JP4350950B2 - サイトカインタンパク質のファミリー - Google Patents
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Description
“親和性標識”とは、第2ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第2ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンS トランスフェラーゼ(Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988), Glu-Glu親和性標識 (Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), 物質P、すなわちFlagTM ペプチド(Hoppなど., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988)、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商品供給者(例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; Eastman Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA)から入手できる。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、1又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して)を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする(すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAspをコードする)。
“作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
“パラ体(paralogs)”とは、生物によって製造される、異なっているが,しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれる。
zcyto21遺伝子は、配列番号5に示されるような200個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。zcyto21についてのシグナル配列は、配列番号5のアミノ酸残基1(Met)〜アミノ酸残基19(Ala)を含んで成るものとして推定され得る。zcyto21についての成熟ペプチドは、アミノ酸残基20(Gly)で開始する。zcyto21は、PCT出願WO02/02627号に記載されている。
zcyto24遺伝子は、配列番号9に示されるような202個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。zcyto24分泌シグナル配列は、配列番号9のアミノ酸残基1(Met)〜アミノ酸残基28(Ala)を含んで成る。分泌シグナル配列の分解についての他の部位は、アミノ酸残基20(Thr)で見出され得る。成熟ペプチドは、アミノ酸残基29(Asp)〜アミノ酸残基202(Val)を含んで成る。
zcyto20, zcyto21及びzcyto22遺伝子は、ヒト染色19q13.13にマッピングされている。それらの遺伝子の発現に基づけば、染色体19のこの領域は、インターフェロン−様遺伝子群を含んで成るものとして同定されている。これが新規ファミリーである。さらなる表示は、マウス染色体7上のシンテニック遺伝子群、すなわちzcyto24(配列番号8)及びzcyto25(配列番号10)の同定である。
例えば、Delague., (Am. J. Hum. Genet. 67: 236-243, 2000)は、Charcot-Marie-Tooth病が19q13.1-13.3に位置することを同定した(Delagueなど., Am. J. Hum. Genet. 67: 236-243, 2000)。
変異体zcyto20, zcyto21, 及びzcyto22ポリペプチド及び実質的に類似する配列同一性は、1又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換(表5を参照のこと)及びタンパク質及びポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換;小さな欠失、典型的には1〜約30個のアミノ酸の欠失;及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。
zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25ポリペプチドは、単独で、又は他の脈管形成剤、例えばVEGFと組合して投与され得る。追加の剤と組合してzcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25を用いる場合、それらの2種の化合物は、処理される特定の条件のために適切なように、同時に又は連続的に投与され得る。
もう1つの観点においては、本発明は、アミノ酸残基22〜アミノ酸残基205の配列番号2に示されるようなアミノ酸配列、又はアミノ酸残基1〜アミノ酸残基205の配列番号2に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチを包含する。
もう1つの観点においては、本発明は、アミノ酸残基29〜アミノ酸残基202の配列番号9に示されるようなアミノ酸配列、又はアミノ酸残基1〜アミノ酸残基202の配列番号9に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを包含する。
もう1つの観点においては、本発明は、アミノ酸残基29〜アミノ酸残基202の配列番号11に示されるようなアミノ酸配列、又はアミノ酸残基1〜アミノ酸残基202の配列番号11に示されるようなアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドを包含する。
もう1つの観点においては、本発明は、アミノ酸残基22〜アミノ酸残基205の配列番号7に示されるような、又はアミノ酸残基1〜アミノ酸残基205の配列番号7に示されるような少なくとも14個の連続したアミノ酸である、哺乳類において抗原性応答を刺激する単離されたポリペプチドを包含する。
本発明は、医薬的に許容できるビークルにおける本明細書に記載されるポリペプチドを含んで成る医薬組成物を包含する。
本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を包含する。
もう1つの態様においては、本発明は、ヌクレオチド64〜ヌクレオチド618の配列番号6に示されるようなヌクレオチド配列、又はヌクレオチド1〜ヌクレオチド618の配列番号6に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチドを包含する。
もう1つの態様においては、本発明は、ヌクレオチド67〜ヌクレオチド606の配列番号10に示されるようなヌクレオチド配列、又はヌクレオチド1〜ヌクレオチド606の配列番号10に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチドを包含する。
本発明は、本明細書に記載される発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞を提供し、ここで前記宿主細胞が、細菌、酵母細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択される。
