ES2311622T3 - Familia proteica de citoquinas. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 80% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202.
Description
Familia proteica de citoquinas.
La diferenciación celular de los organismos
multicelulares está controlada por hormonas y factores de
crecimiento polipeptídicos. Estas molécula difundibles permiten a
las células comunicarse entre sí y actúan en concierto para formar
tejidos y órganos, y para reparar y regenerar el tejido dañado. Los
ejemplos de las hormonas y los factores de crecimiento incluyen las
hormonas esteroides, la hormona paratiroidea, la hormona
estimuladora del folículo, los interferones, las interleuquinas, el
factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de
crecimiento epidérmico, y el factor estimulador de las colonias de
granulocitos-macrófagos, entre otros.
Las hormonas y los factores de crecimiento
influyen en el metabolismo celular uniéndose a proteínas receptoras.
Ciertos receptores son proteínas integrantes de la membrana que se
unen con la hormona o el factor de crecimiento en el exterior de la
célula, y que están conectados a rutas de señalización en el
interior de la célula, tales como los sistemas de segundos
mensajeros. Otras clases de receptores son las moléculas
intracelulares solubles.
Las citoquinas estimulan generalmente la
proliferación o diferenciación de células del linaje hematopoyético
o participan en los mecanismos de respuesta inmunitaria o
inflamatoria del organismo. Los ejemplos de las citoquinas que
afectan a la hematopoyesis son la eritropoyetina (EPO), que estimula
el desarrollo de glóbulos rojos; la trombopoyetina (TPO), que
estimula el desarrollo de células del linaje de los megacariocitos;
y el factor estimulador de las colonias de granulocitos
(G-CSF), que estimula el desarrollo de los
neutrófilos. Estas citoquinas son útiles en la restauración de los
niveles normales de glóbulos rojos en pacientes que padecen anemia,
trombocitopenia, y neutropenia o que reciben quimioterapia para el
cáncer.
Las citoquinas juegan importantes papeles en la
regulación de la hematopoyesis y las respuestas inmunitarias, y
pueden influir en el desarrollo de linfocitos. La familia de
citoquinas de clase II humanas incluye los subtipos de
interferón-\alpha (IFN-\alpha),
interferón-\beta (IFN-\beta),
interferón-\gamma (INF-\gamma),
IL-10, IL-19 (Patente de los Estados
Unidos 5.985.614), MDA-7 (Jiang et al.,
Oncogene 11, 2477-2486, (1995)),
IL-20 (Jian et al., Oncogene
11, 2477-2486, (1995)), IL-22
(Xie et al., J. Biol. Chem. 275,
31335-31339, (2000)), y AK-155
(Knappe et al., J. Virol. 74,
3881-3887, (2000). La mayoría de las citoquinas se
unen a y transducen señales por medio de los receptores de
citoquinas de Clase I o de Clase II. Los miembros de la familia de
receptores de citoquinas de clase II humanos incluyen el
interferón-\alphaR1
(IFN-\alphaR1), el interferón
\gamma-R2
(IFN-\gamma-R2), el
interferón-\gamma R1 (IFN-\gamma
R1), el interferón-\gammaR2
(IFN-\gammaR2), la IL-10R (Liu
et al., J. Immunol, 152,
1821-1829, (1994)), el CRF2-4
(Lutfalla et al., Genomics 16,
366-373, (1993)), IL-20R\beta
(Blumberg et al., Cell 104,
9-19,(2001)) (también conocido como zcytor7 (Patente
de los Estados Unidos 5.945.511) y CRF2-8 (Kotenko
et al., Oncogene 19, 2557-2565,
(2000)), IL-20R\beta (Blumberg et al.,
ídem., (2001)) (también conocido como DIRS1 (Publicación PCT
WO 99/46379)), IL-22RA1 (IL-22
receptor \alpha1, sometido a HUGO para su aprobación) (también
conocido como IL-22R (Xie et al., J. Biol.
Chem. 275, 31335-31339, (2000)), zcytor
II (Patente de los Estados Unidos 5.965.704) y
CRF2-9 (Kotenko et al., Oncogene
19, 2257-2565, (2000)), y el factor
tisular.
Los receptores de citoquinas de clase II son
típicamente heterodímeros compuestos por dos cadenas receptoras
distintas, las subunidades del receptor \alpha y \beta (Stahl
et al., Cell 74, 587-590,
(1993)). En general, las subunidades \alpha son las proteínas de
unión a citoquinas primarias, y las subunidades \beta se requieren
para la formación de sitios de unión de alta afinidad, así como
para la transducción de la señal. Una excepción es el receptor de
IL-20 en el cual ambas subunidades son requeridas
para la unión de IL-20 (Blumberg et al.,
ídem, (2001)).
Los receptores de citoquinas de clase II son
identificados por un dominio de unión a citoquina conservado de
aproximadamente 200 aminoácidos (D200) en la porción extracelular
del receptor. Este dominio de unión a la citoquina está formado por
dos dominios de fibronectina de tipo III (FnIII) de aproximadamente
100 aminoácidos cada uno (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87, 6934-6938, (1990); Thoreau et
al., FEBS Lett 282, 16-31,
(1991)). Cada dominio FnIII contiene restos Cys, Pro, y Trp
conservados que determinan un patrón de plegamiento característico
de siete hebras \beta similares al dominio constante de las
inmunoglobulinas (Uze et al., J. Interferon Cytokine
Res. 15, 3-26, (1995)). Los elementos
estructurales conservados de la familia de receptores de citoquinas
de clase II hacen posible identificar nuevos miembros de esta
familia basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos
primaria. Previamente los autores de la presente invención han
identificado con éxito dos nuevos miembros de la familia de
receptores de citoquinas de clase II, Zcytor7 (Patente de los
Estados Unidos 5.945.511) (también conocido como
IL-20R \alpha (Blumberg et al.,
ídem, (2001)) y zcytor11 (Patente de los Estados Unidos
5.965.704) (también conocido como IL-22R (Blumberg
et al., ídem, (2001)), utilizando este enfoque. La
identificación de miembros novedosos adicionales de la familia de
receptores de citoquinas de clase II tiene interés porque las
citoquinas juegan un papel vital en la regulación de las respuestas
biológicas.
La IL-22, también conocida como
IL-TIF (IL-10 relacionada con el
factor inducible derivado de las células T) (Dumoutier et
al., J. Immunology, 164,
1814-1819, (2000)), es un homólogo de la
IL-10 descrito recientemente. La
IL-22 de ratón fue identificada originalmente como
un gen inducido por IL-9 en células T y mastocitos
in vitro (Dumoutier et al., J. Immunology
164, 1814-1819, (2000)). La actividad de
inducción por reaccionante en fase aguda fue observada en hígado de
ratón tras la inyección con IL-22, y la expresión de
IL-22 fue inducida rápidamente tras la inyección de
lipopolisacárido (LPS), sugiriendo que la IL-22
contribuye a la respuesta inflamatoria in vivo (Dumoutier
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,
10144-10149 (2000)).
Las interleuquinas son una familia de citoquinas
que median las respuestas inmunológicas, incluyendo la inflamación.
Las interleuquinas median una variedad de patologías inflamatorias.
Primordial para la respuesta inflamatoria es la célula T, que
produce muchas citoquinas e inmunidad adaptativa a los antígenos.
Las citoquinas producidas por las células T han sido clasificadas
como de tipo I y tipo II (Kelso, A. Immun. Cell Biol.
76:300-317, 1998). Las citoquinas de tipo I
incluyen IL-2, IFN-\gamma,
LT-\alpha, y están implicadas en las respuestas
inflamatorias, la inmunidad viral, la inmunidad de parásitos
intracelulares y el rechazo de aloinjertos. Las citoquinas de tipo
2 incluyen IL-4, IL-5,
IL-6, IL-10 e IL-13,
y están implicadas en las respuestas humorales, la inmunidad de
helmintos y la respuesta alérgica. Las citoquinas compartidas por el
tipo I y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y
TNF-\alpha. Existe cierta evidencia que sugiere
que las poblaciones de células T que producen el Tipo 1 y el Tipo 2
migran preferentemente en diferentes tipos de tejido inflamado.
Desde el punto de vista terapéutico, tienen
particular interés los interferones (proporcionan revisiones sobre
los interferones De Maeyer y De Maeyer-Guignard,
"Interferons", en The Cytokine Handbook, 3ª Edición,
Thompson (ed.), páginas 491-516 (Academic Press Ltd.
1998), y Walsh, Biopharmaceuticals:Biochemistry and
Biotechnology, páginas 158-188 (John Wiley &
Sons 1998)). Los interferones muestran una variedad de actividades
biológicas, y son útiles para el tratamiento de ciertas enfermedades
autoinmunitarias, concretamente cánceres, y para la potenciación de
la respuesta inmunitaria frente a agentes infecciosos, incluyendo
virus, bacterias, hongos, y protozoos. Hasta la fecha, se han
identificado seis formas de interferón, que han sido clasificadas
en dos grupos principales. Los denominados interferones de "tipo
I" incluyen el interferón-\alpha, el
interferón-\beta, el
interferón-\omega, el interferón \delta y el
interferón-\tau. En la actualidad, el
interferón-\gamma y una subclase de
interferón-\alpha son los únicos interferones de
tipo II.
Los interferones de tipo I, que se piensa que
derivan del mismo gen ancestral, han conservado una estructura
suficientemente similar para actuar por medio del mismo receptor de
la superficie celular. La cadena \alpha del receptor del
interferón \alpha/\beta humano comprende un dominio
N-terminal extracelular, que tiene las
características de un receptor de citoquinas de clase II. El
interferón-\gamma no comparte una homología
significativa con los interferones de tipo I o con el interferón de
subtipo \alpha de tipo II, pero comparte numerosas actividades
biológicas con los interferones de tipo I.
En los seres humanos, al menos 16 genes no
alélicos codifican diferentes subtipos de
interferón-\alpha, mientras los interferones
\beta y \omega están codificados por genes individuales. Los
genes de los interferones de tipo I están agrupados en el brazo
corto del cromosoma 9. A diferencia de los genes humanos
estructurales típicos, el interferón-\alpha, el
interferón-\beta y el
interferón-\omega carecen de intrones. Un único
gen para el interferón-\gamma humano está
localizado sobre el cromosoma 12 y contiene tres intrones. Hasta la
fecha, el interferón-\tau ha sido descrito
solamente en el ganado vacuno y ovino, mientras el
interferón-\delta ha sido descrito solamente en
cerdos.
Los medicos clínicos están sacando ventaja de
las múltiples actividades de los interferones utilizando las
proteínas para tratar una amplia gama de afecciones. Por ejemplo, se
ha aprobado una forma de interferón-\alpha para
su uso en más de 50 países para el tratamiento de afecciones médicas
tales como la leucemia de las células pilosas, el carcinoma de
células renales, el carcinoma de células basales, el melanoma
maligno, el sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, el mieloma
múltiple, la leucemia mielógena crónica, el linfoma no Hodgkin, la
papilomatosis laríngea, la micosis fungoides, el condiloma
acuminado, la hepatitis B crónica, la hepatitis C, la hepatitis D
crónica, y la hepatitis no A, no B/C crónica. La Administración de
Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos ha aprobado el uso del
interferón-\beta para tratar la esclerosis
múltiple, una enfermedad crónica del sistema nervioso. El
interferón-\gamma se utiliza para tratar las
enfermedades granulomatosas crónicas, en las cuales el interferón
potencia el sistema inmunitario del paciente para destruir los
patógenos bacterianos, fúngicos, y protozoicos infecciosos. Los
estudios clínicos también indican que el
interferón-\gamma puede ser útil en el
tratamiento del SIDA, la leismaniasis, y la lepra lepromatosa.
La genoteca de secuencias DATABASE EMBL EBI, 8
de Octubre de 1999, Núm. de Acceso AC011445, proporciona la
secuencia completa del clon CTC-246B18 del cromosoma
19 de Homo Sapiens.
En la publicación EP 0032134 se describen
secuencias de ADN, moléculas de ADN recombinante y procedimientos
para producir polipéptidos de tipo interferón humano.
Brack et al., Gene, Vol. 15, Núm. 4,
Parte 1, páginas 379-394, 1 de Diciembre de 1981,
describen el análisis molecular de la familia de genes del
interferón-alfa humano.
Xie M-H et al., J.
Biological Chemistry, Vol. 275, Núm. 40, páginas
31335-31339, 6 de Octubre de 2000, describen la
interleuquina (IL)-22, una citoquina humana que
señaliza por medio de proteínas relacionadas con el receptor de
interferón CRF-2-4 e
IL-22R.
En la publicación WO 00/55324 se describe un
interferón-alfa murino, denominado también zcyto
13.
En la publicación WO 03/066002 se describe un
mecanismo independiente de IFN-A/B de protección
anti-viral por medio de un par
ligando-receptor: los ligandos de IFN ocupan un
receptor IFN-LR1 (CRF2-12) e
IL-10R2 (CRF2-4) para la
señalización y la inducción de actividades biológicas.
En la publicación WO 02/092762 se describen
polipéptidos de citoquinas y métodos asociados.
Burge & Karlin, J. Mol. Biol. (1997), Vol.
268, páginas 78-94, describen una predicción de
estructuras génicas completas en ADN genómico humano.
Las actividades in vivo demostradas de la
familia de las citoquinas ilustran el enorme potencial clínico, y
la necesidad de otras citoquinas, agonistas de citoquinas, y
antagonistas de citoquinas. La presente invención estudia estas
necesidades proporcionando una nueva citoquina que estimula las
células del linaje celular hematopoyético, así como las
composiciones y los métodos relacionados.
La presente invención proporciona un polipéptido
aislado que tiene una identidad de al menos 80% con un polipéptido
seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y
(d) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202.
Antes de exponer la invención con detalle, puede
resultar útil para la comprensión de la misma definir los
siguientes términos:
El término "etiqueta de afinidad" se
utiliza en la presente memoria para indicar un segmento
polipeptídico que puede estar anclado a un segundo polipéptido para
proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido
o proporcionar sitios para el anclaje del segundo polipéptido a un
sustrato. En principio, se puede utilizar como etiqueta de afinidad
cualquier péptido o proteína para el cual se encuentre disponible
un anticuerpo u otro agente de unión específico. Las etiquetas de
afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson
et al., EMBO J., 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods
Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson,
Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu
(Grusenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido Flag® (Hopp
et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988),
péptido de unión a estreptavidina, u otro epítopo antigénico o
dominio de unión. Véase, en general, Ford et al. Protein
Expression and Purification 2: 95-107,
1991. Los ADN que codifican
las etiquetas de afinidad son asequibles de proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia, Biotech, Piscataway, NJ).
las etiquetas de afinidad son asequibles de proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia, Biotech, Piscataway, NJ).
El término "variante alélica" se utiliza en
la presente memoria para indicar cualquiera de las dos o más formas
alternativas de genes que ocupan el mismo locus cromosómico. La
variación alélica surge naturalmente por medio de la mutación, y
puede dar como resultado un polimorfismo fenotípico dentro de las
poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin
cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos
que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término
variante alélica también se utiliza en la presente memoria para
indicar una proteína codificada por una variante alélica de un
gen.
Los términos "amino terminal" y "carboxi
terminal" se utilizan en la presente memoria para indicar
posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo
permite, estos términos se utilizan con referencia a una secuencia
concreta o una porción de un polipéptido para indicar proximidad o
posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia situada
carboxi terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro
de un polipéptido está localizada próxima al extremo carboxilo de
la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el
extremo carboxilo del polipéptido completo.
El término "par
complemento/anti-complemento" indica radicales no
idénticos que forman un par estable, asociado no covalentemente en
condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o
estreptavidina) son miembros prototípicos de un par
complemento/anti-complemento. Otros pares
complemento/anti-complemento ilustrativos incluyen
pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o
epítopo), pares de polinucleótidos efectores/antisentido, y
similares. Cuando es deseable la posterior disociación del par
complemento/anti-complemento, el par
complemento/anti-complemento tiene preferiblemente
una afinidad de unión < 10^{9} M^{-1}.
El término "complementos de una molécula de
polinucleótido" indica una molécula de polinucleótido que tiene
una secuencia de bases complementaria y una orientación inversa en
comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la
secuencia 5'ATGCACGGG3' es complementaria a 5'CCCGTGCAT3'.
El término "secuencia de nucleótidos
degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o
más codones degenerados (en comparación con una molécula de
polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los
codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos,
pero codifican el mismo resto aminoácido (esto es, los tripletes
GAU y GAC codifican cada uno Asp).
El término "vector de expresión" se utiliza
para indicar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende
un segmento que codifica un polipéptido de interés conectado
operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su
transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias
promotoras y terminadoras, y también pueden incluir uno o más
orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un
intensificador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de
expresión derivan generalmente de ADN plasmídico o viral, o pueden
contener elementos de ambos.
El término "aislado", cuando se aplica a un
polinucleótido, indica que el polinucleótido ha sido separado de su
medio genético natural y por tanto está libre de otras secuencias
codificadoras extrañas o no deseadas, y se encuentra en una forma
adecuada para su uso en sistemas de producción de proteínas
diseñados genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas que
se separan de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos.
Las moléculas de ADN aislado de la presente invención están libres
de otros genes con los cuales están asociadas normalmente, pero
pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural
tales como promotores y terminadores. La identificación de las
regiones asociadas será evidente para un experto normal en la
técnica (véase por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature
316:774-78, 1985).
Un polipéptido o proteína "aislado" es un
polipéptido o proteína que se encuentra en unas condiciones
distintas de las de su medio nativo, por ejemplo separado de la
sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido
aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos,
concretamente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere
proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada,
esto es, puros en más de 95%, más preferiblemente puros en más de
99%. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado"
no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas
alternativas, tales como dímeros o alternativamente formas
glicosiladas o trans-
formadas.
formadas.
El término "neoplásico", cuando se refiere
a células, indica células que experimentan una proliferación nueva
y anómala, concretamente en un tejido en el que la proliferación no
está controlada y es progresiva, dando como resultado un neoplasma.
Las células neoplásicas pueden ser malignas, esto es invasivas y
metastásicas, o benignas.
El término "conectado operablemente",
cuando se refiere a segmentos de ADN, indica que los segmentos están
dispuestos de manera que funcionan en concierto para los propósitos
deseados, p. ej., la transcripción se inicia en el promotor y
prosigue a través del segmento codificador hacia el terminador.
El término "ortólogo" indica un polipéptido
o proteína obtenido de una especie que es la contraparte funcional
de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las
diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la
especiación.
Los "parálogos" son proteínas distintas
pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Se
cree que los parálogos surgen por la duplicación de genes. Por
ejemplo la \alpha-globina, la
\beta-globina, y la mioglobina son parálogos
entre sí.
Un "polinucleótido" es un polímero de bases
desoxirribonucleotidídicas o ribonucleotídicas de hebra sencilla o
doble leído del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y
ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in
vitro, o preparados a partir de una combinación de moléculas
naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se
expresan en forma de pares de bases (abreviado como "pb"),
nucleótidos ("nt"), o kilobases ("kb"). Cuando el
contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir
polinucleótidos que son de hebra sencilla o de doble hebra. Cuando
el término se aplica a moléculas de doble hebra se utiliza para
indicar la longitud global y se entenderá que es equivalente al
término "pares de bases". Los expertos en la técnica
reconocerán que las dos hebras del polinucleótido de doble hebra
pueden diferir ligeramente en su longitud y que los extremos de las
mismas pueden ser escalonados como resultado de la escisión
enzimática; de este modo todos los nucleótidos de la molécula de
polinucleótido de doble hebra pueden no estar emparejados.
Un "polipéptido" es un polímero de restos
aminoácido unidos por enlaces peptídicos, ya sean producidos
naturalmente o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de
aproximadamente 10 restos aminoácido son referidos comúnmente como
"péptidos".
El término "promotor" se utiliza en la
presente memoria por su significado reconocido en la técnica para
indicar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que
proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la
transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente,
pero no siempre, en las regiones 5' no codificadoras de los
genes.
Una "proteína" es una macromolécula que
comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también
puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos
carbohidratados. Los carbohidratos y otros sustituyentes no
peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en la
cual se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las
proteínas se definen en la presente memoria en términos de la
estructura de su cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes
tales como los grupos carbohidratados generalmente no se
especifican, pero sin embargo pueden estar presentes.
\newpage
El término "receptor" indica una proteína
asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (esto es,
un ligando) y media el efecto del ligando sobre la célula. Los
receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura
multipeptídica que comprende un dominio de unión al ligando
extracelular y un dominio efector intracelular que está implicado
típicamente en la transducción de la señal. La unión del ligando al
receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor
que ocasiona una interacción entre el dominio efector y la otra o
las otras moléculas de la célula. Esta interacción conduce a su vez
a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos
metabólicos que están ligados a las interacciones
receptor-ligando incluyen transcripción génica,
fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP
cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los
lípidos de la membrana, adherencia celular, hidrólisis de lípidos de
inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores
pueden estár unidos a la membrana, o pueden ser citosólicos o
nucleares, monoméricos (p. ej., receptor de la hormona estimuladora
del tiroides, receptor beta-adenérgico) o
multiméricos (p. ej., receptor de PDGF, receptor de la hormona del
crecimiento, receptor de IL-3, receptor de
GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor
de eritropoyetina y receptor de IL-6).
El término "secuencia señal secretora"
indica una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un
"péptido secretor") que, como componente de un polipéptido más
grande, dirige el polipéptido más grande a través de una ruta
secretora de una célula en la cual es sintetizada. El polipéptido
más grande es escindido comúnmente para separar el péptido secretor
durante el tránsito a través de la ruta secretora.
El término "variante de empalme" se utiliza
en la presente memoria para indicar formas alternativas de ARN
transcrito a partir de un gen. La variación de empalme surge
naturalmente por el uso de sitios de empalme alternativos dentro de
una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre moléculas
de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado
diversos ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de
empalme pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de
aminoácidos alteradas. El término variante de empalme se utiliza en
la presente memoria para indicar una proteína codificada por una
variante de empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.
Se entenderá que los pesos moleculares y las
longitudes de los polímeros determinados por medio de métodos
analíticos imprecisos (p. ej., electroforesis en gel) son valores
aproximados. Cuando semejante valor es expresado como "alrededor
de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor
establecido de X es exacto en \pm 10%.
La presente invención incluye un género de
moléculas polinucleotídicas y polipeptídicas que tienen similitud
funcional y estructural con los interferones. En esta nueva familia,
que incluye moléculas denominadas zcyto20 (SEQ ID NOS: 1 y 2),
zcyto21 (SEQ ID NOS: 4 y 5), zcyto22 (SEQ ID NOS: 6 y 7), zcyto24
(SEQ ID NOS: 8 y 9), zcyto25 (SEQ ID NOS: 10 y 11), zcyto20, 21, y
22 son secuencias humanas y zcyto24 y 25 son secuencias de ratón.
La homología entre la familia a nivel de nucleótidos y aminoácidos
se muestra en la Tabla 1, oscilando de aproximadamente 72% a 98% a
nivel de nucleótidos, y de 51% a 97% a nivel de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 es una ilustración de la identidad de
la secuencia entre zcyto20, zcyto21, zcyto22, IFN\alpha,
IFN\beta, IFN\gamma, e IL10 a nivel de aminoácidos.
Se ha demostrado que todos los miembros de la
familia se unen al mismo receptor de citoquina de clase II,
denominado receptor zcytor19. Además, se ha demostrado que cada
molécula de la familia muestra ciertas actividades biológicas.
Estas actividades incluyen, por ejemplo, actividades antivirales y
aumento de niveles de células mieloides circulantes. Si bien no se
desea estar ligado a la teoría, estas moléculas parecen señalizar
todas a través de receptor zcytor19 por medio de la misma ruta.
El gen Zcyto20 codifica un polipéptido de 205
aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 2. Se puede
pronosticar que la secuencia señal para Zcyto20 comprende del resto
aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 21 (Ala) del SEQ ID NO: 2.
El péptido maduro para Zcyto20 comienza en el resto aminoácido 22
(Val).
El gen Zcyto21 codifica un polipéptido de 200
aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 5. Se puede
pronosticar que la secuencia señal para Zcyto21 comprende del resto
aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 19 (Ala) del SEQ ID NO: 5.
El péptido maduro para Zcyto21 comienza en el resto aminoácido 20
(Gly). Zcyto21 ha sido descrito en la solicitud PCT WO
02/02627.
El gen Zcyto22 codifica un polipéptido de 205
aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 7. Se puede
pronosticar que la secuencia señal para Zcyto22 comprende del resto
aminoácido 1 (Met) al resto aminoácido 21 (Ala) del SEQ ID NO: 7.
El péptido maduro para Zcyto22 comienza en el resto aminoácido 22
(Val).
El gen Zcyto24 codifica un polipéptido de 202
aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 9. La secuencia señal
secretora para Zcyto24 comprende del resto aminoácido 1 (Met) al
resto aminoácido 28 (Ala) del SEQ ID NO: 9. Un sitio alternativo
para la escisión de la secuencia señal secretora se puede encontrar
en el resto aminoácido 24 (Thr). El polipéptido maduro comprende
del resto aminoácido 29 (Asp) al resto aminoácido 202 (Val).
El gen Zcyto25 codifica un polipéptido de 202
aminoácidos, como se muestra en el SEQ ID NO: 11. La secuencia
señal secretora para Zcyto25 comprende del resto aminoácido 1 (Met)
al resto aminoácido 28 (Ala) del SEQ ID NO: 11. Un sitio
alternativo para la escisión de la secuencia señal secretora se
puede encontrar en el resto aminoácido 24 (Thr). El polipéptido
maduro comprende del resto aminoácido 29 (Asp) al resto aminoácido
202 (Val).
Los genes Zcyto20, Zcyto21, y
Zcyto22 han sido mapeados en el cromosoma 19q13.13 humano.
Basándose en el descubrimiento de estos genes, esta región del
cromosoma 19 ha sido identificada por comprender una agrupación de
genes de tipo interferón. Una indicación adicional de que ésta es
una nueva familia de genes es la identificación de una agrupación
sinténica de genes en el cromosoma 7 de ratón, zcyto24 (SEQ ID NO:
8) y zcyto25 (SEQ ID NO: 10).
Como se describe más abajo, la presente
invención proporciona polipéptidos aislados que tienen una secuencia
de aminoácidos que es idéntica al menos en 70%, al menos en 80%, o
al menos en 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de los
restos aminoácido 22 a 205 del SEQ ID NO: 2 o de los restos
aminoácido 1 a 205 del SEQ ID NO: 2, o algún fragmento de los
mismos. La presente invención también incluye un polipéptido que
comprende adicionalmente una secuencia secretora de la señal que
reside en una posición amino terminal con respecto a la primera
secuencia de aminoácidos, donde la secuencia secretora de la señal
comprende los restos aminoácido 1 a 21 de la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 2.
En otra realización, la presente invención
proporciona polipéptidos aislados que tienen una secuencia de
aminoácidos que es idéntica al menos en 70%, al menos en 80%, o al
menos en 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a cualquiera de los restos
aminoácido 22 a 205 del SEQ ID NO: 7 o de los restos aminoácido 1 a
205 del SEQ ID NO: 7. La presente invención también incluye un
polipéptido que comprende adicionalmente una secuencia secretora de
la señal que reside en una posición amino terminal con respecto a la
primera secuencia de aminoácidos, donde la secuencia secretora de
la señal comprende los restos aminoácido 1 a 21 de la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 7.
En general, se pronostica que las citoquinas,
como la eritropoyetina (EPO), tienen una estructura de cuatro
hélices alfa, siendo las hélices A, C y D las más importantes en las
interacciones ligando-receptor, y son los más
altamente conservados entre los miembros de la familia. Sin embargo,
los interferones (INF), y el interferón alfa y el interferón tau en
particular, se caracterizan por haces de seis hélices. La hélice A
de la EPO es equivalente a la hélice A de zcyto20; la hélice B de la
EPO es equivalente a la hélice C de zcyto20; la hélice C de la EPO
es equivalente a la hélice D de zcyto20, y la hélice D de la EPO es
equivalente a la hélice F de zcyto20. De este modo, el bucle entre
el bucle AB, y el bucle CD de la EPO se expande en zcyto20 para
contener las hélices B y E cortas de zcyto20. Las estructuras
helicoidales de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 son
similares a la estructura de seis hélices encontrada en los
interferones. Los límites de las estructuras secundarias en las
proteínas se definen generalmente de acuerdo con una gama de ángulos
PHI y PSI del esqueleto de la cadena de proteína a partir de un
modelo tridimensional de la proteína. Los modelos pueden ser
construidos, por ejemplo, a partir de cristalografía de rayos x o
datos de RMN, o modelado por homología basándose en una estructura
resuelta. Dependiendo de las técnicas utilizadas, incluyendo las
condiciones para la formación de cristales y la determinación de la
estructura flexible en solución por RMN, los límites de estas
estructuras secundarias pueden ser ligeramente alterados. De este
modo, los expertos en la técnica reconocerán que los límites
helicoidales, y las estructuras secundarias en general, dependiendo
del entorno, pueden desplazarse 2, 3, 4, o más restos, pero las
regiones helicoidales son esencialmente las descritas más abajo.
(Véase, Brandon y Toosze, Introduction to Protein Structure,
Garland Publishing Co., Inc. Nueva York, 1991; Anderson et
al., Structure, 10(2):175-84,
2002).
Las hélices de Zcyto20 se pronostican como
sigue: la hélice A está definida por los restos aminoácido 52 (Ala)
a 66 (Leu); la hélice B por los restos aminoácido 78 (Arg) a 87
(Val); la hélice C por los restos aminoácido 91 (Pro) a 108 (Thr);
la hélice D por los restos aminoácido 116 (Val) a 138 (Ser); la
hélice E por los restos aminoácido 151 (Thr) a 172 (Lys); y la
hélice F por los restos aminoácido 177 (Gly) a 197 (Cys); como se
muestra en el SEQ ID NO: 2. Cuatro restos cisteína son conservados
entre Zcyto20, Zcyto21, e IFN-\alpha. Además,
Zcyto20 tiene 3 cisteínas adicionales. La cisteína del resto
aminoácido 204, puede formar un enlace disulfuro intermolecular, en
particular para formar homodímeros con moléculas de Zcyto20
adicionales. El análisis adicional de Zcyto20 basado en
alineamientos múltiples pronostica que las cisteínas de los restos
aminoácido 37 y 136; 69 y 197; y 71 y 178 (como se muestra en el
SEQ ID NO: 2) formarán enlaces disulfuro intramoleculares. Los
polinucleótidos correspondientes que codifican las regiones,
dominios, motivos, restos y secuencias del polipéptido Zcyto20
descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 1.
Las hélices de Zcyto21 se pronostican como
sigue: la hélice A está definida por los restos aminoácido 49 (Ser)
a 63 (Leu); la hélice B por los restos aminoácido 76 (Asn) a 84
(Val); la hélice C por los restos aminoácido 89 (Val) a 104 (Ala);
la hélice D por los restos aminoácido 111 (Glu) a 133 (Gln); la
hélice E por los restos aminoácido 137 (Thr) a 158 (Lys); y la
hélice F por los restos aminoácido 163 (Gly) a 189 (Leu); como se
muestra en el SEQ ID NO: 5. Los restos cisteína son conservados
entre Zcyto21, Zcyto21, e TNF-\alpha, y pueden
formar un enlace disulfuro intermolecular, en particular para
formar homodímeros con moléculas de Zcyto21 adicionales. El
análisis adicional de Zcyto21 basado en los alineamientos múltiples
pronostica que las cisteínas de los restos aminoácido 34 y 131, y
68 y 164, formarán enlaces disulfuro intramoleculares. La cisteína
del resto 190 está libre, y puede formar una asociación disulfuro
intermolecular. Los correspondientes polinucleótidos que codifican
las regiones, dominios, motivos, restos y secuencias del polipéptido
Zcyto21 descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID
NO: 4.
Las hélices de Zcyto22 se pronostican como
sigue: la hélice A está definida por los restos aminoácido 52 (Ala)
a 66 (Leu); la hélice B por los restos aminoácido 78 (Arg) a 87
(Val); la hélice C por los restos aminoácido 91 (Pro) a 108 (Thr);
la hélice D por los restos aminoácido 116 (Val) a 138 (Ser); la
hélice E por los restos aminoácido 151 (Thr) a 172 (Lys); y la
hélice F por los restos aminoácido 177 (Gly) a 197 (Cys); como se
muestra en el SEQ ID NO:7. Cuatro restos cisteína son conservados
entre Zcyto22, Zcyto21, e IFN-\alpha. Además,
Zcyto22 tiene 3 cisteínas adicionales. La cisteína del resto
aminoácido 204, puede formar un enlace disulfuro intermolecular, en
particular para formar homodímeros con moléculas de Zcyto22
adicionales. El análisis adicional de Zcyto22 basado en
alineamientos múltiples pronostica que las cisteínas de los restos
aminoácido 37 y 136; 69 y 197; y 71 y 178 (como se muestra en el
SEQ ID NO: 7) formarán enlaces disulfuro intramoleculares. Los
correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones,
dominios, motivos, restos, y secuencias del polipéptido Zcyto22
descritos en la presente memoria se muestran en el SEQ ID NO: 6.
Las cisteínas conservadas para zcyto24 se
muestran en los restos 44, 78, 141, y 175 del SEQ ID NO: 9. El
análisis adicional de zcyto 24 basado en los alineamientos
múltiples pronostica que se formarán enlaces disulfuro entre las
cisteínas de los restos aminoácido 44 y 141; 78 y 175; (como se
muestra en el SEQ ID NO: 9). Los correspondientes polinucleótidos
que codifican las regiones, dominios, motivos, restos, y secuencias
del polipéptido zcyto24 descritos en la presente memoria se
muestran en el SEQ ID NO: 9. Las hélices pronosticadas en zcyto24
(como se muestra en el SEQ ID NO: 9) son: los restos
59-73 (hélice A); los restos 85-94
(hélice B); los restos 98-115 (hélice C); los
restos 121-143 (hélice D); los restos
147-169 (hélice E); los restos
174-194 (hélice F).
Las cisteínas conservadas para zcyto25 se
muestran en los restos 44, 78, 141, y 175 del SEQ ID NO: 11. El
análisis adicional de zcyto25 basado en alineamientos múltiples
pronostica que los enlaces disulfuro se formarán entre las
cisteínas de los restos aminoácido 44 y 141; 78 y 175 (como se
muestra en el SEQ ID NO: 11). Los correspondientes polinucleótidos
que codifican las regiones, dominios, motivos, restos y secuencias
del polipéptido zcyto25 descritos en la presente memoria se
muestran en el SEQ ID NO: 11. Las hélices pronosticadas en zcyto25
(mostrado en el SEQ ID NO: 11) son; los restos 59-73
(hélice A); los restos 85-94 (hélice B); los restos
98-115 (hélice C); los restos
121-143 (hélice D); los restos
147-169 (hélice E); los restos
174-194 (hélice F).
El análisis mutacional detallado de la
IL-2 murina (Zurawski et al., EMBO J.
12:5113-5119, 1993) muestra los restos de
las hélices A y C que son importantes para la unión a
IL-2R\beta; los restos críticos son Asp_{34},
Asn_{99}, y Asn_{103}. Los múltiples restos del bucle A/B y de
la hélice B de la IL-2 murina son importantes para
la unión con IL-2R\alpha, mientras solamente un
único resto, Gln_{141} de la hélice D, es vital para la unión con
IL-2R\alpha. De un modo similar, las hélices A y C
son sitios de interacción entre IL-4 e
IL-4R\alpha (estructuralmente similar a
IL-2R\alpha), y los restos de la hélice D son
vitales para la interacción con IL-2R\alpha (Wang
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94:1657-1662, 1997; Kruse et al.,
EMBO J. 11:3237-3244, (1992). En
particular, la mutación Tyr_{124} por Asp en la
IL-4 humana crea un antagonista, que se une a
IL-4R\alpha pero no a
IL-2R\alpha y por lo tanto no puede señalizar
(Kruse et al., ídem. 1992).
