CN101676728A - 细胞因子受体 - Google Patents

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S·R·普莱斯奈尔
许文峰
J·E·诺瓦克
T·E·维特摩尔
F·J·格兰特
W·R·金德斯沃格尔
K·M·克鲁切尔
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Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

公开了形成IL－28r和CRF2－4的异型二聚化受体复合物的新方法。这些方法可用于体外和体内检测和治疗病毒感染。配体结合受体多肽还可用于体外和体内阻断配体活性。本发明还包括蛋白质的生产方法、用途及其抗体。

Description

细胞因子受体
本分案申请是基于申请号为03812713X，申请日为2003年04月18日，发明名称为“细胞因子受体”的中国专利申请的分案申请。
发明背景
激素和多肽生长因子控制多细胞生物的增殖及分化。这些可扩散的分子使细胞能够相互交流并行为一致以形成细胞和器官，以及修复受损组织。激素和生长因子的例子包括类固醇激素(例如，雌激素、睾酮)、甲状旁腺素、促卵泡激素、白细胞介素、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和降钙素。
激素和生长因子通过与受体结合影响细胞代谢。受体可能是细胞内与信号途径相连的整合膜蛋白，例如第二信使系统。其它的受体类别为可溶性分子，例如转录因子。尤其令人感兴趣的是细胞因子受体——促进细胞增殖和/或分化的分子。细胞因子的例子包括刺激血红细胞发育的促红细胞生成素(EPO)、刺激巨核细胞系细胞发育的血小板生成素(TPO)、和刺激嗜中性粒细胞发育的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这些细胞因子对患有贫血症、血小板减少症以及嗜中性白细胞减少症或正在接受癌症化疗的病人恢复正常血细胞水平有用。
这些细胞因子的已证实体内活性例证了其它细胞因子、细胞因子激动剂、和细胞因子拮抗剂的巨大临床潜力以及对它们的需求。本发明通过提供新的造血细胞因子受体及相关的组合物和方法而满足了这些需求。
本发明提供用于这些及其它用途的多肽，根据本文的教导这些用途对本领域技术人员来说是显而易见的。参照以下发明详述，本发明的这些及其它方面将是显而易见的。
发明描述
在详细阐述本发明之前，对下列术语进行定义或许会对理解发明有所帮助：
本文用术语“亲和标记物”表示能附着于第二个多肽以为第二个多肽的纯化和检测作准备或为第二个多肽与底物的结合提供位点的多肽片断。原则上，抗体或其它特异结合介质可结合的任何肽或蛋白质都可用作亲和标记物。亲和标记物包括多组氨酸段、A蛋白(Nilsson等人，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等人，Methods Enzymol.198：3，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson，基因67：31，1988)、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952-4，1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等人，Biotechnology 6：1204-10，1988)、链霉抗生物素蛋白结合肽、或其它抗原表位或结合结构域。通常参见，Ford等，蛋白质表达及纯化(Protein ExDression and Purification)2：95-107，1991。可从商业供应商(例如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)得到编码亲和标记物的DNA。
本文用术语“等位变体”表示占据相同染色体座位的基因的两个或多个可选形式中的任一个。等位变异由突变天然产生，且可能导致种群中的表型多态性。基因突变可以是沉默的(所编码多肽无变化)或者可能编码氨基酸序列改变了的多肽。本文中术语等位变体还表示由基因的等位变体编码的蛋白质。
本文用术语“氨基末端”和“羧基末端”表示多肽内的位置。在上下文允许的地方，这些术语用于表示多肽中的特定序列或一部分的邻近或相对位置。例如，多肽内位于参照序列羧基末端的某一确定序列被定位于与该参照序列的羧基末端接近，但并非必定是在该完整多肽的羧基末端。
本文用术语“互补/反向互补对”表示在适宜条件下形成非共价结合的、稳定配对的不同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)是互补/反向互补对的最典型成员。其它的互补/反向互补对例子包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对，及类似。如果之后需要互补/反向互补对解结合，则优选互补/反向互补对的结合亲和力＜109M-1。
术语“多核苷酸分子的互补序列”是指与对照序列相比较具有互补碱基序列且方向相反的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
术语“简并核苷酸序列”表示包括一个或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的对照多核苷酸分子相比)。简并密码子包含不同的核苷酸三联体，但是编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体各自编码Asp)。
术语“表达载体”用于表示含有目的多肽编码片段的线性或环状DNA分子，该多肽编码片段可操作性相连于使其转录的附加片段。这些附加片段包括启动子和终止子序列，还可能包括一个或多个复制起点，一个或多个选择性标记、增强子、聚腺苷酸化信号，等。表达载体通常衍生自质粒或病毒DNA，或者可能同时含有两者的元件。
术语“分离的”，当其用于多核苷酸时，表示该多核苷酸已被分离出其天然的遗传环境且因此不带有其它的外来或多余编码序列，并处于适宜在遗传工程化的蛋白质生产系统中使用的形式。这样的分离分子是那些从它们的天然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不带有它们通常结合的其它基因，但是可以包括自然产生的5′和3′非翻译区例如启动子和终止子。对本领域普通技术人员来说对结合区的鉴定是显而易见的。(参见例如，Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。
“分离的”多肽或蛋白质指在不同于其天然环境的条件下发现的多肽或蛋白质，例如在血液或动物组织之外。分离的多肽的一种优选形式是，它基本不带有其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选该多肽是高度纯化形式的，即大于95％的纯度，更优选大于99％的纯度。当其在上下文中使用时，术语“分离的”不排除以可选择的物理形式，例如二聚体、多聚体、或可选择的糖基化或衍生形式，存在的相同多肽。
术语“可操作性连接”，当其涉及DNA片段时，表示这些片段经过排列以使它们按照既定的目的协调发挥功能，例如，转录在启动子处起始并经编码片段行进至终止子。
术语“直向同源物”表示获自某一物种而与获自另一不同物种的多肽或蛋白质在功能上相应的蛋白质。直向同原物间的序列差异是物种形成的结果。
“侧向同源物(paralog)”是由某一生物产生的截然不同但是结构上相关联的蛋白质。据信侧向同源物是由基因重复产生的。例如，α-球蛋白、β-球蛋白、和肌球蛋白互为侧向同源物。
“多核苷酸”是从5′至3′端阅读的单或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可从天然来源分离、体外合成、或从天然和合成的分子组合制备。多核苷酸的大小以碱基对(简写为“bp”)、核苷酸(“nt”)、或千碱基(“kb”)表示。在上下文允许的地方，后两个术语可以描述单链或双链多核苷酸。当该术语用于双链分子时，它表示全长并与“碱基对”作相同理解。本领域技术人员公知的是，双链多核苷酸的两条链在长度上可以稍有不同且因此作为酶切结果末端可能不平；这样双链多核苷酸分子中可能并非所有的核苷酸都是配对的。
“多肽”是经肽键相连的氨基酸残基的聚合物，无论是天然的或是合成的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称作“肽”。
本文所使用的“探针和/或引物”可以是RNA或DNA。DNA可以是cDNA或基因组DNA。多核苷酸探针和引物是单或双链DNA或RNA，通常是合成的寡核苷酸，但可能从克隆的cDNA或基因组序列或其互补序列产生。分析探针通常长度至少为20个核苷酸，尽管也可以使用稍短的探针(14-17个核苷酸)。PCR引物长度至少为5个核苷酸，优选15个或更多个nt，更优选20-30nt。定位分析基因中的小区域时可以使用短多核苷酸。对基因进行总体分析时，多核苷酸探针可包含整个外显子或更长。可采用本领域熟知的技术对探针进行标记以提供可探测信号，例如用酶、生物素、放射性核素、荧光团、化学发光物、顺磁性颗粒及类似物质，它们可从许多来源商业获得，例如Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，和Amersham Corp.，Arlington Heights，IL。
本文用术语“启动子”在本领域中公知的含义来表示含有供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因的一部分。启动子序列通常，但不总是，出现在基因的5′非编码区。
“蛋白质”是含有一或更多条多肽链的大分子。蛋白质还可以含有非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其它的非肽取代物可由生产该蛋白质的细胞添加至蛋白质，且其随细胞类型而变化。本文根据蛋白质的氨基酸骨架结构来定义蛋白质；取代物例如碳水化合物基团通常不指明，但是它们可能是存在的。
本文中术语“受体”表示结合生物活性分子(“配体”)并介导配体对细胞的作用的、结合细胞的蛋白质，或这样的蛋白质的多肽亚单位。配体与受体的结合使受体的构象改变(并且在某些情况中，受体多聚化，即，相同或不同的受体亚单位结合)从而引起效应器结构域与细胞内的其它分子发生相互作用。这些互作接着导致细胞代谢改变。与受体-配体互作相连的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、细胞增殖、环腺苷酸生成增加、细胞钙活动化、膜脂质活动化、细胞粘连、肌醇脂水解和磷脂水解。细胞因子受体亚单位的特征是包含细胞外结构域、将多肽锚定于细胞膜的跨膜结构域、和细胞内结构域的多结构域结构。该细胞外结构域典型为配体结合结构域，且该细胞内结构域典型为涉及信号转导的效应器结构域，尽管配体结合和效应器功能可能存在于多聚化受体的不同亚单位上。配体结合结构域本身也可能是多结构域结构。多聚化的受体包括同型二聚体(例如，PDGF受体αα和ββ同种型、促红细胞生成素受体、MPL、和G-CSF受体)、其亚单位各自具有配体结合和效应器结构域的异型二聚体(例如，PDGF受体αβ同种型)、以及具有功能全异的亚单位组成的多聚体(例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、和GM-CSF受体)。一些受体亚单位通常为多个受体共有。例如，不能在其自身上结合配体但是包括细胞内信号转导结构域的AIC2B亚单位，是IL-3和GM-CSF受体的一个组分。根据结构和功能，许多细胞因子受体可被归入四个相关家族中的一个。例如造血受体的特征在于存在包含保守半胱氨酸残基和WSXWS基序(SEQ ID NO：5)的结构域。细胞因子受体结构的综述见Urdal，Ann.Reports Med.Chem.26：221-228，1991和Cosman，Cytokine 5：95-106，1993。在使生物获得新的生物功能的选择压力下，有可能从已经存在的受体基因副本产生新的受体家族成员从而导致出现多基因家族。因此家族成员包含祖先基因的遗迹，这些特有的特征可用于分离和鉴定其它的家族成员。因此，将细胞因子受体超家族细分为几个家族，例如，免疫球蛋白家族(包括CSF-1、MGF、IL-1、和PDGF受体)；血细胞生成素家族(包括IL-2受体β-亚单位、GM-CSF受体α-亚单位、GM-CSF受体β-亚单位；和G-CSF、EPO、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、和IL-9受体)；TNF受体家族(包括TNF(p80)TNF(p60)受体、CD27、CD30、CD40、Fas、和NGF受体)。
术语“受体多肽”用于表示完整的受体多肽链及其部分，包括分离的功能性结构域(例如，配体结合结构域)。术语“配体结合结构域”和“细胞因子结合结构域”可互换使用。
“分泌信号序列”是编码一个多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为一个较大的多肽的组分，指导该较大多肽穿过将其合成的细胞中的分泌途径。该较大的肽通常在经分泌途径的运输过程中被切割以去除分泌肽。
“可溶性受体”是指不结合于细胞膜的受体多肽。可溶性受体最常见的是缺少跨膜结构域和胞质结构域的配体结合受体多肽。可溶性受体可以含有附加的氨基酸残基，例如为多肽的纯化而提供的亲和标记物或多肽与底物的结合位点、或免疫球蛋白的恒定区域序列。许多细胞表面受体具有自然产生的、经蛋白质水解而产生的可溶性配对物。如果可溶性受体多肽缺少足够的跨膜和细胞内多肽片段部分以分别提供膜锚定或信号转导，那么就说它们基本上不具有跨膜和细胞内多肽片段。
本文中用术语“剪接变体”表示从一个基因转录的RNA的可选择形式。剪接变异通过转录RNA分子内不同的剪接位点而自然发生，或者较少见的是发生在分别转录的RNA分子间，且可能从相同的基因转录产生几个mRNA。剪接变体可能编码具有改变了氨基酸序列的多肽。本文中术语剪接变体也可用于表示转录自某基因的mRNA剪接变体所编码的蛋白质。
用不精确的分析方法(例如，凝胶电泳)测定的聚合物的分子量和长度将被理解为近似值。当将这样的值表示为“约”X或“近似为”X时，所述值X将被理解为精确值±10％。
将本文所引用的所有参考文献全文引作参考。
细胞因子受体亚单位的特征在于含有配体结合结构域和典型涉及信号转导的效应器结构域的多结构域结构。多聚化的细胞因子受体包括同型二聚体(例如，PDGF受体αα和ββ同种型、促红细胞生成素受体、MPL(血小板生成素受体)、和G-CSF受体)；其亚单位各自具有配体结合和效应器结构域的异型二聚体(例如，PDGF受体αβ同种型)；和具有功能全异的亚单位组成的多聚体(例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、和GM-CSF受体)。一些受体亚单位通常为几个受体共有。例如，不能在其自身上结合配体但是包括细胞内信号转导结构域的AIC2B亚单位，是IL-3和GM-CSF受体的一个组分。根据结构和功能，许多细胞因子受体可被归入四个相关家族中的一个。例如I类造血受体的特征在于存在包含保守半胱氨酸残基和WSXWS基序(SEQ IDNO：5)的结构域。以二硫键环为特征的附加结构域，包括蛋白质激酶结构域、纤连蛋白III型结构域、和免疫球蛋白结构域，存在于特定的造血受体中。细胞因子受体结构的综述见Urda 1，Ann.Reports Med. Chem.26：221-228，1991和Cosman，Cytokine 5：95-106，1993。据信，在使生物获得新的生物功能的选择压力下，有可能从已经存在的受体基因副本产生新的受体家族成员从而导致出现多基因家族。因此家族成员包含祖先基因的遗迹，这些特有的特征可用于分离和鉴定其它的家族成员。
细胞表面细胞因子受体进一步以附加结构域的存在为特征。这些受体通过以疏水氨基酸残基序列(典型约21-25个残基)为特征的跨膜结构域被锚定于细胞膜中，该序列两侧通常为带正电荷的残基(Lys或Arg)。蛋白质中与细胞外结构域相反的一端并由跨膜结构域与之分开的是细胞内结构域。
本发明的zcytor 19受体是一个II类细胞因子受体。这些受体通常结合于四螺旋花束(four-helix-bundle)细胞因子。白细胞介素-10和干扰素具有这一类型的受体(例如，干扰素-γ、α和β链以及干扰素-α/β受体α和β链)。II类细胞因子受体其特征在于其细胞外结构域中存在一或多个细胞因子受体模块(CRM)。其它的II类细胞因子受体包括zcytor11(一般为US专利号5965704所有)、CRF2-4(GenbankAccession No.Z17227)、IL-10R(Genbank Accession No.U00672和NM_001558)、DIRS1、zcytor7(一般为US专利号5 945 511所有)、zcytor16、组织因子，及类似。II类细胞因子受体的CRMs与更为熟知的I类细胞因子受体的CRMs稍有不同。尽管II类CRMs包含两个纤连蛋白III型类似结构域，它们在组织方面却不同。
zcytor19，如同所有已知的除干扰素-α/β受体α链之外的II类受体一样，在其细胞外结构域只有一个II类CRM。zcytor19是干扰素/IL-10类的螺旋状细胞因子的受体。如上所述，zcytor19与其它的II类细胞因子受体相似，例如zcytor11和zcytor16。因其结合IL28A、IL28B、和IL29配体的能力，Zcyto19受体(ZcytoR19)被命名为IL29RA。
对一个编码zcytor19的人cDNA克隆(SEQ ID NO：18)所作的分析揭示了一个编码520个氨基酸(SEQ ID NO：19)的开放阅读框，它包括分泌信号序列(SEQ ID NO：19的残基1(Met)至20(Gly))和成熟zcytor19细胞因子受体多肽(SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至520(Arg))，约206个氨基酸残基的细胞外配体结合结构域(SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至226(Asn))、约23个氨基酸残基的跨膜结构域(SEQ ID NO：19的残基227(Trp)至249(Trp))、和约271个氨基酸残基的细胞内结构域(SEQ ID NO：19的残基250(Lys)至520(Arg))。细胞外配体结合结构域内有两个纤连蛋白III型结构域和一个接头区域。第一个纤连蛋白III型结构域包括SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至119(Tyr)，接头包括SEQ ID NO：19的残基120(Leu)至124(Glu)，第二个纤连蛋白III型结构域包括SEQ ID NO：19的残基125(Pro)至223(Pro)。因此，将包括SEQ ID NO：19的氨基酸21(Arg)至223(Pro)的多肽视为配体结合片段(SEQ ID NO：4)。此外，正如II类受体中典型保守的一样，如SEQ ID NO：19所示其中有包括残基43(Trp)和68(Trp)的保守色氨酸残基，以及SEQ ID NO：19第74、82、195、217位的保守半胱氨酸残基。
另外，对一个编码zcytor19的人cDNA克隆(SEQ ID NO：1)所作的分析揭示了一个编码491个氨基酸(SEQ ID NO：2)的开放阅读框，它包括分泌信号序列(SEQ ID NO：2的残基1(Met)至20(Gly))和成熟zcytor19细胞因子受体多肽(SEQ ID NO：2的残基21(Arg)至491(Arg))，约206个氨基酸残基的细胞外配体结合结构域(SEQ ID NO：2的残基21(Arg)至226(Asn))、约23个氨基酸残基的跨膜结构域(SEQID NO：2的残基227(Trp)至249(Trp))、和约242个氨基酸残基的细胞内结构域(SEQ ID NO：2的残基250(Lys)至491(Arg))。细胞外配体结合结构域内有两个纤连蛋白III型结构域和一个接头区域。第一个纤连蛋白III型结构域包括SEQ ID NO：2的残基21(Arg)至119(Tyr)，接头包括SEQ ID NO：2的残基120(Leu)至124(Glu)，第二个纤连蛋白III型结构域较短，包括SEQ ID NO：2的残基125(Pro)至223(Pro)。因此，将包括SEQ ID NO：2的氨基酸21(Arg)至223(Pro)的多肽视为配体结合片段(SEQ ID NO：4)。此外，正如I I类受体中典型保守的一样，如SEQ ID NO：2所示其中还有包括残基43(Trp)和68(Trp)的保守色氨酸残基，以及SEQ ID NO：2第74、82、195、217位的保守半胱氨酸残基。
zcytor19受体mRNA的一种截短的可溶形式似乎是天然表达的。对一个编码该截短的可溶zcytor19的人cDNA克隆(SEQ ID NO：20)所作的分析揭示了一个编码211个氨基酸(SEQ ID NO：21)的开放阅读框，它包括分泌信号序列(SEQ ID NO：21的残基1(Met)至20(Gly))和成熟的截短可溶zcytor19受体多肽(SEQ ID NO：21的残基21(Arg)至221(Ser))，约143个氨基酸残基的截短的细胞外配体结合结构域(SEQID NO：21的残基21(Arg)至163(Trp))，没有跨膜结构域，但有一个约48个氨基酸残基的附加结构域(SEQ ID NO：21的残基164(Lys)至211(Ser))。该截短的细胞外配体结合结构域内有两个纤连蛋白III型结构域和一个接头区域。第一个纤连蛋白III型结构域包括SEQID NO：21的残基21(Arg)至119(Tyr)，接头包括SEQ ID NO：21的残基120(Leu)至124(Glu)，第二个纤连蛋白III型结构域包括SEQ IDNO：21的残基125(Pro)至163(Trp)。因此，将包括SEQ ID NO：21的氨基酸21(Arg)至163(Trp)的多肽视为配体结合片段。此外，正如II类受体中典型保守的一样，如SEQ ID NO：21所示其中有包括残基43(Trp)和68(Trp)的保守色氨酸残基，以及SEQ ID NO：21第74和82位的保守半胱氨酸残基。
此外，本发明的zcytor19多肽可被天然表达，如上所述，其中细胞外配体结合结构域在成熟多肽、或细胞外细胞因子结合结构域或细胞因子结合片段的N-末端含有5-15个附加氨基酸残基。
本领域技术人员将认识到，这些结构域边界是近似的并且是以与已知蛋白质的比对和蛋白质折叠预测为依据的。从结构域末端缺失残基是有可能的。此外，SEQ ID NO：2的上述区域、结构域和基序也显示在SEQ ID N O：1中；SEQ ID NO：19的上述结构域和基序也显示在SEQ IDNO：18中；SEQ ID NO：21的上述结构域和基序也显示在SEQ ID NO：20中。
跨膜区、以及保守和低变基序的存在通常与蛋白质中的重要结构区域相关，或定义蛋白质中的重要结构区域。低变区(例如，疏水簇)通常存在于结构上很重要的区域中(Sheppard，P.et al.，Gene150：163-167，1994)。这样的低变区常含有稀少或不常见的氨基酸，例如色氨酸。这样的保守低变基序侧翼或之间的区域可能更富于变化，但常常是在功能上很重要的因为它们可能涉及或定义重要结构和活性例如结合结构域、生物和酶活性、信号转导、细胞-细胞互作、组织定位结构域及类似。
对zcytor19序列的分析显示它是与II类细胞因子受体，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5,965,704所有)、CRF2-4(Genbank Accession No.Z17227)、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5,945,511所有)受体，相同的受体亚家族的成员之一。该亚家族的若干成员(例如，结合干扰素的受体、IL-10、IL-19、和IL-TIF的受体)与第二亚单位(称作β-亚单位)联合以结合配体并转导信号。特异β-亚单位与一些特异细胞因子受体亚单位结合。已显示，zcytor19与CRF2-4形成异型二聚体。
CRF2-4也表现为zcytor11(IL-22R)结合IL-10的结合配偶体，以及zcytor11结合细胞因子IL-TIF的结合配偶体(参见，WIPO公开WO00/24758；Dumontier et al.，J.Immunol.164：1814-1819，2000；Spencer，SD et al.，J.Exp.Med.187：571-578，1998；Gibbs，VC和Pennica Gene 186：97-101，1997(CRF2-4cDNA)；Xie，MH etal.，J.Biol.Chem.275：31335-31339，2000；和Kotenko，SV etal.，J.Biol.Chem.manuscript in press M007837200；Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat’l.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000；Liu Y et al，J Immunol.152；1821-1829，1994(IL-10R cDNA)。该亚家族中的受体也可结合以形成转导信号的异型二聚体。同样地，II类受体复合物可以是异型二聚体式，或多聚体式的。因此，包含zcytor19亚单位的单体、同型二聚体、异型二聚体和多聚体受体包括在本发明范围内。
本领域普通技术人员用本文所述方法可鉴定和/或制备大量保留了信号转导或配体结合活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19的多肽片段或变体。例如，可通过制备大量与细胞外细胞因子结合结构域(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至226(Asn))、细胞因子结合片段(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至223(Pro)；SEQ ID NO：4)或等位变体或其种间直向同源物)基本同源的多肽来制备保留了野生型zcytor19蛋白质配体结合活性的zcytor19“可溶性受体”。此外，可分离变体zcytor19可溶性受体。这样的多肽可能，例如从部分或整个跨膜和细胞内结构域处，包括附加氨基酸。如同本文一般公开地，这样的多肽还可能包括附加多肽片段，例如标记、亲和标记物，及类似。
已显示，本发明的受体与一类与干扰素具有功能和结构相似性的多核苷酸和多肽分子形成复合物。在这一包括分子zcyto20(SEQ IDNOS：51和52)、zcyto21(SEQ ID NOS：54和55)、zcyto22(SEQ IDNOS：56和57)、zcyto24(SEQ ID NOS：59和60)、zcyto25(SEQ IDNOS：61和62)的新家族中，zcyto20、21、和22是人序列，zcyto24和25是小鼠序列。此外，已显示该家族中的各分子呈现特定的生物活性。这些活性包括，例如，抗病毒活性和提高循环骨髓细胞水平。不想受理论的束缚，这些分子出现于通过同一途径经由zcytor19受体的所有信号。
表1示出配体家族内在核苷酸和氨基酸水平的同源性，核苷酸水平的范围约为72％至98％，氨基酸水平约为51％至97％。
表1
核苷酸序列同一性
Figure G2009101751191D00121
表2是对zcyto20、zcyto21、zcyto22、IFNα、IFNβ、IFNγ、和IL10在氨基酸水平上的序列同一性的说明。
表2
氨基酸序列同一性
Figure G2009101751191D00131
Zcyto20编码205个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：52所示。可以预计Zcyto20的信号序列含有SEQ ID NO：52的氨基酸残基1(Met)至氨基酸残基21(Ala)。Zcyto20的成熟肽始于氨基酸残基22(Val)。
Zcyto21编码200个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：55所示。可以预计Zcyto21的信号序列含有SEQ ID NO：55的氨基酸残基1(Me t)至氨基酸残基19(Ala)。Zcyto21的成熟肽始于氨基酸残基20(Gly)。PCT申请WO 02/02627中已对Zcyto21作了描述。
Zcyto22编码205个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：57所示。可以预计Zcyto22的信号序列含有SEQ ID NO：57的氨基酸残基1(Met)至氨基酸残基21(Ala)。Zcyto22的成熟肽始于氨基酸残基22(Val)。
Zcyto24编码202个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：60所示。Zcyto24的信号序列含有SEQ ID NO：60的氨基酸残基1(Met)至氨基酸残基28(Ala)。在氨基酸残基24(Thr)处可以发现作为选择的分泌信号序列切割位点。该成熟肽含有氨基酸残基29(Asp)至氨基酸残基202(Val)。
Zcyto25基因编码202个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：62所示。Zcyto 25分泌信号序列包含SEQ ID NO：62的氨基酸残基1(Met)至氨基酸残基28(Ala)。在氨基酸残基24(Thr)处可以发现作为选择的分泌信号序列的切割位点。该成熟多肽含有氨基酸残基29(Asp)至氨基酸残基202(Val)。
CRF2-4(SEQ ID NOS：63和64)是zcytor19的推定信号配偶体，这一证据进一步支持了：该受体在免疫调节系统中起着重要作用，影响着生理例如先天免疫系统和炎症免疫系统。
定位配体/受体对中受体的表达或许对于鉴定配体作用的靶细胞或组织具有重要意义。尤其是当受体/配体复合物涉及一个异型二聚体受体并且其中一个亚单位被广泛表达而另一个亚单位以或者空间或者时间限制型的受限方式表达时，这是特别有用的。已通过原位杂交鉴定了一个皮肤癌样品中的zcytor19表达，其中癌症颗粒上皮细胞显强阳性，而在正常皮肤中未观察到阳性信号。其它已鉴定的表达zcytor19的组织包括胎儿肝脏，其中在窦状间隙的单核细胞混合群体中观察到信号；在肺中，在II型肺泡上皮细胞中观察到了表达；以及在间隙组织的巨噬细胞样单核细胞中。对zcytor19的Northern分析鉴定到了一个～4.5kb转录物的表达，它在心脏、骨骼肌、胰腺、和前列腺组织中、以及在Burkitt′s淋巴瘤(RAJI)细胞系和SW-480结肠直肠癌细胞系中表达量最大。
如上所述，zcytor19中的保守氨基酸残基区域可用作鉴定新家族成员的工具。例如，可以利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从获自大量组织来源或细胞系的RNA中扩增编码保守区的序列。从zcytor19序列设计的高度简并引物尤其对这一目有用。本领域技术人员易于设计并使用这样的简并引物。
本发明提供多核苷酸分子，包括编码本文所公开的zcytor19多肽的DNA和RNA分子。根据遗传密码简并性，本领域技术人员将意识到，在这些多核苷酸分子中可能有可观的序列变异。SEQ ID NO：3是一个包括所有编码SEQ ID NO：2的zcytor19多肽的DNA的简并DNA序列；SEQ IDNO：28是一个包括所有编码SEQ ID NO：19的zcytor19多肽的DNA的简并DNA序列；SEQ ID NO：29是一个包括所有编码SEQ ID NO：21的zcytor19多肽的DNA的简并DNA序列。本领域技术人员公知，通过用U取代T，SEQID NO：3、SEQ ID NO：28、和SEQ ID NO：29的简并序列也还提供编码SEQID NO：2、SEQ ID NO：19、和SEQ ID NO：21的所有RNA序列。因此，包括SEQ ID NO：3的核苷酸1至核苷酸1473、SEQ ID NO：28的核苷酸1至核苷酸1560、SEQ ID NO：29的核苷酸1至核苷酸633在内的编码zcytor19多肽的多核苷酸是本发明所预见的。此外，如本文所述的这些简并序列的亚片段例如多肽的成熟形式、细胞外、细胞因子结合结构域、细胞内结构域、及其类似包括在本发明之内。本领域技术人员根据本文所述的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21及其亚片段易于确定SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中各自编码这些亚片段的核苷酸。表3列出了SEQ ID NO：3中所用的单字母代码，以指示简并核苷酸位置。“分辨率”指由单字母表示的核苷酸。“互补核苷酸”表示其互补核苷酸的代码。例如，代码Y表示C或T，其互补碱基R表示A或G，A与T互补，G与C互补。
表3
Figure G2009101751191D00161
SEQ ID NOs：3、28、29、53、及58中所用的简并密码子，其对于某一给定的氨基酸来说包括所有可能的密码子，示于表4。
表4
本领域普通技术人员将意识到，在确定作为编码各氨基酸的所有可能密码子的代表的某个简并密码子时会有些含糊不清。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)在某些情况下可以编码精氨酸(AGR)，而精氨酸的简并密码子(MGN)在某些情况下可以编码丝氨酸(AGY)。编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在相似的关系。因此，一些由简并序列构成的多核苷酸可能编码变体氨基酸序列，但本领域普通技术人员通过参照SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：19，和/或SEQ ID NO：21的氨基酸序列可以容易地鉴定这样的变体序列。如本文所述可以容易地测定变体序列的功能。
本领域普通技术人员还将意识到，不同的物种可能表现“偏爱密码子利用”。一般，参见，Grantham，et al.，Nuc.Acids Res.8：1893-912，1980；Haas，et al.Curr.Biol.6：315-24，1996；Wain-Hobson，et al.，Gene 13：355-64，1981；Grosjean和Fiers，Gene 18：199-209，1982；Holm，Nuc.Acids Res.14：3075-87，1986；Ikemura，J.Mol.Biol.158：573-97，1982。如本文所使用的，术语“偏爱密码子利用”或“偏爱密码子”是一个公知的术语，指在特定物种细胞中最常使用的蛋白质翻译密码子，从而偏好编码各氨基酸的可能密码子中的一个或几个代表(参见表2)。例如，氨基酸苏氨酸(Thr)可由ACA、ACC、ACG、或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子；在其它物种，例如，昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，可能偏爱不同的Thr密码子。可用本领域公知的各种方法将特定物种的偏爱密码子导入本发明的多核苷酸中。将偏爱密码子序列导入重组DNA可以，例如，通过在特定细胞或物种中更有效的进行蛋白质翻译而提高蛋白质的生产。所以，SEQ ID NO：3中公开的简并密码子序列用作在本领域常用的以及本文公开的各种细胞类型和物种中优化zcytor19多核苷酸的表达的模板。可以如本文所述测试并优化含有偏爱密码子的序列在不同物种中的表达，并测试其功能。
在本发明的优选实施方式中，分离的多核苷酸在严谨条件下将与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：20、或与之互补的序列中大小相似的区域杂交。通常，严谨条件是在确定的离子强度和pH下低于热熔解点(Tm)约5℃处。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的靶序列与完全互补的探针杂交时的温度。本领域公知大量计算Tm的方程式，并且这些方程式特异于不同长度的DNA、RNA和DNA-RNA杂交体和多核苷酸探针序列(参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Press1989)；Ausubel et al.，(eds。)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，Inc.1987)；Berger和Kimmel(eds.)，Guide to Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件例如OLIGO 6.0(LSR；Long Lake，MN)和Primer Premier 4.0(Premier Biosoft International；Palo Alto，CA)，以及Internet上的网址，都可获得用于分析给定序列并根据用户定义的条件计算Tm的工具。这样的程序还可以在所定义条件下分析给定的序列并鉴定合适的探针序列。典型地，较长的多核苷酸序列(例如，＞50碱基对)的杂交在低于计算出的Tm约20-25℃处进行。对于较小的探针(例如，＜50碱基对)的杂交一般在Tm或低于Tm 5-10℃下进行。这允许DNA-DNA和DNA-RNA杂交体实现最大的杂交速率。添加甲酰胺可以在更低的温度下达到更高的严谨度，缓冲液中每1％的甲酰胺可使杂交体的Tm降低约1℃。适宜的严谨杂交条件相当于42℃下在含有下列物质的缓冲液中孵育约5小时至过夜：约40-50％甲酰胺、至多约6×的SSC、约5×Denhardt溶液、0至约10％葡聚糖硫酸酯、以及约10-20μg/ml可商业获得的变性载体DNA。通常，这样的严谨条件包括20-70℃的温度和含有至多6×的SSC和0-50％甲酰胺的杂交缓冲液；杂交后在至多约2×的SSC中洗膜。例如，适宜的洗涤严谨度相当于0.1×SSC至2×SSC、0.1％SDS，55℃至65℃。杂交和洗涤过程中可以使用不同的严谨程度以实现与靶序列最大程度的特异结合。典型地，杂交后的洗涤在逐渐升高的严谨度下完成以从杂交复合物中除去未杂交的多核苷酸探针。严谨的杂交和洗涤条件依赖于反映在Tm上的探针长度、所用的杂交和洗涤液，而且它们由本领域技术人员根据经验来确定。
如前面所指出的，本发明的分离的多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法是本领域熟知的。通常，RNA分离自产生大量zcytor19RNA的组织或细胞。通过Northern杂交鉴定这样的组织和细胞(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201，1980)，它们包括PBLs、脾、胸腺、骨髓、和淋巴组织、人红白血病细胞系、急性单核细胞性白血病细胞系、B-细胞和T-细胞白血病组织或细胞系、其它淋巴样及造血细胞系，及类似。可经异硫氰酸胍抽提、之后在CsCl梯度中离心分离制备总RNA(Chirgwin et al.，Biochemistry 18：52-94，1979)。用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-12，1972)从总RNA制备Poly(A)+。用公知方法从poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。作为选择，也可以分离基因组DNA。之后通过例如杂交或聚合酶链式反应(PCR)(Mullis，U.S.专利号4,683,202)鉴定和分离编码zcytor19多肽的多核苷酸。
可以通过常规的克隆方法获得编码zcytor19的全长克隆。优选为互补DNA(cDNA)，尽管对于一些应用(例如，在转基因动物中的表达)来说可能优选使用基因组克隆、或修饰cDNA以包括至少一个基因组内含子。制备cDNA和基因组克隆的方法是熟知且在本领域普通技术范围内的，包括将本文公开的序列或其部分用于探查或探测文库。可以用zcytor19的抗体、受体片段、或其它特异结合配偶体探测表达文库。
本发明的多核苷酸还可用DNA合成仪合成。目前理想的方法是亚磷酰胺法。如果对于某一应用(例如合成基因或基因片段)来说需要化学合成的双链，则分别制备各互补链。制备全长基因的另一可选择途径是合成一套重叠的寡核苷酸(40至100核苷酸)。参见Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles & Applications of Recombinant DNA，(ASM Press，Washington，D.C.1994)；Itakuraet al.，Annu.Rev.Biochem.53：323-56，1984和Climie et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：633-7，1990。此外，通常还增加包含为转录和翻译正确起始和终止的信号的其它序列。
本发明进一步提供来自其它种的对应多肽和多核苷酸(直向同源物)。这些种包括但不限于，哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物、鱼类、昆虫和其它的脊椎和非脊椎种。特别值得关注的是来自哺乳动物种的zcytor19多肽，包括鼠类、猪、绵羊、犬、猫、马、以及其它灵长类动物的多肽。可以结合使用本发明提供的信息和组合物与常规的克隆技术来克隆人zcytor19的直向同源物。
本领域技术人员将认识到，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：18、或SEQID NO：20中公开的序列代表人zcytor19的一个等位基因，并且预计将会出现等位变异和可变剪接。可根据标准方法探测来自不同个体的cDNA或基因组文库来克隆该序列的等位变体。SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：18或SEQ ID NO：20中所示DNA序列的等位变体是在本发明范围内的，它们包括那些包含沉默突变的序列以及那些其中的突变导致氨基酸序列改变的序列，作为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的等位变体的蛋白质也一样是在本发明范围内的。从另一可变剪接形式得到的mRNAs产生的、保留了zcytor19多肽特性的cDNA被包括在本发明的范围内，由这样的cDNA和mRNA编码的多肽也一样被包括在本发明范围内。可以根据本领域已知的标准方法探测来自不同个体和组织的cDNA或基因组文库来克隆这些序列的等位变体和剪接变体。
本发明还提供分离的、与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：21的多肽及其直向同源物实质上类似的zcytor19多肽。本文中用术语“实质上类似的”表示与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21中所示序列或其直向同源物具有至少70％、更优选至少80％序列同一性的多肽。这样的多肽更优选至少90％、且最优选95％或更高地一致于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21或其直向同源物。序列同一性百分数用本领域常规方法确定。参见，例如，Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603-616，1986以及Henikoff和Henikoff，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，1992。简言之，以缺口开放罚分为10、缺口延伸罚分为1、以及表5(氨基酸用标准的单字母代码表示)所示的Henikoff和Henikoff的“blosum62”记分矩阵(同上)来比对两条氨基酸序列以优化比对得分。之后计算同一性百分数为：
