PT2251353E - Preparações homogéneas de il-28 e il-29 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PREPARAÇÕES HOMOGÉNEAS DE IL-29"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As citocinas desempenham papéis importantes na regulação da hematopoiese e respostas imunes, e podem influenciar o desenvolvimento dos linfócitos. A familia de citocinas humanas de classe II inclui subtipos de interferão-α (IFN-a), interferão-β (IFN-β), interferão-Y (IFN-Y), IL-10, IL-19 (Patente U.S. 5 985 614), MDA-7 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-20 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-22 (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)), e AK-155 (Knappe et al., J. Virol. 74, 3881-3887, (2000)). A maioria das citocinas liga-se e transduz sinais através de recetores de citocina de Classe I ou de Classe II. Os membros da familia de recetores de citocina humana de classe II incluem interferão-aRl (IFN-aRl), interferão-y-R2 (IFN-Y-R2), interferão-Y RI (IFN-y Rl) , interferão-yR2 (IFN-YR2), IL-10R (Liu et al., J. Immunol. 152, 1821-1829, (1994)), CRF2-4 (Lutfalla et al. Genomics 16, 366-373, (1993)), IL-20RP (Blumberg et al., Cell 104, 9-19, (2001)) (também conhecido como zcytor7 (Patente U.S. 5 945 511) e CRF2-8 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2557-2565, (2000)), Ι10-20Ββ (Blumberg et al., ibid, (2001)) (também conhecido como DIRS1 (documento PCT WO 99/46379)), IL-22RA1 (IL-22 recetor-αΐ, submetido a HUGO para aprovação) (também conhecido como IL-22R (Xie et al., J. Biol, Chem. 275, 31335-31339, (2000)), zcytorll (Patente U.S. 5 965 704) e CRF2-9 (Kotenko et al., Oncogene 19, 2557-2565, (2000)), e fator de tecido.

Os recetores de citocina de Classe II são tipicamente heterodimeros compostos por duas cadeias de recetor distintas, as subunidades do recetor α e β (Stahl et al., 2

Cell 74, 587-590, (1993)). Em geral, as subunidades <x são as proteínas de ligação à citocina primárias, e as subunidades β são necessárias para a formação de locais de ligação com elevada afinidade, bem como para a transdução do sinal. Uma exceção é o recetor IL-20 no gual ambas subunidades são necessárias para a ligação de IL-20 (Blumberg et al., ibid, (2001)).

Os recetores de citocina de classe II são identificados por um domínio de ligação à citocina conservado de cerca de 200 aminoácidos (D200) na porção extracelular do recetor. Este domínio de ligação à citocina é composto por dois domínios de fibronectina tipo III (FnlII) de, aproximadamente, 100 aminoácidos cada (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 6934-6938, (1990); Thoreau et al., FEBS Lett. 282, 16-31, (1991)). Cada domínio FnlII contém resíduos de Cys, Pro, e Trp conservados que determinam um padrão de dobragem característico de sete cadeias β semelhantes ao domínio constante das imunoglobulinas (Uze et al., J. Interferon Cytokine Res. 15, 3-26, (1995)). Os elementos estruturais conservados da família de recetores de citocina de classe II tornaram possível identificar novos membros desta família com base na homologia da sequência de aminoácidos primária.

As interleucinas são uma família de citocinas que medeiam respostas imunológicas, incluindo inflamação. Central a uma resposta imune é a célula T, que produz muitas citocinas e imunidade adaptiva a antígenos. As citocinas produzidas pela célula T foram classificadas como tipo 1 e tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). As citocinas de tipo 1 incluem IL-2, interferão-gama (IFN-y), LT-oí, e estão envolvidas em respostas inflamatórias, imunidade virai, imunidade parasitária intracelular e rejeição de aloenxertos. As citocinas tipo 2 incluem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, e estão envolvidas 3 em respostas humorais, imunidade a helmintes e resposta alérgica. As citocinas partilhadas entre tipo 1 e 2 incluem IL-3, GM-CSF e TNF-α. Existe alguma evidência que sugere que o tipo 1 e o tipo 2 que produzem populações de células T migram preferencialmente para diferentes tipos de tecido inflamado.

De particular interesse, do ponto de vista terapêutico, são os interferões (para uma revisão sobre os interferões ver De Maeyer e De Maeyer-Guignard, "Interferons," no The Citocina Handbook, 3a Edição, Thompson (editor), páginas 491-516 (Academic Press Ltd. 1998), e Walsh, Biofarmacêuticos. Biochemistry and Biotechnology, páginas 158-188 (John Wiley & Sons 1998)). Os interferões exibem uma variedade de atividades biológicas, e são úteis para o tratamento de certas doenças autoimunes, cancros particulares, e a intensificação da resposta imune contra agentes infeciosos, incluindo virus, bactérias, fungos, e protozoários. Até à data, foram identificadas seis formas de interferão, que foram classificadas em dois grupos principais. Os chamados IFNs de "tipo I" incluem IFN-a, TFN-β, IFN-ω, IFN-δ, e interferão-i. Atualmente, IFN-v e uma subclasse de IFN-a são os únicos IFNs de tipo II.

Os IFNs de tipo I, que se pensa serem derivados do mesmo gene ancestral, reteram estrutura semelhante suficiente para atuarem pelo mesmo recetor de superfície celular. A cadeia α do recetor humano IFN-α/β compreende um dominio N-terminal extracelular, que tem as caracteristicas de um recetor de citocina de classe II. 0 IFN-y não partilha homologia significativa com o IFN de tipo I ou com o subtipo IFN-α de tipo II, mas partilha um número de atividades biológicas com o IFN de tipo I.

Os clinicos estão a tirar partido das múltiplas atividades dos interferões utilizando as proteínas para tratar uma ampla variedade de condições patológicas. Por 4 exemplo, uma forma de IFN-α foi aprovada para utilização em mais de 50 países para o tratamento de condições médicas tais como tricoleucemia, carcinoma de células renais, carcinoma basocelular, melanoma maligno, sarcoma de Kaposi relacionado com SIDA, mieloma múltiplo, leucemia mielógena crónica, linfoma de não Hodgkin, papilomatose laríngica, micose fungoide, verrugas genitais, hepatite crónica B, hepatite C, hepatite crónica D, e hepatite crónica não A, não B/C. A Administração de Alimentos e Fármacos dos Estados Unidos aprovou a utilização de IFN-β para tratar esclerose múltipla, uma doença crónica do sistema nervoso. O IFN-y é utilizado para tratar doenças granulomatosas crónicas, nas quais o interferão potência a resposta imune do paciente no sentido de destruir patógenos bacterianos, fúngicos e protozoários infeciosos. Estudos clínicos também indicam que o IFN-y pode ser útil no tratamento de SIDA, leishemaniose, e lepra lepromatosa.

As IL-28A, IL-28B, e IL-29 compreendem uma nova família de proteínas recentemente descoberta que tem uma homologia de sequência com os interferões de tipo I e homologia genómica com o IL-10. Esta nova família é descrita na sua totalidade no pedido co-detido PCT WO 02/086087 e Sheppard et al., Nature Immunol. 4:63-68, 2003. Funcionalmente, a IL-28 e IL-29 assemelham-se a INFs de tipo I na sua capacidade de induzir um estado antiviral nas células mas, ao contrário dos IFNs de tipo I, não exibem atividade anti-proliferativa contra certas linhas celulares B. A IL-28 e IL-29 são conhecidas por ter um número estranho de cisteínas (pedido PCT WO 02/086087 e Sheppard et al., supra.) A expressão da IL-28 e IL-29 recombinantes pode resultar numa mistura heterogénea de proteínas composta por ligações dissulfido intramoleculares em conformações múltiplas. A separação destas formas pode ser difícil e laboriosa. 5 É, por isso, desejável providenciar moléculas de IL-28 a IL-29 com um padrão único de ligação dissulfido intramolecular no momento da expressão e métodos para redobrar e purificar estas preparações para manter a homogeneidade. Assim, a presente especificação descreve composições e métodos para produzir preparações homogéneas de IL-28 e IL-29. 0 documento WO 02/086087 descreve uma familia da proteína citocina.

Sheppard P. et al., Nature Immunology, Vol. 4(1), Janeiro de 2003, páginas 63-68, descrevem IL-28, IL-29 e o seu recetor de citocina de classe II IL-28R.

Rajarathnam K. et al., Biochemistry, Vol. 38(24), 15 de Junho de 1999, páginas 7653-7658, descrevem pontes dissulfido em IL-8 probed using non-natural di-sulphide analogues: Dissociation of roles in structure from function.

Francis G.E. et al., International Journal of Hematology, Vol. 68(1), 1998, páginas 1-18, descrevem a peguilação das citocinas e outras proteínas e péptidos terapêuticos: A importância da otimização biológica de reações de emparelhamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

Na descrição que se segue, é utilizado extensivamente um número de termos. São providenciadas as seguintes definições para facilitar a compreensão da invenção. A menos que especificado o contrário, "o, " "um," e "pelo menos um" são utilizados alternadamente e significam um ou mais de um. O termo "etiqueta de afinidade" é utilizado aqui para denotar um segmento de polipeptídeo que pode ser anexado a um segundo polipeptídeo para providenciar a purificação ou deteção do segundo polipeptídeo ou providenciar locais para 6 anexação do segundo polipeptídeo ao substrato. Em princípio, qualquer péptido ou proteína para o qual um anticorpo ou outro agente de ligação específico está disponível pode ser utilizado como uma etiqueta de afinidade. As etiquetas de afinidade incluem um trato de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutationa S transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952-4, 1985), substância P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de ligação à estreptavidina, ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Ver, em geral, Ford et al., Protein expression and Purificação 2: 95-107, 1991. As etiquetas de afinidade que codificam ADN estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O termo "VARIANTE alélica" é utilizado aqui para denotar quaisquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo fenotipico dentro das populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (sem alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequência de aminoácidos alterada. O termo VARIANTE alélica também é utilizado aqui para denotar uma proteína codificada por uma VARIANTE alélica de um gene.

Os termos "terminal amino" e "terminal carboxilo" são utilizados aqui para denotar posições dentro dos polipeptídeos. Onde o contexto o permite, estes termos são utilizados com referência a uma sequência ou porção particular de um polipeptídeo para indicar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, um certo terminal carboxilo posicionado numa sequência em relação a uma sequência de 7 referência dentro de um polipeptídeo está localizado próximo do terminal carboxilo da sequência de referência, mas não está necessariamente no terminal carboxilo do polipeptideo completo. 0 termo "par complemento/anti-complemento" indica frações não idênticas que formam um par estável, não covalentemente associado, em condições apropriadas. Por exemplo, biotina e avidina (ou estreptavidina) são membros prototípicos de um par complemento/anti-complemento. Outros pares complemento/anti-complemento exemplares incluem pares recetor/ligando, pares anticorpo/antígeno (ou hapteno ou epítopo), pares de polinucleotídeos senso/antissenso, e afins. Onde a dissociação subsequente do par complemento/anti-complemento é desejável, o par complemento/anti-complemento tem, preferencialmente, uma afinidade de ligação <109 M_1. 0 termo "sequência de nucleotídeo degenerada" denota uma sequência de nucleotídeos que inclui um ou mais codões degenerados (quando comparada com uma molécula de polinucleotídeo de referência que codifica um polipeptídeo). Os codões degenerados contêm tripletos diferentes de nucleotídeos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto é, tripletos GAU e GAC cada codificam Asp) . 0 termo "vetor de expressão" é utilizado para indicar uma molécula de ADN, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica um polipeptídeo de interesse operativamente ligado a segmentos adicionais que providenciam a sua transcrição. Tais segmentos adicionais incluem sequências promotoras e de terminação, e também podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um potenciador, um sinal de poliadenilação, etc. Os vetores de expressão são geralmente derivados de ADN de plasmídeo ou virai, ou podem conter elementos de ambos. 0 termo "isolado", quado aplicado a um polinucleotideo, indica que o polinucleotideo foi removido do seu meio genético natural e está, por isso, livre de outras sequências codificantes extrínsecas indesejadas, e está numa forma adequada para utilização dentro de sistemas de produção de proteina desenhada por engenharia genética. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas do seu ambiente natural e incluem ADNc e clones genómicos. As moléculas de ADN isoladas da presente invenção estão livres de outros genes com os quais estão vulgarmente associadas, mas podem incluir regiões 5' e 3' não traduzidas que ocorrem naturalmente tais como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas serão evidentes para alguém com habilitação comum na arte (ver, por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Um polipeptideo ou proteina "isolado" é um polipeptideo ou proteina que é encontrado numa condição diferente do seu ambiente nativo, tais como separado de tecido animal ou sangue. Numa forma preferida, o polipeptideo isolado está substancialmente livre de outros polipeptideos, particularmente outros polipeptideos de origem animal. É preferido providenciar os polipeptideos numa forma altamente purificada, isto é, superior a 95% de pureza, mais preferencialmente superior a 99% de pureza. Quando utilizado neste contexto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipeptideo em formas fisicas alternativas, tais como dimeros ou formas em alternativa glicosiladas ou derivadas. 0 termo "nivel" quando se refere a células imunes, tais como células NK, células T, em particular células T citotóxicas, células B e afins, um nivel aumentado ou é número aumentado de células ou atividade aumentada da função celular. 0 termo "nivel" qundo se refere a infeções virais refere-se a uma alteração no nivel de infeção virai e 9 inclui, mas não se limita a, uma alteração no nivel de células CTLs ou NK (conforme descrito anteriormente) , uma diminuição da carga virai, um título de anticorpo antiviral aumentado, diminuição dos níveis serológicos de alanina aminotransferase, ou melhoria, conforme determinada por exame histológico, de um tecido ou orgão alvo. A determinação de se estas alterações no nível são diferenças significativas ou alterações cai bem dentro das habilitações de alguém habilitado na arte. 0 termo "operativamente ligado", quando se refere a segmentos de ADN, indica que os segmentos são organizados de maneira a funcionar concertadamente para os seus propósitos pretendidos, por exemplo, a transcrição inicia-se no promotor e prossegue através do segmento codificante até ao terminador. 0 termo "ortólogo" indica um polipeptídeo ou proteína obtido de uma espécie que é o correspondente funcional de um polipeptídeo ou proteína de uma espécie diferente. As diferenças nas sequências entre ortólogos são resultado da especiação.

Os "parálogos" são proteínas distintas, mas estruturalmente relacionadas, feitas por um organismo. Pensa-se que os parálogos surgem através da duplicação dos genes. Por exemplo, a-globina, β-globina, e mioglobina são parálogos umas das outras.

Um "polinucleotídeo" é um polímero de cadeia simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo lidas da extremidade 5' para a extremidade 3' . Os polinucleotídeos incluem ADN e ADN, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. Os tamanhos de polinucleotídeos são expressos como pares de base (abreviado "pb"), nucleotídeos ("nt"), ou quilobases ("kb"). Onde o contexto o permite, os últimos dois termos podem descrever polinucleotídeos que são de 10 cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é utilizado para denotar o comprimento global e será compreendido como equivalente ao termo "pares de base". Será reconhecido por aqueles habilitados na arte que as duas cadeias de um polinucleotideo de cadeia dupla podem diferir ligeiramente e que as extremidades das mesmas podem ser escalonadas como resultado de clivagem enzimática; assim, todos os nucleotideos dentro de uma molécula de polinucleotideo de cadeia dupla podem não estar emparelhados.

Um "polipeptideo" é um polimero de residuos de aminoácidos unidos por ligações peptidicas, seja produzido naturalmente ou sinteticamente. Os polipeptídeos com menos de cerca de 10 resíduos referidos como "péptidos". de aminoácidos são vulgarmente 0 termo "promotor" é utilizado aqui pelo seu significado reconhecido na arte para indicar uma porção de um gene que contém sequências de ADN que providenciam a ligação da ARN polimerase e a iniciação da transcrição. As sequências promotoras são vulgarmente, mas não sempre, encontradas nas regiões 5' não codificantes dos genes.

Uma "proteína" é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipeptídeos. Uma proteína também pode compreender componentes não peptídicos, tais como grupos carbohidrato. Os carbohidratos e outros substituintes não peptidicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida, e variará com o tipo de célula. As proteínas são definidas aqui em termos das suas estruturas dorsais de aminoácido; substituintes tais como grupos carbohidratos não são geralmente especificados, mas podem, ainda assim, estar presentes. O termo "recetor" indica uma proteína associada com a célula que se liga a uma molécula bioativa (isto é, um ligando) e medeia o efeito do ligando na célula. Os recetores ligados à membrana são caracterizados por uma 11 estrutura multi-péptido que compreende um domínio extracelular de ligação ao ligando e um domínio intracelular efetor que está tipicamente envolvido na transdução do sinal. A ligação do ligando ao recetor resulta numa alteração conformacional no recetor que causa uma interação entre o domínio efetor e outra(s) molécula(s) na célula. Por sua vez, esta interação conduz a uma alteração no metabolismo da célula. Eventos metabólicos que estão ligados a interações recetor-ligando incluem transcrição de genes, fosforilação, desfosforilação, aumentos na produção de AMP cíclica, mobilização de cálcio celular, mobilização de lípidos da membrana, adesão celular, hidrólise de lípidos inositol e hidrólise de fosfolípidos. Em geral, os recetores podem estar ligados à membrana, citosólicos ou nucleares; monoméricos (por exemplo, recetor da hormona estimuladora da tiroide, recetor beta-adrenérgico) ou multiméricos (por exemplo, recetor PDGF, recetor da hormona de crescimento, recetor IL-3, recetou GM-CSF, recetou G-CSF, recetor da eritropoietina e recetor IL-6). 0 termo "sequência sinal secretora" indica uma sequência de ADN que codifica um polipeptídeo (um "péptido secretor") que, como um componente de um polipeptídeo maior, dirige o polipeptídeo maior através de uma via secretora de uma célula na qual é sintetizado. 0 polipeptídeo maior é vulgarmente clivado para remover o péptido secretor durante o trânsito através da via secretora. 0 termo "VARIANTE de junção" é utilizado aqui para indicar formas alternativas de ARN transcritas de um gene. A variação de junção surge naturalmente através da utilização de locais de junção alternativos dentro de uma molécula de ARN transcrita, ou menos vulgarmente entre moléculas de ARN transcritas separadamente, e pode resultar em vários ARNm transcritos a partir do mesmo gene. As 12 VARIANTES de junção podem codificar polipeptídeos com sequência de aminoácidos alterada. 0 termo VARIANTE de junção também é utilizado aqui para indicar uma proteina codificada por uma VARIANTE de junção de um ARNm transcrito de um qene.

Os pesos e comprimentos moleculares de polimeros determinados por métodos analiticos imprecisos (por exemplo, eletroforese em qel) serão compreendidos como sendo valores aproximados. Quando um tal valor é expresso como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor indicado de X será entendido como sendo preciso a ±10%. "zcyto20", "zcyto21", "zcyto22" são as desiqnações prévias para a IL-28A humana, IL-29 humana, e IL-28B humana, respetivamente. As sequências de nucleotideos e de aminoácidos para IL-28A são mostradas na SEQ. ID N.° 1 e SEQ. ID N.° 2, respetivamente. As sequências de nucleotideos e de aminoácidos para IL-29 são mostradas na SEQ. ID N.° 3 e SEQ. ID N.° 4, respetivamente. As sequências de nucleotideos e de aminoácidos para IL-28B são mostradas na SEQ. ID N.° 5 e SEQ. ID N.° 6, respetivamente. Estas sequências estão descritas na sua totalidade no pedido PCT WO 02/086087 vulgarmente designada pela ZymoGenetics, Inc. "zcyto24" e "zcyto25" são as designações prévias para a IL-28 de ratinho, e são mostrados nas SEQ. ID N.°s 7, 8, 9, 10, respetivamente. O polinucleotideo e polipeptideos são descritos na sua totalidade na aplicação PCT WO 02/086087 vulgarmente designada pela ZymoGenetics, Inc. "zcytorl9" é a designação prévia para a subunidade α do recetor IL-28, e é mostrada na SEQ. ID N.° 11. Os polinucleotideos e polipeptideos são descritas no pedido PCT WO 02/20569 em nome da Schering, Inc., e no documento WO 02/44209 designado pela ZymoGenetics, Inc. O "recetor IL-28" indica a subunidade α da IL-28 e a subunidade CRF2-4 que formam um recetor heterodimérico. 13 A presente especificação descreve moléculas de polinucleotideo, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam mutantes de cisteina da IL-28 e IL-29 que resultam na expressão de uma preparação de IL-28 ou IL-29 recombinante que é uma preparação homogénea. Para os fins desta invenção, uma preparação homogénea da IL-28 e IL-29 é uma preparação a qual compreende, pelo menos, 98% de um padrão único de ligações dissulfido intramoleculares no polipeptideo purificado. Noutras modalidades, a conformação dissulfido única numa preparação de polipeptideo purificado é homogénea a 99%. Em geral, estes mutantes da cisteina manterão alguma atividade biológica IL-28 ou IL-29 de tipo selvagem, conforme descrito aqui. Por exemplo, as moléculas da presente invenção podem-se ligar ao recetor IL-28 com alguma especificidade. Em geral, um ligando que se liga ao seu recetou Cognato é especifico quando o KD cai dentro do intervalo de 100 nM a 100 pM. A ligação especifica no intervalo de 100 mM a 10 nM KD é uma ligação de baixa afinidade. A ligação especifica no intervalo de 2,5 pM a 100 pM KD é uma ligação de elevada afinidade. Num outro exemplo, a atividade biológica dos mutantes de cisteina da da IL-28 ou IL-29 está presente quando as moléculas são capazes de expressar algum nivel de atividade antiviral associada com o tipo selvagem de IL-28 ou IL-29. A determinação do nivel de atividade antiviral é descrita com detalhe aqui.

Quando se refere a IL-28, o termo significará tanto IL-28A como IL-28B. Anteriormente, a IL-28A foi designada zcyto20 (SEQ. ID N.°s 1 e 2), IL-29 foi designada zcyto21 (SEQ. ID N.°s 3 e 4), e IL-28B foi designada zcyto22 (SEQ. ID N.°s 5 e 6). (Ver, pedido PCT WO 02/086087 and Sheppard et al., supra.) Os ortólogos de ratinho para IL-28 foram previamente designados zcyto24 (SEQ. ID N.°s 7 e 8), zcyto25 (SEQ. ID N.°s 9 e 10). O gene da IL-28A de tipo selvagem codifica um 14 polipeptídeo de 200 aminoácidos, conforme mostrado na SEQ. ID N.° 2. A sequência sinal para IL-28A pode ser prevista como compreendendo resíduo de aminoácido -25 (Met) até ao resíduo de aminoácido -1 (Ala) da SEQ. ID N.° 2. O péptido maduro para IL-28A começa no resíduo de aminoácido 1 (Vai) da SEQ. ID N.° 2. As hélices da IL-28A são previstas como se segue: hélice A é definida pelos resíduos de aminoácidos 31 (Ala) a 45 (Leu); hélice B pelos resíduos de aminoácidos 58 (Thr) a 65 (Gin); hélice C pelos resíduos de aminoácidos 69 (Arg) a 86 (Ala); hélice D pelos resíduos de aminoácidos 95 (Vai) a 114 (Ala) ; hélice E pelos resíduos de aminoácidos 126 (Thr) a 142 (Lys); e hélice F pelos resíduos de aminoácidos 148 (Cys) a 169 (Ala); conforme mostrado na SEQ. ID N.° 2. O gene da IL-29 de tipo selvagem codifica um polipeptídeo de 200 aminoácidos, conforme mostrado na SEQ. ID N.° 4. A sequência sinal para IL-29 pode ser prevista como compreendendo resíduo de aminoácido -19 (Met) até ao resíduo de aminoácido -1 (Ala) da SEQ. ID N.° 4, SEQ. ID N.° 119, ou SEQ. ID N.° 121. O péptido maduro para IL-29 começa no resíduo de aminoácido 1 (Gly) da SEQ. ID N.° 4. A IL-29 foi descrita no pedido PCT WO 02/02627. As hélices da IL-29 são previstas como se segue: hélice A é definida pelos resíduos de aminoácidos 30 (Ser) a 44 (Leu); hélice B pelos resíduos de aminoácidos 57 (Asn) a 65 (Vai); hélice C pelos resíduos de aminoácidos 70 (Vai) a 85 (Ala); hélice D pelos resíduos de aminoácidos 92 (Glu) a 111 (Gin); hélice E pelos resíduos de aminoácidos 118 (Thr) a 139 (Lys); e hélice F pelos resíduos de aminoácidos 144 (Gly) a 170 (Leu); conforme mostrado na SEQ. ID N.° 4. O gene da IL-28B de tipo selvagem codifica um polipeptídeo de 200 aminoácidos, conforme mostrado na SEQ. ID N.° 6. A sequência sinal para IL-28B pode ser prevista como compreendendo resíduo de aminoácido -21 (Met) até ao resíduo de aminoácido -1 (Ala) da SEQ. ID N.° 6. O péptido 15 maduro para IL-28B começa no residuo de aminoácido 1 (Vai) da SEQ. ID N.° 6. As hélices IL-28B são previstas como se segue: hélice A é definida pelos resíduos de aminoácidos 31 (Ala) a 45 (Leu); hélice B pelos resíduos de aminoácidos 58 (Thr) a 65 (Gin); hélice C pelos Resíduos de aminoácidos 69 (Arg) a 86 (Ala); hélice D pelos resíduos de aminoácidos 95 (Gly) a 114 (Ala); hélice E pelos resíduos de aminoácidos 126 (Thr) a 142 (Lys) ; e hélice F pelos resíduos de aminoácidos 148 (Cys) a 169 (Ala); conforme mostrado na SEQ. ID N.° 6. A presente especificação descreve mutações nas sequências de tipo selvagem da IL-28 e IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 1, 2, 3, 4, 5, e 6, que resultam na expressão de formas únicas da molécula da IL-28 ou IL-29. Porque se pensa que a heterogeneidade das formas é um resultado de múltiplos padrões de ligação dissulfido intramoleculares, a presente especificação descreve mutações aos resíduos de cisterna dentro das sequências da IL-28 e IL-29 de tipo selvagem. Quando as IL-28 e IL-29 são expressas em E. coli, está presente uma metionina no N-terminal ou amino-terminal. As SEQ. ID N.°s 12-17, por exemplo, mostram a numeração do resíduo de nucleotídeo e de aminoácido para a IL-28A, IL-29 e IL-28B quando a Met do N-terminal está presente. 0 Quadro 1 mostra as possíveis combinações dos pares de cisterna ligados por ligações dissulfido intramoleculares para as IL-28A, IL-28B, e IL-29 de tipo selvagem. 16

Quadro 1 IL-28A SEQ. ID N,° 2 c16-c115 ^48 ^148 c50-c148 c167-c174 c16-c48 c16-c50 c48-c115 c50-c115 c115-c148 Met IL-28A SEQ. ID N.° 13 Cl7"Cll6 C4g-Ci,g c51-c1498 c168-c175 Cl7"C4q Cl7-Csi c49-c116 c51-c116 c116-c149 IL-29 SEQ. ID N.° 4 c15-c112 C4 9-Ci45 Cll2"Cl71 Met 11-29 SEQ, ID N,° 15 c16-c113 c50-c146 c113-c172 IL-28B SEQ. ID 11.° 6 c16-c115 C48“Ci48 c50-c148 c167-c174 c16-c48 c16-c50 c48-c115 c50-c115 c115-c148 Met IL-28B SEQ. ID N.° Π Cl7“Cll6 c149 c51-c149 c168-c175 Ci7-c4g Cl7-Csi c49-c116 c51-c116 c116-c149 17

As moléculas de polinucleotídeo e polipeptídeo descritas aqui têm uma mutação em uma ou mais das cisteinas presentes na IL-28a de tipo selvagem. As moléculas de IL-29 ou IL-28B retêm, no entanto, alguma atividade biológica conforme descrito aqui. 0 Quadro 2 ilustra mutantes de cisteina exemplares, em particular mutações pontuais da cisteina (C) em serina (S) .

Quadro 2 IL-28A C48S SEQ. ID N.° 19 Met IL-28A C49S SEQ. ID N.° 21 IL-28A C50S SEQ. ID N.° 23 Met IL-28A C51S SEQ. ID N.° 25 IL-29 C171S SEQ. ID N.° 27 Met IL-29 C172S SEQ. ID N.° 29

Todos os membros da familia mostraram ligar-se ao mesmo recetor de citocinas de classe II, IL-28R. A subunidade α da IL-28 foi previamente designada recetor zcytorl9. Ainda que não se pretenda ficar ligado à teoria, estas moléculas parecem sinalizar todas através do recetor da IL-28R através da mesma via. 0 recetor da IL-28 é descrito num pedido de patente comumente designado PCT WO 02/44209; Sheppard et al., supra; Kotenko et al., Nature Immunol. 4:69-77, 2003; e PCT WO/03/040345. IL-28R é um membro dos recetores de citocina de classe II que se caracteriza pela presença de um ou mais módulos do recetor de citocina (CRM) nos seus domínios extracelulares. Outros recetores de citocina de classe II incluem zcytorll (Patente U.S. 5 965 704 comumente detida), CRF2-4 (Acessão do Genbank N.° Z17227), IL-10R (Acessão do Genbank N.° U00672 e NM_001558), DIRS1, zcytor7 (Patente U.S. 5 945 511 comumente detida), e fator de tecido. O recetor da IL-28, como todos os recetores de classe II conhecidos, exceto a cadeia alfa do recetor do interferão-alfa/beta, tem apenas um CRM de classe II no seu domínio extracelular. 18

Quatro feixes helocoidais de citocinas são também agrupados pelo comprimento das suas hélices componentes. As citocinas com forma de "hélice longa" consistem geralmente em entre 24-30 hélices de residuo, e incluem IL-6, fator neutrotrófico ciliar (CNTF), fator inibitório da leucemia (LIF) e hormona de crescimento humano (hGH). As citocinas com forma de "hélice curta" consistem geralmente em entre 18-21 hélices de residuo e incluem IL-2, IL-4 e GM-CSF. Estudos utilizando CNTF e IL-β demonstraram que uma hélice CNTF pode ser trocada pela hélice equivalente em IL-6, conferindo propriedades de ligação a CTNF à quimera. Assim, parece que os dominios funcionais das citocinas com quatro hélices são determinados com base na homologia estrutural, independentemente da identidade de sequência, e podem manter integridade funcional numa quimera (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Desta forma, os polipeptideos dos mutantes de cisteina IL-28 e IL-29 serão úteis para preparar moléculas de fusão quimérica, particularmente com outros interferões para determinar e modular a especificidade de ligação do recetor. De particular interesse são as proteínas de fusão que combinam dominios helicais e laços dos interferões e citocinas tais como INF-cx, IL-10, hormona humana do crescimento. A presente especificação descreve moléculas de polinucleotideo, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam, por exemplo, polipeptideos do mutante de cisteina IL-28 ou IL-29. Por exemplo, a presente especificação descreve sequências de nucleotideo degeneradas que codificam polipeptideos da IL-28A C48S, Met IL-28A C49S, IL-28A C50S, Met IL-28A C51S, IL-29 C171S e Met IL-29 C172S reveladas aqui. Aqueles habilitados na arte rapidamente reconhecerão que, dada a degeneração do código genético, é possivel observar variação de sequência considerável entre estas moléculas de polinucleotideo. As SEQ. ID N.°s 30, 31, 32, 33, 34, e 35 são uma sequência de 19 ADN degenerada que abrange todos os ADNs que codificam IL-28A C48S, Met IL-28A C49S, IL-28A C50S, Met IL-28A C51S, IL-29 C171S e Met IL-29 C172S, respetivamente. Aqueles habilitados na arte reconhecerão que a sequência degenerada das SEQ. ID N.°s 30, 31, 32, 33, 34, e 35 também providencia todas as sequências de ARN que codificam as SEQ. ID N.°s 30, 31, 32, 33, 34, e 35 substituindo U por T e são, por isso, descritas aqui.

Os polipeptideos da IL-28A também incluem uma mutação na segunda cisterna, C2, do polipeptideo maduro. Por exemplo, C2 do terminal N ou terminal amino do polipeptideo da SEQ. ID N.° 2 é a cisterna na posição do aminoácido 48, ou posição 49 (Met adicional no N-terminal) se expressa em E. coli (ver, por exemplo, SEQ. ID N.° 13) . Esta segunda cisterna (da qual existem sete, como IL-28B) ou C2 da IL-28A podem ser mutadas, por exemplo, numa serina, alanina, treonina, valina, ou asparagina, moléculas do mutante C2 da IL-28A incluem, por exemplo, moléculas de polinucleotideo conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 20 e 22, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam os polipeptideos do mutante C2 da IL-28a, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 21 e 23, respetivamente. As SEQ. ID N.°s 36 e 37 são polipeptideos C2 adicionais da IL-28A da presente invenção.

Além dos mutantes C2 da IL-28A, a presente especificação descreve polipeptideos IL-28A que compreendem uma mutação na terceira posição da cisterna, C3, do polipeptideo maduro. Por exemplo, C3 do terminal N ou terminal amino do polipeptideo da SEQ. ID N.° 2, é a cisterna na posição 50, ou posição 51 (Met adicional no N-terminal) se expressa em E. coli (ver, por exemplo, SEQ. ID N.° 13). As moléculas mutantes C3 da IL-28A incluem, por exemplo, moléculas de polinucleotideo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 24 e 26, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptideos mutantes C3 de IL-28A, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 25 e 27, respetivamente. As SEQ. 20 ID N.°s 38 e 39 são polipeptídeos C3 adicionais da IL-28A da presente invenção.

Os polipeptídeos IL-28A incluem, por exemplo, as SEQ. ID N.°s 2, 13, 19, 21, 23, e 25, que são codificadas por moléculas de polinucleotídeo da IL-28a, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 1, 12, 18, 20, 22, e 24, respetivamente. Além disso, os polipeptídeos IL-28A incluem, por exemplo, as SEQ. ID N.°s 36, 37, 38, e 39.

Os polipeptídeos da IL-28B também incluem uma mutação na segunda cisteína, C2, do polipeptídeo maduro. Por exemplo, C2 do terminal N ou terminal amino do polipeptídeo da SEQ. ID N.° 6 é a cisteína na posição 48 do aminoácido, ou posição 49 (Met adicional no N-terminal) se expressa em E. coli (ver, por exemplo, a SEQ. ID N.° 17). Esta segunda cisteína (da qual existem sete, como IL-28A) ou C2 da IL-28B podem ser mutadas, por exemplo, numa serina, alanina, treonina, valina, ou asparagina. As moléculas mutantes C2 da IL-28B incluem, por exemplo, moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 122 e 124, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptídeos do mutante C2 da IL-28B, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 123 e 125, respetivamente. Moléculas mutantes C2 da IL-28B adicionais incluem moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 130 e 132 incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptídeos mutantes C2 da IL-28B, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 131 e 133, respetivamente (publicação PCT WO 03/066002 (Kotenko et al.)).

Além dos mutantes C2 da IL-28B, a presente especificação descreve polipeptídeos IL-28B que compreendem uma mutação na terceira posição da cisteína, C3, do polipeptídeo maduro. Por exemplo, C3 do terminal N ou terminal amino do polipeptídeo da SEQ. ID N.° 6 é a cisteína na posição 50, ou posição 51 (Met adicional no N-terminal) se expressa em E. coli (ver, por exemplo, SEQ. ID 21 Ν.° 17). As moléculas mutantes C3 da IL-28B incluem, por exemplo, moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 126 e 128, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptideos mutantes C3 da IL-28B, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 127 e 129, respetivamente. Moléculas mutantes C3 adicionais da IL-28B incluem moléculas de polinucleotideo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 134 e 136 incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptideos mutantes C3 da IL-28B, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 135 e 137, respetivamente (publicação PCT WO 03/066002 (Kotenko et al.)).

Os polipeptideos IL-28B incluem, por exemplo, as SEQ. ID N.°s 6,17, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, e 137, que são codificadas por moléculas de polinucleotideo da IL-28B, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 5, 16, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, e 136, respetivamente.

Os polipeptideos da IL-29 da presente invenção (como definidos nas reivindicações) incluem uma mutação na quinta cisteina, C5, do polipeptídeo maduro. Por exemplo, C5 do terminal N do polipeptideo da SEQ. ID N.° 4, é a cisteina na posição 171, ou posição 172 (Met adicional no N-terminal) se expressa em E. coli. (ver, por exemplo, SEQ. ID N.° 15). Esta quinta cisteina ou C5 da IL-29 é mutada numa serina. Estes polipeptideos mutantes C5 da IL-29 têm um padrão de ligação dissulfido da Cl (Cysl5 da SEQ. ID N.° 4)/C3(Cysll2 da SEQ. ID N.° 4) e C2(Cys49 da SEQ. ID N.° 4)/C4(Cysl45 da SEQ. ID N.° 4). Moléculas mutantes C5 adicionais da IL-29 incluem moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 26, 28, 82, 84, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, e 160, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptideos de mutantes C5 da IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 27, 29, 83, 85, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161, respetivamente. Moléculas mutantes C5 adicionais da IL-29 includem 22

moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 86, 88, 94, e 96, incluindo moléculas de ADN e ARN que codificam polipeptídeos de mutantes C5 da IL-29 conforme mostrado nas SEQ. ID N .° s 87, co 95, e 97 respetivamente (publicação PCT WO 03/066002 (Kotenko et al.))· Além disso, as moléculas mutantes C5 da IL-29 incluem moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 102, 104, 110, e 112, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptídeos de mutantes C5 da IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 103, 105, 111, e 113, respetivamente (publicação PCT WO 02/092762 (Baum et al.)) .

Além dos mutantes C5 da IL-29, a presente especificação descreve polipeptídeos da IL-29 que compreendem uma mutação na primeira posição da cisteína, Cl, do polipeptídeo maduro. Por exemplo, Cl do terminal N do polipeptídeo da SEQ. ID N.° 4 é a cisteína na posição 15, ou posição 16 (Met adicional no N-terminal) se expressa em E. coli (ver, por exemplo, SEQ. ID N.° 15). Estes polipeptídeos de mutantes Cl da IL-29 terão, assim, um padrão previsto de ligação dissulfido de C2 (Cys49 da SEQ. ID N.° 4)/C4(Cysl45 da SEQ. ID N.° 4) e C3(Cysll2 da SEQ. ID N.° 4)/C5(Cysl71 da SEQ. ID N.° 4). Moléculas mutantes Cl adicionais da IL-29 incluem moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 74, 76, 78, e 80, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptídeos de mutantes Cl da IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 75, 77, 79 e 81, respetivamente. Moléculas mutantes Cl adicionais da IL-29 incluem moléculas de polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 90, 92, 98, e 100, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptídeos de mutantes Cl da IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 91, 93, 99, e 101, respetivamente (publicação PCT WO 03/066002 (Kotenko et al.)). Além disso, as moléculas mutantes Cl da IL-29 incluem moléculas de 23 polinucleotídeo, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 106, 108, 114, e 116, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam polipeptídeos de mutantes Cl da IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 107, 109, 115, e 117, respetivamente (publicação PCT WO 02/092762 (Baum et al.)).

Os polipeptídeos da IL-29 descritos aqui, por exemplo, SEQ. , ID N. °s4, LO \—1 27, 2 9, 75 , 77, 79, 81, 83, 85 , 87, co LO 91, 93, 95 , 97, . 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161, que são codificados por moléculas de polinucleotídeo da IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 3, 14, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, e 160, podem ainda incluir uma sequência sinal conforme mostrado na SEQ. ID N.° 119 ou uma sequência sinal conforme mostrado na SEQ. ID N.° 121. Além disso, a presente especificação descreve os polipeptídeos da IL-29 conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 40 e 41. Uma molécula de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da sequência sinal da SEQ. ID N.° 119 é mostrada como SEQ. ID N.° 118. Uma molécula de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da sequência sinal da SEQ. ID N.° 120 é mostrada como SEQ. ID N.° 121.

Num aspeto, a presente especificação descreve um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência que tem, pelo menos, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de resíduos de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19 / 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 75, 77, 79, 81 r 83 , 85, 87, 89, 91, 93, 95 , 97 , 99, 101, 103, 105, 107, 1 09, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 1 37, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161. 0 polipeptídeo pode, opcionalmente, compreender, pelo menos 15, pelo menos 30, pelo menos 45, ou pelo menos 60, aminoácidos sequenciais de uma sequência 24 de aminoácidos, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75 , 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161. Numa outra modalidade , o polipeptídeo isolado é um aminoácido cujos resíduos são selecionados a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 10 1, i 03, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, . 123 , 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, . 139, 141, 143,

145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161. O polipeptídeo pode ter uma alteração de aminoácido conservadora, comparado com a sequência de aminoácidos sele cionada a partir • do grupo que consi ste nas SEQ . ID N. °s 2, 4 , 6, 8, 10 , 13, 15, 17, 19 , 21, 23, 25, 27, 29 , 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 75, 77, 79, 81 , 83, 83, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115 ,117, 123, 125, 127 , 129, 131, 133, . 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, e 161 •

Num outro aspeto, a presente especificação descreve uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4 , 6, O \—1 00 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29 , 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83 , 85, 87, 89, 91 , 93 , 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127 , 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, , 159, e 161; e uma fração de óxido de polialquilo. A fração de óxido de polialquilo pode, opcionalmente, ser polietilenoglicol, tal como um propionaldeído mPEG com 20kD ou um propionaldeído mPEG com 30kD. O polietilenoglicol pode ser linear ou ramificado. O polietilenoglicol pode estar covalentemente anexado ao 25 polipeptídeo pelo N-terminal ou C-terminal.

Num outro aspeto, a presente especificação descreve uma proteina de fusão que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo unido por uma ligação peptídica, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161; e um segundo polipeptídeo. O segundo polipeptídeo pode, opcionalmente, ser um fragmento de anticorpo. O fragmento de anticorpo pode, opcionalmente, ser F(ab')/ F (ab) , Fab', Fab, Fv, scFv, e/ou unidade de reconhecimento mínimo. O segundo polipeptídeo pode, opcionalmente, ser albumina humana. 0 segundo polipeptídeo pode, opcionalmente, ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em etiquetas de afinidade, toxinas, radionucleotídeos, enzimas e flurofóros. O Quadro 3 apresenta os códigos de uma só letra utilizados nas SEQ. ID N.°s 30, 31, 32, 33, 34, e 35 para indicar posições de nucleotídeos degeneradas. "Resoluções" são os nucleotídeos indicados por uma letra código. "Complemento" indica o código para o nucleótido(s) complementar. Por exemplo, o código Y denota C ou T, e o seu complemento R denota A ou G, com A sendo complementar a T, e G sendo complementar a C.

Quadro 3

Nucleotíde 0 Resolução Complemento Resolução A A T T C C G G G G C C 26

Nucleotíde Resolução Complemento Resolução o

T T A A R A G Y C T Y C T R A G M A C K G T K G T M A C S C G S C G W A T W A T H A C | T D A G | T B C G | T V A C | G V A C | G B C G | T D A G | T H A C | T N A C | G | T N A C | G

Os codões degenerados utilizados nas SEQ. ID N.°s 30, 31, 32, 33, 34, e 35, abrangindo todos os codões possíveis para um dado aminoácido, são apresentados no Quadro 4.

Quadro 4

Aminoácido Código de 1 letra Codões Codão degenerado Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG WSN TCT Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gin Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG MGN CGT Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA YTN TTG Vai V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp W TGG TGG 27

Aminoácido Código de 1 letra Codões Codão degenerado Ter TAA TAG TGA TRR Asn|Asp B RAY Glu|Gin Z SAR Any X NNN

Alguém com habilitação comum na arte apreciará que é introduzida alguma ambiguidade na determinação de um codão degenerado, representativo de todos os codões possiveis que codificam cada aminoácido. Por exemplo, o codão degenerado para a serina (WSN) pode, em algumas circunstâncias, codificar arginina (AGR), e o codão degenerado para a arginina (MGN) pode, em algumas circunstâncias, codificar serina (AGY). Existe uma relação semelhante entre codões que codificam a fenilalanina e a leucina. Assim, alguns polinucleotídeos abrangidos pela sequência degenerada podem codificar sequências VARIANTES de aminoácidos, mas alguém com habilitação comum na arte pode identificar facilmente tais sequências VARIANTES por referência com a sequência de aminoáci dos, por exemplo , das SEQ. ID N . ° s 19, 21 , 23, 25 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75 , 77, 79, 81, 83 , 85, . 87 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113 115, 117 , 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161. A funcionalidade das sequências VARIANTES pode ser testada conforme descrito aqui.

Alguém com habilitação comum na arte também apreciará que espécies diferentes podem exibir "utilização do codão preferencial." Em geral, ver, Grantham, et al., Nuc, Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean e Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Hohm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Como utilizado aqui, o termo "utilização do codão preferencial" ou "codões preferenciais" é um termo da arte 28 que se refere aos codões de tradução da proteína que são utilizados com mais frequência nas células de uma dada espécie, favorecendo, assim, um ou uns poucos representantes dos codões possíveis que codificam cada aminoácido (ver Quadro 4). Por exemplo, o aminoácido Treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG, ou ACT, mas nas células de mamíferos ACC é o codão mais vulgarmente utilizado; noutras espécies, por exemplo, células de inseto, levedura, vírus ou bactérias, codões Thr diferentes podem ser preferenciais. Os codões preferenciais para uma espécie particular podem ser introduzidos nos polinucleotídeos da presente invenção através de uma variedade de métodos conhecidos na arte. A introdução de sequências de codão preferencial em ADN recombinante pode, por exemplo, intensificar a produção da proteína tornando a tradução da proteína mais eficiente dentro de um tipo de células ou espécie particular. Assim, a sequência do codão degenerado revelada nas SEQ. ID N.°s 30, 31, 32, 33, 34, e 35 serve como um molde para otimizar a expressão de polinucleotídeos em vários tipos de células e espécies vulgarmente utilizados na arte e revelados aqui. As sequências que contêm codões preferenciais podem ser testadas e otimizadas para expressão em várias espécies, e a sua funcionalidade testada conforme descrito aqui.

Num outro aspeto, a presente especificação descreve um poli nucleotí deo isolado selecionado a part ir do grupo que cons iste nas : SEQ. ID N . °s 1, 3, . 5, 7, 9, 12, 14 , 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80 r 82, 84, 86, 8É 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 10 8, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 12 6, 128, 130 , 132, 134, 1 36, 138 , 140, 142, 144, 146, 148, 15 0, 152, 154 , 156, 158, e 160.

Num outro aspeto, a presente especificação descreve um polinucleotídeo isolado capaz de hibridar com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 29 78, O 00 82, 84 , 86, co co 90, 92, 94 , 96, 98, 100, 102, 104, 106, 10 8, 110, 112, 114, 116 , 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 13 6, 138, 140, 142, 144 , 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, e 160, ou um complemento da mesma, em condiçõe :s de hibridação de 50% formamida, 5xSSC (lxSSC: 0,15 M cloreto de sódio e 15 mM citrato de sódio), 50 mM fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt (lOOx solução de Denhardt: 2% (p/v) Ficoll 400, 2% (p/v) polivinilpirrolidona, e 2% (p/v) albumina do soro bovina, 10% sulfato de dextrano, e 20 mg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado, tosado a cerca de 42°C até cerca de 70°C, em que o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptideo que tem atividade antiviral. Opcionalmente, o polipeptideo codificado tem atividade antiviral contra a hepatite B e/ou hepatite C. Opcionalmente, o polinucleotideo isolado pode codificar, pelo menos, uma porção de uma sequência selecionada a part ir do grupo das SEQ . ID N.°s 2, 4, 6, O \—1 00 , 13, 15 17, 19, 21 ; 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41 75, , 77 79, 81, 83 , 85, 87, 89, 91, 93, 95 , 97, 99, 101, 103, 105 107, 109, 111, 113, 115, 117 , 123, 125, 127, 129, 131, 133 135, 137, 139, 141, 143, 145 , 147, 149, 151, 153, 155, 157 159, e 161. O polinucleotideo isolado pode codificar um polipeptideo representado pelas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, O \—1 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 , 27 , 29, 36, 37, 38 , 39, V O 41, 75, 77, 79 , 81 , 83, , 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103 , 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145 , 147, 149, 151, 153, 155 , 157, 159, ou 1 61.

Num outro aspeto, a presente especificação descreve um polinucleotideo isolado que codifica um polipeptideo em que o polipeptideo codificado é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 30 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161.

Num outro aspeto, a presente especificação descreve um polinucleotideo isolado que codifica um polipeptídeo em que o polipeptideo codificado tem, pelo menos, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161, em que o polipeptideo codificado tem atividade antiviral. Opcionalmente, o polipeptideo codificado tem atividade antiviral contra a hepatite B e/ou hepatite C.

Conforme indicado previamente, os polinucleotideos isolados da presente invenção incluem ADN e ARN. Métodos para preparar ADN e ARN são bem conhecidos na arte. Em geral, o ARN é isolado a partir de um tecido ou célula que produz grandes quantidades de ARN de mutante da cisteina da IL-28 ou IL-29. Tais tecidos e células são identificados por Northern blotting (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5201, 1980), ou por Classificação com meio condicionado de vários tipos de células em relaçao à atividade nas células ou tecido alvo. Assim que se identifica o tecido ou célula que produz a atividade ou ARN, o ARN total pode ser preparado utilizando extração com tiocianato de guanidinio seguido de isolamento por Centrifugação num gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). O poli (A)+ ARN é preparado a partir do ARN total utilizando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-12, 1972). É preparado ADN complementar (ADNc) a partir do poli(A)+ ARN utilizando métodos conhecidos. Em alternativa, pode ser isolado ADN genómico. Os polinucleotideos que codificam os polipeptideos de mutante da cisteina da IL-28 31 ou IL-29 são depois identificados e isolados por, por exemplo, hibridação ou PCR.

