ES2311622T3 - Familia proteica de citoquinas. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 80% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

Description

Familia proteica de citoquinas.

Antecedentes de la invención

La diferenciación celular de los organismos multicelulares está controlada por hormonas y factores de crecimiento polipeptídicos. Estas molécula difundibles permiten a las células comunicarse entre sí y actúan en concierto para formar tejidos y órganos, y para reparar y regenerar el tejido dañado. Los ejemplos de las hormonas y los factores de crecimiento incluyen las hormonas esteroides, la hormona paratiroidea, la hormona estimuladora del folículo, los interferones, las interleuquinas, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento epidérmico, y el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos, entre otros.

Las hormonas y los factores de crecimiento influyen en el metabolismo celular uniéndose a proteínas receptoras. Ciertos receptores son proteínas integrantes de la membrana que se unen con la hormona o el factor de crecimiento en el exterior de la célula, y que están conectados a rutas de señalización en el interior de la célula, tales como los sistemas de segundos mensajeros. Otras clases de receptores son las moléculas intracelulares solubles.

Las citoquinas estimulan generalmente la proliferación o diferenciación de células del linaje hematopoyético o participan en los mecanismos de respuesta inmunitaria o inflamatoria del organismo. Los ejemplos de las citoquinas que afectan a la hematopoyesis son la eritropoyetina (EPO), que estimula el desarrollo de glóbulos rojos; la trombopoyetina (TPO), que estimula el desarrollo de células del linaje de los megacariocitos; y el factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), que estimula el desarrollo de los neutrófilos. Estas citoquinas son útiles en la restauración de los niveles normales de glóbulos rojos en pacientes que padecen anemia, trombocitopenia, y neutropenia o que reciben quimioterapia para el cáncer.

Las citoquinas juegan importantes papeles en la regulación de la hematopoyesis y las respuestas inmunitarias, y pueden influir en el desarrollo de linfocitos. La familia de citoquinas de clase II humanas incluye los subtipos de interferón-\alpha (IFN-\alpha), interferón-\beta (IFN-\beta), interferón-\gamma (INF-\gamma), IL-10, IL-19 (Patente de los Estados Unidos 5.985.614), MDA-7 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-20 (Jian et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-22 (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)), y AK-155 (Knappe et al., J. Virol. 74, 3881-3887, (2000). La mayoría de las citoquinas se unen a y transducen señales por medio de los receptores de citoquinas de Clase I o de Clase II. Los miembros de la familia de receptores de citoquinas de clase II humanos incluyen el interferón-\alphaR1 (IFN-\alphaR1), el interferón \gamma-R2 (IFN-\gamma-R2), el interferón-\gamma R1 (IFN-\gamma R1), el interferón-\gammaR2 (IFN-\gammaR2), la IL-10R (Liu et al., J. Immunol, 152, 1821-1829, (1994)), el CRF2-4 (Lutfalla et al., Genomics 16, 366-373, (1993)), IL-20R\beta (Blumberg et al., Cell 104, 9-19,(2001)) (también conocido como zcytor7 (Patente de los Estados Unidos 5.945.511) y CRF2-8 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2557-2565, (2000)), IL-20R\beta (Blumberg et al., ídem., (2001)) (también conocido como DIRS1 (Publicación PCT WO 99/46379)), IL-22RA1 (IL-22 receptor \alpha1, sometido a HUGO para su aprobación) (también conocido como IL-22R (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)), zcytor II (Patente de los Estados Unidos 5.965.704) y CRF2-9 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2257-2565, (2000)), y el factor tisular.

Los receptores de citoquinas de clase II son típicamente heterodímeros compuestos por dos cadenas receptoras distintas, las subunidades del receptor \alpha y \beta (Stahl et al., Cell 74, 587-590, (1993)). En general, las subunidades \alpha son las proteínas de unión a citoquinas primarias, y las subunidades \beta se requieren para la formación de sitios de unión de alta afinidad, así como para la transducción de la señal. Una excepción es el receptor de IL-20 en el cual ambas subunidades son requeridas para la unión de IL-20 (Blumberg et al., ídem, (2001)).

Los receptores de citoquinas de clase II son identificados por un dominio de unión a citoquina conservado de aproximadamente 200 aminoácidos (D200) en la porción extracelular del receptor. Este dominio de unión a la citoquina está formado por dos dominios de fibronectina de tipo III (FnIII) de aproximadamente 100 aminoácidos cada uno (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6934-6938, (1990); Thoreau et al., FEBS Lett 282, 16-31, (1991)). Cada dominio FnIII contiene restos Cys, Pro, y Trp conservados que determinan un patrón de plegamiento característico de siete hebras \beta similares al dominio constante de las inmunoglobulinas (Uze et al., J. Interferon Cytokine Res. 15, 3-26, (1995)). Los elementos estructurales conservados de la familia de receptores de citoquinas de clase II hacen posible identificar nuevos miembros de esta familia basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos primaria. Previamente los autores de la presente invención han identificado con éxito dos nuevos miembros de la familia de receptores de citoquinas de clase II, Zcytor7 (Patente de los Estados Unidos 5.945.511) (también conocido como IL-20R \alpha (Blumberg et al., ídem, (2001)) y zcytor11 (Patente de los Estados Unidos 5.965.704) (también conocido como IL-22R (Blumberg et al., ídem, (2001)), utilizando este enfoque. La identificación de miembros novedosos adicionales de la familia de receptores de citoquinas de clase II tiene interés porque las citoquinas juegan un papel vital en la regulación de las respuestas biológicas.

La IL-22, también conocida como IL-TIF (IL-10 relacionada con el factor inducible derivado de las células T) (Dumoutier et al., J. Immunology, 164, 1814-1819, (2000)), es un homólogo de la IL-10 descrito recientemente. La IL-22 de ratón fue identificada originalmente como un gen inducido por IL-9 en células T y mastocitos in vitro (Dumoutier et al., J. Immunology 164, 1814-1819, (2000)). La actividad de inducción por reaccionante en fase aguda fue observada en hígado de ratón tras la inyección con IL-22, y la expresión de IL-22 fue inducida rápidamente tras la inyección de lipopolisacárido (LPS), sugiriendo que la IL-22 contribuye a la respuesta inflamatoria in vivo (Dumoutier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10144-10149 (2000)).

Las interleuquinas son una familia de citoquinas que median las respuestas inmunológicas, incluyendo la inflamación. Las interleuquinas median una variedad de patologías inflamatorias. Primordial para la respuesta inflamatoria es la célula T, que produce muchas citoquinas e inmunidad adaptativa a los antígenos. Las citoquinas producidas por las células T han sido clasificadas como de tipo I y tipo II (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Las citoquinas de tipo I incluyen IL-2, IFN-\gamma, LT-\alpha, y están implicadas en las respuestas inflamatorias, la inmunidad viral, la inmunidad de parásitos intracelulares y el rechazo de aloinjertos. Las citoquinas de tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están implicadas en las respuestas humorales, la inmunidad de helmintos y la respuesta alérgica. Las citoquinas compartidas por el tipo I y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-\alpha. Existe cierta evidencia que sugiere que las poblaciones de células T que producen el Tipo 1 y el Tipo 2 migran preferentemente en diferentes tipos de tejido inflamado.

Desde el punto de vista terapéutico, tienen particular interés los interferones (proporcionan revisiones sobre los interferones De Maeyer y De Maeyer-Guignard, "Interferons", en The Cytokine Handbook, 3ª Edición, Thompson (ed.), páginas 491-516 (Academic Press Ltd. 1998), y Walsh, Biopharmaceuticals:Biochemistry and Biotechnology, páginas 158-188 (John Wiley & Sons 1998)). Los interferones muestran una variedad de actividades biológicas, y son útiles para el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunitarias, concretamente cánceres, y para la potenciación de la respuesta inmunitaria frente a agentes infecciosos, incluyendo virus, bacterias, hongos, y protozoos. Hasta la fecha, se han identificado seis formas de interferón, que han sido clasificadas en dos grupos principales. Los denominados interferones de "tipo I" incluyen el interferón-\alpha, el interferón-\beta, el interferón-\omega, el interferón \delta y el interferón-\tau. En la actualidad, el interferón-\gamma y una subclase de interferón-\alpha son los únicos interferones de tipo II.

Los interferones de tipo I, que se piensa que derivan del mismo gen ancestral, han conservado una estructura suficientemente similar para actuar por medio del mismo receptor de la superficie celular. La cadena \alpha del receptor del interferón \alpha/\beta humano comprende un dominio N-terminal extracelular, que tiene las características de un receptor de citoquinas de clase II. El interferón-\gamma no comparte una homología significativa con los interferones de tipo I o con el interferón de subtipo \alpha de tipo II, pero comparte numerosas actividades biológicas con los interferones de tipo I.

En los seres humanos, al menos 16 genes no alélicos codifican diferentes subtipos de interferón-\alpha, mientras los interferones \beta y \omega están codificados por genes individuales. Los genes de los interferones de tipo I están agrupados en el brazo corto del cromosoma 9. A diferencia de los genes humanos estructurales típicos, el interferón-\alpha, el interferón-\beta y el interferón-\omega carecen de intrones. Un único gen para el interferón-\gamma humano está localizado sobre el cromosoma 12 y contiene tres intrones. Hasta la fecha, el interferón-\tau ha sido descrito solamente en el ganado vacuno y ovino, mientras el interferón-\delta ha sido descrito solamente en cerdos.

Los medicos clínicos están sacando ventaja de las múltiples actividades de los interferones utilizando las proteínas para tratar una amplia gama de afecciones. Por ejemplo, se ha aprobado una forma de interferón-\alpha para su uso en más de 50 países para el tratamiento de afecciones médicas tales como la leucemia de las células pilosas, el carcinoma de células renales, el carcinoma de células basales, el melanoma maligno, el sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, el mieloma múltiple, la leucemia mielógena crónica, el linfoma no Hodgkin, la papilomatosis laríngea, la micosis fungoides, el condiloma acuminado, la hepatitis B crónica, la hepatitis C, la hepatitis D crónica, y la hepatitis no A, no B/C crónica. La Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos ha aprobado el uso del interferón-\beta para tratar la esclerosis múltiple, una enfermedad crónica del sistema nervioso. El interferón-\gamma se utiliza para tratar las enfermedades granulomatosas crónicas, en las cuales el interferón potencia el sistema inmunitario del paciente para destruir los patógenos bacterianos, fúngicos, y protozoicos infecciosos. Los estudios clínicos también indican que el interferón-\gamma puede ser útil en el tratamiento del SIDA, la leismaniasis, y la lepra lepromatosa.

La genoteca de secuencias DATABASE EMBL EBI, 8 de Octubre de 1999, Núm. de Acceso AC011445, proporciona la secuencia completa del clon CTC-246B18 del cromosoma 19 de Homo Sapiens.

En la publicación EP 0032134 se describen secuencias de ADN, moléculas de ADN recombinante y procedimientos para producir polipéptidos de tipo interferón humano.

Brack et al., Gene, Vol. 15, Núm. 4, Parte 1, páginas 379-394, 1 de Diciembre de 1981, describen el análisis molecular de la familia de genes del interferón-alfa humano.

Xie M-H et al., J. Biological Chemistry, Vol. 275, Núm. 40, páginas 31335-31339, 6 de Octubre de 2000, describen la interleuquina (IL)-22, una citoquina humana que señaliza por medio de proteínas relacionadas con el receptor de interferón CRF-2-4 e IL-22R.

En la publicación WO 00/55324 se describe un interferón-alfa murino, denominado también zcyto 13.

En la publicación WO 03/066002 se describe un mecanismo independiente de IFN-A/B de protección anti-viral por medio de un par ligando-receptor: los ligandos de IFN ocupan un receptor IFN-LR1 (CRF2-12) e IL-10R2 (CRF2-4) para la señalización y la inducción de actividades biológicas.

En la publicación WO 02/092762 se describen polipéptidos de citoquinas y métodos asociados.

Burge & Karlin, J. Mol. Biol. (1997), Vol. 268, páginas 78-94, describen una predicción de estructuras génicas completas en ADN genómico humano.

Las actividades in vivo demostradas de la familia de las citoquinas ilustran el enorme potencial clínico, y la necesidad de otras citoquinas, agonistas de citoquinas, y antagonistas de citoquinas. La presente invención estudia estas necesidades proporcionando una nueva citoquina que estimula las células del linaje celular hematopoyético, así como las composiciones y los métodos relacionados.

La presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 80% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y

(d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

Antes de exponer la invención con detalle, puede resultar útil para la comprensión de la misma definir los siguientes términos:

El término "etiqueta de afinidad" se utiliza en la presente memoria para indicar un segmento polipeptídico que puede estar anclado a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para el anclaje del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, se puede utilizar como etiqueta de afinidad cualquier péptido o proteína para el cual se encuentre disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico. Las etiquetas de afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grusenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido Flag® (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al. Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ADN que codifican
las etiquetas de afinidad son asequibles de proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia, Biotech, Piscataway, NJ).

El término "variante alélica" se utiliza en la presente memoria para indicar cualquiera de las dos o más formas alternativas de genes que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente por medio de la mutación, y puede dar como resultado un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica también se utiliza en la presente memoria para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

Los términos "amino terminal" y "carboxi terminal" se utilizan en la presente memoria para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se utilizan con referencia a una secuencia concreta o una porción de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia situada carboxi terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está localizada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término "par complemento/anti-complemento" indica radicales no idénticos que forman un par estable, asociado no covalentemente en condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anti-complemento. Otros pares complemento/anti-complemento ilustrativos incluyen pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos efectores/antisentido, y similares. Cuando es deseable la posterior disociación del par complemento/anti-complemento, el par complemento/anti-complemento tiene preferiblemente una afinidad de unión < 10^{9} M^{-1}.

El término "complementos de una molécula de polinucleótido" indica una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de bases complementaria y una orientación inversa en comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5'ATGCACGGG3' es complementaria a 5'CCCGTGCAT3'.

El término "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación con una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto aminoácido (esto es, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

El término "vector de expresión" se utiliza para indicar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés conectado operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un intensificador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión derivan generalmente de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos.

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, indica que el polinucleótido ha sido separado de su medio genético natural y por tanto está libre de otras secuencias codificadoras extrañas o no deseadas, y se encuentra en una forma adecuada para su uso en sistemas de producción de proteínas diseñados genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aislado de la presente invención están libres de otros genes con los cuales están asociadas normalmente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para un experto normal en la técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o proteína que se encuentra en unas condiciones distintas de las de su medio nativo, por ejemplo separado de la sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, concretamente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, esto es, puros en más de 95%, más preferiblemente puros en más de 99%. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o alternativamente formas glicosiladas o trans-
formadas.

El término "neoplásico", cuando se refiere a células, indica células que experimentan una proliferación nueva y anómala, concretamente en un tejido en el que la proliferación no está controlada y es progresiva, dando como resultado un neoplasma. Las células neoplásicas pueden ser malignas, esto es invasivas y metastásicas, o benignas.

El término "conectado operablemente", cuando se refiere a segmentos de ADN, indica que los segmentos están dispuestos de manera que funcionan en concierto para los propósitos deseados, p. ej., la transcripción se inicia en el promotor y prosigue a través del segmento codificador hacia el terminador.

El término "ortólogo" indica un polipéptido o proteína obtenido de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la especiación.

Los "parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen por la duplicación de genes. Por ejemplo la \alpha-globina, la \beta-globina, y la mioglobina son parálogos entre sí.

Un "polinucleótido" es un polímero de bases desoxirribonucleotidídicas o ribonucleotídicas de hebra sencilla o doble leído del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vitro, o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan en forma de pares de bases (abreviado como "pb"), nucleótidos ("nt"), o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son de hebra sencilla o de doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra se utiliza para indicar la longitud global y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases". Los expertos en la técnica reconocerán que las dos hebras del polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en su longitud y que los extremos de las mismas pueden ser escalonados como resultado de la escisión enzimática; de este modo todos los nucleótidos de la molécula de polinucleótido de doble hebra pueden no estar emparejados.

Un "polipéptido" es un polímero de restos aminoácido unidos por enlaces peptídicos, ya sean producidos naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos aminoácido son referidos comúnmente como "péptidos".

El término "promotor" se utiliza en la presente memoria por su significado reconocido en la técnica para indicar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en las regiones 5' no codificadoras de los genes.

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidratados. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en la cual se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de la estructura de su cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidratados generalmente no se especifican, pero sin embargo pueden estar presentes.

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El término "receptor" indica una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (esto es, un ligando) y media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura multipeptídica que comprende un dominio de unión al ligando extracelular y un dominio efector intracelular que está implicado típicamente en la transducción de la señal. La unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que ocasiona una interacción entre el dominio efector y la otra o las otras moléculas de la célula. Esta interacción conduce a su vez a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están ligados a las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de la membrana, adherencia celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden estár unidos a la membrana, o pueden ser citosólicos o nucleares, monoméricos (p. ej., receptor de la hormona estimuladora del tiroides, receptor beta-adenérgico) o multiméricos (p. ej., receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6).

El término "secuencia señal secretora" indica una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de una ruta secretora de una célula en la cual es sintetizada. El polipéptido más grande es escindido comúnmente para separar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora.

El término "variante de empalme" se utiliza en la presente memoria para indicar formas alternativas de ARN transcrito a partir de un gen. La variación de empalme surge naturalmente por el uso de sitios de empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado diversos ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. El término variante de empalme se utiliza en la presente memoria para indicar una proteína codificada por una variante de empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.

Se entenderá que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados por medio de métodos analíticos imprecisos (p. ej., electroforesis en gel) son valores aproximados. Cuando semejante valor es expresado como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor establecido de X es exacto en \pm 10%.

La presente invención incluye un género de moléculas polinucleotídicas y polipeptídicas que tienen similitud funcional y estructural con los interferones. En esta nueva familia, que incluye moléculas denominadas zcyto20 (SEQ ID NOS: 1 y 2), zcyto21 (SEQ ID NOS: 4 y 5), zcyto22 (SEQ ID NOS: 6 y 7), zcyto24 (SEQ ID NOS: 8 y 9), zcyto25 (SEQ ID NOS: 10 y 11), zcyto20, 21, y 22 son secuencias humanas y zcyto24 y 25 son secuencias de ratón. La homología entre la familia a nivel de nucleótidos y aminoácidos se muestra en la Tabla 1, oscilando de aproximadamente 72% a 98% a nivel de nucleótidos, y de 51% a 97% a nivel de aminoácidos.

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TABLA 1 Identidad de la secuencia de nucleótidos

1

La Tabla 2 es una ilustración de la identidad de la secuencia entre zcyto20, zcyto21, zcyto22, IFN\alpha, IFN\beta, IFN\gamma, e IL10 a nivel de aminoácidos.

TABLA 2 Identidad de la secuencia de aminoácidos

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Se ha demostrado que todos los miembros de la familia se unen al mismo receptor de citoquina de clase II, denominado receptor zcytor19. Además, se ha demostrado que cada molécula de la familia muestra ciertas actividades biológicas. Estas actividades incluyen, por ejemplo, actividades antivirales y aumento de niveles de células mieloides circulantes. Si bien no se desea estar ligado a la teoría, estas moléculas parecen señalizar todas a través de receptor zcytor19 por medio de la misma ruta.

El gen Zcyto20 codifica un polipéptido de 205 aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 2. Se puede pronosticar que la secuencia señal para Zcyto20 comprende del resto aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 21 (Ala) del SEQ ID NO: 2. El péptido maduro para Zcyto20 comienza en el resto aminoácido 22 (Val).

El gen Zcyto21 codifica un polipéptido de 200 aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 5. Se puede pronosticar que la secuencia señal para Zcyto21 comprende del resto aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 19 (Ala) del SEQ ID NO: 5. El péptido maduro para Zcyto21 comienza en el resto aminoácido 20 (Gly). Zcyto21 ha sido descrito en la solicitud PCT WO 02/02627.

El gen Zcyto22 codifica un polipéptido de 205 aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 7. Se puede pronosticar que la secuencia señal para Zcyto22 comprende del resto aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 21 (Ala) del SEQ ID NO: 7. El péptido maduro para Zcyto22 comienza en el resto aminoácido 22 (Val).

El gen Zcyto24 codifica un polipéptido de 202 aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 9. La secuencia señal secretora para Zcyto24 comprende del resto aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 28 (Ala) del SEQ ID NO: 9. Un sitio alternativo para la escisión de la secuencia señal secretora se puede encontrar en el resto aminoácido 24 (Thr). El polipéptido maduro comprende del resto aminoácido 29 (Asp) al resto aminoácido 202 (Val).

El gen Zcyto25 codifica un polipéptido de 202 aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 11. La secuencia señal secretora para Zcyto25 comprende del resto aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 28 (Ala) del SEQ ID NO: 11. Un sitio alternativo para la escisión de la secuencia señal secretora se puede encontrar en el resto aminoácido 24 (Thr). El polipéptido maduro comprende del resto aminoácido 29 (Asp) al resto aminoácido 202 (Val).

Los genes Zcyto20, Zcyto21, y Zcyto22 han sido mapeados en el cromosoma 19q13.13 humano. Basándose en el descubrimiento de estos genes, esta región del cromosoma 19 ha sido identificada por comprender una agrupación de genes de tipo interferón. Una indicación adicional de que ésta es una nueva familia de genes es la identificación de una agrupación sinténica de genes en el cromosoma 7 de ratón, zcyto24 (SEQ ID NO: 8) y zcyto25 (SEQ ID NO: 10).

Como se describe más abajo, la presente invención proporciona polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 70%, al menos en 80%, o al menos en 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de los restos aminoácido 22 a 205 del SEQ ID NO: 2 o de los restos aminoácido 1 a 205 del SEQ ID NO: 2, o algún fragmento de los mismos. La presente invención también incluye un polipéptido que comprende adicionalmente una secuencia secretora de la señal que reside en una posición amino terminal con respecto a la primera secuencia de aminoácidos, donde la secuencia secretora de la señal comprende los restos aminoácido 1 a 21 de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2.

En otra realización, la presente invención proporciona polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 70%, al menos en 80%, o al menos en 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de los restos aminoácido 22 a 205 del SEQ ID NO: 7 o de los restos aminoácido 1 a 205 del SEQ ID NO: 7. La presente invención también incluye un polipéptido que comprende adicionalmente una secuencia secretora de la señal que reside en una posición amino terminal con respecto a la primera secuencia de aminoácidos, donde la secuencia secretora de la señal comprende los restos aminoácido 1 a 21 de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7.

En general, se pronostica que las citoquinas, como la eritropoyetina (EPO), tienen una estructura de cuatro hélices alfa, siendo las hélices A, C y D las más importantes en las interacciones ligando-receptor, y son los más altamente conservados entre los miembros de la familia. Sin embargo, los interferones (INF), y el interferón alfa y el interferón tau en particular, se caracterizan por haces de seis hélices. La hélice A de la EPO es equivalente a la hélice A de zcyto20; la hélice B de la EPO es equivalente a la hélice C de zcyto20; la hélice C de la EPO es equivalente a la hélice D de zcyto20, y la hélice D de la EPO es equivalente a la hélice F de zcyto20. De este modo, el bucle entre el bucle AB, y el bucle CD de la EPO se expande en zcyto20 para contener las hélices B y E cortas de zcyto20. Las estructuras helicoidales de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 son similares a la estructura de seis hélices encontrada en los interferones. Los límites de las estructuras secundarias en las proteínas se definen generalmente de acuerdo con una gama de ángulos PHI y PSI del esqueleto de la cadena de proteína a partir de un modelo tridimensional de la proteína. Los modelos pueden ser construidos, por ejemplo, a partir de cristalografía de rayos x o datos de RMN, o modelado por homología basándose en una estructura resuelta. Dependiendo de las técnicas utilizadas, incluyendo las condiciones para la formación de cristales y la determinación de la estructura flexible en solución por RMN, los límites de estas estructuras secundarias pueden ser ligeramente alterados. De este modo, los expertos en la técnica reconocerán que los límites helicoidales, y las estructuras secundarias en general, dependiendo del entorno, pueden desplazarse 2, 3, 4, o más restos, pero las regiones helicoidales son esencialmente las descritas más abajo. (Véase, Brandon y Toosze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing Co., Inc. Nueva York, 1991; Anderson et al., Structure, 10(2):175-84, 2002).

Las hélices de Zcyto20 se pronostican como sigue: la hélice A está definida por los restos aminoácido 52 (Ala) a 66 (Leu); la hélice B por los restos aminoácido 78 (Arg) a 87 (Val); la hélice C por los restos aminoácido 91 (Pro) a 108 (Thr); la hélice D por los restos aminoácido 116 (Val) a 138 (Ser); la hélice E por los restos aminoácido 151 (Thr) a 172 (Lys); y la hélice F por los restos aminoácido 177 (Gly) a 197 (Cys); como se muestra en el SEQ ID NO: 2. Cuatro restos cisteína son conservados entre Zcyto20, Zcyto21, e IFN-\alpha. Además, Zcyto20 tiene 3 cisteínas adicionales. La cisteína del resto aminoácido 204, puede formar un enlace disulfuro intermolecular, en particular para formar homodímeros con moléculas de Zcyto20 adicionales. El análisis adicional de Zcyto20 basado en alineamientos múltiples pronostica que las cisteínas de los restos aminoácido 37 y 136; 69 y 197; y 71 y 178 (como se muestra en el SEQ ID NO: 2) formarán enlaces disulfuro intramoleculares. Los polinucleótidos correspondientes que codifican las regiones, dominios, motivos, restos y secuencias del polipéptido Zcyto20 descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 1.

Las hélices de Zcyto21 se pronostican como sigue: la hélice A está definida por los restos aminoácido 49 (Ser) a 63 (Leu); la hélice B por los restos aminoácido 76 (Asn) a 84 (Val); la hélice C por los restos aminoácido 89 (Val) a 104 (Ala); la hélice D por los restos aminoácido 111 (Glu) a 133 (Gln); la hélice E por los restos aminoácido 137 (Thr) a 158 (Lys); y la hélice F por los restos aminoácido 163 (Gly) a 189 (Leu); como se muestra en el SEQ ID NO: 5. Los restos cisteína son conservados entre Zcyto21, Zcyto21, e TNF-\alpha, y pueden formar un enlace disulfuro intermolecular, en particular para formar homodímeros con moléculas de Zcyto21 adicionales. El análisis adicional de Zcyto21 basado en los alineamientos múltiples pronostica que las cisteínas de los restos aminoácido 34 y 131, y 68 y 164, formarán enlaces disulfuro intramoleculares. La cisteína del resto 190 está libre, y puede formar una asociación disulfuro intermolecular. Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones, dominios, motivos, restos y secuencias del polipéptido Zcyto21 descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 4.

Las hélices de Zcyto22 se pronostican como sigue: la hélice A está definida por los restos aminoácido 52 (Ala) a 66 (Leu); la hélice B por los restos aminoácido 78 (Arg) a 87 (Val); la hélice C por los restos aminoácido 91 (Pro) a 108 (Thr); la hélice D por los restos aminoácido 116 (Val) a 138 (Ser); la hélice E por los restos aminoácido 151 (Thr) a 172 (Lys); y la hélice F por los restos aminoácido 177 (Gly) a 197 (Cys); como se muestra en el SEQ ID NO:7. Cuatro restos cisteína son conservados entre Zcyto22, Zcyto21, e IFN-\alpha. Además, Zcyto22 tiene 3 cisteínas adicionales. La cisteína del resto aminoácido 204, puede formar un enlace disulfuro intermolecular, en particular para formar homodímeros con moléculas de Zcyto22 adicionales. El análisis adicional de Zcyto22 basado en alineamientos múltiples pronostica que las cisteínas de los restos aminoácido 37 y 136; 69 y 197; y 71 y 178 (como se muestra en el SEQ ID NO: 7) formarán enlaces disulfuro intramoleculares. Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones, dominios, motivos, restos, y secuencias del polipéptido Zcyto22 descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 6.

Las cisteínas conservadas para zcyto24 se muestran en los restos 44, 78, 141, y 175 del SEQ ID NO: 9. El análisis adicional de zcyto 24 basado en los alineamientos múltiples pronostica que se formarán enlaces disulfuro entre las cisteínas de los restos aminoácido 44 y 141; 78 y 175; (como se muestra en el SEQ ID NO: 9). Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones, dominios, motivos, restos, y secuencias del polipéptido zcyto24 descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 9. Las hélices pronosticadas en zcyto24 (como se muestra en el SEQ ID NO: 9) son: los restos 59-73 (hélice A); los restos 85-94 (hélice B); los restos 98-115 (hélice C); los restos 121-143 (hélice D); los restos 147-169 (hélice E); los restos 174-194 (hélice F).

Las cisteínas conservadas para zcyto25 se muestran en los restos 44, 78, 141, y 175 del SEQ ID NO: 11. El análisis adicional de zcyto25 basado en alineamientos múltiples pronostica que los enlaces disulfuro se formarán entre las cisteínas de los restos aminoácido 44 y 141; 78 y 175 (como se muestra en el SEQ ID NO: 11). Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones, dominios, motivos, restos y secuencias del polipéptido zcyto25 descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 11. Las hélices pronosticadas en zcyto25 (mostrado en el SEQ ID NO: 11) son; los restos 59-73 (hélice A); los restos 85-94 (hélice B); los restos 98-115 (hélice C); los restos 121-143 (hélice D); los restos 147-169 (hélice E); los restos 174-194 (hélice F).

El análisis mutacional detallado de la IL-2 murina (Zurawski et al., EMBO J. 12:5113-5119, 1993) muestra los restos de las hélices A y C que son importantes para la unión a IL-2R\beta; los restos críticos son Asp_{34}, Asn_{99}, y Asn_{103}. Los múltiples restos del bucle A/B y de la hélice B de la IL-2 murina son importantes para la unión con IL-2R\alpha, mientras solamente un único resto, Gln_{141} de la hélice D, es vital para la unión con IL-2R\alpha. De un modo similar, las hélices A y C son sitios de interacción entre IL-4 e IL-4R\alpha (estructuralmente similar a IL-2R\alpha), y los restos de la hélice D son vitales para la interacción con IL-2R\alpha (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J. 11:3237-3244, (1992). En particular, la mutación Tyr_{124} por Asp en la IL-4 humana crea un antagonista, que se une a IL-4R\alpha pero no a IL-2R\alpha y por lo tanto no puede señalizar (Kruse et al., ídem. 1992).

Las citoquinas con paquetes de cuatro hélices también se agrupan por la longitud de sus hélices componentes. Las citoquinas con forma de "hélice larga" generalmente consisten en hélices de entre 24-30 restos, e incluyen la IL-6, el factor neurotrófico ciliar (CNTF), el factor inhibidor de la leucemia (LIF) y la hormona del crecimiento humana (hGH). Las citoquinas con forma de "hélice corta" consisten generalmente en hélices de entre 18-21 restos e incluyen la IL-2, la IL-4 y el GM-CSF. Los estudios en los que se utilizan CNTF e IL-6 demostraron que la hélice de CNTF se puede intercambiar por la hélice equivalente de IL-6, confiriendo propiedades de unión de CTNF a la quimera. De este modo, parece que los dominios funcionales de las citoquinas con cuatro hélices están determinados basándose en la homología estructural, con independencia de la identidad de la secuencia, y pueden mantener su integridad funcional en una quimera (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Por lo tanto, los dominios helicoidales de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 serán útiles para preparar moléculas de fusión quiméricas, concretamente con otros interferones para determinar y modular la especificidad de unión al receptor. Tienen un interés particular las proteínas de fusión que combinan los dominios helicoidales y en bucle de interferones y citoquinas tales como INF-\alpha, IL-10, hormona de crecimiento humana.

Se ha demostrado que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 forman un complejo con el receptor huérfano denominado zcytor19. Zcytor19 se describe en la solicitud de patente comúnmente asignada PCT/US01/44808. Se ha demostrado que zcyto22, zcyto21, y zcyto24 se unen o señalizan también por medio de zcytor19, apoyando adicionalmente que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 son miembros de la misma familia de citoquinas. El receptor zcytor19 es un receptor de citoquina de clase II. Los receptores de citoquina de clase II normalmente se unen a las citoquinas de cuatro paquetes helicoidales. Por ejemplo, la interleuquina-10 y los interferones se unen a receptores de esta clase (p. ej., receptor del interferón gamma, cadenas alfa y beta y las cadenas alfa y beta del receptor del interferón-alfa/beta).