Figure G2009101751191D00221
表5
   A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
A  4
R -1  5
N -2  0  6
D -2 -2  1  6
C  0 -3 -3 -3  9
Q -1  1  0  0 -3  5
E -1  0  0  2 -4  2  5
G  0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6
H -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4
K -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5
M -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7
S  1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4
T  0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7
V  0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4
用上文所公开的比率以相似方法测定多核苷酸分子的序列同一性。
本领域技术人员知道有许多已经建立的算法可以用来比对两条氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是用于检测本文公开的氨基酸序列与推定的变体zcytor19的氨基酸序列间的同一性水平的适宜蛋白质比对方法。FASTA算法由Pearson和Lipman描述于，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)，以及由Pearson描述于，Meth.Enzymol.183：63(1990)。
简言之，不考虑保守氨基酸的取代、插入、或缺失，FASTA首先通过鉴定查询序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21)与测试序列间具有最高密度的同一性(若ktup变量为1)或同一性对(若ktup＝2)的共有区域来显示序列相似性特征。通过比较所有配对氨基酸的相似性(使用氨基酸取代矩阵)对具有最高密度同一性的十个区域重新记分，并对该区域的末端进行“修剪”以只包括那些对最高分值作出贡献的残基。如果有几个区域的分值大于“阈值”(用预定的公式根据序列长度和ktup值来计算)，则检查这些经修剪的初始区域以确定这些区域是否可以连接以形成带缺口的最接近比对。最后，用修正的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch，J.Mol. Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))将两条氨基酸序列的最高得分区进行比对，该算法允许氨基酸的插入和缺失。FASTA分析的优选参数为：ktup＝1，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝1，且取代矩阵＝BLOSUM62，其它参数设为默认值。如Pearson的Meth.Enzymol.183：63(1990)中附录2所述，可以通过修改记分矩阵文档(“SMATRIX”)将这些参数导入FASTA程序。
也可将FASTA以上面公开的比率用于测定核酸分子的序列同一性。对于核酸序列比较，ktup值可介于一至六之间，优选从三至六，最优选为三，同时其它FASTA程序参数设为默认值。
BLOSUM62表(表3)是一个衍生自蛋白质序列片段约2000个局部多重比对的氨基酸取代矩阵，代表大于500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff和Henikoff，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89：10915(1992))。因此，BLOSUM62取代频率可用于定义可能被导入本发明氨基酸序列中的保守氨基酸取代。尽管有可能仅基于化学特性来设计氨基酸取代(如下述)，术语“保守氨基酸取代”优选地指代由一个大于-1的BLOSUM62值所代表的取代。例如，如果一个氨基酸取代是以一个为0、1、2、或3的BLOSUM62值为特征的，则该氨基酸取代是保守的。根据该系统，优选的保守氨基酸取代其特征为至少为1的BLOSUM62值(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代其特征为至少为2的BLOSUM62值(例如，2或3)。
变体zcytor19多肽或实质上同源的zcytor19多肽其特征为具有一个或多个氨基酸取代、缺失或增加。这些改变优选为性质上次要的，即，不显著影响多肽的折叠和活性的保守氨基酸取代(参见表6)及其它取代；小的缺失，典型为1至约30个氨基酸；和小的氨基-或羧基-末端延伸，例如氨基末端蛋氨酸残基、约有20～25个氨基酸的小接头肽、或亲和标记物。本发明因此包括含有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的相应区域至少80％、优选至少90％、且更优选95％或更高程度相同的序列的多肽，不包括标记物、延伸、接头序列及类似。包含亲和标记物的多肽可进一步在zcytor19多肽和亲和标记物间含有蛋白水解切割位点。适宜的位点包括凝血酶切割位点和因子Xa的切割位点。
表6
保守的氨基酸取代
碱性：精氨酸
      赖氨酸
      组氨酸
酸性：谷氨酸
      天冬氨酸
极性：谷氨酰胺
      天冬酰胺
疏水：亮氨酸
      异亮氨酸
      缬氨酸
芳香族：苯丙氨酸
        色氨酸
        酪氨酸
小：甘氨酸
    丙氨酸
    丝氨酸
    苏氨酸
    蛋氨酸
本发明进一步提供大量的其它多肽融合体和含有一个或多个多肽融合体的相关多聚蛋白质。例如，可将zcytor19多肽制备成一个与U.S.专利No.5 155 027和5 567 584中公开的二聚化蛋白质的融合体。就这方面，优选的二聚化蛋白质包括免疫球蛋白恒定区结构域。免疫球蛋白-zcytor19多肽融合体可以在遗传工程化的细胞中表达以产生大量多聚zcytor19类似物。zcytor19多肽上可以融合辅助结构域以将它们靶向至特定的细胞、组织、或大分子(例如，胶原)。可以将zcytor19多肽融合至两个或更多个部分上，例如用于纯化的亲和标记物和靶向结构域。多肽融合体还可以含有一个或多个切割位点，尤其是在结构域之间。参见，Tuan等，Connective Tissue Research 34：1-9，1996。
本发明的蛋白质还可以包括非自然产生的氨基酸残基。非自然产生的氨基酸包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲基脯氨酸(2，4-methanoproline)、顺式-4-羟基脯氨酸、反式4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、及4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非自然产生的氨基酸残基整合进蛋白质的方法。例如，可以使用一种体外系统，在该系统中用化学氨酰化的抑制型tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰tRNA的方法是本领域已知的。在含有大肠杆菌S30提取物和商业购买的酶和其它试剂的无细胞系统中完成包含无义突变的质粒的转录和翻译。用层析法纯化蛋白质。参见，例如，Robertson等，J.Am.Chem.Soc.113：2722，1991；Ellman等，Methods Enzymol.202：301，1991；Chung等，Science 259：806-9，1993；和Chung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10145-9，1993)。在第二种方法中，通过微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制型tRNA在爪蟾(Xenopus)卵母细胞中完成翻译(Turcatti等，J.Biol.Chem.271：19991-8，1996)。第三种方法中，在不含将被取代的天然氨基酸(如苯丙氨酸)但含有目的非自然产生的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养大肠杆菌细胞。将非自然产生的氨基酸整合进蛋白质中以取代其对应的天然氨基酸。参见，Koide等，Biochem.33：7470-7476，1994。通过体外化学修饰可将自然产生的氨基酸残基转化为非自然产生的种类。化学修饰可与定点诱变结合以进一步扩大取代的范围(Wynn和Richards，Protein Sci. 2：395-403，1993)。
少量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非自然产生的氨基酸、以及非天然氨基酸可用于取代zcytor19氨基酸残基。
可根据本领域已知的方法鉴定本发明多肽的重要氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells，Science 244：1081-5，1989；Bass等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4498-502，1991)。在后一技术中，将单个丙氨酸突变导入分子中的各残基处，如下面所公开的测试所得突变分子的生物学活性(例如，配体结合和信号转导)以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。亦参见，Hilton等，J.Biol.Chem.271：4699-4708，1996。还可通过对结构的物理分析以及推定接触位点氨基酸的突变来确定配体-受体、蛋白质-蛋白质或其它生物学相互作用位点，如通过核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记这样的技术来确定。参见，例如，de Vos等，Science255：306-312，1992；Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.309：59-64，1992。对重要氨基酸的鉴定还可以从对与相关受体同源性的分析来推断。
可以确定区域或结构域内对保持结构完整至关重要的氨基酸残基。在这些区域内，可以确定能够或多或少地容忍改变并保持整个分子的三维结构的特异残基。分析序列结构的方法，包括但不限于，用可获得的软件(例如，Insight
Figure G2009101751191D00281
viewer和同源性建模工具；MSI，San Diego，CA)对高氨基酸或核苷酸同一性的多个序列进行比对和计算机分析、二级结构倾向(secondary structure propensities)、双元模式、互补包装(complementary packing)和隐蔽极性互作(buried polar interactions)(Barton，Current Opin.Struct. Biol.5：372-376，1995和Cordes等，Current Opin.Struct.Biol. 6：3-10，1996)。通常，在设计分子修饰或鉴定特异片段时，结构确定都伴随着对经修饰分子的活性评估。
在zcytor19多肽中所做的氨基酸序列改变要将对生物活性至关重要的较高级有序结构的破坏降至最低。例如，当zcytor19多肽含有一个或多个结构结构域时，例如纤连蛋白III型结构域，氨基酸残基的改变应不至于破坏结构域结构和几何特征、以及分子中其它的如果其构象改变会使分子丧失一些重要功能的组分，例如分子与其结合配体的结合的功能。氨基酸序列改变的效果可通过，例如，上述公开的计算机模型来预测，或通过结晶结构分析来测定(参见，例如，Lapthorn等，Nat.Struct.Biol.2：266-268，1995)。本领域中熟知的其它技术可比较变体蛋白质与标准分子(例如，天然蛋白质)的折叠。例如，可以比较变体分子与标准分子中的半胱氨酸形式。质谱法和还原及烷基化化学修饰为确定与二硫键有关或无关的半胱氨酸残基提供了方法(Bean等，Anal.Biochem.201：216-226，1992；Gray，Protein Sci.2：1732-1748，1993；和Patterson等，Anal.Chem. 66：3727-3732，1994)。通常认为，如果经修饰的分子不具有与标准分子相同的二硫键形式，那么折叠将受到影响。另一种熟知并被普遍接受的测定折叠的方法是圆二色性(CD)。测定和比较由修饰分子和标准分子产生的CD图谱是常规的(Johnson，蛋白质7：205-214，1990)。结晶学是另一种熟知的分析折叠和结构的方法。核磁共振(NMR)、消化肽图谱和表位图谱也是分析蛋白质与多肽间折叠和结构相似性的公知方法(Schaanan等，Science 257：961-964，1992)。
可以产生如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21中所示zcytor19蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性分布图(Hopp等，Proc. Natl.Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth. 88：1-18，1986和Triquier等，Protein Engineering 11：153-169，1998)。该分布图是以一个滑动的六残基窗口为基础的。隐蔽的G、S和T残基和暴露的H、Y和W残基被忽略。例如，在zcytor19中，亲水性区域包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基295至300；SEQ ID NO：2的451至456；SEQ ID NO：2的301至306；SEQ ID NO：2的244至299；和SEQ ID NO：2的65至70。此外，本领域技术人员将意识到，包括带有抗原表位的多肽在内的zcytor19亲水性区域可通过Jameson-Wolf图来预测，例如，用DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)。
本领域技术人员将意识到，在设计zcytor19多肽氨基酸序列中的修饰时要考虑亲水性和疏水性，以不至于破坏整个结构和生物学特性。值得特别注意的是选自Val、Leu和Ile这一组或Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp这一组的疏水性残基进行取代。例如，可耐受置换的残基可能包括如SEQ ID NO：2中所示的这样的残基。然而，在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19第74、82、195、和217位的半胱氨酸残基，以及在SEQ IDNO：4中对应的Cys残基相对来说是不耐受置换的。此外，SEQ ID NO：21第74、82位的半胱氨酸残基相对来说是不耐受置换的。
对重要氨基酸的鉴定还可以根据对II类细胞因子受体家族成员与zcytor19间的序列相似性的分析来推断。用例如前述的“FASTA”分析，鉴定了蛋白质家族内高相似性的区域并将其用于分析氨基酸序列的保守区域。根据结构鉴定变体zcytor19多核苷酸的另一种可选择的方法是确定编码潜在的变体zcytor19多核苷酸的核酸分子是否能与具有上述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：20的核苷酸序列的核酸分子杂交。
其它鉴定本发明多肽中重要氨基酸的方法是本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells，Science 244：1081(1989)，Bass等，Proc.Natl Acad.Sci.USA88：4498(1991)，Coombs和Corey，“Site-Directed Mutagenesis andProtein Engineering，”in Protein：Analysis and Design，Angeletti(ed.)，第259-311页(Academic Press，Inc.1998))。在后一技术中，将单个丙氨酸突变导入分子中的各残基处，如下面所公开地测试所得突变分子的生物学活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。这样的诱变和筛选方法是本领域常规的。亦参见，Hilton等，J.Biol.Chem.271：4699(1996)。
本发明还包括zcytor19多肽的功能性片段和编码这样的功能性片段的核酸分子。本文所定义的“功能性”zcytor19或其片段其特征在于，其增殖或分化活性、其诱导或抑制特化的细胞功能的能力、或其特异结合抗-zcytor19抗体或zcytor19配体(无论是可溶的或固定的)的能力。此外，功能性片段还包括信号肽、细胞内信号结构域，及类似。如本文前述，zcytor19其特征在于II类细胞因子受体结构。因此，本发明进一步提供包括下列的的融合蛋白质：(a)含有本文所述的细胞外结构域、细胞因子结合结构域、或细胞内结构域的多肽分子；和(b)含有一个或多个这些结构域的功能性片段。融合蛋白质的另一个多肽部分或许可由另一个II类细胞因子受体或促进融合蛋白质分泌的非天然的和/或不相关的分泌信号肽形成，其中的另一个I I类细胞因子受体例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5965704所有)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5 945 511所有)、及类似。
可以对核酸分子进行常规的缺失分析以获得编码zcytor19多肽的核酸分子的功能性片段。举例来说，具有核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：20的DNA分子或其片段，可以用Bal31核酸酶消化以得到一系列嵌套式缺失。之后将这些DNA片段以正确的阅读框插入表达载体，分离表达的多肽并检测zcytor19活性、或结合抗-zcytor19抗体或zcytor19配体的能力。外切核酸酶消化的另一种可替换方式是使用寡核苷酸定点诱变以导入缺失或终止密码子以特异产生目的zcytor19片段。或者作为选择，也可以通过聚合酶链式反应来合成特定的zcytor19多核苷酸片段。
鉴定功能性结构域的标准方法是本领域技术人员熟知的。例如，Horisberger和Di Marco已经对有关在干扰素的一端或两端都进行截断的研究进行了总结，Pharmac.Ther.66：507(1995)。此外，还描述了对蛋白质进行功能性分析的标准技术，例如，Treuter等，Molec. Gen.Genet.240：113(1993)；Content等，“Expression andpreliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetaseinduced by human interferon”，Biological Interferon Systems， Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems，Cantell(ed.)，第65-72页(Nijhoff 1987)；Herschman，“The EGFReceptor”，Control of Animal Cell Proliferation 1，Boynton等，(eds.)第169-199页(Academic Press 1985)；Coumailleau等，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga等，J.Biol.Chem. 270：25291(1995)；Yamaguchi等，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)；和Meisel等，Plant Molec.Biol.30：1(1996)。
可以用已知的诱变和筛选方法进行多个氨基酸的取代及检测，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53-57，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156，1989)所公开的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，Biochem.30：10832-10837，1991；Ladner等，U.S.专利号5 223409；Huse，WIPO公开WO 92/062045)和区域定向诱变(Derbyshire等，Gene 46：145，1986；Ner等，DNA 7：127，1988)。
通过Stemmer公开的Nature 370：389-91，1994，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-51，1994及WIPO公开WO97/20078公开的DNA重排可以产生所公开的zcytor19DNA和多肽序列的变体。
可将本文公开的诱变方法与高通量自主筛选方法结合以检测所克隆的突变zcytor19受体多肽在宿主细胞中的活性。此方面优选的检测包括细胞增殖检测和以生物传感器为基础的配体结合检测，下面将它们进行描述。用现代化的装置可以从宿主细胞中回收编码活性受体或其部分(例如，配体结合片段、信号结构域、及类似)的突变DNA分子并进行快速测序。这些方法允许常规且快速地确定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性。
另外，本发明的蛋白质(或多肽其片段)可与其它生物活性分子尤其是细胞因子受体结合以提供多功能分子。例如，zcytor19可溶性受体的一个或多个结构域可与其它细胞因子可溶性受体结合以增强它们的生物学特性或生产效率。
本发明因此提供一系列新的杂合分子，这些分子中含有一个或多个zcytor19结构域的片段与另一个多肽融合。优选通过DNA水平的剪接实现融合以允许在重组生产系统中表达嵌合分子。之后对获得的分子检测例如改进的可溶性、改进的稳定性、延长的清除半衰期、改进的表达和分泌水平、以及药效动力学之类的特性。这样的杂合分子可进一步在组分蛋白质或多肽间含有附加的氨基酸残基(例如，多肽接头)。
对于任何zcytor19多肽，包括变体、可溶性受体、及融合多肽或蛋白质，本领域普通技术人员利用上述表1和2提供的信息可以容易地产生编码该变体的完全简并多核苷酸序列。
本发明的zcytor19多肽，包括全长多肽、生物活性片段、及融合多肽，可以根据常规的技术在遗传工程化的宿主细胞中产生。适宜的宿主细胞是那些可以用外源DNA转化或转染并在培养基中生长的细胞类型，包括细菌、真菌细胞、和培养的高等真核细胞。优选为真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA导入多种宿主细胞的技术公开于Sambrook等的，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989，和Ausubel等，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987。
一般，编码zcytor19多肽的DNA序列在表达载体中可操作性连接于其它的表达所需的遗传元件，通常包括转录启动子和终止子。载体通常还将包含一个或多个可选择标记以及一个或多个复制起点，尽管本领域技术人员将意识到在特定的系统中选择标记可由不同的载体提供，并且外源DNA可通过整合进宿主细胞基因组来进行复制。对启动子、终止子、选择标记、载体及其它元件的选择是本领域普通技术人员水平范围内的常规设计。文献中描述了许多这样的元件，并且它们可从供应商获得。
为指导zcytor19多肽进入宿主细胞的分泌途径，表达载体中提供了分泌信号序列(还已知为引导序列、前序列原(prepro sequence)或前序列)。分泌信号序列可以是zcytor19的、或者可以衍生自其它的分泌蛋白质(例如，t-PA)或重新合成。分泌信号序列可操作性连接于zcytor19DNA序列，即，两个序列以正确的阅读框连接并定位以指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常定位于编码目的多肽的DNA序列的5′，尽管特定的分泌信号序列可能定位于目的DNA序列中的其它位置(参见，例如，Welch等，U.S.专利号5 037 743；Holland等，U.S.专利号5 143 830)。
作为选择，本发明多肽中所包含的分泌信号序列用于指导其它多肽进入分泌途径。本发明提供这样的融合多肽。可以制备信号融合多肽，其中衍生自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19的氨基酸1(Met)至氨基酸20(Gly)的分泌信号序列用本领域已知以及本文公开的方法可操作性连接于另一多肽。包含在本发明融合多肽中的分泌信号序列优选融合于附加的多肽的氨基末端以指导附加肽进入分泌途径。
本发明中培养的哺乳动物细胞是适宜的宿主。将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic cell Genetics 7：603，1981：Graham和Van der Eb，Virology 52：456，1973)、电穿孔法(Neumann等，EMBO J.1：841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同上)、和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 15：73，1993；Ciccarone等，Focus 15：80，1993)、和病毒载体(Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-90，1989；Wang和Finer，Nature Med. 2：714-716，1996)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽公开于，例如，Levinson等，U.S.专利号4,713,339；Hagen等，U.S.专利号4784950；Palmiter等，U.S.专利号4 579 821；和Ringold，U.S.专利号4656 134。适宜的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham等，J. Gen.Virol.36：59-72，1977)和中国仓鼠卵巢(例如，CHO-K1；ATCC No.CCL 61)细胞系。其它的适宜细胞系是本领域已知的并且可从公共保藏处获得，例如美国典型培养物保藏所(ATCC)，Rockville，Maryland。通常，优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。参见，例如，U.S.专利号4 956 288。其它的适宜启动子包括那些来自金属硫蛋白基因(U.S.专利号4 579 821和4 601 978)的启动子和腺病毒主要晚期启动子。
药物选择通常用于选择其中已插入了外源DNA的培养的哺乳动物细胞。这样的细胞通常被称为“转染子”。已在选择试剂存在下进行培养并能将目的基因传递至其子代的细胞被称作“稳定转染子”。优选的选择标记为编码抗新霉素抗性的基因。在存在新霉素类药物的条件下进行选择，例如G-418或类似。选择系统也可用于提高目的基因的表达水平，该过程称作“扩增”。通过在低水平选择试剂存在的条件下培养转染子、以及随后提高选择试剂的量以选择高水平生产导入基因的产物的细胞，来完成扩增。优选的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，其产生对氨甲蝶呤的抗性。也可以使用其它的药物抗性基因(例如，潮霉素抗性、多重抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。或许可以使用其它可导入改变表型的标记，例如绿色荧光蛋白，或细胞表面蛋白例如CD4、CD8、I类MHC，胎盘碱性磷酸酶，以通过例如FACS分类或磁珠分离技术从未被转染的细胞中选择出已转染的细胞。
还可用其它高等真核细胞做宿主，包括植物细胞、昆虫细胞和鸟类细胞。Sinkar等，J.Biosci.(Bangalore)11：47-58，1987已经对将毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)用作载体在植物细胞中表达基因作了综述。Guarino等，U.S.专利号5 162 222和WIPO公开文本WO 94/06463公开了对昆虫细胞的转化以及外源多肽在其中的生产。可以用重组杆状病毒转染昆虫细胞，重组杆状病毒通常衍生自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)(AcNPV)。参见，King，L.A.和Possee，R.D.，The Baculovirus Expression System：A Laboratory Guide，London，Chapman & Hall；O′Reilly，D.R.等，Baculovirus Expression Vectors：A Laborat ory Manual，New York，OxfordUniversity Press.，1994；和，Richardson，C.D.，Ed.，Baculovirus Expression Protocols.Methodsin Molecular Biology，Totowa，NJ，Humana Press，1995。制备重组zcytor19杆状病毒的第二种方法利用了Luckow所述的以转座子为基础的系统(Luckow，V.A，等，J Virol 67：4566-79，1993)。该系统，其中利用了转化载体，在Bac-to-BacTM试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)中出售。该系统利用了转移载体，pFastBac1TM(Life Technologies)，该载体包含了Tn7转座子以将编码zcytor19多肽的DNA转移进作为大质粒“bacmid”保持在大肠杆菌中的杆状病毒基因组。参见，Hill-Perkins，M.S.和Possee，R.D.，J Gen Virol 71：971-6，1990；Bonning，B.C.等，J Gen Virol 75：1551-6，1994；和，Chazenbalk，G.D.，和Rapoport，B.，J Biol Chem 270：1543-9，1995。另外，转移载体可按读码框与DNA融合，所述DNA编码所表达的zcytor19多肽C-或N-末端的表位标记物，例如，Glu-Glu表位标记物(Grussenmeyer，T.等，Proc.Natl. Acad.Sci.82：7952-4，1985)。
重组病毒用于感染宿主细胞，典型为衍生自秋粘虫草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞系。参见，一般，Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA，ASM Press，Washington，D.C.，1994。另一个适宜的细胞系是衍生自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的High FiveOTM细胞系(Invitrogen)(U.S.专利号5 300 435)。用可商业获得的无血清培养基生长及维持细胞。适宜的培养基是适于Sf9细胞的Sf900 IITM(Life Technologies)或ESF 921TM(ExpressionSystems)；和适于粉纹夜蛾细胞的Ex-cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或Express FiveOTM(Life Technologies)。所用方法一般描述于可获得的实验指南中(King，L.A.和Possee，R.D.，同 上；O′Reilly，D.R.等，同上；Richardson，C.D.，同上)。随后自上清液中对zcytor19多肽的纯化可通过本文所述方法来完成。
真菌细胞，包括酵母细胞，也可以在本发明中使用。此处尤其值得注意的酵母种包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、和嗜甲毕赤酵母(Pichiamethanolica)。用外源DNA转化啤酒糖酵母细胞并由其生产重组多肽的方法公开于，例如，Kawasaki，U.S.专利号4 599 311；Kawasaki等，U.S.专利号4 931 373；Brake，U.S.专利号4 870 008；Welch等，U.S.专利号5 037 743；和Murray等，U.S.专利号4 845 075。根据由选择标记确定的表型来选择转化细胞，通常是抗药性或是在缺少特定营养物质(例如，亮氨酸)下的生长能力。优选在啤酒糖酵母中使用的载体系统是由Kawasaki等公开的POT1载体系统(U.S.专利号4 931373)，它允许根据在含葡萄糖的培养基中的生长来选择转化细胞。适宜在酵母细胞中使用的启动子和终止子包括那些来自糖酵解酶基因(参见，例如，Kawasaki，U.S.专利号4 599 311；Kingsman等，U.S.专利号4 615 974；和Bitter，U.S.专利号4 977 092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。亦参见U.S.专利号4 990 446、5 063 154、5 139936和4 661 454。其它酵母，包括多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、嗜甲毕赤酵母(Pichiamethanolica)、Pichia guillermondii、和麦芽糖念珠菌(Candidamaltosa)的转化系统是本领域已知的。参见，例如，Gleeson等，J.Gen. Microbiol.132：3459-3465，1986和Cregg，U.S.专利号4 882 279。根据McKnight等的方法还可以利用曲霉菌属(Aspergillus)细胞，(U.S.专利号4 935 349)。Sumino等公开了转化Acremoniumchrysogenum的方法(U.S.专利号5 162 228)。Lambowitz公开了转化脉胞菌(Neurospora)的方法(U.S.专利号4 486 533)。嗜甲毕赤酵母用作宿主生产重组蛋白质的用途公开于WIPO公开WO 97/17450、WO97/17451、WO 98/02536、和WO 98/02565。
原核宿主细胞，包括细菌大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)和其它属菌株在本发明中也是有用的宿主细胞。转化这些宿主并在其中表达克隆的外源DNA序列的技术是本领域已知的(参见，例如，Sambrook等，同上)。
根据常规程序在含有营养物质及所选宿主细胞生长所必需的其它组分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。多种适宜的培养基，包括成分确定培养基和复合培养基，是本领域已知的且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基还可以根据需要包含例如生长因子或血清这样的组分。生长培养基通常将通过，例如，药物选择或必需营养物质缺陷，来选择含有外源添加的DNA的细胞，所述必需营养物质根据表达载体上携带的或共转染进入宿主细胞的选择标记来添加。在约25℃至35℃下，将嗜甲毕赤酵母细胞培养于含有充足碳源、氮源及微量营养物质的培养基中。用常规方法，例如振荡小三角瓶或发酵罐喷气，为液体培养基提供充足的通气条件。嗜甲毕赤酵母的优选培养基是YEPD(2％D-葡萄糖、2％BactoTM蛋白胨(DifcoLaboratories，Detroit，MI)、1％BactoTM酵母提取物(DifcoLaboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。
在本发明的一个方面，由培养的细胞生产zcytor19细胞因子受体(包括跨膜和细胞内结构域)，并用该细胞筛选该受体的配体，包括天然配体，以及天然配体的激动剂和拮抗剂。该方法概括而言，即，将编码该受体的cDNA或基因与其表达所需的遗传元件(例如，转录启动子)相结合，并将所得的表达载体插入宿主细胞。选择表达DNA并产生功能受体的细胞，并将其用于多种筛选系统。
适宜用于表达本发明新受体并转导受体介导的信号的哺乳动物细胞包括表达β-亚单位的细胞，β-亚单位例如II类细胞因子受体亚单位，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5,965,704所有)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5,945,511所有)受体。这样的亚单位既可以在细胞中天然表达，也可以与zcytor19受体共转染。I类细胞因子受体的一种典型细胞系统是使用表达gp130的细胞、和共表达gp130和LIF受体的细胞(Gearing等，EMBO J.10：2839-2848，1991；Gearing等，U.S.专利号5 284 755)。就此，通常优选使用对与同一亚家族中的受体相结合的其它细胞因子(例如IL-6或LIF)发生响应的细胞，因为这样的细胞将包含必要的信号转导途径。这一类型的优选细胞包括BaF3细胞(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell Biol.6：4133-4135，1986)、人类TF-1细胞系(ATCC号CRL-2003)和DA-1细胞系(Branch等，Blood 69：1782，1987；Broudy等，Blood 75：1622-1626，1990)。在替代方式中，可将适宜的宿主细胞工程化以产生β-亚单位或目的细胞反应所需的其它细胞组分。例如，可转染鼠细胞系BaF3(Palacios和Steinmetz，Cell41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell Biol.6：4133-4135，1986)、幼仓鼠肾(BHK)细胞系、或CTLL-2细胞系(ATCC TIB-214)以表达独立的II类亚单位，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5965704所有)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5 945 511所有)受体以及zcytor19。通常优选使用同种的宿主细胞和受体，然而该方法允许将细胞工程化以表达来自任何种类的多个受体亚单位，从而克服潜在的由种特异性引起的限制。在替代方式中，可以克隆人受体cDNA的物种同源物并将其用于相同种类来源的细胞系，例如鼠cDNA，用于BaF3细胞系中。因此可将依赖于一种造血生长因子，例如IL-3，的细胞系工程化为依赖于zcytor19配体或抗-zcytor19抗体的细胞系。
将表达功能性zcytor19的细胞用于筛选检测。本领域已知多种适宜的检测方法。这些检测是以对靶细胞中的生物反应的探测为基础的。一种这样的检测是细胞增殖检测。将细胞在含有或不含测试化合物的条件下培养，并通过例如，测定氚标胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入或根据以Alymar BlueTM(AccuMed，Chicago，IL)或3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)的还原或代谢降解为基础的比色检测(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，1983)检测细胞增殖。另一种可作为选择的检测形式利用了进一步被工程化以表达报告基因的细胞。受体基因连接于对受体链接的途径响应的启动子元件，例如，JAK/STAT途径，且该检测探测报告基因的转录激活。在这方面优选的启动子元件是血清反应元件，SRE(参见，例如，Shaw等，Cell 56：563-572，1989)。优选这样的报告基因是萤光素酶基因(de Wet等，Mol.Cell Biol.7：725，1987)。用本领域已知的方法(例如，Baumgartner等，J.Biol.Chem.269：19094-29101，1994；Schenborn和Goiffin，Promega Notes 41：11，1993)根据发光来检测萤光素酶的表达。萤光素酶检测试剂盒可从，例如，Promega Corp.，Madison，WI商业获得。可利用这一类型的靶细胞系筛选化学药品库、细胞-条件培养基、真菌液体培养基、土壤样品、水样，及类似。
将利用zcytor19可溶性受体多肽的分泌捕获方法用于分离zcytor19配体(Aldrich，等，Cell 87：1161-1169，1996)，如实施例中所述。鉴定zcytor19的天然配体的方法包括，将表达zcytor19的细胞因子依赖型细胞系突变并于选择自分泌生长的条件下培养。参见WIPO公开号WO 95/21930。
作为受体，zcytor19多肽的活性可用硅基生物传感器微量生理测定仪来测定，该测定仪测定与受体结合和之后的生理细胞应答相关的细胞外酸化速率或质子外排。一种示范仪器是Molecular Devices，Sunnyvale，CA制造的CytosensorTM微量生理测定仪。本发明提供的其它检测包括使用杂合受体多肽。这些杂合多肽分为两类。第一类中，zcytor19的细胞内结构域，约含SEQ ID NO：2的残基250(Lys)至491(Arg)或SEQ ID NO：19的残基250(Lys)至520(Arg)，与第二个受体的配体结合结构域连接。优选第二个受体为造血细胞因子受体，例如mpl受体(Souyri等，Cell 63：1137-1147，1990)。杂合受体将进一步包含跨膜结构域，该跨膜结构域可以来自这两个受体中的任何一个。之后将编码杂合受体的DNA构建体插入宿主细胞。在该结合结构域的配体存在下培养该表达杂合受体的细胞并检测反应。该系统提供了一种利用易于获得的配体分析由zcytor19介导的信号转导的方法。这一系统还可用于确定特定细胞系是否能响应由zcytor19转导的信号。第二类杂合受体多肽包括细胞外(配体-结合)细胞因子结合结构域(SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至226(Asn))、或细胞因子结合片段(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至223(Pro)；SEQ ID NO：4)和第二个受体的胞质结构域，优选为细胞因子受体，以及跨膜结构域。该跨膜结构域可以来自这两个受体中的任何一个。第二类杂合受体在已知能够响应由第二个受体转导的信号的细胞中表达。综合之，这两类杂合受体都使得广泛的细胞类型能用于以受体为基础的检测系统中。
之后将发现能表达zcytor19的配体的细胞用于制备cDNA文库，可根据上述从该文库中分离出配体编码cDNA。因此，除了新的受体多肽之外，本发明还提供克隆该受体的多肽配体的方法。