本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを提供する。
本発明は、次の例により一層容易に理解されるが、但しそれらの例は本発明を制限するものではない。
zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを、相同組換えにより構成することができる。cDNAのフラグメント、例えばzcyto20 cDNAを、zcyto20挿入点を両端に有するベクター配列に対応する5’及び3’末端でのフランキング領域を有する配列番号1のポリヌクレオチドを用いて、PCRにより単離する。プライマーZC40923及びZC40927は、それぞれ配列番号12及び13で染めされる。
PCR反応混合物を、1%アガ−ロスゲル上で展開し、そして挿入体のサイズに対応するバンドを、QIAquickTM Gel Extractionn Kit( Qiagenn, Valencia, CA )を用いてゲル抽出する。
zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25を含むプラスミドは、ヌクレオチド−特異的プライマーを用いて、同様にして調製される。
CHO DG44細胞(Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-666, 1986)を、10cmの組織培養皿にプレートし、そしてHam’s F12/FBS培地(Ham’sF12培地(Life Technologies)、5%ウシ胎児血清(Hyclone,Logan, UT)、1%のL−グルタミン(JRH Biosciences, Lenexa, KS)、1%のピルビン酸ナトリウム(Life Technologies))において、37℃で5%CO2下で、一晩、約50%〜70%の集密性まで増殖する。次に、細胞を、血清フリー(SF)培地配合物(Ham’s f12, 10mg/mlのトランスフェリン、5mg/mlのインスリン、2mg/mlのフェチュイン、1%のL−グルタミン及び1%のピルビン酸ナトリウム)における、膜濾過された水中ポリカチオン脂質2,3−ジオレイルオキシ−N−[2−(スペルミンカルボキサミド)エチル]−N, N−ジメチル−1−プロパニミニウム−トリフルオロアセテート及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(LipofectamineTM Reagent, Life Technologies)の3:1(w/w)リポソーム配合物を用いて、リポソーム−介在性トランスフェクションにより、zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25、すなわちzcyto20を含むプラスミドにより形質転換する。
十分な長さのzcyto24及びzcyto25タンパク質を、BHK細胞において生成する。例えば、BHK細胞はzcyto24-CEE/pZMP21又はzcyto25-CEE/pZMP21(例1)によりトランスフェクトされた。BHK570細胞(ATCC CRL-10314)を、T75組織培養皿にプレートし、そして増殖培地(SL7V4、5%ウシ胎児血清(Hyclone, Logan, UT)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)において、37℃で一晩、5%CO2下で、約50〜70%の集密性まで増殖する。次に、細胞を、血清フリー(SF)培地において、リポソーム−介在性トランスフェクション(LipofectamineTM;Life Technologiesを用いて)に従って、zcyto24-CEE/pZMP21又はzcyto25-CEE/pZMP21によりトランスフェクトする。プラスミドを15mlの管においてSF培地に希釈し、640μlの合計最終体積にする。
アデノウィルスベクターの構成のために、zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25のタンパク質コード領域を、それぞれ、5’及び3’末端でPmeI及びAscI制限部位を付加するプライマーを用いて、PCRにより増幅する。増幅を、次の通りに、PCR反応において十分な長さのcDNA鋳型により行う:95℃で5分(1サイクル);続いて95℃で1分、61℃で1分及び72℃で1.5分(15サイクル);続いて72℃で7分;続いて4℃でのソーキング。PCR反応生成物を、TAE緩衝液(0.04Mのトリス−酢酸塩、0.001MのEDTA)中、1.2%の低溶融−温度アガロースゲル上に負荷する。
A:zcyto20及びzcyto22:
予測されるコード配列内においてzcyto20及びzcyto22の両者に共通するPCRプライマーを企画した。それらを、ZC39339(配列番号47)及びZC39393(配列番号48)と命名する。PCRを、異なった組織からの一連のヒトcDNAライブラリーに対して行なった。生成物は、脳、ランゲルハンス島(膵臓)、前立腺、精巣、HPVS(前立腺上皮)及びCD3+ライブラリーにおいて観察された。次に、PCRプライマーを、開始メチオニンの5’側及びzcyto20(zcyto22に対して高い類似性を有する)のための終結コドンの3’側のゲノム配列から企画した。
推定されるコード配列内におけるzcyto24及びzcyto25の両者に対して共通するPCRプライマーを企画した。それらは、ZC39687(配列番号53)及びZC39741(配列番号54)と命名される。PCRを、異なった組織からの一連のマウスcDNAライブラリーに対して行なった。生成物は次のライブラリーにおいて観察された:心臓、肺、膵臓、Torrres前立腺、皮膚、小腸、精巣及び胸腺。次に、PCRプライマーを、出発メチオニンの5’側及び終結コドンで企画した。
A:zcyto20の発現のための構造体:
発現ベクターpzBV37L:zCyto20を、昆虫細胞においてzcyto20ポリペプチドを発現するための調製した。zcyto20の配列及びそれぞれ、5’及び3’末端上のコードされたBspE1及びXba1制限部位を含む536bpのフラグメントを、Expand High Fidelity PCR System(Boerhinger Mannheim)を用いて、その製造業者の説明書に従って、プライマーZC41932(配列番号14)及びZC41933(配列番号15)を用いて、プラスミドzcyto20からPCR増幅のためにより生成した。
発現ベクターpZBV32L:zCyto20ceeを、昆虫細胞においてzcyto20ceeポリペプチドを発現するために調製した。pZBV32L:zCyto20ceeを、C−末端GLU−GLU標識(配列番号16)を有するzcyto20ポリペプチドを発現するために企画した。この構造体を用いて、シグナルペプチドが切断された後、zcyto20のN−末端アミノ酸配列を決定した。
それぞれ5’及び3’末端上にBamHI及びXbaI制限部位を含む、625bpのzcyto20フラグメントを、次のプライマーを用いて、zcyto20 cDNAを含むプラスミドからのPCR増幅により生成した:zc40240及びzc40241(それぞれ、配列番号17及び配列番号18)。PCR反応条件は、10%DMSOを含む100μlの体積の反応について、Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) を用いて、次の通りであった:94℃で4分(1サイクル);94℃で30秒、50℃で30秒、及び72℃で65秒(30サイクル);72℃で4分(1サイクル);続いて、4℃でのソーキング。