Podem ser obtidos clones de comprimento inteiro que codificam mutante de Cisteina da IL-28 ou IL-29 por procedimentos de clonagem convencionais. São preferidos clones de ADN complementar (ADNc), apesar de para algumas aplicações (por exemplo, expressão em animais transgénicos) pode ser preferível utilizar um clone genómico, ou modificar um clone de ADNc para incluir, pelo menos, um intrão genómico. M~etodos para preparar ADNc e clones genómicos são bem conhecidos e dentro do nivel de alguém com habilitação comum na arte, e incluem a utilização da sequência revelada aqui, ou partes da mesma, para sondar ou iniciar uma biblioteca. As bibliotecas de expressão podem ser sondadas com anticorpos a fragmentos de recetor da IL-28, ou a outros parceiros de ligação específicos.

Aqueles habilitados na arte reconhecerão que as sequências revelada nas, por exemplo, SEQ. ID N.°s 1, 3, e 5, respetivamente, representam mutações de alelos únicos da IL-28 humana e bandas da IL-29, e que se espera que a variação alélica e a excisão-união alternativa ocorram. Por exemplo, foi identificada uma VARIANTE da IL-29 onde o resíduo de aminoácido 169 (Asn), conforme mostrado na SEQ. ID N.° 4, é um resíduo de Arg, conforme descrito no documento WO 02/086087. Tais VARIANTES alélicas estão incluídas na presente invenção. As VARIANTES alélicas desta sequência podem ser clonadas sondando ADNc ou bibliotecas genómicas de diferentes indivíduos de acordo com procedimentos convencionais. As VARIANTES alélicas da sequência de ADN mostrada nas SEQ. ID N.° 1, 3 e 5, incluindo aquelas que contêm mutações silenciosas e aquelas nas quais as mutações resultam em alterações da sequência de aminoácidos, além das mutações da cisteina, são descritas aqui, como o são proteínas que são VARIANTES alélicas das SEQ. ID N.°s 2, 4, e 6. Os ADNc gerados a 32 partir de ARNm excisado em alternativa que retém as propriedades dos polipeptideos do mutante de Cisterna da IL-28 ou IL-29, estão incluídos no âmbito da presente invenção, como o estão os polipeptideos codificados por tais ADNc e ARNm. As VARIANTES alélicas de VARIANTES de junção destas sequências podem ser clonadas sondando ADNc ou bibliotecas genómicas de diferentes indivíduos ou tecidos de acordo com procedimentos convencionais conhecidos na arte, e mutações as cisteínas que codificam os polinucleotídeos ou resíduos de cisteína podem ser introduzidos conforme descrito aqui. VARIANTE isolada ou moléculas de ácido nucleico que codificam mutantes de Cisteína da IL-28 e IL-29 podem hibridar em condições de restringência com moléculas de ácido nucleico com a sequência nucleotídica das SEQ Q 1—1 N.°s 18, 20, 22, 24 , 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 00 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 , 156, 158, e 160 ou com moléculas de ácido nucleico com uma sequência nucleotídica complementar às SEQ. ID N.°s 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 8 o, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 r 10 8, 110, 112, 114, . 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134 r 13 6, 138, 140, 142, . 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158 r e 160. Em geral, as condições res ;tringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a uma força iónica definida e pH. A Tm é a temperatura (sob força iónica definida e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibridiza com uma sonda que lhe corresponde perfeitamente.

Um par de moléculas de ácido nucleico, tais como ADN-ADN, ARN-ARN e ADN-ARN, pode hibridar se as sequências nucleotídicas têm algum grau de complementariedade. Os híbridos podem tolerar pares de base desfasados na hélice 33 dupla, mas a estabilidade do híbrido é influenciada pelo grau de desfasamento. A Tm do híbrido desfasado diminui em 10 C po cada 1-1,5% de desfasamento dos pares de base. Variar a restringência das condições de hibridaçao permite controlar o grau de desfasamento que estará presente no híbrido. 0 grau de restringência aumenta à medida que a temperatura de hibridaçao aumenta e a força iónica do tampão de hibridaçao diminui.

Está bem dentro das capacidades de alguém habilitado na arte o adaptar estas condições para utilização com um híbrido polinucleotídeo particular. A Tm para uma sequência alvo específica é a temperatura (em condições definidas) à qual 50% da sequência alvo hibridará com uma sequência da sonda que lhe corresponde na perfeição. Aquelas condições que influenciam a Tm incluem o tamanho e conteúdo em pares de base da sonda de polinucleotídeo, a força iónica da solução de hibridaçao, e a presença de agentes destabilizadores na solução de hibridação. Numerosas equações para calcular a Tm são conhecidos na arte, e são específicas para ADN, ARN e híbridos de ADN-ARN e sequências da sonda de polinucleotídeo de comprimento variável (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current

Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger e Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); e Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Programas de análise de sequências como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) e Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Paio Alto, CA) , bem como sites na Internet, representam ferramentas disponíveis para analisar uma dada sequência e calcular a Tm com base em critérios definidos pelo utilizador. Tais programas também podem analisar uma dada sequência em condições definidas e identificar sequências 34 de sonda adequadas. Tipicamente, a hibridação de sequências de polinucleotideo mais longas, >50 pares de base, é realizada a temperaturas de cerca de 20-25°C abaixo da Tm calculada. Para sondas mais pequenas, <50 pares de base, a hibridação é tipicamente realizada à Tm ou 5-10°C abaixo da Tm calculada. Isto permite a taxa máxima de hibridação paa híbridos de ADN-ADN e ADN-ARN.

Após a hibridação, as moléculas de ácido nucleico podem ser lavadas para remover moléculas de ácido nucleico não hibridizadas sob condições restringentes, ou em condições altamente restringentes. As condições de lavagem restringentes típicas incluem a lavagem numa solução de 0,5x - 2x SSC com 0,1% dodecil sulfato de sódio (SDS) a 55 65°C. Ou seja, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma VARIANTE ou polipeptídeos de mutante de Cisteína da IL-28 ou IL-29 hibridam com uma molécula de ácido nucleico com a sequência nucleotídica das SEQ. ID N.°s 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, e 160, respetivamente (ou o seu complemento) em condições de lavagem restringentes, nas quais a restrigência de lavagem é equivalente a 0,5x - 2x SSC com 0,1% SDS a 55 - 65°C, incluindo 0,5x SSC com 0,1% SDS a 55°C, ou 2x SSC com 0,1% SDS a 65°C. Alguém habilitado na arte pode planear prontamente condições equivalentes, por exemplo, substituindo SSPE por SSC na solução de lavagem.

Condições de lavagem altamente restringentes típicas incluem lavagem numa solução de 0,lx - 0,2x SSC com 0,1% dodecil sulfato de sódio (SDS) a 50 - 65°C. Por outras palavras, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma VARIANTE de um polipeptídeo de mutante de Cisteína IL-28 ou IL-29 hibridam com uma molécula de ácido nucleico com a sequência nucleotídica das SEQ. ID N.°s 18, 20, 22, 2A, 26, 35 OD CM 74, 76, 78, 80, 82, OO OO OO OO 90, 92, 94, 96, CD co 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 , 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142 , 144 , 146, 148, 150, 152, 154 , 156, 158, e 160 (ou o seu complemento) em condições de lavagem altamente restringentes, nas quais a restringência de lavagem é equivalente a 0,lx - 0,2x SSC com 0,1% SDS a 50 - 65°C, incluindo 0,lx SSC com 0,1% SDS a 50 °C, ou 0,2x SSC com 0,1% SDS a 65°C.

Polipeptideos isolados da IL-28 ou IL-29 podem ter identidade de sequência substancialmente semelhante aos polipeptideos da presente invenção, por exemplo SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101,103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ou 161. O termo "identidade de sequência substancialmente semelhante" é utilizado aqui para denotar polipeptideos que compreendem, pelo menos, 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou superior a 99% de identidade de sequência com a sequência, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, \—1 CM 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, , 40, 41, 75, 77 79, \—1 OO 93, 85, 87, 89 , 91 , 93 , 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, , 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ou 161, ou os seus ortólogo s. A presente especificação descreve polipeptideos que compreendem uma sequência de aminoácidos com, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou superior a 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo, ou fragmento do mesmo, da presente invenção. A presente especificação 36 descreve polinucleotídeos que codificam tais polipeptideos. Os polipeptideos da IL-28 e IL-29 descritos aqui são preferencialmente polipeptideos recombinantes, polipeptideos da IL-28 e IL-29 descritos aqui têm, pelo menos 15, pelo menos 30, pelo menos 45, ou pelo menos 60 aminoácidos sequenciais. Por exemplo, um polipeptídeo IL-28 ou IL-29 tem, pelo menos 15, pelo menos 30, pelo menos 45, ou pelo menos 60 aminoácidos sequenciais das SEQ. ID N.°s 2, 4 ,6,8, 10 , 13 , 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 36, , 37, 38, 39, 40, 41 , 75 , 77, 79, 81, 83 , 85, 87, 89, 91, 93, . 95, 97, 99, 101 r 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 12 !9, 131 , 133, , 135 , 137, 139, 141, , 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ou 161. Métodos para determinar a identidade percentual são descritos a seguir. A presente especificação descreve moléculas VARIANTES de ácido nucleico que podem ser identificadas utilizando dois critérios: uma determinação da semelhança entre o polipeptideo codificado com a sequência de aminoácidos das SEQ. ID N.°s 19, 21 , 23, , 25, 27, 29, 36, 37, 38 , 39, 40 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, r 97, 99 101, 103 , 105, 107, 109, 111, 113, 115, . 117 , 123, 125, 127 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141, 143, . 145 , 147, 149, 151 153, 155, 157, 159 ou 161 respetivamente, e/ou um ensaio de hibridação, conforme descrito anteriormente. Tais VARIANTES incluem moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridam com uma molécula de ácido nucleico com a sequência nucleotidica das SEQ. ID N . °s 18 , 2 0, r 22, 24, 26, 28, 74, 76 , 78, 80 82, 84, 86, 8 8, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 108, 110 , 112, 114, 116, 122, 124, 126, . 128 , 130, 132, 134 136, 138 , 140, 142, 144, 146, 148, 150, . 152 , 154, 156, 158 e 160, respetivamente (ou o seu complemento) em condições de lavagem restringentes, nas quais a restringência de lavagem é equivalente a 0,5x - 2x SSC com 0,1% SDS a 55 -65°C; ou (2) que codificam um polipeptideo com, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo 37 menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou superior a 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ . ID N.° s 19, 21, 23, 25, 27 , 29, 37, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81 , 83, . 85, 87, 89, 91, . 93, LO CD 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125 , 127, 129, 131 , 133 , 135, 137, . 139 , 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159 ou 161. Em alternativa, as VARIANTES podem ser caracterizadas como moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridam com uma molécula de ácido nucleico com a sequência nucleotidica das SEQ. ID N.°s 18, 20, 22, 24, 26, 28, 74, 76, 78, 80 , 82, 84, co co co KD O 92, 94, 96, 98, 100, 1 02, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 122, . 124 , 126, 128, 130 , 132 , 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, ou 160, respetivamente (ou o seu complemento) em condições de lavagem altamente restringentes, nas quais a restringência de lavagem é equivalente a 0,lx - 0,2x SSC com 0,1% SDS a 50 - 65°C; e (2) que codificam um polipeptideo com, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou superior a 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ. ID N.°s 19, 21 , 23, LO CM 27, 29, 36, 37, 38 , 39, 40 41, 75, 77, 79, 81, 00 00 LO OO 87, CO KO 91, 93, 95, , 97, 99 101, 103 , 105, 107, 109, 111, 113, 115, , 117 , 123, 125, 127 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141, 143, , 145 , 147, 149, 151 153, 155, 157, 159 ou 161, respetivamente. A identidade de sequência percentual é determinada por métodos convencionais. Ver, por exemplo, Altschul et al., Buli. Math. Bio. 48:603 (1986), e Henikoff e Henikoff,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1992). Resumindo, duas sequências de aminoácidos são alinhadas para otimizar as classificações de alinhamento utilizando uma abertura do intervalo de 10, uma penalização da extensão do intervalo 38 de 1, e a matriz de classificação "BLOSUM62" de Henikoff e Henikoff (ibid.), conforme mostrado no Quadro 4 (os aminoácidos são indicados pelos códigos de uma letra convencionais). número total de correspondências idênticas [comprimento da sequência mais longa x mais o número de intervalos inseridos na sequência mais longa de modo a alinhar as duas sequências]

Quadro 5 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 Μ -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2-15 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0-3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 7 -2 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1-2 1 -1 -2 -2 0 -3

Aqueles habilitados na arte apreciam que existem muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar 39 duas sequências de aminoácidos. 0 algoritmo de pesquisa de similaridade "FASTA" de Pearson e Lipman é um método de alinhamento de proteínas adequado para examinar o nível de identidade partilhado por uma sequência de aminoácidos revelada aqui e a sequência de aminoácidos de uma VARIANTE aceite da IL-28 ou IL-29. 0 algoritmo FASTA é descrito por Pearson e Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), e por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).

Resumindo, o FASTA primeiro caracteriza a semelhança entre sequências identificando regiões partilhadas pela sequência de pesquisa (por exemplo, SEQ. ID N.° 2) e uma sequência teste que tem a densidade mais alta das identidades (se a variável ktup é 1) ou pares de identidades (se ktup= =2) , sem considerar substituições, inserções ou deleções de aminoácidos conservadoras. As dez regiões com a densidade mais elevada de identidades são depois re-classifiçadas comparando a similaridade de todos os aminoácidos emparelhados utilizando uma matriz de substituição de aminoácidos, e as extremidades das regiões são "aparadas" para incluir apenas aqueles resíduos que contribuem para a classificação mais alta. Se existem várias regiões com classificações superiores ao valor "limite" (calculado por uma formula pré-determinada com base no comprimento da sequência e no valor ktup), então as regiões iniciais aparadas são examinadas para determinar se as regiões podem ser unidas para formar um alinhamento aproximado com intervalos. Finalmente, as regiões que se classificam mais alto das duas sequências de aminoácidos são alinhadas utilizando uma modificação do algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Match. 26:787 (1974)), que permite inserções e deleções de aminoácidos. Parâmetros preferidos para a análise FASTA são: ktup=l, penalização para abertura do intervalo=10, penalização para extensão do intervalo =1, e matriz de 40 substituição=BLOSUM62. Estes parâmetros podem ser introduzidos num programa FASTA modificando o ficheiro de classificação da matriz ("SMATRIX"), conforme explicado no Apêndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol.183: 63 (1990). FASTA também pode ser utilizado para determinar a identidade de sequência de moléculas de ácido nucleico utilizando uma razão, conforme revelado anteriormente. Aa comparações de sequências nucleotidicas, o valor ktup pode oscilar entre um a seis, preferencialmente de três a seis, mais preferencialmente três, com outros parâmetros definidos como por defeito.

Os polipeptideos ou polipeptideos mutantes da cisteina da IL-28 ou IL-29 VARIANTE, com identidade de sequência substancialmente semelhante, são caracterizados como tendo uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos. Estas alterações são preferencialmente de uma natureza menor, ou seja, substituições de aminoácido conservadoras (ver Quadro 6) e outras substituições que não afetam significativamente a dobragem ou atividade do polipeptídeo; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; e extensões no amino- ou carboxilo-terminal, tais como um residuo de metionina no amino-terminal, um pequeno péptido ligante de até cerca de 20-25 residuos, ou uma etiqueta de afinidade. A presente especificação descreve polipeptideos de cerca de 146 a 207 residuos de aminoácidos que compreendem uma sequência com, pelo menos 8096, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou superior a 99% de identidade de sequência com a região correspondente das SEQ. ID N . ° s 19 , 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, . 41 , 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 1C 11, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129 , 131, , 133 , 135, 137, 139 , 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 , 155 , 157 ', 159 ou 1 61. Os polipepti deos 41 que compreendem etiquetas de afinidade podem ainda compreender um local de clivagem proteolítico entre o polipeptideo da IL-28 e IL-29 e a etiqueta de afinidade. Tais locais preferidos incluem locais de clivagem da trombina e locais de clivagem do fator Xa.

Quadro 6 Substituições de aminoácido conservadoras Básicas: arginina

Acídicas:

Polares:

Hidrofóbicas lisina histidina ácido glutâmico Ácido aspártico glutamina asparagina leucina isoleucina valina

Aromáticas

Pequenas: fenilalanina triptofano tirosina glicina alanina serina treonina metionina A determinação dos resíduos de aminoácidos que compreendem regiões ou domínios que são críticos para manter a integridade estrutural pode ser determinada. Dentro destas regiões uma pessoa pode determinar resíduos específicos que serão mais ou menos tolerantes a alterações e mantêm a estrutura terciária global da molécula. Métodos para analisar a estrutura da sequência incluem, mas não se limitam a, alinhamento de múltiplas sequências com elevada identidade de aminoácido ou nucleotídeo, propensões de estrutura secundárias, padrões binários, acondicionamento complementar e interações polares enterradas (Barton, 42

Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 e Cordes et al. , Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). Em geral, quando se desenham modificações a moléculas ou identificam fragmentos especificos, a determinação da estrutura será acompanhada pela avaliação da atividade das moléculas modificadas.

As alterações da sequência de aminoácidos são feitas em polipeptideos mutantes da cisterna da IL-28 ou IL-29 de modo a minimizar a interrupção da estrutura de ordem mais elevada essencial à atividade biológica. Por exemplo, onde o polipeptideo mutante da cisterna da IL-28 ou IL-29 compreende uma ou mais hélices, serão feitas alterações nos residuos de aminoácidos de modo a não interromper a geometria da hélice e outros componentes da molécula onde as alterações na conformação reduzem alguma função crítica, por exemplo, a ligação da molécula aos seus parceiros de ligação. Os efeitos das alterações na sequência de aminoácidos podem ser previstos por, por exemplo, modelação por computador, enforme revelado anteriormente, ou determinados por análise da estrutura do cristal (ver, por exemplo, Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995) . Outras técnicas que são bem conhecidas na arte comparam a dobragem de uma proteína VARIANTE a uma molécula padrão (por exemplo, a proteína nativa), Por exemplo, pode ser feita a comparação do padrão de cisteína numa VARIANTE e moléculas padrão. A espetrometria de massa e modificação química utilizando redução e alquilação providenciam métodos para determinar resíduos de cisteína que estão associados com ligações dissulfido ou estão livres de tais associações (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sei. 2:1732-1748, 1993; e Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). É geralmente aceite que se uma molécula moificada não tem o mesmo padrão de cisteína que a molécula padrão, a dobragem seria afetada. Outro método bem conhecido e aceite para medir a dobragem é o 43

dicroismo circular (CD) . Medir e comparar os espectros de CD gerados por uma molécula modificada e molécula padrão é rotina (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). A cristalografia é outro método bem conhecido para analisar a dobragem e estrutura. A ressonância magnética nuclear (NMR), mapeamento de péptido digestivo e mapeamento de epitopo são métodos também conhecidos para analisar a dobragem e semelhanças estruturais entre proteínas e polipeptídeos (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992).

Pode ser gerado um perfil de hidrofilicidade Hopp/Woods da sequência da proteína mutante da cisteína da IL- 2 8 ou IL-29, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 3 8, 39, 40 , 41 , 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 , 113 , H5, 117, 123, 125, 127, 129 , 131 , 133, 135, 137, 139 , 141 , 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 15 9 ou 161 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sei.78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88 : 1-18, 1986 e Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). O perfil é baseado numa janela deslizante de seis resíduos. Os resíduos de G, S, e T enterrados e resíduos de Η, Y, e W expostos foram ignorados. Aqueles habilitados na arte reconhecerão que a hidrofilicidade ou hidrofobicidade serão tidas em conta aquando do desenho de modificações na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo mutante de cisteína da IL-28 ou IL-29, de modo a não interromper o perfil estrutural e biológico global. De particular interesse para a substituição são os resíduos hidrofóbicos selecionados a partir do grupo que consiste em Vai, Leu e Ile ou do grupo que consiste em Met, Gly, Ser, Ala, Tyr e Trp.

As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise da similaridade de sequência entre o IFN-α e membros da família da IL-28A, IL-28B, e IL-29 (conforme mostrado nos Quadros 1 e 2). Utilizando métodos tais como a análise "FASTA" descrita 44 anteriormente, são identificadas regiões de elevada similaridade dentro de uma familia de proteínas e utilizadas para analisar sequências de aminoácidos para regiões conservadas. Uma abordagem alternativa para identificar um polinucleotideo VARIANTE com base na estrutura é determinar se uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene da IL-28 ou IL-29 VARIANTE potencial pode hibridar com uma molécula de ácido nucleico, conforme discutido anteriormente.

Outros métodos de identificar aminoácidos essenciais nos polipeptideos da presente invenção são os procedimentos conhecidos na arte, tais como mutagénese sitio-dirigida ou mutagénese de exploração da alanina (Cunningham e Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 88:4498 (1991), Coombs e Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering," em Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). Na última técnica, mutações únicas de alanina são introduzidas a cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes de cisteína resultantes são testadas pela atividade biológica ou bioquímica, como revelado a seguir, para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996). A presente especificação descreve fragmentos funcionais de polipeptideos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína e moléculas de ácido nucleico que codificam tais fragmentos funcionais. Uma IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína "funcional" ou fragmento do mesmo, conforme definido aqui, é caracterizado pela sua atividade proliferativa ou diferenciadora, pela sua capacidade de induzir ou inibir funções da célula especializadas, ou pela sua capacidade de se ligar especificamente a um anticorpo anti-IL-28 ou IL-29 ou recetor IL-28 (seja solúvel ou imobilizado). As atividades especializadas dos 45 polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante na cisteína e como testá-las são reveladas aqui. Conforme previamente descrito aqui, os polipeptídeos IL-28 e IL-29 são caracterizados por conterem seis hélices associadas entre si. Assim, a presente especificação descreve proteínas de fusão que abrangem: (a) moléculas de polipeptídeo que compreendem uma ou mais das hélices descritas anteriormente; e (b) fragmentos funcionais que compreendem uma ou mais destas hélices. A outra porção do polipeptídeo da proteína de fusão pode ser contribuída por outra citocina de estrutura helicoidal ou interferão, tal como IFN-α, ou por um péptido sinal não nativo e/ou secretor não relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão.

Os polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína descritos aqui, incluindo polipeptídeos de comprimento inteiro, fragmentos biologicamente ativos, e polipeptídeos de fusão podem ser produzidos de acordo com técnicas convencionais utilizando células nas quais foi introduzido um vetor de expressão que codifica o polipeptídeo. Conforme utilizado aqui, "células nas quais foi introduzido um vetor de expressão" incluem ambas células que foram diretamente manipuladas pela introdução de moléculas de ADN exógeno e progenia da mesma que contém o ADN introduzido. Células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de células que podem ser transformados ou transfetados com ADN exógeno e crescidas em cultura, e incluem bactérias, células fúngicas e células eucariontes superiores cultivadas. Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introduzir ADN exógeno numa variedade de células hospedeiras são revelados por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

Num outro aspeto, a presente invenção providencia um 46 vetor de expressão (conforme definido nas reivindicações) que compreende os elementos operativamente ligados seguintes: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que codifica um polipeptídeo da invenção; e um terminador da transcrição. A presente especificação descreve um vetor de expressão que compreende uma molécula de ADN isolada e purificada incluindo os seguintes elementos operativamente ligados: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que codifica um polipeptídeo com, pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a part ir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.c ’ s 19, 21 , 23, 25, 27, 2 9, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77 , 79, 81 , 83, 85, 87, 8 9, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 1 .17, 123, 125, 127 , 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157, 159, e 161; e um terminador da transcrição. A molécula de ADN pode ainda compreender uma sequência sinal secretora operativamente ligada ao segmento de ADN. O polipeptídeo codificado pode ainda compreender uma etiqueta de afinidade, conforme descrito aqui. A presente especificação descreve uma célula cultivada que contém o vetor de expressão anteriormente descrito. O polipeptídeo codificado pode, opcionalmente, compreender, pelo menos 15, pelo menos 30, pelo menos 45, ou pelo menos 60 aminoácidos sequenciais de uma sequência de aminoácidos, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161. O polipeptídeo codificado pode, opcionalmente ter atividade antiviral, por exemplo, hepatite B e hepatite C.

Num outro aspeto a presente invenção providencia uma célula cultivada (como definido nas reivindicações) 47 compreendendo um vetor de expressão, como definido nas reivindicações.

Num outro aspeto a presente invenção providencia um método de produzir uma proteína compreendendo: cultivar uma célula, como revelado anteriormente, em condições em que o segmento de ADN é expresso; e recuperar a proteína codificada pelo segmento de ADN, como definido nas reivindicações.

Em geral, uma sequência de ADN que codifica um polipeptídeo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna está operativamente ligado a outros elementos genéticos requeridos para a sua expressão, incluindo geralmente um promotor e terminador de transcrição, dentro de um vetor de expressão. 0 vetor também conterá vulgarmente um ou mais marcadores selecionáveis e uma ou mais origens de replicação, apesar daqueles habilitados na arte reconhecerem que dentro de certos sistemas podem ser providenciados marcadores selecionáveis em vetores separados, e a replicação do ADN exógeno pode ser providenciada pela integração no genoma da célula hospedeira. A seleção de promotores, terminadores, marcadores selecionáveis, vetores e outros elementos é uma questão de desenho de rotina que está ao nível de alguém com habilitação comum na arte. Muitos de tais elementos estão descritos na literatura e estão disponíveis através de fornecedores comerciais. ver,

Para dirigir um polipeptídeo da IL-28 or IL-29 da cisteína mutante para uma via secretora de uma célula hospedeira, é providenciada uma sequência sinal secretora (também conhecida como uma sequência líder, sequência prepro ou sequência pré) no vetor de expressão. A sequência sinal secretora pode ser aquela da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína, por exemplo, SEQ. ID N.° 119 ou SEQ. ID N.° 121, ou pode ser derivada de outra proteína segregada (por exemplo, t-PA; ver, Patente U.S. N.° 5 641 655) ou 48 sintetizada de novo. A sequência sinal secretora está operativamente ligada à sequência de ADN da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina, isto é, as duas sequências são unidas na grelha de leitura correta e posicionadas para dirigir o polipeptideo recentemente sintetizado para a via secretora da célula hospedeira. As sequências sinais secretoras são vulgarmente posicionadas 5' em relação à sequência de ADN que codifica o polipeptideo de interesse, apesar de certas sequências sinais poderem ser posicionadas noutros sitios na sequência de ADN de interesse (ver, por exemplo, Welch et al., Patente U.S. N.° 5 037 743; Holland et al., Patente U.S. N.° 5 143 830).

Uma ampla variedade de células hospedeiras recombinants adequadas inclui, mas não se limita a, organismos hospedeiros procariontes gram-negativos. Estirpes adequadas de E. coli incluem W3110, estirpes derivadas de K12 MM294, TG-1, JM-107, BL21, e UT5600. Outras estirpes adequadas incluem: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4I, DHS, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DHILS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 C600, E. coli HB101, E. coli K12 C600 R. sub. k-M. sub. k-, E. coli K12 RR1 (ver, por exemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Outros hospedeiros procariontes gram-negativos podem incluir Serratia, Pseudomonas, Caulobacter. Os hospedeiros procariontes podem incluir organismos gram-positivos tais como Bacillus, por exemplo, B. subtilis e B. thuringienesis, e B. thuringienesis var. israelensis, bem como Streptonryces, por exemplo, S. lividans, S. ambofaciens, S. fradiae, e S. griseofuscus. Estirpes adequadas de Bacillus subtilus incluem BR151, YB886, MI119, MI120, e B170 (ver, por exemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," em DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). 49 Técnicas convencionais para propagar vetores em hospedeiros procariontes são bem conhecidas daqueles habilitados na arte (ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology. 3a Edição (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)). Numa modalidade, os métodos da presente invenção utilizam IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna expressas na estirpe W3110, que foi depositada na Coleção Americana de Culturas Tipo (ATCC) como ATCC # 27325.

Quando a produção a grande escala da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina utilizando o sistema de expressão da presente invenção é necessária, pode ser utilizada a fermentação em série. Geralmente, a fermentação em série compreende que um frasco de sementes seja preparado como etapa inicial crescendo estirpes de E. coli que expressam IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina num meio adequado em cultura em frasco de agitação para permitir o crescimento até uma densidade ótica (OD) de entre 5 e 20 a 600 nm. Um meio adequado conteria nitrogénio proveniente de uma fonte (s) tal como sulfato de amónio, fosfato de amónio, cloreto de amónio, extrato de levedura, proteínas animais hidrolizadas, proteínas de plantas hidrolizadas ou caseínas hidrolizadas. 0 fosfato será fornecido a partir do fosfato de potássio, fosfato de amónio, ácido fosfórico ou fosfato de sódio. Outros componentes seriam cloreto de magnésio ou sulfato de magnésio, sulfato de ferro ou cloreto de ferro, e outros elementos residuais. O meio de crescimento pode ser suplementado com carbohidratos, tais como frutose, glicose, galactose, lactose, e glicerol, para melhorar o crescimento. Em alternativa, uma cultura de lote alimentado é utilizada para gerar um alto rendimento da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina proteína. As IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina que produz estirpes de E. colí são crescidas em condições semelhantes às descritas para o vaso da etapa inicial utilizado para inocular uma fermentação em série. 50

Após a fermentação as células são colhidas por centrifugação, re-suspensas em tampão de homogenização e homogenizadas, por exemplo, num homogenizador APV-Gaulin (Invensys APV, Tonawanda, Nova Iorque) ou outro tipo de equipamento de rotura de células, tais como moinhos de contas ou sonicadores. Em alternativa, as células são tomadas diretamente do fermentador e homogenizadas num homogenizador APV-Gaulin. A preparação de corpo de inclusão lavada pode ser solubilizada utilizando cloridrato de guanidina (5-8 M) ou ureia (7 - 8 M) contendo um agente redutor tal como beta mercaptoetanol (10 - 100 mM) ou ditiotreitol (5-50 mM). As soluções podem ser preparadas em tampões Tris, fosfato, HEPES ou outros tampões apropriados. Os corpos de inclusão também podem ser solubilizados com ureia (2-4 M) contendo lauril sulfato de sódio (0,1-2%). No processo para recuperar a IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina purificada das estirpes hospedeiras de E. coli transformadas nas quais a IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina é acumulada como corpos de inclusão refráteis, as células sofrem rotura e os corpos de inclusão são recuperados por centrifugação. Os corpos de inclusão são depois solubilizados e desnaturados em 6 M cloridrato de guanidina contendo um agente redutor. A IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina reduzida é depois oxidada numa etapa de renaturação controlada. A IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina redobrada pode ser passada através de um filtro para clarificação e remoção de proteína insolúvel. A solução é depois passada por um filtro para clarificação e remoção da proteína insolúvel. Depois da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina proteína ser redobrada e concentrada, a proteína da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina redobrada é capturada em tampão diluído numa coluna de troca de iões e purificada utilizando cromatografia de interação hidrofóbica.

As células de mamífero cultivadas são hospedeiras 51 adequados no âmbito da presente invenção. Métodos para introduzir ADN exógeno em células hospedeiras de mamífero incluem transfeção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham e Van der Eb, Virology 52:456, 1973), eletroporação (Neumann et al., EMBO J. 1:841-5, 1982), transfeção mediada por Dear-dextrina (Ausubel et al.., ibid.), e transfeção mediada por lipossomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993, e vetores virais (Miller e Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang e Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996). A produção de polipeptídeos recombinantes em células de mamífero cultivadas é revelada, por exemplo, por Levinson et al., Patente U.S. N.° 4 713 339; Hagen et al., Patente U.S. N.° 4 784 950; Palmiter et al., Patente U.S. N.° 4 579 821; e Ringold, Patente U.S. N.° 4 656 134. Células de mamífero cultivadas adequadas incluem as linhas de células COS-1 (ATCC N. ° CRL 1650), COS-7 (ATCC N. ° CRL 1651), BHK (ATCC N.° CRL 1632), BHK 570 (ATCC N. ° CRL 10314), 293 (ATCC N.° CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) e de ovário de hamster chinês (por exemplo CHO-K1; ATCC N. ° CCL 61). Linhas de células adequadas adicionais são conhecidas na arte e estão disponíveis a partir de repositórios públicos tais como a Coleção Americana de Culturas Tipo, Manassas, VA. Em geral, promotores de transcrição fortes são preferidos, tais como os promotores do SV-40 ou Citomegalovírus. Ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 4 956 288. Outros promotores adequados incluem aqueles dos genes da metalotioneina (Patentes U.S. N.°s 4 579 821 e 4 601 978) e o promotor tardio principal de adenovírus. A seleção do fármaco é geralmente utilizada para selecionar células de mamífero cultivadas nas quais foi inserido ADN exógeno. Tais células são vulgarmente referidas como "transfetantes". As células que foram 52 cultivadas na presença de um agente seletivo e são capazes de passar o gene de interesse à sua progenia são referidas como "transfetantes estáveis." Um marcador selecionável preferido é um gene gue codifica resistência ao antibiótico neomicina. A seleção é realizada na presença de um fármaco tipo neomicina, tal como G-418 ou afins. Os sistemas de seleção também podem ser utilizados para aumentar o nivel de expressão do gene de interesse, um processo referido como "amplificação." A amplificação é realizada cultivando transfetantes na presença de um baixo nivel do agente seletivo e depois aumentando a guantidade do agente seletivo para selecionar as células que produzem niveis elevados dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador selecionável amplificável preferido é a dihidrofolato redutase, que confere resistência ao metotrexato. Outros genes de resistência aos fármacos (por exemplo resistência à higromicina, resistência multi-fármacos, puromicina acetiltransferase) também podem ser utilizados. Marcadores alternatives que introduzem um fenótipo alterado, tais como proteina fluorescente verde, ou proteínas da superfície celular tais como: CD4, CD8, Classe I do MHC, fosfatase alcalina placental podem ser utilizadas para separar as células transfetadas das células não transfetadas po tais meios como a classificação FACS ou tecnologia de separação de contas magnéticas.

Outras células eucariontes superiores também podem ser utilizadas como hospedeiros, incluindo células de plantas, células de insetos e células de aves. A utilização de Agrobacterium rhizogenes como um vetor para expresser genes em células de plantas foi revista por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. A transformação das células de insetos e produção de polipeptideos estrangeiros nelas é revelado por Guarino et al., Patente U.S. N.° 5 162 222 e publicação WIPO WO 94/06463. As células de insetos podem ser infetadas com baculovirus recombinante, 53 vulgarmente derivados de vírus de poliedrose nuclear da Autographa californica (AcNPV). Ver, King, L.A. e Possee, R.D., The Baculovírus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; 0'Reilly, D.R. et al., Baculovírus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nova Iorque, Oxford University Press., 1994; e, Richardson, C. D., Ed., Baculovírus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. 0 segundo método de fazer baculovírus recombinante utiliza um sistema baseado em transposão descrito por Luckow (Luckow, V.A, et al., J Virol 67 : 4566-79, 1993). Este sistema é vendido no kit Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza um vetor de transferência, pFastBacl™ (Life Technologies) que contém um transposão Tn7 para mover o ADN que codifica o polipeptídeo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína para um genoma de baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo designado um "bacmídeo." 0 vetor de transferência pFastBacl™ utiliza o promotor polihedrina do AcNPV para dirigir a expressão do gene de interesse, neste caso a IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína. Contudo, pFastBacl™ pode ser modificado até um grau considerável. 0 promotor polihedrina pode ser removido e substituído com o promotor da proteína básica do baculovírus (também conhecido como Pcor, p6.9 ou promotor MP) que é expresso mais cedo na infeção pelo baculovírus, e foi demonstrado ser vantajoso para expressar proteínas segregadas. Ver, Hill-Perkins, M.S. e Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6; 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; e, Chazenbalk, G.D., e Rapoport, B., J.

Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. Em tais construções de vetores de transferência, pode ser utilizada uma versão curta ou longa do promotor da proteína básica. Além disso, os vetores de transferência podem ser construídos para substituir as sequências sinais secretoras da IL-28 ou IL-29 nativas com sequências sinais secretoras derivadas de 54 proteínas de insetos. Por exemplo, a sequência sinal secretora da Ecdisteroide Glucosiltransferase (EGT), melitina da abelha do mel (Invitrogen, Carlsbad, CA) , ou gp67 de baculovírus (PharMingen, San Diego, CA) pode ser utilizada em construções para substituir a sequência sinal secretora nativa da IL-28 ou IL-29. Além disso, os vetores de transferência podem incluir uma fusão no quadro com ADN que codifica uma etiqueta de epítopo no terminal C ou N do polipeptídeo expresso da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína, por exemplo, uma etiqueta de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952-4, 1985). Utilizando técnicas conhecidas na arte, um vetor de transferência contendo IL-28 ou IL-29 mutante de cisteína é transformado em E. Coli, e triado para baemídeos que contêm um gene lacZ interrompido indicativo de baculovírus recombinante. 0 ADN do baemídeo que contém o genoma do baculovírus recombinante é isolado, utilizando técnicas convencionais, e utilizado para transfetar células de Spodoptera frugiperda, por exemplo células Sf9. 0 vírus recombinante que expressa IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína é subsequentemente produzido. Os stocks virais recombinantes são feitos por métodos vulgarmente utilizados na arte. 0 vírus recombinante é utilizado para infetar células hospedeiras, tipicamente uma linha de células derivada a partir da lagarta-do-milho-americana, Spodoptera frugiperda. Ver, em geral, Glick e Pasternak, Molecular_Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Outra linha de células adequada é a linha de células High FiveO™ (Invitrogen) derivada da Trichoplusia ni (Patente U.S. N.° 5 300 435).

As células fúngicas, incluindo células de leveduras, também podem ser utilizadas no âmbito da presente invenção. As espécies de leveduras com particular interesse neste 55 aspeto incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, e Pichia methanolica. Métodos para transformer células de S. cerevisiae com ADN exógeno e produzir polipeptideos recombinantes das mesmas são revelados por, por exemplo, Kawasaki, Patente U.S. N.° 4 599 311; Kawasaki et al., Patente U.S. N.° 4 931 373; Brake, Patente U.S. N.° 4 870 008; Welch et al., Patente U.S. N.° 5 037 743; e Murray et al., Patente U.S. N.° 4 845 075. As células transformadas são selecionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador selecionável, normalmente resistência a fármacos ou pela capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular (por exemplo, leucina). Um sistema de vetor preferido para utilização em Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vetor POT1 revelado por Kawasaki et al. (Patente U.S. N.° 4 931 373), que permite que as células transformadas sejam selecionadas por crescimento em meios contendo glicose. Promotores e terminadores adequados para utilização em leveduras incluem aqueles dos genes de nzimas glicoliticas (ver, por exemplo, Kawasaki, Patente U.S. N.° 4 599 311; Kingsman et al., Patente U.S. N.° 4 615 974; e Bitter, Patente U.S. N.° 4 977 092) e genes de álcool desidrogenase. Ver também Patentes U.S. N.°s 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 e 4 661 454. Os sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polimorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 e Cregg, Patente U.S. N.° 4 882 279. As células de Aspergillus podem ser utilizadas de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente U.S. N.° 4 935 349. Os métodos para transformar Acremonium chrysogenum são revelados por Sumino et al., Patente U.S. N.° 5 162 228. Os métodos para transformar Neurospora são revelados por Lambowitz, Patente 56 U.S. N.° 4 486 533. A utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é revelada nas Patentes U.S. N.°s 5 955 349, 5 888 768 e 6 001 597, Patente U.S. N.° 5 965 389, Patente U.S. N.° 5 736 383, e Patente U.S. N.° 5 854 039. É preferido purificar os polipeptideos e proteínas da presente invenção até ^80% de pureza, mais preferencialmente até ^90% de pureza, ainda mais preferencialmente >95% de pureza, e particularmente preferido é um estado farmaceuticamente puro, que é superior a 99,9% puro em relação a macromoléculas contaminantes, particularmente outras proteínas e ácidos nucleicos, e livre de agentes infeciosos e pirogénicos. Preferencialmente, um polipeptídeo ou proteína purificado é substancialmente livre de outros polipeptideos uo proteínas, particularmete aqueles de origem animal.

Proteínas recombinantes da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína expressas (incluindo polipeptideos quiméricos e proteínas multiméricas) são purificadas por métodos convencionais de purificação de proteínas, tipicamente por uma combinação de técnicas cromatográficas. Ver, em geral, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988; e Scopes, Protein Purificação: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nova Iorque, 1994. As proteínas que compreendem uma etiqueta de afinidade de polihistidina (tipicamente cerca de 6 resíduos de histidina) são purificadas por cromatografia de afinidade numa resina de quelato de níquel. Ver, por exemplo, Houchuli et al., Bio/Technol. 6: 1321-1325, 1988. As proteínas que compreendem uma etiqueta glu-glu podem ser purificadas por cromatografia de imuno-afinidade de acordo com procedimentos convencionais. Ver, por exemplo, Grussenmeyer et al., supra. As fusões de proteína de ligação à maltose são purificadas numa coluna de amilose de acordo com métodos conhecidos na arte. 57

Os polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína também podem ser preparados através de síntese química de acordo com métodos conhecidos na arte, incluindo síntese de fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensação de fragmento ou síntese de solução clássica. Ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptid Synthesis (2a edição), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer e Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; e Atherton et al., Solid Phase Peptid Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989. A síntese in vitro é particularmente vantajosa para a preparação de polipeptídeos mais pequenos.

Utilizando métodos conhecidos na arte, as proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína podem ser preparadas como monómeros ou multímeros; glicosiladas ou não glicosiladas; peguiladas ou não peguiladas; proteínas de fusão; e podem ou não incluir um resíduo do aminoácido metionina inicial. Conjugados da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína utilizados para terapêutica podem compreender frações de polímero solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis. Demonstrou-se que a conjugação de interferões com polímeros solúveis em água potência a meia-vida circulatória do interferão, e reduz a imunogenicidade do polipeptídeo (ver, por exemplo, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), e Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)).

Polímeros solúveis em água adequados incluem polietilenoglicol (PEG), monometoxi-PEG, mo-no-(CICIO) alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona)PEG, tresil monometoxi PEG, propionaldeído monometoxi-PEG, propionaldeído PEG, bis-succinimidil carbonato PEG, homopolímeros de propilenoglicol, um co-polímero oxido de polipropileno/ óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), butiraldeído monometoxi-PEG, butiraldeído PEG, acetaldeído monometoxi-PEG, acetaldeído 58 PEG, metoxil PEG-succinimidil propionato, metoxil PEG-succinimidi butanoato, polivinil álcool, dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em carbohidratos. PEG adequados podem ter um peso molecular de cerca de 600 a cerca de 60,000, incluindo, por exemplo, 5,000 daltons, 12,000 daltons, 20,000 daltons, 30,000 daltons, e 40,000 daltons, que podem ser lineares ou ramificados. Um conjugado da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína também pode compreender uma mistura de tais polímeros solúveis em água.

Um exemplo de um conjugado da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína compreende uma fração da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína e uma frção de óxido de polialquilo anexada ao terminal N da fração da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína. PEG é um óxido de polialquilo adequado. A título ilustrativo, IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína pode ser modificada com PEG, um processo conhecido como "PEGuilação." A PEGuilação da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína pode ser realizada por quaisquer das reações de PEGuilação conhecidas na arte (ver, por exemplo, EP 0 154 316, Delgado et al., Criticai Reviews in Therapeutic Drug

Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin.

Pharmacokinet. 27:290 (1994), e Francis et al., Int J

Hematol 68:1 (1998)). Por exemplo, a PEGuilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou por uma reação de alquilação com uma molécula de polietilenoglicol reativa. Numa abordagem alternativa, os conjugados de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína são formados condensando PEG ativada, na qual um grupo hidroxi ou amino terminal da PEG foi substituído por um ligante ativado (ver, por exemplo,

Karasiewicz et al., Patente U.S. N.° 5 382 657). A PEGuilação por acilação tipicamente requer a reação de um éster ativo derivado da PEG com um polipeptídeo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína. Um exemplo de um éster PEG ativado é PEG esterificado para N-hidroxisuccinimida. Como utilizado aqui, o termo "acilação" inclui os tipos 59 seguintes de ligações entre IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina e um polímero solúvel em água: amida, carbamato, uretano, e afins. Métodos para preparar IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna Peguiladas por acilação compreenderão tipicamente as etapas de (a) reagir um polipeptídeo da IL- 28 ou IL-29 mutante da cisteina com PEG (tal como um éster reativo de um derivado de aldeído de PEG) em condições pelas quais um ou mais grupos PEG anexam-se a IL-28 ou IL- 29 mutante da cisteina, e (b) obter o(s) produto(s) da reação. Em geral, as condições ótimas de reação para reações de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e resultados desejados. Por exemplo, qunto maior a razão de PEG: IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina, maior a percentagem de produto da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina poliPeguilado. A PEGuilação por alquilação geralmente envolve reagir um aldeído terminal, por exemplo, propionaldeído, butiraldeído, acetaldeído, e afins, derivados de PEG com IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina na presença de um agente redutor. Os grupos PEG são preferencialmente anexos ao polipeptídeo através de um grupo -CH2-NH2. A derivação através da alquilação redutiva para produzir um produto monoPeguilado tira partido da reatividade diferencial dos diferentes tipos de grupos amino primários disponíveis para derivação. Tipicamente, a reação é realizada a um pH que permite uma pessoa tirar partido das diferenças pKa entre os grupos amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do resíduo N-terminal da proteína. Através de tal derivação seletiva, a anexação do polímero solúvel em água que contém um grupo reativo tal como um aldeído, a uma proteína é controlada. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína sem modificação significativa de outros grupos reativos tais como os grupos amino de cadeia lateral da lisina. 60 A alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea de molécula conjugada de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina monopolimero pode compreender as etapas de: (a) reagir um polipeptideo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina com uma PEG reativa em condições de alquilação redutiva a um pH adequado para permitir a modificação seletiva do grupo α-amino no terminal amino da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina, e (b) obter o(s) produto(s) de reação. 0 agente redutor utilizado para a alquilação redutiva deveria ser estável em solução aquosa e preferencialmente ser capaz de reduzir apenas a base Schiff formada no processo inicial da alquilação redutiva. Agentes redutores preferidos incluem boro-hidreto de sódio, cianoboro-hidreto de sódio, dimetilamina borano, trimetilamina borano, e piridina borano.

Para uma população substancialmente homogénea de conjugados da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina monopolimero, as condições da reação de alquilação redutiva são aquelas que permitem a anexação seletiva da fração do polimero solúvel em água ao terminal N da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina. Tais condições de reação providenciam geralmente diferenças de pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo α-amino no terminal N. O pH também afeta a razão do polimero para proteina a ser utilizada. Em geral, se o pH é mais baixo, um excess maior de polimero para proteina será desejado porque quanto menos reativo o a-grupo do N-terminal, mais polimero é necessário para atingir as condições ótimas. Se o pH é mais alto, a razão polimero: IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina não precisa de ser tão grande porque estão disponiveis mais grupos reativos. Tipicamente, o pH cairá no intervalo de 3 - 9, ou 3 - 6. Outro fator a ponderar é o peso molecular do polimero solúvel em água. Em geral, quanto maior o peso molecular do polimero, menor o número de moléculas de polimero que pode ser anexado à proteina. Para reações de 61 PEGuilação, o peso molecular típico é cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa, cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, cerca de 12 kDa a cerca de 40 kDa, ou cerca de 20kDa a cerca de 30 kDa. A razão molar do polímero solúvel em água para IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína cairá geralmente no intervalo de 1:1 a 100:1. Tipicamente, a razão molar do polímero solúvel em água para IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína será 1:1 a 20:1 para poliPEGuilação, e 1:1 a 5:1 para monoPEGuilação. Métodos gerais para produzir conjugados compreendendo interferão e frações de polímero solúvel em água são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente U.S. N.° 5 382 657, Greenwald et al., Patente U.S. N.° 5 738 846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997). Espécies peguiladas podem ser separadas de polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína não conjugados utilizando métodos de purificação convencionais, tais como diálise, ultrafiltração, cromatografia de troca de iões, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho, e afins.

As moléculas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína descritas aqui são capazes de se ligar especificamente ao recetor IL-28 e/ou atuar como um agente antiviral. A ligação de polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína ao recetor IL-28 pode ser testada utilizando abordagens estabelecidas. IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína pode ser iodinada utilizando uma pérola de iodo (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as recomendações do fabricante, e a 125I-IL-28 ou 125I-IL-29 podem depois ser utilizados, conforme descrito anteriormente.

Numa primeira abordagem cinquenta nanogramas de I-IL-28 ou 125I-IL-29 podem ser combinados com lOOOng de proteína de fusão da IgG humana do recetor IL-28, na presença ou ausência de possíveis competidores de ligação 62 incluindo IL-28 mutante de cisteina não rotulada, IL-29 mutante de cisteina, IL-28, ou IL-29. As mesmas reações de ligação também seriam realizadas substituindo outras fusões de IgG humana recetor de citocina como controlos para a especificidade. Após incubação a 4°C, a proteína-G (Zymed, SanFransisco, CA) é adicionada à reação, para capturar as fusões de recetor-IgG e quaisquer proteínas ligadas a elas, e as reações são incubadas durante outra hora a 4°C. A sefarose proteína-G é depois colhida, lavada três vezes com PBS e 125I-IL-28 ou 125I-IL-29 ligada é medida por um contador gama (Packard Instruments, Downers Grove,IL).