zcytor19的激动剂配体、或抗-zcytor19抗体，可能在刺激细胞介导的免疫中以及对刺激淋巴细胞增殖有用，例如治疗涉及免疫抑制的感染，包括特定的病毒感染。其它用途包括肿瘤抑制，其中恶性转化导致产生具有抗原性的肿瘤细胞。zcytor19的激动剂配体、或抗-zcytor19抗体可用于诱导细胞毒性，该细胞毒性可能由效应细胞例如T-细胞、NK细胞(自然杀伤细胞)、或LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)的激活介导，或经凋亡途径直接诱导。例如，zcytor19抗体可用于在带有zcytor19的癌细胞上刺激细胞毒性或ADCC。激动剂配体可能对于通过提高受影响的细胞类型的水平来治疗白血球减少症、以及增强骨髓移植后的T-细胞库再生也是有用的。
拮抗剂配体、化合物、可溶性zcytor19受体、或抗-zcytor19抗体可用于对免疫系统的抑制，例如治疗自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、炎性肠疾病、Crohn病，等。免疫抑制还可用于降低组织或器官移植或嫁接排斥以及通过抑制受影响细胞类型的增殖来治疗T-细胞特异白血病或淋巴瘤。
本发明预期裸抗-zcytor19抗体(或其裸抗体片段)的用途，以及免疫缀合物用于实现对各种疾病的治疗的用途，各种疾病包括B-细胞恶性肿瘤和本文所述的其它其中zcytor19被表达的癌症。这样的免疫缀合物和抗-zcytor19抗体可用于在带有zcytor19的癌细胞上刺激细胞毒性或ADCC。可用标准技术制备免疫缀合物。例如，可通过直接将治疗性试剂缀合到抗体组分上来制备免疫缀合物(参见，例如，Shih等，Int.J.Cancer 41：832-839(1988)；Shih等，Int.J.Cancer46：1101-1106(1990)；和Shih等，U.S.专利号5 057 313)。简言之，标准方法包括，将具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个自由氨基官能团并载有多个药物、毒素、螯合剂、硼附加物、或其它治疗性试剂的载体聚合物反应。该反应导致产生一个初始Schiff碱(亚胺)键，它可以通过还原而稳定成一个仲胺以形成最终的缀合物。
载体聚合物可以是氨基葡聚糖或最少有50个氨基酸残基的多肽，尽管可以使用其它基本相同的聚合物载体。优选，最终免疫缀合物在水溶液中是可溶的，例如在哺乳动物血清中，以便于给药和在治疗中有效靶向其用途。因此，载体聚合物上的增溶官能团将增强最终的免疫缀合物在血清中的溶解度。
在制备含有多肽治疗性试剂的免疫缀合物的另一种可选择方法中，经戊二醛缩合或通过多肽上激活的羧基基团与氨基葡聚糖上的氨基反应使治疗性试剂与氨基葡聚糖耦联。可将螯合剂附着于抗体组分以制备含有放射性金属或磁共振增强物质的免疫缀合物。作为示例的螯合剂包括乙二胺四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸的衍生物。可用常规方法将硼附加物，例如碳硼烷，结合到抗体组分上。
免疫缀合物也可通过直接将治疗性试剂缀合到抗体组分上来制备。除了治疗性试剂是直接连接到氧化抗体组分上的之外，总的过程与间接缀合方法类似。
作为进一步的说明，可通过形成二硫键将治疗性试剂连接在还原的抗体组分的铰链区。例如，可将破伤风类毒素肽构建成只有一个用于将该肽结合到抗体组分上的半胱氨酸残基。作为替代，可用异双功能交联剂例如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫)丙酸将这样的肽结合至抗体组分。Yu等，Int.J.Cancer 56：244(1994)。如此缀合的一般技术是本领域熟知的。参见，例如，Wong，Chemistry Of ProteinConjugation and Cross-Linking(CRC Press 1991)；Upeslacis等，“Modification of Antibody by Chemical Methods，”in MonoclonalAntibody：Principles and Applications，Birch等(eds.)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibody，”inMonoclonal Antibody：Production，Engineering and ClinicalApplication，Ritter等(eds.)，第60-84页(Cambridge UniversityPress 1995)。
如上所述，抗体Fc区中的碳水化合物部分可用于缀合治疗性试剂。然而，如果抗体片段是用作免疫缀合物中的抗体组分，则Fc区是缺失的。不过，有可能将碳水化合物部分引入抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leung等，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等，U.S.专利号5 443 953(1995)。之后将工程化的碳水化合物部分用于缀合治疗性试剂。
此外，本领域技术人员将意识到缀合方法中的无数可能变化。例如，碳水化合物部分可用于结合聚乙二醇以延长完整抗体、或其抗原结合片段在血液、淋巴液、或其它细胞外液体中的半衰期。而且，有可能通过将治疗性试剂与一个碳水化合物部分和一个自由巯基基团缀合而构建一个二价免疫缀合物。可将这样的自由巯基基团定位在抗体组分的铰链区。
一类免疫缀合物包括抗体组分和多肽细胞毒素。适宜多肽细胞毒素的一个例子是核糖体失活蛋白。I型核糖体失活蛋白为单链蛋白，而II型核糖体失活蛋白由两个经二硫键相连的不同亚单位(A和B链)组成(综述参见Soria等，Targeted Diagn.Ther.7：193(1992))。有用的I型核糖体失活蛋白包括来自肥皂草(Saponaria officinalis)的多肽(例如，皂草素-1，皂草素-2，皂草素-3，皂草素-6)、来自苦瓜(Momordica charantia)的多肽(例如，木鳖子皂苷)、来自Byronia dioica的多肽(例如，bryodin，bryodin-2)、来自栝楼(Trichosanthes kirilowii)的多肽(例如，trichosanthin，trichokirin)、来自Gelonium multiflorum的多肽(例如，gelonin)、来自美洲商陆(Phytolacca americana)的多肽(例如，商陆抗病毒蛋白，商陆抗病毒蛋白-II，商陆抗病毒蛋白-S)、来自非洲商陆(Phytolacca dodecandra)的多肽(例如，dodecandrin，Mirabilis抗病毒蛋白)，及类似。核糖体失活蛋白描述于，例如，Walsh等，U.S.专利号5 635 384。
适宜的II型核糖体失活蛋白包括来自Ricinus communis的多肽(例如，蓖麻毒蛋白)、来自相思子(Abrus precatorius)的多肽(例如，相思豆毒蛋白)、来自Adenia digitata的多肽(例如，modeccin)，及类似。由于II型核糖体失活蛋白包括结合半乳糖苷的B链和使腺苷脱嘌呤的毒性A链，因此II型核糖体失活蛋白缀合物应当包括A链。其它有用的核糖体失活蛋白包括bouganin、棒麦角素(clavin)、玉米核糖体失活蛋白、Vaccaria pyramidata核糖体失活蛋白、黑杆菌素b、碱性黑杆菌素1、ebuline、racemosine b、软瓜蛋白(luffin)-a、软瓜蛋白-b、软瓜蛋白-S、和本领域技术人员已知的其它核糖体失活蛋白。参见，例如，Bolognesi和Stirpe，国际公开No.WO98/55623，Colnaghi等，国际公开No.WO97/49726，Hey等，U.S.专利号5,635,384，Bolognesi和Stirpe，国际公开No.WO95/07297，Arias等，国际公开No.WO94/20540，Watanabe等，J.Biochem.106：6 977(1989)；Islam等，Agric.Biol.Chem.55：229(1991)，和Gao等，FEBS Lett.347：257(1994)。
自然产生的核糖体失活蛋白的类似物和变体对本文所述的靶向组合物也是适宜的，而且这样的蛋白质是本领域技术人员已知的。可用公众可获得的氨基酸和核苷酸序列制备核糖体失活蛋白。作为示例，编码皂草素-6的核苷酸序列公开于Lorenzetti等，U.S.专利号5 529932，而Walsh等，U.S.专利号5 635 384，描述了玉米和大麦核糖体失活蛋白的核苷酸和氨基酸序列。此外，核糖体失活蛋白也是可商业获得的。
其它的多肽细胞毒素包括核糖核酸酶、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、白喉毒素、假单胞菌外毒素、和假单胞菌内毒素。参见，例如，Pastan等，Cell 47：641(1986)，和Goldenberg，CA-A Cancer Journalfor Clinicians 44：43(1994)。
另一大类有用的细胞毒素是酪氨酸激酶抑制剂。由于已有建议认为酪氨酸激酶对增殖的激活在肿瘤的发生和发展中起重要作用，这一激活可被传递酪氨酸激酶抑制剂的抗-zcytor19抗体组分抑制。适宜的酪氨酸激酶抑制剂包括异黄酮，例如染料木黄酮(5，7，4’-三羟基异黄酮)、大豆黄素(7，4’-二羟基异黄酮)、和鹰嘴豆素A(4-甲氧基染料木黄酮)，及类似。将酪氨酸抑制剂与生长因子缀合的方法描述于，例如，Uckun，U.S.专利号5 911 995。
另一组有用的多肽细胞毒素包括免疫调节剂。如本文所使用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共同刺激分子、造血因子、及类似，以及合成的这些分子的类似物。免疫调节剂的例子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素(例如，白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-28A、IL-28B、和IL-29)、集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、干扰素(例如干扰素-α、-β、-γ、-ω、-ε、和-τ)、干细胞生长因子“S1因子”、促红细胞生成素、和血小板生成素。举例的免疫调节剂部分包括IL-2、IL-6、IL-10、干扰素-γ、TNF-α、及类似。
包括免疫调节剂的免疫缀合物提供了将免疫调节剂运送至靶细胞的方法，尤其可用于对抗肿瘤细胞。免疫调节剂的细胞毒性效应是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Klegerman等，“Lymphokines andMonokines”，Biotechnology and Pharmacy，Pessuto等(eds.)，第53-70页(Chapman & Hall 1993)。例如，干扰素可以通过诱导I类组织相容性抗原在各种细胞表面的增强表达来抑制细胞增殖，并从而增强细胞毒性T淋巴细胞破坏细胞的速率。此外，据信肿瘤坏死因子，例如肿瘤坏死因子-α，通过诱导DNA片段化而产生细胞毒性效应。
本发明还包括含有编码细胞毒素的核酸分子的免疫缀合物。作为该方法的一个例子，Hoganson等，Human Gene Ther.9：2565(1998)，描述了由FGF-2介导、通过制备与含有皂草素基因的表达载体缩合的FGF-2-聚赖氨酸缀合物来运送皂草素基因。其它适宜的毒素是本领域技术人员已知的。
可用缀合多肽的标准方法制备细胞毒性多肽和抗体组分的缀合物。例如，Lam和Kelleher，U.S.专利号5 055 291，描述了对与白喉毒素片段A或蓖麻蛋白毒素缀合的抗体的制备。将成纤维细胞生长因子与皂草素缀合的方法的一般方法也已被阐明，如下列文献所述：Lappi等，Biochem.Biophys.Res.Commun.160：917(1989)，Soria等，Targeted Diagn.Ther.7：193(1992)，Buechler等，Eur.J.Biochem.234：706(1995)，Behar-Cohen等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.36：2434(1995)，Lappi和Baird，U.S.专利号5 191 067，Calabresi等，U.S.专利号5 478 804，和Lappi和Baird，U.S.专利号5 576 288。亦参见，Ghetie和Vitteta，“Chemical Construction ofImmunotoxins”，Drug Targeting：Strategies，Principles，andApplications；Francis和Delgado(Eds.)，第1-26页(Humana Press，Inc.2000)，Hall(Ed.)，Immunotoxin Methods and Protocols(Humana Press，Inc.2000)；和Newton和Rybak，“Constructionof Ribonuclease-Antibody Conjugates for SelectiveCytotoxicity”，Drug Targeting：Strategies，Principles，andApplications，Francis和Delgado(Eds.)，第27-35页(Humana Press，Inc.2000)。
作为另一种可选择的方式，可用标准方法制备包含抗体组分和细胞毒性多肽的融合蛋白。制备含有细胞毒性多肽部分的融合蛋白的方法是抗体-毒素融合蛋白生产领域内熟知的。例如，包含白细胞介素-2部分的抗体融合蛋白描述于Boleti等，Ann.Oncol.6：945(1995)，Nicolet等，Cancer Gene Ther.2：161(1995)，Becker等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 93：7826(1996)，Hank等，Clin.Cancer Res.2：1951(1996)，和Hu等，Cancer Res.56：4998(1996)。另外，Yang等，Hum.Antibody Hybridomas 6：129(1995)，描述了包括F(ab′)2片段和肿瘤坏死因子α部分的融合蛋白。抗体-假单胞菌外毒素A融合蛋白已被描述于Chaudhary等，Nature 339：394(1989)，Brinkmann等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 88：8616(1991)，Batra等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 89：5867(1992)，Friedman等，J.Immunol.150：3054(1993)，Wels等，Int.J.Can.60：137(1995)，Fominaya等，J.Biol.Chem.271：10560(1996)，Kuan等，Biochemistry 35：2872(1996)，和Schmidt等，Int.J.Can.65：538(1996)。含有白喉毒素部分的抗体-毒素融合蛋白已描述于Kreitman等，Leukemia 7：553(1993)，Nicholls等，J.Biol.Chem.268：5302(1993)，Thompson等，J.Biol.Chem.270：28037(1995)，和Vallera等，Blood88：2342(1996)。Deonarain等，Tumor Tarrgeting 1：177(1995)，已描述了一种具有RNase部分的抗体-毒素融合蛋白，而Linardou等，Cell Biophys.24-25：243(1994)，制备了一种含有DNaseI组分的抗体-毒素融合蛋白。在Better等，J.Biol.Chem.270：14951(1995)中，gelonin被用作抗体-毒素融合蛋白中的毒素部分。作为进一步的例子，Dohlsten等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 91：8945(1994)，报道了一种含有葡萄球菌肠毒素-A的抗体-毒素融合蛋白。亦参见，Newton和Rybak，“Preparation of Recombinant RNase Single-ChainAntibody Fusion Proteins”，Drrug Targeting：Strategies，Principles，and Applications，Francis和Delgado(Eds.)，第77-95页(Humana Press，Inc.2000)。
作为多肽细胞毒素的一种替换形式，免疫缀合物可以包含一种放射性同位素作为细胞毒性部分。例如，免疫缀合物可以包含抗-zcytor19抗体组分和辐射α粒子的放射性同位素、辐射β粒子的放射性同位素、辐射γ粒子的放射性同位素、俄歇电子辐射物、辐射α-粒子的中子俘获物或通过俘获电子而衰变的放射性同位素。适宜的放射性同位素包括198Au、199Au、32P、33P、125I、131I、123I、90Y、186Re、188Re、67Cu、211At、47Sc、103Pb、109Pd、212Pb、71Ge、77As、105Rh、113Ag、119Sb、121Sn、131Cs、143Pr、161Tb、177Lu、191Os、193MPt、197Hg，及类似。
可直接或通过螯合剂间接地将放射性同位素结合到抗体组分上。例如，可以用螯合剂将提供β-粒子和γ-射线的67Cu缀合到抗体组分上，该螯合剂例如为对溴乙酰胺-苄基-乙四胺四乙酸。Chase和Shapiro，“Medical Applications of Radioisotopes”，Gennaro(Ed.)，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，第843-865页(Mack Publishing Company 1995)。作为另一种可选择的替代物，可以用二亚乙基三氨五乙酸将放射出高能β-粒子的90Y结合到抗体组分上。此外，Stein等，Antibody Immunoconj.Radiopharm.4：703(1991)描述了一种用131I对抗体组分进行直接放射标记的示范性适宜方法。作为选择，可以用标准技术将硼附加物例如碳硼烷结合到抗体组分上。
适于制备免疫缀合物的另一适宜细胞毒素类型是化疗药物。作为举例的化疗药物包括氮芥子气、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、表鬼臼毒素、铂配位复合物，及类似。化疗药物的特定例子包括氨甲蝶呤、多柔比星、柔红霉素、cytosinarabinoside、顺铂、长春地辛、丝裂霉素、博来霉素、美法仑、苯丁酸氮芥、美登木素生物碱(maytansinoids)、家利车霉素(calicheamicin)、泰素，及类似。适宜的化疗药物描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(MackPublishing Co.1995)，和Goodman And Gilman′s ThePharmacological Basis Of Therapeutics，第9版(MacMillanPublishing Co.1995)。其它适宜的化疗药物是本领域技术人员已知的。
在另一种方法中，通过将光敏试剂或染料与抗体组分缀合来制备免疫缀合物。荧光及其它色原、或染料，例如对可见光敏感的卟啉，通过将适宜的光指向损伤已被用于检测和治疗损伤。这一类型的“光辐射”、“光线疗法”、或“光动力学”疗法描述于，例如，Mew等，J.Immunol.130：1473(1983)，Jori等(eds.)，PhotodynamicTherapy Of Tumors And Other Diseases(Libreria Progetto 1985)，Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8744(1986)，van denBergh，Chem.Britain 22：430(1986)，Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.288：471(1989)，Tatsuta等，Lasers Surg.Med.9：422(1989)，和Pelegrin等，Cancer 67：2529(1991)。
上述方法也可用于制备含有免疫缀合物的多特异性抗体组合物。
本文公开的抗体包括结合zcytor19/CRF2-4异型二聚体复合物(包括异型二聚可溶性受体)的抗体。
抗-zcytor19抗体，及多特异性抗体组合物可用于通过阻止zcytor19配体(例如，zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)与内源zcytor19受体的结合来调节免疫系统。可将这样的抗体对任何需要治疗的对象给药，而且本发明预期对兽用及人类两者的治疗性用途。作为例子的对象包括哺乳动物体对象，例如农场动物、家养动物、和人类患者。
结合zcytor19的多特异性抗体组合物和双重反应性抗体可用于治疗自身免疫疾病、B细胞癌、免疫调节、和其它病理(例如，ITCP、T细胞-介导的疾病、cattleman’s disease、自身免疫疾病、脊髓异常增生综合征，及类似)、肾脏疾病、移植排斥、以及移植物对宿主的疾病。本发明的抗体可特异性靶向调控免疫应答中的B细胞应答。此外，本发明的抗体可用于调节B细胞发育、由B细胞完成的抗原呈递、抗体生产、和细胞因子生产。
拮抗性抗-zcytor19抗体可用于中和zcytor19配体治疗B细胞淋巴瘤和白血病、慢性或急性淋巴细胞性白血病、骨髓瘤例如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、和淋巴瘤例如非何杰金(non-Hodgkins)淋巴瘤，与上述疾病伴随的是zcytor19配体多肽的增加，或其中zcytor19配体为存活因子或生长因子。抗-zcytor19抗体也可用于治疗免疫受损病人体内出现的与EB病毒(Epstein Barr virus)相关的淋巴瘤(例如，AIDS或器官移植)。
与zcytor19结合而诱导信号的抗-zcytor19抗体可能通过诱导导致生长抑制、细胞循环停止、细胞凋亡、或肿瘤细胞死亡的信号而直接抑制淋巴瘤和白血病细胞的生长。引发信号的zcytor19抗体是直接抑制或杀死癌细胞的优选抗体。另外，激动性抗-zcytor19单克隆抗体可能激活正常B细胞并促进抗癌免疫应答。抗-zcytor19抗体可能直接抑制白血病、淋巴瘤、及多发性骨髓瘤的生长，且该抗体可能还执行免疫效应器功能。抗-zcytor19单克隆抗体可能导致产生抗体-依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性、和吞噬作用。
zcytor19配体可在嗜中性细胞、单核细胞、树突细胞、已经激活的单核细胞中表达。在特定的自身免疫失调中(例如，重症肌无力、及类风湿性关节炎)，B细胞被zcytor19配体激活后可能使自身免疫恶化。选择性阻断B-淋巴细胞活动的免疫抑制剂蛋白可能在治疗疾病中有用。自体抗体的产生对于几种自身免疫疾病是普遍的，并促进组织损伤和疾病恶化。自体抗体还可导致免疫复合物沉积并发症的发生，并导致多种系统性红斑狼疮症状，包括肾衰竭、神经痛症状及死亡。调节不依赖于细胞应答的抗体生产可能在许多疾病状态也是有益的。在类风湿性关节炎中B细胞也已显示出对由关节炎引起的免疫球蛋白的分泌起重要作用。基于此，对zcytor19配体抗体生产的抑制或许在治疗自身免疫疾病例如重症肌无力或类风湿性关节炎中是有益的。免疫抑制剂疗法例如选择性阻断或中和B-淋巴细胞作用的抗-zcytor19抗体或许有利于这样的目的。
本发明提供用抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物选择性阻断或中和B-细胞作用的方法，其中的B-细胞作用与末期肾脏疾病相关、但可能与或可能不与自身免疫疾病相关。这样的方法对于治疗免疫肾脏疾病也将是有用的。这样的方法对于治疗肾小球肾炎也是有用的，所述肾小球肾炎与下列疾病例如膜性肾病、IgA肾病或Berger’s病、IgM肾病、Goodpasture病、感染后肾小球肾炎(post-infectiousglomerulonephritis)、肾小球膜增殖性疾病(mesangioproliferative disease)、慢性淋巴细胞性白血病、微小病变肾病综合征。这样的方法也可于治疗与例如狼疮、多动脉炎、Henoch-Schonlein、硬皮病、HIV-相关疾病、淀粉样变性病或溶血性尿毒综合征这样的疾病有关的次级肾小球肾炎或脉管炎的治疗性用途。本发明的方法还可用于治疗与慢性肾盂肾炎、止痛剂滥用、肾钙沉着症、由其它原因引起的肾病、肾结石、或慢性或急性间质性肾炎相关的间质性肾炎或肾盂肾炎的部分治疗性用途。
此外，本发明提供利用抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物选择性阻断或中和与肝脏有关的病毒感染的方法。如实施例24所示，尽管正常和患病肝脏样本都表达zcytor19mRNA，但是在肝炎病毒C和肝炎病毒B呈阳性的肝脏样本中有受体的特异表达。
当肝脏疾病为炎症性且持续至少六个月时，通常将其视为慢性肝炎。用反转录酶/聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HCV-RNA，主动感染的肝炎病毒C(HCV)病人其血液为HCV-RNA阳性。本发明的方法将延缓肝脏疾病的进程，并可根据例如血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平改善、天冬氨酸转氨酶(AST)水平改善、活组织检测的肝门炎症减轻、或肝坏死减轻来衡量。组织学上的好转可用Histological Activity Index(Davis等，New Eng.J.Of Med.321：1501-1506，1989；Knodell等，Hepatology 1：431-435，1981)衡量。检测好转的其它方法是本领域已知的，且可由临床医师测定，可包括，例如，HCV抗体的评估(Kuo，等，Science，244：362-364，1989)。
本发明还提供治疗肾脏或尿路肿瘤、多发性骨髓瘤、淋巴细胞瘤、白血病、轻链肾炎、或淀粉样变性病的方法。
本发明还提供用抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物阻断或抑制已激活B细胞的方法，以用于治疗哮喘及其它慢性呼吸道疾病例如支气管炎和肺气肿。
本发明还提供用抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物抑制或中和T细胞应答的方法，以用于免疫抑制，尤其是对例如移植物-对-宿主疾病和抑制排斥这样的治疗性用途。此外，抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物，可能在治疗象胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠道疾病(IBD)、及Crohn’s病这样的自身免疫疾病治疗方案中有用。。本发明的方法对于治疗慢性炎症疾病，尤其是减轻关节痛、肿、缺血和其它相关症状以及治疗感染性休克，具有特别的治疗价值。
B细胞应答对抵御包括细菌、病毒、原生动物、和寄生感染的传染病非常重要。抵御传染性微生物的抗体可以通过与抗原结合之后而将病原体固定，接着受到补体介导的裂解或细胞介导的攻击。激动性、或信号性抗-zcytor19抗体可用于增强体液免疫，且将会是对处于传染病风险中的个体、或作为免疫附加物的有效治疗药物。
可以得到已成熟建立的动物模型以用于体内检测本发明的抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物在特定疾病状态下的效果。作为说明，可以在许多患有自身免疫疾病的动物模型，例如用作系统性红斑狼疮模型的MRL-1pr/1pr或NZB×NZW F1同类小鼠系，体内检测抗-zcytor19抗体。这样的动物模型是本领域已知的。
通常，抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物的给药剂量，将随着受试者的年龄、重量、高度、性别、总体医学状况和以前的病史这样的因素而变化。作为说明，抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物，可以低蛋白质剂量给药，例如20至100毫克蛋白质每剂量，一次或重复给药。作为选择，抗-zcytor19抗体、或多特异性抗体组合物，可以30至90毫克蛋白质每剂量、或40至80毫克蛋白质每剂量、或50至70毫克蛋白质每剂量的剂量给药，尽管也可以根据情况的指示使用较低或较高的剂量。
可经静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、膜内、经区域导管灌注、或直接对损伤区注射将抗体组分对受试者给药。当通过注射进行治疗性蛋白质给药时，给药可以是连续灌输或经单次或多次灌注方式。其它的给药途径包括口腔、粘膜、肺部、及皮内。
可根据本领域已知的方法配制含有抗-zcytor19抗体、或双特异性抗体组分的药物组合物，以制备药学上有用的组合物，其中治疗性蛋白质以混合物形式与药学上可接受的载体组合。如果一种组合物可以被受体病人忍受那么则称该组合物为“药学上可接受的”。无菌磷酸缓冲盐就是药学上可接受载体的一个例子。其它适宜的载体是本领域人员已知的。参见，例如，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company 1995)。
为治疗目的，将抗-zcytor19抗体或双特异性抗体组分、以及药学上可接受的载体以治疗有效量对病人给药。如果抗-zcytor19抗体或双特异性抗体组分、以及药学上可接受载体的组合的给药量是生理学上显著的，则称该给药是以“治疗有效量”进行的。如果一种试剂的存在导致受体病人生理上的可检测改变，则该试剂是生理学上显著的。例如，如果一种炎症治疗试剂的存在会减轻炎症反应的话，则该试剂是生理学上显著的。作为另一个例子，一种用于抑制肿瘤细胞生长的试剂是生理学上显著的，如果该试剂的给药导致肿瘤细胞数量减少、转移减少、实体肿瘤体积变小、或肿瘤坏死减少。
可以液体形式、气雾剂或固体形式提供含有抗-zcytor19抗体、或双特异性抗体组分的药物组合物。液体形式，如可注射溶液或口服悬液。固体形式的例子包括胶囊、片剂、和控制释放形式。后一形式的例子包括微渗泵和植入物(Bremer等，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery”，Drug DeliverySystems，Ranade和Hollinger(eds.)，第95-123页(CRC Press 1995)；Bremer等，“Protein Delivery with Infusion Pumps”，ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders and Hendren(eds.)，第239-254页(Plenum Press 1997)；Yewey等，“Delivery of Proteinfrom a Controlled Release Injectable Implant”，ProteinDelivery：Physical Systems，Sanders和Hendren(eds.)，第93-117页(Plenum Press 1997))。
作为另一个例子，脂质体提供了经静脉内、腹膜内、膜内、肌内、皮内、或经口服给药、吸入、或鼻内给药而将抗-zcytor19抗体、或双特异性抗体组分运送至受试者的方法。脂质体是由一个或多个环绕水性内腔的脂双层组成的微观载体(参见，通常，Bakker-Woudenberg等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs 46：618(1993)，和Ranade，“Site-SpecificDrug Delivery Using Liposomes as Carriers”，Drug DeliverySystems，Ranade和Hollinger(Eds.)，第3-24页(CRC Press1995))。脂质体在组成上与细胞膜类似，且因此脂质体可以安全的给药并可以生物降解。依赖于制备方法，脂质体可能是单层或多层的，脂质体的直径大小可以在0.02μm至大于10μm范围内变化。脂质体中可以包入多种试剂：在脂双层中掺入疏水试剂以及在内侧水相空间掺入亲水试剂(参见，例如，Machy等，Liposomes In Cell Biology andPharmacology(John Libbey 1987)，和Ostro等，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。此外，有可能通过改变脂质体大小、脂双层数量、脂质组成、以及脂质体的电荷和表面特征来控制所包埋试剂的治疗可获得性。
作为将含有抗-zcytor19抗体组分的脂质体进行给药的另一可选择方式，可以用生物素化的抗-zcytor19抗体对靶细胞进行预标记。清除血浆中的自由抗体后，将链霉抗生物素蛋白-缀合的脂质体给药。这一一般方法描述于，例如，Harasym等，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998)。这样一种方法也可用于制备多特异性抗体组合物。
本发明还考虑了经化学修饰的抗体组分，其中抗体组分与聚合物交联。典型地，该聚合物是水溶性的以使抗体组分在水性环境，例如生理环境，不会沉淀。适宜聚合物的一个例子是已经过修饰而具有一个反应基团的聚合物，该反应基团例如用于酰化作用的活性酯、用于烷基化的醛基。以此方式，可以控制多聚化程度。反应性醛的一个例子是聚乙二醇丙醛、或其单-(C1-C10)烷氧基、或芳氧基衍生物(参见，例如，Harris等，U.S.专利号5 252 714)。该聚合物可以是分支或非分支的。此外，聚合物混合物可用于制备与抗体组分的缀合物。
适宜的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧-PEG、单-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、2，2，2-三氟乙磺酰基单甲氧PEG、PEG丙醛、二-琥珀酰亚氨羧酸酯PEG、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚物、聚氧乙基多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素、或其它基于碳水化合物的聚合物。适宜的PEG其分子量可以为自约600至约60 000，包括例如，5 000、12 000、20 000和25 000。缀合物还可以包括这样的水溶性聚合物的混合物。
制备含有多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的一般方法是本领域已知的。参见，例如，Karasiewicz等，U.S.专利号5 382 657，Greenwald等，U.S.专利号5 738 846，Nieforth等，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)，Monkarsh等，Anal.Biochem.247：434(1997))。
在与抗体组分缀合之前或之后，用上述方法也可将多肽细胞毒素与可溶性聚合物缀合。可溶性聚合物还可与抗体融合蛋白缀合。
可将裸露的抗-zcytor19抗体、或抗体片段补充进免疫缀合物或抗体融合蛋白一同给药。在一种变化的方式中，将裸露的抗-zcytor19抗体(或裸露的抗体片段)与低剂量放射性标记的抗-zcytor19抗体或抗体片段一同给药。作为第二种可选择的方式，裸露的抗-zcytor19抗体(或抗体片段)与低剂量放射性标记的抗-zcytor19抗体-细胞因子免疫缀合物一同给药。作为第三种可选择的方式，裸露的抗-zcytor19抗体(或抗体片段)与未标记的抗-zcytor19-细胞因子免疫缀合物-同给药。关于131I-标记免疫缀合物的“低剂量”，优选剂量是在15至40mCi范围内，而最优选范围是20至30mCi。相反，优选的90Y-标记免疫缀合物的剂量是在10至30mCi范围内，而最优选范围是10至20mCi。类似地，可将双特异性抗体组分补充进免疫缀合物或抗体融合蛋白一同给药。
用于热中子活化疗法的、具有负载了硼附加物的载体的免疫缀合物将以类似的方式正常地起作用。然而，在进行中子放射前一直等到非靶向免疫缀合物清除完将是有利的。可以用结合该免疫缀合物的抗体来加速清除。参见U.S.专利号4 624 846对该原理的描述。
本发明还考虑了一种治疗方法，其中用免疫调节剂进行给药以防止、减轻或逆转由放射诱导或药物诱导的正常细胞尤其是造血细胞的毒性效应。受体哺乳动物提高的耐受性使得辅助免疫调节剂疗法允许细胞毒性试剂的高剂量给药。此外，辅助免疫调节剂疗法可以防止、减轻或逆转剂量限制的骨髓毒性。适于辅助疗法的免疫调节剂的例子包括粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、血小板生成素、IL-1、IL-3、IL-12、及类似。辅助免疫调节剂疗法这一方法由Goldenberg公开于U.S.专利号5 120 525。
抗-zcytor19抗体疗法的功效可通过给裸露抗体组分补加免疫缀合物以及本文所述的其它补充治疗形式得到增强。在这样的多面疗法中，补加的治疗性组合物可以在用裸露的抗-zcytor19抗体给药之前、同时或之后给药。本发明的多面疗法进一步包括用裸露的抗-zcytor19抗体组分进行、并补充抗-zcytor19免疫缀合物给药的免疫疗法。在另一种形式的多面疗法中，受试者接受裸露的抗-zcytor19抗体和标准的癌症化疗。
本发明的抗体和抗体片段可用作疫苗以治疗上述各种失调和疾病。例如，具有双反应性的zcytor19受体单克隆抗体这一抗体组分可以提供适宜的疫苗基础。zcytor19受体的半胱氨酸富集区也可以为疫苗提供有用的组分。例如，疫苗可以包括至少以下一种多肽：含有SEQID NO：2的氨基酸残基8至41的多肽、含有SEQ ID NO：4的氨基酸残基34至66的多肽、和含有SEQ ID NO：4的氨基酸残基71至104的多肽。
药物组合物可以试剂盒的形式提供，该试剂盒包括一个含有抗-zcytor19抗体组分、或双特异性抗体组分的容器。治疗性分子可以单次或多次剂量的可注射溶液形式、或可在注射前重构的无菌粉末形式提供。作为选择，这样的试剂盒可以包括用于抗-zcytor19抗体组分给药的干粉分散器、液体雾化器或喷雾器。这样的试剂盒可以进一步包括给以指示和药物组合物用途的文字信息。此外，这样的信息还可以包括该组合物对已知对外源抗体具有超敏特性的病人禁忌使用的陈述。
zcytor19多肽，例如可溶性zcytor19受体，还可用在诊断系统中检测配体的循环水平。在一种相关的实施方式中，特异结合zcytor19受体多肽的抗体或其它试剂可用于检测循环中的受体多肽。被提升或抑制的配体或受体多肽水平可以指示病理状况，包括癌症。可溶性受体多肽有助于病理学进程并可作为未显疾病的间接标志。例如，人血清中升高的可溶性IL-2受体水平与普遍的炎症和肿瘤状况有关，例如心肌梗死、哮喘、重症肌无力、类风湿性关节炎、急性T-细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、结肠癌、乳腺癌、和卵巢癌(Heaney等，Blood 87：847-857，1996)。类似地，由于zcytor19在B-细胞性白血病细胞中表达，因此zcytor19表达水平的升高甚至可用作未显疾病，例如白血病，的标志。
可通过表达编码zcytor19细胞外细胞因子结合结构域(SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至226(Asn))、细胞因子结合片段(例如，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19的残基21(Arg)至223(Pro)；SEQ ID NO：4)、zcytor19变体的可溶性形式、或非人受体中的相应区域的截短形式的DNA来制备zcytor19受体或“可溶性受体”的配体结合多肽。优选细胞外结构域以基本不含跨膜和细胞内多肽片段的形式制备。此外，zcytor19细胞因子结合结构域内的配体结合多肽片段，如上所述，也可用作用于本文所述用途的zcytor19可溶性受体。为指导受体多肽从宿主细胞中输出，将受体DNA与编码分泌肽的第二个DNA片段连接，例如t-PA分泌肽或zcytor19分泌肽。为便于纯化分泌的受体多肽，可将一个C-末端延伸与受体多肽融合，C-末端延伸例如聚-组氨酸标记物、Glu-Glu标记肽、P物质、FlagTM肽(Hopp等，Bio/Technology 6：1204-1210，1988；可从Eastman Kodak Co.获得，New Haven，CT)或是某一抗体或其它特异性结合试剂可结合的另一多肽或蛋白质。
在另一可选择的方法中，受体细胞外结构域可表达为与免疫球蛋白重链恒定区的融合体，该免疫球蛋白重链恒定区包含两个恒定区结构域且缺少可变区，典型为Fc片段。这样的融合体典型地以多聚化分子形式分泌，其中Fc部分经二硫键彼此结合，而且两个受体多肽彼此靠近排列。这种类型的融合体可用于从溶液中亲和纯化出同类配体、用作体外检测工具、通过特异性滴定出配体来体外阻断信号、以及通过将其经非肠道途径给药而用作体内拮抗剂以结合循环中的配体并将其从循环中清除。为纯化配体，在利于受体-配体结合的条件下(典型为接近生理温度、pH和离子强度)将zcytor19-Ig嵌合体添加至包含配体(例如，细胞-条件培养基或组织提取物)的样品中。之后用固定在固体支持物(例如，不溶的树脂珠)上的蛋白质A从混合物中分离该嵌合体-配体复合物。之后用常规的化学技术，例如用盐或pH梯度，洗脱该配体。在另一可选择的方式中，可将嵌合体本身结合在固体支持物上，并进行上述的结合及洗脱。可再次分级分离所收集的级分直至达到所期望的纯度。
此外，zcytor19可溶性受体可用作“配体槽(ligand sink)”，即拮抗剂，以在不期望出现配体的治疗性或其它用途中体内或体外结合配体。例如，在大量表达生物活性zcytor19配体的癌症中，zcytor19可溶性受体可在体内直接用作该配体的拮抗剂，并且可以帮助减弱与该疾病有关的进程及症状。此外，通过体内结合那些将促进那些癌症增殖的配体，zcytor19可溶性受体可用于延缓过度表达zcytor19受体的癌症的进程。zcytor19可溶性受体的类似体外应用可用作，例如，筛选在不含zcytor19配体的条件下生长的细胞系。
此外，zcytor19可溶性受体可用于体内或诊断用途以检测在体内或组织样品中表达zcytor19配体的癌。例如，zcytor19可溶性受体可与本文所述的放射性标记或荧光标记缀合，并利用体外配体-受体类型结合试验、或荧光显像试验用于检测组织样品中配体的存在。此外，放射性标记的zcytor19可溶性受体可用于体外给药以通过本领域已知的放射显像技术检测表达配体的实体肿瘤。类似地，zcytor19多核苷酸、多肽、抗-zcytor19抗体、或肽结合片段可用于检测表达zcytor19受体的癌。在一种优选实施方式中，zcytor19多核苷酸、多肽、抗-zcytor19抗体、或肽结合片段可用于检测白血病，更优选为B-细胞白血病，最优选为前-B-细胞急性成淋巴细胞性白血病(pre-B-cellacute lymphoblastic leukemia)。
本发明的多肽优选纯化至≥80％纯度，更优选至≥90％纯度，甚至更优选≥95％纯度，且特别优选的是达到药物纯状态，即根据所污染的大分子尤其是蛋白质和核酸其纯度大于99.9％、且不含传染性或发热试剂。优选地，纯化的多肽基本不含其它多肽，特别是动物来源的其它多肽。