Las citoquinas con paquetes de cuatro hélices
también se agrupan por la longitud de sus hélices componentes. Las
citoquinas con forma de "hélice larga" generalmente consisten
en hélices de entre 24-30 restos, e incluyen la
IL-6, el factor neurotrófico ciliar (CNTF), el
factor inhibidor de la leucemia (LIF) y la hormona del crecimiento
humana (hGH). Las citoquinas con forma de "hélice corta"
consisten generalmente en hélices de entre 18-21
restos e incluyen la IL-2, la IL-4 y
el GM-CSF. Los estudios en los que se utilizan CNTF
e IL-6 demostraron que la hélice de CNTF se puede
intercambiar por la hélice equivalente de IL-6,
confiriendo propiedades de unión de CTNF a la quimera. De este
modo, parece que los dominios funcionales de las citoquinas con
cuatro hélices están determinados basándose en la homología
estructural, con independencia de la identidad de la secuencia, y
pueden mantener su integridad funcional en una quimera (Kallen et
al., J. Biol. Chem.
274:11859-11867, 1999). Por lo tanto, los
dominios helicoidales de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 serán útiles para preparar moléculas de fusión quiméricas,
concretamente con otros interferones para determinar y modular la
especificidad de unión al receptor. Tienen un interés particular las
proteínas de fusión que combinan los dominios helicoidales y en
bucle de interferones y citoquinas tales como
INF-\alpha, IL-10, hormona de
crecimiento humana.
Se ha demostrado que zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 forman un complejo con el receptor huérfano
denominado zcytor19. Zcytor19 se describe en la solicitud de patente
comúnmente asignada PCT/US01/44808. Se ha demostrado que zcyto22,
zcyto21, y zcyto24 se unen o señalizan también por medio de
zcytor19, apoyando adicionalmente que zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 son miembros de la misma familia de citoquinas.
El receptor zcytor19 es un receptor de citoquina de clase II. Los
receptores de citoquina de clase II normalmente se unen a las
citoquinas de cuatro paquetes helicoidales. Por ejemplo, la
interleuquina-10 y los interferones se unen a
receptores de esta clase (p. ej., receptor del interferón gamma,
cadenas alfa y beta y las cadenas alfa y beta del receptor del
interferón-alfa/beta).
Los receptores de citoquinas de clase II se
caracterizan por la presencia de uno o más módulos de receptores de
citoquina (CRM) en sus dominios extracelulares. Otros receptores de
citoquina de clase II incluyen zcytor11 (Patente de los Estados
Unidos del mismo propietario Núm. 5.965.704), CRF2-4
(Núm. de Acceso Genbank Z17227), IL-10R (Núms. de
Acceso Genbank U00672 y NM_001558), DIRSI, zcytor7 (Patente de los
Estados Unidos del mismo propietario Núm. 5.945.511), y factor
tisular. Zcytor19, como todos los receptores de clase II conocidos
excepto la cadena alfa del receptor del interferón alfa/beta,
tiene solamente un único CRM de clase II en su dominio
extracelular.
El análisis del clon de ADNc humano que codifica
Zcytor19 (SEQ ID NO: 26) reveló un marco de lectura abierto que
codificaba 520 aminoácidos (SEQ ID NO: 27) que comprendía una
secuencia señal secretora (restos 1 (Met) a 20 (Gly) del SEQ ID NO:
27) y un polipéptido receptor de citoquina zcytor19 maduro (restos
21 (Arg) a 520 (Arg) del SEQ ID NO: 27) un dominio de unión al
ligando extracelular de aproximadamente 206 restos aminoácido
(restos 21 (Arg) a 226 (Asn) del SEQ ID NO: 27), un dominio
transmembrana de aproximadamente 23 restos aminoácido (restos 227
(Trp) a 249 (Trp) del SEQ ID NO: 27), y un dominio extracelular de
aproximadamente 271 restos aminoácido (restos 250 (Lys) a 520 (Arg)
del SEQ ID NO: 27). Dentro del dominio de unión al ligando
extracelular, existen dos dominios de fibronectina de tipo III y
una región conectora. El primer dominio de fibronectina de tipo III
comprende los restos 21 (Arg) a 119 (Tyr) del SEQ ID NO: 27, el
conector comprende los restos 120 (Leu) a 124 (Glu) del SEQ ID NO:
27, y el segundo dominio de fibronectina de tipo III comprende los
restos 125 (Pro) a 223 (Pro) del SEQ ID NO: 27. De este modo, un
polipéptido que comprende los aminoácidos 21 (Arg) a 223 (Pro) del
SEQ ID NO: 27 se considera un fragmento de unión al ligando. Además
en cuanto a los restos típicamente conservados en los receptores de
clase II, existen restos Triptófano conservados que comprenden los
restos 43 (Trp) y 68 (Trp) mostrados en el SEQ ID NO: 27, y restos
Cisteína conservados en las posiciones 74, 82, 195, 217 del SEQ ID
NO: 27.
Además, se identificó un clon de ADNc humano que
codifica una variante de Zcytor19 con una deleción del aminoácido
30. Esta variante de zcytor19 (como se muestra en el SEQ ID NO: 23)
comprende un marco de lectura abierto que codifica 491 aminoácidos
(SEQ ID NO: 24) que comprende una secuencia señal secretora (restos
1 (Met) a 20 (Gly) del SEQ ID NO: 24) y un polipéptido receptor de
citoquina zcytor19 maduro (restos 21 (Arg) a 491 (Arg) del SEQ ID
NO: 24), un dominio de unión al ligando extracelular de
aproximadamente 206 restos aminoácido (restos 21 (Arg) a 226 (Asn)
del SEQ ID NO: 24, un dominio transmembrana de aproximadamente 23
restos aminoácido (restos 227 (Trp) a 249 (Trp) del SEQ ID NO: 24),
y un dominio intracelular de aproximadamente 242 restos aminoácido
(restos 250 (Lys) a 491 (Arg) del SEQ ID O: 24). En el dominio de
unión al ligando extracelular, existen dos dominios de fibronectina
de tipo III y una región conectora. El primer dominio de
fibronectina de tipo III comprende los restos 21 (Arg) a 119 (Tyr)
del SEQ ID NO: 24, el conector comprende los restos 120 (Leu) a 124
(Glu) del SEQ ID NO: 24, y el segundo dominio de fibronectina de
tipo III es corto, y comprende los restos 125 (Pro) a 223 (Pro) del
SEQ ID NO: 24. De este modo, un polipéptido que comprende los
aminoácidos 21 (Arg) a 223 (Pro) del SEQ ID O: 24 se considera un
fragmento de unión al ligando. Además en cuanto a los receptores
típicamente conservados de clase II, existen restos Triptófano
conservados que comprenden los restos 43 (Trp) y 68 (Trp) como se
muestra en el SEQ ID NO: 24), y restos Cisteína conservados en las
posiciones 74, 82, 195, 217 del SEQ ID NO: 24.
Una forma soluble truncada del ARNm del receptor
zcytor19 parece ser expresada naturalmente. El análisis de un clon
de ADNc humano que codifica el Zcytor19 soluble truncado (SEQ ID NO:
28) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 211
aminoácidos (SEQ ID NO: 29) que comprendía una secuencia señal
secretora (restos 1 (Met) a 20 (Gly) del SEQ ID NO: 29) y un
polipéptido zcytor19 soluble truncado maduro (restos 21 (Arg) a 211
(Ser) del SEQ ID NO: 29), un dominio de unión al ligando
extracelular truncado de aproximadamente 143 restos aminoácido
(restos 21 (Arg) a 163 (Trp) del SEQ ID NO: 29), ningún dominio
transmembrana, pero un dominio adicional de aproximadamente 48
restos aminoácido (restos 164 (Lys) a 211 (Ser) del SEQ ID NO: 29).
En el dominio de unión al ligando extracelular truncado, existen
dos dominios de fibronectina de tipo III y una región ligadora. El
primer dominio de fibronectina de tipo III comprende los restos 21
(Arg) a 119 (Tyr) del SEQ ID NO: 29, el conector comprende los
restos 120 (Leu) a 124 (Glu) del SEQ ID NO: 29, y el segundo dominio
de fibronectina de tipo III comprende los restos 125 (Pro) a 163
(Trp) del SEQ ID NO: 29. De este modo, un polipéptido que comprende
los aminoácidos 21 (Arg) a 163 (Trp) del SEQ ID NO: 29 se considera
un fragmento de unión al ligando. Además en cuanto a los restos
típicamente conservados de los receptores de clase II, existen
restos Triptófano que comprenden los restos 43 (Trp) y 68 (Trp) como
se muestra en el SEQ ID NO: 29; y los restos Cisteína conservados
en esta forma soluble truncada del receptor zcytor19 están en las
posiciones 74, y 82 del SEQ ID NO: 29.
El receptor zcytor19 es un miembro de la misma
subfamilia de receptores que los receptores de citoquinas de clase
II, y los receptores de esta subfamilia se pueden asociar para
formar homodímeros que transducen una señal. Varios miembros de la
subfamilia (p. ej., los receptores que se unen al interferón,
IL-10, IL-19, e
IL-TIF) se combinan con una segunda subunidad
(denominada subunidad \beta) para unirse al ligando y transducir
una señal. Sin embargo, en muchos casos, las subunidades \beta
específicas se asocian con una pluralidad de subunidades de
receptores de citoquinas específicos. Por ejemplo, los receptores de
citoquinas de clase II, tales como zcytor11 (Patente de los Estados
Unidos Núm. 5.965.704) y el receptor CRF2-4 se
heterodimerizan para unirse a la citoquina IL-TIF
(Véase, la publicación WIPO WO 00/24758; Dumontier et al.,
J. Immunol. 164:1814-1819, 2000;
Spencer, SD et al., J. Exp. Med.
187:571-578, 1998; Gibbs, VC y Pennica
Gene 186:97-101,1997
(CRF2-4 cDNA); Xie, MH et al., J. Biol.
Chem. 275:31335-31339, 2000). Se cree que
el receptor de IL-10\beta es sinónimo de
CRF2-4 (Dumoutier, L. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Liu Y
et al., J. Immunol.
152:1821-1829, 1994 (IL-10R
cDNA). Por lo tanto, se podría esperar que zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se unan a receptores zcytor19
monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos. La
evidencia experimental ha identificado CRF2-4 (SEQ
ID NOS: 40 y 41) como supuesto compañero de unión para zcytor19 lo
que confirma adicionalmente que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25 juegan un papel importante en el sistema inmunomodulador,
afectando a fisiologías tales como el sistema inmunitario innato y
el sistema de respuesta inflamatoria.
La localización de la expresión de un receptor
para un par ligando/receptor puede tener trascendencia para
identificar la célula o tejido diana en el cual actúa el ligando.
Esto resulta particularmente útil cuando el complejo
receptor/ligando implica un receptor heterodimérico en el cual una
de las subunidades es expresada ampliamente y la otra subunidad es
expresada de una manera limitada, ya sea restringida espacialmente o
temporalmente. Utilizando la hibridación in situ se ha
identificado la expresión de zcytor19 en una muestra de carcinoma
de piel, donde el epitelio granular canceroso era fuertemente
positivo, si bien no se observa una señal positiva en la piel
normal. Otros tejidos que se ha identificado que expresan zcytor19
incluyen hígado fetal, donde se observó señal en una población
mixta de células mononucleares en espacios sinusoidales; en pulmón
se observó la expresión en epitelio alveolar de tipo II; y en
células mononucleares de tipo macrófago en el tejido intersticial.
El análisis northern de zcytor19 identificó la expresión de un
transcrito de \sim4,5 kb que estaba en su mayor parte en el
corazón, el músculo esquelético, el páncreas, y el tejido
prostático, además de en la línea celular de el linfoma de Burkitt
(RAJI) y en la línea celular de carcinoma colorrectal
SW-480.
La presente invención proporciona moléculas de
polinucleótidos, incluyendo las moléculas de ADN y ARN, que
codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y
zcyto25 descritos en la presente memoria. Los expertos en la
técnica reconocerán fácilmente que, a la vista de la degeneración
del código genético, es posible una considerable variación de la
secuencia entre estas moléculas de polinucleótido. El SEQ ID NO: 3
es una secuencia de ADN degenerado que abarca todos los ADN que
codifican el polipéptido zcyto20 del SEQ ID NO: 2. Los expertos en
la técnica reconocerán que la secuencia degenerada del SEQ ID NO: 3
también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican el
SEQ ID NO: 2 sustituyendo U por T. De este modo, los polinucleótidos
que codifican el polipéptido zcyto20 que comprenden del nucleótido
1 o 64 al nucleótido 615 del SEQ ID NO: 3 y sus ARN equivalentes
son contemplados por la presente invención. La Tabla 3 expone los
códigos de una letra utilizados en el SEQ ID NO: 3 para indicar las
posiciones de nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son
los nucleótidos indicados por una letra del código. El
"complemento" indica el código para el nucleótido o los
nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y indica C o T,
y su complemento R indica A o G, siendo A complementario a T, y
siendo G complementario a C.
El SEQ ID NO: 46 es una secuencia de ADN
degenerada que abarca todos los ADN que codifican el polipéptido
zcyto22 del SEQ ID NO: 7. Los expertos en la técnica reconocerán que
la secuencia degenerada del SEQ ID NO: 46 también proporciona todas
las secuencias de ARN que codifican el SEQ ID NO: 7 sustituyendo U
por T. De este modo, los polinucleótidos que codifican el
polipéptido zcyto22 que comprenden del nucleótido 1 o 64 al
nucleótido 615 del SEQ ID NO: 46 y sus ARN equivalentes son
contemplados por la presente invención. La Tabla 3 expone los
códigos de una letra utilizados en el SEQ ID NO: 46 para indicar las
posiciones de los nucleótidos degenerados. Las "resoluciones"
son los nucleótidos indicados por una letra del código. El
"complemento" indica el código para el nucleótido o los
nucleótidos complementarios. Por ejemplo, el código Y indica C o T,
y su complemento R indica A o G, siendo A complementario a T, y
siendo G complementario a C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los codones degenerados utilizados en el SEQ ID
NO: 3, que abarca todos los posibles codones para un aminoácido
dado, se exponen en la Tabla 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Un experto normal en la técnica apreciará que se
introduce cierta ambigüedad al determinar un codón degenerado,
representativo de todos los posibles codones que codifican cada
aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN)
puede, en algunas circunstancias, codificar arginina (AGR), y el
codón degenerado para arginina (MGN) puede, en algunas
circunstancias, codificar serina (AGY). Existe una relación similar
entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. De este
modo, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada
pueden codificar secuencias de aminoácidos variables, pero un
experto en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias
variables mediante la referencia a la secuencia de aminoácidos del
SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 7. Las secuencias variantes pueden ser
sometidas a ensayo fácilmente en cuanto a la funcionalidad como se
describe en la presente memoria.
Un experto normal en la técnica también
apreciará que diferentes especies pueden mostrar un "uso
preferente de codones ". En general, véase, Grantham, et
al., Nuc. Acids Res.
8:1893-912,1980; Haas, et al.,
Curr. Biol. 6:315-24, 1996;
Wain-Hobson, et al., Gene
13:355-64,1981; Grosjean y Fiers, Gene
18:199-209,1982; Holm, Nuc. Acids
Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J.
Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Según se
utiliza en la presente memoria, el término "uso preferente de
codones", o "codones preferentes" es un término de la
técnica que hace referencia a codones de traducción de las
proteínas que son utilizados muy frecuentemente en las células de
ciertas especies, favoreciendo de este modo uno o unos pocos
representativos de los posibles codones que codifican cada
aminoácido (Véase la Tabla 3). Por ejemplo, el aminoácido Treonina
(Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en
células de mamífero ACC es el codón más comúnmente utilizado; en
otras especies, por ejemplo, células de insecto, levaduras, virus o
bacterias, pueden ser preferentes diferentes codones de Thr. Los
codones preferentes para una especie concreta pueden ser
introducidos en los polinucleótidos de la presente invención
mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La
introducción de secuencias de codones preferentes en el ADN
recombinante puede potenciar, por ejemplo, la producción de la
proteína haciendo más eficaz la traducción de la proteína en un
tipo concreto de célula o especie. Por lo tanto, la secuencia de
codones degenerados descrita en los SEQ ID NOS: 3 y 46 sirve como
molde para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos
tipos celulares y especies comúnmente utilizados en la técnica y
descritos en la presente memoria. Las secuencias que contienen
codones preferentes pueden ser sometidas a ensayo y optimizadas en
cuanto a su expresión en diversas especies, y sometidas a ensayo en
cuanto a su funcionalidad como se describe en la presente
memoria.
Como se ha observado previamente, los
polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y
ARN. Los métodos para preparar ADN y ARN son bien conocidos en la
técnica. En general, el ARN se aísla de un tejido o célula que
produce grandes cantidades de ARN de zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25. Tales tejidos y células se identifican mediante
transferencia Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:5201, 1980), o mediante escrutinio del medio
acondicionado de diversos tipos de células en cuanto a su actividad
sobre células o tejidos diana. Una vez que se identifica la
actividad o la célula o tejido que produce el ARN, se puede
preparar el ARN total utilizando la extracción con isotiocianato de
guanidinio seguido de aislamiento mediante centrifugación en
gradientes de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry
18:52-94, 1979). El ARN
poli(A)^{+} se prepara a partir del ARN total
utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 69:1408-12, 1972). El ADN
complementario (ADNc) se prepara a partir de ARN
poli(A)^{+} utilizando métodos conocidos. Como
alternativa, se puede aislar ADN genómico. Los polinucleótidos que
codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 se identifican después y se aíslan, por ejemplo, mediante
hibridación o PCR.
Se pueden obtener clones completos que codifican
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 mediante procedimientos
de clonación convencionales. Se prefieren clones de ADN
complementario (ADNc), aunque para algunas aplicaciones (p. ej., la
expresión en animales transgénicos) puede ser preferible utilizar un
clon genómico, o modificar un clon de ADNc para que incluya al
menos un intrón genómico. Los métodos para preparar clones de ADNc y
genómicos son bien conocidos y están dentro del nivel de los
expertos en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita
en la presente memoria, o partes de la misma, para sondear o cebar
una genoteca. Las genotecas de expresión pueden ser sondeadas con
anticuerpos para fragmentos del receptor Zcytor19, u otros patrones
de unión
específicos.
específicos.
La presente invención proporciona adicionalmente
polipéptidos y polinucleótidos contraparte de otras especies
(ortólogos). Estas especies incluyen, pero no están limitadas a
mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras
especies de vertebrados e invertebrados. Tienen un interés
particular los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 de otras especies de mamíferos, incluyendo los polipéptidos
murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos, y de
otros primates. Los ortólogos de zcyto20, zcyto21, y zcyto22
humanos se pueden clonar utilizando la información y las
composiciones proporcionadas por la presente invención combinadas
con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, se puede
clonar un ADNc utilizando el ARNm obtenido de un tipo de tejido o
célula que expresa zcyto20, zcyto21, y zcyto22 como se describe en
la presente memoria. Las fuentes adecuadas de ARNm pueden ser
identificadas sondeando transferencias Northern con sondas
diseñadas a partir de secuencias descritas en la presente memoria.
Después se prepara una genoteca a partir del ARNm de un tejido o
una línea celular positivos. El ADNc que codifica zcyto20, zcyto21,
y zcyto22 puede ser aislado mediante una variedad de métodos, tales
como el sondeo con un ADNc humano completo o parcial o con uno o
más grupos de sondas degeneradas basadas en las secuencias
descritas. También se puede clonar un ADNc utilizando la reacción
en cadena de la polimerasa, o PCR (Mullis, Patente de los Estados
Unidos Núm. 4.683.202), utilizando los cebadores diseñados a partir
de la secuencia de zcyto20 humana representativa descrita en la
presente memoria. En un método adicional, se puede utilizar la
genoteca de ADNc para transformar o transfectar células
anfitrionas, y se puede detectar la expresión del ADNc de interés
con un anticuerpo para el polipéptido zcyto20, estudios de unión o
análisis de la actividad. También se pueden aplicar técnicas
similares al aislamiento de clones genómicos.
Los expertos en la técnica reconocerán que la
secuencia descrita en los SEQ ID NOS: 1, 4 y 6, respectivamente,
representan alelos individuales de las bandas de zcyto20, zcyto21, y
zcyto22 humanos, y que se espera que se produzcan la variación
alélica y el empalme alternativo. Las variantes alélicas de esta
secuencia pueden ser clonadas sondeando las genotecas de ADNc o
genómicas de diferentes individuos de acuerdo con los procedimientos
normalizados. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN
mostrada en el SEQ ID NO: 1, 4 y 6, incluyendo aquellas que
contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las cuales las
mutaciones dan como resultado cambios de aminoácidos, están dentro
del alcance de la presente invención, como lo están las proteínas
que son variantes alélicas del SEQ ID NO: 2, 5, y 7. Los ADNc
generados a partir de ARNm empalmados alternativamente, que
conservan las propiedades de los polipéptidos zcyto20, zcyto21, y
zcyto22, están incluidos en el alcance de la presente invención,
como lo están los polipéptidos codificados por tales ADNc y ARNm.
Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas
secuencias pueden ser clonadas sondeando genotecas de ADNc o
genómicas de diferentes individuos o tejidos de acuerdo con los
procedimientos normalizados conocidos en la técnica.
La presente invención también proporciona
reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico. Por
ejemplo, se pueden utilizar los genes de zcyto20, zcyto21, y
zcyto22, las sondas que comprenden ADN o ARN de zcyto20, zcyto21, y
zcyto22 o una subsecuencia de los mismos para determinar si el gen
de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 está presente en un cromosoma
humano, tal como el cromosoma 19, o si se ha producido una mutación
génica. Zcyto20, zcyto21, y zcyto22 están localizados en la región
q13.13 del cromosoma 19. Las aberraciones cromosómicas detectables
en el locus del gen zcyto20, zcyto21, y zcyto22 incluyen, pero no
están limitadas a, aneuploidía, cambios en el número de copias de
genes, pérdida de heterogeneidad (LOH), translocaciones,
inserciones, deleciones, cambios en los sitios de restricción y
transposiciones. Tales aberraciones pueden ser detectadas
utilizando los polinucleótidos de la presente invención empleando
técnicas de genética molecular, tales como el análisis del
polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), el
análisis de las repeticiones cortas en tándem (STR) empleando
técnicas de PCR, y otros mecanismos de análisis de conexión
genética conocidos en la técnica (Sambrook et al.,
ibid; Ausubel et al., ibid; Marian,
Chest 108:255-65, 1995).
El conocimiento preciso de la posición de un gen
puede ser útil para numerosos fines, incluyendo: 1) determinar si
una secuencia es parte de un cóntigo existente y obtener secuencias
genéticas circundantes adicionales de diversas formas, tales como
YAC, BAC o clones de ADNc; 2) proporcionar un posible gen candidato
para una enfermedad heredable que muestra conexión con la misma
región cromosómica; y 3) realizar referencias cruzadas a organismos
modelo, tales como ratón, que pueden ayudar a determinar qué función
podría tener un gen concreto.
Por ejemplo, Delague et al., (Am. J. Hum.
Genet. 67:236-243, 2000) identificaron que la
enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
está localizada en 19q13.1-13.3 (Delague et
al., Am. J. Hum. Genet. 67:236-243, 2.000).
Un diagnóstico podría ayudar a los médicos a
determinar el tipo de enfermedad y la terapia asociada apropiada, o
ayudar en el asesoramiento genético. Como tales, se pueden utilizar
los anticuerpos anti-zcyto20, los polinucleótidos,
y los polipéptidos de la invención para la detección del polipéptido
anti-zcyto20, el ARNm o los anticuerpos
anti-zcyto20, que sirven de ese modo como marcadores
y pueden ser utilizados directamente para detectar enfermedades
genéticas o cánceres, como se describe en la presente memoria,
utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la
presente memoria. Adicionalmente, se pueden utilizar sondas
polinucleotídicas de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 para detectar
anomalías o genotipos asociados con deleciones y translocaciones en
el cromosoma 19q13.13 asociadas con enfermedades humanas u otras
translocaciones implicadas en el progreso maligno de tumores u
otras mutaciones de 19q13.13, que se espera que estén implicadas en
transposiciones cromosómicas de malignidades; o en otros cánceres.
De un modo similar, las sondas polinucleotídicas de zcyto20 pueden
ser utilizadas para detectar anomalías o genotipos asociados con la
trisomía del cromosoma19q13.13 y la pérdida del cromosoma asociada
con enfermedades humanas o el aborto espontáneo. De este modo, se
pueden utilizar sondas polinucleotídicas de zcyto20, zcyto21 y
zcyto22 para detectar anomalías o genotipos asociados con estos
defectos.
En general, los métodos de diagnóstico
utilizados en el análisis de conexión genética, para detectar una
anomalía genética o una aberración en un paciente, son conocidos en
la técnica. Las sondas analíticas tendrán generalmente una longitud
de al menos 20 nt, aunque se pueden utilizar sondas algo más cortas
(p. ej., 14-17 nt). Los cebadores de PCR tienen una
longitud de al menos 5 nt, preferiblemente 15 nt o más, más
preferiblemente 20-30 nt. Para el análisis grosero
de los genes, o del ADN cromosómico, una sonda polinucleotídica de
zcyt020 puede comprender un exón completo o más. Los exones son
fácilmente determinados por un experto en la técnica comparando las
secuencias de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 (SEQ ID NOS: 1, 4 y 6,
respectivamente) con el ADN genómico para zyto20, zcyto21, y
zcyto22. En general, los métodos de diagnóstico utilizados en el
análisis de conexión genética, para detectar una anomalía genética
o una aberración en un paciente, son conocidos en la técnica. La
mayoría de los métodos de diagnóstico comprenden las etapas de (a)
obtener una muestra genética de un paciente potencialmente enfermo,
un paciente enfermo o un potencial portador no enfermo de un alelo
de enfermedad recesiva; (b) producir un primer producto de reacción
incubando la muestra genética con una sonda polinucleotídica de
zcyto20 donde el polinucleótido hibridará con una secuencia
polinucleotídica complementaria, por ejemplo en el análisis de RFLP
o incubando la muestra genética con cebadores efectores o
antisentido en una reacción de PCR en condiciones de reacción de
PCR apropiadas; (iii) Visualizar el primer producto de reacción
mediante electroforesis en gel y/u otro método conocido por ejemplo
visualizando el primer producto de reacción con una sonda
polinucleótidica de zcyto20 donde el polinucleótido hibridará con
la correspondiente secuencia polinucleotídica complementaria de la
primera reacción, y (iv) comparar el primer producto de reacción
visualizado con el segundo producto de reacción de control de una
muestra genética de un paciente de tipo salvaje. Una diferencia
entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de
control es indicativa de una anomalía genética en el paciente
enfermo o potencialmente enfermo, o la presencia de un fenotipo
portador recesivo heterocigoto para un paciente no enfermo, o la
presencia de un defecto genético en un tumor de un paciente enfermo,
o la presencia de una anomalía genética en un feto o embrión
preimplantado. Por ejemplo, una diferencia en el patrón del
fragmento de restricción, la longitud de los productos de la PCR,
la longitud de las secuencias repetitivas en el locus genético
zcyto20, y similares, son indicativas de una anomalía genética, una
aberración genética, o una diferencia alélica en comparación con el
control de tipo salvaje normal. Los controles pueden ser de miembros
no afectados de la familia, o individuos no relacionados,
dependiendo del ensayo y de la disponibilidad de muestras. Las
muestras genéticas para su uso en la presente invención incluyen ADN
genómico, ARNm, y ADNc aislado de cualquier tejido u otra muestra
biológica de un paciente, tal como pero no limitada a, sangre,
saliva, semen, células embrionarias, fluido amniótico, y similares.
La sonda polinucleotídica o cebador puede ser ADN o ARN, y
comprenderá una porción del SEQ ID NO: 1, el complemento del SEQ ID
NO: 1,o un ARN equivalente del mismo. Tales métodos de demostración
del análisis de conexión genética para fenotipos de enfermedades
humanas son bien conocidos en la técnica. Para una referencia a los
métodos basados en la PCR en los diagnósticos véase, en general,
Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana
Press, Inc. 1991), White (Ed.), PCR Protocols: Current Methods
and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.),
Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996),
Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana
Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR
(Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR in
Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).
Las mutaciones asociadas con el locus zcyto20,
zcyto21, y zcyto22 pueden ser detectadas utilizando moléculas de
ácido nucleico de la presente invención empleando métodos
normalizados para el análisis de las mutaciones directas, tales
como el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de
restricción, el análisis de las repeticiones cortas en tándem
utilizando técnicas de PCR, el análisis de amplificación refractaria
del sistema de mutaciones, detección del polimorfismo de la
conformación de la hebra sencilla, métodos de escisión con ARNasa,
electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, análisis de
emparejamientos erróneos asistido por fluorescencia, y otros
mecanismos de análisis genético conocidos en la técnica (véase, por
ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics
(Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255
(1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human
Press Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic
Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.),
Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford
University Press 1996), Birren et al., (eds.), Genome
Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1998), Dracopoli et al., (eds.), Current
Protocols in Human Genetics (John Wiley and Sons 1998), y
Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing", en
Principles of Molecular Medicine, páginas
83-88 (Humana Press, Inc. 1998)). El análisis
directo de un gen zcyto20 en cuanto a una mutación se puede
realizar utilizando el ADN genómico de un sujeto. Los métodos para
amplificar el ADN genómico, obtenido por ejemplo de linfocitos de
sangre periférica, son bien conocidos por los expertos en la técnica
(véase, por ejemplo, Dracopoli et al., (eds.), Current
Protocols in Human Genetics, en las páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John
Wiley and Sons 1998)).
En las realizaciones de la invención, las
moléculas de ácido nucleico que codifican zcyto20 aislado pueden
hibridar en condiciones restrictivas con moléculas de ácido nucleico
que tienen la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1, con las
moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos
de los nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO: 1, o con las moléculas
de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos
complementaria al SEQ ID NO: 1. En general, se seleccionan las
condiciones restrictivas para que sean alrededor de 5ºC más bajas
que el punto de fusión térmico (T_{m}) para una secuencia
específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La T_{m} es la
temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidos) a la
cual el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda
perfectamente emparejada. En las realizaciones de la invención, las
moléculas de ácido nucleico que codifican zcyto22 pueden hibridar
en condiciones restrictivas con moléculas de ácido nucleico que
tienen la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 6, con moléculas
de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos 64 a 618
del SEQ ID NO: 6, o con moléculas de ácido nucleico que tienen una
secuencia de nucleótidos complementaria al SEQ ID NO: 6.
Un par de moléculas de ácido nucleico, tales
como ADN-ADN, ARN-ARN y
ADN-ARN, pueden hibridar si las secuencias de
nucleótidos tienen cierto grado de complementariedad. Los híbridos
pueden tolerar pares de bases emparejados erróneamente en la doble
hélice, pero la estabilidad de los híbridos está influenciada por el
grado de emparejamientos erróneos. La T_{m} del híbrido con
emparejamientos erróneos disminuye 1ºC cada 1-1,5%
de pares de bases emparejados erróneamente. La variación de la
restricción de las condiciones de hibridación permite el control
sobre el grado de emparejamientos erróneos que estará presente en el
híbrido. El grado de restricción aumenta a medida que la
temperatura de hibridación aumenta y la fuerza iónica del tampón de
hibridación disminuye.
Está dentro de las capacidades del experto en la
técnica adaptar estas condiciones para su uso con un híbrido
polinucleotídico concreto. La T_{m} para una secuencia diana
específica es la temperatura (en las condiciones definidas) a la
cual el 50% de la secuencia diana hibridará con una secuencia de la
sonda perfectamente emparejada. Aquellas condiciones que influyen
en la T_{m} incluyen, el tamaño y el contenido de pares de bases
de la sonda polinucleotídica, la fuerza iónica de la solución de
hibridación, y la presencia de agentes desestabilizantes en la
solución de hibridación. Se conocen en la técnica numerosas
ecuaciones para calcular la T_{m}, y son específicas para los
híbridos de ADN, ARN, y ADN-ARN y para secuencias de
sondas polinucleotídicas de longitud variable (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989);
Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular
Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel
(eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic
Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.
26:227 (1990)). El soporte lógico de análisis de la secuencia tal
como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0
(Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), así como los sitios
de Internet, son herramientas disponibles para analizar una
secuencia dada y calcular la T_{m} basándose en criterios
definidos por el usuario. Tales programas también pueden analizar
una secuencia dada en las condiciones definidas e identificar
secuencias de sondas adecuadas. Típicamente, la hibridación de
secuencias polinucleotídicas más largas, >50 pares de bases, se
realiza a temperaturas de alrededor de 20-25ºC por
debajo de la T_{m} calculada. Para sondas más pequeñas, <50
pares de bases, la hibridación se lleva a cabo típicamente a una
T_{m} de 5-10ºC por debajo de la T_{m}
calculada. Esto permite la máxima velocidad de hibridación para los
híbridos ADN-ADN y ADN-ARN.
Tras la hibridación, las moléculas de ácido
nucleico se pueden lavar para separar las moléculas de ácido
nucleico que no han hibridado en condiciones restrictivas, o en
condiciones altamente restrictivas. Las condiciones de lavado
restrictivas típicas incluyen el lavado en una solución de 0,5x - 2x
SSC con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% a
55-65ºC. Esto es, las moléculas de ácido nucleico
que codifican los polipéptidos zcyto20, zcyto21 y zcyto22 variantes
hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia
de nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, y 6, respectivamente (o su
complemento) en condiciones de lavado restrictivas, en las cuales
la restricción del lavado es equivalente a 0,5x - 2x SSC con SDS al
0,1% a 55-65ºC, incluyendo 0,5x SSC con SDS al 0,1%
a 55ºC, o 2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC. Un experto en la técnica
puede idear fácilmente condiciones equivalentes, por ejemplo,
sustituyendo SSPE por SSC en la solución de lavado.
Las condiciones de lavado altamente restrictivas
típicas incluyen el lavado en una solución de 0,1x - 0,2x SSC con
dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 50-65ºC. En
otras palabras, las moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido zcyto 20 variante hibridan con una molécula de ácido
nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1 (o
su complemento) en condiciones de lavado altamente restrictivas, en
las cuales la restricción del lavado es equivalente a 0,1x - 0,2x
SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC, incluyendo 0,1 x SSC
con SDS al 0,1% a 50ºC, o 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC.
La presente invención también proporciona
polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24y zcyto25 aislados
que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar con
los polipéptidos de los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11,
respectivamente, o sus ortólogos. El término "identidad de
secuencia sustancialmente similar" se utiliza en la presente
memoria para indicar polipéptidos que comprenden una identidad de
secuencia de al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos
95%, o más del 95% con las secuencias mostradas en los SEQ ID NOS:
2, 5, 7, 9, 11, respectivamente, o sus ortólogos. La presente
invención también incluye polipéptidos que comprenden una secuencia
de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%,
al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más del 95%, 96%, 97%,
98%, 99% con la secuencia de restos aminoácido 1 a 205 o 21 a 205
del SEQ ID NO: 2 o el SEQ ID NO: 7. La presente invención incluye
adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican tales
polipéptidos. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad
se describen más abajo.
La presente invención también contempla
moléculas de ácido nucleico de zcyto20, zcyto21, y zcyto22 variantes
que pueden ser identificadas utilizando dos criterios: una
determinación de la similitud entre el polipéptido codificado por
la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11,
respectivamente, y/o un análisis de hibridación, como se ha
descrito antes. Tales variantes de zcyto20 incluyen moléculas de
ácido nucleico: (1) que hibridan con una molécula de ácido nucleico
que tiene la secuencia de nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, 6,
8, 10, respectivamente (o su complemento) en condiciones de lavado
restrictivas, en las cuales la restricción del lavado es
equivalente a 0,5x - 2x SSC con SDS al 0,1% a
55-65ºC; o (2) que codifican un polipéptido que
tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, al menos 80%, al
menos 90%, al menos 95% o más de 95% con la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 2. Alternativamente, las variantes de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser
caracterizadas como moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridan
con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de
nucleótidos de los SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, 10, respectivamente (o
su complemento) en condiciones de lavado altamente restrictivas, en
las cuales la restricción del lavado es equivalente a 0,1x - 0,2x
SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC; y (2) que codifican
un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos
70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% con la
secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NOS: 2, 5, 7, 9, 11,
respectivamente.
El porcentaje de identidad de la secuencia se
determina mediante métodos convencionales. Véase, por ejemplo,
Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603
(1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:10915 (1992). Brevemente, se alinean dos secuencias de
aminoácidos para optimizar las puntuaciones de alineamiento
utilizando una penalización de apertura del espacio de 10, una
penalidad de ampliación del espacio de 1, y la matriz de puntuación
"BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ídem.) como se
muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos están indicados por los
códigos de una letra normalizados).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica apreciarán que
existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos
secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud
"FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de
proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido
por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria y
la secuencia de aminoácidos de un supuesto zcyto20 variante. El
algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth
Enzymol. 183:63 (1990).
