CN100448993C - 干扰素样蛋白质Zcyto21 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与干扰素α在氨基酸序列水平上最紧密相关的干扰素样蛋白质Zcyto21的多核苷酸和多肽分子。本发明还包括Zcyto21多肽的抗体，和使用这些多核苷酸和多肽的方法。

Description

干扰素样蛋白质Zcyto21
发明背景
多细胞生物的细胞分化由激素和多肽生长因子控制。这些可扩散的分子使得细胞能够彼此交流并彼此相呼应地行动以形成组织和器官、以及修复和再生损坏的组织。激素和生长因子的实例包括尤其是类固醇激素、甲状旁腺激素、促滤泡激素、干扰素、白细胞介素、血小板来源的生长因子、表皮生长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
激素和生长因子通过和受体蛋白结合影响细胞代谢。某些受体是膜内在蛋白质，它们在细胞外与激素或生长因子结合，并在细胞内与信号转导途径，如第二信使系统连接。其它类型的受体是可溶性细胞内分子。
细胞因子一般刺激造血细胞谱系细胞的增殖或分化，或参与机体的免疫和炎症应答机制。影响血细胞生成的细胞因子的实例有刺激红细胞发育的红细胞生成素(EPO)；刺激巨核细胞谱系的细胞发育的血小板生成素(TPO)；和刺激中性粒细胞发育的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这些细胞因子可用于恢复贫血症、血小板减少症及中性粒细胞减少症患者或接受癌症化疗的患者的正常血细胞水平。细胞因子在调节血细胞生成和免疫应答中有重要作用，并可以影响淋巴细胞的发育。
人II类细胞因子家族包括干扰素-α(IFN-α)亚型、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-10、IL-19(美国专利5,985,614)、MDA-7(Jiang等，Oncogene 11，2477-2486，(1995))、IL-20(Jiang等，Oncogene 11，2477-2486，(1995))、IL-22(Xie等，J.Biol.Chem.275，31335-31339，(2000))和AK-155(Knappe等，J.Virol.74，3881-3887(2000))。大多数细胞因子通过与I类或II类细胞因子受体结合和转导信号。人II类细胞因子受体家族的成员包括干扰素-αR1(IFN-αR1)、干扰素-γ-R2(IFN-γ-R2)、干扰素-γR1(IFN-γR1)、干扰素-γR2(IFN-γR2)、IL-10R(Liu等，J.Immunol.152，1821-1829，(1994))、CRF2-4(Lutfalla等，Genomics 16，366-373，(1993))、IL-20Rβ(Blumberg等，Cell，104，9-19，(2001))(又称作zcytor7(美国专利5,945,511)和CRF2-8(Kotenko等，Oncogene 19，2557-2565，(200))、IL-20Rβ(Blumberg等，同上，(2001))(又称作DIRS1(PCT WO 99/46379))、IL-22RA1(IL-22受体α1，提交给HUGO要求批准)(又称作IL-22R(Xie等，J.Biol.Chem.275，31335-31339，(2000))、zcytor11(美国专利5,965,704)和CRF2-9(Kotenko等，Oncogene，19，2557-2565，(2000))及组织因子。
II类细胞因子受体典型地是异二聚体，由两个不同的受体链，即α和β受体亚基组成(Stahl等，Cell，74，587-590，(1993))。一般地，α亚基是主要的细胞因子结合蛋白，而β亚基是形成高亲和结合位点以及进行信号转导所必需的。IL-20受体是一个例外，其中的两个亚基均是IL-20结合所必需的(Blumberg等，同上(2001))。
II类细胞因子受体可以通过受体的细胞外部分中大约200个氨基酸(D200)的保守细胞因子结合域来鉴定。该细胞因子结合域由两个III型纤连蛋白(FnIII)域(各大约有100个氨基酸)组成(Bazan J.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6934-6938(1990)；Thoreau等，FEBSLett.282，16-31(1991))。每个FnIII域都含有保守的Cys、Pro和Trp残基，这些残基决定了7个β链的特征性折叠方式，其类似于免疫球蛋白的恒定区(Uze等，J.Interferon Cytokin Res.15，3-26(1995))。II类细胞因子受体家族的保守结构元件使得可以基于一级氨基酸序列同源性鉴定该家族的新成员。使用该方法，先前我们已经成功地鉴定到两个II类细胞因子受体家族新成员，zcytor7(美国专利5,945,511)(又称作IL-22Rα(Blumberg等，同上(2001))和zcytor11(美国专利5,965,704)(又称作IL-22R(Blumberg等，同上(2001))。由于细胞因子在生物学应答的调节中的重要作用，因此鉴定II类细胞因子受体家族的其它新成员是有意义的。
IL-22，又称作IL-TIF(IL-10相关的T细胞来源的可诱导因子)(Dumout ier等，J.Immunology 164，1814-1819，(2000))，是新近描述的IL-10同系物。小鼠的IL-22最初被鉴定为在体外T细胞和肥大细胞中IL-9诱导的基因(Dumoutier等，J.Immunology，164，1814-1819，(2000))。注射IL-22后在小鼠肝中观察到急性期反应物诱导活性，并且在注射脂多糖(LPS)后快速诱导了IL-22的表达，这提示IL-22参与体内的炎症应答(Dumoutier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，10144-10149(2000))。
白细胞介素是介导免疫学应答(包括炎症)的细胞因子家族。白细胞介素介导多种炎性病理。T细胞是免疫应答的中枢，其产生许多细胞因子和针对抗原的获得性免疫。T细胞产生的细胞因子被划分为1型和2型(Kelso，A.，Immun.Cell Biol.76：300-317，1998)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α，其参与炎症应答、病毒免疫、细胞内寄生物免疫和同种异体移植排斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，其参与体液应答、蠕虫免疫和过敏反应。1型和2型共有的细胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-α。有一些证据提示产生1型和2型的T细胞群体偏好向不同类型的发炎组织中迁移。
从治疗的角度出发，干扰素尤其有意义(关于干扰素的综述见DeMaeyer和De Maeyer-Guignard，“干扰素”，《细胞因子手册》(TheCytokine Handbook)，第3版，Thompson(编)，第491-516页(Academic Press Ltd.1998)和Walsh，Biopharmaceuticals：Biochemistry and Biotechnology，第158-188页(John Wiley & Sons1998))。干扰素显示出多种生物学活性，可用于治疗某些自身免疫疾病(尤其是癌症)和增强对感染剂(包括病毒、细菌、真菌和原生生物)的免疫应答。迄今，已经鉴定到6种形式的干扰素，它们分为两个大组。所谓的“I型”干扰素包括干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素δ、干扰素τ。目前，干扰素γ和干扰素α的一个亚类是仅有的II型干扰素。
I型干扰素被认为来源于相同的祖先基因，保留了充分相似的结构以致可以通过相同的细胞表面受体起作用。人干扰素α/β受体的α链包含N端细胞外域，其具有I I类细胞因子受体的特征。干扰素γ与I型干扰素或II型干扰素α亚型没有显著的同源性，但与I型干扰素有许多相同的生物学活性。
对于人而言，至少有16个非等位基因编码不同亚型的干扰素α，而干扰素β和ω仅由单个基因编码。I型干扰素基因成簇排列在9号染色体的短臂中。与人类的典型结构基因不同，干扰素α、干扰素β和干扰素ω缺少内含子。编码人干扰素γ的单个基因位于第12号染色体上并含有3个内含子。迄今，干扰素τ仅在牛和绵羊中有过描述，而干扰素δ仅在猪中有过描述。
临床医师借助干扰素的多种活性利用该蛋白治疗多种疾病。例如，一种形式的干扰素α已被50多个国家批准用于治疗医学疾病，如多毛细胞白血病、肾细胞癌、基层细胞癌、恶性黑素瘤、AIDS相关的卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、喉乳头状瘤、蕈样肉芽肿病、尖锐湿疣、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、慢性非甲非乙/丙型肝炎。美国药品和食品管理局已经批准使用干扰素β治疗多发性硬化、神经系统的慢性疾病。干扰素γ被用于治疗慢性肉芽肿性疾病，干扰素在其中增强患者的免疫应答以破坏感染性细菌、真菌和原生生物病原体。临床研究还指出，干扰素γ可以用于治疗AIDS、利什曼病和瘤型麻风。
已证实的细胞因子家族的体内活性说明其它细胞因子、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂的巨大临床潜力和需求。本发明通过提供刺激造血细胞谱系的细胞的新细胞因子以及相关的组合物和方法来满足这些需求。
附图简述
附图是SEQ ID NO：2所示ZZcyto21蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性分布图。该分布图以滑动的6残基窗为基础。忽略隐蔽的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基。这些残基在图中通过小写字母表示。
发明详述
在详细阐述本发明之前，定义如下术语可能有助于本发明的理解。
术语“亲和标签”在本文中用于指可以和第二多肽结合以便于该第二多肽的纯化或检测或为第二多肽和底物的结合提供位点的多肽片断。原则上，可以获得其抗体或其它特异性结合剂的任何肽或蛋白质均可以用作亲和标签。亲和标签包括多聚组氨酸序列段、A蛋白(Nilsson等，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等，Methods Enzymol.198：3，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson等，Gene 67：31，1988)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952-4，1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等，Biotechnology6；1204-10，1988)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原性表位或结合域。一般参见Ford等，Protein Expression and Purification 2：95-107，1991。编码亲和标签的DNA可从供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)处获得。
术语“等位变体”在本文中用于指占据相同的染色体座位的两个或多个不同基因形式中的任一个。等位变异可以通过突变自然产生，并可以在群体内导致表型多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有改变)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体在本文中也用于指由等位基因变体编码的蛋白质。
术语“氨基端”和“羧基端”在本文中用于指多肽内的位置。在上下文允许的情况下，参考多肽的特定序列或部分，这些术语用于指邻近或相对的位置。例如，在一个多肽中位于参考序列羧基端的某个序列指该序列位于该参考序列的羧基端近侧的位置，但不一定位于完整多肽的羧基端。
术语“互补物/反互补物对”是指不相同的部分，这些部分在适当的条件下将形成通过非共价方式连接的稳定对。例如，生物素和亲和素(或链霉亲和素)是互补物/反互补物对的典型成员。互补物/反互补物对的其它实例包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等。当期望随后使互补物/反互补物对解离时，优选该互补物/反互补物对具有小于109M-1的结合亲和力。
术语“多核苷酸分子的互补分子”是指与参考序列相比具有互补碱基序列并取向相反的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。
术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(例如，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“表达载体”用于指包含编码目的多肽的区段的线性或环状DNA分子，其中所述的多肽编码区段在该DNA分子中与帮助其转录的其它区段可操作地连接。这些其它区段包括启动子和终止序列，并还可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。
术语“分离的”当应用于多核苷酸时是指该多核苷酸已经离开其天然遗传环境并因此不含有其它无关或不需要的编码序列，而且它以适合在遗传工程化蛋白质制备系统中使用的形式存在。该分离的分子是从其天然环境中被分离出来的那些分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含有原来与之相连接的其它基因，但可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。相连区域的鉴定对于本领域普通技术人员而言是明显的(参见例如，Dynan和Tijan，Nature 316：774-78，1985)。
“分离的”多肽或蛋白质是在非其天然环境的条件下，例如离开血液和动物组织存在的多肽或蛋白质。在优选形式中，分离的多肽基本上不含有其它多肽，尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高度纯化形式，即纯度大于95％、更优选纯度大于99％的多肽。在上下文中，术语“分离的”不排除存在其它可能的物理形式(如二聚体)或其它可能的糖基化或衍生形式的相同多肽。
术语“赘生”当指细胞时表示细胞正在经历新的异常增殖，尤其是在增殖不受控制和进行性发展的组织中，从而导致赘生物的产生。赘生性细胞可以是恶性的，例如侵入性的和转移性的，或是良性的。
术语“可操作地连接的”当指DNA区段时表示这些区段按一定方式排列以致它们可以协调地为其预期的目的发挥作用，例如在启动子中起始转录并前行通过编码区段到达终止子。
术语“定向进化同源物”(ortholog)是指从一个物种获得的多肽或蛋白质，其是来自不同物种的多肽或蛋白质的功能对应物。定向进化同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
“平行进化同源物”(paralog)是生物体产生的不同的但结构上相关的蛋白质。平行进化同源物被认为起源于基因重复。例如，α珠蛋白、β珠蛋白和肌红蛋白彼此是平行进化同源物。
“多核苷酸”是指从5’向3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以从天然来源分离、体外合成或通过天然和合成的分子的组合来制备。多核苷酸的大小表示为碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下，后两个术语可以描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时，其用于指整个长度，并且应理解为相当于术语“碱基对”。本领域技术人员明了，双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍有差异而且它们的末端可以因酶促切割而是交错的；因此在双链多核苷酸分子中可能并非所有的核苷酸都是配对的。
“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸残基的多聚物，它们可以是天然产生的或合成产生的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常被称作“肽”。
术语“启动子”在本文中用于表示其所在领域认可的含义，指含有为RNA聚合酶结合和转录起始提供条件的DNA序列的基因部分。启动子序列通常，但并不总是，存在于基因的5’非编码区。
“蛋白质”是指包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽成分，如糖基。糖和其它非肽取代基可以由产生蛋白质的细胞添加至蛋白质上，并且它们将随细胞类型的不同而不同。蛋白质在本文中以其氨基酸主链结构来定义；诸如糖基等这样的取代基一般不作详细说明，但可以存在。
术语“受体”是指与生物活性分子(即配体)结合并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白质。膜结合受体的特征在于包含细胞外配体结合域和细胞内效应域(典型地参与信号转导)的多个肽的结构。配体与受体的结合导致受体构象改变，引起效应域和细胞内的其它分子之间发生相互作用。该相互作用又导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用联系的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产生的增加、细胞钙动员、膜脂动员、细胞粘着、肌醇脂的水解和磷脂的水解。受体一般可以是膜结合的、细胞质的或细胞核的；单体(例如促甲状腺激素受体、β肾上腺素受体)或多体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。
术语“分泌信号序列”是指编码如下多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽作为更大多肽的一个成分指导该更大多肽通过合成它的细胞的分泌途径。该更大多肽通常在运输通过分泌途径的过程中被切割而除去分泌肽。
术语“拼接变体”在本文中用于指基因转录产生的RNA的多种可选择形式。拼接变异通过利用存在于转录的RNA分子中的、或较少情况下单独转录的RNA分子之间的多个可供选择的拼接位点而自然产生，并可以导致从相同的基因转录产生几种mRNA。拼接变体可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语拼接变体在本文中也用于指基因转录产生的mRNA拼接变体编码的蛋白质。
应当理解通过粗略的分析方法(例如凝胶电泳)测定的多聚物的分子量和长度是近似值。当该值以“约”X或“大约”X表示时，X的所述值应理解为精确到±10％。
本文引用的所有参考文献均完整地并入作为参考。
Zcyto21基因编码200个氨基酸的多肽，显示在SEQ ID NO：2中。可以预测出Zcyto21的信号序列包含SEQ ID NO：2第1位氨基酸残基(Met)至第19位氨基酸残基(Ala)。Zcyto21的成熟肽起始于第20位氨基酸残基(Gly)。