Sf9細胞を、6−ウェルプレートに、1×106個の細胞/ウェルで接触し、そして27℃で1時間、付着せしめた。約5μgのbacmid DNAを、100μlのSf−900II SFM (Life Technologies) により希釈した。20μlのLIPOFECTAMINE試薬(Life Technologies)を、100μlのSf−900II SFMにより希釈した。bacmid DNA及び脂質溶液を軽く混合し、そして室温で45分間インキュベートした。800μlのSf−900II SFMを、前記脂質−DNA混合物に添加した。培地をウェルから吸引し、そして1mlのDNA−脂質混合物を細胞に添加した。細胞を27℃で一晩インキュベートした。DNA−脂肪混合物を個々のウエルから吸引し、そして2mlのSf−900II培地により置換した。プレートを、27℃、90%湿度で、約7日間インキュベートし、そしてウィルスを収穫した。
Sf9細胞を、2mlのSF−900IIを含む6−ウェルプレートに、1×106個の細胞/ウェルで接種した。トランスフェクションプレートからの500μlのウィルスを、ウェルにプレートし、そしてプレートを、27℃、90%湿度で96時間インキュベートし、この後、ウィルスを、収穫した(一次増幅)。
第2回目の増幅を、一次増幅プレートからのウィルス100μlを1×106個の細胞/ウェルを含むウェルにプレートに移すことによって行なった。プレートを、収穫の前,96時間インキュベートした。
このウィルス原液を、増殖阻害曲線により滴定し、そして1のMOIを示す滴定培養物を合計48時間、進行せしめる。上清液を、Glu-Glu標識に対して特異的な一次モノクローナル抗体、続いてHRP接合されたヤギ抗体−ネズミ二次抗体を用いて、還元ウェスターンにより分析した。結果は、約20kDaのバンドを示した。上清液をまた、活性分析のために使用することができる。
大規模感染を完結し、下流の精製のための材料を供給することができる。
同様に、zcyti21及びzcyti22を、バキュロウィルスにおいて発現した。
組換えタンパク質を、本明細書に記載されるタンパク質のいずれかのために製造する。
A.zcyto20の精製:
組換えカルボキシル末端Glu−Glu標識されたzcyto20を、組換えバキュロウィルス感染された昆虫細胞、又は安定しているか又は過渡的なBHK細胞系のいずれかから生成した。培養物を収穫し、そして培地を、0.2μmのフィルターを用いて無菌濾過した。
組換えzcyto20タンパク質を、銀染色方法(Fast Silver, Geno Technology, Inc., St. Louis, MO)及び抗−EE抗体を用いてのウェスターンブロットと共に、SDS−PAGE(Nupage 4-12% Bis-Tris, Invitrogen, Calsbad, CA)により分析した。ならし培地又は精製されたタンパク質のいずれかを、Xcell IITM MINL-CELL (Invitrogen, Calsbad, CA) を用いて電気泳動し、そしてXcell IITM ブロットモジュール(Invitorogen)を用いて、室温で撹拌しながらニトロセルロース(0.2μm;Bio−Rad Laboratories, Hercules, CA)に、その装置マニュアルに提供される説明書に従って移行した。
BV培地からの精製されたzcyto20−CEEタンパク質は、4〜12%のBis−Trisゲル上で21kDaのモノマーとして移動し、そしてマイナーな36kDaのダイマーバンドもまた観察された。ダイマータンパク質は、還元剤を用いての還元に基づいてモノマーバンドになり、このことは、ジスルフィド結合によるzcyto21-CEEの二量体化を示唆し、そしてそれは鎖間ジスルフィド結合をもたらす奇数(合計7)のシステイン残基と一致する。
zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25ポリペプチドを、類似する態様で精製した。
特徴づけられたIFN−α、IFN−β、IFN−γプロモーターの局部配列一列整列、及びzcyto20, zcyto21及びzcyto24の上流領域と他の多くのサイトカインとのそれらの一列整列が、それらの遺伝子が同時調節されるかどうかを決定するために行なわれた。遺伝子調節の通常の性質が遺伝子の上流の領域の配列類似性において影響される仮説が存在した。
既知サイトカインのグループと領域2との一列整列は、Knappeなど. (J. Virol. 74: 3881-3887, 2000) に与えられるように、AK155の転写開始部位に関して、位置−415でのAK155プロモーターにおける適合性を生成した。zcyto20プロモーターにおけるその位置に推定のNF-κB結合部位が存在する事実は、AK155プロモーターにおけるNF−κBの可能性ある存在を示す。
Zcyto21遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、成熟した受精能雄(スタッド)(B6C3f1、生後2〜8ヶ月(Taconic Farms, Germantown, NY))、精管切除された雄(ダッド)(CD1、生後2〜8ヶ月(Taconic Farms))、成熟直前の受胎能雌(ドナー)(B6C3f1、生後4〜5週(Taconic Farm))及び成熟した受胎能雌(受容体)(CD1、生後2〜4ヶ月、(Taconic Farm))を用いて生成する。
Zcyto21遺伝子のcDNAを含むプラスミドDNA10〜20μgを、線状化し、ゲル精製し、そして10mMのトリス(pH7.4)、0.25mMのEDTA(pH8.0)に、マイクロインジェクションのためのμl当たり5〜10ngの最終濃度で再懸濁する。
数ピコリッターのDNAを、前核中に注入し、そして注射針を、核と接触しないで引き抜く。この工程を、すべての卵が注入されるまで反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、37℃/5%CO2のインキュベーターにおいての一晩の貯蔵のために、ガス抜きされたW640培地を有する器官組織−培養皿中に移す。
受容体対でケージに戻し、そして19〜21日間の妊娠を可能にする。Zcyto21 cDNAにより注射された動物は、誕生の前、死亡した。
A:zcytor19ポリクローナル抗体:
ポリクローナル抗体を、精製された組換えタンパク質huzcytor19/MBP-6Hにより2匹の雌New Zealand 白ウサギを免疫化することにより調製する。ウサギは、完全フロイントアジュバント中、200μgの精製されたタンパク質の初期腹腔内(ip)注射、続いて、不完全フロイントアジュバント中、100μgのペプチドの追加の免疫化ip注射を3週ごとに与えられる。第2回目の追加免疫注射(合計3回の注射)の投与の7〜10日後、動物を放血し、そして血清を集める。次に、動物を追加免疫化し、そして3週ごとに放血する。
ポリクローナル抗体を、精製された組換えタンパク質zcyto20/MBP-6H, zcyto21/MBP-6H及びzcyto22/MBP-6H, 並びにマウスzcyto24/MBP-6H又はzcyto25/MBP-6Hにより雌のNew Zealand白ウサギを免疫化することにより調製する。ウサギは、完全フロイントアジュバント中、200μgの精製されたタンパク質の初期腹腔内(ip)注射、続いて、不完全フロイントアジュバント中、100μgのペプチドの追加の免疫化ip注射を3週ごとに与えられる。第2回目の追加免疫注射(合計3回の注射)の投与の7〜10日後、動物を放血し、そして血清を集める。次に、動物を追加免疫化し、そして3週ごとに放血する。
A:種々の細胞型:
一次細胞(正常ヒト気管支上皮細胞、正常ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞及びヒト平滑筋細胞;CLONETICS Corporation; Walkersville, MD) 及びヒト絨毛癌細胞系(Jar, BeWo, 及び3A-Sub E細胞;ATCC, Manassas, VA)の培養物を、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸(ポリI:C、100μg/ml)(SIGMA;St. Louis, MO)の存在下で又は培地のみにおいて増殖した。4時間インキュベーションの後、全RNAを細胞から単離し、そしてRNアーゼ−フリーのDNアーゼにより処理した。
