CN101531715A - 细胞因子蛋白质家族 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与干扰素α在氨基酸序列水平上极为紧密相关的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的多核苷酸和多肽分子。该蛋白质家族的受体是II类细胞因子受体。本发明包括降低病毒感染和增强单核细胞数量的方法。本发明还包括zcyto20多肽的抗体,和制备这些多核苷酸和多肽的方法。
Description
发明背景
多细胞生物的细胞分化由激素和多肽生长因子控制。这些可扩散的分子使得细胞能够彼此交流并彼此相呼应地行动以形成组织和器官、以及修复和再生损坏的组织。激素和生长因子的实例包括尤其是类固醇激素、甲状旁腺激素、促滤泡激素、干扰素、白细胞介素、血小板来源的生长因子、表皮生长因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
激素和生长因子通过和受体蛋白结合影响细胞代谢。某些受体是膜内在蛋白质,它们在细胞外与激素或生长因子结合,并在细胞内与信号转导途径,如第二信使系统连接。其它类型的受体是可溶性细胞内分子。
细胞因子一般刺激造血细胞谱系细胞的增殖或分化,或参与机体的免疫和炎症应答机制。影响血细胞生成的细胞因子的实例有刺激红细胞发育的红细胞生成素(EPO);刺激巨核细胞谱系的细胞发育的血小板生成素(TPO);和刺激中性粒细胞发育的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这些细胞因子可用于恢复贫血症、血小板减少症及中性粒细胞减少症患者或接受癌症化疗的患者的正常血细胞水平,
细胞因子在调节血细胞生成和免疫应答中有重要作用,并可以影响淋巴细胞的发育。人II类细胞因子家族包括干扰素-α(IFN-α)亚型、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-10、IL-19(美国专利5,985,614)、MDA-7(Jiang等,Oncogene 11,2477-2486,(1995))、IL-20(Jiang等,Oncogene 11,2477-2486,(1995))、IL-22(Xie等,J.Biol.Chem.275,31335-31339,(2000))和AK-155(Knappe等,J.Virol.74,3881-3887(2000))。大多数细胞因子通过与I类或II类细胞因子受体结合和转导信号。人II类细胞因子受体家族的成员包括干扰素-αR1(IFN-αR1)、干扰素-γ-R2(IFN-γ-R2)、干扰素-γR1(IFN-γR1)、干扰素-γR2(IFN-γR2)、IL-10R(Liu等,J.Immunol.152,1821-1829,(1994))、CRF2-4(Lutfalla等,Genomics16,366-373,(1993))、IL-20Rβ(Blumberg等,Cell,104,9-19,(2001))(又称作zcytor7(美国专利5,945,511)和CRF2-8(Kotenko等,Oncogene 19,2557-2565,(200))、IL-20Rβ(Blumberg等,同上,(2001))(又称作DIRS1(PCT WO 99/46379))、IL-22RA1(IL-22受体α1,提交HUGO要求批准)(又称作IL-22R(Xie等,J.Biol.Chem.275,31335-31339,(2000))、zcytorll(美国专利5,965,704)和CRF2-9(Kotenko等,Oncogene,19,2557-2565,(2000))及组织因子。
II类细胞因子受体典型地是异二聚体,由两个不同的受体链,即α和β受体亚基组成(Stahl等,Cell,74,587-590,(1993))。一般地,α亚基是主要的细胞因子结合蛋白,而β亚基是形成高亲和结合位点以及进行信号转导所必需的。IL-20受体是一个例外,其中的两个亚基均是IL-20结合所必需的(Blumberg等,同上(2001))。
II类细胞因子受体可以通过受体的细胞外部分中大约200个氨基酸(D200)的保守细胞因子结合域来鉴定。该细胞因子结合域由两个III型纤连蛋白(FnIII)域(各大约有100个氨基酸)组成(BazanJ.F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6934-6938(1990);Thoreau等,FEBSLett.282,16-31(1991))。每个FnIII域都含有保守的Cys、Pro和Trp残基,这些残基决定了7个β链的特征性折叠方式,其类似于免疫球蛋白的恒定区(Uze等,J.Interferon Cytokin Res.15,3-26(1995))。II类细胞因子受体家族的保守结构元件使得可以基于一级氨基酸序列同源性鉴定该家族的新成员。使用该方法,先前我们已经成功地鉴定到两个II类细胞因子受体家族新成员,zcytor7(美国专利5,945,511)(又称作IL-22Rα(Blumberg等,同上(2001))和zcytor1l(美国专利5,965,704)(又称作IL-22R(Blumberg等,同上(2001))。由于细胞因子在生物学应答的调节中的重要作用,因此鉴定II类细胞因子受体家族的其它新成员是有意义的。