Zcyto21基因包含在BAC序列AC011445和AC018477中，这些序列已被作图定位在人类染色体19q13.13上。19号染色体的此区域还可能含有一簇干扰素样基因。表现出Zcyto21多核苷酸序列的共有序列cDNA显示在SEQ ID NO：6中，而其编码的多肽显示在SEQ ID NO：7中。
如下所述，本发明提供具有与SEQ ID NO：2第20至200位氨基酸残基或SEQ ID NO：2第1至200位氨基酸残基至少70％、至少80％或至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的分离的多肽。本发明还提供具有与SEQ ID NO：9第20至219位氨基酸残基或SEQ ID NO：9第1至219位氨基酸残基至少70％、至少80％或至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的分离的多肽。本发明还提供具有与SEQ ID NO：12第20至203位氨基酸残基或SEQ ID NO：12第1至203位氨基酸残基至少70％、至少80％或至少90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的分离的多肽。本发明还包括还含有相对于此第一个氨基酸序列位于氨基端的信号分泌序列的多肽，其中该信号分泌序列包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的第1至19位氨基酸残基。
一般地，细胞因子被预测具有4个α螺旋结构(其中螺旋A、C和D在配体和受体的相互作用中最为重要)，而且是该家族成员中更为高度保守的。然而，干扰素(INF)，尤其是干扰素α和干扰素τ的特征在于6个螺旋束。INF螺旋A相当于Zcyto21的螺旋A；INF螺旋B相当于Zcyto21的螺旋C；INF螺旋C相当于Zcyto21的螺旋D；INF螺旋D相当于Zcyto21的螺旋F。这样，INF的AB环和CD环之间的环在Zcyto21中被扩展而含有Zcyto21的短螺旋B和E。
预测的Zcyto21的螺旋如下：螺旋A确定为第49(Ser)至63(Leu)位氨基酸残基；螺旋B为第76(Asn)至84(Val)位氨基酸残基；螺旋C为第89(Val)至第104(Ala)位氨基酸残基；螺旋D为第111(Glu)至133(Gln)位氨基酸残基；螺旋E为第137(Thr)至158(Lys)位氨基酸残基；和螺旋F为第163(Gly)至189(Leu)位氨基酸残基；如SEQ ID NO：2所示。半胱氨酸残基在Zcyto21和INF-α中是保守的，可以形成分子间二硫键，尤其是和另一Zcyto21分子形成同二聚体。基于多重比对对Zcyto21的进一步分析预测，氨基酸残基第34和131位，第68和164位的半胱氨酸(见SEQ ID NO：2)将形成分子内二硫键。第190位残基半胱氨酸是游离的，可以形成分子间二硫键。编码本文所述Zcyto21多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO：1中。SEQ ID NO：2的简并多核苷酸序列见SEQID NO：3。SEQ ID NO：9的简并多核苷酸序列见SEQ ID NO：10。SEQID NO：12的简并多核苷酸序列见SEQ ID NO：13。
对鼠IL-2的详细突变分析(Zurawski等，EMBO J.12：5113-5119，1993)显示螺旋A和C中的残基对于与IL-2Rβ的结合是重要的；关键性残基是Asp34、Asn99和Asn103。鼠IL-2的A/B环和螺旋B中的多个残基对于IL-2Rα的结合是重要的，而螺旋D中仅一个残基Gln141对于与IL-2Rα的结合是至关重要的。类似地，螺旋A和C是IL-4和IL-4Rα(结构类似于IL-2Rα)之间相互作用的位点，而且螺旋D中的残基对于与IL-2Rα的相互作用是至关重要的。(Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1657-1662，1997；Kruse等，EMBO J.11：3237-3244，1992)。尤其是，人IL-4中Tyr124突变为Asp产生拮抗剂，其与IL-4Rα结合但不与IL-2Rα结合，因此不能产生信号(Kruse等，同上，1992)。
4螺旋束的细胞因子还通过其组成螺旋的长度分组。“长螺旋”形式的细胞因子一般由24-30个残基的螺旋组成，包括IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生长激素(hGH)。“短螺旋”形式的细胞因子一般由18-21个残基的螺旋组成，包括IL-2、IL-4和GM-CSF。使用CNTF和IL-6进行的研究证实，可以将CNTF螺旋替换为IL-6中的等同螺旋，从而使该嵌合体具有CTNF结合性质。因此，似乎可以基于结构同源性，而不管序列的同一性如何，确定4螺旋细胞因子的功能域，而且这些功能域能够在嵌合体中保持功能的完整性(Kallen等，J.Biol.Chem.274：11859-11867，1999)。因此，Zcyto21的螺旋域对于制备嵌合融合分子(尤其是与其它干扰素融合)以确定和调节受体的结合特异性是有用的。尤其有意义的是将来自干扰素和细胞因子如IFN-α、IL-10、人生长激素的螺旋和环区域组合在一起的融合蛋白。
已经在脑、胰岛、前列腺、睾丸、垂体、胎盘、卵巢肿瘤、肺肿瘤、直肠肿瘤和卵巢肿瘤的组织、以及活化的免疫细胞系(CD3+)和已转化了人乳头状瘤病毒IV(HPVS)的前列腺上皮细胞系中鉴定到Zcyto21mRNA。
本发明提供编码本文公开的Zcyto21多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本领域技术人员容易明了，鉴于遗传密码子的简并性，这些多核苷酸分子中可能会有相当大量的序列变异。SEQ ID NO：3、10和13是简并DNA序列，其包含了分别编码SEQ ID NO：2、9和12的Zcyto21多肽的所有DNA。本领域技术人员将明了，通过用U替代T，例如，SEQ ID NO：3的简并序列还提供了编码SEQ ID NO：2的所有RNA序列。因此，包含SEQ ID NO：3的第1或58位至第603位核苷酸的编码Zcyto21多肽的多核苷酸和其RNA等价物是本发明所考虑的。表1列出SEQ ID NO：3中用以指示简并核苷酸位置的单字母代码。“解释(resolution)”是代码字母所表示的核苷酸。“互补物”是指互补核苷酸的代码。例如，代码Y表示C或T，其互补物R表示A或G，其中A与T互补而G与C互补。
表1
Figure C0181315300151
表2中给出了SEQ ID NO：3、10和13中使用的简并密码子，包括了给定氨基酸的所有可能密码子。
表2
Figure C0181315300161
本领域技术人员将明了，在确定代表编码每个氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时引入了某种不确定性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)可以在某些情况下编码精氨酸(AGR)，而精氨酸的简并密码子(MGN)可以在某些情况下编码丝氨酸(AGY)。类似的关系也存在于编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子间。因此，简并序列包括的某些多核苷酸可以编码变体氨基酸序列，但本领域技术人员通过参考SEQ ID NO：2的氨基酸序列可以容易地鉴定出这些变体序列。变体序列的功能性可以容易地按照本文所述来测试。
本领域技术人员也将理解，不同物种可以表现出“优先密码子使用”。一般参见Grantham等，Nuc.Acids Res.8：1893-912，1980；Haas等，Curr.Biol.6：315-24，1996；Wain-Hobson等，Gene 13：355-64，1981；Grosjean和Fiers，Gene 18：199-209，1982；Holm，Nuc.Acids Res.14：3075-87，1986；Ikemura，J.Mol.Biol.158：573-97，1982。本文中，术语“优先密码子使用”或“优先密码子”是本领域的一个术语，指某个物种的细胞中最为频繁使用的蛋白质翻译密码子，因此在编码各种氨基酸的可能密码子中会偏向一种或几种代表性的密码子(见表3)。例如，苏氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子；在其它物种中，例如，昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，不同的Thr密码子可能是优先的。通过本领域已知的多种方法，可以将一个特定物种的优先密码子引入本发明多核苷酸中。将优先密码子序列引入重组DNA中可以例如通过使蛋白质在特定细胞类型或物种中的翻译更为有效来增强蛋白质的产生。因此，SEQ ID NO：3公开的简并密码子序列可以作为模板以优化多核苷酸在本领域常用的和本文公开的不同细胞类型和物种中的表达。可以按本文的公开对含有优先密码子的序列在不同物种中的表达进行测试和优化，并测试这些序列的功能性。
正如前面提及的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法是本领域熟知的。一般地，从产生大量Zcyto21RNA的组织或细胞中分离RNA。这些组织和细胞可以通过Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201，1980)或通过根据对靶细胞或组织的活性筛选来自不同细胞类型的条件培养液来鉴定。一旦鉴定到产生该活性或RNA的细胞或组织后，就可以使用异硫氰酸胍抽提，之后在CsCl梯度中离心分离，制备总RNA(Chirgwin等，Biochemistry 18：52-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-12，1972)从总RNA制备poly(A)+RNA。可以使用已知方法从poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。在另一可供选择的方案中，可以分离基因组DNA。然后通过例如杂交或PCR鉴定并分离编码Zcyto21多肽的多核苷酸。
可以通过常规克隆方法获得编码Zcyto21的更长克隆。优选互补DNA(cDNA)克隆，但对于一些应用(例如在转基因动物中表达)可能优选使用基因组克隆，或对cDNA克隆进行修饰以包括至少一个基因组内含子。制备cDNA和基因组克隆的方法是熟知的并属于本领域普通技术人员的水平，它们包括使用本文公开的序列或其部分来作为探针筛选文库或作为引物来扩增文库。表达文库可以使用Zcyto21受体片断的抗体或其它特异性结合伙伴来探查。
本发明还提供来自其它物种的对应多肽和多核苷酸(定向进化同源物)。这些物种包括但不限于哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物、鱼类、昆虫和其它脊椎动物和无脊椎动物物种。尤其有意义的是来自其它哺乳动物物种的Zcyto21多肽，包括鼠、猪、绵羊、牛、犬、猫、马和其它灵长类动物多肽。可以使用本发明提供的信息和组合物以及常规克隆技术克隆人Zcyto21的定向进化同源物。例如，可以使用从表达本文公开的Zcyto21的组织或细胞类型获得的mRNA克隆cDNA。mRNA的适宜来源可以通过用根据本文公开的序列设计的探针探查Northern印迹来鉴定。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。之后可以通过多种方法，例如用完整的或部分的人cDNA或用一组或多组基于公开的序列的简并探针进行探查，分离编码Zcyto21的cDNA。还可以使用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利4,683,202)，使用根据本文公开的代表性人Zcyto21序列设计的引物，克隆cDNA。在另一方法中，可以使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，然后可以用Zcyto21多肽的抗体、结合研究或活性测试方法检测目的cDNA的表达。类似的技术也可以应用于基因组克隆的分离。
本领域技术人员将意识到，SEQ ID NOS：1中公开的序列仅代表人Zcyto21的一种等位基因，而且预期可以出现等位变异和可变拼接。该序列的等位变体可以通过利用标准方法探查来自不同个体的cDNA或基因组文库进行克隆。SEQ ID NO：1所示DNA序列的等位变体，包括含有沉默突变的那些和其中的突变导致氨基酸序列改变的那些，均属于本发明的范围，作为SEQ ID NO：2的等位变体的蛋白质同样也属于本发明的范围。由可变拼接产生的mRNA制备的、仍保留了Zcyto21多肽的性质的cDNA包括在本发明范围内，同样这些cDNA和mRNA编码的多肽也包括在本发明范围内。这些序列的等位变体和拼接变体可以通过使用本领域已知的标准方法探查来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库进行克隆。可变拼接变体的实例显示在SEQ ID NO：8(SEQID NO：9显示了相应的多肽)和SEQ ID NO：11(SEQ ID NO：12显示了相应的多肽)。等位变体的一个例子显示在SEQ ID NO：4，其对应于SEQ ID NO：5所示多肽序列。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的多肽序列之间在核苷酸第572位存在多态性。该多态性可能产生Zcyto21的拮抗剂或功能降低或改变的分子，这可能导致更大可能的疾病易感性。
本发明还提供在诊断应用中有用的试剂。例如，Zcyto21基因、包含Zcyto21DNA或RNA或其亚序列的探针可以用于确定Zcyto21基因是否存在于人染色体上，如19号染色体上，或是否有基因突变发生。Zcyto21定位在19号染色体的q13.13区。Zcyto21基因座位上可检测的染色体畸变包括，但不限于，非整倍性、基因拷贝数改变、异质性丧失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位点改变和重排。可以通过使用分子遗传学技术，例如限制性片断长度多态性(RFLP)分析、利用PCR技术进行的短串联重复(STR)分析，和本领域已知的其它遗传学连锁分析技术(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，Chest 108：255-65，1995)，使用本发明多核苷酸来检测这些畸变。
基因位置的精确信息对于许多目的可能是有用的，包括：1)确定序列是否是现有重叠群的一部分并以多种形式例如YAC、BAC或cDNA克隆获得其它的周围遗传序列；2)为表现出与相同染色体区域连锁的遗传疾病提供可能的候选基因；和3)与模式生物(例如小鼠)相互参照，这可以帮助确定特定基因可能具有的功能。
例如，Delague等(Am.J.Hum.Genet.67：236-243，2000)鉴定到Charcot-Marie-Tooth疾病定位在19q13.1-13.3(Delague等，Am.J.Hum.Genet.67：236-243，2000)。
诊断可以帮助医师确定疾病类型和适当的相关治疗，或帮助遗传咨询。同样地，使用本领域已知的和本文描述的方法，按本文所述，本发明的抗Zcyto21抗体、多核苷酸和多肽可以用于检测Zcyto21多肽、mRNA或抗Zcyto21抗体，由此充当标记，并可以直接用于检测遗传疾病或癌症。而且，可以使用Zcyto21多核苷酸探针检测与如下情况相关的异常或基因型：染色体19的人类疾病相关性缺失及易位、或涉及肿瘤的恶性发展的其它易位、或预期涉及恶性肿瘤或其它癌症中的染色体重排的其它19q13.13突变。类似地，可以使用Zcyto21多核苷酸探针检测与如下情况有关的异常或基因型：与人类疾病或自然流产相关的染色体19q13.13三体性和染色体丢失。因此，Zcyto21多核苷酸探针可以用于检测与这些缺陷有关的异常或基因型。
一般地，用于遗传连锁分析以检测患者的遗传畸变或异常的诊断方法是本领域已知的。分析性探针一般长至少20nt，但有时可以使用更短的探针(例如14-17nt)。PCR引物长至少5nt，优选15nt或更大，更优选20-30nt。对于基因或染色体DNA的总体分析，Zcyto21多核苷酸探针可以包含完整的外显子或更多。本领域技术人员通过比较Zcyto21序列(SEQ ID NOS：1)与Zcyto21的基因组DNA，可以容易地确定外显子。一般地，用于遗传连锁分析以检测患者的遗传畸变或异常的诊断方法是本领域已知的。大多数诊断方法包括步骤：(a)从可能患病的患者、患病的患者或隐性疾病等位基因的可能非患病携带者获得遗传样品；(b)通过在例如RFLP分析中将遗传样品与zcyto 21多核苷酸探针一起孵育(其中所述多核苷酸与互补多核苷酸序列杂交)或通过将遗传样品和有义及反义引物在PCR反应中在适当的PCR反应条件下一起孵育，产生第一反应产物；(c)通过凝胶电泳和/或其它已知方法显现第一反应产物，例如使用Zcyto21多核苷酸探针(其中所述多核苷酸将与第一反应物中的互补多核苷酸序列杂交)显现第一反应产物；和(d)将显现的第一反应产物和来自野生型患者的遗传样品的第二对照反应产物进行比较。第一反应产物和对照反应产物之间的差异将指示该患病的或可能患病的患者中的遗传异常，或非患病患者存在杂合隐性携带者表型、或病患者的肿瘤中存在遗传缺陷、或胎儿或植入前胚胎中存在遗传异常。例如，Zcyto21遗传座位在限制性片断图、PCR产物长度、重复序列长度方面的差异将指示与正常野生型对照相比存在遗传异常、遗传畸变或等位差异。对照可以来自未受影响的家族成员或无关个体，这取决于所作试验及样品的可获得性。用于本发明的遗传样品包括从患者的任何组织或其它生物学样品(例如，但不限于，血液、唾液、精液、胚胎细胞、羊水等)分离的基因组DNA、mRNA和cDNA。多核苷酸探针或引物可以是RNA或DNA，并将包含SEQ IDNO：1的部分、SEQ ID NO：1的互补分子、或其RNA等同物。进行人类疾病表型的遗传连锁分析的这些方法是本领域熟知的。对于基于PCR的诊断方法，一般参见Mathew(编)，Protocols in Human MolecularGenetics(Humana Press，Inc.1991)、White(编)，PCR Protocols：Current Methods and Applications(Humana Press，Inc.1993)、Cotter(编)，Molecular Diagnosis of Cancer(Humana Press，Inc.1996)、Hanausek和Walaszek(编)，Tumor Marker Protocol s(HumanaPress Inc.1998)、Lo(编)，Clinical Applications of PCR(HumanaPress，Inc.1998)和Meltzer(编)，PCR in Bioanalysis(HumanaPress，Inc.1998))。