全末梢血液単核細胞を、Ficoll Hypagueを用いて、ヒト血液から単離した。T細胞を、VarioMacs陽性選択カラムにより、製造業者の説明書(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) に従って、末梢血液単核細胞から精製した。個々の集団からのサンプルを、染色し、そして蛍光抗体細胞分類(FACS)(Bectin Dickinson, San Jose, CA)により分析し、%富化率を決定した。CD3+T−細胞を、約95%精製した。全末梢血液白血球又はCD3+T細胞を、ポリI:C(100μg/ml)の存在下で又は培地のみにおいて増殖した。
zcyto22 mRNAを、ポリI:Cにより刺激された全末梢血液単核細胞及びCD3+T細胞において検出した。その結果は、zcyto22 mRNA合成が、CD3+T細胞を包含する末梢血液単核細胞において既知インターフェロンインジューサー、ポリI:Cにより刺激されることを示す。
それらの結果は、zeyto24及びzcyto25、並びに他のファミリーメンバーに対するポリI:Cの効果を示す。
一次ヒト免疫細胞集団及びヒト免疫細胞系からのRNAのパネルを、TRT−PCRを用いて、zcyto20, zcyto21及びzcyto22発現についてスクリーンした。パネルは、実験室において製造され、そして下記に記載されるように、16種の種々の休止及び活性化された細胞からのRNAを含んだ。すべての一次免疫細胞集団を、いくつかの匿名のドナーの血液から単離した。次に、種々の免疫細胞サブセット(CD3+、CD14+、CD19+及びCD56+)を、ラベルされた微小ビーズ及びMiltenyi BiotecからのMagnetic Cell Separation Systemを用いて単離した。RNAを、Rneasy MidiprepTM Kit (Qiagen, Valencia, CA) を用いて、その製造業者の説明書に従って調製した。CD56+ NK細胞RNAを、それらの休止状態における細胞から単離した。
抗ウィルス活性についての初期機能的アッセイを、一次的にトランスフェクトされたヒト胚腎臓(HEK)細胞からのならし培地を用いて行なった。このならし培地の生成は、次の通りに記載される。zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24又はzcyto25のための十分な長さのcDNAを、標準方法を用いて、pzp7Zベクター中にクローン化した。zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24又はzcyto25構造体を、293HEK細胞中にトランスフェクトした。手短には、個々の構造体に関しては、700,000細胞/ウェル(6ウェルプレート)を、約18時間プレートし、その後、2mlのDMEM−10%ウシ胎児血清においてトランスフェクトした。
バキュロウィルス由来のならし培地を用いての抗ウィルスアッセイの結果は、293により一時的に感染されたならし培地を用いてのその効果に類似した。表11は、zcyto21を含むバキュロウィルス由来のならし培地が用量依存性態様で、HeLa細胞におけるウィルス感染を阻害したが、ところが対照のならし培地は細胞障害効果の出現を阻止するのに失敗したことを示す。
追加の抗ウィルスアッセイを、ヒト頸部癌(HeLa)を用いて行なった。第1日目、抗−hu−IFN−受容体MAb(Research Diagnostics Inc.)及びイソタイプ−適合された負の対照MAbを、96−ウェル平底マイクロタイタープレートに希釈した。zcyto20, zcyto21又はzcyto22を発現するバキュロウィルスにより感染されたSf9細胞からのならし培地を添加し、0.0625× CMの最終濃度を得、そしてウェル当たり50,000のHeLa細胞をプレートした。
BaF3を用いて、Zcyto20が抗−増殖性質を有するかどうかを決定する。子供ハムスター腎臓(BHK)細胞を、Zcyto20 cDNA、又はZα30と呼ばれる無関係のcDNAの上流にCMVプロモーター及びイントロンAを含む発現ベクターにより、BRLリポフェクタミンを用いて安定してトランスフェクトする。安定してトランスフェクトされた細胞を、細胞工場において血清フリー培地に接種し、そしてならし培地が収穫される前、3日間、増殖し、そして5Kフィルターにより10倍に濃縮する。濃縮されたならし培地サンプルを4℃で貯蔵する。
1型インターフェロンとそれらの特異的な受容体との相互作用は、それらの抗ウィルス/抗増殖活性を担当する多くの遺伝子の誘発を導く。それらは、2’−5’オリゴアデニル酸シンセターゼ(2−5Aシンセターゼ)、二本鎖RNA依存性Pkrキナーゼ(Pkr)、リン脂質スクランブラーゼ及び細胞間付着分子−1(ICAM−1)を包含する。まだ未知である機能を有する遺伝子、例えば56kDaのインターフェロン刺激された遺伝子生成物(ISG−56k)の誘発がまた存在する。それらの遺伝子のいくつか又はすべてがzcyto20による細胞の処理に基づいて誘発されるかどうかを決定するために、ヒトDaudi Bリンパ様細胞を、zcyto20を発現するバキュロウィルスにより感染されたSf9細胞からのならし培地により72時間、処理した。
ビオチニル化されたzcyto21を、既知又は孤児サイトカイン受容体への結合について試験した。サイトカイン受容体(ヒトIFNαR1, IFNβR2, IFNβ2, IL−10R, CRF2-4, ZcytoR7, DIRS1, Zcytor19及び組織因子)のcDNAを含むpZP7発現ベクターを、COS細胞中にトランスフェクトし、そしてトランスフェクトされたCOS細胞へのビオチニル化されたzcyto20の結合を、下記に記載される分泌トラップアッセイを用いて行なった。このアッセイにおける陽性結合は、受容体−リガンド対を示す。
COS細胞トランスフェクションを次の通りに行なった:COS細胞を、フィブロネクチン被覆された、12−ウェル組織培養プレート(Becton Dickinson, Bedford, MA)上にプレートし(1×105個の細胞/ウェル)、そして37℃で一晩インキュベートした。サイトカイン受容体DNA(0.75μg)を、50μlの血清フリーDMEM培地(500mlのDMEM中、55mgのピルビン酸ナトリウム、146mgのL−グルタミン、5mgのトランスフェリン、2.5mgのインスリン、1μgのセレニウム及び5mgのフェツュイン)と共に混合し、次に、45μlの血清フリーDMEM培地中、5μlのLipofectamineTM (Invitrogen, Carlsbad, CA) と共に混合し、そして室温で30分間インキュベートした。
分泌トラップを次の通りに行なった:培地を吸引し、そして細胞をPBS中、1%BSAにより2度、すすいだ。細胞を、水中、TNB(0.1Mのトリス−HCl、0.15MのNaCl及び0.5%のBlocking Reagent (NEN Renaissance TSA-Direct Kit, NEN Life Science Products, Boston, MA))により1時間、阻止した。細胞を、TNB中、3μg/mlのビオチニル化されたzcyto21タンパク質(例27)と共に1時間インキュベートした。次に、細胞を、PBS中、1%BSAにより3度、洗浄し、そしてTNB中、1:300に希釈されたStreptavidin−HRP(NENキット)と共にさらに1時間インキュベートした。再び細胞を、PBS中、1%BSAにより3度、洗浄し、そして次に、PBS中、1.8%ホルムアルデヒドにより15分間、固定した。次に、細胞を、TNT(水中、0.1Mのトリス−HCl, 0.15MのNaCl及び0.05%のTween−20)により3度、洗浄した。