Los receptores de citoquinas de clase II se caracterizan por la presencia de uno o más módulos de receptores de citoquina (CRM) en sus dominios extracelulares. Otros receptores de citoquina de clase II incluyen zcytor11 (Patente de los Estados Unidos del mismo propietario Núm. 5.965.704), CRF2-4 (Núm. de Acceso Genbank Z17227), IL-10R (Núms. de Acceso Genbank U00672 y NM_001558), DIRSI, zcytor7 (Patente de los Estados Unidos del mismo propietario Núm. 5.945.511), y factor tisular. Zcytor19, como todos los receptores de clase II conocidos excepto la cadena alfa del receptor del interferón alfa/beta, tiene solamente un único CRM de clase II en su dominio extracelular.

El análisis del clon de ADNc humano que codifica Zcytor19 (SEQ ID NO: 26) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 520 aminoácidos (SEQ ID NO: 27) que comprendía una secuencia señal secretora (restos 1 (Met) a 20 (Gly) del SEQ ID NO: 27) y un polipéptido receptor de citoquina zcytor19 maduro (restos 21 (Arg) a 520 (Arg) del SEQ ID NO: 27) un dominio de unión al ligando extracelular de aproximadamente 206 restos aminoácido (restos 21 (Arg) a 226 (Asn) del SEQ ID NO: 27), un dominio transmembrana de aproximadamente 23 restos aminoácido (restos 227 (Trp) a 249 (Trp) del SEQ ID NO: 27), y un dominio extracelular de aproximadamente 271 restos aminoácido (restos 250 (Lys) a 520 (Arg) del SEQ ID NO: 27). Dentro del dominio de unión al ligando extracelular, existen dos dominios de fibronectina de tipo III y una región conectora. El primer dominio de fibronectina de tipo III comprende los restos 21 (Arg) a 119 (Tyr) del SEQ ID NO: 27, el conector comprende los restos 120 (Leu) a 124 (Glu) del SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio de fibronectina de tipo III comprende los restos 125 (Pro) a 223 (Pro) del SEQ ID NO: 27. De este modo, un polipéptido que comprende los aminoácidos 21 (Arg) a 223 (Pro) del SEQ ID NO: 27 se considera un fragmento de unión al ligando. Además en cuanto a los restos típicamente conservados en los receptores de clase II, existen restos Triptófano conservados que comprenden los restos 43 (Trp) y 68 (Trp) mostrados en el SEQ ID NO: 27, y restos Cisteína conservados en las posiciones 74, 82, 195, 217 del SEQ ID NO: 27.

Además, se identificó un clon de ADNc humano que codifica una variante de Zcytor19 con una deleción del aminoácido 30. Esta variante de zcytor19 (como se muestra en el SEQ ID NO: 23) comprende un marco de lectura abierto que codifica 491 aminoácidos (SEQ ID NO: 24) que comprende una secuencia señal secretora (restos 1 (Met) a 20 (Gly) del SEQ ID NO: 24) y un polipéptido receptor de citoquina zcytor19 maduro (restos 21 (Arg) a 491 (Arg) del SEQ ID NO: 24), un dominio de unión al ligando extracelular de aproximadamente 206 restos aminoácido (restos 21 (Arg) a 226 (Asn) del SEQ ID NO: 24, un dominio transmembrana de aproximadamente 23 restos aminoácido (restos 227 (Trp) a 249 (Trp) del SEQ ID NO: 24), y un dominio intracelular de aproximadamente 242 restos aminoácido (restos 250 (Lys) a 491 (Arg) del SEQ ID O: 24). En el dominio de unión al ligando extracelular, existen dos dominios de fibronectina de tipo III y una región conectora. El primer dominio de fibronectina de tipo III comprende los restos 21 (Arg) a 119 (Tyr) del SEQ ID NO: 24, el conector comprende los restos 120 (Leu) a 124 (Glu) del SEQ ID NO: 24, y el segundo dominio de fibronectina de tipo III es corto, y comprende los restos 125 (Pro) a 223 (Pro) del SEQ ID NO: 24. De este modo, un polipéptido que comprende los aminoácidos 21 (Arg) a 223 (Pro) del SEQ ID O: 24 se considera un fragmento de unión al ligando. Además en cuanto a los receptores típicamente conservados de clase II, existen restos Triptófano conservados que comprenden los restos 43 (Trp) y 68 (Trp) como se muestra en el SEQ ID NO: 24), y restos Cisteína conservados en las posiciones 74, 82, 195, 217 del SEQ ID NO: 24.

Una forma soluble truncada del ARNm del receptor zcytor19 parece ser expresada naturalmente. El análisis de un clon de ADNc humano que codifica el Zcytor19 soluble truncado (SEQ ID NO: 28) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 211 aminoácidos (SEQ ID NO: 29) que comprendía una secuencia señal secretora (restos 1 (Met) a 20 (Gly) del SEQ ID NO: 29) y un polipéptido zcytor19 soluble truncado maduro (restos 21 (Arg) a 211 (Ser) del SEQ ID NO: 29), un dominio de unión al ligando extracelular truncado de aproximadamente 143 restos aminoácido (restos 21 (Arg) a 163 (Trp) del SEQ ID NO: 29), ningún dominio transmembrana, pero un dominio adicional de aproximadamente 48 restos aminoácido (restos 164 (Lys) a 211 (Ser) del SEQ ID NO: 29). En el dominio de unión al ligando extracelular truncado, existen dos dominios de fibronectina de tipo III y una región ligadora. El primer dominio de fibronectina de tipo III comprende los restos 21 (Arg) a 119 (Tyr) del SEQ ID NO: 29, el conector comprende los restos 120 (Leu) a 124 (Glu) del SEQ ID NO: 29, y el segundo dominio de fibronectina de tipo III comprende los restos 125 (Pro) a 163 (Trp) del SEQ ID NO: 29. De este modo, un polipéptido que comprende los aminoácidos 21 (Arg) a 163 (Trp) del SEQ ID NO: 29 se considera un fragmento de unión al ligando. Además en cuanto a los restos típicamente conservados de los receptores de clase II, existen restos Triptófano que comprenden los restos 43 (Trp) y 68 (Trp) como se muestra en el SEQ ID NO: 29; y los restos Cisteína conservados en esta forma soluble truncada del receptor zcytor19 están en las posiciones 74, y 82 del SEQ ID NO: 29.

El receptor zcytor19 es un miembro de la misma subfamilia de receptores que los receptores de citoquinas de clase II, y los receptores de esta subfamilia se pueden asociar para formar homodímeros que transducen una señal. Varios miembros de la subfamilia (p. ej., los receptores que se unen al interferón, IL-10, IL-19, e IL-TIF) se combinan con una segunda subunidad (denominada subunidad \beta) para unirse al ligando y transducir una señal. Sin embargo, en muchos casos, las subunidades \beta específicas se asocian con una pluralidad de subunidades de receptores de citoquinas específicos. Por ejemplo, los receptores de citoquinas de clase II, tales como zcytor11 (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.965.704) y el receptor CRF2-4 se heterodimerizan para unirse a la citoquina IL-TIF (Véase, la publicación WIPO WO 00/24758; Dumontier et al., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Spencer, SD et al., J. Exp. Med. 187:571-578, 1998; Gibbs, VC y Pennica Gene 186:97-101,1997 (CRF2-4 cDNA); Xie, MH et al., J. Biol. Chem. 275:31335-31339, 2000). Se cree que el receptor de IL-10\beta es sinónimo de CRF2-4 (Dumoutier, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Liu Y et al., J. Immunol. 152:1821-1829, 1994 (IL-10R cDNA). Por lo tanto, se podría esperar que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se unan a receptores zcytor19 monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos. La evidencia experimental ha identificado CRF2-4 (SEQ ID NOS: 40 y 41) como supuesto compañero de unión para zcytor19 lo que confirma adicionalmente que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 juegan un papel importante en el sistema inmunomodulador, afectando a fisiologías tales como el sistema inmunitario innato y el sistema de respuesta inflamatoria.

La localización de la expresión de un receptor para un par ligando/receptor puede tener trascendencia para identificar la célula o tejido diana en el cual actúa el ligando. Esto resulta particularmente útil cuando el complejo receptor/ligando implica un receptor heterodimérico en el cual una de las subunidades es expresada ampliamente y la otra subunidad es expresada de una manera limitada, ya sea restringida espacialmente o temporalmente. Utilizando la hibridación in situ se ha identificado la expresión de zcytor19 en una muestra de carcinoma de piel, donde el epitelio granular canceroso era fuertemente positivo, si bien no se observa una señal positiva en la piel normal. Otros tejidos que se ha identificado que expresan zcytor19 incluyen hígado fetal, donde se observó señal en una población mixta de células mononucleares en espacios sinusoidales; en pulmón se observó la expresión en epitelio alveolar de tipo II; y en células mononucleares de tipo macrófago en el tejido intersticial. El análisis northern de zcytor19 identificó la expresión de un transcrito de \sim4,5 kb que estaba en su mayor parte en el corazón, el músculo esquelético, el páncreas, y el tejido prostático, además de en la línea celular de el linfoma de Burkitt (RAJI) y en la línea celular de carcinoma colorrectal SW-480.

La presente invención proporciona moléculas de polinucleótidos, incluyendo las moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 descritos en la presente memoria. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible una considerable variación de la secuencia entre estas moléculas de polinucleótido. El SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ADN degenerado que abarca todos los ADN que codifican el polipéptido zcyto20 del SEQ ID NO: 2. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada del SEQ ID NO: 3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican el SEQ ID NO: 2 sustituyendo U por T. De este modo, los polinucleótidos que codifican el polipéptido zcyto20 que comprenden del nucleótido 1 o 64 al nucleótido 615 del SEQ ID NO: 3 y sus ARN equivalentes son contemplados por la presente invención. La Tabla 3 expone los códigos de una letra utilizados en el SEQ ID NO: 3 para indicar las posiciones de nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son los nucleótidos indicados por una letra del código. El "complemento" indica el código para el nucleótido o los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, siendo A complementario a T, y siendo G complementario a C.

El SEQ ID NO: 46 es una secuencia de ADN degenerada que abarca todos los ADN que codifican el polipéptido zcyto22 del SEQ ID NO: 7. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada del SEQ ID NO: 46 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican el SEQ ID NO: 7 sustituyendo U por T. De este modo, los polinucleótidos que codifican el polipéptido zcyto22 que comprenden del nucleótido 1 o 64 al nucleótido 615 del SEQ ID NO: 46 y sus ARN equivalentes son contemplados por la presente invención. La Tabla 3 expone los códigos de una letra utilizados en el SEQ ID NO: 46 para indicar las posiciones de los nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son los nucleótidos indicados por una letra del código. El "complemento" indica el código para el nucleótido o los nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, siendo A complementario a T, y siendo G complementario a C.

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TABLA 3

3

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Los codones degenerados utilizados en el SEQ ID NO: 3, que abarca todos los posibles codones para un aminoácido dado, se exponen en la Tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

4

Un experto normal en la técnica apreciará que se introduce cierta ambigüedad al determinar un codón degenerado, representativo de todos los posibles codones que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar arginina (AGR), y el codón degenerado para arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar serina (AGY). Existe una relación similar entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. De este modo, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variables, pero un experto en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias variables mediante la referencia a la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 7. Las secuencias variantes pueden ser sometidas a ensayo fácilmente en cuanto a la funcionalidad como se describe en la presente memoria.

Un experto normal en la técnica también apreciará que diferentes especies pueden mostrar un "uso preferente de codones ". En general, véase, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912,1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64,1981; Grosjean y Fiers, Gene 18:199-209,1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Según se utiliza en la presente memoria, el término "uso preferente de codones", o "codones preferentes" es un término de la técnica que hace referencia a codones de traducción de las proteínas que son utilizados muy frecuentemente en las células de ciertas especies, favoreciendo de este modo uno o unos pocos representativos de los posibles codones que codifican cada aminoácido (Véase la Tabla 3). Por ejemplo, el aminoácido Treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en células de mamífero ACC es el codón más comúnmente utilizado; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, levaduras, virus o bacterias, pueden ser preferentes diferentes codones de Thr. Los codones preferentes para una especie concreta pueden ser introducidos en los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferentes en el ADN recombinante puede potenciar, por ejemplo, la producción de la proteína haciendo más eficaz la traducción de la proteína en un tipo concreto de célula o especie. Por lo tanto, la secuencia de codones degenerados descrita en los SEQ ID NOS: 3 y 46 sirve como molde para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos celulares y especies comúnmente utilizados en la técnica y descritos en la presente memoria. Las secuencias que contienen codones preferentes pueden ser sometidas a ensayo y optimizadas en cuanto a su expresión en diversas especies, y sometidas a ensayo en cuanto a su funcionalidad como se describe en la presente memoria.

Como se ha observado previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para preparar ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN se aísla de un tejido o célula que produce grandes cantidades de ARN de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Tales tejidos y células se identifican mediante transferencia Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980), o mediante escrutinio del medio acondicionado de diversos tipos de células en cuanto a su actividad sobre células o tejidos diana. Una vez que se identifica la actividad o la célula o tejido que produce el ARN, se puede preparar el ARN total utilizando la extracción con isotiocianato de guanidinio seguido de aislamiento mediante centrifugación en gradientes de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). El ARN poli(A)^{+} se prepara a partir del ARN total utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). El ADN complementario (ADNc) se prepara a partir de ARN poli(A)^{+} utilizando métodos conocidos. Como alternativa, se puede aislar ADN genómico. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se identifican después y se aíslan, por ejemplo, mediante hibridación o PCR.

Se pueden obtener clones completos que codifican zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 mediante procedimientos de clonación convencionales. Se prefieren clones de ADN complementario (ADNc), aunque para algunas aplicaciones (p. ej., la expresión en animales transgénicos) puede ser preferible utilizar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc para que incluya al menos un intrón genómico. Los métodos para preparar clones de ADNc y genómicos son bien conocidos y están dentro del nivel de los expertos en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita en la presente memoria, o partes de la misma, para sondear o cebar una genoteca. Las genotecas de expresión pueden ser sondeadas con anticuerpos para fragmentos del receptor Zcytor19, u otros patrones de unión
específicos.

La presente invención proporciona adicionalmente polipéptidos y polinucleótidos contraparte de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, pero no están limitadas a mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. Tienen un interés particular los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de otras especies de mamíferos, incluyendo los polipéptidos murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos, y de otros primates. Los ortólogos de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 humanos se pueden clonar utilizando la información y las composiciones proporcionadas por la presente invención combinadas con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, se puede clonar un ADNc utilizando el ARNm obtenido de un tipo de tejido o célula que expresa zcyto20, zcyto21, y zcyto22 como se describe en la presente memoria. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden ser identificadas sondeando transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de secuencias descritas en la presente memoria. Después se prepara una genoteca a partir del ARNm de un tejido o una línea celular positivos. El ADNc que codifica zcyto20, zcyto21, y zcyto22 puede ser aislado mediante una variedad de métodos, tales como el sondeo con un ADNc humano completo o parcial o con uno o más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. También se puede clonar un ADNc utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullis, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.202), utilizando los cebadores diseñados a partir de la secuencia de zcyto20 humana representativa descrita en la presente memoria. En un método adicional, se puede utilizar la genoteca de ADNc para transformar o transfectar células anfitrionas, y se puede detectar la expresión del ADNc de interés con un anticuerpo para el polipéptido zcyto20, estudios de unión o análisis de la actividad. También se pueden aplicar técnicas similares al aislamiento de clones genómicos.

Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en los SEQ ID NOS: 1, 4 y 6, respectivamente, representan alelos individuales de las bandas de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 humanos, y que se espera que se produzcan la variación alélica y el empalme alternativo. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas sondeando las genotecas de ADNc o genómicas de diferentes individuos de acuerdo con los procedimientos normalizados. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN mostrada en el SEQ ID NO: 1, 4 y 6, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las cuales las mutaciones dan como resultado cambios de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como lo están las proteínas que son variantes alélicas del SEQ ID NO: 2, 5, y 7. Los ADNc generados a partir de ARNm empalmados alternativamente, que conservan las propiedades de los polipéptidos zcyto20, zcyto21, y zcyto22, están incluidos en el alcance de la presente invención, como lo están los polipéptidos codificados por tales ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias pueden ser clonadas sondeando genotecas de ADNc o genómicas de diferentes individuos o tejidos de acuerdo con los procedimientos normalizados conocidos en la técnica.

La presente invención también proporciona reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden utilizar los genes de zcyto20, zcyto21, y zcyto22, las sondas que comprenden ADN o ARN de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 o una subsecuencia de los mismos para determinar si el gen de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 está presente en un cromosoma humano, tal como el cromosoma 19, o si se ha producido una mutación génica. Zcyto20, zcyto21, y zcyto22 están localizados en la región q13.13 del cromosoma 19. Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen zcyto20, zcyto21, y zcyto22 incluyen, pero no están limitadas a, aneuploidía, cambios en el número de copias de genes, pérdida de heterogeneidad (LOH), translocaciones, inserciones, deleciones, cambios en los sitios de restricción y transposiciones. Tales aberraciones pueden ser detectadas utilizando los polinucleótidos de la presente invención empleando técnicas de genética molecular, tales como el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), el análisis de las repeticiones cortas en tándem (STR) empleando técnicas de PCR, y otros mecanismos de análisis de conexión genética conocidos en la técnica (Sambrook et al., ibid; Ausubel et al., ibid; Marian, Chest 108:255-65, 1995).

El conocimiento preciso de la posición de un gen puede ser útil para numerosos fines, incluyendo: 1) determinar si una secuencia es parte de un cóntigo existente y obtener secuencias genéticas circundantes adicionales de diversas formas, tales como YAC, BAC o clones de ADNc; 2) proporcionar un posible gen candidato para una enfermedad heredable que muestra conexión con la misma región cromosómica; y 3) realizar referencias cruzadas a organismos modelo, tales como ratón, que pueden ayudar a determinar qué función podría tener un gen concreto.

Por ejemplo, Delague et al., (Am. J. Hum. Genet. 67:236-243, 2000) identificaron que la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth está localizada en 19q13.1-13.3 (Delague et al., Am. J. Hum. Genet. 67:236-243, 2.000).

Un diagnóstico podría ayudar a los médicos a determinar el tipo de enfermedad y la terapia asociada apropiada, o ayudar en el asesoramiento genético. Como tales, se pueden utilizar los anticuerpos anti-zcyto20, los polinucleótidos, y los polipéptidos de la invención para la detección del polipéptido anti-zcyto20, el ARNm o los anticuerpos anti-zcyto20, que sirven de ese modo como marcadores y pueden ser utilizados directamente para detectar enfermedades genéticas o cánceres, como se describe en la presente memoria, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. Adicionalmente, se pueden utilizar sondas polinucleotídicas de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 para detectar anomalías o genotipos asociados con deleciones y translocaciones en el cromosoma 19q13.13 asociadas con enfermedades humanas u otras translocaciones implicadas en el progreso maligno de tumores u otras mutaciones de 19q13.13, que se espera que estén implicadas en transposiciones cromosómicas de malignidades; o en otros cánceres. De un modo similar, las sondas polinucleotídicas de zcyto20 pueden ser utilizadas para detectar anomalías o genotipos asociados con la trisomía del cromosoma19q13.13 y la pérdida del cromosoma asociada con enfermedades humanas o el aborto espontáneo. De este modo, se pueden utilizar sondas polinucleotídicas de zcyto20, zcyto21 y zcyto22 para detectar anomalías o genotipos asociados con estos defectos.

En general, los métodos de diagnóstico utilizados en el análisis de conexión genética, para detectar una anomalía genética o una aberración en un paciente, son conocidos en la técnica. Las sondas analíticas tendrán generalmente una longitud de al menos 20 nt, aunque se pueden utilizar sondas algo más cortas (p. ej., 14-17 nt). Los cebadores de PCR tienen una longitud de al menos 5 nt, preferiblemente 15 nt o más, más preferiblemente 20-30 nt. Para el análisis grosero de los genes, o del ADN cromosómico, una sonda polinucleotídica de zcyt020 puede comprender un exón completo o más. Los exones son fácilmente determinados por un experto en la técnica comparando las secuencias de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 (SEQ ID NOS: 1, 4 y 6, respectivamente) con el ADN genómico para zyto20, zcyto21, y zcyto22. En general, los métodos de diagnóstico utilizados en el análisis de conexión genética, para detectar una anomalía genética o una aberración en un paciente, son conocidos en la técnica. La mayoría de los métodos de diagnóstico comprenden las etapas de (a) obtener una muestra genética de un paciente potencialmente enfermo, un paciente enfermo o un potencial portador no enfermo de un alelo de enfermedad recesiva; (b) producir un primer producto de reacción incubando la muestra genética con una sonda polinucleotídica de zcyto20 donde el polinucleótido hibridará con una secuencia polinucleotídica complementaria, por ejemplo en el análisis de RFLP o incubando la muestra genética con cebadores efectores o antisentido en una reacción de PCR en condiciones de reacción de PCR apropiadas; (iii) Visualizar el primer producto de reacción mediante electroforesis en gel y/u otro método conocido por ejemplo visualizando el primer producto de reacción con una sonda polinucleótidica de zcyto20 donde el polinucleótido hibridará con la correspondiente secuencia polinucleotídica complementaria de la primera reacción, y (iv) comparar el primer producto de reacción visualizado con el segundo producto de reacción de control de una muestra genética de un paciente de tipo salvaje. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control es indicativa de una anomalía genética en el paciente enfermo o potencialmente enfermo, o la presencia de un fenotipo portador recesivo heterocigoto para un paciente no enfermo, o la presencia de un defecto genético en un tumor de un paciente enfermo, o la presencia de una anomalía genética en un feto o embrión preimplantado. Por ejemplo, una diferencia en el patrón del fragmento de restricción, la longitud de los productos de la PCR, la longitud de las secuencias repetitivas en el locus genético zcyto20, y similares, son indicativas de una anomalía genética, una aberración genética, o una diferencia alélica en comparación con el control de tipo salvaje normal. Los controles pueden ser de miembros no afectados de la familia, o individuos no relacionados, dependiendo del ensayo y de la disponibilidad de muestras. Las muestras genéticas para su uso en la presente invención incluyen ADN genómico, ARNm, y ADNc aislado de cualquier tejido u otra muestra biológica de un paciente, tal como pero no limitada a, sangre, saliva, semen, células embrionarias, fluido amniótico, y similares. La sonda polinucleotídica o cebador puede ser ADN o ARN, y comprenderá una porción del SEQ ID NO: 1, el complemento del SEQ ID NO: 1,o un ARN equivalente del mismo. Tales métodos de demostración del análisis de conexión genética para fenotipos de enfermedades humanas son bien conocidos en la técnica. Para una referencia a los métodos basados en la PCR en los diagnósticos véase, en general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (Ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).

Las mutaciones asociadas con el locus zcyto20, zcyto21, y zcyto22 pueden ser detectadas utilizando moléculas de ácido nucleico de la presente invención empleando métodos normalizados para el análisis de las mutaciones directas, tales como el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, el análisis de las repeticiones cortas en tándem utilizando técnicas de PCR, el análisis de amplificación refractaria del sistema de mutaciones, detección del polimorfismo de la conformación de la hebra sencilla, métodos de escisión con ARNasa, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, análisis de emparejamientos erróneos asistido por fluorescencia, y otros mecanismos de análisis genético conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al., (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley and Sons 1998), y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing", en Principles of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)). El análisis directo de un gen zcyto20 en cuanto a una mutación se puede realizar utilizando el ADN genómico de un sujeto. Los métodos para amplificar el ADN genómico, obtenido por ejemplo de linfocitos de sangre periférica, son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Dracopoli et al., (eds.), Current Protocols in Human Genetics, en las páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley and Sons 1998)).

En las realizaciones de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican zcyto20 aislado pueden hibridar en condiciones restrictivas con moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1, con las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO: 1, o con las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria al SEQ ID NO: 1. En general, se seleccionan las condiciones restrictivas para que sean alrededor de 5ºC más bajas que el punto de fusión térmico (T_{m}) para una secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La T_{m} es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente emparejada. En las realizaciones de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican zcyto22 pueden hibridar en condiciones restrictivas con moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 6, con moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO: 6, o con moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria al SEQ ID NO: 6.

Un par de moléculas de ácido nucleico, tales como ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN, pueden hibridar si las secuencias de nucleótidos tienen cierto grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases emparejados erróneamente en la doble hélice, pero la estabilidad de los híbridos está influenciada por el grado de emparejamientos erróneos. La T_{m} del híbrido con emparejamientos erróneos disminuye 1ºC cada 1-1,5% de pares de bases emparejados erróneamente. La variación de la restricción de las condiciones de hibridación permite el control sobre el grado de emparejamientos erróneos que estará presente en el híbrido. El grado de restricción aumenta a medida que la temperatura de hibridación aumenta y la fuerza iónica del tampón de hibridación disminuye.

Está dentro de las capacidades del experto en la técnica adaptar estas condiciones para su uso con un híbrido polinucleotídico concreto. La T_{m} para una secuencia diana específica es la temperatura (en las condiciones definidas) a la cual el 50% de la secuencia diana hibridará con una secuencia de la sonda perfectamente emparejada. Aquellas condiciones que influyen en la T_{m} incluyen, el tamaño y el contenido de pares de bases de la sonda polinucleotídica, la fuerza iónica de la solución de hibridación, y la presencia de agentes desestabilizantes en la solución de hibridación. Se conocen en la técnica numerosas ecuaciones para calcular la T_{m}, y son específicas para los híbridos de ADN, ARN, y ADN-ARN y para secuencias de sondas polinucleotídicas de longitud variable (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). El soporte lógico de análisis de la secuencia tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), así como los sitios de Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular la T_{m} basándose en criterios definidos por el usuario. Tales programas también pueden analizar una secuencia dada en las condiciones definidas e identificar secuencias de sondas adecuadas. Típicamente, la hibridación de secuencias polinucleotídicas más largas, >50 pares de bases, se realiza a temperaturas de alrededor de 20-25ºC por debajo de la T_{m} calculada. Para sondas más pequeñas, <50 pares de bases, la hibridación se lleva a cabo típicamente a una T_{m} de 5-10ºC por debajo de la T_{m} calculada. Esto permite la máxima velocidad de hibridación para los híbridos ADN-ADN y ADN-ARN.

Tras la hibridación, las moléculas de ácido nucleico se pueden lavar para separar las moléculas de ácido nucleico que no han hibridado en condiciones restrictivas, o en condiciones altamente restrictivas. Las condiciones de lavado restrictivas típicas incluyen el lavado en una solución de 0,5x - 2x SSC con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 55-65ºC. Esto es, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21 y zcyto22 variantes hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, y 6, respectivamente (o su complemento) en condiciones de lavado restrictivas, en las cuales la restricción del lavado es equivalente a 0,5x - 2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC, incluyendo 0,5x SSC con SDS al 0,1% a 55ºC, o 2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC. Un experto en la técnica puede idear fácilmente condiciones equivalentes, por ejemplo, sustituyendo SSPE por SSC en la solución de lavado.

Las condiciones de lavado altamente restrictivas típicas incluyen el lavado en una solución de 0,1x - 0,2x SSC con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 50-65ºC. En otras palabras, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido zcyto 20 variante hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 (o su complemento) en condiciones de lavado altamente restrictivas, en las cuales la restricción del lavado es equivalente a 0,1x - 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC, incluyendo 0,1 x SSC con SDS al 0,1% a 50ºC, o 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC.

La presente invención también proporciona polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24y zcyto25 aislados que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar con los polipéptidos de los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11, respectivamente, o sus ortólogos. El término "identidad de secuencia sustancialmente similar" se utiliza en la presente memoria para indicar polipéptidos que comprenden una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o más del 95% con las secuencias mostradas en los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11, respectivamente, o sus ortólogos. La presente invención también incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más del 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la secuencia de restos aminoácido 1 a 205 o 21 a 205 del SEQ ID NO: 2 o el SEQ ID NO: 7. La presente invención incluye adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad se describen más abajo.

La presente invención también contempla moléculas de ácido nucleico de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 variantes que pueden ser identificadas utilizando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado por la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11, respectivamente, y/o un análisis de hibridación, como se ha descrito antes. Tales variantes de zcyto20 incluyen moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, respectivamente (o su complemento) en condiciones de lavado restrictivas, en las cuales la restricción del lavado es equivalente a 0,5x - 2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC; o (2) que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Alternativamente, las variantes de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser caracterizadas como moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, respectivamente (o su complemento) en condiciones de lavado altamente restrictivas, en las cuales la restricción del lavado es equivalente a 0,1x - 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC; y (2) que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% con la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11, respectivamente.

El porcentaje de identidad de la secuencia se determina mediante métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Brevemente, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar las puntuaciones de alineamiento utilizando una penalización de apertura del espacio de 10, una penalidad de ampliación del espacio de 1, y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ídem.) como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos están indicados por los códigos de una letra normalizados).

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5

TABLA 5

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500

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Los expertos en la técnica apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria y la secuencia de aminoácidos de un supuesto zcyto20 variante. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth Enzymol. 183:63 (1990).

En resumen, FASTA caracteriza primero la similitud de secuencia identificando las regiones compartidas por la secuencia problema (p. ej., SEQ ID NO: 2) y una secuencia de ensayo que tienen la mayor densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup= 2), sin considerar sustituciones de aminoácidos conservativas, inserciones, o deleciones. La diez regiones con la mayor densidad de identidades son restauradas después comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados utilizando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones son "recortados" para que incluyan solamente aquellos restos que contribuyen a la puntuación más alta. Si existen numerosas regiones con puntuaciones mayores que el valor de "corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si las regiones pueden ser reunidas para formar un alineamiento aproximado con espacios. Finalmente, las regiones de puntuación más elevada de las dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalización de apertura del espacio = 10, penalización de ampliación del espacio = 1, y matriz de sustitución = BLOSUM62. Estos parámetros pueden ser introducidos en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de Meth. Enzymol. 183:63 (1990) de Pearson.

También se puede utilizar FASTA para determinar la identidad de secuencia de las moléculas de ácido nucleico utilizando una proporción como se ha descrito antes. Para las comparaciones de las secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede oscilar entre uno y seis, preferiblemente entre tres y seis, muy preferiblemente tres, con los otros parámetros ajustados por defecto.

Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, y zcyto22 variantes o los polipéptidos con una identidad de secuencia sustancialmente similar se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, esto es sustituciones de aminoácidos conservativas (véase la Tabla 5) y otras sustituciones que no afectan significativamente al plegamiento o la actividad del polipéptido; pequeñas deleciones, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y prolongaciones amino y carboxilo terminales, tales como un resto metionina amino terminal, un péptido conector pequeño de hasta alrededor de 20-25 restos, o una etiqueta de afinidad. La presente invención incluye de este modo polipéptidos de alrededor de 154 a 235 restos aminoácido que comprenden una secuencia que es idéntica al menos en 70%, preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la correspondiente región del SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad pueden comprender adicionalmente un sitio de escisión proteolítica entre el polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y la etiqueta de afinidad. Los sitios preferidos de tales sitios incluyen sitios de escisión de trombina y sitios de escisión del factor Xa.

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TABLA 6 Sustituciones conservativas de aminoácidos

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Se puede efectuar la determinación de los restos aminoácido que comprenden regiones o dominios que son críticos para mantener la integridad estructural. En estas regiones se pueden determinar los restos específicos que serán más o menos tolerantes al cambio y mantener la estructura terciaria global de la molécula. Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen, pero no están limitados al alineamiento de secuencias múltiples con una elevada identidad de aminoácidos o nucleótidos, las propensiones de la estructura secundaria, los patrones binarios, el empaquetamiento complementario y las interacciones polares ocultas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). En general, cuando se diseñan modificaciones de moléculas o se identifican fragmentos específicos, la determinación de la estructura estará acompañada de la evaluación de la actividad de las moléculas modificadas.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos se realizan en los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 con el fin de minimizar la desorganización de la estructura de odren superior esencial para la actividad biológica. Por ejemplo, cuando el polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 comprende una o más hélices, se realizarán cambios en los restos aminoacido con el fin de no desorganizar la geometría de la hélice y otros componentes de la molécula en los que los cambios de conformación reducen alguna función crítica, por ejemplo, la unión de la molécula a sus compañeros de unión. Los efectos de los cambios en la secuencia de aminoácidos se pueden pronosticar, por ejemplo, mediante modelado por ordenador como se ha descrito antes o determinar mediante análisis de la estructura cristalina (véase, p. ej., Lapthorn et al., Nat. Sruct. Biol. 2:266-268, 1995). Otros mecanismos que son bien conocidos en la técnica comparan el plegamiento de una proteína variante con una molécula normalizada (p. ej., la proteína nativa). Por ejemplo, se puede realizar la comparación con el patrón de cisteína en las moléculas variante y normalizada. La espectrometría de masas y la modificación química utilizando reducción y alquilación proporcionan métodos para determinar los restos cisteína que están asociados con enlaces disulfuro o están libres de tales asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226,1992; Gray Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; y Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Generalmente se cree que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de cisteína que la molécula normalizada el plegamiento se verá afectado. Otro método bien conocido y aceptado para medir el plegamiento es el dicroismo circular (CD). La medida y la comparación de los espectros de CD generados por una molécula modificada y una molécula normalizada son una rutina (Johnson, Proteins 7:205-214,1990). La cristalografía es otro método bien conocido para analizar el plegamiento y la estructura. La resonancia magnética nuclear (RMN), el mapeo digestivo de péptidos y el mapeo de epítopos también son métodos conocidos para analizar el plegamiento y las similitudes estructurales entre proteínas y polipéptidos (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992).