可以使用本发明核酸分子通过用于直接突变分析的标准方法，如限制性片断长度多态性分析、基于PCR技术的短串联重复分析、扩增不应突变系统分析(amplification-refractory mutation systemanalysis)、单链构象多态性检测、RNase切割方法、变性梯度凝胶电泳、借助荧光的错配分析和其它本领域已知的遗传分析技术(见，例如，Mathew(编)，Protocols in Human Molecular Genetics(HumanaPress，Inc.1991)，Marian，Chest 108：255(1995)；Coleman和Tsongalis，Molecular Diagnosis(Humana Press，Inc.1996)；Elles(编)Molecular Diagnosis of Genetic Diseases(Humana Press，Inc.1996)；Landegren(编)Laboratory Protocols for MutationDetection(Oxford University Press 1996)；Birren等(编)，GenomeAnalysis，第2卷：检测基因(Cold Spring Harbor Laboratory Press1998)；Dracopoli等(编)，Current Protocols in Human Genetics(John Wiley & Sons 1998)；和Richards和Ward，“分子诊断检测”，《Principles of Molecular Medicine》第83-88页(Humana Press，Inc.1998))，检测与Zcyto21座位有关的突变。对Zcyto21基因的突变的直接分析可以使用受试对象的基因组DNA来进行。扩增从例如外周血淋巴细胞获得的基因组DNA的方法是本领域技术人员熟知的(见，例如，Dracopoli等(编)，Current Protocols in Human Genetics，第7.1.6-7.1.7页(John Wiley & Sons 1998))。
在本发明实施方案中，分离的Zcyto21编码核酸分子可以在严紧条件下与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交，与具有SEQ ID NO：1核苷酸第58-603位的核苷酸序列的核酸分子杂交，或与具有与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列的核酸分子杂交。一般地，选择的严紧条件为对于特定的序列在规定的离子强度和pH下比热熔解温度(Tm)低大约5℃。Tm是50％靶序列与完全匹配的探针发生杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。
如果一对核苷酸序列具有一定程度的互补性，则该核酸分子对，例如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA可以杂交。杂交体可以在双螺旋中耐受错配碱基对，但杂交体的稳定性受到错配程度的影响。错配的杂交体的Tm每1-1.5％碱基对错配降低1℃。改变杂交条件的严紧性使得可以控制杂交体中存在的错配程度。当杂交温度增加而杂交缓冲液的离子强度减少时，严紧程度增加。
使这些条件适用于具体的多核苷酸杂交体属于本领域技术人员的能力范围。特定靶序列的Tm是50％该靶序列与完全匹配的探针序列发生杂交时的温度(在规定的条件下)。影响Tm的那些条件包括：多核苷酸探针的大小和碱基对量、杂交溶液的离子强度和杂交溶液中去稳定剂的存在。用于计算Tm的许多等式是本领域已知的，它们对于DNA、RNA和DNA-RNA杂交体及不同长度的多核苷酸探针序列是特异的(见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel等(编)，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.1987)；Berger和Kimmel(编)，Guide to Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件如OLIGO 6.0(LSR；Long Lake，MN)和Primer Premier 4.0(Premier Biosoft International；PaloAlto，CA)以及英特网上的站点，是公众可得到的工具，可基于用户定义的标准用于分析给定序列和计算Tm。这些程序也可以在规定的条件下分析给定的序列并确定适宜的探针序列。典型地，较长多核苷酸序列(＞50个碱基对)的杂交在低于计算的Tm大约20-25℃的温度下进行。对于较小的探针(＜50个碱基对)，杂交典型地在Tm或低于计算的Tm 5-10℃的温度下进行。这允许DNA-DNA和DNA-RNA杂交体以最大速率杂交。
杂交后，可以在严紧条件或在高度严紧条件下洗涤核酸分子以除去未杂交的核酸分子。典型的严紧洗涤条件包括在0.5×-2×SSC加0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中55-65℃洗涤。也就是说，编码Zcyto21多肽变体的核酸分子可以在严紧洗涤条件下与具有SEQ IDNOS：1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)杂交，其中所述洗涤严紧性相当于0.5×-2×SSC加0.1％SDS在55-65℃下，包括0.5×SSC加0.1％SDS在55℃下或2×SSC加0.1％SDS在65℃下。本领域技术人员可以通过例如用SSPE代替洗涤溶液中的SSC，容易地设计出等同的条件。
典型的高度严紧洗涤条件包括在0.1×-0.2×SSC加0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中50-65℃洗涤。也就是说，编码Zcyto21多肽变体的核酸分子可以在高度严紧洗涤条件下与具有SEQ ID NOS：1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)杂交，其中所述洗涤严紧性相当于0.1×-0.2×SSC加0.1％SDS在50-65℃下，包括0.1×SSC加0.1％SDS在50℃下或0.2×SSC加0.1％SDS在65℃下。
本发明还提供与SEQ ID NOS：2的多肽或它们的定向进化同源物具有基本上相似的序列一致性的分离的Zcyto21多肽。术语“基本上相似的序列一致性”在本文中用于指与SEQ ID NOS：2所示序列或它们的定向进化同源物有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的多肽。本发明还包括含有与SEQ ID NO：2氨基酸残基第1至200位或第20至200位的序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性的氨基酸序列的多肽。本发明还包括编码这些多肽的核酸分子。确定一致性百分数的方法见如下描述。
本发明还考虑可以使用两个标准确定的Zcyto21核酸分子变体：对所编码多肽与SEQ ID NOS：2的相似性的确定，和/或如上所述的杂交分析。这些Zcyto21变体包括：(1)与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)在严紧洗涤条件下杂交的核酸分子，其中该洗涤严紧性相当于0.5×-2×SSC加0.1％SDS在55-65℃下；或(2)编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的多肽的核酸分子。或者，Zcyto21变体可以表征为：(1)与具有SEQ ID NOS：1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)在高度严紧洗涤条件下杂交的核酸分子，其中该洗涤严紧性相当于0.1×-0.2×SSC加0.1％SDS在50-65℃下；和(2)编码与SEQ ID NOS：2的氨基酸序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％的序列一致性的多肽的核酸分子。
序列一致性百分数可通过常规方法确定。见例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48：603(1986)，和Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89；10915(1992)。简而言之，使用10的缺口(gap)开放罚分、1的缺口延伸罚分和Henikoff和Henikoff(同上)的“BLOSUM62”评分矩阵(见表3，氨基酸用标准单字母代码表示)，将两个氨基酸序列对齐以优化比对分数。
Figure C0181315300251
Figure C0181315300261
本领域技术人员明了，已有许多成熟的算法可以比对两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性检索算法是一个适宜的蛋白质比对方法，可用于检测本文公开的氨基酸序列和推测的Zcyto21变体的氨基酸序列之间的一致性水平。FASTA算法描述在Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)及Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)。
简而言之，FASTA首先通过确定查询序列(例如SEQ ID NO：2)和测试序列共有的区域，即在不考虑保守氨基酸替代、插入或缺失的情况下具有最大的一致性密度(如果ktup变量为1)或具有成对的一致性(如果ktup＝2)的区域，以表征序列相似性。然后使用氨基酸替代矩阵比较所有配对的氨基酸的相似性，对具有最大的一致性密度的10个区域进行重新评分，并“修剪”这些区域的末端以便仅包括对此最高分数有贡献的那些残基。如果有分数大于“截断值”(通过预先确定的公式基于序列长度和ktup值计算的)的几个区域，则检验这些经修剪的最初区域以确定这些区域是否可以结合缺口以形成近似对齐。最后，使用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))(该算法允许氨基酸插入和缺失)，对这两个氨基酸序列的最大得分区域进行比对。FASTA分析的优选参数是：ktup＝1、缺口开放罚分＝10、缺口延伸罚分＝1和替代矩阵＝BLOSUM62。这些参数可以通过修饰评分矩阵文件(“SMATRIX”)引入FASTA程序中，对此的解释参见Pearson，Meth.Enzymol.183；63(1990)的附录2。
使用上面公开的比例，FASTA还可以用于确定核酸分子的序列一致性。对于核苷酸序列比较，ktup值可以在1至6的范围内，优选3至6，最优选3，而其它参数设置为默认值。
Zcyto21多肽变体或具有实质上相似的序列一致性的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸替代、缺失或插入。这些改变优选在性质上较小，即保守氨基酸替代(见表4)和不显著影响多肽的折叠或活性的其它替代；小的缺失，典型地一个至约30个氨基酸的缺失；氨基或羧基端延伸，例如氨基端甲硫氨酸残基，不超过约20-25个残基的小的接头肽或亲和标签。本发明因此提供包含与SEQ ID NO：2的相应区域有至少70％、优选至少90％、更优选95％、96％、97％、98％、99％或更多一致的序列的具有约149-230个氨基酸残基的多肽。包含亲和标签的多肽还可以在Zcyto21多肽与亲和标签之间含有蛋白酶剪切位点。优选的这些位点包括凝血酶切割位点和因子Xa切割位点。
表4
保守氨基酸替代
  碱性：   精氨酸
  赖氨酸
  组氨酸
  酸性：   谷氨酸
  天冬氨酸
  极性：   谷氨酰胺
  天冬酰胺
  疏水：   亮氨酸
  异亮氨酸
  缬氨酸
  芳香：   苯丙氨酸
  色氨酸
  酪氨酸
  小氨基酸：   甘氨酸
  丙氨酸
  丝氨酸
  苏氨酸
  甲硫氨酸
可以确定包含对于维持结构完整性关键的区域或域的氨基酸残基。可以确定在这些区域中或多或少耐受改变而保持分子的整个三级结构的特定残基。分析序列结构的方法包括，但不限于具有高氨基酸或核苷酸一致性的多个序列的比对、二级结构倾向(propensity)、二元图(binary patterns)、互补堆积(complementary packing)和隐蔽的极性相互作用(Barton，Current Opin.Struct.Biol.5：372-376，1995；和Cordes等，Current Opin.Struct.Biol.6：3-10，1996)。一般地，当设计分子修饰或鉴定特定片断时，将在确定结构的同时评价修饰的分子的活性。
可以在Zcyto21多肽中进行氨基酸序列改变以便最少破坏对于生物学活性必需的高级结构。例如，当Zcyto21多肽包含一个或多个螺旋时，将改变氨基酸残基以便不破坏螺旋的几何学和其中的构象改变将使一些关键功能(例如分子与其结合伙伴的结合)减弱的其它分子成分。氨基酸序列改变的效果可以通过例如以上公开的计算机模拟进行预测，或通过晶体结构分析进行测定(见例如Lapthorn等，Nat.Struct.Biol.2：266-268，1995)。本领域熟知的其它技术对变体蛋白和标准分子(例如天然蛋白)的折叠进行比较。例如，可以比较变体和标准分子中的半胱氨酸分布情况。质谱和使用还原和烷基化的化学修饰为测定与二硫键相关的或未形成这些键的半胱氨酸残基提供了方法(Bean等，Anal.Biochem.201：216-266，1992；Gray，ProteinSci.2：1732-1748，1993；和Patterson等，Anal.Chem.66：3727-3732，1994)。一般认为如果修饰的分子与标准分子具有不相同的半胱氨酸分布情况，则折叠受到影响。另一个用于测量折叠的被接受的熟知方法是园二色性(CD)。测量和比较修饰分子和标准分子产生的CD谱是常规的(Johnson，Proteins 7；205-214，1990)。晶体学是另一个分析折叠和结构的熟知方法。核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是分析折叠及蛋白质和多肽之间的结构相似性的已知方法(Schaanan等，Science 257：961-964，1992)。
可以制备SEQ ID NO：2所示Zcyto21蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性分布图(Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth.88：1-18，1986和Triquier等，ProteinEngineering 11：153-169，1998)。该分布图以滑动的六残基窗为基础。忽略隐蔽的G、S和T残基及暴露的H、Y和W残基。例如，在Zcyto21中，亲水区域包括SEQ ID NO：2中所示的第155(Glu)至160(Glu)位氨基酸残基；第51(Lys)至第56(Ala)位氨基酸残基；第50(Phe)至第55(Asp)位氨基酸残基；第140(Pro)至第145(Arg)位氨基酸残基；第154(Gln)至159(Lys)位氨基酸残基。
本领域技术人员将明了，当在Zcyto21多肽的氨基酸序列中设计修饰时应考虑亲水性或疏水性，以便不破坏整体的结构和生物学情况。对于替代尤其有意义的是选自Val、Leu和Ile组成的组或选自Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp组成的组的疏水性残基。
从INF-α与其它干扰素之间的序列相似性分析，也可以推断出哪些是必需氨基酸。使用如前述“FASTA”分析等方法，可以在蛋白质家族中鉴定高相似性区域，这些区域可以用于分析保守区域的氨基酸序列。基于结构鉴定变体Zcyto21多核苷酸的另一可选择的方法是按上述确定编码潜在Zcyto21基因变体的核酸分子是否可以和具有SEQID NOS：1的核苷酸序列的核酸分子杂交。
可鉴定本发明多肽中的必需氨基酸的其它方法是本领域已知的方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science244：1081(1989)，Bass等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4498(1991)，Coombs和Corey，“定点诱变和蛋白质工程”，《Proteins：Analysis and Design》，Angeletti(编)，第259-311页(AcademicPress，Inc.1998))。在后一技术中，在分子的每个残基位置引入单丙氨酸突变，并按下面的公开方法测试所获突变分子的生物学或生物化学活性以确定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。也参见Hilton等，J.Biol.Chem.271：4699(1996)。
本发明还包括Zcyto21多肽的功能性片断和编码这些功能性片断的核酸分子。在本文中，“功能性”Zcyto21或其片断的特征在于其增殖或分化活性、诱导或抑制特化细胞功能的能力或特异结合抗Zcyto21抗体或Zcyto21受体(可溶的或固定的)的能力。如本文前述，Zcyto21的特征在于6螺旋束结构，包括：螺旋A由第49(Ser)至63(Leu)位氨基酸残基限定；螺旋B由第76(Asn)至84(Val)位氨基酸残基限定；螺旋C为第89(Val)至第104(Ala)位氨基酸残基；螺旋D为第111(Glu)至133(Gln)位氨基酸残基；螺旋E为第137(Thr)至158(Lys)位氨基酸残基；和螺旋F为第163(Gly)至189(Leu)位氨基酸残基；如SEQ ID NO：2所示。因此，本发明还提供如下融合蛋白，其包括：(a)包含上述一个或多个螺旋的多肽分子；和(b)包含这些螺旋中的一个或多个的功能性片断。融合蛋白的另一多肽部分可以由另一螺旋束细胞因子或干扰素(如INF-α)提供或由促进融合蛋白分泌的非天然的和/或无关的分泌信号肽提供。
本发明Zcyto21多肽，包括全长多肽、生物学活性片断和融合多肽，可以根据常规技术使用其中导入了编码该多肽的表达载体的细胞来制备。本文中，“其中导入了表达载体的细胞”包括直接接受操作引入了外源DNA分子的细胞和其含有该引入的DNA的后代。适宜的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染且可以培养生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA引入多种宿主细胞的技术公开在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Ausubel等，编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley and Sons，Inc.NY，1987。
一般地，编码Zcyto21多肽的DNA序列与对于其表达必需的其它遗传元件，一般包括转录启动子和终止子，在表达载体中可操作地连接。载体通常还含有一个或多个选择标记和一个或多个复制起点，但本领域技术人员将明了在某些系统中选择标记可以在分开的不同载体上提供，而且外源DNA的复制可以通过整合至宿主细胞基因组中来实现。启动子、终止子、选择标记、载体和其它元件的选择是属于本领域普通技术人员水平内的常规设计。这些元件中的许多在文献中已有描述，并可通过供应商获得。
为了引导Zcyto21多肽进入宿主细胞的分泌途径，可以在表达载体中提供分泌信号序列(又称作前导序列，前原序列(prepro sequence)或前序列(pre sequence))。该分泌信号序列可以是Zcyto21的分泌信号序列，或可以来源于另一分泌蛋白(例如t-PA；见美国专利5,641,655)或从头合成。将分泌信号序列与Zcyto21的DNA序列可操作地连接，即将两个序列在正确的阅读框中连接并放置在一定位置以指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5’，但某些信号序列可以位于目的DNA序列的其它地方(见例如Welch等，美国专利5,037,743；Holland等，美国专利5,143,830)。