En resumen, FASTA caracteriza primero la
similitud de secuencia identificando las regiones compartidas por
la secuencia problema (p. ej., SEQ ID NO: 2) y una secuencia de
ensayo que tienen la mayor densidad de identidades (si la variable
ktup es 1) o pares de identidades (si ktup= 2), sin considerar
sustituciones de aminoácidos conservativas, inserciones, o
deleciones. La diez regiones con la mayor densidad de identidades
son restauradas después comparando la similitud de todos los
aminoácidos emparejados utilizando una matriz de sustitución de
aminoácidos, y los extremos de las regiones son "recortados"
para que incluyan solamente aquellos restos que contribuyen a la
puntuación más alta. Si existen numerosas regiones con puntuaciones
mayores que el valor de "corte" (calculado mediante una
fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el
valor ktup), las regiones iniciales recortadas se examinan para
determinar si las regiones pueden ser reunidas para formar un
alineamiento aproximado con espacios. Finalmente, las regiones de
puntuación más elevada de las dos secuencias de aminoácidos se
alinean utilizando una modificación del algoritmo de
Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman
y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970)); Sellers,
SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite
inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos
para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalización de apertura del
espacio = 10, penalización de ampliación del espacio = 1, y matriz
de sustitución = BLOSUM62. Estos parámetros pueden ser introducidos
en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de
puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el Apéndice 2 de
Meth. Enzymol. 183:63 (1990) de Pearson.
También se puede utilizar FASTA para determinar
la identidad de secuencia de las moléculas de ácido nucleico
utilizando una proporción como se ha descrito antes. Para las
comparaciones de las secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede
oscilar entre uno y seis, preferiblemente entre tres y seis, muy
preferiblemente tres, con los otros parámetros ajustados por
defecto.
Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, y zcyto22
variantes o los polipéptidos con una identidad de secuencia
sustancialmente similar se caracterizan por tener una o más
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios
son preferiblemente de una naturaleza menor, esto es sustituciones
de aminoácidos conservativas (véase la Tabla 5) y otras
sustituciones que no afectan significativamente al plegamiento o la
actividad del polipéptido; pequeñas deleciones, típicamente de uno
a aproximadamente 30 aminoácidos; y prolongaciones amino y carboxilo
terminales, tales como un resto metionina amino terminal, un
péptido conector pequeño de hasta alrededor de
20-25 restos, o una etiqueta de afinidad. La
presente invención incluye de este modo polipéptidos de alrededor
de 154 a 235 restos aminoácido que comprenden una secuencia que es
idéntica al menos en 70%, preferiblemente al menos 90%, y más
preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la correspondiente
región del SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos que comprenden etiquetas
de afinidad pueden comprender adicionalmente un sitio de escisión
proteolítica entre el polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25 y la etiqueta de afinidad. Los sitios preferidos de tales
sitios incluyen sitios de escisión de trombina y sitios de escisión
del factor Xa.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se puede efectuar la determinación de los restos
aminoácido que comprenden regiones o dominios que son críticos para
mantener la integridad estructural. En estas regiones se pueden
determinar los restos específicos que serán más o menos tolerantes
al cambio y mantener la estructura terciaria global de la molécula.
Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen,
pero no están limitados al alineamiento de secuencias múltiples con
una elevada identidad de aminoácidos o nucleótidos, las propensiones
de la estructura secundaria, los patrones binarios, el
empaquetamiento complementario y las interacciones polares ocultas
(Barton, Current Opin. Struct. Biol.
5:372-376, 1995 y Cordes et al.,
Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10,
1996). En general, cuando se diseñan modificaciones de moléculas o
se identifican fragmentos específicos, la determinación de la
estructura estará acompañada de la evaluación de la actividad de las
moléculas modificadas.
Los cambios en la secuencia de aminoácidos se
realizan en los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 con el fin de minimizar la desorganización de la estructura
de odren superior esencial para la actividad biológica. Por
ejemplo, cuando el polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 comprende una o más hélices, se realizarán cambios en los
restos aminoacido con el fin de no desorganizar la geometría de la
hélice y otros componentes de la molécula en los que los cambios de
conformación reducen alguna función crítica, por ejemplo, la unión
de la molécula a sus compañeros de unión. Los efectos de los cambios
en la secuencia de aminoácidos se pueden pronosticar, por ejemplo,
mediante modelado por ordenador como se ha descrito antes o
determinar mediante análisis de la estructura cristalina (véase, p.
ej., Lapthorn et al., Nat. Sruct. Biol.
2:266-268, 1995). Otros mecanismos que son
bien conocidos en la técnica comparan el plegamiento de una
proteína variante con una molécula normalizada (p. ej., la proteína
nativa). Por ejemplo, se puede realizar la comparación con el
patrón de cisteína en las moléculas variante y normalizada. La
espectrometría de masas y la modificación química utilizando
reducción y alquilación proporcionan métodos para determinar los
restos cisteína que están asociados con enlaces disulfuro o están
libres de tales asociaciones (Bean et al., Anal.
Biochem. 201:216-226,1992; Gray
Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; y
Patterson et al., Anal. Chem.
66:3727-3732, 1994). Generalmente se cree
que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de cisteína
que la molécula normalizada el plegamiento se verá afectado. Otro
método bien conocido y aceptado para medir el plegamiento es el
dicroismo circular (CD). La medida y la comparación de los espectros
de CD generados por una molécula modificada y una molécula
normalizada son una rutina (Johnson, Proteins
7:205-214,1990). La cristalografía es otro
método bien conocido para analizar el plegamiento y la estructura.
La resonancia magnética nuclear (RMN), el mapeo digestivo de
péptidos y el mapeo de epítopos también son métodos conocidos para
analizar el plegamiento y las similitudes estructurales entre
proteínas y polipéptidos (Schaanan et al., Science
257:961-964, 1992).
Se puede generar un perfil del carácter
hidrófilo de Hopp/Woods de la secuencia de la proteína zcyto20 que
se muestra en el SEQ ID NO: 2 (Hopp et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp,
J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y
Triquier et al., Protein Engineering
11:153-169, 1998). El perfil se basa en una
ventana corrediza de seis restos. Los restos G, S, y T ocultos y
los restos H, Y, y W expuestos se ignoraron. Por ejemplo, en
zcyto20, las regiones hidrofílicas incluyen los restos aminoácido
169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 54
(Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 53 (Phe) a
58 (Asp) del SEQ ID NO: 2, los restos aminoácido 168 (Gln) a 173
(Lys) del SEQ ID NO: 2, y los restos aminoácido 154 (Pro) a 159
(Arg) del SEQ ID NO: 2.
Se puede generar un perfil del carácter
hidrófilo Hopp/Woods de la secuencia de la proteína zcyto22 que se
muestra en el SEQ ID NO: 7 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 78:3824-3828,1981; Hopp, J.
Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier
et al., Protein Engineering
11:153-169, 1998). El perfil se basa en una
ventana corrediza de seis restos. Los restos G, S, y T ocultos y
los restos H, Y, y W expuestos se ignoraron. Por ejemplo, en
zcyto22, las regiones hidrófilas incluyen los restos aminoácido 169
(Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 54 (Lys)
a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 53 (Phe) a 58
(Asp) del SEQ ID NO: 7, los restos aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys)
del SEQ ID NO: 7, y los restos aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del
SEQ ID NO: 7.
Los expertos en la técnica reconocerán que el
carácter hidrófilo o el carácter hidrófobo se tomarán en
consideración cuando se diseñen modificaciones de la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25, con el fin de no desorganizar la estructura global y el
perfil biológico. Son de particular interés para la sustitución los
restos hidrófobos seleccionados del grupo que consiste en Val, Leu e
Ile o el grupo que consiste en Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp.
Las identidades de los aminoácidos esenciales
también son inferidas del análisis de similitud de la secuencia
entre IFN-\alpha y los miembros de la familia de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 (como se muestra en
las Tablas 1 y 2). Utilizando métodos tales como el análisis
"FASTA" descrito previamente, se identifican regiones de
elevada similitud dentro de una familia de proteínas y se utilizan
para analizar secuencias de aminoácidos para regiones conservadas.
Un enfoque alternativo para identificar un polinucleótido variante
basándose en la estructura consiste en determinar si una molécula de
ácido nucleico que codifica un gen zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24, y zcyto 25 variante potencial puede hibridar con una
molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de
los SEQ ID NOS: 1, 4, 6, 8, o 10 mencionados antes.
Otros métodos de identificación de aminoácidos
esenciales en los polipéptidos de la presente invención son los
procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis
dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido con alanina
(Cunningham y Wells, Science 244:1081 (1989), Bass
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498
(1991)), Coombs y Corey, "Site-Directed
Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis
and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311
(Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, se introducen
mutaciones de alanina individuales en cada resto de la molécula, y
las moléculas mutantes resultantes se someten a ensayo en cuanto a
la actividad biológica o bioquímica como se describe más abajo para
identificar los restos aminoácido que son críticos para la
actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J.
Biol. Chem. 271:4699 (1996).
La presente invención también incluye los
fragmentos funcionales de los polipéptidos zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24, y zcyto25 y las moléculas de ácido nucleico que
codifican tales fragmentos funcionales. Un zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24, y zcyto25 funcional o un fragmento del mismo según
se define en la presente memoria se caracteriza por su actividad
proliferativa o diferenciadora, por su capacidad para inducir o
inhibir funciones celulares especializadas, o por su capacidad para
unirse específicamente a un anticuerpo anti- zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24, y zcyto25 o al receptor zcytor19 (ya sea soluble o
inmovilizado). Como se ha descrito previamente en la presente
memoria, los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y
zcyto25 se caracterizan por un haz de seis hélices. De este modo,
la presente invención proporciona adicionalmente proteínas de fusión
que abarcan: (a) moléculas polipeptídicas que comprenden una o más
de las hélices descritas antes; y (b) fragmentos funcionales que
comprenden una o más de estas hélices. La otra porción polipeptídica
de la proteína de fusión puede ser aportada por otra citoquina o
interferón del haz helicoidal, tal como
INF-\alpha, o por un péptido señal secretor no
nativo y/o no relacionado que facilita la secreción de la proteína
de fusión.
Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24, y zcyto25 de la presente invención, incluyendo los
polipéptidos completos, los fragmentos biológicamente activos, y
los polipéptidos de fusión pueden ser producidos de acuerdo con las
técnicas convencionales utilizando células en las que se ha
introducido un vector de expresión que codifica el polipéptido.
Según se utiliza en la presente memoria, las "células en las
cuales se ha introducido un vector de expresión" incluyen tanto
células que han sido manipuladas directamente mediante la
introducción de moléculas de ADN exógeno como la progenie de las
mismas que contienen el ADN introducido. Las células anfitrionas
adecuadas son aquellos tipos de células que pueden ser transformados
o transfectados con ADN exógeno y desarrolladas en cultivo, e
incluyen bacterias, células fúngicas, y células eucarióticas
superiores cultivadas. Las técnicas para la manipulación de
moléculas de ADN clonadas y la introducción de ADN exógeno en una
variedad de células anfitrionas son descritas por Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y
Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
En general, una secuencia de ADN que codifica un
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 está
conectada operablemente a otros elementos genéticos requeridos para
su expresión, incluyendo generalmente un promotor de la
transcripción y un terminador, dentro de un vector de expresión. El
vector también contendrá comúnmente uno o más marcadores
seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos
expertos en la técnica reconocerán que en ciertos sistemas se
pueden proporcionar marcadores seleccionables en vectores
separados, y se puede proporcionar la replicación del ADN exógeno
mediante la integración en el genoma de la célula anfitriona. La
selección de los promotores, terminadores, marcadores
seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño
rutinario dentro del nivel del experto en la técnica. Muchos de
tales elementos se describen en la literatura y son asequibles por
medio de proveedores comerciales.
Para dirigir un polipéptido zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24, y zcyto25 a la ruta secretora de una célula
anfitriona, se proporciona una secuencia señal secretora (también
conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) al
vector de expresión. La secuencia señal secretora puede ser la de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25, o puede derivar de
otra proteína secretada (p. ej., t-PA; véase la
Patente de los Estados Unidos Núm. 5.641.655) o ser sintetizada
de novo. La secuencia señal secretora está conectada
operablemente a la secuencia de ADN de zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24, y zcyto25, esto es, las dos secuencias se unen en el marco
de lectura correcto y se sitúan para dirigir el polipéptido recién
sintetizado a la ruta secretora de la célula anfitriona. Las
secuencias de la señal secretora se sitúan comúnmente 5' con
respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de
interés, aunque ciertas secuencias señal se pueden situar en
cualquier parte de la secuencia de ADN de interés (véase, p. ej.,
Welch et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.037.743;
Holland et al., Patente de los Estados Unidos Núm.
5.143.830).
En la presente invención se pueden utilizar
células de mamífero cultivadas como anfitriones. Los métodos para
introducir ADN exógeno en las células anfitrionas de mamífero
incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler
et al., Cell 14:725,1978; Corsaro y Pearson,
Somatic Cell Genetics 7:603,1981; Graham y Van der
Eb, Virology 52:456, 1973), la electroporación
(Neumann et al., EMBO J.
1:841-845, 1982), la transfección mediada
por DEAE-dextrano (Ausubel et al.,
ídem), y la transfección mediada por liposomas
(Hawley-Nelson et al., Focus
15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus
15:80, 1993). La producción de polipéptidos recombinantes en
células de mamífero cultivadas es descrita, por ejemplo, por
Levinson et al. Patente de los Estados Unidos Núm.
4.713.339; Hagen et al., Patente de los Estados Unidos Núm.
4.784.950; Palmiter et al., Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.579.821; y Ringold, Patente de los Estados Unidos Núm.
4.656.134. Las células de mamífero adecuadas incluyen las líneas
celulares COS-1 (ATCC Núm. CRL 1650=,
COS-7 (ATCC Núm. CRL 1651), BHK (ATCC Núm. CRL
1632), BHK 570 (ATCC Núm. CRL 10314), 293 (ATCC Núm. CRL 1573;
Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977) y de ovario de hámster Chino
(p. ej., CHO-K1, ATCC Núm. CCL 61; o CHO DG44,
Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet.
12:555, 1986). Se conocen líneas celulares adecuadas
adicionales en la técnica y se encuentran disponibles de depósitos
públicos tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo,
Mannasas, VA. En general, se prefieren promotores de la
transcripción fuertes, tales como los promotores de
SV-40 o citomegalovirus. Véase, p. ej. la Patente
de los Estados Unidos Núm. 4.956.288. Otros promotores adecuados
incluyen aquellos de los genes de la metalotioneína (Patentes de
los Estados Unidos Núms. 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor
tardío principal de adenovirus. Los vectores de expresión para su
uso en células de mamífero incluyen pZP-1 y
pZP-9, que han sido depositados en la Colección de
Cultivos Tipo Americana, Mannasas, VA USA con los números de acceso
98669 y 98668, respectivamente, y los derivados de los mismos.
Generalmente se utiliza la selección con
fármacos para seleccionar células de mamífero cultivadas en las
cuales se ha insertado ADN foráneo. Tales células son referidas
comúnmente como "transfectantes". Las células que han sido
cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar
el gen de interés a su progenie son referidas como
"transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido
es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La
selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo
neomicina, tal como G-418 o similar. También se
pueden utilizar sistemas de selección para incrementar el nivel de
expresión del gen de interés, un procedimiento referido como
"amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando
transfectantes y aumentando después la cantidad de agente selectivo
para seleccionar las células que producen elevados niveles de los
productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable
amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere
resistencia al metotrexato. También se pueden utilizar otros genes
de resistencia a fármacos (p. ej., resistencia a higromicina,
resistencia a múltiples fármacos, puromicin acetiltransferasa).
El sistema de adenovirus también puede ser
utilizado para la producción de proteína in vitro. Cultivando
células 293 no infectadas con adenovirus en condiciones en las que
las células no se dividen rápidamente, las células pueden producir
proteínas durante períodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, se
hacen crecer células BHK hasta la confluencia en factorías de
células, después se exponen al vector adenoviral que codifica la
proteína secretada de interés. Luego se hacen crecer las células en
condiciones sin suero, lo que permite sobrevivir durante varias
semanas a las células infectadas sin una división celular
significativa. En un método alternativo, las células 293 infectadas
con el vector de adenovirus se pueden hacer crecer como células
adherentes o en un cultivo en suspensión a una densidad celular
relativamente elevada para producir cantidades significativas de
proteína (Véase Garnier et al., Cytotechnol.
15:145-55, 1994). Con cualquier protocolo, se
puede aislar repetidamente una proteína heteróloga secretada,
expresada del sobrenadante del cultivo celular, producto lisado, o
fracciones de membrana dependiendo de la disposición de la proteína
expresada en la célula. En el protocolo de producción de células
293 infectadas, también se pueden obtener eficazmente proteínas no
secretadas.
Se pueden infectar células de insecto con
baculovirus recombinante, comúnmente derivado del virus de la
polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) de
acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. En un método
preferido, el baculovirus recombinante es producido por medio del
uso de un sistema basado en transposones descrito por Luckow et
al., (J. Virol. 67:4566-4579,
1993). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, es
asequible comercialmente en forma de kit (kit
Bac-to-Bac®; Life Technologies,
Rockville, MD). El vector de transferencia (p. ej., pFastBac1®,
Life Technologies) contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que
codifica la proteína de interés a un genoma de baculovirus mantenido
en E. coli como un plásmido grande denominado
"bácmido". Véase, Hill-Perkins y Posee, J.
Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Boonning
et al., J. Gen. Virol.
75:1551-1556, 1994; y Chazenbalk y Rapoport,
J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995.
Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en
marco con un ADN que codifica una prolongación del polipéptido o
una etiqueta de afinidad como se ha descrito antes. Utilizando
mecanismos conocidos en la técnica, un vector de transferencia que
contiene una secuencia codificadora de zcyto20, zcyto22, zcyto24, y
zcyto25 es transformado en células anfitrionas de E. coli, y
las células son escrutadas en cuanto a los bácmidos que contienen
un gen lacZ interrumpido indicativo del baculovirus recombinante. El
ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante
es aislado, utilizando técnicas comunes, y utilizado para
transfectar células de Spodoptera frugiperda, tales como
células Sf9. Con posterioridad se produce el virus recombinante que
expresa la proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25.
Las soluciones de partida virales recombinantes se elaboran
mediante métodos utilizados comúnmente en la técnica.
Para la producción de proteína, se utiliza el
virus recombinante para infectar las células anfitrionas,
típicamente una línea celular derivada de gusano cogollero
Spodoptera frugiperda (p. ej., células Sf9 o Sf21) o
Trichloplusia ni (p. ej., células High Five®; Invitrogen,
Carlsbad, CA). Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos
Núm. 5.300.435. Se utilizan medios libres de suero para hacer crecer
y mantener las células. Las formulaciones de medio adecuadas son
conocidas en la técnica y se pueden obtener de proveedores
comerciales. Las células se hacen crecer desde una densidad de
inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5}
células a una densidad de 1-2 x 10^{6} células,
momento en el cual se añade una solución de partida de virus
recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 1,0,
más típicamente cerca de 3. Los procedimientos utilizados son
generalmente conocidos en la técnica.
También se pueden utilizar como anfitriones
otras células eucarióticas superiores, incluyendo células vegetales
y células de aves. El uso de Agrobacterium rhizogenes como
vector para expresar genes en células vegetales ha sido revisado
por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore)
11:47-58,1987.
Las células fúngicas, incluyendo las células de
levadura, también pueden ser utilizadas en la presente invención.
Las especies de levadura de particular interés en este aspecto
incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y
Pichia methanolica. Los métodos para transformar las células
de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos
recombinantes a partir de ellas son descritos, por ejemplo, por
Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.599.311; Kawasaki
et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.931.373; Brake,
Patente de los Estados Unidos Núm. 4.870.008; Welch et al.,
Patente de los Estados Unidos Núm. 5.037.743; y Murray et
al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.845.075. Las células
transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el
marcador seleccionable, comúnmente de resistencia a fármacos o por
la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente concreto (p.
ej., leucina). Un sistema vector preferido para su uso en
Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POTI
descrito por Kawasaki et al. (Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas
mediante el crecimiento en medio que contiene glucosa. Los
promotores y terminadores adecuados para su uso en levadura incluyen
aquellos de genes de enzimas glicolíticas (véase, p. ej., Kawasaki,
Patente de los Estados Unidos Núm. 4.599.311; Kingsman et
al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.615.974; Y Bitter,
Patente de los Estados Unidos Núm. 4.977.092) y genes de alcohol
deshidrogenasa. Véanse también las Patentes de los Estados Unidos
Núms. 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. Los sistemas de
transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula
polymorpha, Schyzosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia
methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa son
conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Gleeson et
al., J. Gen. Microbiol.
132:3459-3465, 1986; Cregg, Patente de los
Estados Unidos Núm. 4.882.279; y Raymond et al.,
Yeast 14:11-23, 1998. Se pueden
utilizar células de Aspergillus de acuerdo con los métodos
de McKnight et al., Patente de los Estados Unidos Núm.
4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium
chrysogenum son descritos por Sumino et al., Patente de
los Estados Unidos Núm. 5.162.228. Los métodos para transformar
Neurospora son descritos por Lambowitz, Patente de los Estados
Unidos Núm. 4.486.533. La producción de proteínas recombinantes en
Pichia methanolica se describe en las Patentes de los
Estados Unidos Núms. 5.716.808, 5.736.383, 5.854.039, y
5.888.768.
Las células procarióticas, incluyendo las cepas
de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y otros géneros
también son útiles en la presente invención. Los mecanismos para
transformar estos anfitriones y expresar las secuencias de ADN
foráneo clonadas en ellos son bien conocidos en la técnica (véase,
p. ej., Sambrook et al., ídem). Cuando se expresa un
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en una
bacteria tal como E. coli, el polipéptido puede ser
conservado en el citoplasma, típicamente en forma de gránulos
insolubles, o puede ser dirigido al espacio periplásmico mediante
una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las
células son lisadas, y los gránulos son recuperados y
desnaturalizados utilizando, por ejemplo, isotiocianato de
guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede ser replegado
después y dimerizado diluyendo el desnaturalizante, por ejemplo
mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación
de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a una
solución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido puede
ser recuperado del espacio periplásmico en una forma soluble y
funcional desorganizando las células (por ejemplo, mediante
sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del
espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando de ese modo
la necesidad de desnaturalización y replegamiento.
Las células anfitrionas transformadas o
transfectadas se cultivan de acuerdo con los procedimientos
convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y
otros componentes requeridos para el crecimiento de las células
anfitrionas seleccionadas. Una variedad de medios adecuados,
incluyendo medios definidos y medios complejos, son conocidos en la
técnica e incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los
medios también pueden contener componentes tales como factores de
crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento
seleccionará generalmente células que contienen el ADN añadido
exógenamente, por ejemplo, mediante selección con fármacos o
deficiencia en un nutriente esencial que es complementada por el
marcador seleccionable portado en el vector de expresión o
co-transfectado en la célula anfitriona. Los
cultivos líquidos son proporcionados con aireación suficiente
mediante métodos convencionales, tales como sacudimiento de
matraces pequeños o purgado de fermentadores.
Se prefiere purificar los polipéptidos y
proteínas de la presente invención a una pureza \geq80%, más
preferiblemente una pureza \geq 90%, incluso más preferiblemente
una pureza \geq95%, y es particularmente preferido un estado
farmacéuticamente puro, que es de una pureza mayor de 99,9% con
respecto a las macromoléculas contaminantes, concretamente otras
proteínas y ácidos nucleicos, libre de agentes infecciosos y
pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido o proteína purificado
está sustancialmente libre de otros polipéptidos o proteínas,
concretamente aquellos de origen animal.
Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25 recombinantes expresadas (incluyendo los polipéptidos
quiméricos y las proteínas multiméricas) son purificadas mediante
métodos de purificación de proteínas convencionales, típicamente
por medio de una combinación de técnicas cromatográficas. Véanse, en
general, Affinity Chromatography: Principles & Methods,
Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988; y Scopes,
Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, New York, 1994. Las proteínas que
comprenden una etiqueta de afinidad de polihistidina (típicamente
aproximadamente 6 restos histidina) son purificadas mediante
cromatografía de afinidad sobre una resina de quelato de níquel.
Véase, por ejemplo, Houchuli et al., Bio/Technol. 6:
1321-1325, 1988. Las proteínas que comprenden una
etiqueta glu-glu pueden ser purificadas mediante
cromatografía de inmunoafinidad de acuerdo con los procedimientos
convencionales. Véase, por ejemplo, Grussenmeyer et al.,
ídem. Las fusiones de proteínas que se unen a maltosa se
purifican sobre una columna de amilosa de acuerdo con los métodos
conocidos en la técnica.
Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 también se pueden preparar por medio de síntesis
química de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica,
incluyendo la síntesis en fase sólida exclusiva, los métodos en
fase sólida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis en
solución clásica. Véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem.
Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide
Synthesis (2ª edición), Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984;
Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; y Atherton et
al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL
Press, Oxford, 1989. La síntesis in vitro es particularmente
ventajosa para la preparación de polipéptidos más pequeños.
Utilizando los métodos conocidos en la técnica,
se pueden preparar las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25 en forma de monómeros o multímeros; glicosilados o no
glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden incluir o no un
resto aminoácido metionina inicial.
Las células diana para el uso en análisis de
actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 incluyen,
sin limitación, células vasculares (especialmente células
endoteliales y células de la musculatura lisa), células
hematopoyéticas (mieloides y linfoides), células hepáticas
(incluyendo hepatocitos, células endoteliales fenestradas, células
Kupffer, células Ito), fibroblastos (incluyendo fibroblastos
dérmicos humanos y fibroblastos de pulmón), células pulmonares
fetales, sinoviocitos articulares, pericitos, condriocitos,
osteoblastos, y células epiteliales de próstata. Las células
endoteliales y hematopoyéticas derivan de una célula ancestral
común, el hemangioblasto (Choi et al., Development
125:725-732, 1998).
Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25 de la presente invención se caracterizan por su
actividad, esto es, la modulación de la proliferación,
diferenciación, migración, adherencia, o metabolismo de los tipos
de células sensibles. La actividad biológica de las proteínas
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se analiza utilizando
análisis in vitro o in vivo diseñados para detectar la
proliferación, diferenciación, migración o adherencia celular; o
los cambios en el metabolismo celular (p. ej., la producción de
otros factores de crecimiento u otras macromoléculas). Muchos
análisis adecuados son conocidos en la técnica, y los análisis
representativos se describen en la presente memoria. Los análisis
que utilizan células cultivadas son los más convenientes para el
escrutinio, por ejemplo para determinar los efectos de las
sustituciones, deleciones, o inserciones de aminoácidos. Sin
embargo, a la vista de la complejidad de los procesos evolutivos
(por ejemplo, angiogénesis, curación de heridas), generalmente se
emplearán análisis in vivo para confirmar y caracterizar
adicionalmente la actividad biológica. Ciertos modelos in
vitro, tales como el modelo de la matriz de gel de colágeno
tridimensional de Pepper et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm.
189:824-831, 1992), son suficientemente complejos
para analizar los efectos histológicos. Los análisis se pueden
realizar utilizando proteínas producidas exógenamente, o se pueden
llevar a cabo in vivo o in vitro utilizando células
que expresan el polipéptido o los polipéptidos de interés. Los
análisis se pueden realizar utilizando las proteínas zcyto20 solas
o combinadas con otros factores de crecimiento, tales como miembros
de la familia de VEGF o citoquinas hematopoyéticas (p. ej., EPO,
TPO, G-CSF, factor de células pluripotenciales). Los
análisis representativos se describen más abajo.
La actividad de las proteínas zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se puede medir in vitro utilizando
células cultivadas o in vivo administrando las moléculas de
la invención reivindicada a un modelo animal apropiado. Los
análisis que miden la proliferación o la diferenciación celular son
bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los análisis que miden
la proliferación incluyen análisis tales como la quimiosensibilidad
al colorante rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigational
New Drugs 8:347-354, 1990), la incorporación de
nucleótidos radiomarcados (como describen, p. ej., Raines y Ross,
Methods Enzymol. 109:749-773, 1985; Wahl et
al., Mol. Cell. Biol. 8:5016-5025, 1988; y Cook
et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989),
la incorporación de
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) en el ADN de las células en proliferación (Porstmann et
al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), y
el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods
65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res.
48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth
Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer
Res. 48:4827-4833, 1988). La diferenciación se
puede analizar utilizando células precursoras adecuadas que pueden
ser inducidas a diferenciarse a un fenotipo mas maduro. Los
análisis que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, medir
los marcadores de la superficie celular asociados con la expresión
específica de la fase de un tejido, actividad enzimática, actividad
funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB,
5:281-284, 1991; Francis, Differentiation
57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol.
Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todos
incorporados en la presente memoria como referencia).
La actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 también puede ser detectada utilizando análisis
diseñados para medir la producción inducida por zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de uno o más factores de crecimiento
adicionales u otras macromoléculas. Semejantes análisis preferidos
incluyen aquellos para determinar la presencia del factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento
epidérmico (EGF), el factor de crecimiento transformante alfa
(TGF\alpha), la interleuquina-6
(IL-6), el VEGF, el factor de crecimiento de
fibroblastos ácido (aFGF), la angiogenina, y otras macromoléculas
producidas por el hígado. Los análisis adecuados incluyen análisis
de mitogénesis que utilizan células diana sensibles a la
macromolécula de interés, análisis de unión a receptores, análisis
de unión competitiva, análisis inmunológicos (p. ej., ELISA), y
otros formatos conocidos en la técnica. La secreción de
metaloproteasa se mide a partir de fibroblastos dérmicos humanos
primarios, sinoviocitos y condriocitos tratados. Los niveles
relativos de colagenasa, gelatinasa y estromalisina producidos en
respuesta al cultivo en presencia de una proteína zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se mide utilizando geles para zimogramas
(Loita y Stetler-Stevenson, Cancer Biology
1:96-106, 1990). La síntesis de
procolágeno/colágeno por fibroblastos dérmicos y condriocitos en
respuesta a una proteína de ensayo se mide utilizando la
incorporación de prolina-H^{3} a colágeno naciente
secretado. El colágeno marcado con H^{3} se visualiza mediante
SDS-PAGE seguido de autorradiografía (Unemori y
Amento, J. Biol. Chem. 265: 10681-10685, 1990). La
secreción de glicosaminoglicano (GAG) a partir de fibroblastos
dérmicos y condriocitos se mide utilizando un análisis de unión a
colorante azul de 1,9-dimetilmetileno (Farndale
et al., Biochim. Biophys. Acta 883:173-177,
1986). Los análisis de colágeno y GAF también se llevan a cabo en
presencia de IL-1\alpha o
TGF-\alpha para examinar la capacidad de la
proteína zcyto20 para modificar las respuestas establecidas a estas
citoquinas.
Se ha demostrado que ciertos miembros de la
familia de proteínas que comprenden zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 incrementan el número de monocitos circulantes
in vivo. La activación de los monocitos es importante tanto
en la inmunidad innata como adaptativa. Por ejemplo, se ha
demostrado que la activación de los monocitos estimula la
presentación de antígenos por diversos mecanismos. La presentación
de antígenos promueve la activación y la proliferación de las
células T, tanto células T citotóxicas como coadyuvantes. La
maduración y activación de las células dendríticas también promueve
la activación de las células T y la inmunidad tanto innata como
adaptativa. También se ha demostrado que los incrementos de
monocitos y macrófagos activados aumentan la actividad citolítica.
Por lo tanto, zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 serán
útiles como agentes anti-infecciosos, potenciando
las respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales,
innatas. Se observaron incrementos en la tinción ICAM en monocitos
CD14+ sugiriendo que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
juegan un papel en la activación de los monocitos. Si bien los datos
muestran que los miembros de la familia promueven una respuesta
anti-viral frente a los virus, también pueden
resultar afectados las bacterias y los parásitos.
Los análisis de activación de monocitos se
llevan a cabo (1) para observar la capacidad de las proteínas
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para estimular
adicionalmente la activación de monocitos, y (2) para examinar la
capacidad de las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 para modular la activación de monocitos inducida por el
anclaje o inducida por endotoxinas (Fuhlbrigge et al., J.
Immunol. 138: 3799-3802, 1987). Los niveles de
IL-1\alpha y TNF\alpha producidos en respuesta a
la activación se miden mediante ELISA (Biosource, Inc. Camarillo,
Ca.). Las células monocitos/macrófagos, en virtud de CD14 (receptor
de LPS), son exquisitamente sensibles a endotoxina, y a las
proteínas con niveles moderados de actividad de tipo endotoxina
activarán estas células.
El incremento de los niveles de monocitos
sugiere que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden
tener un efecto directo sobre las células progenitoras mieloides en
la médula ósea. El aumento de la diferenciación de las células
progenitoras mieloides en monocitos es esencial en la restauración
de la inmunocompetencia, por ejemplo, después de la quimioterapia.
De este modo, la administración de zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 a pacientes que reciben quimioterapia podría
promover su recuperación y capacidad para resistir la infección
comúnmente asociada con los regímenes de quimioterapia. De este
modo, los métodos para ampliar el número de monocitos o células
progenitoras de monocitos o bien cultivando médula ósea o bien
células de sangre periférica con las moléculas de la presente
invención de manera que haya un incremento en los monocitos o en
las células progenitoras de monocitos para lograr este efecto in
vitro o ex vivo. La presente invención también
proporciona la administración in vivo de las moléculas de la
presente invención a un mamífero que necesita un aumento de
monocitos o células progenitoras de monocitos. El incremento de
monocitos o células progenitoras de monocitos se puede medir
utilizando los métodos bien conocidos por los médicos clínicos,
médicos, y otras personas expertas en la técnica. Las células
monocíticas están incluidas en el linaje mieloide de las células
hematopoyéticas, por tanto afectan a otras células ya que el linaje
no sería inusual. Por ejemplo, cuando un factor facilita la
diferenciación o la proliferación de un tipo de célula al linaje
mieloide o linfoide, puede afectar a la producción de otras células
con un progenitor o célula pluripotencial
común.
común.
La actividad hematopoyética de las proteínas
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 puede ser analizada
sobre diversas células hematopoyéticas en cultivo. Los análisis
preferidos incluyen análisis de colonias de médula ósea primaria y
análisis de colonias de linaje restringido en fase tardía, que son
conocidos en la técnica (p. ej., Holly et al., Publicación
WIPO WO 95/21920). Las células de médula ósea cultivadas sobre un
medio semi-sólido adecuado (p. ej., metilcelulosa al
50% que contiene suero bovino fetal al 15%, seralbúmina bovina al
10%, y mezcla de antibiótico PSN al 0,6%) se incuban en presencia de
polipéptido de ensayo, después se examinan microscópicamente en
cuanto a la formación de colonias. Los factores hematopoyéticos
conocidos se utilizan como controles. La actividad mitogénica de
los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sobre
las líneas celulares hematopoyéticas se pueden medir como se ha
descrito antes.
La migración celular se analiza esencialmente
como describen Kahler et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis,
and Vascular Biology 17:932-939, 1997). Se considera
que una proteína es quimiotáctica si induce la migración de células
desde una zona de baja concentración de proteína a una zona de
elevada concentración de proteína. Un análisis típico se realiza
utilizando cámaras Boyden modificadas con una membrana de
poliestireno que separa las dos cámaras (Transwell; Corning Costar
Corp.). La muestra de ensayo, diluida en medio que contiene BSA al
1%, se añade a la cámara inferior de una placa de 24 pocillos que
contiene Transwells. Las células se colocan después sobre el
inserto Transwell que ha sido pretratado con gelatina al 0,2%. La
migración celular se mide después de 4 horas de incubación a 37ºC.
Las células que no migran se limpian de la parte superior de la
membrana Transwell, y las células ancladas a la cara inferior de la
membrana se fijan y se tiñen con violeta cristal al 0,1%. Las
células teñidas se extraen después con ácido acético al 10% y se
mide la absorbancia a 600 nm. Después se calcula la migración a
partir de la curva de calibrado. La migración celular también se
puede medir utilizando el método Matrigel de Grant et al.
("Angiogenesis as a component of
epithelial-mesenchymal interactions" en Goldberg
y Rosen, Epithelial-Mesenchymal Interaction in
Cancer, Birkhäuser Verlag, 1995, 235-248; Baatout,
Anticancer Research 17:451-456, 1997).
La actividad de adherencia celular se analiza
esencialmente como describen LaFleur et al. (J. Biol. Chem.