Numa segunda abordagem, a capacidade das moléculas de inibirem a ligação de 125I-IL-28 ou 125I-IL-29 aos recetores ligados à placa pode ser testada. Um fragmento do recetor IL-28, representando o domínio extracelular, de ligação ao ligando, pode ser adsorvido aos poços de uma placa com 96 poços incubando 100 μΐ de 1 g/mL de solução de recetor na placa durante a noite. Numa segunda forma, uma fusão de recetor-IgG humana pode ser ligada aos poços de uma placa com 96 poços que foi revestida com um anticorpo dirigido contra a porção da IgG humana da proteína de fusão. Após o revestimento da placa com o recetor a placa é lavada, bloqueada com SUPERBLOCK (Pierce, Rockford, IL) e lavada de novo. As soluções que contêm uma concentração fixa de 125I-IL-28 ou 125I-IL-29 com ou sem concentrações crescentes de competidores de ligação potenciais incluindo, IL-28 mutante de cisteina, IL-29 mutante de cisteina, IL-28 e IL-29, e 100 μΐ da solução adicionada a poços apropriadosda placa. Após uma hora de incubação a 4°C a placa é lavada e a quantidade de 125I-IL-28 ou 125I-IL-29 ligada determinada por contagem (Topcount, Packard Instruments, Downers grove, IL) . A especificidade da ligação de 125I-IL-28 ou 125I-IL-29 pode ser definida por moléculas do recetor utilizadas nestes testes de ligação bem como pelas moléculas utilizadas como inibidores. 63

Além da peguilação, a albumina humana pode ser unida geneticamente a um polipeptídeo da presente invenção para prolongar asua meia-vida. A albumina humana é a proteína do sangue que ocorre naturalmente mais prevalente no sistema circulatório humano, persistindo na circulação no corpo por mais de vinte dias. A investigação tem mostrado que as proteínas terapêuticas geneticamente fundidas com a albumina humana têm meias-vidas mais longas. Uma proteína de fusão da albumina IL28 ou IL29, como peguilação, pode providenciar aos pacientes opções de tratamento mais duradouras que oferecem um esquema de administração mais conveniente, com eficácia e segurança semelhante ou melhorada em comparação com os tratamentos atualmente disponíveis (Patente U.S. N.° 6 165 470; Syed et al., Blood, 89(9): 3243-3253 (1997); Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:1904-1908 (1992); e Zeisel et al., Horm. Res., 37:5-13 (1992) ) .

Como a peguilação previamente mencionada e a albumina humana, uma porção Fc da molécula da IgG humana pode ser fundida com um polipeptídeo da presente invenção. A proteína de fusão resultante pode ter uma meia-vida circulante melhorada devido à fração Fc (Patente U.S. N.° 5 750 375, Patente U.S. N.° 5843 725, Patente U.S. N.° 6 291 646; Barouch et al., Journal of Immunology, 61:1875-1882 (1998); Barouch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97(8):4192-4197 (April 11, 2000); e Kim et al., Transplant Proc., 30(8):4031-4036 (Dec. 1998)). Métodos para detetar e diagnosticar infeções virais são bem conhecidos daqueles habilitados na arte. O método exato utilizado para medir uma redução no vírus em resposta à administração de moléculas da presente invenção será dependente da espécie de vírus e de se a infeção é in vitro ou in vivo. Se a infeção é in vivo, a medição e deteção da infeção e alterações nos níveis da infeção, podem variar dependendo do inivíduo infetado, tipo de infeção virai, e 64 afins. Por exemplo, os métodos incluem, mas não se limitam a, medir alterações nas contagens de células CD4, testes serológicos, medir o ADN do virus e o ARN do virus por testes de reação em cadeia da polimerase convencionais e em quantitativos tempo real, niveis de anticorpo induzidos pelo virus, imunofluorescência e ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas, efeitos citopáticos, e histologia.

Os efeitos antivirais podem ser diretos ou indiretos. Um exemplo de um efeito antiviral direto é, por exemplo, onde o polipeptideo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna compete por um recetor ou co-recetor virai para bloquear a infeção virai. A IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna pode ser dada por via parentérica para prevenir a infeção virai ou para reduzir a replicação virai e re-infeção em curso (Gayowski, T. et al., Transplantation 64:422-426, 1997). Um exemplo de um efeito antiviral indireto é, por exemplo, onde uma IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina pode ligar a CD4 ou a outro recetor leucócito e exibir efeitos antivirais modulando os efeitos da resposta imune.

De particular interesse é a utilização de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina como uma terapêutica antiviral para leucemias virais (HTLV), SIDA (HIV), ou infeções virais gastrointestinais causadas por, por exemplo, rotavirus, calicivirus (por exemplo, Agente Norwalk) e certas estirpes de adenovirus patogénicos, Hepatite B e C.

Tipos adicionais de infeções virais para utilizaçãode IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina incluem, mas não se limitam a: infeções causadas por virus de ADN (por exemplo, Herpesvirus como virus do Herpes Simples, virus de Epstein-Barr, Citomegalovirus; poxvirus como o virus da variola; Hepadnavirus (por exemplo, virus da Hepatite B); Papilomavirus; Adenovirus); virus de ARN (por exemplo, HIV I, II; HTLV I, II; Poliovirus; Hepatite A; coronoviirus, tais como sindrome respiratória aguda súbita (SARS); Ortomixovírus (por exemplo, virus da Influenza); 65

Paramixovírus (por exemplo, vírus do sarampo); vírus da raiva; vírus da Hepatite C) , Flavivírus, vírus da Influenza; calicivírus; vírus da raiva, vírus da peste, Arenavírus, e afins. Além disso, exemplos dos tipos de doenças relacionadas com vírus para as quais IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna poderia ser utilizada incluem, mas não se limitam a: imunodeficiência adquirida; síndrome respiratória aguda severo (SARS); Hepatite; Gastroenterite; doenças hemorráqicas; enterite; cardite; encefalite; paralisia; broquiolite; doença respiratória superior e inferior; Papilomatose respiratória; artrite; doença disseminada, meningite, Mononucleose. Além disso, a IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna pode ser utilizada em várias aplicações para imunoterapêutica antiviral, e em conjunto com outras citocinas, outras proteínas ou pequenas moléculas antivirais, e afins.

Clinicamente, os testes diagnósticos para HCV incluem ensaios serológicos para anticorpos e testes moleculares para partículas virais. Os imunoensaios enzimáticos estão disponíveis (Vrielink et al., Transfusion 37:845-849, 1997), mas podem precisar de confirmação utilizando testes adicionais tais como um ensaio imunoblot (Pawlotsky et al., Hepatology 27:1700-1702, 1998). Os ensaios qualitativos e quantitativos geralmente utilizam técnicas de reação em cadeia da polimerase, e são preferidos para avaliar virémia e respostas ao tratamento (Poynard et al., Lancet 352:1426-1432, 1998; McHutchinson et al., N. Engl. J. Med. 339:1485-1492, 1998) . Estão disponíveis vários testes comerciais, tais como, RT-PCR quantitativa (Amplicor HCV Monitor™, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) e um ensaio de amplificação do sinal de ADN (ácido desoxirribonucleico) ramificado (Quantiplex™ HCV RNA Assay [bDNA], Chiron Corp., Emeryville, CA) . Um teste de laboratório não específico para infeção por HCV mede o nível de alanina aminotransferase (ALT) e é barato e está prontamente 66 disponível (Painel da Conferência sobre Desenvolvimento do Consenso entre Institutos Nacionais de Saúde, Hepatology 26 (Suppl. 1):2S-10S, 1997). A avaliação histológica da biópsia ao figado é geralmente considerada a forma mais precisa de determininar a progressão do HCV (Yano et al., Hepatology 23:1334-1340, 1996.) Para uma revisão de testes clinicos sobre p HCV, ver, Lauer et al., N. Engl. J. Med. 345:41-52, 2001.

Existem vários modelos in vivo para testar HBV e HCV que são conhecidos daqueles habilitados na arte. Em relação ao HCV, por exemplo, o modelo Replicão do HCV é um sistema baseado em células para estudar a eficácia de um fármaco em inibir a replicação do HCV (Blight et al., Science, 290(5498):1972-1974 (Dec. 8, 2000); e Lohmann et al., Science, 285(5424):110-113 (July 2, 1999)). Um modelo HBV in vitro bem conhecido e aceite por alguém habilitado na arte pode ser utilizado para determinar a atividade anti-HBV de uma molécula teste é revelado em Korba et al., Antiviral Res., 19(1):55-70 (1992) e Korba et al., Antiviral Res., 15(3):217-228 (1991).

Por exemplo, os efeitos de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina em mamíferos infetados com HBV podem ser avaliados utilizando a marmota como um modelo. Resumindo, as marmotas cronicamente infetadas com vírus da hepatite da marmota (WHV) desenvolvem hepatite e carcinoma hepatocelular que é semelhante à doença em humanos cronicamente infetados com HBV. O modelo foi utilizado para a avaliação pré-clínica da atividade antiviral. Foi estabelecida uma estirpe de WHV cronicamente infetada e os neonatos são inoculados com soro para providenciar animais para estudar os efeitos de certos compostos utilizando este modelo. (Para uma revisão, ver, Tannantet al., ILAR J. 42(2): 89-102, 2001). Os chimpanzés também podem ser utilizados para avaliar o efeito da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina em mamíferos infetados com HBV. Utilizando chimpanzés, a caracterização do HBV foi 67 feita e estes estudos demonstraram que a doença do chimpanzé era notavelmente semelhante à doença em humanos (Barker et al., J. Inject. Dis. 132:451-458,1975 e Tabor et al., J. Infect. Dis. 147:531-534, 1983.) 0 modelo do chimpanzé foi utilizado para avaliar vacinas (Prince et al., Em: Vaccines 97, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.) As terapêuticas para HIV são testadas de forma rotineira utilizando primatas não humanos infetados com o virus da imunodeficiência simia (para uma revisão, ver, Hirsch et al., Adv. Pharmcol. 49:437-477, 2000 e Nathanson et al., AIDS 13 (suppl. A):S113-S120,1999.) Para uma revisão do uso de primatas não humanos em HIV, hepatite, malária, virus sincicial respiratório, e outras doenças, ver, Sibal et al., ILAR J. 42 (2):74-84, 2001. Um modelo de ratinho transgénico desenvolvido recentemente (Guidotti et al., Journal of Virology 69: 6158-6169, 1995) suporta a replicação de elevados niveis de HBV infecioso e tem sido utilizado como um modelo quimioterapêutico para a infeção por HBV. Os ratinhos transgénicos são tratados com fármacos antivirais e os niveis de ADN e ARN do HBV são medidos no figado e soro dos ratinhos transgénicos após o tratamento. Os niveis da proteina de HBV também podem ser medidos no soro do ratinho transgénico após o tratamento. Este modelo tem sido utilizado para avaliar a eficácia da lamivudina e IFN-alfa em reduzir os títulos virais de HBV (Money et al., Antiviral Therapy 3:59-68,1998).

Além disso, polipeptídeos e proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína podem ser caracterizados pela sua atividade, ou seja, modulação da proliferação, diferenciação, migração, adesão, expressão de genes ou metabolismo de tipos de células recetivas. A atividade biológica de polipeptídeos e proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína é testada utilizando ensaios in vitro ou in vivo desenhados para detetar a proliferação, diferenciação, migração ou adesão celular; ou aterações na 68 expressão dos genes ou metabolismo celular (por exemplo, produção de outros fatores de crescimento ou outras macromoléculas). Muitos ensaios adequados são conhecidos na arte, e ensaios representativos são revelados aqui. Os ensaios que utilizam células cultivadas são os mais convenientes para classificação, tais como para determinar os efeitos de substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos. A atividade das proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna pode ser medida in vitro utilizando células cultivadas ou in vivo administrando moléculas da invenção reivindicada a um modelo animal apropriado. Os ensaios que medem a proliferação ou diferenciação celular são bem conhecidos na arte. Por exemplo, os ensaios que medem a proliferação incluem tais ensaios como quimiossensibilidade a corante vermelho neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990), incorporação de nucleotídeos radiomarcados (conforme revelado por, por exemplo, Raines e Ross, Methods Enzymol. 109:749-773, 1985; Wahl et al., Mol. Cell Biol. 8:5016-5025, 1988; e Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989), incorporação de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) no ADN de células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), e utilização de sais de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Câncer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; e Scudiero et al., Câncer Res. 48:4827-4833, 1988) . A diferenciação pode ser testada utilizando células precursoras adequadas que podem ser induzidas para se diferenciarem num fenótipo mais maduro. Os ensaios que medem a diferenciação incluem, por exemplo, medição de marcadores de superfície celular associados com a expressão específica de fase de um tecido, atividade enzimática, atividade funcional ou alterações morfológicas (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 69 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todas incorporadas aqui por referência). A atividade do polipeptídeo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna também pode ser detetada utilizando ensaios desenhados para medir a produção induzida pela IL-28 e IL-29 de um ou mais fatores de crescimento adicionais ou outras macromoléculas. Foi demonstrado que certos membros da família de proteínas compreendendo IL-28 e IL-29 aumentam os números de monócitos circulantes in vivo. A ativação dos monócitos é importante e ambas imunidade inata e adaptativa. Por exemplo, foi demonstrado que a ativação de monócitos estimula a apresentação ao antígeno através de vários mecanismos. A apresentação ao antígeno promove a ativação e proliferação das células T, ambas citotóxicas e células T auxiliares. A maturação e ativação de células dendríticas também promovem a ativação de células T e tanto a imunidade inata como adaptativa. Também foi demonstrado que os aumentos em monócitos e macrófagos ativados aumentam a atividade citolítica. Por isso, IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína será útil como um agente anti-infecioso, potenciando as respostas imunes inata, mediadas pelas células e humoral. Foram observados aumentos na coloração por ICAM em monócitos CD14+ o que sugere que a IL-28 e IL-29 desempenham um papel na ativação dos monócitos. Enquanto os dados mostra que os membros da família promovem uma resposta anti-viral ao vírus, as bactérias e parasitas também podem ser afetados.

Os ensaios de ativação dos monócitos são realizados (1) para observar a capacidade das proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína de estimularem ainda mais a ativação dos monócitos, e (2) para examinar a capacidade das proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína para modularem a ativação dos monócitos induzida pela anexação ou induzida pelas endotoxinas (Fuhlbrigge et al., J. Immunol. 138: 3799-3802, 1987). Os níveis de IL-Ια e TNFa 70 produzidos em resposta à ativação são medidos por ELISA (Biosource, Inc. Camarillo, CA). As células monócito/macrófago, em virtude de CD14 (recetor LPS), são requintadamente sensíveis a endotoxinas, e as proteínas que moderam os níveis da atividade tipo endotoxina ativarão estas células.

Os níveis aumentados de monócitos sugerem que a IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna podem ter um efeito direto sobre as células progenitoras mieloides na medula óssea. A diferenciação crescente de células progenitoras mieloides em monócitos é essencial na restauração da imnunocompetência, por exemplo, após a quimioterapia. Assim, a administração de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína a pacientes que estão a receber quimioterapia poderia promover a sua recuperação e capacidade para resistirem à infeção vulgarmente associada com os regimes de quimioterapia. Assim, expandir os números de monócitos ou células progenitoras de monócitos atavés do cultivo de medula óssea ou cultivando células sanguíneas periféricas com as moléculas da presente invenção de modo a que há um aumento nos monócitos ou nas células progenitoras de monócitos para atingir este efeito in vitro ou ex vivo. A presente especificação descreve a administração in vivo das moléculas da presente invenção a um mamífero em necessidade de monócitos ou células progenitoras de monócitos aumentados. Os monócitos ou células progenitoras de monócitos aumentados podem ser medidos utilizando métodos bem conhecidos dos pofissionais clínicos, médicos, e outras pessoas habilitadas na arte. As células de monócitos estão incluídas na linhagem mieloide das células hematopoiéticas, por isso efeitos noutras células naquela linhagem não seria invulgar. Por exemplo, quando um fator facilita a diferenciação ou proliferação de um tipo de célula na linhagem mieloide ou linfoide, isto pode afetar a produção de outras células com um progenitor ou célula estaminal 71 comum. A atividade hematopoiética das proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína pode ser testada em várias células hematopoiéticas em cultivo. Ensaios preferidos incluem ensaios de colónia de medula óssea primária eensaios de colónia restritos pela linhagem de fase tardia, que são conhecidos na arte (por exemplo, Holly et al., WIPO Publicação WO 95/21920). As células da medula colocadas num meio semi-sólido adequado (por exemplo, 50% metilcelulose contendo 15% soro bovino fetal, 10% albumina de soro bovino, e 0,6% mistura de antibiótico PSN) são incubadas na presença do polipeptídeo teste, depois examinado microscopicamente para a formação de colónias. Os fatores hematopoiéticos conhecidos são utilizados como controlos. A atividade mitogénica de polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína em linhas de células hematopoiéticas podem ser medidas, conforme revelado anteriormente. A migração celular é ensaiada essencialmente conforme revelada por Káhler et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17:932-939, 1997). Uma proteína é considerada quimiotática se induz a migração de células de uma área de concentração baixa em proteína para uma área de concentração elevada de proteína. Um ensaio típico é realizado utilizando câmaras de Boyden modificadas com uma membrana de polistrireno separando as duas câmaras (Transwell; Corning Costar Corp.). A amostra teste, diluída em meio contendo 1% BSA, é adicionada à câmara inferior de uma placa com 24 poços contendo Transwell. As células são depois colocadas na inserção Transwell que foi pré-tratada com 0,2% gelatina. A migração celular é medida após 4 horas de incubação a 37°C. As células não migradoras são limpas da membrana Transwell, e células anexas à face inferior da membrana são fixas e coradas com 0,1% violeta cristal. As células coradas são depois extraídas com 10% ácido acético e a absorvância é medida a 600 nm. A migração é depois 72 calculada a partir da curva de calibração padrão. A migração celular também pode ser medida utilizando o método matrigel de Grant et al. ("Angiogenesis as a component of epithelial-mesenchymal interactions" em Goldberg e Rosen, Epithelial-Mesenchymal Interaction in Câncer, Birkháuser Verlag, 1995, 235-248; Baatout, Anticancer Research 17:451-456,1997). A atividade da adesão celular é testada essencialmente conforme revelado por LaFleur et al. (J. Biol. Chem. 272:32798-32803, 1997). Resumidamente, as placas de microtitulação são revestidas com a proteína teste, locais não específicos são bloqueados com BSA, e células (tais como células do músculo liso, leucócitos, ou células endoteliais) são colocadas a uma densidade de aproximadamente 104 - 105 células/poço. As células são incubadas a 37°C (tipicamente durante cerca de 60 minutos), depois as células não aderentes são removidas por lavagem gentil. As células aderentes são quantitativas por métodos convencionais (por exemplo, corando com violeta de cristal, lisando as células, e determininar a densidade ótica do lisado). Os poços controlo são revestidos com uma proteína adesiva conhecida, tal como fibronectina ou vitronectina. A expressão de polinucleotídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína em animais providencia modelos para o estudo adicional dos efeitos biológicos de sobre produção ou inibição da atividade da proteína in vivo. Os polinucleotídeos codificantes da IL-28 ou IL-29 e polinucleotídeos antissenso podem ser introduzidos em animais teste, tais como ratinhos, utilizando vetores virais ou ADN nú, ou animais transgénicos podem ser produzidos.

Uma abordagem in vivo para testar proteínas da presente invenção utiliza sistemas de entrega virais. Vírus exemplares para este fim incluem adenovírus, herpesvírus, retrovírus, vírus vaccinia, e vírus adeno-associados (AAV). 73

Os adenovirus, um virus de ADN de cadeia dupla, é atualmente o vetor de transferência de genes melhor estudado para entrega de ácidos nucleios heterólogos. Para uma revisão, ver Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; e Douglas e Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997. 0 sistema adenovirus oferece várias vantagens. Os adenovirus podem (i) acomodar inserções de ADN relativamente grandes; (ii) ser crescidos até titulos elevados; (iii) infetar um espectro amplo de tipos de células de mamíferos; e (iv) ser utilizados com muitos promotores diferentes incluindo promotores ubiquos, específicos de tecido, e reguláveis. Porque os adenovirus são estáveis na corrente sanguínea, eles podem ser administrados por injeção intravenosa. Ver também, Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; e Johnston e Tang, Meth. Cell Biol. 43:353-365, 1994.

Os ratinhos transgénicos, produzidos por engenharia genética para expressar um gene de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina, e ratinhos que exibem uma ausência completa de função do gene de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina, referidos como "ratinhos knockout" (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992), também podem ser gerados (Lowell et al., Nature 366:740-742, 1993). Estes ratinhos podem ser empregues para estudar o gene da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina e a proteina codificado por ele num sistema in vivo. Os promotores preferidos para a expressão transgénica incluem promotores dos genes da metalotioneina e albumina. A maioria das citocinas bem como de outras proteínas produzids pelos linfócitos ativados desempenham um papel biológico importante na diferenciação celular, ativação, recrutamento e homeostase de células em todo o corpo. Espera-se que IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina e inibidores da sua atividade tenham uma variedade de aplicações terapêuticas. Estas aplicações terapêuticas 74 incluem o tratamento de doenças que requerem a requlação imune, incluindo doenças autoimunes tais como artrite reumatóide, esclerose múltipla, miastenia grave, lúpus eritematoso sistémico, e diabetes. A IL-28 ou IL-29 podem ser importantes na regulação da inflamação, e, por isso, seriam úteis no tratamento da artrite reumatóide, asma e sepsia. Pode existir um papel da IL-28 ou L-29 na mediação da tumorgénese, em que um antagonista da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna seria útil no tratamento de cancro. A IL-28 ou IL-29 pode ser útil na modulação do sistema imune, onde os antagonistas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna podem ser utilizados para reduzir a rejeição de enxertos, prevenir a doença enxerto-vs-hospedeiro, aumentar a imunidade a doenças infeciosas, tratar pacientes imunocomprometidos (por exemplo, pacientes HIV+) , ou na melhoria de vacinas.

Foi demonstrado que os membros da família de proteínas da presente invenção têm um efeito antiviral que é semelhante ao interferão-α. 0 interferão foi aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de doenças autoimunes, verrugas genitais, hepatite crónica C, carcinoma da bexiga, carcinoma cervical, papilomatose laríngea, micose fungoide, hepatite crónica B, sarcoma de Kaposi em pacientes infetados com o vírus da imunodeficiência humana, melanoma maligno, tricoleucemia, e esclerose múltipla. Além disso, a IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína pode ser utilizada para tratar formas de arteriosclerose, tais como aterosclerose, inibindo a proliferação celular. Em conformidade, a presente especificação descreve utilizando proteínas, polipeptídeos, e péptidos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína com atividade IL-28 e IL-29 para tratar tais condições patológicas, bem como para tratar retinopatia. A especificação descreve a utilização de proteínas, polipeptídeos, e péptidos de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína com atividade IL-28 e IL-29 para distúrbios 75 linfoproliferativos, incluino linfomas de células B, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocitica aguda, linfomas de não Hodgkin, mieloma múltiplo, leucemia mielocitica aguda, leucemia mielocitica crónica.

Também foi demonstrado que os interferões induzem a expressão de antigenos por células cultivadas (ver, por exemplo, Auth et al., Hepatology 18:546 (1993), Guadagni et al. , Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994), Girolomoni et al.,

Eur. J. Immunol. 25:2163 (1995), e Maciejewski et al.,

Blood 85:3183 (1995). Esta atividade potência a capacidade de identificar novos antigenos associados com tumores in vitro. Além disso, a capacidade dos interferões de aumentarem o nivel de expressão dos antigenos de tumor humano indica que os interferões podem ser úteis num cenário de adjuvante para imunoterapêutica ou potenciar a imunocintigrafia utilizando anticorpos contra antigenos anti-tumorais (Guadagni et al., Câncer Immunol. Immunother. 26:222 (1988); Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers 9:53 (1994)). Assim, a presente invenção inclui a utilização de proteínas, polipeptídeos e péptidos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina com atividade IL-28 e IL-29 como um adjuvante para imunoterapêutica ou para melhorar a imunocintigrafia utilizando anticorpos contra antigenos anti-tumorais. A atividade e efeito de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina na progressão do tumor e metástase podem ser medidos in vivo. Vários modelos de ratinhos singeneicos foram desenvolvidos para estudar a influência de polipeptideos, compostos ou outros tratamentos na progressão do tumor. Nestes modelos, as células tumorais passadas em cultivo são implantadas em ratinhos da mesma estirpe que o dador do tumor. As células desenvolver-se-ão em tumores com caracteristicas semelhantes nos ratinhos recetores, e a metástase também ocorrerá em alguns dos modelos. Modelos de tumor apropriados para os nossos 76 estudos incluem o carcinoma do pulmão de Lewis (ATCC N.° CRL-1642) e o melanoma B16 (ATCC N.° CRL-6323), entre outros. Estas são ambas linhas tumorais vulgarmente utilizadas, singeneicas para o ratinho C57BL6, que são prontamente cultivadas e manipuladas in vitro. Os tumores resultantes da implantação de qualquer uma destas linhas de células são capazes de formar metástases para o pulmão em ratinhos C57BL6. 0 modelo do carcinoma do pulmão de Lewis foi recentemente utilizado em ratinhos para identificar um inibidor da angiogénese (0'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328,1994). Os ratinhos C57BL6/J são tratados com um agente experimental seja por injeção diária da proteina recombinante, agonista ou antagonista ou por uma injeção única de adenovirus recombinante. Três dias após este tratamento, 105 a 106 células são implantadas sob a pele dorsal. Em alternativa, as próprias células podem ser infetadas com adenovirus recombinante, tais como um que expressa IL-28 e IL-29 mutante de cisterna, antes da implantação de modo que a proteina é sintetizada no local do tumor ou intracelularmente, em vez de sistemicamente. Os ratinhos normalmente desenvolvem tumores visiveis em 5 dias. É permitido aos tumores crescerem durante um periodo de até 3 semanas, durante cujo tempo estes podem atingir um tamanho de 1500 - 1800 mm3 no grupo tratado controlo. O tamanho do tumor e o peso corporal são cuidadosamente monitorizados ao longo da experiência. No momento do sacrifício, o tumor é removido e pesado juntamente com os pulmões e o figado. Foi demonstrado que o peso do pulmão está bem correlacionado com a carga de tumor metastático. Como uma medida adicional, as metástases da superfície do pulmão são contadas. O tumor, pulmões e figado ressetados são preparados para exame histopatológico, imunohistoquimica, e hibridação in situ, utilizando métodos conhecidos na arte e descritos aqui. A influência do polipeptideo expresso em questão, por exemplo, IL-28 e IL- 77 2 9 mutante de cisteina, sobre a capacidade do tumor de recrutar vasculatura e passar por metástase pode, assim, ser avaliada. Além disso, além de utilizar adenovirus, as células implantadas podem ser transfetadas de forma transitória com IL-28 e IL-29 mutante de cisteina. A utilização de transfetantes estáveis da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina, bem como a utilização de promotores induziveis para ativar a expressão da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina in vivo são conhecidos na arte e podem ser utilizados neste sistema para avaliar a indução de metástase. Além disso, meio condicionado purificado de IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina pode ser diretamente injetado neste modelo de ratinho, e ser, assim, utilizado neste sistema. Para referência geral ver, 0'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994; e Rusciano D, et al. Murine Models of Figado Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995. IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina também podem ser utilizados para tratar miocardite, um distúrbio que surge quando o coração está envolvido num processo inflamatório. Pensa-se que a infiltração de linfócitos e a miocitólise resultam após a infeção pelo virus, bactérias, fungos ou parasitas (ver, por exemplo, Brodison et al., J. Infection 37:99 (1998)). IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina podem ser injetados por via intravenosa ou subcutânea para tratar infeções associadas com a miocardite. IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina também podem ser administradas por via intravenosa como uma citocina imunoreguladora no tratamento de miocardite autoimune. As dosagens de interferão podem ser extrapoladas utilizando um modelo autoimune de miocardite no ratinho A/J (Donermeyer, et al., J. Exp. Med. 182 :1291 (1995)) .

Reportagens recentes realçaram o papel dos interferes de tipo I na prevenção de diabetes induzidos por virus induzindo um forte estado antiviral em células beta 78 pancreáticas na fase inicial da infeção virai (Flodstroem et al., Nature Immunology 3, 373 - 382 (2002)). Isto previne a perda de células beta devido a morte cellular induzida pelo virus e autoimunidade que a acompanha. A IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna também induz um estado antiviral nas células que expressa o recetor IL-28. O recetor IL-28 é altamente expresso no tecido pancreático e, portanto, a IL-28 e IL-29 podem desempenhar um papel na prevenção de diabetes induzidos por virus devido à morte de células beta. Além disso, o papel dos interferões de tipo I na prevenção de diabetes induzidos por virus pode ser extendido a outras doenças autoimunes induzidas por virus e, portanto, a IL-28 e IL-29 também podem desempenhar um papel na prevenção de outras doenças tais como esclerose muscular, lúpus, e doenças autoimunes induzidas por virus em tecidos que expressam o recetor IL-28.

Os polipeptideos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outros agentes vasculogénicos ou angiogénicos, incluindo VEGF. Quando se utiliza IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina em combinação com um agente adicional, os dois compostos podem ser administrados simultâneamente ou sequencialmente conforme apropriado para a condição patológica especifica a ser tratada. A IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina sera útil no tratamento de tumorgénese, e, portanto, seria útil no tratamento de cancro. Uma IL-28 pode inibir as linhas de tumor das células B, o que sugere que podem existir benefícios terapêuticos no tratamento de pacientes com IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina de modo a induzir as células de tumor de célula B num estado menos proliferativo. O ligando poderia ser administrado em combinação com outros agentes já em uso incluindo ambos agentes quimioterapêuticos convencionais, bem como moduladores imunes, tais como o interferão alfa. 79

Demonstrou-se que os interferões alfa/beta são eficazes no tratamento de algumas leucemias e modelos de doença animal, e os efeitos inibidores do crescimento do interferão-alfa e IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina podem ser aditivos para linhas de células derivadas do tumor de células B. A presente especificação descreve uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo isolado selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 2, 4 ,6,8, 10, 13 , 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29 , 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75 , 77, 79, 81, 83 , 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 r 117, 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135 , 137, 139, 141, , 143 t 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161, e um veí culo farmaceuticamente aceitável.

Para uso farmacêutico, proteínas da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina são formuladas para entrega tópica ou parentérica, particularmente intravenosa ou subcutânea, de acordo com os métodos convencionais. Em geral, as formulações farmacêuticas incluirão polipeptídeo da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina, solução salina tamponada, 5% dextrose em água, ou afins. As formulações podem, ainda, incluir um ou mais excipientes, conservantes, solubilizadores, agentes tamponantes, albumina para prevenir a perda de proteína nas superfícies do frasco, etc. Os métodos de formulação são bem conhecidos na arte e são revelados, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a edição, 1995. IL-28 ou IL-29 mutante da cisteina serão preferencialmente utilizadas numa concentração de cerca de 10 a 100 yg/ml de volume total, apesar de poderem ser utilizadas concentrações no intervalo de 1 ng/ml a 1000 yg/ml. Para aplicação tópica, tal como para a promoção de cura de feridas, a proteína sera aplicada no interval de 0,1-10 yg/cm2 da área da 80 ferida, com a dose exata determinada pelo clinico de acordo com os padrões aceites, tendo em consideração a natureza e severidade da condição patológica a ser tratada, as caracteristicas do paciente, etc. A determinação da dose está dentro do nível da habilitação comum na arte. A dosagem é diária ou intermitente ao longo do período de tratamento. A administração intravenosa sera por injeção por bólus ou infusão ao longo de um período típico de uma a várias horas. Também podem ser empregues formulações de libertação prolongada. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IL-28 or IL-29 mutante de cisteína é uma quantidade suficiente para produzir uma alteração clinicamente significativa na condição patológica tratada, tal como uma alteração clinicamente significativa na carga virai ou função imune, uma redução significativa na morbidez, ou uma classificação histológica significativamente aumentada. A título ilustrativo, as formulações farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit compreendendo um recipiente que compreende um polipeptídeo da IL-28 ou IL29 da presente invenção. Os polipeptídeos terapêuticos podem ser providenciados na forma de uma solução injetável para doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injeção. Em alternativa, tal kit pode incluir um dispersor de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para administração de um polipeptídeo terapêutico. Tal kit pode, ainda, compreender informação escrita com indicações e uso da composição farmacêutica. Além disso, tal informação pode incluir uma declaração de que a formulação do polipeptídeo da IL-28 ou IL29 está contra-indicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida ao polipeptídeo da IL-28 ou IL29. A presente especificação descreve um método de produzir um anticorpo para um polipeptídeo compreendendo: 81 inocular um animal com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 19, 21, 23, 25, 27, 29, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 75 , 77, 79, 81, 83, 85 , 87, 89, 91, 93, 95 , 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, . 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, . 147, 149, 151, , 153 i, 155 , 157 , 159, e 161, em que o polipeptideo despoleta uma resposta imune no animal para produzir o anticorpo; e isolar o anticorpo do animal. A presente especificação descreve um anticorpo (por exemplo, anticorpo neutralizante) produzido pelo método conforme revelado anteriormente, em que o anticorpo se liga a um polipeptideo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N.°s 19, 21, 23, , 25, 27, 29, 36, 37, 38 , 39, 40, 41, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, r 97, 99, 101, 103, 105 , 107, 109, 111, 113, 115, . 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133 , 135, 137, 139, 141, 143, . 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e 161. 0 anticorpo revelado anteriormente pode ligar-se especificamente a um polipeptideo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ. ID N . °s 19, 21, 23, , 25, 27, 29, 36, 37 ', 38 , 39, 40, 41, 75, 7 7, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 , 95 , 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, e ; 161 . A presente especificação descreve um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um polipeptideo, conforme descrito aqui. 0 anticorpo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste num anticorpo policlonal, num anticorpo monoclonal murino, num anticorpo humanizado derivado de um anticorpo monoclonal murino, num fragmento de anticorpo, e num anticorpo monoclonal humano. 0 fragmento de anticorpo pode ser conforme descrito aqui, em que dito fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Pv, scFv, e unidade de reconhecimento minima. 82 A presente especificação descreve um anticorpo anti-idiotipo que se liga especificamente ao anticorpo, conforme descrito aqui.

Como utilizado aqui, o termo "anticorpos" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, fragmentos de ligação ao antigeno dos mesmos, tais como os fragmentos F(ab')2 e Fab, anticorpos de cadeia simples, e afins, incluindo anticorpos produzidos por engenharia genética. Os anticorpos não humanos podem ser humanizados enxertando CDRs não humanas numa estrutura humana e regiões constantes, ou incorporando os dominios variáveis inteiros não humanos (opcionalmente "encobrindo-os" com uma superficie tipo humana por substituição dos residuos expostos, em que o resultado é um anticorpo "superficial"). Em algumas ocasiões, os anticorpos humanizados podem reter residuos não humanos dentro dos dominios da estrutura da região variável humana para potenciar caracteristicas de ligação adequadas. Através dos anticorpos humanizantes, a meia-vida biológica pode ser aumentada, e o potencial para reações imunes adversas no momento da administração para os humanos é reduzido. Alguém habilitado na arte pode gerar anticorpos humanizados com dominios constantes específicos e diferentes (isto é, diferentes subclasses de Ig) para facilitar ou inibir várias funções imunes associadas com os dominios constantes do anticorpo particular. Os anticorpos são definidos como ligados especificamente se eles se ligam a polipeptideo ou proteina da IL-28 ou IL-29 mutante da cisterna com uma afinidade de, pelo menos, 10 vezes superior à afinidade de ligação ao polipeptideo ou proteina controlo (não IL-28 e IL-29 mutante de cisterna). A afinidade de um anticorpo monoclonal pode ser prontamente determinada por alguém com habilitação comum na arte (ver, por exemplo, Scatchard, Ann. NY. Acad. Sei. 51: 660-672, 1949) .

Os métodos para preparar anticorpos policlonais e 83 monoclonais são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hibridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982, que está incorporada aqui por referência) . 0 imunogene do polipeptídeo pode ser uma molécula de comprimento inteiro ou uma porção do mesmo. Se a porção do polipeptídeo é "tipo hapteno", tal porção pode ser unida ou ligada, de forma vantajosa, a um veículo macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) , albumina do soro bovino (BSA) ou toxóide tetânico) para imunização.

Pode ser utilizada uma variedade de testes conhecidos daqueles habilitados na arte para detetar anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos da IL-28 ou IL-29 mutante da cisteína. Ensaios exemplars estão descritos com detalhe em Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (Editores), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Exemplos representativos de tais ensaios incluem: imunoeletroforese concorrente, radio-imunoensaios, radio-imunoprecipitações, ensaios imunoenzimáticos (ELISA), ensaios dot blot, ensaios Western blot, ensaios de inibição ou competição, e ensaios sandwich.

Para certas aplicações, incluindo usos diagnósticos in vitro e in vivo, é vantajoso empregar anticorpos rotulados. Etiquetas ou rótulos diretos adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, co-fatores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e afins; etiquetas ou rótulos indiretos podem incluir o uso de biotina-avidina o outros pares complemento/anti-complemento como intermediários. Os anticorpos da presente invenção podem também ser, direta ou indiretamente, conjugados com fármacos, toxinas, radionuclídeos e afins, e estes conjugados utilizados para aplicações terapêuticas ou de diagnóstico in vivo (por exemplo, inibição da proliferação celular) . Ver, em geral, Ramakrishnan et al., Câncer Res. 84 56: 1324-11330, 1996. A presente invenção é, ainda, ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1

Plasmideos de Expressão de mamíferos

Foi construído um plasmídeo de expressão contendo zcyto20 e zcyto21 através de recombinação homóloga. Os fragmentos de ADNc de zcyto20 e zcyto21 foram gerados utilizando amplificação por PCR. Os iniciadores para PCR foram como se segue: zcyto20/pZMP21: zc40923, e zc43152 SEQ. ID N.°s 42 e 43, respetivamente; e zcyto21/pZMP21: zc40922, e zc43153 SEQ. ID N.°s 2 e 73, respetivamente. A mistura de reação de PCR foi corrida num gel de agarose a 1% e uma banda correspondente ao tamanho da inserção foi extraída por gel utilizando um Kit de Extração de Gel QIAquick™ (Qiagen, Valência, CA). O plasmídeo pZMP21, que foi cortado com BglII, foi utilizado para recombinação com o fragmento de inserção da PCR. O plasmídeo pZMP21 é um vetor de expressão de mamífero contendo uma cassete de expressão com o promotor MPSV, e múltiplos locais de restrição para inserção das sequências codificantes; uma origem de replicação de E. coli; uma unidade de expressão de marcador selecionável de mamífero compreendendo um promotor SV40, potenciador e origem de replicação, um gene DHFR, e o terminador SV40; e as sequências URA3 e CEN-ARS necessárias para seleção e replicação em S. cerevisiae. Foi construído a partir de pZP9 (depositado na Coleção Americana de Culturas Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, sob a Acessão N.° 98668) com os elementos genéticos de levedura retirados de pRS316 (depositada na Coleção Americana de Culturas Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, sob a Acessão N.° 77145), um elemento de local 85 de entrada no ribossoma interno (IRES) de poliovírus, e o domínio extracelular de CD8 truncado na extremidade C-terminal do domínio transmembranar.

Cem microlitros de células competentes de levedura (S. cerevisiae) foram independentemente combinadas com 10 μΐ do ADN de inserção e 100 ng do vetor pZMP21 de corte anterior, e a mistura foi transferida para uma cuvete de eletroporação de 0,2-cm. A mistura levedura/ADN foi eletropulsada utilizando definições de fonte de energia (Laboratórios BioRad, Hercules, CA) de 0,75 kV (5 kV/cm), 00 ohms, e 25 mF. Seiscentos ml de 1,2 M sorbitol foram adicionados à cuvete, e a levedura foi colocada numa aliquota de 100 μΐ e 300 μΐ em duas placas URA-D e incubada a 30°C. Após cerca de 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa foram ressuspensos em 1 ml H2O e rotados brevemente para fazer uma pelete de células de levedura. A pelete de células foi ressuspensa em 0,5 ml de tampão de lise (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) . Os quinhentos microlitros da mistura de lise foram adicionados a um tubo Eppendorf contendo 250 μΐ de contas de vidro lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio, foi agitada num vórtex durante 3 minutos, e rotada durante 5 minutos numa centrífuga para Eppendorf à velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foram transferidos para um tubo fresco, e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol (EtOH) e 30 μΐ 3M acetato de sódio, seguido de centrifugação durante 30 minutos à velocidade máxima. A pelete de ADN foi rssuspensa em 30 μΐ TE. A transformação de células hospedeiras eletrocompetentes de E. coli (MC1061) foi feita utilizando 5 μΐ do preparado de ADN de levedura e 50 μΐ de células. As células foram eletropuladas a 2,0 kV, 25 mF, e 400 ohms. Após a eletroporação, 1 ml SOC (2% Triptona Bacto™ (Difco, Detroit, MI), 0,5% extrato de levedura (Difco), 10 mM NaCl, 86

2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04, 20 mM glicose) foi adicionado e depois as células foram colocadas numa aliquota de 50 μΐ e 200 μΐ em duas placas LB AMP (caldo de LB (Lennox), 1,8% Agar Bacto™ (Difco), 100 mg/L

Ampicilina).

As inserções de três clones para cada construção foram sujeitas a análise de sequência e foi selecionado um clone para cada construção, contendo a sequência correta. O ADN de plasmideo de escala superior foi isolado utilizando um kit disponível comercialmente (Kit QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, Valência, CA) , de acordo com as instruções do fabricante. As construções corretas foram designadas zcyto20/pZMP21 e zcyto21/pZMP21.

Exemplo 2

Expressão de construções de mamíferos em células CHO 200 pg de uma construção de zcyto2 0/pZMP21 e zcyto21/pZMP21 foram digeridos com 200 unidades de Pvu I a 37°C durante três horas e depois foram precipitados com IPA e rotados num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. O sobrenadante foi decantado da pelete, e a pelete foi lavada com 1 mL de 7 0% etanol e permitido incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente. O tubo foi rodado numa microcentrífuga durante 10 minutos a 14,000 RPM e o sobrenadante foi aspirado da pelete. A pelete foi depois ressuspensa em 750 μΐ de meio PF-CHO num ambiente estéril, e permitida incubar a 60°C durante 30 minutos. As células CHO foram rodadas e ressuspensas utilizando a solução de meio de ADN. A mistura ADN/célula foi colocada numa cuvete com intervalos de 0,4 cm e eletroporada utilizando os seguintes parâmetros: 950 mF, alta capacitância, e 300 V. Os conteúdos da cuvete foram depois removidos e diluídos para 25 mLs com meio PF-CHO e colocados num frasco de agitação de 125 mL. O frasco foi colocado numa incubadora num agitador a 37°C, 6% CO2, e a agitação a 120 RPM.

Exemplo 3 87

Purificação e análise da Proteína zcyto2Q-CH0 A. Purificação da Proteína Zcyto20-CHO A proteína zcyto20 (IL-28A) recombinante foi produzida a partir de um grupo de linhas de células DXB11-CH0. As culturas foram colhidas, e os meios foram filtrados estéreis utilizando um filtro de 0,2 ym. A purificação da proteína zcyto20-CHO foi conseguida pelo uso sequencial de uma coluna Poros HS 50 (Applied Biosystems, Framingham, MA), uma coluna monolítica WCX (Isco, Inc., Lincoln, NE), uma coluna ToyoPearl Butilo 650S (TosoH, Montgomeryville, PA) , e uma coluna Superdex 75 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Os meios de cultura a partir da DXB111-CHO foram ajustados para um pH 6,0 antes de carregar na coluna Poros 50 HS. A coluna foi lavada com 50 mM MES (ácido 2-morfolinoetanesulfónico) , 100 mM NaCl, pH 6 e a proteína ligada foi eluída com um gradiente linear de volumes de coluna 10 (CV) para 60% de 50 mM MES, 2 M NaCl, pH 6. As frações eluintes foram recolhidas e a presença da proteína zcyto20 foi confirmada por SDS-PAGE com uma coloração Coomassie. Estas frações contendo a proteína zcyto20 foram agrupadas, diluídas com água duplamente destilada a uma condutividade de cerca de 20 mS, e carregadas numa coluna Monolítica WCX. A coluna foi lavada com 93% de 50 mM MES, 100 mM NaCl, pH 6, e 7% de 50 mM MES, 2 M NaCl, pH 6. A proteína ligada foi eluída com um gradiente linear de 25-CV a partir de 7% a 50% de 50 mM MES, 2 M NaCl, pH 6. As frações eluintes foram colhidas e a presença da proteína zcyto20 foi confirmada por SDS-PAGE com uma coloração Coomassie. As frações contendo a proteína zcyto20 foram agrupadas, ajustadas para 1 M sulfato de amónio e carregadas para uma coluna ToyoPearl Butilo 650S. A Zcyto20 foi eluída com um gradiente de sulfato de amónio decrescente e as frações contendo a zcyto20 pura foram agrupadas e concentradas para injeção numa coluna Superdex 75. As frações contendo a proteína zcyto20 da coluna de filtração em gel foram agrupadas, concentradas, filtradas através de um filtro com 0,2 ym e congeladas a -80°C. A concentração da proteina purificada final foi determinada por um ensaio BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) e análise de aminoácido por HPLC.

B. Análise SDS-PAGE e Western blotting da proteína zcyto20-CHO A proteina zcyto20 recombinante foi analisada por SDS-PAGE (Nupage 4-12% Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA) e Western blot utilizando IgG anti-zcyto21-CEE-BV de coelho como o anticorpo primário que reage de forma cruzada com a proteína zcyto20-CHO. O gel foi submetido a eletroforese utilizando Xcell II mini-cell da Invitrogen (Carlsbad, CA) e transferido para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 ym (Laboratórios Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando o módulo Xcell II blot da Invitrogen, de acordo com as indicações providenciadas no manual de instruções. A transferência foi corrida a 500 mA durante 50 minutos num tampão contendo 25 mM Tris base, 200 mM glicina, e 20% metanol. A membrana foi bloqueada com 10% de leite seco magro em lx PBS durante 10 minutos, depois sondado com o anticorpo primário em lx PBS contendo 2,5% leite seco magro. O blot foi rotulado durante uma hora à temperatura ambiente enquanto era agitado. Para a rotulagem do anticorpo secundário, o blot foi lavado três vezes durante 10 minutos cada com PBS e depois sondado com anti-IgG de coelho de cabra conjugado com HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) durante uma hora. O blot foi lavado três vezes com lx PBS durante 10 minutos cada e desenvolvido utilizando uma mistura 1:1 de reagentes Super-Sinal® ULTRA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) e o sinal foi capturado utilizando um Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Alemanha). C. Sumário da purificação e análise da proteína A proteína zcyto20 purificada a partir de meios CHO migrou predominantemente como um dupleto a aproximadamente 89 20 kDa e como um dímero tripleto menor a cerca de 38 kDa num gel 4-12% Bis-Tris em condições não redutoras. Todas colapsaram numa única banda com 20 kDa em condições redutoras. O mapeamento do péptido MS indicou uma mistura de dois isómeros em relação à ligação dissulfido e a presença do local de glicosilação ligado a 0.

Exemplo 4

Purificação e análise da Proteina zcyto21-CH0 A. Purificação da Proteína Zcyto21-CH0 A zcyto21 recombinante foi produzida a partir de linhas de células DXB11-CHO estáveis. As culturas foram colhidas, e os meios foram filtrados estéreis utilizando um filtro com 0,2 pm. As proteínas foram purificadas a partir dos meios condicionados começando com uma combinação de cromatografia de troca catiónica e aniónica seguida de uma cromatografia de interação hidrofóbica e de uma cromatografia por exclusão de tamanho. Os meios de cultura de DXB111-CHO foram ajustados para um pH 6,0 antes de

carregar numa coluna Poros 50 HS (Applied Biosystems, Framingham, MA) . A coluna foi lavada com lx PBS, pH 6 e a proteina ligada foi eluida com 5x PBS, pH 8,4. A fração eluinte foi colhida e a presença da proteina zcyto21 foi confirmada por SDS-PAGE com uma coloração Coomassie. Esta fração foi depois diluida para uma condutividade de 13 mS e o seu pH ajustado para 8,4 e fluido através de uma coluna Poros 50 HQ (Applied Biosystems, Framingham, MA). O

escoamento contendo a proteina zcyto21 foi depois ajustado para cerca de 127 mS com sulfato de amónio e carregado numa coluna Toyopearl Fenilo 650S (TosoH, Montgomeryville, PA) . A proteina Zcyto21 foi eluida com um gradiente de sulfato de amónio decrescente e as frações contendo a zcyto21 pura foram agrupadas e concentradas para injeção numa coluna Superdex 75 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A concentração da proteina purificada final foi determinada por um ensaio BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) e 90 análise de aminoácido por HPLC.