本发明中可以使用培养的哺乳动物细胞作为宿主。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics7：603，1981；Graham和Van der Eb，Virology 52：456，1973)、电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 15：73，1993；Ciccarone等，Focus 15：80，1993)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽公开在例如Levinson等，美国专利4,713,339；Hagen等，美国专利4,784,950；Palmiter等，美国专利4,579,821；和Ringold，美国专利4,656,134。适宜的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCCNo.CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)和中国仓鼠卵巢细胞系(例如CHO-K1，ATCC No.CCL 61；或CHO DG44，Chasin等，Som.Cell Molec.Genet.12：555，1986)。其它适宜的细胞系是本领域已知的，并可以通过公共保藏单位(如美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)获得。一般地，优选强转录启动子，如来自SV40或巨细胞病毒的启动子。见例如美国专利4,956,288。其它适宜的启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。用于哺乳动物细胞的表达载体包括pZP-1和pZP-9(它们保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)，保藏号分别是98669和98668)及其衍生物。
一般使用药物筛选以选择其中插入了外源DNA的培养的哺乳动物细胞。这些细胞通常被称作“转染子”。在选择剂存在下培养并能够将目的基因传递给其后代的细胞被称作“稳定转染子”。优选的选择标记是编码抗生素新霉素抗性的基因。选择在存在新霉素类药物，如G-418等时进行。还可以使用选择系统以增加目的基因的表达水平，该过程被称作“扩增”。扩增的实施方式是：在有低水平选择剂时培养转染子然后增加选择剂的量以选择产生高水平的引入基因之产物的细胞。优选的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶，该酶赋予对氨甲蝶呤的抗性。也可以使用其它药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多重抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。
也可以将腺病毒系统用于体外蛋白质生产。通过在细胞不会快速分裂的条件下培养腺病毒感染的非293细胞，该细胞可以长时期产生蛋白质。例如，在细胞工厂中将BHK细胞培养至汇合，然后将其暴露于编码目的分泌蛋白的腺病毒载体。然后在无血清条件下培养细胞，在该条件下允许感染的细胞存活几周而不发生显著的细胞分裂。在另一可选择的方法中，可以将腺病毒感染的293细胞以贴壁细胞的形式或以悬浮培养物的形式培养至相对高的细胞密度以产生显著大量的蛋白质(见Garnier等，Cytotechnol.15：145-55，1994)。使用任一种方案，可以根据表达蛋白在细胞中的分布重复从细胞培养物上清液、裂解物或膜碎片中分离表达的分泌异源蛋白质。在使用感染的293细胞的生产方案中，还可以有效地获得非分泌的蛋白质。
可以用通常来源于苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒根据本领域已知的方法感染昆虫细胞。在优选方法中，通过使用基于转座子的系统(描述在Luckow等，J.Virol.67：4566-4579，1993)产生重组杆状病毒。该系统利用转移载体，并可以以试剂盒的形式购买得到(Bac-to-BacTM试剂盒；Life Technologies，Rockville，MD)。所述转移载体(例如pFastBaclTM；Life Technologies)含有Tn7转座子以便可以将编码目的蛋白质的DNA移入在大肠杆菌中作为所谓“杆粒”的大质粒维持的杆状病毒基因组中。见，Hill-Perkins和Possee，J.Gen.Virol.71：971-976，1990；Bonning等，J.Gen.Virol.75：1551-1556，1994；和Chazenbalk Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543-1549，1995。此外，转移载体可以包括与编码上文公开的多肽延伸段或亲和标签的DNA的框内融合物。使用本领域已知技术，可以将含有Zcyto21编码序列的转移载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，筛选带有含中断的lacZ基因(指示重组杆状病毒)的杆粒的细胞。使用常规技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并用其转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，如Sf9细胞。随后产生表达Zcyto21蛋白的重组病毒。通过本领域常用方法制备重组病毒原液。
为了产生蛋白质，可以使用该重组病毒感染宿主细胞，典型地来源于秋粘虫，草地贪夜蛾(如Sf9或Sf21细胞)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(如High FiveTM细胞；Invitrogen，Carlsbad，CA)的细胞系。见例如美国专利5,300,435。使用无血清培养基培养和维持细胞。适宜的培养基配方是本领域已知的，可以从供应商处获得。从大约2-5×105个细胞的接种密度将细胞培养至1-2×106个细胞的密度，此时加入感染复数(MOI)为0.1-10，更典型地近3的重组病毒原液。所用方法是本领域一般已知的。
还可以使用其它高等真核细胞作为宿主，包括植物细胞和鸟类细胞。关于毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为载体用于植物细胞中表达基因的综述见Sinkar等，J.Biosci.(Bangalore)11：47-58，1987。
在本发明中还可以使用真菌细胞，包括酵母细胞。在此方面特别有意义的酵母种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和Pichia methanolica。用外源DNA转化酿酒酵母细胞和从其中制备重组多肽的方法公开在例如Kawassaki，美国专利4,599,311；Kawasaki等，美国专利4,931,373；Brake，美国专利4,870,008；Welch等，美国专利5,037,743；和Murray等，美国专利4,845,075。通过选择标记所确定的表型，通常是药物抗性或在缺少特定养分(例如亮氨酸)时的生长能力，选择转化细胞。用于酿酒酵母的优选载体系统是Kawasaki等(美国专利4,931,373)公开的POTI载体系统，该系统允许通过在含有葡萄糖的培养基中的生长选择转化细胞。用于酵母的适宜启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(见例如Kawasaki，美国专利4,599,311；Kingsman等，美国专利4,615,974；和Bitter，美国专利4,977,092)和醇脱氢酶的那些。也参见美国专利4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。用于其它酵母，包括多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、Schizosaccharomyces pombe、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、季也蒙氏毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的转化系统也是本领域已知的。见例如Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132：3459-3465，1986；Cregg，美国专利4,882,279；和Raymond等，Yeast 14，11-23，1998。可以根据McKnight等，美国专利4,935,349的方法使用曲霉属细胞。转化Acremonium chrysogenum的方法公开在Sumino等，美国专利5,126,228。转化链孢霉的方法公开在Lambowitz，美国专利4,486,533。在Pichia methanolica中制备重组蛋白公开在美国专利5,716,808、5,736,383、5,854,039和5,888,768。
原核宿主细胞，包括细菌大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)和其它属的菌株，也是本发明中有用的宿主细胞。转化这些宿主和表达克隆在其中的外源DNA序列的技术是本领域熟知的(见例如Sambrook等，同上)。当在细菌如大肠杆菌中表达Zcyto21多肽时，可以将多肽保留在细胞质中，典型地以不溶性颗粒的形式，或可以通过细菌分泌序列将其引导至周质间隙。在前面的情况下，裂解细胞，回收该颗粒并使用例如异硫氰酸胍或尿素进行变性。之后通过稀释该变性剂，例如通过对尿素溶液和还原及氧化谷胱甘肽的组合进行透析，随后对缓冲盐溶液进行透析，使该变性的多肽重折叠并二聚化。在后一情况下，可以从周质间隙中以可溶性功能形式回收该多肽，方式是破碎细胞(通过如超声或渗压震扰)释放周质间隙内容物并回收该蛋白质，这由此省去变性和重折叠的需要。
根据常规方法在含有养分和其它对于所选宿主细胞的生长必需的成分的培养基中培养转化的或转染的宿主细胞。多种适宜的培养基，包括已知成分培养基和复杂培养基，是本领域已知的，一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基还可以含有诸如生长因子或血清这样的成分。生长培养基一般通过例如药物筛选或缺少可由表达载体携带的或共转染至宿主细胞中的选择标记补充的必需养分来选择含有外源添加DNA的细胞。通过常规方式，如振摇小三角瓶或发酵罐喷气给液体培养物提供充足的空气。
优选纯化本发明多肽和蛋白质达到≥80％纯度，更优选≥90％纯度，甚至更优选≥95％纯度，尤其优选药物纯状态，即相对于污染的大分子，尤其是其它蛋白质和核酸而言大于99.9％的纯度，而且不含感染剂和致热剂。优选地，纯化的多肽或蛋白质基本上不含有其它多肽或蛋白质，尤其是动物来源的那些。
可以通过常规蛋白质纯化方法，典型地通过层析技术的组合，纯化表达的重组Zcyto21蛋白质(包括嵌合多肽和多体蛋白)。一般参见亲和层析：原则和方法(Affinity Chromatography：Principles &Methods)，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，瑞典，1988；和Scopes，蛋白质纯化：原则和实践(Protein Purification：Principles and Practice)，Springer-Verlag，纽约，1994。包含多聚组氨酸亲和标签(典型地约6个组氨酸残基)的蛋白质可以通过在镍螯合树脂上亲和层析进行纯化。见例如Houchuli等，Bio/Technol.6；1321-1325，1988。包含glu-glu标签的蛋白质可以根据常规方法通过免疫亲和层析纯化。见例如Grussenmeyer等，同上。麦芽糖结合蛋白融合物根据本领域已知的方法在直链淀粉柱上纯化。
Zcyto21多肽还可以根据本领域已知的方法通过化学合成制备，包括完全固相合成、部分固相合成方法、片断缩合或经典的溶液合成。见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis(第2版)，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984；Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3，1986；和Atherton等，Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach，IRL Press，Oxford，1989。体外合成对于制备较小的多肽是尤其有利的。
使用本领域已知方法，可以制备单体或多体；糖基化或未糖基化；PEG化(pegylated)或未PEG化(non-pegylated)形式的Zcyto21蛋白质，这些蛋白质可以包括或可以不包括起始甲硫氨酸残基。
用于Zcyto21活性分析的靶细胞包括，但不限于，血管细胞(尤其是内皮细胞和平滑肌细胞)、造血(髓样和淋巴样)细胞、肝脏细胞(包括肝细胞、有窗内皮细胞、枯否氏细胞和Ito细胞)、成纤维细胞(包括人皮肤成纤维细胞和肺成纤维细胞)、胎肺细胞、关节滑膜细胞、周细胞、软骨细胞、成骨细胞和前列腺上皮细胞。内皮细胞和造血细胞来源于共同的祖先细胞，即成血管细胞(hemangioblast)(Choi等，Development 125：725-732，1998)。
本发明的Zcyto21蛋白质可以通过其活性，即调节应答细胞类型的增殖、分化、迁移、粘着或代谢，进行表征。Zcyto21蛋白质的生物学活性可以使用设计以检测细胞增殖、分化、迁移或粘着，或细胞代谢的改变(例如其它生长因子或其它大分子的产生)的体外或体内试验来测试。许多适宜的试验是本领域已知的，本文中公开了代表性试验。对于筛选，例如对于确定氨基酸替代、缺失或插入的效果，使用培养细胞进行的试验是最方便的。然而，鉴于发育过程(例如血管发生、伤口愈合)的复杂性，一般使用体内试验验证和进一步表征生物学活性。某些体外模型，例如Pepper等的三维胶原凝胶基质模型(Biochem.Biophys.Res.Comm.189：824-831，1992)足够复杂以致可测试组织学效果。可以使用外源产生的蛋白质进行试验，或可以使用表达目的多肽的细胞在体外或体内进行试验。可以使用单独的或与其它生长因子(例如VEGF家族成员)或造血细胞因子(如EPO、TPO、G-CSF、干细胞因子)结合的Zcyto21蛋白质进行试验。代表性的试验公开如下。
Zcyto21蛋白的活性可以使用培养细胞体外测量，或通过将本发明分子施用于适当的动物模型来体内测量。测量细胞增殖或分化的试验是本领域熟知的。例如，测量增殖的试验包括例如对中性红染料的化学敏感性(Cavanaugh等，Investigational New Drugs 8：347-354，1990)、在增殖细胞的DNA中掺入放射性标记的核苷酸(公开在例如Rains和Ross，Methods Enzymol.109：749-773，1985；Wahl等，Mol.Cell Biol.8：5016-5025，1988；和Cook等，Analytical Biochem.179：1-7，1989)、在增殖细胞的DNA中掺入5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(Porstmann等，J.Immunol.Methods 82：169-179，1985)、和使用四氮唑盐(Mosmann，J.Immunol.Methods 65：55-63，1983；Alley等，Cancer Res.48：589-601，1988；Marshall等，Growth Reg.5：69-84，1995；和Scudiero等，Cancer Res.48：4872-4833，1988)。分化可以使用能被诱导分化出更成熟表型的适宜前体细胞来测试。测量分化的试验包括例如测量与组织的阶段特异性表达有关的细胞表面标记、酶活性、功能活性或形态学改变(Watt，FASEB，5：281-284，1991；Francis，Differentiation 57：63-75，1994；Res，Adv.Anim.CellBiol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；所有文献均并入本文作为参考)。
还可以使用设计以检测Zcyto21诱导的一种或多种其它生长因子或其它大分子的产生的试验来检测Zcyto21的活性。优选的该类试验包括确定肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、白细胞介素-6(IL-6)、VEGF、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管生成素和肝脏产生的其它大分子是否存在的那些试验。适宜的试验包括使用应答目的大分子的靶细胞进行的有丝分裂试验、受体结合试验、竞争结合试验、免疫学试验(例如ELISA)和本领域已知的其它形式。可以从经处理的原代人皮肤成纤维细胞、滑膜细胞和软骨细胞测量金属蛋白酶分泌。响应在Zcyto21蛋白质存在下培养而产生的胶原酶、明胶酶和基质溶解酶(stromalysin)的相对水平可以使用酶谱凝胶(Loita和Stetler-Stevenson，Cancer Biology 1：96-106，1990)测量。皮肤成纤维细胞和软骨细胞应答测试蛋白质而进行的原胶原/胶原合成可以使用3H-脯氨酸在新生的分泌胶原中的掺入来测量。3H-标记的胶原可以通过SDS-PAGE之后放射自显影进行观察(Unemori和Amento，J.Biol.Chem.265：10681-10685，1990)。从皮肤成纤维细胞和软骨细胞分泌的糖胺聚糖(GAG)可以使用1，9-二甲基亚甲蓝染料结合试验(Farndale等，Biochem.Biophys.Acta 883：173-177，1986)测量。胶原和GAG试验还可以在存在IL-1α或TGF-α时进行以检测Zcyto21蛋白质修饰针对这些细胞因子建立的应答的能力。
可进行单核细胞活化试验以(1)探测Zcyto21蛋白质进一步刺激单核细胞激活的能力，和(2)检测Zcyto21蛋白质调节由附着诱导的或由外毒素诱导的单核细胞活化的能力(Fuhlbrigge等，J.Immunol.138：3799-3802，1987)。响应活化产生的IL-1α和TNFα的水平可以通过ELISA(Biosource，Inc.Camarillo，CA)测量。单核细胞/巨噬细胞借助CD14(LPS受体)对外毒素极为灵敏，具有适当水平的外毒素样活性的蛋白质可以活化这些细胞。
Zcyto21蛋白质的造血活性可以在培养的多种造血细胞上进行测试。优选的测试方法包括原代骨髓集落分析和晚期谱系限制性集落分析，它们是本领域已知的(例如Holly等，WIPO公开物WO 95/21920)。将接种在适宜半固体培养基(例如含有15％胎牛血清、10％牛血清白蛋白和0.6％PSN抗生素混合物的50％甲基纤维素)上的髓细胞在存在测试多肽的情况下培养，然后显微镜检测集落形成。已知的造血因子用作对照。Zcyto21多肽对造血细胞系的促有丝分裂活性可以按以上公开测量。