可用分级分离和/或常规的纯化方法和介质纯化表达的重组zcytor19多肽(或zcytor19嵌合或融合多肽)。硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提可用于分级分离样品。示范性的纯化步骤可包括羟基磷灰石、大小排阻、FPLC和反相高效液相层析。适宜的层析介质包括衍生葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、专业硅石、及类似。优选为PEI、DEAE、QAE和Q衍生物。有代表性的层析介质包括那些用苯基、丁基、或辛基衍生化的介质，例如Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)及类似；或聚丙烯酸树脂，例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)及类似。适宜的固体支持物包括在其使用条件下不溶的玻璃珠、硅基树脂、纤维质树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂及类似。可用反应基团修饰这些支持物以允许蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基和/或碳水化合物部分与之结合。耦联化学的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化、及碳二亚胺耦联化学的羧基和氨基衍生物。这些及其它固体介质是本领域熟知并广泛使用的，并可从供应商处获得。将受体多肽与支持介质结合的方法是本领域熟知的。对特定方法的选择是常规的设计并部分取决于所选支持物的特性。参见，例如，Affinity Chromatography：Principles & Methods，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
本发明的多肽可通过其生化、结构、及生物学特性来分离。例如，固定化金属离子吸附(IMAC)层析可用于纯化组氨酸富集的蛋白质，包括那些含有聚组氨酸标签的蛋白质。简言之，首先用二价金属离子形成螯合物而使凝胶带电(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1-7，1985)。根据所用的金属离子，组氨酸富集蛋白质将以不同亲和性被基质吸附，并将通过竞争性洗脱剂、降低pH、或使用强螯合剂被洗脱。其它的纯化方法包括用凝集素亲和层析及离子交换层析对糖基化蛋白质的纯化(Methods in Enzymol.，第182卷，“Guide to ProteinPurification”，M.Deutscher，(ed.)，Acad.Press，San Diego，1990，第529-39页)。在本发明另外的实施方式中，为便于纯化可以构建目的多肽与亲和标记物(例如，麦芽糖结合蛋白质、免疫球蛋白结构域)的融合体。
此外，用本领域已经描述的方法，将具有创造性的zcytor19的区域或结构域结合其它人类细胞因子受体家族蛋白质、或异源蛋白质的区域或结构域构建了多肽融合体、或杂合zcytor19蛋白质(Sambrook等，同上，Altschul等，同上，Picard，Cur.Opin.Biology，5：511-5，1994，以及其中的参考文献)。这些方法使得可以对目的多肽中较大的结构域或区域的生物学重要性进行判定。这样的杂合体可以改变反应动力学、结合、缩小或扩大底物特异性、或改变多肽的组织和细胞定位，并可应用于结构未知的多肽。
可用本领域技术人员已知的方法，通过制备融合蛋白的各组分并将其化学耦联来制备融合多肽或蛋白质。作为选择，可用已知技术产生在正确阅读框中的编码融合蛋白的一或多个组分的多核苷酸，并用本文所述方法进行表达。例如，赋予生物功能的部分或全部结构域可在本发明的zcytor19与来自另一细胞因子家族成员的功能相同的结构域间进行互换。这样的结构域包括但不限于，如本文所公开的分泌信号序列、细胞外细胞因子结合结构域、细胞因子结合片段、纤连蛋白III型结构域、跨膜结构域、和细胞内信号结构域。这样的融合蛋白预期将具有与本发明多肽或其它已知家族蛋白相同或类似的、依赖于所构建的融合体的功能图谱。此外，这样的融合蛋白可能表现本文所公开的其它特性。
标准的分子或生物克隆技术可用于在zcytor19多肽和那些它们所融合的多肽间交换功能等同结构域。通常，编码目的结构域的DNA片段，例如，本文所述的zcytor19结构域，按阅读框可操作性连接于至少一个编码附加多肽(例如来自另一细胞因子受体的结构域或区域，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5 965 704所有)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5 945 511所有)、或其它II类细胞因子受体)的其它DNA片段，并如本文所述被插入适当的表达载体。通常将编码相应多肽区域的数个DNA片段按阅读框可操作性相连以产生编码完整融合蛋白、或其功能部分的单一构建体，这样来构建DNA构建体。例如，DNA构建体从N-末端至C-末端将编码一个包含信号多肽、接着是跨膜结构域、接着是细胞内信号结构域的融合蛋白。如本文所述这样的融合蛋白可被表达、分离、并检测活性。此外，这样的融合蛋白可用于表达并分泌将要使用的zcytor19多肽片段，例如用于接种动物以产生本文所述的抗-zcytor19抗体。例如可将分泌信号序列可操作性连接于如本文所公开的细胞外细胞因子结合结构域、细胞因子结合片段、单个纤连蛋白III型结构域、跨膜结构域、和细胞内信号结构域、或其组合(例如，含有与接头相连的纤连蛋白III结构域的可操作性连接多肽，或本文所述的zcytor19多肽片段)以分泌zcytor19多肽片段，该zcytor19多肽片段可用本文描述的方法进行纯化并如本文所述用作接种动物的抗原以产生如本文所述的抗-zcytor19抗体。
一种在体内检测本发明蛋白质的方法涉及病毒运送系统。用于该目的的代表性病毒包括腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、和腺伴随病毒(AAV)。腺病毒，一种双链DNA病毒，是目前研究得最充分的用于运送异源核酸的基因转移载体(综述参见，T.C.Becker等，Meth.Cell Biol.43：161-89，1994；和J.T.Douglas和D.T.Curiel，Science & Medicine 4：44-53，1997)。腺病毒系统具有以下优点：(i)腺病毒可以容忍相当大的DNA插入；(ii)可以生长至高滴度；(iii)感染众多的哺乳动物细胞类型；和(iv)可与大量不同的启动子一同使用，包括普遍存在的、组织特异的、以及可调控启动子。而且，由于腺病毒在血流中是稳定的，它们可经静脉注射给药。
根据观察到的zcytor19的组织分布，激动剂(包括天然配体/底物/辅助因子/等等)和拮抗剂在体内和体外应用中都有巨大的潜力。确定为zcytor19激动剂的化合物对体外和体内刺激免疫和造血细胞生长有用。例如，zcytor19可溶性受体、和激动剂化合物可用作成分确定细胞培养基的组分，并可单独或与其它细胞因子和激素结合用于取代在细胞培养中通常使用的血清。因此激动剂对促进培养的T-细胞、B-细胞以及其它淋巴和骨髓细胞系细胞的生长和发育特别有用。此外，zcytor19可溶性受体、激动剂、或拮抗剂可用于体外检测以测定导致从分离的初级骨髓培养物形成克隆的刺激。这样的检测方法是本领域熟知的。
拮抗剂还可用作鉴定配体-受体互作位点的研究试剂。zcytor19活性抑制剂(zcytor19拮抗剂)包括抗-zcytor19抗体和可溶性zcytor19受体，以及其它肽-和非肽-物质(包括核酶)。
zcytor19也可用于鉴定调节剂(例如拮抗剂)活性。将测试化合物添加于本文所公开的方法中以鉴定抑制zcytor19活性的化合物。除了本文公开的检测方法之外，还可在为测定zcytor19结合、寡聚化、或对依赖于zcytor19的细胞应答的刺激/抑制而设计的大量检测方法中测定样品中zcytor19活性的抑制。
zcytor19配体结合多肽，例如本文公开的细胞外结构域或细胞因子结合结构域，还可用于纯化配体。多肽被固定于固体支持物上，例如琼脂糖珠、交联琼脂糖、玻璃、纤维素树脂、硅基树脂、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺、或类似的在使用条件下稳定的材料。将多肽连接至固体基质的方法是本领域已知的，包括胺化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酸亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、和酰肼活化。通常将得到的介质制成柱状，并使包含配体的流体过柱一或多次以使配体与受体多肽结合。之后在破坏配体-受体结合的盐浓度、离液剂(盐酸胍)、或pH变化中洗脱配体。
使用利用了配体结合受体(或抗体，互补/反向互补对之一)或其结合片段的检测系统、以及可商业获得的生物传感器装置或许较为便利(例如，BIAcoreTM，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ；或SELDITM technology，Ciphergen，Inc.，Palo Alto，CA)。将这样的受体、抗体、互补/反向互补对之一或片段固定在受体芯片表面。该装置的使用公开于Karlsson，J.Immunol.Methods 145：229-240，1991和Cunningham和Wells，J.Mol.Biol.234：554-63，1993。
配体结合受体多肽还可用在本领域已知的其它检测系统中。这样的系统包括用于结合亲和力测定的Scatchard分析(参见Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)和量热分析法(Cunningham等，Science 253：545-48，1991；Cunningham等，Science 245：821-25，1991)。
zcytor19多肽还可用于制备结合zcytor19表位、肽或多肽的抗体。zcytor19多肽或其片段用作接种动物并引发免疫应答的抗原(免疫原)。本领域技术人员能意识到，该具抗原性、带有表位的多肽包含zcytor19多肽(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21)的至少6个、优选至少9个、更优选至少15至约30个连续的氨基酸残基。含有zcytor19多肽更大部分的多肽(即，从30至100残基直到整个氨基酸序列全长)都包括在内。抗原或免疫原性表位还包括本文所述的附着标记、佐剂和载体。适宜的抗原包括由SEQ ID NO：2编码的zcytor19多肽的第21位氨基酸(Arg)至第491位氨基酸(Arg)、或其9至471个氨基酸的连续片段。适宜的抗原还包括由SEQ ID NO：19编码的zcytor19多肽第21位氨基酸(Arg)至第520位氨基酸(Arg)、或其9至500个氨基酸的连续片段；和由SEQ ID NO：21第21位氨基酸(Arg)至第211位氨基酸(Ser)编码的截短的可溶性zcytor19多肽、或其9至191个氨基酸的连续片段。用作抗原的优选肽是细胞外细胞因子结合结构域、细胞因子结合片段、纤连蛋白III型结构域、细胞内信号结构域、或本文公开的其它结构域和基序、或其组合；以及zcytor19亲水肽，例如本领域技术人员根据从例如Hopp/Woods亲水性分布图确定的亲水性图预测的那些zcytor19亲水肽。zcytor19亲水肽包括含有选自下列氨基酸序列的肽：(1)SEQ ID NO：2残基295至300；(2)SEQ IDNO：2残基451至456；(3)SEQ ID NO：2残基301至306；(4)SEQ ID NO：2残基294至299；和(5)SEQ ID NO：2残基65至70。此外，用例如DNASTARProtean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)根据Jameson-Wolf图预测的zcytor19抗原性表位是适宜的抗原。此外，保守基序、和zcytor19的保守基序间的可变区是适宜的抗原。可用本文描述的方法分离纯化由该免疫应答产生的抗体。制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法是本领域熟知的。参见，例如，Current Protocols in Immunology，Cooligan，等(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley和Sons，Inc.，1995；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Hurrell，J.G.R.，Ed.，Monoclonal Hybridoma Antibodies： Techniques and Applications，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982。
对本领域普通技术人员来说显而易见的是，可用zcytor19多肽或其片段接种多种温血动物例如马、牛、山羊、绵羊、犬、鸡、兔、小鼠和大鼠来产生多克隆抗体。可用佐剂增强zcytor19多肽的免疫原性，佐剂例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂。免疫接种有用的多肽还包括融合多肽，例如zcytor19或其一部分与免疫球蛋白多肽或麦芽糖结合蛋白质的融合体。多肽免疫原可以是全长分子或其一部分。如果该多肽部分是“半抗原样”的，则将这样的部分与大分子载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合进行接种可能较为有利。
如本文所述，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化多克隆抗体、单克隆抗体、及抗原结合片段，例如F(ab′)2和Fab蛋白水解片段。基因工程化的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体及类似，以及合成的抗原结合肽和多肽，也包括在内。通过把非人CDR嫁接到人构架和恒定区、或整合整个非人可变结构域(可选择地，通过置换暴露的残基而使它们具有类人表面，其中所得结果是“嵌合”抗体)可将非人抗体人源化。在一些例子中，人源化抗体可能在人可变区构架结构域内保持非人残基以增强正确结合性。通过将抗体人源化，可以提高生物半衰期，并降低由于对人给药而带来不利免疫反应的可能性。此外，可以在已经工程化而含有含有如WIPO公开WO98/24893所公开的人免疫球蛋白基因的转基因非人动物中产生人抗体。优选这些动物中的内源免疫球蛋白基因是失活或剔除的，例如通过同源重组。本发明的抗体包括但不限于，与zcytor19/CRF2-4异型二聚体、以及异型二聚体可溶性受体复合物结合的抗体。
产生或选择在本文中有用的抗体的另一种可选择技术包括，将淋巴细胞在体外暴露于zcytor19蛋白质或肽，并在噬菌体或类似载体中选择抗体展示文库(例如，通过利用固定化的或标记的zcytor19蛋白质或肽)。创造并筛选这样的随机肽展示文库是本领域已知的(Ladner等，US专利号5 223 409；Ladner等，US专利号4 946 778；Ladner等，US专利号5 403 484和Ladner等，US专利号5 571 698)，而且，随机肽展示文库和用于筛选这样的文库的试剂盒是可商业获得的，例如获自Clontech(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc.(San Diego，CA)，New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和Pharmacia LKBBiotechnology Inc.(Piscataway，NJ)。可用本文公开的zcytor19序列筛选随机肽展示文库以鉴定与zcytor19结合的蛋白质。这些与zcytor19多肽互作的“结合肽”可用于标记细胞，例如，那些特异表达zcytor19的细胞；用于经亲和层析纯化同源多肽；它们可直接或间接与药物、毒素、放射性核素及类似耦联。这些结合肽还可用在分析方法中，例如筛选表达文库及中和活性的方法。该结合肽还可用于测定zcytor19多肽循环水平的诊断检测、检测或定量作为潜在病理学或疾病标志的可溶性zcytor19多肽的诊断检测。这些结合肽还可在体外或体内作为阻止zcytor19结合及信号转导的zcytor19“拮抗剂”。这些抗-zcytor19结合肽可用于抑制与zcytor19结合的配体。
满足以下条件时，抗体被视作特异性结合：1)它们表现出阈值水平的结合活性，且2)它们并不显著与相关多肽分子交叉反应。在本文的抗-zcytor19抗体与zcytor19多肽、肽或表位结合的结合亲和力比其与对照多肽(非zcytor19)的结合亲和力至少高出10倍时，则可确定结合的阈值水平。优选，抗体的结合亲和力(Ka)为106M-1或更大，优选107M-1或更大，更优选108M-1或更大，且最优选109M-1或更大。抗体的结合亲和力易于由本领域普通技术人员测定，例如，通过Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)。
可利用标准蛋白质印迹分析(Ausubel等，同上)用探测zcytor19多肽、但不检测已知相关多肽的抗体来显示抗-zcytor19抗体是否显著与相关多肽分子交叉反应。已知相关多肽的例子是那些在现有技术中公开的，例如已知的直向同源物，和侧向同源物，以及蛋白质家族中相似的已知成员(例如，II类细胞因子受体，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5 965704所有)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5 945 511所有)受体)。还可用非人zcytor19、和zcytor19突变体多肽完成筛选。此外，为分离与zcytor19多肽特异性结合的群体，用常规方法可以筛选针对已知相关多肽的抗体。通过筛选可以分离不与已知相关多肽交叉反应的多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Current Protocols in Immunology，Cooligan，等(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley和Sons，Inc.，1995)。特异性抗体的筛选和分离是本领域熟知的。参见，Fundamental Immunology，Paul(eds.)，Raven Press，1993；Getzoff等，Adv.in Immunol.43：1-98，1988；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(eds.)，Academic Press Ltd.，1996；Benjamin等，Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984。如以下所公开的，可用本领域的许多方法来检测特异结合型抗-zcytor19抗体。
本领域技术人员已知的许多方法可用于检测与zcytor19蛋白质或肽特异性结合的抗体。Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(Eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中详细描述了作为范例的检测方法。这样的检测方法的代表性例子包括：同时免疫电泳、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附检测(ELISA)、点杂交或蛋白质印迹检测、抑制或竞争性检测、以及夹心检测。此外，可以筛选相对于突变体zcytor19蛋白质或多肽而与野生型zcytor19蛋白质或多肽结合的抗体。
zcytor19抗体可用于标记表达zcytor19的细胞；经亲和纯化用于分离zcytor19；用于测定zcytor19多肽循环水平的诊断检测；用于检测或定量作为潜在病理学或疾病标志的可溶性zcytor19多肽的诊断检测；用于在组织化学、活组织检查、或组织样品中检测或定量作为潜在病理学或疾病标志的zcytor19多肽的诊断检测；用于在带有zcytor19的癌细胞上刺激细胞毒性或ADCC；用于使用FACS的分析方法；用于筛选表达文库；用于产生抗-独特型抗体；和在体外和体内用作中和抗体或阻断zcytor19活性的拮抗剂。本文的抗体还可直接或间接与药物、毒素、放射性核素及类似耦联，且这些耦联物用于体内诊断或治疗用途。此外，zcytor19或其片段的抗体可用于检测方法中体外检测变性的zcytor19或其片段，例如，蛋白质印迹或本领域已知的其它检测方法。
本文的抗体还可直接或间接与药物、毒素、放射性核素及类似耦联，且这些耦联物用于体内诊断或治疗用途。
可直接或间接将适宜的可探测分子附着至结合zcytor19的多肽(“结合多肽”，包括上述公开的结合肽)、抗体、或生物活性片段或其部分上。适宜的可探测分子包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒及类似。适宜的细胞毒性分子可直接或间接附着至多肽或抗体，并且包括细菌或植物毒素(例如，白喉毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素及类似)、以及治疗性放射性核素，例如碘-131、铼-188或钇-90(例如，或者直接附着至多肽或抗体、或者经螯合部分间接附着)。结合多肽或抗体还可与细胞毒性药物耦联，例如多柔比星。为将可探测或细胞毒性分子间接附着，可将可探测或细胞毒性分子与互补/反向互补对成员之一耦联，其中另一成员与结合多肽或抗体部分结合。为此，生物素/链霉抗生物素蛋白是一个互补/反向互补对的例子。
在另一实施方式中，结合多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白可用于靶向的细胞或组织抑制或消融(例如，治疗癌细胞或组织，例如那些表达zcytor19的特异组织和肿瘤)。作为选择，如果结合多肽有多个功能性结构域(即，激活结构域或配体结合结构域，加上靶向结构域)，则仅包括靶向结构域的融合蛋白或许会适于将可探测分子、细胞毒性分子或互补指向目的细胞或组织类型。当仅包括一个结构域的融合蛋白包括互补分子时，可将反向互补分子与可探测或细胞毒性分子耦联。因此这样的结构域-互补分子融合蛋白代表一类向细胞/组织特异性运送一类反向互补可探测/细胞毒性分子缀合物的靶向运送载体。类似地，在另一实施方式中，zcytor19结合多肽-细胞因子或抗体-细胞因子融合蛋白可用于体内增强对靶组织的杀死，如果该结合多肽-细胞因子或抗-zcytor19抗体靶向超增殖细胞(通常参见，Hornick等，Blood 89：4437-47，1997)。他们描述了能够将细胞因子靶向至目的作用位点、从而使局部细胞因子浓度升高的融合蛋白。适宜的抗-zcytor19抗体靶向不良的细胞或组织(即，肿瘤或白血病)，融合细胞因子通过效应器细胞促进靶细胞裂解。适于此目的的细胞因子包括，例如白细胞介素2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
作为选择，本文所述的zcytor19结合多肽或抗体融合蛋白可通过直接刺激zcytor19调节的凋亡途径而用于体内增强对靶组织的杀死，导致表达zcytor19的超增殖细胞死亡。
本文所述的生物活性结合多肽或抗体缀合物可经口腔、静脉内、动脉内、或导管内送达，或可局部导入至目的作用位点。
此外，抗-zcytor19抗体和结合片段可用于标记和分类本文所述的特异表达zcytor19的细胞，例如骨髓和甲状腺细胞、和其它细胞。这样的标记和分类细胞的方法是本领域熟知的(参见，例如，“Molecular Biology of the Cell”，3rd Ed.，Albert，B.等(GarlandPublishing，London & New York，1994)。本领域技术人员将意识到分离细胞组织类型以进行研究的重要性，以及使用抗体来分离特异的细胞组织类型。
反义方法学可用于抑制zcytor19基因转录，例如体内抑制细胞增殖。将与zcytor19编码多核苷酸片段互补的多核苷酸(例如，如SFQ IDNO：1、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：20所示的多核苷酸)设计成可与编码zcytor19的mRNA结合并抑制这样的mRNA的翻译。这样的反义多核苷酸用于在细胞培养或对象中抑制zcytor19多肽编码基因的表达。
此外，作为一种细胞表面分子，zcytor19多肽可用作将基因疗法导入细胞的靶。这一用途将特别适于将治疗性基因导入正常表达zcytor19的细胞，例如淋巴组织、骨髓、前列腺、甲状腺、和PBLs、或表达zcytor19多肽的癌细胞。例如，例如上述病毒基因疗法可被靶向至表达细胞受体，例如zcytor19多肽，而非病毒受体的特异细胞类型。抗体、或其它识别靶细胞表面上的zcytor19分子的分子可用于指导病毒感染、并将基因治疗性物质注射至靶细胞。参见，Woo，S.L.C，Nature Biotech.14：1538，1996；Wickham，T.J.等，Nature Biotech. 14：1570-1573，1996；Douglas，J.T等，Nature Biotech. 14：1574-1578，1996；Rihova，B.，Crit.Rev.Biotechnol. 17：149-169，1997；和Vile，R.G.等，Mol.Med.Today 4：84-92，1998。例如，包含与zcytor19-特异性抗体耦联的病毒中和性Fab片段的双重特异性抗体可用于将病毒指引至表达zcytor19受体的细胞、并允许含有遗传元件的病毒有效进入细胞。参见，例如，Wickham，T.J.，等，J.Virol.71：7663-7669，1997；和Wickham，T.J.，等，J.Virol. 70：6831-6838，1996。
本发明还提供可用于诊断用途的试剂。例如，zcytor19基因、包括zcytor19DNA或RNA的探针或其亚序列可用于检测1号染色体上是否存在zcytor19基因或是否发生了突变。zcytor19定位于1号染色体的1p36.11区。在zcytor19基因位点上可检测的染色体畸变包括但不限于，非整倍性、基因拷贝数改变、插入、缺失、限制性位点改变及重排。可结合分子遗传技术，例如限制性片段长度多态性(RFLP)分析、荧光原位杂交法、结合PCR技术的短串连重复(STR)分析、以及本领域已知的其它遗传连锁分析(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，Chest 108：255-65，1995)，用本发明的多核苷酸片段检测这样的畸变。
可将有关基因位置的精确信息用于多种目的，包括：1)确定某序列是否是已经存在的叠连群中的一部分，以及获得各种形式的其它周围遗传序列，例如YAC、BAC或cDNA克隆；2)为在同一染色体区中表现连锁的可遗传性疾病提供可能的候选基因；和3)交叉比较有助于确定某一特定基因可能具有什么功能的模式生物，例如小鼠。
zcytor19定位于1号染色体的1p36.11区。本领域技术人员知道，发生在1p36区中及周围的染色体畸变涉及包括成神经细胞瘤、黑色素瘤、乳房、结肠、前列腺及其它癌症在内的若干种癌症。这样的畸变包括染色体总体异常例如易位、杂合性失去(LOH)及发生在1p36区中及周围的类似染色体畸变。因此，1p36.11位点中的标记，例如由本发明的多核苷酸提供的，对于探测存在于癌症中的易位、非整倍性、重排、LOH或其它涉及该染色体区域的染色体异常将会是有用的。例如，zcytor19多核苷酸探针可用于探测与成神经细胞瘤有关的异常或基因型，在成神经细胞瘤中1p36.1和1p36.3间普遍存在LOH，而且在1p36.1有一个明显的断点。至少70％的成神经细胞瘤在1p中具有细胞遗传学上可见的染色体畸变，包括易位和缺失，而且异常最有可能由复杂的易位和缺失机制导致。参见，例如Ritke，MK等，Cytogenet.Cell Genet. 50：84-90，1989；和Weith，A等，Genes Chromosomes Cancer 1：159-166，1989)。由于zcytor19被定位于1p36.11上、且直接落入成神经细胞瘤中的主要畸变区，本领域技术人员可以理解本发明的多核苷酸可用于诊断成神经细胞瘤、以及有助于阐明导致成神经细胞瘤的易位和缺失机制。此外，在黑色素瘤(Dracopoli，NC等，Am.J.Hum.Genet.45 (suppl.)：A19，1989；Dracopoli，NC等，Proc.Nat.Acad.Sci. 86：4614-4618，1989；Goldstein，AM等，Am.J.Hum.Genet. 52：537-550，1993)；以及在同时有前列腺和脑癌史的家族中的前列腺癌(1p36，LOH)(Gibbs，M等，Am.J.Hum.Genet.64：776-787，1999)；和乳腺癌中1p36上的LOH是明显的，其中在乳腺癌中1号染色体的缺失和复制是最常见的畸变(1p36)(Kovacs，G.Int.J.Cancer 21：688-694，1978；Rodgers，C等，Cancer Genet.Cytogent. 13：95-119，1984；和Genuardi，M等，Am.J.Hum.Genet. 45：73-82，1989)。由于在人1号染色体的该区域中易位、LOH和其它畸变是如此普遍，而且zcytor19基因特异定位于1p36.11，因此如本文所述，本发明的多核苷酸可用于探测与人类疾病明显相关的这样的畸变。
此外，关于zcytor19所定位的1p36区中的突变导致癌症和多核苷酸探针可用于探测与之有关的异常或基因型还有进一步的证据：P73，一种作图定位于常常在成神经细胞瘤和其它癌症中缺失的区域1p36的潜在肿瘤抑制剂(Kaghad，M等，Cell 90：809-819，1997)；横纹肌肉瘤，其涉及1号染色体上1p36.2-p36.12区的易位，该易位导致1号染色体上的PAX7基因与13号染色体上的FKHR基因融合；白血病相关蛋白质(LAP)(1p36.1-p35)在各种白血病类型细胞中升高；与肿瘤相关的硫酸肝素蛋白聚糖(Perlecan)(1p36.1)，其中观察到易位；和结肠癌(1p36-p35)。进一步，zcytor19多核苷酸探针可用于探测与1号染色体p36.11缺失和易位相关的异常，这些缺失和易位与上述的人类疾病有关的，优选与癌症有关。此外，在其它异常位点中，Clq补体成分(C1QA、B、和G)(1p36.3-p34.1)；诵读困难(1p36-p34)；淋巴活化抗原CD30(1p36)；1型非电压控制钠通道(1p36.3-p36.2)；是细胞因子受体的类zcytor19肿瘤坏死因子受体(TNFRSF1b和TNFRS12)(1p36.3-p36.2)；磷脂酶A2(PLA2)(1p35)；强直性脊柱肌营养不良(1p36-p35)的那些位点均在人类疾病状态中自我表现并作图定位于人类基因组的该区域。参见人类孟德尔遗传在线(Online Mendellian Inheritance of Man)(OMIMTM，National Centerfor Biotechnology Information，National Library of Medicine。Bethesda，MD)有关人1号染色体的该区域基因图谱、和本文中的参考文献可从万维网服务器公开获得(http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Omim/getmap？chromosome＝1p36)。所有这些用作表现与zcytor19基因相同的染色体区域连锁的遗传疾病的可能的候选基因。因此，zcytor19多核苷酸探针可用于探测与这些缺陷相关的异常或基因型。
类似地，zcytor19基因自身中的缺陷可能导致可遗传的人类疾病状态。zcytor19基因(1p36.11)定位在其它I I类受体，即zcytor11细胞因子受体基因(1p35.1)(一般由US专利号5 965 704所有)、以及TNF受体(1p36.3-p36.2)附近，这暗示该染色体区域是共同调控的、和/或对免疫功能很重要。此外，本领域技术人员应意识到已知细胞因子受体中的缺陷导致人体中的疾病状态。除其它之外，例如，生长激素受体突变导致矮小(Amselem，S等，New Eng.J.Med.321：989-995，1989)，IL-2受体γ突变导致重度联合免疫缺损(SCID)(Noguchi，M等，Cell 73：147-157，1993)，c-Mpl突变导致血小板减少症(Ihara，K等，Proc.Nat.Acad.Sci.96：3132-3136，1999)，以及严重的分支杆菌和沙门氏菌感染导致白细胞介素-12受体缺陷(de Jong，R等，Science 280：1435-1438，1998)。因此，类似地，zcytor19中的缺陷能使疾病状态或易感性变成疾病或感染。由于，zcytor19是处在涉及许多癌症染色体畸变热点中的细胞因子受体、而且在前-B-细胞急性白血病细胞和本文所述的其它癌症中表达，本发明的分子还可能直接涉及癌形成或转移。由于zcytor19基因定位于1p36.11区，zcytor19、多核苷酸探针可用于探测与人类疾病相关的染色体p36.11丢失、三倍、复制或易位，例如免疫细胞癌、成神经细胞瘤、骨髓癌、甲状腺、副甲状腺、前列腺、黑色素瘤、或其它癌症、或免疫疾病。此外，本发明的分子，例如多肽、拮抗剂、激动剂、本发明的多核苷酸和抗体有助于探测、诊断预防、以及治疗与zcytor19相关的遗传缺陷。
可用本发明的核酸分子通过标准直接突变分析方法探测与zcytor19位点相关的突变。，例如限制性片段长度多态性分析、结合PCR技术的短串连重复(STR)分析、amplification-refractory突变系统分析、单链构象多态性检测、RNase切割法、变性梯度凝胶电泳、荧光辅助错配分析、以及本领域已知的其它遗传分析方法(参见，例如，Mathew(ed.)，Protocols in Human Molecular Genetics(HumanaPress，Inc.1991)，Marian，Chest 108：255(1995)，Coleman和Tsongalis，Molecular Diagnostics(Human Press，Inc.1996)，Elles(ed.)Molecular Diagnosis of Genetic Diseases(HumanaPress，Inc.1996)，Landegren(ed.)，Laboratory Protocols forMutation Detection(Oxford University Press 1996)，Birren等(eds.)，Genome Analysis，第2卷：Detecting Genes(Cold SpringHarbor Laboratory Press 1998)，Dracopoli等(eds.)，CurrentProtocols in Human Genetics(John Wiley & Sons 1998)，和Richards和Ward，“Molecular Diagnostic Testing”，Principles ofMolecular Medicine，第83-88页(Humana Press，Inc.1998))。可用受试者基因组DNA对zcytor19完成基因突变的直接分析。扩增基因组DNA(例如获自外周血淋巴细胞)的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Dracopoli等(eds.)，Current Protocols in HumanGenetics，at第7.1.6至7.1.7页(John Wiley & Sons 1998))。
表达zcytor19基因的工程化小鼠，称作“转基因小鼠”，和表现为完全缺失zcytor19基因功能的小鼠，称作“敲除小鼠”，都可以产生(Snouwaert等，Science 257：1083，1992；Lowe11等，Nature 366：740-42，1993；Capecchi，M.R.，Science 244：1288-1292，1989；Palmiter，R.D.等Annu Rev Genet.20：465-499，1986)。例如，无论是普遍、或在组织特异或组织限制性启动子控制下过表达zcytor19的转基因小鼠可用于询问过表达是否产生表型。例如，野生型zcytor19多肽、多肽片段或其突变体的过表达可能改变正常细胞进程，从而产生能确定组织的表型，在该组织中zcytor表达是功能相关的，并且可能为zcytor19、其激动剂或拮抗剂指示了治疗靶标。例如，优选用于工程化的转基因小鼠是表达“显性-阴性”表型的小鼠，例如过表达包含附有跨膜结构域的细胞外细胞因子结合结构域(约为SEQID NO：2或SEQ ID NO：19的氨基酸21(Arg)至249(Trp)；或按阅读框与跨膜结构域附着的SEQ ID NO：4)的zcytor19多肽的小鼠。另一种优选的转基因小鼠是过表达zcytor19可溶性受体的小鼠，例如本文公开的那些zcytor19可溶性受体。此外，这样的过表达可能导致产生与人类疾病表现出相似性的表型。类似地，敲除zcytor19的小鼠可用于确定体内哪里是绝对必需zcytor19的。敲除小鼠的表型可预测zcytor19拮抗剂，例如本文描述的那些，在体内可能具有的效应。小鼠或人zcytor19cDNA可用于分离鼠zcytor19mRNA、cDNA和基因组DNA，之后用它们产生敲除小鼠。这些转基因或敲除小鼠可用于在体内系统中研究zcytor19基因及由其编码的蛋白质，以及可用作对应的人类或动物疾病体内模型(例如那些商购可得的动物群体中的)。本发明的小鼠模型尤其适宜用作癌生物学和发展研究的肿瘤模型。这样的模型在用于人类癌症的治疗性分子的开发和功效中是有用的。由于zcytor19表达的提高、以及zcytor19表达的减少与特异的人类癌症相关，转基因小鼠和敲除小鼠都是有用的癌症动物模型。此外，在一个优选的实施方式中，zcytor19转基因小鼠可用作特异肿瘤，尤其是食道、肝、卵巢、直肠、胃、和子宫肿瘤、和黑色素瘤、B-细胞性白血病、和其它淋巴癌，的动物模型。此外，针对zcytor19的zcytor19反义多核苷酸或核酶的转基因小鼠表达(本文所述的)可类似地用于上述转基因小鼠。
对于制药用途，根据常规方法将本发明的可溶性受体多肽配制成非肠胃途径，特别是经静脉内或皮下，运送的方式。可通过弹丸注射或典型为一至几个小时的输注进行静脉内给药。通常，药物配方将包括zcytor19可溶性受体多肽和药学上可接受的载体，例如盐水、缓冲盐水、溶于水的5％葡萄糖或类似。配方可进一步包括一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止蛋白质在小瓶表面丢失的白蛋白，等等。配制方法是本领域熟知，且公开于，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，19th ed.，1995。治疗剂量通常在每天0.1至100μg/kg病人体重范围内，优选每天0.5-20mg/kg，确切剂量由临床医生根据公认的标准、所治疗疾病的性质和严重程度、病人特征等来确定。对剂量的确定在本领域普通技术范围内。该蛋白质可用于急性治疗给药一个星期或稍短时间，通常是一至三天；或可用于慢性治疗，历时数月或年。通常，治疗有效量的zcytor19可溶性受体多肽是足以产生临床显著效应的量。
此外本发明的多核苷酸和多肽还可用作教学工具，作为与遗传和分子生物学、蛋白质化学和抗体产生和分析相关课程的实验室实习试剂盒。由于其独特的多核苷酸和多肽序列，zcytor19分子可用于测试目的作为标准或“未知”。例如，zcytor19多核苷酸可用作辅助事物，例如，用于教学生如何制备细菌、病毒、和/或哺乳动物表达的表达构建体，包括融合构建体，其中zcytor19是欲表达的基因；用于确定多核苷酸的限制性内切酶切割位点；确定zcytor19多核苷酸在组织中的mRNA和DNA定位(即，通过Northern和Southern印迹以及聚合酶链式反应)；和通过核酸杂交用于鉴定相关的多核苷酸和多肽。
zcytor19多肽可用作教学中的辅助事物，教导抗体的制备；通过蛋白质印迹鉴定蛋白质；蛋白质纯化；测定所表达的zcytor19多肽的量与表达的总蛋白质的比率；鉴定肽切割位点；连接氨基和羧基末端标记；氨基酸序列分析，以及，但不限于体外和体内追踪天然和标记蛋白质的生物活性(即，受体结合、信号转导、增殖、和分化)。zcytor19多肽还可用于教导分析技能，例如质谱法、圆二色性以确定构象，尤其是四α螺旋，x-射线结晶学以确定原子水平的三维结构，核磁共振光谱以揭示蛋白质在溶液中的结构。例如，可把含有zcytor19的试剂盒给学生分析。由于教授可能已知氨基酸序列，因此可以把蛋白质给学生测试以确定或开发学生的技能，之后教师就可以知道学生是否正确分析了该肽。由于每个肽都是独一无二的，因此zcytor19的教学用途本身就是独特的。
以下非限制性实施例将进一步阐明本发明。
实施例
实施例1
人全长zcytor19cDNA的鉴定和分离
从人基因组DNA AL358412(Genbank)鉴定了预计为全长cDNA的zcytor19。预计为全长的zcytor19多核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，其相应多肽序列示于SEQ ID NO：2。鉴定了变体全长zcytor19cDNA序列，并示于SEQ ID NO：18，其相应多核苷酸示于SEQ ID NO：19。此外，鉴定了一种截短可溶形式的zcytor19 cDNA序列，并示于SEQ ID NO：20，其相应多核苷酸示于SEQ ID NO：21。
实施例2
利用RNA印迹和PCR进行的组织试样组中的组织分布
A.用RNA印迹进行的人zcytor19组织分布
用探针探测人多重组织RNA印迹(人12-道MTN印迹I和II，和人免疫系统MTN印迹II)(Clontech)以确定人zcytor19表达的组织分布。用标准PCR方法扩增一个由PCR衍生的可与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：18杂交的探针。用设计成与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：18或其互补序列杂交的引物进行如下的典型PCR反应：94℃下1分钟、65℃下1分钟、和72℃1分钟，30循环；之后72℃下7分钟，1个循环。用琼脂糖凝胶电泳将PCR产物可视化，如本文所述用胶将PCR产物纯化。用，例如，PRIMEIT IITM随机引物标记试剂盒(Stratagene)根据制造商的说明放射性标记探针。用，例如，NUCTRAPTM push column(Stratagene)纯化探针。EXPRESSHYBTM(Clontech)溶液用于预杂交和用作RNA印迹的杂交液。预杂交进行，例如，68℃下2小时。68℃下用约1.5X106cpm/ml的标记探针杂交过夜。将印迹于室温下在2X SSC、0.05％SDS中洗涤三次，之后于50℃下在2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次10分钟。对X-光片曝光后，预计在特异表达zcytor19的组织中可以看到与SEQ ID NO：1 SEQ IDNO：18、或SEQ ID NO：20或编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：21的mRNA长度相对应的转录物，而在其它组织中看不到。
还用人癌细胞系MTNTM(Clontech)进行Northern分析。PCR和探针检测条件如上所述。癌系中的强烈信号表明，zcytor19表达可在激活的细胞中出现和/或可能指示癌疾病状态。此外，用本领域已知方法，对激活淋巴细胞的RNA印迹或PCR分析也可显示zcytor19是否在激活的免疫细胞中表达。根据电子Northern信息，zcytor19显示在前-B-细胞急性成淋巴细胞性白血病细胞中特异表达。