B. Análise por SDS-PAGE e Western blotting da proteína zcyto21-CHO A proteína zcytoíl recombinante foi analisada por SDS-PAGE (Nupage 4-12% Bis-Tris, Invitrogen, Carlsbad, CA) e Western blot utilizando IgG anti-zcyto21-CEE-BV de coelho como o anticorpo primário. O gel foi submetido a eletroforese utilizando Xcell II mini-cell da Invitrogen (Carlsbad, CA) e transferido para uma membrana de nitrocelulose com 0,2 ym (Laboratórios Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando o módulo Xcell II blot da Invitrogen, de acordo com as indicações providenciadas no manual de instruções. A transferência foi corrida a 500 mA durante 50 minutos num tampão contendo 25 mM Tris base, 200 mM glicina, e 20% metanol. O blot transferido foi bloqueado com 10% leite seco magro em lx PBS durante 10 minutos, depois sondado com o anticorpo primário em lx PBS contendo 2,5% leite seco magro. O blot foi rotulado durante uma hora à temperatura ambiente enquanto era agitado. Para a rotulagem do anticorpo secundário, o blot foi lavado três vezes durante 10 minutos cada com PBS e depois sondado com anti-IgG de coelho de cabra conjugado com HRP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) durante uma hora. O blot foi lavado três vezes com lx PBS durante 10 minutos cada e desenvolvido utilizando uma mistura 1:1 de reagentes SuperSinal® ULTRA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) e o sinal foi capturado utilizando um Lumi-Imager (Boehringer Mannheim GmbH, Alemanha). C. Sumário da purificação e análise da proteína A proteína zcyto21 purificada a partir dos meios CHO migrou como duas ou mais bandas com aproximadamente 28 kDa num gel de 4-12% Bis-Tris tanto em condições redutoras como não redutoras. O mapeamento do péptido MS indicou uma mistura de dois isómeros em relação à ligação dissulfido e a presença de um local de glicosilação ligado a N e vários 91 locais de glicosilação ligados a 0.

Exemplo 5

Identificação de formas de IL-29

As frações de pico a partir dos grupos purificados da IL-29 foram digeridas durante a noite a 37°C com sequenciação por nível de tripsina (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) em tampão fosfato a aproximadamente pH 6,3 para limitar o re-arranjo dissulfido. Cada digestão foi analisada por HPLC de fase reversa (Agilent, Paio Alto, CA) ligada em linha a um espectómetro de massa híbrido de vôo com tempo quadrupolar (Micromass, Milford MA). Os espectros foram recolhidos, convertidos a partir da massa em razão de carga para massa, e comparados a todos os péptidos teóricos e combinações de péptidos ligados por dissulfido resultantes da digestão por tripsina da IL-29. Os dissulfidos foram classificados comparando os espectros antes e depois da redução com classificação das massas apropriadas aos péptidos ligados por dissulfido em IL-29. 0 material da fração #20 mostrou o padrão dissulfido C15 - C112 e C49 - C145 com C171 observado como uma cisteína S-glutationil (todas referindo-se à SEQ. ID N.° 4). 0 material da fração #51 mostrou o padrão dissulfido C49 - C145 e C112 - C171 com C15 observado como uma cisteína S- glutationil (referindo-se à SEQ. ID N.° 4).

Exemplo 6

Plasmídeos de expressão de E. coli Construção do vetor de expressão, pTAP237 0 plasmídeo pTAP237 foi gerado inserindo um ligante gerado por PCR no local Smal da ρΤΑΡΙδβ por recombinação homóloga. 0 plasmídeo pTAP186 foi derivado dos plasmídeos pRS316 (um vetor transportador de Saccharomyces cerevisiae) e pMAL-c2, um plasmídeo de expressão de E. coli derivado da pKK223-3 e compreendendo o promotor tac e o terminador rrnB. O plasmídeo ρΤΑΡΙδβ contém um gene de resistência à canamicina no qual o local Sma I foi destruído e tem os 92 locais Notl e Sfil a flanquear as sequências ARS-CEN6 e URA3 de levedura, facilitamdo a sua remoção do plasmídeo por digestão com Notl. 0 ligante gerado por PCR substituiu a sequência acopladora de expressão em pTAP186 com a sequência RBS II sintética. Foi preparado a partir de 100 pmoles cada dos oligonucleotídeos zc29,740 e zc29,741, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 44 e 45, respetivamente, and aproximadamente 5 pmoles cada dos oligonucleotídeos zc29,736 e zc29,738, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 46 e 47, respetivamente. Estes oligonucleotídeos foram combinados por PCR durante dez ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 30 segundos, seguido de ensopado a 4°C. Os produtos de PCR resultantes foram concentrados por precipitação com duas vezes o volume de 100% etanol. A pelete foi ressuspensa em 10 pL de água par ser utilizada para recombinar no vetor recetor pTAP186 digerido com Smal para produzir a construção contendo a sequência RBS II sintética. Aproximadamente 1 pg do ligante gerado por PCR e 100 ng de pTAP186 digerida com Smal foram misturadas juntas e transformadas em células competentes de levdura (S. cerevisiae) . A levedura foi depois colocada em placas -URA D e deixada à temperatura ambiente durante cerca de 72 horas. Depois os transf ormantes Ura+ de uma única placa foram ressuspensos em 1 mL H2O e rodados brevemente para formar uma pelete das células de levedura. A pelete de células foi ressuspensa em 0,5 mL de tampão de lise. O ADN foi recuperado e transformad em MC1061 de E. coli. Os clones foram triados por PCR de colónia, conforme revelado anteriormente, utilizando 20 pmoles cada dos oligonucleotídeos zc29,740 e zc29,741, conforme mostrado nas SEQ. ID N.°s 44 e 45, respetivamente. Os clones que exibiam a banda de tamanho correto num gel de agarose foram sujeitos a análise de sequência. O plasmídeo correto foi designado pTAP237. 93

Exemplo 7

Otimização do codão de mutante de cisteína da IL-29 Ά. Geração da otimização do codão das construções de expressão de tipo selvagem da IL-29 A sequência de gene da IL-29 humana nativa não foi bem expressa na estirpe W3110 de E. coli. 0 exame dos codões utilizados na sequência codificante da IL-29 indicou que estes continham um excesso dos codões menos frequentemente utilizados em E. coli com um valor CAI igual a 0,206. O CAI é uma medida estatística do desvio do codão sinónimo e pode ser utilizado para predizer o nível de produção da proteína (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15(3): 1281-95, 1987). Os genes que codificam as proteínas altamente expressas tendem a ter valores de CAI elevados (> 0,6), enquanto as proteínas codificadas por genes com valores de CAI baixos (d 0,2) são geralmente ineficazmente expressas. Isto sugere uma razão para a fraca produção da IL-29 em E. coli. Além disso, os codões raros são agrupados na segunda metade da mensagem, o que conduz a uma maior probabilidade de bloqueio translacional, terminação prematura da tradução, e incorporação errónea de aminoácido (Kane JF. Curr. Spin. Biotechnol. 6(5):494-500, 1995).

Foi demonstrado que o nível de expressão das proteínas de cujos genes contêm codões raros pode ser dramaticamente melhorado quando o nível de certos ARNt raros é aumentado no hospedeiro (Zdanovsky et al., Applied Environmental Microb. 66:3166-3173, 2000; You et al,. Biotechniques 27:950-954, 1999). O plasmídeo pRARE transporta genes que codificam os ARNt para vários codões que são raramente utilizados em E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX e glyT) . Os genes estão sob o controlo dos seus promotores nativos (Novy, ibid.). A co-expressão com pRARE potenciou a produção da IL-29 em E. coli e produziu aproximadamente 200 mg/L. Estes dados sugerem que re-ressintetizar o gene que codifica a IL-29 com mais utilização de codão apropriada 94 providencia um vetor melhorado para a expressão de grandes quantidades da IL-29.

A sequência codificante da IL-29 otimizada do codão foi construída a partir de dezasseis oligonucleotídeos sobrepostos: zc44,566 (SEQ. ID N.° 48), zc44,565 (SEQ. ID

N.° 49), zc44,564 (SEQ. ID N.° 50), zc44,563 (SEQ. ID N.° 51), zc44,562 (SEQ. ID N.° 52), zc44,561 (SEQ. ID N.° 53), zc44,560 (SEQ. ID N.° 54), zc244,559 (SEQ. ID N.° 55), zc44,558 (SEQ. ID N.° 56), zc44,557 (SEQ. ID N.° 57). A extensão do iniciador destes oligonucleotídeos sobrepostos seguida de amplificação por PCR produziu um gene da IL-29 de comprimento inteiro com codões otimizados para a expressão em E. coli. O produto final da PCR foi inserido no vetor de expressão pTAP237 por recombinação homóloga de levedura. A construção da expressão foi extraída da levedura e transformada em MC1061 de E. coli competente. A resistência dos clones à canamicina foi identificada por PCR de colónia. Um clone positivo foi verificado por sequenciação e subsequente transformação na estirpe do hospedeiro de produção W3110. O vetor de expressão com a sequência da IL-29 otimizada foi designado pSDH184. O gene resultante foi muito bem expresso em E. coli. Os níveis de expressão com a nova construção aumentaram para cerca de 250 mg/L. B. Geração da construção da expressão da mutante da cisteína C172S zcyto21 do codão otimizado A estratégia utilizada para gerar a mutante da

cisteína C172S zcyto21 é baseada no Kit de Mutagénese sítio-dirigida QuikChange (Stratagene). Os iniciadores foram desenhados para introduzir a mutação C172S com base nas sugestões do fabricante. Estes iniciadores foram designados ZG44,340 (SEQ. ID N.° 58) e ZG44,341 (SEQ. ID N.° 59) . Foi realizada uma PCR para gerar a mutante da cisteína C172S zcyto21, de acordo com as instruções do kit de Mutagénese QuikChange. Foram montadas cinco reações 95 idênticas de 50 μΐ. 2,5 μΐ de ADN de pSDH175 (sequência da estrutura dorsal do vetor de levedura ausente) foram utilizados como molde por reação. Foi produzido um cocktail de PCR utilizando as seguintes quantidades de reagentes: 30 μΐ lOx tampão de PCR, 125 ng (27,42 μΐ) ZG44,340, 125 ng (9,18 μΐ) ZG44,341, 6 μΐ dNTP, 6 μΐ Pfu Turbo polimerase (Stratagene, La Jolla, CA), e 206,4 μΐ de água. 47,5 μΐ do cocktail foi aliquotado em cada reação. As condições da PCR foram como se segue: 1 ciclo de 95°C durante 30 segundos seguido de 16 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto, 68 °C durante 7 minutos, seguido de 1 ciclo a 68°C durante 7 minutos, e terminando com uma retenção a 4°C. Todas as cinco reações de PCR foram consolidadas num tubo. De acordo com as instruções do fabricante, foram adicionados 5 μΐ da enzima de restrição Dpnl à reação de PCR e incubados a 37°C durante 2 horas. O ADN foi precipitado adicionando 10% 3 Molar acetato de sódio e dois volumes de etanol 100%. A precipitação foi realizada a -20°C durante 20 minutos. O ADN foi agitado a 14,000 rpm durante 5 minutos e a pelete foi seca por vácuo rápido. A pelete de ADN foi ressuspensa em 20 μΐ de água. O ADN resultante da PCR foi transformado na estirpe DH10B de E.coli. Foram misturados 5 μΐ e ADN com 40 μΐ de células DH10B ElectroMAX (Invitrogen) . A mistura das células e do ADN foi depois eletroporada numa cuvete com 0,1 cm (Bio-Rad) utilizando um Bio-Rad Gene Pulser II™ definido para 1,75 kV, 100 Q, e 25 mF. As células eletroporadas foram depois crescidas a 37°C durante 1 hora. A mistura foi colocada numa placa de canamicina LB + 25 mg/ml e incubada a 37°C durante a noite. Dez clones foram triados para a presença da inserção C172S zcyto21. O ADN foi isolado de todos os dez clones utilizando o Kit QIAprep™ Spin Miniprep (Qiagen, Valência, CA) e analisado para a presença da inserção cortando com as enzimas de restrição Xbal e PstI. Nove clones continham a inserção e foram sequenciados para 96 assegurar que a mutação C172S zcyto21 tinha sido introduzida. Δ sequência de um clone foi verificada e foi subsequentemente rotulada pSDH188.

Exemplo 8

Construção da expressão da IL-29 de E. coli

Um fragmento de ADN da IL-29 contendo a sequência de tipo selvagem foi isolado utilizando PCR. Foram utilizados na reação os iniciadores zc41,212 (SEQ. ID N.° 60) contendo 41 pares de base (pb) da sequência flanqueante do vetor e 24 pb correspondentes ao terminal amino da IL-29, e o iniciador zc41,041 (SEQ. ID N.° 61) contendo 38 pb correspondente à extremidade 3' do vetor que continha a inserção zcyto21. As condições da PCR foram as seguintes: 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72 °C durante 1 minuto; seguido por um encharcamento a 4°C. Uma pequena amostra (2-4 pL) da amostra de PCR foi corrida num gel de agarose 1% com IX tampão TBE para análise, e foi observada a banda esperada do fragmento com aproximadamente 500 pb. O volume restante da reação de 100 pL foi precipitado com 200 pL de etanol absoluto. A pelete foi ressuspensa em 10 pL de água para ser utilizada para recombinar num vetor recetor pTAP238 cortado com Smal para produzir a construção que codifica a zcyto21, conforme revelado anteriormente. O clone com a sequência correta foi designado pTAP377. O clone pTAP377 foi digerido com Notl/Ncol (10 pl de ADN, 5 pl e tampão 3 New England BioLabs, 2 pL de Not 1, 2 pL de Ncol, 31 pL de água durante 1 hora a 37°C) e religado com tampão de T4 ADN ligase (7 pL da digestão prévia, 2 pL de tampão 5X, 1 pL de T4 ADN ligase) . Esta etapa removeu a sequência de levedura, CEN-ARS, para fluir o vetor. O ADN de pTAP337 foi digerido diagnosticamente com Pvu2 e Pstl para confirmar a ausência da sequência de levedura. O ADN de P/taP377 foi transformado na estirpe W3110/pRARE de E. coli, estirpe do hospedeiro que transporta cópias extra de genes de ARNt de 97 E. coli raros.

Exemplo 9

Construção da expressão da IL-28A de E. coli

Um fragmento de ADN contendo a sequência de tipo selvagem da zcyto20 (conforme mostrado na SEQ. ID N.° 1) foi isolado utilizando PCR. Os iniciadores zc43,431 (SEQ. ID N.° 62) contendo 41 pb da sequência flanqueante do vetor e 24 pb correspondentes ao terminal amino de zcyto20, e o iniciador zc43,437 (SEQ. ID N.° 63) continha 38 pb correspondents à extremidade 3' do vetor que continha a inserção de zcyto20. As condições da PCR foram as seguintes: 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 1 minuto; seguido por um encharcamento a 4°C. Uma pequena amostra (2-4 pL) da amostra de PCR foi corrida num gel de agarose 1% com IX tampão TBE para análise, e foi observada a banda esperada do fragmento com aproximadamente 500 pb. O volume stante dos 100 pL de reação foi precipitado com 200 pL de etanol absoluto. A pelete foi ressuspensa em 10 pL de água para ser utilizada para recombinar no vetor recetor pTAP238 cortado com Smal para produzir a construção que codifica a zcyto20, conforme revelado anteriormente. O clone com a sequência correta foi designado pYEL7. Foi digerido com Notl/Ncol (10 pl de ADN, 5 pl de tampão 3 New England BioLabs, 2 pL de Notl, 2 pL de Ncol, 31 pL de água durante 1 hora a 37°C) e religado com tampão T4 ADN ligase (7 pL da digestão prévia, 2 pL de 5X tampão, 1 pL de T4 ADN ligase). Esta etapa removeu a sequência de levedura, CEN-ARS, para fluir o vetor. O ADN da pYEL7 relegado foi digerido diagnosticamente com Pvu2 e Pstl para confirmar a ausência da sequência da levedura. O ADN de PYEL7 foi transformado na estirpe W3110/pRARE de E. coli.

Exemplo 10

Construção da expressão de mutante da cisteina C172S zcyto21 98 A estratégia utilizada para gerar a mutante da cisteina C172S zcyto21 (SEQ. ID N.° 28) é baseada no kit de Mtagénese sitio-dirigida Quik-Change® (Stratagene, La Jolla, CA). Os iniciadores foram desenhados para introduzir a mutação C172S com base nas sugestões do fabricante. Estes iniciadores foram designados ZG44,327 e ZG44,328 (SEQ. ID N.°s 64 e 65, respetivamente) . A PCR foi realizada para gerar a mutante da cisteina C172S zcyto21 de acordo com as instruções do Kit de Mutagénese QuikChange. Foram montadas cinco reações idênticas de 50 μΐ. 2,5 μΐ de ADN de pTAP377 (sequência da estrutura dorsal do vetor de levedura ausente) foi utilizado como molde por reação. Foi produzido um cocktail de PCR utilizando as seguintes quantidades de reagentes: 30 μΐ lOx tampão de PCR, 125 ng (27,42 μΐ) ZG44,327 (SEQ. ID N.° 64), 125 ng (9,18 μΐ) ZG44,328 (SEQ. ID N.° 65), 6 μΐ dNTP, 6 μΐ Pfu Turbo polimerase (Strategene) , e 206, 4 μΐ de água. 47,5 μΐ do cocktail foi aliquotado em cada reação. As condições da PCR foram ase seguintes: 1 ciclo de 95°C durante 30 segundos seguido por 16 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto, 68°C durante 7 minutos, seguido por 1 ciclo a 68°C durante 7 minutos, e terminando com uma retenção a 4°C. Todas as cinco reações de PCR foram consolidadas num tubo. De acordo com as instruções do fabricante, 5 μΐ da enzima de restrição Dpnl foram adicionados à reação de PCR e incubados a 37 °C durante 2 horas. O ADN foi precipitado adicionando 10% 3 Molar acetate de sódio e dois volumes de etanol 100% (Aaper Alcohol, Shelbyville, KY). A precipitação foi realizada a -20°C durante 20 minutos. O ADN foi agitado a 14, 000 rpm durante 5 minutos e a pelete foi seca em vácuo rápido. A pelete de ADN foi ressuspensa em 20 μΐ de água. O ADN resultante da PCR foi transformado na estirpe DH10B de E.coli. Foram misturados 5 μΐ de ADN com 40 μΐ de células DH10B ElectroMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) . A mistura das células e do ADN foi depois 99 eletroporada numa cuvete com 0,1 cm (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando um Bio-Rad Gene Pulser II™ definido para l,75kV, 100Ω, e 25 mF. As células eletroporadas foram depois crescidas a 37°C durante 1 hora. A mistura foi colocada numa placa de canamicina LB + 25 yg/ml e incubada a 37 °C durante a noite. Dez clones foram filtrados para a presença da inserção da IL-29. O ADN foi isolado de todos os dez clones utilizando o kit QIAprep™ Spin Miniprep (Qiagen) e analisado para a presença de inserção cortando com as enzimas de restrição Xbal (Roche) e PstI (New England Biolabs) . Nove clones continham a inserção e foram sequenciados para assegurar que a mutação C172S zcyto21 tinha sido introduzida. A sequência de um clone (isolado #6) foi verificada e foi subsequentemente rotulada pSDHl71. Pode ser implementada uma estratégia semelhante para gerar um mutante C15S zcyto21.

Exemplo 11

Construção da expressão da mutante de cisteina C49S zcyto20 A sequência codificante da mutante de cisteina C49S zcyto20 foi gerada por PCR de sobreposição (SEQ. ID N.° 20). As primeiras 187 bases da sequência da IL-28A de tipo selvagem (SEQ. ID N.° 1) foram geradas por amplificação por PCR utilizando pYEL7 (SEQ. ID N.° 67) como molde e os iniciadores oligonucleotideos zc43,431 (SEQ. ID N.° 62) e zc45, 399 (SEQ. ID N.° 66). O segundo fragmento de ADN da base 105 a 531 foi gerado por amplificação por PCR utilizando pYEL7 (SEQ. ID N.° 67) como molde e os iniciadores oligonucleotideos zc45,398 (SEQ. ID N.° 68) e zc43,437 (SEQ. ID N.° 63). Os iniciadores zc45,399 (SEQ. ID N.° 66) e zc45, 398 (SEQ. ID N.° 68) continham a sequência modificada especifica que alterou a cisteina 49 para uma serina. Estes dois produtos de PCR foram combinados e a sobreposição por PCR amplificou utilizando os iniciadores oligonucleotideos zc43,431 (SEQ. ID N.° 62) e zc43,437 (SEQ. ID N.° 63) . O produto final de PCR foi inserido num 100 vetor de expressão pTAP238 por recombinação homóloga de levedura (Raymond et al. Biotechniques. Jan. 26(1):134-8, 140-1, 1999). A construção de expressão foi extraida da levedura e transformada em DH10B de E. coli competentes. Os clones resistentes à canamicina foram triados por PCR de colónia. Um clone positivo foi verificado por sequenciação e subsequente transformação na estirpe do hospedeiro de produção W3110/pRARE. A construção de expressão com a sequência codificante da mutante de cisterna C49S zcyto20 foi designada pCHAN9.

Exemplo 12

Construção da expressão da mutante de cisteina C51S zcyto20 A sequência codificante da mutante de cisteina C51S zcyto20 foi gerada por PCR de sobreposição (SEQ. ID N.° 24). As primeiras 193 bases da sequência da IL-28A de tipo selvagem foram geradas por amplificação por PCR utilizando pYEL7 (SEQ. ID N.° 67) como molde e os iniciadores oligonucleotideos zc43,431 (SEQ. ID N.° 62) e zc45,397 (SEQ. ID N.° 63). O segundo fragmento de ADN da base 111 a 531 foi gerado por amplificação por PCR utilizando pYEL7 (SEQ. ID N.° 67) como molde e os iniciadores oligonucleotideos zc45,396 (SEQ. ID N.° 70) e zc43,437 (SEQ. ID N.° 63). Os iniciadores zc45,397 (SEQ. ID N.° 69) e zc45,396 (SEQ. ID N.° 70) continham a sequência modificada especifica que alterou a cisteina 51 para uma serina. Estes dois produtos de PCR foram combinados e a sobreposição por PCR amplificou utilizando os iniciadores oligonucleotideos zc43,431 (SEQ. ID N.° 62) e zc43,437 (SEQ. ID N.° 63) . O produto final de PCR foi inserido no noutro vetor de expressão caseiro pTAP238 por recombinação homóloga de levedura (Raymond et al. supra). A construção da expressão foi extraida da levedura e transformada em DH10B de E. coli competentes. Os clones resistentes à canamicina foram triados por PCR de colónia. Um clone positivo foi verificado por sequenciação e subsequente 101 transformação na estirpe do hospedeiro de produção W3110/pRARE. A construção da expressão com a sequência codificante da mutante de cisteina C50S zcyto20 foi designada pCHANIO.

Exemplo 13

Expressão da II-28A, IL-29 e Cys para mutantes de cisteina Ser em E. coli

Em experiências separadas, E. coli transformada com cada um dos vetores de expressão descritos nos Exemplos 6-9 foram inoculadas em 100 mL meio II Superbroth (Becton Dickinson, São Diego, CA) com 0,01% Antifoam 289 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 30 pg/ml canamicina, 35 pg/ml cloranfenicol e cultivadas durante a noite a 37°C. Um inoculo de 5 mL foi adicionado a 500 mL do mesmo meio num frasco de cultura de 2 L que foi agitado a 250 rpm a 37°C até a cultur atingir uma OD600 de 4. IPTG foi depois adicionado até uma concentração final de 1 mM e a agitação continuou por mais 2,5 horas. As células foram centrifugadas a 4,000 x g durante 10 min a 4 °C. As peletes das células foram congeladas a -80°C até utilização mais tarde.

Exemplo 14

Redobragem e Purificação da IL-28 A. Inclusão da preparação do corpo A IL-29 humana de tipo selvagem foi expressa na estirpe W3110 da E. coli como corpos de inclusão, conforme descrito anteriormente. Uma pelete de células de uma fermentação de um lote alimentado foi ressuspensa em 50 mM Tris, pH 7,3. A suspensão foi passada através de um homogenizador APV-Gaulin (Invensys APV, Tonawanda, Nova Iorque) três vezes a 8000 psi. O material insolúvel foi recuperado por centrifugação a 15,000 g durante 30 minutos. A pelete foi lavada consecutivamente com 50 mM Tris, 1% (v/v) Triton X100, pH 7,3 e 4 M Ureia. O corpo de inclusão foi depois disperso em 50 mM Tris, 6 M cloridrato de 102 guanidina, 5 mM DTT à temperatura ambiente durante 1 hora. O material foi depois centrifugado a 15,000 g durante 1 hora. O sobrenadante desta etapa contém IL-29 solúvel reduzida. B. Redobragem A IL-29 solubilizada foi diluida lentamente em 50 mM Tris, pH 8, 0,75 M Arginina, 0,05% PEG3350, 2 mM MgCÍ2, 2 mM CaCÍ2, 0,4 mM KCl, 10 mM NaCl, 4 mM Glutationa reduzida, 0,8 mM Glutationa oxidada à temperatura ambiente enquanto é agitada. A concentração final da IL-29 no tampão de redobragem foi 0,1 mg/ml. A mistura de redobragem foi deixada à temperatura ambiente durante a noite. O ácido acétido concentrado foi depois utilizado para ajustar o pH da suspensão para 5. a suspensão foi depois filtrada através de um filtro com 0,2 ym. A análise por RP-HPLC da mistura de redobragem mostrou dois picos proeminentes. C. Purificação A mistura da redobragem foi diluida em linha (1:2) com 50 mM NaOAc a pH 5 e carregada numa coluna de troca de catiões de fluxo lento de sefarose Pharmacia SP (North Peapack, NJ) . A coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de 50 mM NaOAc, 400 mM NaCl, pH 5. A IL-29 ligada foi eluida com 50 mM NaOAc, 1,4 M NaCl, pH 5. Foi adicionado (NH4) 2S04 sólido ao grupo eluido da etapa de troca de catiões de modo que a concentração final de (NH4)2S04 foi 0,5 Μ. O material foi depois carregado numa coluna

ToyoPearl Fenil 650S HIC (Tosoh Biosep, Montgomery, PA) . A coluna foi depois lavada com 3 volumes de coluna de 50 mM NaOAc, 1 M (NH4)2S04, pH 5. Um gradiente linear de 10 volumes de coluna da 50 mM NaOAc, 1 M (NH4)2S04, pH 5 a 50 mM NaOAc, pH 5 foi utilizado para eluir a zcyto21 ligada. As frações foram colhidos do eluido. Foram observados dois picos proeminentes nesta etapa. Foi realizada a análise por RP-HPLC das frações do eluido. Dois produtos correspondents a dois isómeros ligados por ligação dissulfido foram 103 produzidos após a troca do tampão final em PBS, pH 7,3. Exemplo 15

Redobragem e Purificação da mutante da cisteina da IL-29

Como descrito no Exemplo 3, a purificação da IL-2 9 produziu dois isómeros ligados por ligação dissulfido. Uma etapa HIC FPLC foi empregue para separar as duas formas. A separaçao não foi resolvida na linha de base. "Peak Shaving" (Corte de Picos) severos tiveram de ser utilizados para obter isómeros substancialmente puros (>95%) . 0 rendimento para esta etapa e, por extensão, para todo o processo sofreu. S rendimentos finais foram 8% e 9% para a forma C15-C112 e para a forma C112-C171, respetivamente. A IL-29 de tipo selvagem produzida em sistemas CHO e baculovirus (BV) também mostrou fenómenos semelhantes. Ficou estabelecido que a forma C15-C112 do isómero é homóloga em padrões de ligação dissulfido ao INF de tipo I. A forma C15-C112 também demonstrou uma bioatividade 30 vezes superior do que a forma C112-C171 num ensaio ISRE (ver a seguir).

Redobragem e purificação da muteína Cysl72Ser zcyto21 mutein A preparação de corpo de inclusão, redobragem e purificação do polipeptídeo C172S zcyto21 (SEQ. ID N.° 29) é essencialmente a mesma que aquelas da IL-29 de tipo selvagem (SEQ. ID N.° 4). A análise por RP-HPLC da mistura de redobragem da muteina mostrou apenas um pico proeminente correspondente à forma C15-C112 da IL-29 de tipo selvagem. A cromatografia HIC subsequente mostrou apenas um único pico. Foi, por isso, desnecessário empregar "peak shaving" severo. O rendimento final para o processo completo está próximo dos 50%. O polipeptídeo Cysl72Ser zcyto21 (SEQ. ID N.° 29) mostrou bioatividade equivalente à forma C15-C112 da IL-2 9 de tipo selvagem num ensaio ISRE mostrado no Exemplo 16.

Exemplo 16 104

Atividade Antiviral; efeito citopático em células Hela e L92 9

Os ensaios funcionais iniciais para a atividade antiviral foram conduzidos utilizando meios condicionados a partir de células de rim embrionário humano (HEK) transitoriamente transfetadas. A produção deste meio condicionado é descrita como se segue. Um ADNc de comprimento inteiro para IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou murina foi clonada no vetor pzp7Z utilizando procedimentos convencionais. As construções de IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou murina foram transfetadas em células 293 HEK. Resumidamente, para cada construção 700,000 células/poço (placas de 6 poços) foram colocadas em placa aproximadamente 18h antes da transfeção em 2 mililitros de DMEM + 10% soro bovino fetal. Por poço, 1,5 microgramas de ADN da IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou murina e 0,5 microgramas de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech) foram adicionados a 6 microlitros de reagente Fugene 6 (Roche Biochemicals) num total de 100 microlitros DMEM. Dois microgramas de ADN pIRES2-EGFP sozinho foram utilizados como um controlo negativo. Estas misturas de transfeção foram adicionadas 30 minutos mais tarde às células 293 pré-colocadas em placas. Vinte e quatro horas mais tarde os meios de células foram removidos e foi adicionado DMEM + 0,1 % albumina de soro bovino. Os meios condicionados foram recolhidos após 48 horas, filtrados através de um filtro com 0,45 micron e utilizados em ensaios antivirais e de repórter.

Os ensaios antivirais foram realizados utilizando células do carcinoma cervical humano (HeLa) e células fibroblastos de ratinho (L929). No primeiro dia, o meio condicionado contendo a IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou murina foi diluido e colocado em placa com 50,000 células numa placa de microtitulação de fundo raso com 96 poços. Após um periodo de incubação de 24 horas a 37°C, o meio foi 105 removido e substituído com meio contendo vírus da encefalomiocardite numa multiplicidade de infeção de 0,1. As células foram de novo incubadas durante 24 horas a 37°C. Os poços da cultura foram depois classificados visualmente de acordo com uma escala de 4 pontos para a presença de efeito citopático, que foi depois convertida para %CPE, conforme mostrado no Quadro 7. O meio condicionado das células transfetadas com GFP isolado e interferão-a-2a humano purificado ou interferão-alfa murino foram incluídos como controlos.

Quadro 7: Determinação do efeito citopático

Designação Observação do efeito citopático (CPE) - Sem CPE + /- Possível CPE (cerca de 1% de superfície de monocamada) + CPE limitado a uma placa (cerca de 5% da superfície) + 1 CPE está limitado a três placas, afetando menos de 25% da monocamada 1 25 % CPE 1-2 37% CPE 2 50% CPE 2-3 62% CPE 3 75% CPE 3-4 87% CPE 4 100% CPE 0 Quadro 8 mostra que o meio condicionado contendo IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou murina inibiu a infeção virai (%CPE) nas células HeLa de uma maneira dependente da dose, enquanto o meio condicionado GFP controlo falhou em bloquear significativamente o aparecimento de efeito citopático. Conforme mostrado no Quadro 9, o meio condicionado contendo IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou 106 murina não inibiu a infeção virai nas células L929. Em ambas as experiências o interferão purificado exibiu atividade antiviral positiva.

Quadro 8: Efeito Citopático percentual da IL-28A, IL-28B, ou IL-29 humana ou murina em células HeLa utilizando meio condicionado (CM)

Concentra ção CM Relativa GFP Contro lo zcyto 20 IL- 28A (CM) zcyto 21 IL-29 (CM) zcyto 22 IL- 28B (CM) zcyto 24 IL-28 ratin ho (CM) zcyto 25 IL-28 ratin ho (CM) hlFN -a- 2a Concentra ção de hIFN-a-2a Sem Add 87 87 87 87 87 87 87 0 ng/ml , 0001 , 008X 87 10 56 0 0 10 15 ng/ml , 0156X 87 2,5 31 0 0 5 8,3 , 001 ng/ml ,0325X 87 5 10 0 0 5 1,7 , 01 ng/ml , 0 625X 87 2,5 10 0 0 0 0 , 1 ng/ml . 125X 87 0 5 0 0 0 0 1 ng/ml , 25X 87 00 0 0 0 0 10 ng/ml , 5X 87 00 0 0 0 0 100 ng/ml

Quadro 9 ou IL-29 : Efeito Citopático percentual da IL-28A, IL-28B, humana ou murina em células L929 utilizando meio condicionado (CM) Concentra ção CM Relativa GFP Contro lo zcyto 20 (CM) zcyto 21 (CM) zcyto 22 (CM) zcyto 24 (CM) zcyto 25 (CM) mlFN alfa Concentra ção de mlFN-alfa Sem Add 87 87 87 87 87 87 87 0 ng/ml , 008X 87 87 87 87 87 87 87 , 0001 ng/ml ,0156X 87 87 87 87 87 87 87 , 001 ng/ml , 0325X 87 87 87 87 87 87 87 , 01 ng/ml ,0625X 87 87 87 87 87 87 58 , 1 ng/ml . 125X 87 87 87 87 87 87 6,7 1 ng/ml , 25X 87 87 87 87 87 87 0 10 ng/ml , 5X 87 87 87 87 87 87 0 100 ng/ml

Exemplo 17

Sinalização através da via de resposta do Interferão A interação de interferões de tipo 1 com os seus recetores específicos conduz à indução de um número de genes responsável pela sua atividade 107 antiviral/antiproliferativa. Estes incluem 2'-5' oligoadenilato sintetase (2-5 OAS), quinase Pkr dependente de ARN de cadeia dupla (Pkr), fosfolípido scramblase, e molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1). A indução de genes com função ainda desconhecida, tal como um produto de gene estimulado pelo interferão 56kDa (ISG-56k), também ocorre. Para determiner se alguns ou todos estes genes são induzidos no momento do tratamento de células com IL-28A, células linfoides Daudi B humanas foram tratadas durante 72 horas com meio condicionado de células Sf9 infetadas com baculovirus que expressa IL-28A. Foi utilizado meio condicionado de células Sf9 infetado com baculovirus de tipo selvagem como um controlo negativo. Após tratamento, as células foram colhidas e lisadas para isolamento do ARN total. Um micrograma de ARN total foi convertido em ADNc utilizando transcriptase reversa e utilizado como um molde para a reação em cadeia da polimerase utilizando iniciadores oligonucleotideos específicos para os genes estimulados pelo interferão humano descritos anteriormente. Os iniciadores oligonucleotideos para glicerol-3-fosfato desidrogenase humana (G3PDH) foram utilizados como um gene controlo não estimulado por interferão. Os resultados mostram a indução clara da ISG-56k, Pkr, 2-5 OAS e fosfolípido scramblase após o tratamento das células com IL-28A. A não indução foi observada para ICAM-1 ou para o gene controlo não estimulado por interferão, G3PDH.

Exemplo 18

Ensaio de reportagem da transdução do sinal O ensaio de reportagem da transdução do sinal pode ser utilizado para determiner a interação funcional da IL-28 e IL-29 humana e de ratinho com o recetor IL-28. As células de rim embrionário humano (HEK) são transfetadas com um plasmídeo repórter que contém um elemento de resposta estimulado pelo interferão (ISRE) que dirige a transcrição de um gene repórter luciferase na presença ou ausência de 108 vetores de expressão pZP7 contendo ADNc para recetores de citocina de classe II (incluindo DIRS1 humano, IFNaRl, IFNaR2 e recetor IL-28). A atividade da luciferase apos a estimulação das células transfetadas com ligandos de classe II (incluindo IL-28A (SEQ. ID N.° 2), IL-29 (SEQ. ID N.° 4), IL-28B (SEQ. ID N.° 6), zcytolO, huILlO e huIFNa-2a) reflete a interação do ligando com recetores de citocina transfetados e nativos na superfície da célula. Os resultados e métodos são descritos a seguir.

Transfeções de células

As células 293 HEK foram transfetadas como se segue: 700,000 293 células/poço (placas com 6 poços) foram colocadas em placas aproximadamente 18h antes da transfeção em 2 mililitros de DMEM + 10% soro bovino fetal. Por poço, 1 micrograma de ADN de pISRE-Luciferase (Stratagene), 1 micrograma de ADN de recetor de citocina e 1 micrograma de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech,) foram adicionados a 9 microlitros de reagente Fugene 6 (Roche Biochemicals) num total de 100 microlitros de DMEM. Foram utilizados dois microgramas de ADN de pIRES2-EGFP quando o ADN do recetor de citocina não foi incluído. Esta mistura de transfeção foi adicionada 30 minutos mais tarde às células 293 pré-colocadas em placas. Vinte e quatro horas mais tarde as células transfetadas foram removidas da placa utilizando tripsina-EDTA and replated a aproximadamente 25,000 células/poço em placas de microtitulação com 96 poços.

Aproximadamente 18 h antes da estimulação do ligando, os meios foram alterados para DMEM + 0,5%FBS.

Ensaios de Reportagem da Transdução do sinal

Os ensaios de reportagem de transdução do sinal for a feitos como se segue: Após um período de incubação de 18h a 37°C em DMEM + 0,5%FBS, as células transfetadas foram estimuladas com diluições (em DMEM + 0,5%FBS) dos seguintes ligandos de classe II; IL-28A, IL-29, IL-28B, zcytolO, huILlO e huIFNa-2a. Após um período de incubação de 4 horas 109 a 37°C, as células foram lisadas, e as unidades de luz relativa (RLU) foram medidas num luminómetro após adição de um substrato de luciferase. Os resultados obtidos são mostrados como a indução em número de vezes da RLU das amostras experimentais sobre o meio controlo isolado (RLU de amostras experimentais/RLU do meio isolado = indução em número de vezes). O Quadro 10 mostra que a IL-28A, IL-29, e IL-28B induzem a sinalização de ISRE nas células 293 transfetadas com ISRE-luciferase dando uma indução de 15 a 17 vezes na atividade da luciferase em relação ao meio isolado. A adição de ADN da subunidade alfa do recetor IL-28 (SEQ. ID N.° 11), utilizando a CRF2-4 endógena (SEQ. ID N.° 71) à mistura de transfeção resulta numa indução 6 a 8 vezes superior na sinalização de ISRE por IL-28A, IL-29, e IL-28B dando uma indução de 104 a 125 vezes. Nenhum dos outros ADN de recetor de citocina de classe II transfetados resultou na sinalização aumentada de ISRE. Estes resultados indicam que a IL-28A, IL-29, e IL-28B interagem funcionalmente com o recetor de citocina da IL-28. O Quadro 10 tmbém mostra que a huIFNa-2a pode induzir a sinalização de ISRE em células 293 transfetadas com ISRE-luciferase dando uma indução de 205 vezes da atividade luciferase em comparação com o meio isolado. Contudo, a adição de ADN do recetor IL-28 à transfeção conduz a uma redução de 11 vezes na sinalização de ISRE (comparado com o ADN da ISRE-luciferase isolado), o que sugere que a sobre-expressão do recetor IL-28 afeta negativamente a sinalização do interferão, em contraste com os efeitos positivos da sobre-expressão do recetor IL-28 na sinalização de IL-28A, IL-29, e IL-28B.

Quadro 10

Sinalização Interferão estimulação vezes)_ Ligando pelo Elemento de Resposta estimulada pelo (ISRE) de células 293 transfetadas após a da Citocina de Classe II (Indução em número de

I SRE-Luc

ISRE-Luc./IL-28R 110

Sinalização pelo Elemento de Resposta estimulada pelo Interferão (ISRE) de células 293 transfetadas após a estimulação da Citocina de Classe II (Indução em número de vezes) Ligando ISRE-Luc. ISRE-Luc./IL-28R IL-28A (125ng/ml) 15 125 IL-29 (125nng/ml) 17 108 IL-28B (125ng/ml) 17 104 HuIFNa-2a (lOOng/ml) 205 18 ZcytolO (125ng/ml) 1,3 1 HuILlO (lOOng/ml) 1 0,5

Exemplo 19

Ensaios de Transdução do sinal com mutantes de cisteína da IL-29

Transfeções de células

Para produzir células 293 HEK que sobre-expressam de forma estável o recetor IL-28 humano, as células 293 foram transfetadas como se segue: 300,000 293 células/poço (placas com 6 poços) foram colocadas em placas aproximadamente 6h antes da transfeção em 2 mililitros de DMEM +10% soro bovino fetal. Por poço, 2 microgramas de um vetor de expressão pZP7 contendo o ADNc da subunidade alfa do recetor IL-28 humano (SEQ. ID N.° 11) foi adicionado a 6 microlitros de reagent Fugene 6 (Roche Biochemicals) num total de 100 microlitros de DMEM. Esta mistura de transfeção foi adicionada 30 minutos mais tarde às células 293 pré-colocadas em placas. Quarenta e oito horas mais tarde as células transfetadas foram colocadas sob 2 micrograma/mililitro seleção de puromicina. As células resistentes à puromicina foram transportadas como uma população de células.

As células 293 HEK que sobre-expressam o recetor IL-28 humano foram transfetadas como se segue: 700,000 293 células/poço (placas com 6 poços) foram colocadas em placas aproximadamente 18h antes da transfeção em 2 mililitros DMEM + 10% soro bovino fetal. Por poço, 1 micrograma de 111 ΚΖ157 contendo um elemento de resposta estimulado pelo interferão (ISRE) que dirige a transcrição de um gene repórter luciferase foram adicionados a 3 microlitros de reagente Fugene 6 (Roche Biochemicals) num total de 100 microlitros de DMEM. Esta mistura de transfeção foi adicionada 30 minutos mais tarde às células 293HEK pré-colocadas em placas. Quarenta e oito horas mais tarde as células transfetadas foram removidas da placa utilizando tripsina-EDTA e re-colocadas em placas em 500 microgramas/ml G418 (Geneticin, Life Technologies). As células resistentes à puromicina e G418 foram transportadas como uma população de células.

Ensaios de reportagem de transdução do sinal

Os ensaios de reportagem de transdução do sinal foam feitos como se segue: as células 293HEK que sobre-expressam o recetor IL-28 humano e contendo KZ157 foram tratadas com tripsina-EDTA e re-colocadas em placas a aproximadamente 25,000 células/poço em placas de microtitulação com 96 poços. Aproximadamente 18 h antes da estimulação do ligando, os meios foram alterados para DMEM + 0,5%FBS.

Após um periodo de incubação de 18h a 37°C em DMEM + 0,5%FBS, as células transfetadas foram estimuladas com diluições (em DMEM + 0,5%FBS) das diferentes formas de zcyto21 deriada de E. coli contendo diferentes padrões de ligação da cisteina. Após um periodo de incubação de 4 horas a 37°C, as células foram lisadas, e as unidades de luz relativa (RLU) foram medidas num luminómetro após adição de um substrato de luciferase. Os resultados obtidos são mostrados como a indução em número de vezes da RLU das amostras experimentais sobre o meio controlo isolado (RLU de amostras experimentais/RLU do meio isolado = indução em número de vezes). O Quadro 11 mostra que a forma C1-C3 (C16-C113) da IL-2 9 derivada de E. coli de tipo selvagem é mais capaz de induzir a sinalização de ISRE do que a forma C3-C5 de tipo 112 selvagem (C113-C172) ou uma mistura da forma C1-C3 de tipo selvagem e a forma C3-C5 (C16-C113, C113-C172), todas referindo-se à SEQ. ID N.° 15. 0 Quadro 12 mostra que C1-C3 (C16-C113) da IL-29 derivada de E. coli de tipo selvagem e C1-C3 (C16-C113; SEQ. ID N.° 15) da IL-29 derivada de E. coli da mutante de cisteina (C172S) (SEQ. ID N.° 29) são igualmente capazes de induzir a sinalização de ISRE em células 293HEK que sobre-expressam o recetor IL-28 humano.

Quadro 11

Sinalização de ISRE por diferentes formas de IL-29 derivada de E. coli (Indução em número de vezes) Concentração de Citocina (ng/ml) forma C1-C3 (C16-C113) forma C3-C5 (C113-C172) Mistura de Cl-C3 e C3-C5 100 36 29 34 10 38 25 35 1 32 12 24 0,1 10 2 5 0,01 3 1 1 0,001 1 1 1

Quadro 12

Sinalização de ISRE por diferentes formas de IL-29 derivada de E, coli (Indução em número de vezes) Concentração de Citocina (ng/ml) C1-C3 de tipo selvagem Cl72 S C1-C3 de mutante de cisteina 1000 9, 9 CO 100 9,3 8,7 10 9,3 8,1 1 7,8 7 0,1 4, 6 3,3 \—1 o «k o 1,9 1,5 0, 001 1,3 0, 9 113

Exemplo 20

Indução da IL-28A, IL-29, IL-28B por poli I:C e infeção virai Células mononucleares sanguíneas periféricas humanas isoladas de fresco foram crescidas na presença de ácido poliinosínico-ácido policitidílico (poli I:C; 100 yg/ml) (SIGMA; St. Louis, MO), vírus da encefalomiocardite (EMCV) com um MOI de 0,1, ou em meio isolado. Após um período de incubação de 15h, o ARN total foi isolado das células e tratado com ADNase livre de ARNase. 100 ng de ARN total foram utilizados como molde para RT-PCR de uma etapa utilizando a RT-PCR de uma etapa Superscript com kit Platinum Taq e iniciadores específicos de gene, conforme sugerido pelo fabricante (Invitrogen).

Foram observadas quantidades baixas a indetetáveis de ARN da IL-28A, IL-28B, e IL-29 humana, IFN-α e IFN-β nas células não tratadas. Por oposição, a quantidade deARN da IL-28A, IL-29, IL-28B foi aumentada por ambos tratamento com poli I:C e infeção virai, como também se verificou para os interferões de tipo I. Estas experiências indicam que IL-28A, IL-29, IL-28B, interferões como os de tipo I, podem ser induzidos por ARN de cadeia dupla ou por infeção virai. Exemplo 21

Atividade sinalizadora da IL-28, IL-29 comparada com IFNa em células HepG2 A. Transfeções de células

As células HepG2 foram transfetadas como se segue: 700,000 HepG2 células/poço (placas com 6 poços) foram colocadas em placas aproximadamente 18h antes da transfeção em 2 mililitros de DMEM + 10% soro bovino fetal. Por poço, 1 micrograma de ADN de pISRE-Luciferase (Stratagene) e 1 micrograma de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech,) foram adicionados a 6 microlitros de reagente Fugene 6 (Roche Biochemicals) num total de 100 microlitros de DMEM. Esta mistura de transfeção foi adicionada 30 minutos mais tarde 114 às células HepG2 pré-colocadas em placas. Vinte e quatro horas mais tarde as células transfetadas foram removidas da placa utilizando tripsina-EDTA e re-colocadas em placas a aproximadamente 25,000 células/poço em placas de microtitulação com 96 poços. Aproximadamente 18 h antes da estimulação do ligando, os meios foram alterados para DMEM + 0,5%FBS. B. Ensaios de reportagem de transdução do sinal

Os ensaios de reportagem de transdução do sinal foram feitos como se segue: Após um periodo de incubação de 18h a 37°C em DMEM + 0,5%FBS, as células transfetadas foram estimuladas com 100 ng/ml de ligandos IL-28A, IL-29, IL- 28B, zcyto24, zcyto25 e huIFN-cx2a. Após um periodo de incubação de 4 horas a 31° graus, as células foram lisadas, e as unidades de luz relativa (RLU) foram medidas num luminómetro após adição de um substrato de luciferase. Os resultados obtidos são mostrados como a indução em número de vezes da RLU das amostras experimentais sobre o meio controlo isolado (RLU de amostras experimentais/RLU do meio isolado = indução em número de vezes). 0 Quadro 13 mostra que IL-28A, IL-29, IL-28B, zcyto24 e zcyto25 induzem a sinalização de ISRE em células de figado HepG2 humanas transfetadas com ISRE-luciferase.

Quadro 13: Indução em número de vezes de sinalização de ISRE dependente da citocina em células HepG2

Citocina Indução em número de vezes IL-28A 5, 6 IL-29 4 IL-28B 5, 8 Zcyto24 4,7 Zcyto25 3 HuIFN-a2a 5, 8

Exemplo 22

Atividade antiviral da IL-29 comparada com IFNa em células

HepG2 115

Um ensaio antiviral foi adaptado para EMCV (Coleção Americana de Culturas Tipo # VR-129B, Manassas, VA) com células humanas (Familletti, P., et al.., Methods Enzym. 78: 387-394, 1981). As células foram colocadas em placas com citocinas e incubadas 24 horas antes do desafio por EMCV a uma multiplicidade de infeção de 0,1 a 1. As células foram analisadas para a viabilidade com um bioensaio de captação de corante 24 horas após a infeção (Berg, K., et al., Apmis 98: 156-162, 1990). Foi dado às células alvo MTT e incubadas a 37°C durante 2 horas. Uma solução solubilizadora foi adicionada, incubada durante a noite a 37°C e a densidade ótica a 570 nm foi determinada. A OD570 é diretamente proporcional à atividade antiviral.

Os resultados mostram que a atividade antiviral quando IL-29 e IFN foram testados com células HepG2: IL-29, IFN-β e IFN a-2a foram adicionados a concentração variada às células HepG2 antes da infeção por EMCV e ensaio de captação do corante. A média e o desvio-padrão da OD570 de poços triplicados são mostradas no gráfico. OD570 é diretamente proporcional à atividade antiviral. Para IL-29, a EC50 foi 0,60 ng/ml; para IFN-cx2a, a EC50 foi 0,57 ng/ml; e para IFN-β, a EC50 foi 0,46 ng/ml.