IL-22,又称作IL-TIF(IL-10相关的T细胞来源的可诱导因子)(Dumoutier等,J.Immunology 164,1814-1819,(2000)),是新近描述的IL-10同系物。小鼠的IL-22最初被鉴定为在体外T细胞和肥大细胞中IL-9诱导的基因(Dumoutier等,J.Immunology,164,1814-1819,(2000))。注射IL-22后在小鼠肝中观察到急性期反应物诱导活性,并且在注射脂多糖(LPS)后快速诱导了IL-22的表达,这提示IL-22参与体内的炎症应答(Dumoutier等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10144-10149(2000))。
白细胞介素是介导免疫学应答(包括炎症)的细胞因子家族。白细胞介素介导多种炎性病理。T细胞是免疫应答的中枢,其产生许多细胞因子和针对抗原的获得性免疫。T细胞产生的细胞因子被划分为1型和2型(Kelso,A.,Immun.Cell Biol.76:300-317,1998)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α,其参与炎症应答、病毒免疫、细胞内寄生物免疫和同种异体移植排斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13,其参与体液应答、蠕虫免疫和过敏反应。1型和2型共有的细胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-α。有一些证据提示产生1型和2型的T细胞群体偏好向不同类型的发炎组织中迁移。
从治疗的角度出发,干扰素尤其有意义(关于干扰素的综述见DeMaeyer和De Maeyer-Guignard,“干扰素”,《细胞因子手册》(TheCytokine Handbook),第3版,Thompson(编),第491-516页(Academic Press Ltd.1998)和Walsh,Biopharmaceuticals:Biochemistry and Biotechnology,第158-188页(John Wiley & Sons1998))。干扰素显示出多种生物学活性,可用于治疗某些自身免疫疾病(尤其是癌症)和增强对感染剂(包括病毒、细菌、真菌和原生生物)的免疫应答。迄今,已经鉴定到6种形式的干扰素,它们分为两个大组。所谓的“I型”干扰素包括干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素δ、干扰素τ。目前,干扰素γ和干扰素α的一个亚类是仅有的II型干扰素。
I型干扰素被认为来源于相同的祖先基因,保留了充分相似的结构以致可以通过相同的细胞表面受体起作用。人干扰素α/β受体的α链包含N端细胞外域,其具有II类细胞因子受体的特征。干扰素γ与I型干扰素或II型干扰素α亚型没有显著的同源性,但与I型干扰素有许多相同的生物学活性。
对于人而言,至少有16个非等位基因编码不同亚型的干扰素α,而干扰素β和ω仅由单个基因编码。I型干扰素基因成簇排列在9号染色体的短臂中。与人类的典型结构基因不同,干扰素α、干扰素β和干扰素ω缺少内含子。编码人干扰素γ的单个基因位于第12号染色体上并含有3个内含子。迄今,干扰素τ仅在牛和绵羊中有过描述,而干扰素δ仅在猪中有过描述。
临床医师借助干扰素的多种活性利用该蛋白治疗多种疾病。例如,一种形式的干扰素α已被50多个国家批准用于治疗医学疾病,如多毛细胞白血病、肾细胞癌、基层细胞癌、恶性黑素瘤、AIDS相关的卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、慢性骨髓性白血病、非何杰金氏淋巴瘤、喉乳头状瘤、蕈样肉芽肿病、尖锐湿疣、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、慢性非甲非乙/丙型肝炎。美国药品和食品管理局已经批准使用干扰素β治疗多发性硬化、神经系统的慢性疾病。干扰素γ被用于治疗慢性肉芽肿性疾病,干扰素在其中增强患者的免疫应答以破坏感染性细菌、真菌和原生生物病原体。临床研究还指出,干扰素γ可以用于治疗AIDS、利什曼病和瘤型麻风。
已证实的细胞因子家族的体内活性说明其它细胞因子、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂的巨大临床潜力和需求。本发明通过提供刺激造血细胞谱系的细胞的新细胞因子以及相关的组合物和方法来满足这些需求。
发明详述
在详细阐述本发明之前,定义如下术语可能有助于本发明的理解。