Se puede generar un perfil del carácter hidrófilo de Hopp/Woods de la secuencia de la proteína zcyto20 que se muestra en el SEQ ID NO: 2 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana corrediza de seis restos. Los restos G, S, y T ocultos y los restos H, Y, y W expuestos se ignoraron. Por ejemplo, en zcyto20, las regiones hidrofílicas incluyen los restos aminoácido 169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 54 (Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 53 (Phe) a 58 (Asp) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys) del SEQ ID NO: 2, y los restos aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del SEQ ID NO: 2.

Se puede generar un perfil del carácter hidrófilo Hopp/Woods de la secuencia de la proteína zcyto22 que se muestra en el SEQ ID NO: 7 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828,1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana corrediza de seis restos. Los restos G, S, y T ocultos y los restos H, Y, y W expuestos se ignoraron. Por ejemplo, en zcyto22, las regiones hidrófilas incluyen los restos aminoácido 169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 54 (Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 53 (Phe) a 58 (Asp) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys) del SEQ ID NO: 7, y los restos aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del SEQ ID NO: 7.

Los expertos en la técnica reconocerán que el carácter hidrófilo o el carácter hidrófobo se tomarán en consideración cuando se diseñen modificaciones de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, con el fin de no desorganizar la estructura global y el perfil biológico. Son de particular interés para la sustitución los restos hidrófobos seleccionados del grupo que consiste en Val, Leu e Ile o el grupo que consiste en Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp.

Las identidades de los aminoácidos esenciales también son inferidas del análisis de similitud de la secuencia entre IFN-\alpha y los miembros de la familia de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 (como se muestra en las Tablas 1 y 2). Utilizando métodos tales como el análisis "FASTA" descrito previamente, se identifican regiones de elevada similitud dentro de una familia de proteínas y se utilizan para analizar secuencias de aminoácidos para regiones conservadas. Un enfoque alternativo para identificar un polinucleótido variante basándose en la estructura consiste en determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto 25 variante potencial puede hibridar con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, o 10 mencionados antes.

Otros métodos de identificación de aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención son los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498 (1991)), Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada resto de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se someten a ensayo en cuanto a la actividad biológica o bioquímica como se describe más abajo para identificar los restos aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).

La presente invención también incluye los fragmentos funcionales de los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 y las moléculas de ácido nucleico que codifican tales fragmentos funcionales. Un zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 funcional o un fragmento del mismo según se define en la presente memoria se caracteriza por su actividad proliferativa o diferenciadora, por su capacidad para inducir o inhibir funciones celulares especializadas, o por su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti- zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 o al receptor zcytor19 (ya sea soluble o inmovilizado). Como se ha descrito previamente en la presente memoria, los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 se caracterizan por un haz de seis hélices. De este modo, la presente invención proporciona adicionalmente proteínas de fusión que abarcan: (a) moléculas polipeptídicas que comprenden una o más de las hélices descritas antes; y (b) fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas hélices. La otra porción polipeptídica de la proteína de fusión puede ser aportada por otra citoquina o interferón del haz helicoidal, tal como INF-\alpha, o por un péptido señal secretor no nativo y/o no relacionado que facilita la secreción de la proteína de fusión.

Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 de la presente invención, incluyendo los polipéptidos completos, los fragmentos biológicamente activos, y los polipéptidos de fusión pueden ser producidos de acuerdo con las técnicas convencionales utilizando células en las que se ha introducido un vector de expresión que codifica el polipéptido. Según se utiliza en la presente memoria, las "células en las cuales se ha introducido un vector de expresión" incluyen tanto células que han sido manipuladas directamente mediante la introducción de moléculas de ADN exógeno como la progenie de las mismas que contienen el ADN introducido. Las células anfitrionas adecuadas son aquellos tipos de células que pueden ser transformados o transfectados con ADN exógeno y desarrolladas en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas, y células eucarióticas superiores cultivadas. Las técnicas para la manipulación de moléculas de ADN clonadas y la introducción de ADN exógeno en una variedad de células anfitrionas son descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 está conectada operablemente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo generalmente un promotor de la transcripción y un terminador, dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que en ciertos sistemas se pueden proporcionar marcadores seleccionables en vectores separados, y se puede proporcionar la replicación del ADN exógeno mediante la integración en el genoma de la célula anfitriona. La selección de los promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño rutinario dentro del nivel del experto en la técnica. Muchos de tales elementos se describen en la literatura y son asequibles por medio de proveedores comerciales.

Para dirigir un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 a la ruta secretora de una célula anfitriona, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) al vector de expresión. La secuencia señal secretora puede ser la de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25, o puede derivar de otra proteína secretada (p. ej., t-PA; véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.641.655) o ser sintetizada de novo. La secuencia señal secretora está conectada operablemente a la secuencia de ADN de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25, esto es, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se sitúan para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la ruta secretora de la célula anfitriona. Las secuencias de la señal secretora se sitúan comúnmente 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal se pueden situar en cualquier parte de la secuencia de ADN de interés (véase, p. ej., Welch et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.037.743; Holland et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.143.830).

En la presente invención se pueden utilizar células de mamífero cultivadas como anfitriones. Los métodos para introducir ADN exógeno en las células anfitrionas de mamífero incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725,1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603,1981; Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), la electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), la transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ídem), y la transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas es descrita, por ejemplo, por Levinson et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 4.713.339; Hagen et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.784.950; Palmiter et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.579.821; y Ringold, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.656.134. Las células de mamífero adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC Núm. CRL 1650=, COS-7 (ATCC Núm. CRL 1651), BHK (ATCC Núm. CRL 1632), BHK 570 (ATCC Núm. CRL 10314), 293 (ATCC Núm. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y de ovario de hámster Chino (p. ej., CHO-K1, ATCC Núm. CCL 61; o CHO DG44, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986). Se conocen líneas celulares adecuadas adicionales en la técnica y se encuentran disponibles de depósitos públicos tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Mannasas, VA. En general, se prefieren promotores de la transcripción fuertes, tales como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase, p. ej. la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de la metalotioneína (Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío principal de adenovirus. Los vectores de expresión para su uso en células de mamífero incluyen pZP-1 y pZP-9, que han sido depositados en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Mannasas, VA USA con los números de acceso 98669 y 98668, respectivamente, y los derivados de los mismos.

Generalmente se utiliza la selección con fármacos para seleccionar células de mamífero cultivadas en las cuales se ha insertado ADN foráneo. Tales células son referidas comúnmente como "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie son referidas como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar. También se pueden utilizar sistemas de selección para incrementar el nivel de expresión del gen de interés, un procedimiento referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes y aumentando después la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen elevados niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También se pueden utilizar otros genes de resistencia a fármacos (p. ej., resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicin acetiltransferasa).

El sistema de adenovirus también puede ser utilizado para la producción de proteína in vitro. Cultivando células 293 no infectadas con adenovirus en condiciones en las que las células no se dividen rápidamente, las células pueden producir proteínas durante períodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, se hacen crecer células BHK hasta la confluencia en factorías de células, después se exponen al vector adenoviral que codifica la proteína secretada de interés. Luego se hacen crecer las células en condiciones sin suero, lo que permite sobrevivir durante varias semanas a las células infectadas sin una división celular significativa. En un método alternativo, las células 293 infectadas con el vector de adenovirus se pueden hacer crecer como células adherentes o en un cultivo en suspensión a una densidad celular relativamente elevada para producir cantidades significativas de proteína (Véase Garnier et al., Cytotechnol. 15:145-55, 1994). Con cualquier protocolo, se puede aislar repetidamente una proteína heteróloga secretada, expresada del sobrenadante del cultivo celular, producto lisado, o fracciones de membrana dependiendo de la disposición de la proteína expresada en la célula. En el protocolo de producción de células 293 infectadas, también se pueden obtener eficazmente proteínas no secretadas.

Se pueden infectar células de insecto con baculovirus recombinante, comúnmente derivado del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. En un método preferido, el baculovirus recombinante es producido por medio del uso de un sistema basado en transposones descrito por Luckow et al., (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, es asequible comercialmente en forma de kit (kit Bac-to-Bac®; Life Technologies, Rockville, MD). El vector de transferencia (p. ej., pFastBac1®, Life Technologies) contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica la proteína de interés a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande denominado "bácmido". Véase, Hill-Perkins y Posee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Boonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en marco con un ADN que codifica una prolongación del polipéptido o una etiqueta de afinidad como se ha descrito antes. Utilizando mecanismos conocidos en la técnica, un vector de transferencia que contiene una secuencia codificadora de zcyto20, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 es transformado en células anfitrionas de E. coli, y las células son escrutadas en cuanto a los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo del baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante es aislado, utilizando técnicas comunes, y utilizado para transfectar células de Spodoptera frugiperda, tales como células Sf9. Con posterioridad se produce el virus recombinante que expresa la proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25. Las soluciones de partida virales recombinantes se elaboran mediante métodos utilizados comúnmente en la técnica.

Para la producción de proteína, se utiliza el virus recombinante para infectar las células anfitrionas, típicamente una línea celular derivada de gusano cogollero Spodoptera frugiperda (p. ej., células Sf9 o Sf21) o Trichloplusia ni (p. ej., células High Five®; Invitrogen, Carlsbad, CA). Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.300.435. Se utilizan medios libres de suero para hacer crecer y mantener las células. Las formulaciones de medio adecuadas son conocidas en la técnica y se pueden obtener de proveedores comerciales. Las células se hacen crecer desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células a una densidad de 1-2 x 10^{6} células, momento en el cual se añade una solución de partida de virus recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 1,0, más típicamente cerca de 3. Los procedimientos utilizados son generalmente conocidos en la técnica.

También se pueden utilizar como anfitriones otras células eucarióticas superiores, incluyendo células vegetales y células de aves. El uso de Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58,1987.

Las células fúngicas, incluyendo las células de levadura, también pueden ser utilizadas en la presente invención. Las especies de levadura de particular interés en este aspecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica. Los métodos para transformar las células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de ellas son descritos, por ejemplo, por Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.599.311; Kawasaki et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.931.373; Brake, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.870.008; Welch et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.037.743; y Murray et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente de resistencia a fármacos o por la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente concreto (p. ej., leucina). Un sistema vector preferido para su uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POTI descrito por Kawasaki et al. (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas mediante el crecimiento en medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para su uso en levadura incluyen aquellos de genes de enzimas glicolíticas (véase, p. ej., Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.599.311; Kingsman et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.615.974; Y Bitter, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse también las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schyzosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.882.279; y Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. Se pueden utilizar células de Aspergillus de acuerdo con los métodos de McKnight et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum son descritos por Sumino et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora son descritos por Lambowitz, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.486.533. La producción de proteínas recombinantes en Pichia methanolica se describe en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.716.808, 5.736.383, 5.854.039, y 5.888.768.

Las células procarióticas, incluyendo las cepas de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y otros géneros también son útiles en la presente invención. Los mecanismos para transformar estos anfitriones y expresar las secuencias de ADN foráneo clonadas en ellos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al., ídem). Cuando se expresa un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en una bacteria tal como E. coli, el polipéptido puede ser conservado en el citoplasma, típicamente en forma de gránulos insolubles, o puede ser dirigido al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células son lisadas, y los gránulos son recuperados y desnaturalizados utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede ser replegado después y dimerizado diluyendo el desnaturalizante, por ejemplo mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a una solución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido puede ser recuperado del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional desorganizando las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando de ese modo la necesidad de desnaturalización y replegamiento.

Las células anfitrionas transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células anfitrionas seleccionadas. Una variedad de medios adecuados, incluyendo medios definidos y medios complejos, son conocidos en la técnica e incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento seleccionará generalmente células que contienen el ADN añadido exógenamente, por ejemplo, mediante selección con fármacos o deficiencia en un nutriente esencial que es complementada por el marcador seleccionable portado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula anfitriona. Los cultivos líquidos son proporcionados con aireación suficiente mediante métodos convencionales, tales como sacudimiento de matraces pequeños o purgado de fermentadores.

Se prefiere purificar los polipéptidos y proteínas de la presente invención a una pureza \geq80%, más preferiblemente una pureza \geq 90%, incluso más preferiblemente una pureza \geq95%, y es particularmente preferido un estado farmacéuticamente puro, que es de una pureza mayor de 99,9% con respecto a las macromoléculas contaminantes, concretamente otras proteínas y ácidos nucleicos, libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido o proteína purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos o proteínas, concretamente aquellos de origen animal.

Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 recombinantes expresadas (incluyendo los polipéptidos quiméricos y las proteínas multiméricas) son purificadas mediante métodos de purificación de proteínas convencionales, típicamente por medio de una combinación de técnicas cromatográficas. Véanse, en general, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988; y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994. Las proteínas que comprenden una etiqueta de afinidad de polihistidina (típicamente aproximadamente 6 restos histidina) son purificadas mediante cromatografía de afinidad sobre una resina de quelato de níquel. Véase, por ejemplo, Houchuli et al., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988. Las proteínas que comprenden una etiqueta glu-glu pueden ser purificadas mediante cromatografía de inmunoafinidad de acuerdo con los procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Grussenmeyer et al., ídem. Las fusiones de proteínas que se unen a maltosa se purifican sobre una columna de amilosa de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.

Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 también se pueden preparar por medio de síntesis química de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, incluyendo la síntesis en fase sólida exclusiva, los métodos en fase sólida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis en solución clásica. Véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2ª edición), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984; Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; y Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989. La síntesis in vitro es particularmente ventajosa para la preparación de polipéptidos más pequeños.

Utilizando los métodos conocidos en la técnica, se pueden preparar las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en forma de monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden incluir o no un resto aminoácido metionina inicial.

Las células diana para el uso en análisis de actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 incluyen, sin limitación, células vasculares (especialmente células endoteliales y células de la musculatura lisa), células hematopoyéticas (mieloides y linfoides), células hepáticas (incluyendo hepatocitos, células endoteliales fenestradas, células Kupffer, células Ito), fibroblastos (incluyendo fibroblastos dérmicos humanos y fibroblastos de pulmón), células pulmonares fetales, sinoviocitos articulares, pericitos, condriocitos, osteoblastos, y células epiteliales de próstata. Las células endoteliales y hematopoyéticas derivan de una célula ancestral común, el hemangioblasto (Choi et al., Development 125:725-732, 1998).

Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de la presente invención se caracterizan por su actividad, esto es, la modulación de la proliferación, diferenciación, migración, adherencia, o metabolismo de los tipos de células sensibles. La actividad biológica de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se analiza utilizando análisis in vitro o in vivo diseñados para detectar la proliferación, diferenciación, migración o adherencia celular; o los cambios en el metabolismo celular (p. ej., la producción de otros factores de crecimiento u otras macromoléculas). Muchos análisis adecuados son conocidos en la técnica, y los análisis representativos se describen en la presente memoria. Los análisis que utilizan células cultivadas son los más convenientes para el escrutinio, por ejemplo para determinar los efectos de las sustituciones, deleciones, o inserciones de aminoácidos. Sin embargo, a la vista de la complejidad de los procesos evolutivos (por ejemplo, angiogénesis, curación de heridas), generalmente se emplearán análisis in vivo para confirmar y caracterizar adicionalmente la actividad biológica. Ciertos modelos in vitro, tales como el modelo de la matriz de gel de colágeno tridimensional de Pepper et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 189:824-831, 1992), son suficientemente complejos para analizar los efectos histológicos. Los análisis se pueden realizar utilizando proteínas producidas exógenamente, o se pueden llevar a cabo in vivo o in vitro utilizando células que expresan el polipéptido o los polipéptidos de interés. Los análisis se pueden realizar utilizando las proteínas zcyto20 solas o combinadas con otros factores de crecimiento, tales como miembros de la familia de VEGF o citoquinas hematopoyéticas (p. ej., EPO, TPO, G-CSF, factor de células pluripotenciales). Los análisis representativos se describen más abajo.

La actividad de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se puede medir in vitro utilizando células cultivadas o in vivo administrando las moléculas de la invención reivindicada a un modelo animal apropiado. Los análisis que miden la proliferación o la diferenciación celular son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los análisis que miden la proliferación incluyen análisis tales como la quimiosensibilidad al colorante rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990), la incorporación de nucleótidos radiomarcados (como describen, p. ej., Raines y Ross, Methods Enzymol. 109:749-773, 1985; Wahl et al., Mol. Cell. Biol. 8:5016-5025, 1988; y Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989), la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el ADN de las células en proliferación (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988). La diferenciación se puede analizar utilizando células precursoras adecuadas que pueden ser inducidas a diferenciarse a un fenotipo mas maduro. Los análisis que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, medir los marcadores de la superficie celular asociados con la expresión específica de la fase de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todos incorporados en la presente memoria como referencia).

La actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 también puede ser detectada utilizando análisis diseñados para medir la producción inducida por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de uno o más factores de crecimiento adicionales u otras macromoléculas. Semejantes análisis preferidos incluyen aquellos para determinar la presencia del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento transformante alfa (TGF\alpha), la interleuquina-6 (IL-6), el VEGF, el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), la angiogenina, y otras macromoléculas producidas por el hígado. Los análisis adecuados incluyen análisis de mitogénesis que utilizan células diana sensibles a la macromolécula de interés, análisis de unión a receptores, análisis de unión competitiva, análisis inmunológicos (p. ej., ELISA), y otros formatos conocidos en la técnica. La secreción de metaloproteasa se mide a partir de fibroblastos dérmicos humanos primarios, sinoviocitos y condriocitos tratados. Los niveles relativos de colagenasa, gelatinasa y estromalisina producidos en respuesta al cultivo en presencia de una proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se mide utilizando geles para zimogramas (Loita y Stetler-Stevenson, Cancer Biology 1:96-106, 1990). La síntesis de procolágeno/colágeno por fibroblastos dérmicos y condriocitos en respuesta a una proteína de ensayo se mide utilizando la incorporación de prolina-H^{3} a colágeno naciente secretado. El colágeno marcado con H^{3} se visualiza mediante SDS-PAGE seguido de autorradiografía (Unemori y Amento, J. Biol. Chem. 265: 10681-10685, 1990). La secreción de glicosaminoglicano (GAG) a partir de fibroblastos dérmicos y condriocitos se mide utilizando un análisis de unión a colorante azul de 1,9-dimetilmetileno (Farndale et al., Biochim. Biophys. Acta 883:173-177, 1986). Los análisis de colágeno y GAF también se llevan a cabo en presencia de IL-1\alpha o TGF-\alpha para examinar la capacidad de la proteína zcyto20 para modificar las respuestas establecidas a estas citoquinas.

Se ha demostrado que ciertos miembros de la familia de proteínas que comprenden zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 incrementan el número de monocitos circulantes in vivo. La activación de los monocitos es importante tanto en la inmunidad innata como adaptativa. Por ejemplo, se ha demostrado que la activación de los monocitos estimula la presentación de antígenos por diversos mecanismos. La presentación de antígenos promueve la activación y la proliferación de las células T, tanto células T citotóxicas como coadyuvantes. La maduración y activación de las células dendríticas también promueve la activación de las células T y la inmunidad tanto innata como adaptativa. También se ha demostrado que los incrementos de monocitos y macrófagos activados aumentan la actividad citolítica. Por lo tanto, zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 serán útiles como agentes anti-infecciosos, potenciando las respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales, innatas. Se observaron incrementos en la tinción ICAM en monocitos CD14+ sugiriendo que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 juegan un papel en la activación de los monocitos. Si bien los datos muestran que los miembros de la familia promueven una respuesta anti-viral frente a los virus, también pueden resultar afectados las bacterias y los parásitos.

Los análisis de activación de monocitos se llevan a cabo (1) para observar la capacidad de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para estimular adicionalmente la activación de monocitos, y (2) para examinar la capacidad de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para modular la activación de monocitos inducida por el anclaje o inducida por endotoxinas (Fuhlbrigge et al., J. Immunol. 138: 3799-3802, 1987). Los niveles de IL-1\alpha y TNF\alpha producidos en respuesta a la activación se miden mediante ELISA (Biosource, Inc. Camarillo, Ca.). Las células monocitos/macrófagos, en virtud de CD14 (receptor de LPS), son exquisitamente sensibles a endotoxina, y a las proteínas con niveles moderados de actividad de tipo endotoxina activarán estas células.

El incremento de los niveles de monocitos sugiere que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden tener un efecto directo sobre las células progenitoras mieloides en la médula ósea. El aumento de la diferenciación de las células progenitoras mieloides en monocitos es esencial en la restauración de la inmunocompetencia, por ejemplo, después de la quimioterapia. De este modo, la administración de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 a pacientes que reciben quimioterapia podría promover su recuperación y capacidad para resistir la infección comúnmente asociada con los regímenes de quimioterapia. De este modo, los métodos para ampliar el número de monocitos o células progenitoras de monocitos o bien cultivando médula ósea o bien células de sangre periférica con las moléculas de la presente invención de manera que haya un incremento en los monocitos o en las células progenitoras de monocitos para lograr este efecto in vitro o ex vivo. La presente invención también proporciona la administración in vivo de las moléculas de la presente invención a un mamífero que necesita un aumento de monocitos o células progenitoras de monocitos. El incremento de monocitos o células progenitoras de monocitos se puede medir utilizando los métodos bien conocidos por los médicos clínicos, médicos, y otras personas expertas en la técnica. Las células monocíticas están incluidas en el linaje mieloide de las células hematopoyéticas, por tanto afectan a otras células ya que el linaje no sería inusual. Por ejemplo, cuando un factor facilita la diferenciación o la proliferación de un tipo de célula al linaje mieloide o linfoide, puede afectar a la producción de otras células con un progenitor o célula pluripotencial
común.

La actividad hematopoyética de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 puede ser analizada sobre diversas células hematopoyéticas en cultivo. Los análisis preferidos incluyen análisis de colonias de médula ósea primaria y análisis de colonias de linaje restringido en fase tardía, que son conocidos en la técnica (p. ej., Holly et al., Publicación WIPO WO 95/21920). Las células de médula ósea cultivadas sobre un medio semi-sólido adecuado (p. ej., metilcelulosa al 50% que contiene suero bovino fetal al 15%, seralbúmina bovina al 10%, y mezcla de antibiótico PSN al 0,6%) se incuban en presencia de polipéptido de ensayo, después se examinan microscópicamente en cuanto a la formación de colonias. Los factores hematopoyéticos conocidos se utilizan como controles. La actividad mitogénica de los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sobre las líneas celulares hematopoyéticas se pueden medir como se ha descrito antes.

La migración celular se analiza esencialmente como describen Kahler et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17:932-939, 1997). Se considera que una proteína es quimiotáctica si induce la migración de células desde una zona de baja concentración de proteína a una zona de elevada concentración de proteína. Un análisis típico se realiza utilizando cámaras Boyden modificadas con una membrana de poliestireno que separa las dos cámaras (Transwell; Corning Costar Corp.). La muestra de ensayo, diluida en medio que contiene BSA al 1%, se añade a la cámara inferior de una placa de 24 pocillos que contiene Transwells. Las células se colocan después sobre el inserto Transwell que ha sido pretratado con gelatina al 0,2%. La migración celular se mide después de 4 horas de incubación a 37ºC. Las células que no migran se limpian de la parte superior de la membrana Transwell, y las células ancladas a la cara inferior de la membrana se fijan y se tiñen con violeta cristal al 0,1%. Las células teñidas se extraen después con ácido acético al 10% y se mide la absorbancia a 600 nm. Después se calcula la migración a partir de la curva de calibrado. La migración celular también se puede medir utilizando el método Matrigel de Grant et al. ("Angiogenesis as a component of epithelial-mesenchymal interactions" en Goldberg y Rosen, Epithelial-Mesenchymal Interaction in Cancer, Birkhäuser Verlag, 1995, 235-248; Baatout, Anticancer Research 17:451-456, 1997).

La actividad de adherencia celular se analiza esencialmente como describen LaFleur et al. (J. Biol. Chem. 272:
32798-32803, 1997). Brevemente, se cubren placas de microtitulación con la proteína de ensayo, los sitios no específicos se bloquean con BSA, y las células (tales como células de musculatura lisa, leucocitos, o células endoteliales) se cultivan en placa a una densidad de aproximadamente 10^{4}-10^{5} células/pocillo. Los pocillos se incuban a 37ºC (típicamente durante alrededor de 60 minutos), después se separan las células no adherentes mediante lavado suave. Las células adheridas se cuantifican mediante métodos convencionales (p. ej., mediante tinción con violeta cristal, lisando las células, y determinando la densidad óptica del producto lisado). Los pocillos de control se recubren con una proteína adherente conocida, tal como fibronectina o vitronectina.

La actividad de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se puede medir con un microfisiómetro biosensor basado en silicio que mide la velocidad de acidulación extracelular o la excreción de protones asociada con la unión al receptor y las posteriores respuestas celulares fisiológicas. Uno de tales dispositivos ilustrativos es el Cytosensor® Microphysiometer fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, Ca. Una variedad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el transporte de iones, la producción de energía, la respuesta inflamatoria, la activación reguladora y receptora, y similares, se pueden medir mediante este método. Véanse, por ejemplo, McConnell et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; y Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. El microfisiómetro se puede utilizar para analizar las células eucarióticas o procarióticas adherentes o no adherentes. Midiendo los cambios de la acidulación extracelular en el medio celular a lo largo del tiempo, el microfisiómetro mide directamente las respuestas celulares a diversos estímulos, incluyendo las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, sus agonistas, y antagonistas. Preferiblemente, el microfisómetro se utiliza para medir las respuestas de una célula eucariótica sensible a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, en comparación con una célula eucariótica de control que no responde a un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Las células eucarióticas sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 comprenden células en las cuales ha sido transfectado un receptor para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, creando de ese modo una célula que es sensible a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, así como células naturalmente sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Las diferencias, medidas por un cambio, por ejemplo, un aumento o disminución de la acidulación extracelular, en la respuesta de las células expuestas a un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, con respecto a un control no expuesto a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, son una medida directa de las respuestas celulares moduladas por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Por otra parte, tales respuestas moduladas por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser analizadas bajo una variedad de estímulos. La presente invención proporciona de este modo métodos para identificar los agonistas y antagonistas de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, que comprenden proporcionar células sensibles a un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, cultivar una primera porción de las células en ausencia de un compuesto de ensayo, cultivar una segunda porción de las células en presencia de un compuesto de ensayo, y detectar un cambio, por ejemplo, un incremento o una disminución, en una respuesta celular de la segunda porción de las células en comparación con la primera porción de las células. El cambio en la respuesta celular se muestra como un cambio medible en la velocidad de acidulación extracelular. Cultivar una tercera porción de las células en presencia de una proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y la ausencia de un compuesto de ensayo proporciona un control positivo para las células sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y un control para comparar la actividad agonista de un compuesto de ensayo con la del polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Los antagonistas de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se pueden identificar exponiendo las células a una proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en presencia y ausencia del compuesto de ensayo, con lo que una reducción de la actividad estimulada por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 es indicativa de actividad antagonista en el compuesto de
ensayo.

La expresión de los polinucleótidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en animales proporciona modelos para el estudio adicional de los efectos biológicos de la producción excesiva o de la inhibición de la actividad de la proteína in vivo. Los polinucleótidos que codifican zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y los polinucleótidos antisentido pueden ser introducidos en animales de ensayo, tales como ratones, utilizando vectores virales o ADN desnudo, o se pueden producir animales transgénicos.

Un enfoque in vivo para analizar las proteínas de la presente invención utiliza sistemas de liberación virales. Los virus ilustrativos para este propósito incluyen adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus vaccinia, y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un ADN virus de doble hebra, es en la actualidad el vector de transferencia génica mejor estudiado para la liberación de ácidos nucleicos heterólogos. Para una revisión, véanse Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997. El sistema de adenovirus ofrece numerosas ventajas. El adenovirus puede (i) acomodar insertos de ADN relativamente grandes; (ii) hacerse crecer hasta un título elevado; (iii) infectar una amplia gama de tipos de células de mamífero; y (iv) ser utilizado con muchos promotores diferentes incluyendo promotores ubicuos, específicos de tejidos, y regulables. Debido a que los adenovirus son estables en la corriente sanguínea, pueden ser administrados mediante inyección intravenosa.

Suprimiendo porciones del genoma de adenovirus, se pueden acomodar insertos más grandes (hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos pueden ser incorporados al ADN viral mediante ligación directa o mediante recombinación homóloga con un plásmido co-transfectado. En un sistema ilustrativo, el gen esencial E1 es suprimido del vector viral, y el virus no replicará a menos que el gen E1 sea proporcionado por la célula anfitriona (p. ej., la línea celular 293 humana). Cuando se administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus se dirige principalmente al hígado. Si el sistema de liberación adenoviral tiene una deleción del gen E1, el virus no puede replicar en las células anfitrionas. Sin embargo, el tejido del anfitrión (p. ej., el hígado) expresará y transformará (y, si se encuentra presente una secuencia señal, secretará) la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en la circulación en el hígado altamente vascularizado, y se podrán determinar los efectos sobre el animal infectado.

Un método alternativo de liberación génica comprende separar las células del organismo e introducir un vector en las células en forma de plásmido de ADN desnudo. Las células transformadas se re-implantan después en el organismo. Los vectores de ADN desnudo se introducen en células anfitrionas mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo la transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola génica, o uso de un transportador vector de ADN. Véanse, Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; y Johnston y Tang, Meth. Cell Biol. 43:353-365, 1994.

También se pueden generar (Lowell et al., Nature 366:740-742, 1993) ratones transgénicos, diseñados para expresar un gen zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, y ratones que muestran una ausencia completa de función génica de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, referidos como "ratones con un gen desactivado" (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992). Estos ratones pueden ser empleados para estudiar el gen zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y la proteína codificada de ese modo en un sistema in vivo. Los ratones transgénicos son particularmente útiles para investigar el papel de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en el desarrollo temprano ya que permiten la identificación de anomalías evolutivas o los bloqueos resultantes de la expresión excesiva o insuficiente de un factor específico. Véanse también, Maisonpierre et al., Science 277:55-60, 1997 y Hanahan, Science 277:48-50, 1997. Los promotores preferidos para la expresión transgénica incluyen los promotores de los genes de la metalotioneína y de la albúmina.

Se ha asociado una pérdida de control inhibidor normal de la contracción muscular con una lesión o perturbación de neuronas secretoras de ácido gamma-aminobutírico seleccionadas. Por ejemplo, el Síndrome de la Persona Rígida muestra una rigidez notable de la musculatura, que se cree que está mediada por la interferencia del funcionamiento de sus neuronas productoras de ácido gamma-aminobutírico (GABA). Otros trastornos neuromusculares relacionados incluyen miotonía, miopatías metabólicas, síndrome de Isaac, distonía, y espasmos tetánicos (Valldeoriola, J. Neurol 246:423-431, 1999).