Exemplo 23

Expressão de ARNm da IL-28RA no fígado e em subconjuntos de linfócitos

De modo a examiner mais profundamente a distribuição do ARNm para IL-28RA, foi realizada uma RT-PCR semi-quantitativa utilizando o sistema SDS 7900HT (Applied Biosystems, CA). Foi realizada RT-PCR duma etapa utilizando 100 ng de ARN total para cada amostra e iniciadores específicos de gene. Foi gerada uma curva padrão para cada iniciador estabelecida utilizando ARN Bjab e todos os valores da amostra foram normalizados a HPRT. Os resultados normalizados são sumarizados nos Quadros 14-17. Os valores normalizados para IFNAR2 e CRF2-4 também são mostrados. 116

Quadro 14: Células B e T expressam níveis significativos de ARNm da IL-28RA. São observados níveis baixos nas células dendríticas e na maioria dos monócitos.

Quadro 14 Célula/Tecido IL-28RA IFNAR2 CRF2-4 Células dendríticas não estimuladas ,04 5, 9 9,8 Células dendríticas +IFNg ,07 3, 6 4,3 Células dendríticas ,16 7,85 3, 9 CD14+ estimuladas com LPS/IFNg ,13 12 27 CD14+monócitos em repouso ,12 11 15,4 Hu CD14+ Inativo, 4,2 TBD TBD Hu CD14+ 1 ug/ml LPS ativo, 2,3 TBD TBD H, Amígdala inflamada 3 12,4 9,5 H, Células B+PMA/Iono 4 e 24 hrs 3, 6 1,3 1,4 Hu CD19+ em repouso 6, 2 TBD TBD Ha CD19+ 4 hr, PMA/Iono 10, 6 TBD TBD Hu CD19+ 24 hr ativo, PMA/Iono 3,7 TBD TBD IgD+ células B 6, 47 13, 15 6, 42 IgM+ Células B 9,06 15,4 2,18 IgD- Células B 5, 66 2,86 6,76 NKCells + PMA/Iono 0 6,7 2, 9 Hu CD3+ desativada 2,1 TBD TBD CD4+ em repouso , 9 8,5 29, 1 CD4+ Não estimulada 18 hrs 1, 6 8,4 13,2 CD4+ +Poli I/C 2,2 4,5 5,1 CD4+ + PMA/Iono ,3 1,8 , 9 CD3 neg em repouso 1, 6 7,3 46 CD3 neg não estimulada 18 hrs 2,4 13,2 16, 8 CD3 neg+Poli I/C 18 hrs 5,7 7 30,2 CD3 neg+LPS 18 hrs 3,1 11, 9 28,2 CD8+ não estimulada 18 hrs 1,8 4, 9 13, 1 CD8+ estimulada com PMA/Ion 18 hrs ,3 , 6 1,1 117

Conforme mostrado no Quadro 14, o tecido normal do fígado e as linhas de células derivadas do fígado exibem níveis substanciais de ARNm da IL-28RA e CRF2-4.

Quadro 15 Célula/tecido IL-28RA IFNAR2 CRF2-4 HepG2 1,6 3,56 2,1 HepG2 UGAR 5/10/02 1,1 1,2 2,7 HepG2, CGAT HKES081501C 4,3 2,1 6 HuH7 5/10/02 1, 63 16 2 hepatoma HuH7 - CGAT 4,2 7,2 3,1 Fígado, normal - CGAT #HXYZ020801K 11,7 3,2 8,4 Fígado, NAT - Tecido adjacente normal 4,5 4,9 7,7 Fígado, NAT - Tecido adjacente normal 2,2 6, 3 10,4 Hep SMVC veia hepática 0 1,4 6, 5 Hep SMCA artéria hepática 0 2,1 7,5 Fibro Hep. 0 2, 9 6,2 Ca. hepático 3, 8 2, 9 5, 8 Adenocarcinoma fígado 8,3 4,2 10,5 SK-Hep-I adenocarcinoma, Fígado ,1 1,3 2,5 Adenocarcinoma pancreático Humano AsPC-1 ,7 ,8 1,3 Células estreladas hepáticas humanas , 025 4,4 9,7

Conforme mostrado no Quadro 15, as células epiteliais das vias respiratórias primárias contêm níveis abundantes de IL-28RA e CRF2-4.

Quadro 16 Célula/tecido IL-28RA IFNAR2 CRF2-4 U87MG - glioma 0 , 66 , 99 NHBE não estimulada 1, 9 1,7 8,8 NHBE + TNF-alfa 2,2 5,7 4,6 118 Célula/tecido IL-28RA IFNAR2 CRF2-4 NHBE + poli I/C 1,8 nd nd células epiteliais das vias respiratórias pequenas 3, 9 3,3 27,8 NHLF - fibroblastos do pulmão humano normais 0 nd nd Conforme mostrado no Quadro 16, a presente em espécimes de fígado normal expressão aumentada em tecido de espécimes Hepatite C e Hepatite B. IL-28RA está e doente, com infetados com Quadro 17 Célula/tecido IL-28RA CRF2-4 IFNAR2 Fígado com Necrose de coagulação 8,87 15, 12 1,72 Fígado com Hepatite Autoimune 6, 46 8, 90 3, 07 Hepatite Neonatal 6,29 12,46 6,16 Doença hepática de estádio final 4,79 17,05 10,58 Falha Hepática Fulminante 1, 90 14,20 7, 69 Falha Hepática Fulminante 2,52 11,25 8,84 Cirrose, biliar primária 4, 64 12,03 3, 62 Cirrose alcoólica (de Laennec) 4,17 8,30 4,14 Cirrose, criptogénica 4,84 7,13 5,06 Hepatite C+, com cirrose 3, 64 7, 99 6, 62 Hepatite C+ 6, 32 11,29 7,43 hepatite secundária fulminante a Hep A 8, 94 21, 63 8,48 Hepatite C+ 7, 69 15, 88 8,05 Hepatite B+ 1, 61 12,79 6, 93 Figado Normal 8,76 5,42 3,78 Figado Normal 1,46 4,13 4,83 Figado NAT 3, 61 5,43 6, 42 Figado NAT 1, 97 10,37 6, 31 Fígado Fetal Hu 1,07 4,87 3, 98 119 Célula/tecido IL-28RA CRF2-4 IFNAR2 Carcinoma Hepatocelular 3,58 3, 80 3,22 Adenocarcinoma Fígado 8,30 10,48 4,17 Hep. SMVC. veia hepática 0,00 6,46 1,45 Hep SMCA artéria hepática 0,00 7,55 2,10 Fibroblasto Hep. 0,00 6,20 2, 94 hepatoma HuH7 4,20 3, 05 7,24 carcinoma Hepatocelular HepG2 3,40 5, 98 2,11 9K-Hep-1 adenocarcinoma Fígado 0,03 2,53 1,30 HepG2 Não estimulada 2,06 2, 98 2,28 HepG2+zcyto21 2,28 3, 01 2,53 HepG2+IFNa 2, 61 3, 05 3, 00 Fígado Normal de fêmea - degradado 1,38 6, 45 4,57 Fígado Normal - degradado 1, 93 4, 99 6, 25 Fígado Normal - degradado 2,41 2,32 2,75 Fígado doente - degradado 2,33 3, 00 6, 04 Hepatócitos primaries da Clonetics 9, 13 7,97 13, 30

Conforme mostrado nos Quadros 18-22, a IL-28RA é detetável nas células B normais, linhas de células de linfoma B, células T, linhas de células de linfoma T (Jurkat), linfócitos normais e transformados (células B e células T) e monócitos humanos normais. Quadro 18 Média HPRT Média IL- 28RA IL-28RA normlizada IFNAR2 IFNR2 normalizada CRF2- 4 CRF2-4 Normalizada CD14+24hr não estimulada #A38 13,1 68, 9 5,2 92,3 7,0 199, 8 15,2 CD14+ 24 hr estimulada #A38 6, 9 7,6 1,1 219, 5 31,8 276, 6 40, 1 CD14+24 hr não estimulada #A112 17,5 40, 6 2,3 163, 8 9,4 239,7 13, 7 120 Média HPRT Média IL- 28RA IL-28RA normlizada IFNAR2 IFNR2 normalizada CRF2- 4 CRF2-4 Normalizada CD14+ 24 hr estimulada #A112 11,8 6, 4 0,5 264,6 22,4 266, 9 22,6 CD14+ em repouso #X 32,0 164,2 5,1 1279,7 39, 9 699, 9 21,8 CD14+ +LPS #x 21,4 40, 8 1,9 338,2 15, 8 518, 0 24,2 CD14+ 24 hr não estimulada #A39 26, 3 86, 8 3,3 297,4 11,3 480, 6 18,3 CD14+ 24 hr estimulada #A39 16, 6 12,5 0, 8 210, 0 12,7 406, 4 24,5 HL60 Em repouso 161,2 0,2 0, 0 214,2 1,3 264,0 1,6 HL60+PMA 23, 6 2,8 0,1 372,5 15, 8 397,5 16, 8 U937 Em repouso 246, 7 0, 0 0, 0 449, 4 1,8 362,5 1,5 U937+PMA 222,7 0, 0 0, 0 379, 2 1,7 475, 9 2,1 Jurkat Em repouso 241,7 103, 0 0,4 327,7 1,4 36, 1 0,1 Jurkat ativado 130,7 143,2 1,1 Colo2 05 88, 8 43,5 0,5 HT-29 26, 5 30,5 1,2

Quadro 19 HPRT SD IL-28RA SD Mono 24hr não estimulada #A38 0, 6 2,4 Mono 24 hr estimulada #A38 0,7 0,2 Mono 24 hr não estimulada #A112 2,0 0,7 Mono 24 hr estimulada #A112 0,3 \—1 o Mono em repouso #X 5,7 2,2 Mono+LPS #X LO O O \—1 Mono 24 hr não estimulada #A39 0,7 0,8 121 HPRT SD IL-28RA SD Mono 24 hr estimulada #A39 0,1 0,7 HL60 Em repouso 19, 7 0,1 HL60+PMA 0,7 0,4 U937 Em repouso 7,4 0,0 U937+PMA 7,1 0,0 Jurkat Em repouso 3,7 1,1 Jurkat ativado 2,4 1,8 Colo205 1, 9 0,7 HT-29 2,3 1,7

Quadro 20

Hprt Média IFNAR2Média IL-28RA Média CRF Média CD3+/CD4+ 0 10,1 85, 9 9, 0 294, 6 CD4/CD3+ Não estimulada 18 hrs 12, 9 108,7 20,3 170,4 CD4+/CD3+ +Poli I/C 18 hrs 24,1 108,5 52,1 121,8 CD4+/CD3+ + PM/lIono 18 hrs 47,8 83,7 16, 5 40,8 CD3 neg 0 15,4 111,7 24,8 706, 1 CD3 neg não estimulada 18 hrs 15,7 206, 6 37,5 263, 0 CD3 neg +Poli I/C 18 hrs 9, 6 67,0 54,7 289, 5 CD3 neg +LPS 18 hrs 14,5 173,2 44, 6 409, 3 CD8+ Não estimulada, 18 hrs 6,1 29, 7 11, 1 79, 9 CD8+ + PMA/Iono 18 hrs 78,4 47, 6 26, 1 85,5 12,8,1 - NHBE Não estimulada 47,4 81,1 76, 5 415, 6 122

Hprt Média IFNAR2Média IL-28RA Média CRF Média 12,8,2 - NHBE+TNF-alf a 42,3 238,8 127,7 193, 9 SAEC 15,3 49, 9 63, 6 426, 0

Quadro 21 IL-28RA Normalizad o CRF Normalizad o IFNAR2 Normalizad o IL- 28R A DP CR F DP IFNAR 2 DP CD3+/CD4+ 0 0, 9 29, 1 8,5 0,1 1, 6 0,4 CD4/CD3+ Não estimulada 18 hrs 1, 6 13,2 8,4 0,2 1, 6 1,4 CD4+/CD3+ +Poli I/C 18 hrs 2,2 5,1 4,5 0,1 0, 3 0,5 CD4+/CD3+ + PMA/Iono 18 hrs 0,3 0, 9 1,8 0,0 0, 1 0,3 CD3 neg 0 1, 6 46, 0 7,3 0,2 4, 7 1,3 CD3 neg não estimulada 18 hrs 2,4 16, 8 13,2 0,4 2, 7 2,3 CD3 neg +Poli I/C 18 5,7 30,2 7,0 0,3 1, 7 0,8 CD3 neg+LPS 18 hrs 3,1 28,2 11, 9 0,4 5, 4 2, 9 CD8+ Não estimulada , 18 hrs 1,8 13, 1 4, 9 0,1 1, 1 0,3 CD8+ + PMA/Iono 18 hrs 0,3 1,1 0, 6 0,0 0, 1 0,0 123 12,8,1 NHBE Não estimulada 1, 6 co co 1,7 \—1 O 0, 4 \—1 o 12,8,2 NHBE+TNF-alf a 3, 0 4, 6 5,7 0,1 0, 1 0,1 SAEC 4,1 27,8 3,3 0,2 1, 1 0,3

Quadro 22 DP Hprt DP IFNAR2 DP IL-2 8 RA DP CRF CD3+/CD4+ 0 0,3 3,5 0, 6 12,8 CD4/CD3+ Não estimulada 18 hrs 1,4 13,7 1,1 8,5 CD4+/CD3+ +Poli I/C 18 hrs 1,3 9,8 1, 6 3,4 CD4+/CD3+ + PMA/Iono 18 hrs 4,0 10,3 0,7 3,7 CD3 neg 0 1,4 16, 6 1, 6 28, 6 CD3 neg não estimulada 18 hrs 2,4 16, 2 2,7 12, 6 CD3 neg +Poli I/C 18 hrs 0,5 7,0 1,0 8,3 CD3 neg +LPS 18 hrs 1,0 39, 8 5, 6 73, 6 CD8+ Não estimulada, 18 hrs 0,2 1, 6 0,5 6,1 CD8+ + PMA/Iono 18 hrs 1,3 1,7 0,2 8,1 12,8,1- NHBE Não estimulada 2,4 5, 6 2,7 2,8 12,8,2 - NHBE+TNF-alfa 0,5 3,4 3,5 3,4 SAEC 0,5 4,8 1,8 9, 9

Exemplo 24 IL-28 de ratinho não afeta a proliferação de células Daudi Células Daudi humanas foram suspensas em RPMI + 10%FBS a 50,000 células/mililitro e 5000 células foram 124 colocadas por poço numa placa com 96 poços. IL-29-CEE (IL-29 conjugada com etiqueta glu), IFN-y ou IFN-a2a foi adicionado em diluições em série duplas a cada poço. IL-29-CEE foi utilizada num intervalo de concentração de 1000 ng/ml a 0,5 ng/ml. IFN-y foi utilizado num intervalo de concentração de 125 ng/ml a 0,06 ng/ml. IFN-oí2a foi utilizado num intervalo de concentração de 62 ng/ml a 0,03 ng/ml. As células foram incubadas durante 72 h a 37°C. Após 72 h. foi adicionado Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 microlitros/poço. As placas foram, ainda, incubadas a 37°C, 5% CO, durante 24 horas. As placas foram lidas no leitor de placas Fmax™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) utilizando o programa SoftMax™ Pro, a comprimentos de onda de 544 (Excitação) e 590 (Emissão) . O Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica bseada na atividade metabólica das células, e é, por isso, uma medida direta da proliferação celular em comparação com um controlo negativo. Os resultados indicam que a IL-29-CEE, ao contrário de IFN-a2a, não tem efeito significativo na proliferação das células Daudi.

Exemplo 25 IL-28 de ratinho não tem efeito antiproliferativo nas células B de ratinho Células B de ratinho foram isoladas a partir de baços 2 Balb/C (7 meses de idade) esgotando células CD43+ utilizando contas magnéticas MACS. As células B purificadas foram cultivadas in vitro com LPS, anti-IgM ou anticorpos monoclonais anti-CD40. A IL-28 de ratinho ou IFNa de ratinho foi adicionada às culturas e foi adicionada 3H-timidina às 48 hrs e a incorporação de 3H-timidina foi medida após 72 hrs. de cultivo. IFNa a 10 ng/ml inibiu a incorporação de 3H-timidina por células B de ratinho estimuladas com LPS ou com anti-IgM. Contudo, a IL-28 de ratinho não inibiu a incorporação de 3H-timidina a qualquer concentração testada, incluindo 125 1000 ng/ml. Por oposição, ambos mlFNa e IL-28 de ratinho aumentaram a incorporação de 3H timidina por células B de ratinho estimuladas com MAb anti-CD40.

Estes dados demonstram que a IL-28 de atinho, ao contrário de IFNa, não exibe no atividade antiproliferativa mesmo em concentrações elevadas. Além disso, a zcyto24 potência a proliferação na presença de MAbs anti-CD40. Os resultados ilustram que a IL-28 de ratinho difere de IFNa pelo facto da IL-28 de ratinho não exibir atividade antiproliferativa nas células B de ratinho, mesmo em concentrações elevadas. Além disso, a IL-28 de ratinho potência a proliferação na presença de anticorpos monoclonais anti-CD40.

Exemplo 26

Ensaio de expansão da medulla óssea Células mononucleares da medula humana (Poietic Technologies, Gaithersburg, Md.) foram aderidas a plástico durante 2 hrs em aMEM, 10% FBS, 50 micromolar p- mercaptoetanol, 2 ng/ml FLT3L a 37°C. Células não aderentes foram depois colocadas em placas a 25,000 a 45,000 células/poço (placas de cultura de tecido com 96 poços) em aMEM, 10% FBS, 50 micromolar β-mercaptoetanol, 2 ng/ml FLT3L na presença ou ausência de 1000 ng/ml IL-29-CEE, 100 ng/ml IL-29-CEE, 10 ng/ml IL-29-CEE, 100 ng/ml IFN-a2a, 10 ng/ml IFN-a2a ou 1 ng/ml IFN-a2a. Estas células foram incubadas com uma variedade de citocinas para testar a expansão ou diferenciação de células hematopoiéticas da medula (20 ng/ml IL-2, 2 ng/ml IL-3, 20 ng/ml IL-4, 20 ng/ml IL-5, 20 ng/ml IL-7, 20 ng/ml IL-10, 20 ng/ml IL-12, 20 ng/ml IL-15, 10 ng/ml IL-21 ou sem citocina adicionada). Após 8 a 12 dias foi adicionado Alamar Blue (Accumed,

Chicago, 111.) a 20 microlitros/poço. As placas foram, ainda, incubadas a 37 °C, 5% CO, durante 24 horas. As placas foram lidas no leitor de placas Fmax” (Molecular

Devices Sunnyvale, Calif.) utilizando o programa SoftMax 126

Pro, nos comprimentos de onda 544 (Excitação) e 590 (Emissão). O Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica baseada na atividade metabólica das células, e é, assim, uma medida direta da proliferação celular em comparação com um controlo negativo. IFN-a2a causou uma inibição significativa da expansão da medula óssea emtodas as condições testadas. Por oposição, IL-29 não teve efeito significativo na expansão das células da medula óssea na presença de IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-21 ou sem citocina adicionada.

Foi observada uma pequena inibição da expansão das células da medula óssea na presença de IL-2 ou IL-15.

Exemplo 27

Inibição da sinalização de IL-28 e IL-29 com recetor solúvel (zcytoR19/CRF2-4) A. Ensaio de reportagem da transdução do sinal

Pode ser utilizado um ensaio de reportagem de transdução do sinal para mostrar as propriedades inibidoras dos recetores solúveis zcytorl9-Fc4 homodimérico e zcytorl9-Fc/CRF2-4-Fc heterodimérico na sinalização de zcyto20, zcyto21 e zcyto24. As células de rim embrionário humano (HEK) que sobre-expressam o recetor zcytorl9 são transfetadas com um plasmideo repórter que contém um elemento de resposta estimulado pelo interferão (ISRE) que dirige a transcrição de um gene repórter luciferase. A atividade da luciferase após a estimulação das células transfetadas com ligandos (incluindo zcyto20 (SEQ. ID N.° 2), zcyto21 (SEQ. ID N.° 4), zcyto24 (SEQ. ID N.° 8)) reflete a interação do ligando com o recetor solúvel. B. Transfeções de células Células 293 HEK que sobre-expressam zcytorl9 foram transfetadas como se segue: 700,000 293 células/poço (placas com 6 poços) foram colocadas em placas aproximadamente 18h antes da transfeção em 2 mililitros de DMEM + 10% soro bovino fetal. Por poço, foram adicionados 1 127 micrograma de ADN de pISRE-Luciferase (Stratagene) e 1 micrograma de ADN de pIRES2-EGFP (Clontech,) a 6 microlitros de reagente Fugene 6 (Roche Biochemicals) num total de 100 microlitros de DMEM. Esta mistura de transfeção foi adicionada 30 minutos mais tarde às células 293 pré-colocadas em placas. Vinte e quatro horas mais tarde as células transfetadas foram removidas da placa utilizando tripsina-EDTA e re-colocadas em placas a aproximadamente 25,000 células/poço em placas de microtitulação com 96 poços. Aproximadamente 18 h antes da estimulação do ligando, os meios foram alterados para DMEM + 0,5%FBS. C. Ensaios de reportagem de transdução do sinal

Os ensaios de reportagem de transdução do sinal foram feitos como se segue: Após um período de incubação de 18h a 37 °C em DMEM + 0,5%FBS, as células transfetadas foram estimuladas com 10 ng/ml zcyto20, zcyto21 ou zcyto24 e 10 microgramas/ml dos seguintes recetores solúveis; homodímero zcytorl9-Fc humano, heterodímero zcytorl9-Fc humano/CRF2-4-Fc humano, homodímero CRF2-4-Fc humano, homodímero zcytorl9-Ig murino. Após um período de incubação de 4 horas a 37°C, as células foram lisadas, e as unidades de luz relativa (RLU) foram medidas num luminómetro após adição de um substrato de luciferase. Os resultados obtidos são mostrados como a inibição percentual da sinalização induzida pelo ligando na presença de recetor solúvel relativa à sinalização na presença de apenas PBS. O Quadro 23 mostra que o recetor solúvel heterodimérico zcytorl9-Fc humano/ CRF2-4 humano é capaz de inibir a sinalização induzida por zcyto20, zcyto21 e zcyto24 entre 16 e 45% do controlo. O recetor solúvel heterodimérico zcytorl9-Fc humano também é capaz de inibir a sinalização induzida por zcyto21 em 45%. Não foram observados efeitos significativos com os recetores solúveis heterodiméricos huCRF2-4-Fc ou muzcytorl9-Ig. 128

Quadro 23: Inibição percentual de sinalização induzida pelo ligando do elemento resposta estimulada pelo Interferão (ISRE) por Recetores solúveis

Ligando Huzcytorl9-Fc/ huCRF2-4-Fc Huzcytorl9-Fc HuCRF2-4-Fc Muzcytorl9- Ig Zcyto20 16% 92% 80% 91% Zcyto21 16% 45% 79% 103% Zcyto24 47% 90% 82% 89%

Exemplo 28 IL-28 e IL-29 inibem a replicação do HIV em PBMCs humanas frescas 0 virus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovirus patogénico que infeta as células do sistema imune. As células CD4 T e monócitos são os tipos de célulos infetados primários. Para testar a capacidade da IL-28 e IL-29 de inibirem a replicação do HIV in vitro, PBMCs de dadores normais foram infetadas com o virus do HIV na presença de IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG. Células mononucleares sanguíneas periféricas humanas frescas (PBMCs) foram isoladas a partir do sangue inteiro obtido de dadores triados que eram seronegativos ao HIV e HBV. As células sanguíneas periféricas foram tornadas numa pelete e lavadas 2-3 vezes por centrifugação a baixa velocidade e ressuspensas em PBS para remover plaquetas contaminantes. As células sanguíneas lavadas foram diluídas 1:1 com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS) e colocada em camadas sobre 14 mL de meio de separação de linfócitos ((LSM; cellgro™ por Mediatech, Inc. Herndon, VA); densidade 1,078 +/-0,002 g/ml) num tubo de centrífuga de 50 mL e centrifugada durante 30 minutos a 600 x G. PBMCs com bandas foram gentilmente aspiradas da interface resultante e lavadas subsequentemente 2X em PBS por centrifugação abaixa velocidade. Após a lavagem final, 129 as células foram contadas por exclusão do azul de tripano e ressuspensas a 1 x 107 células/mL em RPMI 1640 suplementado com 15% soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 4 mg/mL PHA-P. As células foram permitidas incubar durante 48-72 horas a 37°C. Após incubação, PBMCs foram centrifugadas e ressuspensas em RPMI 1640 com 15% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina, 100 mg/mL estreptomicina, 10 mg/mL gentamicina, e 20 U/mL IL-2 humana recombinante. PBMCs foram mantidas no meio a uma concentração de 1-2 x 106 células/mL com alterações do meio bissemanais até utilizadas no protocolo do ensaio. Os monócitos foram esgotados da cultura como o resultado da aderência ao frasco de cultura de tecidos.

Para o ensaio PBMC convencional, células estimuladas por PHA-P de, pelo menos, dois dadores normais foram agrupadas, diluidas em meio fresco a uma concentração final de 1 x 106 células/mL, e colocadas em placas nos poços interiores de uma microplaca de fundo redondo com 96 poços a 50 mL/poço (5 x 104 células/poço) . As diluições teste foram preparadas a uma concentração 2X os tubos de microtitulação e 100 mL de cada concentração foram colocados em poços apropriados num formato convencional. IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG foram adicionadas a concentrações de 0-10 mg/ml, normalmente em diluições 1/2 log. 50 mL de uma diluição pré-determinada de stock de virus foram colocados em cada poço teste (MOI final de 0,1). Os poços com apenas células e virus adicionados foram utilizados como controlo virus. Foram preparadas placas separadas identicamente sem virus para estudos de citotoxicidade do fármaco utilizando um sistema de teste MTS. As culturas PBMC foram mantidas durante sete dias após a infeção, a partir dos quais as amostras de sobrenadante livres de células foram colhidas e testadas para a atividade da transcriptase reversa e níveis de antígeno p24. 130

Uma diminuição da atividade da transcriptase reversa ou nos niveis do antigeno p24 com IL-28, IL-29 e MetlL-29C172S-PEG seriam indicadores de atividade antiviral. Os resultados demonstrariam que a IL-28 e IL-29 podem ter um valor terapêutico no tratamento de HTV e SIDA.

Exemplo 29 IL-28 e IL-29 inibem a replicação de GBV-B em células de fígado de sagui HCV é um membro da família Flaviviridae de vírus de ARN. HCV não se replica bem quer em culturas ex-vivo ou in vitro e, por isso, não existem sistemas satisfatórios para testar a atividade anti-HCV de moléculas in vitro. O vírus GB B (GBV-B) é um modelo substituto apelativo para utilização no desenvolvimento de agentes antivirais anti-HCV, uma vez que tem um nível relativamente alto de identidade de sequência com o HCV e é um vírus hepatotrópico. Até à data, o vírus pode apenas ser crescido nos hepatócitos primários de certos primatas não humanos. Isto é conseguido ou por isolando hepatócitos in vitro e infetando-os com GBV-B, ou isolando hepatócitos a partir de saguis infetados com GBV-B e diretamente utilizando-os com compostos antivirais.

Os efeitos da IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG são testados na produção de ARN extracelular de GBV-B por RT-PCR TaqMan e na citotoxicidde utilizando reagente CellTiter96® (Promega, Madison, WI) em seis diluições meia-log de polipeptídeo de IL-28, IL-29 ou MetIL-29C172S-PEG em triplicado. As culturas não tratadas servem como os controlos da célula e do vírus. Ambos RIBAVIRIN® (200 mg/ml na concentração teste mais alta) e IFN-a (5000 IU/ml ao teste mais alto) são incluídos como compostos controlo positivos. As culturas de hepatócitos primários são isoladas e colocadas em placas sobre placas de revestidas com colagénio. No dia seguinte as culturas são tratadas com as amostras teste (IL-28, IL-29, MetIL-29C172S-PEG, IFNa, 131 ou RIBAVIRIN®) durante 24hr antes de serem expostas a viriões GBV-B ou tratadas diretamente com as amostras teste quando se utilizam hepatócitos infetados in vivo. As amostras e meios teste são adicionados no dia seguinte, e substituidos três dias depois. Três a quatro dias mais tarde (no dia 6-7 após a adição da amostra teste) o sobrenadante é recolhido e os números de células quantificados com CellTiter96®. 0 ARN virai é extraído do

sobrenadante e quantificado com réplicas em triplicado num ensaio de RT-PCR TaqMan quantitativo utilizando um ARN transcrito in vitro que contém o alvo da RT-PCR como um padrão. A média das amostras replicadas é calculada. A inibição da produção do vírus é avaliada construindo um gráfico com os valores do ARN médio e os números de células das amostras em triplicado em relação aos controlos do vírus não tratados e células. A concentração inibidora do fármaco que resulta em 50% de inibição da produção de ARN GBV-B (IC50) e a concentração tóxica que resulta na destruição de 50% dos números de células relativos aos valores controlo (TC50) são calculados por interpolação a partir dos gráficos criados com os dados. A inibição da produção do ARN GBV-B por IL-28 e 29 é uma indicação das propriedades antivirais da IL-28 e IL-29 neste vírus tipo Hepatite C nos hepatócitos, o orgão primário de infeção da Hepatite C, e resultados positivos sugerem que a IL-28 ou IL-29 podem ser úteis no tratamento de infeções por HCV em humanos.

Exemplo 30 IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG inibem a replicação de HBV em células WT10 A Hepatite crónica B (HBV) é uma das infeções virais mais comuns e severas dos humanos que pertence à família de vírus Hepadnaviridae. Para testar as atividades antivirais da IL-28 e IL-29 contra a HBV, IL-28, IL-29 e MetlL-29C172S-PEG foram testadas contra a HBV num sistema de 132 infeção in vitro utilizando uma VARIANTE da linha HepG2 do figado humano. IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG inibiram a replicação virai neste sistema, o que sugere valor terapêutico no tratamento de HBV em humanos. Células WT10 são um derivado da linha de células HepG2 2.2.15 do figado humano. As células WT10 são transfetadas de forma estável com o genoma da HBV, o que permite a expressão estável de transcritos de HBV na linha de células (Fu e Cheng, Antimicrobial Agents Chemother. 44(12):3402-3407, 2000) . No ensaio WT10 o fármaco em questão e um controlo 3TC serão testados a cinco concentrações cada, diluidos numa série de meio-log. Os pontos terminais são PCR TaqMan para ADN da HBV extracelular (IC50) e números de células utilizando reagente CellTiter96 (TC50). O ensaio é semelhante ao descrito por Korba et al. Antiviral Res. 15 (3):217-228, 1991 e Korba et al., Antiviral Res. 19(1):55-70, 1992. Resumidamente, as células WT10 são colocadas em placas de microtitulação com 96 poços. Após 16-24 horas, a camada confluente de células HepG2-2.2.15 é lavada e o meio é substituído com meio completo contendo concentrações variadas de amostras teste em triplicado. 3TC é utilizado como o controlo positivo, enquanto o meio isolado é adicionado às células como um controlo negativo (controlo virus, VC) . Três dias mais tarde, o meio de cultura é substituído com meio fresco contendo as amostras teste adequadamente diluídas. Seis dias após a adição inicial do composto teste, o sobrenadante da cultura de células é recolhido, tratado com pronase e ADNse, e utilizado num ensaio de PCR TaqMan quantitativo em tempo real. O ADN da HBV amplificado por PCR é detetado em tempo real monitorizando os aumentos nos sinais de fluorescência que resultam da degradação exonucleolítica de uma molécula sonda fluorescente extinta que hibridiza com o ADN da HBV amplificado. Por cada amplificação por PCR, é erada simultâneamente uma curva padrão utilizando diluições de 133 ADN da HBV purificado. A atividade antiviral é calculada a partir da redução nos niveis de ADN da HBV (IC5o) · Um ensaio de captação de corante é depois empregue para medir a viabilidade das células que é utilizado para calcular a toxicidade (TC50). 0 indice terapêutico (TT) é calculado como TC50/IC50. IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG inibiram HepB a replicação virai nas células WT10 com um IC50 < 0,032 ug/ml. Isto demonstra que a atividade antiviral da IL-28 e IL-29 contra a HBV crescida em linhas de células do figado, providenciando evidência do valor terapêutico para tratar a HBV em pacientes humanos.

Exemplo 31 IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG inibem a replicação de BVDV em células de rim bovino HCV é um membro da familia de virus de ARN Flaviviridae. Outros virus que pertencem a esta familia são o virus da diarreia virai bovina (BVDV) e o virus da febre amarela (YFV) . HCV não se replica bem quer em culturas ex vivo ou in vitro e, por isso, não existem sistemas para testar a atividade anti-HCV in vitro. Os ensaios BVDV e YFV são utilizados como virus substituto para HCV para testar as atividades antivirais contra a familia de virus Flavivirida.

Os efeitos antivirais de IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG forama avaliados em ensaios de inibição do efeito citopático (CPE). O ensaio mediu a morte celular utilizando células de rim bovino de Madin-Darby (MDBK) após infeção com virus BVDV citopático e a inibição da morte celular por adição de IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG. As células MDBK foram propagandas em meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM) contendo vermelho de fenol com 10% soro de cavalo, 1% glutamina e 1% penicilina-estreptomicina. Os ensaios de inibição de CPE foram realizados em DMEM sem vermelho de fenol com 2% FBS, 1% glutamina e 1% Pen-Strep. No dia 134 anterior aos ensaios, as células foram tripsinaizadas (1 % tripsina-EDTA), lavadas, contadas e colocadas a 104 células/poço em placas de fundo raso com 96 poços BioCoat® (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) num volume de 100 μΐ/poço. No dia seguinte, o meio foi removido e uma aliquota pré-titulada do vírus foi adicionada às células. A quantidade de virus foi a diluição máxima que produziria a morte completa das células (>80%) no momento do desenvolvimento máximo de CPE (dia 7 para BVDV) . A viabilidade das células foi determinada utilizando um reagente CellTiter96® (Promega), de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando um leitor de placa Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). As amostras teste foram testadas a seis concentrações cada, diluídas em meio de ensaio numa série de meio-log. IFNa e RIBAVIRIN® foram utilizados como controlos positivos. As amostras teste foram adicionadas no momento da infeção virai. Os dados médios corrigidos pela cor de fundo e da amostra para a redução de CPE percentual e viabilidade percentual das células a cada concentração foram determinados em relação aos controlos e a IC5o foi calculada em relação à TC50. IL-28, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG inibiram a morte celular induzida por BVDV em células de rim bovino MDBK. IL-28 inibiu a morte celular com um IC50 de 0,02 yg/ml, IL-29 inibiu a morte celular com um IC50 de 0,19 yg/ml, e MetIL-29C172S-PEG inibiu a morte celular com um IC50 de 0,45 yg/ml. Isto demonstrou que a IL-28 e IL-29 têm atividade antiviral contra a família de vírus Flavivirida. Exemplo 32

Indução dos genes estimulados pelo Interferão por IL-28 e IL-29 A. Células Mononucleares sanguíneas periféricas humanas Células mononucleares sanguíneas periféricas humanas isoladas de fresco foram crescidas na presença de IL-29 (20 ng/mL), IFNa2a (2 ng/ml) (PBL Biomedical Labs, Piscataway, 135 NJ), ou em meio isolado. As células foram incubadas durante 6, 24, 48, ou 72 horas, e depois o ARN total foi isolado e tratado com ADNase livre de ARNase. 100 ng de ARN total foi utilizado como um molde para RT-PCR® de uma etapa Semi-Quantitativa utilizando Reagentes RT-PCR de uma etapa Taqman Master Mix® e iniciadores específicos de gene, conforme sugerido pelo fabricante (Applied Biosystems, Branchburg, NJ). Os resultados foram normalizados para HPRT e são mostrados como a indução em número de vezes sobre o meio controlo isolado para cada ponto de tempo. O Quadro 24 mostra que a IL-29 induz a expressão do gene estimulado pelo Interferão em células mononucleares sanguíneas periféricas humanas em todos os pontos de tempo testados.

Quadro 24

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes Pkr Indução em número de vezes OAS 6 hr IL29 3,1 2,1 2,5 6 hr IFNa2a 17,2 9,6 16,2 24 hr IL2 9 19,2 5, 0 8,8 24 hr IFNa2a 57,2 9,4 22,3 48 hr IL29 7,9 3, 5 3, 3 48hr IFNa2a 18,1 5, 0 17,3 72 hr IL29 9,4 3,7 9, 6 72 hr IFNa2a 29, 9 6,4 47,3 B. Células T Humanas ativadas Células T humanas foram isoladas por seleção negativa a partir de células mononucleares sanguíneas periféricas 136 colhidas de fresco utilizando o kit Pan T-cell Isolation®, de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi, Auburn, CA) . As células T foram depois ativadas e expandidas durante 5 dias com anti-CD3 ligada a placa, anti-CD28 solúvel (0,5ug/ml), (Pharmingen, San Diego, CA) e Interleucina 2 (IL-2; 100 U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN), lavadas e depois expandidas por mais 5 dias com IL-2. Após a ativação e expansaão, as células foram estimuladas com IL-28A (20 ng/ml), IL-29 (20 ng/ml), ou meio isolado durante 3, 6, ou 18 horas. O ARN total foi isolado e tratado com ADNase livre de ARNase. Foi realizada uma RT-PCR® de uma etapa Semi-Quantitativa, conforme descrito no exemplo anterior. Os resultados foram normalizados para HPRT e são mostrados como a indução em número de vezes sobre o meio controlo isolado para cada ponto de tempo. O Quadro 25 mostra que IL-28 e IL-29 induzem a expressão do gene estimulado pelo Interferão em células T humanas ativadas em todos os pontos de tempo testados.

Quadro 25

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes Pkr Indução em número de vezes OAS Dador #1 3 hr IL2 8 5,2 2,8 4,8 Dador #1 3 hr IL2 9 5, 0 3,5 6, 0 Dador #1 6 hr IL2 8 5,5 2,2 3, 0 Dador #1 6 hr IL2 9 6, 4 2,2 3,7 Dador #1 18 hr IL2 8 4, 6 4,8 4,0 Dador #1 18 hr IL2 9 5, 0 00 00 4,1 Dador #2 3 hr IL2 8 5,7 2,2 3, 5 137

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes Pkr Indução em número de vezes OAS Dador #2 3 hr IL2 9 6, 2 2,8 4,7 Dador #2 6 hr IL2 8 7,3 1, 9 4,4 Dador #2 6 hr IL2 9 8,7 2, 6 4, 9 Dador #2 18 hr IL2 8 4,7 2,3 3, 6 Dador #218 hr IL2 9 4, 9 2,1 3, 8 C. Hepatócitos primários humanos

Hepatócitos humanos isolados de fresco de dois dadores separados (Cambrex, Baltimore, MD e CellzDirect, Tucson, AZ) foram estimulados com IL-28A (50 ng/ml), IL-29 (50 ng/ml), IFNa2a (50 ng/ml), ou meio isolado durante 24 horas. Após a estimulação, o ARN total foi isolado e tratado com ADNase livre de ARNase. Foi realizada RT-PCR de uma etapa semi-quantitativa conforme descrito previamente no exemplo anterior. Os resultados foram normalizados para HPRT e são mostrados como a indução em número de vezes sobre o meio controlo isolado para cada ponto de tempo. O Quadro 26 mostra que a IL-28 e IL-29 induzem a expressão do gene estimulado pelo Interferão em hepatócitos primários humanos após estimulação durante 24 horas.

Quadro 26

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes Pkr Indução em número de vezes OAS Dador #1 IL28 31,4 6, 4 30,4 Dador #1 IL29 31,8 5,2 27,8 Dador #1 IFN-a2a 63,4 8,2 66, 7 Dador #2 IL28 41,7 4,2 24,3 138

Indução em Indução em Indução em número de número de número de vezes MxA vezes Pkr vezes OAS Dador #2 IL29 44,8 5,2 25,2 Dador #2 IFN- 53,2 4,8 38,3 a2a D. HepG2 e HuH7: linhas de células de Hepatoma do Fígado Humano Células HepG2 e HuH7 (ATCC N.°s 8065, Manassas, VA) foram estimuladas com IL-28A (10 ng/ml), IL-29 (10 ng/ml), IFNa2a (10 ng/ml), IFNB (1 ng/ml) (PBL Biomedical, Piscataway, NJ) , ou meio isolado durante 24 ou 48 horas. Numa cultura separada, as células HepG2 foram estimuladas conforme descrito anteriormente com 20 ng/ml de MetlL-29C172S-PEG ou MetIL-29-PEG. o ARN total foi isolado e tratado com ADNase livre de ARNase. 100 ng de ARN total foi utilizado como um molde para RT-PCR de uma etapa semi-quantitativa, conforme descrito anteriormente. Os resultados foram normalizados para HPRT e são mostrados como a indução em número de vezes sobre o meio controlo isolado para cada ponto de tempo. O Quadro 27 mostra que IL-28, e IL-29 induzem a expressão de ISG em linhas de células HepG2 e HuH7 de hepatoma do figado após 24 e 48 horas.

Quadro 27

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes Pkr Indução em número de vezes OAS HepG2 24 hr IL2 8 12,4 0,7 3, 3 HepG2 24 hr IL2 9 36, 6 2,2 6,4 HepG2 24 hr IFNcx2a 12,2 1,9 3,2 HepG2 24 hr ΙΓΝβ 93, 6 3,9 19, 0 139

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes Pkr Indução em número de vezes OAS HepG2 48hr IL28 2,7 0,9 1,1 HepG2 48hr IL29 27,2 2,1 5, 3 HepG2 4 8 hr IFNa2a 2,5 0,9 1,2 HepG2 48hr IFNP 15, 9 1,8 3, 3 HuH7 24 hr IL28 132,5 5,4 52, 6 HuH7 24 hr IL29 220,2 7,0 116, 6 HuH7 24 hr IFNa2a 157,0 5,7 67,0 HuH7 24 hr ΙΡΝβ 279, 8 5, 6 151,8 HuH7 48hr IL28 25, 6 3,4 10,3 HuH7 48hr IL29 143, 5 7,4 00 o QD HuH7 48 hr IFNa2a 91,3 5, 8 32,3 HuH7 48hr ΙΓΝβ 65, 0 4,2 35, 7

Quadro 28

Indução em número de vezes MxA Indução em número de vezes OAS Indução em número de vezes Pkr MetIL-29-PEG 36, 7 6, 9 2,2 MetIL-29C1725- PEG 46, 1 CO 2,8

Os dados mostrados são para 20 ng/ml de versões de metIL-29-PEG e metIL-29C172S-PEG da IL-29 após a cultura durante 24 horas.

Os dados mostrados são normalizados para HPRT e mostrados como indução em número de vezes sobre células não estimuladas.

Exemplo 33

Atividade antiviral da IL-28 e IL-29 em sistema replicão HCV A capacidade dos fármacos antivirais de inibirem a replicação de HCV pode ser testada in vitro com o sistema replicão HCV. O sistema replicão consiste na linha de 140 células do hepatoma humano Huh7 que foi transfetada com replicões de ARN subgenómicos que dirigem a replicação constitutiva de ARN genómico de HCV (Blight, K.J. et al. Science 290:1972-1974, 2000). O tratamento de clones de replicão com IFNa a 10 IU/ml reduz a quantidade de ARN de HCV em 85% comparado com as linhas de células controlo não tratadas. A capacidade de IL-28A e IL-29 de reduzirem a quantidade de ARN de HCV produzida pelos clones de replicão em 72 horas indica que o estado antiviral conferido às células Huh7 por tratamento com IL-28A/IL-29 é ineficaz na inibição da replicação do replicão de HCV, e, por isso, muito provavelmente eficaz na inibição da replicação da HCV. A capacidade de IL-28A e IL-29 de inibirem a replicação de HCV como determinada pelo kit de ADN de cadeia ramificada de Bayer, é para ser feita sob as seguintes condições 1. IL28 isolada a concentrações crescentes (6)* até 1,0 yg/ml 2. IL2 9 isolada a concentrações crescentes (6)* até 1,0 yg/ml 3. PERIL29 alone a concentrações crescentes (6) * até 1,0 pg/ml 4. IFNcx2A isolado a 0,3, 1,0, e 3,0 IU/ml 5. Ribavirina isolada. O controlo positivo é IFNa e o controlo negativo é ribavirina.

As células são coradas após 72 horas com azul de Alomar para avaliar a viabilidade. *As concentrações para as condições 1-3 são: 1,0 pg/ml, 0,32 yg/ml, 0,10 pg/ml, 0,032 yg/ml, 0,010 yg/ml, 0,0032 yg/ml. O clone replicão (BB7) é tratado IX por dia durante 3 dias consecutivos com as doses listadas anteriormente. O ARN total do HCV é medido após 72 horas. 141

Exemplo 34 IL-28 e IL-29 têm atividade antiviral contra vírus patogénicos São utilizados dois métodos para testar a atividade antiviral in vitro da IL-28 e IL-29 contra um painel de virus patogénicos incluindo, entre outros, adenovirus, virus da parainfluenza, virus sincicial respiratório, rinovirus, virus coxsackie, virus da influenza, virus vaccinia, virus de West Nile, virus do dengue, virus da encefalite equina Venezuelana, virus pichinde e virus da polio. Estes dois métodos são a inibição do efeito citopático induzido pelo virus (CPE) determinado pelo exame visual (microscópico) das células e aumento da captação do corante vermelho neutral (NR) nas células. No método de inibição CPE, sete concentrações do fármaco teste (diluições loglO, tais como 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 ng/ml) são avaliadas contra cada virus em microplacas de fundo raso com 96 poços contendo células hospedeiras. Os compostos são adicionados 24 horas antes do virus, que é utilizado numa concentração de aproximadamente 5 a 100 doses infeciosas de cultura de células por poço, dependendo do virus, o que equivale a uma multiplicidade de infeção (MOI) de 0,01 a 0,0001 partículas infeciosas por célula. Os testes são lidos após a incubação a 37°C durante um tempo especificado suficiente para permitir o desenvolvimento adequado do efeito citopático virai. No ensaio de captação do NR, o corante (0,34% concentração no meio) é adicionado ao mesmo conjunto de placas utilizadas para obter as classificações visuais. Após 2 h, a intensidade da cor do corante absorvido pelas, e subsequentemente eluido das, células é determinado utilizando um auto-leitor de microplaca. A atividade antiviral é expressa como a concentração 50% eficaz (inibidora do virus) (EC50) determinada desenhando um gráfico a concentração do composto versus a inibição percentual no papel de gráfico 142 semilogarítmico. Os dados EC50/IC50, em alguns casos, podem ser determinados por programa de análise de regressão apropriado. Em geral, as EC50s determinadas pelo ensaio NR são duas a quatro vezes superiores às obtidas pelo método CPE.

