JP2004502419A

JP2004502419A - インターフェロン−様タンパク質ｚｃｙｔｏ２１

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Publication number: JP2004502419A
Application number: JP2002507878A
Authority: JP
Inventors: シェパード，ポール　オー．; プレスネル，スコット　アール．; フォックス，ブライアン　エー．; ギルバート，テレサ; ハルドマン，ベティ　エー．; グラント，フランシス　ジェイ．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2004-01-29
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: WO2002002627A3; EP2132984A3; RU2292394C2; US7485700B2; US7655223B2; US20070048841A1; US20050014228A1; EP1939293A3; US20080102490A1; DE60128093D1; EP1294888A2; US7919595B2; BR0112119A; EP2132984A2; US20110054148A1; US20070049736A1; US20050106680A1; US7253261B2; EP1717316B1; US6927040B2

Abstract

本発明は、Ｚｃｙｔｏ２１、すなわちアミノ酸配列レベルでインターフェロン−αに最も密接的関連するインターフェロン−様タンパク質についてのポリヌクレオチド及びポリペプチド分子に関する。本発明はまた、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドに対する抗体、及びポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用方法を包含する。

Description

【０００１】
発明の背景：
多細胞生物の細胞分化は、ホルモン及びポリペプチド成長因子により制御される。それらの拡散できる分子は、細胞によるお互いとの伝達、及び組織及び器官の形成に関しての細胞の作用、及び損傷を受けた組織の修復及び再生を可能にする。ホルモン及び成長因子の例は、中でも、ステロイドホルモン、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、血小板由来の成長ホルモン、上皮成長因子及び顆粒状−マクロファージコロニー刺激因子を包含する。
【０００２】
ホルモン及び成長因子は、受容体タンパク質に結合することによって細胞代謝に影響を及ぼす。一定の受容体が、細胞外のホルモン又は成長因子を結合し、そして細胞内のシグナル経路、例えば“第２メッセンジャーシステムに結合される膜内在性タンパク質である。他の種類の受容体は可溶性細胞内分子である。
【０００３】
サイトカインは一般的に、造血系の細胞の増殖又は分化を刺激し、又は身体の免疫及び炎症応答に関係している。造血に影響を及ぼすサイトカインの例は、赤血球細胞の成長を刺激するエリトロポエチン（ＥＰＯ）；巨核球系の細胞の成長を刺激するトロンボポエチン（ＴＰＯ）；及び好中球の成長を刺激する顆粒球−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。それらのサイトカインは、貧血、血小板減少症及び好中球減少症を有する患者における正常な血液細胞レベルの回復、又は癌のための化学療法の受容において有用である。サイトカインは、造血及び免疫応答の調節において重要な役割を演じ、そしてリンパ球成長に影響を及ぼすことができる。
【０００４】
ヒトＩＩ型サイトカインファニリーは、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）サブタイプ、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターロイキン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９（アメリカ特許第５，９８５，６１４号）、ＭＤＡ−７（Ｊｉａｎｇなど．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１１、２４７７−２４８６（１９９５））、ＩＬ−２０（Ｊｉａｎｇなど．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１１，２４７７−２４８６（１９９５））、ＩＬ−２２（Ｘｉｅなど．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３１３３５−３１３３９（２０００））、及びＡＫ−１５５（Ｋｎａｐｐｅなど．，Ｌ．Ｖｉｒｏｌ．７４，３８８１−３８８７（２０００））を包含する。ほとんどのサイトカインは、Ｉ型又はＩＩ型サイトカイン受容体を通してシグナルを結合し、そして形質導入する。
【０００５】
ヒトＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、次のものを包含する：インターフェロンαＲ１（ＩＦＮ−αＲ１）、インターフェロン−γ−Ｒ２（ＩＦＮ−γ−Ｒ２）、インターフェロン−γＲ１（ＩＦＮ−γＲ１）、インターフェロン−γＲ２（ＩＦＮ−γＲ２）、ＩＬ−１０Ｒ（Ｌｉｕなど．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，１８２１−１８２９（１９９４））、ＣＲＦ２−４（Ｌｕｔｆａｌｌａなど．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１６，３６０−３７３（１９９３））、ＩＬ−２０Ｒβ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇなど．，Ｃｅｌｌ１０４，９−１９（２００１））（また、ｚｃｙｔｏｒ７（アメリカ特許第５，９４５，５１１号）及びＣＲＦ２−８（Ｋｏｔｅｎｋｏなど．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９，２５５７−１５６５（２０００）として知られている）、ＩＬ−２０Ｒβ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇなど．，前記（２００１））（また、ＤＩＲＳ１（ＰＣＴＷＯ９９／４６３７９号）としても知られている）、ＩＬ−２２ＲＡ１（許可のためにＨＵＧＯに提供されているＩＬ−２２受容体−α１）（また、ＩＬ−２２Ｒ（Ｘｉｅなど．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３１３３５−３１３３９（１０００）としても知られている）、Ｚｃｙｔｏｒ１１（アメリカ特許第５，９６５，７０４号）、及びＣＲＦ２−９（Ｋｏｔｅｎｋｏなど．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９，２５５７−２５６５（２０００））、並びに組織因子。
【０００６】
ＩＩ型サイトカイン受容体は典型的には、２種の異なった受容体鎖、すなわちα及びβ受容体サブユニットから成るヘテロダイマーである（Ｓｔａｈｌなど．，Ｃｅｌｌ７４，５８７−５９０（１９９３））。一般的に、αサブユニットは、一次サイトカイン結合タンパク質であり、そしてβサブユニットは、高親和性結合部位の形成、及びシグナルトランスダクションのために必要とされる。例外は、両サブユニットがＩＬ−２０結合のために必要とされるＩＬ−２０である（Ｂｌｕｍｂｅｒｇなど．，前記（２００１））。
【０００７】
ＩＩ型サイトカイン受容体は、受容体の細胞外部分における約２００個のアミノ酸の保存されたサイトカイン−結合ドメイン（Ｄ２００）により同定される。このサイトカイン−結合ドメインは、それぞれ約１００個のアミノ酸の２種のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦｎＩＩＩ）ドメインから構成される（ＢａｚａｎＪ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，６９３４−６９３８（１９９０）；Ｔｈｏｒｅａｕなど．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２８２，１６−３１（１９９１））。個々のＦｎＩＩＩドメインは、免疫グロブリンの不変ドメインに類似する７個のβ−鎖の特徴的な折りたたみパターンを決定する保存されたＣｙｓ、Ｐｒｏ及びＴｒｐ残基を含む（Ｕｚｅなど．，Ｊ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１５，３−２６（１９９５））。ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーの保存された構造要素は、一次アミノ酸配列相同性に基づいて、このファミリーの新規メンバーの同定を可能にする。
【０００８】
これまで、本発明者は、ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーの２種の新規メンバー、すなわちｚｃｙｔｏｒ７（アメリカ特許第５，９４５，５１１号）（また、ＩＬ−２０Ｒα（Ｂｌｕｂｅｒｇなど．，前記（２００１）として知られている）、及びｚｃｙｔｏｒ１１（アメリカ特許第５，９６５，７０４号）（また、ＩＬ−２２Ｒ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇなど．，前記（２００１））としても知られている）を、このアプローチを用いて同定している。ＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーの追加の新規メンバーの同定は、サイトカインが生物学的応答の調節において重要な役割を演じるので、興味あることである。
【０００９】
ＩＬ−ＴＩＦ（ＩＬ−１０関連のＴ細胞−由来の誘発因子）としても知られているＩＬ−２２（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒなど．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１６４，１８１４−１８１９（２０００））は、最近記載されたＩＬ−１０相同体である。マウスＩＬ−２２は、Ｔ細胞及び肥満細胞においてインビトロでＩＬ−９により誘発される遺伝子として本来、同定されている（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒなど．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１６４，１８１４−１８１９（２０００））。急性相反応体誘発活性が、ＩＬ−２２注入に基づいてマウス肝臓において観察され、そしてＩＬ−２２発現は、リポ多糖（ＬＰＳ）注入の後に急速に誘発され、このことは、ＩＬ−２２がインビボで、炎症応答に寄与することを示唆する（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒなど．，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１０１４４−１０１４９（２０００））。
【００１０】
インターロイキンは、炎症を包含する免疫学的応答を仲介するサイトカインのファミリーである。インターロイキンは、種々の炎症病理学を仲介する。免疫応答の中枢は、抗原に対して多くのサイトカイン及び適応免疫性を誘発するＴ細胞である。Ｔ細胞により生成されるサイトカインは、タイプ１及びタイプ２として分類されて来た（Ｋｅｌｓｏ，Ａ．Ｉｍｍｕｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７６：３００−３１７，１９９８）。タイプ１サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＴ−αを包含し、そして炎症応答、ウィルス免疫性、細胞内寄生体免疫性及び同種移植片拒絶に包含される。タイプ２サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を包含し、そして体液性応答、寄生虫免疫性及びアレルギー応答に包含される。タイプ１とタイプ２との間の共有されるサイトカインは、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＮＦ−αを包含する。タイプ１及びタイプ２生成Ｔ細胞集団は、異なったタイプの炎症組織中に選択的に移動する。
【００１１】
治療的観点から、インターフェロンは特に興味あるものである（インターフェロンに関する再考は、ＤｅＭａｅｙｅｒａｎｄＤｅＭａｅｙｅｒ−Ｇｕｉｇｎａｒｄ， “Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ” ｉｎＴｈｅＣｙｔｏｋｉｎｅＨａｎｄｂｏｏｋ，３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（ｅｄ．），Ｐａｇｅｓ４９１−５１６（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｔｄ．１９９８）、及びＷａｌｓｈ，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｇｅｓ１５８−１８８（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）により提供される）。
【００１２】
インターフェロンは、種々の生物学的生活を示し、そして一定の自己免疫疾患、特定の癌の処理、及び感染剤、例えばウィルス、細菌、菌類及び原生動物に対する免疫応答の増強のために有用である。今日まで、６種の形のインターフェロンが同定されており、それらは２種の腫瘍グループに分類されている。いわゆる、“Ｉ型”インターフェロンは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−ω、インターフェロン−δ及びインターフェロンτを包含する。現在、インターフェロンγ及び１つのサブクラスのインターフェロン−αは唯一ＩＩ型インターフェロンである。
【００１３】
同じ先祖の遺伝子に由来すると思われるＩ型インターフェロンは、同じ細胞表面受容体により作用するのに十分な類似する構造を保持している。ヒトインターフェロン−α／β受容体のα−鎖は、ＩＩ型サイトカイン受容体の特徴を有する細胞外Ｎ−末端ドメインを含む。インターフェロン−γは、Ｉ型インターフェロン又はＩＩ型インターフェロン−αサブタイプと有意な相同性を共有しないが、しかしＩ型インターフェロンと多くの生物学的活性を共有する。
【００１４】
ヒトにおいては、少なくとも１６種の非対立遺伝子が異なったサブタイプのインターフェロン−αをコードし、そしてインターフェロン−β及びωは、単一の遺伝子によりコードされる。Ｉ型インターフェロン遺伝子は染色体９の短いアームにおいて群れをなしている。典型的なヒト構造遺伝子とは異なって、インターフェロン−α、インターフェロン−β及びインターフェロン−ωはイントロンを欠いている。ヒトインターフェロン−γのための単一の遺伝子が染色体１２上に位置し、そして３個のイントロンを含む。今日まで、インターフェロン−τは家畜及び羊においてのみ記載されており、そしてインターフェロン−δは、ブタにおいてのみ記載されて来た。
【００１５】
臨床医は、広範囲の病状を処理するために、タンパク質を用いることによってインターフェロンの複数の活性を利用することができる。例えば、１つの形のインターフェロン−αは、医学的な状態、例えば毛細胞白血病、腎細胞癌、基底細胞癌、悪性メラノーマ、ＡＩＤＳ−関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非−Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、尖圭コンジローム、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性Ｄ型肝炎及び慢性非−Ａ、非−Ｂ／Ｃ肝炎の処理のために５０以上の個々での使用のために許可されている。Ｕ．Ｓ．ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎは、多発性硬化症、神経系の慢性疾患を処理するためにインターフェロン−βの使用を許可している。インターフェロン−γは慢性肉芽腫病を処理するために使用され、ここでインターフェロンは、感染性細胞、菌類及び原生病原体に応答して患者の免疫応答を増強する。臨床研究は、インターフェロンγがＡＩＤＳ、リーシュマニア症及びらい腫らいの処理において有用であることを示唆している。
【００１６】
サイトカインファミリーの例示されたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性及びそれらの必要性を説明する。本発明は、造血細胞系の細胞を刺激する新規サイトカイン、並びに関連する組成物及び方法を提供することにより、それらの必要性と取り組む。
【００１７】
発明の特定の記載：
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助けることができる：
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。
【００１８】
主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎなど．，　ＥＭＢＯＪ．４：１０７５，１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎなど．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３，１９９１），グルタチオンＳ　トランスフェラーゼ（ＳｍｉｔｓａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７；３１，１９８８），Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：７９５２−４，１９８５），物質Ｐ、すなわちＦｌａｇ^ＴＭペプチド（Ｈｏｐｐなど．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４−１２１０，１９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。
【００１９】
一般的に、Ｆｏｒｄなど．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２：９５−１０７，１９９１を参照のこと。親和性標識をコードするＤＮＡは、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ；ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ，ＮｅｗＨｅｖｅｎ，ＣＴ；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手できる。
【００２０】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００２１】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００２２】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス　ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０^９Ｍ^−１の結合親和性を有する。
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に対して相補的である。
【００２３】
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００２４】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに操作可能的に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状ＤＮＡ分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスＤＮＡから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００２５】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノム　クローンを含む分子である。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、通常関係しない他の遺伝子を含まないが、しかし天然において存在する５’及び３’ 未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（例えば、ＤｙｎａｎａｎｄＴｉｊａｎ，Ｎａｔｕｒｅ３１６：７７４―７８，１９８５を参照のこと）。
【００２６】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”とは、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００２７】
用語“新形成”とは、細胞を言及する場合、新規で且つ異常な増殖を受ける細胞、特に増殖において、制御できなく、且つ前進性であり、特に新形成をもたらす組織を示す。腫瘍性細胞は、悪性、すなわち侵襲性で且つ転移性であるか、又は良性であり得る。
“操作可能的に連結された”とは、ＤＮＡセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
【００２８】
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００２９】
“ポリヌクレオチド”は、５’末端から３’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略語“ｂｐ”）、ヌクレオチド（“ｎｔ”）、又はキロ塩基（“ｋｂ”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。
【００３０】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもいずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約１０個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。
用語“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００３１】
用語“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００３２】
用語“受容体”は、生物活性分子（すなわち“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づけられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。
【００３３】
受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、ＡＭＰ生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シトソール性又は核性であり；モノマー（例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体）、又はマルチマー（例えばＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、ＩＬ−３受容体、ＧＭ―ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポイエチン受容体及びＩＬ―６受容体）であり得る。
【００３４】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするＤＮＡ配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００３５】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００３６】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子は、配列番号２に示されるような２００個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。Ｚｃｙｔｏ２１についてのシグナル配列は、配列番号２のアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸残基１９（Ａｌａ）を含んで成るものとして予測され得る。Ｚｃｙｔｏ２１についての成熟ペプチドは、アミノ酸残基２０（Ｇｌｙ）で開始する。
【００３７】
Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子は、ヒト染色体１９ｑ１３．１３に位置するＢＡＣ配列ＡＣ０１１４４５及びＡＣ０１８４７７に含まれる。染色体１９のこの領域はまた、インターフェロン−様遺伝子群を含んで成る。Ｚｃｙｔｏ２１のポリヌクレオチド配列を示すコンセンサスｃＤＮＡは、配列番号６に示され、そしてそれをコードするポリペプチドは、配列番号７に示される。
【００３８】
下記に記載されるように、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基２０〜２００、又は配列番号２のアミノ酸残基１〜２００のいずれかに対して７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号９のアミノ酸残基２０〜２１９、又は配列番号９のアミノ酸残基１〜２１９のいずれかに対して７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号１２のアミノ酸残基２０〜２０３、又は配列番号２のアミノ酸残基１〜２００のいずれかに対して７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。本発明はまた、第１アミノ酸配列に対してアミノ−末端位置に存在するシグナル分泌配列を含んで成るポリペプチドを包含し、ここで前記シグナル分泌配列は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９を含んで成る。
【００３９】
一般的にサイトカインは、リガンド−受容体相互作用において最も重要であるヘリックスＡ、Ｃ及びＤを有する４−αヘリックス構造を有することが予測され、そしてファミリーのメンバー間でより高く保存される。しかしながら、インターフェロン（ＩＮＦ）、及びインターフェロン−α及びインターフェロン−τは、６個のヘリックス束として特徴づけられる。ＩＮＦヘリックスＡはＺｃｙｔｏ２１のヘリックスＡと同等であり；ＩＮＦヘリックスＢはＺｃｙｔｏ２１のヘリックスＣと同等であり；ＩＮＦヘリックスＣはＺｃｙｔｏ２１のヘリックスＤと同等であり；そしてＩＮＦヘリックスＤはＺｃｙｔｏ２１のヘリックスＦと同等である。従って、ＩＮＦのＡＢループとＤＣループとの間のループは、Ｚｃｙｔｏ２１の短いヘリックスＢ及びＥを含むよりＺｃｙｔｏ２１において拡張される。
【００４０】
Ｚｃｙｔｏ２１ヘリックスは次の通りに予測される：配列番号２に示されるように、ヘリックスＡはアミノ酸残基４９（Ｓｅｒ）〜６３（Ｌｅｕ）により定義され；ヘリックスＢはアミノ酸残基７６（Ａｓｎ）〜８４（Ｖａｌ）により定義され；ヘリックスＣはアミノ酸残基８９（Ｖａｌ）〜１０４（Ａｌａ）により定義され；ヘリックスＤはアミノ酸残基１１１（Ｇｌｕ）〜１３３（Ｇｌｎ）により定義され；ヘリックスＥはアミノ酸残基１３７（Ｔｈｒ）〜１５８（Ｌｙｓ）により定義され；そしてヘリックスＦはアミノ酸残基１６３（Ｇｌｙ）〜１８９（Ｌｅｕ）により定義される。システイン残基は、Ｚｃｙｔｏ２１〜ＩＮＦ−α間に保存され、そして特に、追加のＺｃｙｔｏ２１分子と共にホモダイマーを形成するために分子間ジスルフィド結合を形成することができる。
【００４１】
複数の一列整列に基づくＺｃｙｔｏ２１のさらなる分析は、アミノ酸残基３４及び１３１、及び６８及び１６４でのシステイン（配列番号２に示されるように）が、分子間自スルフィド結合を形成するであろうことを予測する。残基１９０でのシステインは任意であり、そして分子間ジスルフィド会合を形成することができる。本明細書に記載されるＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコードするその対応するポリヌクレオチドは、配列番号１に示される通りである。配列番号２の縮重ポリヌクレオチド配列は、配列番号３に示される。配列番号９の縮重ポリヌクレオチドは、配列番号１０に示される。配列番号１２の縮重ポリヌクレオチド配列は、配列番号１３に示される。
【００４２】
詳細な突然変異分析が、ｚａｌｐｈａ１１リガンドに高く関係しているＩＬ−４及びＩＬ−２の両者について行われた。ネズミＩＬ−２の分析（Ｚｕｒａｗｓｋｉなど．，ＥＭＢＯＪ．１２：５１１３−５１１９，１９９３）は、ヘリックスＡ及びＣにおける残基がＩＬ−２Ｒβへの結合のために重要であり；決定的な残基がＡｓｐ_３４，Ａｓｎ_９９及びＡｓｎ_１０３であることを示す。ネズミＩＬ−２ループＡ／Ｂ及びヘリックスルＢ内の複数の残基は、ＩＬ−２Ｒα結合のために重要であり、そしてヘリックスＤにおける単一の残基、すなわちＧｌｎ_１４１のみが、ＩＬ−２Ｒαとの結合のために活動的である。
【００４３】
同様に、ヘリックスＡ及びＣは、ＩＬ−４及びＩＬ−４Ｒα（ＩＬ−２Ｒαに構造的に類似する）間の相互作用の部位であり、そしてヘリックスＤ内の残基は、ＩＬ−２Ｒα相互作用のために活動的である（Ｗａｎｇなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１６５７−１６６２，１９９７；Ｋｒｕｓｅなど．，ＥＭＢＯＪ．１１：３２３７−３２４４，１９９２）。特に、ヒトＩＬ−４における突然変異（Ｔｙｒ_１２１→Ａｓｐ）は、ＩＬ−４Ｒαと結合するが、しかしＩＬ−２Ｒαとは結合せず、そして従って、シグナルであり得ないアンタゴニストを創造する（Ｋｒｕｓｅなど．，前記、１９９２）。
【００４４】
４−ヘリカル束サイトカインはまた、それらの成分ヘリックスの長さにより分類される。“長い−ヘリックス”形のサイトカインは一般的に、２４〜３０個の残基のヘリックスから成り、そしてＩＬ−６、繊毛好中球因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を包含する。“短い−ヘリックス”形のサイトカインは一般的に、１８〜２１個の残基のヘリックスから成り、そしてＩＬ−２，ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを包含する。ＣＮＴＦ及びＩＬ−６を用いての研究は、ＣＮＴＦヘリックスがＩＬ−６における相当のヘリックスにより交換され得、キメラにＣＴＮＦ−結合性質を付与することを示した。
【００４５】
従って、４−ヘリカルサイトカインの機能的ドメインが配列同一性に関係なく、構造的相同性に基づいて決定され、そしてキメラにおいて機能的に組み込みを維持することができると思われる（Ｋａｌｌｅｎなど．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１８５９−１１８６７，１９９９）。従って、Ｚｃｙｔｏ２１のヘリカルドメインは、受容体結合特異性を決定し、そして調節するために他のインターフェロンを有するキメラ融合分子を調製するために有用であろう。インターフェロン及びサイトカイン、例えばＩＮＦ−α、ＩＬ−１０、ヒト成長ホルモンからのヘリカル及びループドメインを結合する融合タンパク質が特に興味の対象である。
【００４６】
Ｚｃｙｔｏ２１ｍＲＮＡは、脳、ランゲルハンス島、前立腺、精巣、下垂体、胎盤、卵巣腫瘍、肺腫瘍、直腸腫瘍及び卵巣腫瘍、並びにヒト乳頭腫ウィルスＩＶ（ＨＰＶＳ）のより形質転換されている、活性化された免疫細胞系（ＣＤ３＋）及び前立腺上皮細胞系の組織において同定されている。
【００４７】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、例えば本明細書に開示されるＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号３、１０及び１３は、配列番号２、９及び１２のＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドをコードするすべてのＤＮＡを包含する縮重ＤＮＡ配列である。当業者はまた、配列番号３の変性配列がＵとＴとを置換することによって、配列番号２をコードするすべてのＲＮＡ配列も供給することを理解するであろう。
【００４８】
従って、配列番号３のヌクレオチド１又は５８−６０３を含んで成るＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド及びそれらのＲＮＡ相当物は、本発明により包含される。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号３内に使用される１文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【００４９】
【表１】