272:
32798-32803, 1997). Brevemente, se cubren placas de microtitulación con la proteína de ensayo, los sitios no específicos se bloquean con BSA, y las células (tales como células de musculatura lisa, leucocitos, o células endoteliales) se cultivan en placa a una densidad de aproximadamente 10^{4}-10^{5} células/pocillo. Los pocillos se incuban a 37ºC (típicamente durante alrededor de 60 minutos), después se separan las células no adherentes mediante lavado suave. Las células adheridas se cuantifican mediante métodos convencionales (p. ej., mediante tinción con violeta cristal, lisando las células, y determinando la densidad óptica del producto lisado). Los pocillos de control se recubren con una proteína adherente conocida, tal como fibronectina o vitronectina.
32798-32803, 1997). Brevemente, se cubren placas de microtitulación con la proteína de ensayo, los sitios no específicos se bloquean con BSA, y las células (tales como células de musculatura lisa, leucocitos, o células endoteliales) se cultivan en placa a una densidad de aproximadamente 10^{4}-10^{5} células/pocillo. Los pocillos se incuban a 37ºC (típicamente durante alrededor de 60 minutos), después se separan las células no adherentes mediante lavado suave. Las células adheridas se cuantifican mediante métodos convencionales (p. ej., mediante tinción con violeta cristal, lisando las células, y determinando la densidad óptica del producto lisado). Los pocillos de control se recubren con una proteína adherente conocida, tal como fibronectina o vitronectina.
La actividad de las proteínas zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se puede medir con un microfisiómetro
biosensor basado en silicio que mide la velocidad de acidulación
extracelular o la excreción de protones asociada con la unión al
receptor y las posteriores respuestas celulares fisiológicas. Uno de
tales dispositivos ilustrativos es el Cytosensor® Microphysiometer
fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, Ca. Una variedad de
respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el
transporte de iones, la producción de energía, la respuesta
inflamatoria, la activación reguladora y receptora, y similares, se
pueden medir mediante este método. Véanse, por ejemplo, McConnell
et al., Science 257:1906-1912, 1992;
Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84-108,
1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth.
212:49-59, 1998; y Van Liefde et al., Eur. J.
Pharmacol. 346:87-95, 1998. El microfisiómetro se
puede utilizar para analizar las células eucarióticas o
procarióticas adherentes o no adherentes. Midiendo los cambios de
la acidulación extracelular en el medio celular a lo largo del
tiempo, el microfisiómetro mide directamente las respuestas
celulares a diversos estímulos, incluyendo las proteínas zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, sus agonistas, y antagonistas.
Preferiblemente, el microfisómetro se utiliza para medir las
respuestas de una célula eucariótica sensible a zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25, en comparación con una célula
eucariótica de control que no responde a un polipéptido zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Las células eucarióticas
sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 comprenden
células en las cuales ha sido transfectado un receptor para zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, creando de ese modo una célula
que es sensible a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, así
como células naturalmente sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25. Las diferencias, medidas por un cambio, por
ejemplo, un aumento o disminución de la acidulación extracelular, en
la respuesta de las células expuestas a un polipéptido zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, con respecto a un control no
expuesto a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, son una
medida directa de las respuestas celulares moduladas por zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Por otra parte, tales
respuestas moduladas por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 pueden ser analizadas bajo una variedad de estímulos. La
presente invención proporciona de este modo métodos para
identificar los agonistas y antagonistas de las proteínas zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, que comprenden proporcionar
células sensibles a un polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25, cultivar una primera porción de las células en
ausencia de un compuesto de ensayo, cultivar una segunda porción de
las células en presencia de un compuesto de ensayo, y detectar un
cambio, por ejemplo, un incremento o una disminución, en una
respuesta celular de la segunda porción de las células en
comparación con la primera porción de las células. El cambio en la
respuesta celular se muestra como un cambio medible en la velocidad
de acidulación extracelular. Cultivar una tercera porción de las
células en presencia de una proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 y la ausencia de un compuesto de ensayo
proporciona un control positivo para las células sensibles a
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y un control para
comparar la actividad agonista de un compuesto de ensayo con la del
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Los
antagonistas de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se
pueden identificar exponiendo las células a una proteína zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en presencia y ausencia del
compuesto de ensayo, con lo que una reducción de la actividad
estimulada por zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 es
indicativa de actividad antagonista en el compuesto de
ensayo.
ensayo.
La expresión de los polinucleótidos zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en animales proporciona modelos
para el estudio adicional de los efectos biológicos de la producción
excesiva o de la inhibición de la actividad de la proteína in
vivo. Los polinucleótidos que codifican zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y los polinucleótidos antisentido pueden
ser introducidos en animales de ensayo, tales como ratones,
utilizando vectores virales o ADN desnudo, o se pueden producir
animales transgénicos.
Un enfoque in vivo para analizar las
proteínas de la presente invención utiliza sistemas de liberación
virales. Los virus ilustrativos para este propósito incluyen
adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus vaccinia, y virus
adenoasociados (AAV). El adenovirus, un ADN virus de doble hebra, es
en la actualidad el vector de transferencia génica mejor estudiado
para la liberación de ácidos nucleicos heterólogos. Para una
revisión, véanse Becker et al., Meth. Cell Biol.
43:161-89, 1994; y Douglas y Curiel, Science &
Medicine 4:44-53, 1997. El sistema de adenovirus
ofrece numerosas ventajas. El adenovirus puede (i) acomodar insertos
de ADN relativamente grandes; (ii) hacerse crecer hasta un título
elevado; (iii) infectar una amplia gama de tipos de células de
mamífero; y (iv) ser utilizado con muchos promotores diferentes
incluyendo promotores ubicuos, específicos de tejidos, y
regulables. Debido a que los adenovirus son estables en la corriente
sanguínea, pueden ser administrados mediante inyección
intravenosa.
Suprimiendo porciones del genoma de adenovirus,
se pueden acomodar insertos más grandes (hasta 7 kb) de ADN
heterólogo. Estos insertos pueden ser incorporados al ADN viral
mediante ligación directa o mediante recombinación homóloga con un
plásmido co-transfectado. En un sistema ilustrativo,
el gen esencial E1 es suprimido del vector viral, y el virus no
replicará a menos que el gen E1 sea proporcionado por la célula
anfitriona (p. ej., la línea celular 293 humana). Cuando se
administra intravenosamente a animales intactos, el adenovirus se
dirige principalmente al hígado. Si el sistema de liberación
adenoviral tiene una deleción del gen E1, el virus no puede
replicar en las células anfitrionas. Sin embargo, el tejido del
anfitrión (p. ej., el hígado) expresará y transformará (y, si se
encuentra presente una secuencia señal, secretará) la proteína
heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán en la circulación en
el hígado altamente vascularizado, y se podrán determinar los
efectos sobre el animal infectado.
Un método alternativo de liberación génica
comprende separar las células del organismo e introducir un vector
en las células en forma de plásmido de ADN desnudo. Las células
transformadas se re-implantan después en el
organismo. Los vectores de ADN desnudo se introducen en células
anfitrionas mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo la
transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión
celular, DEAE-dextrano, precipitación con fosfato
de calcio, uso de una pistola génica, o uso de un transportador
vector de ADN. Véanse, Wu et al., J. Biol. Chem.
263:14621-14624, 1988; Wu et al., J. Biol.
Chem. 267:963-967, 1992; y Johnston y Tang, Meth.
Cell Biol. 43:353-365, 1994.
También se pueden generar (Lowell et al.,
Nature 366:740-742, 1993) ratones transgénicos,
diseñados para expresar un gen zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25, y ratones que muestran una ausencia completa
de función génica de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25, referidos como "ratones con un gen desactivado"
(Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992). Estos ratones
pueden ser empleados para estudiar el gen zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y la proteína codificada de ese modo
en un sistema in vivo. Los ratones transgénicos son
particularmente útiles para investigar el papel de las proteínas
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en el desarrollo
temprano ya que permiten la identificación de anomalías evolutivas
o los bloqueos resultantes de la expresión excesiva o insuficiente
de un factor específico. Véanse también, Maisonpierre et
al., Science 277:55-60, 1997 y Hanahan, Science
277:48-50, 1997. Los promotores preferidos para la
expresión transgénica incluyen los promotores de los genes de la
metalotioneína y de la albúmina.
Se ha asociado una pérdida de control inhibidor
normal de la contracción muscular con una lesión o perturbación de
neuronas secretoras de ácido gamma-aminobutírico
seleccionadas. Por ejemplo, el Síndrome de la Persona Rígida
muestra una rigidez notable de la musculatura, que se cree que está
mediada por la interferencia del funcionamiento de sus neuronas
productoras de ácido gamma-aminobutírico (GABA).
Otros trastornos neuromusculares relacionados incluyen miotonía,
miopatías metabólicas, síndrome de Isaac, distonía, y espasmos
tetánicos (Valldeoriola, J. Neurol 246:423-431,
1999).
De un modo similar, la medida directa del
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, o su
pérdida de expresión en un tejido puede ser determinada en un
tejido o en células a medida que experimentan un progreso tumoral.
El aumento de invasividad y motilidad de las células, o el aumento o
pérdida de expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 en una condición pre-cancerosa o cancerosa,
en comparación con el tejido normal, puede servir como diagnóstico
para la transformación, invasión y metástasis en el progreso
tumoral. Como tal, el conocimiento de la fase de progreso del tumor
o de la metástasis ayudará al médico a elegir la terapia más
apropiada, o la agresividad del tratamiento, para un paciente con
cáncer individual dado. Los métodos para medir el aumento y la
pérdida de expresión (de ARNm o de proteína) son bien conocidos en
la técnica y se describen en la presente memoria y pueden ser
aplicados a la expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25. Por ejemplo, la aparición o desaparición de polipéptidos
que regulan la motilidad celular puede ser utilizada para ayudar a
la diagnosis y prognosis del cáncer de próstata (Banyard, J. and
Zetter, B. R., Cancer and Metast. Rev. 17:449-458,
1999). Como efector de la motilidad celular, o como marcador
específico del hígado, el aumento o pérdida de expresión de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 puede servir como
diagnóstico para el cáncer de cerebro y otros cánceres. Por otra
parte, de un modo análogo al antígeno específico de próstata (PSA),
el incremento de los niveles de polipéptidos zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25, o de anticuerpos
anti-zcyto20, anti-zcyto21,
anti-zcyto22, anti-zcyto24 y
anti-zcyto25 en un paciente, con respecto a un
control normal pueden ser indicativos de cánceres de cerebro y otros
cánceres (Véase, p. ej., Mulders, T M T, et al., Eur. J.
Surgical Oncol. 16:37-41, 1990). La fuerte expresión
de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en un tejido que
normalmente se encuentra que no expresa los polinucleótidos serviría
como diagnóstico de una anomalía en el tipo de célula o tejido, de
invasión o metástasis de tejido hepático canceroso en tejido no
hepático, y podría ayudar a un médico a dirigir un ensayo o
investigación adicional, o ayudar a dirigir la terapia.
Además, se pueden utilizar sondas de
oligonucleótidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25,
anticuerpos anti-zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25, y la detección de la presencia de los polipéptidos
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en un tejido para
evaluar si se encuentra presente cerebro u otro tejido que se ha
encontrado que expresa normalmente zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25, por ejemplo, después de una intervención
quirúrgica que implica la extirpación de un hígado o tejido neuronal
enfermo o canceroso. Como tales, los polinucleótidos, polipéptidos,
y anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados como
ayuda para determinar si todo el tejido es extirpado después de la
intervención quirúrgica, por ejemplo, después de una intervención
quirúrgica para cáncer de cerebro y otros cánceres. En tales casos,
es especialmente importante separar todo el tejido potencialmente
enfermo para maximizar la recuperación del cáncer, y para minimizar
la recurrencia. Las realizaciones preferidas incluyen anticuerpos
anti-zcyto20 fluorescentes, radiomarcados, o
marcados calorimétricamente y compañeros de unión de los
polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, que se
pueden utilizar histológicamente o in situ.
Por otra parte, la actividad y el efecto de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sobre el progreso del
tumor y la metástasis se puede medir in vivo. Se han
desarrollado numerosos modelos de ratón singeneicos para estudiar
la influencia de polipéptidos, compuestos u otros tratamientos
sobre el progreso de tumores. En estos modelos, se implantan en
ratones células tumorales pasadas por cultivo de la misma cepa que
el donante del tumor. Las células se desarrollarán en tumores que
tendrán características similares en el ratón receptor, y también
se producirán metástasis en algunos de los modelos. Los modelos
tumorales apropiados para los estudios de los autores de la
presente invención incluyen el carcinoma de pulmón de Lewis (ATCC
Núm. CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC Núm.
CRL-6323), entre otros. Estas son ambas líneas
tumorales comúnmente utilizadas, singeneicas para el ratón C57BL6,
que son fácilmente cultivadas y manipuladas in vitro. Los
tumores resultantes de la implantación de cualquiera de estas
líneas celulares son susceptibles de metástasis en el pulmón en
ratones C57BL6. El modelo de carcinoma de pulmón de Lewis ha sido
utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de
la angiogénesis (O'Reilly M S, et al. Cell 79:
315-328, 1994). Los ratones C57BL6/J se tratan con
un agente experimental por medio de una inyección diaria de proteína
recombinante, agonista o antagonista o bien de una sola inyección
de adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento,
se implantan 10^{5} a 10^{6} células bajo la piel dorsal.
Alternativamente, se pueden infectar las propias células con
adenovirus recombinante, por ejemplo uno que expresa zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25, antes del implante de manera
que la proteína sea sintetizada en el sitio del tumor o
intracelularmente, en lugar de sistémicamente. Los ratones
desarrollan normalmente tumores visibles en 5 días. Se deja que los
tumores crezcan durante un período de hasta 3 semanas, tiempo
durante el cual alcanzan un tamaño de 1500-1800 mm3
en el grupo tratado de control. El tamaño del tumor y el peso
corporal se controlan cuidadosamente durante todo el experimento.
En el momento del sacrificio, se separa el tumor y se pesa junto con
los pulmones y el hígado. Se ha demostrado que el peso del pulmón
se corresponde bien con la carga de tumor metastásico. Como medida
adicional, se cuentan las metástasis en la superficie pulmonar. El
tumor, los pulmones y el hígado reseccionados se preparan para el
examen histopatológico, la inmunohistoquímica y la hibridación in
situ, utilizando los métodos conocidos en la técnica y
descritos en la presente memoria. La influencia del polipeptido
expresado en cuestión, p. ej., zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o
zcyto25, sobre la capacidad del tumor para reclutar vasculatura y
experimentar metástasis puede ser evaluada de este modo. Además,
aparte de utilizar adenovirus, las células implantadas pueden ser
transfectadas transitoriamente con zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 o zcyto25. El uso de transfectantes zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 estables así como el uso de promotores
inducibles para activar la expresión de zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 in vivo son conocidos en la técnica y se
pueden utilizar en este sistema para evaluar la inducción de
metástasis por zcyto20. Por otra parte, se pueden inyectar
directamente zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 and zcyto25
purificados y medios acondicionados con zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 en este modelo de ratón, y por tanto se pueden
utilizar en este sistema. Para una referencia general véanse,
O'Reilly M S, et al. Cell 79:315-328, 1994;
y Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis.
Invasion Metastasis 14:349-361, 1995.
Se puede utilizar la metodología antisentido
para inhibir la transcripción del gen zcyto20 para examinar los
efectos de semejante inhibición in vivo. Se diseñan
polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un
polinucleótido que codifica zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 (p. ej., un polinucleótido como se muestra en el SEQ ID NO:
1) para que se unan al ARNm que codifica zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 y para inhibir la traducción de semejante ARNm.
Tales oligonucleótidos antisentido también se pueden utilizar para
inhibir la expresión los genes que codifican los polipéptidos
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en un cultivo
celular.
La mayor parte de las citoquinas así como otras
proteínas producidas por linfocitos activados juegan un importante
papel biológico en la diferenciación celular, la activación, el
reclutamiento y la homeostasis de las células en todo el organismo.
Se espera que zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 y los
inhibidores de su actividad tengan una variedad de aplicaciones
terapéuticas. Estas aplicaciones terapéuticas incluyen el
tratamiento de enfermedades que requieren regulación inmunitaria,
incluyendo las enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis
reumatoide, la esclerosis múltiple, la miastenia grave, el lupus
eritematoso generalizado, y la diabetes. Zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 pueden ser importantes en la regulación de la
inflamación, y por lo tanto serían útiles en el tratamiento de la
artritis reumatoide, el asma y la sepsis. Puede existir un papel de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 en la mediación de la
tumorigénesis, por medio del cual un antagonista de zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sería útil en el tratamiento del
cáncer. Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser
útiles en la modulación del sistema inmunitario, por medio de lo
cual se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
y antagonistas de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para
reducir el rechazo de injertos, evitar la enfermedad anfitrión
contra injerto, reforzar la inmunidad para las enfermedades
infecciosas, tratar a pacientes inmunocomprometidos (p. ej.,
pacientes VIH+), o para mejorar vacunas.
Se ha demostrado que los miembros de la familia
de proteínas de la presente invención tienen un efecto antiviral
que es similar al interferón-\alpha. El interferón
ha sido aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de las
enfermedades autoinmunitarias, el condiloma acuminado, la hepatitis
C crónica, el carcinoma de vejiga, el carcinoma cervical, la
papilomatosis faríngea, la micosis fungoides, la hepatitis B
crónica, el sarcoma de Kaposi en pacientes infectados con virus de
la inmunodeficiencia humana, el melanoma maligno, la leucemia de
células pilosas, y la esclerosis múltiple. Además, se pueden
utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para tratar
formas de arteriosclerosis tales como la aterosclerosis, inhibiendo
la proliferación celular. Por consiguiente, la presente invención
contempla el uso de proteínas, polipéptidos, y péptidos que tienen
actividad zcyto20 para tratar tales afecciones, así como para tratar
la retinopatía. La presente invención también contempla el uso de
proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para tratar trastornos
linfoproliferativos, incluyendo los linfomas de células B, la
leucemia linfocítica crónica, la leucemia linfocítica aguda, los
linfomas No Hodkin, el mieloma múltiple, la leucemia mielocítica
aguda, la leucemia mielocítica crónica.
También se ha demostrado que los interferones
inducen la expresión de antígenos por células cultivadas (véanse,
p. ej., Auth et al., Hepatology 18:546 (1993), Guadagni et
al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994), Girolomoni et
al., Eur. J. Immunol. 25:2163 (1995), y Maciejewski et
al., Blood 85:3183 (1995). Esta actividad potencia la capacidad
para identificar nuevos antígenos asociados a tumores in
vitro. Por otra parte, la capacidad de los interferones para
aumentar el nivel de expresión de los antígenos tumorales humanos
indica que los interferones pueden ser útiles en un entorno
coadyuvante para la inmunoterapia o potenciar la inmunoescintografía
utilizando anticuerpos anti-antígenos tumorales
(Guadagni et al., Cancer Immunol. Immunother. 26:222 (1988);
Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994)). De este
modo, la presente invención incluye el uso de proteínas,
polipéptidos y péptidos que tienen actividad zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 como coadyuvante para la inmunoterapia o
para mejorar la inmunoescintografía utilizando anticuerpos
anti-antígenos tumorales.
Los métodos para la detección y la diagnosis de
las infecciones virales son bien conocidos por los expertos en la
técnica. El método exacto utilizado para medir una reducción de
virus en respuesta a la administración de moléculas de la presente
invención dependerá del paciente, del tipo de infección viral, y
similares. Por ejemplo, los métodos incluyen, pero no están
limitados a, medición de los cambios en los recuentos de células
CD4, ensayos serológicos, medición del ADN del virus y el ARN del
virus mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativos convencionales y en tiempo real, niveles de
anticuerpos inducidos por virus, análisis de inmunoabsorción con
inmunofluorescencia y ligados a enzimas, efectos citopáticos, e
histología.
Por otra parte, zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 se pueden unir a CD4 u otro receptor de leucocitos
y mostrar efectos antivirales, por ejemplo, frente al virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) o al virus de las células T
linfotróficas humanas (VLTH). Alternativamente, el polipéptido
zcyto20 puede competir por un receptor o
co-receptor viral para bloquear la infección viral.
Se puede administrar zcyto20 parenteralmente para evitar la
infección viral o para reducir la replicación viral en marcha y la
re-infección (Gayowski, T. et al.,
Transplantation 64:422-426, 1997). De este modo, se
puede utilizar zcyto20 como agente terapéutico antiviral, por
ejemplo para leucemias virales (VLTH), SIDA (VIH), o infecciones
virales gastrointestinales causadas, por ejemplo, por rotavirus,
calicivirus (p. ej., Agente Norwalk) y ciertas cepas de adenovirus
patogénicos, Hepatitis B y C.
También se pueden utilizar zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para tratar la miocarditis, un trastorno
que surge cuando el corazón está implicado en un proceso
inflamatorio. Se piensa que la infiltración de linfocitos y la
miocitolisis son el resultado de la infección por virus, bacterias,
hongos o parásitos (véase, por ejemplo, Brodison et al., J.
Infection 37:99 (1998)). Se pueden inyectar zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 intravenosamente o subcutáneamente para
tratar infecciones asociadas con la miocarditis. También se pueden
administrar intravenosamente zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 como una citoquina inmunorreguladora en el tratamiento de
la miocarditis autoinmunitaria. Se pueden extrapolar las dosis de
interferón utilizando un modelo autoinmunitario de miocarditis en
el ratón A/J (Donermeyer, et al., J. Exp. Med. 182:1291
(1995)).
La administración exógena de
interferón-\tau en ovejas incrementa la tasa de
embarazo (Aggarwal, Human Cytokines III, (Blackwell Science 1997)).
Como se describe en la presente memoria, Zcyto20mRNA es expresado en
la placenta. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso
de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, por ejemplo de los
zcyto20, zcyto21, y zcyto22 humanos descritos, para promover y
proteger el crecimiento del feto. Como ilustración, se pueden
utilizar zcyto20, zcyto21, y zcyto22 para proteger un feto en
desarrollo de infecciones virales (p. ej., virus de
inmunodeficiencia humana, virus de papiloma humano, y similares).
Además, se pueden utilizar zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 para promover la fertilización in vitro.
Informes recientes han destacado el papel de los
interferones de tipo I en la prevención de la diabetes inducida por
virus induciendo un potente estado antiviral en células pancreáticas
beta pronto durante la infección viral (Flodstroem et al.,
Nature Immunology 3, 373-382 (2002)). Esto evita la
pérdida de células beta debida a la muerte de las células inducidas
por virus y a la autoinmunidad que la acompaña. Zcyto20, 21 y 22
también pueden inducir un estado antiviral en células que expresan
su receptor, zcytor19. Zcytor19 es altamente expresado en tejido
pancreático y por lo tanto zcyto20-22 pueden jugar
un papel en la prevención de la diabetes inducida por virus debida
a la muerte de células beta. Además, el papel de los interferones de
tipo I en la prevención de la diabetes inducida por virus puede ser
ampliado a otras enfermedades autoinmunitarias inducidas por virus
y por lo tanto, zcyto20-22 también puede jugar un
papel en la prevención de otras enfermedades tales como la
esclerosis muscular, el lupus, y las enfermedades autoinmunitarias
inducidas por virus en tejidos que expresan el receptor de
zcyto20-22, zcytor19.
La expresión sistémica crónica de los
interferones de tipo I también ha sido asociada con la patogénesis
de la diabetes de tipo I. Dada la similitud de los interferones de
tipo I con zcyto20-22 en lo que respecta a la
actividad biológica y la inducción génica, la expresión sistémica
crónica de zcyto20, 21, o 22 también podría jugar un papel en la
patogénesis de la diabetes de tipo I. Por lo tanto, un inhibidor de
la actividad de zcyto20-22 en el páncreas podría
ser beneficioso en la prevención de la diabetes de tipo I.
Los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 pueden ser administrados solos o combinados con
otros agentes vasculogénicos o angiogénicos, incluyendo VEGF. Cuando
se utilizan zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 combinados
con un agente adicional, los dos compuestos pueden ser administrados
simultáneamente o sucesivamente según sea apropiado para la
afección específica que se esté tratando.
Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
serán útiles en el tratamiento de la tumorigénesis, y por lo tanto
serían útiles en el tratamiento del cáncer. Una inhibición con
zcyto20 de células B normales estimuladas con IgM y un efecto
similar observado en líneas tumorales de células B sugieren que
puede existir un beneficio terapéutico en el tratamiento de
pacientes con zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 con el
fin de inducir en las células del tumor de células B un estado
menos proliferativo. El ligando podría ser administrado combinado
con otros agentes que ya se usan incluyendo tanto agentes
quimioterapéuticos convencionales como moduladores inmunitarios
tales como el interferón alfa. Se ha demostrado que los interferones
alfa/beta son eficaces en el tratamiento de algunas leucemias y
modelos de enfermedades animales, y los efectos inhibidores del
crecimiento del interferón alfa y zcyto20 pueden ser aditivos para
las líneas celulares derivadas de tumores de células B.
La presente invención proporciona un método para
reducir la proliferación de células B o T neoplásicas que comprende
administrar a un mamífero con un neoplasma de células B o T una
cantidad de una composición de zcyto20 suficiente para reducir la
proliferación de las células B o T neoplásicas. La estimulación con
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de células NK líticas
a partir de progenitores de médula y la proliferación de células T
después de la activación de los receptores de antígenos potenciaría
el tratamiento para pacientes que reciben transplantes de médula
alogénicos, y por lo tanto zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 potenciarán la generación de respuestas
anti-tumorales, con o sin la infusión de linfocitos
de donantes.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método de reducción de la proliferación de células B
o T neoplásicas que comprende administrar a un mamífero con un
neoplasma de células B o T una cantidad de una composición de un
antagonista de zcyto20 suficiente para reducir la proliferación de
las células B o T neoplásicas. Además, el antagonista de zcyto20
puede ser una proteína de fusión ligando/toxina.
Se puede emplear una toxina de fusión zcyto20-,
zcyto21-, zcyto22-, zcyto24- and zcyto25-saporina
contra un grupo similar de leucemias y linfomas, ampliando la gama
de leucemias que pueden ser tratadas con zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25. La activación mediada por la toxina de fusión del
receptor de zcyto20 proporciona dos medios independientes para
inhibir el crecimiento de las células diana, siendo el primero
idéntico a los efectos observados para el ligando solo, y el segundo
debido a la liberación de la toxina a través de la internalización
del receptor.
Para su uso farmacéutico, se formulan las
proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para la
liberación tópica o parenteral, concretamente intravenosa o
subcutánea de acuerdo con los métodos convencionales. En general,
las formulaciones farmacéuticas incluirán un polipéptido zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 combinado con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución
salina tamponada con fosfato, dextrosa en agua al 5%, o similar.
Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más
excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponadores,
albúmina para evitar la pérdida de proteína en las superficies de
los viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la
técnica y los describe, por ejemplo, Remington: The Science and
Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton,
Pa., 19th ed., 1995. Zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
se utilizarán preferiblemente a una concentración de alrededor de
10 a 100 \mug/ml de volumen total, aunque se pueden utilizar
concentraciones en el intervalo de 1 ng/ml a 1.000 \mug/ml. Para
la aplicación tópica, por ejemplo para la promoción de la curación
de heridas, la proteína se aplicará en el intervalo de
0,1-10 \mug/cm^{2} de la zona de la herida, con
la dosis exacta determinada por el médico clínico de acuerdo con
los patrones aceptados, tomando en consideración la naturaleza y la
gravedad de la afección que se va a tratar, los rasgos del paciente,
etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto
en la técnica. La dosificación es diaria o intermitente a lo largo
del período de tratamiento. La administración intravenosa será
mediante inyección de bolo o infusión a lo largo de un período
típico de una a varias horas. También se pueden emplear
formulaciones de liberación sostenida. En general, una cantidad
terapéuticamente eficaz de zcyto20 es una cantidad suficiente para
producir un cambio clínicamente significativo en la afección
tratada, tal como un cambio clínicamente significativo en la función
hematopoyética o inmunitaria, una reducción significativa de la
morbidez, o una puntuación histológica significativamente
incrementada.
Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25, los agonistas, y los antagonistas son útiles para
modular la expansión, proliferación, activación, diferenciación,
migración, o metabolismo de los tipos de células sensibles, que
incluyen tanto células primarias como líneas celulares cultivadas.
Son de particular interés en este aspecto las células
hematopoyéticas, las células mesenquimáticas (incluyendo las células
pluripotenciales y las células mieloides y linfoides maduras), las
células endoteliales, las células de la musculatura lisa, los
fibroblastos, los hepatocitos, las células neurales y las células
pluripotenciales embrionarias. Los polipéptidos zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se añaden a los medios de cultivo de
tejidos para estos tipos de células a una concentración de
alrededor de 10 pg/ml a alrededor de 100 ng/ml. Aquellos expertos en
la técnica reconocerán que las proteínas zcyto20 pueden ser
combinadas ventajosamente con otros factores de crecimiento en el
medio de cultivo.
En el campo de la investigación de laboratorio,
también se pueden utilizar las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 y zcyto25 como patrones de peso molecular o como reactivos
en análisis para determinar los niveles circulantes de la proteína,
por ejemplo en la diagnosis de trastornos caracterizados por la
producción excesiva o insuficiente de proteína zcyto20 o en el
análisis del fenotipo celular.
Las proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24
y zcyto25 también se pueden utilizar para identificar inhibidores
de su actividad. Se añaden compuestos de ensayo a los análisis
descritos antes para identificar los compuestos que inhiben la
actividad de la proteína zcyto20. Además de los análisis descritos
antes, se pueden someter a ensayo las muestras en cuanto a la
inhibición de la actividad zcyto20 en una variedad de análisis
diseñados para medir la unión al receptor o la
estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Por ejemplo, las
líneas celulares sensibles a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 pueden ser transfectadas con un constructo génico informador
que es sensible a una ruta celular estimulada por zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Los constructos génicos informadores de
este tipo son conocidos en la técnica, y comprenderán generalmente
un elemento de respuesta al suero activado por zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25 (SRE) conectado operablemente a un gen
que codifica una proteína analizable, tal como luciferasa. Los
compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidato se someten a
ensayo en cuanto a su capacidad para inhibir la actividad de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sobre las células
diana como evidencia un descenso en la estimulación por zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 de la expresión del gen
informador. Los análisis de este tipo detectarán compuestos que
bloquean directamente los receptores de la superficie celular que
se unen a zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, así como
compuestos que bloquean los procedimientos en la ruta celular
posterior a la unión del ligando al receptor. Como alternativa, se
pueden someter a ensayo los compuestos u otras muestras en cuanto al
bloqueo directo de la unión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 al receptor utilizando zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 etiquetados con una marca detectable (p. ej., I^{125},
biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC, y similares). En los
análisis de este tipo, la capacidad de una muestra de ensayo para
inhibir la unión de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
marcado al receptor es indicativa de la actividad inhibidora, lo
que puede ser confirmado por medio de análisis secundarios. Los
receptores utilizados en los análisis de unión pueden ser
receptores celulares, o receptores inmovilizados, aislados.
Según se utiliza en la presente memoria, el
término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígenos de los
mismos tales como fragmentos F(ab')_{2} y Fab, anticuerpos
de cadena sencilla, y similares, incluyendo anticuerpos diseñados
genéticamente. Los anticuerpos no humanos pueden ser humanizados
injertando CDR no humanas sobre regiones marco y constantes humanas,
o incorporando los dominios variables no humanos completos
("encubriéndolos" opcionalmente con una superficie de tipo
humano mediante sustitución de los restos expuestos, donde el
resultado es un anticuerpo recubierto "veneered"). En algunos
casos, los anticuerpos humanizados pueden conservar restos no
humanos en los dominios del marco de la región variable humana para
potenciar unas características de unión apropiadas. Por medio de
anticuerpos humanizantes, se puede incrementar la vida media
biológica, y se reduce el potencial para las reacciones inmunitarias
adversas tras la administración a seres humanos. Un experto en la
técnica puede generar anticuerpos humanizados con dominios
constantes específicos y diferentes (esto es, subclases diferentes
de Ig) para facilitar o inhibir diversas funciones inmunitarias
asociadas con dominios constante de anticuerpos concretos. Se define
que los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un
polipéptido o proteína zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
con una afinidad al menos 10 veces mayor que la afinidad de unión al
polipéptido o proteína de control (no zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 ni zcyto25). La afinidad de un anticuerpo monoclonal puede
ser fácilmente determinada por un experto en la técnica (véase, por
ejemplo, Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672,
1949).
Los métodos para preparar anticuerpos
policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica (véase
por ejemplo, Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma
Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca
Raton, Fla., 1982, que se incorpora en la presente memoria como
referencia). Resulta de particular interés generar anticuerpos para
sitios antigénicos hidrofílicos que incluyen, por ejemplo, los
restos aminoácido 169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 2, los
restos aminoácido 54 (Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 2, los restos
aminoácido 53 (Phe) a 58 (Asp) del SEQ ID NO: 2, los restos
aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys) del SEQ ID NO: 2, y los restos
aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, en
zcyto22, serían útiles las regiones hidrofílicas que incluyen los
restos aminoácido 169 (Glu) a 174 (Glu) del SEQ ID NO: 7, los restos
aminoácido 54 (Lys) a 59 (Ala) del SEQ ID NO: 7, los restos
aminoácido 53 (Phe) a 58 (Asp) del SEQ ID NO: 7, los restos
aminoácido 168 (Gln) a 173 (Lys) del SEQ ID NO: 7, y los restos
aminoácido 154 (Pro) a 159 (Arg) del SEQ ID NO: 7. Como resultaría
evidente para un experto en la técnica, se pueden generar
anticuerpos policlonales a partir de una variedad de animales de
sangre caliente tales como caballos vacas, cabras, ovejas, perros,
pollos, conejos, ratones, y ratas. La inmunogenicidad de un
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 podría ser
incrementada por medio del uso de un coadyuvante tal como alúmina
(hidróxido de aluminio) o coadyuvante completo o incompleto de
Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también
incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de un
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 o una
porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con una
proteína de unión a maltosa. El inmunógeno polipeptídico puede ser
una molécula completa o una porción de la misma. Si la porción
polipeptídica es de "tipo hapteno", semejante porción se puede
unir o conectar ventajosamente con un portador macromolecular (tal
como hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH), seralbúmina bovina
(BSA) o toxoide del tétanos) para la inmunización.
Las técnicas alternativas para generar o
seleccionar anticuerpos incluyen la exposición in vitro de
linfocitos a los polipéptidos zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25, y la selección de genotecas de presentación de anticuerpos
en fagos o vectores similares (p. ej., por medio del uso de un
polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
inmovilizado o marcado). Se pueden producir anticuerpos humanos en
animales no humanos, transgénicos que han sido diseñados para que
contengan genes de inmunoglobulina como se describe en la
Publicación WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de
inmunoglobulina endógenos de estos animales sean inactivados o
eliminados, por ejemplo mediante recombinación homóloga.
Se puede utilizar una variedad de análisis
conocidos por los expertos en la técnica para detectar anticuerpos
que se unen específicamente a polipéptidos zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Se describen análisis ilustrativos con
detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos
representativos de tales análisis incluyen; inmunoelectroforesis
concurrente, radio-inmunoanálisis,
radio-inmunoprecipitaciones, análisis de
inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), análisis de transferencia
puntual, análisis de transferencia Western, análisis de inhibición
o competición, y análisis sándwich.
Se pueden utilizar anticuerpos para zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para la purificación por
afinidad de la proteína, en análisis de diagnóstico para determinar
los niveles circulantes de la proteína; para detectar o cuantificar
el polipéptido zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 soluble
como marcador de la patología o enfermedad subyacente; para la
inmunolocalización en animales completos o secciones de tejidos,
incluyendo aplicaciones de inmunodiagnóstico; para la
inmunohistoquímica; y como antagonistas para bloquear la actividad
de la proteína in vitro e in vivo. También se pueden
utilizar anticuerpos para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 para etiquetar células que expresan zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 y zcyto25; para la purificación por afinidad de
los polipéptidos y proteínas zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25; en métodos analíticos empleando FACS; para escrutar
genotecas de expresión; y para generar anticuerpos
anti-idiotípicos. Los anticuerpos se pueden conectar
a otros compuestos, incluyendo agentes terapéuticos y de
diagnóstico, utilizando métodos conocidos para proporcionar el
redireccionamiento de esos compuestos a células que expresan los
receptores para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25. Para
ciertas aplicaciones, incluyendo los usos de diagnóstico in
vitro e in vivo, resulta ventajoso emplear anticuerpos
marcados. Las etiquetas o marcas directas adecuadas incluyen
radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores,
marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas
magnéticas y similares; las etiquetas o marcas indirectas pueden
representar el uso de biotina-avidina u otros pares
complemento/anti-complemento como intermedios. Los
anticuerpos de la presente invención se pueden conjugar directa o
indirectamente con fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y
estos productos conjugados se pueden utilizar para el diagnóstico o
para aplicaciones terapéuticas in vivo (p. ej., la inhibición
de la proliferación celular). Véase, en general, Ramakrishnan et
al., Cancer Res. 56:1324-1330, 1996.