Quadro 29: Ensaio Visual

Virus Linha de células Fármaco EC50 Visual IC50 Visual SI Visual (IC50/ EC50) Adenovirus A54 9 IL-28A >10 mg/ml > 10 mg/ml 0 Adenovirus A54 9 IL-29 > 10 mg/ml > 10 mg/ml 0 Adenovirus A54 9 MetIL-2 9 C172S-PEG > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 virus da Parainfluenza MA-104 IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Virus da Parainfluenza MA-104 IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Virus da Parainfluenza MA-104 MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Virus sincicial respiratório MA-104 IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Virus sincicial respiratório MA-104 IL-29 >10 mg/ml > 10 mg/ml 0 Virus sincicial respiratório MA-104 MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 2 KB IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 2 KB IL-29 >10 mg/ml >10 mp/ml 0 Rino 2 KB MetIL-2 9 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 9 HeLa IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 9 HeLa IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 9 HeLa MetIL-2 9 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 143 Vírus Linha de células Fármaco EC5 0 Visual IC5 0 Visual SI Visual (IC5 0/ EC5 0) vírus Coxsackie B4 KB IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus Coxsackie B4 KB IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus Coxsackie B4 KB MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Rim canino Maden- Darby IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Rim canino Maden- Darby IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Rim canino Maden- Darby MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Vero IL-28A 0,1 mg/ml >10 mg/ml >100 Influenza (tipo A [H3N2]) Vero IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) vero MetIL-29 C172S-PEG 0,045 mg/ml >10 mg/ml >222 Vírus Vaccinia Vero IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Vírus Vaccinia Vero IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Vírus Vaccinia Vero MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Vírus do West Nile Vero IL-28A 0,00001 mg/ml >10 mg/ml >1,000,0 00 Vírus do West Nile Vero IL-29 0,000032 mg/ml > 10 mg/ml >300,000 Vírus do West Nile Vero MetIL-29 C172S-PEG 0,001 mg/ml >10 mg/ml > 10,000 Vírus do Dengue Vero IL-28A 0,01 mg/ml >10 mg/ml >1000 144 Vírus Linha de células Fármaco EC5 0 Visual IC5 0 Visual SI Visual (IC5 0/ EC5 0) Vírus do Dengue Vero IL-29 0,032 mg/ml > 10 mg/ml >312 Vírus do Dengue Vero MetIL-29 C172S-PEG 0,0075 mg/ml >10 mg/ml >1330 Vírus da encefalite equine Venezuelana Vero IL-28A 0,01 mg/ml >10 mg/ml >1000 Vírus da encefalite equine Venezuelana Vero IL-29 0,012 mg/ml >10 mg/ml >833 Vírus da encefalite equine Venezuelana Vero MetIL-29 C172S-PEG 0.0065 mg/ml >10 mg/ml >1538 vírus Pichinde BSC-1 IL-28A >10 mg/ml > 10 mg/ml 0 vírus Pichinde BSC-1 IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus Pichinde BSC-1 MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus d a Polio Vero IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus d a Polio Vero IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus d a Polio Vero MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0

Quadro 30: Ensaio do vermelho Neutral Vírus Linha de células Fármaco EC50 NR IC5 0 NR SI NR (IC50/EC50) Adenovírus A54 9 IL-28A > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 Adenovírus A54 9 IL-29 > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 Adenovírus A54 9 MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus da Parainfluenza MA-104 IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus da Parainfluenza MA-104 IL-29 > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 145 Vírus Linha de células Fármaco EC50 NR IC5 0 NR SI NR (IC50/EC50) vírus da Parainfluenza MA-104 MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Vírus sincicial respiratório MA-104 IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Vírus sincicial respiratório MA-104 IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Vírus sincicial respiratório MA-104 MetIL-29 C172S-PEG 5,47 mg/ml >10 mg/ml >2 Rino 2 KB IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 2 KB IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 2 KB MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Rino 9 HeLa IL-28A 1,726 mg/ml >10 mg/ml >6 Rino 9 HeLa IL-29 0, 982 mg/ml >10 mg/ml >10 Rino 9 HeLa MetIL-29 C172S-PEG 2,051 mg/ml >10 mg/ml >5 vírus Coxsackie B4 KB IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus Coxsackie B4 KB IL-29 > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus Coxsackie B4 KB MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Rim canino Maden- Darby IL-28A > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Rim canino Maden- Darby IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 Influenza (tipo A [H3N2]) Rim canino Maden- Darby MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 146

Influenza (tipo A [H3N2]) Vero IL-28A 0,25 mg/ml >10 mg/ml >40 Influenza (tipo A [H3N2]) Vero IL-29 2 mg/ml >10 mg/ml >5 Influenza (tipo A [H3N2]) Vero MetIL-29 C 172S-PEG 1,4 mg/ml >10 mg/ml >7 virus Vaccinia Vero IL-28A > 10 mg/ml >10 mg/ml 0 virus Vaccinia Vero IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 virus Vaccinia Vero MetIL-29 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 virus do West Nile Vero IL-28A 0,0001 mg/ml >10 mg/ml >100,000 virus do West Nile Vero IL-29 0,00025 mg/ml >10 mg/ml >40,000 virus do West Nile Vero MetIL-29 C172S-PEG 0,00037 mg/ml >10 mg/ml >27,000 virus do Dengue Vero IL-28A 0,1 mg/ml >10 mg/ml >100 virus do Dengue Vero IL-29 0,05 mg/ml >10 mg/ml >200 virus do Dengue Vero MetIL-29 C172S- PEC3 0,06 mg/ml >10 mg/ml >166 Virus da encefalite equine Venezuelana Vero IL-28A 0,035 mg/ml >10 mg/ml >286 Virus da encefalite equine Venezuelana Vero IL-29 0,05 mg/ml >10 mg/ml >200 Virus da encefalite equine Venezuelana Vero MetIL-29 C172S-PEG 0,02 mg/ml >10 mg/ml >500 virus Pichinde BSC-1 IL-28A >10 mg/ml >10 mg/ml 0 virus Pichinde BSC-1 IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 147 vírus Pichinde BSC-1 MetIL-2 9 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus da Polio Vero IL-28A > 1,672 mg/ml >10 mg/ml >6 vírus da Polio Vero IL-29 >10 mg/ml >10 mg/ml 0 vírus da Polio Vero MetIL-2 9 C172S-PEG >10 mg/ml >10 mg/ml 0

Exemplo 35 IL-28, IL-29, metIL-29-PEG e metIL-29C172S-PEG estimulam a indução de ISG na linha de células de Fígado de ratinho AML-12

Os genes estimulados pelo Interferão (ISGs) são genes que são induzidos por interferões de tipo I (IFNs) e também pelas moléculas da família da IL-28 e IL-29, o que sugere que o IFN e IL-28 e IL-29 induzem vias semelhantes que conduzem à atividade antiviral. Os IFNs humanos de tipo I (IFNoíI-4 e ΙΕΝβ) têm pouca ou nenhuma atividade em células de ratinho, o que se pensa ser causado pela falta de reatividade cruzada entre espécies. Para testar se a IL-28 e IL-29 humanas têm efeitos nas células de ratinho, a indução de ISG por IL-28 e IL-29 humanas foi avaliada por PCR em tempo real na linha de células derivada do fígado de ratinho AML-12.

As células AML-12 foram colocadas em placas com 6 poços em meio completo DMEM a uma concentração de 2 x 106 células/poço. Vinte e quatro horas depois de colocar as células em placas, foram adicionadas as IL-28 e IL-29 humanas à cultura a uma concentração de 20 ng/ml. Como controlo, as células foram ou estimuladas com IFND de ratinho (controlo positivo) ou não estimuladas (negativo). As células foram colhidas às 8, 24, 48 e 72 horas após a adição de IL-28A humana derivada de CHO (SEQ. ID N.° 2) ou IL-29 (SEQ. ID N.° 4). O ARN foi isolado a partir das peletes de células utilizando o kit RNAEasy-kit® (Qiagen, Valência, CA) . O ARN foi tratado com ADNase (Millipore, 148

Billerica, ΜΔ) para limpar ao ARB de qualquer ADN contaminante. O ADNc foi gerado utilizando o kit Perkin-Elmer RT. A indução do gene ISG foi avaliada por PCR em tempo real utilizando iniciadores e sondas específicos para OAS, Pkr e Mxl de ratinho. Para obter dados quantitativos, PCR HPRT em tempo real foi feita em duplex com PCR ISG. Foi obtida uma curva padrão utilizando as quantidades conhecidas de ARN das PBLs de ratinho estimuladas pelo IFN. Todos os dados são mostrados como expressão relativa à expressão de HPRT interna.

As IL-28A e IL-29 humanas estimularam a indução de ISG na linha de células dos hepatócitos de ratinho AML-12 e demonstraram que, ao contrário dos IFNs d tipo I, as proteínas da família IL-28/29 mostraram reatividade entre espécies.

Quadro 31

Estimulação OAS PkR Mxl Nenhuma 0,001 0,001 0,001 IL-28 Humana 0,04 0,02 \£> O O IL-29 Humana 0,04 0,02 0,07 IL-28 de ratinho 0,04 0,02 0,08 IFNa de ratinho 0,02 0,02 \—1 o o

Todos os dados mostrados são expressos como número de vezes relative à expressão de gene HPRT ng de OAS ARNm = valor normalizado da quantidade de ARNm de OAS relativa aos ng internos de ARNm de HPRT de gene organizado, HPRT A título de exemplo, os dados para o ponto de tempo das 48 horas são mostrados. 149

Quadro 32 AML12's Indução em número de vezes Mxl Indução em número de vezes OAS Indução em número de vezes Pkr MetIL-29-PEG 728 614 8 MetIL-29C172S-PEG 761 657 8

As células foram estimuladas com 20 ng/ml metIL-29-PEG ou metIL-29C172S-PEG durante 24 horas.

Os dados mostrados são normalizados para HPRT e mostrados como indução em número de vezes sobre células não estimuladas.

Exemplo 36 ISGs são induzidas eficazmente em baços de ratinhos transgénicos que expressam a IL-29 humana

Foram gerados ratinhos transgénicos (Tg) que expressam a IL-29 humana sob o controlo do promotor Eu-lck. Para estudar se a IL-29 humana tem atividade biológica in vivo em ratinhos, a expressão de ISGs foi analisada por PCR em tempo real nos baços de ratinhos transgénicos IL-29 Eu-lck.

Os ratinhos transgénicos (C3H/C57BL/6) foram gerados utilizando uma construção que expressa o gene da IL-29 humana sob o controlo do promotor Eu-lck. Este promotor está ativo nas células T e células B. Os ratinhos transgénicos e os seus companheiros de ninhada não transgénicos (n=2/gp) foram sacrificados às cerca de 10 semanas de idade. Os baços dos ratinhos foram isolados. O ARN doi isolado das peletes de células utilizando o kit RNAEasy-kit® (Qiagen) . O ARN foi tratado com ADNase para limpar o ARN de qualquer ADN contaminante. O ADNc foi gerado utilizando uma mistura Perkin-Elmer RT®. A indução do gene ISG foi avaliada por PCR em tempo real utilizando iniciadores e sondas (5' FAM, 3' NFQ) especificas para OAS, Pkr e Mxl de ratinho. Para obter dados quantitativos, a PCR HPRT em tempo real foi realizada em duplex com a PCR ISG. 150

Além disso, foi obtida uma curva padrão utilizando quantidades conhecidas de PBLs de ratinho estimuladas por IFN. Todos os dados são mostrados como expressão relativa à expressão de HPRT interna.

Os baços isolados a partir de ratinhos IL-29 Tg mostraram alta indução de OAS, Pkr e Mxl de ISGs comparada com os seus controlos companheiros de ninhada não Tg, o que sugere que a IL-29 humana está biologicamente ativa in vivo em ratinhos.

Quadro 33

Ratinhos OAS PkR Mxl Não Tg 4,5 4,5 3,5 IL-29 Tg 12 8 21

Todos os dados mostrados são expressão em número de vezes relativa à expressão do gene HPRT. É mostrada a expressão média em dois ratinhos.

Exemplo 37

Proteínas da IL-28 e IL-29 Humana induzem a Expressão do gene ISG no Fígado, baço e sangue de ratinhos

Para determinar se as IL-28 e IL-29 humanas induzem genes estimulados por interferão in vivo, foram injetadas proteínas da IL-28A e IL-29 humanas derivadas da CHO em ratinhos. Além disso, IL-29 derivada de E. coli foi também testada em ensaios in vivo, conforme descrito anteriormente, utilizando MetIL-29C172S-PEG e MetIL-29-PEG. Em vários pontos de tempo e a diferentes doses, aindução do gene ISG foi medida no sangue, baço e fígados dos ratinhos.

Ratinhos C57BL/6 foram injetados por i.p ou i.v comum intervalo de doses (10 yg - 250 yg) de IL-28A e IL-29 humanas derivadas da CHO ou MetIL-29C172S-PEG e MetlL-29C16-C113-PEG. Os ratinhos foram sacrificados em vários pontos de tempo (lhr - 48hr) . Os baços e os fígados foram isolados dos ratinhos, e o ARN foi isolado. 0 ARN também foi isolado das células sanguíneas. As células foram 151 tornadas em peletes e o ARN isolado das peletes utilizando o kit RNAEasy®-kit (Qiagen) . 0 ARN foi tratado com ADNase (Amicon) para livrar o ARN de qualquer ADN contaminante. 0 ADNc foi gerado utilizando a mistura Perkin-Elmer RT (Perkin-Elmer). A indução do gene ISG foi medida por PCR em tempo real utilizando iniciadores e sondas especificas para OAS, Pkr e Mxl de ratinho. Para obter dados quantitativos, A PCR HPRT em tempo real foi realizada em duplex com a PCR ISG. Foi calculada uma curva padrão com quantidades conhecidas de PBS de ratinho estimulada por IFN. Todos os dados são mostrados como expressão relativa à expressão de HPRT interna. A IL-29 humana induziu a expressão do gene ISG (OAS, Pkr, Mxl) nos figados, baços e sangues de ratinhos de uma maneira dependente da dose. A expressão de ISGs exibiu um pico entre as 1-6 horas após a injeção e mostrou expressão prolongada sobre os ratinhos controlo até 48 horas. Nesta experiência, a IL-28A humana não induziu a expressão de gene ISG.

Quadro 34

Inj eção OAS-lhr OAS-6hr OAS-24hr OAS-4 8hr nenhuma - figado 1, 6 1, 6 1,6 1, 6 IL-29 figado 2,5 4 2,5 2,8 nenhuma - baço 00 \—1 1,8 00 \—1 1,8 IL-29 - baço 4 6 3,2 3,2 nenhuma - sangue 5 5 5 5 IL-29 sangue 12 18 11 10

Os resultados mostrados são a expressão em número de vezes relativa à expressão de gene HPRT. É mostrado um conjunto de dados de amostra para OAS induzido pela IL-29 no figado com uma única injeção de 250 yg i.v.. Os dados mostrados são a expressão média de 5 animais/ grupo diferentes. 152

Quadro 35

Inj eção OAS (24hr) Nenhuma 1,8 IL-29 10 yg 3,7 IL-29 50 yg CM IL-29 250 yg 6

Quadro 36

MetIL-2 9-PEG MetIL-29C172S-PEG Ingénuos 3hr 6hr 12hr 24hr 3hr 6hr 12hr 24hr 24hr PKR 18,24 13, 93 4, 99 3, 77 5,29 5, 65 3,79 3, 55 3,70 OAS 91,29 65, 93 54,04 20,81 13, 42 13, 02 10,54 8,72 6, 60 Mxl 537,51 124,99 33, 58 35, 82 27,89 29, 34 16, 61 0,00 10, 98

Os ratinhos foram injetados com 100 yg de proteínas i.v. Os dados mostrados são a expressão em número de vezes sobre a expressão de HPRT a partir dos fígados de ratinhos. Dados semelhantes foram obtidos do sangue e baços dos ratinhos.

Exemplo 38 IL-28 e IL-29 induzem a Proteína ISG em ratinhos

Para analisar o efeito das IL-28 e IL-29 humanas na indução da proteína ISG (OAS), foram testados o soro e plasma de ratinhos tratados com IL-28 e IL-29 para atividade da OAS.

Ratinhos C57BL/6 foram injetados i.v com PBS ou um intervalo de concentrações (10 yg-250 yg) de IL-28 ou IL-29 humana. 0 soro e plasma foram isolados de ratinhos em vários pontos de tempo, e a atividade da OAS foi medida utilizando o kit de radioimunoensaio OAS (RIA) da Eiken Chemicals (Tokyo, Japan). IL-28 e IL-29 induziram a atividade OAS no soro e plasma de ratinhos, o que mostra que estas proteínas estão 153 biologicamente ativas in vivo.

Quadro 37

Injeção OAS-lhr OAS-6hr OAS-24hr OAS-48hr Nenhuma 80 80 80 80 IL-29 80 80 180 200 A atividade da OAS é mostrada a pmol/dL de plasma para uma única concentração (250 yg) da IL-29 humana.

Exemplo 39 IL-28 e IL-29 inibem a patologia adenoviral em ratinhos

Para testar as atividades antivirais da IL-28 e IL-29 contra virus que infetam o figado, as amostras teste foram testadas em ratinhos contra vetores adenovirais infeciosos que expressam um gene da proteína fluorescente verde interna (GFP). Quando injetados por via intravenosa, estes vírus têm como alvo primário o fígado para a expressão de genes. Os adenovirus são deficientes na replicação, mas provocam danos ao fígado devido ao infiltrado de células inflamatórias que pode ser monitorizado por medição dos níveis no soro das enzimas do fígado como AST e ALT, ou por exame direto da patologia do fígado.

Ratinhos C57B1/6 foram dados uma vez diariamente injeções intraperitoneais de 50 yg de IL-28 de ratinho (zcyto24, conforme mostrado na SEQ. ID N.° 8) ou metlL- 29C172S- PEG durante 3 dias. Os animais controlo foram injetados com PBS. Uma hora depois da 3* dose, os ratinhos foram dados uma única injeção bólus intravenosa na veia da cauda de vector adenoviral, AdGFP (1 X 109 unidades formadoras de placa (pfu) ) . Depois disto, dia sim dia não, os ratinhos eram dados uma dose adicional de PBS, IL-28 de ratinho ou metIL-29C172S-PEG por mais 4 doses (total de 7 doses) . Ma hora após a dose final de PBS, IL-28 de ratinho ou metIL-29C172S-PEG os ratinhos foram terminalmente sangrados e sacrificados. O soro e tecido do fígado foram 154 analisados. 0 soro foi analisado pelas enzimas AST e ALT do figado. 0 figado foi isolado e analisado para a expressão de GFP e histologia. Para a histologia, os espécimes de figado foram fixados em formalina e depois embebidos em parafina seguido de coloração H&E. As secções do figado que tinham sido ofuscadas para tratar foram examinadas com um microscópio ótico. As alterações foram notadas e classificadas numa escala desenada para medir a patologia e inflamação do figado. IL-28 e IL-29 de ratinho inibiram a infeção adenoviral e a expressão de gene conforme medido pela fluorescência do figado. Ratinhos tratados com PBS (n=8) tinham uma fluorescência do figado média relativa de 52,4 (unidades arbitrárias). Por oposição, os ratinhos tratados com IL-28 (n=8) tinham uma fluorescência do figado relativa de 34,5, e os ratinhos tratados com IL-29 (n=8) tinham uma fluorescência do figado relativa de 38,9. Uma redução da infeção adenoviral e na expressão de gene conduziu a uma patologia do figado reduzida conforme medido pelos niveis de ALT e AST no soro e histologia. Os ratinhos tratados com PBS (n=8) tinham um nivel de AST no soro médio de 234 U/L (unidades/litro) e nivel de ALT no soro de 250 U/L. Por oposição, os ratinhos tratados com IL-28 (n=8) tinham um nivel de AST no soro médio de 193 U/L e um nivel de ALT no soro de 216 U/L, e os ratinhos tratados com IL-29 (n=8) tinham um nivel de AST no soro médio de 162 U/L e um nivel de ALT de 184 U/L. Além disso, a histologia do figado indicava que os ratinhos dados quer IL-28 de ratinho ou IL-29 tinham classificações de figado e inflamação mais baixas do que o grupo tratado com PBS. Os fígados do grupo IL-2 9 também exibiram menos proliferação de células sinusoidais, menos figuras mitóticas e menos alterações nos hepatócitos (por exemplo vacuolação, presença de núcleos mútliplos, aumento dos hepatócitos) do que no grupo de tratamento com PBS. Estes dados demonstram que as IL-28 e IL-29 de ratinho 155

têm propriedades antivirais contra um vírus fígado-trófico. Exemplo 40 Modelos LCMV

As infeções por vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) em ratinhos são um excelente modelo de infeção aguda e crónica. Estes modelos são utilizados para avaliar o efeito das citocinas na resposta imune antiviral e os efeitos que a IL-28 e IL-29 têm na carga virai e na resposta imune antiviral. Os dois modelos utilizados são: infeção por LCMV Armstrong (aguda) e infeção por LCMV Clone 13 (crónica) . (Ver, por exemplo, Wherry et al., J. Virol. 77:4911-4927, 2003; Blattman et al., Nature Med. 9(5):540-547, 2003; Hoffman et al., J. Immunol. 170:1339-1353, 2003.) Existem três estádios do desenvolvimento da célula T CD8 em resposta ao vírus: 1) expansão, 2) contração, e 3) memória (modelo agudo). IL-28 ou IL-29 é injetada durante cada etapa para ambos modelos agudo e crónico. No modelo crónico, IL-28 ou IL-29 é injetada 60 dias após a infeção para avaliar o efeito de IL-28 ou IL-29 na carga virai persistente. Para ambos modelos agudo e crónico, IL-28 ou IL-29 é injetada, e a carga virai no sangue, baço e fígado é examinada. Outro parâmetro que pode ser examinado inclui: coloração de tetrâmero por fluxo para contar o número de células CD8+ T específicas de LCMV; a capacidade de células tetrâmerof para produzirem citocinas quando estimuladas com o seu antígeno LCMV cognato; e a capacidade das células CD8+ T específicas de LCMV de proliferarem em resposta ao seu antígeno LCMV cognato. Células T específicas de LCMV são fenotipadas por citometria de fluxo para avaliar o estado de ativação e diferenciação das células. Além disso, a capacidade de CTL específicas de LCMV de lisarem células alvo que transportam o seu antígeno LCMV cognato é examinada. O número e função de células CD4+ T específicas de LCMV são também avaliados.

Uma redução na carga virai após tratamento com IL-28 156 ou IL-29 é determinada. Uma redução de 50% na carga virai em qualquer orgão, especialmente fígado, seria significativa. Para os ratinhos tratados com IL-28 ou IL-29, um aumento de 20% na percentagem de células T tetrâmero positivas que proliferam, produzem citocina, ou exibem um fenótipo maduro em relação aos ratinhos não tratados também seria considerado significativo. A injeção de IL-28 ou IL-29 conduzindo a uma redução na carga virai é devida a um controlo mais eficaz da infeção virai, especialmente no modelo crónico onde quando não tratado, os títulos virais mantêm-se elevados por um período de tempo extenso. Uma redução de duas vezes o título virai em relação aos ratinhos não tratados é considerada significativa.

Exemplo 41

Modelo de Influenza de infeção Virai aguda A. Experiência Preliminar para testar a atividade antiviral Para determiner a atividade antiviral da IL-28 ou IL-29 na infeção aguda pelo vírus Influenza, é realizado um estudo in vivo utilizando ratinhos c57Bl/6 infetados com influenza utilizando o seguinte protocolo:

Animais: ratinhos fêmea BALB/c com 6 semanas de idades (Charles River) com 148 ratinhos, 30 por grupo. Grupos: (1) controlo absoluto (não infetados) para correr em paralelo pelo título de anticorpo e histopatologia (2 animais por grupo) (2) veículo (i.p.) solução salina (3) Amantadina (controlo positivo) 10 mg/dia durante 5 dias (por os) a começar 2 horas antes da infeção (4) tratados com IL-28 ou IL-29 (5 yg, i.p. a começar 2 horas após a infeção) (5) IL-28 infeção) ou IL-29 (25 yg/ i.p. a começar 2 horas após (6) IL-28 infeção) ou IL-29 (125 yg# i.p. a começar 2 horas após 157

Dia Ο - exceto para os controlos absolutos, todos os animais infetados com vírus da Influenza Para carga virai (10 a LD50)

Para exercício de imunologia (LD30)

Dia 0 - 9 - injeções diárias de IL-28 ou IL-29 (i.p.)

Peso corporal e aspeto geral registado (3 vezes/semana)

Dia 3 - sacrifício de 8 animais por grupo Carga Virai no pulmão direito (TCID50)

Histopatologia no pulmão esquerdo

Amostra de sangue para titulação de anticorpo

Dia 10 - sacrifício de todos os animais sobreviventes recolher amostras de sangue para titulação de anticorpo,

isolar linfócitos do pulmão (4 grupos de 3) para ensaio CTL direto (em todos os 5 grupos), e imunofenotipagem quantitativa pra os seguintes marcadores: CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD8/CDllb, CD8/CD44/CD62L, CD3/DX5, GR-1/F480, e CD19.

Estudo N. ° 2 O estudo de eficácia da IL-28 ou IL-29 em ratinhos C57B1/6 infetados com vírus adaptado a ratinho é feito utilizando ratinhos fêmea C57B1/6 com 8 semanas de idade (Charles River). Grupo 1: Veículo (i.p.)

Grupo 2: Controlo positivo: anticorpo neutralizador anti-influenza (A/USSR anti-influenza de cabra (H1N1) (Chemicon International, Temecula, CA) ; 40 yg/ratinho às 2 h e 4 h após a infeção (10 μΐ intranasal) Grupo 3: IL-28 ou IL-29 (5 yg, i.p.) Grupo 4: IL-28 ou IL-29 (25 yg, i.p.) Grupo 5: IL-28 ou IL-29 (125 yg, i.p.) São preparadas observações de vida seguintes e exercícios imunológicos:

Dia 0 - todos os animais infetados com o vírus da Influenza (dose determinada na experiência 2)

Dias 0 - 9 - injeções diárias de IL-28 ou IL-29 (i.p.)

Peso corporal e aspeto geral registado dia sim dia não Dia 10 - sacrifício dos animais sobreviventes e realização de ensaio virai para determinar a carga virai no pulmão. 158 0 isolamento de linfócitos no pulmão (para ensaio CTL direto nos pulmões utilizando EL-4 como alvos e diferentes razões E:T (com base nos melhores resultados das experiências 1 e 2).

Coloração do tetrâmero: 0 número de tetrâmeros de classe I do MHC de ligação às células CD8+ T que contêm o da epitopo nucleoproteína da influenza A (NP) é avaliado utilizando complexos de classe I do MHC com péptidos virais: FLU-NP366-374/Db (ASNEN-METM) , (LMCV péptido/Db) .

Imunofenotipagem quantitativa dos seguintes: CD8, tetrâmero, IFNy intracelular, NK1.1, CD8, tetrâmero, CD62L, CD44, CD3 (+ ou -), NK1.1 ( + ) , IFNy intracelular, CD4, CD8, NK1.1, DX5, CD3 (+ ou -), NK1.1, DX5, tetrâmero, amostras de cor únicas para ajuste do citómetro.

Estudo de Sobrevivência/Re-desafio

Dia 30: estudo de sobrevivência com ratinhos são tratados durante 9 dias com diferentes doses de IL-28 ou IL-29 ou com controlo anticorpo anti-influenza positivo. O peso corporal e produção de anticorpo são medidos em amostras de soro individuais (Total, IgGl, IgG2a, IgG2b). Estudo de Re-desafio:

Dia 0: ambos os grupos serão infetados com virus A/PR (1LD30) .

Grupo 6 não será tratado.

Grupo 7 será tratado durante 9 dias com 125 yg de IL- 28 ou IL-29.

Dia 30: estudo de sobrevivência O peso corporal e produção de anticorpo são medidos em amostras de soro individuais (Total, IgGl, IgG2a, IgG2b).

Dia 60: estudo de re-desafio

Os sobreviventes em cada grupo serão divididos em 2 subgrupos

Grupo 6A e 7A serão re-desafiados com vírus A/PR (1 LD30)

Grupo 6B e 7B serão re-desaf iados com vírus A/PR (1 159 LD30).

Ambos os grupos serão seguidos e o dia de sacrifício será determinado. 0 peso corporal e produção de anticorpo são medidos em amostras de soro individuais (Total, IgGl, IgG2a, IgG2b) .

Exemplo 42 IL-28 e IL-29 têm atividade antiviral contra o vírus da Hepatite B (HBV) in vivo

Um modelo de ratinho transgénico (Guidotti et al., J. Virology 69:6158-6169, 1995) suporta a replicação de níveis elebados de HBV infecioso e tem sido utilizado como um modelo quimioterapêutico para a infeção por HBV. Os ratinhos transgénicos são tratados com fármacos antivirais e os níveis de ADN e ARN de HBV são medidos no fígado e soro do ratinho transgénico após o tratamento. Os níveis da proteína HBV também podem ser medidos no soro do ratinho transgénico após o tratamento. Este modelo tem sido utilizado para avaliar a eficácia da lamivudina e IFN-α na redução de títulos virais de HBV.

Ratinhos TG HBV (machos) são dados injeções intraperitoneais de 2,5, 25 ou 250 microgramas de IL-28 or IL-29 dia sim dia não durante 14 dias (total de 8 doses). S ratinhos foram sangrados para recolha do soro no dia do tratamento (dia 0) e no dia 7. Uma hora depois da dose final de IL-29 os ratinhos são sujeitos a sangramento terminal e são sacrificados. O soro e fígado são analisados para ADN de HBV no fígado, ARN de HBV no fígado, ADN de HBV no soro, HBc fígado, Hbe no soro e HBs no soro. A redução de ADN de HBV no fígado, ARN de HBV no fígado, ADN de HBV no soro, HBc fígado, Hbe no soro ou HBs no soro em resposta a IL-28 ou IL-29 reflete a atividade antiviral destes compostos contra a HBV.

Exemplo 43 IL-28 e IL-29 inibem a replicação do herpesvírus-8 humano (HHV-8) em células BCBL-1 160

As atividades antivirais da IL-28 e IL-29 foram testadas contra HHV-8 num sistema de infeção in vitro utlizando uma linha de células de linfoide B, BCBL-1.

No ensaio HHV-8, um composto teste e um controlo ganciclovir foram testados a cinco concentrações cada, diluídos numa série de meio-log. Os pontos terminais foram PCR TaqMan para ADN de HHV-8 extracelular (IC50) e números de células utilizando o reagente CellTiter96® (TC50; Promega, Madison, WI) . Resumidamente, as células BCBL-1 foram colocadas em placas de microtitulação com 96 poços. Após 16-24 horas as células foram lavadas e o meio doi sbstituído com meio completo contendo várias concentrações do composto teste em triplicado. Ganciclovir foi o controlo positivo, enquanto o meio isolado foi um controlo negativo (controlo do vírus, VC). Três dias depois o meio de cultura foi substituído com meio fresco contendo o composto teste adequadamente diluído. Seis dias depois da administração inicial do composto teste, o sobrenadante da cultura de células foi colhido, tratado com pronase e ADNase e depois utilizado num ensaio de PCR TaqMan em tempo real quantitativa. O ADN de HHV-8 amplificado pela PCR foi detetado em tempo real monitorizando os aumentos nos sinais de fluorescência que resultam da degradação exonucleolítica de uma molécula sonda fluorescente extinta que hibridiza com o ADN de HHV-8 amplificado. Por cada amplificação por PCR, foi gerada simultâneamente uma curva padrão utilizando diluições de ADN de HHV-8 purificado. A atividade antiviral foi calculada a partir da redução nos níveis de ADN de HHV-8 (IC50). Um ensaio de captação de corante novo foi depois empregue para medir a viabilidade das células que foi utilizada para calcular a toxicidade (TC50) · O índice terapêutico (TT) é calculado como TC50/IC50. IL-28 e IL-29 inibem a replicação virai de HHV-8 em células BCBL-1. IL-28A tinha um IC50 de 1 pg/ml e um TC50 de >10 yg/ml (TI >10) . IL-29 tinh um IC50 de 6,5 yg/ml e um 161 TC50 de >10 μg/ml (TI >1,85). MetIL-29C172S-PEG tinha um IC5o de 0,14 yg/ml e um TC50 de >10 yg/ml (TI >100) .

Exemplo 44

Atividade antiviral da IL-28 e IL-29 conta o vírus de Epstein Barr (EBV)

As atividades antiviras da IL-28 e IL-29 são testadas contra o EBV num sistema de infeção in vitro numa linha de células linfoide B, P3HR-1. No ensaio EBV um composto teste e um controlo são testados a cinco concentrações cada, diluídos numa série de meio-log. Os pontos terminais são PCR TaqMan para ADN do EBV extracelular (IC50) e números de células utilizando o reagente CellTiter96® (TC50; Promega). Resumidamente, as células P3HR-1 são colocadas em placas de microtitulação com 96 poços. Após 16-24 horas as células são lavadas e o meio é substituído com meio completo contendo várias concentrações do composto teste em triplicado. Além de um controlo positivo, o meio isolado é adicionado as células como um controlo negativo (controlo do vírus, VC). Três dias depois o meio de cultura é substituído com meio fresco contendo o composto teste adequadamente diluído. Seis dias depois da administração inicial do composto teste, o sobrenadante a cultura de células é recolhido, tratado com pronase e ADNse e depois utilizado num ensaio de PCR TaqMan em tempo real quantitativo. O ADN de EBV amplificado por PCR é detetado em tempo real monitorizando os aumentos nos sinais de fluorescência que resultam da degradação exonucleolítica de uma molécula sonda fluorescente extinta que hibridiza com o ADN do EBV amplificado. Por cada amplificação por PCR, foi simultâneamente gerada uma curva padrão utilizando diluições do ADN de EBV purificado. A atividade antiviral é calculada a partir da redução nos níveis de ADN do EBV (IC50) . Um ensaio de captação de corante novo foi depois empregue para medir a viabilidade das células que foi utilizada para calcular a toxicidade (TC50) . O índice 162 terapêutico (TT) é calculado como TC50/IC50.

Exemplo 45

Atividade antiviral da IL-28 e IL-29 contra o vírus do Herpes Simples-2 (HSV-2)

As atividades antiviras da IL-28 e IL-29 foram testadas contra HSV-2 num sistema de infeção in vitro em células Vero. Os efeitos antivirais da IL-28 e IL-29 foram avaliados em ensaios de inibição do efeito citopático (CPE). 0 ensaio envolve a morte das células Vero pelo vírus HSV-2 citopático e a inibição da morte celular pela IL-28 e IL-29. As células Vero são propagandas no meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM) contend vermelho de fenol com 10% de soro de cavalo, 1% glutamina e 1% penicilina-estreptamicina, enquanto os ensaios de inibição CPE são realizados em DMEM sem vermelho de fenol com 2% FBS, 1% glutamina e 1% Pen-Strep. No dia anterior aos ensaios, as células foram tripsinaizadas (1% tripsina-EDTA), lavadas, contadas e colocadas a 104 células/poço em placas BioCoat® de fundo raso com 96 poços (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) num volume de 100 μΐ/poço. Na manhã seguinte, o meio foi removido e uma aliquota pré-titulada de vírus foi adicionada às células. A quantidade de vírus utilizada é a diluição máxima que produziria a morte celular completa (>80%) no momento de desenvolvimento CPE máximo. A viabilidade das células é determinada utilizando um reagente CellTiter 96® (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante, utilizando um leitor de placa Vmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Os compostos são testados a seis concentrações cada, diluídos em meio de ensaio numa série de meio-log. Foi utilizado aciclovir como um controlo positivo. Os compostos foram adicionados no momento da infeção virai. Os dados médios corrigidos pela cor do fundo e do fármaco para a redução de CPE percentual e a viabilidade das células percentual a cada concentração são determinadas em relação aos controlos e a IC50 163 calculada em relação à TC50. IL-28A, IL-29 e MetIL-29C172S-PEG não inibiram a morte celular (IC50 de >10ug/ml) este ensaio. Também não houve atividade antiviral do IFNy no ensaio.

LISTA DAS SEQUÊNCIAS <110> ZymoGenetics, L.L.C. e Bristol-Myers Squibb Company <120> PREPARAÇÕES HOMOGÉNEAS DE IL-28 E IL-29 <130> <140> EP 0815028 7.4 <141> 200 4-08-09 <150> US 60/493 194 <151> 200 3-08-07 <150> US 60/551 841 <151> 200 4-03-10 <150> US 60/559 142 <151> 200 4-04-02 <160> 161 <170> FastSEQ para Windows

<210> 1 <211> 734 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> 164 <221> sig péptido <222> (53) ... (127) <221> mat péptido <222> (128 ) ... (655) <221> CDS <222> (53) ...(655) <400> 1 tgggtgacag cctcagagtg tttcttctgc tgacaaagac cagagatcag ga atg aaa 58

Met Lys -25 cta gac atg act ggg gac tgc acg cca gtg ctg gtg ctg atg gcc gca 106 Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Vai Leu Vai Leu Met Ala Ala -20 -15 -10 gtg ctg acc gtg act gga gca gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct 154 Vai Leu Thr Vai Thr Gly Ala vai Pro Vai Ala Arg Leu His Gly Ala -5 1 5 ctc ccg gat gca agg ggc tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct 202 Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser 10 15 20 25 cca cag gag ctg cag gcc ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag 250 165

Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu 30 35 40 tcg ctt ctg ctg aag gac tgc agg tgc cac tcc ege ctc ttc ccc agg 298 Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg 45 50 55 acc tgg gac ctg agg cag ctg cag gtg agg gag ege ccc atg gct ttg 346 Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu 60 65 70 gag gct gag ctg gee ctg acg ctg aag gtt ctg gag gee acc gct gac 394 Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp 75 80 85 act gac cca gee ctg gtg gac gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg 442 Thr Asp Pro Ala Leu Vai Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu 90 95 100 105 cac cat ate ctc tcc cag ttc cgg gee tgt ate cag cct cag CCC acg 490 His Hi3 rie Leu Ser Gin Phe Arg Ala Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr 110 115 120 gca ggg ccc agg acc cgg ggc ege ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc 538 Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu 125 130 135 cag gag gee cca aaa aag gag tcc cct ggc tgc ctc gag gee tet gtc 586 Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai 140 145 150 acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gee 634 Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala 155 160 165 agt ggg gac ctg tgt gtc tga ccctcccacc agtcatgcaa cctgagattt 685 Ser Gly Asp Leu Cys Vai 4e 170 175 tatttataaa ttagccactt gtcttaattt attgccaccc agtcgctat 734 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SINAL <222> (1) ... (25) <400> 2 166

Met Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Thr Pro Val Leu val Leu Met -25 -20 -15 -10 Ala Ala Vai Leu Thr Vai Thr Gly Ala Val Pro val Ala Arg Leu His -5 1 5 Gly Ala Leu Pro ASp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser 10 15 20 Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu 25 30 35 Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe 40 45 50 55 Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu Gin val Arg Glu Arg Pro Met 60 65 70 Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys val Leu Glu Ala Thr 75 80 85 Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu val Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu HiS 90 95 100 Thr Leu His His He Leu Ser Gin Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin 105 110 115 Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr 120 125 130 135 Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala 140 145 150 Ser vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys 155 160 165 vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 170 175 <210> 3 <211> 856 <212> ADN <213> Home i sapiens <22 0> <221> sig péptido <222> (98) ...(154) <221> mat péptido <222> (155 ) ... (700) <221> CDS <222> (98) ... (700) <4Ο0> 3 167 aattaccttt tcactttaca cacatcatct tggattgccc attttgcgtg gctaaaaagc 60 agagccatgc cgctggggaa gcagttgcga tttagcc atg gct gca gct tgg acc 115

Met Ala Ala Ala Trp Thr -15 gtg gtg ctg gtg act ttg gtg cta ggc ttg gcc gtg gca ggc cct gtc 163 Vai Vai Leu Vai Thr Leu val Leu Gly Leu Ala Val Ala Gly Pro Val -10 -5 1 ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg 211 Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg 5 10 15 ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gcc agg 259 Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg 20 25 30 35 gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age tct 307 Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser 168 40 45 50 cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag 355 Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val Arg Glu 55 60 65 cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg 403 Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu 70 75 80 gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt 451 01 u Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu 85 90 95 cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc tgt ate cag cct 499 His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro 100 105 110 115 cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc cgc ctc cac cac tgg ctg 547 Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu 120 125 130 cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag 595 His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu 135 140 145 gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctc aaa 643 Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys 150 155 160 tat gtg gcc gat ggg aac ctg tgt ctg aga acg tea acc cac cct gag 691 Tyr vai Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu 165 170 175 tcc acc tga caccccacac cttatttatg cgctgagccc tactccttcc 740

Ser Thr * 180 ttaatttatt tcctctcacc ctttatttat gaagctgcag ccctgactga gacatagggc 800 tgagtttatt gttttacttt tatacattat gcacaaataa acaacaagga attgga 856 <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> SINAL <222> (D . . . (19) <400> 4 169

Met Ala Ala Ala Trp -15 Thr Vai val Leu Val -10 Thr Leu Val Leu Gly -5 Leu Ala Vai Ala Gly 1 Pro Vai Pro Thr 5 Ser Lys Pro Thr Thr 10 Thr Gly Lys Gly Cys 15 His Ile Gly Arg Phe 20 Lys Ser Leu Ser Pro 25 Gin Glu Leu Ala

Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys 30 35 40 45 Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg 50 55 60 Leu Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala 65 70 75 Leu Thr Leu Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp 80 85 90 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu 95 100 105 Gin Ala Cys rie Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly 110 115 120 125 Arg Leu His HÍS Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg 160 165 170 Thr Ser Thr HiS Pro Glu Ser Thr 175 180 <210> 5 <211> 734 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> sig péptido <222> (53) ... (127) <221> mat péptido <222> (12 £ 3) ... (655 <221> CDS <222> (53) ...(655) <400> 5 170 tgggtgacag cctcagagtg tttcttctgc tgacaaagac cagagatcag ga atg aaa 58

Met Lys -25 cta gac atg acc ggg gac tgc atg cca gtg ctg gtg ctg atg gee gea 106 Leu Asp Met Thr Gly Asp Cys Met Pro vai Leu vai Leu Met Ala Ala -20 -15 -10 gtg ctg acc gtg act gga gea gtt cct gtc gee agg ctc ege ggg gct 154 Vai Leu Thr Vai Thr Gly Ala vai Pro Vai Ala Arg Leu Arg Gly Ala -5 1 5 ctc ccg gat gea agg ggc tgc cac ata gee cag ttc aag tcc ctg tet 202 Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser 10 15 20 25 cea cag gag ctg cag gee ttt aag agg gee aaa gat gee tta gaa gag 250 Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu 30 35 40 teg ctt ctg ctg aag gac tgc aag tgc ege tcc ege ctc ttc ccc agg 298 Ser Leu Leu Leu Lys ASp Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg 45 50 55 acc tgg gac ctg agg cag ctg cag gtg agg gag ege ccc gtg gct ttg 346 Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu Gin vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu 60 65 70 gag gct gag ctg gee ctg acg ctg aag gtt ctg gag gee acc gct gac 394 Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp 75 80 85 act gac cca gee ctg ggg gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg 442 Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu 90 95 100 105 cac cat ate ctc tcc cag ctc cgg gee tgt ate cag cct cag ccc acg 490 His His Ile Leu Ser Gin Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr 110 115 120 gea ggg ccc agg acc cgg ggc ege ctc cac cat tgg ctg cac cgg ctc 538 Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu 125 130 135 cag gag gee cca aaa aag gag tcc cct ggc tgc ctc gag gee tet gtc 586 Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai 140 145 150 acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gee 634 Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala 155 160 165 age ggg gac ctg tgt gtc tga cccttccgcc agtcatgcaa cctgagattt 685

Ser Gly Asp Leu Cys Vai * 170 175 734 tatttataaa ttagccactt ggcttaattt attgccaccc agtcgctat 171 <210> 6 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> SINAL <222> (D .. . (25) <4 0 0> 6

Met -25 Lys Leu Asp Met Thr -20 Gly Asp Ala Ala Vai Leu Thr -5 Vai Thr Gly Gly Ala Leu 10 Pro Asp Ala Arg Gly 15 Leu Ser 25 Pro Gin Glu Leu Gin 30 Ala

Cys Met Pro -15 val Leu val Leu Met -10 Ala Val 1 Pro Val Ala Arg 5 Leu Arg Cys HiS iie Ala Gin 20 Phe Lys Ser Phe Lys Arg Ala 35 Lys Asp Ala Leu

Glu 40 Glu Ser Leu Leu Leu 45 Lys Asp Pro Arg Thr Trp Asp 60 Leu Arg Gin Ala Leu Glu Ala 75 Glu Leu Ala Leu Ala Asp Thr 90 Asp Pro Ala Leu Gly 95 Thr Leu 105 His HiS Xle Leu Ser 110 Gin Pro 120 Thr Ala Gly Pro Arg 125 Thr Arg Arg Leu Gin Glu Ala 140 Pro Lys Lys Ser Val Thr Phe 155 Asn Leu Phe Arg val Ala Ser 170 Gly Asp Leu Cys Val 175

Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe 50 55 Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro Val 65 70 Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr SO 85 Asp val Leu Asp Gin Pro Leu His 100 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin 115 Gly Arg Leu His His Trp Leu His 130 135 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala 145 150 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys 160 165 <210> 7 <211> 633 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> 1 •H CQ _péptido 172 <222> (22)...(105) <221> mat_péptido <222> (106)...(630)

<221> CDS <222> (22)...(630) < 4 0 0 > 7 tcacagaccc cggagagcaa c atg aag cca gaa aca gct ggg ggc cac atg 51 Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met -25 -20 ctc ctc ctg ctg ttg cct ctg ctg ctg gcc gea gtg ctg aca aga acc 99 Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ala Vai Leu Thr Arg Thr -15 -10 -5 caa gct gac cct gtc ccc agg gcc acc agg ctc cca gtg gaa gea aag 147 Gin Ala Asp Pro Vai Pro Arg Ala Thr Arg Leu Pro vai Glu Ala Lys 1 5 10 gat tgc cac att gct cag ttc aag tct ctg tcc cca aaa gag ctg cag 195 Asp Cys Hi3 Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gin 15 20 25 30 gcc ttc aaa aag gcc aag gat gcc ate gag aag agg ctg ctt gag aag 243 Ala Phe Lys Lys Ala Lys Asp Ala Ile Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys 35 40 45 gac ctg agg tgc agt tcc cac ctc ttc ccc agg gcc tgg gac ctg aag 291 173

Asp Leu Arg Cys Ser Ser His Leu Phe 50 55 cag ctg cag gtc caa gag ege ccc aag Gin Leu Gin vai Gin Glu Arg Pro Lys 65 70 ctg acc ctg aag gtc tgg gag aac atg Leu Thr Leu Lys val Trp Glu Asn Met 80 85 ate ctg ggc cag cct ctt cat aca ctg Ile Leu Gly Gin Pro Leu His Thr Leu 95 100 cag acc tgt aca cag ctt cag gee aca Gin Thr Cys Thr Gin Leu Gin Ala Thr 115 ege ege etc tcc ege tgg ctg cac agg Arg Arg Leu Ser Arg Trp Leu His Arg 130 135 gag acc cct ggc tgc ctg gag gee tet Glu Thr Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser 145 150 ctg etc acc cgg gac etc aag tgt gtg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Cys Val 160 165

Pro Arg Ala Trp Asp 60 Leu Lys gee Ala ttg Leu cag Gin gct Ala 75 gag Glu gtg Val gee Ala 339 act Thr gac ASp tea Ser 90 gee Ala ctg Leu gee Ala acc Thr 387 age Ser cac His 105 att Ile cac His tcc Ser cag Gin ctg Leu 110 435 gea Ala 120 gag Glu ccc Pro agg Arg tcc Ser ccg Pro 125 age Ser 483 etc Leu cag Gin gag Glu gee Ala cag Gin 140 age Ser aag Lys 531 gtc val acc Thr tcc Ser aac Asn 155 ctg Leu ttt Phe ege Arg 579 gee Ala aat Asn gga Gly 170 gac Asp cag Gin tgt Cys gtc Val 627 633 tga cct *

<210> 8 <211> 202 <212> PRT <213> Mus musculus <22 0> <221> <222> SINAL (1)...(28) <400> 174

Met Lys Pro Glu -25 Thr Ala Gly Gly Leu Leu Leu -10 Ala Ala vai Leu Thr -5 Arg 5 Ala Thr Arg Leu Pro 10 vai Glu Phe Lys Ser Leu Ser 25 Pro Lys Glu Asp Ala Ile Glu 40 Lys Arg Leu Leu HiS Leu Phe Pro Arg Ala Trp Asp

HiS -20 Met Leu Leu Leu Leu -15 Leu Pro Arg Thr Gin Ala Asp 1 Pro Vai Pro Ala Lys Asp 15 Cys X His Ile Ala Gin 20 Leu Gin 30 Ala Phe Lys Lys Ala 35 Lys Glu 45 Lys Asp Leu Arg Cys 50 Ser Ser Leu Lys Gin Leu Gin Vai Gin Glu 55 60 Arg Pro 70 Lys Ala Leu Gin Ala 75 Glu Glu 85 Asn Met Thr Asp Ser 90 Ala Leu His Thr Leu Ser His 105 Ile His Ser Gin Ala Thr Ala 120 Glu Pro Arg Ser Leu His Arg 135 Leu Gin Glu Ala Gin 140 Glu Ala 150 Ser Vai Thr Ser Asn 155 Leu Lys 165 Cys Vai Ala Asn Gly 170 Asp Gin 65 Vai Ala Leu Thr Leu Lys Vai Trp 80 Ala Thr Ile Leu Gly Gin Pro Leu 95 100 Gin Leu Gin Thr Cys Thr Gin Leu 110 115 Pro Ser Arg Arg Leu Ser Arg Trp 125 130 Ser Lys Glu Thr Pro Gly Cys Leu 145 Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu 160

Cys Vai

<210> 9 <211> 632 <212> ADN <213> Mus musculus <22 0> <221> sig péptido <222> (22)...(105) <221> mat péptido <222> (106) ... (630 <221> CDS <222> (22) ... (630) <400> 9 175 tcacagaccc cggagagcaa c atg aag cca gaa aca gct ggg ggc cac atg 51 Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met -25 -20 ctc ctc ctg ctg ttg cct ctg ctg ctg gcc gea gtg ctg aca aga acc 99 Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ala val Leu Thr Arg Thr -15 -10 -5 caa gct gac cct gtc ccc agg gcc acc agg ctc cca gtg gaa gea aag 147 Gin Ala Asp Pro vai Pro Arg Ala Thr Arg Leu Pro val Glu Ala Lys 1 5 10 gat tgc cac att gct cag ttc aag tct ctg tcc cca aaa gag ctg cag 195 Asp Cys His He Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gin 15 20 25 30 gcc ttc aaa aag gcc aag ggt gcc ate gag aag agg ctg ctt gag aag 243 Ala Phe Lys Lys Ala Lys Gly Ala He Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys 35 40 45 gac atg agg tgc agt tcc cac ctc ate tcc agg gcc tgg gac ctg aag 291 Asp Met Arg Cys Ser Ser His Leu ile Ser Arg Ala Trp Asp Leu Lys 50 55 60 cag ctg cag gtc caa gag ege ccc aag gcc ttg cag gct gag gtg gcc 339 Gin Leu Gin Val Gin Glu Arg Pro Lys Ala Leu Gin Ala Glu Val Ala 65 70 75 ctg acc ctg aag gtc tgg gag aac ata aat gac tea gcc ctg acc acc 387 Leu Thr Leu Lys val Trp Glu Asn Ile Asn Asp Ser Ala Leu Thr Thr 80 85 90 ate ctg ggc cag cct ctt cat aca ctg age cac att cac tcc cag ctg 435 Ile Leu Gly Gin Pro Leu His Thr Leu Ser His Ile His Ser Gin Leu 95 100 105 110 cag acc tgt aca cag ctt cag gcc aca gea gag ccc aag ccc ccg agt 483 Gin Thr Cys Thr Gin Leu Gin Ala Thr Ala Glu Pro Lys Pro Pro Ser 115 120 125 ege ege ctc tcc ege tgg ctg cac agg ctc cag gag gcc cag age aag 531 Arg Arg Leu Ser Arg Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Gin Ser Lys 130 135 L40 gag act cct ggc tgc ctg gag gac tct gtc acc tcc aac ctg ttt caa 579 Glu Thr Pro Gly Cys Leu Glu Asp Ser val Thr Ser Asn Leu Phe Gin 145 150 155 ctg ctc ctc cgg gac ctc aag tgt gtg gcc agt gga gac cag tgt gtc 627 Leu Leu Leu Arg Asp Leu Lys Cys Val Ala Ser Gly Asp Gin Cys Val 160 165 170 tga cc 632 * <210> 10 <211> 202 176 <212> PRT <213> Mus muscul <22 0> <221> SINAL <222> (D . . . (28) <4 0 0> 10