与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号３、１０及び１３に使用される縮重コドンが表２に示される。
【００５０】
【表２】

【００５１】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【００５２】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するであろう。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：１８９３−９１２，１９８０；Ｈａａｓ，など．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５−２４，１９９６；　Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ　１３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ　ａｎｄ　Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ　１８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（表３を参照のこと）。
【００５３】
例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。
【００５４】
例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号３に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【００５５】
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的には、ＲＮＡは、多量のＺｃｙｔｏ２１ＲＮＡを生成する組織又は細胞から単離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：５２０１，１９８０）により、又は標的細胞又は組織上の活性についての種々の細胞型からのならし培地のスクリーニングにより同定される。
【００５６】
前記活性、又はＲＮＡ生成細胞又は組織が同定されると、全ＲＮＡは、グアニジウムＨＣｌ抽出、続くＣｓＣｌグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２−９４，１９７９）。ポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡは、ＡｖｉｖａｎｄＬｅｄｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：１４０８−１４１２，１９７２）の方法を用いて全ＲＮＡから調製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、既知の方法を用いて、ポリ（Ａ）^＋　ＲＮＡから調製される。他方では、ゲノムＤＮＡが単離され得る。次に、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【００５７】
Ｚｃｙｔｏ２１をコードするより長いクローンは、従来のクローニング方法により得られる。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンが好ましいが、但し、いくつかの用途（例えば、トランスジェニック動物における発現）に関しては、ゲノムクローンを使用し、又は少なくとも１つのゲノムイントロンを含むようｃＤＮＡクローンを修飾することが好ましい。ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを調製するための方法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一部の使用を包含する。発現ライブラリーは、Ｚｃｙｔｏ２１受容体フラグメントに対する抗体、受容体フラグメント、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【００５８】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物リガンド及びポリヌクレオチドを供給する。これらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドである。ヒトＺｃｙｔｏ２１のオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃＤＮＡは、Ｚｃｙｔｏ２１を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン　ブロットをプローブすることによって同定され得る。
【００５９】
次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。次に、Ｚｃｙｔｏ２１コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なヒトＺｃｙｔｏ２１配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ，アメリカ特許第４，６８３，２０２号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃＤＮＡライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム　クローンの単離に適用され得る。
【００６０】
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトＺｃｙｔｏ２１バンドの単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１に示されるＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。
【００６１】
それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。他のスプライシングされた変異体の例は、配列番号８（その対応するポリペプチドについては配列番号９）、及び配列番号１１（その対応するポリペプチドについては配列番号１２）に示される。対立遺伝子変異体の例は、配列番号４に示され、これは、配列番号５に示されるようなポリペプチド配列に対応する。配列番号１に示されるようなポリペプチド配列と、ヌクレオチド番号５７２で配列番号４に示されるそのポリペプチド配列との間に多型現象が存在する。この多型現象が、Ｚｃｙｔｏ２１のアンタゴニスト、又は疾病敏感性のより高い確立を導く、低められた又は変更された機能の分子のアンタゴニストを創造することができる。
【００６２】
本発明はまた、診断用途に使用できる試薬も提供する。例えば、Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子、Ｚｃｙｔｏ２１ＤＮＡ又はＲＮＡを含んで成るプローブ、又はそれらの副配列が、Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子がヒト染色体、例えば染色体１９上に存在するかどうか、又は遺伝子突然変異が生じたかどうか決定するために使用され得る。Ｚｃｙｔｏ２１は、染色体１９のｑ１３．１３領域に位置する。Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数体、遺伝子コピー数の変化、異質性の損失（ＬＯＨ）、トランスロケーション、挿入、欠失、制限部位の変化及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。そのような異常型は、分子遺伝子技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＦＬＰ）分析、ＰＣＲを用いての短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，前記；Ａｕｓｕｂｅｌなど．，前記；Ｍａｒｉａｎ，Ｃｈｅｓｔ１０８：２５５−６５，１９９５）。
【００６３】
遺伝子の位置の正確な知識は、多くの目的、例えば１）配列が存在するコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）の一部であるかどうかを決定し、そして追加の周囲遺伝子配列を種々の形、例えばＹＡＣ、ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンの形で得るために；２）同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝性疾病のための可能な候補体遺伝子を供給するために；及び　３）特定遺伝子が何の機能を有するかの決定を助けることができるモデル生物、例えばマウスを相互参照するために有用である。
例えば、Ｄｅｌａｇｕｅ．，（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：２３６−２４３，２０００）は、Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ病が１９ｑ１３．１−１３．３に位置することを同定した（Ｄｅｌａｇｕｅなど．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７：２３６−２４３，２０００）。
【００６４】
診断は、疾病のタイプ及び適切な関連する治療の決定において医者を助けることができるか、又は遺伝的カウンセリングを助けることができる。それ自体、本発明の抗−Ｚｃｙｔｏ２１抗体、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチド、ｍＲＮＡ又は抗−Ｚｃｙｔｏ２１抗体の検出のために使用され、従って当業界において知られており、そして本明細書において記載される方法を用いて、本明細書に記載されるようにして、遺伝的疾病又は癌の検出のためのマーカーとして作用し、そしてそのために直接的に使用される。
【００６５】
さらに、ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドプローブは、染色体１９欠失、及びヒト疾病に関連するトランスロケーション、又は腫瘍の悪性進行に関与する他のトランスロケーション、又は悪性又は他の癌における染色体転移に関与すると思われる他の１９ｑ１３．１３突然変異に関連する他のトランスロケーションに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。同様に、Ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドプローブは、染色体１９ｑ１３．１３トリソミーに関連する異常性又は遺伝子型、及びヒト疾病又は自然流産に関連する染色体欠失を検出するために使用され得る。従って、Ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠陥に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【００６６】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために、遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。分析用プローブは一般的に少なくとも２０ｎｔの長さであるが、但し幾分、短いプローブも使用され得る（例えば、１４〜１７ｎｔ）。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５ｎｔの長さ、好ましくは１５ｎｔ又はそれ以上、より好ましくは２０〜３０ｎｔである。遺伝子又は染色体ＤＮＡの全体的な分析のためには、Ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドは完全なエキソン又はそれ以上を含んで成ることができる。エキソンは、Ｚｃｙｔｏ２１配列（配列番号１）とＺｃｙｔｏ２１についてのゲノムＤＮＡとを比較することによって、当業者により容易に決定される。
【００６７】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために、遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。ほとんどの診断方法は、
（ｉ）潜在的に疾病の患者、疾病の患者又は劣性疾病対立遺伝子の可能性ある非疾病キャリヤーから遺伝子サンプルを得；
（ｉｉ）Ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドプローブと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより（ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＲＦＩＰ分析においては、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）、又は適切なＰＣＲ反応条件下でＰＣＲ反応において、センス及びアンチセンスプライマーと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより、第１反応生成物を生成し；
【００６８】
（ｉｉｉ）前記第１反応生物を、電気泳動及び／又は他の既知方法により可視化し、例えば、前記第１反応生成物を、Ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドプローブ（ここで、前記ポリヌクレオチドは第１反応の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）により可視化し、そして
（ｉＶ）野生型患者からの遺伝子サンプルの第２対照反応生成物と、前記可視化された第１反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
【００６９】
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、疾病又は潜在的に疾病の患者における遺伝子異常性の、又は非疾病患者についてのヘテロ接合性劣性キャリヤー表現型の存在の、又は疾病患者からの腫瘍における遺伝子欠陥の存在の、又は胎児又は移植前胚における遺伝子異常性の存在の表示である。例えば、制限フラグメントパターン、ＰＣＲ生成物の長さ、Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子座の反復性配列の長さ、及び同様のもの差異は、遺伝子異常性、遺伝子異常型、又は正常な野生型対照に比較しての対立遺伝子差異の表示である。
【００７０】
対照は、サンプルの試験及び利用性に依存して、影響されていないファミリーメンバー又は無関係の個人からであり得る。本発明内への使用のための遺伝子サンプルは、患者からのいずれかの組織又は他の生物学的サンプル、例えば血液、唾液、精子、胚細胞、羊水及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）から単離されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、そして配列番号１の一部、配列番号１の補体、又はそれらのＲＮＡ同等物を含んで成る。ヒト疾病表現型ヘの遺伝子連鎖分析を示すそのような方法は、当業界において良く知られている。
【００７１】
診断における、ＰＣＲに基づく方法の参照のためには、一般的、次の文献を参照のこと：Ｍａｔｈｅｗ（ｅｄ．），ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１），Ｗｈｉｔｅ（ｅｄ），ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ；ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ，１９９３），Ｃｏｔｔｅｒ（ｅｄ），ｍｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＣａｎｃｅｒ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６），ＨａｎａｕｓｅｋａｎｄＷａｌａｓｚｅｋ（ｅｄｓ．），ＴｕｍｏｒＭａｒｋｅｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓ。（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）．Ｌｏ（ｅｄ），ＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８），及びＭｅｌｔｚｅｒ（ｅｄ），ＰＣＲｉｎＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．１９９８））。
【００７２】
Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子座に関連する突然変異は、直接的な突然変異分析のための標準方法、例えば制限フラグメント長さ多型現象分析、ＲＣＲ技法を用いての短いタンデム反復体分析、増幅―無反応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、ＲＮアーゼ分解方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析技法を用いることにより、本発明の核酸分子を用いて検出され得る（例えば、次の文献を参照のこと：Ｍａｔｈｅｗ（ｅｄ），ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９１），Ｍａｒｉａｎ，Ｃｈｅｓｔ１０８：２５５（１９９５）．ＣｏｌｅｍａｎａｎｄＴｓｏｎｇａｌｉｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９６），Ｅｌｌｅｓ（ｅｄ．）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．１９９６），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（ｅｄ．）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＭｕｔａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ１９９６），Ｂｉｒｒｅｎなど．（ｅｄｓ．）ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓＶｏｌ．２：ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＧｅｎｅｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ１９９８）．Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど．（ｅｄｓ．）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）．及びＲｉｃｈａｒｄｓａｎｄＷａｒｄ， “ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎＰｒｅｉｎｅｉｐｌｅｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｐａｇｅｓ８３−８８（ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ｌｕｃ．１９９８）。突然変異についてのＺｃｙｔｏ２１遺伝子の直接的な分析は、対象のゲノムＤＮＡを用いて行われ得る。例えば、末梢血液リンパ球から得られるゲノムＤＮＡを増幅するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど．（ｅｄｓ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，ｐ７．１．６−７．１．６（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）を参照のこと。
【００７３】
本発明の態様においては、単離されたＺｃｙｔｏ２１−コードの核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、配列番号１のヌクレオチド５８〜６０３のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又は配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。
【００７４】
１対の核酸分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＲＮＡ−ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのＴｍは、１〜１．５％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。
【００７５】
特定のポリヌクレオチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合することは、当業者の能力内である。特定標的配列のためのＴｍは、標的配列の５０％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下で）である。Ｔｍに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【００７６】
Ｔｍを計算するための多くの等式は、当業界において知られており、そしてＤＮＡ，ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、及び種々の長さのポリヌクレオチドプローブに対して特異的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｉｎｇ：ＡＬａｖｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌなど．，（ｅｄｓ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ（ｅｄｓ．），ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）；及びＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７（１９９０）を参照のこと）。
【００７７】
配列分析ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ６．０（ＬＳＲ；ＬｏｎｇＬａｋｅ，ＭＮ）及びＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ４．０（ＰｒｅｍｉｅｒＢｉｏｓｏｆｔＩｎｔｅｒＮａｔｉｏｎａｌ；ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ），並びにインターネット上のサイトが、所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてＴｍを計算するための入手できる手段である。そのようなプログラムはまた。定義された条件下で所定の配列を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することもできる。典型的には、５０個以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。より小さなプローブ、すなわち５０個以下の塩基対のプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Ｔｍ又はそれよりも５〜１０℃低い温度で実施される。これは、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関するハイブリダイゼーションの最大の速度を可能にする。
【００７８】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５５〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液、例えば５５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるＳＳＣをＳＳＰＥにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【００７９】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、５０〜６５℃での０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．１×〜０．２×ＳＳＣの溶液による洗浄を包含する。換言すれば、変異体Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５０〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液、例えば５０℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液に等しい。
【００８０】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれらのオルト体に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸残基１−２００又は２０−２００の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドも包含する。本発明はさらに、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子も包含する。％同一性を決定するための方法は、下記に記載される。
【００８１】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得る変異体Ｚｃｙｔｏ２１核酸分子を企画する：上記記載のような、配列番号２のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなＺｃｙｔｏ２１変異体は、（１）５５〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【００８２】
他方では、Ｚｃｙｔｏ２１変異体は、（１）５０〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
【００８３】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３−６１６，１９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ（前記）の“ｂｌｏｓｕｍ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００８４】
【数１】