Los polipéptidos y proteínas de la presente
invención se pueden utilizar para identificar y aislar receptores.
Los receptores de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25
pueden estar implicados en la regulación del crecimiento en el
hígado, la formación de vasos sanguíneos, y otros procedimientos
evolutivos. Por ejemplo, las proteínas y polipéptidos zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 se pueden inmovilizar sobre una
columna, y hacer correr las preparaciones de membrana a lo largo de
la columna (como se describe generalmente en Immobilized Affinity
Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press,
San Diego, Ca., 1992, págs. 195-202). Las proteínas
y polipéptidos también pueden ser radiomarcados (Methods Enzymol.,
vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed.,
Academic Press, San Diego, 1990, 721-737) o marcados
por fotoafinidad (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem.
62:483-514, 1993 y Fedan et al., Biochem.
Pharmacol. 33:1167-1180, 1984) y utilizados para
etiquetar proteínas de la superficie celular específicas. De una
manera similar, las proteínas y polipéptidos zcyto20 radiomarcados
se pueden utilizar para clonar el receptor cognado en análisis de
unión utilizando células transfectadas con una genoteca de
expresión de ADNc.
Se pueden utilizar los polipéptidos zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para ilustrar técnicas
analíticas tales como la espectrometría de masas, el dicroismo
circular, para determinar la conformación, especialmente de las
cuatro hélices alfa, la cristalografía de rayos x para determinar la
estructura tridimensional en el detalle atómico, la espectroscopía
de resonancia magnética nuclear para revelar la estructura de las
proteínas en solución. Por ejemplo, se puede proporcionar un kit
que contiene zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 al
estudiante para analizarlos. Puesto que la secuencia de aminoácidos
sería conocida por el instructor, se puede proporcionar la proteína
al estudiante como ensayo para determinar las técnicas o desarrollar
las técnicas del estudiante, el instructor debería conocer después
si el estudiante ha analizado correctamente o no el polipéptido.
Puesto que cada polipéptido es único, la utilidad docente de zcyto20
sería única en sí misma.
Los anticuerpos que se unen específicamente a
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 pueden ser utilizados
como ayuda ilustrativa para instruir a los estudiantes sobre cómo
preparar columnas de cromatografía de afinidad para purificar
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25, clonar y secuenciar el
polinucleótido que codifica un anticuerpo y de este modo como
práctica para ilustrar a un estudiante sobre cómo diseñar
anticuerpos humanizados. El gen, polipéptido, o anticuerpo de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 sería empaquetado
después por compañías de reactivos y vendido a instituciones
docentes de manera que los estudiantes adquieran experiencia en las
técnicas de la biología molecular. Debido a que cada gen y cada
proteína son únicos, cada gen y cada proteína crean
sensibilizaciones y experiencias de aprendizaje únicas para los
estudiantes en las prácticas de laboratorio. Tales kits docentes
que contienen el gen, polipéptido, o anticuerpo ZCYTO20 se
consideran dentro del alcance de la presente invención.
En resumen, la presente invención proporciona un
polipéptido aislado que tiene una identidad de al menos 80% o 95% o
100% con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se
muestra en el SEQ ID NO:2 desde el resto aminoácido 22 al resto
aminoácido 205; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205; (c) un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID
NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y (d)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se
muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto
aminoácido 202.
En otra realización, el polipéptido aislado se
une a un receptor como se muestra en los SEQ ID NOS: 24, 27 o 29 en
forma de un receptor monomérico u homodimérico o en los SEQ ID NOS:
24, 27 o 29 combinados con el SEQ ID NO: 41 en forma de un receptor
heterodimérico.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos
como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al
resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el
resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos
como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al
resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el
resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos
como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al
resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el
resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos
como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al
resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el
resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos
del SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido
205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido
1 al resto aminoácido 205, donde dicho polipéptido estimula una
respuesta antigénica en un mamífero.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos
del SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido
205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido
1 al resto aminoácido 205, donde dicho polipéptido estimula una
respuesta antigénica en un mamífero.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos
del SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido
202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido
1 al resto aminoácido 202, donde dicho polipéptido estimula una
respuesta antigénica en un mamífero.
En otro aspecto, la presente incluye un
polipéptido aislado que tiene al menos 14 aminoácidos contiguos del
SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o
como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 1 al
resto aminoácido 202, donde dicho polipéptido estimula una respuesta
antigénica en un mamífero.
La presente invención incluye composiciones
farmacéuticas que comprenden los polipéptidos descritos en la
presente memoria, en vehículos farmacéuticamente aceptables.
La presente invención también incluye proteínas
de fusión que comprenden los polipéptidos descritos en la presente
memoria.
En otros aspectos, la presente invención incluye
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, donde la
molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos del
SEQ ID NO:3, (b) un polinucleótido que permanece hibridado después
de unas condiciones de lavado restrictivas a un polinucléotido que
consiste en la secuencia de nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO:1, o
el complemento de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 64
a 618 del SEQ ID NO:1.
En otra realización, el polinucleótido aislado
que codifica un polipéptido, donde la molécula de ácido nucleico se
selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que
comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:36, (b) un
polinucleótido que permanece hibridado después de unas condiciones
de lavado restrictivas a un polinucleótido que consiste en la
secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID
NO:6, o el complemento de la secuencia de nucleótidos de los
nucleótidos 64 a 618 del SEQ ID NO:6.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 64 al
nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el
nucleótido 1 al nucleótido 618.
En otra realización, la presente invención
incluye un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de
nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde el nucleótido
64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde el
nucleótido 1 al nucleótido 618.
En otra realización, la presente invención
incluye polinucleótido aislado que comprende una secuencia de
nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 8 desde el nucleótido
67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde el
nucleótido 1 al nucleótido 606.
En otra realización, la presente invención
incluye un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de
nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde el nucleótido
67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde el
nucleótido 1 al nucleótido 606.
La presente invención proporciona vectores de
expresión, que comprenden las moléculas de ácido nucleico aisladas
descritas en la presente memoria con un promotor de la
transcripción, y un terminador de la transcripción, donde el
promotor está conectado operablemente con la molécula de ácido
nucleico, y donde la molécula de ácido nucleico está conectada
operablemente con el terminador de la transcripción.
La presente invención proporciona células
anfitrionas recombinantes que comprenden el vector de expresión
descrito en la presente memoria, donde la célula anfitriona se
selecciona del grupo que consiste en bacterias, células de
levadura, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero,
y células vegetales.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método de producción de un polipéptido, comprendiendo
el método la etapa de cultivar células anfitrionas recombinantes
que comprenden los vectores de expresión descritos en la presente
memoria, y que producen los polipéptidos.
La presente invención proporciona un anticuerpo
o fragmento de anticuerpo que se une específicamente con los
polipéptidos descritos en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para la expansión de células monocíticas o
progenitores de células monocíticas que comprende cultivar médula
ósea o células de sangre periférica con una composición que
comprende una cantidad de los polipéptidos descritos en la presente
memoria suficiente para producir un incremento en el número de
células monocíticas o progenitores de células monocíticas en la
médula ósea o en las células de sangre periférica en comparación
con la médula ósea o las células de sangre periférica cultivadas en
ausencia del polipéptido administrado.
La presente invención también proporciona un
método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un mamífero
expuesto a un antígeno o a un patógeno que comprende: (1) determinar
un nivel de un anticuerpo específico del antígeno o del patógeno;
(2) administrar una composición que comprende los polipéptidos
descritos en la presente memoria en un vehículo farmacéutico
aceptable; (3) determinar un nivel
post-administración de anticuerpo específico del
antígeno o patógeno; (4) comparar el nivel de anticuerpo de la etapa
(1) con el nivel de anticuerpo de la etapa (3), donde un incremento
del nivel de anticuerpo es indicativo de la estimulación de la
respuesta inmunitaria.
En otros aspectos, la presente invención
proporciona un método de producción de una respuesta antiviral en
un mamífero que comprende administrar a un mamífero con una
infección viral una cantidad de una composición de los polipéptidos
descritos en la presente memoria suficiente para mostrar una
reducción del virus.
La presente invención, descrita de este modo
generalmente, se entenderá más fácilmente mediante la referencia a
los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y
no se pretende que sean limitantes de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede construir un plásmido de expresión que
contiene un polinucleótido que codifica zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 o zcyto25 por medio de recombinación homóloga. Se aísla un
fragmento de ADNc, por ejemplo ADNc de zcyto20, mediante PCR
utilizando la secuencia de polinucleótidos del SEQ ID NO: 1 con
regiones limítrofes en los extremos 5' y 3' correspondientes a las
secuencias del vector que flanquean el punto de inserción de
zcyto20. Los cebadores ZC40923 y ZC40927 se muestran en los SEQ ID
NOS: 12 y 13, respectivamente.
La mezcla de reacción para la PCR se hace correr
sobre un gel de agarosa al 1% y se extrae del gel una banda
correspondiente al tamaño del inserto utilizando un QIAquick® Gel
Extraction Kit (Qiagen, Valencia, Ca.). El plásmido pZMP21 es un
vector de expresión en mamífero que contiene una casete de expresión
que tiene el promotor de MPSV, múltiples sitios de restricción para
la inserción de secuencias codificadoras, un codón de terminación,
un origen de replicación de E. coli; una unidad de expresión
de un marcador seleccionable de mamífero que comprende un promotor
de SV40, un intensificador y un origen de replicación, un gen DHFR,
y el terminador de SV40; y las secuencias URA3 y
CEN-ARS requeridas para la selección y replicación
en S. cerevisiae. Éste se construye a partir de pZP9
(depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 10801
University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, con
el Núm. de Acceso 98668) con los elementos genéticos de la levadura
tomados de pRS316 (depositado en la Colección de Cultivos Tipo
Americana, 10801 University Boulevard, Manassas, Va.
20110-2209, con el Núm. de Acceso 77145), un
elemento del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) de
poliovirus, y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo
C-terminal del dominio transmembrana. El plásmido
pZMP21 fue digerido con BgIII, y utilizado para la recombinación con
el inserto de PCR.
Se combinan cien microlitros de células de
levadura competente (S. cerevisiae) independientemente con
10 \mul de las diversas mezclas de ADN anteriores y se transfieren
a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de
levadura/ADN se someten a electropulsos utilizando ajustes de
suministro de potencia (BioRad Laboratories, Hercules, Ca.) de 0,75
kV (5 kV/cm), \infty ohms, 25 \muF. A cada cubeta se le añaden
600 \mul de sorbitol 1,2 M, y la levadura se cultiva en placa en
dos alícuotas de 300 \mul sobre placas URA-D y se
incuban a 30ºC. Después de aproximadamente 48 horas, se resuspenden
los transformantes de levadura Ura+ de una única placa en 1 ml de
H_{2}O y se centrifugan brevemente para sedimentar las células de
levadura. El sedimento celular se resuspende en 1 ml de tampón de
lisis (Triton X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100 mM,
Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Se añaden 500 \mul de la mezcla de
lisis a un tubo Eppendorf que contiene 300 \mul de cuentas de
vidrio lavadas con ácido y 200 \mul de
fenol-cloroformo, se someten a vórtice durante
intervalos de 1 minuto dos o tres veces, y se centrifugan durante 5
minutos en una centrífuga Eppendorf a la velocidad máxima. Se
transfieren 300 \mul de la fase acuosa a un tubo nuevo, y el ADN
se precipita con 600 \mul de etanol (EtOH), seguido de
centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se
resuspende en 10 \mul de H_{2}O.
La transformación de células anfitrionas de
E. coli electrocompetentes (células Electromax DH10B®;
obtenidas de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md.) se realiza
con 0,5-2 ml de prep de ADN de levadura y 40 \mul
de células. Las células someten a electropulsación a 1,7 kV, 25
\muF, y 400 ohms. Después de la electroporación, se cultivan en
placa 1 ml de SOC (Bacto® Tryptona al 2% (Difco, Detroit, Mich.),
extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2
10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 \mul
sobre cuatro placas LB AMP (Caldo LB (Lennox), Bacto® Agar (Difco)
al 1,8%, 100 mg/L de Ampicilina).
Los clones individuales que albergan el
constructo de expresión correcto para zcyto20 se identifican
mediante digestión con enzimas de restricción para verificar la
presencia del inserto zcyto20 y para confirmar que las diversas
secuencias de ADN se han unido correctamente entre sí. Los insertos
de los clones positivos se someten a análisis de la secuencia. El
ADN plasmídico a mayor escala se aísla utilizando un kit disponible
en el mercado (QIAGEN Plasmid Maxi Kit, Qiagen, Valencia, Ca.) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. El constructo
correcto se denomina zcyto20-CEE/pZMP21.
Los plásmidos que contienen zcyto21, zcyto22,
zcyto24 o zcyto25 se preparan de una manera similar, utilizando
cebadores específicos de los nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan en placa células CHO DG44 (Chasin
et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-666,
1986) en placas de cultivo de 10 cm y se deja que crezcan hasta una
confluencia de aproximadamente 50% a 70% durante la noche a 37ºC.,
CO_{2} al 5%, en medio F12/FBS de Ham (medio F12 de Ham (Life
Technologies), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, Utah),
L-glutamina al 1% (JRH Biosciences, Lenexa, Kans.),
piruvato de sodio al 1% (Life Technologies)). Después las células
se transfectan con un plásmido que contiene zcyto20, zcyto21,
zcyto22, zcyto24 o zcyto25, esto es zcyto20/pZMP6, mediante
transfección mediada por liposomas utilizando una formulación de
liposomas 3:1 (p/p) del lípido policatiónico
2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminocarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propaniminio-trifluoroacetato
y el lípido neutro dioleoilfosfatidiletanolamina en agua filtrada a
través de membrana (Lipofectamine® Reagent, Life Technologies), en
una formulación de medio sin suero (SF) (F12 de Ham, 10 mg/ml de
transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina,
L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%). Se
diluye zcyto20/pZMP6 en tubos de 15 ml a un volumen final total de
640 \mul con medio SF. Se mezclan 35 \mul de Lipofectamine® con
605 \mul de medio SF. La mezcla resultante se añade a la mezcla de
ADN y se deja incubar aproximadamente 30 minutos a la temperatura
ambiente. Se añaden 5 ml de medio SF a la mezcla de
ADN:Lipofectamine®. Las células se enjuagan una vez con 5 ml de
medio SF, se aspiran, y se añade la mezcla de ADN:Lipofectamine. Las
células se incuban a 37ºC durante cinco horas, después se añaden
6,4 ml de F12 de Ham/FBS al 10%, medio PSN al 1% a cada placa. Las
placas se incuban a 37ºC durante la noche, y la mezcla de
ADN:Lipofectamine se sustituye por FBS al 5%/medio de Ham al día
siguiente. A los tres días de la transfección, las células se
dividen en matraces T-175 en medio de crecimiento.
A los 7 días de la transfección, las células se colorean con
FITC-anticuerpo monoclonal anti-CD8
(Pharmingen, San Diego, Ca.) seguido de cuentas magnéticas
conjugadas con anti-FITC (Miltenyi Biotec, Auburn,
Ca.). Las células CD8 positivas se separan utilizando columnas
disponibles en el mercado (columnas mini-MACS;
Miltenyi Biotec) de acuerdo con las directrices del fabricante y se
colocan en DMEM/F12 de Ham/FBS al 5% sin nucleósidos pero con
metotrexato 50 nM (medio de selección).
Las células se cultivan en placa para subclonar
una densidad de 0,5, 1 y 5 células por pocillo en placas de 96
pocillos en medio de selección y se deja que crezcan durante
aproximadamente dos semanas. Los pocillos se verifican para la
evaporación de medio y se llevan de nuevo a 200 \mul por pocillo
según sea necesario durante este procedimiento. Cuando un gran
porcentaje de las colonias de la placa están próximas a la
confluencia, se recogen 100 \mul de medio de cada pocillo para su
análisis mediante transferencia puntual, y las células se alimentan
con medio de selección de nueva aportación. El sobrenadante se
aplica a un filtro de nitrocelulosa en un aparato para
transferencia puntual, y el filtro se trata a 100ºC en un horno de
vacío para desnaturalizar la proteína. El filtro se incuba en
Tris-glicina 525 mM, pH 9,1,
\beta-mercaptoetanol 5 mM, a 65ºC, 10 minutos,
después en Tampón Western A con leche en polvo desnatada al 2,5%
(gelatina al 0,25%, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150
mM, EDTA 5 mM, Igepal CA-630 al 0,05%) durante la
noche a 4ºC en un aparato de sacudimiento giratorio. El filtro se
incuba con el producto conjugado de anticuerpo-HRP
en tampón Western A con leche en polvo desnatada al 2,5% durante 1
hora a la temperatura ambiente sobre un aparato de sacudimiento
giratorio. El filtro se lava después tres veces a la temperatura
ambiente en PBS más Tween 20 al 0,01%, 15 minutos por lavado. El
filtro se revela con reactivos quimioluminiscentes (kit de marcaje
directo ECL®; Amersham Corp., Arlington Heights, Ill) de acuerdo
con las directrices del fabricante y se exponen a la película
(Hyperfilm ECL, Amersham Corp.) durante aproximadamente 5 minutos.
Los clones positivos se tratan con tripsina de la placa de 96
pocillos y se transfieren a placas de 6 pocillos en medio de
selección para el aumento a escala y el análisis mediante
transferencia Western.
Las proteínas zcyto24 y zcyto25 completas fueron
producidas en células BHK. Por ejemplo, las células BHK se
transfectaron con zcyto24-CEE/pZMP21 o
zcyto25-CEE/pZMP21 (Ejemplo 1). Las células BHK 570
(ATCC CRL-10314) se cultivaron en placa en matraces
para el cultivo de tejidos T75 y se dejó que crecieran hasta una
confluencia de aproximadamente 50 a 70% durante la noche a 37ºC,
CO_{2} al 5%, en medio de crecimiento (SL7V4, suero bovino fetal
al 5% (Hyclone, Logan, Utah), penicilina/estreptomicina al 1%).
Después las células se transfectaron con
zcyto24-CEE/pZMP21 o
zcyto25-CEE/pZMP21 mediante transfección mediada por
liposomas (utilizando Lipofectamine®; Life Technologies), en medio
sin suero (SF). El plásmido se diluyó en tubos de 1,5 ml hasta un
volumen final total de 640 \mul con medio SF. Se mezclaron 35
\mul de la mezcla de lípidos con 605 \mul de medio SF, y la
mezcla resultante se dejó incubar aproximadamente 30 minutos a la
temperatura ambiente. Después se añadieron seis ml de medio SF a la
mezcla de ADN/lípido. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de
medio SF, se aspiraron, y se añadió la mezcla de ADN/lípido. Las
células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, después se
añadieron 15 ml de medio de crecimiento a cada placa. Las placas se
incubaron a 37ºC durante la noche, y la mezcla de ADN/lípido se
sustituyó por medio de selección (SL7V4, suero bovino fetal al 5%
(Hyclone, Logan, Utah), penicilina/estreptomicina al 1%, MTX 1
\muM) al día siguiente. Aproximadamente 7-10 días
después de la transfección, las colonias resistentes al metotrexato
se trataron con tripsina, y las células se volvieron a cultivar en
placa en matraces T-162 y se transfirieron a un
cultivo a gran escala.
Para la construcción de vectores de adenovirus,
la región codificadora de la proteína de zcyto20, zcyto21, zcyto22,
zcyto24 o zcyto25 se amplifica mediante PCR utilizando cebadores que
añaden los sitios de restricción PmeI y AscI a los extremos 5' y 3'
respectivamente. La amplificación se realiza con un molde de ADN
completo en una reacción de PCR como sigue: un ciclo a 95ºC durante
5 minutos; seguido de 15 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 61ºC
durante 1 minuto, y 72ºC durante 1,5 minutos; seguido de 72ºC
durante 7 minutos; seguido de enjuagado a 4ºC. El producto de
reacción de la PCR se carga sobre un gel de agarosa de bajo punto
de fusión al 1,2% en tampón TAE (Tris-acetato 0,04
M, EDTA 0,001 M). El producto de la PCR es escindido del gel y
purificado utilizando un kit disponible en el mercado que comprende
una columna de centrifugación en membrana de gel de sílice
(QIAquick® PCR Purification Kit y kit de limpieza en gel; Qiagen,
Inc.) como en las instrucciones del kit. El producto de la PCR se
digiere después con PmeI y AscI, se extrae con fenol/cloroformo, se
precipita con EtOH, y se rehidrata en 20 ml de TE (Tris/EDTA pH 8).
El fragmento zcyto20 se liga después en los sitios
PmeI-AscI del vector transgénico
pTG12-8 y se transforma en células competentes
DH10B® de E. coli mediante electroporación. El vector
pTG12-8 derivaba de p2999B4 (Palmiter et al.,
Mol Cell Biol. 13:5266-5275, 1993) por inserción de
un intrón de insulina II de rata (aprox. 200 pb) y un poliligador
(Fse I/Pme I/Asc I) en el sitio Nru I. El vector comprende un
promotor de metalotioneína (MT-1) de ratón (aprox.
750 pb) y una región no traducida de la hormona de crecimiento
humana (hGH) y una señal de poliadenilación (aprox. 650 pb)
flanqueados por 10 kb de la secuencia limítrofe 5' de
MT-1 y 7 kb la secuencia limítrofe 3' de
MT-1. El ADNc es insertado entre las secuencias de
la insulina II y la hGH. Los clones que contienen el ADNc de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25 se identifican
mediante miniprep de ADN plasmídico seguido de digestión con PmeI y
AscI.
Los clones positivos se secuencian para asegurarse de que no había deleciones u otras anomalías en el constructo.
Los clones positivos se secuencian para asegurarse de que no había deleciones u otras anomalías en el constructo.
Se prepara ADN utilizando un kit disponible en
el mercado (Maxi Kit, Qiagen, Inc.), y el ADN se libera del vector
pTG12-8 utilizando las enzimas PmeI y AscI. El ADNc
se aísla sobre un gel de agarosa de baja temperatura de fusión al
1% y se escinde del gel. La porción de gel se reblandece a 70ºC, y
el ADNc se extrae dos veces con un volumen igual de fenol tamponado
con Tris, se precipita con EtOH, y se resuspende en 10 \mul de
H_{2}O.
El ADNc se clona en los sitios
EcoRV-AscI de un pAdTrack-CMV
modificado (He, T-C. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998). Este constructo
contiene el gen marcador de la proteína fluorescente verde (GFP).
El promotor de CMV que dirige la expresión de GFP es remplazado por
el promotor de SV40, y la señal de poliadenilación de SV40 es
remplazada por la señal de poliadenilación de la hormona de
crecimiento humana. Además, el poliligador nativo es remplazado por
los sitios FseI, EcoRV, y AscI. Esta forma modificada de
pAdTrack-CMV se denomina pZyTrack. La ligación se
realiza utilizando un kit de ligación y escrutinio de ADN disponible
en el mercado (Fast-Link® kit; Epicentre
Technologies, Madison, Wis.). Los clones que contienen zcyto20 son
identificados mediante digestión de ADN miniprep con FseI y AscI.
Con el fin de linealizar el plásmido, aproximadamente 5 \mug del
plásmido pZyTrack zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 o zcyto25
resultante son digeridos con PmeI. Aproximadamente 1 \mug del
plásmido linealizado es co-transformado con 200 ng
de pAdEasy superenrollado (He et al., ídem) en
células E. coli BJ5183 (He et al., ídem). La
co-transformación se realiza utilizando un
Bio-Rad Gene Pulser a 2,5 kV, 200 ohms y 25 \muFa.
La mezcla de cotransformación completa se cultiva en placa sobe 4
placas LB que contienen 25 \mug/ml de kanamicina. Las colonias más
pequeñas se seleccionan y se expanden en LB/kanamicina, y el ADN
del adenovirus recombinante se identifica mediante procedimientos
miniprep con ADN normalizados. El ADN miniprep de adenovirus
recombinante se transforma en células E. coli DH10B®
competentes, y se prepara ADN utilizando un Maxi Kit (Qiagen, Inc.)
de acuerdo con las instrucciones del kit.
Aproximadamente 5 \mug de ADN adenoviral
recombinante se digieren con la enzima PacI (New England Biolabs)
durante 3 horas a 37ºC en un volumen de reacción de 100 \mul que
contienen 20-30U de PacI. El ADN digerido se extrae
dos veces con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipita
con etanol. El sedimento de ADN se resuspende en 10 \mul de agua
destilada. Un matraz T25 de células QBI-293 A
(Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canada), inoculadas el
día antes y desarrolladas hasta una confluencia de
60-70%, es transfectado con el ADN digerido con
PacI. El ADN digerido con PacI se diluye hasta un volumen total de
50 \mul con HBS estéril (NaCl 150 mM, HEPES 20 mM). En un tubo
separado, se diluyen 20 \mul de sales de
N-[1-(2,3-Dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil-amonio
(DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) de 1 mg/ml hasta
un volumen total de 100 \mul con HBS. Se añade el ADN al DOTAP,
se mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo, y se deja a la
temperatura ambiente durante 15 minutos. El medio se separa de las
células 293 A y se lava con 5 ml de medio esencial mínimo sin suero
(MEM) alfa que contiene piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no
esenciales MEM 0,1 mM, y tampón HEPES 25 mM (reactivos obtenidos de
Life Technologies, Gaithersburg, Md.). Se añaden 5 ml de MEM sin
suero a las células 293 A y se mantienen a 37ºC. La mezcla de
ADN/lípido se añade gota a gota al matraz T25 de células 293 A, se
mezcla suavemente, y se incuba a 37ºC durante 4 horas. Después de 4
horas el medio que contiene la mezcla de ADN/lípido se separa por
aspiración y se sustituye por 5 ml de MEM completo que contiene
suero bovino fetal al 5%. Las células transfectadas se controlan en
cuanto a la expresión de GFP y la formación de focos (placas
virales).
Siete días después de la transfección de las
células 293 A con el ADN adenoviral recombinante, las células
expresan la proteína GFP y empiezan a formar focos ("placas"
virales). El producto lisado celular bruto se recoge utilizando un
raspador celular para recoger todas las células 293 A. El producto
lisado se transfiere a un tubo cónico de 50 ml. Para liberar la
mayoría de las partículas de virus de las células, se realizan tres
ciclos de congelación/descongelación en un baño de hielo seco/etanol
y un baño de agua a 37ºC.
El producto lisado bruto se amplifica
(amplificación primaria (1º)) para obtener una "solución de
partida" de trabajo de producto lisado zcyto20 rAdV.
Diez placas de 10 cm de células 293 A casi
confluentes (80-90%) se ajustan 20 horas antes, se
añaden 200 ml de producto lisado rAdV bruto a cada placa de 10 cm,
y las células se controlan durante 48 a 72 horas en cuanto al CPE
(efecto citopático) bajo el microscopio de luz blanca y a la
expresión de GFP bajo el microscopio fluorescente. Cuando todas las
células 293 A muestran CPE, se recoge este producto lisado de
partida y se realizan ciclos de congelación descongelación como se
ha descrito antes.
Después se realiza una amplificación secundaria
(2º) de zcyto20 rAdV. Se preparan veinte placas para el cultivo de
tejidos de 15 cm de células 293 A de manera que las células sean
confluentes en 80-90%. Se separan todos menos 20 ml
de medio MEM al 5%, y cada placa se inocula con
300-500 ml del producto lisado rAdV amplificado 1º.
Después de 48 horas las células 293 A se lisan a partir de la
producción del virus, el producto lisado se recoge en botellas de
centrífuga de polipropileno de 250 ml, y se purifica el rAdV.
Se añade detergente NP-40 a una
concentración final de 0,5% a las botellas de producto lisado con el
fin de lisar todas las células. Las botellas se colocan sobre una
plataforma giratoria durante 10 minutos agitando tan rápido como
sea posible sin que se caigan las botellas. Los desechos se
sedimentan mediante centrifugación a 20.000 x G durante 15 minutos.
El sobrenadante se transfiere a botellas de centrífuga de
policarbonato de 250 ml, y se añaden 0,5 volúmenes de solución de
PEG8000/NaCl 2,5 M al 20%. Las botellas se sacuden durante la noche
sobre hielo. Las botellas se centrifugan a 20.000\times G durante
15 minutos, y el sobrenadante se descarta en una solución
blanqueadora. Utilizando un raspador celular estéril, el producto
precipitado de virus/PEG, blanco, de 2 botellas se resuspende en
2,5 ml de PBS. La solución de virus resultante se coloca en tubos
de microcentrífuga de 2 ml y se centrifuga a 14,000\times G en la
microcentrífuga durante 10 minutos para separar cualquier desecho
celular adicional. El sobrenadante de los tubos de centrífuga de 2
ml se transfiere a un tubo con capucha a presión y se ajusta a una
densidad de 1,34 g/ml con CsCl. La solución se transfiere a tubos
de centrífuga de paredes gruesas, de policarbonato, de 3,2 ml y se
centrifuga a 348.000\times G durante 3-4 horas a
25 \muC. El virus forma una banda blanca. Utilizando puntas de
pipeta de calibre ancho, se recoge la banda de virus.
Se utiliza una columna de intercambio iónico
disponible en el mercado (p. ej., columnas PD-10
precargadas con Sephadex® G-25M; Pharmacia Biotech,
Piscataway, N.J.) para eliminar la sal de la preparación de virus.
La columna se equilibra con 20 ml de PBS. El virus se carga y se
deja circular en la columna. Se añaden 5 ml de PBS a la columna, y
se recogen fracciones de 8-10 gotas. Las densidades
ópticas de las diluciones 1:50 recogidas de cada fracción se
determinan a 260 nm en un espectrofotómetro. Las fracciones del pico
se reúnen, y se determina la densidad óptica (DO) de una dilución
1:25. La DO se convierte en concentración de virus utilizando la
fórmula:
(DO a 260 nm)(25)(1,1\times10^{12})=viriones/ml.
(DO a 260 nm)(25)(1,1\times10^{12})=viriones/ml.
Para almacenar el virus, se añade glicerol al
virus purificado a una concentración final de 15%, se mezcla suave
pero eficazmente, y se almacena a -80ºC.
Se sigue un protocolo desarrollado por Quantum
Biotechnologies, Inc. (Montreal, Canada) para medir la infectividad
del virus recombinante. Brevemente, se siembran dos placas para el
cultivo de tejidos de 96 pocillos con 1\times10^{4} células 293
A por pocillo en MEM que contiene suero bovino fetal al 2% para cada
virus recombinante que se va a analizar. Después de 24 horas se
elaboran diluciones 1:10 de cada virus de 1\times10^{-2} a
1\times10^{-14} en MEN que contiene suero bovino fetal al 2%. Se
colocan 100 \mul de cada dilución en cada uno de los 20 pocillos.
Después de 5 días a 37ºC, se leen los pocillos positivos o negativos
para CPE, y se calcula un valor para las "Unidades Formadoras de
Placa/ml" (PFU).
Se diseñaron cebadores de PCR que eran comunes
tanto a zcyto20 como a zcyto22 dentro de la secuencia codificadora
pronosticada. Estos se denominan ZC39339 (SEQ ID NO:47) y ZC39393
(SEQ ID NO:48). La PCR se llevó a cabo sobre un panel de genotecas
de ADNc humano de diferentes tejidos. El producto se observó en
genotecas de cerebro, islotes (páncreas), próstata, placenta,
testículo, HPVS (epitelio de próstata), y CD3+. Después se diseñaron
cebadores de PCR a partir de la secuencia genómica 5' de la
metionina de partida y 3' del codón de terminación para zcyto20
(con una elevada similitud con zcyto22). Estos fueron denominados
ZC39340 (SEQ ID NO:49) y ZC39341 (SEQ ID NO:50). Se llevó a cabo la
PCR sobre las genotecas identificadas previamente. Cuatro genotecas
contuvieron clones completos. La secuenciación de los productos de
la PCR generados de estas genotecas dio como resultado tres
genotecas que contenían zcyto22 (próstata, testículo y CD3+), y una
genoteca que contenía zcyto20 (HPVS (epitelio de próstata)).
También se llevó a cabo una PCR utilizando cebadores específicos
para la secuencia codificadora pronosticada de zcyto22. Estos se
denominan ZC39295 (SEQ ID NO:51) y ZC39298 (SEQ ID NO:52). Las
genotecas positivas por esta PCR fueron cerebro, próstata, CD3+, y
testículo. La secuenciación confirmó la secuencia de zcyto22.
Se diseñaron cebadores de PCR que eran comunes
tanto a zcyto24 como a zcyto25 en la secuencia codificadora
pronosticada. Estas se denominaron ZC39687 (SEQ ID NO:53) y ZC39741
(SEQ ID NO:54). Se llevó a cabo la PCR sobre un panel de genotecas
de ADNc de ratón de diferentes tejidos. El producto se observó en
las siguientes genotecas: corazón, pulmón, placenta, próstata de
Torres, piel, intestino delgado, testículo y timo. Los cebadores de
la PCR se diseñaron después 5' de la metionina de partida y en los
codones de terminación. El cebador 5' se designa ZC39732 (SEQ ID
NO:55) y empareja con las secuencias tanto de zcyto24 como de
zcyto25. El cebador 3' de Zcyto24 se denomina ZC39701 (SEQ ID
NO:56). El cebador 3' de zcyto25 se denomina ZC39688 (SEQ ID NO:57).
La PCR se llevó a cabo sobre las genotecas positivas indicadas
antes. Para zcyto24, todas las genotecas excepto corazón y próstata
de Torres fueron positivas. La secuenciación confirmó la secuencia
de zcyto24 a partir de genotecas de placenta, testículo, e
intestino delgado. Para zcyto25, todas las genotecas excepto corazón
y próstata de Torres fueron positivas. La secuenciación confirmó la
secuencia de zcyto25 a partir de genoteca de pulmón.
Se preparó un vector de expresión,
pzBV37L:zCyto20, para expresar polipéptidos zcyto20 en células de
insecto. Se generó un fragmento de 536 pb que contenía la secuencia
para zcyto20 y codificaba los sitios de restricción BspE1 y Xba1
sobre los extremos 5' y 3', respectivamente, mediante amplificación
por PCR de un zcyto20 plasmídico utilizando los cebadores ZC41932
(SEQ ID NO:14) y ZC41933 (SEQ ID NO:15) utilizando el Expand High
Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) como en las instrucciones
del fabricante. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 1
ciclo de 94ºC durante 4 minutos, 30 ciclos de 94ºC durante 30
segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 1
ciclo a 72ºC durante 4 minutos; seguido de un enjuagado a 4ºC.
Se visualizó una pequeña porción del producto de
la PCR mediante electroforesis en gel (agarosa NuSieve al 1%), y se
confirmó una longitud del fragmento de aproximadamente 550 pb. El
resto de la mezcla de reacción se purificó por medio de un kit de
purificación Qiagen PCR como en las instrucciones del fabricante y
se hizo eluir en 30 \mul de agua. El ADNc se digirió en un
volumen de 36 \mul utilizando Bspe1 y Xba1 (New England Biolabs,
Beverly, Mass.) en condiciones de tampón apropiadas a 37ºC. El
producto de la PCR digerido se hizo correr a través de un gel
agarosa TAE al 1%, se escindió y se extrajo utilizando un QIAquick®
Gel Extraction Kit (Qiagen, Cat. No. 28704) y se hizo eluir en 30
\mul de tampón EB. El producto de la PCR de zcyto20 digerido se
ligó en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pZBV37L en
los sitios Bspe1 y Xba1. El vector pZBV37L es una modificación del
vector de expresión pFastBac1® (Life Technologies), donde el
promotor de la polihedrosis ha sido separado y sustituido por el
Promotor de la Proteína Alcalina de activación tardía y las
secuencia señal del líder EGT aguas arriba del MCS. Se ligaron 5
\mul del fragmento de la PCR de zcyto20 digerido con enzimas de
restricción y se ligaron 4 \mul del correspondiente vector pZBV37L
durante 72 horas a 15ºC en un volumen de 20 \mul en condiciones
de tampón apropiadas. Se transformaron 5 \mul de la mezcla de
ligadura en 33 \mul de células ElectoMAX® DH12S® (Life
Technologies, Cat. No. 18312-017) mediante
electroporación a 400 Ohms, 2,00 kV y 25 pF en una cubeta de
electroporación con espacios de 2 mm (BTX, Modelo Núm. 620). Las
células transformadas se diluyeron en 500 \mul de medio LB y se
hicieron sobrecrecer durante 1 hora a 37ºC y se cultivaron en placa
10 \mul y 20 \mul de la dilución sobre placas LB que contenían
100 \mug/ml de ampicilina. Los clones se analizaron mediante PCR
y se seleccionaron los clones positivos, se cultivaron en placa, y
se sometieron a secuenciación. Después se confirmó la secuencia.