B.用PCR进行的组织试样组中的组织分布
用PCR筛选来自人组织的一系列cDNA试样的zcytor19表达。试样是自制的，其包含94个马拉松cDNA(marathon cDNA)，来自各种正常及癌性人组织和细胞系的cDNA样品示于下表5。cDNA来自自制文库，或来自从自制RNA制品、Clontech RNA、或Invitrogen RNA制得的马拉松cDNA。马拉松cDNA是用marathon-ReadyTM试剂盒制备的(Clontech，Palo Alto，CA)，并用网格蛋白引物ZC21195(SEQ ID NO：6)和ZC21196(SEQ ID NO：7)进行QC测试，且之后根据网格蛋白带的强度进行稀释。为确保试验组的质量，实施了三种质量控制(QC)测试：(1)为评估所用文库的RNA质量，用PCR结合载体寡核苷酸测试自制cDNA的平均插入大小，其中的载体寡核苷酸对于各自cDNA文库的载体序列是特异的；(2)用5’载体寡核苷酸ZC14 063(SEQ ID NO：8)和3’α微管蛋白特异性寡核苷酸引物ZC17 574(SEQ ID NO：9)或3’G 3PDH特异性寡核苷酸引物ZC17 600(SEQ ID NO：10)通过标准PCR方法扩增全长α微管蛋白或G3PDH cDNA，借此将试样组样品中的cDNA浓度标准化；和(3)对一个样品测序以核查可能的核糖体或线粒体DNA污染。将试样组置于含有人基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)阳性对照样品的96孔板中。每孔含约0.2-100pg/μl cDNA。用寡核苷酸ZC37685(SEQID NO：26)和ZC37681(SEQ ID NO：27)、TaKaRa Ex TaqTM(TAKARA ShuzoCo LTD，Biomedicals Group，Japan)、和Rediload染料(ResearchGenetics，Inc.，Huntsville，AL)进行PCR。扩增如下进行：94℃2分钟，1循环；94℃30秒，70℃30秒，5循环；94℃30秒，64℃30秒和72℃30秒，35循环；之后是72℃5分钟，1循环。将约10μl PCR反应产物用于4％琼脂糖凝胶进行标准琼脂糖凝胶电泳。在肾上腺腺体、膀胱、子宫颈、结肠、胎儿心脏、胎儿皮肤、肝脏、肺、黑色素瘤、卵巢、唾液腺、小肠、胃、脑、胎儿肝脏、肾、前列腺、脊髓、甲状腺、、胎盘、睾丸、食道肿瘤、肝肿瘤、卵巢肿瘤、直肠肿瘤、胃肿瘤、子宫肿瘤、骨髓、CD3+文库、HaCAT文库、HPV文库和HPVS文库中观察了正确预计的DNA片段的大小。由于这一引物对并不跨越内含子，所以在检测中一些被基因组DNA或未加工的mRNA信息污染的组织可能存在出现假阳性的风险。
因此，用上述方法使用了一对跨越内含子的不同的引物对ZC38481(SEQ ID NO：47)和ZC38626(SEQ ID NO：48)，以重新评估组织分布。在结肠、胎儿心脏、胎儿肝脏、肾、肝脏、肺、乳腺、前列腺、唾液腺、小肠、脂肪细胞文库、脑文库、胰岛文库、前列腺文库、RPMI 1788(B-细胞系)、脊髓、胎盘文库、睾丸、食道肿瘤、卵巢肿瘤、直肠肿瘤、胃肿瘤、HaCAT文库、HPV文库和HPVS文库中观察到了正确预计的DNA片段的大小(256bp)。
还用上述方法用另一引物对检测了小鼠组织试样组：(1)ZC38706(SEQ ID NO：49)和ZC38711(SEQ ID NO：50)(800bp产物)。这一试样组显示了小鼠zcytor19的有限组织分布：小鼠前列腺细胞系、唾液腺文库、及皮肤。
表7
  组织/细胞系  #样品  组织/细胞系  #样品
  肾上腺   1  骨髓   3
  膀胱   1  胎儿脑   3
  骨髓   1  胰岛   2
  脑   1  前列腺   3
  子宫颈   1  RPMI#1788(ATCC#CCL-156)   2
  结肠   1  睾丸   4
  胎儿脑   1  甲状腺   2
  胎儿心脏   1  WI 38(ATCC#CCL-75   2
  胎儿肾   1  ARIP(ATCC#CRL-1674-大鼠)   1
  胎儿肝脏   1  HaCat-人角质化细胞   1
  胎儿肺   1  HPV(ATCC#CRL-2221)   1
  胎儿肌肉   1  肾上腺腺体   1
  胎儿皮肤   1  前列腺SM   2
  心脏   2  CD3+选择的PBMC’s离子霉素+PMA刺激的   1
  K562(ATCC#CCL-243)   1  HPVS(ATCC#CRL-2221)-选择的   1
  肾   1  心脏   1
  肝脏   1  垂体   1
  肺   1  胎盘   2
  淋巴结   1  唾液腺   1
  黑色素瘤   1  HL60(ATCC#CCL-240)   3
  胰腺   1  血小板   1
  垂体   1  HBL-100   1
  胎盘   1  肾小球膜   1
  前列腺   1  T-细胞   1
  直肠   1  嗜中性细胞   1
  唾液腺   1  MPC   1
  骨骼肌   1  Hut-102(ATCC#TIB-162)   1
  小肠   1  内皮细胞   1
  脊髓   1  HepG2(ATCC#HB-8065)   1
  脾   1  成纤维细胞   1
  胃   1  E.Histo   1
  睾丸   2
  胸腺   1
  甲状腺   1
  气管   1
  子宫   1
  食道肿瘤   1
  胃肿瘤   1
  肾肿瘤   1
  肝脏肿瘤   1
  肺肿瘤   1
  卵巢肿瘤   1
  直肠肿瘤   1
  子宫肿瘤   1
实施例3
基于PCR的zcytor19基因染色体作图
用可商业获得的“GeneBridge 4 Radiation Hybrid(RH)MappingPanel”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)将zcytor19定位于1号染色体。GeneBridge 4 RH试样组包含来自93个辐射杂合体克隆中各克隆的DNA、以及两个对照DNA(HFL供体和A23受体)。公众可利用的WWW服务器(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)允许对Whitehead研究所/MIT基因组研究中心(WhiteheadInstitute/MIT Center for Genome Research)用GeneBridge 4 RH试样组构建的人类基因组辐射杂合体图谱(“WICGR”辐射杂合体图谱)进行相关作图。
为用GeneBridge 4 RH试验组对zcytor19作图，将20μl反应液置于适于PCR的96孔微量滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中，并用于“RoboCycler Gradient 96”热循环仪(Stratagene)。95个PCR反应液各自由下列物质组成：2μl 10×KlenTaq PCR反应缓冲液(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)、1.6μl dNTP混合物(各2.5mM，PERKIN-ELMER，Foster City，CA)、1μl有义引物ZC27 895(SEQ ID NO：14)、1μl反义引物ZC27 899(SEQ ID NO：24)、2μl“RediLoad”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)、0.4μl 50×Advantage KlenTaq聚合酶混合物(ClontechLaboratories，Inc.)、25ng来自各杂合体克隆或对照的DNA、和补足总量至20μl的蒸馏水。用等量矿物油覆盖并密封反应液。PCR循环仪条件如下：初始1循环，94℃变性5分钟；35循环，94℃变性45秒、54℃退火45秒和72℃延伸1分钟又15秒；之后是最后一个循环，72℃延伸7分钟。反应液在2％琼脂糖凝胶(EM Science，Gibbstown，NJ)上电泳分离，并经溴化乙锭染色可视化。结果显示，在1号染色体WICGR辐射杂合体图谱上zcytor19作图定位于1p36.11染色体区域中。
实施例4
表达zcytor19可溶性受体：zcytor19CEE、zcytor19CFLG、 zcytor19CHIS和zcytor19-Fc4的哺乳动物表达载体的构建
A.含有zcytor19CEE、zcytor19CFLG和zcytor19CHIS的zcytor19 哺乳动物表达载体的构建
制备了一个用于表达可溶zcytor19多肽细胞外结构域的表达载体，pC4 zcytor19CEE，其中构建体经设计得以表达一个zcytor19多肽，该zcytor19多肽含有预测的初始甲硫氨酸、在预测的跨膜结构域处截短、并具有一个C-末端Glu-Glu标签的(SEQ ID NO：11)。
含有本文所述zcytor19的zcytor19细胞外或细胞因子结合结构域的zcytor19DNA片段，由PCR产生，并用标准方法纯化。将切割的DNA亚克隆进具有信号肽的质粒表达载体，信号肽例如是天然zcytor19信号肽，并将一个Glu-Glu标签(SEQ ID NO：11)附加到zcytor19多肽编码多核苷酸序列的C-末端。这样的哺乳动物表达载体包含一个具有哺乳动物启动子、为插入编码序列的多重限制性位点、终止密码子和哺乳动物终止子的表达盒。质粒还可以具有：大肠杆菌复制起点，具有SV40启动子、增强子和复制起点的哺乳动物选择标记表达单元、DHFR基因和SV40终止子。
用标准分子生物学技术将限制性消化的zcytor19插入物与事先消化的载体相连接，并根据制造商的指示将其电转化进感受态细胞，例如DH10B感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)，并置于含有50mg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，培养过夜。用由各克隆制备的DNA的限制性分析法来筛选克隆。用序列分析验证阳性克隆的插入序列。根据制造商的说明用
Figure G2009101751191D00811
Maxi制备试剂盒(Qiagen)进行大规模质粒制备。
用相同的过程制备带有由6个成串组氨酸构成的C-末端组氨酸标签和一个C-末端
Figure G2009101751191D00812
标签zcytor19CFLAG(SEQ ID NO：12)的zcytor19可溶性受体。为构建这些构建体，前述载体带有CHIS或者标签以替代glu-glu标签(SEQ ID NO：11)。
B.可溶性人zcytor19受体zcytor19-Fc4的哺乳动物表达构建体
制备表达载体，zcytor19/Fc4/pzmp20，以在BHK细胞中表达C-末端用Fc4标记的可溶性zcytor19(人zcytor19-Fc4)。将包括zcytor19受体细胞外结构域多核苷酸序列的zcytor19cDNA片段与Fc4多核苷酸序列(SEQ ID NO：13)按阅读框融合以产生zcytor19-Fc4融合体(SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23)。pzmp20载体是一个包含Fc4多核苷酸序列和一个克隆位点的哺乳动物表达载体，其中的克隆位点允许通过标准分子生物学技术快速构建C-末端Fc4融合体。
用PCR产生一个630个碱基对片段，其包含人zcytor19细胞外结构域并分别在5’和3’端带有BamHI和Bg12位点。该PCR片段由引物ZC37967(SEQ ID NO：24)和ZC37972(SEQ ID NO：25)从人脑cDNA文库扩增产生。PCR反应条件如下：30循环，94℃20秒，68℃2分钟；1循环，68℃4分钟；之后10℃浸泡。片段经BamHI和Bg12限制性核酸内切酶消化，随后用1％凝胶电泳纯化，并用QiaQuick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)将带纯化。室温下连接5小时将获得的纯化DNA连入事先用Bg12消化的pzmp20载体，该载体含有Bg 12位点的Fc43’。
根据制造商的指示，将1μl连接混合物在37μl DH10B电击感受态大肠杆菌(Gibco)中进行电转化。于400μl LB培养基中稀释转化细胞，并置于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上。对克隆进行限制性消化分析，并对阳性克隆作DNA测序以验证融合体构建体的序列。
实施例5
zcytor19可溶性受体多肽的转染和表达
A.人zcytor19可溶性受体：zcytor19/Fc4的哺乳动物表达
将BHK 570细胞(ATCC NO：CRL-10314)接种到T-75组织培养瓶中，并允许其在37℃、5％CO2、DMEM/FBS培养基(DMEM，Gibco/BRL高葡萄糖，(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)，5％胎牛血清，1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenea，KS)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中生长至约50～70％汇合。之后在无血清(SF)培养基配方(DMEM，10mg/ml转铁蛋白，5mg/ml胰岛素，2mg/ml胎球蛋白，1％L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)中，利用LipofectamineTM(Gibco BRL)用质粒zcytor19/Fc4/pzmp20(实施例4B)转染细胞。用SF培养基在15ml试管中将10μg质粒DNA zcytor19/Fc4/pzmp20(实施例4B)稀释至终体积500μl。将50μl Lipofectamine与450μl SF培养基混合。将Lipofectamine混合物加至DNA混合物中，并在室温下培养约30分钟。将4ml SF培养基加至DNA：Lipofectamine混合物。用5ml SF培养基漂洗细胞一次，抽气，并加入DNA：Lipofectamine混合物。37℃下培养细胞5小时，之后加入5ml DMEM/10％FBS培养基。将培养瓶在37℃下培养过夜，之后以1∶2、1∶10、和1∶50的细胞与选择培养基(上述的DMEM/FBS培养基再加入1μM氨甲蝶呤(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.))的比率将细胞分装入150mm的培养板中。转染后大约10天，用胰蛋白酶消化一个150mm培养板的1μM氨甲蝶呤抗性克隆，收集细胞，将其中一半细胞再接种于10μM氨甲蝶呤上；以进一步放大zcytor19/Fc4蛋白质的表达。用SDS-PAGE和Western分析来测试来自所收集扩增细胞的条件培养基样品。
也可分离、筛选表达可溶性受体的单个克隆以及使其在细胞培养基中生长，并用标准技术纯化。此外，CHO细胞也是为此目的的适宜细胞。
实施例6
用ORIGEN检测评估zcytor19受体的异二聚化
根据制造商的规程，通过与五倍摩尔量的磺基-NHS-LC-生物素(Pierce，Inc.，Rockford，IL)反应将可溶性zcytor19受体zcytor19CFLAG(实施例4和实施例5)、或gp130(Hibi，M.等，Cell 63：1149-1157，1990)生物素化。可溶性zcytor19受体和另一个可溶性受体亚单位，例如，可溶II类细胞因子受体，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5,965,704所有)、CRF2-4(SEQ ID NO：64)、DIRS1、zcytor7(一般由US专利号5,945,511所有)可溶性受体。该亚家族中受体可结合形成转导信号的异二聚体。根据制造商的规程，用五倍摩尔量的Ru-BPY-NHS(Igen，Inc.，Gaithersburg，MD)标记这些可溶性受体。生物素化的和Ru-BPY-NHS-标记形式的可溶性zcytor19受体可分别称作Bio-zcytor19受体和Ru-zcytor19；生物素化的和Ru-BPY-NHS-标记形式的其它可溶性受体亚单位可以类似方式命名。可用来自表达与zcytor19异二聚化受体结合的配体的细胞的条件培养基、或用纯化的配体进行检测。优选的配体是zcyto20(SEQ ID NO：52)，zcyto21(SEQID NO：55)，zcyto22(SEQ ID NO：57)，zcyto24(SEQ ID NO：60)，zcyto25(SEQ ID NO：62)，和与II类异二聚化细胞因子受体例如IL-10、IL-9、IL-TIF、干扰素、TSLP(Levine，SD等，同上；Isaksen，DE等，同上；Ray，RJ等，同上；Friend，SL等，同上)结合的配体，及类似。
对于最初的可溶性受体结合表征，测试上述细胞因子、或条件化的培养基，以确定它们是否能介导zcytor19受体的同型二聚化以及它们是否能介导zcytor19受体与上述可溶性受体亚单位的异型二聚化。为此，将50μl条件培养基或含有纯化细胞因子的TBS-B与50μl TBS-B(20mM Tris，150mM NaCl，1mg/ml BSA，pH 7.2)混合，该TBS-B包含例如，400ng/ml Ru-zcytor19受体和Bio-zcytor19、或400ng/mlRu-zcytor19受体和例如，Bio-CRF2-4、或400ng/ml例如，Ru-CRF2-4和Bio-zcytor19。于室温下孵育一小时后，加入30μg链霉抗生物素蛋白包被的2.8mm磁珠(Dynal，Inc.，Oslo，Norway)，再将反应液于室温下孵育一小时。之后添加200μl ORIGEN检测缓冲液(Igen，Inc.，Gaithersburg，MD)，并用M8 ORIGEN分析仪(Igen，Inc.)检测受体结合程度。
实施例7
产生zcytor19受体异二聚体的构建体
构建了表达分泌型人zcytor19异二聚体的载体。在该载体中，将zcytor19的细胞外细胞因子结合结构域与IgGγ1(IgGγ1)的重链(SEQID NO：14和SEQ ID NO：15)融合，而将异二聚化的细胞因子受体亚单位(例如，II类细胞因子受体，例如，CRF2-4)的细胞外部分与人κ轻链(人κ轻链)(SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)融合。
A.IgGγ1和人κ轻链融合载体的构建
将IgGγ1重链(SEQ ID NO：14)克隆进Zem229R哺乳动物表达载体(ATCC保藏No.69447)，这样就可以克隆进任何具有5’EcoRI和3’NheI位点的目的细胞因子受体细胞外结构域从而产生一个N-末端细胞外结构域-C-末端IgGγ1融合体。该构建体中所用的IgGγ1片段是通过PCR从作为模板的Clontech人胎儿肝脏cDNA文库中分离IgGγ1序列制得的。PCR产物用本文所述方法纯化并用MluI和EcoRI(Boerhinger-Mannheim)消化，乙醇沉淀，并用本文公开的标准分子生物学技术将之与含有MluI/EcoRI接头的寡核苷酸连接进入预先用EcoRI消化的Zem229R。
将人κ轻链(SEQ ID NO：16)克隆进Zem228R哺乳动物表达载体(ATCC保藏No.69446)，这样就可以克隆进任何具有5’EcoRI位点和3’KpnI位点的目的细胞因子受体细胞外结构域从而产生一个N-末端细胞外结构域-C-末端人κ轻链融合体。由于人κ轻链序列(用KpnI酶在SEQ ID NO：16的核苷酸62位后切割)内有一个KpnI位点，因此设计一个特异引物以将目的细胞因子受体细胞外结构域的3’末端克隆进该KpnI位点：设计引物由此使得所产生的PCR产物包含目的细胞因子受体细胞外结构域和至多至KpnI位点的部分人κ轻链(SEQ ID NO：16)。该引物优选含有目的细胞因子受体细胞外结构域的3’末端至少10个核苷酸与SEQ ID NO：16的5’端按阅读框融合。该构建体中所用的人κ轻链片段是通过PCR从同上的Clontech人胎儿肝脏cDNA文库中分离人κ轻链序列制得的。PCR产物用本文所述方法纯化并用MluI和EcoRI(Boerhinger-Mannheim)消化，乙醇沉淀，并用本文公开的标准分子生物学技术将之与含有MluI/EcoRI接头的寡核苷酸连接进入预先用EcoRI消化的Zem228R。
B.将zcytor19受体或异二聚体亚单位细胞外结构域插入融合载 体构建体
用上述构建载体构建了一个具有与IgGγ1融合的zcytor19的构建体。用标准方法和提供EcoRI和NheI限制性位点的寡核苷酸，从前列腺cDNA文库(Clontech)或激活淋巴细胞cDNA文库PCR得到本文所述的zcytor19受体的细胞外结构域或细胞因子结合结构域，由此完成构建。如本文所述，PCR产物用EcoRI和Nhe I消化，凝胶纯化，并将之连接进上述事先用EcoRI和NheI消化及条带纯化的Zem229R/IgGγ1。对所得载体测序以验证zcytor19/IgGγ1融合体(zcytor19/Ch1 IgG)是正确的。
还根据上述构建了一个具有与κ轻链融合的异型二聚化细胞因子亚单位细胞外结构域，即CRF2-4(SEQ ID NO：64)，的独立构建体。如上所述，用标准方法和提供EcoRI和KpnI限制性位点的寡核苷酸对，例如，淋巴细胞cDNA文库(Clontech)进行PCR，由此完成对细胞因子受体/人κ轻链的构建。用EcoRI和KpnI消化所得PCR产物，并将该产物连接进事先用EcoRI和KpnI消化和条带纯化的上述Zem228R/人κ轻链载体。对所得载体测序以验证细胞因子受体亚单位/人κ轻链融合体是正确的。
D.zcytor19和异二聚体化细胞因子受体亚单位细胞外结构域的 共表达
根据各制造商说明书用LipofectaminePlusTM试剂(Gibco/BRL)将上述载体各约15μg共转染进哺乳动物细胞，例如，BHK-570细胞(ATCC No.CRL-10314)。将转染的细胞在含有1μM氨甲蝶呤(MTX)(Sigma，St.Louis，MO)和0.5mg/ml G418(Gibco/BRL)的DMEM+5％FBS(Gibco/BRL)中选择10天。所获的转染子集合又在10μm MTX和0.5mg/ml G418中选择了10天。
将所获的经两次选择的细胞集合用于产生蛋白质。将该集合的Three Factories(Nunc，Denmark)用于产生10L无血清条件培养基。将该条件培养基通过1ml蛋白质-A柱和并在约10，750微升级分处洗脱。收集这一具有最高蛋白质浓度的级分并用PBS透析(10kD MW截止值)。最后用常规方法将透析物用于氨基酸分析(AAA)。
实施例8
zcytor19受体在体外的重新构建
为鉴定zcytor19-信号复合物中所涉及的组分，按照下述进行受体重建研究。例如，通过本文所述的标准方法用带有萤光素酶报告基因的哺乳动物表达载体质粒感染BHK 570细胞(ATCC No.CRL-10314)，将该感染的细胞用作生物检测细胞系以测定在zcytor19的配体存在下从被转染的zcytor19受体复合物到萤光素酶报告基因的信号转导应答。若BHK细胞不内源表达zcytor19受体，则使用BHK细胞。也可以使用其它细胞系。一种有代表性的萤光素酶报告基因哺乳动物表达载体是KZ134质粒，该质粒是用互补寡核苷酸构建的，所述互补寡核苷酸包含来自4基因的STAT转录因子结合元件。经修饰的c-fos Sis可诱导元件(m67SIE、或hSIE)(Sadowski，H.等，Science 261：1739-1744，1993)，p21WAF1基因的p21S IE1(Chin，Y.等，Science272：719-722，1996)，β-酪蛋白基因的乳腺应答元件(Schmitt-Ney，M.等，Mol.Cell. Biol.11：3745-3755，1991)，和Fcg RI基因的可诱导元件STAT，(Seidel，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.92：3041-3045，1995)。这些寡核苷酸包含Asp718-XhoI相容性末端，并用标准方法连接进带有c-Fos启动子(Poulsen，L.K.等，J.Biol Chem.273：6229-6232，1998)的受体萤火虫萤光素酶报告基因载体，该载体已事先用相同的酶消化且包含新霉素选择标记。利用标准转染和选择方法，用KZ134质粒稳定转染BHK、或BaF3细胞，以分别得到BHK/KZ134或BaF3/KZ134细胞系。
单独用zcytor19受体、或用zcytor19受体和各种其它未知亚单位之一共转染生物检测细胞系。受体复合物包括但不限于，仅为zcytor19受体、zcytor19受体与II类细胞因子受体的各种组合，例如，干扰素-γ、α和β链和干扰素-α/β受体α和β链、zcytor11(一般由US专利号5 965 704所有)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(一般由专利号5 945511所有)受体。之后在细胞因子条件培养基或纯化的细胞因子存在下检测各独立的受体复合物细胞系，并用常规方法检测萤光素酶活性。将未转染的生物检测细胞系用作背景萤光素酶活性对照，且由此将其用作与各种受体复合物组合产生的信号比较的基线。在正确的受体复合物存在下与zcytor19受体结合的条件培养基或细胞因子，预计将给出约5倍于背景或更大的萤光素酶读出值。
作为选择，可进行一种类似的检测，其中如本文所述共转染Baf3/zcytor19细胞系并用已知的检测方法例如标准Alamar蓝增殖检测测定增殖。
实施例9
A：COS细胞转染和分泌捕获
检测生物素化的zcyto21(SEQ ID NO：55)与已知或孤儿细胞因子受体的结合。将包含细胞因子受体cDNA(包括人IFNαR1、IFNβR1、IFNαR2、IFNβR2、IL-10R、CRF2-4、ZcytoR7、DIRS1、zcytor19、和组织因子)的pZP7表达载体转染进COS细胞，用下述分泌捕获检测完成生物素化的zcyto20与被转染COS细胞的结合。该检测中的阳性结合显示了受体-配体对。
COS细胞转染
如下进行COS细胞转染：将COS细胞接种于(1×105细胞/孔)纤连蛋白包被的12孔组织培养皿中(Becton Dickinson，Bedford，MA)并在37℃下培养过夜。将细胞因子受体DNA(0.75μg)与50μl无血清DMEM培养基(55mg丙酮酸钠、146mg L-谷氨酰胺、5mg转铁蛋白、2.5mg胰岛素、1μg硒和5mg胎球蛋白溶于500ml DMEM)混合，之后与5μlLipofectamineTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)在45μl无血清DMEM培养基中混合，并在室温下孵育30分钟。再添加400μl无血清DMEM培养基。用无血清DMEM漂洗细胞，并添加500μl DNA混合物。37℃培养细胞5小时，到时再加入500μl 20％FBS DMEM培养基(100ml FBS，55mg丙酮酸钠和146mg L-谷氨酰胺溶于500ml DMEM)并过夜培养细胞。
分泌捕获测试法
按下述完成分泌捕获：对培养基送气，并用溶于PBS的1％ BSA洗涤细胞两次。用TNB(0.1M Tris-HCL，0.15M NaCl和0.5％阻断剂(NENRenaissance TSA-Direct Kit，NEN Life Science Products，Boston，MA)，溶于水中)阻断细胞1小时。将细胞在含有3μg/ml生物素化zcyto21蛋白质(实施例27)的TNB中培养1小时。之后用溶于PBS的1％BSA洗涤细胞3次，并将细胞在含有以1∶300稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(NEN试剂盒)的TNB中再培养1小时。再次用溶于PBS的1％BSA洗涤细胞3次，之后用溶于PBS的1.8％甲醛固定细胞15分钟。之后用TNT(0.1M Tris-HCL，0.15M NaCl，和0.05％Tween-20，溶于水)洗涤细胞3次。
阳性结合用以1∶50稀释于稀释缓冲液(NEN试剂盒)中的荧光素酪胺(tyramide)试剂进行检测，孵育4.5分钟，以及用TNT洗涤。细胞用以1∶5稀释于TNT中的Vectashield Mounting Media(Vector LabsBurlingame，CA)进行保存。在荧光显微镜下用FITC滤镜将细胞可视化。
检测用人zcytor19cDNA转染、并用生物素化的zcyto21孵育的细胞上的阳性结合。其它转染受体都未结合zcyto21，而且zcytor19不结合对照生物素化的蛋白质。这些数据表明，zcytor19是zcyto21的受体。
进一步的试验显示，人和小鼠的zcytor19和生物素化的zcyto21间都有阳性结合。还在用人zcytor19cDNA转染的、并与生物素化的zcyto20和zcyto24孵育的细胞表面检测到了阳性结合。
实施例10
人zcytor19在大肠杆菌中的表达
A.zcytor19-MBP融合体表达载体pTAP170/zcytor19的构建
通过同源重组构建了一个表达质粒，该质粒包含编码N-末端与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的部分人zcytor19的多核苷酸。用PCR分离了人zcytor19cDNA(SEQ ID NO：1)片段。在制备人zcytor19片段的PCR反应中使用了两个引物：(1)引物ZC39204(SEQ ID NO：30)，包含40bp载体侧翼序列和24bp与人zcytor19氨基末端对应的序列，和(2)引物ZC39205(SEQ ID NO：31)，包含40bp与载体侧翼序列对应的3’末端和24bp与人zcytor19羧基末端对应的序列。PCR反应条件如下：94℃1分钟，1循环。之后是94℃30秒，60℃30秒，和68℃1.5分钟，共20循环；之后4℃浸泡，平等进行两次同样的实验。从100μl各PCR反应物取5μl用1×TBE缓冲液在1.0％琼脂糖凝胶中跑胶分析，并看到了预计的约700bp片段的条带。将余下的95μl PCR反应物装入第二个PCR试管，用400μl纯乙醇沉淀，并重悬于10μl水中以重组入Smal切割的受体载体pTAP170，以制备编码MBP-人zcytor19融合体的构建体，如下所述。
质粒pTAP170衍生自质粒pRS316和pMAL-c2。质粒pRS316是一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)穿梭载体(Hieter P.和Sikorski，R.，Genetics 122：19-27，1989)。pMAL-C2(NEB)是一个大肠杆菌表达质粒。它带有驱动MalE(MBP编码基因)的tac启动子，之后是一个组氨酸标签，一个凝血酶切割位点，克隆位点，以及rrnB终止子。载体pTAP170是通过酵母同源重组构建的。将100ng经EcoR1切割的pMAL-c2与1μg经Pvu1切割的pRS316、1μg接头、和1μgSca1/EcoR1切割的pRS316重新结合。该接头由在PCR反应中组合的寡核苷酸zc19 372(100皮摩尔)：zc19 351(1皮摩尔)：zc19 352(1皮摩尔)，和zc19 371(100皮摩尔)组成。条件如下：10循环94℃30秒，50℃30秒，和72℃30秒；之后于4℃浸泡。经100％乙醇沉淀将PCR产物浓缩。
将一百微升感受态酵母细胞(S.cerevisiae)与10μl含有约1μg人zcytor19插入物、100ng经Sma I消化的pTAP170载体的混合物混合，并转移至0.2cm电击转化小试管中。在0.75kV(5kV/cm)、infiniteohms和25μF下向酵母/DNA混合物施加电脉冲。向各小试管中加入600μl 1.2M山梨醇。之后将酵母以两份300μl等分试样接种到两个-URAD培养平板上并在30℃下培养。
约48小时后，将来自单个平板的Ura+酵母转化子重悬浮于H2O中并短暂离心以使酵母细胞成块。将细胞块重悬于1ml裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)。将五百微升裂解混合物加入含有300μl酸洗的玻璃珠和500μl酚氯仿的Eppendorf管中，间隔两或三次涡旋1分钟，之后在Eppendorf离心机中以最大转速离心5分钟。将三百微升水相转移至新试管中，并用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA，之后于4℃离心10分钟。将DNA块重悬于100μl水中。
用1μl酵母DNA制品和40μl MC1061细胞转化电击感受态大肠杆菌细胞(MC1061，Casadaban等，J.Mol.Biol.138，179-207)。在2.0kv、25μF和400欧姆的条件下向细胞施加电脉冲。电击转化后，向细胞添加0.6ml SOC(2％
Figure G2009101751191D00911
蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)。37℃下培养一小时后，将细胞以一等分试样接种于LB Kan培养平板(LB液体培养基(Lennox)，1.8％BactoTM琼脂(Difco)，30mg/L卡那霉素)。
利用表达鉴定了带有人zcytor19正确表达载体构建体的单个克隆。细胞在含有30μg/ml卡那霉素的Superbroth II(BectonDickinson)中生长过夜。用50μl过夜培养物接种2ml含有30μg/ml卡那霉素的新鲜Superbroth II。37℃下振荡培养2小时。用1mM IPTG诱导1ml培养物。2-4小时后，将250μl各培养物与250μl含有5％βME和染料(8M尿素，100mM Tris pH7.0，10％丙三醇，2mM EDTA，5％SDS)的Thorner缓冲液混合。煮沸样品5-10分钟。将20μl加载于4％-12％PAGE凝胶(NOVEX)的各泳道。在1×MES缓冲液中跑胶。将阳性克隆命名为pTAP317并进行序列分析。pTAP317内的MBP-zcytor19多核苷酸序列示于SEQ ID NO：32，相应的MBP-zcytor19融合体多肽序列示于SEQID NO：33。
B.人zcytor19的细菌表达
37℃下在下列反应液中用Not1(NEB)消化十微升测序DNA一小时以除去CEN-ARS：10μl DNA、3μl缓冲液3(NEB)、15μl水、和2μl Notl(10U/μl NEB)。之后将7μl消化物与2μl 5×缓冲液和T4DNA连接酶(1u/μl BRL)混合。反应液在室温下孵育一小时。将一微升反应液转化进大肠杆菌菌株W3110(ATCC)。在2.0kv，25μF和400欧姆条件下向细胞施加电脉冲。电击转化后，向细胞添加0.6ml SOC(2％BactoTM蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mMNaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4，20mM葡萄糖)。37℃下培养一小时后，将细胞以一等分试样接种于LB Kan培养平板(LB液体培养基(Lennox)，1.8％BactoTM琼脂(Difco)，30mg/L卡那霉素)。对单个克隆进行诊断消化以分析酵母标记和复制序列的缺失。
用一个阳性克隆接种含有30μg/ml卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)过夜起始培养物。用起始培养物接种4个各装有500ml Superbroth II+Kan的2L-带挡板的锥形瓶。37℃摇瓶培养直至OD600达4.1，转速为250rpm。在该点时，用1mM IPTG诱导培养物。培养物在37℃、250rpm再生长2小时，之后留2ml用于分析，其余的经离心收集。将离心块保存于-80℃，直到将其转移用于蛋白质纯化。
实施例11
zcytor19-FC4融合体的纯化方案
除非特别指明，所有程序都在4C下完成。用Amicon/MilliporeSpiral cartridge，10kD MWCO将条件培养基浓缩20倍(环境温度)。之后将浓缩培养基以最优捕获流速用于适宜大小的POROS 50 A(耦联了蛋白质A)柱。用10倍于柱体积(CV)的平衡缓冲液洗涤柱，之后用3CV的0.1M甘氨酸快速洗脱，甘氨酸pH为3。在洗脱以将pH中和至大约7.2之前，向所收集的级分中加入预定体积的2M TRIS(pH8.0)。跑亮蓝(Sigma)染色的NuPAGE胶以分析洗脱物。收集目的级分，并用30kD MWCO离心浓缩仪浓缩至标准体积。将浓缩的蛋白质A集合注入适当大小的Phamicia Sephacryl 200柱以除去聚集物，并将蛋白质缓冲交换至pH为7.3的PBS中。再用亮蓝(Sigma)染色的NuPAGE胶分析洗脱物。收集洗脱级分。作蛋白质印迹，并跑亮蓝(Sigma)染色的NuPAGE胶以证实纯度和含量。为进一步分析，对蛋白质作氨基酸分析(AAA)，并对N-末端测序。AAA分析和N-末端测序证实了zcytor19-Fc多肽；N-末端氨基酸序列是预计的SRPRL APPQX VTLLS QNFSV(SEQ ID NO：34)。
实施例12
基于对多组织和血液组分第一链cDNA试样组所作RT-PCR分析的 人zcytor19表达
用可商业获得的标准化多组织第一链cDNA试样组(OriGeneTechnologies，Inc.Rockville，MD；BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)检查zcytor19的基因表达。这些包括OriGene的人组织Rapid-ScanTM试样组(含有24种不同组织)和下列BD BiosciencesClontech的多组织cDNA(MTCTM)试样组：人MTC试样组I(含有8种不同的成人组织)、人MTC试样组II(含有8种不同的成人组织)、人胎儿MTC试样组(含有8种不同的胎儿组织)、人肿瘤MTC试样组(含有来自7种不同器官的癌)、人血液级分MTC试样组(含有9种不同的血液级分)、和人免疫系统MTC试样组(含有6种不同的器官和外周血白细胞)。
用zcytor19特异寡核苷酸引物ZC40285(SEQ ID NO：35)和ZC40286(SEQ ID NO：36)进行PCR反应，该反应产生一个426bp的产物，在该PCR反应中还使用了Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)和RediLoadTM染料(Research Genetics，Inc.，Huntville，AL)。PCR循环仪条件如下：起始第一循环95℃下变性15分钟，95℃变性45秒，63℃退火1分钟和72℃延伸1分钟又15秒，共35个循环，之后是最后一个循环72℃延伸7分钟。反应物经2％琼脂糖凝胶(EM Science，Gibbstown，NJ)电泳分离，并经溴化乙锭染色可视化。
在下列成人组织中观察到了一个大小正确的DNA片段：肾上腺腺体、骨髓、结肠、心脏、肝脏、肺、淋巴结、肌肉、卵巢、胰腺、胎盘、前列腺、唾液腺、小肠、脾、胃、睾丸、甲状腺、和扁桃腺。在下列胎儿组织中观察到了一个大小正确的DNA片段：心脏、肝脏、肺、肾、骨骼肌、脾、和胸腺。在下列成人血液级分中观察到了一个大小正确的DNA片段：外周血白细胞、单核的细胞(B-细胞、T-细胞、和单核细胞)、静息的CD8+细胞(抑制型/细胞毒性T-细胞)、静息的CD19+细胞(B-细胞)、激活的CD19+细胞、激活的单核的细胞、和激活的CD4+细胞。在下列肿瘤组织中观察到了一个大小正确的DNA片段：乳腺癌、结肠腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、和前列腺癌。
如本文所公开的，由于zcytor19在这些特异的肿瘤组织中表达，因此zcytor19多核苷酸、多肽和抗体可用作肿瘤标记。此外，zcytor19的抗体，以及抗体的毒素缀合物、细胞因子缀合物或其它缀合物，或zcytor19受体配体自身，可能具有抗-肿瘤活性。zcytor19配体的拮抗剂，例如抗-zcytor19抗体或可溶性受体也可用作抗-肿瘤试剂。
实施例13
zcytor19 KO小鼠的产生和分析
A.小鼠zcytor19基因阳性BAC克隆的鉴定
按照制造商的说明，用Incyte Genomic(St.Louis，Missouri)的易筛选DNA库(Easy-to-Screen DNA Pool)、BAC小鼠ES(ReleaseI)鉴定了一个小鼠zcytor19基因阳性的BAC克隆。设计寡核苷酸以产生包含部分外显子6、全部内含子和部分外显子7的PCR片段。
用1.75单位的Advantage 2聚合酶(Clontech)完成25μl的PCR反应。将2μl或10μl BAC文库DNA用于含有67mM Tris pH8.8、16.6mM(NH4)2SO4、6.7mM MgCl2的缓冲液中的模板。
5mM 2-巯基乙醇，100μg/ml明胶、10％二甲基亚砜、1mM脱氧核苷酸、140nM正向引物ZC39128(SEQ ID NO：37)和140nM反向引物ZC39129(SEQ ID NO：38)。PCR条件如下：95℃1分钟；30循环的95℃15秒，55℃30秒，和68℃30秒；和68℃2分钟；之后4℃浸泡。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。发现阳性PCR产物为1149bp。
按照制造商的说明用Incyte’s BAC Mouse Filter Set(ReleaseII)鉴定了另外四个小鼠zcytor19基因阳性BAC克隆。设计寡核苷酸以从小鼠cDNA模板产生一个含有部分外显子6、和部分外显子7序列的PCR片段。
用1.75单位的Advantage 2聚合酶(Clontech)完成25μl的PCR反应。将2μl新生小鼠皮肤cDNA文库(JAK 062700B)用于含有67mMTris pH8.8、16.6mM(NH4)2SO4、6.7mM MgCl2的缓冲液中的模板。
5mM 2-巯基乙醇，100μg/ml明胶、10％二甲基亚砜、1mM脱氧核苷酸、140nM正向引物ZC39128(SEQ ID NO：37)和140nM反向引物ZC39129(SEQ ID NO：38)。PCR条件同上述。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离并用Qiaquick(Qiagen)凝胶抽提试剂盒纯化。分离出的约400bp的DNA片段用Prime-It II(Stratagene)随机引物标记试剂盒标记并用MicroSpin S-200HR柱(AmershamPharmacia)纯化。
用标记的探针筛选Incyte的7个滤膜BAC文库组。55℃下用ExpressHyb(Clontech)杂交过夜。50℃下用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤滤膜三次30分钟，放射自显影过夜，并与厂商的隔栅图案(gridpattern)比较以鉴定阳性克隆。
B.小鼠zcytor19阳性BAC的表征
从Incyte Genomics获得了五个来自129/SvJ胚胎干细胞文库(Release I和II)的小鼠zcytor19阳性BAC克隆。BAC克隆生长于液体培养基中的大肠杆菌宿主菌株DH10B内，并根据制造商的说明用BAC大质粒纯化试剂盒MKB-500(Incyte Genomics)提取。根据PCR检测，发现5个BAC克隆中有4个包含至少2000bp的5’非翻译区、外显子1、和外显子5。根据以下条件将100ng各BAC DNA用作模板：用1.75单位的Advantage 2聚合酶(Clontech)在缓冲液中完成25μl的PCR反应，所述缓冲液中含有67mM Tris pH8.8、16.6mM(NH4)2SO4、6.7mM MgCl2、5mM 2-巯基乙醇、100μg/ml明胶、10％二甲基亚砜、1mM脱氧核苷酸、140nM正向引物和140nM反向引物。