【００８５】
【表３】

【００８６】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体Ｚｃｙｔｏ２１のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８），及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）により記載される。
【００８７】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
【００８８】
最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄｗｉｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４，１９７０；Ｓｅｌｌｅｒｓ，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７，１９７４）の変法を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ２ｏｆＰｅａｒｓｏｎ，１９９０（前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【００８９】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは４〜６であり得る。
【００９０】
変異体Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチド及び実質的に類似する配列同一性は、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約２０〜２５個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
【００９１】
従って、本発明は、配列番号２のその対応する領域に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、及びより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する配列を含んでなる、約１４９〜２３０個のアミノ酸残基のポリペプチドを包含する。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドと親和性標識との間にタンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及び第Ｘａ因子分解部位を含む。
【００９２】
【表４】

【００９３】
構造統合性の維持に対して決定的である領域又はドメインを含んで成るアミノ酸残基の決定が行われ得る。それらの領域内で、多かれ少なかれ、変化に耐性であり、そして分子の全体的な三次構造を維持するであろう特定の残基を決定することができる。配列構造を分析するための方法は、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を有する複数配列の一列整列、二次構造性質、二元パターン、相補的パッケージング及び埋もれた極性相互作用を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Ｂａｒｔｏｎ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３７２−３７６，１９９５及びＣｏｒｄｅｓなど．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３−１０，１９９６）。一般的に、分子への修飾を企画するか又は特定のフラグメントを同定する場合、構造の決定は、修飾された分子の活性を評価することによって付随されるであろう。
【００９４】
アミノ酸配列の変更が、生物学的活性に対して必須である高次構造体の破壊を最少にするためにＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドにおいて行われる。例えば、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドが１又は複数のヘリックスを含む場合、アミノ酸残基の変更が、分子のヘリックス幾何学的及び他の成分を破壊しないよう行われ、ここでコンホメーションの変化が、いくらかの決定的な機能、例えば分子の、その結合パートナーへの結合を妨害する。アミノ酸配列の変更の効果は、例えば上記に開示されるようなコンピューターモデルにより予測され得、又は結晶構造の分析により決定され得る（例えば、Ｌａｐｔｈｏｒｎなど．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：２６６−２６８，１９９５）。当業界において良く知られている他の技法は、標準の分子（例えば、生来のタンパク質）と変異体タンパク質の折りたたみを比較する。
【００９５】
例えば、変異体及び標準の分子におけるシステインパターンの比較が行われ得る。質量分光及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾は、ジスルフィド結合に関連するか又はそのような関連を有さないシステイン残基を決定するための方法を提供する（Ｂｅａｎなど．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：２１６−２２６，１９９２；Ｇｒａｙ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２：１７３２−１７４８，１９９３：及びＰａｔｔｅｒｓｏｎなど．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：３７２７−３７３２，１９９４）。一般的に、修飾された分子が標準の分子と同じシステインパターンを有さない場合、折りたたみが影響を及ぼされると思われる。
【００９６】
折りたたみを測定するためのもう１つの良く知られており、且つ許容できる方法は、円ニ色性（ＣＤ）である。修飾された分子及び標準の分子により生成されるＣＤスペクトルの測定及び比較は、通常のことである（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ７：２０５−２１４，１９９０）。結晶学は、折りたたみ及び構造を分析するためのもう１つの良く知られた方法である。核磁気共鳴（ＮＭＲ）、消化ペプチドマッピング及びエピトープマッピングはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみ及び構造的類似性を分析するための既知方法でもある（Ｓｃｈａａｎａｎなど．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６１−９６４，１９９２）。
【００９７】
配列番号２に示されるようなＺｃｙｔｏ２１タンパク質配列のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ親水性プロフィールが生成され得る（Ｈｏｐｐなど．，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２８，１９８１；Ｈｏｐｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．８８：１−１８，１９８６及びＴｒｉｑｕｉｅｒなど．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１１：１５３−１６９，１９９８）。前記プロフィールは、スライドする６−残基窓（ｓｌｉｄｉｎｇｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅｗｉｎｄｏｗ）に基づかれている。埋もれたＧ，Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ，Ｙ及びＷ残基は無視された。例えば、Ｚｃｙｔｏ２１においては、親水性領域は、配列番号２の残基１５５（Ｇｌｕ）−１６０（Ｇｌｕ）；残基５１（Ｌｙｓ）−５６（Ａｌａ）；残基５０（Ｐｈｅ）−５５（Ａｓｐ）；残基１４０（Ｐｒｏ）−１４５（Ａｒｇ）及び残基１５４（Ｇｌｎ）−１５９（Ｌｙｓ）を含む。
【００９８】
当業者は、親水性又は疎水性が、全体的な構造及び生物学的プロフィールを破壊しないよう、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドのアミノ酸配列における修飾を企画する場合、考慮されるであろうことを認識するであろう。Ｖａｌ，Ｌｅｕ及びＩｌｅから成る群、又はＭｅｔ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｙｒ及びＴｒｐから成る群から選択された疎水性残基の置換が特に興味の対象である。
【００９９】
必須アミノ酸の正体はまた、インターフェロン−αと他のインターフェロンとの間の配列類似性の分析から推定され得る。前に記載された“ＦＡＳＴＡ”分析のような方法を用いて、高い類似性の領域が、タンパク質ファミリー内に同定され、そして保存された領域のためのアミノ酸配列を分析するために使用される。構造に基づいて変異体Ｚｃｙｔｏ２１オリゴヌクレオチドを同定するためのもう１つのアプローチは、可能性ある変異体Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子をコードする核酸分子が、上記で論じられたように、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズできるかどうかを決定することである。
【０１００】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸を同定する他の方法は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン走査突然変異誘発である（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍａｎｄＷｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１（１９８９）；Ｂａｓｓなど．，Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４４９８（１９９１）；ＣｏｏｍｂｓａｎｄＧｏｒｅｙ， “Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｉｎＰｒｏｔｅｉｎｓ．ＡｕａｌｙｓｉｓａｎｄＤｅｓｉｇｎ，Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ（ｅｄ．），Ｐ．２５９−３１１（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８））。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子におけるあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるように、生物学的又は生化学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９（１９９６）を参照のこと。
【０１０１】
本発明はまた、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドの機能的フラグメント及びそのような機能的フラグメントをコードする核酸分子を包含する。本明細書に定義されるように、“機能的” Ｚｃｙｔｏ２１又はフラグメントは、その増殖又は分化活性により、特殊化された細胞機能を誘発し、又は阻害するその能力により、又は抗−Ｚｃｙｔｏ２１抗体又はＺｃｙｔｏ２１受容体（可溶性であるか又は固定されている）に対して特異的に結合するその能力により特徴づけられる。
【０１０２】
本明細書においてこれまでに記載されたように、Ｚｃｙｔｏ２１は、次のように６−ヘリカル−束構造により特徴づけられる：配列番号２に示されるように、ヘリックスＡはアミノ酸残基４９（Ｓｅｒ）−６３（Ｌｅｕ）により定義され；ヘリックスＢはアミノ酸残基７６（Ａｓｎ）−８４（Ｖａｌ）により定義され；ヘリックスＣはアミノ酸残基８９（Ｖａｌ）−１０４（Ａｌａ）により定義され；ヘリックスＤはアミノ酸残基１１１（Ｇｌｕ）−１３３（Ｇｌｎ）により定義され；ヘリックスＥはアミノ酸残基１３７（Ｔｈｒ）−１５８（Ｌｙｓ）により定義され；そしてヘリックスＦはアミノ酸残基１６３（Ｇｌｙ）−１８９（Ｌｅｕ）により定義される。
【０１０３】
従って、本発明はさらに、（ａ）上記に記載される１又は複数のヘリックスを含んで成るポリペプチド分子；及び（ｂ）１又は複数のそれらのヘリックスを含んで成る機能的フラグメントを包含する融合タンパク質を提供する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、もう１つのヘリカル−束サイトカイン又はインターフェロン、たとえばＩＮＦ−アルファにより、又は融合タンパク質の分泌を促進する、非生来の及び／又は関連しない分泌シグナルペプチドにより寄与され得る。
【０１０４】
本発明のＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド、例えば十分な長さのポリペプチド、生物学的活性のフラグメント及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、前記ポリペプチドをコードする発現ベクターを組み込まれている細胞を用いて生成され得る。本明細書において使用される場合、“発現ベクターを組み込まれている細胞”とは、外因性ＤＮＡ分子の導入により直接的に操作されている細胞及び導入されたＤＮＡを含むその子孫の両者を包含する。
【０１０５】
適切な宿主細胞は、外因性ＤＮＡにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。クローン化されたＤＮＡ分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性ＤＮＡを導入するための技法は次の文献に開示される：Ｓａｍｂｒｏｏｌなど．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９，及びＡｕｓｕｂｅｌなど．，ｅｄｓ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｓ．，ＮＹ，１９８７。
【０１０６】
一般的に、本発明のＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性ＤＮＡの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【０１０７】
Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、Ｚｃｙｔｏ２１の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばｔ−ＰＡ；アメリカ特許第５，６４１，６５５号を参照のこと）に由来し、又は新たに合成され得る。
【０１０８】
分泌シグナル配列は、Ｚｃｙｔｏ２１ＤＮＡ配列に操作可能的に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるＤＮＡ配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．，アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０１０９】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性ＤＮＡを、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒなど．，Ｃｅｌｌ１４：７２５，１９７８；ＣｏｒｓａｒｏａｎｄＰｅａｒｓｏｎ，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ７：６０３，１９８１；Ｇｒａｈａｍなど．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２；４５６，１９７３），エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎなど．，ＥＭＢＯＪ．１：８４１−８４５，１９８２）；ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌなど．，前記）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ −Ｎｅｌｓｏｎなど．，Ｆｏｃｕｓ１５：７３，１９９３；Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ　など．，Ｆｏｃｕｓ１５：８０，１９９３）を包含する。培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばｌｅｖｉｎｓｏｎなど．，アメリカ特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎなど．，アメリカ特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒなど．，アメリカ特許第４，５７９，８２１号；及びＲｉｎｇｏｌｄ，アメリカ特許第４，６５６，１３４号により開示される。
【０１１０】
培養された適切な哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１６５）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１０３１４）、２９３（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｈａｍなど．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ．３６：５９−７２，１９７７）、及びチャイニーズ　ハムスター卵巣（例えば　ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６１）細胞系を包含する。追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる。
【０１１１】
一般的に、強い転写プロモーター、例えばＳＶ−４０又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第４，９５６，２８８号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許４，５７９，８２１号及び第４，６０１，９７８号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。哺乳類細胞に使用するための発現ベクターは、それぞれ、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡＵＳＡに受託番号９８６６９及び９８６６８として寄託されているｐＺＰ−１及びｐＺＰ−９を包含する。
【０１１２】
薬物選択は一般的に、外来性ＤＮＡが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。
【０１１３】
“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン　アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。
【０１１４】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使用され得る。アデノウィルス感染された非−２９３細胞を、その細胞が急速に分裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を生成することができる。例えば、ＢＨＫ細胞は、細胞工場において集密性まで増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
【０１１５】
他方では、アデノウィルスベクター感染された２９３Ｓ細胞が、有意な量のタンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養において増殖せしめられ得る（Ｇａｒｎｉｅｒなど．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１４５−５５，１９９４を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異種タンパク質が、細胞における発現されたタンパク質の素因に依存して、細胞培養物上清液、溶解物又は、膜画分から反復して単離され得る。感染された２９３Ｓ細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得られる。
【０１１６】
昆虫細胞は、当業界において知られている方法に従って、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染され得る。好ましい方法においては、組換えバキュロウィルスは、Ｌｕｃｋｏｗ（Ｌｕｃｋｏｗ，ＶＡ，など．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６７：４５６６−７９，１９９３）により記載されるトランスポゾンの使用を通して生成される。トランスファーベクターをそ用するこのシステムは、キット形（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ^ＴＭキット；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）として市販されている。
【０１１７】
このトランスファーベクター（ｐＦａｓｔＢａｃｌ^ＴＭ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、“ｂａｃｍｉｄ”　と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、興味あるタンパク質をコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含む。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄＰｏｓｓｅｅ，Ｒ．Ｄ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９７１−６，１９９０；Ｂｏｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｃ．など．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１５５１−６，１９９４；及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ，Ｇ．Ｄ．，ａｎｄ　Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｂ．，Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７０：１５４３−９，１９９５を参照のこと。さらに、トランスファーベクター上記に開示されるようなポリペプチド延長又は親和性標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる。
【０１１８】
当業界において知られている技法を用いて、Ｚｃｙｔｏ２１−コードの配列を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリ宿主細胞を形質転換し、そして前記細胞が、組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａについてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄＤＮＡが、通常の技法を用いて単離され、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、例えばＳｆ９細胞をトランスフェクトするために使用される。Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質を発現する組換えウィルスが結果的に生成される。組換えウィルス　ストックは、当業者において通常使用される方法により製造される。
【０１１９】
タンパク質生成に関しては、組換えウィルスは、次の宿主細胞をトランスフェクトするために使用される：典型的には、シロナヤガに由来する細胞系、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（例えばＳｆ９又は、Ｓｆ２１細胞）又はトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）（例えば、ＨＩＧＨＦｉｖｅ^ＴＭ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。例えば、アメリカ特許第５，３００，４３５号を参照のこと。血清フリー培地が、細胞の増殖及び維持のために使用され得る。適切な培地形成は、当業者において知られており、そして市販の業者から得られる。細胞は典型的には、組換えウィルスストックが０．１〜１０、より典型的には、約３の感染の多重度（ＭＯＩ）で添加される時点で、約２〜５×１０^５個の細胞１〜２×１０^６個の細胞の接種密度で増殖される。使用される方法は、一般的に当業界において知られている。
【０１２０】
他の高等真核細胞、例えば植物細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の使用は、Ｓｉｎｋａｒなど．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ）１１：４７−５８，１９８７により再考されている。
【０１２１】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）を包含する。外因性ＤＮＡによりＳ．　セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ，アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉなど．，アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ，アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙなど．，アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０１２２】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉなど．（アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ，アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．，アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ，アメリカ特許第４，９７７，０９２号を参照のこと）及びアルコール　デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０１２３】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、クルイベリミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（Ｐｉｃｈｉａｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０１２４】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎなど．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９−３４６５，１９８６及びＣｒｅｇｇ，アメリカ特許第４，８８２，２７９号；及びＲａｙｍｏｎｄなど．，Ｙｅａｓｔ１４，１１−２３，１９９８を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔなど．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ．，アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。ピチア・メタノリカにおける組換えタンパク質の生成は、アメリカ特許第５，７１６，８０８号、第５，７３６，３８３号、第５，８５４，０３９号及び第５，８８８，７６８号に開示される。
【０１２５】
原核宿主細胞、例えば細菌Ｅ．コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにクローン化される外来性ＤＮＡ配列を発現するための技法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，前記を参照のこと）。細菌、例えばＥ．コリにおいてＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。
【０１２６】
前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０１２７】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたＤＮＡを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。液体培養物は、従来の手段、例えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーションを提供される。
【０１２８】
本発明のポリペプチド及びタンパク質を８０％以上の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、９９．９％以上の純度であり、そして感染性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチド又はタンパク質は、他のポリペプチド又はタンパク質、特に動物起源のそれらを実質的に有さない。
【０１２９】
発現された組換えＺｃｙｔｏ２１タンパク質（キメラポリペプチド及びマルチマータンパク質を包含する）は、従来のタンパク質精製方法、典型的にはクロマトグラフィー技法の組合せにより精製される。一般的には、ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，１９８８；及びＳｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９４を参照のこと。ポリヒスチジン親和性標識（典型的には、約６個のヒスチジン残基）を含んで成るタンパク質は、ニッケルキレート樹脂上での親和性クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｈｏｕｃｈｕｌｉなど．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：１３２１−１３２５，１９８８を参照のこと。ｇｌｕ−ｇｌｕ標識を含んで成るタンパク質は、従来の方法に従って、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。例えば、Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．，前記を参照のこと。マルトース結合タンパク質融合体は、当業界において知られている方法に従って、アミロースカラム上で精製される。