さらなる実験は、ビオチニル化されたzcyto21によるヒト及びマウスZcytor19間の陽性結合を示した。陽性結合はまた、ヒトzcytor19 cDNAによりトランスフェクトされ、そしてビオチニル化されたzcyto20及びzcyto24と共にインキュベートされた細胞上に検出された。
シグナルトランスダクションレオーターアッセイを用いて、zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25とzcytor19との機能的相互作用を決定した。ヒト胚腎臓(HEK)細胞を、クラスIIサイトカイン受容体(ヒトDIRS1, IFNαRI, IFNαRZ及びZcytor19(配列番号23及び26)を包含する)のためのcDNAを含むpZP7発現ベクターの存在又は不在下でルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を駆動する、インターフェロン−刺激された応答要素(ISRE)を含むレポータープラスミドによりトランスフェクトした。クラスIIリガンド(zcyto21(配列番号1)、zcyto21(配列番号4)、zcyto22(配列番号6)、zcyto10, huIL10及びhuIFNa−2aを包含する)による、トランスフェクトされた細胞の刺激に続くルシフェラーゼ活性は、細胞表面上のトランスフェクトされた及び天然のサイトカイン受容体とリガンドとの相互作用に影響を及ぼす。
293HEK細胞を次の通りにトランスフェクトした:800,000の293細胞/ウェル(6ウェルプレート)を、2mlのDMEM+10%ウシ胎児血清におけるトランスフェクションの約18時間前、プレートした。ウェル当たり、1μgのpISER−Luciferase DNA (Stratagene), 1μgのサイトカイン受容体DNA及び1μgのpIRES2-EGFP DNA (Clontech) を、合計100μlのDMEM中、9μgのFugene6試薬(Roche Biochemicals)に添加した。サイトカイン受容体DNAが包含されていない場合、2μgのpIRES2−EGFP DNAが使用された。このトランスフェクション混合物を、30分後、プレ−プレートされた293細胞に添加した。24時間後、トランスフェクトされた細胞を、トリプシン−EDTAを用いてプレートから除き、そして96ウェルマイクロタイタープレートにおけるウェル当たり約25,000の細胞で置換した。リガンド刺激の約18時間前、培地を、DMEM+0.5%FBSに換えた。
シグナルトランスダクションレポーターアッセイを次の通りに行なった:DMEM+0.5%FBSにおける37℃での18時間のインキュベーションに続いて、トランスフェクトされた細胞を、次のクラスIIリガンドの希釈溶液(DMEM+0.5%FBSにおける)により刺激した:zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto10, huIL10及びhuIFNa-2a。37℃での4時間のインキュベーションに続いて、細胞を溶解し、そして相対的光単位(RLU)を、ルシフェラーゼ基質の添加の後、ルミノメーター上で測定した。その得られる結果は、培地のみの対照よりも実験サンプルのRLUの倍率誘発(fold induction)として示される(実験サンプルRLU/培地のみのRLU=倍率誘発)。
A:IL10Rb中和化抗体はISREシグナル化を阻害する:
シグナルトランスダクションレポーターアッセイを用いて、zcytor19及びIL10Rb(CRF2-4)とzcyto20, zcyto21及びzcyto22との機能的相互作用を決定した。ヒト胚腎臓(HEK)細胞、又は安定してヒトzcytoR19を過剰発現するヒト胚腎臓(HEK)細胞を、ルシフェラーゼレポーターの転写を駆動するインターフェロンー刺激された応答要素(ISRE)を含むレポータープラスミドによりトランスフェクトした。IL10Rb(CRF2−4)に対する中和抗体の存在又は不在下でクラスIIリガンド(zcyto20, zcyto21, zcyto22及びhuIFNa-2aを包含する)による、トランスフェクトされた細胞の刺激に続いてのルシフェラーゼ活性は、細胞表面上でのサイトカイン受容体とリガンドとの相互作用に影響を及ぼす。この結果及び方法は下記に記載される。
ヒトzcytoR19を安定して過剰発現する293HEK細胞を生成するために、293細胞を次の通りにしてトランスフェクトした:300,000個の293細胞/ウェル(6ウェルプレート)を、2mlのDMEM+10%ウシ胎児血清におけるトランスフェクションの約6時間前、プレートした。ウェル当たり、ヒトzcytoR19(配列番号23)のcDNAを含むp2P7発現ベクター2μgを、合計100μlのDMEM中、6μlのFugene6試薬(Roche Biochemicals)に添加した。このトランスフェクション混合物を、30分後、プレ−プレートした293細胞に添加した。48時間後、トランスフェクトされた細胞を、2μg/mlのプロマイシン選択下に配置した。プロマイシン耐性細胞を、細胞集団として使用した。
シグナルトランスダクションレポーターアッセイを次の通りにして行なった:DMEM+0.5%FBSにおける37℃での18時間のインキュベーションに続いて、トランスフェクトされた細胞を、IL10Rb(zcyto21のために2.5μg/ml、zcyto20及びzcyto22のために8μg/ml、R & D Systems)に対する中和ポリクローナルヤギ抗体又はPBSにより37℃で1時間、前処理した。ヒトzcytoR19を安定して過剰発現するヒト胚腎臓(HEK)細胞をまた、zcyto20及びzcyto22を包含する実験のための抗体対照としてのIFNAR1(8μg/ml、R & D Systems) に対する非中和ポリクローナルヤギ抗体により前処理した。
抗ウィルスアッセイを行ない、zcyto20の抗ウィルス活性を阻止する抗−IL10Rb抗体の能力を決定した。アッセイは、293HEK細胞(野生型、又はヒトzcytor19を過剰発現する)を用いて行なわれた。第1日目、抗体(抗−ヒトIL10Rβ、抗−ヒトLeptin受容体、R & D Systems)を、5μg/mlで細胞培地に希釈し、そして次に、ウェル当たり50,000個の細胞と共に、96−ウェルプレート中にプレートした。37℃で1時間のインキュベーションに続いて、zcyto20−CEE(例3からの)(野生型293細胞のために200ng/ml, ヒトzcytoR19を過剰発現する293細胞のために0.5ng/ml)又はヒトインターフェロン−a−2a(野生型293細胞のために1ng/ml, ヒトzcytoR19を過剰発現する293細胞のために100ng/ml)を、ウェルに添加し、そして37℃で一晩インキュベートした。
シグナルトランスダクションレポーターアッセイを行ない、zcytor19及びIL10Rb (CRF2-4) とzcyto20, zcyto21及びzcyto22との機能的相互作用を決定した。ハムスター肝臓(BHK)細胞を、クラスIIサイトカイン受容体zcyto19及びIL10Rb(CRF2-4)のためのcDNAを含むpZP7発現ベクターの存在又は不在下でルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を駆動するインターフェロン−刺激された応答要素(ISRE)を含むレポータープラスミドによりトランスフェクトした。クラスIIリガンド(zcyto20, zcyto21及びzcyto22を包含する)による、トランスフェクトされた細胞の刺激に続くルシフェラーゼ活性は、細胞表面上でのトランスフェクトされた及び天然のサイトカイン受容体とリガンドの相互作用に影響を及ぼす。それらの結果及び方法は、下記に記載される。