细胞迁移基本上按Kahler等(Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology 17：932-939，1997)公开的方法测定。如果一个蛋白质诱导细胞从低蛋白浓度的区域向高蛋白浓度的区域迁移，则该蛋白被认为具有趋化性。典型的试验使用修饰的Boyden室(用聚苯乙烯膜分开两室)(Transwell；Corning Costar Corp.)进行。将稀释在含有1％BSA的培养基中的测试样品加入含Transwell的24孔板的下部室中。然后，将细胞放在预先用0.2％明胶处理的Transwell插入物上。37℃孵育4小时后测量细胞迁移。除去Transwell膜顶部的非迁移细胞，并固定附着在膜下表面上的细胞，用0.1％结晶紫染色。然后用10％乙酸提取染色的细胞，并于600nm测量吸光度。然后从标准标定曲线计算迁移。还可以使用Grant等(“血管发生是上皮-间充质相互作用的一个成分”，Goldberg和Rosen，Epithelial-Mesenchymal Interaction in Cancer，BirkhauserVerlag，1995，235-248；Baatout，Anticancer Research 17：451-456，1997)的matrigel方法测量细胞迁移。
细胞粘着活性基本上按照LaFleur等(J.Biol.Chem.272：32798-32803，1997)公开的方法测定。简而言之，用测试蛋白质包被微量滴定板，用BSA封闭非特异位点，并以大约104-105个细胞/孔的密度接种细胞(如平滑肌细胞、白细胞或内皮细胞)。在37℃孵育这些孔(典型地大约60分钟)，然后通过温和洗涤除去未贴壁的细胞。通过常规方法(例如用结晶紫染色、裂解细胞并测定裂解物的光密度)定量贴壁细胞的数量。对照孔用已知的粘着蛋白，如纤连蛋白或玻连蛋白包被。
Zcyto21蛋白质的活性可以用硅基生物传感显微生理计(microphysiometer)(其测量与受体结合及随后的细胞生理反应有关的细胞外酸化速率或质子排出)测量。此类装置的一个例子是Molecular Devices(Sunnyvale，CA)制造的CytosensorTM显微生理计。多种细胞应答，如细胞增殖、离子运输、能量产生、炎症应答、调节和受体激活等均可以通过此方法测量。见，例如，McConnell等，Science 257：1906-1912，1992；Pitchford等，Meth.Enzymol.228：84-108，1997；Arimilli等，J.Immunol.Meth.212：49-59，1998；和Van Liefde等，Eur.J.Pharmacol.346：87-95，1998。显微生理计可以用于分析粘着或非粘着真核细胞或原核细胞。通过测量细胞培养基中细胞外酸化随时间推移的改变，显微生理计可以直接测量出细胞对多种刺激(包括Zcyto21蛋白、它们的激动剂和拮抗剂)的应答。优选使用显微生理计测量相对于不应答Zcyto21多肽的对照真核细胞，Zcyto21应答性真核细胞的反应。Zcyto21应答性真核细胞包括通过转染Zcyto21的受体而产生的应答Zcyto21的细胞、以及天然应答Zcyto21的细胞。通过细胞外酸化的改变(如增加或减少)测量到的暴露于Zcyto21的细胞与对照(未暴露于Zcyto21)在反应方面的差异，是对Zcyto21调节的细胞应答的直接测量。而且，由Zcyto21调节的此类应答还可以在多种刺激物下进行测定。因此，本发明提供鉴定Zcyto21蛋白的激动剂和拮抗剂的方法，包括提供应答Zcyto21多肽的细胞，将这些细胞的第一部分在无测试化合物时进行培养，将这些细胞的第二部分在有测试化合物时进行培养，和检测第二部分细胞相对于第一部分细胞在细胞应答方面的改变，如增加或减少。细胞应答的改变表现为可测量的细胞外酸化速率的改变。将上述细胞的第三部分在有Zcyto21蛋白但无测试化合物的情况下进行培养，这为Zcyto21应答性细胞提供了阳性对照，并为比较测试化合物的激动剂活性与Zcyto21多肽的活性提供了对照。Zcyto21的拮抗剂可以通过使细胞在有和无测试化合物的情况下暴露于Zcyto21蛋白进行鉴定，籍此Zcyto21刺激活性的降低指示测试化合物具有拮抗剂活性。
Zcyto21多核苷酸在动物中的表达为进一步研究体内过量产生或抑制蛋白质的生物学效应提供了模型。可以使用病毒载体或裸DNA将Zcyto21的编码多核苷酸和反义多核苷酸引入测试动物，如小鼠中，或可以制备转基因动物。
测试本发明蛋白质的一个体内方法利用了病毒递送系统。用于此目的的实例病毒包括腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和腺相关病毒(AAV)。腺病毒，一种双链DNA病毒，是目前研究得最好的递送异源核酸的基因转移载体。综述见Becker等，Meth.Cell Biol.43：161-89，1994；和Douglas和Curiel，Science & Medicine 4：44-53，1997。腺病毒系统有几个优点。腺病毒可以(i)容纳相当大的插入DNA；(ii)生长至高滴度；(iii)感染广谱的哺乳动物细胞类型；和(iv)与许多不同的启动子，包括遍在的、组织特异性的和可调节的启动子一起使用。由于腺病毒在血流中是稳定的，故它们可以通过静脉注射给药。
通过缺失部分腺病毒基因组，可以容纳更大的异源DNA插入片断(多达7kb)。可以通过直接连接或通过和共转染的质粒同源重组，将这些插入片断整合在病毒DNA中。在一个示例性系统中，从病毒载体中缺失必需的E1基因，这样除非宿主细胞(如人293细胞系)提供E1基因，否则该病毒将不能复制。当通过静脉内方式施用给完整动物时，腺病毒主要靶向肝。如果腺病毒递送系统具有E1基因缺失，则该病毒不能在宿主细胞中复制。然而，宿主组织(例如肝)将表达和加工(并且，如果存在信号序列，分泌)该异源蛋白质。分泌的蛋白质将在高度血管化的肝中进入循环系统，并可以测定它对感染动物的作用。
基因递送的另一备选方法包括采取机体的细胞并以裸DNA质粒的形式将载体引入该细胞中。然后将转化的细胞重新植入机体。将裸DNA载体引入宿主细胞的方法是本领域已知的，包括转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运者。见，Wu等，J.Biol.Chem.263：14621-14624，1988；Wu等，J.Biol.Chem.267：963-967，1992；和Johnston和Tang，Meth.Cell Biol.43：353-365，1994。
还可以制备(Lowell等，Nature 366：740-742，1993)经工程化表达Zcyto21基因的转基因小鼠、和表现出完全缺失Zcyto21基因功能的小鼠，后者被称作“敲除小鼠(knockout mice)”(Snouwaert等，Science 257：1083，1992)。可以利用这些小鼠在体内系统中研究Zcyto21基因和由此编码的蛋白质。转基因小鼠对于研究Zcyto21蛋白在早期发育中的作用尤其有用，因为它们允许鉴定由于特异因子的过度或不足表达引起的发育异常或中断。也参见Maisonpierre等，Science 277：55-60，1997和Hanahan，Science 277：48-50，1997。转基因表达的优选启动子包括来自金属硫蛋白和白蛋白基因的启动子。
对肌肉收缩的正常抑制性控制的丧失与选择的分泌γ氨基丁酸的神经元的损伤或紊乱有关。例如，僵人综合征表现出显著的肌肉系统僵硬，这被认为是通过干扰产生γ氨基丁酸(GABA)的神经元的功能来介导的。其它相关的神经肌肉疾病包括肌强直、代谢性肌病、艾萨克综合征、肌张力障碍和强直性痉挛(Valldeoriola，J.Neurol.246：423-431，1999)。
类似地，可以在经历肿瘤进展的组织或细胞中对Zcyto21多肽、或它在组织中的表达丧失进行直接测量。与正常组织相比，癌前或癌性情况下细胞侵入性和运动性的增加、或Zcyto21表达的获得或丧失可以用于诊断肿瘤进程中的转化、侵入和转移。就这一点而论，有关肿瘤进展或转移阶段的信息将帮助医师针对给定的独特癌症患者选择最适当的治疗或治疗侵袭性。用于测量(mRNA或蛋白质的)表达获得和丧失的方法是本领域熟知的并描述在本文中，可以将它们应用于Zcyto21的表达。例如，可以使用调节细胞运动性的多肽的出现或消失来帮助诊断前列腺癌和进行预后(Banyard，J.和Zetter，B.R.，Cancer and Metast.Rev.17：449-458，1999)。作为细胞运动性的效应子或作为肝特异性标志，Zcyto21的表达获得或丧失可以用于诊断脑癌和其它癌症。而且，类似于前列腺特异性抗原(PSA)，相对于正常对照，患者中Zcyto21多肽的水平增加或抗Zcyto21抗体可以指示脑癌和其它癌症(见例如Mulders，TMT等，Eur.J.Surgical Oncol.16：37-41，1990)。Zcyto21在正常发现不表达Zcyto21的组织中的强表达可以用于诊断细胞或组织类型中的异常、癌性肝组织向非肝组织的侵入或转移，并可以帮助医师指导进一步的测试或研究或帮助医师指导治疗。
此外，Zcyto21多核苷酸探针、抗Zcyto21抗体、及对组织中Zcyto21存在的检测也可以用于评价是否存在正常表达Zcyto21的脑或其它组织，例如，在涉及切除患病的或癌性肝或神经组织的手术后进行评价。在这点上，本发明的多核苷酸、多肽和抗体可以用于帮助确定手术后(例如，脑和其它癌的手术后)是否所有的组织都被切除。在这些情况中，尤其重要的是除去所有潜在的患病组织以便在癌症后实现最大的恢复和最小的复发。优选的实施方案包括可以组织学或原位使用的荧光的、放射性标记的或量热方式标记的抗Zcyto21抗体和Zcyto21多肽结合伙伴。
而且，可以体内测量Zcyto21的活性和对肿瘤进展及转移的影响。几个同基因小鼠模型已被开发用于研究多肽、化合物或其它治疗对肿瘤进展的影响。在这些模型中，将传代培养的肿瘤细胞植入与肿瘤供体相同品系的小鼠中。细胞将在受体小鼠中发育成具有相似特征的肿瘤，而且在某些模型中会发生转移。对于我们的研究，适当的肿瘤模型包括尤其是Lewis肺癌(ATCC No.CRL-1642)和B16黑素瘤(ATCC No.CRL-6323)。这两个均是常用的肿瘤系，与C57BL6小鼠同基因，易于在体外培养和操作。由植入其中任一个细胞系引起的肿瘤能够在C57BL6小鼠中向肺转移。Lewis肺癌模型近来被用于小鼠中鉴定血管生成抑制剂(O’Reilly MS等，Cell 79：315-328，1994)。通过每日注射重组蛋白、激动剂或拮抗剂或一次性注射重组腺病毒用试验剂处理C57BL6/J小鼠。此处理后3天，将105至106个细胞移植在背部皮肤之下。或者，可以在移植前用重组腺病毒(例如表达Zcyto21的重组腺病毒)感染细胞本身，以便在肿瘤位置或在细胞内而不是在全身合成该蛋白质。该小鼠正常在5日内长出可见的肿瘤。允许该肿瘤生长多达3个星期，在此期间它们在对照处理组中可以达到1500-1800mm3大小。在整个实验过程中仔细监测肿瘤的尺寸和体重。处死时，与肺和肝一起取出肿瘤并称重。肺重显示出与转移的肿瘤负荷十分相关。作为另一种测量方法，计数肺表面转移瘤。使用本领域已知的和本文中描述的方法处理切下的肿瘤、肺和肝以便进行组织病理学检查、免疫组织化学分析和原位杂交。由此可以评价表达的目的多肽，例如Zcyto21对肿瘤募集血管系统和进行转移的能力的影响。此外，除了使用腺病毒外，还可以用Zcyto21瞬时转染植入的细胞。应用稳定的Zcyto21转染子以及应用诱导型启动子体内激活Zcyto21表达是本领域已知的，而且可以将它们用于该系统中以评价Zcyto21对转移的诱导。而且，可以直接将纯化的Zcyto21或Zcyto21的条件培养基注射至该小鼠模型中，并由此用于该系统。一般地参见，O’Reilly MS等，Cell 79：315-328，1994；和Rusciano D等，肝转移的鼠模型，Invasion Metastasis 14：349-361，1995。
可以使用反义方法学抑制Zcyto21基因转录以检测该抑制的体内效应。设计与Zcyto21的编码多核苷酸(例如SEQ ID N0：1中所示多核苷酸)的区段互补的多核苷酸，以便其与Zcyto21的编码mRNA结合并抑制该mRNA翻译。这些反义寡核苷酸还可以用于细胞培养物中抑制Zcyto21多肽的编码基因的表达。
大多数细胞因子以及活化淋巴细胞产生的其它蛋白质对于整个身体的细胞分化、激活、募集和细胞稳态有重要的生物学作用。Zcyto21及其活性的抑制剂预期具有多种治疗用途。这些治疗用途包括治疗需要免疫调节的疾病，包括自身免疫病如类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮和糖尿病。Zcyto21对于炎症调节可能是重要的，因此可以用于治疗类风湿性关节炎、哮喘和败血症。Zcyto21可能在介导肿瘤发生中有作用，由此Zcyto21拮抗剂可以用于治疗癌症。Zcyto21可以用于调节免疫系统，由此，可以使用Zcyto21及Zcyto21的拮抗剂降低移植排斥、预防移植物抗宿主疾病、增强对感染性疾病的免疫、治疗无免疫应答的患者(例如HIV+患者)或改善疫苗。
作为脑、胰岛、前列腺、睾丸、垂体、胎盘、卵巢肿瘤、肺肿瘤、直肠肿瘤和卵巢肿瘤的组织、以及CD3+细胞系和病毒感染的前列腺上皮细胞系中的干扰素样多肽，Zcyto21可用于在这些和其它组织中调节病毒感染、肿瘤发生和转移。在这类情况下，该干扰素样分子可以由细胞释放在感染位置或异常细胞生长位置，或其可以作为分泌分子从远处的组织向这些位置迁移。
Zcyto21的抗病毒性质对于体外和体内治疗乳头状瘤病毒感染尤其有用。例如，人类乳头状瘤病毒所引起的肿瘤会造成良性肿瘤(即生殖疣)以及恶性肿瘤如鳞状细胞癌。这些疾病的治疗通常是进行手术或组织破坏。然而，目前，一些抗病毒/免疫调节药物，包括干扰素α，已被证实可以有效地降低肿瘤的大小。见Baker，G.Eet等，Dermatol.Clin.Apr.15：331-340，1997。而且，如Rockley，P.F.等(Pharmacol.Ther.65(2)：265-287，1995)所讨论的，用干扰素进行的免疫治疗可以指向所有的感染位置，包括临床、亚临床和潜伏疾病。在此例子中，IFN-α、IFN-β和IFN-γ已成功地作为单一疗法以及与其它治疗联用以治疗肛门和生殖器尖锐湿疣。在该治疗中Zcyto21将是类似于IFN-α、IFN-β和IFN-γ的有用疗法。而且，在某些类型的人类乳头状瘤病毒和宫颈癌之间存在强相关性。可以使用Zcyto21检测、监测和治疗宫颈癌。
作为胰岛细胞中一种小的分泌蛋白质，Zcyto21可以调节这些细胞的生长和分化。此外，Zcyto21还可以用于治疗与这些细胞的生长和分化有关的糖尿病和免疫疾病。
Zcyto21在脑和垂体细胞中的存在说明，它还可以用于这些细胞的生长和分化。而且，本发明分子可能负责营养稳态，包括与进食和食欲压抑有关的行为疾病。此外，Zcyto21分子可以用于治疗一般性的生殖疾病。
Zcyto21多肽可以单独或联合其它脉管生成或血管生成剂(包括VEGF)给药。当与其它药剂联合使用Zcyto21时，对于所治疗的具体疾病，可以适当地同时或相继施用这两种化合物。
Zcyto21对于治疗肿瘤发生是有用的，因此可以用于治疗癌症。Zcyto21可以抑制抗IgM刺激的正常B细胞，在B细胞肿瘤系中观察到类似效果，这提示使用Zcyto21治疗患者以诱导B细胞肿瘤细胞进入增殖较不活跃的状态可以具有治疗益处。可以将该配体和其它已应用的药剂(包括常规化疗药剂以及免疫调节剂如干扰素α)联合给药。α/β干扰素已被证实可以有效地治疗某些白血病和动物疾病模型，而且对于B细胞肿瘤来源的细胞系，干扰素α和Zcyto21的生长抑制作用可以相加。
本发明提供降低赘生性B或T细胞增殖的方法，包括给具有B或T细胞赘生物的哺乳动物施用给药量足以降低赘生性B或T细胞增殖的zcyto 21组合物。Zcyto21可以刺激来自骨髓祖先细胞的裂解性NK细胞并在抗原受体活化后刺激T细胞增殖，这将增强对接受同种异型骨髓移植的患者的治疗，因此，在输注或不输注供体淋巴细胞的情况下，Zcyto21均可以增强抗肿瘤应答的产生。
另一方面，本发明提供降低赘生性B或T细胞增殖的方法，包括给具有B或T细胞赘生物的哺乳动物施用给药量足以降低赘生性B或T细胞增殖的zcyto 21拮抗剂组合物。而且，该Zcyto21拮抗剂可以是配体/毒素融合蛋白。
可以使用Zcyto21与皂草素的融合毒素对抗一组类似的白血病和淋巴瘤，从而扩大了可以用Zcyto21治疗的白血病范围。融合毒素介导的zcyto20受体激活为抑制靶细胞生长提供了两个独立方式，第一个方式与单独使用配体时观察到的效应一样，而第二个方式的原因在于通过受体内化递送毒素。
基于本文的教导，本发明干扰素样Zcyto21分子可以用于检测、监测或治疗多种疾病，如多毛细胞白血病、肾细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色瘤、AIDS相关的卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、喉乳头状瘤、蕈样肉芽肿、尖锐湿疣、乳头瘤病毒诱导的疣状表皮发育不良慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、慢性非甲非乙/丙型肝炎。美国药品和食品管理局已经批准使用干扰素β治疗多发性硬化、神经系统的慢性疾病。干扰素γ被用于治疗慢性肉芽肿疾病，干扰素在其中增强患者的免疫应答以破坏感染性细菌、真菌和原生生物病原体。临床研究还指出，干扰素γ可以用于治疗AIDS、利什曼病和瘤型麻风。
对于药物应用，可以根据常规方法对Zcyto21蛋白质进行配制以便局部或胃肠外，尤其是静脉内或皮下给药。一般，药物制剂包括Zcyto21多肽和可药用载体，如盐水、缓冲盐水、5％葡聚糖水溶液等。制剂还可以包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止蛋白质丢失在瓶表面上的白蛋白等。配制方法是本领域熟知的，公开在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版，1995。Zcyto21优选以大约10至100μg/ml总体积的浓度使用，但也可以使用1ng/ml至1000μg/ml的浓度。对于局部使用，例如为了促进伤口愈合，可以按0.1-10μg/cm2伤口面积使用该蛋白质，确切的剂量由临床医师根据接受的标准，考虑待治疗疾病的性质和严重性、患者的特性等来确定。剂量的确定属于本领域普通技术人员的水平。可以在治疗期间每日或间歇地给药。可以在一至几个小时的典型时间期限内通过快速注射或灌注进行静脉给药。还可以使用缓释制剂。一般，Zcyto21的治疗有效量是指足以造成所治疗疾病出现临床上显著改变(例如造血或免疫功能方面的临床显著改变、发病率的显著降低或组织学评分的显著增加)的量。
Zcyto21蛋白质、激动剂和拮抗剂可以用于调节应答性细胞类型的扩增、增殖、激活、分化、迁移或代谢，这些细胞类型包括原代细胞和培养的细胞系。在这方面尤其有意义的是造血细胞、间充质细胞(包括干细胞和成熟髓样细胞和淋巴样细胞)、内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、肝细胞、神经细胞和胚胎干细胞。将Zcyto21多肽加入这些细胞类型的组织培养基中，浓度为约10pg/ml至约100ng/ml。本领域技术人员将明了，可以在培养基中有利地联合使用Zcyto21蛋白质和其它生长因子。
在实验室研究领域，Zcyto21蛋白还可以用作分子量标准或在测定该蛋白质的循环水平的分析中用作试剂，如用于诊断以过量或低量产生Zcyto21蛋白质为特征的疾病或分析细胞表型。
还可以用Zcyto21蛋白质鉴定它们活性的抑制剂。将测试化合物加入上述试验中以鉴定抑制Zcyto21蛋白质活性的化合物。除了上述试验外，还可以在多种设计用来测量受体结合或Zcyto21依赖性细胞应答的刺激/抑制的试验中测试样品对Zcyto21活性的抑制。例如，可以用响应Zcyto21所刺激的细胞途径的报道基因结构转染Zcyto21应答性细胞系。该类报道基因结构是本领域已知的，一般包括可操作地与编码可检测蛋白质(如萤光素酶)的基因连接的Zcyto21激活的血清效应元件(SRE)。在靶细胞上测试候选化合物、溶液、混合物或提取物抑制Zcyto21活性的能力，这可以通过Zcyto21刺激的报道基因表达的减少来证实。此类试验可以检测直接阻断Zcyto21与细胞表面受体结合的化合物以及阻断发生在受体-配体结合后的细胞途径中的过程的化合物。在备选方法中，可以使用连接有可检测标记(例如125I、生物素、辣根过氧化物酶、FITC等)的Zcyto21，测试直接阻断Zcyto21与受体结合的化合物或其它样品。在此类试验中，测试样品抑制标记的Zcyto21与受体结合的能力指示了抑制活性，这可以通过别的试验进行验证。用于结合试验中的受体可以是细胞受体或分离的固定化受体。