【０１３０】
Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドはまた、当業界において知られている方法に従って、化学合成、例えば排除固相合成、部分固相方法、フラグメント縮重又は従来の溶液合成を通して調製され得る。例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３；Ｓｔｅｗａｒｔなど．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ），ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４；ＢａｙｅｒａｎｄＲａｐｐ，Ｃｈｅｍ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．３：３，１９８６；及びＡｔｈｅｒｔｏｎなど．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９を参照のこと。インビトロ合成は、小さなポリペプチドの調製のために特に好都合である。
【０１３１】
当業界において知られている方法を用いて、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質は、モノマー又はマルチマーとして調製され得；グリコシル化されても又はグリコシル化されなくても良く；ペギレート化されても又はペギレート化されなくても良く；そして初期メチオニンアミノ酸を含んでも又は含まなくとも良い。
Ｚｃｙｔｏ２１活性アッセイに使用するための標的細胞は、血管細胞（特に、内皮細胞及び平滑筋細胞）、造血（骨髄性又はリンパ）細胞、肝臓細胞（例えば、肝細胞、有窓性内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞及びＩｔｏ細胞）、線維芽細胞（例えばヒト皮膚線維芽細胞及び肺線維芽細胞）、胎児肺細胞、関節性骨膜細胞、周皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞及び前立腺上皮細胞を包含する。内皮細胞及び造血細胞は、共通する先祖細胞、すなわち血管芽細胞に由来する（Ｃｈｏｉなど．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２５：７２５−７３２，１９９８）。
【０１３２】
本発明のＺｃｙｔｏ２１タンパク質は、それらの活性、すなわち相当する細胞型の増殖、分化、移動、付着又は代謝の調節により特徴づけられる。Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の生物学的活性は、細胞増殖、分化、移動又は付着を検出するよう企画されたインビトロ又はインビボアッセイ；又は細胞代謝（例えば、他の成長因子又は他の高分子の生成）の変化によりアッセイされる。多くの適切なアッセイは当業界において知られており、そして代表的なアッセイが本明細書に開示される。培養された細胞を用いてのアッセイは、アミノ酸置換、欠失又は挿入の効果をスクリーニングするために、例えば決定するために最も便利である。
【０１３３】
しかしながら、発育工程（例えば、脈管形成、創傷治癒）の複雑性の観点から、インビボアッセイは一般的に、生物学的活性を確かめ、そしてさらに特徴づけるために使用されるであろう。一定のインビトロモデル、例えばＰｅｐｐｅｒなど．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８９：８２４−８３１，１９９２）の三次元コラーゲンゲルマトリックスモデルは、組織学的効果をアッセイするために十分に複雑化される。アッセイは、外因的に生成されたタンパク質を用いて行われ得るか、又は興味あるポリペプチドを発現する細胞を用いて、インビボ又はインビトロで行われ得る。アッセイは、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質のみを用いて、又は他の成長因子、例えばＶＥＧＦファミリー又は造血サイトカイン（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ―ＣＳＦ、幹細胞因子）のメンバーと組み合わせて行われ得る。
【０１３４】
Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の活性は、培養された細胞を用いてインビトロで、又は本発明の分子を適切な動物モデルに投与することによってインビボで測定され得る。細胞増殖又は分化を測定するアッセイは、当業界において良く知られている。たとえば、増殖を測定するアッセイは、次のようなアッセイを包含する：中性赤色素に対する化学感受性（Ｃａｒａｎａｕｇｈなど．，ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌＮｅｗＤｒａｇｓ８：３４７−３５４，１９９０；引用により本明細書に組み込まれる）、放射性ラベルされたヌクレオチドの組み込み（ＲａｉｎｅｓａｎｄＲｏｓｓ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１０９：７４９−７７３，１９８５；Ｗａｈｉなど．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８：５０１６−５０２５，１９８８；及びＣｏｏＫなど．，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ．１７９：１−７，１９８９；引用により本明細書に組み込まれる）、増殖する細胞のＤＮＡへの５−ブロモー２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の組み込み（Ｐｏｒｓｔｍａｎｎなど．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８２：１６９−１７９，１９８５；引用により本明細書に組み込まれる）、及びテトラゾリウム塩の使用（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６５：５５−６３，１９８３；Ａｌｌｅｙなど．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：５８９−６０１，１９８；Ｍａｒｓｈａｌｌなど．，ＧｒｏｗｔｈＲｅｇ．５：６９−８４，１９９５；及びＳｃｕｄｉｅｒｏなど．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：４８２７−４８３３，１９８８；すべては引用により本明書に組み込まれる）。
【０１３５】
分化は、より成熟した表現型に分化するよう誘発され得る適切な前駆体細胞を用いてアッセイされ得る。分化を測定するアッセイは、たとえば組織の段階−特異的発現に関連する細胞表面マーカー、酵素活性、官能的活性、又は形態変化の測定を包含する（Ｗａｔｔ，ＦＡＳＥＢ５：２８１−２８４，１９９１；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ５７：６３−７５，１９９４；Ｒａｅｓ，Ａｄｖ．Ａｎｉｍ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，１ｉ６１−１７１，１９８９；すべては引用により本明細書に組み込まれる）。
【０１３６】
Ｚｃｙｔｏ２１活性はまた、１又は複数の追加の成長因子又は他の高分子のＺｃｙｔｏ２１−誘発された生成を測定するよう企画されたアッセイを用いて検出され得る。好ましいそのようなアッセイは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、インターロイキン−６（ＩＬ―６）、ＶＥＧＦ、酸性線維芽成長因子（ａＦＧＦ）、アンジオゲニル、及び肝臓により生成される他の高分子の存在を決定するためのアッセイを包含する。
【０１３７】
適切なアッセイは、興味ある高分子に応答する標的細胞を用いての有糸分裂誘発アッセイ、受容体−結合アッセイ、競争結合アッセイ、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、及び当業界において知られている他の形式を包含する。メタロプロテアーゼ分泌は、処理された一次ヒト皮膚線維芽細胞、骨膜細胞及び軟骨細胞から測定される。Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の存在下での培養に応答して生成される、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロマリシンの相対的レベルは、ザイモグラムゲルを用いて測定される（ＬｏｉｔａａｎｄＳｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌｏｇｙ１：９６−１０６，１９９０）。
【０１３８】
試験タンパク質に応答して皮膚線維芽細胞及び軟膏細胞によるプロコラーゲン／コラーゲン合成は、発生期分泌されたコラーゲン中への^３Ｈ−プロリン組み込みを用いて測定される。^３Ｈ−ラベルされたコラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてのオートラジオグラフィーにより可視化される（ＵｎｅｍｏｒｉａｎｄＡｍｅｎｔｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０６８１−１０６８５，１９９０）。皮膚線維芽細胞及び軟骨細胞からのムコ多糖（ＧＡＧ）分泌は、１，９−ジメチルメチレンブルー色素結合アッセイを用いて測定される（Ｆａｒｎｄａｌｅなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ８８３：１７３−１７７，１９８６）。コラーゲン及びＧＡＧアッセイはまた、それらのサイトカインに対する確立された応答を改良するＺｃｙｔｏ２１タンパク質の能力を試験するために、ＩＬ−１α又はＴＧＦ−αの存在下で行われる。
【０１３９】
単球活性化アッセイは、（１）単球活性化をさらに刺激するＺｃｙｔｏ２１タンパク質の能力を得るために、及び（２）結合−誘発された又は内毒素―誘発された単球活性化を調節するＺｃｙｔｏ２１タンパク質の能力を試験するために行われる（Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅなど．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３７９９−３８０２，１９８７）。活性化に応答して生成されるＩＬ−１α及びＴＮＦαは、ＥＬＩＳＡにより測定される（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）。単球／マクロファージ細胞は、ＣＤ１４（ＬＰＳ受容体）のおかげで、内毒素に対して敏感であり、そして適切なレベルの内毒素様活性を有するタンパク質それらの細胞を活性化するであろう。
【０１４０】
Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の造血活性が、培養における種々の造血細胞に対してアッセイされ得る。好ましいアッセイは、当業界において知られている、一次骨髄コロニーアッセイ及び後期段階の系統−制限されたコロニーアッセイを包含する（例えば、Ｈｏｌｌｙなど．，ＷＩＰＯＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＷＯ９５／２１９２０号）。適切な半固体培地（例えば、１５％ウシ胎児血清、１０％ウシ血清アルブミン及び０．６％ＰＳＮ抗生物質混合物を含む５０％メチルセルロース）上にプレートされた骨髄細胞が、試験ポリペプチドの存在下でインキュベートされ、次に、コロニー形成について顕微鏡により試験される。既知の造血因子が対照として使用される。造血細胞系に対するＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドの有糸分裂活性は、上記に開示されるようにして測定され得る。
【０１４１】
細胞動物は、Ｋａｈｌｅｒなど．（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＶａｓｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１７：９３２−９３９，１９９７）により実質的に開示されるようにして、アッセイされる。タンパク質は、それが低タンパク質濃度の領域から高タンパク質濃度の領域への移動を誘発する場合、走化性であると思われる。典型的なアッセイは、２つのチャンバーを分離するポリスチレン膜（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ；ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒＣｏｒｐ．）を有する改良されたＢｏｙｄｅｎチャンバーを用いて行われる。１％ＢＳＡを含む培地に希釈された試験サンプルが、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを含む２４−ウェルプレートの低部チャンバーに添加される。次に、細胞が０．２％ゼラチンにより前処理されたＴｒａｎｓｗｅｌｌ挿入体に配置される。
【０１４２】
細胞移動が、３７℃での４時間のインキュベーションの後に測定される。非移動性細胞はＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜の上部から除かれ、そして膜の低表面に結合される細胞が固定され、そして０．１％結晶バイオレットにより染色される。次に、染色された細胞が１０％酢酸により抽出され、そして吸光度が６００ｎｍで測定される。次に、移動が標準の検量曲線から計算される。細胞移動はまた、Ｇｒａｎｔなど．（“Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ” ｉｎＧｏｌｄｂｅｒｇａｎｄＲｏｓｅｎ，Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｉｎＣａｎｃｅｒ，ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＶｅｒｌａｇ，１９９５，２３５−２４８；Ｂａａｔｏｕｔ，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＴｅｓｅａｒｃｈ１７：４５１−４５６，１９９７）のマトリゲル方法を用いて測定され得る。
【０１４３】
細胞付着活性は、ＬａＦｌｅｕｒなど．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２７９８−３２８０３，１９９７）により開示されるようにして、実質的にアッセイされる。手短には、マイクロタイタープレートが、試験タンパク質により被覆され、非特異的部位がＢＳＡによりブロックされ、そして細胞（例えば、平滑筋細胞、白血球又は内皮細胞）が、約１０^４〜１０^５個の細胞／ウェルの密度でプレートされる。ウェルが３７℃で（典型的には約６０分間）インキュベートされ、次に、非付着性細胞が軽い洗浄により除去される。付着された細胞が従来の方法により（例えば、結晶バイオレットにより染色され、細胞を溶解し、そして溶解物の光学密度を決定することにより）、定量化される。対照ウェルは、既知の付着タンパク質、例えばフィブロネクチン又はビトロネクチンにより被覆される。
【０１４４】
Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の活性は、受容体結合及び続く生理学的細胞応答に関連する細胞外酸性化速度又はプロトン排泄を測定する珪素基材のバイオセンサーマイクロフィジオメーターにより測定され得る。典型的な装置は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡにより製造されるＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ^ＴＭＭｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒである。種々の細胞応答、たとえば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー生成、炎症応答、調節及び受容体活性化及び同様のものが、この方法により測定され得る。例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．など．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：１９０５−１９１２，１９９２；Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ，Ｓ．など．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２８：８４−１０８，１９９７；Ａｒｉｍｉｌｌｉ，Ｓ．など．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１２：４９−５９，１９９８；ＶａｎＬｉｅｆｄｅ，Ｉ．など．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４６：８７−９５，１９９８を参照のこと。
【０１４５】
マイクロフィジオメーターは、付着性又は非付着性真核又は原核細胞をアッセイするために使用され得る。時間にわたって細胞培地における細胞外酸性化の変化を測定することによって、マイクロフィジオメーターは、種々の刺激、例えばＺｃｙｔｏ２１タンパク質、それらのアゴニスト又はアンタゴニストに対する細胞応答を直接的に測定する。好ましくは、マイクロフィジオメーターは、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドに対して応答しない対照の真核細胞に比較して、Ｚｃｙｔｏ２１−応答性真核細胞の応答を測定するために使用される。Ｚｃｙｔｏ２１−応答性真核細胞は、Ｚｃｙｔｏ２１のための受容体がトランスフェクトされ、それにより、Ｚｃｙｔｏ２１に対して応答性である細胞を創造し、そして天然においてＺｃｙｔｏ２１に対して応答性の細胞を包含する。
【０１４６】
Ｚｃｙｔｏ２１に対して暴露されない対照に比較して、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドに対して暴露された細胞の応答における細胞外酸性化の上昇又は低下により測定される差異が、Ｚｃｙｔｏ２１−調節された細胞応答の直接的に測定である。さらに、そのようなＺｃｙｔｏ２１−調節された応答は、種々の刺激下でアッセイされ得る。従って、本発明は、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドに対して応答性の細胞を供給し、前記細胞の第１部分を試験化合物の不在下で培養し、前記細胞の第２部分を試験化合物の存在下で培養し、そして前記細胞の第１部分に比較して、前記細胞の第２部分の細胞応答の上昇又は低下の変化を検出することを含んでなる、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するための方法が提供される。
【０１４７】
細胞応答の変化は、細胞外酸性化速度の測定できる変化として示される。Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の存在及び試験化合物の存在下での細胞の第３部分の培養が、Ｚｃｙｔｏ２１−応答細胞のための陽性対照、及びＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドの活性と試験化合物のアゴニスト活性を比較するための対照を提供する。Ｚｃｙｔｏ２１のアンタゴニストは、試験化合物の存在及び不在下でＺｃｙｔｏ２１タンパク質に細胞を暴露することによって同定され得、それにより、Ｚｃｙｔｏ２１−刺激された活性の低下が、試験化合物におけるアンタゴニスト活性の表示である。
【０１４８】
動物におけるＺｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドの発現が、インビボのタンパク質活性の過剰生成又は阻害の生物学的効果のさらなる研究においてのモデルを提供する。Ｚｃｙｔｏ２１−コードのポリヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドは、ウィルスベクター又は裸ＤＮＡを用いて、試験動物、例えばマウス中に導入され得、又はトランスジェニック動物が生成され得る。
【０１４９】
本発明のタンパク質をアッセイするための１つのインビボアプローチは、ウィルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種拡散の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｔ．Ｃ．Ｂｅｃｋｅｒなど．，Ｍｅｔｈ．ＣｅｌｌＢｉｏ．４３：１６１−８９，１９９４；及びＪ．Ｔ．ＤｏｕｇｌａｓａｎｄＤ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４：４４−５３，１９９７を参照のこと）。アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する：（ｉ）アデノウィルスは比較的大きなＤＮＡ挿入体を適応せしめることができ；（ｉｉ）高い力価に増殖され得；（ｉｉｉ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ｉｖ）多数の異なったプロモーター、例えば偏在する、組織特異的、及び調節可能なプロモーターと共に使用され得る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与され得る。
【０１５０】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種ＤＮＡの大きな挿入体（７ｋｂまでの）が提供され得る。それらの挿入体は、直接的な結合により又は同時トランスフェクトされたプラスミドとの相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれ得る。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞（例えば、ヒト２９３細胞系）により供給されなければ、複製しないであろう。
【０１５１】
損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。アデノウィルス供給システムがＥ１遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織（例えば、肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするのであろう（そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する）。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【０１５２】
遺伝子供給の他の方法は、身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとして細胞中にベクターを導入することを含んで成る。裸ＤＮＡベクターは、当業界において知られている方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシュウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡトランスポーター使用により宿主細胞中に導入される。Ｗｕなど．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４，１９８８；Ｗｕなど．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７，１９９２；及びＪｏｈｎｓｔｏｎａｎｄＴａｎｇ，Ｍｅｔｈ，Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３：３５３−３６５，１９９４を参照のこと。
【０１５３】
Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子を発現するよう構築されたトランスジェニックマウス、又は“ノックアウトマウス”として言及される、Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子機能の完全な存在を示すマウス（Ｓｎｏｕｗａｅｒｔなど．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：１０８３，１９９２）がまた、生成され得る（Ｌｏｗｅｌｌなど．，Ｎａｔｕｒｅ３６６：７４０−７４２，１９９３）。それらのマウスは、インビボシステムにおけるＺｃｙｔｏ２１遺伝子、及びそれによりコードされるタンパク質を研究するために使用され得る。トランスジェニックマウスは、それらが特定因子の過剰又は過少発現に起因する成長性異常及び遮断の同定を可能にすることにおいて、初期成長におけるＺｃｙｔｏ２１タンパク質の役割を調べるために特に有用である。また、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅなど．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：５５−６０，１９９７，及びＨａｎｅｈａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：４８−５０，１９９７を参照のこと。トランスジェニック発現のための好ましいプロモーターは、メタロチオネイン及びアルブミン遺伝子からのプロモーターを包含する。
【０１５４】
筋肉収縮の正常な阻害制御の損失は、選択されたγ−アミノ酪酸−分泌ニューロンの損傷又は心配に関連している。例えば、ＳｔｉｆｆＭａｎＳｙｎｄｒｏｍｅは、それらのγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）生成ニューロンの機能の妨害を通して介在されると思われる、筋肉組織の著しい硬直性を示す。他の関連する神経筋肉障害は、ミオトニー、代謝性ミオパシー、アイザック症候群、ジストニー及び強直性収縮を包含する（Ｖａｌｌｄｅｏｒｉｏｌａ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２４６：４２３−４３１，１９９９）。
【０１５５】
同様に、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドの直接的な測定、又は組織における発現のその損失が、それらが腫瘍の進行を受けるにつれて、組織又は細胞において決定され得る。前癌又は癌状態における細胞の侵襲性及び運動性の上昇、又はＺｃｙｔｏ２１の発現の獲得又は損失が、正常な組織に比較して、腫瘍進行における形質転換、侵襲性及び転移についての診断として作用することができる。進行又は転移の腫瘍段階の知識は、所定の個々の癌患者のために、最も適切な治療又は処理の攻撃性を選択する上で医薬を助けるであろう。発現（ｍＲＮＡ又はタンパク質のいずれかの）の獲得及び損失を測定する方法は、当業界において良く知られており、そして本明細書に記載されており、そしてＺｃｙｔｏ２１発現に適用され得る。
【０１５６】
例えば、細胞運動性を調節するポリペプチドの出現又は消出が、前立腺癌の診断及び予後を助けるために使用され得る（Ｂａｎｙａｒｄ，Ｊ．ａｎｄＺｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ｒ．，ＣａｎｃｅｒａｎｄＭｅｔａｓｔ．Ｒｅｖ．１７：４４９−４５８，１９９９）。細胞運動性、活性化、増殖又は分化のエフェクターとして、発現のＺｃｙｔｏ２１獲得又は損失が脳及び他の癌についての診断分析として作用することができる。
【０１５７】
さらに、正常対照に対して、患者におけるＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド又は抗−Ｚｃｙｔｏ２１抗体の高められたレベルが、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に類似して、脳及び他の癌の表示である（例えば、Ｍｕｌｄｅｒｓ，ＴＭＴ，など．，Ｅｕｒ．Ｊ．ＳｕｒｇｉｃａｌＯｎｃｏｌ．１６：３７−４０，１９９０を参照のこと）。Ｚｃｙｔｏ２１を発現することが通常見出されていない組織における強いＺｃｙｔｏ２１発現が、細胞又は組織型における異常性、すなわち非肝臓組織中への癌性肝臓組織の侵入又は転移の診断として作用し、そしてさらなる試験又は調査の指図において医者を助け、又は治療の指図を助ける。
【０１５８】
さらに、Ｚｃｙｔｏ２１ポリヌクレオチドプローブ及び抗−Ｚｃｙｔｏ２１抗体、並びに組織におけるＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドの存在の検出は、Ｚｃｙｔｏ２１を通常発現することが見出されている脳又は他の組織が、例えば、疾病又は癌性肝臓又は神経組織の切除を包含する手術の後に存在するかどうかを評価するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、すべての組織が手術の後、例えば脳及び他の癌についての手術の後、切除されたかどうかを決定するための助剤として使用され得る。そのような場合、癌からの回復を最大にし、そして再発を最少にするために、すべての可能性ある疾病組織を除去することが特に重要である。好ましい態様は、組織学的に又は現場使用され得る、蛍光性、放射性ラベルされた、又は比色的にラベルされた抗−Ｚｃｙｔｏ２１抗体及びＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド結合パートナーを包含する。
【０１５９】
さらに、腫瘍進行及び転移に対するＺｃｙｔｏ２１の活性及び効果が、インビボで測定され得る。いくつかの同系マウスモデルが、腫瘍進行に対するポリペプチド、化合物又は他の処理の影響を研究するために開発されて来た。それらのモデルにおいては、培養継代された腫瘍細胞が、腫瘍ドナーと同じ株のマウス中に移植される。細胞は、受容体マウスにおいて類似する特徴を有する腫瘍中に増殖し、そして転移がまた、そのモデルのいくつかにおいて生じるであろう。本発明者の研究のための適切な腫瘍モデルは、中でも、Ｌｅｗｉｓ肺癌（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１６４２）及びＢ１６黒色腫（ＡＴＣＣＮｏ．Ｃｒｌ−６３２３）を包含する。それらは、インビトロで容易に培養され、そして操作される、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスと同種の通常使用される腫瘍系である。
【０１６０】