PCR条件如下：95℃1分钟；30循环的95℃15秒、55℃30秒、和68℃30秒；和68℃2分钟；之后4℃保存。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。用正向引物ZC40784(SEQ ID NO：39)和反向引物ZC40785(SEQID NO：40)扩增得到部分5’UTR，并发现其为957bp。用正向引物ZC40786(SEQ ID NO：41)和反向引物ZC40787(SEQ ID NO：42)扩增得到部分5’UTR、完整外显子1和部分内含子1，并发现其约为950bp。用正向引物ZC39128(SEQ ID NO：37)和正向引物ZC39129(SEQ IDNO：38)扩增得到包含部分外显子6、完整内含子6和部分外显子7的序列，并发现其为1149bp。
经Southern印迹分析发现，五个BAC克隆中有四个包含至少3796bp的5’UTR和至少6922bp的3’UTR。寡核苷酸ZC40784(SEQ IDNO：39)和ZC39129(SEQ ID NO：38)用T4多核苷酸激酶(Roche)进行末端标记，并用于探测Southern印迹，该印迹上包含5个已用限制性核酸内切酶EcoRI(Life Technologies)和XbaI(New England Biolabs)消化的BAC候选克隆。结果表明，5个BAC中有4个包含至少3796bp的5’UTR以及5个克隆全都包含至少6922bp的3’UTR。
C.小鼠zcytor19内含子6序列的确定
消化寡核苷酸以产生包含部分外显子6、完整内含子6和部分外显子7序列的PCR片段。
用1.75单位的Advantage 2聚合酶(Clontech)完成25μl的PCR反应。100ng 129/Sv小鼠基因组DNA用作缓冲液中的模板，所述缓冲液中含有67mM Tris pH8.8、16.6mM(NH4)2SO4、6.7mM MgCl2、5mM2-巯基乙醇、100μg/ml明胶、10％二甲基亚砜、1mM脱氧核苷酸、140nM正向引物ZC39128(SEQ ID NO：37)和140nM反向引物ZC39129(SEQID NO：38)。PCR条件同上述。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，发现其为1149bp。之后用Qiaquick(Qiagen)PCR纯化试剂盒纯化。用寡核苷酸ZC 39128(SEQ ID NO：37)和ZC 39129(SEQ ID NO：38)作序列分析确定了内含子6的序列。
D.小鼠zcytor19内含子5序列的确定
设计寡核苷酸以产生包含部分外显子5、完整内含子5和部分外显子6序列的PCR片段。用1.75单位的Advantage 2聚合酶(Clontech)完成25μl的PCR反应。100ng 129/Sv小鼠基因组DNA用作缓冲液中的模板，所述缓冲液含有67mM Tris pH8.8、16.6mM(NH4)2SO4、6.7mMMgCl2、5mM 2-巯基乙醇、100μg/ml明胶、10％二甲基亚砜、1mM脱氧核苷酸、140nM正向引物ZC39408(SEQ ID NO：43)和140nM反向引物ZC39409(SEQ ID NO：44)。PCR条件如下：95℃1分钟；30循环的95℃15秒、55℃30秒、和68℃30秒；和68℃2分钟；之后4℃保持。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，发现其为356bp。之后用Qiaquick(Qiagen)PCR纯化试剂盒纯化。用寡核苷酸ZC39408(SEQ ID NO：43)和ZC 39409(SEQ ID NO：44)作序列分析确定了内含子5的序列。
E.产生小鼠zcytor19基因KO构建体的寡核苷酸设计
为调查zytor19基因的生物学功能，用同源重组技术在胚胎干(ES)细胞中产生了一个敲除小鼠模型。该模型中，删除了编码外显子1、2和3以产生一个zcytor19基因的无效突变。这一删除去除了zcytor19蛋白质的翻译起始密码子、信号结构域和部分细胞外结构域，从而使zcytor19基因失活。
ET克隆技术将用于产生KO载体(Stewart等，Nucl Acids Res. 27：6，1999)。首先，用卡那霉素抗性盒替换小鼠zcytor19基因的内含子1、2和3。设计了一个长121个核苷酸的正向敲除寡核苷酸(SEQ IDNO：45)，它有52bp与zcytor19m的5’UTR同源、带有一个具有SfiI、FseI、BamH I和HindIII限制性位点的42bp接头且还有27bp与卡那霉素抗性盒5’末端同源。设计了一个长125个核苷酸的反向敲除寡核苷酸(SEQ ID NO：46)，它有50bp与小鼠zcytor19的内含子3同源、带有一个具有SfiI、AscI、BamHI和HindIII限制性位点的48bp接头且还有27bp与卡那霉素抗性盒3’末端同源。上述核苷酸可用于合成长1073bp的PCR片段，该片段包含整个卡那霉素抗性盒、且最初的52bp与小鼠zcytor19的5’UTR同源以及最后50bp与内含子3同源。
之后该片段将用于经ET克隆构建敲除载体，ET克隆过程中经甘油处理制备感受态小鼠zcytor19阳性BAC细胞宿主，之后用质粒pBADα/β/γ(Amp)转染。氯霉素和氨苄青霉素抗性选择转化的细胞。之后用包含同源臂的卡那霉素PCR片段再次转化细胞。通过向培养基中添加阿拉伯糖激活Redα基因，来诱导pBADα/β/γ(Amp)的β和γ重组蛋白质。用卡那霉素和氨苄青霉素抗性选择重组BAC，之后用PCR筛选。一旦鉴定了一个重组BAC，则将包含卡那霉素抗性盒插入物上游至少1800bp和下游至少6000bp的序列亚克隆进衍生自pGEM7的载体。之后通过标准连接克隆用IRES/LacZ/Neo-MC1盒替换卡那霉素抗性盒。IRES是一个衍生自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入序列。它按阅读框与报告基因1acZ融合，并连接polyA信号。在IRES/LacZ报告基因的下游，MC1启动子驱动G418抗性选择标记Neo基因的表达。可选择标记盒在全部三个阅读框中都包含终止密码子。这样，用药物抗性基因Neo选择胚胎干(ES)细胞中的同源重组事件。IRES/LacZ报告基因将用于监控同源重组后被替换基因的表达。ES细胞中敲除载体和靶位间的同源重组导致在野生型位点处，包括完整外显子1、2和3在内的总共17980bp被长约5200bp的IRES/LacZ/Neo-MC1盒替换。
F.zcytor19KO小鼠的产生
上述KO载体经PmeI消化线性化，并电转化进ES细胞。用标准KO方案，经PCR筛选策略鉴定、和Southern印迹分析验证同源重组事件。参见，A.L.Joyner，Gene Targeting.A Practical Approach.IRLPress 1993。
一旦鉴定了同源重组事件，则扩增ES细胞，并将其注射进胚泡以产生嵌合体。根据标准程序，将把嵌合雄性与C57black雌性交配以实现无效突变种质传递。参见Hogan，B.等，Manipulating theMouse Embryo.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1994。
将繁殖杂合KO动物以测试zcytor19基因的生物学功能。所产生的后代中，1/4应为野生型，1/2应为杂合型，以及1/4应为纯合型。如下述将对纯合型作详细分析。
G.来自zcytor19纯合动物的组织的显微镜分析
由于zcytor19在下列组织中表达，我们将仔细检查这些组织：结肠、卵巢胎盘、垂体、淋巴结、小肠、唾液腺、直肠、前列腺、睾丸、脑、肺、肾、甲状腺、脊髓、骨髓、和子宫颈。
从表达zcytor19的转基因动物收集脾、胸腺、和肠系膜淋巴结，并处理用于组织学检查。常规收集的其它组织包括下列：肝脏、心脏、肺、脾、胸腺、肠系膜淋巴结、肾、皮肤、乳腺、胰腺、胃、小肠和大肠、脑、唾液腺、气管、食道、肾上腺、垂体、生殖道、男性性腺附腺、包括外周神经的骨骼肌、和带骨髓的股骨。从纯合动物和野生型对照中收集这些组织。样品在10％的缓冲福尔马林中固定，常规处理，石蜡包埋，5微米切片，以及用苏木精和曙红染色。切片用于检测组织学、和病理学改变，例如炎症反应，和特定细胞类型的增殖减少。
H.来自缺失zcytor19的纯合小鼠的组织的流式细胞分析
将缺失zcytor19基因的纯合动物处死进行外周血、胸腺、淋巴结、骨髓、和脾的流式细胞分析。
在冰冷的培养基(500ml RPMI 1640培养基(JRH Biosciences.Lenexa，KS)；5ml 100×L-谷氨酰胺(Gibco BRL.Grand Island，NY)；5ml 100×丙酮酸钠(Gibco BRL)；5ml 100×青霉素、链霉素、新霉素(PSN)(Gibco BRL))中用镊子将器官撕下，之后轻轻的将细胞压过渗滤器(Falcon，VWR Seattle，WA)，由此从脾、胸腺和淋巴结制得细胞悬液。收集外周血(200ml)至肝素化的试管中并用含有10U肝素/ml的HBSS稀释至10ml。经低渗裂解从脾和外周血制备物中除去红血球。用冰冷的培养基从股骨冲洗骨髓制得骨髓细胞悬液。用台盼兰(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)对细胞计数并测定活力。将细胞重悬于冰冷的染色培养基(HBSS，1％胎牛血清，0.1％叠氮化钠)中，浓度为每毫升一千万个细胞。向细胞悬液中加入10％正常山羊血清和Fc阻断剂(PharMingen，La Jolla，CA)实现Fc受体的阻断以及抗体与细胞的非特异性结合。
将细胞悬液与等体积用荧光染料标记的单克隆抗体(PharMingen)混合，在冰上孵育60分钟，之后在将细胞重悬于400ml洗涤缓冲液前用冰冷的洗涤缓冲液(PBS，1％胎牛血清，0.1％叠氮化钠)洗涤两次，所述400ml洗涤缓冲液中含有1mg/ml作为某些样品中的活性标记的7-AAD(Molecular Probes，Eugene，OR)。在FACSCalibur流式细胞仪(BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA)上获得流式数据。获得与分析都是用CellQuest软件(BD ImmunocytometrySystems)完成的。
将分析所有淋巴器官中的细胞群体以探测在特异T细胞、B细胞、或其它淋巴细胞细胞系中的异常，以及这些器官中的细胞构成。
实施例14
用原位杂交鉴定表达zcytor19的细胞
筛选特定的人组织并用原位杂交筛选zcytor19的表达。制备并切片了各种不同的人组织，并将其用于原位杂交，各种组织包括正常和癌性结肠、子宫颈癌、子宫内膜癌、正常和癌性卵巢、正常和癌性皮肤、胎儿肝脏、肺、心脏和MFH(肌肉瘤)。组织固定于10％缓冲的福尔马林中并用标准技术封闭于石蜡中。对组织进行4至8微米切片。组织是用标准程序处理的。简言之，用
Figure G2009101751191D01011
(NationalDiagnostics，Atlanta，GA)将组织切片脱蜡，之后用乙醇脱水。下一步是在37℃下用蛋白酶K(50μg/ml)(Boehringer Diagnostics，Indianapolis，IN)对其进行消化2至7分钟。该步骤之后是组织的乙酰化和重新水合。
用标准方法设计一个针对人zcytor19(变体x1)序列(INC7128744，示于SEQ ID NO：25)的原位探针，该探针含有zcytor19的3’UTR。用T7RNA聚合酶产生一个反义探针。根据各制造商的说明用体外转录系统(
Figure G2009101751191D01012
体外转录系统，Promega，Madison，WI)对探针进行标记，所不同的是使用的是地高辛配基探针而不是放射性标记的rCTP并用水调节以补足减少的rNTP的体积。用地高辛配基标记的zcytor19探针(上述)完成了原位杂交。将探针以1至5pmol/ml的浓度加到载玻片上12至16小时，60℃。随后将载玻片在2×SSC和0.1×SSC中洗涤，55℃。根据各制造商的说明，用TSATM(Tyramide SignalAmplification；PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)将信号放大并用VECTOR Red底物试剂盒(VECTOR Laboratories，Burlingame，CA)将信号可视化。之后用苏木精将载玻片复染。
在几种测试组织中观察到了信号：在直肠癌组织中，在癌细胞中观察到了弱信号和一些免疫浸润。然而，在正常结肠和肠中未观察到阳性信号，包括固有膜、上皮、免疫结节中的细胞和外周神经节神经细胞。在子宫颈癌组织中，在癌细胞和免疫结节中的一些细胞中出现弱信号。在子宫内膜癌组织中，癌细胞中出现了弱信号。正常子宫组织中未观察到阳性信号。在卵巢癌样品中，一些癌细胞呈弱阳性。在正常卵巢样品中，毛细血管的一些内皮和大滤泡的上皮呈弱阳性。在皮肤癌样品中，癌性颗粒上皮呈强阳性，而在正常皮肤中未观察到阳性信号。在胎儿肝脏中，在窦状隙的单核细胞混合群体中观察到了信号。在肺中，zcytor19在II型肺泡上皮中呈阳性。支气管上皮偶尔也会呈弱阳性。间质组织中的巨噬样单核细胞也呈阳性。心脏中，肌细胞呈阴性而一些循环单核细胞呈zcytor19阳性。在一个样品中，血管内皮可能是弱阳性。测试的其它组织包括MFH(肌肉瘤)样品和卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)皮肤样品。这些组织中没有确定的阳性信号。
用原位杂交从人类组织的子宫颈癌、正常和癌结肠、十二指肠、子宫内膜癌、正常和癌卵巢、子宫、心脏、肝脏、肺、肌肉癌、和正常和癌皮肤筛选zcytor19表达。用标准技术在10％缓冲福尔马林中固定组织，并封闭在石蜡中。5微米切片组织。用标准程序处理组织。简言之，组织用HistoClear(National Diagnostics，Atlanta，GA)脱蜡，之后用乙醇脱水。之后在23℃用蛋白酶K(50μg/ml)(BoehringerDiagnostics，Indianapolis，IN)消化切片4-15分钟。该步骤之后是将组织乙酰化并重新水合。
设计了一个针对人zcytor19序列的原位杂交探针。用限制酶HindIII消化质粒DNA 100933，其覆盖了自3’UTR末端的0.7kb。用T-7RNA聚合酶产生反义探针。根据各制造商的说明，利用原位转录系统(Promega，Madison，WI)对探针进行地高辛配基(Boehringer)标记。
利用经地高辛配基或生物素标记的zcytor19探针(上述)完成原位杂交。
将探针以1至5pmol/ml的浓度加到载玻片上12至16小时，60℃。随后将载玻片在2×SSC和0.1×SSC中洗涤，55℃。根据各制造商的说明，用酪胺信号放大系统(TSA)(TSA，原位间接试剂盒；NEN)将信号放大并用VECTOR Red底物试剂盒(VECTOR Lab)将信号可视化。之后用苏木精(VECTOR Laboratories，Burlingame，CA)将载玻片复染。
在大多数癌样品中观察到了阳性信号。在子宫颈癌中，癌性上皮细胞是阳性的。还在淋巴小结的一个淋巴细胞亚群中观察到了一些信号。类似地，在结肠癌样品中癌细胞和某些免疫细胞都呈阳性，而正常结肠样品呈阴性。子宫内膜癌和卵巢癌中也呈弱染色，而正常卵巢和子宫呈阴性。在肌肉瘤样品的癌区中有弱染色。皮肤癌和卡波西肉瘤中的角质化细胞也为阳性，而在正常皮肤中未观察到染色。在心脏和肝脏，一个细胞亚群，可能是循环的WBC，也呈zcytor19阳性。似乎某些血管中的内皮细胞细胞也可能呈阳性。在肺中，II型肺细胞和巨噬样细胞呈阳性。在某些肺样本中支气管内皮和上皮也呈阳性。总之，zcytor19在癌细胞中似乎是受正调节的。在一个淋巴细胞和内皮细胞的亚群中，有低水平的zcytor19mRNA。
如本文所公开的，由于zcytor19在这些特定的肿瘤组织中表达，因此zcytor19多核苷酸、多肽和抗体可用作肿瘤标记。此外，zcytor19的抗体，以及抗体的毒素缀合物、细胞因子缀合物或其它缀合物，或zcytor19受体配体自身，可能具有抗-肿瘤活性。zcytor19配体的拮抗剂，例如抗-zcytor19抗体或可溶性受体也可用作抗-肿瘤试剂。
实施例15
用嘌呤霉素抗性和零霉素(zeomycin)抗性载体构建表达
zcytor19受体的BaF3细胞(BaF3 zcytor19细胞)
用30μg zcytor19表达载体构建了两种类型的全长zcytor19受体表达细胞，如下所述，一个具有嘌呤霉素抗性，一个具有零霉素抗性。将具嘌呤霉素抗性的表达zcytor19受体mRNA的BaF3细胞命名为BaF3/zcytor19-p。将具零霉素抗性的表达zcytor19受体mRNA的BaF3细胞命名为BaF3/zcytor19-z。
A.构建表达zcytor19受体的BaF3细胞
BaF3，一种衍生自鼠骨髓且依赖于白细胞介素-3(IL-3)的前淋巴细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell.Biol.6：4133-4135，1986)，保持在补加了10％热失活的胎牛血清、2ng/ml鼠IL-3(mIL-3)(R & D，Minneapolis，MN)、2mM L-glutaMax-1TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)的完全培养基(RPMI培养基(JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS))中。电击转化前，根据各制造商的说明用Qiagen MaxiPrep试剂盒(Qiagen)制备并纯化了pZP-5N/CRF2-4。将用于电击转化的BaF3细胞在PBS(Gibco BRL)中洗涤两次，之后以107细胞/ml的细胞密度重悬于RPMI培养基中。将1ml重悬浮的BaF3细胞与30μgpZP-7p/zcytor19质粒DNA、或30μg pZP-7z/zcytor19质粒DNA混合，并转移至可随意使用的独立电击转化室(GIBCO BRL)中。用电击转化装置(CELL-PORATORTM；GIBCO BRL)给予细胞两次电击(800 lFad/300V.；1180 lFad/300V.)，各次电击间间隔1分钟。恢复5分钟后，将电击转化的细胞转移到50ml完全培养基中，并置于孵化箱中15-24小时(37℃，5％CO2)。之后将细胞离心下来，并重悬于含有用于选择被pZP-7p/zcytor19所转染细胞的嘌呤霉素(Clonetech)(2μg/ml)、或用于选择被pZP-7z/zcytor19所转染细胞的零霉素(1：150-1：333)的50ml完全培养基中，并置于T-162锥形瓶中以分离抗生素抗性集合。用RT-PCR检测被转染BaF3细胞(以下将称作BaF3/zcytor19-puro和BaF3/zcytor19-zeo细胞)的zcytor19表达。
B.用RT-PCR证实zcytor19的表达
收集BaF3/zcytor19-puro和BaF3/zcytor19-zeo细胞的RNA，之后用于反转录反应，随后用PCR检测zcytor19的存在。
待细胞培养瓶被生长至铺满后，移出10ml并离心以获得细胞块。根据制造商的流程，用RNeasy Total RNA纯化试剂盒和不含RNase的DNase组(Qiagen)从细胞块纯化RNA。之后用StrataScript RT-PCR试剂盒(Stratagene)完成对样品的反转录，整个RT反应过程按照制造商的流程完成。将引物ZC40279和ZC37863各0.2pmol、0.2mM含等量各核苷酸的dNTP混合物(Roche)、5□110×cDNA PCR反应缓冲液(Clonetech)、3□1来自RT反应的DNA、0.5□1 Advantage2聚合酶(Clonetech)混合，用水将终体积调节至50□1，由此完成PCR。反应在Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400上进行，95℃5分钟，之后30循环的95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，之后是72℃7分钟和4℃保持。将样品与3ml载样染料混合，取25ml在1％OmniPu琼脂糖(Merck)凝胶上跑胶。在BaF3/zcytor19-puro和BaF3/zcytor19-zeo凝胶上都检测到了zcytor19带，这表明那些细胞表达该基因。
实施例16
多克隆抗体
用纯化的重组蛋白质huzcytor19/MBP-6H对两只雌性新西兰白兔进行免疫从而制备多克隆抗体。用溶于弗氏完全佐剂的200μg纯化蛋白质对每只兔子给予最初的腹膜内(ip)注射，之后用溶于弗氏不完全佐剂的100μg肽每三周进行一次ip加强免疫注射。第二次加强注射后(共注射三次)七至十天，取动物血液并收集血清。之后每三周对动物进行一次加强免疫和取血。
用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白质柱(Pharmacia LKB，Peapack，N.J.)，其中每克CNBr-SEPHAROSE由10mg纯化的重组MBP制得，使huzcyotr19/MBP-6H特异兔血清与抗-MBP抗体预先进行吸附。用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白质柱，其由10mg特异性抗原纯化重组蛋白质huzcytor19/MBP-6H制成，从兔血清亲和纯化huzcytor19-特异性多克隆抗体，之后在PBS中20×透析过夜。以500ng/ml纯化的蛋白质huzcytor19/MBP-6H或huzcytor19-Fc4作为抗体靶，用ELISA显示Huzcytor19-特异性抗体的特征。确定了兔抗-huzcytor19/MBP-6H亲和纯化抗体对其特异性纯化的重组抗原huzcytor19/MBP-6H和纯化的重组huzcytor19-Fc4检测下限值。
实施例17
信号转导受体检测
信号转导受体检测可用于检测zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24、和zcyto25与zcytor19的功能性互作。用报告质粒转染人胚肾(HEK)细胞，该报告质粒含有在pZP7表达载体存在或不存在的情况下驱动萤光素酶报告基因转录的由干扰素刺激的应答元件(ISRE)，pZP7表达载体包含II类细胞因子受体(包括人DIRS1、IFNaR1、IFNaR2和zcytor19(SEQ ID NO：23))的cDNA。用II类配体(包括zcyto20(SEQ ID NO：52)、zcyto21(SEQ ID NO：55)、zcyto22(SEQ ID NO：57)、zcyto10、huIL10和huIFNa-2a))刺激转染细胞后，萤光素酶活性反应出配体与转染的及天然细胞因子受体在细胞表面的互作。结果与方法如下述。
细胞转染
如下述转染293HEK细胞：转染前约18小时以700000个293细胞/孔(6孔板)将细胞接种于2毫升DMEM+10％胎牛血清。向各含有9微升Fugene6试剂(Roche Biochemicals)且总体积为100微升DMEM的孔中加入1微克pISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)、1微克细胞因子受体DNA和1微克pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。当未使用细胞因子受体DNA时，使用了两微克pIRES2-EGFP DNA。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。二十四小时后用胰蛋白酶-EDTA将转染细胞从培养板上移出，并以约25,000细胞/孔重新接种于96孔微量滴定板。在用配体刺激之前约18小时，将培养基换成DMEM+0.5％FBS。
信号转导报告试验
按下述完成信号转导报告试验：37℃下在DMEM+0.5％FBS中培养18小时后，用以下II类配体的稀释液(稀释于DMEM+0.5％FBS)刺激已转染的细胞：zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto10、huIL10和huIFNa-2a。37℃培养4小时后，裂解细胞，加入萤光素酶底物后在发光计上测定相对光单位(RLU)。所得结果以试验样品相对于培养基对照的RLU诱导倍数表示(试验样品的RLU/培养基的RLU＝诱导倍数)。表14显示，zcyto20、zcyto21和zcyto22在用ISRE-萤光素酶转染的293细胞中诱导ISRE信号，所给出的萤光素酶活性诱导是培养基对照的15至17倍。向转染混合物中加入zcytor19DNA导致由zcyto20、zcyto21和zcyto22所诱导的ISRE信号再增强6至8倍，总诱导为104至125倍。其它转染的II类细胞因子受体DNA都未导致ISRE信号增强。这些结果表明，zcyto20、zcyto21和zcyto22与zcytor19细胞因子受体发生功能性相互作用。表8也显示，huIFNa-2a能在ISRE-萤光素酶转染的293细胞中诱导ISRE信号，与单独的培养基相比萤光素酶活性诱导为205倍。然而，转染中加入zcytor19DNA导致ISRE-信号(与只含ISRE-萤光素酶DNA相比)降低10倍，这暗示着与zcytor19的过表达对zcyto20、zcyto21和zcyto22信号所产生的正面影响相反，zcytor19的过表达会对干扰素信号产生负面影响。
表8：II类细胞因子刺激后转染的293细胞的干扰素刺激应答元件(ISRE)信号(诱导倍数)
  配体   ISRE-Luc.   ISRE-Luc./zcytor19
  Zcyto20(125ng/ml)   15   125
  Zcyto21(125ng/ml)   17   108
  Zcyto22(125ng/ml)   17   104
  HuIFNa-2a(100ng/ml)   205   18
  Zcyto10(125ng/ml)   1.3   1
  HuIL10(100ng/ml)   1   0.5
实施例18：对IL10Rb(CRF2-4)作为zcytor19受体亚单位的鉴定
A：IL10Rb中和抗体抑制ISRE信号
用信号转导报告试验检测zcyto20、zcyto21、和zcyto22与zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。用报告质粒转染人胚肾(HEK)细胞或稳定过度表达人zcytor19的人胚肾(HEK)细胞，该报告质粒含有驱动萤光素酶报告基因转录的由干扰素刺激的应答元件(ISRE)。在IL10Rb(CRF2-4)的中和抗体存在或不存在的情况下用II类配体(包括zcyto20、zcyto21、zcyto22和huIFNa-2a)刺激转染细胞后，萤光素酶活性反应出配体与细胞因子受体在细胞表面的互作。结果与方法如下述。
细胞转染：
为制备稳定过度表达人zcytor19的293HEK细胞，如下转染293细胞：转染前6小时以300000个293细胞/孔(6孔板)将细胞接种于2毫升DMEM+10％胎牛血清。向含有6微升Fugene6试剂(RocheBiochemicals)且总体积为100微升DMEM的每孔中加入2微克含有人zcytor19 cDNA(SEQ ID NO：23)的pZP7表达载体。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。四十八小时后将转染细胞置于2微克/毫升嘌呤霉素下进行选择。将嘌呤霉素抗性细胞用做一个细胞群体。
如下述转染293HEK细胞(野生型或过表达人zcytor19的)：转染前18小时以700000个293细胞/孔(6孔板)将细胞接种于2毫升DMEM+10％胎牛血清。向各含有6微升Fugene6试剂(Roche Biochemicals)且总体积为100微升DMEM的孔中加入1微克pISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)和1微克pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。二十四小时后用胰蛋白酶-EDTA将转染细胞从培养板上移出，并以约25,000细胞/孔重新接种于96孔微量滴定板。在用配体刺激之前约18小时，将培养基换成DMEM+0.5％FBS。
信号转导报告试验：
按下述完成信号转导报告试验：37℃下在DMEM+0.5％FBS中培养18小时后，37℃下用IL10Rb的中和多克隆山羊抗体(对zcyto21用2.5微克/ml；对zcyto20和zcyto22用8微克/ml，R & D Systems)或PBS预处理转染细胞1小时。稳定过表达人zcytor19的人胚肾(HEK)细胞也用IFNAR1的非中和多克隆山羊抗体(8微克/ml，R & D Systems)预处理，以在涉及zcyto20和zcyto22的试验中作为抗体对照。用以下II类配体的稀释液(稀释于DMEM+0.5％FBS)刺激经预处理的细胞：zcyto20、zcyto21、或zcyto22。各试验中都使用了huIFNa-2a作为对照。37℃培养4小时后，裂解细胞，加入萤光素酶底物后在发光计上测定相对光单位(RLU)。所得结果以试验样品相对于培养基对照的RLU诱导倍数表示(试验样品的RLU/培养基的RLU＝诱导倍数)。
表9和10显示，用IL10Rb的中和抗体对野生型293细胞或过表达人zcytor19的293细胞的预处理抑制由zcyto20诱导的ISRE信号。对由huIFNa-2a诱导的ISRE信号没有或极少抑制。这些结果表明，为得到ISRE信号的最大诱导zcyto20需要与IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto20的受体是zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的异型二聚化组合。
表9：II类细胞因子刺激后IL10Rb对转染的野生型293细胞ISRE信号的抑制(诱导倍数)
  细胞因子浓度(ng/ml)  Zcyto20   Zcyto20+IL10Rb中和抗体   HuIFNa-2a   HuIFNa-2a    +IL10Rb中和抗体
  100   8.4   0.8   152   102
  10   4   0.9   160   117
  1   1   0.9   90   69
  0.1   1   1   12   6
  0.01   1   0.8   1.2   1
  0   1   1   1   1
表10：II类细胞因子刺激后IL10Rb对转染的zcytor19过表达293细胞ISRE信号的抑制(诱导倍数)
  细胞因子浓度(ng/ml)  Zcyto20   Zcyto20+IL10Rb中和抗体   HuIFNa-2a   HuIFNa-2a    +IL10Rb中和抗体
  100   91   60   16   16
  10   97   23   14   15
  1   68   1.3   8   8.4
  0.1   6   1.1   1.5   1.9
  0.01   1.1   1.2   1.2   1.3
  0   1   1   1   1
表11和12显示，用IL10Rb的中和抗体对野生型293细胞或过表达人zcytor19的293细胞的预处理抑制由zcyto21产生的ISRE信号。对由huIFNa-2a诱导的ISRE信号没有或极少抑制。这些结果表明，为得到ISRE信号的最大诱导zcyto21需要与IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto21的受体是zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的异型二聚化组合。
表11：II类细胞因子刺激后IL10Rb对转染的野生型293细胞ISRE信号的抑制(诱导倍数)
  细胞因子浓度(ng/ml)  Zcyto21   Zcyto21+IL10Rb中和抗体   HuIFNa-2a   HuIFNa-2a    +IL10Rb中和抗体
  100   4.1   1.8   31   30
  10   3.2   1.4   32   31
  1   1.5   1.3   16.3   15
  0.1   1.1   1.3   1.4   2
  0.01   1.2   1.3   1.1   1.2
  0.001   1.2   1.3   0.9   2.1
  0   1   1   1   1
表12 II类细胞因子刺激后IL10Rb对转染的zcytor19过表达293细胞ISRE信号的抑制(诱导倍数)
  细胞因子浓度(ng/ml)  Zcyto21   Zcyto21+IL10Rb中和抗体   HuIFNa-2a   HuIFNa-2a    +IL10Rb中和抗体
  100   45   31   9   7.7
  10   48   28   9   8.5
  1   35   5.8   4.3   4.3
  0.1   3.5   1   1.4   1.3
  0.01   1.5   1.1   0.9   1.2
  0.001   1.1   1   1.2   1
  0   1   1   1   1
表13和14显示，用IL10Rb的中和抗体对野生型293细胞或过表达人zcytor19的293细胞的预处理抑制zcyto22对ISRE信号的诱导。对由huIFNa-2a诱导的ISRE信号没有或极少抑制。这些结果表明，为得到ISRE信号的最大诱导zcyto22需要与IL10Rb(CRF2-4)相互作用，而且zcyto22的受体是zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的异型二聚化组合。
表13：II类细胞因子刺激后IL10Rb对转染的野生型293细胞ISRE信号的抑制(诱导倍数)
  细胞因子浓度(ng/ml)  Zcyto22   Zcyto22+IL10Rb中和抗体   HuIFNa-2a   HuIFNa-2a    +IL10Rb中和抗体
  100   11   1.2   152   102
  10   8   1   160   117
  1   1.8   0.8   90   69
  0.1   1.2   0.8   12   6
  0.01   0.9   0.9   1.2   1
  0   1   1   1   1
表14：II类细胞因子刺激后IL10Rb对转染的zcytor19过表达293细胞ISRE信号的抑制(诱导倍数)
  细胞因子浓度(ng/ml)  Zcyto22   Zcyto22+IL10Rb中和抗体   HuIFNa-2a   HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体
  100   82   76   16   16
  10   97   39   14   15
  1   69   2.3   8   8.4
  0.1   8.4   1.1   1.5   1.9
  0.01   1   1.3   1.2   1.3
  0   1   1   1   1
B：A：抗-IL10Rb抗体阻断抗病毒活性
为测定抗-IL10Rb抗体阻断zcyto20的抗病毒活性的能力完成了抗病毒试验。用293HEK细胞(野生型的或过表达人zcytor19的)进行试验。第一天，抗体(抗-人IL10Rβ，抗-人瘦蛋白受体，R & D Systems)在细胞培养基中稀释至5微克/ml，之后以50,000个细胞每孔接种96孔板。37℃下培养一小时后，向孔中加入zcyto20-CEE(来自实施例3)(对野生型293细胞用200ng/ml，对过表达人zcytor19的293细胞用0.5ng/ml)或人干扰素-a-2a(对野生型293细胞用1ng/ml，对过表达人zcytor19的293细胞用100ng/ml)，37℃下培养过夜。第二天，除去培养基，并替换为含有脑心肌炎病毒(EMCV)感染系数为0.1的培养基。之后于37℃过夜培养细胞。接下来，向每孔中加入25uL 5mg/ml甲基噻唑四唑鎓(MTT)(Sigma)，37度孵育2小时，之后用100uL提取缓冲液(12.5％SDS，45％DMF)提取各孔。37℃培养过夜后，在Spectromax读板器(Molecular Devices，CA)上测定570nM处的光密度。光密度(570nm)降低表明，存活细胞减少(丧失抗病毒活性)。不同试验条件下的光密度(570nm)示于下表15中。结果表明，对人IL10受体β的阻断特异性中和zcyto20的抗病毒活性而不影响干扰素-a-2a的活性。这表明，人IL10受体β是涉及zcyto20抗病毒活性的受体复合物(包括人zcytor19)中的一部分。
表15：用ECMV-感染的细胞因子处理的细胞的光密度(570nm)
  细胞因子   野生型293细胞：抗-IL10Rb   野生型293细胞：抗-瘦蛋白R Huzcytor19-过表达293细胞：抗-IL10Rb  Huzcytor19-过表达293细胞：抗-瘦蛋白R
  Zcyto20-CEE   0.94   1.88   0.95   2.24
  HuIFNa-2a   2.58   2.4   2.18   2.05
C：zcytor19和IL10Rb的共表达增强zcyto20、zcyto21、和 zcyto22信号：
用信号转导报告试验检测zcyto20、zcyto21和zcyto22与zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。用报告质粒转染仓鼠肾(BHK)细胞，该报告质粒含有在pZP7表达载体存在或不存在的情况下驱动萤光素酶报告基因转录的由干扰素刺激的应答元件(ISRE)，pZP7表达载体包含II类细胞因子受体zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的cDNA。用II类配体(包括zcyto20、zcyto21和zcyto22)刺激转染细胞后，萤光素酶活性反应出配体与转染的及天然细胞因子受体在细胞表面的互作。结果与方法如下述。
细胞转染
如下述转染BHK-570细胞：转染前约5小时以200000个BHK细胞/孔(6孔板)将细胞接种于2毫升DMEM+5％胎牛血清。向各含有9微升Fugene6试剂(Roche Biochemicals)且总体积为100微升DMEM的孔中加入1微克pISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)、1微克细胞因子受体DNA和1微克pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。当未使用细胞因子受体DNA时，使用了两微克pIRES2-EGFP DNA。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的BHK细胞中。二十四小时后用胰蛋白酶-EDTA将转染细胞从培养板上移出，并以约25,000细胞/孔重新接种于96孔微量滴定板。在用配体刺激之前约18小时，将培养基换成DMEM+0.5％FBS。
信号转导报告试验
按下述完成信号转导报告试验：37℃下在DMEM+0.5％FBS中培养18小时后，用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24、和zcyto25配体的稀释液(稀释于DMEM+0.5％FBS)刺激已转染的细胞。37℃培养4小时后，裂解细胞，加入萤光素酶底物后在发光计上测定相对光单位(RLU)。所得结果以试验样品相对于培养基对照的RLU诱导倍数表示(试验样品的RLU/培养基的RLU＝诱导倍数)。表16显示，zcyto20、zcyto21和zcyto22在用ISRE-萤光素酶和zcytor19转染的BHK细胞中以剂量依赖的方式诱导ISRE信号。向转染混合物中加入IL10Rb(CRF2-4)DNA导致在低于细胞因子10～100倍剂量下出现最大信号诱导的一半。只用ISRE转染未观察到信号。这些结果显示，zcyto19和IL10Rb(CRF2-4)的共表达增强zcyto20、zcyto21和zcyto22通过由干扰素刺激的应答元件而产生信号的能力，表明zcyto20、zcyto21和zcyto22的受体是IL10Rb(CRF2-4)和zcytor19的异型二聚组合。
表16：II类细胞因子刺激后转染的BHK细胞的干扰素刺激应答元件(ISRE)信号(诱导倍数)
  II类配体浓度(ng/ml)   zcyto20/只用zcytor19转染的细胞   zcyto20/用zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)转染的细胞   zcyto21/只用zcytor19转染的细胞   zcyto21/用zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)转染的细胞   zcyto22/只用zcytor19转染的细胞   zcyto22/用zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)转染的细胞
  1000   2.25   2.1   3.3   2.2   1.8   2.2
  100   2.2   2.6   2.6   2.5   2   2.2
  10   2.1   2.4   2.4   2.6   1.9   2.7
  1   1.3   2.5   2   2.5   1.5   2.7
  0.1   1.25   2.1   1.4   2.2   1.1   2.4
  0.01   1.2   1.6   1.4   1.6   1.2   1.7
  0.001   1.4   1.5   1.3   1.3   1.2   1.3
  0   1   1   1   1   1   1
实施例19
配体与可溶性受体的结合
配体(zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24、和zcyto25)与可溶性受体的结合可用碘-珠(iodo-bead)标记法进行检测。例如，标记了125I标记zcyto21-CEE(1.2×107CPM/ml；1.5ng/u l；和8.6×106CPM/ug)。
以约10,000ng冷zcyto21作为竞争剂，将五十纳克125I标记zcyto21-cEE(参见实施例3)(399,600CPM)与1000ng冷zcytor19/Fc4同型二聚受体、1000ng冷zcytor19/CRF2-4异二聚体受体、或1000ng作为对照的对照II类细胞因子受体/Fc4受体混合。4℃孵育样品2小时，之后向各样品添加30ul蛋白质-G(Zymed San Francisco，CA)。4℃孵育样品1小时，并用PBS洗涤3次。在γ计数器中测定经洗涤的蛋白质-G的放射活性(Packard Instruments，Downers Grove，IL)。
实施例20
用zcyto20和zcyto21-生物素对人单核细胞进行流式细胞染色
外周血白细胞(PBLs)用Ficoll Hypaque(Amersham，Sweden)分离法分离自肝素化的人血液。以1×10e6细胞每微升的密度于37℃下将PBL培养于6-孔组织培养平板的标准培养基中。培养过夜后，收集PBLs，并用浓度为10ug/ml的生物素化的zcyto20-cee和zcyto21-cee(参见实施例18)染色。用以1∶1000的稀释比例制得的藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen，CA，USA)检测染色。染色后，将PBL在2％聚甲醛中固定，并在Facscaliber(Becton Dickinson，SanDiego，CA)上读取。数据用Cellquest软件(Becton Dickinson)进行分析。结果表明，生物素化的zcyto20-cee和zcyto21-cee都对外周血白细胞髓门(myeloid gate)中的细胞染色。淋巴门(lymphoid gate)中的细胞不与zcyto20-cee和zcyto21-cee结合.