术语“亲和标签”在本文中用于指可以和第二多肽结合以便于该第二多肽的纯化或检测或为第二多肽和底物的结合提供位点的多肽片断。原则上,可以获得其抗体或其它特异性结合剂的任何肽或蛋白质均可以用作亲和标签。亲和标签包括多聚组氨酸序列段、A蛋白(Nilsson等,EMBO J.4:1075,1985;Nilsson等,Methods Enzymol.198:3,1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson等,Gene 67:31,1988)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952-4,1985)、P物质、FlagTM肽(Hopp等,Biotechnology6;1204-10,1988)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原性表位或结合域。一般参见Ford等,Protein Expression and Purification 2:95-107,1991。编码亲和标签的DNA可从供应商(例如Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)处获得。
术语“等位变体”在本文中用于指占据相同的染色体座位的两个或多个不同基因形式中的任一个。等位变异可以通过突变自然产生,并可以在群体内导致表型多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有改变)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体在本文中也用于指由等位基因变体编码的蛋白质。
术语“氨基端”和“羧基端”在本文中用于指多肽内的位置。在上下文允许的情况下,参考多肽的特定序列或部分,这些术语用于指邻近或相对的位置。例如,在一个多肽中位于参考序列羧基端的某个序列指该序列位于该参考序列的羧基端近侧的位置,但不一定位于完整多肽的羧基端。
术语“互补物/反互补物对”是指不相同的部分,这些部分在适当的条件将形成通过非共价方式连接的稳定对。例如,生物素和亲和素(或链霉亲和素)是互补物/反互补物对的典型成员。互补物/反互补物对的其它实例包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等。当期望随后使互补物/反互补物对解离时,优选该互补物/反互补物对具有小于109M-1的结合亲和力。
术语“多核苷酸分子的互补分子”是指与参考序列相比具有互补碱基序列并取向相反的多核苷酸分子。例如,序列5’ATGCACGGG3’与5’CCCGTGCAT3’互补。
术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体,但编码相同的氨基酸残基(例如,GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“表达载体”用于指包含编码目的多肽的区段的线性或环状DNA分子,其中所述的多肽编码区段在该DNA分子中与帮助其转录的其它区段可操作地连接。这些其它区段包括启动子和终止序列,并还可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA,或可以含有两者的元件。
术语“分离的”当应用于多核苷酸时是指该多核苷酸已经离开其天然遗传环境并因此不含有其它无关或不需要的编码序列,而且它以适合在遗传工程化蛋白质制备系统中使用的形式存在。该分离的分子是从其天然环境中被分离出来的那些分子,包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含有原来与之相连接的其它基因,但可以包括天然存在的5’和3’非翻译区,如启动子和终止子。相连区域的鉴定对于本领域普通技术人员而言是明显的(参见例如,Dynan和Tijan,Nature 316:774-78,1985)。
“分离的”多肽或蛋白质是在非其天然环境的条件下,例如离开血液和动物组织存在的多肽或蛋白质。在优选形式中,分离的多肽基本上不含有其它多肽,尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高度纯化形式,即纯度大于95%、更优选纯度大于99%的多肽。在上下文中,术语“分离的”不排除存在其它可能的物理形式(如二聚体)或其它可能的糖基化或衍生形式的相同多肽。
术语“赘生”当指细胞时表示细胞正在经历新的异常增殖,尤其是在增殖不受控制和进行性发展的组织中,从而导致赘生物的产生。赘生性细胞可以是恶性的,例如侵入性的和转移性的,或是良性的。
术语“可操作地连接的”当指DNA区段时表示这些区段按一定方式排列以致它们可以协调地为其预期的目的发挥作用,例如在启动子中起始转录并前行通过编码区段到达终止子。
术语“定向进化同源物”(ortholog)是指从一个物种获得的多肽或蛋白质,其是来自不同物种的多肽或蛋白质的功能对应物。定向进化同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
“平行进化同源物”(paralog)是生物体产生的不同的但结构上相关的蛋白质。平行进化同源物被认为起源于基因重复。例如,α珠蛋白、β珠蛋白和肌红蛋白彼此是平行进化同源物。