それらの細胞系のいずれかの移植に起因する腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスの肺に転移することができる。Ｌｅｗｉｓ肺癌モデルが最近、脈管形成のインヒビターを同定するためにマウスに使用されている（Ｏ’ＲｅｉｌｌｙＭＳ，など．Ｃｅｌｌ７９：３１５−３２８，１９９４）。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスが、組換えタンパク質、アゴニスト又はアンタゴニストの毎日の注入、又は組換えアデノウィルスの１回の注入を通して、実験剤により処理される。この処理に続いて３日で、１０^５〜１０^６個の細胞が背面の皮膚下に移植される。他方では、細胞自体が、タンパク質が全身的によりもむしろ腫瘍部位で又は細胞内で合成されるよう、移植の前、組換えアデノウィルス、例えばＺｃｙｔｏ２１を発現するアデノウィルスにより感染され得る。マウスは、通常５日以内に眼に見える腫瘍を進行する。
【０１６１】
腫瘍が３週間までの間、増殖され、この間、それらは対照の処理グループにおいて１５００−１８００ｍｍ^３のサイズに達することができる。腫瘍サイズ及び体重が、その実験を通して注意してモニターされる。殺害の時点で、腫瘍が、肺及び肝臓と共に除去され、そして計量される。肺の重量が、転移性腫瘍負荷量と相互関係することが示された。さらなる測定として、肺表面転移が計数される。切除された腫瘍、肺及び肝臓が、当業界において知られており、そして本明細書に記載される方法を用いて、組織学的試験、免疫組織化学及び現場ハイブリダイゼーションのために調製される。従って血管構造を回復し、そして転移を受ける腫瘍の能力に対する、問題の発現されたポリペプチド、例えばＺｃｙｔｏ２１の影響が評価され得る。
【０１６２】
さらに、アデノウィルスとは別に、移植された細胞がＺｃｙｔｏ２１により一時的にトランスフェクトされ得る。安定したＺｃｙｔｏ２１トランスフェクトの使用、及びインビボでのＺｃｙｔｏ２１発現を活性化する誘発性プロモーターの使用は、当業界において知られており、そして転移のＺｃｙｔｏ２１誘発を評価するためにこのシステムに使用され得る。さらに、精製されたＺｃｙｔｏ２１又はＺｃｙｔｏ２１−ならし培地が、このマウスモデルに直接的に注入され、そして従って、このシステムに使用される。一般的な文献については、Ｏ’ＲｅｉｌｌｙＭＳ，など．Ｃｅｌｌ７９：３１５−３２８，１９９４，及びＲｕｓｃｉａｎｏＤ，など、ＭｕｒｉｎｅＭｏｄｅｌｓｏｆＬｉｖｅｒＭｅｔａｓｔａｓｉｓ，ＩｎｖａｓｉｏｎＭｅｔａｓｔａｓｉｓ１４：３４９−３６１，１９９５を参照のこと。
【０１６３】
抗血清方法は、インビボでＺｃｙｔｏ２１遺伝子転写の阻害の効果を試験するためにそのような転写を阻害するために使用され得る。Ｚｃｙｔｏ２１−コードのポリヌクレオチド（例えば、配列番号１に示されるようなポリヌクレオチド）のセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチドが、Ｚｃｙｔｏ２１−コードのｍＲＮＡに結合し、そしてそのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害するよう企画される。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、細胞培養におけるＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド−コードの遺伝子の発現を阻害するためにも使用され得る。
【０１６４】
ほとんどのサイトカイン、及び活性化されたリンパ球により生成される他のタンパク質は、身体中の細胞の細胞分化、活性化、レクルートメント及び恒常性において重要な生物学的役割を演じる。そのような治療用途は、免疫調節を必要とする疾病、例えば自己免疫疾患、例えばリウマチ様関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス及び糖尿病の処理を包含する。Ｚｃｙｔｏ２１は、炎症の調節において重要であり、そして従って、リウマチ様関節炎、ぜん息及び敗血症の処理において有用である。腫瘍形成の介在においてＺｃｙｔｏ２１の役割が存在し、それによりＺｃｙｔｏ２１アンタゴニストが癌の処理において有用である。Ｚｃｙｔｏ２１が免疫系の調節において有用であり、それによりＺｃｙｔｏ２１及びＺｃｙｔｏ２１アンタゴニストは、移植片拒絶を低めるために、対宿主性移植片病を妨げるために、感染性疾病に対する免疫性を追加するために、免疫無防備状態の患者（例えば、ＨＩＶ^＋患者）を処理するために、及びワクチンの改良のために使用され得る。
【０１６５】
脳、ランゲルハンス島、前立腺、精巣、下垂体、胎盤、卵巣腫瘍、肺腫瘍、及び直腸腫瘍の組織、並びにＣＤ３＋細胞系及びウィルス感染された前立腺上皮細胞系におけるインターフェロン様ポリペプチドとして、Ｚｃｙｔｏ２１は、それらの及び他の組織におけるウィルス感染、腫瘍形成及び転移を調節するために有用である。そのような場合、インターフェロン様分子は、感染又は異常細胞増殖の部位で細胞により開放され得、又は分泌された分子として、それは異なった組織からその部位に移動することができる。
【０１６６】
Ｚｃｙｔｏ２１の抗ウィルス性質は、乳頭腫ウィルスによる感染を、インビトロ及びインビボで処理することにおいて特に有用である。例えば、ヒト乳頭腫ウィルスにより引き起こされる腫瘍は、良性の腫瘍（すなわち、性器いぼ）及び悪性腫瘍、例えば鱗状細胞癌を引き起こす。それらの状態についての処理は通常、手術、又は組織破壊である。しかしながら、現在、いくつかの抗ウィルス／免疫調節薬剤、例えばインターフェロンαが、腫瘍サイズを低めることにおいて効果的であることが示されている。Ｂａｋｅｒ，Ｇ．など．，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｒ．１５：３３１−３４０，１９９７を参照のこと。
【０１６７】
さらに、Ｒｏｃｋｌｅｙ，Ｐ．Ｆ．など．，（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６５（２）：２６５−２８７，１９９５）により論じられるように、インターフェロンによる免疫療法が、感染、例えば臨床学的、潜在性疾病のすべての部位に対して向けられ得る。この例においては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γが、肛門性器突圭コンジロームを処理するために、単一療法として、及び他の療法と組み合わせて都合良く使用されて来た。Ｚｃｙｔｏ２１は、この処理においてＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γに類似する有用な処理であろう。さらに、一定型のヒト乳頭腫ウィルスと頸部癌との間に強い関連性が存在している。Ｚｃｙｔｏ２１は、頸部癌を検出し、モニター、そして処理するために使用され得る。
【０１６８】
ランゲルハンス島細胞における小さな分泌されたタンパク質として、Ｚｃｙｔｏ２１は、それらの細胞の増殖及び分化を調節することができる。さらに、Ｚｃｙｔｏ２１は、糖尿病、及び細胞の増殖及び分化に関連する免疫学的状態の処理において有用である。
脳及び下垂体細胞におけるＺｃｙｔｏ２１の存在は、それがそれらの細胞の増殖及び分化に使用され得ることを示す。さらに、本発明の分子は、栄養恒常性、例えば栄養補給及び食欲抑制に関連する挙動性疾患を担当できる。さらに、Ｚｃｙｔｏ２１分子は、一般的に、生殖疾患の処理に使用され得る。
【０１６９】
Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドは、単独で、又は他の脈管形成剤、例えばＶＥＧＦと組合して投与され得る。追加の剤と組合してＺｃｙｔｏ２１を用いる場合、それらの２種の化合物は、処理される特定の条件のために適切なように、同時に又は連続的に投与され得る。
【０１７０】
Ｚｃｙｔｏ２１は腫瘍形成の処理において有用であり、そして従って、癌の処理において有用である。抗−ＩｇＭ刺激された正常Ｂ−細胞のＺｃｙｔｏ２１の阻害及び類似する効果が、Ｂ−細胞腫瘍系において観察され、このことは、Ｂ細胞腫瘍細胞を低い増殖状態に誘発するために、Ｚｃｙｔｏ２１による患者の処理において治療的効果が存在することを示している。リガンドは、従来の化学療法剤及び免疫調節剤、例えばインターフェロンαの両者を包含する使用において、他の剤と組合して投与され得る。α／βインターフェロンは、いくつかの白血病及び動物疾患モデルの処理において効果的であることが示されており、そしてインターフェロンのα及びＺｃｙｔｏ２１の成長阻害効果は、Ｂ−細胞腫瘍由来の細胞系に対して付加的であり得る。
【０１７１】
本発明は、新生Ｂ又はＴ細胞の増殖を低めるのに十分な量のＺｃｙｔｏ２１の組成物を、Ｂ又はＴ細胞新生を有する哺乳類に投与することを含んで成る、新生Ｂ又はＴ細胞の増殖を低めるための方法を提供する。骨髄前駆体からの溶解性ＮＫ細胞のＺｃｙｔｏ２１刺激及び抗原受容体の活性化に続いてのＴ細胞の増殖は、同種骨髄移植を受ける患者のための処理を増強し、そして従って、Ｚｃｙｔｏ２１は、ドナーリンパ球の注入を伴なって又はそれを伴なわないで、抗−腫瘍応答の生成を増強するであろう。
もう１つの態様においては、本発明は、新生Ｂ又はＴ細胞の増殖を低めるのに十分な量のＺｃｙｔｏ２１アンタゴニストの組成物を、Ｂ又はＴ細胞新生を有する哺乳類に投与することを含んで成る、新生Ｂ又はＴ細胞の増殖を低めるための方法を提供する。さらに、Ｚｃｙｔｏ２１１アンタゴニストは、リガンド／毒素融合タンパク質であり得る。
【０１７２】
Ｚｃｙｔｏ２１−サポリン融合毒素が、類似する組の白血病及びリンパ腫に対して使用され得、これがＺｃｙｔｏ２１により処理され得る白血病の範囲を拡張する。Ｚｃｙｔｏ２１受容体の融合毒性介在性活性化が、標的細胞の増殖を阻害する次の２種の独立した手段を提供し、ここで前記第１の手段はリガンドのみにより見られる効果と同一であり、そして第２の手段は受容体インターナリゼーションを通しての毒性の供給による手段である。
【０１７３】
本明細書における教授に基づいて、本発明のインターフェロン様Ｚｃｙｔｏ２１分子は、次のような種々の病状を検出し、モニターし、又は処理するために有用である：ヘアリー・セル白血病、腎細胞癌、基底細胞癌、悪性メラノーマ、ＡＩＤＳ関連のカポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非−Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、喉頭乳頭腫形成、菌状息肉腫、尖圭コンジローム、乳頭腫ウィルス−誘発されたゆうぜい状表皮発育異常症、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性Ｄ型肝炎及び慢性非−Ａ，非−Ｂ／Ｃ肝炎。
【０１７４】
アメリカ食品医薬品局は、多発性硬化症、すなわち神経系の慢性疾患を処理するインターフェロン−βの使用を許可した。インターフェロン−γは、慢性肉芽腫性疾病を処理するために使用され、ここで前記インターフェロンは、感染性細菌、菌類及び原生動物病原体を破壊するために患者の免疫応答を増強する。臨床学的研究はまた、インターフェロン−γがＡＩＤＳ、リーシュマニア症及びらい腫性らい病の処理において有用であることを示している。
【０１７５】
医薬使用のためには、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質は、従来の方法に従って、非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。一般的に、医薬製剤は、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドを、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。配合方法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９^ｔｈｅｄ．，１９９５に開示される。Ｚｃｙｔｏ２１は、好ましくは、１０〜１００μｇ／ｍｌ合計体積の濃度で使用され得るが、但し１ｎｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度が使用され得る。
【０１７６】
局部適用、例えば創傷治癒の増進に関しては、タンパク質は、０．１〜１０μｇ／ｃｍ^２の創傷領域の範囲で適用され、そして正確な用量は、処理される病状の性質及び重症度、患者の形質、等を考慮して、許容される標準に従って、医者により決定される。用量の決定は、当業者のレベルの範囲内である。投与は、処理の期間、毎日又は断続的である。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な期間にわたって、ボーラス注射又は注入によってであろう。持効性配合物もまた使用され得る。一般的に、Ｚｃｙｔｏ２１の治療的有効量とは、処理される病状の臨床学的に有意な変化、例えば造血又は免疫機能の臨床学的に有意な変化、羅病率の有意な低下、又は有意に高められた組織学的評点を生成するのに十分な量である。
【０１７７】
Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質、アゴニスト及びアンタゴニストは、一次細胞及び培養される細胞系の両者を包含する応答細胞型の拡張、増殖、活性化、分化、移動又は代謝を調節するために有用である。これに関する特に興味あるものは、造血細胞、間葉細胞（幹細胞、成熟骨髄性細胞及びリンパ細胞を包含する）、内皮細胞、外皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、神経細胞及び胚幹細胞である。Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドは、約１０ｐｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、それらの細胞型のための組織培養培地に添加される。当業者は、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質が培養培地において他の成長因子と共に都合良く組合され得ることを認識するであろう。
【０１７８】
実験室調査においては、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質は、タンパク質の循環レベルを決定するためのアッセイにおいて、例えばＺｃｙｔｏ２１タンパク質の過剰又は過少生成により特徴づけられる疾病の診断において、又は細胞表現型の分析において、分子量標準又は試薬としても使用され得る。
【０１７９】
Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質はまた、その活性のインヒビターを同定するためにも使用され得る。試験化合物は、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の活性を阻害する化合物を同定するために、本明細書に開示されるアッセイに添加される。本明細書に開示されるそれらのアッセイの他に、サンプルは、受容体結合を測定するよう企画された種々のアッセイ内のＺｃｙｔｏ２１活性の阻害、又はＺｃｙｔｏ２１−依存性細胞応答の刺激／阻害について試験され得る。例えばＺｃｙｔｏ２１−応答性細胞系は、Ｚｃｙｔｏ２１−刺激された細胞経路に応答するレポーター遺伝子構造体によりトランスフェクトされ得る。
【０１８０】
このタイプのレポーター遺伝子構造体は、当業界において知られており、そして一般的に、アッセイできるタンパク質、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子に操作可能的に連結されるＺｃｙｔｏ２１−活性化された血清応答要素（ＳＲＥ）を含むであろう。候補体化合物、溶液、混合物又は抽出物は、レポーター遺伝子発現のＺｃｙｔｏ２１刺激の低下により明らかなように、標的細胞に対するＺｃｙｔｏ２１の活性を阻害する能力について試験される。このタイプのアッセイは、細胞−表面受容体に結合するＺｃｙｔｏ２１を直接的にブロックする化合物、及びこの受容体−リガンド結合に続く細胞経路における工程をブロックする化合物を検出するであろう。
【０１８１】
他方では、化合物又は他のサンプルが、検出できるラベル（例えば^１２５Ｉ、　ビオチン、ホースラディシュ　ペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ、及び同様のもの）により標識されるＺｃｙｔｏ２１を用いて、受容体へのＺｃｙｔｏ２１結合の直接的なブロッキングについて試験され得る。このタイプのアッセイにおいては、受容体へのラベルされたＺｃｙｔｏ２１の結合を阻害する試験サンプルの能力は、二次アッセイを通して確かめられ得る阻害活性の表示である。結合アッセイ内に使用される受容体は、細胞受容体、又は単離され、固定された受容体であり得る。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）_２及びＦａｂフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの（遺伝子的に構築された抗体を包含する）を包含する。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトＣＤＲのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（ｃｌｏａｋｉｎｇ）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。
【０１８３】
ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。当業者は、特定の不変ドメインと関連する種々の免疫機能を促進するか、又は阻害するために、特定の及び異なった不変ドメイン（すなわち、異なったＩｇサブクラス）を有するヒト適合された抗体を生成することができる。抗体は、それらが対照（非−Ｚｃｙｔｏ２１）ポリペプチド又はタンパク質に対する結合親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性を伴なってＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド又はタンパク質に結合する場合、特異的に結合するとして定義される。モノクローナル抗体の親和性は、当業者により容易に決定され得る（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９を参照のこと）。
【０１８４】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている（例えば、Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｇ．Ｒ．，Ｅｄ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２を参照のこと）。配列番号２に示されるように、残基１５５（Ｇｌｕ）〜１６０（Ｇｌｕ）；残基５１（Ｌｙｓ）〜５６（Ａｌａ）；残基５０（Ｐｈｅ）〜５５（Ａｓｐ）；残基１４０（Ｐｒｏ）〜１４５（Ａｒｇ）；及び残基１５４（Ｇｌｎ）〜１５９（Ｌｙｓ）を包含する親水性抗原性部位に対する抗体を生成することが、特に興味ある対象である。当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットから生成され得る。Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。
【０１８５】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン　ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばＺｃｙｔｏ２１ポリペプチド又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０１８６】
抗体を生成し、そして選択するためのもう１つの技法は、Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドに対するリンパ球のインビトロ暴露、及びファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーの選択（例えば、固定された又はラベルされたＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドの使用を通して）を包含する。ヒト抗体は、ＷＩＰＯ公開ＷＯ９８／２４８９３号に開示されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むよう構築されたトランスジェニック非−ヒト動物において生成される。好ましくは、それらの動物における内因性免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えにより不活性化されるか又は排除される。
【０１８７】
当業者に知られている種々のアッセイがＺｃｙｔｏ２１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗａｎｄｌａｎｅ（Ｅｄｓ．），ＣｏｌｄＳｐｅｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８８に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセイ。
【０１８８】
Ｚｃｙｔｏ２１に対する抗体が、タンパク質の循環レベルを決定するための診断アッセイ内でのタンパク質の親和性精製のために；基礎をなす病理学又は疾病のマーカーとしての可溶性Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドの検出又は定量化のために；完全な動物又は組織断片内の免疫位置決定、例えば免疫診断適用のために；免疫組織化学のために；及びインビトロ及びインビボでのタンパク質活性を阻止するためのアンタゴニストとして使用され得る。
【０１８９】
Ｚｃｙｔｏ２１に対する抗体はまた、Ｚｃｙｔｏ２１を発現する細胞の標的化のために；Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチド及びタンパク質の親和性精製のために；ＦＡＣＳを用いる分析方法において；発現ライブラリーのスクリーニングのために；及び抗−イディオタイプ抗体の生成のために使用され得る。抗体は、Ｚｃｙｔｏ２１のための受容体を発現する細胞へのそれらの化合物の標的化を提供するために、既知方法を用いて、治療剤及び診断剤を包含する他の化合物に連結され得る。
【０１９０】
インビトロ及びインビボ診断を包含する一定の用途に関しては、ラベルされた抗体を使用することが好都合である。適切な直接的な標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学ルミネセントマーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；関節的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明の抗体はまた、薬剤、毒素、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体は、インビボ診断又は治療の用途（例えば、細胞増殖の阻害）のために使用され得る。一般的には、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎなど．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６：１３２４−１３３０，１９９６を参照のこと。
【０１９１】
本発明のポリペプチド及びタンパク質は、受容体を同定し、そして単離するために使用され得る。Ｚｃｙｔｏ２１受容体は、肝臓における増殖調節、血管形成及び他の成長工程に包含され得る。例えば、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質及びポリペプチドがカラム上に固定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（一般的には、ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＡｆｆｉｎｉｔｙＬｉｇａｎｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎなど．，ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９２，ｐｐ．１９５−２０２に開示されるようにして）。
【０１９２】
タンパク質及びポリペプチドがまた、放射性ラベルされ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８２， “ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９０，７２１−７３７）、又は光親和性ラベルされ（Ｂｒｕｎｎｅｒなど．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４８３−５１４，１９９３及びＦｅｄａｎなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｎａｃｏｌ．３３：１１７６−１１８０，１９８４）、そして特定の細胞−表面タンパク質を標識するために使用され得る。類似する態様においては、放射性ラベルされたＺｃｙｔｏ２１タンパク質及びポリペプチドは、発現ｃＤＮＡライブラリーによりトランスフェクトされた細胞を用いての結合アッセイにおいて同起源受容体をクローン化するために使用され得る。
【０１９３】
Ｚｃｙｔｏ２１ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、質量分析学、コンホメーション、特に４個のαヘリックスを決定するために、円ニ色性を、原子の立体構造を詳細に決定するために、Ｘ−線結晶学を、溶液におけるタンパク質の構造を表すために、核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、Ｚｃｙｔｏ２１を含むキットが、学生の分析熟練を開発するために与えられ得る。アミノ酸配列は教師によっては知られており、すなわちタンパク質は学生の熟練を決定し、又はその熟練を進展せしめるための試験として学生に提供されるので、教師は、学生がポリペプチドを正しく分析したかどうかを知ることができる。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、Ｚｃｙｔｏ２１の教育的利用はそれ自体ユニークであろう。
【０１９４】
Ｚｃｙｔｏ２１に対して特異的に結合する抗体は、Ｚｃｙｔｏ２１を精製し、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するために、親和性クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを学生に教授するための教授援助として、及び従って、ヒト適合された抗体をいかにして企画するかを学生に教授するための実習課目として使用され得る。次に、Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージされ、そして学生が分子生物学の分野において熟練を得るために教育機関に市販される。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は、実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内で有ると思われる。従って、一般的に記載された本発明は、次の例により容易に理解されるが、それらは例示的であって、本発明を制限するものではない。
【０１９５】
実施例
例１：
Ｚｃｙｔｏ２１をコードするポリヌクレオチドのすべて又は一部を含む発現プラスミドを、相同組換えにより構成する。Ｚｃｙｔｏ２２１ｃＤＮＡのフラグメントを、Ｚｃｙｔｏ２１挿入点を両端に有するベクター配列に応答する５’及び３’末端でフランキング領域と共に配列番号１のポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより単離する。ＰＣＲのためのプライマーはそれぞれ、５’末端から３’末端の方に次のものを包含する：前記ベクターからの４０ｂｐのフランキング配列、及びＺｃｙｔｏ２１の読み取り枠からのアミノ及びカルボキシル末端に対応する１７ｂｐ。
【０１９６】
１００μｌのＰＣＲ反応混合物のうち１０μｌを、分析のための１×ＴＢＥ緩衝液と共に、０．８％低溶融−温度アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ（商標）；ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）ゲル上に負荷する。残る９０μｌの反応混合物を、５μｌの１ＭのＮａＣｌ及び２５０μｌの無水エタノール添加により沈殿せしめる。ＳｍａＩにより切断されたプラスミドｐＺＭＰ６を、ＰＣＲフラグメントによる組換えのために使用する。プラスミドｐＺＭＰ６は、サイトメガロウィルス直前プロモーター、コード配列の挿入のための複数の反応部位、及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセット；複数のＥ．コリ起点；ＳＶ４０プロモーター、複製のエンハンサー及び起点、ＤＨＦＲ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを含んで成る哺乳類選択マーカー発現単位；及びＳ．セレビシアエにおける選択及び複製のために必要とされるＵＲＡ３及びＣＥＮ−ＡＲＳ配列を含む哺乳類発現ベクターである。
【０１９７】
それを、ｐＺＰ９（受託番号９８６６８号として、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託されている）、及びｐＲＳ３１６（受託番号７７１４５号として、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９に寄託されている）から取られた酵母遺伝子要素、ポリオウィルスから内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素、並びにトランスメンブラントドメインのＣ−末端で切断されたＣＤ８の細胞外ドメインから構成した。
【０１９８】
１００μｌのコンピテント酵母（Ｓ．セレビシアエ）細胞を、それぞれ、上記からの種々のＤＮＡ混合物１０μｌと共に組合し、そして０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母／ＤＮＡ混合物を、０．７５ｋＶ（５ｋＶ／ｃｍ）、∞オーム、２５μＦの電力供給（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）設定を用いて、電気パルスする。個々のキュベットに、１．２Ｍのソルビトール６００μｌを添加し、そして酵母を、１つのＵＲＡ−Ｄプレート上に２種の３００μｌアリコートでプレートし、そして３０℃でインキュベートする。約４８時間の後、単一のプレートからのＵｒａ^＋酵母形質転換体を、１ｍｌの水に再懸濁し、そして軽く回転せしめ、酵母細胞をペレット化する。
【０１９９】