实施例21
Northern分析zcytor19的表达
用探针检测了RNA印迹以确定zcytor19的组织分布。用如SEQ IDNO：21所示的基因特异引物5’ZC40285；和如SEQ ID NO：22所示的基因特异引物3’ZC 40286，进行PCR获得了人zcytor19cDNA片段。模板是克隆的人zcytor19cDNA(SEQ ID NO：23)。PCR片段经凝胶纯化，用RmT随机引物标记试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)对～25ng进行P32α-dCTP标记。
用探针对以下RNA印迹(Clontech，Palo Alto，CA)进行了zcytor19mRNA表达的探测：(1)人癌细胞系印迹C，它含有来自以下各癌细胞系的RNA样品：前髓细胞白血病HL-60、HELA S3、慢性骨髓性白血病k-562、成淋巴细胞性白血病MOLT-4、Burkitt′s淋巴瘤RAJI、结肠直肠腺癌SW480、肺癌A549、和黑色素瘤G-361；(2)人MTN H印迹，它包含来自以下组织的mRNA：心脏、全脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾、和胰腺；(3)人MTN H3，它包含来自以下组织的mRNA：胃、甲状腺、脊髓、淋巴结、气管、肾上腺腺体、和骨髓；和(4)人MTN H4，它包含来自以下组织的mRNA：脾、胸腺、前列腺睾丸、子宫、小肠、结肠、和外周血白细胞。除了向杂交和预杂交缓冲液中另加入0.2mg/ml鲑鱼精子DNA以降低非特异性杂交外，根据制造商的建议在ULTRAhybTM超敏杂交缓冲液(Ambion，Austin，TX)中完成杂交。杂交后，在50℃下用0.1×SSC/0.5％SDS处理印迹从而除去非特异性放射信号。用BioMax MR膜和增感屏(Eastman Kodak，Rochester，NY)对印迹感光，根据制造商推荐为3天。
～4.5kb转录物的表达在心脏、骨骼肌、胰腺和前列腺组织、以及Burkitt′s淋巴瘤(RAJI)细胞系中为最大。在多个其它组织中有较低水平的表达。此外，还有一个不如较大转录物丰富但也存在于许多组织和细胞系中的～2kb转录物。睾丸组织除有2和4.5kb转录物外，可能还含有～4kb和1.4kb的转录物。肾上腺腺体等量表达4.5kb和2kb转录物。
实施例22
基于对刺激或未刺激细胞的RT-PCR分析的人zcytor19表达
用对下列细胞类型的RT-PCR分析检查zcytor19的基因表达：Hela、293、Daudi、CD14+、U937、和HL-60。
用可商业获得的RT-PCR第一链合成系统(Invitrogen lifetechnologies，Carlsbad，CA)从总RNA合成第一链cDNA。用zcytor19x1(SEQ ID NO：1)和zcytor19x2(SEQ ID NO：18)特异性寡核苷酸引物ZC40288(SEQ ID NO：65)和ZC40291(SEQ ID NO：66)、Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶及缓冲液(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)、GeneAmp dNTPs(Applied Biosystems，Foster City，CA)、RediLoadTM染料(Research Genetics，Inc.，Huntville，AL)和2μl来自各细胞类型的第一链cDNA(第一链反应的10％)进行随后的PCR反应，上述引物分别产生806bp和892bp的产物。PCR循环仪条件如下：初始1循环95℃变性15分钟，35循环的94℃变性45秒，63℃退火1分钟和72℃延伸1分又15秒，之后是最后1循环72℃延伸7分钟。反应液在2％琼脂糖凝胶(EM Science，Gibbstown，NJ)上电泳分离，并经溴化乙锭染色可视化。
在Hela±IFN-β(只有892bp带)、293+Parental Adv、Daudi±IFN-β、Daudi±IFN-α、激活的CD14+、激活的HL-60中看到了正确大小的条带。在静息的CD14+、静息及激活的U937、和静息的HL-60中未观察到条带。这些结果显示单核细胞或单核细胞细胞系的分化或激活后诱导zcytor19表达。
实施例23
产生hzcytor19/hCRF2-4异二聚体的构建体
构建了表达分泌型hzcytor19/hCRF2-4异二聚体的细胞系。在该构建体中，hzcytor19的细胞外结构域与C-末端带有Glu-Glu标签(SEQID NO：11)的IgG重链γ1(Fc4)(SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)融合，而CRF2-4的细胞外结构域(SEQ ID NO：64)与C-末端带有组氨酸标签的Fc4融合。对于异二聚体的hzcytor19和hCRF2-4臂，在受体的细胞外部分和Fc4的N-末端间都构建了一个12氨基酸的Gly-Ser间隔区。此外，在Fc4结构域和C-末端标签间构建了一个凝血酶切割位点以使得能够经蛋白水解将标签去除。
为构建异二聚体的hzcytor19/Fc4-CEE部分，用在5’和3’末端设计了BamHI和Bg12限制性位点的寡核苷酸ZC37967(SEQ ID NO：24)和ZC37972(SEQ ID NO：25)从脑cDNA文库中经PCR扩增了hzcytor19的细胞外部分，PCR条件如下：25循环的94℃60秒，57℃60秒，和72℃120秒；和72℃7分钟。PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，用BamHI和Bg12(Boerhinger-Mannheim)消化，经凝胶电泳分离并用QIAquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)纯化。hzcytor19BamHI/Bg12片段被连接进已用Bg12消化的Fc4/pzmp20载体。在tPA前导肽和人Fc4片段间克隆zcytor19片段。序列一经确认，则经EcoRI和Bg12消化切出带有tPA前导肽的zcytor19的DNA片段，之后将其克隆进pzp9/zcytor7/Fc4-CEE载体。该载体带有与具CEE标签的Fc4融合的hzcytor7细胞外部分，用EcoRI和BamHI消化可以除去hzcytor7细胞外部分并允许hzcytor19的替换。对所得连接产物的微量制剂筛选正确大小的EcoRI/BamHI插入物，并对阳性微量制剂进行测序以验证PCR反应的精确性。
为构建异二聚体的hCRF2-4/Fc4-cHIS，用寡核苷酸ZC39319(SEQID NO：68)和ZC39325(SEQ ID NO：70)在下列条件下从pZP-9CRF中PCR扩增了hCRF2-4的细胞外部分：30循环的94℃60秒，57℃60秒，和72℃120秒；和72℃7分钟。PCR产物如上述进行纯化，之后用EcoRI和BamHI消化。PCR产物带有一个内部EcoRI位点，因此消化后得到了两个条带：0.101kB EcoRI/EcoRI片段和0.574kB EcoRI/BamHI片段。0.574EcoRI/BamHI片段被连接进已用EcoRI和BamHI消化的载体#249pHZ-1DR1/Fc4-TCS-cHIS。该载体带有与具C-HIS标签(SEQ IDNO：[#])的Fc4融合的hDR-1细胞外部分，用EcoRI和BamHI消化可以除去hDR-1细胞外部分并允许hCRF2-4的替换。对所得连接产物的微量制剂筛选正确大小的EcoRI/BamHI插入物，阳性微量制剂用EcoRI消化并进行条带纯化以用于进一步的构建。将0.101kB EcoRI/EcoRI片段连接进经EcoRI消化的微量制剂，并用KpnI/NdeI限制性消化筛选插入方向正确的克隆。对带有大小正确的插入物的克隆测序以验证PCR反应的精确性。
根据各制造商的说明，用Lipofectamine(Gibco/BRL)将hzcytor19/Fc4-cEE和hCRF2-4/Fc-4-cHIS各约16μg共转染进BHK-570(ATCC No.CRL-10314)细胞。转染的细胞在含有1μM氨甲蝶呤(MTX)(Sigma，St.Louis，MO)和0.5mg/ml G418(Gibco/BRL)的DMEM+5％FBS(Gibco/BRL)中选择10天。所获的转染子集合又在10μM MTX和0.5mg/ml G418中选择了10天。
实施例24
zcytor19/CRF2-4异二聚体受体的纯化
zcytor19/CRF2-4异二聚体条件培养基经0.2μm过滤器过滤并加入0.02％(w/v)叠氮化钠。以10～20ml/min将条件培养基直接上样至多孔蛋白质A 50柱(Poros Protein A 50 Column)。上样后，用PBS洗涤柱，并用pH 3.0的0.1M甘氨酸将结合的蛋白质洗脱。将含有蛋白质的洗脱级分调至pH 7.2，并用YM30 Stirred Cell Membrane(Millipore)浓缩至＜80ml。
将80ml从蛋白质A柱洗脱的物质上样到318ml的Superdex 200HiLoad 26/60柱(Pharmacia)。以3ml/min用PBS pH 7.2对柱进行洗脱。收集含有蛋白质的级分以去除凝集物。用固体NaCl和咪唑将Superdex 200收集物调节至0.5M NaCl、10mM咪唑，用NaOH将pH调节至7.5。将经过调节的蛋白质溶液以2CV/hr上样至200ml NiNTA柱(Qiagen)。用PBS洗涤柱后，用五个浓度的咪唑分五步将蛋白质洗脱：40mM、100mM、150mM、250mM、500mM。收集各咪唑步骤洗脱的级分并经N-末端测序进行分析。收集含有经测序确认的异二聚体的级分，并用YM30 Stirred Cell Membrane(Millipore)浓缩至50ml。将50ml从NiNTA柱洗脱的物质上样到318ml的Superdex 200 HiLoad 26/60柱(Pharmacia)。以3ml/min用PBS pH 7.2对柱进行洗脱。收集含有蛋白质的级分以除去根据SEC MALS分析确定的凝集物。
用N-末端测序、氨基酸分析、和SEC-MALS对纯化的蛋白质进行分析。检测了与其配体(zcyto20、21、22、24、和25)的结合亲和力和生物学活性(包括它的中和活性)。
实施例25
肝脏和淋巴细胞亚群中的IL28RA mRNA表达
为进一步检测IL28RA的mRNA分布，用SDS 7900HT系统(AppliedBiosystems，CA)完成半定量RT-PCR。用100ng各样品的总RNA和基因特异引物完成一步RT-PCR(One-step RT-PCR)。用Bjab RNA对各引物组生成一条标准曲线，并将所有样品值标准化成HPRT。标准化的结果总结在表17-19中。同时显示了IFNAR2和CRF2-4的标准化值。
表17：B和T细胞表达显著水平的IL28RA mRNA。在树突细胞和大多数单核细胞中观察到低水平。
表17
  细胞/组织   I128RA   IFNAR2   CRF2-4
  未刺激的树突细胞   .04   5.9   9.8
  树突细胞+IFNg   .07   3.6   4.3
  树突细胞   .16   7.85   3.9
  用LPS/IFNg刺激的CD14+   .13   12   27
  静息的CD14+单核细胞   .12   11   15.4
  未激活的Hu CD14+   4.2   TBD   TBD
  1ug/ml LPS激活的Hu CD14+   2.3   TBD   TBD
  H.炎症扁桃腺   3   12.4   9.5
  H.B-细胞+PMA/Iono 4 & 24小时   3.6   1.3   1.4
  静息的Hu CD19+   6.2   TBD   TBD
  Hu CD19+4小时.PMA/Iono   10.6   TBD   TBD
  Hu CD19+24小时激活的PMA/Iono   3.7   TBD   TBD
  IgD+B-细胞   6.47   13.15   6.42
  IgM+B-细胞   9.06   15.4   2.18
  IgD-B-细胞   5.66   2.86   6.76
  NK细胞+PMA/Iono   0   6.7   2.9
  未激活的Hu CD3+   2.1   TBD   TBD
  静息的CD4+   .9   8.5   29.1
  未经刺激的CD4+18小时   1.6   8.4   13.2
  CD4++Poly I/C   2.2   4.5   5.1
  CD4++PMA/Iono   .3   1.8   .9
  静息的CD3 neg   1.6   7.3   46
  未经刺激的CD3 neg 18小时   2.4   13.2   16.8
  CD3 neg+Poly I/C 18小时   5.7   7   30.2
  CD3 neg+LPS 18小时   3.1   11.9   28.2
  CD8+未刺激18小时   1.8   4.9   13.1
  用PMA/Ion刺激18小时的CD8+   .3   .6   1.1
如表18所示，正常肝脏组织和从肝脏衍生细胞系表现IL28RA和CRF2-4mRNA的显著水平。
表18
  细胞/组织   IL28RA   IFNAR2   CRF2-4
  HepG2   1.6   3.56   2.1
  HepG2 UGAR 5/10/02   1.1   1.2   2.7
  HepG2，CGAT HKES081501C   4.3   2.1   6
  HuH7 5/10/02   1.63   16   2
  HuH7肝细胞瘤-CGAT   4.2   7.2   3.1
  肝脏，正常-CGAT #HXYZ020801K   11.7   3.2   8.4
  肝脏，NAT-正常相邻组织   4.5   4.9   7.7
  肝脏，NAT-正常相邻组织   2.2   6.3   10.4
  Hep SMVC hep静脉   0   1.4   6.5
  Hep SMCA hep.动脉   0   2.1   7.5
  Hep.Fibro   0   2.9   6.2
  Hep.Ca.   3.8   2.9   5.8
  肝脏腺癌   8.3   4.2   10.5
  SK-Hep-1肝脏腺癌   .1   1.3   2.5
  AsPC-1Hu.胰腺腺癌   .7   .8   1.3
  Hu.Hep.星形细胞   .025   4.4   9.7
如表19所示，原代气管上皮细胞含有丰富的IL28RA和CRF2-4。
表19
  细胞/组织   IL28RA   IFNAR2   CRF2-4
  U87MG-神经胶质瘤   0   .66   .99
  未经刺激的NHBE   1.9   1.7   8.8
  NHBE+TNF-α   2.2   5.7   4.6
  NHBE+poly I/C   1.8   nd   nd
  小气管内皮细胞   3.9   3.3   27.8
  NHLF-正常人肺成纤维细胞   0   nd   nd
如表20所示，zcytor19存在于正常和患病肝脏样本中，在来自被丙肝和乙肝感染的样本的组织中表达增强。
表20
  细胞/组织   IL28RA   CRF2-4   IFNAR2
  凝固性坏死的肝脏   8.87   15.12   1.72
  患自身免疫肝炎的肝脏   6.46   8.90   3.07
  新生儿肝炎   6.29   12.46   6.16
  肝脏疾病末期   4.79   17.05   10.58
  爆发性肝脏衰竭   1.90   14.20   7.69
  爆发性肝脏衰竭   2.52   11.25   8.84
  原发性胆汁性肝硬变   4.64   12.03   3.62
  酒精性肝硬变(Laennec′s)   4.17   8.30   4.14
  隐源性肝硬化   4.84   7.13   5.06
  丙肝+，伴随硬化   3.64   7.99   6.62
  丙肝+   6.32   11.29   7.43
  甲肝继发性爆发性肝炎   8.94   21.63   8.48
  丙肝+   7.69   15.88   8.05
  乙肝+   1.61   12.79   6.93
  正常肝脏   8.76   5.42   3.78
  正常肝脏   1.46   4.13   4.83
  肝脏NAT   3.61   5.43   6.42
  肝脏NAT   1.97   10.37   6.31
  Hu胎儿肝脏   1.07   4.87   3.98
  肝细胞癌   3.58   3.80   3.22
  肝脏腺癌   8.30   10.48   4.17
  hep.SMVC，hep.静脉   0.00   6.46   1.45
  Hep SMCA hep.动脉   0.00   7.55   2.10
  Hep.成纤维细胞   0.00   6.20   2.94
  HuH7肝癌   4.20   3.05   7.24
  HepG2肝细胞癌   3.40   5.98   2.11
  SK-Hep-1肝脏腺癌   0.03   2.53   1.30
  未经刺激的HepG2   2.06   2.98   2.28
  HepG2+zcyto21   2.28   3.01   2.53
  HepG2+IFNa   2.61   3.05   3.00
  正常的雌性肝脏-退化的   1.38   6.45   4.57
  正常肝脏-退化的   1.93   4.99   6.25
  正常肝脏-退化的   2.41   2.32   2.75
  患病肝脏-退化的   2.33   3.00   6.04
  来自Clonetics的原代肝细胞   9.13   7.97   13.30
如表21-25所示，在正常B细胞、B淋巴瘤细胞系、T细胞、T淋巴瘤细胞系(Jurkat)、正常和转化的淋巴细胞(B细胞和T细胞)和正常人单核细胞中可探测到zcytor19。
表21
Figure G2009101751191D01241
表22
  HPRT SD   IL28RA SD
  Mono 24小时未经刺激的#A38   0.6   2.4
  Mono 24小时刺激的#A38   0.7   0.2
  Mono 24小时未经刺激的#A112   2.0   0.7
  Mono 24小时刺激的#A112   0.3   0.1
  Mono rest #X   5.7   2.2
  Mono+LPS #X   0.5   1.0
  Mono 24小时未经刺激的#A39   0.7   0.8
  Mono 24小时刺激的#A39   0.1   0.7
  HL60，静息的   19.7   0.1
  HL60+PMA   0.7   0.4
  U937，静息的   7.4   0.0
  U937+PMA   7.1   0.0
  Jurkat，静息的   3.7   1.1
  Jurkat，激活的   2.4   1.8
  Colo205   1.9   0.7
  HT-29   2.3   1.7
表23
Mean Hprt   MeanIFNAR2   MeanIL28RA Mean CRF
  CD3+/CD4+0   10.1   85.9   9.0   294.6
  CD4/CD3+未经刺激的18小时   12.9   108.7   20.3   170.4
  CD4+/CD3++Poly I/C 18小时   24.1   108.5   52.1   121.8
  CD4+/CD3++PMA/Iono 18小时   47.8   83.7   16.5   40.8
  CD3 neg 0   15.4   111.7   24.8   706.1
  CD3 neg未经刺激的18小时   15.7   206.6   37.5   263.0
  CD3 neg+Poly I/C 18小时   9.6   67.0   54.7   289.5
  CD3 neg+LPS 18小时   14.5   173.2   44.6   409.3
  CD8+未经刺激的.18小时   6.1   29.7   11.1   79.9
  CD8++PMA/Iono 18小时   78.4   47.6   26.1   85.5
  12.8.1-NHBE未经刺激的   47.4   81.1   76.5   415.6
  12.8.2-NHBE+TNF-α   42.3   238.8   127.7   193.9
  SAEC   15.3   49.9   63.6   426.0
表24
  IL28RANorm   CRFNorm   IFNAR2Norm   IL28RASD   CRFSD   IFNAR2SD
  CD3+/CD4+0   0.9   29.1   8.5   0.1   1.6   0.4
  CD4/CD3+未经刺激的18小时   1.6   13.2   8.4   0.2   1.6   1.4
  CD4+/CD3++Poly I/C 18小时   2.2   5.1   4.5   0.1   0.3   0.5
  CD4+/CD3++PMA/Iono 18小时   0.3   0.9   1.8   0.0   0.1   0.3
  CD3 neg 0   1.6   46.0   7.3   0.2   4.7   1.3
  CD3 neg未经刺激的18小时   2.4   16.8   13.2   0.4   2.7   2.3
  CD3 neg+Poly I/C 18小时   5.7   30.2   7.0   0.3   1.7   0.8
  CD3 neg+LPS 18小时   3.1   28.2   11.9   0.4   5.4   2.9
  CD8+未经刺激的.18小时   1.8   13.1   4.9   0.1   1.1   0.3
  CD8++PMA/Iono 18小时   0.3   1.1   0.6   0.0   0.1   0.0
  12.8.1-NHBE未经刺激的   1.6   8.8   1.7   0.1   0.4   0.1
  12.8.2-NHBE+TNF-α   3.0   4.6   5.7   0.1   0.1   0.1
  SAEC   4.1   27.8   3.3   0.2   1.1   0.3
表25
  SD Hprt   SD IFNAR2  SD IL28RA   SD CRF
  CD3+/CD4+0   0.3   3.5   0.6   12.8
  CD4/CD3+未经刺激的18小时   1.4   13.7   1.1   8.5
  CD4+/CD3++Poly I/C 18小时   1.3   9.8   1.6   3.4
  CD4+/CD3++PMA/Iono 18小时   4.0   10.3   0.7   3.7
  CD3 neg 0   1.4   16.6   1.6   28.6
  CD3 neg未经刺激的18小时   2.4   16.2   2.7   12.6
  CD3 neg+Poly I/C 18小时   0.5   7.0   1.0   8.3
  CD3 neg+LPS 18小时   1.0   39.8   5.6   73.6
  CD8+未经刺激的.18小时   0.2   1.6   0.5   6.1
  CD8++PMA/Iono 18小时   1.3   1.7   0.2   8.1
  12.8.1-NHBE未经刺激的   2.4   5.6   2.7   2.8
  12.8.2-NHBE+TNF-α   0.5   3.4   3.5   3.4
  SAEC   0.5   4.8   1.8   9.9
实施例26
用可溶性异二聚体，和可溶性同型二聚体对IIL28A、IL29、和 zcyto24信号的抑制
信号转导报告试验
信号转导报告试验可用于显示zcytor19-Fc4同型二聚化和zcytor19-Fc/CRF2-4-Fc异二聚体化可溶性受体对zcyto20、zcyto21和zcyto24信号的抑制剂特性。用报告质粒转染过表达zcytor19受体的人胚肾(HEK)细胞，该报告质粒含有驱动萤光素酶报告基因转录的由干扰素刺激的应答元件(ISRE)。用配体(包括zcyto20(SEQ ID NO：52)、zcyto21(SEQ ID NO：55)、和zcyto24(SEQ ID NO：60))刺激转染细胞后，萤光素酶活性反应出配体与可溶性受体的互作。
细胞转染
如下述转染过表达人zcytor19的293HEK细胞：转染前约18小时以700000个293细胞/孔(6孔板)将细胞接种于2毫升DMEM+10％胎牛血清。向各含有6微升Fugene6试剂(Roche Biochemicals)且总体积为100微升DMEM的孔中加入1微克pISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)和1微克pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。二十四小时后用胰蛋白酶-EDTA将转染细胞从培养板上移出，并以约25,000细胞/孔重新接种于96孔微量滴定板。在用配体刺激之前约18小时，将培养基换成DMEM+0.5％FBS。
信号转导报告试验
按下述完成信号转导报告试验：37℃下在DMEM+0.5％FBS中培养18小时后，用10ng/ml zcyto20、zcyto21或zcyto24和10微克/ml以下可溶性受体刺激转染的细胞：人zcytor19-Fc同型二聚体、人zcytor19-Fc/人CRF2-4-Fc异二聚体、人CRF2-4-Fc同型二聚体、鼠zcytor19-Ig同型二聚体。37℃培养4小时后，裂解细胞，加入萤光素酶底物后在发光计上测定相对光单位(RLU)。
根据对在可溶性受体存在的情况下由配体诱导的信号的抑制相对于对只有PBS存在的情况下的信号的抑制的百分数来表示所得的结果。表26显示，人zcytor19-Fc/人CRF2-4异二聚化可溶性受体能以对照的16～45％抑制zcyto20、zcyto21和zcyto24-诱导的信号。人zcytor19-Fc同型二聚化可溶性受体也能以45％抑制由zcyto21诱导的信号。用huCRF2-4-Fc或muzcytor19-Ig同型二聚化可溶性受体未观察到显著影响。
表26：可溶性受体对由配体诱导的干扰素刺激应答元件(ISRE)信号的抑制百分数
  配体   Huzcytor19-Fc/huCRF2-4-Fc   Huzcytor19-Fc   HuCRF2-4-Fc   Muzcytor19-Ig
  Zcyto20   16％   92％   80％   91％
  Zcyto21   16％   45％   79％   103％
  Zcyto24   47％   90％   82％   89％
根据上述应当理解，尽管为了举例说明而在本文中描述了特定的实施方式，仍可在不偏离本发明精神和范围的情况下作出各种改变。因此，本发明仅受所附权利要求书的限制。
序列表
<110>ZymoGenetics，Inc.
<120>细胞因子受体
<130>02-10PC
<150>60/373,813
<151>2002-04-19
<160>69
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1476
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1473)
<400>1
atg gcg ggg ccc gag cgc tgg ggc ccc ctg ctc ctg tgc ctg ctg cag  48
Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln
 1               5                   10                  15
gcc gct cca ggg agg ccc cgt ctg gcc cct ccc cag aat gtg acg ctg  96
Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
             20                  25                  30
ctc tcc cag aac ttc agc gtg tac ctg aca tgg ctc cca ggg ctt ggc  144
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
         35                  40                  45
aac ccc cag gat gtg acc tat ttt gtg gcc tat cag agc tct ccc acc  192
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
     50                  55                  60
cgt aga cgg tgg cgc gaa gtg gaa gag tgt gcg gga acc aag gag ctg  240
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
 65                  70                  75                  80
cta tgt tct atg atg tgc ctg aag aaa cag gac ctg tac aac aag ttc    288
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
                 85                  90                  95
aag gga cgc gtg cgg acg gtt tct ccc agc tcc aag tcc ccc tgg gtg    336
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
            100                 105                 110
gag tcc gaa tac ctg gat tac ctt ttt gaa gtg gag ccg gcc cca cct    384
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
        115                 120                 125
gtc ctg gtg ctc acc cag acg gag gag atc ctg agt gcc aat gcc acg    432
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
    130                 135                 140
tac cag ctg ccc ccc tgc atg ccc cca ctg ttt ctg aag tat gag gtg    480
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Phe Leu Lys Tyr Glu Val
145                 150                 155                 160
gca ttt tgg ggg ggg ggg gcc gga acc aag acc cta ttt cca gtc act    528
Ala Phe Trp Gly Gly Gly Ala Gly Thr Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
                165                 170                 175
ccc cat ggc cag cca gtc cag atc act ctc cag cca gct gcc agc gaa    576
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
            180                 185                 190
cac cac tgc ctc agt gcc aga acc atc tac acg ttc agt gtc ccg aaa    624
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
        195                 200                 205
tac agc aag ttc tct aag ccc acc tgc ttc ttg ctg gag gtc cca gaa    672
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
    210                 215                 220
gcc aac tgg gct ttc ctg gtg ctg cca tcg ctt ctg ata ctg ctg tta    720
Ala Asn Trp Ala Phe Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
gta att gcc gca ggg ggt gtg atc tgg aag acc ctc atg ggg aac ccc    768
Val Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Trp Lys Thr Leu Met Gly Asn Pro
                245                 250                 255
tgg ttt cag cgg gca aag atg cca cgg gcc ctg gaa ctg acc aga ggg    816
Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg Ala Leu Glu Leu Thr Arg Gly
            260                 265                 270
gtc agg ccg acg cct cga gtc agg gcc cca gcc acc caa cag aca aga    864
Val Arg Pro Thr Pro Arg Val Arg Ala Pro Ala Thr Gln Gln Thr Arg
        275                 280                 285
tgg aag aag gac ctt gca gag gac gaa gag gag gag gat gag gag gac    912
Trp Lys Lys Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp
    290                 295                 300
aca gaa gat ggc gtc agc ttc cag ccc tac att gaa cca cct tct ttc    960
Thr Glu Asp Gly Val Ser Phe Gln Pro Tyr Ile Glu Pro Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
ctg ggg caa gag cac cag gct cca ggg cac tcg gag gct ggt ggg gtg    1008
Leu Gly Gln Glu His Gln Ala Pro Gly His Ser Glu Ala Gly Gly Val
                325                 330                 335
gac tca ggg agg ccc agg gct cct ctg gtc cca agc gaa ggc tcc tct    1056
Asp Ser Gly Arg Pro Arg Ala Pro Leu Val Pro Ser Glu Gly Ser Ser
            340                 345                 350
gct tgg gat tct tca gac aga agc tgg gcc agc act gtg gac tcc tcc    1104
Ala Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr Val Asp Ser Ser
        355                 360                 365
tgg gac agg gct ggg tcc tct ggc tat ttg gct gag aag ggg cca ggc    1152
Trp Asp Arg Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Gly Pro Gly
    370                 375                 380
caa ggg ccg ggt ggg gat ggg cac caa gaa tct ctc cca cca cct gaa    1200
Gln Gly Pro Gly Gly Asp Gly His Gln Glu Ser Leu Pro Pro Pro Glu
385                 390                 395                 400
ttc tcc aag gac tcg ggt ttc ctg gaa gag ctc cca gaa gat aac ctc    1248
Phe Ser Lys Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro Glu Asp Asn Leu
                405                 410                 415
tcc tcc tgg gcc acc tgg ggc acc tta cca ccg gag ccg aat ctg gtc  1296
Ser Ser Trp Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu Pro Asn Leu Val
            420                 425                 430
cct ggg gga ccc cca gtt tct ctt cag aca ctg acc ttc tgc tgg gaa  1344
Pro Gly Gly Pro Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Thr Phe Cys Trp Glu
        435                 440                 445
agc agc cct gag gag gaa gag gag gcg agg gaa tca gaa att gag gac  1392
Ser Ser Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser Glu Ile Glu Asp
    450                 455                 460
agc gat gcg ggc agc tgg ggg gct gag agc acc cag agg acc gag gac  1440
Ser Asp Ala Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln Arg Thr Glu Asp
465                 470                 475                 480
agg ggc cgg aca ttg ggg cat tac atg gcc agg tga                  1476
Arg Gly Arg Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg
                485                 490
<210>2
<211>491
<212>PRT
<213>现代人
<400>2
Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln
 1               5                  10                  15
Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
            20                  25                  30
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
        35                  40                  45
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
    50                  55                  60
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
65                  70                  75                  80
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
                85                  90                  95
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
            100                 105                 110
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
        115                 120                 125
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
    130                 135                 140
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Phe Leu Lys Tyr Glu Val
145                 150                 155                 160
Ala Phe Trp Gly Gly Gly Ala Gly Thr Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
                165                 170                 175
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
            180                 185                 190
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
        195                 200                 205
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
    210                 215                 220
Ala Asn Trp Ala Phe Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Val Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Trp Lys Thr Leu Met Gly Asn Pro
                245                 250                 255
Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg Ala Leu Glu Leu Thr Arg Gly
            260                 265                 270
Val Arg Pro Thr Pro Arg Val Arg Ala Pro Ala Thr Gln Gln Thr Arg
        275                 280                 285
Trp Lys Lys Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp
    290                 295                 300
Thr Glu Asp Gly Val Ser Phe Gln Pro Tyr Ile Glu Pro Pro Ser Phe
305                 310                 315                 320
Leu Gly Gln Glu His Gln Ala Pro Gly His Ser Glu Ala Gly Gly Val
                325                 330                 335
Asp Ser Gly Arg Pro Arg Ala Pro Leu Val Pro Ser Glu Gly Ser Ser
            340                 345                 350
Ala Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr Val Asp Ser Ser
        355                 360                 365
Trp Asp Arg Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Gly Pro Gly
    370                 375                 380
Gln Gly Pro Gly Gly Asp Gly His Gln Glu Ser Leu Pro Pro Pro Glu
385                 390                 395                 400
Phe Ser Lys Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro Glu Asp Asn Leu
                405                 410                 415
Ser Ser Trp Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu Pro Asn Leu Val
            420                 425                 430
Pro Gly Gly Pro Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Thr Phe Cys Trp Glu
        435                 440                 445
Ser Ser Pro Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser Glu Ile Glu Asp
    450                 455                 460
Ser Asp Ala Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln Arg Thr Glu Asp
465                 470                 475                 480
Arg Gly Arg Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg
                 485                 490
<210>3
<211>1473
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：2的简并多核苷酸序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(1473)
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>6，9，12，18，24，27，30，33，36，42，45
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>117，123，126，132，135，138，141，144，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>228，231，240，243，249，261，276，294，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>369，375，378，381，384，387，390，393，
<223>n＝A，T，C或G
<400>3
atggcnggnc cngarmgntg gggnccnytn ytnytntgyy tnytncargc ngcnccnggn     60
mgnccnmgny tngcnccncc ncaraaygtn acnytnytnw sncaraaytt ywsngtntay    120
ytnacntggy tnccnggnyt nggnaayccn cargaygtna cntayttygt ngcntaycar    180
wsnwsnccna cnmgnmgnmg ntggmgngar gtngargart gygcnggnac naargarytn    240
ytntgywsna tgatgtgyyt naaraarcar gayytntaya ayaarttyaa rggnmgngtn    300
mgnacngtnw snccnwsnws naarwsnccn tgggtngarw sngartayyt ngaytayytn    360
ttygargtng arccngcncc nccngtnytn gtnytnacnc aracngarga rathytnwsn    420
gcnaaygcna cntaycaryt nccnccntgy atgccnccny tnttyytnaa rtaygargtn    480
gcnttytggg gnggnggngc nggnacnaar acnytnttyc cngtnacncc ncayggncar    540
ccngtncara thacnytnca rccngcngcn wsngarcayc aytgyytnws ngcnmgnacn    600
athtayacnt tywsngtncc naartaywsn aarttywsna arccnacntg yttyytnytn    660
gargtnccng argcnaaytg ggcnttyytn gtnytnccnw snytnytnat hytnytnytn    720
gtnathgcng cnggnggngt nathtggaar acnytnatgg gnaayccntg gttycarmgn    780
gcnaaratgc cnmgngcnyt ngarytnacn mgnggngtnm gnccnacncc nmgngtnmgn   840
gcnccngcna cncarcarac nmgntggaar aargayytng cngargayga rgargargar   900
gaygargarg ayacngarga yggngtnwsn ttycarccnt ayathgarcc nccnwsntty   960
ytnggncarg arcaycargc nccnggncay wsngargcng gnggngtnga ywsnggnmgn  1020
ccnmgngcnc cnytngtncc nwsngarggn wsnwsngcnt gggaywsnws ngaymgnwsn  1080
tgggcnwsna cngtngayws nwsntgggay mgngcnggnw snwsnggnta yytngcngar  1140
aarggnccng gncarggncc nggnggngay ggncaycarg arwsnytncc nccnccngar  1200
ttywsnaarg aywsnggntt yytngargar ytnccngarg ayaayytnws nwsntgggcn  1260
acntggggna cnytnccncc ngarccnaay ytngtnccng gnggnccncc ngtnwsnytn  1320
caracnytna cnttytgytg ggarwsnwsn ccngargarg argargargc nmgngarwsn  1380
garathgarg aywsngaygc nggnwsntgg ggngcngarw snacncarmg nacngargay  1440
mgnggnmgna cnytnggnca ytayatggcn mgn                               1473
<210>4
<211>203
<212>PRT
<213>现代人
<400>4
Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu Leu Ser Gln Asn
1               5                  10                  15
Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly Asn Pro Gln Asp
20                  25                  30
Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr Arg Arg Arg Trp
35                  40                  45
Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu Leu Cys Ser Met
50                  55                  60
Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe Lys Gly Arg Val
65                  70                  75                  80
Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val Glu Ser Glu Tyr
85                  90                  95
Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro Val Leu Val Leu
100                 105                 110
Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr Tyr Gln Leu Pro
115                 120                 125
Pro Cys Met Pro Pro Leu Phe Leu Lys Tyr Glu Val Ala Phe Trp Gly
130                 135                 140
Gly Gly Ala Gly Thr Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr Pro His Gly Gln
145                 150                 155                 160
Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu His His Cys Leu
165                 170                 175
Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys Tyr Ser Lys Phe
180                 185                 190
Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro
195                 200
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>WSXWS基序
<221>VARIANT
<222>(1)...(5)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>VARIANT
<222>(1)...(5)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>VARIANT
<222>3
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>VARIANT
<222>(1)...(5)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>VARIANT
<222>(1)...(5)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>5
Trp Ser Xaa Trp Ser
1               5
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC21195
<400>6
gaggagacca taacccccga cag                                      23
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC21196
<400>7
catagctccc accacacgat ttt                     23
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC14063
<400>8
caccagacat aatagctgac agac t                  25
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC17574
<400>9
ggtrttgctc agcatgcaca c                       21
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC17600
<400>10
catgtaggcc atgaggtcca ccac                    24
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Glu-Glu肽标记物
<400>11
Glu Tyr Met Pro Met Glu
1               5
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FLAG肽标记物
<400>12
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210>13
<211>699
<212>DNA
<213>现代人
<400>13
gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag     60
ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg    120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc    180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag    240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat    300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc    360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg    420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc    480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct    540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc    600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac    660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa                           699
<210>14
<211>990
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(990)
<400>14
gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag     48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
 1               5                   10                  15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac     96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
             20                  25                  30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc    144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
         35                  40                  45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc    192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Va1 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
     50                  55                  60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc    240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
 65                  70                  75                  80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag    288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                  85                  90                  95
aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc    336
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca    384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc    432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg    480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag    528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg    576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac    624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
         195                 200                 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg    672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag    720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat    768
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac    816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc    864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac    912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
     290                 295                 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg    960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa                            990
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>15
<211>330
<212>PRT
<213>现代人
<400>15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                  10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>16
<211>321
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(321)
<400>16
act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag     48
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
 1               5                   10                  15
ttg aaa tct ggt acc gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat     96
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
             20                  25                  30
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc csa tcg    144
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
         35                  40                  45
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc    192
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
     50                  55                  60
tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa    240
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
 65                  70                  75                  80
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc    288
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
                 85                  90                  95
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag                        321
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys  *
            100                 105
<210>17
<211>106
<212>PRT
<213>现代人
<400>17
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                  10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>18
<211>1563
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1563)
<400>18
atg gcg ggg ccc gag cgc tgg ggc ccc ctg ctc ctg tgc ctg ctg cag     48
Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln
 1               5                   10                  15
gcc gct cca ggg agg ccc cgt ctg gcc cct ccc cag aat gtg acg ctg     96
Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
             20                  25                  30
ctc tcc cag aac ttc agc gtg tac ctg aca tgg ctc cca ggg ctt ggc    144
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
         35                  40                  45
aac ccc cag gat gtg acc tat ttt gtg gcc tat cag agc tct ccc acc    192
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
     50                  55                  60
cgt aga cgg tgg cgc gaa gtg gaa gag tgt gcg gga acc aag gag ctg    240
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
 65                  70                  75                  80
cta tgt tct atg atg tgc ctg aag aaa cag gac ctg tac aac aag ttc    288
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
                 85                  90                  95
aag gga cgc gtg cgg acg gtt tct ccc agc tcc aag tcc ccc tgg gtg    336
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
            100                 105                 110
gag tcc gaa tac ctg gat tac ctt ttt gaa gtg gag ccg gcc cca cct    384
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
        115                 120                 125
gtc ctg gtg ctc acc cag acg gag gag atc ctg agt gcc aat gcc acg    432
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
    130                 135                 140
tac cag ctg ccc ccc tgc atg ccc cca ctg gat ctg aag tat gag gtg    480
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
145                 150                 155                 160
gca ttc tgg aag gag ggg gcc gga aac aag acc cta ttt cca gtc act    528
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
                165                 170                 175
ccc cat ggc cag cca gtc cag atc act ctc cag cca gct gcc agc gaa    576
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
            180                 185                 190
cac cac tgc ctc agt gcc aga acc atc tac acg ttc agt gtc ccg aaa    624
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
        195                 200                 205
tac agc aag ttc tct aag ccc acc tgc ttc ttg ctg gag gtc cca gaa    672
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
    210                 215                 220
gcc aac tgg gct ttc ctg gtg ctg cca tcg ctt ctg ata ctg ctg tta    720
Ala Asn Trp Ala Phe Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
gta att gcc gca ggg ggt gtg atc tgg aag acc ctc atg ggg aac ccc     768
Val Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Trp Lys Thr Leu Met Gly Asn Pro
                245                 250                 255
tgg ttt cag cgg gca aag atg cca cgg gcc ctg gac ttt tct gga cac     816
Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg Ala Leu Asp Phe Ser Gly His
            260                 265                 270
aca cac cct gtg gca acc ttt cag ccc agc aga cca gag tcc gtg aat     864
Thr His Pro Val Ala Thr Phe Gln Pro Ser Arg Pro Glu Ser Val Asn
        275                 280                 285
gac ttg ttc ctc tgt ccc caa aag gaa ctg acc aga ggg gtc agg ccg     912
Asp Leu Phe Leu Cys Pro Gln Lys Glu Leu Thr Arg Gly Val Arg Pro
    290                 295                 300
acg cct cga gtc agg gcc cca gcc acc caa cag aca aga tgg aag aag     960
Thr Pro Arg Val Arg Ala Pro Ala Thr Gln Gln Thr Arg Trp Lys Lys
305                 310                 315                 320
gac ctt gca gag gac gaa gag gag gag gat gag gag gac aca gaa gat    1008
Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Thr Glu Asp
                325                 330                 335
ggc gtc agc ttc cag ccc tac att gaa cca cct tct ttc ctg ggg caa    1056
Gly Val Ser Phe Gln Pro Tyr Ile Glu Pro Pro Ser Phe Leu Gly Gln
            340                 345                 350
gag cac cag gct cca ggg cac tcg gag gct ggt ggg gtg gac tca ggg    1104
Glu His Gln Ala Pro Gly His Ser Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Gly
        355                 360                 365
agg ccc agg gct cct ctg gtc cca agc gaa ggc tcc tct gct tgg gat    1152
Arg Pro Arg Ala Pro Leu Val Pro Ser Glu Gly Ser Ser Ala Trp Asp
    370                 375                 380
tct tca gac aga agc tgg gcc agc act gtg gac tcc tcc tgg gac agg    1200
Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr Val Asp Ser Ser Trp Asp Arg
385                 390                 395                 400
gct ggg tcc tct ggc tat ttg gct gag aag ggg cca ggc caa ggg ccg    1248
Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Gly Pro Gly Gln Gly Pro
                405                 410                 415
ggt ggg gat ggg cac caa gaa tct ctc cca cca cct gaa ttc tcc aag    1296
Gly Gly Asp Gly His Gln Glu Ser Leu Pro Pro Pro Glu Phe Ser Lys
            420                 425                 430
gac tcg ggt ttc ctg gaa gag ctc cca gaa gat aac ctc tcc tcc tgg    1344
Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro Glu Asp Asn Leu Ser Ser Trp
        435                 440                 445
gcc acc tgg ggc acc tta cca ccg gag ccg aat ctg gtc cct ggg gga    1392
Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu Pro Asn Leu Val Pro Gly Gly
    450                 455                 460
ccc cca gtt tct ctt cag aca ctg acc ttc tgc tgg gaa agc agc cct    1440
Pro Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Thr Phe Cys Trp Glu Ser Ser Pro
465                 470                 475                 480
gag gag gaa gag gag gcg agg gaa tca gaa att gag gac agc gat gcg    1488
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser Glu Ile Glu Asp Ser Asp Ala
                485                 490                 495
ggc agc tgg ggg gct gag agc acc cag agg acc gag gac agg ggc cgg    1536
Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln Arg Thr Glu Asp Arg Gly Arg
            500                 505                 510
aca ttg ggg cat tac atg gcc agg tga                                1563
Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg*
        515                 520
<210>19
<211>520
<212>PRT
<213>现代人
<400>19
Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln
1               5                  10                  15
Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
20                  25                  30
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
35                  40                  45
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
50                  55                  60
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
65                  70                  75                  80
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
85                  90                  95
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
100                 105                 110
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
115                 120                 125
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
130                 135                 140
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
145                 150                 155                 160
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
165                 170                 175
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
180                 185                 190
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
195                 200                 205
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
210                 215                 220
Ala Asn Trp Ala Phe Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Ile Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Val Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile Trp Lys Thr Leu Met Gly Asn Pro
245                 250                 255
Trp Phe Gln Arg Ala Lys Met Pro Arg Ala Leu Asp Phe Ser Gly His
260                 265                 270
Thr His Pro Val Ala Thr Phe Gln Pro Ser Arg Pro Glu Ser Val Asn
275                 280                 285
Asp Leu Phe Leu Cys Pro Gln Lys Glu Leu Thr Arg Gly Val Arg Pro
290                 295                 300
Thr Pro Arg Val Arg Ala Pro Ala Thr Gln Gln Thr Arg Trp Lys Lys
305                 310                 315                 320
Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Thr Glu Asp
325                 330                 335
Gly Val Ser Phe Gln Pro Tyr Ile Glu Pro Pro Ser Phe Leu Gly Gln
340                 345                 350
Glu His Gln Ala Pro Gly His Ser Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Gly
355                 360                 365
Arg Pro Arg Ala Pro Leu Val Pro Ser Glu Gly Ser Ser Ala Trp Asp
370                 375                 380
Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr Val Asp Ser Ser Trp Asp Arg
385                 390                 395                 400
Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Gly Pro Gly Gln Gly Pro
405                 410                 415
Gly Gly Asp Gly His Gln Glu Ser Leu Pro Pro Pro Glu Phe Ser Lys
420                 425                 430
Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro Glu AspAsn Leu Ser Ser Trp
435                 440                 445
Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu ProAsn Leu Val Pro Gly Gly
450                 455                 460
Pro Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Thr Phe Cys Trp Glu Ser Ser Pro
465                 470                 475                 480
Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser Glu Ile Glu Asp Ser AspAla
485                 490                 495
Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln Arg Thr Glu Asp Arg GlyArg
500                 505                 510
Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg
515                 520
<210>20
<211>674
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(633)
<400>20
atg gcg ggg ccc gag cgc tgg ggc ccc ctg ctc ctg tgc ctg ctg cag     48
Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln
 1              5                   10                  15
gcc gct cca ggg agg ccc cgt ctg gcc cct ccc cag aat gtg acg ctg     96
Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
             20                  25                  30
ctc tcc cag aac ttc agc gtg tac ctg aca tgg ctc cca ggg ctt ggc    144
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
         35                  40                  45
aac ccc cag gat gtg acc tat ttt gtg gcc tat cag agc tct ccc acc    192
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
     50                  55                  60
cgt aga cgg tgg cgc gaa gtg gaa gag tgt gcg gga acc aag gag ctg    240
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
 65                  70                  75                  80
cta tgt tct atg atg tgc ctg aag aaa cag gac ctg tac aac aag ttc    288
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
                 85                  90                  95
aag gga cgc gtg cgg acg gtt tct ccc agc tcc aag tcc ccc tgg gtg    336
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
            100                 105                 110
gag tcc gaa tac ctg gat tac ctt ttt gaa gtg gag ccg gcc cca cct    384
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
        115                 120                 125
gtc ctg gtg ctc acc cag acg gag gag atc ctg agt gcc aat gcc acg    432
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
    130                 135                 140
tac cag ctg ccc ccc tgc atg ccc cca ctg gat ctg aag tat gag gtg    480
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
145                 150                 155                 160
gca ttc tgg aag gag ggg gcc gga aac aag gtg gga agc tcc ttt cot    528
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Val Gly Ser Ser Phe Pro
                165                 170                 175
gcc ccc agg cta ggc ccg ctc ctc cac ccc ttc tta ctc agg ttc ttc    576
Ala Pro Arg Leu Gly Pro Leu Leu His Pro Phe Leu Leu Arg Phe Phe
            180                 185                 190
tca ccc tcc cag cct gct cct gca ccc ctc ctc cag gaa gtc ttc cct    624
Ser Pro Ser Gln Pro Ala Pro Ala Pro Leu Leu Gln Glu Val Phe Pro
        195                 200                 205
gta cac tcc tgacttctgg cagtcagccc taataaaatc tgatcaaagt            673
Val His Ser
    210
a                                                                  674
<210>21
<211>211
<212>PRT
<213>现代人
<400>21
Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln
1               5                  10                  15
Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
20                  25                  30
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
35                  40                  45
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
50                  55                  60
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
65                  70                  75                  80
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
85                  90                  95
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
100                 105                 110
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
115                 120                 125
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
130                 135                 140
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
145                 150                 155                 160
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Val Gly Ser Ser Phe Pro
165                 170                 175
Ala Pro Arg Leu Gly Pro Leu Leu His Pro Phe Leu Leu Arg Phe Phe
180                 185                 190
Ser Pro Ser Gln Pro Ala Pro Ala Pro Leu Leu Gln Glu Val Phe Pro
195                 200                 205
Val His Ser
210
<210>22
<211>1422
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Zcytor19-Fc4融合蛋白
<221>CDS
<222>(1)...(1422)
<400>22
atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt ggc    48
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                   10                  15
gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc gag ttg aga cgc     96
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
             20                  25                  30
ttc cgt aga tcc agg ccc cgt ctg gcc cct ccc cag aat gtg acg ctg    144
Phe Arg Arg Ser Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
         35                  40                  45
ctc tcc cag aac ttc agc gtg tac ctg aca tgg ctc cca ggg ctt ggc    192
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
     50                  55                  60
aac ccc cag gat gtg acc tat ttt gtg gcc tat cag agc tct ccc acc    240
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
 65                  70                  75                  80
cgt aga cgg tgg cgc gaa gtg gaa gag tgt gcg gga acc aag gag ctg    288
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
                 85                  90                  95
cta tgt tct atg atg tgc ctg aag aaa cag gac ctg tac aac aag ttc    336
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
            100                 105                 110
aag gga cgc gtg cgg acg gtt tct ccc agc tcc aag tcc ccc tgg gtg    384
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
        115                 120                 125
gag tcc gaa tac ctg gat tac ctt ttt gaa gtg gag ccg gcc cca cct    432
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
    130                 135                 140
gtc ctg gtg ctc acc cag acg gag gag atc ctg agt gcc aat gcc acg    480
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
145                 150                 155                 160
tac cag ctg ccc ccc tgc atg ccc cca ctg gat ctg aag tat gag gtg    528
fyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
                165                 170                 175
gca ttc tgg aag gag ggg gcc gga aac aag acc cta ttt cca gtc act    576
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
            180                 185                 190
ccc cat ggc cag cca gtc cag atc act ctc cag cca gct gcc agc gaa     624
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
        195                 200                 205
cac cac tgc ctc agt gcc aga acc atc tac acg ttc agt gtc ccg aaa     672
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
    210                 215                 220
tac agc aag ttc tct aag ccc acc tgc ttc ttg ctg gag gtc cca gaa     720
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
225                 230                 235                 240
gcc aac tgg aga tct tca gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca     768
Ala Asn Trp Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
                245                 250                 255
gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa     816
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
            260                 265                 270
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg     864
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
        275                 280                 285
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac     912
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
    290                 295                 300
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag     960
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305                 310                 315                 320
cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac    1008
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                325                 330                 335
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa    1056
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            340                 345                 350
gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag    1104
Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
        355                 360                 365
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg    1152
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
    370                 375                 380
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc    1200
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385                 390                 395                 400
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac    1248
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                405                 410                 415
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc    1296
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            420                 425                 430
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc    1344
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        435                 440                 445
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag    1392
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    450                 455                 460
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa                            1422
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys  *
465                 470
<210>23
<211>473
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Zcytor19-Fc4融合蛋白
<400>23
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Ser Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
        35                  40                  45
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
    50                  55                  60
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
65                  70                  75                  80
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