本文中，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其抗原结合片断如F(ab’)2和Fab片断、单链抗体等，其中包括遗传工程化抗体。非人抗体可以通过在人构架和恒定区上嫁接非人CDR、或通过整合完整的非人可变区(任选地通过替换暴露的残基用人样表面“遮蔽”它们，其中结果是“镶饰”抗体)实现人源化。在一些情况中，人源化抗体可以在人可变区构架域中保留非人残基以增加正确的结合特征。通过使抗体人源化，可以增加生物学半衰期，并减少在施用于人后出现不良免疫应答的可能性。本领域技术人员可以用特定和不同的恒定区(即不同的Ig亚型)制备人源化抗体以促进或抑制与特定抗体恒定区有关的不同免疫功能。如果抗体与Zcyto21多肽或蛋白质的结合亲和力比抗体与对照(非Zcyto21)多肽或蛋白质的结合亲和力高至少10倍，则该抗体被定义为发生特异结合。本领域普通技术人员可以容易地测定单克隆抗体的亲和力(见，例如Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-627，1949)。
制备单克隆和多克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Hurrell，J.G.R.编，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques andApplications，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982，并入本文作为参考)。尤其有意义的是制备针对亲水性抗原性位点的抗体，所述抗原性位点包括例如SEQ ID NO：2第155(Glu)至160(Glu)位氨基酸残基；第51(Lys)至56(Ala)位氨基酸残基；第50(Phe)至55(Asp)位氨基酸残基；第140(Pro)至145(Arg)位氨基酸残基；第154(Gln)至159(Lys)位氨基酸残基。本领域普通技术人员将明了，多克隆抗体可以从多种温血动物如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠制备。Zcyto21多肽的免疫原性可以通过使用佐剂如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂来加强。用于免疫的多肽还包括融合多肽，如Zcyto21多肽或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，则该部分可以有利地与大分子载体(如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
制备或筛选抗体的备选技术包括体外使淋巴细胞暴露于Zcyto 21多肽、和在噬菌体或类似载体中筛选抗体展示文库(例如通过使用固定化的或标记的Zcyto215多肽)。人抗体可以在已经通过工程化而含有人免疫球蛋白基因的转基因非人动物中制备，见WIPO公开文本WO98/24893中的公开。优选通过例如同源重组的方式失活或清除这些动物中的内源性免疫球蛋白基因。
本领域技术人员已知的多种试验均可以用于检测特异结合Zcyto21多肽的抗体。示例性试验详细描述在Antibodies：ALaboratory Manual，Harlow和Lane(编)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988。此类试验的代表性例子包括：并行免疫电泳(concurrent immunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点印迹分析、Western印迹分析、抑制或竞争试验和三明治试验。
Zcyto21的抗体可以用于亲和纯化这些蛋白质，在诊断试验中用于确定这些蛋白质的循环水平；用于检测或定量作为潜在病理学或疾病的标志的可溶性Zcyto21多肽；用于在整体动物或组织切片中免疫定位，包括免疫诊断应用；用于免疫组织化学；和用作拮抗剂以体内和体外阻断蛋白质活性。Zcyto21的抗体还可以用于标记表达Zcyto21的细胞；用于亲和纯化Zcyto21多肽和蛋白质；用于使用FACS的分析方法中；用于筛选表达文库；和用于制备抗独特型抗体。可以使用已知方法使抗体和其它化合物，包括治疗性和诊断性药剂连接，以使这些化合物可以靶向表达Zcyto21的受体的细胞。对于某些应用，包括体外和体内诊断应用，有利的是使用标记的抗体。适宜的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等；间接标签或标记可以类似使用生物素-亲和素或其它互补物/反互补物对作为中间体。本发明抗体还可以直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等偶连，而且这些偶连物可以用于体内诊断或治疗应用(例如抑制细胞增殖)。一般见Ramakrishnan等，Cancer Res.56：1324-1330，1996。
本发明多肽和蛋白质可以用于鉴定和分离受体。Zcyto21的受体可能参与肝脏中的生长调节、血管形成和其它发育过程。例如，可以将Zcyto21蛋白质和多肽固定在柱子上，然后使膜制品过柱(一般见Immbolized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等编，Academic Press，San Diego，CA，1992，第195-202页)。还可以对蛋白质和多肽进行放射性标记(Methods Enzymol.第182卷，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher编，Academic Press，San Diego，1990，721-737)或光亲和标记(Brunner等，Ann.Rev.Biochem.62：483-514，1993和Fedan等，Biochem Pharmacol.33：1167-1180，1984)，并可以将其用于标记特异的细胞表面蛋白质。类似地，可以在结合试验中使用cDNA表达文库转染的细胞，利用放射性标记的Zcyto21蛋白质和多肽克隆同源受体。
Zcyto21多肽还可以用于教导分析技术，例如质谱、园二色性以确定尤其是四α螺旋的构象，x射线晶体学以在原子细节上确定三维结构，核磁共振光谱分析以揭示蛋白质在溶液中的结构。例如，可以给学生含有Zcyto21的试剂盒用于分析。由于氨基酸序列是教导者已知的，因此可以给予学生该蛋白质作为确定或发展学生技能的试验，然后教导者将知道学生是否正确地分析了该多肽。由于每个多肽都是独特的，因此教学利用Zcyto21本身将具有独特性。
与Zcyto21特异结合的抗体可以用作教学辅助工具以教导学生如何制备亲和层析柱以纯化Zcyto21，以及克隆和测序编码该抗体的多核苷酸并由此作为实践课用于教导学生如何设计人源化抗体。Zcyto21基因、多肽或抗体可以由试剂公司包装并出售给教学机构以便学生掌握分子生物学领域的技能。由于每个基因和蛋白质都是独特的，因此在实验课中每个基因和蛋白质对于学生来说都构成了独特的挑战和学习经验。这些含有Zcyto21基因、多肽或抗体的教学试剂盒被认为属于本发明范围。由此一般描述的本发明参考以下实施例将更容易被理解，这些实施例用于举例说明，而不对本发明产生限制。
实施例
实施例1
含有编码Zcyto21的多核苷酸之全部或部分的表达质粒通过同源重组构建。使用SEQ ID NO：1的多核苷酸序列通过PCR分离Zcyto21cDNA的片断，该多核苷酸序列的5’和3’端侧翼区相应于Zcyto21插入点两侧的载体序列。每个PCR引物从5’至3’端包括来自载体的40bp侧翼序列和相应于Zcyto21可读框氨基端和羧基端的17bp序列。
取100μl PCR反应混合物中的10μl用1×TBE缓冲液在0.8％低熔点琼脂糖(SealPlaque
Figure C0181315300521
FMC BioProducts，Rochland，ME)凝胶上电泳分析。剩下的90μl反应混合物通过加入5μl 1M NaCl和250μl无水乙醇而沉淀。使用已被Sma I切割的质粒pZMP6来与该PCR片断重组。质粒pZMP6是一个哺乳动物表达载体，包含带有巨细胞病毒即早期启动子、用于插入编码序列的多限制位点、终止密码子和人生长激素终止子的表达盒；大肠杆菌复制起点；包含SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单位；和在酿酒酵母中选择和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列。它pZP9(保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏号98668)，使用取自pRS316(保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，保藏号77145)的酵母遗传元件、来自脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)和在跨膜域的C末端截短的CD8细胞外域构建成的。
独立地将100μl感受态酵母(酿酒酵母)细胞与10μl来自上面的不同DNA混合物混合，然后转移至0.2cm的电穿孔杯中。酵母/DNA混合物使用设置在0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF的供电装置(BioRadLaboratories，Hercules，CA)进行电脉冲处理。向每个杯中加入600μl 1.2M山梨糖醇，然后按两个300μl等分试样将酵母接种在两个URA-D平板上，30℃孵育。大约48小时后，将来自一个平板的Ura+酵母转化体重新悬浮在1ml H2O中，短暂离心以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬在1ml裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris，pH 8.0、1mM EDTA)中。将500μl裂解混合物加入含有300μl酸洗涤过的玻璃珠和200μl酚-氯仿的Eppendorf管中，涡旋1分钟，重复2或3次，然后以最大速度在Eppendorf离心机中离心5分钟。将300μl水相转移至新的管中，然后用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA，之后4℃离心10分钟。将DNA沉淀重悬在10μl H2O。
用0.5-2ml酵母DNA制品和40μl细胞进行电感受态大肠杆菌宿主细胞(Electromax DH10BTM细胞；获自Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的转化。以1.7kV、25μF和400欧姆对细胞进行电脉冲处理。电穿孔后，将1ml SOC(2％BactoTM胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)以250μl等分试样铺在4个LB AMP平板(LB培养基(Lennox)、1.8％BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。
通过限制性消化鉴定含有正确的Zcyto21表达结构的单个克隆，以验证Zcyto21插入片断的存在和证实各个DNA序列已正确地彼此连接。对阳性克隆的插入片断进行序列分析。使用商业试剂盒(QIAGENPlasmid Maxi试剂盒，Qiagen，Valencia，CA)根据厂商说明书大规模分离质粒DNA。正确的结构命名为pZMP6/Zcyto21。
实施例2
将CHO DG44细胞(Chasin等，Som.Cell Molec.Genet.12：555-666，1986)铺在10cm组织培养皿中，使之在37℃和5％CO2下在Ham氏F12/FBS培养基(Ham氏F12培养基(Life Technologies)、5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)、1％L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)、1％丙酮酸钠(Life Technologies))中生长至50％至70％汇合。然后通过脂质体介导的转染，用3∶1(w/w)聚阳离子脂2，3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙亚胺鎓三氟乙酸盐和中性脂二油酰基磷脂酰乙醇胺在膜过滤水中的脂质体制剂(LipofectamineTM Reagent，Life Technologies)，在无血清(SF)培养基制剂(Ham氏F12、10mg/ml转铁蛋白、5mg/ml胰岛素、2mg/ml胎球蛋白、1％L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)中，用质粒Zcyto21/pZMP6转染细胞。用SF培养基将Zcyto21/pZMP6稀释在15ml管中至640μl的总最终体积。使35μl LipofectamineTM和605μl SF培养基混合。将所获混合物加入DNA混合物中，使之在室温孵育约30分钟。向DNA：LipofectamineTM混合物中加入5ml SF培养基。用5ml SF培养基洗涤细胞一次，将之吸出，之后加入DNA：LipofectamineTM混合物。37℃孵育细胞5小时，然后向每个平板加入6.4ml Ham氏F12/10％FBS、1％PSN培养基。平板在37℃孵育过夜，第二天用新鲜的5％FBS/Ham氏F12更换DNA：LipofectamineTM混合物。在转染后第三天，将细胞分开，放入T-175摇瓶的生长培养基中。在转染后第7天，用FITC-抗CD8单克隆抗体(Pharmingen Biotec)，之后用抗FITC偶连的磁珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)染色细胞。使用商品柱(mini-MACS柱；Miltenyi Biotec)根据厂商指导分离CD8阳性细胞，将其放入无核苷但有50nM氨甲蝶呤的DMEM/Ham氏F12/5％FBS(选择培养基)中。
以每孔0.5、1和5个细胞的密度将细胞接种在96孔平皿的选择培养基中以便进行亚克隆，使细胞生长大约2周。检查孔中培养基的蒸发，在该过程中如果必要可以使每孔恢复到200μl。当平板上大多数集落接近汇合时，从每个孔收集100μl培养基用于点印迹分析，并给细胞添加新鲜选择培养基。在点印迹装置中将上清液加载在硝酸纤维素滤膜上，然后真空炉中100℃处理该滤膜以变性蛋白质。滤膜在625mM Tris-甘氨酸(pH 9.1)、5mM β-巯基乙醇中65℃孵育10分钟，然后在2.5％脱脂干奶粉的Western A缓冲液(0.25％明胶、50mMTris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、0.05％Igepal CA-630)中于旋转摇床上4℃孵育过夜。室温下于旋转摇床上在2.5％脱脂干奶粉的Western A缓冲液中用抗体-HRP缀合物孵育滤膜1小时。然后室温下在添加有0.01％Tween 20的PBS中洗涤滤膜三次，每次15分钟。用化学发光试剂(ECLTM直接标记试剂盒；Amersham Corp.，ArlingtonHeights，IL)根据厂商指导显色滤膜，然后将其对胶片(HyperfilmECL，Amersham Corp.)曝光约5分钟。用胰蛋白酶处理96孔皿中的阳性克隆，将之转移至6孔皿的选择培养基中以便放大和用于Western印迹分析。
实施例3
在用pZMP6/Zcyto21(实施例1)转染的BHK细胞中制备全长Zcyto21蛋白质。将BHK570细胞(ATCC CRL-10314)接种在10cm组织培养皿，使之在37℃和5％CO2下于DMEM/FBS培养基(DMEM，Gibco/BRLHigh Glucose；Life Technologies)、5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1mM L-谷氨酰胺(JRH Bioscience，Lenexa，KS)、lmM丙酮酸钠(Life Technologies)中过夜生长至大约50％至70％汇合。然后通过脂质体介导的转染(使用LipofectamineTM；Life Technologies)在无血清(SF)培养基(补加了10mg/ml转铁蛋白、5mg/ml胰岛素、2mg/ml胎球蛋白、1％L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠的DMEM)中用pZMP6/Zcyto21转染该细胞。用SF培养基将质粒稀释在15ml管中至640μl的总最终体积。将35μl脂混合物和605μl SF培养基混合，室温孵育所获混合物大约30分钟。然后将5ml SF培养基加入DNA：脂混合物中。用5mlSF培养基洗涤细胞一次，将之吸出，然后加入DNA：脂混合物。细胞在37℃孵育5小时，然后向每个平板加入6.4ml DMEM/10％FBS，1％PSN培养基。37℃孵育平板过夜，第二天用新鲜的5％FBS/DMEM培养基更换DNA：脂混合物。在转染后第5天，将细胞分开，放入T-162烧瓶的选择培养基(DMEM+5％胎牛血清、1％L-Gln、1％NaPyr、1μM氨甲蝶呤)。转染后大约10天，胰蛋白酶处理来自各个转染的两个150mm培养皿中的抗氨甲蝶呤集落，将细胞汇合，并接种在T-162摇瓶中然后转移至大规模培养。
实施例4
为了构建腺病毒载体，使用分别在5’和3’末端添加了PmeI和AscI限制性位点的引物通过PCR扩增人Zcyto21蛋白质编码区。使用全长Zcyto21 cDNA模板按如下在PCR反应中进行扩增：95℃5分钟进行一个循环；之后95℃1分钟、61℃1分钟、72℃1.5分钟进行15个循环；之后72℃7分钟；之后4℃保温。将PCR反应产物加载至TAE缓冲液(0.04M Tris乙酸，0.001M EDTA)中的1.2％低熔点琼脂糖凝胶上。从凝胶上切下Zcyto21PCR产物，并用包含硅胶膜离心柱的商业试剂盒(
Figure C0181315300561
PCR纯化试剂盒和凝胶提纯试剂盒；Qiagen，Inc.)按照试剂盒说明进行纯化。然后用PmeI和AscI消化、酚/氯仿抽提、EtOH沉淀PCR产物，之后重新在20mM TE(Tris/EDTA pH 8.0)中水合。然后将Zcyto21片断连接至转基因载体pTG12-8的PmeI-AscI位点中，并通过电穿孔转化大肠杆菌DH10BTM感受态细胞。载体pTG12-8通过在Nru I位点插入大鼠胰岛素II内含子(大约200bp)和多接头(Fse I/Pme I/AscI)来源于p2999B4(Palmiter等，Mol.Cell Biol.13：5266-5275，1993)。该载体包含被10kb MT-15’侧翼序列和7kbMT-13’侧翼序列包围的小鼠金属硫蛋白(MT-1)启动子(大约750bp)和人生长激素(hGH)非翻译区及聚腺苷酸化信号(大约650bp)。将cDNA插在胰岛素II和hGH序列之间。含有Zcyto21的克隆通过质粒DNA小量制备，之后用PmeI和AscI消化进行鉴定。测序阳性克隆以确保构建体中无缺失或其它异常。