細胞ペレットを、１ｍｌの溶解緩衝液（２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁する。５００μｌの溶解混合物を、３００μｌの酸−洗浄されたガラスビーズ及び２００μｌのクロロホルムを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に添加し、１分の間、２又は３度、かきまぜ、そして最大速度でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機により５分間、回転せしめる。３００μｌの水性相を、新しい管に移し、そしてＤＮＡを、６００μｌのエタノール（ＥｔＯＨ）により沈殿し、続いて、４℃で１０分間、遠心分離する。ＤＮＡペレットを、１０μｌの水に再懸濁する。
【０２００】
エレクトロコンピテントＥ．コリ宿主細胞（ＥｌｅｃｔｒｏｍａｘＤＨ１０Ｂ^ＴＭ細胞；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから得られた）の形質転換を、０．５〜２ｍｌの酵母ＤＮＡ調製物及び３０μｌの細胞により行う。細胞を１．７ｋＶ，２５μＦ及び４００オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、１ｍｌのＳＯＣ（２％のＢａｃｔｏ^ＴＭＴｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ），０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｔｃｏ）、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、２０ｍＭのグルコース）を、４個のＬＢＡＭＰプレート（ＬＢブイヨン（Ｌｅｎｎｏｘ）、１．８％のＢａｃｔｏ^ＴＭ寒天（Ｄｉｆｃｏ）、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン）上に、２５０μｌのアリコートでプレートする。
【０２０１】
Ｚｃｙｔｏ２１のための正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、Ｚｃｙｔｏ２１挿入体の存在を確かめ、そして種々のＤＮＡ配列がお互い正しく連結されていることを確かめる。陽性クローンの挿入体を、配列分析にゆだねる。大規模プラスミドＤＮＡを、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄＭａｃｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って単離する。正しい構造体を、ｐＺＭＰ６／Ｚｃｙｔｏ２１と命名する。
【０２０２】
例２：
ＣＨＯ　ＤＧ４４細胞（Ｃｈａｓｉｎなど．，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５−６６６，１９８６）を、１０ｃｍの組織培養皿にプレートし、そしてＨａｍ’ｓＦ１２／ＦＢＳ培地（Ｈａｍ’ｓＦ１２培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１％のＬ−グルタミン（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、１％のピルビン酸ナトリウム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））において、３７℃で５％ＣＯ_２下で、一晩、約５０％〜７０％の集密性まで増殖する。
【０２０３】
次に、細胞を、血清フリー（ＳＦ）培地配合物（Ｈａｍ’ｓｆ１２，１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、２ｍｇ／ｍｌのフェチュイン、１％のＬ−グルタミン及び１％のピルビン酸ナトリウム）における、膜濾過された水中ポリカチオン脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパニミニウム−トリフルオロアセテート及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭＲｅａｇｅｎｔ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の３：１（ｗ／ｗ）リポソーム配合物を用いて、リポソーム−介在性トランスフェクションにより、プラスミドＺｃｙｔｏ２１／ｐＺＭＰ６により形質転換する。
【０２０４】
Ｚｃｙｔｏ２１／ｐＺＭＰ６を、１５ｍｌの管において、ＳＦ培地により希釈し、６４０μｌの最終体積にする。３５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭを、６０５μｌのＳＦ培地と共に混合する。その得られる混合物を、ＤＮＡ混合物に添加し、そして室温で約３０分間インキュベートする。５ｍｌのＳＦ培地を、ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ混合物に添加する。細胞を５ｍｌのＳＦ培地により１度すすぎ、吸引し、そしてＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ混合物を添加する。細胞を３７℃で５時間インキュベートし、次に６．４ｍｌのＨａｍ’ｓＦ１２／１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＮ培地を個々のプレートに添加する。
【０２０５】
プレートを３７℃で一晩インキュベートし、そしてＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ混合物を、次の日、新鮮な５％ＦＢＳ／Ｈａｍ’ｓ培地により交換する。トランスフェクションの３日後、細胞を、増殖培地を含むＴ−１７５フラスコ中に分割する。トランスフェクションの７日後、細胞を、ＦＴＴＣ−抗−ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｒ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）により染色し、続いて抗−ＦＴＴＣ−接合された磁気ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）により処理する。ＣＤ８−陽性細胞を、市販のカラム（ｍｉｎｉ−ＭＡＣＳカラム；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、製造業者の説明書に従って分離し、そしてヌクレオシドを有さないが、しかし５０ｎＭのメトトレキセートを有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ１２／５％ＦＢＳ（選択培地）中に添加する。
【０２０６】
細胞を、選択培地を含む９６−ウェル皿において、０．５、１及び５個の細胞／ウェルの密度でサブクローニングするためにプレートし、そして約２週間、増殖せしめる。ウェルを、培地の蒸発について調べ、そしてその工程の間、必要な場合、２００μｌ／ウェルに戻す。プレートにおけるコロニーの％が集密性近くになる場合、１００μｌの培地を、ドットプロットによる分析のために個々のウェルから集め、そして細胞に新しい選択培地を供給する。上清液を、ドットブロット装置におけるニトロセルロースフィルターに適用し、そしてフィルターを、真空オーブンにおいて１００℃で処理し、タンパク質を変性する。フィルターを、６２５ｍＭのトリス−グリシン、ｐＨ９．５、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール溶液において、６５℃で１０分間、次に、２．５％脱脂ドライミルクＷｅｓｔｅｒｎＡ緩衝液（０．２５％ゼラチン、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０）において、回転振盪機上で４℃で一晩インキュベートする。
【０２０７】
フィルターを、２．５％脱脂ドライミルクＷｅｓｔｅｒｎＡ緩衝液において、回転振盪機上で室温で１時間、抗体−ＨＲＰ接合体と共にインキュベートする。次に、このフィルターを、ＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０により室温で３度（１５分／洗浄）、洗浄する。フィルターを、化学ルミネセンス試薬（ＥＣＬ^ＴＭ直接的ラベリングキット；ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）により、製造業者の説明書に従って展開し、そしてフィルム（ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬ，ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．）に約５分間、感光する。９６ウェル皿からの陽性クローンをトリプシン処理し、そして増大及びウェスターンブロットによる分析のために、選択培地を含む６−ウェル皿に移す。
【０２０８】
例３：
十分な長さのＺｃｙｔｏ２１タンパク質を、ｐＺＭＰ６／Ｚｃｙｔｏ２１（例１）によりトランスフェクトされたＢＨＫ細胞において生成する。ＢＨＫ５７０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１０３１４）を、１０−ｃｍの組織培養皿にプレートし、そしてＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ；ＬｉｆｅＦｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１ｍＭのＬ−グルタミン（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、３７℃で一晩、５％ＣＯ_２下で、約５０〜７０％の集密性まで増殖する。
【０２０９】
次に、細胞を、血清フリー（ＳＦ）培地（１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｍｌ／ｍｌのインスリン、２ｍｇ／ｍｌのフェチュイン、１％ｌ−グルタミン及び１％ピルビン酸ナトリウムにより補充されたＤＭＥＭ）において、リポソーム−介在性トランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを用いて）に従って、ｐＺＭＰ６／Ｚｃｙｔｏ２１によりトランスフェクトする。プラスミドを１５ｍｌの管においてＳＦ培地に希釈し、６４０μｌの合計最終体積にする。脂質混合物３５μｌを、ＳＦ培地６０５μｌと共に混合し、そしてその得られる混合物を、室温で約３０分間インキュベートする。
【０２１０】
次に、５ｍｌのＳＦ培地を、ＤＮＡ：脂質混合物に添加する。細胞を５ｍｌのＳＦ培地により１度すすぎ、吸引し、そしてＤＮＡ：脂質混合物を添加する。細胞を、３７℃５時間インキュベートし、次に６．５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＮ培地を個々のプレートに添加する。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、そしてＤＮＡ：脂質混合物を、次の日、新鮮な５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地により交換する。トランスフェクションの５日後、細胞を、選択培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ、１％Ｌ−Ｇｌｎ，１％ＮａＰｙｒ、１μＭのメトトレキセート）を含むＴ−１６２フラスコ中に分割する。トランスフェクションの約１０日後、個々のトランスフェクションからのメトトレキセート耐性コロニーの２種の１５０ｍｍ培養皿を、トリプシン処理し、そして細胞をプレートし、そしてＴ−１６２フラスコ中にプレートし、そして大規模培養に移す。
【０２１１】
例４：
アデノウィルスベクターの構成のために、ヒトＺｃｙｔｏ２１のタンパク質コード領域を、それぞれ、５’及び３’末端でＰｍｅＩ及びＡｓｃＩ制限部位を付加するプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅する。増幅を、次の通りに、ＰＣＲ制限において十分な長さのＺｃｙｔｏ２１ｃＤＮＡ鋳型により行う：９５℃で５分（１サイクル）；続いて９５℃で１分、６１℃で１分及び７２℃で１．５分（１５サイクル）；続いて７２℃で７分；続いて４℃でのソーキング。ＰＣＲ反応生成物を、ＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍのトリス−酢酸塩、０．００１ＭのＥＤＴＡ）中、１．２％の低溶融−温度アガロースゲル上に負荷する。Ｚｃｙｔｏ２１ＰＣＲ生成物をゲルから切除し、そしてシリカゲル膜回転カラム（ＱＩＡＱｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット及びキット；Ｑｉａｇｌｎ，Ｉｎｃ．）を含んで成る市販のキットを用いて、そのキットの説明書に従って、精製する。
【０２１２】
次にＰＣＲ生成物を、ＰｍｅＩ及びＡｓｃＩにより消化し、フェノール／クロロホルム抽出し、ＥｔＯＨ沈殿し、そして２０ｍｌのＴＥ（トリス／ＥＤＴＡ，ＰＨ８）に再水和化する。次に、Ｚｃｙｔｏ２１フラグメントを、トランスジェニックベクターｐＴＧ１２−８のＰｍｅＩ−ＡｓｃＩ部位中の連結し、そしてエレクトロポレーションによりＥ．コリＤＨ１０Ｂ^ＴＭコンピテント細胞を形質転換する。ベクターｐＴＧ１２−８は、ＮｒｕＩ部位中へのラットインスリンＩＩイントロン（約２００ｂｐ）及びポリリンカー（ＦｓｅＩ／ＰｍｅＩ／ＡｓｃＩ）の挿入により、ｐ２９９９Ｂ４（Ｐａｌｏｍｉｔｅｒなど．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３：５２６６−５２７５，１９９３）から誘導された。
【０２１３】
前記ベクターは、マウスメタロチオネイン（ＭＴ−１）プロモーター（約７５０ｂｐ）、及びヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）未翻訳領域、１０ｋｂのＭＴ−１５’フランキング配列及び７ｋｂのＭＴ−１３’フランキング配列を両端に有するポリアデニル化シグナル（約６５０ｂｐ）を含んで成る。ｃＤＮＡを、インスリンＩＩとｈＧＨ配列との間に挿入する。Ｚｃｙｔｏ２１を含むクローンを、プラスミドＤＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐにより同定し、続いてＰｍｅＩ及びＡｓｅＩにより消化する。陽性クローンを配列決定し、構造体における欠失又は他の異常性が存在しなかったことを確かめる。
【０２１４】
ＤＮＡを市販のキット（ＭａｘｉＫｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて調製し、そしてＺｃｙｔｏ２１ｃＤＮＡを、ＰｍｅＩ及びＡｓｃＩ酵素を用いて、ｐＴＧ１２−８ベクターから開放する。ｃＤＮＡを、１％低溶解温度アガロースゲル上で単離し、そしてゲルから切除する。ゲルスライスを７０℃で融解し、そしてＤＮＡを等体積のトリス−緩衝されたフェノールにより２度、抽出し、ＥｔＯＨにより沈殿し、そして１０μｌの水に再懸濁する。
【０２１５】
Ｚｃｙｔｏ２１ｃＤＮＡを、修飾されたｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（Ｈｅ，Ｔ−Ｃ．など．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：２５０９−２５１４，１９９８）のＥｃｏＲＶ−ＡｓｃＩ部位中にクローン化する。この構造体は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を含む。ＧＦＰ発現由来のＣＭＶプロモーターを、ＳＶ４０プロモーターにより置換し、そしてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより置換する。さらに、生来のポリリンカーを、ＦｓｅＩ、ＥｃｏＲＶ及びＡｓｃＩ部位により置換する。ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶのこの修飾された形を、ｐＺｙＴｒａｃｋと命名する。連結を、市販のＤＮＡ連結及びスクリーニングキット（Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ（商標）キット；ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行う。Ｚｃｙｔｏ２１を含むクローンを、ＦｓｅＩ及びＡｓｃＩによるｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡの消化により同定する。
【０２１６】
プラスミドを線状化するために、約５μｇのその得られるｐＺｙＴｒａｃｋＺｃｙｔｏ２１プラスミドを、ＰｍｅＩにより消化する。約１μｇの線状化されたプラスミド及び２００ｎｇのスーパーコイルｐＡｄＥａｓｙ（Ｈｅなど．，前記）を用いて、Ｅ．コリＢＪ５１８３細胞（Ｈｅなど．，前記）を同じ形質転換する。同時形質転換は、２．５ｋＶ，２００オーム及び２５μＦａで、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを用いて行われる。完全な同時形質転換混合物を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む４ＬＢプレート上にプレートする。最少のコロニーを採取し、そしてＬＢ／カナマイシンにおいて拡張し、そして組換えアデノウィルスＤＮＡを、標準のＤＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐ方法により同定する。組換えアデノウィルスｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを用いて、Ｅ．コリＤＨ１０Ｂ^ＴＭコンピテント細胞を形質転換し、そしてＤＮＡを、Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、その説明書に従って調製する。
【０２１７】
約５μｇの組換えアデノウィルスＤＮＡを、２０〜３０ＵのＰａｃＩを含む反応体積１００μｌにおいて、３７℃で３時間、ＰａｃＩ酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）により消化する。消化されたＤＮＡを等体積のフェノール／クロロホルムにより２度、抽出し、そしてエタノールにより沈殿する。ＤＮＡペレットを、１０μｌの蒸留水に再懸濁する。その日までに接種され、そして６０〜７０％の集密性まで増殖されたＱＢＩ−２９３Ａ細胞（ＱｕａｎｔｕｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｃ．Ｃａｎａｄａ）のＴ２５フラスコを、ＰａｃＩ−消化されたＤＮＡによりトランスフェクトする。ＰａｃＩ−消化されたＤＮＡを、無菌のＨＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）により、合計５０μｌの体積まで希釈する。別の管において、２０μｌの１ｍｇ／ｍｌのＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウム塩（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、ＨＢＳにより、１００μｌの合計体積に希釈する。
【０２１８】
ＤＮＡをＤＯＴＡＰに添加し、ピペットを上下することによって軽く混合し、そして室温で１５分間、放置する。培地を２９３Ａ細胞から除去し、そして１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから得られた試薬）を含む、５ｍｌの血清フリーの最少必須培地（ＭＥＭ）αにより洗浄する。５ｍｌの血清フリーのＭＥＭを、２９３Ａ細胞に添加し、そして３７℃で維持する。ＤＮＡ／脂質混合物を、２９３Ａ細胞のＴ２５フラスコに滴下し、軽く混合し、そして３７℃で４時間インキュベートする。４時間後ＤＮＡ／脂肪混合物を含む培地を吸引し、そして５％ウシ胎児血清を含む完全ＭＥＭ５ｍｌにより交換する。トランスフェクトされた細胞を、ＧＦＰ発現、及び焦点の形成（ウィルスプラーク）についてモニターする。
【０２１９】
組換えアデノウィルスＤＮＡによる２９３Ａ細胞のトランスフェクションの７日後、細胞はＧＦＰタンパク質を発現し、そして焦点（ウィルス“プラーク”）を形成し始める。粗ウィルス溶解物を、細胞剥離機を用いて集め、２９３Ａ細胞のすべてを集める。その溶解物を５０ｍｌの円錐状管に移す。細胞からウィルス粒子のほとんどを開放するために、３回の凍結／融解サイクルを、ドライアイス／エタノール浴及び３７℃の水浴いおいて行う。
【０２２０】
粗溶解物を増幅し（一次増幅）、Ｚｃｙｔｏ２１ｒＡｄＶ溶解物の作業用“原液”を得る。ほぼ集密性（８０〜９０％）の２９３Ａ細胞の１０個の１０ｃｍのプレートを、前もって２０時間に設定し、２００ｍｌの粗ｒＡｄＶ溶解物を個々の１０ｃｍプレートに添加し、そして細胞を、白色光顕微鏡下でのＣＰＥ（細胞変性効果）、及び蛍光顕微鏡下でのＣＦＰの発現について、４８〜７２時間モニターする。２９３Ａ細胞のすべてがＣＰＥを示す場合、上記のようにして、この原液溶解物を集め、そして凍結／融解サイクルを行う。
【０２２１】
次に、Ｚｃｙｔｏ２１ｒＡｄＶの二次増幅を行う。２９３Ａ細胞の２０個の１５ｃｍの組織培養皿を、細胞が８０〜９０％の集密になるよう調製する。すべてではないが、しかし２０ｍｌの５％ＭＥＭ培地を除去し、そして個々の皿を、３００〜５００ｍｌの一次増幅されたｒＡｄＶ溶解物と共にインキュベートする。４８時間後、２９３Ａの細胞をウィルス生成から溶解し、溶解物を２５０ｍｌのポリプロピレン遠心分離ボトル中に集め、そしてｒＡｄＶを精製する。
【０２２２】
ＮＰ−４０界面活性剤を、すべての細胞を溶解するために、粗溶解物のボトルに添加し、０．５％の最終濃度にする。ボトルを、ボトルが落ちないようできるだけ早く、１０分間の撹拌のために、回転プラットフォーム上に配置する。残骸を、２０，０００ｘｇでの１５分間の遠心分離によりペレット化する。上清液を、２５０ｍｌのポリカーボネート遠心分離ボトルに移し、そして０．５体積の２０％ＰＥＧ８０００／２．５ＭのＮａＣｌ溶液を添加する。ボトルを氷上で一晩、振盪する。ボトルを、２０，０００ｘｇで１５分間、遠心分離し、そして上清液を漂白溶液に捨てる。
【０２２３】
無菌の細胞スクレーパを用いて、２つのボトルからのウィルス／ＰＥＧ沈殿物を、２．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。得られるウィルス溶液を、２ｍｌのマイクロ遠心分離管に入れ、そしてマイクロ遠心分離機において１４，０００ｘｇで１０分間、遠心分離し、いずれかの追加の細胞残骸を除去する。２ｍｌのマイクロ遠心分離管からの上清液を、１５ｍｌのポリプロピレンスナップ管中に移し、そしてＣｓＣｌにより１．３４ｇ／ｍｌの密度に調節する。溶液を、３．２ｍｌのポリカーボネート厚壁遠心分離管に移し、そして３４８，０００ｘｇで３〜４時間、２５μＣで回転する。ウィルスは白色バンドを形成する。広口ピペット先端を用いて、ウィルスバンドを集める。
【０２２４】
市販のイオン交換カラム（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５Ｍにより予備充填されたＰＤ−１０カラム；ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、ウィルス調製物を脱塩する。カラムを、２０ｍｌのＰＢＳにより平衡化する。ウィルスを充填し、そしてカラムを運転する。５ｍｌのＰＢＳをカラムに添加し、そして８〜１０滴の画分を集める。個々の画分の１：５０希釈溶液の光学密度を、分光計上で２６０ｎｍで決定する。ピーク画分をプールし、そして１：２５希釈溶液の光学密度（ＯＤ）を決定する。ＯＤを、次の式：（２６０ｎｍでのＯＤ）（２５）（１．１×１０^１２）＝ビリオン／ｍｌを用いて、ウィルス濃度に転換する。
【０２２５】
ウィルスを貯蔵するために、グリセロールを、精製されたウィルスに添加し、１５％の最終濃度にし、軽くではあるが、しかし効果的に混合し、そして−８０μＣでアリコートにおいて貯蔵する。
【０２２６】
ＱｕａｎｔｕｍＢｉｔｏｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ．Ｃａｎａｄａ）により開発されたプロトコールに従って、組換えウィルス感染性を測定する。手短には、２個の９６−ウェル組織培養プレートを、アッセイされるべき個々の組換えウィルスのための２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭにおいて、ウェル当たり１×１０^４個の２９３Ａ細胞により接種する。２４時間後、個々のウィルスの１０倍希釈（１×１０^−２〜１×１０^−４）を、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭにおいて行う。１００μｌの個々の希釈溶液を、個々の２０ウェルに配置する。３７℃での５日後、ウェルを、ＣＰＥについて正又は負のいずれかで読み取り、そして“プラーク形成単位／ｍｌ”（ＰＦＵ）についての値を計算する。
【０２２７】
例５：
Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、成熟した受精能雄（スタッド）（Ｂ６Ｃ３ｆ１、生後２〜８ヶ月（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ））、精管切除された雄（ダッド）（ＣＤ１、生後２〜８ヶ月（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍｓ））、成熟直前の受胎能雌（ドナー）（Ｂ６Ｃ３ｆ１、生後４〜５週（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍ））及び成熟した受胎能雌（受容体）（ＣＤ１、生後２〜４ヶ月、（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍ））を用いて生成する。
【０２２８】
ドナーを１週間、気候順化し、そしてマウス当たり約８ＩＵのＰｒｅｇｎａｎｔＭａｒｅ’ｓＳｅｒｕｍゴナドトロピン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＬ．Ｐ．注射し、そして４６〜４７時間後、マウス当たり８ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＦＳｉｇｍａ））をＩ．Ｐ．注射し、過排卵を誘発する。ドナーを、ホルモン注射に続いて、スタッドと交配する。排卵は一般的に、ｈＣＧ注射の１３時間以内に生じる。交接は、次の交配の朝、膣栓の存在により確かめられる。
【０２２９】
受精された卵を、手術用スコープ（ＬｅｉｃａＭＺ１２ＳｔｅｒｅｏＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｌｅｉｃａ，Ｗａｔｚｌａｒ，ＤＥ）下で集める。卵管を集め、そして卵を、ヒアルロニダーゼを含む尿検査スライド（Ｓｉｇｍａ）中に開放する。卵をヒアルロニダーゼにより１度、及び５％ＣＯ_２，５％Ｏ_２，及び９０％Ｎ_２と共に３７℃でインキュベートされたＷｈｉｔｔｅｎ’ｓＷ６４０培地（表４）により２度、洗浄する。次に、卵を、マイクロインジェクションまで、３７℃／５％ＣＯ_２インキュベーターに貯蔵する。
Ｚｃｙｔｏ２１遺伝子のｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ１０〜２０μｇを、線状化し、ゲル精製し、そして１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に、マイクロインジェクションのためのμｌ当たり５〜１０ｎｇの最終濃度で再懸濁する。
【０２３０】
プラスミドＤＮＡを、暖かなＣＯ_２−平衡化された鉱油により被覆された１滴のＷ６４０培地に含まれる収穫された卵中にマイクロインジェクトする。ＤＮＡを、注射針中に吸引し（０．７５ｍｍのＩＤ、１ｍｍのＯＤの硼珪酸塩ガラス細管から押出される）、そして個々の卵中に注入する。個々の卵の一倍体前核の１つ又は両者中に、注射針を注入する。
数ピコリッターのＤＮＡを、前核中に注入し、そして注射針を、核と接触しないで引き抜く。この工程を、すべての卵が注入されるまで反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、３７℃／５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいての一晩の貯蔵のために、ガス抜きされたＷ６４０培地を有する器官組織−培養皿中に移す。
【０２３１】
次の日、前日の注射からの１２〜１７個の健康な２−細胞胚を、受容体中に移す。拡大された膨大部を位置決定し、そしてその膨大部と嚢との間に卵管を保持し、卵管のニックを、その膨大部又は嚢を引き裂かないことを確かめて、嚢に接近して２８ｇの針により製造する。胚をこのニックを通して移植し、そして腹膜壁上に保持することによって、生殖器官を、腹腔中に戻す。
受容体対でケージに戻し、そして１９〜２１日間の妊娠を可能にする。分娩後１９〜２１日で離乳を行う。離乳した子供を性別に分離し、そして別々の性別ゲージに配置し、そして０．５ｃｍの生検（遺伝子型分類のために使用される）を、無菌のハサミにより尾から切り取る。
【０２３２】
ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＤｎｅａｓｙキットを用いて、その製造業者の説明書に従って、前記尾から切除された生検から調製する。ゲノムＤＮＡを、トランスジェニックベクターのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）３’側ＵＴＲ部分に対して企画されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより分析する。ヒト配列に対してユニークな領域を、ヒト及びマウス成長ホルモン３’側ＵＴＲＤＮＡ配列の一列整列から同定し、ＰＣＲ反応がマウス配列を増幅しないことを確かめる。ｈＧＨの３６８塩基対フラグメントを増幅するプライマー、及びベクター配列にハイブリダイズし、そしてｃＤＮＡ挿入体を増幅するプライマーを、しばしばｈＧＨプライマーと共に使用する。それらの実験においては、トランスジーンについての陽性の動物からのＤＮＡは、２種のバンド、すなわちｈＧＨ３’側ＵＴＲフラグメントに対応する３６８塩基対バンド、及びｃＤＮＡ挿入体に対応する種々のサイズのバンドを生成するであろう。
【０２３３】
動物がトランスジェニック（ＴＧ）であるものとして確かめられると、それらは、ＴＧ雌と野生型雄とを、又はＴＧ雄と１又は２匹の野生型雌とを配置することによって近交系中に戻し交雑され得る。子供が生まれ、そして離乳されると、性別に分離され、そしてそれらの尾から遺伝子型分類のために切除される。
個々のトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルの分析を、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）に基づいて、ＲＮＡ溶液にハイブリダイゼーションアッセイ、又は同じＰＣＲを用いて、製造業者の説明書に従って行う。
【０２３４】
【表５】