                85                  90                  95
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
            100                 105                 110
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
        115                 120                 125
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
    130                 135                 140
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
                165                 170                 175
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
            180                 185                 190
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
        195                 200                 205
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
    210                 215                 220
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
225                 230                 235                 240
Ala Asn Trp Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
                245                 250                 255
Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
            260                 265                 270
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
        275                 280                 285
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
    290                 295                 300
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
305                 310                 315                 320
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                325                 330                 335
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            340                 345                 350
Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
        355                 360                 365
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
    370                 375                 380
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
385                 390                 395                 400
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                405                 410                 415
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            420                 425                 430
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        435                 440                 445
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    450                 455                 460
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC37967
<400>24
gcggatccag gccccgtctg gcccctcc                                      28
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC37972
<400>25
gcagatctcc agttggcttc tgggacctcc                                    30
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC37685
<400>26
ccagccctac attgaaccac ctt                                      23
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC37681
<400>27
cctcgcctcc tcttcctcct ca                                       22
<210>28
<211>1560
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：19的简并多核苷酸序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(1560)
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>6，9，12，18，24，27，30，33，36，42，45
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>117，123，126，132，135，138，141，144，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>228，231，240，243，249，261，276，294，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>369，375，378，381，384，387，390，393，
<223>n＝A，T，C或G
<400>28
atggcnggnc cngarmgntg gggnccnytn ytnytntgyy tnytncargc ngcnccnggn      60
mgnccnmgny tngcnccncc ncaraaygtn acnytnytnw sncaraaytt ywsngtntay     120
ytnacntggy tnccnggnyt nggnaayccn cargaygtna cntayttygt ngcntaycar     180
wsnwsnccna cnmgnmgnmg ntggmgngar gtngargart gygcnggnac naargarytn     240
ytntgywsna tgatgtgyyt naaraarcar gayytntaya ayaarttyaa rggnmgngtn     300
mgnacngtnw snccnwsnws naarwsnccn tgggtngarw sngartayyt ngaytayytn     360
ttygargtng arccngcncc nccngtnytn gtnytnacnc aracngarga rathytnwsn     420
gcnaaygcna cntaycaryt nccnccntgy atgccnccny tngayytnaa rtaygargtn     480
gcnttytgga argarggngc nggnaayaar acnytnttyc cngtnacncc ncayggncar     540
ccngtncara thacnytnca rccngcngcn wsngarcayc aytgyytnws ngcnmgnacn     600
athtayacnt tywsngtncc naartaywsn aarttywsna arccnacntg yttyytnytn     660
gargtnccng argcnaaytg ggcnttyytn gtnytnccnw snytnytnat hytnytnytn     720
gtnathgcng cnggnggngt nathtggaar acnytnatgg gnaayccntg gttycarmgn     780
gcnaaratgc cnmgngcnyt ngayttywsn ggncayacnc ayccngtngc nacnttycar     840
ccnwsnmgnc cngarwsngt naaygayytn ttyytntgyc cncaraarga rytnacnmgn     900
ggngtnmgnc cnacnccnmg ngtnmgngcn ccngcnacnc arcaracnmg ntggaaraar     960
gayytngcng argaygarga rgargargay gargargaya cngargaygg ngtnwsntty    1020
carccntaya thgarccncc nwsnttyytn ggncargarc aycargcncc nggncaywsn    1080
gargcnggng gngtngayws nggnmgnccn mgngcnccny tngtnccnws ngarggnwsn    1140
wsngcntggg aywsnwsnga ymgnwsntgg gcnwsnacng tngaywsnws ntgggaymgn    1200
gcnggnwsnw snggntayyt ngcngaraar ggnccnggnc arggnccngg nggngayggn    1260
caycargarw snytnccncc nccngartty wsnaargayw snggnttyyt ngargarytn    1320
ccngargaya ayytnwsnws ntgggcnacn tggggnacny tnccnccnga rccnaayytn    1380
gtnccnggng gnccnccngt nwsnytncar acnytnacnt tytgytggga rwsnwsnccn    1440
gargargarg argargcnmg ngarwsngar athgargayw sngaygcngg nwsntggggn    1500
gcngarwsna cncarmgnac ngargaymgn ggnmgnacny tnggncayta yatggcnmgn    1560
<210>29
<211>633
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：21的简并多核苷酸序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(633)
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>6，9，12，18，24，27，30，33，36，42，45
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>117，123，126，132，135，138，141，144，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>228，231，240，243，249，261，276，294，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>369，375，378，381，384，387，390，393，
<223>n＝A，T，C或G
<400>29
atggcnggnc cngarmgntg gggnccnytn ytnytntgyy tnytncargc ngcnccnggn     60
mgnccnmgny tngcnccncc ncaraaygtn acnytnytnw sncaraaytt ywsngtntay    120
ytnacntggy tnccnggnyt nggnaayccn cargaygtna cntayttygt ngcntaycar    180
wsnwsnccna cnmgnmgnmg ntggmgngar gtngargart gygcnggnac naargarytn    240
ytntgywsna tgatgtgyyt naaraarcar gayytntaya ayaarttyaa rggnmgngtn    300
mgnacngtnw snccnwsnws naarwsnccn tgggtngarw sngartayyt ngaytayytn    360
ttygargtng arccngcncc nccngtnytn gtnytnacnc aracngarga rathytnwsn    420
gcnaaygcna cntaycaryt nccnccntgy atgccnccny tngayytnaa rtaygargtn    480
gcnttytgga argarggngc nggnaayaar gtnggnwsnw snttyccngc nccnmgnytn    540
ggnccnytny tncayccntt yytnytnmgn ttyttywsnc cnwsncarcc ngcnccngcn    600
ccnytnytnc argargtntt yccngtncay wsn                                 633
<210>30
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39204
<400>30
tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc aggccccgtc tggcccctcc    60
ccag                                                                 64
<210>31
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39205
<400>31
tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ccagttggct tctgggacct    60
ccag                                                                 64
<210>32
<211>1922
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>MBP-人zcytoR19融合蛋白多核苷酸序列
<221>CDS
<222>(123)...(1922)
<400>32
ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca   60
caggaaacag ccagtccgtt taggtgtttt cacgagcact tcaccaacaa ggaccataga  120
tt atg aaa act gaa gaa ggt aaa ctg gta atc tgg att aac ggc gat     167
   Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp
    1               5                   10                  15
aaa ggc tat aac ggt ctc gct gaa gtc ggt aag aaa ttc gag aaa gat    215
Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp
                 20                  25                  30
acc gga att aaa gtc acc gtt gag cat ccg gat aaa ctg gaa gag aaa    263
Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys
             35                  40                  45
ttc cca cag gtt gcg gca act ggc gat ggc cct gac att atc ttc tgg    311
Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp
         50                  55                  60
gca cac gac cgc ttt ggt ggc tac gct caa tct ggc ctg ttg gct gaa    359
Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu
     65                  70                  75
atc acc ccg gac aaa gcg ttc cag gac aag ctg tat ccg ttt acc tgg    407
Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp
 80                  85                  90                  95
gat gcc gta cgt tac aac ggc aag ctg att gct tac ccg atc gct gtt    455
Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val
                100                 105                 110
gaa gcg tta tcg ctg att tat aac aaa gat ctg ctg ccg aac ccg cca    503
Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro
            115                 120                 125
aaa acc tgg gaa gag atc ccg gcg ctg gat aaa gaa ctg aaa gcg aaa    551
Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys
        130                 135                 140
ggt aag agc gcg ctg atg ttc aac ctg caa gaa ccg tac ttc acc tgg    599
Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp
    145                 150                 155
ccg ctg att gct gct gac ggg ggt tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc    647
Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly
160                 165                 170                 175
aag tac gac att aaa gac gtg ggc gtg gat aac gct ggc gcg aaa gcg    695
Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala
                180                 185                 190
ggt ctg acc ttc ctg gtt gac ctg att aaa aac aaa cac atg aat gca    743
Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala
            195                 200                 205
gac acc gat tac tcc atc gca gaa gct gcc ttt aat aaa ggc gaa aca    791
Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr
        210                 215                 220
gcg atg acc atc aac ggc ccg tgg gca tgg tcc aac atc gac acc agc    839
Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser
    225                 230                 235
aaa gtg aat tat ggt gta acg gta ctg ccg acc ttc aag ggt caa cca    887
Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro
240                 245                 250                 255
tcc aaa ccg ttc gtt ggc gtg ctg agc gca ggt att aac gcc gcc agt    935
Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser
                260                 265                 270
ccg aac aaa gag ctg gca aaa gag ttc ctc gaa aac tat ctg ctg act    983
Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr
            275                 280                 285
gat gaa ggt ctg gaa gcg gtt aat aaa gac aaa ccg ctg ggt gcc gta    1031
Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val
        290                 295                 300
gcg ctg aag tct tac gag gaa gag ttg gcg aaa gat cca cgt att gcc    1079
Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala
    305                 310                 315
gcc acc atg gaa aac gcc cag aaa ggt gaa atc atg ccg aac atc ccg    1127
Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro
320                 325                 330                 335
cag atg tcc gct ttc tgg tat gcc gtg cgt act gcg gtg atc aac gcc    1175
Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala
                340                 345                 350
gcc agc ggt cgt cag act gtc gat gaa gcc ctg aaa gac gcg cag act    1223
Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr
            355                 360                 365
aat tcg agc tcc cac cat cac cat cac cac gcg aat tcg gta ccg ctg    1271
Asn Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu
        370                 375                 380
gtt ccg cgt gga tcc agg ccc cgt ctg gcc cct ccc cag aat gtg acg    1319
Val Pro Arg Gly Ser Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr
    385                 390                 395
ctg ctc tcc cag aac ttc agc gtg tac ctg aca tgg ctc cca ggg ctt    1367
Leu Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu
400                 405                 410                 415
ggc aac ccc cag gat gtg acc tat ttt gtg gcc tat cag agc tct ccc    1415
Gly Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro
                420                 425                 430
acc cgt aga cgg tgg cgc gaa gtg gaa gag tgt gcg gga acc aag gag    1463
Thr Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu
            435                 440                 445
ctg cta tgt tct atg atg tgc ctg aag aaa cag gac ctg tac aac aag    1511
Leu Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys
        450                 455                 460
ttc aag gga cgc gtg cgg acg gtt tct ccc agc tcc aag tcc ccc tgg    1559
Phe Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp
    465                 470                 475
gtg gag tcc gaa tac ctg gat tac ctt ttt gaa gtg gag ccg gcc cca    1607
Val Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro
480                 485                 490                 495
cct gtc ctg gtg ctc acc cag acg gag gag atc ctg agt gcc aatgcc    1655
Pro Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala AsnAla
                500                 505                 510
acg tac cag ctg ccc ccc tgc atg ccc cca ctg gat ctg aag tat gag    1703
Thr Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu
            515                 520                 525
gtg gca ttc tgg aag gag ggg gcc gga aac aag acc cta ttt cca gtc    1751
Val Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Thr Leu Phe Pro Val
        530                 535                 540
act ccc cat ggc cag cca gtc cag atc act ctc cag cca gct gcc agc    1799
Thr Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser
    545                 550                 555
gaa cac cac tgc ctc agt gcc aga acc atc tac acg ttc agt gtc ccg    1847
Glu His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro
560                 565                 570                 575
aaa tac agc aag ttc tct aag ccc acc tgc ttc ttg ctg gag gtc cca    1895
Lys Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro
                580                 585                 590
gaa gcc aac tgg tgt ttt ggc gga tga                                1922
Glu Ala Asn Trp Cys Phe Gly Gly  *
            595
<210>33
<211>599
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>MBP-人zcytoR19融合蛋白多肽序列
<400>33
Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1               5                  10                  15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20                  25                  30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35                  40                  45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp GlyPro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50                  55                  60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65                  70                  75                  80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85                  90                  95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100                 105                 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115                 120                 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130                 135                 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145                 150                 155                 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165                 170                 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180                 185                 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195                 200                 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210                 215                 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225                 230                 235                 240
ValAsn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245                 250                 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260                 265                 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275                 280                 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290                 295                 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305                 310                 315                 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325                 330                 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340                 345                 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355                 360                 365
Ser Ser Ser His His His His His His Ala Asn Ser Val Pro Leu Val
370                 375                 380
Pro Arg Gly Ser Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu
385                 390                 395                 400
Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly
405                 410                 415
Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr
420                 425                 430
Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly Thr Lys Glu Leu
435                 440                 445
Leu Cys Ser Met Met Cys Leu Lys Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Lys Phe
450                 455                 460
Lys Gly Arg Val Arg Thr Val Ser Pro Ser Ser Lys Ser Pro Trp Val
465                 470                 475                 480
Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu Phe Glu Val Glu Pro Ala Pro Pro
485                 490                 495
Val Leu Val Leu Thr Gln Thr Glu Glu Ile Leu Ser Ala Asn Ala Thr
500                 505                 510
Tyr Gln Leu Pro Pro Cys Met Pro Pro Leu Asp Leu Lys Tyr Glu Val
515                 520                 525
Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly Asn Lys Thr Leu Phe Pro Val Thr
530                 535                 540
Pro His Gly Gln Pro Val Gln Ile Thr Leu Gln Pro Ala Ala Ser Glu
545                 550                 555                 560
His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr Ile Tyr Thr Phe Ser Val Pro Lys
565                 570                 575
Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr Cys Phe Leu Leu Glu Val Pro Glu
580                 585                 590
Ala Asn Trp Cys Phe Gly Gly
595
<210>34
<211>20
<212>PRT
<213>现代人
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)...(20)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>VARIANT
<222>10
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>34
Ser Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Xaa Val Thr Leu Leu Ser Gln
1               5                  10                  15
Asn Phe Ser Val             20
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40285
<400>35
gccccagcca cccaacagac aaga                                      24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40286
<400>36
ccaggtggcc caggaggaga ggtt                                      24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39128
<400>37
ggcatggaag ataatgaaag gaaa                                      24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39129
<400>38
gccgtcactc ccaactgggg atgt                                       24
<210>39
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40784
<400>39
ggatagtgtt ttgagtttct gtgga                                      25
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40785
<400>40
accaggagtt caaggttaac cttgg                                      25
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40786
<400>41
gggaattcct gcagaaactc agta                                       24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40787
<400>42
cccttcctgc tcctttgact gcgt                                      24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39408
<400>43
gcccagctgc atcttcctag aggc                                      24
<210>44
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC39409
<400>44
gggcattgcc aggacagctc ttttg                                     25
<210>45
<211>121
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>zcytor19敲除正向寡核苷酸
<400>45
cacctgccgc ccaggggcct tgcggcgggc ggcggggacc ccagggaccg aaggccatag     60
cggccggccc ctaggatccg aattctagaa gctttgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca    120
t                                                                    121
<210>46
<211>125
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>zcytor19敲除反向寡核苷酸
<400>46
ggctggtccc ctgcaagagt agcaagcgct tcttcagcat ccggacttac ggcctcgctg     60
gccggcgcgc ctaggaattc tctagaggat ccaagctttt agaaaaactc atcgagcatc    120
aaatg                                                                125
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38481
<400>47
cctccttcca gaatgccacc tc                                              22
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38626
<400>48
ctgctatgtt ctatgatgtg cctga                                           25
<210>49
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38706
<400>49
ggaagataat gaaaggaaac cc                                      22
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC38711
<400>50
tatgaggagt cccctgtgct g                                       21
<210>51
<211>618
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(618)
<400>51
atg act ggg gac tgc acg cca gtg ctg gtg ctg atg gcc gca gtg ctg   48
Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Val Leu Val Leu Met Ala Ala Val Leu
 1               5                   10                  15
acc gtg act gga gca gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct ctc ccg   96
Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro
             20                  25                  30
gat gca agg ggc tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct cca cag  144
Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln
         35                  40                  45
gag ctg cag gcc ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag tcg ctt  192
Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu
     50                  55                  60
ctg ctg aag gac tgc agg tgc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg  240
Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp
 65                  70                  75                  80
gac ctg agg cag ctg cag gtg agg gag cgc ccc atg gct ttg gag gct  288
Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala
                 85                  90                  95
gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac  336
Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp
            100                 105                 110
cca gcc ctg gtg gac gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat  384
Pro Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His
        115                 120                 125
atc ctc tcc cag ttc cgg gcc tgt gtg agt cgt cag ggc ctg ggc acc  432
Ile Leu Ser Gln Phe Arg Ala Cys Val Ser Arg Gln Gly Leu Gly Thr
    130                 135                 140
cag atc cag cct cag ccc acg gca ggg ccc agg acc cgg ggc cgc ctc  480
Gln Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu
145                 150                 155                 160
cac cat tgg ctg tac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag tcc cct  528
His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro
                165                 170                 175
ggc tgc ctc gag gcc tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg  576
Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr
            180                 185                 190
cga gac ctg aat tgt gtt gcc agt ggg gac ctg tgt gtc tga          618
Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val  *
        195                 200                 205
<210>52
<211>205
<212>PRT
<213>现代人
<400>52
Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Val Leu Val Leu Met Ala Ala Val Leu
 1               5                  10                  15
Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln
        35                  40                  45
Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu
    50                  55                  60
Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp
65                  70                  75                  80
Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala
                85                  90                  95
Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Leu Val Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His
        115                 120                 125
Ile Leu Ser GlnPhe Arg Ala Cys Val Ser Arg Gln Gly Leu Gly Thr
    130                 135                 140
Gln Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu
145                 150                 155                 160
His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro
                165                 170                 175
Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr
            180                 185                 190
Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val
        195                 200                 205
<210>53
<211>615
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(615)
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>6，9，18，21，24，27，30，33，39，42，45
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>105，108，120，132，135，138，141，150，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>237，246，249，255，261，264，270，273，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>342，345，348，354，357，366，369，375，
<223>n＝A，T，C或G
<400>53
atgacnggng aytgyacncc ngtnytngtn ytnatggcng cngtnytnac ngtnacnggn  60
gcngtnccng tngcnmgnyt ncayggngcn ytnccngayg cnmgnggntg ycayathgcn 120
carttyaarw snytnwsncc ncargarytn cargcnttya armgngcnaa rgaygcnytn 180
gargarwsny tnytnytnaa rgaytgymgn tgycaywsnm gnytnttycc nmgnacntgg 240
gayytnmgnc arytncargt nmgngarmgn ccnatggcny tngargcnga rytngcnytn 300
acnytnaarg tnytngargc nacngcngay acngayccng cnytngtnga ygtnytngay 360
carccnytnc ayacnytnca ycayathytn wsncarttym gngcntgygt nwsnmgncar 420
ggnytnggna cncarathca rccncarccn acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn 480
caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar 540
gcnwsngtna cnttyaayyt nttymgnytn ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn 600
ggngayytnt gygtn                                                  615
<210>54
<211>603
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(603)
<400>54
atg gct gca gct tgg acc gtg gtg ctg gtg act ttg gtg cta ggc ttg   48
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                   10                  15
gcc gtg gca ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag   96
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
             20                  25                  30
ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg  144
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
         35                  40                  45
agc ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa  192
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
     50                  55                  60
aac tgg agt tgc agc tct cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg  240
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
 65                  70                  75                  80
ctt ctc cag gtg agg gag cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc  288
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                 85                  90                  95
ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac  336
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac atc ctc tcc cag ctc  384
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
cag gcc tgt atc cag cct cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc  432
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
cgc ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag  480
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
tcc gct ggc tgc ctg gag gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc  528
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg gac ctg tgt ctg aga  576
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
acg tca acc cac cct gag tcc acc tga                              603
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr  *
         195                200
<210>55
<211>200
<212>PRT
<213>现代人
<400>55
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                85                  90                  95
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr
        195                 200
<210>56
<211>615
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(615)
<400>56
atg acc ggg gac tgc atg cca gtg ctg gtg ctg atg gcc gca gtg ctg  48
Met Thr Gly Asp Cys Met Pro Val Leu Val Leu Met Ala Ala Val Leu
 1               5                   10                  15
acc gtg act gga gca gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg  96
Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro
             20                  25                  30
gat gca agg ggc tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct cca cag    144
Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln
         35                  40                  45
gag ctg cag gcc ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag tcg ctt    192
Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu
     50                  55                  60
ctg ctg aag gac tgc aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg    240
Leu Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp
 65                  70                  75                  80
gac ctg agg cag ctg cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct    288
Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala
                  85                  90                  95
gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac    336
Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp
            100                 105                 110
cca gcc ctg ggg gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat    384
Pro Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His
        115                 120                 125
atc ctc tcc cag ctc cgg gcc tgt gtg agt cgt cag ggc ccg ggc acc    432
Ile Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Val Ser Arg Gln Gly Pro Gly Thr
    130                 135                 140
cag atc cag cct cag ccc acg gca ggg ccc agg acc cgg ggc cgc ctc    480
Gln Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu
145                 150                 155                 160
cac cat tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag tcc cct    528
His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro
                165                 170                 175
ggc tgc ctc gag gcc tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg    576
Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr
            180                 185                 190
cga gac ctg aat tgt gtt gcc agc ggg gac ctg tgt gtc                615
Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val
        195                 200                 205
<210>57
<211>205
<212>PRT
<213>现代人
<400>57
Met Thr Gly Asp Cys Met Pro Val Leu Val Leu Met Ala Ala Val Leu
 1               5                  10                  15
Thr Val Thr Gly Ala Val Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln
        35                  40                  45
Glu Leu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu
    50                  55                  60
Leu Leu Lys Asp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp
65                  70                  75                  80
Asp Leu Arg Gln Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala
                85                  90                  95
Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp
            100                 105                 110
Pro Ala Leu Gly Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His
        115                 120                 125
Ile Leu Ser Gln Leu Arg Ala Cys Val Ser Arg Gln Gly Pro Gly Thr
    130                 135                 140
Gln Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu
145                 150                 155                 160
His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro
                165                 170                 175
Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Ash Leu Phe Arg Leu Leu Thr
            180                 185                 190
Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val
        195                 200                 205
<210>58
<211>615
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(615)
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>6，9，21，24，27，30，33，39，42，45，48
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>105，108，120，132，135，138，141，150，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>237，246，249，255，261，264，270，273，
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>339，342，345，348，354，357，366，369，
<223>n＝A，T，C或G
<400>58
atgacnggng aytgyatgcc ngtnytngtn ytnatggcng cngtnytnac ngtnacnggn  60
gcngtnccng tngcnmgnyt nmgnggngcn ytnccngayg cnmgnggntg ycayathgcn 120
carttyaarw snytnwsncc ncargarytn cargcnttya armgngcnaa rgaygcnytn 180
gargarwsny tnytnytnaa rgaytgyaar tgymgnwsnm gnytnttycc nmgnacntgg 240
gayytnmgnc arytncargt nmgngarmgn ccngtngcny tngargcnga rytngcnytn 300
acnytnaarg tnytngargc nacngcngay acngayccng cnytnggnga ygtnytngay 360
carccnytnc ayacnytnca ycayathytn wsncarytnm gngcntgygt nwsnmgncar 420
ggnccnggna cncarathca rccncarccn acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn 480
caycaytggy tncaymgnyt ncargargcn ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar 540
gcnwsngtna cnttyaayyt nttymgnytn ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn 600
ggngayytnt gygtn                                                  615
<210>59
<211>633
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(22)...(630)
<400>59
tcacagaccc cggagagcaa c atg aag cca gaa aca gct ggg ggc cac atg  51
                        Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met
                         1               5                   10
ctc ctc ctg ctg ttg cct ctg ctg ctg gcc gca gtg ctg aca aga acc     99
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Thr Arg Thr
                 15                  20                  25
caa gct gac cct gtc ccc agg gcc acc agg ctc cca gtg gaa gca aag    147
Gln Ala Asp Pro Val Pro Arg Ala Thr Arg Leu Pro Val Glu Ala Lys
             30                  35                  40
gat tgc cac att gct cag ttc aag tct ctg tcc cca aaa gag ctg cag    195
Asp Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gln
         45                  50                  55
gcc ttc aaa aag gcc aag gat gcc atc gag aag agg ctg ctt gag aag    243
Ala Phe Lys Lys Ala Lys Asp Ala Ile Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys
     60                  65                  70
gac ctg agg tgc agt tcc cac ctc ttc ccc agg gcc tgg gac ctg aag    291
Asp Leu Arg Cys Ser Ser His Leu Phe Pro Arg Ala Trp Asp Leu Lys
 75                  80                  85                 90
cag ctg cag gtc caa gag cgc ccc aag gcc ttg cag gct gag gtg gcc    339
Gln Leu Gln Val Gln Glu Arg Pro Lys Ala Leu Gln Ala Glu Val Ala
                 95                 100                 105
ctg acc ctg aag gtc tgg gag aac atg act gac tca gcc ctg gcc acc    387
Leu Thr Leu Lys Val Trp Glu Asn Met Thr Asp Ser Ala Leu Ala Thr
            110                 115                 120
atc ctg ggc cag cct ctt cat aca ctg agc cac att cac tcc cag ctg    435
Ile Leu Gly Gln Pro Leu His Thr Leu Ser His Ile His Ser Gln Leu
        125                 130                 135
cag acc tgt aca cag ctt cag gcc aca gca gag ccc agg tcc ccg agc    483
Gln Thr Cys Thr Gln Leu Gln Ala Thr Ala Glu Pro Arg Ser Pro Ser
    140                 145                 150
cgc cgc ctc tcc cgc tgg ctg cac agg ctc cag gag gcc cag agc aag    531
Arg Arg Leu Ser Arg Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ser Lys
155                 160                 165                 170
gag acc cct ggc tgc ctg gag gcc tct gtc acc tcc aac ctg ttt cgc    579
Glu Thr Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Ser Asn Leu Phe Arg
                175                 180                 185
ctg ctc acc cgg gac ctc aag tgt gtg gcc aat gga gac cag tgt gtc  627
Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Cys Val Ala Asn Gly Asp Gln Cys Val
            190                 195                 200
tga cct                                                          633
<210>60
<211>202
<212>PRT
<213>现代人
<400>60
Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Thr Arg Thr Gln Ala Asp Pro Val Pro
            20                  25                  30
Arg Ala Thr Arg Leu Pro Val Glu Ala Lys Asp Cys His Ile Ala Gln
        35                  40                  45
Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gln Ala Phe Lys Lys Ala Lys
    50                  55                  60
Asp Ala Ile Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys Asp Leu Arg Cys Ser Ser
65                  70                  75                  80
His Leu Phe Pro Arg Ala Trp Asp Leu Lys Gln Leu Gln Val Gln Glu
                85                  90                  95
Arg Pro Lys Ala Leu Gln Ala Glu Val Ala Leu Thr Leu Lys Val Trp
            100                 105                 110
Glu Asn Met Thr Asp Ser Ala Leu Ala Thr Ile Leu Gly Gln Pro Leu
        115                 120                 125
His Thr Leu Ser His Ile His Ser Gln Leu Gln Thr Cys Thr Gln Leu
    130                 135                 140
Gln Ala Thr Ala Glu Pro Arg Ser Pro Ser Arg Arg Leu Ser Arg Trp
145                 150                 155                 160
Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ser Lys Glu Thr Pro Gly Cys Leu
                165                 170                 175
Glu Ala Ser Val Thr Ser Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu
            180                 185                 190
Lys Cys Val Ala Asn Gly Asp Gln Cys Val
        195                 200
<210>61
<211>632
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(22)...(630)
<400>61
tcacagaccc cggagagcaa c atg aag cca gaa aca gct ggg ggc cac atg   51
                        Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met
                         1               5                   10
ctc ctc ctg ctg ttg cct ctg ctg ctg gcc gca gtg ctg aca aga acc   99
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Thr Arg Thr
                 15                  20                  25
caa gct gac cct gtc ccc agg gcc acc agg ctc cca gtg gaa gca aag  147
Gln Ala Asp Pro Val Pro Arg Ala Thr Arg Leu Pro Val Glu Ala Lys
             30                  35                  40
gat tgc cac att gct cag ttc aag tct ctg tcc cca aaa gag ctg cag  195
Asp Cys His Ile Ala Gln Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gln
         45                  50                  55
gcc ttc aaa aag gcc aag ggt gcc atc gag aag agg ctg ctt gag aag  243
Ala Phe Lys Lys Ala Lys Gly Ala Ile Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys
     60                  65                  70
gac atg agg tgc agt tcc cac ctc atc tcc agg gcc tgg gac ctg aag  291
Asp Met Arg Cys Ser Ser His Leu Ile Ser Arg Ala Trp Asp Leu Lys
 75                  80                  85                  90
cag ctg cag gtc caa gag cgc ccc aag gcc ttg cag gct gag gtg gcc  339
Gln Leu Gln Val Gln Glu Arg Pro Lys Ala Leu Gln Ala Glu Val Ala
                 95                 100                 105
ctg acc ctg aag gtc tgg gag aac ata aat gac tca gcc ctg acc acc  387
Leu Thr Leu Lys Val Trp Glu Asn Ile Asn Asp Ser Ala Leu Thr Thr
            110                 115                 120
atc ctg ggc cag cct ctt cat aca ctg agc cac att cac tcc cag ctg  435
Ile Leu Gly Gln Pro Leu His Thr Leu Ser His Ile His Ser Gln Leu
        125                 130                 135
cag acc tgt aca cag ctt cag gcc aca gca gag ccc aag ccc ccg agt    483
Gln Thr Cys Thr Gln Leu Gln Ala Thr Ala Glu Pro Lys Pro Pro Ser
    140                 145                 150
cgc cgc ctc tcc cgc tgg ctg cac agg ctc cag gag gcc cag agc aag    531
Arg Arg Leu Ser Arg Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ser Lys
155                 160                 165                 170
gag act cct ggc tgc ctg gag gac tct gtc acc tcc aac ctg ttt caa    579
Glu Thr Pro Gly Cys Leu Glu Asp Ser Val Thr Ser Asn Leu Phe Gln
                175                 180                 185
ctg ctc ctc cgg gac ctc aag tgt gtg gcc agt gga gac cag tgt gtc    627
Leu Leu Leu Arg Asp Leu Lys Cys Val Ala Ser Gly Asp Gln Cys Val
            190                 195                 200
tga cc                                                             632
 *
<210>62
<211>202
<212>PRT
<213>现代人
<400>62
Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Thr Arg Thr Gln Ala Asp Pro Val Pro
            20                  25                  30
Arg Ala Thr Arg Leu Pro Val Glu Ala Lys Asp Cys His Ile Ala Gln
        35                  40                  45
Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gln Ala Phe Lys Lys Ala Lys
    50                  55                  60
Gly Ala Ile Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys Asp Met Arg Cys Ser Ser
65                  70                  75                  80
His Leu Ile Ser Arg Ala Trp Asp Leu Lys Gln Leu Gln Val Gln Glu
                85                  90                  95
Arg Pro Lys Ala Leu Gln Ala Glu Val Ala Leu Thr Leu Lys Val Trp
            100                 105                 110
Glu Asn Ile Asn Asp Ser Ala Leu Thr Thr Ile Leu Gly Gln Pro Leu
        115                 120                 125
His Thr Leu Ser His Ile His Ser Gln Leu Gln Thr Cys Thr Gln Leu
    130                 135                 140
Gln Ala Thr Ala Glu Pro Lys Pro Pro Ser Arg Arg Leu Ser Arg Trp
145                 150                 155                 160
Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ser Lys Glu Thr Pro Gly Cys Leu
                165                 170                 175
Glu Asp Ser Val Thr Ser Asn Leu Phe Gln Leu Leu Leu Arg Asp Leu
            180                 185                 190
Lys Cys Val Ala Ser Gly Asp Gln Cys Val
        195                 200
<210>63
<211>1013
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(14)...(991)
<400>63
ccagcgtccg tcc atg gcg tgg agc ctt ggg agc tgg ctg ggt ggc tgc    49
               Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys
                1               5                   10
ctg ctg gtg tca gca ttg gga atg gta cca cct ccc gaa aat gtc aga   97
Leu Leu Val Ser Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg
         15                  20                  25
atg aat tct gtt aat ttc aag aac att cta cag tgg gag tca cct gct  145
Met Asn Ser Val Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala
     30                  35                  40
ttt gcc aaa ggg aac ctg act ttc aca gct cag tac cta agt tat agg  193
Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg
 45                  50                  55                  60
ata ttc caa gat aaa tgc atg aat act acc ttg acg gaa tgt gat ttc  241
Ile Phe Gln Asp Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe
                 65                  70                  75
tca agt ctt tcc aag tat ggt gac cac acc ttg aga gtc agg gct gaa  289
Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu
             80                  85                  90
ttt gca gat gag cat tca gac tgg gta aac atc acc ttc tgt cct gtg  337
Phe Ala Asp Glu His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val
         95                 100                 105
gat gac acc att att gga ccc cct gga atg caa gta gaa gta ctt gct    385
Asp Asp Thr Ile Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala
    110                 115                 120
gat tct tta cat atg cgt ttc tta gcc cct aaa att gag aat gaa tac    433
Asp Ser Leu His Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr
125                 130                 135                 140
gaa act tgg act atg aag aat gtg tat aac tca tgg act tat aat gtg    481
Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val
                145                 150                 155
caa tac tgg aaa aac ggt act gat gaa aag ttt caa att act ccc cag    529
Gln Tyr Trp Lys Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln
            160                 165                 170
tat gac ttt gag gtc ctc aga aac ctg gag cca tgg aca act tat tgt    577
Tyr Asp Phe Glu Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys
        175                 180                 185
gtt caa gtt cga ggg ttt ctt cct gat cgg aac aaa gct ggg gaa tgg    625
Val Gln Val Arg Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp
    190                 195                 200
agt gag cct gtc tgt gag caa aca acc cat gac gaa acg gtc ccc tcc    673
Ser Glu Pro Val Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser
205                 210                 215                 220
tgg atg gtg gcc gtc atc ctc atg gcc tcg gtc ttc atg gtc tgc ctg    721
Trp Met Val Ala Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu
                225                 230                 235
gca ctc ctc ggc tgc ttc tcc ttg ctg tgg tgc gtt tac aag aag aca    769
Ala Leu Leu Gly Cys Phe Ser Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr
            240                 245                 250
aag tac gcc ttc tcc cct agg aat tct ctt cca cag cac ctg aaa gag    817
Lys Tyr Ala Phe Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu
        255                 260                 265
ttt ttg ggc cat cct cat cat aac aca ctt ctg ttt ttc tcc ttt cca   865
Phe Leu Gly His Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro
    270                 275                 280
ttg tcg gat gag aat gat gtt ttt gac aag cta agt gtc att gca gaa   913
Leu Ser Asp Glu Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu
285                 290                 295                 300
gac tct gag agc ggc aag cag aat cct ggt gac agc tgc agc ctc ggg   961
Asp Ser Glu Ser Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly
                305                 310                 315
acc ccg cct ggg cag ggg ccc caa agc tag gctctgagaa ggaaacacac    1011
Thr Pro Pro Gly Gln Gly Pro Gln Ser  *
            320                 325
tc                                                               1013
<210>64
<211>325
<212>PRT
<213>现代人
<400>64
Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser
 1               5                  10                  15
Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val
            20                  25                  30
Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly
        35                  40                  45
Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp
    50                  55                  60
Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu
                85                  90                  95
His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile
            100                 105                 110
Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His
        115                 120                 125
Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr
    130                 135                 140
Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys
145                 150                 155                 160
Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu
                165                 170                 175
Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg
            180                 185                 190
Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val
        195                 200                 205
Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala
    210                 215                 220
Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Cys Phe Ser Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe
                245                 250                 255
Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His
            260                 265                 270
Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu
        275                 280                 285
Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser
    290                 295                 300
Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly
305                 310                 315                 320
Gln Gly Pro Gln Ser
                325
<210>65
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC19372
<400>65
tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc                     40
<210>66
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC19351
<400>66
acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60
<210>67
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC19352
<400>67
actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 60
<210>68
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC39319
<400>68
atcggaattc gcagaagcca tggcgtggag ccttggg                          37
<210>69
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC39325
<400>69
cagtggatcc ggaggggacc gtttcgtc                                    28

Claims (12)

1.一种检测样品中的配体的体外方法，其中所述的配体包含选自下列的多肽：
(a)SEQ ID NO：52的氨基酸残基22-205；
(b)SEQ ID NO：55的氨基酸残基20-200；
(c)SEQ ID NO：57的氨基酸残基22-205；
(d)SEQ ID NO：60的氨基酸残基；和
(e)SEQ ID NO：62的氨基酸残基29-202；
其中所述的方法包括：
使所述的样品与异二聚受体接触，其中所述的受体包含第一受体多肽和第二受体多肽；
其中所述的第一受体多肽包含与下列氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸残基的序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸21-223；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸21-226；
(iii)SEQ I D NO：19的氨基酸21-223；或
(iv)SEQ ID NO：19的氨基酸21-226；
并且其中所述的第二受体包含CRF2-4的胞外结构域；
并且其中所述的异二聚受体结合所述的配体；并且
检测所述的配体与所述的异二聚受体的结合。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的第一受体多肽选自：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸21-223；
(ii)SEQ ID NO：2的氨基酸21-226；
(iii)SEQ ID NO：19的氨基酸21-223；或
(iv)SEQ ID NO：19的氨基酸21-226。
3.根据前面任一项权利要求的方法，其中所述的第一受体多肽与IgGγ1的重链融合。
4.根据前面任一项权利要求的方法，其中所述的第二受体多肽与人κ轻链融合。
5.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述的第一受体多肽还包含与下列氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸残基的序列：
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸227-491；或
(ii)SEQ ID NO：19的氨基酸227-520。
6.根据前面任一项权利要求的方法，其中所述的配体是被标记的，并且通过检测所述的标记来检测所述配体的结合。
7.根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述的受体是被标记的，并且通过检测所述的标记来检测所述配体的结合。
8.根据权利要求1-5任一项的方法，其中通过检测所述配体的活性来检测所述配体的结合，其中所述的活性选自增殖活性、抗病毒活性或模拟与启动子元件连接的报告基因的表达，所述的元件能接纳与所述的受体连接的胞内途径。
9.根据前面任一项权利要求的方法，其中检测所述的配体指示选自癌症和自身免疫病症的病理状况。
10.根据前面任一项权利要求的方法，还包括从所述的样品分离所述的配体。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的受体固定化于固体支持物上。
12.一种拮抗配体活性的体外方法，其中所述的配体包含选自下列的多肽：
(a)SEQ ID NO：52的氨基酸残基22-205；
(b)SEQ ID NO：55的氨基酸残基20-200；
(c)22-205SEQ ID NO：57的氨基酸残基；
(d)SEQ ID NO：60的氨基酸残基29-202；和
(e)SEQ ID NO：62的氨基酸残基29-202；
其中所述的方法包括使所述的配体与可溶性异二聚受体接触，所述的受体包含第一受体多肽和第二受体多肽；并且
其中所述的第一受体多肽包含与下列氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸残基的序列：
(i)氨基酸21-223of SEQ ID NO：2；
(ii)氨基酸21-226of SEQ I D NO：2；
(iii)氨基酸21-223of SEQ ID NO：19；
(iv)氨基酸21-226of SEQ ID NO：19；
(v)氨基酸21-163of SEQ ID NO：21；
并且其中所述的第二受体多肽包含CRF2-4的胞外结构域；
其中所述的异二聚受体多肽结合所述的配体；
并且其中所述的活性选自增殖活性和抗病毒活。
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