Se preparó un vector de expresión,
pZBV32L:zCyto20cee, para expresar polipéptidos zcyto20cee en células
de insecto. PZBV32L:zCyto20cee fue diseñado para expresar un
polipéptido zcyto20 con una etiqueta GLU-GLU
C-terminal (SEQ ID NO:16). Este constructo se puede
utilizar para determinar la secuencia de aminoácidos
N-terminal de zcyto20 una vez que el péptido señal
ha sido escindido.
Se generó un fragmento zcyto20 de 625 pb que
contenía los sitios de restricción BamHI y XbaI en los extremos 5'
y 3', respectivamente, mediante amplificación por PCR a partir de un
plásmido que contenía ADNc de zcyto20 utilizando los cebadores
zc40240 y zc40241 (SEQ ID NOS: 17 y 18, respectivamente). Las
condiciones de reacción de la PCR fueron las siguientes: Se utilizó
el Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) para un
volumen de reacción de 100 \mul que contenía DMSO al 5%. 1 ciclo a
94ºC durante 4 minutos; 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC
durante 30 segundos, y 72ºC durante 60 segundos; 1 ciclo a 72ºC
durante 4 minutos; seguido de un enjuagado a 4ºC. Se visualizaron 5
\mul del fragmento de la PCR mediante electroforesis en gel
(agarosa NuSieve al 1%). El resto de la mezcla de reacción se
purificó por medio de un kit de purificación Qiagen PCR como en las
instrucciones del fabricante y se hizo eluir en 30 \mul de agua.
El ADNc fue digerido en un volumen de 35 \mul utilizando BamHI y
XbaI (New England Biolabs, Beverly, Mass.) en condiciones de tampón
apropiadas durante 2 horas a 37ºC. La banda del producto de PCR
digerido se hizo correr a través de un gel de agarosa TAE al 1%, se
escindió y se extrajo utilizando QIAquick® Gel Extraction Kit
(Qiagen) y se hizo eluir en 30 \mul de agua. El producto de la
PCR de zCyto20cee digerido, purificado se ligó en el sitio de
clonación múltiple de un vector pZB32L preparado previamente y
digerido con enzimas de restricción (BamHI y XbaI). El vector
pZBV32L es una modificación del vector de expresión pFastBac1® (Life
Technologies), donde el promotor de la polihedrosis ha sido
separado y sustituido por el Promotor de la Proteína Alcalina de
activación tardía, y la secuencia codificadora para la etiqueta
Glu-Glu (SEQ ID NO:10) así como la señal de
terminación fueron insertadas en el extremo 3' de la región de
clonación múltiple. Se ligaron 5 \mul del inserto zCyto20
digerido con enzimas de restricción y 40 ng del correspondiente
vector pZBV32L durante la noche a 16ºC en un volumen de 20 \mul.
Se transformaron cinco \mul de la mezcla de ligadura en 50 \mul
de células ElectoMAX® DH12s® (Life Technologies) mediante
electroporación a 400 Ohms, 2,00 kV y 25 \muF en una cubeta de
electroporación con un espacio de 2 mm. Las células transformadas
se diluyeron en 500 \mul de medio SOC (Triptona Bacto al 2%,
Extracto de Levadura Bacto al 0,5%, 10 ml de NaCl 1M, KCl 1,5 mM,
MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM) y se cultivaron
en placa 50 \mul de la dilución sobre placas LB que contenían 100
\mug/ml de ampicilina. Se analizaron los clones mediante PCR y
digestión con enzimas de restricción. Los clones positivos se
seleccionaron y se cultivaron en placa para su secuenciación. Una
vez que se hubo confirmado la secuencia apropiada, se transformaron
25 ng de ADN del clon positivo en 66 \mul de células competentes
DH10Bac® Max Efficiency® (GIBCO-BRL) mediante
choque térmico durante 45 segundos en un bloque térmico a 42ºC. Las
células DH10Bac® transformadas se diluyeron en 600 \mul de medio
SOC (Triptona Bacto al 2%, Extracto de Levadura Bacto al 0,5%, 10
ml de NaCl 1M, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y
glucosa 20 mM) y se hicieron crecer a 37ºC durante 1 hora y se
cultivaron en placa 100 \mul sobre placas de Agar Luria que
contenía 50 \mug/ml de kanamicina, 7 \mug/ml de gentamicina, 10
\mug/ml de tetraciclina, 40 \mug/mL de IPTG y 200 \mug/mL de
Bluo Gal. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Se
utilizó una selección de color para identificar aquellas células
que tenían ADN viral transpuesto (referido como "bácmido").
Aquellas colonias, que eran de color blanco, se escogieron para su
análisis. Las colonias se analizaron mediante PCR y se seleccionaron
las colonias positivas (que contenían el bácmido deseado) para el
crecimiento y posterior purificación del ADN de los bácmidos. Se
escrutaron los clones en cuanto al inserto de peso molecular
correcto por medio de amplificación por PCR del ADN utilizando
cebadores para el elemento transponible del bácmido: ZC447 (SEQ ID
NO:19) y ZC976 (SEQ ID NO:20). Las condiciones de reacción para la
PCR fueron las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 4 minutos; 25
ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC
durante 2,5 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 4 minutos; seguido de
enjuagado a 4ºC. El producto de la PCR se hizo correr sobre un gel
de agarosa al 1% para confirmar el tamaño del inserto. Aquellos que
tenían el tamaño correcto se utilizaron para transfectar células de
Spodoptera Frugiperda (Sf9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células Sf9 a 1\times10^{6}
células por pocillo en una placa de 6 pocillos y se dejó que se
anclaran durante 1 hora a 27ºC. Se diluyeron aproximadamente 5
\mug de ADN del bácmido hasta 100 \mul con
Sf-900 II SFM (Life Technologies). Se diluyeron 20
\mul de Lipofectamine® Reagent (Life Technologies) hasta 100
\mul con Sf-900 II SFM. El ADN del bácmido y las
soluciones de lípido se mezclaron suavemente y se incubaron durante
45 minutos a la temperatura ambiente. Se añadieron 800 \mul de
Sf-900 II SFM a la mezcla de
lípidos-ADN. El medio se aspiró del pocillo y se
añadió 1 ml de la mezcla de ADN-lípidos a las
células. Las células se incubaron a 27ºC durante la noche. La
mezcla de ADN-lípidos se aspiró de cada pocillo y
sustituyó por 2 ml de medio Sf-900 II. Las placas
se incubaron a 27ºC, humedad del 90%, durante aproximadamente 7 días
después de lo cual se cosechó el virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células Sf9 a 1\times10^{6}
células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Se colocaron 500
\mul de virus de la placa de transfección en el pocillo y la placa
se incubó a 27ºC, humedad 90%, durante 96 horas después de lo cual
se cosechó el virus (amplificación primaria).
La segunda ronda de amplificación se llevó a
cabo transfiriendo 100 \mul de virus de la placa de amplificación
primaria a pocillos que contenían 1\times10^{6} células por
pocillo. La placa se incubó durante 96 horas antes de la
cosecha.
Se realizó una ronda adicional de amplificación
(amp. terciaria). Se hicieron crecer células Sf9 en 50 ml de
Sf-900 II SFM en un matraz de sacudimiento de 250 ml
a una densidad aproximada de 1\times10^{6} células/ml. Después
se infectaron con 1 ml de solución de partida viral de la placa
anterior y se incubaron a 27ºC durante 6 días momento después del
cual se cosechó el virus.
La solución viral de partida se tituló mediante
una curva de inhibición del crecimiento y se dejó que el cultivo
con un título que indicaba una Multiplicidad de Infección (MOI) de
uno continuara durante un total de 48 horas. El sobrenadante se
analizó por medio de un Western reducido utilizando un anticuerpo
monoclonal primario específico para la etiqueta
Glu-Glu seguido de un anticuerpo secundario
anti-murino de cabra conjugado con HRP. Los
resultados indicaron una banda de aproximadamente 20 kDa. También
se suministró sobrenadante para el análisis de la
actividad.
actividad.
Después se generó una gran solución de partida
viral mediante el siguiente método: se hicieron crecer células Sf9
en IL Sf-900 II SFM en un matraz con sacudimiento de
2.800 ml hasta una densidad aproximada de 1\times10^{6}
células/ml. Después se infectaron con 5 ml de la solución viral de
partida del matraz anterior y se incubaron a 27ºC durante 4 días
momento después del cual se cosechó el virus.
Se completaron infecciones a mayor escala para
proporcionar material para la purificación aguas abajo.
De uno modo similar, se expresaron zcyto21 y
zcyto22 en Baculovirus
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede elaborar proteína recombinante para
cualquiera de las proteínas descritas en la presente memoria.
Se produjo zcyto20 etiquetado con
Glu-Glu carboxilo terminal a partir de células de
insecto infectadas con baculovirus recombinante, o líneas celulares
BHK, estables o transitorias. Se recogieron los cultivos, y los
medios se filtraron en condiciones estériles utilizando un filtro de
0,2 \mum.
Las proteínas se purificaron del medio
acondicionado mediante una combinación de cromatografía de afinidad
con anticuerpo Anti-péptido Glu-Glu
(Anti-EE) y cromatografía de exclusión en gel
Superdex 75. El medio de cultivo de BV (pH 6,0, conductividad 7 mS)
se ajustó a pH 6,7. Después se añadió NaCl a los medios de BV y BHK
hasta 300 mM antes de cargarlos en una columna de afinidad de
Proteína A-anticuerpo anti-EE POROS
de 10 x 70 mm (volumen de la columna 5 ml) a un flujo de
2-5 ml/minuto. Luego se lavó la columna con cinco
veces el volumen de la columna (CV) de 5\timesPBS (pH 7,2). La
proteína unida se hizo eluir con ácido acético 0,5 M, NaCl 0,5 M,
pH 3,0. Se recogieron fracciones de 2 ml, y el eluyente se
neutralizó mediante la adición de Tris 2 M. Las muestras de la
columna de afinidad de anticuerpo anti-EE se
analizaron mediante SDS-PAGE con tinción con plata
y transferencia western en cuanto a la presencia de la proteína
zcyto20. Las fracciones que contenían la proteína zcyto20 se
reunieron y se concentraron a aproximadamente 2 ml utilizando un
concentrador Biomax-5 (Millipore), y se cargaron
sobre una columna de filtración en gel Superdex 75 de 16x600 mm
(Amersham Pharmacia Biotech). Las fracciones que contenían la
proteína zcyto20 purificada se reunieron, se filtraron a través de
un filtro de 0,2 \mum, se tomaron alícuotas de 100 \mul cada
una, y se congelaron a -80ºC. La concentración de la proteína
purificada final se determinó mediante análisis BCA (Pierce,
Rockford, Ill.) y análisis de aminoácidos por HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la proteína zcyto20 recombinante
mediante SDS-PAGE (Bis-Tris Nupage
4-12%, Invitrogen, Calsbad, Ca.) con un método de
tinción con plata (Fast Silver, Geno Technology, Inc., St. Louis,
Mo.) y transferencia Western utilizando anticuerpo
anti-EE. Se sometieron a electroforesis o bien el
medio acondicionado o bien la proteína purificada utilizando un
Xcell II® MINI-CELL (Invitrogen, Calsbad, Ca.) y se
transfirieron a nitrocelulosa (0,2 \mum; Bio-Rad
Laboratories, Hercules, Ca.) a la temperatura ambiente utilizando un
módulo de transferencia Xcell II® (Invitrogen) con agitación de
acuerdo con las directrices proporcionadas en el manual del aparato.
La transferencia se hizo correr a 500 mA durante 45 minutos en un
tampón que contenía base Tris 25 mM, glicina 200 mM, y metanol al
20%. Después los filtros se bloquearon con leche en polvo desnatada
al 10% en PBS durante 10 minutos a la temperatura ambiente. La
nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, y después se añadió anticuerpo
primario en PBS que contenía leche en polvo no grasa al 2,5%. Las
transferencias se incubaron durante dos horas a la temperatura
ambiente o durante la noche a 4ºC con sacudimiento débil. Después de
la incubación, las transferencias se lavaron tres veces durante 10
minutos cada una en PBS. Se añadió el anticuerpo secundario (IgG
anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa de
rábano picante; obtenida de Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)
diluido 1:2000 en PBS que contenía leche en polvo desnatada al 2,5%,
y las transferencias se incubaron durante dos horas a la
temperatura ambiente con sacudimiento suave. Las transferencias se
lavaron después tres veces, 10 minutos cada una, en PBS, luego se
enjuagaron rápidamente en H_{2}O. Las transferencias se revelaron
utilizando reactivos con sustrato quimioluminiscente asequibles
comercialmente (reactivos SuperSignal® ULTRA 1 y 2 mezclados 1:1;
reactivos obtenidos de Pierce Chemical Co.), y la señal se capturó
utilizando el soporte lógico Lumi-Imager's Lumi
Analyst 3.0 (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) en tiempos que
oscilaban de 10 segundos a 5 minutos o según fuera necesario.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína zcyto20-CEE
purificada del medio BV migró en forma de un monómero de 21 kDa
sobre el gel Bis-Tris al 4-12%,
también se observó una banda de dímero de 36 kD minoritaria. La
proteína dimérica se convirtió en banda de monómero tras la
reducción utilizando un agente reductor, lo que sugirió la
dimerización de zcyto20-CEE por enlaces disulfuro,
y coincide con el número impar (un total de siete) de restos
cisteína que dan como resultado un enlace disulfuro
intercatenario.
Los polipéptidos zcyto21, zcyto22, zcyto24, y
zcyto25 fueron purificados de una manera similar.
Se realizaron los alineamientos de la secuencia
local de los promotores de IFN-\alpha,
IFN-\beta, IFN-\gamma
caracterizados y los de otras numerosas citoquinas con las regiones
aguas arriba de zcyto20, zcyto21, y zcyto24 para identificar si
estos genes estaban regulados simultáneamente. La hipótesis era que
las propiedades comunes de la regulación génica debían estar
reflejadas en similitudes de secuencia de las regiones aguas arriba
de los genes.
Debido a la baja especificidad de unión de los
TF, las predicciones de sitios de unión individuales tienen una
alta tasa de falsos positivos. Por lo tanto, las predicciones de los
sitios en el aislamiento para la identificación de los sitios de
unión con papeles funcionales in vivo no son útiles. Sin
embargo, se pueden seleccionar los sitios de unión pronosticados
que es probable que tengan funciones específicas de la secuencia
por medio de un filtro basado en la conservación: La observación
biológica de que las regiones reguladoras a menudo están más
fuertemente conservadas entre especies que otras regiones no
codificadoras puede ser cuantificada para revelar patrones de
conservación de se han denominado huellas filogenéticas (Fickett,
et al., Curr. Opin. Biotechnol. 11: 19-24,
2000.) En particular, las comparaciones
humano-roedor han demostrado una valiosa fuente de
identificación de elementos reguladores funcionales (Wasserman et
al., Nat. Genet. 26: 225-228, 2000).
Los alineamientos revelaron emparejamientos
significativos principalmente entre los promotores de diversos
genes de IFN\alpha, mientras, basándose en este análisis, existe
una pequeña evidencia de similitud entre los promotores de
zcyto20-22 y otras citoquinas.
Se realizaron alineamientos de secuencias por
pares con DBA (Jareborg et al., Genome. Res. 9:
815-824, 1999). La búsqueda de sitios de unión a
factores de transcripción individuales se realizó con matrices de
peso de la posición normalizadas (Fickett, Mol. Cell. Biol.
16:437-441, 1996) retiradas de la base de datos
TRANSFAC (versión 3.0, Wingender et al., Nucleic Acids Res.
28: 316-319, 2000), y los alineamientos de las
regiones 1-4 se computaron con SSEARCH, versión
3.1t12 (Pearson, Genomics 11:635-650, 1991).
Basándose en los estudios publicados que implican otros grupos de
TF, se puede esperar que la mayoría de los sitios de unión naturales
suficientemente conservados entre ser humano y ratón sean
detectados en el uso del intervalo de puntuaciones utilizado
(Fickett, Mol. Cell. Biol. 16: 437-4411996;
Wasserman et al., J. Mol. Biol. 278: 167-181,
1998).
Los resultados computacionales sugieren que
cabría esperar rasgos comunes para la regulación de la familia de
zcyto20 y otras citoquinas que se reflejaran por la similitud de la
secuencia a nivel de sitios de unión individuales en lugar de
emparejamientos que abarcaran regiones ampliadas.
Basándose en la búsqueda de sitios de unión de
un grupo de 32 TF, se realizó la identificación de supuestos sitios
de un número limitado de factores conocidos en su mayor parte por
estar implicados en la regulación transcripcional de los
interferones. Los resultados de la comparación muestran supuestos
sitios de unión de TF que juegan importantes papeles en la
regulación transcripcional de IFN-\beta
[NF-\kappaB, ISRE (elemento de unión IRF)] e
IFN-\gamma (AP-1, CREB, GATA,
NF-\kappaB, NF-AT) que también
están presentes en las regiones no codificadoras conservadas. Por
ejemplo, un par de sitios AP-1/NF-AT
colindantes en la región 1, es un ejemplo bien documentado de unión
cooperativa que existe en muchos promotores de citoquinas (Holloway
et al., Mol. Immunol. 38: 567-580, 2000).
Los sitios de unión para los TF que han sido
identificados como críticos para la regulación de citoquinas,
sugieren que la agrupación de sitios de unión de los factores de
transcripción en la región promotora de zcyto20 es un candidato
para una región funcional.
El alineamiento de la región 2 con el grupo de
citoquinas conocidas produjo un emparejamiento en el promotor
AK155, en la posición -415 con respecto al sitio de inicio de la
transcripción de AK155 que proporcionan Knappe et al. (J.
Virol. 74: 3881-3887, 2000). El hecho de que haya un
supuesto sitio de unión NF-kB en esa localización
en el promotor de zcyto20 indica la posible presencia de un sitio
NF-\kappaB en el promotor AK155.
Se produjeron animales transgénicos que
expresaban los genes Zcyto21 utilizando machos fértiles, adultos
(sementales) (B6C3fl, 2-8 meses de edad (Taconic
Farms, Germantown, N.Y.)), machos vasectomizados (estériles
"duds") (CD1, 2-8 meses, (Taconic Farms)),
hembras fértiles prepubescentes (donantes) (B6C3fl,
4-5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles
adultas (receptoras) (CD1, 2-4 meses, (Taconic
Farms)).
Las donantes fueron aclimatadas durante 1 semana
y después se les inyectaron aproximadamente 8 UI/ratón de
gonadotropina Pregnant Mwere's Serum (Sigma, St. Louis, Mo.) I.P., y
46-47 horas más tarde, 8 UI/ratón de gonadotropina
Coriónica humana (hCG (Sigma)) I.P. para inducir una superovulación.
Las donantes fueron apareadas con sementales después de las
inyecciones de hormona. La ovulación generalmente se produce a las
13 horas de la inyección de hCG. La copulación se confirmó por la
presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente del
apareamiento.
Se recogieron los huevos fertilizados con un
ámbito quirúrgico (Microscopio Estero Leica MZ12, Leica, Wetzlar,
Del.). Se recogieron los oviductos y se liberaron los huevos en
portas para análisis urinario que contenían hialuronidasa (Sigma).
Los huevos se lavaron una vez en hialuronidasa, y dos veces en medio
W460 de Whitten (Tabla 7) que había sido incubado con CO_{2} al
5%, O_{2} al 5%, N_{2} al 90% a 37ºC. Los huevos se almacenaron
después en una incubadora a 37ºC/CO_{2} al 5% hasta la
microinyección.
Se linealizaron de diez a veinte microgramos de
ADN plasmídico que contenía un ADNc del gen de Zcyto21, se purificó
en gel, y se resuspendió en Tris 10 mM pH 7,4, EDTA 0,25 mM pH 8,0,
a una concentración final de 5-10 nanogramos por
microlitro para su microinyección.
El ADN plasmídico fue inyectado en los huevos
recogidos contenidos en una gota de medio W640 recubierto con
aceite mineral equilibrado con CO2, templado. El ADN fue retirado en
una aguja para inyección (apartada de un capilar de vidrio de
borosilicato, DI 0,75 mm, DE 1 mm), e inyectado en los huevos
individuales. Cada huevo fue penetrado por la aguja de inyección,
en uno o ambos pronúcleos haploides.
Se inyectaron picolitros de ADN en los
pronúcleos, y la aguja de inyección se retiró sin que entrara en
contacto con los nucleolos. El procedimiento se repitió hasta que
todos los huevos estuvieron inyectados. Los huevos microinyectados
con éxito fueron transferidos a una placa para el cultivo de tejidos
y órganos con medio W640 pregasificado para su almacenamiento
durante la noche en una incubadora a 37ºC/CO_{2} al 5%.
Al día siguiente, se transfirieron
12-17 embriones de 2 células sanos de la inyección
del día anterior al receptor. Se localizó la ampolla hinchada y
manteniendo el oviducto entre la ampolla y la bursa, se realizó una
muesca en el oviducto con una aguja 28 g cerca de la bursa,
asegurándose de no romper la ampolla o la bursa. Los embriones se
implantaron a través de esta muesca, y manteniéndolos sobre la pared
peritoneal, se condujeron de nuevo los órganos reproductores a la
cavidad abdominal.
Los receptores se devolvieron a las jaulas por
parejas, y se permitieron 19-21 días de gestación.
Los animales inyectados con el ADNc de Zcyto21 murieron antes de
nacer.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan anticuerpos policlonales inmunizando
2 conejos blancos New Zealand hembra con la proteína recombinante
purificada huzcytor19/MBP-6H. Se le administra a
cada uno de los conejos una inyección intraperitoneal (ip) inicial
de 200 \mug de proteína purificada en Coadyuvante Completo de
Freund seguido de inyecciones ip de refuerzo de 100 \mug de
péptido en Coadyuvante Incompleto de Freund cada tres semanas. Siete
a diez días después de la administración de la segunda inyección de
refuerzo (3 inyecciones en total), se toman muestras de sangre de
los animales y se recoge el suero. Después los animales se refuerzan
y se toman muestras se sangre cada tres semanas.
El suero de conejo específico de
huzcyotr19/MBP-6H es pre-adsorbido
de anticuerpos anti-MBP utilizando una columna de
proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB, Peapack,
N.J.) que se prepara utilizando 10 mg de MBP recombinante
purificada por gramo de CNBr-SEPHAROSE. Los
anticuerpos policlonales específicos de huzcytor19 son purificados
por afinidad del suero de conejo utilizando una columna de proteína
CNBr-SEPHAROSE 4B que se prepara utilizando 10 mg
de la proteína recombinante purificada para el antígeno específico
huzcytor19/MBP-6H seguido de 20\times diálisis en
PBS durante la noche. Los anticuerpos específicos de huzcytor19 son
caracterizados mediante ELISA utilizando 500 ng/ml de las proteínas
recombinantes purificadas huzcytor19/MBP-6H o
huzcytor19-Fc4 como dianas para el anticuerpo. Se
determina el límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo
purificado por afinidad
anti-huzcytor19/MBP-6H de conejo
sobre su antígeno recombinante purificado específico
huzcytor19/MBP-6H y sobre
huzcytor19-Fc4 recombinante purificado.
Se preparan anticuerpos policlonales inmunizando
conejos blancos New Zealand hembra con la proteína recombinante
purificada zcyto20/MBP-6H,
zcyto21/MBP-6H, y zcyto22/MBP-6H,
así como zcyto24/MBP-6H, o
zcyto25/MBP-6H de ratón. Se les administra a los
conejos una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 \mul de
proteína purificada en Coadyuvante Completo de Freund seguido de
inyecciones ip de refuerzo de 100 \mug de péptido en Coadyuvante
Incompleto de Freund cada tres semanas. Siete a diez días después de
la administración de la segunda inyección de refuerzo (3
inyecciones en total), se toman muestras de sangre de los animales y
se recoge el suero. Después se refuerzan los animales y se toman
muestras de sangre cada tres semanas.
El suero de conejo específico de
zcyto20/MBP-6H, zcyto21/MBP-6H,
zcyto22/MBP-6H, zcyto24/MBP-6H, o
zcyto25/MBP-6H puede ser
pre-adsorbido de los anticuerpos
anti-MBP utilizando una columna de proteína
CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB, Peapack, N.J.)
que se prepara utilizando 10 mg de MBP recombinante purificada por
gramo de CNBr-SEPHAROSE. Los anticuerpos
policlonales específicos de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o
zcyto25 son purificados por afinidad del suero de conejo utilizando
una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B que se
prepara utilizando 10 mg de la proteína recombinante purificada
para el antígeno específico seguido de 20\times diálisis en PBS
durante la noche. Los anticuerpos se caracterizan mediante ELISA
utilizando 500 ng/ml de las proteínas recombinantes purificadas
como dianas para el anticuerpo. Se determina el límite de detección
inferior (LLD) del anticuerpo purificado sobre su antígeno
recombinante purificado específico.
Se prepararon anticuerpos policlonales para
zcyto21 utilizando un protocolo similar inmunizando conejos con
proteína etiquetada con zcyto21-CEE, y se
purificaron los anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer cultivos de células primarias
(células epiteliales bronquiales humanas normales, fibroblastos
dérmicos humanos normales, células endoteliales de vena umbilical
humana, células endoteliales microvasculares humanas y células de
musculatura lisa humana; CLONETICS Corporation; Walkersville, Md.) y
líneas celulares de coriocarcinoma humano (células Jar, BeWo, y
3A-Sub E; ATCC, Manassas, Va.) en presencia de ácido
poliinosínico-ácido policitidílico (poli I:C; 100 \mug/ml)
(SIGMA; St. Louis, Mo.) o en medio solo. En algunos casos también
se sometieron a ensayo 10 ng/ml de hTNFa o 10 ng/ml de hIL1b.
Después de cuatro horas de incubación, se aisló el ARN total de las
células y se trató con ADNasa sin ARNasa. Se utilizó un microgramo
de ARN total para la síntesis del ADNc de la primera hebra
utilizando el kit Advantage
RT-for-PCR como sugiere el
fabricante (Clontech, Palo Alto, Ca.). Se utilizó un 5% de la
reacción de ADNc para la reacción en cadena de la polimerasa como
sugiere el fabricante (Clontech) utilizando los siguientes pares de
cebadores: zcyto20, ZC40134 (SEQ ID NO:30), ZC40214 (SEQ ID NO:31);
zcyto21, ZC40209 (SEQ ID NO:32), ZC40213 (SEQ ID NO:33); zcyto22,
ZC39295 (SEQ ID NO:34), y ZC39298 (SEQ ID NO:35). Se utilizaron
cebadores para G3PDH como control.
Se detectó ARNm de zcyto20 a bajos niveles en
todos los tipos de células sometidos a ensayo. Se observaron
niveles de ARNm de zcyto20 incrementados en las células NHBE, HUVEC,
JAR, 3-A Sub E y BeWo estimuladas con poli I:C. Se
detectó ARNm de zcyto22 a bajos niveles en todos los tipos de
células sometidos a ensayo. Se observaron niveles de ARNm de
zcyto22 incrementados en las células NHBE, JAR, 3-A
Sub E y BeWo estimuladas con poli I:C. Estos resultados indican que
la síntesis de ARNm de zcyto20 y zcyto22 es estimulada por el
inductor de interferón conocido, poli I:C.
Se detectó ARNm de zcyto21 a bajos niveles en
todos los tipos de células sometidas a ensayo. Se observaron
aumentos de niveles de ARNm de zcyto21 incrementados en las células
NHBE, HUVEC, NHDF, SMC, HMVEC, JAR, 3-A Sub E y
BeWo estimuladas con poli I:C. También se observaron niveles de ARNm
de zcyto21 incrementados en las células placentarias
3-A Sub E tratadas con IL1b. Estos resultados
indican que la síntesis de ARNm de zcyto21 es estimulada por el
inductor de interferón conocido, poli I:C y también pueden ser
estimulada por la citoquina IL1b en ciertos tipos de células.
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica completas a partir de sangre humana utilizando Ficoll
Hypaque. Se purificaron células T de las células mononucleares de
sangre periférica mediante columnas de selección positiva
VarioMacs como en las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec
Inc., Auburn, Ca.). Las muestras de cada población se tiñeron y se
analizaron mediante análisis de clasificación de células con
anticuerpos fluorescentes (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, Ca.)
para determinar el porcentaje de enriquecimiento. Las células T
CD3+ fueron purificadas aproximadamente en 95%. Los leucocitos de
sangre periférica completa o las células T CD3+ se hicieron crecer
en presencia de poli I:C (100 \mug/ml) o en medio solo. Después de
cuatro horas de incubación, se aisló el ARN total de las células y
se trató con ADNasa sin ARNasa. Se realizó una
RT-PCR con el kit Superscript
One-Step RT-PCR con Platinum Taq
(Invitrogen, Frederick, Md.) utilizando 100 ng de ARN total como
molde para la síntesis de ADNc. Los pares de cebadores para la PCR
utilizados fueron: ZC40134 (SEQ ID NO:30) y ZC40214 (SEQ ID NO:31);
zcyto21: ZC40209 (SEQ ID NO:32) y ZC40213 (SEQ ID NO:33); zcyto22:
ZC39295 (SEQ ID NO:34) y ZC39298 (SEQ ID NO:35). También se
sometieron a ensayo alícuotas cada ARN con pares de cebadores
específicos para la Clase I del MHC (Clontech) como control.
Se detectó ARNm de zcyto20 en células
mononucleares de sangre periférica completa estimuladas con poli
I:C. Los resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto20 es
estimulada por el inductor de interferón conocido, poli I:C en
células mononucleares de sangre periférica.
Se detectó ARNm de zcyto21 en células
mononucleares de sangre periférica completas y en células T CD3+
estimuladas con poli I:C. Los resultados indican que la síntesis de
ARNm de zcyto21 es estimulada por el inductor de interferón
conocido, poli I:C en células mononucleares de sangre periférica
incluyendo células T CD3+.
Se detectó ARNm de zcyto22 en células
mononucleares de sangre periférica completas y en células T CD3+
estimuladas con poli I:C. Los resultados indican que la síntesis de
ARNm de zcyto 22 es estimulada por el inductor de interferón
conocido, poli I:C en células mononucleares de sangre periférica
incluyendo células T CD3+.
Estos resultados son indicativos del efecto que
podría tener poli I:C sobre zcyto24 y zcyto25 así como sobre otros
miembros de la familia.
Se escrutó un panel de ARN de poblaciones de
células inmunitarias humanas primarias y líneas celulares
inmunitarias humanas en cuanto a la expresión de zcyto21, zcyto21,
y zcyto22 utilizando una RT-PCR. Los paneles fueron
elaborados internamente y contenían el ARN de dieciséis células en
reposo y activadas diferentes como se describe más abajo. Todas las
poblaciones de células inmunitarias primarias se aislaron de la
sangre de diversos donantes anónimos. Después se aislaron diversos
subgrupos de células inmunitarias (CD3+, CD14+, CD19+, y CD56+)
utilizando Microbeads marcadas y el Magnetic Cell Separation System
de Miltenyi Biotec. El ARN se preparó utilizando el RNeasy
Midiprep® Kit (Qiagen, Valencia, Ca.) como en las instrucciones del
fabricante. Se aisló el ARN de células NK CD56+ de las células en
su fase de reposo. Se activó una población CD3+ utilizando una
combinación de 500 ng/ml de Ionomicina y 5,0 ng/ml de PMA (forbol
12-miristato 13 acetato). Se estimuló otra población
CD3+ utilizando el sobrenadante de esplenocitos de rata estimulados
con Concavalina A, un medio que se sabe que es rico en citoquinas y
factores de crecimiento. Se recogieron células CD3+ para el
aislamiento del ARN en momentos de activación de 0, 4 y 16 horas.
Las muestras CD19+ se aislaron de tonsila humana y se activaron con
0,5 \mug/ml de ionomicina y 10 ng/ml de PMA. Después se recogieron
las células a las 0, 4 horas y 24 horas y se aisló el ARN. Se
activaron monocitos CD14+ humanos con 0,1 ng/ml de lipopolisacárido
(LPS) o 1,0 ng/ml de LPS durante 20 horas. Después se recogieron
células en reposo y activadas y se aisló el ARN. Además, se aisló
el ARN de las líneas celulares monocíticas humanas en reposo y
activadas HL-60, THP-1 y U937. Se
activaron células HL-60 durante la noche con 10
ng/ml de PMA. Las células THP-1 se activaron durante
la noche con 1,0 ng/ml de LPS+10 ng/ml de IFN gamma. Finalmente, se
activaron las células U937 durante la noche con 10 ng/ml PMA. Se
realizó la RT-PCR con el kit Superscript
One-Step RT-PCR con Platinum Taq
(Invitrogen) utilizando 100 ng de ARN total como molde para la
síntesis de ADNc. Los pares de cebadores utilizados para la PCR
fueron: zcyto20: ZC40632 (SEQ ID NO:36) y ZC40633 (SEQ ID NO:37);
zcyto21: ZC40209 (SEQ ID NO:32) y ZC40213 (SEQ ID NO:33); y
zcyto22: ZC40638 (SEQ ID NO:38) y ZC40639 (SEQ ID NO:39). Las
alícuotas de cada ARN también fueron sometidas a ensayo con pares
de cebadores específicos para la Clase I del MHC (Clontech) como
control.
Se detectó el ARNm de zcyto20 en células
THP-1 tratadas con LPS e interferón gamma. También
se detectó ARNm de zcyto20 en células CD3+ tratadas con PMA durante
4 horas. Se detectó ARNm de zcyto21 a bajos niveles en células U937
en reposo y células THP-1 en reposo. El nivel de
ARNm de zcyto21 aumentó tras el tratamiento de las células
THP-1 con LPS e interferón gamma. También se detectó
ARNm de zcyto21 en células CD3+ tratadas con PMA durante 4 horas.
Se detectó ARNm de zcyto22 en células THP-1 tratadas
con LPS e interferón gamma. Asimismo se detectó ARNm de zcyto22 en
células CD3+ tratadas con PMA durante 4 horas y 16 horas así como
células CD3+ tratadas con Conconavalina A durante 4 y 16 horas. Los
resultados indican que la síntesis de ARNm de zcyto20, zcyto21, y
zcyto22 es estimulada por la activación de una línea celular
monocítica y células inmunitarias CD3+ primarias.
Estos resultados son indicativos del efecto que
poli I:C podría tener sobre zcyto24 y zcyto25 así como otros
miembros de la familia.
Los análisis funcionales iniciales para la
actividad antiviral se llevaron a cabo utilizando medio
acondicionado de células de riñón embrionario humano (HEK)
transfectadas transitoriamente. La producción de este medio
acondicionado se describe como sigue. Se clonó un ADNc completo
para zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 en el vector
pzp7Z utilizando procedimientos normalizados. Los constructos de
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 se transfectaron en
células HEK 293. Brevemente, para cada constructo se cultivaron en
placa 700.000 células/pocillo (placas de 6 pocillos)
aproximadamente 18 horas antes de la transfección en 2 mililitros de
DMEM+suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se añadieron 1,5
microgramos de ADN de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25
y 0,5 microgramos de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech) a
6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total
de 100 microlitros de DMEM. Se utilizaron dos microgramos de ADN de
pIRES2-EGFP solo como control negativo. Estas
mezclas de transfección se añadieron 30 minutos más tarde a las
células 293 previamente cultivadas en placa. Veinticuatro horas más
tarde los medios celulares se separaron y se añadió
DMEM+seralbúmina bovina al 0,1%. Los medios acondicionados se
recogieron después de 48 horas, se filtraron a través de un filtro
de 0,45 micras y se utilizaron para análisis antivirales e
informadores.