【０２３５】
例６：
１．インターフェロン−応答性プロモーターからの発現の刺激：
一連の実験においては、Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質を含むならし培地（ＣＭ）を、Ｚｃｙｔｏ２１のためのｃＤＮＡを含む組換えアデノウィルス（Ａｄｚｙ−Ｚｃｙｔｏ２１）により、２９３Ａ細胞を、細胞当たり４００粒子の感染の多重度で感染することによって生成する。ＣＭを、感染の４０時間の時点で収穫し、そして−２０℃で貯蔵する。ＣＭをまた、ｃＤＮＡを欠いている組換えアデノウィルス（ＡｄＺｙ−親）による感染から生成する。
【０２３６】
使用の前、ＣＭの一部を、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５（５，０００の呼称分子量限界）遠心分離フィルターにおいて１４倍に濃縮し、そして次に、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５（１００，０００の呼称分子量限界）遠心分離フィルターを通して濾過し、培地に存在するウィルス粒子の量を減じ、そして最終的に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０．２μｍ注射器フィルターを通して濾過し、ＣＭを減菌する。濃縮されたＣＭサンプルを、結合緩衝液において１：２に希釈し、そしてネズミ細胞系からの細胞と共に３７℃で５時間インキュベートする。
【０２３７】
２．Ｚｃｙｔｏ２１の抗−ウィルス活性：
もう１つの一連の実験は、Ｚｃｙｔｏ２１の抗−ウィルス活性を試験する。それらの研究においては、抗−ウィルスアッセイを、ウェル当たり５０，０００個の細胞での９６−ウェル型において、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含む増殖培地ＲＰＭＩ培地１６４０に、Ｌ９２９細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−１）をプレートすることによって行う。上記のようにして、ＡｄＺｙ−Ｚｃｙｔｏ２１ｍ又はＡｄｚｙ−親のいずれかにより感染された２９３Ａ細胞からのアデノウィルスＣＭを、細胞と共に一晩インキュベートする。
【０２３８】
アッセイにおける正の対照を、１００ｎｇ／ｍｌで開始して、１：１０に連続して希釈されたネズミインターフェロン−αにより提供する。増殖培地のみによるＬ９２９細胞は、負の対照を提供する。処理された細胞を、２４時間インキュベートする。培地を捨て、新鮮な培地を添加し、そして脳脊髄炎ウィルス（ＡＴＣＣＮｏ．ｖｒ１２９ｂ）を、０．１の感染の多重度で導入する（すなわち、１０個のＬ９２９細胞に対して１つのウィルス粒子）。細胞を、ウィルスの存在下で２４時間インキュベートし、そして次に、ウェルを％細胞障害効果（ＣＰＥ）について評点を付ける。
【０２３９】
３．ＢＡＦ３細胞系を用いての抗増殖アッセイ：
ＢａＦ３を用いて、Ｚｃｙｔｏ２１が抗−増殖性質を有するかどうかを決定する。子供ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、Ｚｃｙｔｏ２１ｃＤＮＡ、又はＺα３０と呼ばれる無関係のｃＤＮＡの上流にＣＭＶプロモーター及びイントロンＡを含む発現ベクターにより、ＢＲＬリポフェクタミンを用いて安定してトランスフェクトする。安定してトランスフェクトされた細胞を、細胞工場において血清フリー培地に接種し、そしてならし培地が収穫される前、３日間、増殖し、そして５Ｋフィルターにより１０倍に濃縮する。濃縮されたならし培地サンプルを４℃で貯蔵する。
【０２４０】
次のアッセイを用いて、ＢａＦ３の抗−増殖について試験する。９６ウェルプレートにおいて、８個の１：２希釈溶液を、増殖培地のみ（ＲＰＭＩ１６４０，１０％ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン）、又はネズミＩＬ−３（増殖培地において５０ｐｇ／ｍｌで開始する）から製造する（１００μｌの最終体積）。５０μｌの次のものを、増殖培地のみ又はｍＩＬ−３希釈レーンに添加する：ヒトインターフェロンα（増殖培地に希釈された、１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ又は１ｎｇ／ｍｌ）、ヒトインターフェロンβ（増殖培地に希釈された、１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ又は１ｎｇ／ｍｌ）、ネズミインターフェロン−α（増殖培地に希釈された、１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ又は１ｎｇ／ｍｌ）、ネズミインターフェロン−β（増殖培地に希釈された、１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ又は１ｎｇ／ｍｌ）、Ｚｃｙｔｏ２１（２．５×、０．５×又は０．１×で）、及びネズミＺα３０（２．５×、０．５×又は０．１×で）。
【０２４１】
ＢａＦ３細胞系を、増殖培地により３度、洗浄し、ペレットを増殖培地に再懸濁し、細胞を計数し、そして増殖培地に希釈し、５，０００個の細胞／５０μｌにする。次に、５０μｌの希釈された細胞を、サンプルの個々の溶液に添加する。アッセイプレートを、３７℃のインキュベーターにおいて３〜４日間インキュベートする。次に、２０μｌのＡｌｏｍａｒブルーを個々のウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で一晩インキュベートする。プレートを蛍光プレートリーダ上で、５４４の励起波長及び５９０の発光波長で読み取る。
【０２４２】
例７：
ＰＣＲを用いての組織パネルにおけるヒトＺｃｙｔｏ２１の組織分布：
ヒト組織からのｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いて、Ｚｃｙｔｏ２１発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ヒト組織からの７７種のマラソンｃＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルを包含し、そして細胞系は下記表６に示される。前記ｃＤＮＡサンプルは、自家ライブラリーからであり、自家調製されたＲＮＡのマラソンｃＤＮＡからであり、又はＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からである。マウスマラソンｃＤＮＡは、ＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造さた。
【０２４３】
パネルサンプルの性質を評価するために、品質管理（ＱＣ）についての次の３種の試験を行った：（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ品質を評価するために、自家ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーについてのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴによるＰＣＲにより、平均挿入体について試験し；（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨｃＤＮＡを増幅するために、標準のＰＣＲ方法を用いて達成し；そして（３）サンプルを、可能なリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。
【０２４４】
パネルを、ヒトゲノムのＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）陽性対照サンプルを含む９６−ウェル形式において組みたてた。個々のウェルは約０．２〜１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。第１のＰＣＲ反応を、オリゴＺＣ３９，２７０（配列番号１４）及びＺＣ３９，２７２（配列番号１５）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＲａｄｉｌｏａｄ色素（ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて組みたてた。増幅を次の通りに行った：９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で１０秒（３５サイクル）；６７℃で４５秒及び最終的に７２℃での５分間の延長。
【０２４５】
正しいＤＮＡフラグメントサイズを、脳、ランゲルハンス島、前立腺、精巣、下垂体、胎盤、卵巣腫瘍、肺腫瘍、ＣＤ３＋及びＨＰＶＳにおいて観察した。もう１つのＰＣＲ反応を、オリゴＺＣ３９，２７０（配列番号１４）及びＺＣ３９，２７１（配列番号１６）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＲａｄｉｌｏａｄ色素（ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて組みたてた。増幅を次の通りに行った：９４℃で１分（１サイクル）；９４℃で１０秒（３５サイクル）；６５℃で３０秒、７２℃で３０秒及び最終的に７２℃での３分間の延長。正しいＤＮＡフラグメントサイズを、下垂体、直腸腫瘍及び卵巣腫瘍において観察した。
【０２４６】
【表６】