De un modo similar, la medida directa del polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, o su pérdida de expresión en un tejido puede ser determinada en un tejido o en células a medida que experimentan un progreso tumoral. El aumento de invasividad y motilidad de las células, o el aumento o pérdida de expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en una condición pre-cancerosa o cancerosa, en comparación con el tejido normal, puede servir como diagnóstico para la transformación, invasión y metástasis en el progreso tumoral. Como tal, el conocimiento de la fase de progreso del tumor o de la metástasis ayudará al médico a elegir la terapia más apropiada, o la agresividad del tratamiento, para un paciente con cáncer individual dado. Los métodos para medir el aumento y la pérdida de expresión (de ARNm o de proteína) son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria y pueden ser aplicados a la expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Por ejemplo, la aparición o desaparición de polipéptidos que regulan la motilidad celular puede ser utilizada para ayudar a la diagnosis y prognosis del cáncer de próstata (Banyard, J. and Zetter, B. R., Cancer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). Como efector de la motilidad celular, o como marcador específico del hígado, el aumento o pérdida de expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 puede servir como diagnóstico para el cáncer de cerebro y otros cánceres. Por otra parte, de un modo análogo al antígeno específico de próstata (PSA), el incremento de los niveles de polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, o de anticuerpos anti-zcyto20, anti-zcyto21, anti-zcyto22, anti-zcyto24 y anti-zcyto25 en un paciente, con respecto a un control normal pueden ser indicativos de cánceres de cerebro y otros cánceres (Véase, p. ej., Mulders, T M T, et al., Eur. J. Surgical Oncol. 16:37-41, 1990). La fuerte expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en un tejido que normalmente se encuentra que no expresa los polinucleótidos serviría como diagnóstico de una anomalía en el tipo de célula o tejido, de invasión o metástasis de tejido hepático canceroso en tejido no hepático, y podría ayudar a un médico a dirigir un ensayo o investigación adicional, o ayudar a dirigir la terapia.

Además, se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, anticuerpos anti-zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, y la detección de la presencia de los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en un tejido para evaluar si se encuentra presente cerebro u otro tejido que se ha encontrado que expresa normalmente zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, por ejemplo, después de una intervención quirúrgica que implica la extirpación de un hígado o tejido neuronal enfermo o canceroso. Como tales, los polinucleótidos, polipéptidos, y anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados como ayuda para determinar si todo el tejido es extirpado después de la intervención quirúrgica, por ejemplo, después de una intervención quirúrgica para cáncer de cerebro y otros cánceres. En tales casos, es especialmente importante separar todo el tejido potencialmente enfermo para maximizar la recuperación del cáncer, y para minimizar la recurrencia. Las realizaciones preferidas incluyen anticuerpos anti-zcyto20 fluorescentes, radiomarcados, o marcados calorimétricamente y compañeros de unión de los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, que se pueden utilizar histológicamente o in situ.

Por otra parte, la actividad y el efecto de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sobre el progreso del tumor y la metástasis se puede medir in vivo. Se han desarrollado numerosos modelos de ratón singeneicos para estudiar la influencia de polipéptidos, compuestos u otros tratamientos sobre el progreso de tumores. En estos modelos, se implantan en ratones células tumorales pasadas por cultivo de la misma cepa que el donante del tumor. Las células se desarrollarán en tumores que tendrán características similares en el ratón receptor, y también se producirán metástasis en algunos de los modelos. Los modelos tumorales apropiados para los estudios de los autores de la presente invención incluyen el carcinoma de pulmón de Lewis (ATCC Núm. CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC Núm. CRL-6323), entre otros. Estas son ambas líneas tumorales comúnmente utilizadas, singeneicas para el ratón C57BL6, que son fácilmente cultivadas y manipuladas in vitro. Los tumores resultantes de la implantación de cualquiera de estas líneas celulares son susceptibles de metástasis en el pulmón en ratones C57BL6. El modelo de carcinoma de pulmón de Lewis ha sido utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de la angiogénesis (O'Reilly M S, et al. Cell 79: 315-328, 1994). Los ratones C57BL6/J se tratan con un agente experimental por medio de una inyección diaria de proteína recombinante, agonista o antagonista o bien de una sola inyección de adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento, se implantan 10^{5} a 10^{6} células bajo la piel dorsal. Alternativamente, se pueden infectar las propias células con adenovirus recombinante, por ejemplo uno que expresa zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25, antes del implante de manera que la proteína sea sintetizada en el sitio del tumor o intracelularmente, en lugar de sistémicamente. Los ratones desarrollan normalmente tumores visibles en 5 días. Se deja que los tumores crezcan durante un período de hasta 3 semanas, tiempo durante el cual alcanzan un tamaño de 1500-1800 mm3 en el grupo tratado de control. El tamaño del tumor y el peso corporal se controlan cuidadosamente durante todo el experimento. En el momento del sacrificio, se separa el tumor y se pesa junto con los pulmones y el hígado. Se ha demostrado que el peso del pulmón se corresponde bien con la carga de tumor metastásico. Como medida adicional, se cuentan las metástasis en la superficie pulmonar. El tumor, los pulmones y el hígado reseccionados se preparan para el examen histopatológico, la inmunohistoquímica y la hibridación in situ, utilizando los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. La influencia del polipeptido expresado en cuestión, p. ej., zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25, sobre la capacidad del tumor para reclutar vasculatura y experimentar metástasis puede ser evaluada de este modo. Además, aparte de utilizar adenovirus, las células implantadas pueden ser transfectadas transitoriamente con zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25. El uso de transfectantes zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 estables así como el uso de promotores inducibles para activar la expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 in vivo son conocidos en la técnica y se pueden utilizar en este sistema para evaluar la inducción de metástasis por zcyto20. Por otra parte, se pueden inyectar directamente zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 and zcyto25 purificados y medios acondicionados con zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en este modelo de ratón, y por tanto se pueden utilizar en este sistema. Para una referencia general véanse, O'Reilly M S, et al. Cell 79:315-328, 1994; y Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995.

Se puede utilizar la metodología antisentido para inhibir la transcripción del gen zcyto20 para examinar los efectos de semejante inhibición in vivo. Se diseñan polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 (p. ej., un polinucleótido como se muestra en el SEQ ID NO: 1) para que se unan al ARNm que codifica zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y para inhibir la traducción de semejante ARNm. Tales oligonucleótidos antisentido también se pueden utilizar para inhibir la expresión los genes que codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en un cultivo celular.

La mayor parte de las citoquinas así como otras proteínas producidas por linfocitos activados juegan un importante papel biológico en la diferenciación celular, la activación, el reclutamiento y la homeostasis de las células en todo el organismo. Se espera que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y los inhibidores de su actividad tengan una variedad de aplicaciones terapéuticas. Estas aplicaciones terapéuticas incluyen el tratamiento de enfermedades que requieren regulación inmunitaria, incluyendo las enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la miastenia grave, el lupus eritematoso generalizado, y la diabetes. Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser importantes en la regulación de la inflamación, y por lo tanto serían útiles en el tratamiento de la artritis reumatoide, el asma y la sepsis. Puede existir un papel de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en la mediación de la tumorigénesis, por medio del cual un antagonista de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sería útil en el tratamiento del cáncer. Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser útiles en la modulación del sistema inmunitario, por medio de lo cual se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y antagonistas de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para reducir el rechazo de injertos, evitar la enfermedad anfitrión contra injerto, reforzar la inmunidad para las enfermedades infecciosas, tratar a pacientes inmunocomprometidos (p. ej., pacientes VIH+), o para mejorar vacunas.

Se ha demostrado que los miembros de la familia de proteínas de la presente invención tienen un efecto antiviral que es similar al interferón-\alpha. El interferón ha sido aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias, el condiloma acuminado, la hepatitis C crónica, el carcinoma de vejiga, el carcinoma cervical, la papilomatosis faríngea, la micosis fungoides, la hepatitis B crónica, el sarcoma de Kaposi en pacientes infectados con virus de la inmunodeficiencia humana, el melanoma maligno, la leucemia de células pilosas, y la esclerosis múltiple. Además, se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para tratar formas de arteriosclerosis tales como la aterosclerosis, inhibiendo la proliferación celular. Por consiguiente, la presente invención contempla el uso de proteínas, polipéptidos, y péptidos que tienen actividad zcyto20 para tratar tales afecciones, así como para tratar la retinopatía. La presente invención también contempla el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para tratar trastornos linfoproliferativos, incluyendo los linfomas de células B, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia linfocítica aguda, los linfomas No Hodkin, el mieloma múltiple, la leucemia mielocítica aguda, la leucemia mielocítica crónica.

También se ha demostrado que los interferones inducen la expresión de antígenos por células cultivadas (véanse, p. ej., Auth et al., Hepatology 18:546 (1993), Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994), Girolomoni et al., Eur. J. Immunol. 25:2163 (1995), y Maciejewski et al., Blood 85:3183 (1995). Esta actividad potencia la capacidad para identificar nuevos antígenos asociados a tumores in vitro. Por otra parte, la capacidad de los interferones para aumentar el nivel de expresión de los antígenos tumorales humanos indica que los interferones pueden ser útiles en un entorno coadyuvante para la inmunoterapia o potenciar la inmunoescintografía utilizando anticuerpos anti-antígenos tumorales (Guadagni et al., Cancer Immunol. Immunother. 26:222 (1988); Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994)). De este modo, la presente invención incluye el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 como coadyuvante para la inmunoterapia o para mejorar la inmunoescintografía utilizando anticuerpos anti-antígenos tumorales.

Los métodos para la detección y la diagnosis de las infecciones virales son bien conocidos por los expertos en la técnica. El método exacto utilizado para medir una reducción de virus en respuesta a la administración de moléculas de la presente invención dependerá del paciente, del tipo de infección viral, y similares. Por ejemplo, los métodos incluyen, pero no están limitados a, medición de los cambios en los recuentos de células CD4, ensayos serológicos, medición del ADN del virus y el ARN del virus mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativos convencionales y en tiempo real, niveles de anticuerpos inducidos por virus, análisis de inmunoabsorción con inmunofluorescencia y ligados a enzimas, efectos citopáticos, e histología.

Por otra parte, zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se pueden unir a CD4 u otro receptor de leucocitos y mostrar efectos antivirales, por ejemplo, frente al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o al virus de las células T linfotróficas humanas (VLTH). Alternativamente, el polipéptido zcyto20 puede competir por un receptor o co-receptor viral para bloquear la infección viral. Se puede administrar zcyto20 parenteralmente para evitar la infección viral o para reducir la replicación viral en marcha y la re-infección (Gayowski, T. et al., Transplantation 64:422-426, 1997). De este modo, se puede utilizar zcyto20 como agente terapéutico antiviral, por ejemplo para leucemias virales (VLTH), SIDA (VIH), o infecciones virales gastrointestinales causadas, por ejemplo, por rotavirus, calicivirus (p. ej., Agente Norwalk) y ciertas cepas de adenovirus patogénicos, Hepatitis B y C.

También se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para tratar la miocarditis, un trastorno que surge cuando el corazón está implicado en un proceso inflamatorio. Se piensa que la infiltración de linfocitos y la miocitolisis son el resultado de la infección por virus, bacterias, hongos o parásitos (véase, por ejemplo, Brodison et al., J. Infection 37:99 (1998)). Se pueden inyectar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 intravenosamente o subcutáneamente para tratar infecciones asociadas con la miocarditis. También se pueden administrar intravenosamente zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 como una citoquina inmunorreguladora en el tratamiento de la miocarditis autoinmunitaria. Se pueden extrapolar las dosis de interferón utilizando un modelo autoinmunitario de miocarditis en el ratón A/J (Donermeyer, et al., J. Exp. Med. 182:1291 (1995)).

La administración exógena de interferón-\tau en ovejas incrementa la tasa de embarazo (Aggarwal, Human Cytokines III, (Blackwell Science 1997)). Como se describe en la presente memoria, Zcyto20mRNA es expresado en la placenta. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, por ejemplo de los zcyto20, zcyto21, y zcyto22 humanos descritos, para promover y proteger el crecimiento del feto. Como ilustración, se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, y zcyto22 para proteger un feto en desarrollo de infecciones virales (p. ej., virus de inmunodeficiencia humana, virus de papiloma humano, y similares). Además, se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para promover la fertilización in vitro.

Informes recientes han destacado el papel de los interferones de tipo I en la prevención de la diabetes inducida por virus induciendo un potente estado antiviral en células pancreáticas beta pronto durante la infección viral (Flodstroem et al., Nature Immunology 3, 373-382 (2002)). Esto evita la pérdida de células beta debida a la muerte de las células inducidas por virus y a la autoinmunidad que la acompaña. Zcyto20, 21 y 22 también pueden inducir un estado antiviral en células que expresan su receptor, zcytor19. Zcytor19 es altamente expresado en tejido pancreático y por lo tanto zcyto20-22 pueden jugar un papel en la prevención de la diabetes inducida por virus debida a la muerte de células beta. Además, el papel de los interferones de tipo I en la prevención de la diabetes inducida por virus puede ser ampliado a otras enfermedades autoinmunitarias inducidas por virus y por lo tanto, zcyto20-22 también puede jugar un papel en la prevención de otras enfermedades tales como la esclerosis muscular, el lupus, y las enfermedades autoinmunitarias inducidas por virus en tejidos que expresan el receptor de zcyto20-22, zcytor19.

La expresión sistémica crónica de los interferones de tipo I también ha sido asociada con la patogénesis de la diabetes de tipo I. Dada la similitud de los interferones de tipo I con zcyto20-22 en lo que respecta a la actividad biológica y la inducción génica, la expresión sistémica crónica de zcyto20, 21, o 22 también podría jugar un papel en la patogénesis de la diabetes de tipo I. Por lo tanto, un inhibidor de la actividad de zcyto20-22 en el páncreas podría ser beneficioso en la prevención de la diabetes de tipo I.

Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser administrados solos o combinados con otros agentes vasculogénicos o angiogénicos, incluyendo VEGF. Cuando se utilizan zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 combinados con un agente adicional, los dos compuestos pueden ser administrados simultáneamente o sucesivamente según sea apropiado para la afección específica que se esté tratando.

Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 serán útiles en el tratamiento de la tumorigénesis, y por lo tanto serían útiles en el tratamiento del cáncer. Una inhibición con zcyto20 de células B normales estimuladas con IgM y un efecto similar observado en líneas tumorales de células B sugieren que puede existir un beneficio terapéutico en el tratamiento de pacientes con zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 con el fin de inducir en las células del tumor de células B un estado menos proliferativo. El ligando podría ser administrado combinado con otros agentes que ya se usan incluyendo tanto agentes quimioterapéuticos convencionales como moduladores inmunitarios tales como el interferón alfa. Se ha demostrado que los interferones alfa/beta son eficaces en el tratamiento de algunas leucemias y modelos de enfermedades animales, y los efectos inhibidores del crecimiento del interferón alfa y zcyto20 pueden ser aditivos para las líneas celulares derivadas de tumores de células B.

La presente invención proporciona un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas que comprende administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T una cantidad de una composición de zcyto20 suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. La estimulación con zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de células NK líticas a partir de progenitores de médula y la proliferación de células T después de la activación de los receptores de antígenos potenciaría el tratamiento para pacientes que reciben transplantes de médula alogénicos, y por lo tanto zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 potenciarán la generación de respuestas anti-tumorales, con o sin la infusión de linfocitos de donantes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de reducción de la proliferación de células B o T neoplásicas que comprende administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T una cantidad de una composición de un antagonista de zcyto20 suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. Además, el antagonista de zcyto20 puede ser una proteína de fusión ligando/toxina.

Se puede emplear una toxina de fusión zcyto20-, zcyto21-, zcyto22-, zcyto24- and zcyto25-saporina contra un grupo similar de leucemias y linfomas, ampliando la gama de leucemias que pueden ser tratadas con zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. La activación mediada por la toxina de fusión del receptor de zcyto20 proporciona dos medios independientes para inhibir el crecimiento de las células diana, siendo el primero idéntico a los efectos observados para el ligando solo, y el segundo debido a la liberación de la toxina a través de la internalización del receptor.

Para su uso farmacéutico, se formulan las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para la liberación tópica o parenteral, concretamente intravenosa o subcutánea de acuerdo con los métodos convencionales. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa en agua al 5%, o similar. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponadores, albúmina para evitar la pérdida de proteína en las superficies de los viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y los describe, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19th ed., 1995. Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se utilizarán preferiblemente a una concentración de alrededor de 10 a 100 \mug/ml de volumen total, aunque se pueden utilizar concentraciones en el intervalo de 1 ng/ml a 1.000 \mug/ml. Para la aplicación tópica, por ejemplo para la promoción de la curación de heridas, la proteína se aplicará en el intervalo de 0,1-10 \mug/cm^{2} de la zona de la herida, con la dosis exacta determinada por el médico clínico de acuerdo con los patrones aceptados, tomando en consideración la naturaleza y la gravedad de la afección que se va a tratar, los rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto en la técnica. La dosificación es diaria o intermitente a lo largo del período de tratamiento. La administración intravenosa será mediante inyección de bolo o infusión a lo largo de un período típico de una a varias horas. También se pueden emplear formulaciones de liberación sostenida. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de zcyto20 es una cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en la afección tratada, tal como un cambio clínicamente significativo en la función hematopoyética o inmunitaria, una reducción significativa de la morbidez, o una puntuación histológica significativamente incrementada.

Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, los agonistas, y los antagonistas son útiles para modular la expansión, proliferación, activación, diferenciación, migración, o metabolismo de los tipos de células sensibles, que incluyen tanto células primarias como líneas celulares cultivadas. Son de particular interés en este aspecto las células hematopoyéticas, las células mesenquimáticas (incluyendo las células pluripotenciales y las células mieloides y linfoides maduras), las células endoteliales, las células de la musculatura lisa, los fibroblastos, los hepatocitos, las células neurales y las células pluripotenciales embrionarias. Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se añaden a los medios de cultivo de tejidos para estos tipos de células a una concentración de alrededor de 10 pg/ml a alrededor de 100 ng/ml. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que las proteínas zcyto20 pueden ser combinadas ventajosamente con otros factores de crecimiento en el medio de cultivo.

En el campo de la investigación de laboratorio, también se pueden utilizar las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 como patrones de peso molecular o como reactivos en análisis para determinar los niveles circulantes de la proteína, por ejemplo en la diagnosis de trastornos caracterizados por la producción excesiva o insuficiente de proteína zcyto20 o en el análisis del fenotipo celular.

Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 también se pueden utilizar para identificar inhibidores de su actividad. Se añaden compuestos de ensayo a los análisis descritos antes para identificar los compuestos que inhiben la actividad de la proteína zcyto20. Además de los análisis descritos antes, se pueden someter a ensayo las muestras en cuanto a la inhibición de la actividad zcyto20 en una variedad de análisis diseñados para medir la unión al receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Por ejemplo, las líneas celulares sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser transfectadas con un constructo génico informador que es sensible a una ruta celular estimulada por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Los constructos génicos informadores de este tipo son conocidos en la técnica, y comprenderán generalmente un elemento de respuesta al suero activado por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 (SRE) conectado operablemente a un gen que codifica una proteína analizable, tal como luciferasa. Los compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidato se someten a ensayo en cuanto a su capacidad para inhibir la actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sobre las células diana como evidencia un descenso en la estimulación por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de la expresión del gen informador. Los análisis de este tipo detectarán compuestos que bloquean directamente los receptores de la superficie celular que se unen a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, así como compuestos que bloquean los procedimientos en la ruta celular posterior a la unión del ligando al receptor. Como alternativa, se pueden someter a ensayo los compuestos u otras muestras en cuanto al bloqueo directo de la unión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 al receptor utilizando zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 etiquetados con una marca detectable (p. ej., I^{125}, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC, y similares). En los análisis de este tipo, la capacidad de una muestra de ensayo para inhibir la unión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 marcado al receptor es indicativa de la actividad inhibidora, lo que puede ser confirmado por medio de análisis secundarios. Los receptores utilizados en los análisis de unión pueden ser receptores celulares, o receptores inmovilizados, aislados.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígenos de los mismos tales como fragmentos F(ab')_{2} y Fab, anticuerpos de cadena sencilla, y similares, incluyendo anticuerpos diseñados genéticamente. Los anticuerpos no humanos pueden ser humanizados injertando CDR no humanas sobre regiones marco y constantes humanas, o incorporando los dominios variables no humanos completos ("encubriéndolos" opcionalmente con una superficie de tipo humano mediante sustitución de los restos expuestos, donde el resultado es un anticuerpo recubierto "veneered"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden conservar restos no humanos en los dominios del marco de la región variable humana para potenciar unas características de unión apropiadas. Por medio de anticuerpos humanizantes, se puede incrementar la vida media biológica, y se reduce el potencial para las reacciones inmunitarias adversas tras la administración a seres humanos. Un experto en la técnica puede generar anticuerpos humanizados con dominios constantes específicos y diferentes (esto es, subclases diferentes de Ig) para facilitar o inhibir diversas funciones inmunitarias asociadas con dominios constante de anticuerpos concretos. Se define que los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido o proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 con una afinidad al menos 10 veces mayor que la afinidad de unión al polipéptido o proteína de control (no zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 ni zcyto25). La afinidad de un anticuerpo monoclonal puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

Los métodos para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1982, que se incorpora en la presente memoria como referencia). Resulta de particular interés generar anticuerpos para sitios antigénicos hidrofílicos que incluyen, por ejemplo, los restos aminoácido 169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 54 (Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 53 (Phe) a 58 (Asp) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys) del SEQ ID NO: 2, y los restos aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, en zcyto22, serían útiles las regiones hidrofílicas que incluyen los restos aminoácido 169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 54 (Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 53 (Phe) a 58 (Asp) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys) del SEQ ID NO: 7, y los restos aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del SEQ ID NO: 7. Como resultaría evidente para un experto en la técnica, se pueden generar anticuerpos policlonales a partir de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, y ratas. La inmunogenicidad de un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 podría ser incrementada por medio del uso de un coadyuvante tal como alúmina (hidróxido de aluminio) o coadyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína de unión a maltosa. El inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula completa o una porción de la misma. Si la porción polipeptídica es de "tipo hapteno", semejante porción se puede unir o conectar ventajosamente con un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH), seralbúmina bovina (BSA) o toxoide del tétanos) para la inmunización.

Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos incluyen la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, y la selección de genotecas de presentación de anticuerpos en fagos o vectores similares (p. ej., por medio del uso de un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 inmovilizado o marcado). Se pueden producir anticuerpos humanos en animales no humanos, transgénicos que han sido diseñados para que contengan genes de inmunoglobulina como se describe en la Publicación WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmunoglobulina endógenos de estos animales sean inactivados o eliminados, por ejemplo mediante recombinación homóloga.

Se puede utilizar una variedad de análisis conocidos por los expertos en la técnica para detectar anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Se describen análisis ilustrativos con detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales análisis incluyen; inmunoelectroforesis concurrente, radio-inmunoanálisis, radio-inmunoprecipitaciones, análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), análisis de transferencia puntual, análisis de transferencia Western, análisis de inhibición o competición, y análisis sándwich.

Se pueden utilizar anticuerpos para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para la purificación por afinidad de la proteína, en análisis de diagnóstico para determinar los niveles circulantes de la proteína; para detectar o cuantificar el polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 soluble como marcador de la patología o enfermedad subyacente; para la inmunolocalización en animales completos o secciones de tejidos, incluyendo aplicaciones de inmunodiagnóstico; para la inmunohistoquímica; y como antagonistas para bloquear la actividad de la proteína in vitro e in vivo. También se pueden utilizar anticuerpos para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para etiquetar células que expresan zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25; para la purificación por afinidad de los polipéptidos y proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25; en métodos analíticos empleando FACS; para escrutar genotecas de expresión; y para generar anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos se pueden conectar a otros compuestos, incluyendo agentes terapéuticos y de diagnóstico, utilizando métodos conocidos para proporcionar el redireccionamiento de esos compuestos a células que expresan los receptores para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Para ciertas aplicaciones, incluyendo los usos de diagnóstico in vitro e in vivo, resulta ventajoso emplear anticuerpos marcados. Las etiquetas o marcas directas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las etiquetas o marcas indirectas pueden representar el uso de biotina-avidina u otros pares complemento/anti-complemento como intermedios. Los anticuerpos de la presente invención se pueden conjugar directa o indirectamente con fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos productos conjugados se pueden utilizar para el diagnóstico o para aplicaciones terapéuticas in vivo (p. ej., la inhibición de la proliferación celular). Véase, en general, Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56:1324-1330, 1996.

Los polipéptidos y proteínas de la presente invención se pueden utilizar para identificar y aislar receptores. Los receptores de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden estar implicados en la regulación del crecimiento en el hígado, la formación de vasos sanguíneos, y otros procedimientos evolutivos. Por ejemplo, las proteínas y polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se pueden inmovilizar sobre una columna, y hacer correr las preparaciones de membrana a lo largo de la columna (como se describe generalmente en Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, Ca., 1992, págs. 195-202). Las proteínas y polipéptidos también pueden ser radiomarcados (Methods Enzymol., vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, 721-737) o marcados por fotoafinidad (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483-514, 1993 y Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167-1180, 1984) y utilizados para etiquetar proteínas de la superficie celular específicas. De una manera similar, las proteínas y polipéptidos zcyto20 radiomarcados se pueden utilizar para clonar el receptor cognado en análisis de unión utilizando células transfectadas con una genoteca de expresión de ADNc.

Se pueden utilizar los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para ilustrar técnicas analíticas tales como la espectrometría de masas, el dicroismo circular, para determinar la conformación, especialmente de las cuatro hélices alfa, la cristalografía de rayos x para determinar la estructura tridimensional en el detalle atómico, la espectroscopía de resonancia magnética nuclear para revelar la estructura de las proteínas en solución. Por ejemplo, se puede proporcionar un kit que contiene zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 al estudiante para analizarlos. Puesto que la secuencia de aminoácidos sería conocida por el instructor, se puede proporcionar la proteína al estudiante como ensayo para determinar las técnicas o desarrollar las técnicas del estudiante, el instructor debería conocer después si el estudiante ha analizado correctamente o no el polipéptido. Puesto que cada polipéptido es único, la utilidad docente de zcyto20 sería única en sí misma.

Los anticuerpos que se unen específicamente a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser utilizados como ayuda ilustrativa para instruir a los estudiantes sobre cómo preparar columnas de cromatografía de afinidad para purificar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, clonar y secuenciar el polinucleótido que codifica un anticuerpo y de este modo como práctica para ilustrar a un estudiante sobre cómo diseñar anticuerpos humanizados. El gen, polipéptido, o anticuerpo de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sería empaquetado después por compañías de reactivos y vendido a instituciones docentes de manera que los estudiantes adquieran experiencia en las técnicas de la biología molecular. Debido a que cada gen y cada proteína son únicos, cada gen y cada proteína crean sensibilizaciones y experiencias de aprendizaje únicas para los estudiantes en las prácticas de laboratorio. Tales kits docentes que contienen el gen, polipéptido, o anticuerpo ZCYTO20 se consideran dentro del alcance de la presente invención.

En resumen, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 80% o 95% o 100% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO:2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

En otra realización, el polipéptido aislado se une a un receptor como se muestra en los SEQ ID NOS: 24, 27 o 29 en forma de un receptor monomérico u homodimérico o en los SEQ ID NOS: 24, 27 o 29 combinados con el SEQ ID NO: 41 en forma de un receptor heterodimérico.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

En otro aspecto, la presente incluye un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos descritos en la presente memoria, en vehículos farmacéuticamente aceptables.

La presente invención también incluye proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos descritos en la presente memoria.

En otros aspectos, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, donde la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:3, (b) un polinucleótido que permanece hibridado después de unas condiciones de lavado restrictivas a un polinucléotido que consiste en la secuencia de nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO:1, o el complemento de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO:1.

En otra realización, el polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, donde la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:36, (b) un polinucleótido que permanece hibridado después de unas condiciones de lavado restrictivas a un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO:6, o el complemento de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO:6.

En otro aspecto, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 618.

En otra realización, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde el nucleótido 64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde el nucleótido 1 al nucleótido 618.

En otra realización, la presente invención incluye polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 8 desde el nucleótido 67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 606.

En otra realización, la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde el nucleótido 67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde el nucleótido 1 al nucleótido 606.

La presente invención proporciona vectores de expresión, que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria con un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, donde el promotor está conectado operablemente con la molécula de ácido nucleico, y donde la molécula de ácido nucleico está conectada operablemente con el terminador de la transcripción.

La presente invención proporciona células anfitrionas recombinantes que comprenden el vector de expresión descrito en la presente memoria, donde la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero, y células vegetales.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de un polipéptido, comprendiendo el método la etapa de cultivar células anfitrionas recombinantes que comprenden los vectores de expresión descritos en la presente memoria, y que producen los polipéptidos.

La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con los polipéptidos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la expansión de células monocíticas o progenitores de células monocíticas que comprende cultivar médula ósea o células de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de los polipéptidos descritos en la presente memoria suficiente para producir un incremento en el número de células monocíticas o progenitores de células monocíticas en la médula ósea o en las células de sangre periférica en comparación con la médula ósea o las células de sangre periférica cultivadas en ausencia del polipéptido administrado.

La presente invención también proporciona un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o a un patógeno que comprende: (1) determinar un nivel de un anticuerpo específico del antígeno o del patógeno; (2) administrar una composición que comprende los polipéptidos descritos en la presente memoria en un vehículo farmacéutico aceptable; (3) determinar un nivel post-administración de anticuerpo específico del antígeno o patógeno; (4) comparar el nivel de anticuerpo de la etapa (1) con el nivel de anticuerpo de la etapa (3), donde un incremento del nivel de anticuerpo es indicativo de la estimulación de la respuesta inmunitaria.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un método de producción de una respuesta antiviral en un mamífero que comprende administrar a un mamífero con una infección viral una cantidad de una composición de los polipéptidos descritos en la presente memoria suficiente para mostrar una reducción del virus.

La presente invención, descrita de este modo generalmente, se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Plásmidos de Expresión en Mamíferos

Se puede construir un plásmido de expresión que contiene un polinucleótido que codifica zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25 por medio de recombinación homóloga. Se aísla un fragmento de ADNc, por ejemplo ADNc de zcyto20, mediante PCR utilizando la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 1 con regiones limítrofes en los extremos 5' y 3' correspondientes a las secuencias del vector que flanquean el punto de inserción de zcyto20. Los cebadores ZC40923 y ZC40927 se muestran en los SEQ ID NOS: 12 y 13, respectivamente.

La mezcla de reacción para la PCR se hace correr sobre un gel de agarosa al 1% y se extrae del gel una banda correspondiente al tamaño del inserto utilizando un QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, Ca.). El plásmido pZMP21 es un vector de expresión en mamífero que contiene una casete de expresión que tiene el promotor de MPSV, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificadoras, un codón de terminación, un origen de replicación de E. coli; una unidad de expresión de un marcador seleccionable de mamífero que comprende un promotor de SV40, un intensificador y un origen de replicación, un gen DHFR, y el terminador de SV40; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y replicación en S. cerevisiae. Éste se construye a partir de pZP9 (depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, con el Núm. de Acceso 98668) con los elementos genéticos de la levadura tomados de pRS316 (depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, con el Núm. de Acceso 77145), un elemento del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) de poliovirus, y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C-terminal del dominio transmembrana. El plásmido pZMP21 fue digerido con BgIII, y utilizado para la recombinación con el inserto de PCR.

Se combinan cien microlitros de células de levadura competente (S. cerevisiae) independientemente con 10 \mul de las diversas mezclas de ADN anteriores y se transfieren a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se someten a electropulsos utilizando ajustes de suministro de potencia (BioRad Laboratories, Hercules, Ca.) de 0,75 kV (5 kV/cm), \infty ohms, 25 \muF. A cada cubeta se le añaden 600 \mul de sorbitol 1,2 M, y la levadura se cultiva en placa en dos alícuotas de 300 \mul sobre placas URA-D y se incuban a 30ºC. Después de aproximadamente 48 horas, se resuspenden los transformantes de levadura Ura+ de una única placa en 1 ml de H_{2}O y se centrifugan brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento celular se resuspende en 1 ml de tampón de lisis (Triton X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Se añaden 500 \mul de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contiene 300 \mul de cuentas de vidrio lavadas con ácido y 200 \mul de fenol-cloroformo, se someten a vórtice durante intervalos de 1 minuto dos o tres veces, y se centrifugan durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfieren 300 \mul de la fase acuosa a un tubo nuevo, y el ADN se precipita con 600 \mul de etanol (EtOH), seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se resuspende en 10 \mul de H_{2}O.

La transformación de células anfitrionas de E. coli electrocompetentes (células Electromax DH10B®; obtenidas de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md.) se realiza con 0,5-2 ml de prep de ADN de levadura y 40 \mul de células. Las células someten a electropulsación a 1,7 kV, 25 \muF, y 400 ohms. Después de la electroporación, se cultivan en placa 1 ml de SOC (Bacto® Tryptona al 2% (Difco, Detroit, Mich.), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 \mul sobre cuatro placas LB AMP (Caldo LB (Lennox), Bacto® Agar (Difco) al 1,8%, 100 mg/L de Ampicilina).