“多核苷酸”是指从5’向3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚物。多核苷酸包括RNA和DNA,可以从天然来源分离、体外合成或通过天然和合成的分子的组合来制备。多核苷酸的大小表示为碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下,后两个术语可以描述单链或双链的多核苷酸。当该术语应用于双链分子时,其用于指整个长度,并且应理解为相当于术语“碱基对”。本领域技术人员明了,双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍有差异而且它们的末端可以因酶促切割而是交错的;因此在双链多核苷酸分子中可能并非所有的核苷酸都是配对的。
“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸残基的多聚物,它们可以是天然产生的或合成产生的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常被称作“肽”。
术语“启动子”在本文中用于表示其所在领域认可的含义,指含有为RNA聚合酶结合和转录起始提供条件的DNA序列的基因部分。启动子序列通常,但并不总是,存在于基因的5’非编码区。
“蛋白质”是指包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可以包含非肽成分,如糖基。糖和其它非肽取代基可以由产生蛋白质的细胞添加至蛋白质上,并且它们将随细胞类型的不同而不同。蛋白质在本文中以其氨基酸主链结构来定义;诸如糖基等这样的取代基一般不作详细说明,但可以存在。
术语“受体”是指与生物活性分子(即配体)结合并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白质。膜结合受体的特征在于包含细胞外配体结合域和细胞内效应域(典型地参与信号转导)的多个肽的结构。配体与受体的结合导致受体构象改变,引起效应域和细胞内的其它分子之间发生相互作用。该相互作用又导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用联系的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产生的增加、细胞钙动员、膜脂动员、细胞粘着、肌醇脂的水解和磷脂的水解。受体一般可以是膜结合的、细胞质的或细胞核的;单体(例如促甲状腺激素受体、β肾上腺素受体)或多体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。
术语“分泌信号序列”是指编码如下多肽(“分泌肽”)的DNA序列,所述多肽作为更大多肽的一个成分指导该更大多肽通过合成它的细胞的分泌途径。该更大多肽通常在运输通过分泌途径的过程中被切割而除去分泌肽。
术语“拼接变体”在本文中用于指基因转录产生的RNA的多种可选择形式。拼接变异通过利用存在于转录的RNA分子中的、或较少情况下单独转录的RNA分子之间的多个可供选择的拼接位点而自然产生,并可以导致从相同的基因转录产生几种mRNA。拼接变体可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语拼接变体在本文中也用于指基因转录产生的mRNA拼接变体编码的蛋白质。
应当理解通过粗略的分析方法(例如凝胶电泳)测定的多聚物的分子量和长度是近似值。当该值以“约”X或“大约”X表示时,X的所述值应理解为精确到±10%。
本文引用的所有参考文献均完整地并入作为参考。
本发明包括与干扰素具有功能和结构相似性的一类多核苷酸和多肽分子。此新家族包括命名为zcyto20(SEQ ID NOS:1和2)、zcyto21(SEQ ID NOS:4和5)、zcyto22(SEQ ID NOS:6和7)、zcyto24(SEQID NOS:8和9)、zcyto25(SEQ ID NOS:10和11)的分子,其中zcyto20、21和22是人的序列而zcyto24和25是小鼠的序列。表1显示了核苷酸和氨基酸水平上该家族内的同源性,该同源性在核苷酸水平上为大约72%至98%,而在氨基酸水平上为大约51%至97%。
表1
核苷酶序列一致性
表2显示了zcyto20、zcyto21、zcyto22、IFNα、IFNβ、IFNγ和IL-10在氨基酸水平上的序列一致性。
表2
氨基酸序列一致性
该家族的所有成员均被证实和相同的II类细胞因子受体结合,该受体被命名为zcytor19受体。而且,已经证实家族中的所有成员均表现出某些生物学活性。这些活性包括例如抗病毒活性和增加循环的髓样细胞水平。尽管不想受到理论的束缚,但这些分子似乎均通过zcytor19受体沿着相同的途径传导信号。
zcyto20基因编码205个氨基酸的多肽,显示在SEQ ID NO:2中。可以预测出Zcyto20的信号序列包含SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基(Met)至第21位氨基酸残基(Ala)。Zcyto20的成熟肽起始于第22位氨基酸残基(Val)。