使用商业试剂盒(Maxi试剂盒，Qiagen，Inc.)制备DNA，并使用PmeI和AscI酶从pTG12-8载体中释放Zcyto21 cDNA。在1％低熔点琼脂糖凝胶上分离该cDNA并从凝胶上将之切下。切下的胶条在70℃溶化，用等体积Tris缓冲的酚抽提DNA两次，用EtOH沉淀，然后将之重悬在10μl H2O中。
将Zcyto21 cDNA克隆至修饰的pAdTrack-CMV(He，T-C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2509-2514，1998)的EcoRV-AscI位点中。该构建体含有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因。将驱动GFP表达的CMV启动子替换成SV40启动子，并用人生长激素聚腺苷酸化信号替代SV40的聚腺苷酸化信号。此外，用FseI、EcoRV和AscI位点替换原来的多接头。该修饰形式的pAdTrack-CMV被命名为pZyTrack。使用商业DNA连接和筛选试剂盒(
Figure C0181315300571
试剂盒；Epicentre Technologies，Madison，WI)进行连接。通过用FseI和AscI消化小量制备的DNA，鉴定含有Zcyto21的克隆。为了线性化该质粒，用PmeI消化约5μg的所获pZyTrack Zcyto21质粒。大约1μg线性化质粒和200ng超螺旋pAdEasy(He等，同上)共转化大肠杆菌BJ 5183细胞(He等，同上)。使用Bio-Rad基因脉冲仪在2.5kV、200欧姆和25μFa时进行共转化。将所有的共转化混合物铺在4个含有25μg/ml卡那霉素的LB平板上。挑取最小的菌落并在LB/卡那霉素中扩增，通过标准DNA小量制备方法鉴定重组腺病毒DNA。用小量制备的重组腺病毒DNA转化大肠杆菌DH1OBTM感受态细胞中，并使用Maxi试剂盒(Qiagen，Inc.)根据试剂盒说明制备DNA。
用PacI酶(New England Biolabs)37℃消化约5μg重组腺病毒DNA3小时，其中反应体积为100μl，含有20-30U PacI。消化的DNA用等体积酚/氯仿抽提两次，并用乙醇沉淀。将DNA沉淀重悬在10μl蒸馏水中。用PacI消化的DNA对前一天接种并生长至60％-70％汇合的T25摇瓶中的QBI-293A细胞(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal，Qc.加拿大)进行转染。用无菌HBS(150mM NaCl，20mMHEPES)将PacI消化的DNA稀释至50μl总体积。在单独的管中，用HBS将20μl 1mg/ml N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵盐(DOTAP)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)稀释至100μl总体积。在DOTAP中加入DNA，通过上下抽吸温和地混匀，然后置室温下15分钟。从293A细胞中除去培养基，并用5ml含有1mM丙酮酸钠、0.1mM MEM非必需氨基酸和25mM HEPES缓冲液(从LifeTechnologies，Gaithersburg，MD获得的试剂)的无血清极限必需培养基(MEM)α洗涤。在293A细胞中加入5ml无血清MEM，并置于37℃。向T25摇瓶中的293A细胞滴加DNA/脂混合物，温和混合，并37℃孵育4小时。4小时后，吸出含有DNA/脂混合物的培养基，并更换为含有5％胎牛血清的5ml完全MEM。监测转染细胞的GFP表达和转化灶(病毒斑)的形成。
用重组腺病毒DNA转染293A细胞后7天，细胞表达GFP蛋白并开始形成病灶(病毒“斑”)。使用细胞刮棒收集粗病毒裂解物以便收集所有的293A细胞。将裂解物转移至50ml锥形管中。为了将大多数病毒颗粒从细胞中释放出来，在干冰/乙醇浴和37℃水浴中进行3个冻/融循环。
扩增(初次(1°)扩增)粗裂解物以获得Zcyto21 rAdV裂解物的工作“原液”。预先培养20小时以得到其中293A细胞接近汇合(80％-90％)的10个10cm平板，向每个10cm平板加入200ml粗rAdV裂解物，然后在白光显微镜下监测细胞的CPE(致细胞病变效应)48至72小时，并在荧光显微镜下监测GFP的表达。当所有的293A细胞表现出CPE时，收集此原液裂解物并按上述进行冻融循环。
然后二次(2°)扩增Zcyto21rAdV。预备20个15cm组织培养皿的293A细胞以便细胞达到80-90％汇合。仅留下20ml 5％MEM培养基，并用300-500ml初次扩增的rAdV裂解物接种每个平板。48小时后，由于病毒生产，293A细胞裂解，将裂解物收集在250ml聚丙烯离心瓶中，纯化rAdV。
向粗裂解物的瓶中加入NP-40去污剂，达到0.5％的终浓度，以便裂解所有细胞。将瓶子放置在旋转平台上10分钟，在不翻转瓶子的情况下尽可能快地进行摇动。20,000×G离心15分钟以沉淀碎片。将上清液转移至250ml聚碳酸酯离心瓶中，然后加入0.5体积的20％PEG8000/2.5M NaCl溶液。在冰上振摇瓶子过夜。20,000×G离心瓶子15分钟，然后将上清液丢弃至漂白溶液中。使用无菌细胞刮棒，将2个瓶子的白色病毒/PEG沉淀重悬在2.5ml PBS中。将所获病毒溶液置于2ml微量离心管中，在微量离心机中14,000×G离心10分钟以除去所有的其它细胞碎片。将来自2ml微量离心管的上清液转移至一个15ml聚丙烯具有保护帽盖的管中并用CsCl调节至1.34g/ml密度。将该溶液转移至3.2ml聚碳酸酯薄壁离心管，在25℃以348,000×G离心3-4小时。病毒形成白色条带。使用宽孔吸头收集病毒带。
使用商业离子交换柱(例如预先填充了
Figure C0181315300591
G-25M的PD-10柱；Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)对病毒制品进行脱盐处理。该柱用20ml PBS平衡。加载病毒然后使之过柱。将5ml PBS加入柱中，然后按8-10滴收集馏分。在分光光度计上测定每个馏分的1∶50稀释物在260nm的光密度。汇集峰值馏分，测定1∶25稀释物的光密度(OD)。使用公式：(260nm的OD)(25)(1.1×1012)＝毒粒/ml，将OD转化成病毒浓度。
为了储存病毒，向纯化的病毒中加入甘油达到15％终浓度，温和但有效地混合，并等分后储存在-80μC。
按照Quantum Biotechnologies，Inc.(Montreal，加拿大)发展的实验方案测量重组病毒感染性。简而言之，对于待测定的每个重组病毒，按每孔1×104个293A细胞将细胞接种在两个96孔组织培养板的MEM(含有2％胎牛血清)中。24小时后在含有2％胎牛血清的MEM中制得每个病毒的10倍稀释物(从1×10-2至1×10-14)。在20孔的每个孔中各加入一种稀释物(100μl)。37℃孵育5天后，观察孔的CPE是阳性或阴性，并计算“噬斑形成单位/ml”(PFU)的值。
实施例5
使用成年能育雄性(种鼠)(B6C3f1，2-8月龄(Taconic Farms，Germantown，NY))、切除输精管的雄性(去势动物)(CD1，2-8月龄(Taconic Farms))、性成熟前的能育雌性(供体)(B6C3f1，4-5周龄(Taconic Farms))和成年能育雌性(受体)(CD1，2-4月龄(TaconicFarms))，制备表达Zcyto21基因的转基因动物。
使供体适应环境1周，然后每只小鼠腹膜内(I.P.)注射大约8IU妊娠母马血清促性腺激素(Sigma，St.Louis，MO)，46-47小时后每只小鼠腹膜内(I.P.)注射大约8IU人绒毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))以诱导超排卵。使供体和种鼠交配，随后注射激素。排卵一般发生在注射hCG后13小时内。通过交配后早上阴道栓的存在证实交配发生。
在手术显微镜(Leica MZ12 Stereo Microspcope，Leica，Wetzlar，DE)下收集受精卵。收集输卵管并将卵释放至含有透明质酸酶(Sigma)的尿分析(urinanalysis)玻片上。卵在透明质酸酶中洗涤一次，在Whitten氏W640培养基(表4)(已经在5％CO2、5％O2和90％N2中37℃孵育过)洗涤两次。然后在显微注射前将卵储存在37℃/5％CO2孵箱中。
将10-20μg含有Zcyto21基因的cDNA的质粒DNA线性化，凝胶纯化并重悬在10mM Tris pH 7.4、0.25mM EDTA pH 8.0中，终浓度为每微升5-10ng，用于显微注射。
将质粒DNA显微注射至包含于一滴W640培养基中的收获的卵中，之上覆盖CO2平衡的温暖石蜡油。将DNA吸入注射针(从0.75mm ID、1mm OD硼硅酸盐玻璃毛细管牵拉)，然后注射入各卵中。对于所有的卵，注射针均穿刺入一个或两个单倍体原核中。
将皮升DNA注射至原核中，撤出注射针并且不接触核仁。重复该过程直到所有卵都已完成注射。将成功显微注射的卵转移至含有预先放气(pregassed)的W640培养基的器官组织培养皿中，在37℃/5％CO2孵箱中保存过夜。
第二天，将来自前一天注射的12-17个健康2细胞胚胎植入受体。定位壶腹，固定住壶腹和粘液囊(bursa)之间的输卵管，用28G针头在靠近粘液囊的位置在输卵管上造成一个切口，同时确保不戳破壶腹或粘液囊。通过此切口植入胚胎，然后通过固定在腹膜壁上，引导生殖器官回到腹腔内。
将受体成对放回笼中，允许其妊娠19-21天。出生后，允许在产后19-20天断奶。区分断奶幼鼠的性别，然后放入不同性别的笼中，之后用干净的剪刀切下0.5cm的尾部活检组织(用于基因分型(genotyping))。
使用Qiagen Dneasy试剂盒根据厂商说明从尾剪段制备基因组DNA。使用设计针对该转基因载体的人生长素(hGH)3’UTR部分的引物，通过PCR分析基因组DNA。从人和鼠生长素3’UTR DNA序列的比对，鉴定出该人序列所独特的区域，确保该PCR反应不扩增小鼠序列。扩增hGH的368碱基对片断的引物和与载体序列杂交并扩增cDNA插入片断的引物，常与hGH引物一起使用。在这些实验中，来自转基因阳性动物的DNA产生两条带，一条相应于hGH 3’UTR片断的368碱基对条带和一条相应于该cDNA插入片断的可变大小条带。
一旦证实动物是转基因的(TG)，则可以通过将TG雌性与野生型雄性放置在一起、或将TG雄性与一或两只野生型雌性放置在一起，使转基因动物和近交品系动物进行回交。在幼鼠出生和断奶后，将不同性别的动物分开，并切下它们的尾用于基因分型。
通过RNA溶液杂交分析或实时PCR(在ABI Prism 7700(PE AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)上根据厂商说明进行)分析每个转基因的mRNA表达水平。
表5
WHITTEN’S 640培养基
  mgs/200m   mgs/500/ml
  NaCl   1280   3200
  KCl   72   180
  KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>   32   80
  MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O   60   150
  葡萄糖   200   500
  乳酸钙   106   265
  K Penn(青霉素钾)   15   37.5
  硫酸链霉素   10   25
  NaHCO<sub>3</sub>   380   950
  丙酮酸钠   5   12.5
  H<sub>2</sub>O   200   500
  EDTA   100μl   250μl
  5％酚红   200μl   500μl
  BSA   600   1500
所有试剂均可获自Sigma。
实施例6
1.刺激从干扰素应答性启动子进行表达
在一系列实验中，用含有Zcyto21 cDNA的重组腺病毒(AdZy-Zcyto21)以每个细胞400个病毒粒的感染复数感染293A细胞，以产生含有Zcyto21蛋白质的条件培养基(CM)。在感染后40小时的多个时间点上收获CM，并储存在-20℃。还使用缺乏cDNA的重组腺病毒(AdZy-亲本)进行感染制备了CM。使用前，在Millipore Ultrafree-15(5,000额定的分子量限制)离心滤器中将一部分CM浓缩14倍，然后通过Millipore Ultrafree-15(100,000额定的分子量限制)离心滤器过滤以减少培养基中存在的病毒颗粒数，最后通过Mill ipore 0.2μm注射滤器对CM进行过滤除菌。将浓缩的CM以1∶2稀释在结合缓冲液中，并和来自鼠细胞系的细胞一起37℃孵育5小时。
2.Zcyto21的抗病毒活性
另一系列的实验检测Zcyto21的抗病毒活性。在这些研究中，将L929细胞(ATCC No.CCL-1)接种在96孔板的含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI生长培养基中(每孔50,000个细胞)，进行抗病毒试验。按上述，来自Adzy-Zcyto21m或AdZy-亲本转染的293A细胞的腺病毒CM与细胞一起孵育过夜。本试验的阳性对照是1∶10系列稀释的小鼠干扰素-α(起始为100ng/ml)。单含有L929细胞的生长培养基提供了阴性对照。孵育处理的细胞24小时。弃培养基，加入新鲜培养基，并以0.1感染复数(即每10个L929细胞1个病毒粒)加入脑心肌炎病毒(ATCC No.vr129b)。细胞在病毒存在下孵育24小时，然后对致细胞病变(CPE)百分数进行评分。
3.使用BAF3细胞系的抗增殖分析
使用BaF3以确定Zcyto21是否具有抗增殖性质。用在Zcyto21cDNA或称作Zα30的无关cDNA上游含有CMV启动子及内含子A的表达载体，通过BRL lipofectamine稳定转染幼年仓鼠肾(BHK)细胞。将稳定转染的细胞接种在细胞工厂的无血清培养基中，培养3天后收获条件培养基，然后在5K滤器中将其浓缩10倍。将浓缩的条件培养基样品储存在4℃。
使用如下试验在BaF3上测试抗增殖活性。在96孔板上，用单纯的生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺)、或鼠IL-3(从生长培养基中50pg/ml起始)配制成终体积100μl的8个1∶2系列稀释物。将如下50微升物质加入单纯的生长培养基或mIL-3稀释的道中：人干扰素α(100ng/ml，10ng/ml或1ng/ml，稀释在生长培养基中)、人干扰素β(100ng/ml，10ng/ml或1ng/ml，稀释在生长培养基中)、鼠干扰素α(100ng/ml，10ng/ml或1ng/ml，稀释在生长培养基中)、鼠干扰素β(100ng/ml，10ng/ml或1ng/ml，稀释在生长培养基中)、zcyto20(2.5×，0.5×或0.1×)和鼠Zα30(2.5×，0.5×或0.1×)。
在生长培养基中洗涤BaF3细胞系三次，沉淀重悬在生长培养基中，计数细胞并将之稀释在生长培养基中至5,000个细胞/50μl。然后向每个样品稀释物中加入50μl稀释的细胞。试验板在37℃孵箱中孵育3至4天。然后每孔加入20μl Alomar蓝，平板37℃孵育过夜。在荧光平板读数器上以544激发波长和590发射波长对平板进行读数。
实施例7
使用PCR在一系列组织中分析人Zcyto21的组织分布
使用PCR筛查一系列来自人组织的cDNA样品的Zcyto21表达。该系列是自制的，含有77个来自各种人正常和癌性组织和细胞系(见下表6)的marathon cDNA和cDNA样品。cDNA样品来自自制文库，或自制RNA的marathon cDNA制品、或来自供应商如Clontech(Palo Alto，Ca)或Invitrogen(Carlsbad，CA)。所述marathon cDNA是使用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)制备的。为了保证该系列样品的质量，进行3个质量控制(QC)试验：(1)为了评价用于文库的RNA的质量，使用特异针对各cDNA文库的载体序列的载体寡聚物通过PCR测量自制cDNA的平均插入大小；(2)使用标准PCR方法扩增全长α微管蛋白或G3PDH cDNA，标化此系列样品中的cDNA浓度；和(3)对样品测序以检测可能的核糖体或线粒体DNA污染。将该系列设置为96孔格式，其中包括人基因组DNA(Clontech)阳性对照样品。每个孔含有大约0.2-100pg/μl的cDNA。使用寡聚物ZC39，270(SEQ ID NO：14)和ZC39，272(SEQ ID NO：15)、Advantage 2DNA聚合酶混合物(Clontech)和Rediload染料(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)，设置第一个PCR反应。扩增按如下进行：94℃1分钟1个循环；之后94℃10秒、67℃45秒进行35个循环；最后72℃延伸3分钟终止。在脑、胰岛、前列腺、睾丸、垂体、胎盘、卵巢肿瘤、肺肿瘤、CD3+和HPVS中观察到正确DNA片断大小。使用寡聚物ZC39，270(SEQID NO：14)和ZC39，271(SEQ ID NO：16)、Advantage 2DNA聚合酶混合物(Clontech)和Rediload染料(Research Genetics)，设置另一个PCR反应。扩增按如下进行：94℃1分钟1个循环；之后94℃10秒、65℃30秒、72℃30秒进行35个循环；最后72℃延伸3分钟终止。在垂体、直肠肿瘤和卵巢肿瘤中观察到正确DNA片断。
表6
  组织   #测试样品   组织   #测试样品
  肾上腺   1   膀胱   1
  骨髓   3   脑   2
  宫颈   1   结肠   1
  胎脑   3   胎心   2
  胎肾   1   胎肝   2
  胎肺   1   胎儿皮肤   1
  心脏   2   胎儿肌肉   1
  肾脏   2   肝   1
  肺   1   淋巴结   1
  乳腺   1   黑素瘤   1
  卵巢   1   胰腺   1
  垂体   2   胎盘   3
  前列腺   3   直肠   1
  唾液腺   2   骨骼肌   1
  小肠   1   脊髓   2
  脾脏   1   子宫   1
  胃   1   脂肪细胞文库   1
  睾丸   5   胰岛   1
  胸腺   1   前列腺SMC   1
  甲状腺   2   RPMI 1788(ATCC#CCL-156)   1
  气管   1   WI38(ATCC#CCL-75)   1
  食道肿瘤   1   肺肿瘤   1
  肝脏肿瘤   1   卵巢肿瘤   1
  直肠肿瘤   1   胃肿瘤   1
  子宫肿瘤   2   CD3+文库选择的PBMC(刺激的)   1
  HaCAT文库   1   HPV文库(ATCC#CRL-2221)   1
  HPVs文库(ATCC#CRL-2221)-选择的   1   MG63文库   1
  K562(ATCC#CCL-243)   1
根据以上的描述应当理解，尽管为了举例说明的目的这里描述了本发明的具体实施方案，仍可以进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明只受所附权利要求书的限制。
序列表
<110>ZymoGenetics，Inc.