BHK−570細胞を、次の通りにしてトランスフェクトした:200,000個のBHK細胞/ウェル(6ウェルプレート)を、2mlのDMEM+5%ウシ胎児血清におけるトランスフェクションの約5時間前、プレートした。ウェル当たり、1μgのpISER−Luciferase DNA (Stratagene), 1μgのサイトカイン受容体DNA及び1μgのpIRES2-EGFP DNA (Clontech) を、合計100μlのDMEM中、9μgのFugene6試薬(Roche Biochemicals)に添加した。サイトカイン受容体DNAが包含されていない場合、2μgのpIRES2−EGFP DNAが使用された。このトランスフェクション混合物を、30分後、プレ−プレートされたBNK細胞に添加した。24時間後、トランスフェクトされた細胞を、トリプシン−EDTAを用いてプレートから除き、そして96ウェルマイクロタイタープレートにおけるウェル当たり約25,000の細胞で置換した。リガンド刺激の約18時間前、培地を、DMEM+0.5%FBSに換えた。
シグナルトランスダクションレポーターアッセイを次の通りに行なった:DMEM+0.5%FBSにおける37℃での18時間のインキュベーションに続いて、トランスフェクトされた細胞を、次のクラスIIリガンドの希釈溶液(DMEM+0.5%FBSにおける)により刺激した:zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24,及びzcyto25リガンド。37℃での4時間のインキュベーションに続いて、細胞を溶解し、そして相対的光単位(RLU)を、ルシフェラーゼ基質の添加の後、ルミノメーター上で測定した。その得られる結果は、培地のみの対照よりも実験サンプルのRLUの倍率誘発(fold induction)として示される(実験サンプルRLU/培地のみのRLU=倍率誘発)。
発現ベクター、すなわちpZp9zcytor19CEEを、zcytor19ポリペプチドの可溶性、細胞外ドメインの発現のために調製し、ここで前記構造体は、予測される開始メチオニンから成り、そして予測されるトランスメンブランドメインに隣接して切断され、そしてC−末端Glu−Glu標識(配列番号16)を有するzcytor19ポリペプチドを発現するよう企画されている。
BHK570細胞(ATCC No: CRL-10314)を、T−75組織培養フラスコにプレートし、そしてDMEM/FBS培地(DMEM、Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)、5%ウシ胎児血清、1mMのL−グルタミン(JRH Biosciences, Lenea, KS)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Gibco BRL))において、37℃で5%CO2において、約50〜70%の集密性まで増殖した。次に、細胞を、血清フリー(SF)培地配合物(DMEM、10mg/mlのトランスフェリン、5mg/mlのインスリン、2mg/mgのフェチュイン、1%のL−グルタミン及び1%のピルビン酸ナトリウム)において、LipofectamineTM (Gibcco BRL) を用いて、zcytor19/Fc4/pzmp20(例4B)を含むプラスミドによりトランスフェクトした。
可溶性zcytor19受容体を、5倍モル過剰のスルホ−NHS−LC−ビオチン(Piece, Inc., Rockford, IL)との反応により、製造業者のプロトコールに従って、ビオチニル化する。可溶性zcytor19受容体及び他の可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性クラスIIサイトカイン受容体、例えばCRF2-4(配列番号40)を、5倍モル過剰のRu−BPY−NHS(Igen、Inc., Gaithersburg, MD)により、製造業者のプロトコールに従って、ラベルする。可溶性zcytor19受容体のビオチニル化され、そしてRu−BPY−NHP−ラベルされた形は、それぞれBio− zcytor19受容体及びRu− zcytor19と命名され;他の可溶性受容体サブユニットのビオチニル化され、そしてRu−BPY−NHS−ラベルされた形も同様に命名され得る。アッセイを、ならし培地を用いて、又は精製されたリガンドを用いて行うことができる。
分泌されたヒトzcytor19へテロダイマーを発現するベクターを、zcytor19の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、IgGガンマ1(IgGγ1)のH鎖に融合し、そしてヘテロマ−サイトカイン受容体サブユニット(例えば、クラスIIサイトカイン受容体、例えば、CRF2-4)の細胞外部分を、ヒトカッパL鎖(ヒトκL鎖)に融合することによって構成する。
IgGγ1のH鎖を、Zem229R哺乳発現ベクター(ATCC寄託番号69447号)中にクローン化し、その結果、5’EcoRI及び3’NheI部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインをクローン化でき、N−末端細胞外ドメイン−C−末端IgGγ1融合体をもたらすことができる。この構造体に使用されるIgGγ1フラグメントを、鋳型としてClontech hFetal Liver cDNAライブラリーからIgGγ1配列を単離するために、PCRを用いることにより製造する。PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて、精製し、そしてMluI及びEcoRI(Boerhinger-Mannheim)により消化し、エタノール沈殿し、そして本明細書に開示される標準の分子生物学技法を用いて、MluI及びEcoRIにより前もって消化されたZem229中にMluI/EcoRIリンカーを含んで成る、オリゴと共に連結する。
上記構造ベクターを用いて、IgGγ1に融合されるzcytor19を有する構造体を製造する。この構成は、標準方法及びEcoRI及びNheI制限部位を供給するオリゴを用いて、前立腺cDNAライブラリー(Clontech)又は活性化されたリンパ球cDNAライブラリーからの本明細書に記載されるzcytor19受容体の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、PCR処理することによって行われる。その得られるPCR生成物を、本明細書に記載のようにして、EcoRI及びNheIにより消化し、ゲル精製し、そして上記の前もってEcoRI及びNheI消化され、そしてバンド−精製されたZem229R/IgGγI中に連結する。得られるベクターを、配列決定し、zcytor19/IgGガンマ1融合体(zcytor19/Ch1 IgG)が正しいことを確認する。
約15μgの個々の上記ベクターを、LipofectaminePlusTM 試薬(Gibco/BRL)を用いて、製造業者の説明書に従って、哺乳類細胞、例えばBHK−570細胞(ATCC No. CRL-10314)中に同時トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、1μMのメトトレキセート(MTX)(Sigma,St. Louis, MO)及び0.5mg/mlのG418(Gibco/BRL)を含むDMEM+5%FBS(Gibco/BRL)において、10日間、選択する。得られるトランスフェクタントのプールを、10μmのMTX及び0.5mg/mlのG418において再び選択する。