Los análisis antivirales se llevaron a cabo
utilizando células de carcinoma cervical humano (HeLa) y células de
fibroblasto de ratón (L929). El primer día, el medio acondicionado
que contenía zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, o zcyto25 (Véase
el Ejemplo 10) se diluyó y se cultivó en placa con 50.000 células en
una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. Tras
una incubación de 24 horas a 37ºC, el medio se separó y se
sustituyó por medio que contenía virus de la encefalomiocarditis a
una multiplicidad de infección de 0,1. Las células se incubaron de
nuevo durante 24 horas a 37ºC. Después se puntuaron los pocillos de
cultivo visualmente sobre una escala de 4 puntos en cuanto a la
presencia de efecto citopático, que después se convirtió en % de
CPE como se muestra en la Tabla 8. El medio acondicionado de las
células transfectadas con GFP sola e
interferón-a-2a humano o
interferón-alfa murino purificado se incluyeron como
controles.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La Tabla 9 muestra que el medio acondicionado
que contiene zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 inhibía
la infección viral (% CPE) en células HeLa de una manera dependiente
de la dosis, mientras el medio acondicionado de GFP de control no
logró bloquear significativamente la aparición del efecto
citopático. Como se muestra en la Tabla 10, el medio acondicionado
que contenía zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 no
inhibió la infección viral en las células L929. En ambos
experimentos el interferón purificado mostró actividad antiviral
positiva.
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Como seguimiento, se utilizó medio acondicionado
de células Sf9 infectadas con baculovirus que expresaban zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 en los análisis antivirales. El
medio acondicionado de las células Sf9 infectadas con baculovirus
de tipo salvaje se utilizó como control negativo.
Los resultados del análisis antiviral utilizando
medio acondicionado derivado de baculovirus fueron similares a
aquellos en los que se utilizaba medio acondicionado transfectado
transitoriamente de 293. La Tabla 11 muestra el medio acondicionado
derivado de baculovirus que contenía infección viral inhibida por
zcyto21 en células HeLa de una manera dependiente de la dosis,
mientras el medio acondicionado de baculovirus de control no lograba
bloquear la aparición del efecto citopático.
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La producción del constructo de baculovirus y de
medio acondicionado se ha descrito antes.
Se llevaron a cabo análisis antivirales
adicionales utilizando células de carcinoma cervical humano (HeLa).
El primer día, se diluyeron MAb
anti-Receptor-IFN-hu
(Research Diagnostics Inc) y MAb de control negativo emparejados
por el isotipo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. El medio
acondicionado de las células Sf9 infectadas con baculovirus que
expresaban zcyto20, zcyto21, o zcyto22 se añadió para obtener una
concentración final de 0,0625\timesCM y se cultivaron en placa
con 50.000 células HeLa por pocillo. Tras una incubación de 24
horas a 37ºC, se separó el medio y se sustituyó por medio que
contenía virus de la encefalomiocarditis a una multiplicidad de
infección de 0,1. Las células se incubaron de nuevo durante 24 horas
a 37ºC. Los pocillos de cultivo se puntuaron visualmente en cuanto
a la presencia de efecto citopático (CPE), como se muestra en la
Tabla 8. Se incluyó como control positivo
interferón-a-2a humano purificado a
una concentración de 0,01 ng/ml.
La Tabla 12 muestra que el medio acondicionado
que contenía zcyto20, zcyto21, y zcyto22 tenía actividad antiviral
en células HeLa (como indicaba el cero % de CPE) en presencia o
ausencia de anticuerpos neutralizadores contra la cadena
2-beta del receptor del interferón alfa humano. En
cambio, la actividad antiviral del
interferón-a-2a era inhibida de una
manera dependiente de la dosis específicamente en presencia de
anticuerpos neutralizadores contra la cadena 2-beta
del receptor del interferón-alfa humano. Estos datos
indican que zcyto20 zcyto21, y zcyto22 interaccionan con un
receptor distinto del receptor del interferón alfa humano o éste
interacciona con el receptor del interferón alfa humano con un
mecanismo diferente del del
interferón-a-2a humano.
Se utiliza BaF3 para determinar si Zcyto20 tiene
propiedades anti-proliferativas. Se transfectan
establemente células de riñón de cría de hámster (BHK) con un
vector de expresión que contiene el promotor de CMV más el intrón A
aguas arriba del ADNc de Zcyto20 o de un ADNc no relacionado,
denominado Z\alpha30, utilizando BRL lipofectamina. Las células
transfectadas establemente se siembran en una factoría de células en
medio sin suero y se deja que crezcan durante tres días antes de
recoger y concentrar el medio acondicionado en un filtro 5K a 10X.
Las muestras de medio acondicionado concentrado se almacenan a
4ºC.
El siguiente análisis se utiliza para someter a
ensayo la anti-proliferación de BaF3. En una placa
de 96 pocillos, se realizan diluciones ocho seriadas 1:2 de medio
de crecimiento solo (RPMI 1640, suero bovino fetal 10%, piruvato de
sodio 1 mM, L-glutamina 2 mM), o
IL-3 murina (partiendo de 50 pg/ml en medio de
crecimiento) con un volumen final de 100 \mul. Se añaden
cincuenta microlitros de lo siguiente a ambas calles con medio de
crecimiento solo o mIL-3 diluida:
interferón-\alpha humano (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1
ng/ml diluido en medio de crecimiento),
interferón-\beta (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1 ng/ml
diluido en medio de crecimiento),
interferón-\alpha murino (100 ng/ml, 10 ng/ml, o
1 ng/ml diluido en medio de crecimiento),
interferón-\beta murino (100 ng/ml, 10 ng/ml, o 1
ng/ml diluido en medio de crecimiento), Zcyto20(a
2,5\times, 0,5\times, o 0,1\times), y Z\alpha30 murina (a
2,5\times, 0,5\times, o 0,1\times).
La línea celular BaF3 se lava tres veces en
medio de crecimiento, los sedimentos se resuspenden en medio de
crecimiento, se cuentan las células y se diluyen en medio de
crecimiento a 5.000 células/50 \mul. Después se añaden cincuenta
microlitros de células diluidas a cada una de las diluciones de las
muestras. Las placas de análisis se incuban en una incubadora a
37ºC durante tres a cuatro días. Después se añaden veinte
microlitros de azul Alomar a cada pocillo y la placa se incuba
durante la noche a 37ºC. Las placas se leen en el lector de placa
de la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 544 y
una longitud de onda de emisión de 590.
La interacción de los interferones de tipo 1 con
su receptor específico conduce a la inducción de numerosos genes
responsables de su actividad antiviral/antiproliferativa. Estos
incluyen la 2',5'-oligoadenilato sintetasa
(2-5A sintetasa), la PKr quinasa dependiente del ARN
de doble hebra (Pkr), la fosfolípido escramblasa, y la molécula de
adherencia intercelular 1 (ICAM-1). También se
produce la inducción de genes con una función todavía desconocida,
tal como un producto génico estimulado por el interferón de 56 kDa
(ISG-56k). Para determinar si algunos o todos estos
genes son inducidos tras el tratamiento de las células con zcyto20,
se trataron células linfoides B Daudi humanas durante 72 horas con
medio acondicionado de células Sf9 infectadas con baculovirus que
expresan zcyto20. Se utilizó el medio acondicionado de células Sf9
infectadas con baculovirus de tipo salvaje como control negativo.
Tras el tratamiento las células se recogieron y se lisaron para el
aislamiento del ARN total. Se convirtió 1 \mug de ARN total en
ADNc utilizando la transcriptasa inversa y se utilizó como molde
para la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores
oligonucleotídicos específicos para los genes estimulados por
interferón humano descritos antes. Los cebadores oligonucleotídicos
para la glicerol-3 fosfato deshidrogenasa (G3PDH)
se utilizaron como gen de control no estimulado por interferón. Los
resultados muestran una clara inducción de ISG-56k,
Pkr, 2-5A sintetasa y fosfolípido escramblasa
después del tratamiento de las células con zcyto20. No se observó
inducción para ICAM-1 o el gen de control no
estimulado por interferón, G3PDH.
Se sometió a ensayo zcyto20 biotinilado en
cuanto a la unión a receptores de citoquina conocidos o huérfanos.
Los vectores de expresión de pZP7 que contenían ADNc de receptores
de citoquinas (incluyendo IFN\alphaR1, IFN\betaR2,
IFN\alphaR1, IFN\betaR2, IL-10R,
CRF2-4, ZcytoR7, DIRS1, Zcytor19, y Factor Tisular
humano) fueron transfectados en células COS, y la unión de zcyto20
biotinilado a las células COS transfectadas se llevó a cabo
utilizando el análisis de trampa de secreción descrito más abajo. La
unión positiva en este análisis mostró pares
receptor-ligando.
Las transfecciones de células COS se realizaron
como sigue: se cultivaron en placa células COS (1\times10^{5}
células/ pocillo) sobre placas para el cultivo de tejidos, de 12
pocillos, recubiertas de fibronectina (Becton Dickinson, Bedford,
Mass.) y se incubaron a 37ºC durante la noche. Se mezcló el ADN del
receptor de citoquina (0,75 \mug) con 50 \mul de medio DMEM sin
suero (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de
L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de
insulina, 1 g de selenio y 5 mg de fetuina en 500 ml de DMEM),
después se mezclaron con 5 \mul de Lipofectamine® (Invitrogen,
Carlsbad, Ca.) en 45 \mul de medio DMEM sin suero, y se incubaron
a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron 400
\mul adicionales de medio DMEM sin suero. Las células se
enjuagaron con DMEM sin suero, y se añadieron 500 \mul de mezcla
de ADN. Las células se incubaron durante 5 horas a 37ºC, momento en
el cual se añadieron 500 \mul de medio DMEM FBS al 20% (100 ml de
FBS, 55 mg de piruvato de sodio y 146 mg de
L-glutamina en 500 ml de DMEM) y las células se
incubaron durante la noche.
La trampa de secreción se realizó como sigue: Se
aspiró el medio y se enjuagaron las células dos veces con BSA en
PBS al 1%. Las células se bloquearon durante 1 hora con TNB
(Tris-HCL 0,1M, NaCl 0,15M y Reactivo de Bloqueo al
0,5% (NEN Renaissance TSA-Direct Kit, NEN Life
Science Products, Boston, Mass.) en H_{2}O. Las células se
incubaron durante 1 hora con 3 \mug/ml de proteína zcyto21
biotinilada (Ejemplo 27) en TNB. Después las células se lavaron 3
veces con BSA en PBS al 1% y se incubaron durante otra hora con
Estreptavidina-HRP (kit NEN) diluida 1:300 en TNB.
De nuevo las células se lavaron 3 veces con BSA en PBS al 1%, y
después se fijaron durante 15 minutos con Formaldehído en PBS al
1,8%. Luego las células se lavaron 3 veces con TNT
(Tris-HCL 0,1 M, NaCl 0,15M, y
Tween-20 al 0,05% en H_{2}O).
La unión positiva se detectó con reactivo de
fluorescein-tiramida diluido 1:50 en tampón de
dilución (kit NEN), incubado durante 4,5 minutos, y lavado con TNT.
Las células se conservaron con Vectashield Mounting Media (Vector
Labs Burlingame, Ca.) diluido 1:5 en TNT. Las células se
visualizaron utilizando un filtro FITC sobre un microscopio
fluorescente.
La unión positiva se detectó sobre células
transfectadas con ADNc de zcytor19 humano y e incubadas con zcyto21
biotinilado. Ninguno de los otros receptores transfectados unidos
zcyto21, y zcytor19 se unió a una proteína de control biotinilada.
Estos datos indican que zcytor19 es un receptor para zcyto21.
Experimentos adicionales han mostrado unión
positiva entre Zcytor19 humano y de ratón con zcyto21 biotinilado.
También se detectó unión positiva en células transfectadas con ADNc
de zcytor19 humano e incubadas con zcyto20, y zcyto24
biotinilados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede utilizar un análisis informador de la
transducción de la señal para determinar la interacción funcional
de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25 con zcytor19. Se
transfectan células de riñón embrionario humano (HEK) con un
plásmido informador que contiene un elemento de respuesta estimulado
por interferón (ISRE) que conduce la transcripción de un gen
informador de luciferasa en presencia o ausencia vectores de
expresión pZP7 que contienen los ADNc para los receptores de
citoquinas de clase II (incluyendo DIRS1, IFN\alphaR1,
IFN\alphaR2 y Zcytor19 (SEQ ID NOS: 23 y 26) humanos). La
actividad luciferasa siguiente a la estimulación de células
transfectadas con los ligandos de clase II (incluyendo zcyto20 (SEQ
ID NO:1), zcyto21 (SEQ ID NO:4), zcyto22 (SEQ ID NO:6), zcyto10,
huIL10 y huIFNa-2a) refleja la interacción del
ligando con los receptores de citoquinas transfectados y nativos de
la superficie celular. Los resultados y métodos se describen más
abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron células HEK 293 como sigue: se
cultivaron en placa 700.000 células 293/pocillo (placas de 6
pocillos) aproximadamente 18 horas antes de la transfección a 2
mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se
añadieron 1 microgramo de pISRE-Luciferase DNA
(Stratagene), 1 microgramo de ADN de receptor de citoquina y 1
microgramo de pIRES2-EGFP DNA (Clontech,) a 9
microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total
de 100 microlitros de DMEM. Se utilizaron dos microgramos de ADN de
pIRES2-EGFP cuando no estaba incluido ADN de
receptor de citoquina. Esta mezcla de transfección se añadió 30
minutos más tarde a las células 293 previamente cultivadas en
placa. Veinticuatro horas más tarde las células transfectadas se
separaron de la placa utilizando tripsina-EDTA y se
volvieron a cultivar en placa a aproximadamente 25.000
células/pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Aproximadamente 18 horas antes de la estimulación del ligando, se
cambió el medio a DMEM + FBS al 0,5%.
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Los análisis informadores de la transducción de
la señal se realizaron como sigue: Tras una incubación de 18 horas
a 37ºC en DMEM + FBS al 0,5%, se estimularon las células
transfectadas con diluciones (en DMEM + FBS al 0,5%) de los
siguientes ligandos de clase II; zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto10,
huIL10 y huIFNa-2a. Después de una incubación de 4
horas a 37ºC, se lisaron las células, y se midieron las unidades de
luz relativa (RLU) en un luminómetro tras la adición de un sustrato
de luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como el aumento
de inducción de la RLU de las muestras experimentales sobre el
control con medio solo (RLU de las muestras experimentales/RLU de
medio solo=aumento de la inducción). La Tabla 14 muestra que
zcyto20, zcyto21 y zcyto22 inducen la señalización de ISRE en las
células 293 transfectadas con ISRE-luciferasa
produciendo una inducción de 15 a 17 veces la actividad de la
luciferasa sobre el medio solo. La adición de ADN de zcytor19 a la
mezcla de transfección da como resultado una inducción adicional de
6 a 8 veces en la señalización de ISRE por zcyto20, zcyto21 y
zcyto22 produciendo un aumento de inducción total de 104 a 125.
Ninguna de las otras citoquinas de clase II transfectadas dio como
resultado un aumento de la señalización de ISRE. Estos resultados
indican que zcyto20, zcyto21 y zcyto22 interaccionan funcionalmente
con el receptor de citoquina zcytor19. La Tabla 13 también muestra
que huIFNa-2a puede inducir la señalización de ISRE
en células 293 transfectadas con ISRE-luciferasa
produciendo una inducción de 205 veces la actividad de la luciferasa
en comparación con el medio solo. Sin embargo, la adición de ADN de
zcytor19 a la transfección conduce a una reducción del índice de 11
en la señalización de ISRE (en comparación con el ADN de
ISRE-luciferasa solo), sugiriendo que la expresión
excesiva de zcytor19 afecta negativamente a la señalización del
interferón, en contraste con los efectos positivos de la expresión
excesiva de zcytor19 sobre la señalización de zcyto20, zcyto21 y
zcyto22.
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Se utilizó un análisis de transducción de la
señal para determinar la interacción funcional de zcyto20, zcyto21,
y zcyto22 con zcytor19 e IL10Rb (CRF2-4). Se
transfectaron células de riñón embrionario humano (HEK) o células
de riñón embrionario humano (HEK) que expresaban establemente en
exceso zcytor19 humano con un plásmido informador que contenía un
elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) que conducía
la transcripción de un informador de luciferasa. La actividad de la
luciferasa siguiente a la estimulación de las células transfectadas
con ligandos de clase II (incluyendo zcyto20, zcyto21, zcyto22 y
huIFNa-2a) en presencia o ausencia de un anticuerpo
neutralizador para IL10Rb (CRF2-4) refleja la
interacción del ligando con los receptores de citoquina de la
superficie celular. Los resultados y métodos se describen más
abajo.
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Para producir células HEK 293 que expresan en
exceso establemente zcytoR19 humano, se transfectaron las células
293 como sigue: se cultivaron en placa 300.000 células 293/pocillo
(placas de 6 pocillos) aproximadamente 6 horas antes de la
transfección en 2 mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 10%.
Por pocillo, se añadieron 2 microgramos de un vector de expresión
pZP7 que contenía el ADNc de zcytoR19 humano (SEQ ID NO:23) a 6
microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total
de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de transfección se añadió
30 minutos después a las células 293 previamente cultivadas en
placa. Cuarenta y ocho horas más tarde las células transfectadas se
colocaron bajo selección de 2 microgramos/mililitro de puromicina.
Las células resistentes a la puromicina se aprobaron como población
de células.
Las células HEK 293 (de tipo salvaje o que
expresaban en exceso zcytor19 humano) fueron transfectadas como
sigue: se cultivaron en placa 700.000 células 293/pocillo (placas de
6 pocillos) aproximadamente 18 horas antes de la transfección en 2
mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 10%. Por pocillo, se
añadieron 1 microgramo de pISRE-Luciferase DNA
(Stratagene) y 1 microgramo de pIRES2-EGFP DNA
(Clontech) a 6 microlitros de reactivo Fugene 6 (Roche
Biochemicals) en un total de 100 microlitros de DMEM. Esta mezcla de
transfección se añadió 300 minutos más tarde a las células 293
previamente cultivadas en placa. Veinticuatro horas más tarde las
células transfectadas se separaron de la placa utilizando
tripsina-EDTA y se volvieron a cultivar en placa a
aproximadamente 25.000 células/pocillo en placas de microtitulación
de 96 pocillos. Aproximadamente 18 horas antes de la estimulación
del ligando, se cambió el medio a DMEM + FBS al 0,5%.
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Los análisis informadores de la transducción de
la señal se realizaron como sigue: Tras una incubación de 18 horas
a 37 grados en DMEM + FBS al 0,5%, se pretrararon las células
transfectadas con un anticuerpo de cabra policlonal neutralizador
para IL10Rb (2,5 microgramos/ml para zcyto21; 8 microgramos/ml para
zcyto20 y zcyto22, R&D Systems) o PBS durante 1 hora a 37ºC.
Las células de riñón embrionario humano (HEK) que expresaban en
exceso establemente zcytoR19 humano también se pretrataron con un
anticuerpo de cabra policlonal no neutralizador para IFNAR1 (8
microgramos/ml, R&D Systems) como control de anticuerpo para los
experimentos que implicaban zcyto20 y zcyto22. Las células
pretratadas se estimularon con diluciones (en DMEM + FBS al 0,5%) de
los siguientes ligandos de clase II; zcyto20, zcyto21, o zcyto22.
Como control, se hizo correr huIFNa-2a en cada
experimento. Tras una incubación de 4 horas a 37ºC, las células se
lisaron, y se midieron las unidades de luz relativa (RLU) en un
luminómetro tras la adición de un sustrato de luciferasa. Los
resultados obtenidos se muestran como el aumento de inducción de
RLU de las muestras experimentales sobre el control de medio solo
(RLU de las muestras experimentales/RLU de medio solo=índice de
inducción).
Las Tablas 14 y 15 muestran que la inducción de
la señalización de ISRE por zcyto20 es inhibida por el
pretratamiento de las células 293 de tipo salvaje o de las células
293 que expresan en exceso zcytoR19 humano con un anticuerpo
neutralizador para IL10Rb. Se observa ninguna o poca inhibición de
la inducción por huIFNa-2a de la señalización de
ISRE. Estos resultados indican que zcyto20 requiere la interacción
con IL10Rb (CRF2-4) para una inducción máxima de la
señalización de ISRE y que el receptor para zcyto20 es la
combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb
(CRF2-4).
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Las Tablas 16 y 17 muestra que la señalización
de ISRE por zcyto21 es inhibida por el pretratamiento de las
células 293 de tipo salvaje o las células 293 que expresan en exceso
Zcytor19 humano con un anticuerpo neutralizador para IL10Rb. No se
observa inhibición de la inducción por huIFNa-2a de
la señalización de ISRE. Estos resultados indican que zcyto21
requiere la interacción con IL10Rb (CRF2-4) para la
máxima inducción de la señalización de ISRE y que el receptor para
zcyto21 es la combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb
(CRF2-4).
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Las Tablas 18 y 19 muestran que la inducción de
la señalización de ISRE por zcyto22 es inhibida por el
pretratamiento de las células 293 de tipo salvaje o las células 293
que expresan en exceso zcytor19 humano con un anticuerpo
neutralizador para IL10Rb. Se observa una inhibición nula o pequeña
de la inducción de huIFNa-2a de la señalización de
ISRE. Estos resultados indican que zcyto22 requiere la interacción
con IL10Rb (CRF2-4) para una máxima inducción de la
señalización de ISRE y que el receptor para zcyto22 es la
combinación heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb
(CRF2-4).
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Se realizó un análisis antiviral para determinar
la capacidad del anticuerpo anti-IL10Rb para
bloquear la actividad antiviral de zcyto20. El análisis se llevó a
cabo utilizando células HEK 293 (de tipo salvaje o que expresaban
zcytoR19 humano en exceso). El primer día, se diluyeron los
anticuerpos (anti-IL10R beta humano,
anti-receptor de Leptina humano, R&D Systems) en
medio celular a 5 microgramos/ml y después se cultivaron en placa
con 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Tras una
incubación de una hora a 37ºC, se añadieron
zcyto20-CEE (del Ejemplo 3) (200 ng/ml para las
células 293 de tipo salvaje, 0,5 ng/ml para las células 293 que
expresan en exceso zcytoR19 humano) o
interferón-a-2a humano (1 ng/ml para
las células 293 de tipo salvaje, 100 ng/ml para las células 293 que
expresan en exceso zcytoR19 humano) a los pocillos y se incubaron
durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, se separó el medio y se
sustituyó por medio que contenía virus de la encefalomiocarditis
(EMCV) a una multiplicidad de infección de 0,1. Después se incubaron
las células a 37ºC durante la noche. Con posterioridad, se
añadieron 25 \muL de Metiltiazolotetrazolio (MTT) (Sigma) de 5
mg/ml a cada pocillo, se incubaron 2 horas a 37ºC, y los pocillos se
extrajeron después con 100 \muL de tampón de extracción (SDS al
12,5%, DMF al 45%). Tras incubar durante a noche a 37ºC, se midió la
densidad óptica a 570 nm en un lector de placa Spectromax
(Molecular Devices, CA). El descenso de densidad óptica (570 nm)
indica un descenso de la supervivencia celular (pérdida de actividad
antiviral). Las densidades ópticas (570 nm) para las diferentes
condiciones experimentales se muestran en la Tabla 20 más abajo. Los
resultados indican que el bloqueo del receptor beta de IL10 humano
neutraliza específicamente la actividad antiviral de zcyto20 sin
afectar a la actividad del interferón a-2a. Esto
indica que el receptor beta de IL10 humano es parte del complejo
receptor (incluyendo zcytoR19 humano) implicado en la actividad
antiviral de zcyto20.
Se utilizó un análisis informador de la
transducción para determinar la interacción funcional de zcyto20,
zcyto21 y zcyto22 con zcytor19 e IL10Rb (CRF2-4). Se
transfectaron células de riñón de hámster (BHK) con un plásmido
informador que contenía un elemento de respuesta estimulado por
interferón (ISRE) que conducía la transcripción de un gen
informador de luciferasa en presencia o ausencia de vectores de
expresión pZP7 que contenían ADNc para los receptores de citoquina
de clase II Zcytor19 e IL10Rb (CRF2-4). La actividad
luciferasa tras la estimulación de las células transfectadas con
ligandos de clase II (incluyendo zcyto20, zcyto21 y zcyto22)
refleja la interacción del ligando con receptores de citoquinas
transfectados y nativos sobre la superficie celular. Los resultados
y métodos se describen más abajo.
Se transfectaron células BHK-570
como sigue: se cultivaron en placa 200.000 células BHK/pocillo
(placas de 6 pocillos) aproximadamente 5 horas antes de la
transfección en 2 mililitros de DMEM + suero bovino fetal al 5%.
Por pocillo, se añadieron 1 microgramo de ADN de
pISRE-Luciferasa (Stratagene), 1 microgramo de ADN
de receptor de citoquina y 1 microgramo de ADN de
pIRES2-EGFP (Clontech) a 9 microlitros de reactivo
Fugene 6 (Roche Biochemicals) en un total de 100 microlitros de
DMEM. Se utilizaron dos microgramos de ADN de
pIRES2-EGFP cuando no se incluyó ADN de receptor de
citoquina. Esta mezcla de transfección se añadió 30 minutos más
tarde a las células BHK previamente cultivadas en placa.
Veinticuatro horas más tarde las células transfectadas se separaron
de la placa utilizando tripsina-EDTA y se volvieron
a cultivar en placa a aproximadamente 25.000 células/pocillo en
placas de microtitulación de 96 pocillos. Aproximadamente 18 horas
antes de la estimulación del ligando, se cambió el medio por DMEM +
FBS al 0,5%.
Los análisis informadores de la transducción de
la señal se realizaron como sigue: Tras una incubación de 18 horas
a 37ºC en DMEM + FBS al 0,5%, se estimularon las células
transfectadas con diluciones (en DMEM + FBS al 0,5%) de ligandos
zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25. Tras una incubación
de 4 horas a 37 grados, las células se lisaron, y se midieron las
unidades de luz relativa (RLU) en un luminómetro tras la adición de
un sustrato de luciferasa. Los resultados obtenidos se muestran como
el aumento de inducción de las RLU de las muestras experimentales
sobre el control de medio solo (RLU de las muestras
experimentales/RLU de medio solo = aumento de inducción). La Tabla
21 muestra que zcyto20, zcyto21 y zcyto22 inducen la señalización
de ISRE en células BHK transfectadas con
ISRE-luciferasa y zcytoR19 de una manera dependiente
de la dosis. La adición de ADN de IL10Rb (CRF2-4) a
la mezcla de transfección da como resultado una inducción
semi-máxima de la señalización a una dosis de
citoquina 10-100 veces inferior. No se observó
respuesta con la transfección de ISRE solo. Estos resultados
muestran que la capacidad de zcyto20, zcyto21 y zcyto22 para
señalizar a través del elemento de respuesta estimulado por
interferón es intensificada mediante la expresión simultánea de
zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4) indicando que el
receptor para zcyto20, zcyto21 y zcyto22 es la combinación
heterodimérica de zcytoR19 e IL10Rb (CRF2-4).
Se prepara un vector de expresión para la
expresión del dominio extracelular, soluble del polipéptido
zcytor19, pC4zcytor19CEE, donde el constructo se diseña para
expresar un polipéptido zcytor19 formado por la metionina de inicio
pronosticada y truncada adyacente al dominio transmembrana
pronosticado, y con una etiqueta Glu-Glu
C-terminal (SEQ ID NO: 16).
Se crea un fragmento de ADN de zcytor19 que
comprende el dominio extracelular de zcytor19 o el dominio de unión
a citoquina de zcytor19 descrito en la presente memoria, utilizando
la PCR, y se purifica utilizando métodos normalizados. El ADN
escindido se subclona en un vector de expresión plasmídico que tiene
un péptido señal, p. ej., el péptido señal de zcytor19 nativo, y se
ancla a una etiqueta Glu-Glu (SEQ ID NO:16) en el
extremo C-terminal de la secuencia de
polinucleótidos que codifica el polipéptido zcytor19. Semejante
vector de expresión en mamífero contiene una casete de expresión
que tiene un promotor de mamífero, múltiples sitios de restricción
para la inserción de secuencias codificadoras, un codón de
terminación y terminador de mamífero. El plásmido también puede
tener un origen de replicación de E. coli, una unidad de
expresión de un marcador seleccionable de mamífero que tiene un
promotor, un intensificador y un origen de replicación de SV40, un
gen de DHFR y un terminador de SV40.
El inserto zcytor19 digerido con enzimas de
restricción y el vector digerido previamente se ligan utilizando
técnicas biológicas moleculares normalizadas, y se someten a
electroporación en células competentes tales como células DH10B
competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) de acuerdo con las
directrices del fabricante y se cultivan en placa sobre placas de
LB que contienen 50 mg/ml de ampicilina, y se incuban durante la
noche. Las colonias se escrutan mediante análisis de restricción
del ADN preparado a partir de las colonias individuales. La
secuencia del inserto de clones positivos se verifica mediante
análisis de secuencias. Se realiza una preparación de plásmido a
gran escala utilizando un kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante.
Se utiliza el mismo procedimiento para preparar
los receptores solubles de zcytor19 con una etiqueta his
C-terminal, compuesta por 6 restos de His en una
fila; y una etiqueta FLAG® C-terminal (SEQ ID
NO:42), zcytor19CFLAG. Para construir estos constructos, el vector
mencionado antes tiene la etiqueta C-HIS o FLAG® en
lugar de la etiqueta glu-glu (SEQ ID NO: 16).
Se preparó un vector de expresión,
zcytor19/Fc4/pzmp20, para expresar una versión soluble etiquetada
con Fc4 C-terminalmente de zcytor19
(zcytor19-Fc4 humano) en células BHK. Un fragmento
de ADNc de zcytor19 que incluye la secuencia de polinucleótidos del
dominio extracelular del receptor zcytor19 se fusionó en marco con
la secuencia de polinucleótidos Fc4 (SEQ ID NO:43) para generar una
fusión zcytor19-Fc4. El vector pzm20 es un vector
de expresión en mamífero que contiene la secuencia polinucleotídica
Fc4 y un sitio de clonación que permite la rápida construcción de
fusiones Fc4 C-terminales utilizando técnicas de
biología molecular normalizadas.
Se generó un fragmento de 630 pares de bases
mediante PCR, que contenía el dominio extracelular de zcytor19
humano con sitios BamHI y Bgl2 codificados en los extremos 5' y 3',
respectivamente. Este fragmento de PCR se generó utilizando los
cebadores ZC37967 (SEQ ID NO:44) y ZC37972 (SEQ ID NO:45) mediante
amplificación de una genoteca de ADNc de cerebro humano. Las
condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: 30 ciclos
de 94ºC durante 20 segundos, y 68ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a
68ºC durante 4 minutos; seguido de un enjuagado a 10ºC. El
fragmento fue digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y
Bgl2 y con posterioridad se purificó mediante electroforesis en gel
al 1% y purificación de las bandas utilizando el kit de extracción
en gel QiaQuick (Qiagen). El ADN purificado resultante se ligó
durante 5 horas a la temperatura ambiente en un vector pzmp20
digerido previamente con Bgl2 que contenía Fc4 3' de los sitios
Bgl2.
Se sometió a electroporación un \mul de la
mezcla de ligación en 37 \mul de E. coli DH10B
electrocompetentes (Gibco) de acuerdo con las directrices del
fabricante. Las células transformadas se diluyeron en 400 \mul de
medio LB y se cultivaron en placa sobre placas LB que contenían 100
\mug/ml de ampicilina. Los clones se analizaron mediante
productos digeridos con enzimas de restricción y los clones
positivos se llevaron a secuenciación del ADN para confirmar la
secuencia del constructo de fusión.
Se cultivaron en placa células BHK 570 (ATCC NO:
CRL-10314) en matraces para el cultivo de tejidos
T-75 y se dejó que crecieran hasta una confluencia
de aproximadamente 50 a 70% a 37ºC, CO_{2} al 5%, en medio
DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg,
Md.), suero bovino fetal al 5%, L-glutamina 1 mM
(JRH Biosciences, Lenea, Kans.), piruvato de sodio 1 mM (Gibco
BRL)). Después las células se transfectaron con el plásmido
zcytor19/Fc4/pzmp20 (Ejemplo 4B) utilizando Lipofectamine® (Gibco
BRL), en una formulación de medio sin suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml de
transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina,
L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%). Se
diluyeron 10 \mug del ADN plasmídico zcytor19/Fc4/pzmp20 (Ejemplo
4B) en un tubo de 15 ml hasta un volumen final de 500 \mul con
medio SF. Se mezclaron 50 \mul de Lipofectamine con 450 \mul de
medio SF. La mezcla de Lipofectamine se añadió a la mezcla de ADN y
se dejó incubando aproximadamente 30 minutos a la temperatura
ambiente. Se añadieron 4 ml de medio SF a la mezcla de
ADN:Lipofectamine. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de
medio SF, se aspiraron, y se añadió la mezcla de ADN:Lipofectamine.
Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, y después se
añadieron 5 ml de medio DMEM/FBS al 10%. El matraz se incubó a 37ºC
durante la noche momento después de lo cual las células se
dividieron en el medio de selección (medio DMEM/FBS de antes con la
adición de metotrexato 1 \muM (Sigma Chemical Co., St. Louis,
Mo.) en placas de 150 mm a 1:2, 1:10, y 1:50. Aproximadamente 10
días después de la transfección, se trató con tripsina una placa de
150 mm de colonias resistentes a metotrexato 1 \muM, las células
se reunieron, y se volvieron a cultivar en placa la mitad de las
células en metotrexato 10 \muM; para amplificar adicionalmente la
expresión de la proteína zcytor19/Fc4. Una muestra de medio
acondicionado de esta reserva de células amplificadas se sometió a
ensayo en cuanto a los niveles de expresión utilizando análisis
SDS-PAGE y Western.
También se pueden aislar clones individuales que
expresan los receptores solubles, escrutarlos y hacerlos crecer en
medio de cultivo celular, y purificarlos utilizando técnicas
normalizadas. Por otra parte, las células CHO también son adecuadas
para tales propósitos.
El receptor zcytor19 soluble es biotinilado por
reacción con un exceso molar de cinco veces de
sulfo-NHS-LC-Biotina
(Pierce, Inc., Rockford, Ill.) de acuerdo con el protocolo del
fabricante. El receptor zcytor19 soluble y otra subunidad del
receptor soluble, por ejemplo, los receptores de citoquina de clase
II solubles, por ejemplo, CRF2-4 (SEQ ID NO:40), se
marcan con un exceso molar de cinco veces
Ru-BPY-NHS (Igen, Inc.,
Gaithersburg, Md.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las
formas biotiniladas y marcadas con
Ru-BPY-NHS- del receptor zcytor19
soluble se pueden designar respectivamente receptor
Bio-zcytor19 y Ru-zcytor19; las
formas biotiniladas y marcadas con
Ru-BPY-NHS- de la otra subunidad del
receptor soluble se pueden designar de una manera similar. Los
análisis se llevan a cabo utilizando medio acondicionado o
utilizando ligandos purificados.
Para la caracterización de la unión al receptor
soluble inicial, se someten a ensayo las citoquinas mencionadas
antes, o el medio acondicionado, para determinar si pueden mediar en
la homodimerización del receptor zcytor19 y si pueden mediar en la
heterodimerización del receptor zcytor19 con las subunidades del
receptor soluble descritas antes. Para realizar esto, se combinan
50 \mul de medio acondicionado o TBS-B que
contiene citoquina purificada con 50 \mul de
TBS-B (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1 mg/ml de BSA, pH
7,2) que contiene p. ej., 400 ng/ml de receptor
Ru-zcytor19 y Bio-zcytor19, o 400
ng/ml de receptor Ru-zcytor19 y p. ej.,
Bio-CRF2-4, o 400 ng/ml de p. ej.,
Ru-CRF2-4 y
Bio-zcytor19. Tras la incubación durante una hora a
la temperatura ambiente, se añaden 30 \mug de cuentas magnéticas
de 2,8 mm recubiertas con estreptavidina (Dynal, Inc., Oslo, Norway)
y la reacción se incuba una hora más a la temperatura ambiente.
Después se añaden 200 \mul de tampón de análisis ORIGEN (Igen,
Inc., Gaithersburg, Md.) y se mide el grado de asociación del
receptor utilizando un analizador M8 ORIGEN (Igen, Inc.).
Se construye un vector que expresa un
heterodímero de zcytor19 humano secretado fusionando el dominio de
unión a citoquina extracelular de zcytor19 a la cadena pesada de la
IgG gamma 1 (IgG\gamma1), y la porción extracelular de la
subunidad del receptor de citoquina heterodimérico (p. ej.,
receptores de citoquina de clase II, por ejemplo,
CRF2-4) se fusiona con una cadena ligera kappa
humana (cadena ligera \kappa humana).