Met Lys Pro Glu Thr Ala Gly Gly His Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro -25 -20 -15 Leu Leu Leu Ala Ala vai Leu Thr Arg Thr Gin Ala Asp Pro val Pro -10 -5 1 Arg Ala Thr Arg Leu Pro vai Glu Ala Lys Asp Cys His ile Ala Gin 5 10 15 20 Phe Lys Ser Leu Ser Pro Lys Glu Leu Gin Ala Phe Lys Lys Ala Lys 25 30 35 Gly Ala Ile Glu Lys Arg Leu Leu Glu Lys Asp Met Arg Cys Ser Ser 40 45 50 His Leu Ile Ser Arg Ala Trp Asp Leu Lys Gin Leu Gin Vai Gin Glu 55 60 65 Arg Pro Lys Ala Leu Gin Ala Glu Vai Ala Leu Thr Leu Lys Val Trp 70 75 80

Glu Asn Ile Asn Asp Ser Ala Leu Thr Thr ile Leu Gly Gin Pro Leu 85 90 95 100 His Thr Leu Ser His ile His Ser Gin Leu Gin Thr Cys Thr Gin Leu 105 110 115 Gin Ala Thr Ala Glu Pro Lys Pro Pro Ser Arg Arg Leu Ser Arg Trp 120 125 130 Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Gin Ser Lys Glu Thr Pro Gly Cys Leu 135 140 145 Glu Asp Ser Val Thr Ser Asn Leu Phe Gin Leu Leu Leu Arg Asp Leu 150 155 160 Lys Cys Val Ala Ser Gly Asp Gin Cys Val 165 170

<210> 11 <211> 520 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 177

Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly 1 5 Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu 20 Leu Ser Gin Asn Phe Ser Val Tyr 35 40 Asn Pro Gin Asp Val Thr Tyr Phe 50 55 Arg Arg Arg Trp Arg Glu val Glu 65 70 Leu Cy3 Ser Met Met Cys Leu Lys 85 Lys Gly Arg Val Arg Thr val Ser 100 Glu Ser Glu Tyr Leu Asp Tyr Leu 115 120 Vai Leu Val Leu Thr Gin Thr Glu 130 135 Tyr Gin Leu Pro Pro Cys Met Pro 145 150 Ala Phe Trp Lys Glu Gly Ala Gly 165 Pro His Gly Gin Pro Val Gin Ile 180 His His Cys Leu Ser Ala Arg Thr 195 200 Tyr Ser Lys Phe Ser Lys Pro Thr 210 215 Ala Asn Trp Ala Phe Leu Val Leu 225 230 val Ile Ala Ala Gly Gly Val Ile 245 Trp Phe Gin Arg Ala Lys Met Pro 260 Thr His Pro val Ala Thr Phe Gin 275 280 Asp Leu Phe Leu Cys Pro Gin Lys

Pro Leu 10 Leu Leu Cys Leu Leu 15 Gin Ala 25 Pro Pro Gin Asn Val 30 Thr Leu Leu Thr Trp Leu Pro 45 Gly Leu Gly Val Ala Tyr Gin 60 Ser Ser Pro Thr Glu Cys Ala 75 Gly Thr Lys Glu Leu 80 Lys Gin 90 Asp Leu Tyr Asn Lys 95 Phe Pro 105 Ser Ser Lys Ser Pro 110 Trp Val Phe Glu Val Glu Pro 125 Ala Pro Pro Glu ile Leu Ser 140 Ala Asn Ala Thr Pro Leu Asp 155 Leu Lys Tyr Glu Val 160 Asn Lys 170 Thr Leu Phe Pro val 175 Thr Thr 185 Leu Gin Pro Ala Ala 190 Ser Glu Ile Tyr Thr Phe Ser 205 val Pro Lys Cys Phe Leu Leu 220 Glu Val Pro Glu Pro Ser Leu 235 Leu ile Leu Leu Leu 240 Trp Lys 250 Thr Leu Met Gly Asn 255 Pro Arg 265 Ala Leu Asp Phe Ser 270 Gly His Pro Ser Arg Pro Glu 285 Ser Val Asn Glu Leu Thr Arg Gly val Arg Pro 178 290 295 300 Thr Pro Arg Vai Arg Ala Pro Ala Thr Gin Gin Thr Arg Trp Lys Lys 305 310 315 320 Asp Leu Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Thr Glu Asp 325 330 335 Gly Vai Ser Phe Gin Pro Tyr He Glu Pro Pro Ser Phe Leu Gly Gin 340 345 350 Glu His Gin Ala Pro Gly His Ser Glu Ala Gly Gly Vai Asp Ser Gly 355 360 365 Arg Pro Arg Ala Pro Leu vai Pro Ser Glu Gly Ser Ser Ala Trp ASp 370 375 380 Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala Ser Thr vai ASp Ser Ser Trp Asp Arg 385 390 395 400 Ala Gly Ser Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Gly Pro Gly Gin Gly Pro 405 410 415 Gly Gly Asp Gly His Gin Glu Ser Leu Pro Pro Pro Glu Phe Ser Lys 420 425 430 Asp Ser Gly Phe Leu Glu Glu Leu Pro Glu Asp Asn Leu Ser Ser Trp 435 440 445 Ala Thr Trp Gly Thr Leu Pro Pro Glu Pro Asn Leu Vai Pro Gly Gly 450 455 460 Pro Pro Vai Ser Leu Gin Thr Leu Thr Phe Cys Trp Glu Ser Ser Pro 465 470 475 480 Glu Glu Glu Glu Glu Ala Arg Glu Ser Glu Ile Glu Asp Ser Asp Ala 485 490 495 Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gin Arg Thr Glu Asp Arg Gly Arg 500 505 510 Thr Leu Gly HiS Tyr Met Ala Arg 515 520 <210 > 12

<211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> proteína matura da SEQ. ID N.° 1, com adição de 3' Met

<221> CDS <222> (1)...(531) <400> 12 48 179 48 179 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct ctc ccg gat gca agg ggc Met Vai Pro Vai Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct cca cag gag ctg cag gcc Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag tcg ctt ctg ctg aag gac Phe Lys Arg Ala Lys ASp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 tgc agg tgc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc ccc atg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg gtg Thr Leu Lys vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu val 85 90 95 gac gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag Asp vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu HÍ3 His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 ttc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gca ggg ccc agg acc cgg Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc agt ggg gac ctg tgt gtc Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys val 165 170 175 96 144 192 240 288 336 384 432 430 528 tga *

<210> 13 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 531 180 <223> proteína matura da SEQ. ID N. 1 3 1, , com adição Met <400> 13 Met Vai Pro Vai Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu val 85 90 95 Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175

<210> 14 <211> 621 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> proteína matura da SEQ. ID N.° 3, com adição de 3' Met <221> CDS <222> (1)...(549) <4 0 0> 14 48 181 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala L00 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac etc aaa tat gtg gee gat ggg aac ctg tgt ctg aga acg tea Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga caccccacac cttatttatg cgctgagccc Thr His Pro Glu Ser Thr * 180 tactccttcc ttaatttatt tcctctcacc ctttatttat ga

<210> 15 <211> 182 <212> PRT 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 579 621 182 <213> Sequência artificial <220> <223> proteína matura da SEQ. ID N.° 3, com adição de 3' Met <400> 15

Met Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lvs Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu 85 90 95 ASp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 HiS His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 16 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> proteína matura da SEQ. ID N.° 5, com adição de 3' Met <221> CDS <222> (1)...(531) <4 0 0> 16 183 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc 48 Met Vai Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc 96 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac 144 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 tgc aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag 192 Cys Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp ASp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin val Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg ggg 288 Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin 100 105 110 ctc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg 384 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag 432 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc 480 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc 528 Leu Leu Thr Arg ASp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 tga 531 *

<210> 17 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> proteína matura da SEQ. ID N.° 5, com adição de 3' Met 184 <400> 17

Met 1 Vai Pro Vai Ala 5 Arg Leu Arg Gly Ala 10 Leu Pro Asp Ala Arg 15 Gly Cys His Ile Ala 20 Gin Phé Lys Ser Leu Ser 25 Pro Gin Glu Leu 30 Gin Ala Phe Lys Arg 35 Ala Lys Asp Ala Leu 40 Glu Glu Ser Leu Leu 4S Leu Lys Asp Cys Lys 50 Cys Arg Ser Arg Leu 55 Phe Pro Arg Thr Trp 60 Asp Leu Arg Gin Leu 65 Gin Vai Arg Glu Arg 70 Pro vai Ala Leu Glu 75 Ala Glu Leu Ala Leu 80 Thr Leu Lys Vai Leu 85 Glu Ala Thr Ala Asp 90 Thr Asp Pro Ala Leu 95 Gly ASp Vai Leu ASp 100 Gin Pro Leu His Thr Leu 105 His His ile Leu 110 Ser Gin Leu Arg Ala 115 Cys Ile Gin Pro Gin 120 Pro Thr Ala Gly Pro 125 Arg Thr Arg Gly Arg 130 Leu His His Trp Leu 135 His Arg Leu Gin Glu 140 Ala Pro Lys Lys Glu 145 Ser Pro Gly Cys Leu 150 Glu Ala Ser Vai Thr 155 Phe Asn Leu Phe Arg 160 Leu Leu Thr Arg Asp 165 Leu Asn Cys Vai Ala 170 Ser Gly Asp Leu Cys 175 val

<210> 18 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> C48S mutante da IL-28A

<221> CDS <222> (1)...(528) <4 Ο 0> 18 185 gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct ctc ccg gat gca agg ggc tgc 48 vai Pro Vai Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct cca cag gag ctg cag gcc ttt 96 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag tcg ctt ctg ctg aag gac tcc 144 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ser 35 40 45 agg tgc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg 192 Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp ASp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 cag gtg agg gag cgc ccc atg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg gtg gac 288 Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp 85 90 95 gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag ttc 336 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu HiS His ile Leu Ser Gin Phe 100 105 110 cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gca ggg ccc agg acc cgg ggc 384 Arg Ala Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 cgc ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag 432 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc 480 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc agt ggg gac ctg tgt gtc tga 528 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val * 165 170 175

<210> 19 <211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> C48S mutante da IL-28A 186 <4 Ο 0> 19 vai Pro val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 HÍS lie Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Ser 35 40 45 Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp 85 90 95 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His lie Leu Ser Gin Phe 100 105 110 Arg Ala Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125

Arg Leu 130 His His Trp Leu Tyr 135 Arg Leu Gin Glu Ala 140 Pro Lys Lys Glu Ser 145 Pro Gly Cys Leu Glu 150 Ala Ser Val Thr Phe 155 Asn Leu Phe Arg Leu 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <210> 20 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> C49S mutante da met IL <221> CDS <222> (1)...(531) <400> 20 187 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc 48 Met Vai Pro val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc 96 Cys His lie Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac 144 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 tcc agg tgc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag 192 Ser Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc ccc atg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg gtg 288 Thr Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val 85 90 95 gac gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 ttc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg 384 Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag 432 Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag u υ tp tet gtc acc ttc aac ctc ttc O o 480

Glu 145 Ser Pro Gly Cys Leu 150 Glu Ala Ser Val Thr 155 Phe Asn Leu Phe Arg 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc agt ggg gac ctg tgt gtc Leu Leu Thr Arg A3p 165 Leu Asn Cys Val Ala 170 Ser Gly Asp Leu Cys 175 Val tga * <210> 21 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial 531 188 <220> <223> C49S mutante da met IL-28A <4Ο0> 21

Met Vai Pro Vai Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val 85 90 95 Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <210> 22 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C50S mutante da IL-28A <221> CDS <222> (1) ... (528) <400> 22 189 gtt cct gtc gcc agg ctc cac ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc tgc 48 Vai Pro vai Ala Arg Leu HiS Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 io 15 cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc ttt 96 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac tgc 144 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys 35 40 45 agg tcc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg 192 Arg Ser His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 cag gtg agg gag cgc ccc,atg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg gtg gac 288 leu Lys Vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Vai Asp 85 90 95 gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag ttc 336 vai Leu Aap Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Phe 100 105 110 cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg ggc 384 Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 cgc ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag 432 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc 480 Ser Fro Gly Cys Leu Glu Ala Ser vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc agt ggg gac ctg tgt gtc tga 528 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val * 165 170 175

<210> 23 <211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C50S mutante da IL-28A <400> 23 190

Vai Pro Val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys 35 40 45 Arg Ser HiS Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val Asp 85 90 95 val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Phe 100 105 110 Arg Ala Cys lie Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <210> 24 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C51S mutante da met <221> CDS <222> (1)...(531) <400> 24 191 atg gtt cct gtc gcc agg etc cac ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc 48 Met Vai Pro vai Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc 96 Cys His ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg Ctt ctg ctg aag gac 144 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 tgc agg tcc cac tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag 192 Cys Arg Ser His Ser Arg Leu Phe pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc CCC atg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg gtg 288 Thr Leu Lys vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu val 85 90 95 gac gtc ttg gac cag CCC ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 ttc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg 384 Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg tac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag 432 Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc 480 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc agt ggg gac ctg tgt gtc 528 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val. Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 tga 531 *

<210> 25 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> C51S mutante da met IL-28A 192 <4Ο0> 25

Met 1 H > Pro val Ala 5 Arg Leu His Cys His tle Ala 20 Gin Phe Lys Ser Phe Lys Arg 35 Ala Lys Asp Ala Leu 40 Cys Arg 50 Ser His Ser Arg Leu 55 Phe Leu 65 Gin Vai Arg Glu Arg 70 Pro Met Thr Leu Lys Val Leu 85 Glu Ala Thr Asp Vai Leu Asp 100 Gin Pro Leu His Phè Arg Ala 115 Cys Ile Gin Pro Gin 120 Gly Arg 130 Leu His His Trp Leu 135 Tyr Glu 145 Ser Pro Gly Cys Leu 150 Glu Ala Leu Leu Thr Arg Asp 165 Leu Asn Cys <210> 26

Gly Ala 10 Leu Pro Asp Ala Arg IS Gly Leu 25 Ser Pro Gin Glu Leu 30 Gin Ala Glu Glu Ser Leu Leu 45 Leu Lys Asp Pro Arg Thr Trp 60 Asp Leu Arg Gin Ala Leu Glu 75 Ala Glu Leu Ala Leu 80 Ala Asp 90 Thr Asp Pro Ala Leu 95 Val Thr 105 Leu His His Ile Leu 110 Ser Gin Pro Thr Ala Gly Pro 125 Arg Thr Arg Arg Leu Gin Glu 140 Ala Pro Lys Lys Ser val Thr 155 Phe Asn Leu Phe Arg 160 Val Ala 170 Ser Gly Asp Leu Cys 175 Val

<211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C171S mutante da IL-29 <221> CDS <222> (1)...(546) <400> 26 193 ggt ccg gtt ccg acc tet aaa cca acc acc act ggt aaa ggt tgc cac 48 Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His 1 5 10 15 ate ggt cgt ttc aaa tet ctg tet ccg cag gaa ctg gct tet ttc aaa 96 ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aaa gct cgt gac gct ctg gaa gaa tet ctg aaa ctg aaa aac tgg tet 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc tet tet ccg gtt ttc ccg ggt aac tgg gat ctg cgt ctg ctg cag 192 Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtt cgt gaa cgt ccg gtt gct ctg gaa gct gaa ctg gct ctg acc ctg 240 Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aaa gtt ctg gaa gct gct gea ggt cct gct ctg gaa gat gtt ctg gat 288 Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu Asp 85 90 95 cag ccg ctg cac act ctg cac cac ate ctg tet cag ctg cag gct tgc 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 att caa ccg caa ccg acc gct ggt ccg cgt ccg cgt ggt cgt ctg cac 384 iie Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cat cgt ctg cag gaa gct ccg aaa aaa gaa tet gct ggt 432 HÍS Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gaa gct tet gtt acc ttc aac ctg ttc cgt ctg ctg acc cgt 480 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gat ctg aaa tac gtt gct gat ggt aac ctg tet ctg cgt acc tet acc 528 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Ser Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cat ccg gaa tet acc taa 546 His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 27 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 194 <223> C171S mutante da IL-29 <400> 27

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His . 1 5 10 15 ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile. Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly Asn Leu Ser Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 His Pro Glu Ser Thr 180 <210> 28 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C172S mutante da met <221> CDS <222> (D . . . (549) <4 0 0> 28 ggt tgc Gly Cys 15 atg ggt ccg gtt ccg acc tct aaa cca acc acc act ggt aaa Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys 15 10 48 195 cac ate ggt cgt ttc aaa tct ctg tct ccg cag gaa ctg gct tct ttc 96 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aaa aaa gct cgt gac gct ctg gaa gaa tct ctg aaa ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 tct tgc tct tct ccg gtt ttc ccg ggt aac tgg gat ctg cgt ctg ctg 192 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtt cgt gaa cgt ccg gtt gct ctg gaa gct gaa ctg gct ctg acc 240 Gin vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aaa gtt ctg gaa gct gct gea ggt cct gct ctg gaa gat gtt ctg 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 gat cag ccg ctg cac act ctg cac cac ate ctg tct cag ctg cag gct 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgc att caa ccg caa ccg acc gct ggt ccg cgt ccg cgt ggt cgt ctg 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cat cgt ctg cag gaa gct ccg aaa aaa gaa tct gct 432 His His Trp Leu HiS Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggt tgc ctg gaa gct tct gtt acc ttc aac ctg ttc cgt ctg ctg acc 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cgt gat ctg aaa tac gtt gct gat ggt aac ctg tct ctg cgt acc tct 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala ASp Gly Asn Leu Ser Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cat ccg gaa tct acc taa 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180 <210> 29 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C172S mutante da met <4Ο0> 29 196

Met Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly >1 Gly Cys 1 5 10 15 His He Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His HiS ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Ser Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 30 <211> 525 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência degenerada da SEQ. ID N.° 18 <221> misc característica <222> (1) ... (525)

<223> n = A, T,C ou G <400> 30 gtnccngtng cnmgnytnca yggngcnytn ccngaygcnm gnggntgyca yathgcncar 60 ttyaarwsny tnwsnccnca rgarytncar gcnttyaarm gngcnaarga ygcnytngar 120 garwsnytny tnytnaarga ywsnmgntgy caywsnmgny tnttyccnmg nacntgggay 180 ytnmgncary tncargtnmg ngarmgnccn atggcnytng argcngaryt ngcnytnacn 240 ytnaargtny tngargcnac ngcngayacn gayccngcny tngtngaygt nytngaycar 300 ccnytncaya cnytncayca yathytnwsn carttymgng cntgyathca rccncarcen 360 acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn 420 ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar gcnwsngtna cnttyaayyt nttyingnytn 480 ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn ggngayytnt gygtn 525 197 197 <210> 31 <211> 525 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência degenerada <221> misc caracteristica <222> (1)...(525 ) <223> n = A, T, C ou G <4 0 0> 31 gtnccngtng cnmgnytnca ttyaarwsny tnwsnccnca garwsnytny tnytnaarga ytnmgncary tncacgtnmg ytnaargtny tngargcnac ccnytncaya cnytncayca acngcnggnc cnmgnacnmg ccnaaraarg arwsnccngg ytnacnmgng ayytnaaytg yggngcnytn ccngaygcnm gnggntgyca yathgcncar 60 rgarytncar gcnttyaarm gngcnaarga ygcnytngar 120 ywsnmgntgy caywsnmgny tnttyccnmg nacntgggay 180 ngarmgnccn atggcnytng argcngaryt ngcnytnacn 240 ngcngayacn gayccngcny tngtngaygt nytngaycar 300 yathytnwsn carttymgng cntgyathca rccncarccn 360 nggnmgnytn caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn 420 ntgyytngar gcnwsngtna cnttyaayyt nttymgnytn 480 ygtngcnwsn ggngayytnt gygtn 525

<210> 32 <211> 525 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência degenerada <221> misc caracteristica <222> (D . . . (525 ) <223> n = A,T,C ou G ID N.° 22 <400> 32 198 gtnccngtng cnmgnytnca yggngcnytn ttyaarwsny tnwsnccnca rgarytncar garwsnytny tnytnaarga ywsnmgntgy ytnmgncary tncargtnmg ngarmgnccn ytnaargtny tngargcnac ngcngayacn ccnytncaya cnytncayca yathytnwsn acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn ccngaygcnm gnggntgyca yathgcncar 60 gcnttyaarm gngcnaarga ygcnytngar 120 caywsnmgny tnttyccnmg nacntgggay 180 atggcnytng argcngaryt ngcnytnacn 240 gayccngcny tngtngaygt nytngaycar 300 carttymgng cntgyathca rccncarccn 360 caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn 420 gcnwsngtna cnttyaayyt nttyingnytn 480 ggngayytnt gygtn 525 <210> 33 <211> 525 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência degenerada <221> misc caracteristica <222> (1)...(525 ) <223> n = A, T, C ou G <4 0 0> 33 ID N.° 24 gtnccngtng cnmgnytnca yggngcnytn ccngaygcnm gnggntgyca yathgcncar 60 ttyaarwsny tnwsnccnca rgarytncar gcnttyaarm gngcnaarga ygcnytngar 120 garwsnytny tnytnaarga ywsnmgntgy caywsnmgny tnttyccnmg nacntgggay 180 ytnmgncary tncargtnmg ngarmgnccn atggcnytng argcngaryt ngcnytnacn 240 ytnaargtny tngargcnac ngcngayacn gayccngcny tngtngaygt nytngaycar 300 ccnytncaya cnytncayca yathytnwsn carttymgng cntgyathca rccncarccn 360 acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn 420 ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar gcnwsngtna cnttyaayyt nttymgnytn 480 ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn ggngayytnt gygtn 525

<210> 34 <211> 525 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> ID N.° 26

<223> sequência degenerada da SEQ 199 <221> misc_característica <222> (1)...(525)

<223> n = A,T,C ou G <400> 34 ccngaygcnm gnggntgyca yathgcncar 60 gcnttyaarm gngcnaarga ygcnytngar 120 caywsnmgny tnttyccnmg nacntgggay 180 atggcnytng argcngaryt ngcnytnacn 240 gayccngcny tngtngaygt nytngaycar 300 carttymgng cntgyathca rccncarccn 360 caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn 420 gcnwsngtna cnttyaayyt nttymgnytn 480 ggngayytnt gygtn 525 gtnccngtng cnmgnytnca yggngcnytn ttyaarwsny tnwsnccnca rgarytncar garwsnytny tnytnaarga ywsnmgntgy ytnmgncary tncargtnmg ngarmgnccn ytnaargtny tngargcnac ngcngayacn ccnytncaya cnytncayca yathytnwsn acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn <210> 35 <211> 525 <212> ADN Λ 00 \—1 Csl V Sequência artifi ciai <22 0> <223> sequência degene rada <221> misc caracterist ica <222> (1)...(525) <223> n = A, T, C ou G <4 0 0> 35 ID N.° 28 gtnccngtng cnmgnytnca yggngcnytn ttyaarwsny tnwsnccnca rgarytncar garwsnytny tnytnaarga ywsnmgntgy ytnmgncary tncargtnmg ngarmgnccn ytnaargtny tngargcnac ngcngayacn ccnytncaya cnytncayca yathytnwsn acngcnggnc cnmgnacnmg nggnmgnytn ccnaaraarg arwsnccngg ntgyytngar ytnacnmgng ayytnaaytg ygtngcnwsn ccngaygcnm gnggntgyca yathgcncar 60 gcnttyaarm gngcnaarga ygcnytngar 120 caywsnmgny tnttyccnmg nacntgggay 180 atggcnytng argcngaryt ngcnytnacn 240 gayccngcny tngtngaygt nytngaycar 300 carttymgng cntgyathca rccncarccn 360 caycaytggy tntaymgnyt ncargargcn 420 gcnwsngtna cnttyaayyt nttymgnytn 480 ggngayytnt gygtn 525 <210> 36 200

<211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> C48X mutante da IL-28A <221> VARIANTE <222> (48) ... (48) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai ou Asn <400> 36 vai Pro Val Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Xaa 35 40 45 Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin val Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu val Asp 85 90 95 Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Phe 100 105 110 Arg Ala Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175

<210> 37 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> C49X mutante da met IL-28A 201 <221> VARIANTE <222> (49) . . . (49) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai ou Asn <400> 37

Met 1 Vai Pro Vai Ala Arg 5 Leu His Gly Ala 10 Leu Pro Asp Ala Arg 15 Gly Cys His Ile Ala 20 Gin Phe Lys Ser Leu 25 Ser Pro Gin Glu Leu 30 Gin Ala Phe Lys Arg 35 Ala Lys Asp Ala Leu 40 Glu Glu Ser Leu Leu 45 Leu Lys Asp xaa Arg 50 Cys His Ser Arg Leu 55 Phe Pro Arg Thr Trp 60 Asp Leu Arg Gin Leu 65 Gin Vai Arg Glu Arg 70 Pro Met Ala Leu Glu 75 Ala Glu Leu Ala Leu 80 Thr Leu Lys Vai Leu 85 Glu Ala Thr Ala Asp 90 Thr Asp Pro Ala Leu 95 vai Asp Vai Leu Asp 100 Gin Pro Leu His Thr 105 Leu His His Ile Leu 110 Ser Gin Phe Arg Ala 115 Cys He Gin Pro Gin 120 Pro Thr Ala Gly Pro 125 Arg Thr Arg Gly Arg 130 Leu His His Trp Leu 135 Tyr Arg Leu Gin Glu 140 Ala Pro Lys Lys Glu 145 Ser Pro Gly Cys Leu 150 Glu Ala Ser Vai Thr 155 Phe Asn Leu Phe Arg 160 Leu Leu Thr Arg Asp 165 Leu Asn Cys Vai Ala 170 Ser Gly Asp Leu Cys 175 vai <210> 38

<211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> C50X mutante da IL-28A <221> VARIANTE <222> (50) ... (50) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai ou Asn <400> 38 202

Val 1 Pro Val Ala Arg 5 Leu His Gly His Ile Ala Gin 20 Phe Lys Ser Leu Lys Arg Ala 35 Lys Asp Ala Leu Glu 40 Arg Xaa 50 His Ser Arg Leu Phe 55 Pro Gin 65 Val Arg Glu Arg Pro 70 Met Ala Leu Lys Val Leu Glu 35 Ala Thr Ala Val Leu Asp Gin 100 Pro Leu HiS Thr Arg Ala Cys 115 Ile Gin Pro Gin Pro 120 Arg Leu 130 His His Trp Leu Tyr 135 Arg Ser 145 Pro Gly Cys Leu Glu 150 Ala Ser Leu Thr Arg Asp Leu 165 Asn Cys Val

Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys Ser 10 Pro Gin Glu Leu Gin 15 Ala Phe 25 Glu Ser Leu Leu Leu 30 Lys Asp Cys Arg Thr 45 Trp Asp Leu Arg Gin Leu Leu Glu Ala 60 Glu Leu Ala Leu Thr Asp Thr 75 Asp Pro Ala Leu Val 80 Asp Leu 90 His His Ile Leu Ser 95 Gin Phe 105 Thr Ala Gly Pro Arg 110 Thr Arg Gly Leu Gin Glu 125 Ala Pro Lys Lys Glu val Thr Phe 140 Asn Leu Phe Arg Leu Ala Ser 155 Gly Asp Leu Cys Val 160 170 175 <210> 39

<211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> C51X mutante da met IL-28A <221> VARIANTE <222> (51) ... (51) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai ou Asn <400> 39 203

Met Vai Pro Vai Ala Arg Leu His Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 Cys Arg Xaa His Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin vai Arg Glu Arg Pro Met Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Val 85 90 95 Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin 100 105 110 Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <210> 40 <211> 181

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C171X mutante da IL-29 <221> VARIANTE <222> (171) ... (171) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai ou Asn <400> 40 204

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His 1 5 10 15 ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu HiS Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160

Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175

His Pro Glu Ser Thr 180 <210> 41 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C172X mutante da met IL-29 <221> VARIANTE <222> (172) . . . (172) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Val ou Asn <400> 41 205

Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180 <210> 42

<211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC40923 <400> 42 tccagggaat tcatataggc cggccaccat gaaactagac atgactggg 49

<210> 43 <211> 74 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC43152 206 <400> 43 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagactattt ttagacacac 60 aggtccccac tggc 74

<210> 44 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC29740 <400> 44 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 50

<210> 45 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleotideo iniciador ZC29741 <400> 45 tctgatttaa tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cg 42

<210> 46 <211> 62 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 207 <223> oligonucleotídeo iniciador ZC29736 <4 0 0> 46 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca cagaattcat taaagaggag aaattaactc 60 cc 62 <210> 47 <211> 63 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC29738 <4 0 0> 47 gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca cccgggagtt aatttctcct ctttaatgaa 60 ttc 63 <210> 48 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC44566 <4 0 0> 48 tcttccagag cgtcacgagc ttttttgaaa gaagccagtt cctgcggaga cagagatttg 60 aaacgaccga tgtggcaa 78 <210> 49 <211> 84 <212> ADN <213> Sequência artificial 208 <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC44565 <400> 49 tcgtgacgct ctggaagaat ctctgaaact gaaaaactgg tcttgctctt ctccggtttt 60 cccgggtaac tgggatctgc gtct 84 <210> 50 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo ini <4 0 0> 50 ZC44564 aacagaagct tccaggcaac cagcagattc ttttttcgga gcttcctgca gacgatgcag 60 ccagtggtgc a 71

<210> 51 <211> 73 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC44563 <400> 51 aactggctct gaccctgaaa gttctggaag ctgctgcagg tcctgctctg gaagatgttc 60 tggatcagcc gct 73

<210> 52 <211> 74 <212> ADN 209 <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44562 <400> 52 tcagggtcag agccagttca gcttccagag caaccggacg ttcacgaacc tgcagcagac 60 gcagatccca gtta 74

<210> 53 <211> 76 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44561 <400> 53 tcagctgcag gottgcattc aaccgcaacc gaccgctggt ccgcgtccgc gtggtcgtct 60 gcaccactgg ctgcat 76

<210> 54 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44560 <400> 54 atgcaagcct gcagctgaga caggatgtgg tgcagagtgt gcagcggctg atccagaaca 60 <210> 55 210

<211> 62 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC44559 <400> 55 atgggtccgg ttccgacctc taaaccaacc accactggta aaggttgcca catcggtcgt 60 tt 62

<210> 56 <211> 65 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC44558 <400> 56 ttaggtagat tccggatggg tagaggtacg caggcacagg ttaccatcag caacgtattt 60 cagat 65

<210> 57 <211> 69 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC44557 <400> 57 tgcctggaag cttctgttac cttcaacctg ttccgtctgc tgacccgtga tctgaaatac 60 gttgctgat 69 211

<210> 58 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44340 <400> 58 cgttgctgat ggtaacctgt ctctgcgtac ctctacccat c 41

<210> 59 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44341 <400> 59 gatgggtaga ggtacgcaga gacaggttac catcagcaac g 41

<210> 60 <211> 68 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC41212 <400> 60 212 ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatatata tatgggccct gtccccactt 60 ccaagccc 68 <210> 61

<211> 67 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC41041 <400> 61 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ttaggtggac tcagggtggg 60 ttgacgt 67 <210> 62 <211> 65

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC43431 <4 0 0> 62 ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatatata tatggttcct gtcgccaggc 60 tccac 65 <210> 63 <211> 67 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotídeo iniciador ZC43437 213 <4Ο0> 63 taatctgtat caggctgaaa atcttatctc atccgccaaa acatcagaca cacaggtccc 60 cactggc 67

<210> 64 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44327 <400> 64 gtggccgatg ggaacctgtc cctgagaacg tcaacccac 39

<210> 65 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC44328 <400> 65 gtgggttgac gttctcaggg acaggttoco atcggccac 39

<210> 66 <211> 83 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC45399 214 <4 Ο Ο> 66 tcaggtccca ggtcctgggg aagaggcggg agtggcacct ggagtccttc agcagaagcg 60 actcttctaa ggcatctttg gcc 83

<210> 67 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> zcyto20 maturo começa a partir de pYEL7b <221> CDS <222> (1)...(531) <400> 67 215 atg gtt cct gtc gee agg ctc cac ggg Met vai Pro Val Ala Arg Leu HiS Gly 1 5 tgc cac ata gee cag ttc aag tcc ctg Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu 20 25 ttt aag agg gee aaa gat gee tta gaa Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu 35 40 tgc agg tgc cac tcc ege ctc ttc ccc Cys Arg Cys His Ser Arg Leu Phe Pro 50 55 ctg cag gtg agg gag ege ccc atg gct Leu Gin val Arg Glu Arg Pro Met Ala 65 70 acg ctg aag gtt ctg gag gee acc gct The Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala 85 gac gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr 100 105 ttc cgg gee tgt ate cag cct cag ccc Phe Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro 115 120 ggc ege ctc cac cat tgg ctg tac cgg Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg 130 135 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gee tet Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser 145 150 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val 165 tga <210> 68 gct ctc ccg gat gea agg ggc 48 Ala 10 Leu Pro Asp Ala Arg 15 Gly tet cca cag gag ctg cag gee 96 Ser Pro Gin Glu Leu 30 Gin Ala gag teg ctt ctg ctg aag gac 144 Glu Ser Leu Leu 45 Leu Lys ASp agg acc tgg gac ctg agg cag 192 Arg Thr Trp 60 Asp Leu Arg Gin ttg gag gct gag ctg gee ctg 240 Leu Glu 75 Ala Glu Leu Ala Leu 80 gac act gac cca gee ctg gtg 288 Asp 90 Thr Asp Pro Ala Leu 95 Val ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Leu His His Ile Leu 110 Ser Gin acg gea ggg ccc agg acc cgg 384 Thr Ala Gly Pro 125 Arg Thr Arg etc cag gag gee cca aaa aag 432 Leu Gin Glu 140 Ala Pro Lys Lys gtc acc ttc aac ctc ttc ege 480 val Thr 155 Phe Asn Leu Phe Arg 160 gee agt ggg gac ctg tgt gtc 528 Ala 170 Ser Gly Asp Leu Cys 175 val 531

<211> 83 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC45398 216 <400> 68 ggccaaagat gccttagaag agtcgcttct gctgaaggac tccaggtgcc actcccgcct 60 cttccccagg acctgggacc tga 83 <210> 69 <211> 83 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC45397 <4 0 0> 69 gctgcctcag gtcccaggtc ctggggaaga ggcgggagtg ggacctgcag tccttcagca 60 gaagcgactc ttctaaggca tct 83 <210> 70 <211> 83 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleotideo iniciador ZC45396 <400> 70 agatgcctta gaagagtcgc ttctgctgaa ggactgcagg tcccactccc gcctcttccc 60 caggacctgg gacctgaggc age 83

<210> 71 <211> 1013 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS 217 <222> (14) ... (991) <400> 71 49 ccagcgtccg tcc atg gcg tgg age ctt ggg age tgg ctg ggt ggc tgc Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys 15 10 97 ctg ctg gtg tea gea ttg gga atg gta cca cct ccc gaa aat gtc aga Leu Leu Vai Ser Ala Leu Gly Met Vai Pro Pro Pro Glu Asn Vai Arg 15 20 25 atg aat tet gtt aat ttc aag aac att cta cag tgg gag tea cct gct Met Asn Ser vai Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gin Trp Glu Ser Pro Ala 30 35 40 145 218 ttt gcc aaa ggg aac ctg act ttc aca gct cag tac cta agt tat agg 193 Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gin Tyr Leu Ser Tyr Arg 45 50 55 60 ata ttc caa gat aaa tgc atg aat act acc ttg acg gaa tgt gat ttc 241 Ile Phe Gin Asp Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe 65 70 75 tca agt ctt tcc aag tat ggt gac cac acc ttg aga gtc agg gct gaa 289 Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu 80 85 90 ttt gca gat gag cat tca gac tgg gta aac ate acc ttc tgt cct gtg 337 Phe Ala Asp Glu His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro val 95 100 105 gat gac acc att att gga ccc cct gga atg caa gta gaa gta ctt gct 385 Asp Asp Thr ile ile Gly Pro Pro Gly Met Gin val Glu vai Leu Ala 110 115 120 gat tct tta cat atg cgt ttc tta gcc cct aaa att gag aat gaa tac 433 Asp Ser Leu His Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr 125 130 135 140 gaa act tgg act atg aag aat gtg tat aac tca tgg act tat aat gtg 481 Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val 145 150 155 caa tac tgg aaa aac ggt act gat gaa aag ttt caa att act ccc cag 529 Gin Tyr Trp Lys Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gin Ile Thr Pro Gin 160 165 170 tat gac ttt gag gtc ctc aga aac ctg gag cca tgg aca act tat tgt 577 Tyr Asp Phe Glu Vai Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys 175 180 185 gtt caa gtt cga ggg ttt ctt cct gat cgg aac aaa gct ggg gaa tgg 625 vai Gin vai Arg Giy Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp 190 195 200 agt gag cct gtc tgt gag caa aca acc cat gac gaa acg gtc ccc tcc 673 Ser Glu Pro vai Cys Glu Gin Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser 205 210 215 220 tgg atg gtg gcc gtc ate ctc atg gcc teg gtc ttc atg gtc tgc ctg 721 Trp Met vai Ala Vai Ile Leu Met Ala Ser val Phe Met val Cys Leu 225 230 235 gca ctc ctc ggc tgc ttc tcc ttg ctg tgg tgc gtt tac aag aag aca 769 Ala Leu Leu Gly Cys Phe Ser Leu Leu Trp Cys val Tyr Lys Lys Thr 240 245 250 aag tac gcc ttc tcc cct agg aat tct ctt cca cag cac ctg aaa gag 817 Lys Tyr Ala Phe Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gin His Leu Lys Glu 255 260 265 219 ttt ttg ggc cat cct cat cat aac aca ctt ctg ttt ttc tcc ttt cca 865 Phe Leu Gly His Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro 270 275 280 ttg tcg gat gag aat gat gtt ttt gac aag cta agt gtc att gea gaa 913 Leu Ser Asp Glu Asn Asp Vai Phe Asp Lys Leu Ser vai ile Ala Glu 285 290 295 300 gac tct gag age ggc aag cag aat cct ggt gac age tgc age etc ggg 961 Asp Ser Glu Ser Gly Lys Gin Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly 305 310 315 acc ccg cct ggg cag ggg ccc caa age tag gctctgagaa ggaaacacac 1011 Thr Pro Pro Gly Gin Gly Pro Gin Ser * 320 325 tc 1013

<210> 72 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC40922 <400> 72 tccagggaat tcatataggc cggccaccat ggctgcagct tggaccgtg 49

<210> 73 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleotideo iniciador ZC43153 <400> 73 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagactattt ttaggtggac 60 tcagggtggg t 71 220 220 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <221> <222> <221> <222> <223> <4 0 0> 74 546

ADN

Sequência artificial C15X mutante da IL-29 CDS (1) . . . (546)

variação (44) ... (45) n = A, G, T, ou C 74

Asnl69 221 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn cac 48 Gly Pro val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Set Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg aay ctg tgt ctg aga acg tea acc 528 ASp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 75 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial 222 <220> <221> VARIANTE <222> (15)...(15) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C15X mutante da IL-29, Asnl69 <400> 75

Gly Pro val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His l 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 val Arg Glu Arg pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 Hls Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 HiS Pro Glu Ser Thr 180

<210> 76 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C16X mutante da Met IL29, Asnl70 <221> CDS <222> (1)...(549) 223 <221> variação <222> (47)...(48) <223> η = A, Τ, G, ou C <400> 76 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn 48 Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 HiS Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 gac cag CCC ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac etc aaa tat gtg gee gat ggg aay ctg tgt ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180 224

<210> 77 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <221> VARIANTE <222> (16)...(16) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C16X mutante da Met IL29, Asnl70 <400> 77

Met Gly Pro val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180 <210> 78

<211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial 225 <220> <223> C15X mutante da IL2 9 <221> CDS <222> (1)...(546) <221> variação <222> (44) ... (45) <223> n = A, T, G, ou C <4 0 0> 78

Aspl69 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn cac 48 Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa HiS 1 5 10 15 att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag 192 Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 226 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His lie Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac 384 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Fhe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac ctc aaa tat gtg gee gat ggg gay ctg tgt ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lya Tyr vai Ala Asp Gly Asp Leu Cy3 Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr *· 180

<210> 79 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> C15X mutante da IL29, Aspl69 <221> VARIANTE <222> (15) ... (15) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 79 227

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg ASp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu ASp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125

His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140

Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160

Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175

His Pro Glu Ser Thr 180 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn Met Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc HiS ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac tgg Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc Ser Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gee Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 48 96 144 192 240 288 336 384 228

<210> 80 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> C16X mutante da Met IL29, Aspl70 <221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> (47)...(48)

<223> n = A, T, G, ou C <400> 80 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg gay ctg tgt ctg aga acg tca 528 Arg Asp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 81 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> C16X mutante da Met IL29, Aspl70 229 <221> VARIANTE <222> (16)...(16) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 81

Met Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 82 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Aspl69 mutante da IL29, C171X <221> CDS <222> (1)...(546) <221> variação <222> (512)...(513)

<223> n = A, T, G, ou C 230 <400> 82 ggc cct gtc ccc act tcc aag CCC acc aca act ggg aag ggc tgc cac 48 Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys HÍS 1 5 10 15 att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 ca c tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc açg cg a 480 Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg gay ctg dnn ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 83 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial 231 <22 0>

<223> Aspl69 mutante da IL29, C171X <221> VARIANTE <222> (171) ... (171) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 83

Gly Pro val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu HiS His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Aen Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 HiS Pro Glu Ser Thr 180

<210> 84 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Aspl70 mutante da Met IL29, C172X <221> CDS <222> (1)...(549) 232

<221> variação <222> (515)...(516) <223> η = A, Τ, G, ou C <400> 84 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc 48 Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg 144 Ly3 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc 384 Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 4 32 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac etc aaa tat gtg gee gat ggg gay ctg dnn ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180 233

<210> 85 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> Aspl70 mutante da Met IL29, C172X <221> VARIANTE <222> (172) ... (172)

Vai, ou Asn <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, <400> 85

Met Gly Pro val Pro Thr Ser Lys 1 5 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu 20 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu 35 40 Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro 50 55 Gin val Arg Glu Arg Pro Val Ala 65 70 Leu Lys val Leu Glu Ala Ala Ala 85 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His 100 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala 115 120 His HiS Trp Leu His Arg Leu Gin 130 135 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr 145 150 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp 165 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

Pro Thr 10 Thr Thr Gly Lys Gly 15 Cys Ser 25 Pro Gin Glu Leu Ala 30 Ser Phe Glu Ser Leu Lys Leu 45 Lys Asn Trp Gly Asn Trp Asp 60 Leu Arg Leu Leu Leu Glu Ala 75 Glu Leu Ala Leu Thr 80 Gly Pro 90 Ala Leu Glu Asp Val 95 Leu His 105 Ile Leu Ser Gin Leu 110 Gin Ala Gly Pro Arg Pro Arg 125 Gly Arg Leu Glu Ala Pro Lys 140 Lys Glu Ser Ala Phe Asn Leu 155 Phe Arg Leu Leu Thr 160 Gly Asp 170 Leu xaa Leu Arg Thr 175 Ser

<210> 86 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial 234 234 <22 0> <223> T10P mutante da IL2 9 <221> CDS <222> (1) . . . (546) <221> vari ação <222> (512 )...(513) 1 <223> n = . A, T, G, ou C <4 0 0> 86

Cl 7IX ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc ccn act ggg aag ggc tgc cac 48

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys His 15 10 15 235 att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc Ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag CCC aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cg a 480 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180 <210> 87 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> T10P mutante da IL29

Asnl69, C171X 236 <221> VARIANTE <222> (171) ... (171) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 87

Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys His 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 HiS Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 14 5 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175

His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 88 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> T11P mutante da Met IL29, Asnl70, C172X <221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> (515)...(516)

<223> n = A, T, G, ou C 237 <400> 88 atg ggc cct gtc cce act tcc aag ccc acc ccn act ggg aag ggc tgc 48 Met 1 Gly Pro vai Pro 5 Thr Ser Lys Pro Thr 10 Pro Thr Gly Lys Gly 15 Cys cac att ggc agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tct cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Gin vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gee 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tct gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac ctc aaa tat gtg gee gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tca 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 89 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial 238 <22 0> <223> Τ11Ρ mutante da Met IL2 9, Asnl7 0, <221> VARIANTE <222> (172) ... (172) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 89

Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Sei: Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 90 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Τ10Ρ mutante da IL29, C15X, Asnl69 <221> CDS 239 <222> (1) . . . (546) <221> variação <222> 30, 44, 45 <223> η = A, Τ, G <4 0 0> 90 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc ccn act ggg aag ggc dnn cac 48 Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 iie Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag 192 Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 240 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu HiS Thr Leu His His He Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac 384 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 14 5 150 155 160 gac ctc aaa tat gtg gee gat ggg aay ctg tgt ctg aga acg tea acc 528 ASp Leu Lys Tyr Vai Ala Ãsp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180 <210> 91 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> T10P mutante da IL29, C15X, Asnl69 <221> VARIANTE <222> (15) ... (15) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 91 241 241 Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly A$n Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 ASp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175

His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 92 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> T11P mutante da Met IL29, C16X, Asnl70

<221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> 33, 47, 48

<223> n = A, T, G, ou C 92 <4 0 0> 242 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc Met Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro 1 5 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser 20 25 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu 35 40 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg Ser Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly 50 55 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg Gin val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu 65 70 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc Leu Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly 85 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His 100 105 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly 115 120 cac cac tgg O rt cac cgg etc cag gag

His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu 130 135 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe 145 150 cga gac etc aaa tat gtg gee gat ggg Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly 165 acc cac cct gag tcc acc tga Thr His Pro Glu Ser Thr * 180 acc ccn act ggg aag ggc dnn 48 Thr 10 Pro Thr Gly Lys Gly Xaa 15 cca cag gag cta gcg age ttc 96 Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 30 tea etc aag ctg aaa aac tgg 144 Ser Leu Lys Leu 45 Lys Asn Trp aat tgg gac ctg agg ctt etc 192 Asn Trp Asp 60 Leu Arg Leu Leu gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Glu Ala 75 Glu Leu Ala Leu Thr 80 cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Pro 90 Ala Leu Glu Asp Val Leu 95 ate etc tcc cag etc cag gee 336 Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 110 ccc agg ccc cgg ggc ege etc 384 Pro Arg Pro Arg 125 Gly Arg Leu gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 Ala Pro Lys 140 Lys Glu Ser Ala aac etc ttc ege etc etc acg 480 Asn Leu 155 Phe Arg Leu Leu Thr 160 aay ctg tgt ctg aga acg tea 528 Asn 170 Leu Cys Leu Arg Thr Ser 175

<210> 93 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial 549 243 <22 0> <223> Τ11Ρ mutante da Met IL29, C16X, Asnl70 <221> VARIANTE <222> (16)...(16) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 93

Met Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 HiS Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin val Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 94 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> T10P mutante da IL29, Aspl69, C171X <221> CDS <222> (1)...(546) 244 <221> variação <222> : 30, 512 , 513 <223> η = A, T, i G, ou C <40 0> 94 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro 1 5 att ggc agg ttc aaa tet ctg tea Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser 20 aag gee agg gac gee ttg gaa gag Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu 35 40 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly 50 55 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu 65 70 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly 85 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac Gin Pro Leu His Thr Leu His His 100 ate cag cct cag ccc aca gea ggg He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly 115 120 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag HiS Trp Leu His Arg Leu Gin Glu 130 135 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe 145 150 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly 165 cac cct gag tcc acc tga His Pro Glu Ser Thr * 180 acc ccn act ggg aag ggc tgc cac 48 Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys HiS 10 15 cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 25 30 tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 45 aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 60 gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 75 80 cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 90 95 ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 He Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 105 110 ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 125 gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 140 aac etc ttc ege etc etc acg cga 480 Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 155 160 gay ctg dnn ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 170 * 175 546 245

<210> 95 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Τ10Ρ mutante da IL29, Aspl69, C171X <221> VARIANTE <222> (171) . . . (171) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 95

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys HiS 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 HiS Pro Glu Ser Thr 180

<210> 96 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 246

<223> Τ11Ρ mutante da Met IL29, Aspl70, C172X <221> CDS <222> (1)...(549)

<221> variação <222> 33, 515, 516 <223> n = A, T, G, ou C <400> 9 6 247 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc ccn act ggg aag ggc tgc 48 Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gee 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc 384 Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly n O Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His rrp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac ctc aaa tat gtg gee gat ggg gay ctg dnn ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly ASp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr *

ISO

<210> 97 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> T11P mutante da Met IL29, Aspl70, C172X 248 <221> VARIANTE <222> (172) . . . (172) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 97

Met Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg ASp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu HiS Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 98 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> T10P mutante da IL29, C15X, Aspl69 <221> CDS <222> (1)...(546) <221> variação <222> 30, 44, 45

<223> n = A, T, G, ou C 249 249 <4Ο0> 98 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc ccn act ggg aag ggc dnn cac 48 Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly xaa HiS 1 5 10 15 att ggc agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 He Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tca etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tct cct gtc ttc CCC ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His HÍS Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tct gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 14 5 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg gay ctg tgt ctg aga acg tca acc 528 ASp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 54 6 His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 99 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 250 <223> T10P mutante da IL2 9, C15X, Aspl69 <221> VARIANTE <222> (15) ... (15) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 99