zcytor19−シグナル化複合体に包含される成分を同定するために、受容体再構成の研究を、次の通りにして行う。例えば、ルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクタープラスミドにより、本明細書に記載される標準方法を用いて、トランスフェクトされたBHK570細胞(ATCC No. CRL-10314)は、zcytor19リガンドの存在下でルシフェラーゼレポーターに対する、トランスフェクトされたzcytor19受容体複合体からのシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。BHK細胞は、BHK細胞がzcytor19受容体を内因的に発現しない場合において使用され得る。他の細胞系は使用され得る。
可溶性受容体へのリガンド(zcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25)の結合を、ヨード−ビーズラベリング方法用いてアッセイすることができる。たとえば、125Iラベルされたzcyto21−CEEをラベルする(1.2×107CPM/ml;1.5ng/μl;及び8.6×106CPM/μg)。
末梢血液白血球(PBL)を、ヘパリン処理されたヒト血液からFicoll Hypagne (Amersham, Sweden) 分離により単離した。PBLを、6−ウェル組織培養プレートにおいて、1×106個の細胞/mlの密度で標準培地において37℃で培養した。一晩のインキュベーションに続いて、PBLを収穫し、そしてビオチニル化されたzcyto20-cee(例18を参照のこと)により、10μg/mlの濃度で染色した。染色を、1:1000の希釈度で調製されたPhycoerythrin−レベルされたストレプタビジン(Pharmingen, CA, USA)により検出した。染色に続いて、PBLを2%パラホルムアルデヒドに固定し、そしてFacsaliber(Becton Dickinson, San Diego, CA)上で読み取った。データをCellquestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて分析した。結果は、ビオチニル化されたzcyto20-cee及びzcyto21-ceeが、末梢血液リンパ球の骨髄性ゲートにおける細胞を染色することを示す。骨髄性ゲートにおける細胞は、zcyto20-cee及びzcyto21-ceeを結合しない。
末梢血液リンパ球(PBL)を、ヘパリン処理されたヒト血液から、Ficoll Hypaque分離により単離した。次に、PBLを、次のものから精製されたタンパク質又は培地対照により刺激した:1)zcyto21-CEE(2μg/ml);2)zcyto21-cee(1μg/ml);3)培地のみ;4)A141Fの負の対照のタンパク質(2μg/ml);又は5)IFN−α−A(1ng/ml)(PBL Biomedical NJ, USA)。刺激されたPBLを、5%CO2と共に37℃で、1×106個の細胞/mlの細胞密度でインキュベートした。培養物を24及び48時間で収穫し、そして活性化マーカーのために染色した。
zcyto21CEEを、sulfo-NHS-LC-ビオチンについてのPierce Chemical Companyによる改良されたプロトコールに従うことによってビオチニル化した。250μgのzcyto21CEE(0.5mlのPBS中)を、8.4μlのS−NHS−ビオチンストック(84μg)に添加し、そして揺り動かしながら室温で2時間インキュベートした。インキュベーション段階に続いて、20μlの2Mのトリス−HCl(pH8)を添加し、そしてその混合物を、揺り動かしながら、室温で20分間インキュベートした。ビオチニル化されたリガンド混合物を4℃で貯蔵した。zcyto20CEE, zcyto22CEE及びzcyto24CEEを、実質的に態様で調製した。
ノザンブロットを、zcytor19の組織分析を決定するためにプローブした。ヒトzcytor19 cDNAフラグメントを、遺伝子特異的プライマー、すなわち配列番号21で示されるような5’側ZC40285;及び配列番号22で示されるような3’側ZC40286と共にPCRを用いて得た。PCRフラグメントをゲル精製し、そして約25ngを、Prime−It(商標)Rm Tランダムプライムラベリングキット(Stratagene, LaJolla, CA)を用いて、P32α−dCTPによりラベルした。
特異的ヒト組織を単離し、そして現場ハイブリダイゼーションにより、zcytor19発現についてスクリーンした。調製され、切片化され、そして現場ハイブリダイゼーションにゆだねられた種々のヒト組織は、正常及び癌性結腸、頸部癌、正常及び癌性卵巣、正常及び腫瘍性皮膚、胎児肝臓、心臓及びMFH(筋肉肉腫)を包含した。組織を10%緩衝化されたホルマリンに固定し、そして標準技法を用いて、パラフィンにおいてブロックした。組織を、4〜8ミクロンで切片化した。組織を標準技法を用いて調製した。手短に言及すれば、組織切片を、Histo-Clear(商標)(National Diagnostics, Atlanta, GA) により脱パラフィン化し、そして次に、エタノールにより脱水した。次に、それらを、プロテイナーゼK(50μg/ml)(Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN)により37度で2〜7分間、消化した。この段階に続いて、組織をアセチル化し、そして再水和化した。
zcytor19の遺伝子発現は、次の細胞型のRT-PCR分析を用いて試験された:Hela,293、Daudi、CD14+、U937及びHL-60。
NFκβシグナルトランスダクション経路を通してシグナル化するzcyto20,zcyto21, zcyto22, zcyto24及びzcyto25の能力を、マウス単球/マクロファージレポーター細胞系を用いて試験した。この細胞系を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写を駆動するNFκβ応答要素を含むKZ170レトロウィルスレポーターによりRAW264.7細胞をトランスダクションすることにより生成した。
バキュロウィルス由来のならし培地を用いてのRAW264.7 NFkb−レポーターアッセイの結果は、293過渡的トランスフェクトされたならし培地を用いてのそのアッセイ結果に類似した。Zcyto20−22を含むバキュロウィルス由来のならし培地は、用量依存性態様でルシフェラーゼ発現を誘発したが、ところがその対応する対照のならし培地は誘発しなかった。
zcyto24の毒性及び生物学的活性を、もう1つのクラスIIサイトカイン及び親アデノウィルスベクターに、並びに注射されていないマウスにおいて比較した。4種のグループの8匹のC57B16マウス(雌、生後9週目)を、次の通りに注射した:
グループ1:マウス当たり1×1011個の粒子でAdzcyto24により注射し;
グループ2:1×1011の粒子でクラスIIサイトカイン(Adzcyto)により注射し;
グループ3:1×1011の粒子での親アデノウィルスベクター(Adzcyto)により注射し;そして
グループ4:処理されなかった。
Adzcyto24(グループ1)マウスは、20日の実験の間、体重のわずかな上昇を示し、これは対照グループ(グループ3及び4)に相当する。グループ2のマウスは、体重が低下した。グループ2についての平均体重は、10日目までに約8%低下した。
Claims (22)
- (a)配列番号2のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号7のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及び
(d)配列番号11のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択されたポリペプチド(A)又は当該ポリペプチド(A)に対して少なくとも90%の同一性を有し抗ウイルス活性を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号24, 27又は29に示されるアミノ酸配列のモノマー又はホモダイマー受容体、或いは配列番号41に示されるアミノ酸配列と配列番号24, 27又は29に示されるアミノ酸配列との組合せであるヘテロダイマー受容体と特異的に結合する請求項1記載のポリペプチド。