<120>干扰素样蛋白质Zcyto 21
<130>01-18PC
<150>60/285,424
<151>2001-04-20
<150>60/215,446
<151>2000-06-30
<160>16
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>603
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(603)
<400>1
atg gct gca gct tgg acc gtg gtg ctg gtg act ttg gtg cta ggc ttg     48
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
gcc gtg gca ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag     96
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg    144
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
        35                  40                  45
agc ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa    192
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
    50                  55                  60
aac tgg agt tgc agc tct cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg    240
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
65                  70                  75                  80
ctt ctc cag gtg agg gag cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc    288
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                85                  90                  95
ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac    336
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac atc ctc tcc cag ctc    384
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
cag gcc tgt atc cag cct cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc    432
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
cgc ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag    480
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
tcc gct ggc tgc ctg gag gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc    528
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg gac ctg tgt ctg aga    576
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
acg tca acc cac cct gag tcc acc tga                                603
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr ＊
        195                 200
<210>2
<211>200
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                85                  90                  95
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr
        195                 200
<210>3
<211>600
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(600)
<223>n＝A，T，C or G
<400>3
atggcngcng cntggacngt ngtnytngtn acnytngtny tnggnytngc ngtngcnggn  60
ccngtnccna cnwsnaarcc nacnacnacn ggnaarggnt gycayathgg nmgnttyaar 120
wsnytnwsnc cncargaryt ngcnwsntty aaraargcnm gngaygcnyt ngargarwsn 180
ytnaarytna araaytggws ntgywsnwsn ccngtnttyc cnggnaaytg ggayytnmgn 240
ytnytncarg tnmgngarmg nccngtngcn ytngargcng arytngcnyt nacnytnaar 300
gtnytngarg cngcngcngg nccngcnytn gargaygtny tngaycarcc nytncayacn 360
ytncaycaya thytnwsnca rytncargcn tgyathcarc cncarccnac ngcnggnccn 420
mgnccnmgng gnmgnytnca ycaytggytn caymgnytnc argargcncc naaraargar 480
wsngcnggnt gyytngargc nwsngtnacn ttyaayytnt tymgnytnyt nacnmgngay 540
ytnaartayg tngcngaygg ngayytntgy ytnmgnacnw snacncaycc ngarwsnacn 600
<210>4
<211>603
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(603)
<400>4
atg gct gca gct tgg acc gtg gtg ctg gtg act ttg gtg cta ggc ttg     48
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
gcc gtg gca ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag     96
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg    144
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
        35                  40                  45
agc ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa    192
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
    50                  55                  60
aac tgg agt tgc agc tct cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg    240
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
65                  70                  75                  80
ctt ctc cag gtg agg gag cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc    288
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                85                  90                  95
ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac    336
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac atc ctc tcc cag ctc    384
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
cag gcc tgt atc cag cct cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc    432
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
cgc ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag    480
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
tcc gct ggc tgc ctg gag gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc    528
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg aac ctg tgt ctg aga    576
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
acg tca acc cac cct gag tcc acc tga                                603
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr ＊
        195                 200
<210>5
<211>200
<212>PRT
<212>人
<400>5
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                85                  90                  95
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Ash Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr
        195                 200
<210>6
<211>856
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(98)...(700)
<400>6
aattaccttt tcactttaca cacatcatct tggattgccc attttgcgtg gctaaaaagc    60
agagccatgc cgctggggaa gcagttgcga tttagcc atg gct gca gct tgg acc    115
                                         Met Ala Ala Ala Trp Thr
                                          1               5
gtg gtg ctg gtg act ttg gtg cta ggc ttg gcc gtg gca ggc cct gtc     163
Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val
            10                  15                  20
ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg    211
Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg
        25                  30                  35
ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg agc ttc aag aag gcc agg    259
Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg
    40                  45                  50
gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc agc tct    307
Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser
55                  60                  65                  70
cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag    355
Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gln Val Arg Glu
                75                  80                  85
cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg    403
Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu
            90                  95                  100
gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt    451
Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu
        105                 110                 115
cac acc ctg cac cac atc ctc tcc cag ctc cag gcc tgt atc cag cct    499
His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu Gln Ala Cys Ile Gln Pro
    120                 125                 130
cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc cgc ctc cac cac tgg ctg    547
Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu
135                 140                 145                 150
cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag    595
His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu
                155                 160                 165
gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctc aaa    643
Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys
            170                 175                 180
tat gtg gcc gat ggg aac ctg tgt ctg aga acg tca acc cac cct gag    691
Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu
        185                 190                 195
tcc acc tga caccccacac cttatttatg cgctg agccc tactccttcc           740
Ser Thr＊
    200
ttaatttatt tcctctcacc ctttatttat gaagctgcag ccctgactga gacatagggc  800
tgagtttatt gttttacttt tatacattat gcacaaataa acaacaagga attgga      856
<210>7
<211>200
<212>PRT
<213>人
<400>7
Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu
 1               5                  10                  15
Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys
            20                  25                  30
Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys
    50                  55                  60
Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala
                85                  90                  95
Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp
            100                 105                 110
Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu
        115                 120                 125
Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly
    130                 135                 140
Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu
                165                 170                 175
Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg
            180                 185                 190
Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr
        195                 200
<210>8
<211>676
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(17)...(676)
<400>8
gccctcggcc aattgg atg gtg ccc acc aca ttg gca gag cca tgc cgc tgg   52
                  Met Val Pro Thr Thr Leu Ala Glu Pro Cys Arg Trp
                   1               5                  10
gga agc agt tgc gat tta gcc atg gct gca gct tgg acc gtg gtg ctg    100
Gly Ser Ser Cys Asp Leu Ala Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu
        15                  20                  25
gtg act ttg gtg cta ggc ttg gcc gtg gca ggc cct gtc ccc act tcc    148
Val Thr Leu Val Leu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser
    30                  35                  40
aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tct    196
Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser
45                  50                  55                  60
ctg tca cca cag gag cta gcg agc ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg    244
Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu
                65                  70                  75
gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc agc tct cct gtc ttc    292
Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe
            80                  85                  90
ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag cgc cct gtg    340
Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val
        95                  100                 105
gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct    388
Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Va1 Leu Glu Ala Ala
    110                 115                 120
gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg    436
Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu
125                 130                 135                 140
cac cac atc ctc tcc cag ctc cag gcc tgt atc cag cct cag ccc aca    484
His His Ile Leu Ser Gln Leu Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr
                145                 150                 155
gca ggg ccc agg ccc cgg ggc cgc ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc    532
Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu
            160                 165                 170
cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag gca tct gtc    580
Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val
        175                 180                 185
acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc    628
Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala
    190                 195                 200
gat ggg gac ctg tgt ctg aga acg tca acc cac cct gag tcc acc tga    676
Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr ＊
205                 210                 215
<210>9
<211>219
<212>PRT
<213>人
<400>9
Met Val Pro Thr Thr Leu Ala Glu Pro Cys Arg Trp Gly Ser Ser Cys
 1               5                  10                  15
Asp Leu Ala Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val
            20                  25                  30
Leu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr
        35                  40                  45
Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln
    50                  55                  60
Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp
                85                  90                  95
Asp Leu Arg Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala
            100                 105                 110
Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala
        115                 120                 125
Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu
    130                 135                 140
Ser Gln Leu Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg
145                 150                 155                 160
Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro
                165                 170                 175
Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu
            180                 185                 190
Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu
        195                 200                 205
Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr
    210                 215
<210>10
<211>660
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(660)
<223>n＝A，T，C or G
<400>10
atggtnccna cnacnytngc ngarccntgy mgntggggnw snwsntgyga yytngcnatg     60
gcngcngcnt ggacngtngt nytngtnach ytngtnytng gnytngcngt ngcnggnccn    120
gtnccnacnw snaarccnac nacnacnggn aarggntgyc ayathggnmg nttyaarwsn    180
ytnwsnccnc argarytngc nwsnttyaar aargcnmgng aygcnytnga rgarwsnytn    240
aarytnaara aytggwsntg ywsnwsnccn gtnttyccng gnaaytggga yytnmgnytn    300
ytncargtnm gngarmgncc ngtngcnytn gargcngary tngcnytnac nytnaargtn    360
ytngargcng cngcnggncc ngcnytngar gaygtnytng aycarccnyt ncayacnytn    420
caycayathy tnwsncaryt ncargcntgy athcarccnc arccnacngc nggnccnmgn    480
ccnmgnggnm gnytncayca ytggytncay mgnytncarg argcnccnaa raargarwsn    540
gcnggntgyy tngargcnws ngtnacntty aayytnttym gnytnytnac nmgngayytn    600
aartaygtng cngayggnga yytntgyytn mgnacnwsna cncayccnga rwsnacntrr    660
<210>11
<211>628
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(17)...(628)
<400>11
gccctcggcc aattgg atg gtg ccc acc aca ttg gct tgg acc gtg gtg ctg   52
                  Met Val Pro Thr Thr Leu Ala Trp Thr Val Val Leu
                   1               5                  10
gtg act ttg gtg cta ggc ttg gcc gtg gca ggc cct gtc ccc act tcc    100
Val Thr Leu Val Leu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser
        15                  20                  25
aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tct    148
Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser
    30                  35                  40
ctg tca cca cag gag cta gcg agc ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg    196
Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu
45                  50                  55                  60
gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc agc tct cct gtc ttc    244
Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe
                65                  70                  75
ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag cgc cct gtg    292
Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val
            80                  85                  90
gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct    340
Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala
        95                  100                 105
gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg    388
Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu
    110                 115                 120
cac cac atc ctc tcc cag ctc cag gcc tgt atc cag cct cag ccc aca    436
His His Ile Leu Ser Gln Leu Gln Ala Cys Ile Gln pro Gln Pro Thr
125                 130                 135                 140
gca ggg ccc agg ccc cgg ggc cgc ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc    484
Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu
                145                 150                 155
cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag gca tct gtc    532
Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val
            160                 165                 170
acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc    580
Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala
        175                 180                 185
gat ggg gac ctg tgt ctg aga acg tca acc cac cct gag tcc acc tga    628
Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr ＊
    190                 195                 200
<210>12
<211>203
<212>PRT
<213>人
<400>12
Met Val Pro Thr Thr Leu Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val
 1               5                  10                  15
Leu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr
            20                  25                  30
Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln
        35                  40                  45
Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp
65                  70                  75                  80
Asp Leu Arg Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala
                85                  90                  95
Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala
            100                 105                 110
Leu Glu Asp Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu
        115                 120                 125
Ser Gln Leu Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg
    130                 135                 140
Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro
145                 150                 155                 160
Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu
                165                 170                 175
Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu
            180                 185                 190
Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr
        195                 200
<210>13
<211>612
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>简并序列
<221>misc_feature
<222>(1)...(612)
<223>n＝A，T，C or G
<400>13
atggtnccna cnacnytngc ntggacngtn gtnytngtna cnytngtnyt nggnytngcn     60
gtngcnggnc cngtnccnac nwsnaarccn acnacnacng gnaarggntg ycayathggn    120
mgnttyaarw snytnwsncc ncargarytn gcnwsnttya araargcnmg ngaygcnytn    180
gargarwsny tnaarytnaa raaytggwsn tgywsnwsnc cngtnttycc nggnaaytgg    240
gayytnmgny tnytncargt nmgngarmgn ccngtngcny tngargcnga rytngcnytn    300
acnytnaarg tnytngargc ngcngcnggn ccngcnytng argaygtnyt ngaycarccn    360
ytncayacny tncaycayat hytnwsncar ytncargcnt gyathcarcc ncarccnacn    420
gcnggnccnm gnccnmgngg nmgnytncay caytggytnc aymgnytnca rgargcnccn    480
aaraargarw sngcnggntg yytngargcn wsngtnacnt tyaayytntt ymgnytnytn    540
acnmgngayy tnaartaygt ngcngayggn gayytntgyy tnmgnacnws nacncayccn    600
garwsnacnt rr                                                        612
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC39270
<400>14
aggcggaaga ggttgaaggt gac                                            23
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC39272
<400>15
cgtcctagac cagccccttc ac           22
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸ZC39271
<400>16
gaccgtggtg ctggtgactt tg           22

Claims (14)

1.分离的多肽，其包含SEQ ID NO：2第20至200位氨基酸残基，其中所述多肽具有抗病毒活性。
2.权利要求1的分离的多肽，其中该多肽还包含信号分泌序列，其中该信号分泌序列由SEQ ID NO：2的第1至19位氨基酸残基组成。
3.分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子能够在严紧洗涤条件下在含0.1％十二烷基硫酸钠的0.1-0.2×SSC溶液中在50-65℃与由SEQID NO：1第58至603位核苷酸的核苷酸序列、或SBQ ID NO：1第58至603位核苷酸的核苷酸序列的互补序列组成的核酸分子杂交，其中该多核苷酸编码具有抗病毒活性的蛋白质。
4.权利要求3的分离的多核苷酸分子，其中编码的蛋白质由SEQID NO：2的第20至200位氨基酸残基组成。
5.权利要求3的分离的多核苷酸分子，其中编码的蛋白质由SEQID NO：2的第1至200位氨基酸残基组成。
6.权利要求3的分离的多核苷酸分子，其中该分离的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：1第1至603位核苷酸的核苷酸序列。
7.权利要求3的分离的多核苷酸分子，其中该分离的多核苷酸分子包含SBQ ID NO：4第1-603位核苷酸。
8.载体，其包含权利要求3的分离的多核苷酸分子。
9.表达载体，其包含权利要求3的分离的多核苷酸分子、转录启动子和转录终止子，其中该启动子可操作地与该多核苷酸分子连接，而且该多核苷酸分子可操作地与该转录终止子连接。
10.重组宿主细胞，其包含权利要求9的表达载体，其中该宿主细胞选自：细菌、酵母细胞、真茵细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。
11.制备Zcyto21蛋白质的方法，该方法包括步骤：培养包含权利要求9的表达载体并产生Zcyto21蛋白质的重组宿主细胞。
12.权利要求11的方法，其还包括步骤：从该培养的重组宿主细胞分离Zcyto21蛋白质。
13.抗体或抗体片断，其特异地与权利要求3-7任一项的多核苷酸分子编码的蛋白质结合。
14.由权利要求3-7任一项的多核苷酸分子编码的蛋白质。
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