Los clones individuales que albergan el constructo de expresión correcto para zcyto20 se identifican mediante digestión con enzimas de restricción para verificar la presencia del inserto zcyto20 y para confirmar que las diversas secuencias de ADN se han unido correctamente entre sí. Los insertos de los clones positivos se someten a análisis de la secuencia. El ADN plasmídico a mayor escala se aísla utilizando un kit disponible en el mercado (QIAGEN Plasmid Maxi Kit, Qiagen, Valencia, Ca.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El constructo correcto se denomina zcyto20-CEE/pZMP21.

Los plásmidos que contienen zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25 se preparan de una manera similar, utilizando cebadores específicos de los nucleótidos.

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Ejemplo 2 Expresión en Células de Ovario de Hámster Chino

Se cultivan en placa células CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-666, 1986) en placas de cultivo de 10 cm y se deja que crezcan hasta una confluencia de aproximadamente 50% a 70% durante la noche a 37ºC., CO_{2} al 5%, en medio F12/FBS de Ham (medio F12 de Ham (Life Technologies), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, Utah), L-glutamina al 1% (JRH Biosciences, Lenexa, Kans.), piruvato de sodio al 1% (Life Technologies)). Después las células se transfectan con un plásmido que contiene zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25, esto es zcyto20/pZMP6, mediante transfección mediada por liposomas utilizando una formulación de liposomas 3:1 (p/p) del lípido policatiónico 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propaniminio-trifluoroacetato y el lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina en agua filtrada a través de membrana (Lipofectamine® Reagent, Life Technologies), en una formulación de medio sin suero (SF) (F12 de Ham, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%). Se diluye zcyto20/pZMP6 en tubos de 15 ml a un volumen final total de 640 \mul con medio SF. Se mezclan 35 \mul de Lipofectamine® con 605 \mul de medio SF. La mezcla resultante se añade a la mezcla de ADN y se deja incubar aproximadamente 30 minutos a la temperatura ambiente. Se añaden 5 ml de medio SF a la mezcla de ADN:Lipofectamine®. Las células se enjuagan una vez con 5 ml de medio SF, se aspiran, y se añade la mezcla de ADN:Lipofectamine. Las células se incuban a 37ºC durante cinco horas, después se añaden 6,4 ml de F12 de Ham/FBS al 10%, medio PSN al 1% a cada placa. Las placas se incuban a 37ºC durante la noche, y la mezcla de ADN:Lipofectamine se sustituye por FBS al 5%/medio de Ham al día siguiente. A los tres días de la transfección, las células se dividen en matraces T-175 en medio de crecimiento. A los 7 días de la transfección, las células se colorean con FITC-anticuerpo monoclonal anti-CD8 (Pharmingen, San Diego, Ca.) seguido de cuentas magnéticas conjugadas con anti-FITC (Miltenyi Biotec, Auburn, Ca.). Las células CD8 positivas se separan utilizando columnas disponibles en el mercado (columnas mini-MACS; Miltenyi Biotec) de acuerdo con las directrices del fabricante y se colocan en DMEM/F12 de Ham/FBS al 5% sin nucleósidos pero con metotrexato 50 nM (medio de selección).

Las células se cultivan en placa para subclonar una densidad de 0,5, 1 y 5 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio de selección y se deja que crezcan durante aproximadamente dos semanas. Los pocillos se verifican para la evaporación de medio y se llevan de nuevo a 200 \mul por pocillo según sea necesario durante este procedimiento. Cuando un gran porcentaje de las colonias de la placa están próximas a la confluencia, se recogen 100 \mul de medio de cada pocillo para su análisis mediante transferencia puntual, y las células se alimentan con medio de selección de nueva aportación. El sobrenadante se aplica a un filtro de nitrocelulosa en un aparato para transferencia puntual, y el filtro se trata a 100ºC en un horno de vacío para desnaturalizar la proteína. El filtro se incuba en Tris-glicina 525 mM, pH 9,1, \beta-mercaptoetanol 5 mM, a 65ºC, 10 minutos, después en Tampón Western A con leche en polvo desnatada al 2,5% (gelatina al 0,25%, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Igepal CA-630 al 0,05%) durante la noche a 4ºC en un aparato de sacudimiento giratorio. El filtro se incuba con el producto conjugado de anticuerpo-HRP en tampón Western A con leche en polvo desnatada al 2,5% durante 1 hora a la temperatura ambiente sobre un aparato de sacudimiento giratorio. El filtro se lava después tres veces a la temperatura ambiente en PBS más Tween 20 al 0,01%, 15 minutos por lavado. El filtro se revela con reactivos quimioluminiscentes (kit de marcaje directo ECL®; Amersham Corp., Arlington Heights, Ill) de acuerdo con las directrices del fabricante y se exponen a la película (Hyperfilm ECL, Amersham Corp.) durante aproximadamente 5 minutos. Los clones positivos se tratan con tripsina de la placa de 96 pocillos y se transfieren a placas de 6 pocillos en medio de selección para el aumento a escala y el análisis mediante transferencia Western.

Ejemplo 3 Expresión en Células de Riñón de Cría de Hámster Chino

Las proteínas zcyto24 y zcyto25 completas fueron producidas en células BHK. Por ejemplo, las células BHK se transfectaron con zcyto24-CEE/pZMP21 o zcyto25-CEE/pZMP21 (Ejemplo 1). Las células BHK 570 (ATCC CRL-10314) se cultivaron en placa en matraces para el cultivo de tejidos T75 y se dejó que crecieran hasta una confluencia de aproximadamente 50 a 70% durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, en medio de crecimiento (SL7V4, suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, Utah), penicilina/estreptomicina al 1%). Después las células se transfectaron con zcyto24-CEE/pZMP21 o zcyto25-CEE/pZMP21 mediante transfección mediada por liposomas (utilizando Lipofectamine®; Life Technologies), en medio sin suero (SF). El plásmido se diluyó en tubos de 1,5 ml hasta un volumen final total de 640 \mul con medio SF. Se mezclaron 35 \mul de la mezcla de lípidos con 605 \mul de medio SF, y la mezcla resultante se dejó incubar aproximadamente 30 minutos a la temperatura ambiente. Después se añadieron seis ml de medio SF a la mezcla de ADN/lípido. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron, y se añadió la mezcla de ADN/lípido. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, después se añadieron 15 ml de medio de crecimiento a cada placa. Las placas se incubaron a 37ºC durante la noche, y la mezcla de ADN/lípido se sustituyó por medio de selección (SL7V4, suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, Utah), penicilina/estreptomicina al 1%, MTX 1 \muM) al día siguiente. Aproximadamente 7-10 días después de la transfección, las colonias resistentes al metotrexato se trataron con tripsina, y las células se volvieron a cultivar en placa en matraces T-162 y se transfirieron a un cultivo a gran escala.

Ejemplo 4 Construcción de Vectores de Adenovirus

Para la construcción de vectores de adenovirus, la región codificadora de la proteína de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25 se amplifica mediante PCR utilizando cebadores que añaden los sitios de restricción PmeI y AscI a los extremos 5' y 3' respectivamente. La amplificación se realiza con un molde de ADN completo en una reacción de PCR como sigue: un ciclo a 95ºC durante 5 minutos; seguido de 15 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 61ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 1,5 minutos; seguido de 72ºC durante 7 minutos; seguido de enjuagado a 4ºC. El producto de reacción de la PCR se carga sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,2% en tampón TAE (Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,001 M). El producto de la PCR es escindido del gel y purificado utilizando un kit disponible en el mercado que comprende una columna de centrifugación en membrana de gel de sílice (QIAquick® PCR Purification Kit y kit de limpieza en gel; Qiagen, Inc.) como en las instrucciones del kit. El producto de la PCR se digiere después con PmeI y AscI, se extrae con fenol/cloroformo, se precipita con EtOH, y se rehidrata en 20 ml de TE (Tris/EDTA pH 8). El fragmento zcyto20 se liga después en los sitios PmeI-AscI del vector transgénico pTG12-8 y se transforma en células competentes DH10B® de E. coli mediante electroporación. El vector pTG12-8 derivaba de p2999B4 (Palmiter et al., Mol Cell Biol. 13:5266-5275, 1993) por inserción de un intrón de insulina II de rata (aprox. 200 pb) y un poliligador (Fse I/Pme I/Asc I) en el sitio Nru I. El vector comprende un promotor de metalotioneína (MT-1) de ratón (aprox. 750 pb) y una región no traducida de la hormona de crecimiento humana (hGH) y una señal de poliadenilación (aprox. 650 pb) flanqueados por 10 kb de la secuencia limítrofe 5' de MT-1 y 7 kb la secuencia limítrofe 3' de MT-1. El ADNc es insertado entre las secuencias de la insulina II y la hGH. Los clones que contienen el ADNc de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25 se identifican mediante miniprep de ADN plasmídico seguido de digestión con PmeI y AscI.
Los clones positivos se secuencian para asegurarse de que no había deleciones u otras anomalías en el constructo.

Se prepara ADN utilizando un kit disponible en el mercado (Maxi Kit, Qiagen, Inc.), y el ADN se libera del vector pTG12-8 utilizando las enzimas PmeI y AscI. El ADNc se aísla sobre un gel de agarosa de baja temperatura de fusión al 1% y se escinde del gel. La porción de gel se reblandece a 70ºC, y el ADNc se extrae dos veces con un volumen igual de fenol tamponado con Tris, se precipita con EtOH, y se resuspende en 10 \mul de H_{2}O.

El ADNc se clona en los sitios EcoRV-AscI de un pAdTrack-CMV modificado (He, T-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998). Este constructo contiene el gen marcador de la proteína fluorescente verde (GFP). El promotor de CMV que dirige la expresión de GFP es remplazado por el promotor de SV40, y la señal de poliadenilación de SV40 es remplazada por la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana. Además, el poliligador nativo es remplazado por los sitios FseI, EcoRV, y AscI. Esta forma modificada de pAdTrack-CMV se denomina pZyTrack. La ligación se realiza utilizando un kit de ligación y escrutinio de ADN disponible en el mercado (Fast-Link® kit; Epicentre Technologies, Madison, Wis.). Los clones que contienen zcyto20 son identificados mediante digestión de ADN miniprep con FseI y AscI. Con el fin de linealizar el plásmido, aproximadamente 5 \mug del plásmido pZyTrack zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25 resultante son digeridos con PmeI. Aproximadamente 1 \mug del plásmido linealizado es co-transformado con 200 ng de pAdEasy superenrollado (He et al., ídem) en células E. coli BJ5183 (He et al., ídem). La co-transformación se realiza utilizando un Bio-Rad Gene Pulser a 2,5 kV, 200 ohms y 25 \muFa. La mezcla de cotransformación completa se cultiva en placa sobe 4 placas LB que contienen 25 \mug/ml de kanamicina. Las colonias más pequeñas se seleccionan y se expanden en LB/kanamicina, y el ADN del adenovirus recombinante se identifica mediante procedimientos miniprep con ADN normalizados. El ADN miniprep de adenovirus recombinante se transforma en células E. coli DH10B® competentes, y se prepara ADN utilizando un Maxi Kit (Qiagen, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del kit.

Aproximadamente 5 \mug de ADN adenoviral recombinante se digieren con la enzima PacI (New England Biolabs) durante 3 horas a 37ºC en un volumen de reacción de 100 \mul que contienen 20-30U de PacI. El ADN digerido se extrae dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipita con etanol. El sedimento de ADN se resuspende en 10 \mul de agua destilada. Un matraz T25 de células QBI-293 A (Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canada), inoculadas el día antes y desarrolladas hasta una confluencia de 60-70%, es transfectado con el ADN digerido con PacI. El ADN digerido con PacI se diluye hasta un volumen total de 50 \mul con HBS estéril (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM). En un tubo separado, se diluyen 20 \mul de sales de N-[1-(2,3-Dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) de 1 mg/ml hasta un volumen total de 100 \mul con HBS. Se añade el ADN al DOTAP, se mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo, y se deja a la temperatura ambiente durante 15 minutos. El medio se separa de las células 293 A y se lava con 5 ml de medio esencial mínimo sin suero (MEM) alfa que contiene piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales MEM 0,1 mM, y tampón HEPES 25 mM (reactivos obtenidos de Life Technologies, Gaithersburg, Md.). Se añaden 5 ml de MEM sin suero a las células 293 A y se mantienen a 37ºC. La mezcla de ADN/lípido se añade gota a gota al matraz T25 de células 293 A, se mezcla suavemente, y se incuba a 37ºC durante 4 horas. Después de 4 horas el medio que contiene la mezcla de ADN/lípido se separa por aspiración y se sustituye por 5 ml de MEM completo que contiene suero bovino fetal al 5%. Las células transfectadas se controlan en cuanto a la expresión de GFP y la formación de focos (placas virales).

Siete días después de la transfección de las células 293 A con el ADN adenoviral recombinante, las células expresan la proteína GFP y empiezan a formar focos ("placas" virales). El producto lisado celular bruto se recoge utilizando un raspador celular para recoger todas las células 293 A. El producto lisado se transfiere a un tubo cónico de 50 ml. Para liberar la mayoría de las partículas de virus de las células, se realizan tres ciclos de congelación/descongelación en un baño de hielo seco/etanol y un baño de agua a 37ºC.

El producto lisado bruto se amplifica (amplificación primaria (1º)) para obtener una "solución de partida" de trabajo de producto lisado zcyto20 rAdV.

Diez placas de 10 cm de células 293 A casi confluentes (80-90%) se ajustan 20 horas antes, se añaden 200 ml de producto lisado rAdV bruto a cada placa de 10 cm, y las células se controlan durante 48 a 72 horas en cuanto al CPE (efecto citopático) bajo el microscopio de luz blanca y a la expresión de GFP bajo el microscopio fluorescente. Cuando todas las células 293 A muestran CPE, se recoge este producto lisado de partida y se realizan ciclos de congelación descongelación como se ha descrito antes.

Después se realiza una amplificación secundaria (2º) de zcyto20 rAdV. Se preparan veinte placas para el cultivo de tejidos de 15 cm de células 293 A de manera que las células sean confluentes en 80-90%. Se separan todos menos 20 ml de medio MEM al 5%, y cada placa se inocula con 300-500 ml del producto lisado rAdV amplificado 1º. Después de 48 horas las células 293 A se lisan a partir de la producción del virus, el producto lisado se recoge en botellas de centrífuga de polipropileno de 250 ml, y se purifica el rAdV.

Se añade detergente NP-40 a una concentración final de 0,5% a las botellas de producto lisado con el fin de lisar todas las células. Las botellas se colocan sobre una plataforma giratoria durante 10 minutos agitando tan rápido como sea posible sin que se caigan las botellas. Los desechos se sedimentan mediante centrifugación a 20.000 x G durante 15 minutos. El sobrenadante se transfiere a botellas de centrífuga de policarbonato de 250 ml, y se añaden 0,5 volúmenes de solución de PEG8000/NaCl 2,5 M al 20%. Las botellas se sacuden durante la noche sobre hielo. Las botellas se centrifugan a 20.000\times G durante 15 minutos, y el sobrenadante se descarta en una solución blanqueadora. Utilizando un raspador celular estéril, el producto precipitado de virus/PEG, blanco, de 2 botellas se resuspende en 2,5 ml de PBS. La solución de virus resultante se coloca en tubos de microcentrífuga de 2 ml y se centrifuga a 14,000\times G en la microcentrífuga durante 10 minutos para separar cualquier desecho celular adicional. El sobrenadante de los tubos de centrífuga de 2 ml se transfiere a un tubo con capucha a presión y se ajusta a una densidad de 1,34 g/ml con CsCl. La solución se transfiere a tubos de centrífuga de paredes gruesas, de policarbonato, de 3,2 ml y se centrifuga a 348.000\times G durante 3-4 horas a 25 \muC. El virus forma una banda blanca. Utilizando puntas de pipeta de calibre ancho, se recoge la banda de virus.

Se utiliza una columna de intercambio iónico disponible en el mercado (p. ej., columnas PD-10 precargadas con Sephadex® G-25M; Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) para eliminar la sal de la preparación de virus. La columna se equilibra con 20 ml de PBS. El virus se carga y se deja circular en la columna. Se añaden 5 ml de PBS a la columna, y se recogen fracciones de 8-10 gotas. Las densidades ópticas de las diluciones 1:50 recogidas de cada fracción se determinan a 260 nm en un espectrofotómetro. Las fracciones del pico se reúnen, y se determina la densidad óptica (DO) de una dilución 1:25. La DO se convierte en concentración de virus utilizando la fórmula:
(DO a 260 nm)(25)(1,1\times10^{12})=viriones/ml.

Para almacenar el virus, se añade glicerol al virus purificado a una concentración final de 15%, se mezcla suave pero eficazmente, y se almacena a -80ºC.

Se sigue un protocolo desarrollado por Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Canada) para medir la infectividad del virus recombinante. Brevemente, se siembran dos placas para el cultivo de tejidos de 96 pocillos con 1\times10^{4} células 293 A por pocillo en MEM que contiene suero bovino fetal al 2% para cada virus recombinante que se va a analizar. Después de 24 horas se elaboran diluciones 1:10 de cada virus de 1\times10^{-2} a 1\times10^{-14} en MEN que contiene suero bovino fetal al 2%. Se colocan 100 \mul de cada dilución en cada uno de los 20 pocillos. Después de 5 días a 37ºC, se leen los pocillos positivos o negativos para CPE, y se calcula un valor para las "Unidades Formadoras de Placa/ml" (PFU).

Ejemplo 5 Clonación de Zcyto20, Zcyto22, Zcyto24, y Zcyto25 A: Zcyto20 y Zcyto22

Se diseñaron cebadores de PCR que eran comunes tanto a zcyto20 como a zcyto22 dentro de la secuencia codificadora pronosticada. Estos se denominan ZC39339 (SEQ ID NO:47) y ZC39393 (SEQ ID NO:48). La PCR se llevó a cabo sobre un panel de genotecas de ADNc humano de diferentes tejidos. El producto se observó en genotecas de cerebro, islotes (páncreas), próstata, placenta, testículo, HPVS (epitelio de próstata), y CD3+. Después se diseñaron cebadores de PCR a partir de la secuencia genómica 5' de la metionina de partida y 3' del codón de terminación para zcyto20 (con una elevada similitud con zcyto22). Estos fueron denominados ZC39340 (SEQ ID NO:49) y ZC39341 (SEQ ID NO:50). Se llevó a cabo la PCR sobre las genotecas identificadas previamente. Cuatro genotecas contuvieron clones completos. La secuenciación de los productos de la PCR generados de estas genotecas dio como resultado tres genotecas que contenían zcyto22 (próstata, testículo y CD3+), y una genoteca que contenía zcyto20 (HPVS (epitelio de próstata)). También se llevó a cabo una PCR utilizando cebadores específicos para la secuencia codificadora pronosticada de zcyto22. Estos se denominan ZC39295 (SEQ ID NO:51) y ZC39298 (SEQ ID NO:52). Las genotecas positivas por esta PCR fueron cerebro, próstata, CD3+, y testículo. La secuenciación confirmó la secuencia de zcyto22.

B: Zcyto24 y Zcyto25

Se diseñaron cebadores de PCR que eran comunes tanto a zcyto24 como a zcyto25 en la secuencia codificadora pronosticada. Estas se denominaron ZC39687 (SEQ ID NO:53) y ZC39741 (SEQ ID NO:54). Se llevó a cabo la PCR sobre un panel de genotecas de ADNc de ratón de diferentes tejidos. El producto se observó en las siguientes genotecas: corazón, pulmón, placenta, próstata de Torres, piel, intestino delgado, testículo y timo. Los cebadores de la PCR se diseñaron después 5' de la metionina de partida y en los codones de terminación. El cebador 5' se designa ZC39732 (SEQ ID NO:55) y empareja con las secuencias tanto de zcyto24 como de zcyto25. El cebador 3' de Zcyto24 se denomina ZC39701 (SEQ ID NO:56). El cebador 3' de zcyto25 se denomina ZC39688 (SEQ ID NO:57). La PCR se llevó a cabo sobre las genotecas positivas indicadas antes. Para zcyto24, todas las genotecas excepto corazón y próstata de Torres fueron positivas. La secuenciación confirmó la secuencia de zcyto24 a partir de genotecas de placenta, testículo, e intestino delgado. Para zcyto25, todas las genotecas excepto corazón y próstata de Torres fueron positivas. La secuenciación confirmó la secuencia de zcyto25 a partir de genoteca de pulmón.

Ejemplo 6 Expresión en Baculovirus A: Constructo para la Expresión de Zcyto20

Se preparó un vector de expresión, pzBV37L:zCyto20, para expresar polipéptidos zcyto20 en células de insecto. Se generó un fragmento de 536 pb que contenía la secuencia para zcyto20 y codificaba los sitios de restricción BspE1 y Xba1 sobre los extremos 5' y 3', respectivamente, mediante amplificación por PCR de un zcyto20 plasmídico utilizando los cebadores ZC41932 (SEQ ID NO:14) y ZC41933 (SEQ ID NO:15) utilizando el Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) como en las instrucciones del fabricante. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 1 ciclo de 94ºC durante 4 minutos, 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 1 ciclo a 72ºC durante 4 minutos; seguido de un enjuagado a 4ºC.

Se visualizó una pequeña porción del producto de la PCR mediante electroforesis en gel (agarosa NuSieve al 1%), y se confirmó una longitud del fragmento de aproximadamente 550 pb. El resto de la mezcla de reacción se purificó por medio de un kit de purificación Qiagen PCR como en las instrucciones del fabricante y se hizo eluir en 30 \mul de agua. El ADNc se digirió en un volumen de 36 \mul utilizando Bspe1 y Xba1 (New England Biolabs, Beverly, Mass.) en condiciones de tampón apropiadas a 37ºC. El producto de la PCR digerido se hizo correr a través de un gel agarosa TAE al 1%, se escindió y se extrajo utilizando un QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704) y se hizo eluir en 30 \mul de tampón EB. El producto de la PCR de zcyto20 digerido se ligó en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pZBV37L en los sitios Bspe1 y Xba1. El vector pZBV37L es una modificación del vector de expresión pFastBac1® (Life Technologies), donde el promotor de la polihedrosis ha sido separado y sustituido por el Promotor de la Proteína Alcalina de activación tardía y las secuencia señal del líder EGT aguas arriba del MCS. Se ligaron 5 \mul del fragmento de la PCR de zcyto20 digerido con enzimas de restricción y se ligaron 4 \mul del correspondiente vector pZBV37L durante 72 horas a 15ºC en un volumen de 20 \mul en condiciones de tampón apropiadas. Se transformaron 5 \mul de la mezcla de ligadura en 33 \mul de células ElectoMAX® DH12S® (Life Technologies, Cat. No. 18312-017) mediante electroporación a 400 Ohms, 2,00 kV y 25 pF en una cubeta de electroporación con espacios de 2 mm (BTX, Modelo Núm. 620). Las células transformadas se diluyeron en 500 \mul de medio LB y se hicieron sobrecrecer durante 1 hora a 37ºC y se cultivaron en placa 10 \mul y 20 \mul de la dilución sobre placas LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Los clones se analizaron mediante PCR y se seleccionaron los clones positivos, se cultivaron en placa, y se sometieron a secuenciación. Después se confirmó la secuencia.

B. Construcción y Expresión de Zcyto20 Etiquetado

Se preparó un vector de expresión, pZBV32L:zCyto20cee, para expresar polipéptidos zcyto20cee en células de insecto. PZBV32L:zCyto20cee fue diseñado para expresar un polipéptido zcyto20 con una etiqueta GLU-GLU C-terminal (SEQ ID NO:16). Este constructo se puede utilizar para determinar la secuencia de aminoácidos N-terminal de zcyto20 una vez que el péptido señal ha sido escindido.

1. Construcción de pZBV32L:zCyto20cee

Se generó un fragmento zcyto20 de 625 pb que contenía los sitios de restricción BamHI y XbaI en los extremos 5' y 3', respectivamente, mediante amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía ADNc de zcyto20 utilizando los cebadores zc40240 y zc40241 (SEQ ID NOS: 17 y 18, respectivamente). Las condiciones de reacción de la PCR fueron las siguientes: Se utilizó el Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) para un volumen de reacción de 100 \mul que contenía DMSO al 5%. 1 ciclo a 94ºC durante 4 minutos; 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 60 segundos; 1 ciclo a 72ºC durante 4 minutos; seguido de un enjuagado a 4ºC. Se visualizaron 5 \mul del fragmento de la PCR mediante electroforesis en gel (agarosa NuSieve al 1%). El resto de la mezcla de reacción se purificó por medio de un kit de purificación Qiagen PCR como en las instrucciones del fabricante y se hizo eluir en 30 \mul de agua. El ADNc fue digerido en un volumen de 35 \mul utilizando BamHI y XbaI (New England Biolabs, Beverly, Mass.) en condiciones de tampón apropiadas durante 2 horas a 37ºC. La banda del producto de PCR digerido se hizo correr a través de un gel de agarosa TAE al 1%, se escindió y se extrajo utilizando QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) y se hizo eluir en 30 \mul de agua. El producto de la PCR de zCyto20cee digerido, purificado se ligó en el sitio de clonación múltiple de un vector pZB32L preparado previamente y digerido con enzimas de restricción (BamHI y XbaI). El vector pZBV32L es una modificación del vector de expresión pFastBac1® (Life Technologies), donde el promotor de la polihedrosis ha sido separado y sustituido por el Promotor de la Proteína Alcalina de activación tardía, y la secuencia codificadora para la etiqueta Glu-Glu (SEQ ID NO:10) así como la señal de terminación fueron insertadas en el extremo 3' de la región de clonación múltiple. Se ligaron 5 \mul del inserto zCyto20 digerido con enzimas de restricción y 40 ng del correspondiente vector pZBV32L durante la noche a 16ºC en un volumen de 20 \mul. Se transformaron cinco \mul de la mezcla de ligadura en 50 \mul de células ElectoMAX® DH12s® (Life Technologies) mediante electroporación a 400 Ohms, 2,00 kV y 25 \muF en una cubeta de electroporación con un espacio de 2 mm. Las células transformadas se diluyeron en 500 \mul de medio SOC (Triptona Bacto al 2%, Extracto de Levadura Bacto al 0,5%, 10 ml de NaCl 1M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM) y se cultivaron en placa 50 \mul de la dilución sobre placas LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Se analizaron los clones mediante PCR y digestión con enzimas de restricción. Los clones positivos se seleccionaron y se cultivaron en placa para su secuenciación. Una vez que se hubo confirmado la secuencia apropiada, se transformaron 25 ng de ADN del clon positivo en 66 \mul de células competentes DH10Bac® Max Efficiency® (GIBCO-BRL) mediante choque térmico durante 45 segundos en un bloque térmico a 42ºC. Las células DH10Bac® transformadas se diluyeron en 600 \mul de medio SOC (Triptona Bacto al 2%, Extracto de Levadura Bacto al 0,5%, 10 ml de NaCl 1M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM) y se hicieron crecer a 37ºC durante 1 hora y se cultivaron en placa 100 \mul sobre placas de Agar Luria que contenía 50 \mug/ml de kanamicina, 7 \mug/ml de gentamicina, 10 \mug/ml de tetraciclina, 40 \mug/mL de IPTG y 200 \mug/mL de Bluo Gal. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Se utilizó una selección de color para identificar aquellas células que tenían ADN viral transpuesto (referido como "bácmido"). Aquellas colonias, que eran de color blanco, se escogieron para su análisis. Las colonias se analizaron mediante PCR y se seleccionaron las colonias positivas (que contenían el bácmido deseado) para el crecimiento y posterior purificación del ADN de los bácmidos. Se escrutaron los clones en cuanto al inserto de peso molecular correcto por medio de amplificación por PCR del ADN utilizando cebadores para el elemento transponible del bácmido: ZC447 (SEQ ID NO:19) y ZC976 (SEQ ID NO:20). Las condiciones de reacción para la PCR fueron las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 4 minutos; 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 2,5 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 4 minutos; seguido de enjuagado a 4ºC. El producto de la PCR se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1% para confirmar el tamaño del inserto. Aquellos que tenían el tamaño correcto se utilizaron para transfectar células de Spodoptera Frugiperda (Sf9).

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2. Transfección

Se sembraron células Sf9 a 1\times10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se dejó que se anclaran durante 1 hora a 27ºC. Se diluyeron aproximadamente 5 \mug de ADN del bácmido hasta 100 \mul con Sf-900 II SFM (Life Technologies). Se diluyeron 20 \mul de Lipofectamine® Reagent (Life Technologies) hasta 100 \mul con Sf-900 II SFM. El ADN del bácmido y las soluciones de lípido se mezclaron suavemente y se incubaron durante 45 minutos a la temperatura ambiente. Se añadieron 800 \mul de Sf-900 II SFM a la mezcla de lípidos-ADN. El medio se aspiró del pocillo y se añadió 1 ml de la mezcla de ADN-lípidos a las células. Las células se incubaron a 27ºC durante la noche. La mezcla de ADN-lípidos se aspiró de cada pocillo y sustituyó por 2 ml de medio Sf-900 II. Las placas se incubaron a 27ºC, humedad del 90%, durante aproximadamente 7 días después de lo cual se cosechó el virus.

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3. Amplificación

Se sembraron células Sf9 a 1\times10^{6} células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Se colocaron 500 \mul de virus de la placa de transfección en el pocillo y la placa se incubó a 27ºC, humedad 90%, durante 96 horas después de lo cual se cosechó el virus (amplificación primaria).

La segunda ronda de amplificación se llevó a cabo transfiriendo 100 \mul de virus de la placa de amplificación primaria a pocillos que contenían 1\times10^{6} células por pocillo. La placa se incubó durante 96 horas antes de la cosecha.

Se realizó una ronda adicional de amplificación (amp. terciaria). Se hicieron crecer células Sf9 en 50 ml de Sf-900 II SFM en un matraz de sacudimiento de 250 ml a una densidad aproximada de 1\times10^{6} células/ml. Después se infectaron con 1 ml de solución de partida viral de la placa anterior y se incubaron a 27ºC durante 6 días momento después del cual se cosechó el virus.

La solución viral de partida se tituló mediante una curva de inhibición del crecimiento y se dejó que el cultivo con un título que indicaba una Multiplicidad de Infección (MOI) de uno continuara durante un total de 48 horas. El sobrenadante se analizó por medio de un Western reducido utilizando un anticuerpo monoclonal primario específico para la etiqueta Glu-Glu seguido de un anticuerpo secundario anti-murino de cabra conjugado con HRP. Los resultados indicaron una banda de aproximadamente 20 kDa. También se suministró sobrenadante para el análisis de la
actividad.

Después se generó una gran solución de partida viral mediante el siguiente método: se hicieron crecer células Sf9 en IL Sf-900 II SFM en un matraz con sacudimiento de 2.800 ml hasta una densidad aproximada de 1\times10^{6} células/ml. Después se infectaron con 5 ml de la solución viral de partida del matraz anterior y se incubaron a 27ºC durante 4 días momento después del cual se cosechó el virus.

Se completaron infecciones a mayor escala para proporcionar material para la purificación aguas abajo.

De uno modo similar, se expresaron zcyto21 y zcyto22 en Baculovirus

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Ejemplo 7 Purificación de Proteína

Se puede elaborar proteína recombinante para cualquiera de las proteínas descritas en la presente memoria.

A. Purificación de Zcyto20

Se produjo zcyto20 etiquetado con Glu-Glu carboxilo terminal a partir de células de insecto infectadas con baculovirus recombinante, o líneas celulares BHK, estables o transitorias. Se recogieron los cultivos, y los medios se filtraron en condiciones estériles utilizando un filtro de 0,2 \mum.

Las proteínas se purificaron del medio acondicionado mediante una combinación de cromatografía de afinidad con anticuerpo Anti-péptido Glu-Glu (Anti-EE) y cromatografía de exclusión en gel Superdex 75. El medio de cultivo de BV (pH 6,0, conductividad 7 mS) se ajustó a pH 6,7. Después se añadió NaCl a los medios de BV y BHK hasta 300 mM antes de cargarlos en una columna de afinidad de Proteína A-anticuerpo anti-EE POROS de 10 x 70 mm (volumen de la columna 5 ml) a un flujo de 2-5 ml/minuto. Luego se lavó la columna con cinco veces el volumen de la columna (CV) de 5\timesPBS (pH 7,2). La proteína unida se hizo eluir con ácido acético 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 3,0. Se recogieron fracciones de 2 ml, y el eluyente se neutralizó mediante la adición de Tris 2 M. Las muestras de la columna de afinidad de anticuerpo anti-EE se analizaron mediante SDS-PAGE con tinción con plata y transferencia western en cuanto a la presencia de la proteína zcyto20. Las fracciones que contenían la proteína zcyto20 se reunieron y se concentraron a aproximadamente 2 ml utilizando un concentrador Biomax-5 (Millipore), y se cargaron sobre una columna de filtración en gel Superdex 75 de 16x600 mm (Amersham Pharmacia Biotech). Las fracciones que contenían la proteína zcyto20 purificada se reunieron, se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum, se tomaron alícuotas de 100 \mul cada una, y se congelaron a -80ºC. La concentración de la proteína purificada final se determinó mediante análisis BCA (Pierce, Rockford, Ill.) y análisis de aminoácidos por HPLC.

