质经活化,在血凝方面,与因子Ⅶa有相同的或本质上相同的生物活性。
3、权利要求2的DNA建造,其中所说的第一核苷酸顺序基本上是基因顺序,该基因是从为因子Ⅶ,因子Ⅸ,因子Ⅹ,蛋白质C,凝血酶元,和蛋白质S编码的一组基因中挑选来的。
4、权利要求2的DNA建造,其中所说的第一条核苷酸顺序也为前导肽编码。
5、权利要求2的DNA建造,其中所说的第一核苷酸顺序包括被合成的双线寡核苷酸。
6、权利要求5的DNA建造,其中所说的合成的双线寡核苷酸编码基本为因子Ⅶ的氨基末端区。
7、权利要求1的DNA建造,其中所说的核苷酸顺序编码因子Ⅶ。
8、权利要求7的DNA建造,其中所说的核苷酸顺序的至少一部分顺序是从cDNA克隆或者从因子Ⅶ染色体组克隆中诱导出来。
9、权利要求7的DNA建造,包括第一核苷酸顺序,该顺序是从cDNA克隆或从因子Ⅶ的染色体组克隆中诱导出来的,第一核苷酸顺序又联结到由第一顺序下游位置的第二核苷酸顺序上,第二核苷酸顺序是从因子Ⅶ的c  DNA克隆诱导出来的,联结的顺序为蛋白质编码,在血凝方面,经活化后,该蛋白质与因子Ⅶa有相同的或本质上相同的生物活性。
10、权利要求7的DNA建造,其中所说的核苷酸顺序包括图1b的从bp36到bp1433的c  DNA顺序。
11、权利要求7的DNA建造,其中所说的核苷酸顺序包括图1b的从bp36到bp99的c  DNA序列,下游跟着的顺序是bp166-bp1433。
12、重组质粒,它能够整合到哺乳动物宿主细胞的DNA中,所说的质粒包括一个启动子,其下游接着是根据权利要求1-11中的任何一个所说的核苷酸顺序,所说的核苷酸顺序,其下游跟的是多聚核苷酸信号。
13、用权利要求12的重组转染的哺乳动物细胞。
14、一种产生活性蛋白的方法,该蛋白质在由因子Ⅶa介入的凝血过程中具有生物活性,该方法包括:
建立哺乳动物宿主细胞,该细胞中含有上述权利要求1-11中任一所述的DNA建造;
所说的哺乳动物宿主细胞生长在适宜的培养基上;
分离蛋白产物,该产物被所说的DNA建造编码,DNA建造又是哺乳动物宿主细胞产生的;以及
活化蛋白质产物,产生一种在凝血过程中与因子Ⅶa有相同的生物活性的蛋白质。
15、权利要求14的方法,包括利用编码二氢叶酸还原酶的基因转染哺乳动物宿主细胞放大DNA建造,其中适宜的培养基含有氨甲蝶呤。
16、权利要求14的方法,其中所说的蛋白质产物是利用蛋白水解酶与蛋白质起反应而活化,蛋白水解酶是从因子Ⅻa,因子Ⅸa,激肽释放酶,因子Ⅹa和凝血酶所组成的组中选出。
17、治疗流血失调的药物制剂,其中含有根据权利要求14制备的蛋白质。
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