Zcyto21基因编码200个氨基酸的多肽,显示在SEQ ID NO:5中。可以预测出Zcyto21的信号序列包含SEQ ID NO:5第1位氨基酸残基(Met)至第19位氨基酸残基(Ala)。Zcyto21的成熟肽起始于第20位氨基酸残基(Gly)。Zcyto21描述在PCT申请WO02/02627。
Zcyto22基因编码205个氨基酸的多肽,显示在SEQ ID NO:7中。可以预测出Zcyto22的信号序列包含SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基(Met)至第21位氨基酸残基(Ala)。Zcyto22的成熟肽起始于第22位氨基酸残基(Val)。
Zcyto24基因编码202个氨基酸的多肽,显示在SEQ ID NO:9中。Zcyto24的分泌信号序列包含SEQ ID NO:9第1位氨基酸残基(Met)至第28位氨基酸残基(Ala)。可以在第24位氨基酸残基(Thr)位置找到该分泌信号序列的另一个可选择的切割位点。成熟多肽包含第29位氨基酸残基(Asp)至第202位氨基酸残基(Val)。
Zcyto25基因编码202个氨基酸的多肽,显示在SEQ ID NO:11中。Zcyto25的分泌信号序列包含SEQ ID NO:11的第1位氨基酸残基(Met)至第28位氨基酸残基(Ala)。可以在第24位氨基酸残基(Thr)位置找到该分泌信号序列的另一个可选择的切割位点。成熟多肽包含第29位氨基酸残基(Asp)至第202位氨基酸残基(Val)。
Zcyto20、zcyto21和zcyto22基因已经被作图定位在人类染色体19q13.13。基于这些基因的发现,19号染色体的该区域被确定为包含一簇干扰素样基因。这是一个新的基因家族的另一证据是在小鼠第7号染色体上鉴定到一簇同线基因,zcyto24(SEQ ID NO:8)和zcyto25(SEQ ID NO:10)。
正如下述,本发明提供具有与SEQ ID NO:2的第22位至第205位氨基酸残基或SEQ ID NO:2第1位至第205位氨基酸残基至少70%、至少80%或至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列的分离的多肽,或其某些片断。本发明还包括进一步含有位于第一氨基酸序列的氨基端位置的信号分泌序列的多肽,其中该信号分泌序列包含SEQ ID NO:2氨基酸序列第1至第21位氨基酸残基。
在另一实施方案中,本发明提供具有与SEQ ID NO:7第22至205位氨基酸残基或SEQ ID NO:7第1至205位氨基酸残基至少70%、至少80%或至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的氨基酸序列的分离的多肽。本发明还包括进一步含有位于此第一氨基酸序列的氨基端位置的信号分泌序列的多肽,其中该信号分泌序列包含SEQID NO:7氨基酸序列的第1至21位氨基酸残基。
一般地,象红细胞生成素(EPO)这样的细胞因子被预测具有4个α螺旋结构(其中螺旋A、C和D在配体和受体的相互作用中最为重要),而且是该家族成员中更为高度保守的。然而,干扰素(IFN),尤其是干扰素α和干扰素τ的特征在于6个螺旋束。EPO螺旋A相当于zcyto20的螺旋A;EPO螺旋B相当于zcyto20的螺旋C;EPO螺旋C相当于zcyto20的螺旋D;EPO螺旋D相当于zcyto20的螺旋F。这样,EPO的AB环和CD环之间的环在zcyto20中被扩展而含有zcyto20的短螺旋B和E。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的螺旋结构与干扰素中发现的6螺旋结构相似。蛋白质中二级结构的边界一般从蛋白质的3维模型根据蛋白质主链的一系列PHI和PSI角来确定。可以从例如x射线晶体学或NMR数据、或基于已阐明的结构的同源性模拟来构建模型。根据所用技术,包括晶体形成和柔性NMR溶液结构测定所用的条件,这些二级结构的边界可以稍有不同。因此,本领域技术人员明了,根据环境的不同,螺旋边界及一般而言二级结构可以移动多达2、3、4或更多个残基,但螺旋区域基本上如下面的描述。(见Brandon和Toosze,Introduction to Protein Structure,Garland Publishing Co,inc.纽约,1991;Anderson等,Structure,10(2):175-84,2002。)
预测的Zcyto20的螺旋如下:螺旋A由第52(Ala)至66(Leu)位氨基酸残基确定;螺旋B为第78(Arg)至87(Val)位氨基酸残基;螺旋C为第91(Pro)至第108(Thr)位氨基酸残基;螺旋D为第116(Val)至138(Ser)位氨基酸残基;螺旋E为第151(Thr)至172(Lys)位氨基酸残基;和螺旋F为第177(Gly)至197(Cys)位氨基酸残基;参见SEQ ID NO:2。4个半胱氨酸残基在Zcyto20、Zcyto21和IFN-α中是保守的。此外,zcyto20还具有3个其它的半胱氨酸。氨基酸残基第204位的半胱氨酸可以形成分子间二硫键,尤其是和其它zcyto20分子形成同二聚体。基于多重比对的zcyto20进一步分析预测,氨基酸残基第37和136位;第69和197位;和第71和178位的半胱氨酸(显示在SEQ ID NO:2)将形成分子内二硫键。编码本文所述Zcyto20多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:1中。