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B. Análisis SDS-PAGE y de Transferencia Western de Proteínas Zcyto20

Se analizó la proteína zcyto20 recombinante mediante SDS-PAGE (Bis-Tris Nupage 4-12%, Invitrogen, Calsbad, Ca.) con un método de tinción con plata (Fast Silver, Geno Technology, Inc., St. Louis, Mo.) y transferencia Western utilizando anticuerpo anti-EE. Se sometieron a electroforesis o bien el medio acondicionado o bien la proteína purificada utilizando un Xcell II® MINI-CELL (Invitrogen, Calsbad, Ca.) y se transfirieron a nitrocelulosa (0,2 \mum; Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca.) a la temperatura ambiente utilizando un módulo de transferencia Xcell II® (Invitrogen) con agitación de acuerdo con las directrices proporcionadas en el manual del aparato. La transferencia se hizo correr a 500 mA durante 45 minutos en un tampón que contenía base Tris 25 mM, glicina 200 mM, y metanol al 20%. Después los filtros se bloquearon con leche en polvo desnatada al 10% en PBS durante 10 minutos a la temperatura ambiente. La nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, y después se añadió anticuerpo primario en PBS que contenía leche en polvo no grasa al 2,5%. Las transferencias se incubaron durante dos horas a la temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC con sacudimiento débil. Después de la incubación, las transferencias se lavaron tres veces durante 10 minutos cada una en PBS. Se añadió el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante; obtenida de Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) diluido 1:2000 en PBS que contenía leche en polvo desnatada al 2,5%, y las transferencias se incubaron durante dos horas a la temperatura ambiente con sacudimiento suave. Las transferencias se lavaron después tres veces, 10 minutos cada una, en PBS, luego se enjuagaron rápidamente en H_{2}O. Las transferencias se revelaron utilizando reactivos con sustrato quimioluminiscente asequibles comercialmente (reactivos SuperSignal® ULTRA 1 y 2 mezclados 1:1; reactivos obtenidos de Pierce Chemical Co.), y la señal se capturó utilizando el soporte lógico Lumi-Imager's Lumi Analyst 3.0 (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) en tiempos que oscilaban de 10 segundos a 5 minutos o según fuera necesario.

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C. Resumen de la Purificación y Análisis de Proteínas

La proteína zcyto20-CEE purificada del medio BV migró en forma de un monómero de 21 kDa sobre el gel Bis-Tris al 4-12%, también se observó una banda de dímero de 36 kD minoritaria. La proteína dimérica se convirtió en banda de monómero tras la reducción utilizando un agente reductor, lo que sugirió la dimerización de zcyto20-CEE por enlaces disulfuro, y coincide con el número impar (un total de siete) de restos cisteína que dan como resultado un enlace disulfuro intercatenario.

Los polipéptidos zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 fueron purificados de una manera similar.

Ejemplo 8 Regiones Reguladoras de la Transcripción de Tipo Interferón de Zcyto20

Se realizaron los alineamientos de la secuencia local de los promotores de IFN-\alpha, IFN-\beta, IFN-\gamma caracterizados y los de otras numerosas citoquinas con las regiones aguas arriba de zcyto20, zcyto21, y zcyto24 para identificar si estos genes estaban regulados simultáneamente. La hipótesis era que las propiedades comunes de la regulación génica debían estar reflejadas en similitudes de secuencia de las regiones aguas arriba de los genes.

Debido a la baja especificidad de unión de los TF, las predicciones de sitios de unión individuales tienen una alta tasa de falsos positivos. Por lo tanto, las predicciones de los sitios en el aislamiento para la identificación de los sitios de unión con papeles funcionales in vivo no son útiles. Sin embargo, se pueden seleccionar los sitios de unión pronosticados que es probable que tengan funciones específicas de la secuencia por medio de un filtro basado en la conservación: La observación biológica de que las regiones reguladoras a menudo están más fuertemente conservadas entre especies que otras regiones no codificadoras puede ser cuantificada para revelar patrones de conservación de se han denominado huellas filogenéticas (Fickett, et al., Curr. Opin. Biotechnol. 11: 19-24, 2000.) En particular, las comparaciones humano-roedor han demostrado una valiosa fuente de identificación de elementos reguladores funcionales (Wasserman et al., Nat. Genet. 26: 225-228, 2000).

Los alineamientos revelaron emparejamientos significativos principalmente entre los promotores de diversos genes de IFN\alpha, mientras, basándose en este análisis, existe una pequeña evidencia de similitud entre los promotores de zcyto20-22 y otras citoquinas.

Se realizaron alineamientos de secuencias por pares con DBA (Jareborg et al., Genome. Res. 9: 815-824, 1999). La búsqueda de sitios de unión a factores de transcripción individuales se realizó con matrices de peso de la posición normalizadas (Fickett, Mol. Cell. Biol. 16:437-441, 1996) retiradas de la base de datos TRANSFAC (versión 3.0, Wingender et al., Nucleic Acids Res. 28: 316-319, 2000), y los alineamientos de las regiones 1-4 se computaron con SSEARCH, versión 3.1t12 (Pearson, Genomics 11:635-650, 1991). Basándose en los estudios publicados que implican otros grupos de TF, se puede esperar que la mayoría de los sitios de unión naturales suficientemente conservados entre ser humano y ratón sean detectados en el uso del intervalo de puntuaciones utilizado (Fickett, Mol. Cell. Biol. 16: 437-4411996; Wasserman et al., J. Mol. Biol. 278: 167-181, 1998).

Los resultados computacionales sugieren que cabría esperar rasgos comunes para la regulación de la familia de zcyto20 y otras citoquinas que se reflejaran por la similitud de la secuencia a nivel de sitios de unión individuales en lugar de emparejamientos que abarcaran regiones ampliadas.

Basándose en la búsqueda de sitios de unión de un grupo de 32 TF, se realizó la identificación de supuestos sitios de un número limitado de factores conocidos en su mayor parte por estar implicados en la regulación transcripcional de los interferones. Los resultados de la comparación muestran supuestos sitios de unión de TF que juegan importantes papeles en la regulación transcripcional de IFN-\beta [NF-\kappaB, ISRE (elemento de unión IRF)] e IFN-\gamma (AP-1, CREB, GATA, NF-\kappaB, NF-AT) que también están presentes en las regiones no codificadoras conservadas. Por ejemplo, un par de sitios AP-1/NF-AT colindantes en la región 1, es un ejemplo bien documentado de unión cooperativa que existe en muchos promotores de citoquinas (Holloway et al., Mol. Immunol. 38: 567-580, 2000).

Los sitios de unión para los TF que han sido identificados como críticos para la regulación de citoquinas, sugieren que la agrupación de sitios de unión de los factores de transcripción en la región promotora de zcyto20 es un candidato para una región funcional.

El alineamiento de la región 2 con el grupo de citoquinas conocidas produjo un emparejamiento en el promotor AK155, en la posición -415 con respecto al sitio de inicio de la transcripción de AK155 que proporcionan Knappe et al. (J. Virol. 74: 3881-3887, 2000). El hecho de que haya un supuesto sitio de unión NF-kB en esa localización en el promotor de zcyto20 indica la posible presencia de un sitio NF-\kappaB en el promotor AK155.

Ejemplo 9 Animales Transgénicos

Se produjeron animales transgénicos que expresaban los genes Zcyto21 utilizando machos fértiles, adultos (sementales) (B6C3fl, 2-8 meses de edad (Taconic Farms, Germantown, N.Y.)), machos vasectomizados (estériles "duds") (CD1, 2-8 meses, (Taconic Farms)), hembras fértiles prepubescentes (donantes) (B6C3fl, 4-5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles adultas (receptoras) (CD1, 2-4 meses, (Taconic Farms)).

Las donantes fueron aclimatadas durante 1 semana y después se les inyectaron aproximadamente 8 UI/ratón de gonadotropina Pregnant Mwere's Serum (Sigma, St. Louis, Mo.) I.P., y 46-47 horas más tarde, 8 UI/ratón de gonadotropina Coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir una superovulación. Las donantes fueron apareadas con sementales después de las inyecciones de hormona. La ovulación generalmente se produce a las 13 horas de la inyección de hCG. La copulación se confirmó por la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente del apareamiento.

Se recogieron los huevos fertilizados con un ámbito quirúrgico (Microscopio Estero Leica MZ12, Leica, Wetzlar, Del.). Se recogieron los oviductos y se liberaron los huevos en portas para análisis urinario que contenían hialuronidasa (Sigma). Los huevos se lavaron una vez en hialuronidasa, y dos veces en medio W460 de Whitten (Tabla 7) que había sido incubado con CO_{2} al 5%, O_{2} al 5%, N_{2} al 90% a 37ºC. Los huevos se almacenaron después en una incubadora a 37ºC/CO_{2} al 5% hasta la microinyección.

Se linealizaron de diez a veinte microgramos de ADN plasmídico que contenía un ADNc del gen de Zcyto21, se purificó en gel, y se resuspendió en Tris 10 mM pH 7,4, EDTA 0,25 mM pH 8,0, a una concentración final de 5-10 nanogramos por microlitro para su microinyección.

El ADN plasmídico fue inyectado en los huevos recogidos contenidos en una gota de medio W640 recubierto con aceite mineral equilibrado con CO2, templado. El ADN fue retirado en una aguja para inyección (apartada de un capilar de vidrio de borosilicato, DI 0,75 mm, DE 1 mm), e inyectado en los huevos individuales. Cada huevo fue penetrado por la aguja de inyección, en uno o ambos pronúcleos haploides.

Se inyectaron picolitros de ADN en los pronúcleos, y la aguja de inyección se retiró sin que entrara en contacto con los nucleolos. El procedimiento se repitió hasta que todos los huevos estuvieron inyectados. Los huevos microinyectados con éxito fueron transferidos a una placa para el cultivo de tejidos y órganos con medio W640 pregasificado para su almacenamiento durante la noche en una incubadora a 37ºC/CO_{2} al 5%.

Al día siguiente, se transfirieron 12-17 embriones de 2 células sanos de la inyección del día anterior al receptor. Se localizó la ampolla hinchada y manteniendo el oviducto entre la ampolla y la bursa, se realizó una muesca en el oviducto con una aguja 28 g cerca de la bursa, asegurándose de no romper la ampolla o la bursa. Los embriones se implantaron a través de esta muesca, y manteniéndolos sobre la pared peritoneal, se condujeron de nuevo los órganos reproductores a la cavidad abdominal.

Los receptores se devolvieron a las jaulas por parejas, y se permitieron 19-21 días de gestación. Los animales inyectados con el ADNc de Zcyto21 murieron antes de nacer.

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TABLA 7

7

Ejemplo 10 Producción de Anticuerpo A: Anticuerpos Policlonales para Zcytor19

Se preparan anticuerpos policlonales inmunizando 2 conejos blancos New Zealand hembra con la proteína recombinante purificada huzcytor19/MBP-6H. Se le administra a cada uno de los conejos una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 \mug de proteína purificada en Coadyuvante Completo de Freund seguido de inyecciones ip de refuerzo de 100 \mug de péptido en Coadyuvante Incompleto de Freund cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones en total), se toman muestras de sangre de los animales y se recoge el suero. Después los animales se refuerzan y se toman muestras se sangre cada tres semanas.

El suero de conejo específico de huzcyotr19/MBP-6H es pre-adsorbido de anticuerpos anti-MBP utilizando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB, Peapack, N.J.) que se prepara utilizando 10 mg de MBP recombinante purificada por gramo de CNBr-SEPHAROSE. Los anticuerpos policlonales específicos de huzcytor19 son purificados por afinidad del suero de conejo utilizando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B que se prepara utilizando 10 mg de la proteína recombinante purificada para el antígeno específico huzcytor19/MBP-6H seguido de 20\times diálisis en PBS durante la noche. Los anticuerpos específicos de huzcytor19 son caracterizados mediante ELISA utilizando 500 ng/ml de las proteínas recombinantes purificadas huzcytor19/MBP-6H o huzcytor19-Fc4 como dianas para el anticuerpo. Se determina el límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzcytor19/MBP-6H de conejo sobre su antígeno recombinante purificado específico huzcytor19/MBP-6H y sobre huzcytor19-Fc4 recombinante purificado.

B: Anticuerpos Policlonales para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25

Se preparan anticuerpos policlonales inmunizando conejos blancos New Zealand hembra con la proteína recombinante purificada zcyto20/MBP-6H, zcyto21/MBP-6H, y zcyto22/MBP-6H, así como zcyto24/MBP-6H, o zcyto25/MBP-6H de ratón. Se les administra a los conejos una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 \mul de proteína purificada en Coadyuvante Completo de Freund seguido de inyecciones ip de refuerzo de 100 \mug de péptido en Coadyuvante Incompleto de Freund cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones en total), se toman muestras de sangre de los animales y se recoge el suero. Después se refuerzan los animales y se toman muestras de sangre cada tres semanas.

El suero de conejo específico de zcyto20/MBP-6H, zcyto21/MBP-6H, zcyto22/MBP-6H, zcyto24/MBP-6H, o zcyto25/MBP-6H puede ser pre-adsorbido de los anticuerpos anti-MBP utilizando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB, Peapack, N.J.) que se prepara utilizando 10 mg de MBP recombinante purificada por gramo de CNBr-SEPHAROSE. Los anticuerpos policlonales específicos de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 son purificados por afinidad del suero de conejo utilizando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B que se prepara utilizando 10 mg de la proteína recombinante purificada para el antígeno específico seguido de 20\times diálisis en PBS durante la noche. Los anticuerpos se caracterizan mediante ELISA utilizando 500 ng/ml de las proteínas recombinantes purificadas como dianas para el anticuerpo. Se determina el límite de detección inferior (LLD) del anticuerpo purificado sobre su antígeno recombinante purificado específico.

Se prepararon anticuerpos policlonales para zcyto21 utilizando un protocolo similar inmunizando conejos con proteína etiquetada con zcyto21-CEE, y se purificaron los anticuerpos.

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Ejemplo 11 Expresión de los Genes Zcyto20 Zcyto211 Zcyto22 Zcyto24 y Zcyto25 Después de una Inducción con Ácido Poliinosí- nico-Ácido Policitidílico A: Diversos Tipos de Células

Se hicieron crecer cultivos de células primarias (células epiteliales bronquiales humanas normales, fibroblastos dérmicos humanos normales, células endoteliales de vena umbilical humana, células endoteliales microvasculares humanas y células de musculatura lisa humana; CLONETICS Corporation; Walkersville, Md.) y líneas celulares de coriocarcinoma humano (células Jar, BeWo, y 3A-Sub E; ATCC, Manassas, Va.) en presencia de ácido poliinosínico-ácido policitidílico (poli I:C; 100 \mug/ml) (SIGMA; St. Louis, Mo.) o en medio solo. En algunos casos también se sometieron a ensayo 10 ng/ml de hTNFa o 10 ng/ml de hIL1b. Después de cuatro horas de incubación, se aisló el ARN total de las células y se trató con ADNasa sin ARNasa. Se utilizó un microgramo de ARN total para la síntesis del ADNc de la primera hebra utilizando el kit Advantage RT-for-PCR como sugiere el fabricante (Clontech, Palo Alto, Ca.). Se utilizó un 5% de la reacción de ADNc para la reacción en cadena de la polimerasa como sugiere el fabricante (Clontech) utilizando los siguientes pares de cebadores: zcyto20, ZC40134 (SEQ ID NO:30), ZC40214 (SEQ ID NO:31); zcyto21, ZC40209 (SEQ ID NO:32), ZC40213 (SEQ ID NO:33); zcyto22, ZC39295 (SEQ ID NO:34), y ZC39298 (SEQ ID NO:35). Se utilizaron cebadores para G3PDH como control.

Se detectó ARNm de zcyto20 a bajos niveles en todos los tipos de células sometidos a ensayo. Se observaron niveles de ARNm de zcyto20 incrementados en las células NHBE, HUVEC, JAR, 3-A Sub E y BeWo estimuladas con poli I:C. Se detectó ARNm de zcyto22 a bajos niveles en todos los tipos de células sometidos a ensayo. Se observaron niveles de ARNm de zcyto22 incrementados en las células NHBE, JAR, 3-A Sub E y BeWo estimuladas con poli I:C. Estos resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto20 y zcyto22 es estimulada por el inductor de interferón conocido, poli I:C.

Se detectó ARNm de zcyto21 a bajos niveles en todos los tipos de células sometidas a ensayo. Se observaron aumentos de niveles de ARNm de zcyto21 incrementados en las células NHBE, HUVEC, NHDF, SMC, HMVEC, JAR, 3-A Sub E y BeWo estimuladas con poli I:C. También se observaron niveles de ARNm de zcyto21 incrementados en las células placentarias 3-A Sub E tratadas con IL1b. Estos resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto21 es estimulada por el inductor de interferón conocido, poli I:C y también pueden ser estimulada por la citoquina IL1b en ciertos tipos de células.

B: Células mononucleares de sangre periférica

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica completas a partir de sangre humana utilizando Ficoll Hypaque. Se purificaron células T de las células mononucleares de sangre periférica mediante columnas de selección positiva VarioMacs como en las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, Ca.). Las muestras de cada población se tiñeron y se analizaron mediante análisis de clasificación de células con anticuerpos fluorescentes (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, Ca.) para determinar el porcentaje de enriquecimiento. Las células T CD3+ fueron purificadas aproximadamente en 95%. Los leucocitos de sangre periférica completa o las células T CD3+ se hicieron crecer en presencia de poli I:C (100 \mug/ml) o en medio solo. Después de cuatro horas de incubación, se aisló el ARN total de las células y se trató con ADNasa sin ARNasa. Se realizó una RT-PCR con el kit Superscript One-Step RT-PCR con Platinum Taq (Invitrogen, Frederick, Md.) utilizando 100 ng de ARN total como molde para la síntesis de ADNc. Los pares de cebadores para la PCR utilizados fueron: ZC40134 (SEQ ID NO:30) y ZC40214 (SEQ ID NO:31); zcyto21: ZC40209 (SEQ ID NO:32) y ZC40213 (SEQ ID NO:33); zcyto22: ZC39295 (SEQ ID NO:34) y ZC39298 (SEQ ID NO:35). También se sometieron a ensayo alícuotas cada ARN con pares de cebadores específicos para la Clase I del MHC (Clontech) como control.

Se detectó ARNm de zcyto20 en células mononucleares de sangre periférica completa estimuladas con poli I:C. Los resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto20 es estimulada por el inductor de interferón conocido, poli I:C en células mononucleares de sangre periférica.

Se detectó ARNm de zcyto21 en células mononucleares de sangre periférica completas y en células T CD3+ estimuladas con poli I:C. Los resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto21 es estimulada por el inductor de interferón conocido, poli I:C en células mononucleares de sangre periférica incluyendo células T CD3+.

Se detectó ARNm de zcyto22 en células mononucleares de sangre periférica completas y en células T CD3+ estimuladas con poli I:C. Los resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto 22 es estimulada por el inductor de interferón conocido, poli I:C en células mononucleares de sangre periférica incluyendo células T CD3+.

Estos resultados son indicativos del efecto que podría tener poli I:C sobre zcyto24 y zcyto25 así como sobre otros miembros de la familia.

Ejemplo 12 Análisis de Expresión de Células Inmunitarias Primarias y Líneas Celulares Inmunitarias Humanas Utilizando RT-PCR

Se escrutó un panel de ARN de poblaciones de células inmunitarias humanas primarias y líneas celulares inmunitarias humanas en cuanto a la expresión de zcyto21, zcyto21, y zcyto22 utilizando una RT-PCR. Los paneles fueron elaborados internamente y contenían el ARN de dieciséis células en reposo y activadas diferentes como se describe más abajo. Todas las poblaciones de células inmunitarias primarias se aislaron de la sangre de diversos donantes anónimos. Después se aislaron diversos subgrupos de células inmunitarias (CD3+, CD14+, CD19+, y CD56+) utilizando Microbeads marcadas y el Magnetic Cell Separation System de Miltenyi Biotec. El ARN se preparó utilizando el RNeasy Midiprep® Kit (Qiagen, Valencia, Ca.) como en las instrucciones del fabricante. Se aisló el ARN de células NK CD56+ de las células en su fase de reposo. Se activó una población CD3+ utilizando una combinación de 500 ng/ml de Ionomicina y 5,0 ng/ml de PMA (forbol 12-miristato 13 acetato). Se estimuló otra población CD3+ utilizando el sobrenadante de esplenocitos de rata estimulados con Concavalina A, un medio que se sabe que es rico en citoquinas y factores de crecimiento. Se recogieron células CD3+ para el aislamiento del ARN en momentos de activación de 0, 4 y 16 horas. Las muestras CD19+ se aislaron de tonsila humana y se activaron con 0,5 \mug/ml de ionomicina y 10 ng/ml de PMA. Después se recogieron las células a las 0, 4 horas y 24 horas y se aisló el ARN. Se activaron monocitos CD14+ humanos con 0,1 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) o 1,0 ng/ml de LPS durante 20 horas. Después se recogieron células en reposo y activadas y se aisló el ARN. Además, se aisló el ARN de las líneas celulares monocíticas humanas en reposo y activadas HL-60, THP-1 y U937. Se activaron células HL-60 durante la noche con 10 ng/ml de PMA. Las células THP-1 se activaron durante la noche con 1,0 ng/ml de LPS+10 ng/ml de IFN gamma. Finalmente, se activaron las células U937 durante la noche con 10 ng/ml PMA. Se realizó la RT-PCR con el kit Superscript One-Step RT-PCR con Platinum Taq (Invitrogen) utilizando 100 ng de ARN total como molde para la síntesis de ADNc. Los pares de cebadores utilizados para la PCR fueron: zcyto20: ZC40632 (SEQ ID NO:36) y ZC40633 (SEQ ID NO:37); zcyto21: ZC40209 (SEQ ID NO:32) y ZC40213 (SEQ ID NO:33); y zcyto22: ZC40638 (SEQ ID NO:38) y ZC40639 (SEQ ID NO:39). Las alícuotas de cada ARN también fueron sometidas a ensayo con pares de cebadores específicos para la Clase I del MHC (Clontech) como control.

Se detectó el ARNm de zcyto20 en células THP-1 tratadas con LPS e interferón gamma. También se detectó ARNm de zcyto20 en células CD3+ tratadas con PMA durante 4 horas. Se detectó ARNm de zcyto21 a bajos niveles en células U937 en reposo y células THP-1 en reposo. El nivel de ARNm de zcyto21 aumentó tras el tratamiento de las células THP-1 con LPS e interferón gamma. También se detectó ARNm de zcyto21 en células CD3+ tratadas con PMA durante 4 horas. Se detectó ARNm de zcyto22 en células THP-1 tratadas con LPS e interferón gamma. Asimismo se detectó ARNm de zcyto22 en células CD3+ tratadas con PMA durante 4 horas y 16 horas así como células CD3+ tratadas con Conconavalina A durante 4 y 16 horas. Los resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 es estimulada por la activación de una línea celular monocítica y células inmunitarias CD3+ primarias.

Estos resultados son indicativos del efecto que poli I:C podría tener sobre zcyto24 y zcyto25 así como otros miembros de la familia.

Ejemplo 13 Actividad Antiviral: Efecto Citopático en Células HeLa y L929

Los análisis funcionales iniciales para la actividad antiviral se llevaron a cabo utilizando medio acondicionado de células de riñón embrionario humano (HEK) transfectadas transitoriamente. La producción de este medio acondicionado se describe como sigue. Se clonó un ADNc completo para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 en el vector pzp7Z utilizando procedimientos normalizados. Los constructos de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 se transfectaron en células HEK 293. Brevemente, para cada constructo se cultivaron en placa 700.000 células/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente 18 horas antes de la transfección en 2 mililitros de DMEM+suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se añadieron 1,5 microgramos de ADN de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 y 0,5 microgramos de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Se utilizaron dos microgramos de ADN de pIRES2-EGFP solo como control negativo. Estas mezclas de transfección se añadieron 30 minutos más tarde a las células 293 previamente cultivadas en placa. Veinticuatro horas más tarde los medios celulares se separaron y se añadió DMEM+seralbúmina bovina al 0,1%. Los medios acondicionados se recogieron después de 48 horas, se filtraron a través de un filtro de 0,45 micras y se utilizaron para análisis antivirales e informadores.

Los análisis antivirales se llevaron a cabo utilizando células de carcinoma cervical humano (HeLa) y células de fibroblasto de ratón (L929). El primer día, el medio acondicionado que contenía zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 (Véase el Ejemplo 10) se diluyó y se cultivó en placa con 50.000 células en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. Tras una incubación de 24 horas a 37ºC, el medio se separó y se sustituyó por medio que contenía virus de la encefalomiocarditis a una multiplicidad de infección de 0,1. Las células se incubaron de nuevo durante 24 horas a 37ºC. Después se puntuaron los pocillos de cultivo visualmente sobre una escala de 4 puntos en cuanto a la presencia de efecto citopático, que después se convirtió en % de CPE como se muestra en la Tabla 8. El medio acondicionado de las células transfectadas con GFP sola e interferón-a-2a humano o interferón-alfa murino purificado se incluyeron como controles.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8 Determinación del Efecto Citopático

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La Tabla 9 muestra que el medio acondicionado que contiene zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 inhibía la infección viral (% CPE) en células HeLa de una manera dependiente de la dosis, mientras el medio acondicionado de GFP de control no logró bloquear significativamente la aparición del efecto citopático. Como se muestra en la Tabla 10, el medio acondicionado que contenía zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 no inhibió la infección viral en las células L929. En ambos experimentos el interferón purificado mostró actividad antiviral positiva.

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TABLA 9 Porcentaje de Efecto Citopático de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 en Células HeLa utilizando Medio Acondicionado (CM)

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TABLA 10 Porcentaje de Efecto Citopático de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 en Células L929 utilizando Medio Acondicionado (CM)

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Como seguimiento, se utilizó medio acondicionado de células Sf9 infectadas con baculovirus que expresaban zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 en los análisis antivirales. El medio acondicionado de las células Sf9 infectadas con baculovirus de tipo salvaje se utilizó como control negativo.

Los resultados del análisis antiviral utilizando medio acondicionado derivado de baculovirus fueron similares a aquellos en los que se utilizaba medio acondicionado transfectado transitoriamente de 293. La Tabla 11 muestra el medio acondicionado derivado de baculovirus que contenía infección viral inhibida por zcyto21 en células HeLa de una manera dependiente de la dosis, mientras el medio acondicionado de baculovirus de control no lograba bloquear la aparición del efecto citopático.

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TABLA 11 Porcentaje de Efecto Citopático en Células HeLa utilizando Medio Acondicionado con zcyto20 derivado de Baculovirus (CM)

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La producción del constructo de baculovirus y de medio acondicionado se ha descrito antes.

Ejemplo 14 La Actividad Antiviral no puede ser Bloqueada por los Anticuerpos Contra la Cadena 2 Beta del Receptor del Interferón Alfa Humano

Se llevaron a cabo análisis antivirales adicionales utilizando células de carcinoma cervical humano (HeLa). El primer día, se diluyeron MAb anti-Receptor-IFN-hu (Research Diagnostics Inc) y MAb de control negativo emparejados por el isotipo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. El medio acondicionado de las células Sf9 infectadas con baculovirus que expresaban zcyto20, zcyto21, o zcyto22 se añadió para obtener una concentración final de 0,0625\timesCM y se cultivaron en placa con 50.000 células HeLa por pocillo. Tras una incubación de 24 horas a 37ºC, se separó el medio y se sustituyó por medio que contenía virus de la encefalomiocarditis a una multiplicidad de infección de 0,1. Las células se incubaron de nuevo durante 24 horas a 37ºC. Los pocillos de cultivo se puntuaron visualmente en cuanto a la presencia de efecto citopático (CPE), como se muestra en la Tabla 8. Se incluyó como control positivo interferón-a-2a humano purificado a una concentración de 0,01 ng/ml.

La Tabla 12 muestra que el medio acondicionado que contenía zcyto20, zcyto21, y zcyto22 tenía actividad antiviral en células HeLa (como indicaba el cero % de CPE) en presencia o ausencia de anticuerpos neutralizadores contra la cadena 2-beta del receptor del interferón alfa humano. En cambio, la actividad antiviral del interferón-a-2a era inhibida de una manera dependiente de la dosis específicamente en presencia de anticuerpos neutralizadores contra la cadena 2-beta del receptor del interferón-alfa humano. Estos datos indican que zcyto20 zcyto21, y zcyto22 interaccionan con un receptor distinto del receptor del interferón alfa humano o éste interacciona con el receptor del interferón alfa humano con un mecanismo diferente del del interferón-a-2a humano.

TABLA 12 Porcentaje del Efecto Citopático en Células HeLa utilizando Medio Acondicionado (CM) con zcyto20, zcyto21, o zcyto22 y Anticuerpos Neutralizadores contra la Cadena 2-Beta del Receptor del Interferón Alfa Humano

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Ejemplo 15 Análisis Antiproliferación Utilizando una Línea Celular BAF3

Se utiliza BaF3 para determinar si Zcyto20 tiene propiedades anti-proliferativas. Se transfectan establemente células de riñón de cría de hámster (BHK) con un vector de expresión que contiene el promotor de CMV más el intrón A aguas arriba del ADNc de Zcyto20 o de un ADNc no relacionado, denominado Z\alpha30, utilizando BRL lipofectamina. Las células transfectadas establemente se siembran en una factoría de células en medio sin suero y se deja que crezcan durante tres días antes de recoger y concentrar el medio acondicionado en un filtro 5K a 10X. Las muestras de medio acondicionado concentrado se almacenan a 4ºC.

El siguiente análisis se utiliza para someter a ensayo la anti-proliferación de BaF3. En una placa de 96 pocillos, se realizan diluciones ocho seriadas 1:2 de medio de crecimiento solo (RPMI 1640, suero bovino fetal 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM), o IL-3 murina (partiendo de 50 pg/ml en medio de crecimiento) con un volumen final de 100 \mul. Se añaden cincuenta microlitros de lo siguiente a ambas calles con medio de crecimiento solo o mIL-3 diluida: interferón-\alpha humano (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1 ng/ml diluido en medio de crecimiento), interferón-\beta (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1 ng/ml diluido en medio de crecimiento), interferón-\alpha murino (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1 ng/ml diluido en medio de crecimiento), interferón-\beta murino (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1 ng/ml diluido en medio de crecimiento), Zcyto20(a 2,5\times, 0,5\times, o 0,1\times), y Z\alpha30 murina (a 2,5\times, 0,5\times, o 0,1\times).

La línea celular BaF3 se lava tres veces en medio de crecimiento, los sedimentos se resuspenden en medio de crecimiento, se cuentan las células y se diluyen en medio de crecimiento a 5.000 células/50 \mul. Después se añaden cincuenta microlitros de células diluidas a cada una de las diluciones de las muestras. Las placas de análisis se incuban en una incubadora a 37ºC durante tres a cuatro días. Después se añaden veinte microlitros de azul Alomar a cada pocillo y la placa se incuba durante la noche a 37ºC. Las placas se leen en el lector de placa de la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 544 y una longitud de onda de emisión de 590.

Ejemplo 16 Señalización Vía Ruta de Respuesta al Interferón

La interacción de los interferones de tipo 1 con su receptor específico conduce a la inducción de numerosos genes responsables de su actividad antiviral/antiproliferativa. Estos incluyen la 2',5'-oligoadenilato sintetasa (2-5A sintetasa), la PKr quinasa dependiente del ARN de doble hebra (Pkr), la fosfolípido escramblasa, y la molécula de adherencia intercelular 1 (ICAM-1). También se produce la inducción de genes con una función todavía desconocida, tal como un producto génico estimulado por el interferón de 56 kDa (ISG-56k). Para determinar si algunos o todos estos genes son inducidos tras el tratamiento de las células con zcyto20, se trataron células linfoides B Daudi humanas durante 72 horas con medio acondicionado de células Sf9 infectadas con baculovirus que expresan zcyto20. Se utilizó el medio acondicionado de células Sf9 infectadas con baculovirus de tipo salvaje como control negativo. Tras el tratamiento las células se recogieron y se lisaron para el aislamiento del ARN total. Se convirtió 1 \mug de ARN total en ADNc utilizando la transcriptasa inversa y se utilizó como molde para la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores oligonucleotídicos específicos para los genes estimulados por interferón humano descritos antes. Los cebadores oligonucleotídicos para la glicerol-3 fosfato deshidrogenasa (G3PDH) se utilizaron como gen de control no estimulado por interferón. Los resultados muestran una clara inducción de ISG-56k, Pkr, 2-5A sintetasa y fosfolípido escramblasa después del tratamiento de las células con zcyto20. No se observó inducción para ICAM-1 o el gen de control no estimulado por interferón, G3PDH.