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 m >1 Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr vai Ala ASp Gly ASp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 HiS Pro Glu Ser Thr 180

<210> 100 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> T11P mutante da Met IL29, C16X, Aspl70 <221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> 33, 47, 48 251

<223> η = A, Τ, G, ou C <400> 100 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc ccn act ggg aag ggc dnn 4S toet Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg ASp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp ASp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His lie Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cg a gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg gay ctg tgt ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu ser Thr * 180

<210> 101 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial 252 <220> <223> Τ11Ρ mutante da Met IL2 9, C16X, Aspl70 <221> VARIANTE <222> (16) . . . (16) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 101

Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Pro Thr Gly Lys Gly xaa 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Fhe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 102 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> G18D mutante da IL29, Asnl69, C171X <221> CDS <222> (1)...(546) 253 <221> variação <222> (512 ) . . . (513) <223> η = A, T, ( 3, ou C <40ο> : 102 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His 1 5 10 15 att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag rie Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc CCC ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg Vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt eac acc ctg cac cac ate etc tcc cag ctc cag gcc tgt Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 48 96 144 192 240 288 336 254 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac 384 ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac ctc aaa tat gtg gee gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala ASp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 103 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> G18D mutante da IL29, Asnl69, C171X <221> VARIANTE <222> (171) ... (171) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 103 255

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys HiS 1 5 10 15 Ele Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tye val Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 104 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> G19D mutante da Met IL29, Asnl70, C172X <221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> (515)...(516) <223> n = A, T, G, ou C <400> 104 256 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag CCC acc aca act ggg aag ggc tgc 48 Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 cac att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc 192 Ser Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gee 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac ctc aaa tat gtg gee gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 105 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> G19D mutante da Met IL29, Asnl70, C172X 257 <221> VARIANTE <222> (172) ... (172)

Vai, ou Asn <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, <400> 105

Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys 1 5 His He Asp Arg Phe Lys Ser Leu 20 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu 35 40 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro 50 55 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala 65 70 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala 85 ASp Gin Pro Leu His Thr Leu His 100 Cys rie Gin Pro Gin Pro Thr Ala 115 120 His His Trp Leu His Arg Leu Gin 130 135 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr 145 150 Arg Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp 165 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

Pro Thr 10 Thr Thr Gly Lys Gly Cys 15 Ser 25 Pro Gin Glu Leu Ala Ser 30 Phe Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn 45 Trp Gly Asn Trp Asp 60 Leu Arg Leu Leu Leu Glu Ala 75 Glu Leu Ala Leu Thr 80 Gly Pro 90 Ala Leu Glu Asp Val 95 Leu His 105 He Leu Ser Gin Leu Gin ' 110 Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 125 Glu Ala Pro Lys 140 Lys Glu Ser Ala Phe Asn Leu 155 Phe Arg Leu Leu Thr 160 Gly Asn 170 Leu xaa Leu Arg Thr 175 Ser <210> 106 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C15X mutante da IL29 <221> CDS <222> (1) . . . (546) <221> variação <222> (44) ... (45) G18D, Asnl69 258

<223> η = A, Τ, G, ou C <4 0 0> 106 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn cac 48 Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 He Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu Asp 85 90 95 cag cec ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg aay ctg tgt ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180 259

<210> 107 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> C15X mutante da IL29, G18D, Asnl69 <221> VARIANTE <222> (15)...(15) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 0 0> 107

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 HiS Pro Glu Ser Thr 180

<210> 108 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 260 <223> C16X mutante da Met IL29, G19D, Asnl70 <221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> (47)...(48)

<223> n = A, T, G, ou C <4 0 0> 108 261 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn 48 Met Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa 1 5 10 15 cac att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg 240 Gin Val Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac etc aaa tat gtg gee gat ggg aay ctg tgt ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 109 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 262 <223> C16X mutante da Met IL29, G19D, Asnl70 <221> VARIANTE <222> (16)...(16) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 109

Met Gly Pro vai Pro Thr Ser Lys 1 5 His Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu 20 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu 35 40 Set Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro 50 55 Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala 65 70 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala 85 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His 100 Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala 115 120 His His Trp Leu His Arg Leu Gin 130 135 Gly Cys Leu Glu Alã Ser Vai Thr 145 150 Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp 165 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

Pro Thr 10 Thr Thr Gly Lys Gly 15 xaa Ser 25 Pro Gin Glu Leu Ala 30 Ser Phe Glu Ser Leu Lys Leu 45 Lys Asn Trp Gly Asn Trp Asp 60 Leu Arg Leu Leu Leu Glu Ala 75 Glu Leu Ala Leu Thr 80 Gly Pro 90 Ala Leu Glu Asp Vai 95 Leu His 105 Ile Leu Ser Gin Leu 110 Gin Ala Gly Pro Arg Pro Arg 125 Gly Arg Leu Glu Ala Pro Lys 140 Lys Glu Ser Ala Phe Asn Leu 155 Phe Arg Leu Leu Thr 160 Gly Asn 170 Leu Cys Leu Arg Thr 175 Ser <210> 110 <211> 546 <212> ADN <213> qSequência artificial <22 0> <223> G18D mutante da IL29, <221> CDS <222> (D . . . (546)

Aspl69, Cl7IX 263

<221> variação <222> (512)...(513) <223> η = A, Τ, G, ou C <400> 110 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act 999 aag ggc tgc cac 48 Gly Pro val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His 1 5 10 15 att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta 9 cg age ttc aag 96 Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 >1 Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc 999 aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea 999 ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu HiS Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat 999 gay ctg dnn ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr 180 264 <210> 111 <211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> G18D mutante da IL2 9, • Aspl69, . C171X <221> VARIANTE <222> (171) . . . (1 71) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 0 0> 111

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His 15 10 15

Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30

Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg GlU Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 112 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial 265 <22 0>

<223> G19D mutante da Met IL29, Aspl70, C172X <221> CDS <222> (1)...(549) <221> variação <222> (515) ... (516)

<223> n = A, T, G, ou C <400> 112 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc 48 Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 cac att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Asp Arg Fhe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 266 ggc cca gee ctg gag gac gtc cta 288 Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu 90 95 cac ate etc tcc cag etc cag gee 336 His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 105 110 999 ccc agg ccc cgg ggc ege etc 384 Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 125 gag gee ccc aaa aag gag tcc gct 432 Glu Ala Pro Lys Lys 140 Glu Ser Ala ttc aac etc ttc ege etc etc acg 480 Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 155 160 999 gay ctg dnn ctg aga acg tea 528 Gly Asp Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 170 175 549 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct Leu Lys Vai Leu Glu 85 Ala Ala Ala gac cag ccc ctt cac acc ctg cac Asp Gin PíO Leu 100 His Thr Leu His tgt ate cag cct cag ccc aca gea Cys Ile Gin 115 Pro Gin Pro Thr Ala 120 cac cac tgg ctg cac cgg etc cag His His 130 Trp Leu His Arg Leu 135 Gin ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc Gly Cys 145 Leu Glu Ala Ser 150 Vai Thr cga gac etc aaa tat gtg gee gat Arg Asp Leu Lys Tyc 165 Vai Ala Asp acc cac cct gag tcc acc tga The His Pro Glu 180 Ser Thr ★

<210> 113 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> G19D mutante da Met IL2 9, Aspl70, <221> VARIANTE <222> (172) . . . (172) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 Ο 0> 113 267

Met Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His lie ASp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Set Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His He Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110

Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

<210> 114 <211> 546 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> C15X mutante da IL29, G18D, Aspl69 <221> CDS <222> (1)...(546) <221> variação <222> (44)...(45) <223> η = A, Τ, G, ou C <4 0 0> 114 268 ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn cac 48 Gly Pro val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 att gay agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag 96 Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt 144 Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag 192 Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 gtg agg gag ege cct gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg 240 vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac 288 Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 cag cec ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt 336 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac 384

Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc 432 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cga 480 Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 gac etc aaa tat gtg gee gat ggg gay ctg tgt ctg aga acg tea acc 528 Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 cac cct gag tcc acc tga 546 His Pro Glu Ser Thr * 180 <210> 115

<211> 181 <212> PRT <213> Sequência artificial 269 <220> <223> C15X mutante da IL29, G18D, Aspl69 <221> VARIANTE <222> (15)...(15) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 115

Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Xaa His 1 5 10 15 Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys 20 25 30 Lye Ala Arg ASp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser 35 40 45 Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin 50 55 60 Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu 65 70 75 80 Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp 85 90 95 Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys 100 105 110 Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His 115 120 125 His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly 130 135 140 Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg 145 150 155 160 Asp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser Thr 165 170 175 HÍS Pro Glu Ser Thr 180

<210> 116 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C16X mutante da Met IL29, G19D, Aspl70 <221> CDS <222> (1)... (549) 270 <221> variação <222> (47) ... (48) <223> η = A, Τ, G, ou C <400> 116 atg ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc dnn 48 Met Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly xaa 1 5 10 15 cac att gay agg ttc aaa tet ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Asp Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc 192 Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc 336 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc 384 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct 432 HiS His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 L35 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg gay ctg tgt ctg aga acg tca Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asp Leu Cys Leu Arg Thr Ser 165 170 175 528 acc cac cct gag tcc acc tga Thr His Pro Glu Ser Thr * 180 549 271

<210> 117 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> C16X mutante da Met IL29, G19D, Aspl70 <221> VARIANTE <222> (16)...(16)

Vai, ou Asn <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, <400> 117

Met Gly Pro vai Pro Thr Ser n >1 μι 1 5 His He Asp Arg Phe Lys Ser Leu 20 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu 35 40 Ser Cys Ser Ser Pro val Phe Pro 50 55 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala 65 70 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala 85 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His 100 Cys rie Gin Pro Gin Pro Thr Ala 115 120 His His Trp Leu His Arg Leu Gin 130 135 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr 145 150 Arg Asp Leu Lys Tyr val Ala Asp 165 Thr His Pro Glu Ser Thr 180

Pro Thr 10 Thr Thr Gly Lys Gly Xaa 15 Ser 25 Pro Gin Glu Leu Ala 30 Ser Phe Glu Ser Leu Lys Leu 45 Lys Asn Trp Gly Asn Trp Asp 60 Leu Arg Leu Leu Leu Glu Ala 75 Glu Leu Ala Leu Thr 80 Gly Pro 90 Ala Leu Glu Asp Val 95 Leu His 105 Ile Leu Ser Gin Leu 110 Gin Ala Gly Pro Arg Pro Arg 125 Gly Arg Leu Glu Ala Pro Lys 140 Lys Glu Ser Ala Phe Asn Leu 155 Phe Arg Leu Leu Thr 160 Gly Asp 170 Leu Cys Leu Arg Thr 175 Ser

<210> 118 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência artificial 272 <220> <223> Sinal sequência <221> CDS <222> (1)...(57) <400> 118 atg gct gca gct tgg acc gtg gtg ctg gtg act ttg gtg cta ggc ttg 48

Met Ala Ala Ala Trp Thr Vai Vai Leu Vai Thr Leu Vai Leu Gly Leu 15 10 15 gcc gtg gca 57

Ala vai Ala <210> 119 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sinal sequência <4 0 0> 119

Met Ala Ala Ala Trp Thr vai Vai Leu Vai Thr Leu vai Leu Gly Leu 15 10 15

Ala vai Ala <210> 120 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sinal sequência <221> CDS <222> (D . . . (66) 273 <400> 120 atg gtg ccc acc aca ttg gct tgg acc gtg gtg ctg gtg act ttg gtg 48

Met Val Pro Thr Thr Leu Ala Trp Thr Vai Vai Leu Vai Thr Leu Vai 15 10 15 cta ggc ttg gcc gtg gca 66

Leu Gly Leu Ala val Ala 20 <210> 121 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sinal sequência <4 0 0> 121

Met Val Pro Thr Thr Leu Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val 15 10 15

Leu Gly Leu Ala val Ala 20

<210> 122 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> C48S da IL-28B <221> CDS <222> (1)...(528) <221> variação <222> (143)...(144)

<223> n = A, T, G, ou C 274 <400> 122 gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc tgc 48 Vai Pro val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc ttt 96 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac dnn 144 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Xaa 35 40 45 aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg 192 Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg ggg gat 288 Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag ctc 336 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg ggc 384 Arg Ala Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 cgc ctc cac cat tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag 432 Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc 480 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc tga 528 Leu Thr Arg ASp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys val * 165 170 175

<210> 123 <211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial 275 <220> <221> VARIANTE <222> (48) ... (48) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn

<223> C48S da IL-28B

<4oo> : 123 Val Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 Hls Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Xaa 35 40 45 Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His lie Leu Ser Gin Leu 100 105 110 Arg Ala Cys rie Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <2io> : 124 <211> ! 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> C49S da Met IL-28B <221> CDS <222> (1)...(531) <221> variação <222> (146)...(147)

<223> n = A, T, G, ou C 276 <400> 124 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc 48 Met vai Pro Vai Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc 96 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt. aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac 144 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 dnn aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc CCC agg acc tgg gac ctg agg cag 192 xaa Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg ggg 288 Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Asp Vai Leu ASp Gin Pro Leu His Thr Leu HiS His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 ctc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea 99 g ccc agg acc cgg 384 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag 432 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc 480 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 14S 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age 999 gac ctg tgt gtc 528 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 tga 531

<210> 125 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 277 <221> VARIANTE <222> (49) . . . (49)

<223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C49S da Met IL-28B <400> 125

Met vai Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys HÍS iie Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 xaa Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 Asp val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 Leu Arg Ala Cys lie Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys val 165 170 175

<210> 126 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> C50S da IL-28B

<221> CDS <222> (1)...(528) <221> variação <222> (149)...(150)

<223> n = A, T, G, ou C 27 <400> 126 gtt CCt gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc tgc 48 vai Pro Vai Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc ttt 96 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac tgc 144 Lys Arg Ala Lys ASp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys 35 40 45 aag dnn cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg 192 Lys xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg ggg gat 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag ctc 336 Vai Leu Asp Gin Pro Leu HiS Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 cgg gcc tgt ate cag CCt cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg ggc 384 Arg Ala Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 cgc ctc cac cat tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag 432 Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 tcc CCt ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc 480 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc tga 528 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Vai Ala Ser Gly Asp Leu Cys Vai * 165 Π0 175

<210> 127 <211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 279 <221> VARIANTE <222> (50) . . . (50)

<223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C50S da IL-28B <4 0 0> 127 vai Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 HiS lie Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys 35 40 45 Lys Xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His HiS Ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 Arg Ala Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 Arg Leu HiS HiS Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <210> 128 <211> 531 <212> ADN Λ cn \—1 CM V Sequência artifici <22 0> <223> C51S da Met IL-28B <221> CDS <222> (D · · · (531) <221> variação <222> (152)...(153) 280

<223> η = A, Τ, G, ou C <400> 128 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gca agg ggc 48 Met Vai Pro val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tct cca cag gag ctg cag gcc 96 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag tcg ctt ctg ctg aag gac 144 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 tgc aag dnn cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag 192 Cys Lys Xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc acc gct gac act gac cca gcc ctg 999 288 Thr Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Asp val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 ctc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gca 999 ccc agg acc cgg 384 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag 432 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc 480 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age 999 gac ctg tgt gtc 528 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 tga 531 *

<210> 129 <211> 176 <212> PRT 281 <213> Sequência artificial <220> <221> VARIANTE <222> (51) ... (51) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C51S da Met IL-28B <4 0 0> 129

Met Val Pro val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys His ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 Cys Lys Xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys val Leu Glu Ala Thr Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 Asp Vai Leu ASp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175 <210> 130 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> IL-28B C48S T87S H135Y <221> CDS <222> (D ... (528) 282 <221> variação <222> 143, 144, 261 <223> η = A, Τ, G, ou C <400> 130 gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc tgc 48 vai Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc ttt 96 His ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac dnn 144 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp xaa 35 40 45 aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg 192 Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtt ctg gag gcc wsn gct gac act gac cca gcc ctg ggg gat 288 Leu Lys val Leu Glu Ala Xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag ctc 336 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg ggc 384 Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 cgc ctc cac cat tgg ctg tay cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag 432 Acg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac etc ttc cgc ctc 480 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc tga 528 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys val * 165 170 175

<210> 131 <211> 175 <212> PRT 283 <213> Sequência artificial <22 0> <221> VARIANTE <222> (48)... 48) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <221> VARIANTE <222> (87) ... (87) <223> Xaa = Ser

<223> IL-28B C48S T87S H135Y <4 0 0> 131

Val Pro val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 His lie Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Xaa 35 40 45 Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Val Leu Glu Ala Xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175

<210> 132 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 284 <223> Met IL-28B C49S T88S <221> CDS <222> (1)...(531) <221> variação <222> 146, 147, 264 <223> η = A, Τ, G, ou C <4 0 0> 132 48 285 48 285 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc Met Vai Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc Cys His Xle Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 dnn aag tgc cgc tcc cgc ctc ttc CCC agg acc tgg gac ctg agg cag Xaa Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 ctg cag gtg agg gag cgc CCC gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg Leu Gin val Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtt ctg gag gcc wsn gct gac act gac cca gcc ctg ggg Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 gat gtc ttg gac cag CCC Ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag Asp val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His HiS ile Leu Ser Gin 100 105 110 ctc cgg gcc tgt ate cag cct cag CCC acg gea ggg CCC agg acc cgg Leu Arg Ala Cys rie Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 ggc cgc ctc cac cat tgg ctg tay cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly Asp Leu Cys val 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 165 170 175 tga *

<210> 133 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 531 286 <221> VARIANTE <222> (49) . . . (49) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <221> VARIANTE <222> (88) ... (88) <223> Xaa = Ser

<223> Met IL-28B C49S T88S H136Y <4 0 0> 133

Met Vai Pro Vai Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys His lie Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 Xaa Lys Cys Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin 100 105 110 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu HiS His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys val 165 170 175

<210> 134 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> IL-28B C50S T87S H135Y

<221> CDS <222> (1)...(528) 287 <221> variação <222> 149, 150, 261 <223> η = A, Τ, G, ou C <4 0 0> 134 gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gea agg ggc tgc 48 Val Pro Val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc ttt 96 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe 20 25 30 aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac tgc 144 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys 35 40 45 aag dnn cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag ctg 192 Lys Xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp ASp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtt ctg gag gcc wsn gct gac act gac cca gcc ctg ggg gat 288 Leu Lys Val Leu Glu Ala Xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag ctc 336 Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg ggc 384 Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 11S 120 125 cgc ctc cac cat tgg ctg tay cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag gag 432 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc 480 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc tga 528 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys Val Ala Ser Gly ASp Leu Cys Val * 165 170 175

<210> 135 <211> 175 <212> PRT 288 <213> Sequência artificial <22 0> <221> VARIANTE <222> (50) . . . (50) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <221> VARIANTE <222> (87)...(87) <223> Xaa = Ser

<223> IL-28B C50S T87S H135Y <400> 135

Vai Pro vai Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala Phe .20 25 30 Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp Cys 35 40 45 Lys xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly Asp 85 90 95 Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu HÍ3 His Ile Leu Ser Gin Leu 100 105 110 Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg Gly 115 120 125 Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu 130 135 140 Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175

<210> 136 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> 289 <223> Met IL-28B C51S T88S H136Y <221> CDS <222> (1)...(531) <221> variação <222> 152, 153, 264 <223> n = A, T, G, ou C <4 0 0> 136 atg gtt cct gtc gcc agg ctc cgc ggg gct ctc ccg gat gca agg ggc 48

Met Vai Pro Vai Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 15 10 15 290 tgc cac ata gcc cag ttc aag tcc ctg tet cca cag gag ctg cag gcc 96 Cys His Ile Ala 20 Gin Phe Lys Ser Leu 25 Ser Pro Gin Glu Leu 30 Gin Ala ttt aag agg gcc aaa gat gcc tta gaa gag teg ctt ctg ctg aag gac 144 Phe Lys Arg 35 Ala Lys Asp Ala Leu 40 Glu Glu Ser Leu Leu 45 Leu Lys Asp tgc aag dnn cgc tcc cgc ctc ttc ccc agg acc tgg gac ctg agg cag 192 Cys Lys 50 Xaa Arg Ser Arg Leu 55 Phe Pro Arg Thr Trp 60 Asp Leu Arg Gin ctg cag gtg agg gag cgc ccc gtg gct ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu 65 Gin Vai Arg Glu Arg 70 Pro vai Ala Leu Glu 75 Ala Glu Leu Ala Leu Ô0 acg ctg aag gtt ctg gag gcc wsn gct gac act gac cca gcc ctg ggg 288 Thr Leu Lys Vai Leu 85 Glu Ala Xaa Ala Asp 90 Thr Asp Pro Ala Leu 95 Gly gat gtc ttg gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cat ate ctc tcc cag 336 Asp vai Leu Asp 100 Gin Pro Leu His Thr 105 Leu His His ile Leu 110 Ser Gin ctc cgg gcc tgt ate cag cct cag ccc acg gea ggg ccc agg acc cgg 384 Leu Arg Ala 115 Cys Ile Gin Pro Gin 120 Pro Thr Ala Gly Pro 125 Arg Thr Arg ggc cgc ctc cac cat tgg ctg tay cgg ctc cag gag gcc cca aaa aag 432 Gly Arg 130 Leu HiS His Trp Leu 135 Tyr Arg Leu Gin Glu 140 Ala Pro Lys Lys gag tcc cct ggc tgc ctc gag gcc tet gtc acc ttc aac ctc ttc cgc 480 Glu 145 Ser Pro Gly Cys Leu 150 Glu Ala Ser Val Thr 155 Phe Asn Leu Phe Arg 160 ctc ctc acg cga gac ctg aat tgt gtt gcc age ggg gac ctg tgt gtc 528 Leu Leu Thr Arg Asp 165 Leu Asn Cys Vai Ala 170 Ser Gly Asp Leu Cys 175 Val tga 531

<210> 137 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <221> VARIANTE <222> (51) ... (51) <223> Xaa = Ser, Ala,

Thr,

Vai ou Asn 291 <221> VARIANTE <222> (88) ... (88) <223> Xaa = Ser <223> Met IL-28B C51S T88S Η136Υ <400> 137

Met Vai Pro val Ala Arg Leu Arg Gly Ala Leu Pro Asp Ala Arg Gly 1 5 10 15 Cys His Ile Ala Gin Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Gin Ala 20 25 30 Phe Lys Arg Ala Lys Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Leu Leu Lys Asp 35 40 45 Cys Lys xaa Arg Ser Arg Leu Phe Pro Arg Thr Trp Asp Leu Arg Gin 50 55 60 Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala xaa Ala Asp Thr Asp Pro Ala Leu Gly 85 90 95 Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 Leu Arg Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Thr Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu Tyr Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Pro Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Asn Cys val Ala Ser Gly Asp Leu Cys Val 165 170 175

<210> 138 <211> 543 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C170X da IL-29, truncado depois de Metionina e

Glicina no N-terminal <221> variação <222> (509) ... (510)

<223> n = A, T, G, ou C 292 <221> CDS <222> (1)...(543) <400> 138 cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr 1 5 ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin 20 25 gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea ctc Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu 35 40 age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp 50 55 agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala 65 70 gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala 85 ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu 100 105 cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg 115 120 tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro 130 135 ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu 145 150 ctc aaa tat gtg gcc gat ggg aac ctg Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asn Leu 165 cct gag tcc acc tga Pro Glu Ser Thr * act ggg aag ggc tgc cac att 48 Thr Gly Lys Gly Cys His Ile 10 15 gag cta gcg age ttc aag aag 96 Glu Leu Ala Ser Phe 30 Lys Lys aag ctg aaa aac tgg agt tgc 144 Lys Leu Lys Asn 45 Trp Ser Cys gac ctg agg ctt ctc cag gtg 192 Asp Leu Arg 60 Leu Leu Gin Val gag ctg gcc ctg acg ctg aag 240 Glu Leu 75 Ala Leu Thr Leu Lys 80 ctg gag gac gtc cta gac cag 288 Leu 90 Glu Asp val Leu Asp 95 Gin tcc cag ctc cag gcc tgt ate 336 Ser Gin Leu Gin Ala 110 Cys Ile ccc cgg ggc ege ctc cac cac 384 Pro Arg Gly Arg 125 Leu His HiS aaa aag gag tcc gct ggc tgc 432 Lys Lys Glu 140 Ser Ala Gly Cys ttc ege ctc ctc acg cga gac 480 Phe Arg 155 Leu Leu Thr Arg Asp 160 dnn ctg aga acg tea acc cac 528 Xaa 170 Leu Arg Thr Ser Thr 175 His 543 180 293

<210> 139 <211> 180 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> VARIANTE <222> (170) ... (170) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C170X da IL-29, truncado depois de Metionina e

Glicina no N-terminal <400> 139

Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His ile 1 5 10 15 Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys 20 25 30 Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys 35 40 45 Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val 50 55 60 Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys 65 70 75 80 Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp Gin 85 90 95 Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile 100 105 110 Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His 115 120 125 Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys 130 135 140 Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp 145 150 155 160 Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr Ser Thr His 165 170 175 Pro Glu Ser Thr 180 <210> 140 <211> 540 294

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> icina <223> C169X da IL-29, truncado depois de Metionina, G1 e Prolina no N-terminal <221> variação <222> (506)...(507)

<223> n = A, T, G, ou C <221> CDS <222> (1)...(540) <4 0 0> 140 gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly 1 5 10 15 agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gcc Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala 20 25 30 agg gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser 35 40 45 tct cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val Arg 50 55 60 gag cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val 65 70 75 80 48 96 144 192 240 295 ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc 288 Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro 85 90 95 ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc tgt ate cag 336 Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys He Gin 100 105 110 cct cag ccc aca gca 999 ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac cac tgg 384 Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp 115 120 125 ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg 432 Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu 130 135 140 gag gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga gac ctc 480 Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu 145 150 155 160 aaa tat gtg gcc gat 999 aac ctg dnn ctg aga acg tea acc cac cct 528 Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro 165 170 175 gag tcc acc tga 540

Glu Ser Thr *

<210> 141 <211> 179 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> VARIANTE <222> (169) ... (169) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <223> C169X da IL-29, truncado depois de Metionina, Glicina e Prolina no N-terminal <400> 141 296

Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His ile Gly l 5 10 15 Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser 35 40 45 Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin vai Arg 50 55 60 Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Vai 65 70 75 80 Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro 85 90 95 Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin

Pro Gin Pro 100 Thr Ala Gly Pro Arg 105 Pro Arg Gly Arg Leu 110 His His Trp Leu His 115 Arg Leu Gin Glu Ala 120 Pro Lys Lys Glu Ser 125 Ala Gly Cys Leu Glu 130 Ala Ser Vai Thr Phe 135 Asn Leu Phe Arg Leu 140 Leu Thr Arg Asp Leu 145 Lys Tyr Vai Ala Asp 150 Gly Asn Leu 155 Xaa Leu Arg Thr Ser Thr HiS 160 Pro Glu Ser Thr 165 170 175

<210> 142 <211> 537 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C168X da IL-29, truncado depois de Metionina,

Glicina, Prolina e Valina no N-terminal <221> variação <222> (503)...(504)

<223> n = A, T, G, ou C <221> CDS <222> (1)...(537) <4 0 0> 142 297 ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg 48 Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His He Gly Arg 1 5 10 15 ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gcc agg 96 Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg 20 25 30 gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age tct 144 Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser 35 40 45 cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag 192 Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Vai Arg Glu 50 55 60 cgc cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg 240 Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys vai Leu 65 70 75 80 gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt 288 Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu 85 90 95 cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc tgt ate cag cct 336 His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys ile Gin Pro 100 105 110 cag ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc cgc ctc cac cac tgg ctg 384 Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu 115 120 125 cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag 432 His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu 130 135 140 gca tct gtc acc ttc aac ctc ttc cgc ctc ctc acg cga gac ctc aaa 480 Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg ASp Leu Lys 145 150 155 160 tat gtg gcc gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tca acc cac cct gag 528 Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu 165 170 175 tcc acc tga 537

Ser Thr * <210> 143 <211> 178

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C168X da IL-29, truncado depois de Metionina, 298

Glicina, Prolina e Valina no N-terminal <221> VARIANTE <222> (168) ... (168) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 0 0> 143

Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg 1 5 10 15 Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg 20 25 30 Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser 35 40 45 Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val Arg Glu 50 55 60 Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu 85 90 95 His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro 100 105 110 Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu 115 120 125 His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu 130 135 140 Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys 145 150 155 160 Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu 165 170 175

Ser Thr

<210> 144 <211> 534 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> C167X da IL-29, truncado depois de Metionina,

Glicina, Prolina, Valina e Prolina no N-terminal <221> variação <222> (500)...(501) 299

<223> η = A, Τ, G, ou C <221> CDS <222> (1) ... (534) <4 0 0> 144 act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg ttc 48 Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe 1 5 10 15 aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gcc agg gac 96 Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp 20 25 30 gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age tct cct 144 Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro 35 40 45 gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag ege 192 Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val Arg Glu Arg 50 55 60 cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg gag 240 Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys val Leu Glu 65 70 75 80 gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt cac 288 Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp val Leu Asp Gin Pro Leu His 85 90 95 acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc tgt ate cag cct cag 336 Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys ile Gin Pro Gin 100 105 110 ccc aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac cac tgg ctg cac 384 Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His 115 120 125 cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag gca 432 Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala 130 135 140 tct gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga gac ctc aaa tat 480 Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr 145 150 155 160 gtg gcc gat ggg aac ctg dnn ctg aga a cg tca acc cac cct gag tcc 528 val Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser 165 170 175 acc tga Thr * 534 300

<210> 145 <211> 177 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C167X da IL-29, truncado depois de Metionina,

Glicina, Prolina, Valina e Prolina no N-terminal <221> VARIANTE <222> (167)...(167) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 0 0> 145

Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His lie Gly Arg Phe 1 5 10 15 LyS Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp 20 25 30 Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro 35 40 45 Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Vai Arg Glu Arg 50 55 60 Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys val Leu Glu 65 70 75 80 Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His 85 90 95 Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro Gin 100 105 110 Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His 115 120 125 Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala 130 135 140 Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr 145 150 155 160 Vai Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser 165 170 175

<210> 146 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 301 <223> C166X da IL-29, truncado depois de Metionina,

Glicina, Prolina, Valina, Prolina e Treonina no N-terminal <221> variação <222> (497)...(498)

<223> n = A, T, G, ou C <221> CDS <222> (1)...(531) <4 0 0> 146 302 tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa 48 Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys 1 5 10 15 tct ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gee agg gac gee 96 Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala 20 25 30 ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age tct cct gtc 144 Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val 35 40 45 ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc cag gtg agg gag ege cct 192 Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro 50 55 60 gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg ctg aag gtc ctg gag gee 240 Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys vai Leu Glu Ala 65 70 75 80 gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt cac acc 288 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr 85 90 95 ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee tgt ate cag cct cag ccc 336 Leu HiS His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro 100 105 110 aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc cac cac tgg ctg cac cgg 384 Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg 115 120 125 etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag gea tct 432 Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser 130 135 140 gtc acc ttc aac etc ttc ege etc etc acg cga gac etc aaa tat gtg 480 Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr val 145 150 155 160 gee gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tea acc cac cct gag tcc acc 528 Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 165 170 175 tga * 531 <2io> : 147 <21i> : 176 <212> : PRT <213> : Sequência . artificial 303 <22 0> <223> C166X da IL-29, truncado depois de Metionina,

Glicina, Prolina, Valina, Prolina e Treonina no N-terminal <221> VARIANTE <222> (166) ... (166) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 147

Ser LyS Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His lie Gly Arg Phe Lys 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala 20 25 30 Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro val 35 40 45 Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro 50 55 60 val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr 85 90 95 Leu His His lie Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys He Gin Pro Gin Pro 100 105 110 Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg 115 120 125 Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser 130 135 140 Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val 145 150 155 160 Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 165 170 175

<210> 148 <211> 528 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> C165X da IL-29, truncado depois de Metionina, Glicina, Prolina, Valina, Prolina, Treonina e Serina no N-terminal <221> variação 304 <222> (499) . . . (495) <223> η = A, Τ, G, <221> CDS <222> (1) ... (528) <4 0 0> 148 aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tet 48 Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser 1 5 10 15 ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg 96 Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu 20 25 30 gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age tet cct gtc ttc 144 Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro val Phe 35 40 45 ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag ege cct gtg 192 Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Val Arg Glu Arg Pro Val 50 55 60 gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct 240 Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys val Leu Glu Ala Ala 65 70 75 80 gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg 288 Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu 85 90 95 cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc tgt ate cag cct cag ccc aca 336 His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr 100 105 110 gca ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc 384 Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu 115 120 125 cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag gca tet gtc 432 Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val 130 135 140 acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc 480 Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala 145 150 155 160 gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tca acc cac cct gag tcc acc tga 528 Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr * 165 170 175 305

<210> 149 <211> 175 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> C165X da IL-29, truncado depois de Metionina, Glicina, Prolina, Valina, Prolina, Treonina e Serina no N-terminal <221> VARIANTE <222> (165) ... (165) <223> Xaa — Ser , Ala, Thr , Vai, OU Asn <4 0 0> 149 Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser 1 5 10 15 Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro val Phe 35 40 45 Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin val Arg Glu Arg Pro val 50 55 60 Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu 85 90 95 His His He Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr 100 105 110 Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His HiS Trp Leu His Arg Leu 115 120 125 Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val 130 135 140 Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala 145 150 155 160 Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 165 170 175 <210> 150 <211> 552 <212> ADN <213> Sequência artificial 306 <22 0>

<223> Leu da IL-29 inserção depois de Met no N-terminal, C173X <221> variação <222> (518)...(519)

<223> n = A, T, G, ou C <221> CDS <222> (1)...(552) <4 0 0> 150 atg ytn ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc Met Leu Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly 1 5 10 15 tgc cac att ggc agg ttc aaa tct ctg tca cca cag gag cta gcg age Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser 307 20 25 30 ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac 144 Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn 35 40 45 tgg agt tgc age tet cct gtc ttc CCC ggg aat tgg gac ctg agg ctt 192 Trp Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu 50 55 60 ctc cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc 288 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp vai 85 90 95 cta gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag 336 Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His HiS rie Leu Ser Gin Leu Gin 100 105 110 gcc tgt ate cag cct cag ccc aca gea 999 ccc agg ccc cgg ggc ege 384 Ala Cys ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg 115 120 125 ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc 432 Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser 130 135 140 gct ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc 480 Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu 145 150 155 160 acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg 528 Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr 165 170 175 tca acc cac cct gag tcc acc tga 552 Ser Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 151 <211> 183 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Leu da IL-29 inserção depois de Met no N-terminal, C173X

<221> VARIANTE 308 <222> (173)...(173)

Vai, ou Asn <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, <4 0 0> 151

Met Leu Gly Pro Vai Pro Thr Ser 1 5 Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser 20 Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu 35 40 Trp Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe 50 55 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai 65 70 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala 85 Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu 100 Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr 115 120 Leu His His Trp Leu His Arg Leu 130 135 Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser vai 145 150 Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala 165 Ser Thr HiS Pro Glu Ser Thr 180 <210> 152 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> G2L C172X da IL-29 <221> variação <222> (515)...(516) <223> n = A, T, G, ou C <221> CDS <222> (D . . . (549)

Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly 10 15

Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser 25 30

Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn 45

Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu 60

Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 75 80

Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai 90 95

His His lie Leu Ser Gin Leu Gin 105 110

Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg 125

Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser 140

Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu 155 160

Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr 170 175 309 < 4 0 0 > 152 atg ytn cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc 48 Met Leu Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Ly3 Gly Cys 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc 96 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac tgg 144 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc L92 Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg 240 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta 288 Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc 336 ASp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 no tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc 384 Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct 432 His His Trp Leu HiS Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg 480 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tea 528 Arg Asp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 acc cac cct gag tcc acc tga 549 Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 153 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> G2L C172X da IL-29 310 <221> VARIANTE <222> (172)...(172) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 153

Met Leu Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His lie Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 5S 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Sér val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr

<210> 154 <211> 552 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Ile da IL-29 inserção depois de Met no N-terminal, C173X <221> variação <222> (518)...(519)

<223> n = A, T, G, ou C 311 <221> CDS <222> (1)...(552) <4 Ο Ο> 154 atg ath ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc 48 Met Ile Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly 1 5 10 15 tgc cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age 96 Cys His rie Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser 20 25 30 ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea ctc aag ctg aaa aac 144 Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn 35 40 45 rr <Ú agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt 192 Trp Set Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu 50 55 60 ctc cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg 240 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc 288 Thr Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val 85 90 95 cta gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag 336 Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His He Leu Ser Gin Leu Gin 100 105 110 gcc tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege 384 Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg 115 120 125 ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc 432 Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser 130 135 140 gct ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc 480 Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu 145 150 155 160 acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg 528 Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr 165 170 175 tea acc cac cct gag tcc acc tga 552 Ser Thr His Pro Glu Ser Thr * 180

<210> 155 <211> 183 <212> PRT <213> Sequência artificial

312 <22 0> <223> C173X

Ile da IL-29 inserção depois de Met no N-terminal <221> VARIANTE <222> (173) ... (173) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 155

Met rie Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly 1 5 10 15 Cys HiS ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser 20 25 30 Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn 35 40 45 Trp Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu 50 55 60 Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val 85 90 95 Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin 100 105 110 Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg 115 120 125 Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser 130 135 140 Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu 145 150 155 160 Thr Arg Asp Leu Lys Tyr vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr 165 170 175 Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 180 <210> 156 <211> 549 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> G2I C172X da IL-29 <221> variação 313 <222> (515)...(516) <223> n = A, T, G, ou <221> CDS <222> (1)...(549) <400> 156

C atg a th cet gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg aag ggc tgc Met Ile Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta gcg age ttc His He Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 aag aag gee agg gac gee ttg gaa gag tea etc aag ctg aaa aac tgg Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt etc Ser Cys Ser Ser Pro Vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 cag gtg agg gag ege cet gtg gee ttg gag gct gag ctg gee ctg acg Gin Vai Arg Glu Arg Pro vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 ctg aag gtc ctg gag gee gct gct ggc cca gee ctg gag gac gtc cta Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly pro Ala Leu Glu Asp vai Leu 85 90 95 gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate etc tcc cag etc cag gee ASp Gin Pro Leu His Thr Leu His His ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg ggc ege etc Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 cac cac tgg ctg cac cgg etc cag gag gee ccc aaa aag gag tcc gct His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 48 96 144 192 240 288 336 384 432 314 ggc Gly 145 tgc Cys ctg Leu gag Glu gca Ala tct Ser 150 gtc Vai acc Thr ttc Phe aac Asn ctc Leu 155 ttc cgc Phe Arg ctc Leu ctc Leu acg Thr 160 480 cga Arg gac Asp ctc Leu aaa Lys tat Tyr 165 gtg vai gcc Ala gat ggg aac Asp Gly Asn 170 ctg Leu dnn Xaa ctg Leu aga Arg acg Thr 175 tca Ser 528 acc Thr cac His cct Pro gag Glu 180 tcc Ser acc Thr tga * 549

<210> 157 <211> 182 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>

<223> IL-29 G2I C172X <221> VARIANTE <222> (172)...(172) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 0 0> 157

Met Ile Pro vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys 1 5 10 15 His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe 20 25 30 Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp 35 40 45 Ser Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu 50 55 60 Gin Vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Leu Lys vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Val Leu 85 90 95 Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His HiS ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala 100 105 110 Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu 115 120 125 His HiS Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala 130 135 140 Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr 145 150 155 160 Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser 165 170 175 Thr His Pro Glu Ser Thr 180 315

<210> 158 <211> 531 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> IL-29 depois dos resíduos de aminoácidos 2-7 da Met no N-terminal serem apagados, C166X <221> variação <222> (497)...(498)

<223> n = A, T, G, ou C <221> CDS <222> (1)...(531) <4 0 0> 158 316 atg aag CCC acc aca act ggg aag ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa 48 Met Lys o u CM Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys HiS Ile Gly Arg Phe Lys 1 5 10 15 tct ctg tca cca cag gag cta gcg age ttc aag aag gcc agg gac gcc 96 Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg ASp Ala 20 25 30 ttg gaa gag tca ctc aag ctg aaa aac tgg agt tgc age tct cct gtc 144 Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Vai 35 40 45 ttc ccc ggg aat tgg gac ctg agg ctt ctc cag gtg agg gag ege cct 192 Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin vai Arg Glu Arg Pro 50 55 60 gtg gcc ttg gag gct gag ctg gcc ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc 240 vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala 65 70 75 80 gct gct ggc cca gcc ctg gag gac gtc cta gac cag ccc ctt cac acc 288 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr 85 90 95 ctg cac cac ate ctc tcc cag ctc cag gcc tgt ate cag cct cag ccc 336 Leu Hls His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys ile Gin Pro Gin Pro 100 105 110 aca gca ggg ccc agg ccc cgg ggc ege ctc cac cac tgg ctg cac cgg 384 Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg 115 120 125 ctc cag gag gcc ccc aaa aag gag tcc gct ggc tgc ctg gag gca tct 432 Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser 130 135 140 gtc acc ttc aac ctc ttc ege ctc ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg 480 Vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Vai 145 150 155 160 gcc gat ggg aac ctg dnn ctg aga acg tca acc cac cct gag tcc acc 528 Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 165 170 175 tga 531

<210> 159 <211> 176 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> IL-29 depois dos resíduos de aminoácidos 2-7 da Met 317

no N-terminal serem apagados, C166X <221> VARIANTE <222> (166)...(166) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <4 0 0> 159

Met Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys 1 5 10 15 Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala 20 25 30 Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val 35 40 45 Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg Leu Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro 50 55 60 vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala Leu Thr Leu Lys val Leu Glu Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp Vai Leu Asp Gin Pro Leu HiS Thr 85 90 95 Leu His His Ile Leu Ser Gin Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro 100 105 110 Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg 115 120 125 Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser 130 135 140 vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val 145 150 155 160 Ala Asp Gly Asn Leu xaa Leu Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 165 170 175

<210> 160 <211> 558 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> IL-29 Glu, Ala, e Glu inseridos depois da Met no N-terminal, C175X <221> variação <222> (524)...(525)

<223> n = A, T, G, ou C 318 <221> CDS <222> (1)...(558) <400> 160 atg gar gen gar ggc cct gtc ccc act tcc aag ccc acc aca act ggg 48 Met Glu Ala Glu Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly 1 5 10 15 aag ggc tgc cac att ggc agg ttc aaa tet ctg tea cca cag gag cta 96 Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu 20 25 30 gcg age ttc aag aag gcc agg gac gcc ttg gaa gag tea ctc aag ctg 144 Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu 35 40 45 aaa aac tgg agt tgc age tet cct gtc ttc ccc ggg aat tgg gac ctg 192 Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu 50 55 60 agg ctt ctc cag gtg agg gag ege cct gtg gcc ttg gag gct gag ctg 240 Arg Leu Leu Gin vai Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu 65 70 75 80 gcc ctg acg ctg aag gtc ctg gag gcc gct gct ggc cca gcc ctg gag 288 Ala Leu Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu 85 90 95 gac gtc cta gac cag ccc ctt cac acc ctg cac cac ate ctc tcc cag 336 Asp vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 ctc cag gcc tgt ate cag cct cag ccc aca gea ggg ccc agg ccc cgg 384 Leu Gin Ala Cys He Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg 115 120 125 ggc ege ctc cac cac tgg ctg cac cgg ctc cag gag gcc ccc aaa aag 432 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 gag tcc gct ggc tgc ctg gag gea tet gtc acc ttc aac ctc ttc ege 480 Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser val Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 ctc ctc acg cga gac ctc aaa tat gtg gcc gat ggg aac ctg dnn ctg 528 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu 165 170 175 aga acg tea acc cac cct gag tcc acc tga 558 Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr ★ 180 185 319

<210> 161 <211> 185 <212> PRT <213> Sequência artificial <220>

<223> IL-29 Glu, Ala, e Glu inseridos depois da Met no N-terminal, C175X <221> VARIANTE <222> (175)...(175) <223> Xaa = Ser, Ala, Thr, Vai, ou Asn <400> 161

Met Glu Ala Glu Gly Pro Vai Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly 1 5 10 15 Lys Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gin Glu Leu 20 25 30 Ala Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu 35 40 45 Lys Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro vai Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu 50 55 60 Arg Lêu Leu Gin Vai Arg Glu Arg Pro Vai Ala Leu Glu Ala Glu Leu 65 70 75 80 Ala Leu Thr Leu Lys Vai Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu 85 90 95 Asp vai Leu Asp Gin Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gin 100 105 110 Leu Gin Ala Cys Ile Gin Pro Gin Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg 115 120 125 Gly Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gin Glu Ala Pro Lys Lys 130 135 140 Glu Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser vai Thr Phe Asn Leu Phe Arg 145 150 155 160 Leu Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Vai Ala Asp Gly Asn Leu Xaa Leu 165 170 175 Arg Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 180 185 320

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição US 5985614 A [0001] US 5945511 A [0001] [0047] WO 9946379 A [0001] US 5965704 A [0001] [0047] WO 02086087 A [0008] [0009] [0010] [0037] [0038] [0041] [0072] WO 0220569 A [0039] WO 0244209 A [0039] [0047] WO 0202627 A [0043] WO 03040345 > A [0047] WO 03066002 : A , Kotenko [0053] [ WO 02092762 : a , Baum [0056] [0057] US 5641655 A [0097] US 5037743 A, Welch [0097] [0105] US 5143830 A, Holland [0097] US 4713339 A, Levinson [0101] US 4784950 A, Hagen [0101] US 4579821 A, Palmiter [0101] US 4656134 A, Ringold [0101] US 4956288 A [0101] US 4601978 A [0101] US 5162222 A, Guarino [0103] WO 9406463 A [0103] US 5300435 A [0104] US 4599311 A, Kawasaki [0105] [0054] [0056] [0057] 321 us 4931373 A, Kawasaki [0105] us 4870008 A, Brake [0105] us 4845075 A, Murray [0105] us 4615974 A, Kingsman [0105] us 4977092 A, Bitter [0105] us 4990446 A [0105] us 5063154 A [0105] us 5139936 A [0105] us 4661454 A [0105] us 4882279 A, Cregg [0105] us 4935349 A, McKnight [0105] us 5162228 A, Sumino [0105] us 4486533 A, Lambowitz [0105] us 5955349 A [0105] us 5888768 A [0105] us 6001597 A [0105] us 5965389 A [0105] us 5736383 A [0105] us 5854039 A [0105] EP 0154316 A [0111] us 5382657 A, Karasiewicz [0111] us 5738846 A, Greenwald [0117] us 6165470 A [0121] us 5750375 A [0122] us 5843725 A [0122] us 6291646 B [0122] wo 9521920 A [0135] EP 08150287 ' A [0299] us 60493194 i B [0299] us 60551841 . B [0299] us 60559142 : b [0299]

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Claims (17)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 1-181 da SEQ. ID N.° 4; em que o resíduo de aminoácido que corresponde à cisteína na posição 171 da SEQ. ID N.° 4 é substituído com um resíduo de serina; em que os resíduos de aminoácidos que correspondem à cisteína na posição 15 e posição 112 da SEQ. ID N.° 4 formam uma primeira liqação dissulfido, e em que os resíduos de aminoácidos que correspondem à cisteína na posição 49 e posição 145 da SEQ. ID N.° 4 formam uma segunda ligação dissulfido; e em que o polipeptídeo inibe a replicação da hepatite B ou hepatite C.

2. O polipeptídeo isolado da Reivindicação 1, em que o polipeptídeo tem, pelo menos, 95% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 1-181 da SEQ. ID N. ° 4 .

3. O polipeptídeo isolado da Reivindicação 1, em que o polipeptídeo compreende ainda uma metionina no terminal amino.

4. Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de quaisquer das Reivindicações 1-3.

5. Um vetor de expressão que compreende os seguintes elementos operativamente ligados: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que codifica o polipeptídeo de quaisquer das Reivindicações 1-3; e 2 um terminador de transcrição.

6. Uma célula cultivada que compreende o vetor de expressão da Reivindicação 5, em que a célula expressa o polipeptideo codificado pelo segmento de ADN.

7. Um método de produzir um polipeptideo que compreende: cultivar uma célula que compreende o vetor de expressão da Reivindicação 5, em que a célula expressa o polipeptideo codificado pelo segmento de ADN; e recuperar o polipeptideo expresso.

8. Uma formulação que compreende o polipeptideo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-3, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

9. Um kit que compreende a formulação da Reivindicação 8.

10. Um polipeptideo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 1-181 da SEQ. ID N.° 4, em que o resíduo de aminoácido que corresponde à cisterna na posição 171 da SEQ. ID N.° 4 é substituído por um resíduo de serina, em que o polipeptideo inibe a replicação da hepatite B ou hepatite C; e em que o polipeptideo é peguilado.

11. Um polipeptideo isolado, de acordo com a Reivindicação 10, em que o dito polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ. ID N.° 27.

12. Um polipeptideo isolado, de acordo com a Reivindicação 10, em que o dito polipeptideo compreende ainda uma metionina no terminal amino. 3

13. Um polipeptídeo isolado, de acordo com a Reivindicação 12, em que o dito polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com a SEQ. ID N.° 29.

14. Um polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 10-13, em que o polietilenoglicol tem um peso molecular de 20kD.

15. Um polipeptídeo isolado, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 10-14, em que o polietilenoglicol está ligado ao terminal N do polipeptídeo.

16. Um polipeptídeo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 1-181 da SEQ. ID N.° 4, em que o resíduo de aminoácido que corresponde à cisteína na posição 171 da SEQ. ID N.° 4 é substituído com um resíduo de serina, em que o polipeptídeo inibe a replicação da hepatite B ou hepatite C, e em que o polipeptídeo é conjugado com uma fração de polímero solúvel em água farmaceuticamente aceitável, para utilização na terapêutica.

17. Um polipeptídeo isolado para utilização, de acordo com a Reivindicação 16, em que a fração do polímero solúvel em água é polietilenoglicol.