Se clona la cadena pesada de la IgG\gamma1 en
el vector de expresión de mamífero Zem229R (Núm. de depósito ATCC
69447) de manera que cualquier dominio extracelular del receptor de
citoquina deseado que tenga un sitio 5' EcoRI y 3' NheI pueda ser
clonado dando como resultado una fusión del dominio
extracelular-N-terminal-IgG\gamma1
C-terminal. El fragmento de IgG\gamma1 utilizado
en este constructo se elabora utilizando la PCR para aislar la
secuencia de IgG\gamma1 de una genoteca de ADNc de Hígado Fetal
humano de Clontech como molde. Los productos de la PCR se purifican
utilizando los métodos descritos en la presente memoria y se
digieren con MluI y EcoRI (Boehringer-Mannheim), se
precipitan con etanol y se ligan con oligos que comprenden un
conector MluI/EcoRI, en Zem229R previamente digerido con EcoRI
utilizando técnicas de biología molecular normalizadas descritas en
la presente memoria.
La cadena ligera \kappa humana se clona en el
vector de expresión de mamífero Zem228R (Núm. de depósito ATCC
69446) de manera que cualquier dominio extracelular del receptor de
citoquina deseado que tenga un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' KpnI
pueda ser clonado dando como resultado una fusión del dominio
extracelular de citoquina
N-terminal-cadena ligera \kappa
humana C-terminal. Puesto que un sitio KpnI está
localizado en la secuencia de la cadena ligera \kappa humana, se
diseña un cebador especial para clonar el extremo 3' del dominio
extracelular deseado de un receptor de citoquina en este sitio KpnI:
El cebador se diseña de manera que el producto de la PCR resultante
contiene el dominio extracelular del receptor de citoquina deseado
con un segmento de la cadena ligera \kappa humana por encima del
sitio KpnI. Este cebador comprende preferiblemente una porción de
al menos 10 nucleótidos del extremo 3' del dominio extracelular del
receptor de citoquina deseado fusionado en marco con la cadena
ligera kappa humana. El fragmento de la cadena ligera \kappa
humana utilizado en este constructo se elabora utilizando la PCR
para aislar la secuencia de la cadena ligera \kappa humana de la
misma genoteca de ADNc de Hígado Fetal humana de Clontech utilizada
antes. Los productos de la PCR se purifican utilizando los métodos
descritos en la presente memoria y se digieren con MluI y EcoRI
(Boehringer-Mannheim), se precipitan con etanol y
se ligan con el conector MluI/EcoRI descrito antes, en Zem228R
previamente digerido con EcoRI utilizando las técnicas normalizadas
descritas en la presente memoria.
Utilizando los vectores de construcción
anteriores, se elabora un constructo que tiene zcytor19 fusionado a
IgG\gamma1. Esta construcción se realiza sometiendo a PCR el
dominio extracelular o el dominio de unión a citoquina del receptor
zcytor19 descrito en la presente memoria a partir de una genoteca de
ADNc de próstata (Clontech) o una genoteca de ADNc de linfocitos
activados utilizando métodos normalizados, y oligos que proporcionan
los sitios de restricción EcoRI y NheI. El producto de la PCR
resultante se digiere con EcoRI y NheI, se purifica en gel, como se
describe en la presente memoria, y se liga en Zem229R/IgG\gamma1
previamente digerido con EcoRI y NheI y purificado en banda
descrito antes. El vector resultante se secuencia para confirmar que
la fusión zcytor19/IgG gamma 1 (zcytor19/Ch1 IgG) es correcta.
También se construye un constructo separado que
tiene una subunidad del receptor de citoquina, esto, es,
CRF2-4, dominio extracelular fusionado a la cadena
ligera \kappa como antes. La construcción de receptor de
citoquina/cadena ligera \kappa humana se realiza como antes
mediante PCR, p. ej., de una genoteca de ADNc de linfocitos
(Clontech) utilizando métodos normalizados, y oligos que
proporcionan sitios de restricción EcoRI y KpnI. El producto de la
PCR resultante se digiere con EcoRI y KpnI y después se liga este
producto en un vector Zem228R/cadena ligera \kappa humana
purificado en banda y previamente digerido con EcoRI y KpnI descrito
antes. El vector resultante se secuencia para confirmar que la
fusión de la subunidad del receptor de citoquina/cadena ligera
\kappa humana es correcta.
Aproximadamente 15 \mug de cada uno de los
vectores anteriores, son co-transfectados en células
de mamífero, p. ej., células BHK-570 (Núm. ATCC
CRL-10314) utilizando el reactivo LipofectaminePlus®
(Gibco/BRL), como en las instrucciones del fabricante. Las células
transfectadas se seleccionan durante 10 días en DMEM + FBS al 5%
(Gibco/BRL) que contiene 1 \muM de metotrexato (MTX) (Sigma, St.
Louis, Mo.) y 0,5 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) durante 10 días. La
reserva de transfectantes resultante se selecciona de nuevo en 10
\mum de MTX y 0,5 mg/ml de G418 durante 10 días.
La reserva resultante de células doblemente
seleccionadas se utiliza para generar proteína. Se utilizan tres
Factories (Nunc, Dinamarca) de esta reserva para generar 10 L de
medio acondicionado sin suero. Este medio acondicionado se hace
pasar sobre una columna de proteína A y se hace eluir en
aproximadamente 10 fracciones de 750 microlitros. Las fracciones
que tienen la concentración más alta de proteína se reúnen y se
someten a diálisis (corte de PM 10 kD) frente a PBS. Finalmente la
sustancia sometida a diálisis se somete a análisis de aminoácidos
(AAA) utilizando los métodos rutinarios.
Para identificar los componentes implicados en
el complejo señalizador de zcytor19, se realizan estudios de
reconstitución del receptor como sigue. Por ejemplo, las células BHK
570 (Núm. ATCC CRL-10314) transfectadas, utilizando
los métodos descritos en la presente memoria, con un plásmido vector
de expresión en mamífero con informador de luciferasa sirven como
línea celular de bioanálisis para medir la respuesta de transducción
de la señal de un complejo receptor zcytor19 transfectado al
informador de luciferasa en presencia del ligando zcytor19. Se
utilizarían las células BHK en el evento ya que las células BHK no
expresan endógenamente el receptor zcytor19. Se pueden utilizar
otras líneas celulares. Un vector de expresión de mamífero con
informador de luciferasa ilustrativo es el plásmido KZ134 que se
construye con oligonucleótidos complementarios que contienen los
elementos de unión al factor de transcripción STAT de 4 genes. Un
elemento inducible por Sis modificado con c-fos
(m67SIE, o hSIE) (Sadowski, H. et al., Science
261:1739-1744, 1993), el p21 SIE1 del gen p21 WAFI
(Chin, Y. et al., Science 272:719-722, 1996),
el elemento de respuesta de la glándula mamaria del gen de la
\beta-caseína (Schmitt-Ney, M.
et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991),
y un elemento inducible STAT del gen Fcg R1, (Seidel, H. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995).
Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles con
Asp718-XhoI y se ligan, utilizando métodos
normalizados, en un vector informador de luciferasa de luciérnaga
receptor con un promotor c-Fos (Poulsen, L. K. et
al., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998)
digerido con las mismas enzimas y que contiene un marcador
seleccionable de neomicina. Se utiliza el plásmido KZ134 para
transfectar establemente células BHK, o BaF3, utilizando métodos de
transfección y selección normalizados, para elaborar una línea
celular BHK/KZ134 o BaF3/KZ134 respectivamente.
La línea celular de bioanálisis se transfecta
con receptor zcytor19 solo, o se transfecta simultáneamente con
receptor zcytor19 junto con una de una variedad de otras subunidades
de receptores conocidas. Los complejos de receptores incluyen pero
no están limitados al receptor zcytor19 solamente, diversas
combinaciones de receptor zcytor19 con receptores de citoquina de
clase II, por ejemplo, los receptores de las cadenas alfa y beta del
interferón-gamma y las cadenas alfa y beta del
receptor del interferón alfa/beta, zcytor11 (Patente de los Estados
Unidos del mismo propietario Núm. 5.965.704),
CRF2-4, DIRS1, zcytor7 (Patente de los Estados
Unidos del mismo propietario Núm. 5.945.511). Cada línea celular
del complejo receptor independiente se analiza después en presencia
de medio acondicionado por citoquina o citoquinas purificadas y se
mide la actividad luciferasa utilizando los métodos rutinarios. La
línea celular de bioanálisis no transfectada sirve como control para
la actividad luciferasa del fondo, y de este modo se utiliza como
línea base para comparar la señalización por las diversas
combinaciones de complejos de receptores. Se espera que el medio
acondicionado o la citoquina que se une al receptor zcytor19 en
presencia del complejo de receptor correcto, proporcione una lectura
de luciferasa de aproximadamente 5 veces la del fondo o mayor.
Como alternativa, se puede realizar un análisis
similar donde una línea celular Baf3/zcytor19 es transfectada
simultáneamente como se describe en la presente memoria y se mide la
proliferación, utilizando un análisis conocido tal como un análisis
de proliferación Alamar Blue normalizado.
Se puede analizar la unión de los ligandos
(zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24, y zcyto25) a receptores
solubles utilizando un método de marcaje de cuentas con yodo. Por
ejemplo, se marca zcyto21-CEE marcado con I^{125}
(1,2\times10^{7} CPM/ml; 1,5 ng/\mul; y 8,6\times10^{6}
CPM/\mug).
Se combinan 50 nanogramos del
zcyto21-cEE marcado con I^{125} (Véase el Ejemplo
3) (399.600 CPM) con 1.000 ng de receptor homodimérico zcytor19/Fc4
frío, 1.000 ng de receptor heterodimérico
zcytor19/CRF2-4 frío, o 1.000 ng de un receptor de
citoquina de clase II/receptor Fc4 de control como control con
aproximadamente 10.000 ng de zcyto21 frío como competidor. Las
muestras se incuban durante 2 horas a 4ºC, después de lo cual se
añaden a cada muestra 30 \mul de proteína G (Zymed San Francisco,
Ca.). Las muestras se incuban durante 1 hora a 4ºC, y se lavan 3
veces con PBS. Se mide la radiactividad de la proteína G lavada en
un contador gamma (Packard Instruments, Downers Grove, Ill.).
Se aislaron leucocitos de sangre periférica
(PBL) mediante separación en Ficoll Hypaque (Amersham, Suecia) de
sangre humana heparinizada. Los PBL se cultivaron a 37ºC en medio
normalizado a una densidad de 1\times10^{6} células por
mililitro en placas para el cultivo de tejidos de 6 pocillos. Tras
incubar durante la noche, se recogieron los PBL y se tiñeron con
zcyto20-cee biotinilado y
zcyto21-cee (Véase el Ejemplo 18) a una
concentración de 10 \mug/ml. La tinción se detectó con
estreptavidina marcada con Ficoeritrina (Pharmingen, Ca., USA) que
se había preparado a una dilución de 1:1.000. Tras la tinción los
PBL se fijaron en Paraformaldehído al 2%, y se leyeron en un
Facscaliber (Becton Dickinson, San Diego, Ca.). Los datos se
analizaron utilizando el soporte lógico Cellquest (Becton
Dickinson). Los resultados indican que tanto
zcyto20-cee biotinilado como
zcyto21-cee tiñen las células de la ventana mieloide
de los leucocitos de sangre periférica. Las células de la ventana
linfoide no se unen a zcyto20-cee y
zcyto21-cee.
Se aislaron leucocitos de sangre periférica
(PBL) mediante separación en Ficoll Hypaque de sangre humana
heparinizada. Después los PBL se estimularon con controles de
proteína purificada o medios de los siguientes: 1)
zcyto21-CEE (2 \mug/ml); 2)
zcyto21-cee (1 \mug/ml); 3) Medio solo; 4)
proteína de control negativo A141F (2 \mug/ml); o 5)
IFN-alfa-A (1 ng/ml) (PBL Biomedical
N.J., USA.). Los PBL estimulados se incubaron a una densidad celular
de 1\times10^{6} células por mililitro a 37ºC con CO_{2} al
5%. Los cultivos se cosecharon a las 24 y 48 horas y se tiñeron
para los marcadores de activación.
Los PBL se lavaron con PBS y después se
bloquearon con IgG de ratón normal en tampón Facs (HBSS + suero de
cabra normal, BSA al 2%, NaN3 al 0,2%), seguido de tinción con
anticuerpos para los siguientes marcadores: CD19, CD14, CD3,
HLA-DR, CD54, HLA-ABC (Pharmingen,
Ca., USA e Immunotech, France). Las células se lavaron y después se
fijaron en Paraformaldehído al 2% antes de ser analizado en un
Facscaliber (Becton Dickinson, Ca., USA). Los datos resultantes se
analizaron utilizando el soporte lógico Cellquest (Becton Dickinson,
Ca., USA).
Los resultados indicaron un incremento en la
expresión de CD54 de superficie (ICAM) sobre los monocitos a las 24
y 48 horas con estimulación con zcyto21-cee, en
comparación con el medio de control solo. La estimulación con
zcyto21-cee también dio como resultado un incremento
de la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad I sobre
células B a las 24 horas y un incremento en el MHCI tanto en células
B como en Monocitos a las 48 horas.
Se biotinilaron zcyto21CEE siguiendo un
protocolo modificado por Pierce Chemical Company para
sulfo-NHS-LC-Biotina.
Se añadieron 250 microgramos de zcyto21CEE (en 0,5 ml de PBS) a 8,4
\mul de solución de partida de
S-NHS-biotina (84 \mug), y se
incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas con balanceo.
Tras la etapa de incubación, se añadieron 20 \mul de Tris HCl 2M
(pH 8), y la mezcla se incubó durante 20 minutos a la temperatura
ambiente con balanceo. Las mezclas de ligando biotinilado se
almacenaron después a 4ºC. Se prepararon zcyto20CEE, zcyto22CEE y
zcyto24CEE esencialmente de la misma manera.
Se sondearon transferencias Northern para
determinar la distribución en los tejidos de zcytor19. Se obtuvo un
fragmento de ADNc de zcytor19 humano utilizando la PCR con cebadores
específicos del gen, 5' ZC40285 como se muestra en el SEQ ID NO:
21; y 3' ZC 40286, como se muestra en el SEQ ID NO: 22. El molde fue
ADNc de zcytor19 humano clonado (SEQ ID NO: 23). El fragmento de la
PCR fue purificado en gel, y se marcaron \sim25 ng con
\alpha-dCTP-P^{32} utilizando el
kit de marcaje por cebado al azar Prime-It® RmT
(Stratagene, LaJolla, Ca.).
Las siguientes transferencias Northern
(Clontech, Palo Alto, Ca.) se sondearon en cuanto a la expresión del
ARNm de zcytor19: (1) una transferencia C de una línea celular de
cáncer humana, que contiene muestras de ARN de cada una de las
siguientes líneas celulares de cáncer: leucemia promielocítica
HL-60, HELA S3, leucemia mielógena crónica
k-562, leucemia linfoblástica
MOLT-4, linfoma de Burkitt RAJI, adenocarcinoma
colorrectal SW480, carcinoma de pulmón A549, y melanoma
G-361; (2) una transferencia H de MTN humano, que
contiene ARNm de los siguientes tejidos: corazón, cerebro completo,
placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, y páncreas;
(3) un H3 de MTN humano que contiene ARNm de los siguientes tejidos:
estómago, tiroides, médula espinal, nódulo linfático, tráquea,
glándula suprarrenal, y médula ósea; y (4) un H4 de MTN humano, que
contiene ARNm de los siguientes tejidos: bazo, timo, próstata,
testículo, útero, intestino delgado, colon, y leucocitos de sangre
periférica. Todas las hibridaciones se realizaron en ULTRAhyb®
Ultrasensitive Hybridization Buffer (Ambion, Austin, Tex.) de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con la excepción de
que se añadieron 0,2 mg/ml de ADN de esperma de salmón adicionales
a la hibridación y tampones de prehibridación para disminuir la
hibridación no específica. Tras la hibridación, se separó la señal
radiactiva no específica tratando las transferencias con
0,1\timesSSC/SDS al 0,5% a 50ºC. Las transferencias se expusieron
utilizando BioMax MR Film y pantallas intensificadoras (Eastman
Kodak, Rochester, N.Y.), según las recomendaciones del fabricante
durante 3 días.
La expresión de un transcrito de \sim4,5 kb
fue máxima en corazón, músculo esquelético, páncreas y tejido de
próstata, además de en la línea celular de linfoma de Burkitt
(RAJI). Se observaron niveles inferiores en otros múltiples
tejidos. Además, hubo un transcrito de \sim2 kb que fue
generalmente menos abundante que el transcrito más grande, pero
también presente en muchos de los tejidos y líneas celulares. El
tejido testicular, además de tener los transcritos de 2 y 4,5 kb,
también puede tener transcritos de \sim4 kb y 1,4 kb. La glándula
suprarrenal demostró niveles de expresión iguales de los
transcritos de 4,5 kb y 2 kb.
Se aislaron tejidos humanos específicos y se
escrutaron en cuanto a la expresión de zcytor19 mediante hibridación
in situ. Los diversos tejidos humanos preparados,
seccionados y sometidos a hibridación in situ incluyeron
colon normal y con carcinoma, carcinoma cervical, carcinoma
endometrial, ovario normal y con carcinoma, piel normal y
neoplásica, hígado fetal, pulmón, corazón y MFH (sarcoma de
músculo). Los tejidos se fijaron en formalina tamponada al 10% y se
bloquearon en parafina utilizando técnicas normalizadas. Los tejidos
se seccionaron de 4 a 8 micras. Los tejidos se prepararon
utilizando un protocolo normalizado. Brevemente, se desparafinaron
las secciones de tejido con Histo-Clear® (National
Diagnostics, Atlanta, Ga.) y después se deshidrataron con etanol. A
continuación se digirieron con Proteinasa K (50 \mug/ml)
(Boehringer Diagnostics, Indianapolis, Ind.) a 37ºC durante 2 a 7
minutos. Esta etapa estuvo seguida de acetilación y
re-hidratación de los tejidos.
Se diseñó una sonda in situ contra la
secuencia de zcytor19 humano (variante x1) (INC7128744, como se
muestra en el SEQ ID NO: 25), que contenía la UTR3' de zcytor19
utilizando métodos normalizados. Se utilizó la ARN polimerasa de T7
para generar una sonda antisentido. La sonda se marcó utilizando un
Sistema de Transcripción In Vitro (Riboprobe® in
vitro Transcription System, Promega, Madison, Wis.) siguiendo
las instrucciones del fabricante, excepto que se utilizó
digoxigenina para la sonda en lugar de rCTP radiomarcado y que se
ajustó el agua para acomodar el volumen reducido de los rNTP. La
hibridación in situ se realizó con una sonda de zcytor19
marcada con digoxigenina (arriba). Se añadió la sonda a los portas a
una concentración de 1 a 5 pmoles/ml durante 12 a 16 horas a 60ºC.
Los portas se lavaron con posterioridad en 2\timesSSC y
0,1\timesSSC a 55ºC. Las señales se amplificaron utilizando TSA®
(Tyramide Signal Amplification; PerkinElmer Life Sciences Inc.,
Boston, Mass.) y se visualizaron con un kit de sustrato VECTOR Red
(Vector Laboratories, Burlingame, Ca.) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Los portas se contratiñeron después con
hematoxilina.
Se observaron señales en diversos tejidos
sometidos a ensayo: En tejidos de carcinoma de colon, se observó
una señal débil en las células del carcinoma y algunas
infiltraciones inmunitarias. Sin embargo, no se observó señal
positiva en colon e intestino normal, incluyendo las células de la
lámina propia, el epitelio, los nódulos inmunitarios y las células
nerviosas de los ganglios periféricos. En tejidos de carcinoma
cervical, hay una señal débil en las células del carcinoma y
algunas células de los nódulos inmunitarios. En tejidos de carcinoma
endometrial, se presentan señales débiles en las células del
carcinoma. En tejidos de útero normal, no se observó señal
positiva. En muestras de carcinoma de ovario, algunas células del
carcinoma eran débilmente positivas. En muestras de ovario normal,
una parte del endotelio de los capilares y del epitelio de los
folículos grandes pueden ser débilmente positivos. En la muestra de
carcinoma de piel, el epitelio granular canceroso es fuertemente
positivo, mientras no se observa señal positiva en la piel normal.
En hígado fetal, se observa señal en una población mixta de células
mononucleares en espacios sinusoides. En pulmón, zcytor19 parece ser
positivo en el epitelio alveolar de tipo II. Ocasionalmente el
epitelio bronquial también puede ser débilmente positivo. Las
células mononucleares de tipo macrófago del tejido intersticial
también son positivas. En corazón, los miocitos son negativos
mientras algunas células mononucleares circulantes son positivas
para zcytor19. En una de las muestras, el endotelio de los vasos
puede ser débilmente positivo. Otros tejidos sometidos a ensayo
incluyeron una muestra de MFH (sarcoma muscular) y una muestra de
piel con sarcoma de Kaposi. No existe una señal positiva
concluyente en estos tejidos.
Se examinó la expresión de zcytor19 utilizando
el análisis de RT-PCR de los siguientes tipos de
células: Hela, 293, Daudi, CD14+, U937, y
HL-60.
Se llevó a cabo la síntesis de la primera hebra
del ADNc a partir del ARN total utilizando un sistema de síntesis
de la primera hebra disponible en el mercado para
RT-PCR (Invitrogen life technologies, Carlsbad,
Ca.). Las reacciones de PCR posteriores se ajustaron utilizando los
cebadores oligo específicos de zcytor19\times1 (SEQ ID NO:23) y
zcytor19\times2 (SEQ ID NO:28) ZC40288 (SEQ ID NO:58) y ZC40291
(SEQ ID NO:59) lo que proporcionó un producto de 806 pb y uno de
892 pb, respectivamente, Tampón y ADN Polimerasa HotStarTaq Qiagen,
(Qiagen, Inc., Valencia, Ca.), GeneAmp dNTPs (Applied Biosystems,
Foster City, Ca.), colorante RediLoad^{TM} (Research
Genetics, Inc., Huntville, Ala.) y 2 \mul de ADNc de primera hebra
(10% de la reacción de la primera hebra) de los respectivos tipos
de células. Las condiciones del ciclo de la PCR fueron las
siguientes: un ciclo inicial de 15 minutos de desnaturalización a
95ºC, 35 ciclos de 45 segundos de desnaturalización a 94ºC, 1
minuto de recocido a 63ºC y 1 minuto y 15 segundos de extensión a
72ºC, seguido de un ciclo final de extensión de 7 minutos a 72ºC.
Las reacciones se separaron mediante electroforesis sobre un gel de
agarosa al 2% (EM Science, Gibbstown, N.J.) y se visualizaron
mediante tinción con bromuro de etidio.
Se observaron bandas del tamaño correcto en
Hela\pmIFN-beta (solamente la banda de 892 pb),
293+Parental Adv, Daudi\pmIFN-beta,
Daudi\pmIFN-alfa, CD14+ activadas,
HL-60 activadas. No se observó ninguna banda en
CD14+ en reposo, U937 en reposo y activadas, y HL-60
en reposo. Estos resultados muestran la inducción de la expresión
de zcytoR19 tras la activación o diferenciación de monocitos o
líneas celulares monocíticas.
Se sometió a ensayo la capacidad de zcyto20,
zcyto21, zcyto22, zcyto24 y zcyto25 para señalizar a través de la
ruta de transducción de la señal de NF kappa beta utilizando una
línea celular informadora de monocitos/macrófagos de ratón. Esta
línea celular se generó mediante transducción de células RAW264.7
con el informador retroviral KZ170 que contenía elementos de
respuesta a NF kappa beta que conducían la transcripción de un gen
informador de luciferasa.
Los análisis informadores iniciales que sometían
a ensayo la actividad de zcyto20, zcyto21, zcyto22, zcyto24 y
zcyto25 se realizaron utilizando el medio acondicionado transfectado
transitoriamente para 293 descrito para su uso en los análisis
antivirales. Se recogieron las células RAW264.7/KZ170 y se
cultivaron en placa a una densidad de 50.000 células por pocillo en
placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante la noche a
37ºC en RPMI+FBS al 10%. Al día siguiente, se separó el medio de las
células adherentes y se añadieron a las células medio acondicionado
con zcyto20-25 no diluido o diluciones de medio
acondicionado con zcyto20-25 (diluido en RPMI+BSA
al 0,1%). Tras una incubación de 5 horas a 37ºC, las células se
lisaron, y se leyeron en un luminómetro, tras la adición de un
sustrato de luciferasa. Los resultados se analizaron comparando las
unidades de luz relativa (RLU) del medio acondicionado con
zcyto20-25 con respecto a las unidades de luz
relativa del medio acondicionado con células no transfectadas. El
medio acondicionado con zcyto20-25 no diluido indujo
una expresión de luciferasa 4-9 veces superior que
el medio acondicionado con células no transfectadas no diluido.
Estos resultados indican que zcyto20-25 son capaces
de señalizar por medio de la ruta de señalización de NF kappa beta
en una línea celular de monocitos/macrófagos de ratón.
Como seguimiento, se utilizaron medios
acondicionados de células Sf9 infectadas con baculovirus que
expresaban zcyto20, zcyto21 o zcyto22 en los análisis informadores.
Se utilizó baculovirus de tipo salvaje como control negativo. La
producción de los constructos de baculovirus y de medio
acondicionado se describió más arriba.
Los resultados del análisis informador de NFkb
con RAW264.7 utilizando medio acondicionado derivado de baculovirus
fueron similares a aquellos que utilizan medio acondicionado
transfectado transitoriamente para 293. El medio acondicionado
derivado de baculovirus que contenía zcyto20-22
indujo la expresión de la luciferasa de una manera dependiente de
la dosis, mientras el correspondiente medio acondicionado de control
no lo hizo.
Se compararon la toxicidad y la actividad
biológica de zcyto24 con otra citoquina de Clase II, y un vector de
adenovirus parental, así como en ratones sin inyección. Se
inyectaron cuatro grupos de 8 ratones C57B16 (hembras, 9 semanas de
edad) como sigue:
Grupo 1: Inyectados con Adzcyto24 a
1\times10^{11} partículas por ratón:
Grupo 2: Inyectados con una citoquina de Clase
II (Adzcyto) a 1\times10^{11} partículas;
Grupo 3: Vector de adenovirus parental (Adzpar)
a 1\times10^{11} partículas; y
Grupo 4: No tratado
Se colocaron traspondedores de temperatura sobre
los ratones el Día 1, y se inyectó el virus el Día 0. Se
controlaron la ingesta de alimento por jaula y el peso corporal cada
5 Días, se tomaron muestras de sangre el Día 10 (0,25 ml máx.) para
análisis que incluyeron analizadores de sangre CBC y Abbot. Todos
los ratones se sacrificaron el Día 20.
Se tomaron muestras de sangre de los ratones
tratados con Adzcyto24 (Grupo 1) el Día 10 y los sueros se
sometieron a ensayo en cuanto a la presencia de bioactividad de
zcyto24. Una análisis viral demostró una actividad antiviral
significativa a una dilución máxima de 1:500 para todos y cada uno
de los ratones del grupo con Adzcyto24. Esto corresponde a
aproximadamente 160 ng/ml de zcyto24CEE purificado. En un análisis
antiviral para detectar interferones de ratón no se detectó
actividad en el grupo con Adzcyto24. En un bioanálisis utilizando un
informador con un ISRE también se detectó una actividad de zcyto24
significativa en el suero de los ratones a los que se había
inyectado Adzcyto24 pero no en los otros grupos.
Las sondas de temperatura revelaron que la
temperatura corporal media para el Grupo 2 disminuía más de 5 grados
C el Día 10 mientras la temperatura media para el grupo con
Adzcyto24 (Grupo 1) había disminuido más de 2 grados C. Los grupos
de control presentaron un cambio de temperatura de menos de 1 grado
a lo largo de todo el experimento.
Los ratones con Adzcyto24 (Grupo 1) presentaron
un ligero incremento de peso durante el experimento de 20 Días,
equivalente a los grupos de control (Grupos 3 y 4). Pérdida de peso
de los ratones del Grupo 2: El peso medio para el Grupo 2 disminuyó
\sim8% el Día 10.
El análisis del analizador de sangre de Abbot de
la sangre obtenida el Día 10 y el Día 20 reveló cambios
significativos en los recuentos de leucocitos en los Grupos 1 y 2.
La Fig. 1 muestra un aumento pronunciado en los recuentos de
monocitos en ratones tratados con Adzcyto24 con respecto a los otros
grupos. Los recuentos de monocitos son 2,77 veces superiores en
ratones a los que se ha inyectado Adzcyto24 frente a ratones a los
que se ha inyectado vector parental (Adzpar). El Día 20 los
recuentos de monocitos disminuyeron algo, pero todavía eran
significativamente elevados con respecto a los ratones a los que se
había inyectado el vector parental. La Fig. 2 muestra que la
inyección con adenovirus que codifica una citoquina de Clase II
(Adzcyto) pero no con un adenovirus que codifica zcyto24 conduce a
un incremento del recuento de neutrófilos el Día 10.
Para verificar la identidad de los tipos de
células detectados por el analizador de sangre de Abbot, se realizó
una citometría de flujo con MAbs de linaje específico en la sangre
del Día 20 del experimento. La Fig. 3 muestra el % de células CD11b
positivas, esto es, los monocitos de la sangre periférica de cada
ratón. Trazando los valores medios para cada grupo, la Fig. 4
revela un incremento significativo en el porcentaje de monocitos en
el grupo que ha sido inyectado con adenovirus infectado con Zycyto24
frente al grupo infectado con el vector parental (p=0,05). Esto se
corresponde con los cambios observados previamente con el analizador
de sangre de Abbot.
El análisis de las mismas muestras de sangre con
un MAb específico para granulocitos (GR-1) no reveló
un incremento significativo en el porcentaje de granulocitos (esto
es, principalmente neutrófilos) para los ratones que habían sido
inyectados con Adzcyto24. Los PBL también se tiñeron con MAb
específicos para células B (B220) y no se observaron diferencias
significativas en los ratones que habían sido inyectados con
Adzcyto24 con respecto a los otros grupos.
Notablemente los resfriados y la pérdida de peso
asociados con la inyección de Adzcyto no eran evidentes con
Adzcyto24. La aparente elevación de los monocitos detectada por el
analizador de sangre de Abbot los Días 10 y 20 se confirmó mediante
citometría de flujo de la sangre del Día 20 con Mab específicos del
linaje. Un claro incremento del porcentaje de monocitos en los PBL
de ratones a los que se había inyectado Adzcyto24 parece ser la
única actividad mediada directa o indirectamente por zcyto24 en el
contexto de una infección adenoviral. Es probable que zcyto24
expresado a niveles significativos en los ratones que habían sido
inyectados con Adzcyto24 promueva una respuesta antiviral o bien
reclutando y movilizando los monocitos de los tejidos periféricos o
bien estimulando la producción de monocitos desde las células
progenitoras de la médula ósea o el hígado. Esta evidencia sugiere
que los monocitos/macrófagos son activados por zcyto24 y
zcyto21.
<110> ZymoGenetics, Inc.
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<120> PROTEÍNA CITOQUINA ZCYTO20
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<130> 01-17PC
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<150> US 60/285.408
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<151>
2001-04-20
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<150> 115 60/286,482
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<151>
2001-04-25
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<150> US 60/341.050
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<151>
2001-10-22
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<150> US 60/341,105
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<151>
2001-10-22
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<150> US 09/895,834
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<151>
2001-06-29
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<150> US 60/285,424
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<151>
2001-04-20
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<160> 59
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 618
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<212> ADN
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<220>
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<211> 615
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> secuencia degenerada
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<221> rasgo_misc
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<223> n = A.T.C o G
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<211> 674
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<212> ADN
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<212> ADN
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<210> 33
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<212> ADN
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<223> cebador oligonucleotídico
ZC40213
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> cebador oligonucleotídico
ZC39295
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm76
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39298
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm77
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC40632
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm78
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC40633
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm79
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC40638
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm80
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC40639
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm81
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1013
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(991)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> etiqueta péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 699
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC37967
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm89
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC37972
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm90
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia degenerada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgo_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(615)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39339
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm92
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39393
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm93
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39340
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm94
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39341
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm95
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39295
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm96
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39298
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39687
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm98
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39741
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm99
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39732
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39701
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC39688
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC40288
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm103
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
ZC40291
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm104
Claims (26)
1. Un polipéptido aislado que tiene una
identidad de al menos 80% con un polipéptido seleccionado del grupo
que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y
(d) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202.
2. El polipéptido aislado de la Reivindicación
1, donde dicho polipéptido se une específicamente a un receptor
como se muestra en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29 en forma de un
receptor monomérico u homodimérico, o en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29
combinados con el SEQ ID NO: 41 en forma de un receptor
heterodimérico.
3. Un polipéptido aislado que tiene una
identidad de al menos 95% con un polipéptido seleccionado del grupo
que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y
(d) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202.
4. El polipéptido aislado de la Reivindicación
3, donde dicho polipéptido se une específicamente a un receptor
como se muestra en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29 en forma de un
receptor monomérico u homodimérico, o en los SEQ ID NO: 24, 27 o 29
combinados con el SEQ ID NO: 41 en forma de un receptor
heterodimérico.
5. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde
el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en
el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido
205.
6. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde
el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en
el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido
205.
7. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde
el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en
el SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido
202.
8. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde
el resto aminoácido 29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en
el SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido
202.
9. Un polipéptido aislado que es tiene al menos
14 aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido
22 al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 2
desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, donde dicho
polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.
10. Un polipéptido aislado que tiene al menos 14
aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 22
al resto aminoácido 205 o como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde
el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 205, donde dicho
polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.
11. Un polipéptido aislado que tiene al menos 14
aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 9 desde el resto aminoácido 29
al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde
el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202, donde dicho
polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.
12. Un polipéptido aislado que tiene al menos 14
aminoácidos contiguos del SEQ ID NO: 11 desde el resto aminoácido
29 al resto aminoácido 202 o como se muestra en el SEQ ID NO: 11
desde el resto aminoácido 1 al resto aminoácido 202, donde dicho
polipéptido estimula una respuesta antigénica en un mamífero.
13. Una composición farmacéutica que comprende
una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2
desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se
muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto aminoácido 1 al resto
aminoácido 205, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Una composición farmacéutica que comprende
una secuencia de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7
desde el resto aminoácido 22 al resto aminoácido 205 o como se
muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto aminoácido 1 al resto
aminoácido 205, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Una proteína de fusión que comprende al
menos dos polipéptidos, donde al menos uno de los polipéptidos
comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y
(d) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202.
16. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido, donde el polipéptido codificado tiene una identidad de
al menos 80% con una secuencia de aminoácidos que comprende los
aminoácidos 22-205 del SEQ ID NO: 2.
17. Un polipéptido aislado que codifica un
polipéptido, donde el polipéptido codificado tiene una identidad de
al menos 80% con una secuencia de aminoácidos que comprende los
aminoácidos 22-205 del SEQ ID NO: 7.
18. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 2 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(b) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 7 desde el resto
aminoácido 22 al resto aminoácido 205;
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 9 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202; y
(d) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en el SEQ ID NO: 11 desde el resto
aminoácido 29 al resto aminoácido 202.
19. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 1 desde
el nucleótido 64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID
NO: 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 618.
20. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 6 desde
el nucleótido 64 al nucleótido 618 o como se muestra en el SEQ ID
NO: 6 desde el nucleótido 1 al nucleótido 618.
21. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 8 desde
el nucleótido 67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID
NO: 1 desde el nucleótido 1 al nucleótido 606.
22. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos como se muestra en el SEQ ID NO: 10 desde
el nucleótido 67 al nucleótido 606 o como se muestra en el SEQ ID
NO: 10 desde el nucleótido 1 al nucleótido 606.
23. Un vector de expresión, que comprende la
molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las
Reivindicaciones 19-22, un promotor de la
transcripción, y un terminador de la transcripción, donde el
promotor está conectado operablemente con la molécula de ácido
nucleico, y donde la molécula de ácido nucleico está conectada
operablemente con el terminador de la transcripción.
24. Una célula anfitriona recombinante que
comprende el vector de expresión de la Reivindicación 23, donde la
célula anfitriona se selecciona del grupo que consiste en bacterias,
células de levadura, células fúngicas, células de insecto, células
de mamífero, y células vegetales.
25. Un método de producción de un polipéptido,
comprendiendo el método la etapa de cultivar células anfitrionas
recombinantes que comprenden el vector de expresión de la
Reivindicación 23, y que producen el polipéptido y aislar el
polipéptido de las células anfitrionas cultivadas.
26. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que
se une específicamente con un polipéptido de acuerdo con cualquiera
de las Reivindicaciones 9-12.
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