预测的zcyto21的螺旋如下:螺旋A由第49(Ser)至63(Leu)位氨基酸残基确定;螺旋B为第76(Asn)至84(Val)位氨基酸残基;螺旋C为第89(Val)至第104(Ala)位氨基酸残基;螺旋D为第111(Glu)至133(Gln)位氨基酸残基;螺旋E为第137(Thr)至158(Lys)位氨基酸残基;和螺旋F为第163(Gly)至189(Leu)位氨基酸残基;如SEQ ID NO:5所示。这些半胱氨酸残基在zcyto21、zcyto21和IFN-α中是保守的,可以形成分子间二硫键,尤其是和其它zcyto21分子形成同二聚体。基于多重比对进行的zcyto21的进一步分析预测,氨基酸残基第34和131位,及第68和164位的半胱氨酸将形成分子内二硫键。第190位半胱氨酸是游离的,可以形成分子间二硫键。编码本文所述zcyto21多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:4中。
预测的zcyto22的螺旋如下:螺旋A由第52(Ala)至66(Leu)位氨基酸残基确定;螺旋B为第78(Arg)至87(Val)位氨基酸残基;螺旋C为第91(Pro)至第108(Thr)位氨基酸残基;螺旋D为第116(Val)至138(Ser)位氨基酸残基;螺旋E为第151(Thr)至172(Lys)位氨基酸残基;和螺旋F为第177(Gly)至197(Cys)位氨基酸残基;如SEQ ID NO:7所示。4个半胱氨酸残基在zcyto22、zcyto21和IFN-α中是保守的。此外,zcyto22还具有3个其它的半胱氨酸。氨基酸残基第204位的半胱氨酸可以形成分子间二硫键,尤其是和其它zcyto22分子形成同二聚体。基于多重比对进行的zcyto22的进一步分析预测,氨基酸残基第37和136位;第69和197位;和第71和178位的半胱氨酸(显示在SEQ ID NO:7)将形成分子内二硫键。编码本文所述zcyto22多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQID NO:6中。
Zcyto24的保守半胱氨酸被证实在SEQ ID NO:9的残基第44、78、141和175位。基于多重比对进行的zcyto24的进一步分析预测,氨基酸残基第44位和第141位;第78位和第175位(显示在SEQ ID NO:9)之间将形成二硫键。编码本文所述zcyto24多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:9中。预测的Zcyto24中的螺旋(如SEQ ID NO:9所示)是:残基第59-73位(螺旋A);残基第85-94位(螺旋B);残基第98-115位(残基C);残基第121-143位(螺旋D);残基第147-169位(螺旋E);残基第174-194位(螺旋F)。
Zcyto25的保守半胱氨酸被证实在SEQ ID NO:11的残基第44、78、141和175位。基于多重比对进行的zcyto25的进一步分析预测,氨基酸残基第44位和第141位;第78位和第175位(显示在SEQ ID NO:11)之间将形成二硫键。编码本文所述zcyto25多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:11中。预测的Zcyto25中的螺旋(如SEQ IDNO:11所示)是:残基第59-73位(螺旋A);残基第85-94位(螺旋B);残基第98-115位(残基C);残基第121-143位(螺旋D);残基第147-169位(螺旋E);残基第174-194位(螺旋F)。
对鼠IL-2的详细突变分析(Zurawski等,EMBO J.12:5113-5119,1993)显示螺旋A和C中的残基对于与IL-2Rβ的结合是重要的;关键性残基是Asp34、Asn99和Asn103。鼠IL-2的A/B环和螺旋B中的多个残基对于IL-2Rα的结合是重要的,而螺旋D中仅一个残基Gln141对于与IL-2Rα的结合是至关重要的。类似地,螺旋A和C是IL-4和IL-4Rα(结构类似于IL-2Rα)之间相互作用的位点,而且螺旋D中的残基对于与IL-2Rα的相互作用是至关重要的。(Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1657-1662,1997;Kruse等,EMBO J.11:3237-3244,1992)。尤其是,人IL-4中Tyr124突变为Asp可产生拮抗剂,其与IL-4Rα结合但不与IL-2Rα结合,因此不能产生信号(Kruse等,同上,1992)。