Ejemplo 17 Identificación de Zcytor19 como Receptor para Zcyto21 A: Transfección de Células COS y Trampa de Secreción

Se sometió a ensayo zcyto20 biotinilado en cuanto a la unión a receptores de citoquina conocidos o huérfanos. Los vectores de expresión de pZP7 que contenían ADNc de receptores de citoquinas (incluyendo IFN\alphaR1, IFN\betaR2, IFN\alphaR1, IFN\betaR2, IL-10R, CRF2-4, ZcytoR7, DIRS1, Zcytor19, y Factor Tisular humano) fueron transfectados en células COS, y la unión de zcyto20 biotinilado a las células COS transfectadas se llevó a cabo utilizando el análisis de trampa de secreción descrito más abajo. La unión positiva en este análisis mostró pares receptor-ligando.

Transfecciones de Células COS

Las transfecciones de células COS se realizaron como sigue: se cultivaron en placa células COS (1\times10^{5} células/ pocillo) sobre placas para el cultivo de tejidos, de 12 pocillos, recubiertas de fibronectina (Becton Dickinson, Bedford, Mass.) y se incubaron a 37ºC durante la noche. Se mezcló el ADN del receptor de citoquina (0,75 \mug) con 50 \mul de medio DMEM sin suero (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 g de selenio y 5 mg de fetuina en 500 ml de DMEM), después se mezclaron con 5 \mul de Lipofectamine® (Invitrogen, Carlsbad, Ca.) en 45 \mul de medio DMEM sin suero, y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 400 \mul adicionales de medio DMEM sin suero. Las células se enjuagaron con DMEM sin suero, y se añadieron 500 \mul de mezcla de ADN. Las células se incubaron durante 5 horas a 37ºC, momento en el cual se añadieron 500 \mul de medio DMEM FBS al 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sodio y 146 mg de L-glutamina en 500 ml de DMEM) y las células se incubaron durante la noche.

Análisis de la Trampa de Secreción

La trampa de secreción se realizó como sigue: Se aspiró el medio y se enjuagaron las células dos veces con BSA en PBS al 1%. Las células se bloquearon durante 1 hora con TNB (Tris-HCL 0,1M, NaCl 0,15M y Reactivo de Bloqueo al 0,5% (NEN Renaissance TSA-Direct Kit, NEN Life Science Products, Boston, Mass.) en H_{2}O. Las células se incubaron durante 1 hora con 3 \mug/ml de proteína zcyto21 biotinilada (Ejemplo 27) en TNB. Después las células se lavaron 3 veces con BSA en PBS al 1% y se incubaron durante otra hora con Estreptavidina-HRP (kit NEN) diluida 1:300 en TNB. De nuevo las células se lavaron 3 veces con BSA en PBS al 1%, y después se fijaron durante 15 minutos con Formaldehído en PBS al 1,8%. Luego las células se lavaron 3 veces con TNT (Tris-HCL 0,1 M, NaCl 0,15M, y Tween-20 al 0,05% en H_{2}O).

La unión positiva se detectó con reactivo de fluorescein-tiramida diluido 1:50 en tampón de dilución (kit NEN), incubado durante 4,5 minutos, y lavado con TNT. Las células se conservaron con Vectashield Mounting Media (Vector Labs Burlingame, Ca.) diluido 1:5 en TNT. Las células se visualizaron utilizando un filtro FITC sobre un microscopio fluorescente.

La unión positiva se detectó sobre células transfectadas con ADNc de zcytor19 humano y e incubadas con zcyto21 biotinilado. Ninguno de los otros receptores transfectados unidos zcyto21, y zcytor19 se unió a una proteína de control biotinilada. Estos datos indican que zcytor19 es un receptor para zcyto21.

Experimentos adicionales han mostrado unión positiva entre Zcytor19 humano y de ratón con zcyto21 biotinilado. También se detectó unión positiva en células transfectadas con ADNc de zcytor19 humano e incubadas con zcyto20, y zcyto24 biotinilados.

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Ejemplo 18 Análisis Informador de la Transducción de la Señal

Se puede utilizar un análisis informador de la transducción de la señal para determinar la interacción funcional de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 con zcytor19. Se transfectan células de riñón embrionario humano (HEK) con un plásmido informador que contiene un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) que conduce la transcripción de un gen informador de luciferasa en presencia o ausencia vectores de expresión pZP7 que contienen los ADNc para los receptores de citoquinas de clase II (incluyendo DIRS1, IFN\alphaR1, IFN\alphaR2 y Zcytor19 (SEQ ID NOS: 23 y 26) humanos). La actividad luciferasa siguiente a la estimulación de células transfectadas con los ligandos de clase II (incluyendo zcyto20 (SEQ ID NO:1), zcyto21 (SEQ ID NO:4), zcyto22 (SEQ ID NO:6), zcyto10, huIL10 y huIFNa-2a) refleja la interacción del ligando con los receptores de citoquinas transfectados y nativos de la superficie celular. Los resultados y métodos se describen más abajo.

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Transfecciones Celulares

Se transfectaron células HEK 293 como sigue: se cultivaron en placa 700.000 células 293/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente 18 horas antes de la transfección a 2 mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se añadieron 1 microgramo de pISRE-Luciferase DNA (Stratagene), 1 microgramo de ADN de receptor de citoquina y 1 microgramo de pIRES2-EGFP DNA (Clontech,) a 9 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Se utilizaron dos microgramos de ADN de pIRES2-EGFP cuando no estaba incluido ADN de receptor de citoquina. Esta mezcla de transfección se añadió 30 minutos más tarde a las células 293 previamente cultivadas en placa. Veinticuatro horas más tarde las células transfectadas se separaron de la placa utilizando tripsina-EDTA y se volvieron a cultivar en placa a aproximadamente 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 horas antes de la estimulación del ligando, se cambió el medio a DMEM + FBS al 0,5%.

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Análisis Informadores de la Transducción de la Señal

Los análisis informadores de la transducción de la señal se realizaron como sigue: Tras una incubación de 18 horas a 37ºC en DMEM + FBS al 0,5%, se estimularon las células transfectadas con diluciones (en DMEM + FBS al 0,5%) de los siguientes ligandos de clase II; zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto10, huIL10 y huIFNa-2a. Después de una incubación de 4 horas a 37ºC, se lisaron las células, y se midieron las unidades de luz relativa (RLU) en un luminómetro tras la adición de un sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como el aumento de inducción de la RLU de las muestras experimentales sobre el control con medio solo (RLU de las muestras experimentales/RLU de medio solo=aumento de la inducción). La Tabla 14 muestra que zcyto20, zcyto21 y zcyto22 inducen la señalización de ISRE en las células 293 transfectadas con ISRE-luciferasa produciendo una inducción de 15 a 17 veces la actividad de la luciferasa sobre el medio solo. La adición de ADN de zcytor19 a la mezcla de transfección da como resultado una inducción adicional de 6 a 8 veces en la señalización de ISRE por zcyto20, zcyto21 y zcyto22 produciendo un aumento de inducción total de 104 a 125. Ninguna de las otras citoquinas de clase II transfectadas dio como resultado un aumento de la señalización de ISRE. Estos resultados indican que zcyto20, zcyto21 y zcyto22 interaccionan funcionalmente con el receptor de citoquina zcytor19. La Tabla 13 también muestra que huIFNa-2a puede inducir la señalización de ISRE en células 293 transfectadas con ISRE-luciferasa produciendo una inducción de 205 veces la actividad de la luciferasa en comparación con el medio solo. Sin embargo, la adición de ADN de zcytor19 a la transfección conduce a una reducción del índice de 11 en la señalización de ISRE (en comparación con el ADN de ISRE-luciferasa solo), sugiriendo que la expresión excesiva de zcytor19 afecta negativamente a la señalización del interferón, en contraste con los efectos positivos de la expresión excesiva de zcytor19 sobre la señalización de zcyto20, zcyto21 y zcyto22.

TABLA 13 Señalización del Elemento de Respuesta Estimulado por Interferón (ISRE) de Células 293 transfectadas Tras la Estimulación con Citoquinas de Clase II (Aumento de Inducción)

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Ejemplo 19 Identificación de IL10Rb (CRF2-4) como Subunidad del Receptor para Zcytor19 A: El Anticuerpo Neutralizador de IL10Rb Inhibe la Señalización de ISRE

Se utilizó un análisis de transducción de la señal para determinar la interacción funcional de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 con zcytor19 e IL10Rb (CRF2-4). Se transfectaron células de riñón embrionario humano (HEK) o células de riñón embrionario humano (HEK) que expresaban establemente en exceso zcytor19 humano con un plásmido informador que contenía un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) que conducía la transcripción de un informador de luciferasa. La actividad de la luciferasa siguiente a la estimulación de las células transfectadas con ligandos de clase II (incluyendo zcyto20, zcyto21, zcyto22 y huIFNa-2a) en presencia o ausencia de un anticuerpo neutralizador para IL10Rb (CRF2-4) refleja la interacción del ligando con los receptores de citoquina de la superficie celular. Los resultados y métodos se describen más abajo.

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Transfecciones Celulares

Para producir células HEK 293 que expresan en exceso establemente zcytoR19 humano, se transfectaron las células 293 como sigue: se cultivaron en placa 300.000 células 293/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente 6 horas antes de la transfección en 2 mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se añadieron 2 microgramos de un vector de expresión pZP7 que contenía el ADNc de zcytoR19 humano (SEQ ID NO:23) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección se añadió 30 minutos después a las células 293 previamente cultivadas en placa. Cuarenta y ocho horas más tarde las células transfectadas se colocaron bajo selección de 2 microgramos/mililitro de puromicina. Las células resistentes a la puromicina se aprobaron como población de células.

Las células HEK 293 (de tipo salvaje o que expresaban en exceso zcytor19 humano) fueron transfectadas como sigue: se cultivaron en placa 700.000 células 293/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente 18 horas antes de la transfección en 2 mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se añadieron 1 microgramo de pISRE-Luciferase DNA (Stratagene) y 1 microgramo de pIRES2-EGFP DNA (Clontech) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección se añadió 300 minutos más tarde a las células 293 previamente cultivadas en placa. Veinticuatro horas más tarde las células transfectadas se separaron de la placa utilizando tripsina-EDTA y se volvieron a cultivar en placa a aproximadamente 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 horas antes de la estimulación del ligando, se cambió el medio a DMEM + FBS al 0,5%.

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Análisis Informadores de la Transducción de la Señal

Los análisis informadores de la transducción de la señal se realizaron como sigue: Tras una incubación de 18 horas a 37 grados en DMEM + FBS al 0,5%, se pretrararon las células transfectadas con un anticuerpo de cabra policlonal neutralizador para IL10Rb (2,5 microgramos/ml para zcyto21; 8 microgramos/ml para zcyto20 y zcyto22, R&D Systems) o PBS durante 1 hora a 37ºC. Las células de riñón embrionario humano (HEK) que expresaban en exceso establemente zcytoR19 humano también se pretrataron con un anticuerpo de cabra policlonal no neutralizador para IFNAR1 (8 microgramos/ml, R&D Systems) como control de anticuerpo para los experimentos que implicaban zcyto20 y zcyto22. Las células pretratadas se estimularon con diluciones (en DMEM + FBS al 0,5%) de los siguientes ligandos de clase II; zcyto20, zcyto21, o zcyto22. Como control, se hizo correr huIFNa-2a en cada experimento. Tras una incubación de 4 horas a 37ºC, las células se lisaron, y se midieron las unidades de luz relativa (RLU) en un luminómetro tras la adición de un sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como el aumento de inducción de RLU de las muestras experimentales sobre el control de medio solo (RLU de las muestras experimentales/RLU de medio solo=índice de inducción).

Las Tablas 14 y 15 muestran que la inducción de la señalización de ISRE por zcyto20 es inhibida por el pretratamiento de las células 293 de tipo salvaje o de las células 293 que expresan en exceso zcytoR19 humano con un anticuerpo neutralizador para IL10Rb. Se observa ninguna o poca inhibición de la inducción por huIFNa-2a de la señalización de ISRE. Estos resultados indican que zcyto20 requiere la interacción con IL10Rb (CRF2-4) para una inducción máxima de la señalización de ISRE y que el receptor para zcyto20 es la combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4).

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TABLA 14 Inhibición por IL10Rb de la Señalización de ISRE de Células 293 de tipo salvaje Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquina de Clase II (Aumento de inducción)

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TABLA 15 Inhibición por IL10Rb de la Señalización de ISRE de Células 293 que expresan en exceso zcytoR19 Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquina de Clase II (Aumento de inducción)

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Las Tablas 16 y 17 muestra que la señalización de ISRE por zcyto21 es inhibida por el pretratamiento de las células 293 de tipo salvaje o las células 293 que expresan en exceso Zcytor19 humano con un anticuerpo neutralizador para IL10Rb. No se observa inhibición de la inducción por huIFNa-2a de la señalización de ISRE. Estos resultados indican que zcyto21 requiere la interacción con IL10Rb (CRF2-4) para la máxima inducción de la señalización de ISRE y que el receptor para zcyto21 es la combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4).

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TABLA 16 Inhibición por IL10Rb de la Señalización de ISRE de Células 293 de tipo salvaje Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquina de Clase II (Índice de Estimulación)

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TABLA 17 Inhibición por IL10Rb de la Señalización de ISRE de Células 293 que expresan en exceso zcytoR19 Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquina de Clase II (Índice de Estimulación)

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Las Tablas 18 y 19 muestran que la inducción de la señalización de ISRE por zcyto22 es inhibida por el pretratamiento de las células 293 de tipo salvaje o las células 293 que expresan en exceso zcytor19 humano con un anticuerpo neutralizador para IL10Rb. Se observa una inhibición nula o pequeña de la inducción de huIFNa-2a de la señalización de ISRE. Estos resultados indican que zcyto22 requiere la interacción con IL10Rb (CRF2-4) para una máxima inducción de la señalización de ISRE y que el receptor para zcyto22 es la combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4).

TABLA 18 Inhibición por IL10Rb de la Señalización de ISRE de Células 293 de tipo salvaje Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquina de Clase II (Aumento de inducción)

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TABLA 19 Inhibición por IL10Rb de la Señalización de ISRE de Células 293 que expresan en exceso zcytoR19 Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquina de Clase II (Aumento de inducción)

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B: A: El Anticuerpo Anti-IL10Rb Bloquea la Actividad Antiviral

Se realizó un análisis antiviral para determinar la capacidad del anticuerpo anti-IL10Rb para bloquear la actividad antiviral de zcyto20. El análisis se llevó a cabo utilizando células HEK 293 (de tipo salvaje o que expresaban zcytoR19 humano en exceso). El primer día, se diluyeron los anticuerpos (anti-IL10R beta humano, anti-receptor de Leptina humano, R&D Systems) en medio celular a 5 microgramos/ml y después se cultivaron en placa con 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Tras una incubación de una hora a 37ºC, se añadieron zcyto20-CEE (del Ejemplo 3) (200 ng/ml para las células 293 de tipo salvaje, 0,5 ng/ml para las células 293 que expresan en exceso zcytoR19 humano) o interferón-a-2a humano (1 ng/ml para las células 293 de tipo salvaje, 100 ng/ml para las células 293 que expresan en exceso zcytoR19 humano) a los pocillos y se incubaron durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, se separó el medio y se sustituyó por medio que contenía virus de la encefalomiocarditis (EMCV) a una multiplicidad de infección de 0,1. Después se incubaron las células a 37ºC durante la noche. Con posterioridad, se añadieron 25 \muL de Metiltiazolotetrazolio (MTT) (Sigma) de 5 mg/ml a cada pocillo, se incubaron 2 horas a 37ºC, y los pocillos se extrajeron después con 100 \muL de tampón de extracción (SDS al 12,5%, DMF al 45%). Tras incubar durante a noche a 37ºC, se midió la densidad óptica a 570 nm en un lector de placa Spectromax (Molecular Devices, CA). El descenso de densidad óptica (570 nm) indica un descenso de la supervivencia celular (pérdida de actividad antiviral). Las densidades ópticas (570 nm) para las diferentes condiciones experimentales se muestran en la Tabla 20 más abajo. Los resultados indican que el bloqueo del receptor beta de IL10 humano neutraliza específicamente la actividad antiviral de zcyto20 sin afectar a la actividad del interferón a-2a. Esto indica que el receptor beta de IL10 humano es parte del complejo receptor (incluyendo zcytoR19 humano) implicado en la actividad antiviral de zcyto20.

TABLA 20 Densidad Óptica (570 nm) de Células Tratadas con Citoquina Infectadas con ECMV

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C: La Señalización de Zcyto20, Zcyto21 y Zcyto22 es Intensificada por la Expresión Simultánea de ZcytoR19 e IL10Rb

Se utilizó un análisis informador de la transducción para determinar la interacción funcional de zcyto20, zcyto21 y zcyto22 con zcytor19 e IL10Rb (CRF2-4). Se transfectaron células de riñón de hámster (BHK) con un plásmido informador que contenía un elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) que conducía la transcripción de un gen informador de luciferasa en presencia o ausencia de vectores de expresión pZP7 que contenían ADNc para los receptores de citoquina de clase II Zcytor19 e IL10Rb (CRF2-4). La actividad luciferasa tras la estimulación de las células transfectadas con ligandos de clase II (incluyendo zcyto20, zcyto21 y zcyto22) refleja la interacción del ligando con receptores de citoquinas transfectados y nativos sobre la superficie celular. Los resultados y métodos se describen más abajo.

Transfecciones Celulares

Se transfectaron células BHK-570 como sigue: se cultivaron en placa 200.000 células BHK/pocillo (placas de 6 pocillos) aproximadamente 5 horas antes de la transfección en 2 mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 5%. Por pocillo, se añadieron 1 microgramo de ADN de pISRE-Luciferasa (Stratagene), 1 microgramo de ADN de receptor de citoquina y 1 microgramo de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech) a 9 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Se utilizaron dos microgramos de ADN de pIRES2-EGFP cuando no se incluyó ADN de receptor de citoquina. Esta mezcla de transfección se añadió 30 minutos más tarde a las células BHK previamente cultivadas en placa. Veinticuatro horas más tarde las células transfectadas se separaron de la placa utilizando tripsina-EDTA y se volvieron a cultivar en placa a aproximadamente 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 horas antes de la estimulación del ligando, se cambió el medio por DMEM + FBS al 0,5%.

Análisis Informadores de la Transducción de la Señal

Los análisis informadores de la transducción de la señal se realizaron como sigue: Tras una incubación de 18 horas a 37ºC en DMEM + FBS al 0,5%, se estimularon las células transfectadas con diluciones (en DMEM + FBS al 0,5%) de ligandos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25. Tras una incubación de 4 horas a 37 grados, las células se lisaron, y se midieron las unidades de luz relativa (RLU) en un luminómetro tras la adición de un sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como el aumento de inducción de las RLU de las muestras experimentales sobre el control de medio solo (RLU de las muestras experimentales/RLU de medio solo = aumento de inducción). La Tabla 21 muestra que zcyto20, zcyto21 y zcyto22 inducen la señalización de ISRE en células BHK transfectadas con ISRE-luciferasa y zcytoR19 de una manera dependiente de la dosis. La adición de ADN de IL10Rb (CRF2-4) a la mezcla de transfección da como resultado una inducción semi-máxima de la señalización a una dosis de citoquina 10-100 veces inferior. No se observó respuesta con la transfección de ISRE solo. Estos resultados muestran que la capacidad de zcyto20, zcyto21 y zcyto22 para señalizar a través del elemento de respuesta estimulado por interferón es intensificada mediante la expresión simultánea de zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4) indicando que el receptor para zcyto20, zcyto21 y zcyto22 es la combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4).

TABLA 21 Señalización con el Elemento de Respuesta Estimulado por Interferón (ISRE) de Células BHK Transfectadas Tras la Estimulación con Citoquinas de Clase II (Índice de inducción)

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Ejemplo 20 Construcción de Vectores de Expresión en Mamífero que Expresan Receptores Solubles zcytor19: zcytor19CEE, zcytor19CFLG, zcytor19CHIS y zcytor19-Fc4

Se prepara un vector de expresión para la expresión del dominio extracelular, soluble del polipéptido zcytor19, pC4zcytor19CEE, donde el constructo se diseña para expresar un polipéptido zcytor19 formado por la metionina de inicio pronosticada y truncada adyacente al dominio transmembrana pronosticado, y con una etiqueta Glu-Glu C-terminal (SEQ ID NO: 16).

Se crea un fragmento de ADN de zcytor19 que comprende el dominio extracelular de zcytor19 o el dominio de unión a citoquina de zcytor19 descrito en la presente memoria, utilizando la PCR, y se purifica utilizando métodos normalizados. El ADN escindido se subclona en un vector de expresión plasmídico que tiene un péptido señal, p. ej., el péptido señal de zcytor19 nativo, y se ancla a una etiqueta Glu-Glu (SEQ ID NO:16) en el extremo C-terminal de la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido zcytor19. Semejante vector de expresión en mamífero contiene una casete de expresión que tiene un promotor de mamífero, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificadoras, un codón de terminación y terminador de mamífero. El plásmido también puede tener un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de un marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor, un intensificador y un origen de replicación de SV40, un gen de DHFR y un terminador de SV40.

El inserto zcytor19 digerido con enzimas de restricción y el vector digerido previamente se ligan utilizando técnicas biológicas moleculares normalizadas, y se someten a electroporación en células competentes tales como células DH10B competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) de acuerdo con las directrices del fabricante y se cultivan en placa sobre placas de LB que contienen 50 mg/ml de ampicilina, y se incuban durante la noche. Las colonias se escrutan mediante análisis de restricción del ADN preparado a partir de las colonias individuales. La secuencia del inserto de clones positivos se verifica mediante análisis de secuencias. Se realiza una preparación de plásmido a gran escala utilizando un kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se utiliza el mismo procedimiento para preparar los receptores solubles de zcytor19 con una etiqueta his C-terminal, compuesta por 6 restos de His en una fila; y una etiqueta FLAG® C-terminal (SEQ ID NO:42), zcytor19CFLAG. Para construir estos constructos, el vector mencionado antes tiene la etiqueta C-HIS o FLAG® en lugar de la etiqueta glu-glu (SEQ ID NO: 16).

Se preparó un vector de expresión, zcytor19/Fc4/pzmp20, para expresar una versión soluble etiquetada con Fc4 C-terminalmente de zcytor19 (zcytor19-Fc4 humano) en células BHK. Un fragmento de ADNc de zcytor19 que incluye la secuencia de polinucleótidos del dominio extracelular del receptor zcytor19 se fusionó en marco con la secuencia de polinucleótidos Fc4 (SEQ ID NO:43) para generar una fusión zcytor19-Fc4. El vector pzm20 es un vector de expresión en mamífero que contiene la secuencia polinucleotídica Fc4 y un sitio de clonación que permite la rápida construcción de fusiones Fc4 C-terminales utilizando técnicas de biología molecular normalizadas.

Se generó un fragmento de 630 pares de bases mediante PCR, que contenía el dominio extracelular de zcytor19 humano con sitios BamHI y Bgl2 codificados en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento de PCR se generó utilizando los cebadores ZC37967 (SEQ ID NO:44) y ZC37972 (SEQ ID NO:45) mediante amplificación de una genoteca de ADNc de cerebro humano. Las condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: 30 ciclos de 94ºC durante 20 segundos, y 68ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 68ºC durante 4 minutos; seguido de un enjuagado a 10ºC. El fragmento fue digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y Bgl2 y con posterioridad se purificó mediante electroforesis en gel al 1% y purificación de las bandas utilizando el kit de extracción en gel QiaQuick (Qiagen). El ADN purificado resultante se ligó durante 5 horas a la temperatura ambiente en un vector pzmp20 digerido previamente con Bgl2 que contenía Fc4 3' de los sitios Bgl2.

Se sometió a electroporación un \mul de la mezcla de ligación en 37 \mul de E. coli DH10B electrocompetentes (Gibco) de acuerdo con las directrices del fabricante. Las células transformadas se diluyeron en 400 \mul de medio LB y se cultivaron en placa sobre placas LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Los clones se analizaron mediante productos digeridos con enzimas de restricción y los clones positivos se llevaron a secuenciación del ADN para confirmar la secuencia del constructo de fusión.

Ejemplo 21 Receptor Soluble Zcytor19 Humano de Expresión en Mamífero: Zcytor19/Fc4

Se cultivaron en placa células BHK 570 (ATCC NO: CRL-10314) en matraces para el cultivo de tejidos T-75 y se dejó que crecieran hasta una confluencia de aproximadamente 50 a 70% a 37ºC, CO_{2} al 5%, en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.), suero bovino fetal al 5%, L-glutamina 1 mM (JRH Biosciences, Lenea, Kans.), piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL)). Después las células se transfectaron con el plásmido zcytor19/Fc4/pzmp20 (Ejemplo 4B) utilizando Lipofectamine® (Gibco BRL), en una formulación de medio sin suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%). Se diluyeron 10 \mug del ADN plasmídico zcytor19/Fc4/pzmp20 (Ejemplo 4B) en un tubo de 15 ml hasta un volumen final de 500 \mul con medio SF. Se mezclaron 50 \mul de Lipofectamine con 450 \mul de medio SF. La mezcla de Lipofectamine se añadió a la mezcla de ADN y se dejó incubando aproximadamente 30 minutos a la temperatura ambiente. Se añadieron 4 ml de medio SF a la mezcla de ADN:Lipofectamine. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron, y se añadió la mezcla de ADN:Lipofectamine. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, y después se añadieron 5 ml de medio DMEM/FBS al 10%. El matraz se incubó a 37ºC durante la noche momento después de lo cual las células se dividieron en el medio de selección (medio DMEM/FBS de antes con la adición de metotrexato 1 \muM (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en placas de 150 mm a 1:2, 1:10, y 1:50. Aproximadamente 10 días después de la transfección, se trató con tripsina una placa de 150 mm de colonias resistentes a metotrexato 1 \muM, las células se reunieron, y se volvieron a cultivar en placa la mitad de las células en metotrexato 10 \muM; para amplificar adicionalmente la expresión de la proteína zcytor19/Fc4. Una muestra de medio acondicionado de esta reserva de células amplificadas se sometió a ensayo en cuanto a los niveles de expresión utilizando análisis SDS-PAGE y Western.

También se pueden aislar clones individuales que expresan los receptores solubles, escrutarlos y hacerlos crecer en medio de cultivo celular, y purificarlos utilizando técnicas normalizadas. Por otra parte, las células CHO también son adecuadas para tales propósitos.

Ejemplo 22 Evaluación de la Heterodimerización del Receptor Zcytor19 Utilizando el Análisis ORIGEN

El receptor zcytor19 soluble es biotinilado por reacción con un exceso molar de cinco veces de sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Inc., Rockford, Ill.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El receptor zcytor19 soluble y otra subunidad del receptor soluble, por ejemplo, los receptores de citoquina de clase II solubles, por ejemplo, CRF2-4 (SEQ ID NO:40), se marcan con un exceso molar de cinco veces Ru-BPY-NHS (Igen, Inc., Gaithersburg, Md.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las formas biotiniladas y marcadas con Ru-BPY-NHS- del receptor zcytor19 soluble se pueden designar respectivamente receptor Bio-zcytor19 y Ru-zcytor19; las formas biotiniladas y marcadas con Ru-BPY-NHS- de la otra subunidad del receptor soluble se pueden designar de una manera similar. Los análisis se llevan a cabo utilizando medio acondicionado o utilizando ligandos purificados.

Para la caracterización de la unión al receptor soluble inicial, se someten a ensayo las citoquinas mencionadas antes, o el medio acondicionado, para determinar si pueden mediar en la homodimerización del receptor zcytor19 y si pueden mediar en la heterodimerización del receptor zcytor19 con las subunidades del receptor soluble descritas antes. Para realizar esto, se combinan 50 \mul de medio acondicionado o TBS-B que contiene citoquina purificada con 50 \mul de TBS-B (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1 mg/ml de BSA, pH 7,2) que contiene p. ej., 400 ng/ml de receptor Ru-zcytor19 y Bio-zcytor19, o 400 ng/ml de receptor Ru-zcytor19 y p. ej., Bio-CRF2-4, o 400 ng/ml de p. ej., Ru-CRF2-4 y Bio-zcytor19. Tras la incubación durante una hora a la temperatura ambiente, se añaden 30 \mug de cuentas magnéticas de 2,8 mm recubiertas con estreptavidina (Dynal, Inc., Oslo, Norway) y la reacción se incuba una hora más a la temperatura ambiente. Después se añaden 200 \mul de tampón de análisis ORIGEN (Igen, Inc., Gaithersburg, Md.) y se mide el grado de asociación del receptor utilizando un analizador M8 ORIGEN (Igen, Inc.).

Ejemplo 23 Constructo para Generar un Heterodímero del Receptor Zcytor19

Se construye un vector que expresa un heterodímero de zcytor19 humano secretado fusionando el dominio de unión a citoquina extracelular de zcytor19 a la cadena pesada de la IgG gamma 1 (IgG\gamma1), y la porción extracelular de la subunidad del receptor de citoquina heterodimérico (p. ej., receptores de citoquina de clase II, por ejemplo, CRF2-4) se fusiona con una cadena ligera kappa humana (cadena ligera \kappa humana).

a. Construcción de Vectores de Fusión de IgG Gamma 1 y Cadena Ligera \kappa Humana

Se clona la cadena pesada de la IgG\gamma1 en el vector de expresión de mamífero Zem229R (Núm. de depósito ATCC 69447) de manera que cualquier dominio extracelular del receptor de citoquina deseado que tenga un sitio 5' EcoRI y 3' NheI pueda ser clonado dando como resultado una fusión del dominio extracelular-N-terminal-IgG\gamma1 C-terminal. El fragmento de IgG\gamma1 utilizado en este constructo se elabora utilizando la PCR para aislar la secuencia de IgG\gamma1 de una genoteca de ADNc de Hígado Fetal humano de Clontech como molde. Los productos de la PCR se purifican utilizando los métodos descritos en la presente memoria y se digieren con MluI y EcoRI (Boehringer-Mannheim), se precipitan con etanol y se ligan con oligos que comprenden un conector MluI/EcoRI, en Zem229R previamente digerido con EcoRI utilizando técnicas de biología molecular normalizadas descritas en la presente memoria.

La cadena ligera \kappa humana se clona en el vector de expresión de mamífero Zem228R (Núm. de depósito ATCC 69446) de manera que cualquier dominio extracelular del receptor de citoquina deseado que tenga un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' KpnI pueda ser clonado dando como resultado una fusión del dominio extracelular de citoquina N-terminal-cadena ligera \kappa humana C-terminal. Puesto que un sitio KpnI está localizado en la secuencia de la cadena ligera \kappa humana, se diseña un cebador especial para clonar el extremo 3' del dominio extracelular deseado de un receptor de citoquina en este sitio KpnI: El cebador se diseña de manera que el producto de la PCR resultante contiene el dominio extracelular del receptor de citoquina deseado con un segmento de la cadena ligera \kappa humana por encima del sitio KpnI. Este cebador comprende preferiblemente una porción de al menos 10 nucleótidos del extremo 3' del dominio extracelular del receptor de citoquina deseado fusionado en marco con la cadena ligera kappa humana. El fragmento de la cadena ligera \kappa humana utilizado en este constructo se elabora utilizando la PCR para aislar la secuencia de la cadena ligera \kappa humana de la misma genoteca de ADNc de Hígado Fetal humana de Clontech utilizada antes. Los productos de la PCR se purifican utilizando los métodos descritos en la presente memoria y se digieren con MluI y EcoRI (Boehringer-Mannheim), se precipitan con etanol y se ligan con el conector MluI/EcoRI descrito antes, en Zem228R previamente digerido con EcoRI utilizando las técnicas normalizadas descritas en la presente memoria.

b. Inserción del Receptor Zcytor19 o de los Dominios Extracelulares de la Subunidad Heterodimérica en Constructos del Vector de Fusión

Utilizando los vectores de construcción anteriores, se elabora un constructo que tiene zcytor19 fusionado a IgG\gamma1. Esta construcción se realiza sometiendo a PCR el dominio extracelular o el dominio de unión a citoquina del receptor zcytor19 descrito en la presente memoria a partir de una genoteca de ADNc de próstata (Clontech) o una genoteca de ADNc de linfocitos activados utilizando métodos normalizados, y oligos que proporcionan los sitios de restricción EcoRI y NheI. El producto de la PCR resultante se digiere con EcoRI y NheI, se purifica en gel, como se describe en la presente memoria, y se liga en Zem229R/IgG\gamma1 previamente digerido con EcoRI y NheI y purificado en banda descrito antes. El vector resultante se secuencia para confirmar que la fusión zcytor19/IgG gamma 1 (zcytor19/Ch1 IgG) es correcta.