　前述から、本発明の特定の態様が例示の目的のために本明細書において記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図は、配列番号２に示されるＺｃｙｔｏ２１タンパク質配列のＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄ親水性プロフィールである。このプロフィールは、スライドする６残基窓に基づかれる。隠されたＧ，Ｓ及びＴ残基及び暴露されたＨ，Ｙ及びＷ残基は無視された。それらの残基は、小文字により図に示される。

Claims

配列番号２のアミノ酸残基２０〜２００から成る第１アミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
前記ポリペプチドがさらに、前記第１アミノ酸配列に対してアミノ−末端位置に存在するシグナル分泌配列を含んで成り、ここで前記シグナル分泌配列は配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９を含んで成る請求項１記載の単離されたポリペプチド。
配列番号２のアミノ酸残基２０〜２００、又は配列番号２のアミノ酸残基１〜２００のいずれかに対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと特異的に結合する抗体と特異的に結合する単離されたポリペプチド。
（ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、又は（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５８〜６０３のヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド５８〜６０３のヌクレオチド配列の補体から成る核酸分子に対して、緊縮洗浄条件に続いてハイブリダイズされたまま存続する核酸分子のいずれかである、インターフェロンポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
前記核酸分子によりコードされるアミノ酸配列と配列番号２のその対応するアミノ酸配列との間のいずれかの差異が、保存性アミノ酸置換のためである請求項４記載の単離された核酸分子。
配列番号１のヌクレオチド５８〜６０３のヌクレオチド配列を含んで成る請求項４記載の単離された核酸分子。
配列番号１のヌクレオチド１〜６０３のヌクレオチド配列を含んで成る請求項４記載の単離された核酸分子。
請求項４記載の単離された核酸分子を含んで成るベクター。
請求項４記載の単離された核酸分子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターであって、前記プロモーターが前記核酸分子により操作可能的に連結され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターにより操作可能的に連結されることを特徴とする発現ベクター。
細菌、酵母細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択される、請求項９記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞。
Ｚｃｙｔｏ２１タンパク質の生成方法であって、請求項９記載の発現ベクターを含んで成り、そしてＺｃｙｔｏ２１タンパク質を生成する組換え宿主細胞を培養する段階を含んで成る方法。
前記培養された組換え宿主細胞からＺｃｙｔｏ２１タンパク質を単離する段階をさらに含んで成る請求項１１記載の方法。
請求項１記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント。
生物学的サンプルにおけるＺｃｙｔｏ２１遺伝子発現の存在を検出するための方法であって、
（ａ）Ｚｃｙｔｏ２１核酸プローブと、（ｉ）前記生物学的サンプルから単離された試験ＲＮＡ分子、又は（ｉｉ）単離されたＲＮＡ分子から合成された核酸分子とを、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ、ここで前記プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列の一部を含んで成るヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の補体から成り、そして
（ｂ）前記核酸プローブ、及び前記試験ＲＮＡ分子又は前記合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出し、
ここで前記ハイブリッドの存在が前記生物学的サンプルにおけるＺｃｙｔｏ２１ＲＮＡの存在を示し、又は
（ａ’）前記生物学的サンプルと、請求項１３記載の抗体又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触が前記生物学的サンプルへの前記抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われ、そして
（ｂ’）前記結合された抗体又は結合された抗体フラグメントのいずれかを検出する段階を含んで成る方法。