4螺旋束的细胞因子还通过其组成螺旋的长度分组。“长螺旋”形式的细胞因子一般由24-30个残基的螺旋组成,包括IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生长激素(hGH)。“短螺旋”形式的细胞因子一般由18-21个残基的螺旋组成,包括IL-2、IL-4和GM-CSF。使用CNTF和IL-6进行的研究证实,可以将CNTF螺旋替换为IL-6中的等同螺旋,从而使该嵌合体具有CTNF结合性质。因此,似乎可以基于结构同源性,而不管序列的同一性如何,确定4螺旋细胞因子的功能域,而且这些功能域能够在嵌合体中保持功能的完整性(Kallen等,J.Biol.Chem.274:11859-11867,1999)。因此,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的螺旋域对于制备嵌合融合分子(尤其是与其它干扰素融合)以确定和调节受体的结合特异性是有用的。尤其有意义的是将来自干扰素和细胞因子如IFN-α、IL-10、人生长激素的螺旋和环区域组合在一起的融合蛋白。
已经证实zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以和称为zcytor19的孤儿受体形成复合物。Zcytor19描述在共同转让的专利申请PCT/US01/44808中。已经证实Zcyto22、zcyto21和zcyto24也和zcytor19结合或通过其传导信号,这进一步支持zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25是同一细胞因子家族的成员。Zcytor19受体是II类细胞因子受体。II类细胞因子受体通常与4螺旋束细胞因子结合。例如,白细胞介素10和干扰素与该类型中的受体(例如干扰素γ受体的α和β链、干扰素α/β受体的α和β链)结合。
II类细胞因子受体的特征在于在其细胞外域中存在一个或多个细胞因子受体组件(CRM)。其它II类细胞因子受体包括zcytor11(共同拥有的美国专利5,965,704)、CRF2-4(Genbank登录号Z17227)、IL-10R(Genbank登录号U00672和NM_001558)、DIRS1、zcytor7(共同拥有的美国专利5,945,511)和组织因子。Zcytor19与除了干扰素α/β受体α链外的所有已知II类受体一样,在其细胞外域中仅具有单个II类CRM。
对编码zcytor19的人cDNA克隆(SEQ ID NO:26)的分析显示编码520个氨基酸(SEQ ID NO:27)的开放阅读框,其中包含分泌信号序列(SEQ ID NO:27第1位残基(Met)至第20位残基(Gly))和成熟zcytor19细胞因子受体多肽(SEQ ID NO:27第21位残基(Arg)至第520位残基(Arg)),其中细胞外配体结合域大约206个氨基酸残基(SEQID NO:27第21位残基(Arg)至第226位残基(Asn)),跨膜域大约23个氨基酸残基(SEQ ID NO:27第227位残基(Trp)至第249位残基(Trp)),以及细胞内域大约271个氨基酸残基(SEQ ID NO:27第250位残基(Lys)至第520位残基(Arg))。在细胞外配体结合域内,有两个III型纤连蛋白域和一个接头区。第一个III型纤连蛋白域包含SEQIDNO:27的第21位(Arg)至119位(Tyr)残基,接头包含SEQ ID NO:27的第120位(Leu)至124位(Glu)残基,第二个III型纤连蛋白域包含SEQ ID NO:27的第125位(Pro)至223位(Pro)残基。因此,包含SEQID NO:27第21位(Arg)至第223位(Pro)氨基酸的多肽被认为是配体结合片断。此外,如II类受体中一般是保守的一样,有保守的色氨酸残基(包括SEQ ID NO:27所示第43位残基(Trp)和第68位残基(Trp))和位于SEQ ID NO:27第74、82、195、217位的保守半胱氨酸残基。
此外,还鉴定到编码其中缺失了30个氨基酸残基的zcytor19变体的人cDNA克隆。该zcytor19变体(显示在SEQ ID NO:23)包含编码491个氨基酸(SEQ ID NO:24)的开放式阅读框,其中包含分泌信号序列(SEQ ID NO:24第1位残基(Met)至第20位残基(Gly))和成熟的zcytor19细胞因子受体多肽(SEQ ID NO:24第21位残基(Arg)至第491位残基(Arg)),其中细胞外配体结合域大约206个氨基酸残基(SEQID NO:24第21位残基(Arg)至第226位残基(Asn)),跨膜域大约23个氨基酸残基(SEQ ID NO:24第227位残基(Trp)至第249位残基(Trp)),而细胞内域大约242个氨基酸残基(SEQ ID NO:24第250位残基(Lys)至第491位残基(Arg))。在细胞外配体结合域内,有两个III型纤连蛋白域和一个接头区。第一个III型纤连蛋白域包含SEQ IDNO:24的第21位(Arg)至119位(Tyr)残基,接头包含SEQ ID NO:24的第120位(Leu)至124位(Glu)残基,第二个III型纤连蛋白域较短,包含SEQ ID NO:24的第125位(Pro)至223位(Pro)残基。因此,包含SEQ ID NO:24第21位(Arg)至第223位(Pro)氨基酸的多肽被认为是配体结合片断。此外,正如在II类受体中一般是保守的,有保守的色氨酸残基(包括SEQ ID NO:24所示第43位残基(Trp)和第68位残基(Trp))和位于SEQ ID NO:24第74、82、195、217位的保守半胱氨酸残基。