También se construye un constructo separado que tiene una subunidad del receptor de citoquina, esto, es, CRF2-4, dominio extracelular fusionado a la cadena ligera \kappa como antes. La construcción de receptor de citoquina/cadena ligera \kappa humana se realiza como antes mediante PCR, p. ej., de una genoteca de ADNc de linfocitos (Clontech) utilizando métodos normalizados, y oligos que proporcionan sitios de restricción EcoRI y KpnI. El producto de la PCR resultante se digiere con EcoRI y KpnI y después se liga este producto en un vector Zem228R/cadena ligera \kappa humana purificado en banda y previamente digerido con EcoRI y KpnI descrito antes. El vector resultante se secuencia para confirmar que la fusión de la subunidad del receptor de citoquina/cadena ligera \kappa humana es correcta.

c. Co-Expresión de Zcytor19 y del Dominio Extracelular de la Subunidad del Receptor de Citoquina Heterodimérico

Aproximadamente 15 \mug de cada uno de los vectores anteriores, son co-transfectados en células de mamífero, p. ej., células BHK-570 (Núm. ATCC CRL-10314) utilizando el reactivo LipofectaminePlus® (Gibco/BRL), como en las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionan durante 10 días en DMEM + FBS al 5% (Gibco/BRL) que contiene 1 \muM de metotrexato (MTX) (Sigma, St. Louis, Mo.) y 0,5 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) durante 10 días. La reserva de transfectantes resultante se selecciona de nuevo en 10 \mum de MTX y 0,5 mg/ml de G418 durante 10 días.

La reserva resultante de células doblemente seleccionadas se utiliza para generar proteína. Se utilizan tres Factories (Nunc, Dinamarca) de esta reserva para generar 10 L de medio acondicionado sin suero. Este medio acondicionado se hace pasar sobre una columna de proteína A y se hace eluir en aproximadamente 10 fracciones de 750 microlitros. Las fracciones que tienen la concentración más alta de proteína se reúnen y se someten a diálisis (corte de PM 10 kD) frente a PBS. Finalmente la sustancia sometida a diálisis se somete a análisis de aminoácidos (AAA) utilizando los métodos rutinarios.

d. Reconstitución del Receptor Zcytor19 In Vitro

Para identificar los componentes implicados en el complejo señalizador de zcytor19, se realizan estudios de reconstitución del receptor como sigue. Por ejemplo, las células BHK 570 (Núm. ATCC CRL-10314) transfectadas, utilizando los métodos descritos en la presente memoria, con un plásmido vector de expresión en mamífero con informador de luciferasa sirven como línea celular de bioanálisis para medir la respuesta de transducción de la señal de un complejo receptor zcytor19 transfectado al informador de luciferasa en presencia del ligando zcytor19. Se utilizarían las células BHK en el evento ya que las células BHK no expresan endógenamente el receptor zcytor19. Se pueden utilizar otras líneas celulares. Un vector de expresión de mamífero con informador de luciferasa ilustrativo es el plásmido KZ134 que se construye con oligonucleótidos complementarios que contienen los elementos de unión al factor de transcripción STAT de 4 genes. Un elemento inducible por Sis modificado con c-fos (m67SIE, o hSIE) (Sadowski, H. et al., Science 261:1739-1744, 1993), el p21 SIE1 del gen p21 WAFI (Chin, Y. et al., Science 272:719-722, 1996), el elemento de respuesta de la glándula mamaria del gen de la \beta-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991), y un elemento inducible STAT del gen Fcg R1, (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles con Asp718-XhoI y se ligan, utilizando métodos normalizados, en un vector informador de luciferasa de luciérnaga receptor con un promotor c-Fos (Poulsen, L. K. et al., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y que contiene un marcador seleccionable de neomicina. Se utiliza el plásmido KZ134 para transfectar establemente células BHK, o BaF3, utilizando métodos de transfección y selección normalizados, para elaborar una línea celular BHK/KZ134 o BaF3/KZ134 respectivamente.

La línea celular de bioanálisis se transfecta con receptor zcytor19 solo, o se transfecta simultáneamente con receptor zcytor19 junto con una de una variedad de otras subunidades de receptores conocidas. Los complejos de receptores incluyen pero no están limitados al receptor zcytor19 solamente, diversas combinaciones de receptor zcytor19 con receptores de citoquina de clase II, por ejemplo, los receptores de las cadenas alfa y beta del interferón-gamma y las cadenas alfa y beta del receptor del interferón alfa/beta, zcytor11 (Patente de los Estados Unidos del mismo propietario Núm. 5.965.704), CRF2-4, DIRS1, zcytor7 (Patente de los Estados Unidos del mismo propietario Núm. 5.945.511). Cada línea celular del complejo receptor independiente se analiza después en presencia de medio acondicionado por citoquina o citoquinas purificadas y se mide la actividad luciferasa utilizando los métodos rutinarios. La línea celular de bioanálisis no transfectada sirve como control para la actividad luciferasa del fondo, y de este modo se utiliza como línea base para comparar la señalización por las diversas combinaciones de complejos de receptores. Se espera que el medio acondicionado o la citoquina que se une al receptor zcytor19 en presencia del complejo de receptor correcto, proporcione una lectura de luciferasa de aproximadamente 5 veces la del fondo o mayor.

Como alternativa, se puede realizar un análisis similar donde una línea celular Baf3/zcytor19 es transfectada simultáneamente como se describe en la presente memoria y se mide la proliferación, utilizando un análisis conocido tal como un análisis de proliferación Alamar Blue normalizado.

Ejemplo 24 Unión de Ligandos a Receptores Solubles

Se puede analizar la unión de los ligandos (zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25) a receptores solubles utilizando un método de marcaje de cuentas con yodo. Por ejemplo, se marca zcyto21-CEE marcado con I^{125} (1,2\times10^{7} CPM/ml; 1,5 ng/\mul; y 8,6\times10^{6} CPM/\mug).

Se combinan 50 nanogramos del zcyto21-cEE marcado con I^{125} (Véase el Ejemplo 3) (399.600 CPM) con 1.000 ng de receptor homodimérico zcytor19/Fc4 frío, 1.000 ng de receptor heterodimérico zcytor19/CRF2-4 frío, o 1.000 ng de un receptor de citoquina de clase II/receptor Fc4 de control como control con aproximadamente 10.000 ng de zcyto21 frío como competidor. Las muestras se incuban durante 2 horas a 4ºC, después de lo cual se añaden a cada muestra 30 \mul de proteína G (Zymed San Francisco, Ca.). Las muestras se incuban durante 1 hora a 4ºC, y se lavan 3 veces con PBS. Se mide la radiactividad de la proteína G lavada en un contador gamma (Packard Instruments, Downers Grove, Ill.).

Ejemplo 25 Tinción por Citometría de Flujo de Monocitos Humanos con Zcyto20 y Zcyto21-Biotina

Se aislaron leucocitos de sangre periférica (PBL) mediante separación en Ficoll Hypaque (Amersham, Suecia) de sangre humana heparinizada. Los PBL se cultivaron a 37ºC en medio normalizado a una densidad de 1\times10^{6} células por mililitro en placas para el cultivo de tejidos de 6 pocillos. Tras incubar durante la noche, se recogieron los PBL y se tiñeron con zcyto20-cee biotinilado y zcyto21-cee (Véase el Ejemplo 18) a una concentración de 10 \mug/ml. La tinción se detectó con estreptavidina marcada con Ficoeritrina (Pharmingen, Ca., USA) que se había preparado a una dilución de 1:1.000. Tras la tinción los PBL se fijaron en Paraformaldehído al 2%, y se leyeron en un Facscaliber (Becton Dickinson, San Diego, Ca.). Los datos se analizaron utilizando el soporte lógico Cellquest (Becton Dickinson). Los resultados indican que tanto zcyto20-cee biotinilado como zcyto21-cee tiñen las células de la ventana mieloide de los leucocitos de sangre periférica. Las células de la ventana linfoide no se unen a zcyto20-cee y zcyto21-cee.

Ejemplo 26 Efectos de Zcyto21-CEE sobre la Expresión de Marcadores de Activación en PBL

Se aislaron leucocitos de sangre periférica (PBL) mediante separación en Ficoll Hypaque de sangre humana heparinizada. Después los PBL se estimularon con controles de proteína purificada o medios de los siguientes: 1) zcyto21-CEE (2 \mug/ml); 2) zcyto21-cee (1 \mug/ml); 3) Medio solo; 4) proteína de control negativo A141F (2 \mug/ml); o 5) IFN-alfa-A (1 ng/ml) (PBL Biomedical N.J., USA.). Los PBL estimulados se incubaron a una densidad celular de 1\times10^{6} células por mililitro a 37ºC con CO_{2} al 5%. Los cultivos se cosecharon a las 24 y 48 horas y se tiñeron para los marcadores de activación.

Los PBL se lavaron con PBS y después se bloquearon con IgG de ratón normal en tampón Facs (HBSS + suero de cabra normal, BSA al 2%, NaN3 al 0,2%), seguido de tinción con anticuerpos para los siguientes marcadores: CD19, CD14, CD3, HLA-DR, CD54, HLA-ABC (Pharmingen, Ca., USA e Immunotech, France). Las células se lavaron y después se fijaron en Paraformaldehído al 2% antes de ser analizado en un Facscaliber (Becton Dickinson, Ca., USA). Los datos resultantes se analizaron utilizando el soporte lógico Cellquest (Becton Dickinson, Ca., USA).

Los resultados indicaron un incremento en la expresión de CD54 de superficie (ICAM) sobre los monocitos a las 24 y 48 horas con estimulación con zcyto21-cee, en comparación con el medio de control solo. La estimulación con zcyto21-cee también dio como resultado un incremento de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad I sobre células B a las 24 horas y un incremento en el MHCI tanto en células B como en Monocitos a las 48 horas.

Ejemplo 27 Biotinilación de Ligandos

Se biotinilaron zcyto21CEE siguiendo un protocolo modificado por Pierce Chemical Company para sulfo-NHS-LC-Biotina. Se añadieron 250 microgramos de zcyto21CEE (en 0,5 ml de PBS) a 8,4 \mul de solución de partida de S-NHS-biotina (84 \mug), y se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas con balanceo. Tras la etapa de incubación, se añadieron 20 \mul de Tris HCl 2M (pH 8), y la mezcla se incubó durante 20 minutos a la temperatura ambiente con balanceo. Las mezclas de ligando biotinilado se almacenaron después a 4ºC. Se prepararon zcyto20CEE, zcyto22CEE y zcyto24CEE esencialmente de la misma manera.

Ejemplo 28 Expresión de Zcytor19 mediante Análisis Northern

Se sondearon transferencias Northern para determinar la distribución en los tejidos de zcytor19. Se obtuvo un fragmento de ADNc de zcytor19 humano utilizando la PCR con cebadores específicos del gen, 5' ZC40285 como se muestra en el SEQ ID NO: 21; y 3' ZC 40286, como se muestra en el SEQ ID NO: 22. El molde fue ADNc de zcytor19 humano clonado (SEQ ID NO: 23). El fragmento de la PCR fue purificado en gel, y se marcaron \sim25 ng con \alpha-dCTP-P^{32} utilizando el kit de marcaje por cebado al azar Prime-It® RmT (Stratagene, LaJolla, Ca.).

Las siguientes transferencias Northern (Clontech, Palo Alto, Ca.) se sondearon en cuanto a la expresión del ARNm de zcytor19: (1) una transferencia C de una línea celular de cáncer humana, que contiene muestras de ARN de cada una de las siguientes líneas celulares de cáncer: leucemia promielocítica HL-60, HELA S3, leucemia mielógena crónica k-562, leucemia linfoblástica MOLT-4, linfoma de Burkitt RAJI, adenocarcinoma colorrectal SW480, carcinoma de pulmón A549, y melanoma G-361; (2) una transferencia H de MTN humano, que contiene ARNm de los siguientes tejidos: corazón, cerebro completo, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, y páncreas; (3) un H3 de MTN humano que contiene ARNm de los siguientes tejidos: estómago, tiroides, médula espinal, nódulo linfático, tráquea, glándula suprarrenal, y médula ósea; y (4) un H4 de MTN humano, que contiene ARNm de los siguientes tejidos: bazo, timo, próstata, testículo, útero, intestino delgado, colon, y leucocitos de sangre periférica. Todas las hibridaciones se realizaron en ULTRAhyb® Ultrasensitive Hybridization Buffer (Ambion, Austin, Tex.) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con la excepción de que se añadieron 0,2 mg/ml de ADN de esperma de salmón adicionales a la hibridación y tampones de prehibridación para disminuir la hibridación no específica. Tras la hibridación, se separó la señal radiactiva no específica tratando las transferencias con 0,1\timesSSC/SDS al 0,5% a 50ºC. Las transferencias se expusieron utilizando BioMax MR Film y pantallas intensificadoras (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.), según las recomendaciones del fabricante durante 3 días.

La expresión de un transcrito de \sim4,5 kb fue máxima en corazón, músculo esquelético, páncreas y tejido de próstata, además de en la línea celular de linfoma de Burkitt (RAJI). Se observaron niveles inferiores en otros múltiples tejidos. Además, hubo un transcrito de \sim2 kb que fue generalmente menos abundante que el transcrito más grande, pero también presente en muchos de los tejidos y líneas celulares. El tejido testicular, además de tener los transcritos de 2 y 4,5 kb, también puede tener transcritos de \sim4 kb y 1,4 kb. La glándula suprarrenal demostró niveles de expresión iguales de los transcritos de 4,5 kb y 2 kb.

Ejemplo 29 Expresión de Zcytor19 mediante Análisis In Situ

Se aislaron tejidos humanos específicos y se escrutaron en cuanto a la expresión de zcytor19 mediante hibridación in situ. Los diversos tejidos humanos preparados, seccionados y sometidos a hibridación in situ incluyeron colon normal y con carcinoma, carcinoma cervical, carcinoma endometrial, ovario normal y con carcinoma, piel normal y neoplásica, hígado fetal, pulmón, corazón y MFH (sarcoma de músculo). Los tejidos se fijaron en formalina tamponada al 10% y se bloquearon en parafina utilizando técnicas normalizadas. Los tejidos se seccionaron de 4 a 8 micras. Los tejidos se prepararon utilizando un protocolo normalizado. Brevemente, se desparafinaron las secciones de tejido con Histo-Clear® (National Diagnostics, Atlanta, Ga.) y después se deshidrataron con etanol. A continuación se digirieron con Proteinasa K (50 \mug/ml) (Boehringer Diagnostics, Indianapolis, Ind.) a 37ºC durante 2 a 7 minutos. Esta etapa estuvo seguida de acetilación y re-hidratación de los tejidos.

Se diseñó una sonda in situ contra la secuencia de zcytor19 humano (variante x1) (INC7128744, como se muestra en el SEQ ID NO: 25), que contenía la UTR3' de zcytor19 utilizando métodos normalizados. Se utilizó la ARN polimerasa de T7 para generar una sonda antisentido. La sonda se marcó utilizando un Sistema de Transcripción In Vitro (Riboprobe® in vitro Transcription System, Promega, Madison, Wis.) siguiendo las instrucciones del fabricante, excepto que se utilizó digoxigenina para la sonda en lugar de rCTP radiomarcado y que se ajustó el agua para acomodar el volumen reducido de los rNTP. La hibridación in situ se realizó con una sonda de zcytor19 marcada con digoxigenina (arriba). Se añadió la sonda a los portas a una concentración de 1 a 5 pmoles/ml durante 12 a 16 horas a 60ºC. Los portas se lavaron con posterioridad en 2\timesSSC y 0,1\timesSSC a 55ºC. Las señales se amplificaron utilizando TSA® (Tyramide Signal Amplification; PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, Mass.) y se visualizaron con un kit de sustrato VECTOR Red (Vector Laboratories, Burlingame, Ca.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los portas se contratiñeron después con hematoxilina.

Se observaron señales en diversos tejidos sometidos a ensayo: En tejidos de carcinoma de colon, se observó una señal débil en las células del carcinoma y algunas infiltraciones inmunitarias. Sin embargo, no se observó señal positiva en colon e intestino normal, incluyendo las células de la lámina propia, el epitelio, los nódulos inmunitarios y las células nerviosas de los ganglios periféricos. En tejidos de carcinoma cervical, hay una señal débil en las células del carcinoma y algunas células de los nódulos inmunitarios. En tejidos de carcinoma endometrial, se presentan señales débiles en las células del carcinoma. En tejidos de útero normal, no se observó señal positiva. En muestras de carcinoma de ovario, algunas células del carcinoma eran débilmente positivas. En muestras de ovario normal, una parte del endotelio de los capilares y del epitelio de los folículos grandes pueden ser débilmente positivos. En la muestra de carcinoma de piel, el epitelio granular canceroso es fuertemente positivo, mientras no se observa señal positiva en la piel normal. En hígado fetal, se observa señal en una población mixta de células mononucleares en espacios sinusoides. En pulmón, zcytor19 parece ser positivo en el epitelio alveolar de tipo II. Ocasionalmente el epitelio bronquial también puede ser débilmente positivo. Las células mononucleares de tipo macrófago del tejido intersticial también son positivas. En corazón, los miocitos son negativos mientras algunas células mononucleares circulantes son positivas para zcytor19. En una de las muestras, el endotelio de los vasos puede ser débilmente positivo. Otros tejidos sometidos a ensayo incluyeron una muestra de MFH (sarcoma muscular) y una muestra de piel con sarcoma de Kaposi. No existe una señal positiva concluyente en estos tejidos.

Ejemplo 30 Expresión de Zcytor19 Humano Basada en Análisis RT-PCR de Células Estimuladas Frente a No Estimuladas

Se examinó la expresión de zcytor19 utilizando el análisis de RT-PCR de los siguientes tipos de células: Hela, 293, Daudi, CD14+, U937, y HL-60.

Se llevó a cabo la síntesis de la primera hebra del ADNc a partir del ARN total utilizando un sistema de síntesis de la primera hebra disponible en el mercado para RT-PCR (Invitrogen life technologies, Carlsbad, Ca.). Las reacciones de PCR posteriores se ajustaron utilizando los cebadores oligo específicos de zcytor19\times1 (SEQ ID NO:23) y zcytor19\times2 (SEQ ID NO:28) ZC40288 (SEQ ID NO:58) y ZC40291 (SEQ ID NO:59) lo que proporcionó un producto de 806 pb y uno de 892 pb, respectivamente, Tampón y ADN Polimerasa HotStarTaq Qiagen, (Qiagen, Inc., Valencia, Ca.), GeneAmp dNTPs (Applied Biosystems, Foster City, Ca.), colorante RediLoad^{TM} (Research Genetics, Inc., Huntville, Ala.) y 2 \mul de ADNc de primera hebra (10% de la reacción de la primera hebra) de los respectivos tipos de células. Las condiciones del ciclo de la PCR fueron las siguientes: un ciclo inicial de 15 minutos de desnaturalización a 95ºC, 35 ciclos de 45 segundos de desnaturalización a 94ºC, 1 minuto de recocido a 63ºC y 1 minuto y 15 segundos de extensión a 72ºC, seguido de un ciclo final de extensión de 7 minutos a 72ºC. Las reacciones se separaron mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 2% (EM Science, Gibbstown, N.J.) y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.

Se observaron bandas del tamaño correcto en Hela\pmIFN-beta (solamente la banda de 892 pb), 293+Parental Adv, Daudi\pmIFN-beta, Daudi\pmIFN-alfa, CD14+ activadas, HL-60 activadas. No se observó ninguna banda en CD14+ en reposo, U937 en reposo y activadas, y HL-60 en reposo. Estos resultados muestran la inducción de la expresión de zcytoR19 tras la activación o diferenciación de monocitos o líneas celulares monocíticas.

Ejemplo 31 Estimulación de un Informador NFKB en Células RAW

Se sometió a ensayo la capacidad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para señalizar a través de la ruta de transducción de la señal de NF kappa beta utilizando una línea celular informadora de monocitos/macrófagos de ratón. Esta línea celular se generó mediante transducción de células RAW264.7 con el informador retroviral KZ170 que contenía elementos de respuesta a NF kappa beta que conducían la transcripción de un gen informador de luciferasa.

Los análisis informadores iniciales que sometían a ensayo la actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se realizaron utilizando el medio acondicionado transfectado transitoriamente para 293 descrito para su uso en los análisis antivirales. Se recogieron las células RAW264.7/KZ170 y se cultivaron en placa a una densidad de 50.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante la noche a 37ºC en RPMI+FBS al 10%. Al día siguiente, se separó el medio de las células adherentes y se añadieron a las células medio acondicionado con zcyto20-25 no diluido o diluciones de medio acondicionado con zcyto20-25 (diluido en RPMI+BSA al 0,1%). Tras una incubación de 5 horas a 37ºC, las células se lisaron, y se leyeron en un luminómetro, tras la adición de un sustrato de luciferasa. Los resultados se analizaron comparando las unidades de luz relativa (RLU) del medio acondicionado con zcyto20-25 con respecto a las unidades de luz relativa del medio acondicionado con células no transfectadas. El medio acondicionado con zcyto20-25 no diluido indujo una expresión de luciferasa 4-9 veces superior que el medio acondicionado con células no transfectadas no diluido. Estos resultados indican que zcyto20-25 son capaces de señalizar por medio de la ruta de señalización de NF kappa beta en una línea celular de monocitos/macrófagos de ratón.

Como seguimiento, se utilizaron medios acondicionados de células Sf9 infectadas con baculovirus que expresaban zcyto20, zcyto21 o zcyto22 en los análisis informadores. Se utilizó baculovirus de tipo salvaje como control negativo. La producción de los constructos de baculovirus y de medio acondicionado se describió más arriba.

Los resultados del análisis informador de NFkb con RAW264.7 utilizando medio acondicionado derivado de baculovirus fueron similares a aquellos que utilizan medio acondicionado transfectado transitoriamente para 293. El medio acondicionado derivado de baculovirus que contenía zcyto20-22 indujo la expresión de la luciferasa de una manera dependiente de la dosis, mientras el correspondiente medio acondicionado de control no lo hizo.

Ejemplo 32 Resultados In Vivo

Se compararon la toxicidad y la actividad biológica de zcyto24 con otra citoquina de Clase II, y un vector de adenovirus parental, así como en ratones sin inyección. Se inyectaron cuatro grupos de 8 ratones C57B16 (hembras, 9 semanas de edad) como sigue:

Grupo 1: Inyectados con Adzcyto24 a 1\times10^{11} partículas por ratón:

Grupo 2: Inyectados con una citoquina de Clase II (Adzcyto) a 1\times10^{11} partículas;

Grupo 3: Vector de adenovirus parental (Adzpar) a 1\times10^{11} partículas; y

Grupo 4: No tratado

Se colocaron traspondedores de temperatura sobre los ratones el Día 1, y se inyectó el virus el Día 0. Se controlaron la ingesta de alimento por jaula y el peso corporal cada 5 Días, se tomaron muestras de sangre el Día 10 (0,25 ml máx.) para análisis que incluyeron analizadores de sangre CBC y Abbot. Todos los ratones se sacrificaron el Día 20.

Se tomaron muestras de sangre de los ratones tratados con Adzcyto24 (Grupo 1) el Día 10 y los sueros se sometieron a ensayo en cuanto a la presencia de bioactividad de zcyto24. Una análisis viral demostró una actividad antiviral significativa a una dilución máxima de 1:500 para todos y cada uno de los ratones del grupo con Adzcyto24. Esto corresponde a aproximadamente 160 ng/ml de zcyto24CEE purificado. En un análisis antiviral para detectar interferones de ratón no se detectó actividad en el grupo con Adzcyto24. En un bioanálisis utilizando un informador con un ISRE también se detectó una actividad de zcyto24 significativa en el suero de los ratones a los que se había inyectado Adzcyto24 pero no en los otros grupos.

Las sondas de temperatura revelaron que la temperatura corporal media para el Grupo 2 disminuía más de 5 grados C el Día 10 mientras la temperatura media para el grupo con Adzcyto24 (Grupo 1) había disminuido más de 2 grados C. Los grupos de control presentaron un cambio de temperatura de menos de 1 grado a lo largo de todo el experimento.

Los ratones con Adzcyto24 (Grupo 1) presentaron un ligero incremento de peso durante el experimento de 20 Días, equivalente a los grupos de control (Grupos 3 y 4). Pérdida de peso de los ratones del Grupo 2: El peso medio para el Grupo 2 disminuyó \sim8% el Día 10.

El análisis del analizador de sangre de Abbot de la sangre obtenida el Día 10 y el Día 20 reveló cambios significativos en los recuentos de leucocitos en los Grupos 1 y 2. La Fig. 1 muestra un aumento pronunciado en los recuentos de monocitos en ratones tratados con Adzcyto24 con respecto a los otros grupos. Los recuentos de monocitos son 2,77 veces superiores en ratones a los que se ha inyectado Adzcyto24 frente a ratones a los que se ha inyectado vector parental (Adzpar). El Día 20 los recuentos de monocitos disminuyeron algo, pero todavía eran significativamente elevados con respecto a los ratones a los que se había inyectado el vector parental. La Fig. 2 muestra que la inyección con adenovirus que codifica una citoquina de Clase II (Adzcyto) pero no con un adenovirus que codifica zcyto24 conduce a un incremento del recuento de neutrófilos el Día 10.

Para verificar la identidad de los tipos de células detectados por el analizador de sangre de Abbot, se realizó una citometría de flujo con MAbs de linaje específico en la sangre del Día 20 del experimento. La Fig. 3 muestra el % de células CD11b positivas, esto es, los monocitos de la sangre periférica de cada ratón. Trazando los valores medios para cada grupo, la Fig. 4 revela un incremento significativo en el porcentaje de monocitos en el grupo que ha sido inyectado con adenovirus infectado con Zycyto24 frente al grupo infectado con el vector parental (p=0,05). Esto se corresponde con los cambios observados previamente con el analizador de sangre de Abbot.

El análisis de las mismas muestras de sangre con un MAb específico para granulocitos (GR-1) no reveló un incremento significativo en el porcentaje de granulocitos (esto es, principalmente neutrófilos) para los ratones que habían sido inyectados con Adzcyto24. Los PBL también se tiñeron con MAb específicos para células B (B220) y no se observaron diferencias significativas en los ratones que habían sido inyectados con Adzcyto24 con respecto a los otros grupos.

Notablemente los resfriados y la pérdida de peso asociados con la inyección de Adzcyto no eran evidentes con Adzcyto24. La aparente elevación de los monocitos detectada por el analizador de sangre de Abbot los Días 10 y 20 se confirmó mediante citometría de flujo de la sangre del Día 20 con Mab específicos del linaje. Un claro incremento del porcentaje de monocitos en los PBL de ratones a los que se había inyectado Adzcyto24 parece ser la única actividad mediada directa o indirectamente por zcyto24 en el contexto de una infección adenoviral. Es probable que zcyto24 expresado a niveles significativos en los ratones que habían sido inyectados con Adzcyto24 promueva una respuesta antiviral o bien reclutando y movilizando los monocitos de los tejidos periféricos o bien estimulando la producción de monocitos desde las células progenitoras de la médula ósea o el hígado. Esta evidencia sugiere que los monocitos/macrófagos son activados por zcyto24 y zcyto21.

<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> PROTEÍNA CITOQUINA ZCYTO20

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<130> 01-17PC

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<150> US 60/285.408

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<151> 2001-04-20

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<150> 115 60/286,482

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<151> 2001-04-25

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<150> US 60/341.050

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<151> 2001-10-22

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<150> US 60/341,105

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<151> 2001-10-22

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/895,834

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<151> 2001-06-29

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<150> US 60/285,424

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<151> 2001-04-20

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<160> 59

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 618

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(618)

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<400> 1

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22

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<210> 2

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<211> 205

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

24

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<210> 3

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<211> 615

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia degenerada

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<221> rasgo_misc

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<222> (1)...(615)

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<223> n = A.T.C o G

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<400> 3

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26

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<210> 4

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<211> 603

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(603)

\newpage

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<400> 4

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27

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 200

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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29

30

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<210> 6

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<211> 615

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(615)

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<400> 6

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31

32

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<210> 7

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<211> 205

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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33

34

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<210> 8

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<211> 633

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (22)...(630)

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<400> 8

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35

36

37

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<210> 9

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<211> 202

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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38

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<210> 10

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<211> 632

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (22)...(630)

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<400> 10

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39

40

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<210> 11

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<211> 202

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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41

42

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<210> 12

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC40923

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<400> 12

\hskip1cm43

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<210> 13

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<211> 88

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC40927

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<400> 13

\hskip1cm44

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<210> 14

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC41932

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<400> 14

\hskip1cm45

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<210> 15

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC41933

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<400> 15

\hskip1cm46

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<210> 16

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> glu glu tag

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<400> 16

\hskip1cm460

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<210> 17

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC40240

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<400> 17

\hskip1cm47

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<210> 18

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC447

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC976

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1473)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 491

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 611

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1563

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1563)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

61

62

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 520

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 674

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(633)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40209

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40632

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40633

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40638

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC40639

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1013

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)...(991)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> etiqueta péptido FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 699

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC37967

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC37972

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 615

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia degenerada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> rasgo_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(615)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39339

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39393

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39341

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39687

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39741

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39732

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm100

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<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC39701

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm101

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<210> 57

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador oligonucleotídico ZC39688

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC40288

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<400> 58

\hskip1cm103

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<210> 59

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador oligonucleotídico ZC40291

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<400> 59

\hskip1cm104

Claims (26)

1. Un polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 80% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y

(d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

2. El polipéptido aislado de la Reivindicación 1, donde dicho polipéptido se une específicamente a un receptor como se muestra en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29 en forma de un receptor monomérico u homodimérico, o en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29 combinados con el SEQ ID NO: 41 en forma de un receptor heterodimérico.

3. Un polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 95% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y

(d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

4. El polipéptido aislado de la Reivindicación 3, donde dicho polipéptido se une específicamente a un receptor como se muestra en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29 en forma de un receptor monomérico u homodimérico, o en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29 combinados con el SEQ ID NO: 41 en forma de un receptor heterodimérico.

5. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205.

6. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205.

7. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202.

8. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202.

9. Un polipéptido aislado que es tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

10. Un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

11. Un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

12. Un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202, donde dicho polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.

13. Una composición farmacéutica que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una proteína de fusión que comprende al menos dos polipéptidos, donde al menos uno de los polipéptidos comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y

(d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

16. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, donde el polipéptido codificado tiene una identidad de al menos 80% con una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 22-205 del SEQ ID NO: 2.

17. Un polipéptido aislado que codifica un polipéptido, donde el polipéptido codificado tiene una identidad de al menos 80% con una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 22-205 del SEQ ID NO: 7.

18. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y

(d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.

19. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 618.

20. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde el nucleótido 64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde el nucleótido 1 al nucleótido 618.

21. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 8 desde el nucleótido 67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 606.

22. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde el nucleótido 67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde el nucleótido 1 al nucleótido 606.

23. Un vector de expresión, que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las Reivindicaciones 19-22, un promotor de la transcripción, y un terminador de la transcripción, donde el promotor está conectado operablemente con la molécula de ácido nucleico, y donde la molécula de ácido nucleico está conectada operablemente con el terminador de la transcripción.

24. Una célula anfitriona recombinante que comprende el vector de expresión de la Reivindicación 23, donde la célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero, y células vegetales.

25. Un método de producción de un polipéptido, comprendiendo el método la etapa de cultivar células anfitrionas recombinantes que comprenden el vector de expresión de la Reivindicación 23, y que producen el polipéptido y aislar el polipéptido de las células anfitrionas cultivadas.

26. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 9-12.