- (a)配列番号2のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号7のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及び
(d)配列番号11のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択されたポリペプチドに対して少なくとも95%の同一性を有し、抗ウイルス活性を有するポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、配列番号24, 27又は29に示されるアミノ酸配列のモノマー又はホモダイマー受容体、或いは配列番号41に示されるアミノ酸配列と配列番号24, 27又は29に示されるアミノ酸配列との組合せであるヘテロダイマー受容体と特異的に結合する請求項3記載のポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列、又は配列番号2のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
- 配列番号7のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列、又は配列番号7のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
- 配列番号9のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列、又は配列番号9のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
- 配列番号11のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列、又は配列番号11のアミノ酸残基1〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。
- 医薬的に許容できるビークルに、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んで成る医薬組成物。
- 少なくとも2種のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質であって、前記ポリペプチドの少なくとも1つが、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んで成る、当該融合タンパク質。
- 抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記核酸分子が、
(a)配列番号3のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、
(b)配列番号1のヌクレオチド64〜618のヌクレオチド配列、又は配列番号1のヌクレオチド64〜618のヌクレオチド配列の相補体から成るポリヌクレオチドに対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズされたまま存続するポリヌクレオチドから成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。 - 抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記核酸分子が、
(a)配列番号6のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド、
(b)配列番号6のヌクレオチド64〜618のヌクレオチド配列、又は配列番号6のヌクレオチド64〜618のヌクレオチド配列の相補体から成るポリヌクレオチドに対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズされたまま存続するポリヌクレオチドから成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。 - (a)配列番号2のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)配列番号7のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基205に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(c)配列番号9のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;及び
(d)配列番号11のアミノ酸残基29〜アミノ酸残基202に示されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
から成る群から選択されたポリペプチド(A)又は当該ポリペプチド(A)に対して少なくとも90%の同一性を有し抗ウイルス活性を有するポリペプチド(B)をコードするポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチド(A)とポリペプチド(B)との間の差異が保存性アミノ酸置換による請求項13記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1のヌクレオチド64〜ヌクレオチド618に示されるヌクレオチド配列又は配列番号1のヌクレオチド1〜ヌクレオチド618に示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
- 配列番号6のヌクレオチド64〜ヌクレオチド618に示されるヌクレオチド配列又は配列番号6のヌクレオチド1〜ヌクレオチド618に示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
- 配列番号8のヌクレオチド67〜ヌクレオチド606に示されるヌクレオチド配列又は配列番号8のヌクレオチド1〜ヌクレオチド606に示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
- 配列番号10のヌクレオチド67〜ヌクレオチド606に示されるヌクレオチド配列又は配列番号11のヌクレオチド1〜ヌクレオチド606に示されるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
- 請求項11〜18のいずれか1項に記載の核酸分子、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターであって、前記プロモーターが前記核酸分子と作用可能に連結され、そして前記核酸分子が前記転写ターミネーターと作用可能に連結される発現ベクター。
- 請求項19記載の発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞が、細菌、酵母細胞、菌類細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞及び植物細胞から成る群から選択される組換え宿主細胞。
- ポリペプチドの生成方法であって、請求項19記載の発現ベクターを含んで成り、そして前記ポリペプチドを生成する組換え宿主細胞又は請求項20に記載の宿主細胞を培養し、そして前記培養された宿主細胞から前記ポリペプチドを単離する段階を含んで成る方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント。
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