似乎可天然表达产生Zcytor19受体的一种截短可溶性形式的mRNA。对编码该截短的可溶zcytor19的人cDNA克隆(SEQ ID NO:28)的分析显示编码211个氨基酸(SEQ ID NO:29)的开放式阅读框,其包含分泌信号序列(SEQ ID NO:29第1位残基(Met)至第20位残基(Gly))和成熟的截短可溶性zcytor19受体多肽(SEQ ID NO:29第21位残基(Arg)至第211位残基(Ser)),其中截短的细胞外配体结合域大约143个氨基酸残基(SEQ ID NO:29第21位残基(Arg)至第163位残基(Trp)),无跨膜域,但有一个大约48个氨基酸残基的额外域(SEQ IDNO:29第164位残基(Lys)至第211位残基(Ser))。在截短的细胞外配体结合域内,有两个III型纤连蛋白域和一个接头区。第一个III型纤连蛋白域包含SEQ ID NO:29的第21位(Arg)至119位(Tyr)残基,接头包含SEQ ID NO:29的第120位(Leu)至124位(Glu)残基,第二个III型纤连蛋白域包含SEQ ID NO:29的第125位(Pro)至163位(Trp)残基。因此,包含SEQ ID NO:29第21位(Arg)至第163位(Trp)氨基酸的多肽被认为是配体结合片断。此外,正如在II类受体中一般是保守的,有保守的色氨酸残基(包括SEQ ID NO:29所示第43位残基(Trp)和第68位残基(Trp)),而且在该截短可溶性形式的zcytor19受体中的保守半胱氨酸残基位于SEQ ID NO:29第74和82位。
Zcytor19受体是与II类细胞因子受体相同的受体亚家族的成员,该亚家族的受体可以结合形成转导信号的同二聚体。亚家族的几个成员(例如结合干扰素、IL-10、IL-19和IL-TIF的受体)与第二亚基(称作β-亚基)组合以结合配体和转导信号。然而,在许多情况下,特定的β-亚基与许多特定的细胞因子受体亚基结合。例如,II类细胞因子受体,如zcytor11(美国专利5,965,704)和CRF2-4受体异二聚体化以结合细胞因子IL-TIF(见,WIPO公开文本WO 00/24758;Dumontier等,J.Immunol.164:1814-1819,2000;Spencer,SD等,J.Exp.Med.187:571-578,1998;Gibbs,VC和Pennica,Gene186:97-101,1997(CRF2-4cDNA);Xie,MH等,J.Biol.Chem.275:31335-31339,2000)。IL-10β受体被认为与CRF2-4同义(Dumoutier,L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.97:10144-10149,2000;Liu Y等,J.Immunol.152:1821-1829,1994(IL-10R cDNA)。因此,可以预期,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25将和单体、同二聚体、异二聚体和多聚体的zcytor19受体结合。试验证据已将CRF2-4(SEQ ID NOS:40和41)确定为zcytor19的推测的结合伙伴,这再次支持了zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在免疫调节系统中有重要作用,影响诸如天然免疫系统和炎症应答系统等生理机能。
定位受体/配体对中受体的表达可能对于鉴定配体作用的靶细胞或组织有重要意义。当受体/配体复合物涉及异二聚体受体且受体的一个亚基广泛表达而另一亚基以局限方式(空间或时间上有限)表达时,这尤其有用。使用原位杂交已经在皮肤癌样品中鉴定到zcytor19的表达,其中癌性颗粒状上皮为强阳性,而在正常皮肤中未观察到阳性信号。鉴定到表达zcytor19的其它组织包括胎肝,其中在窦状隙的单个核细胞的混合群体中观察到信号;在肺中观察到II型肺泡上皮内有表达;并在间充质组织的巨噬细胞样单个核细胞中观察到有表达。Zcytor19的Northen分析鉴定到一个大约4.5kb转录本的表达,该转录本表达量在心脏、骨骼肌、胰腺和前列腺组织中,以及在伯基特氏淋巴瘤(RAJI)细胞系和SW-480结肠直肠癌细胞系中最大。
本发明提供编码本文公开的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的多核苷酸分子,包括DNA和RNA分子。本领域技术人员容易明了,鉴于遗传密码子的简并性,这些多核苷酸分子中可能有相当大量的序列变异。SEQ ID NO:3是简并DNA序列,其包含了编码SEQ ID NO:2的zcyto20多肽的所有DNA。本领域技术人员将明了,通过用U替代T,SEQ ID NO:3的简并序列还提供了编码SEQ ID NO:2的所有RNA序列。因此,包含SEQ ID NO:3的第1或64位至第615位核苷酸的编码zcyto20多肽的多核苷酸和其RNA等同物是本发明所考虑的。表3列出SEQ ID NO:3中用以指示简并核苷酸位置的单字母代码。“解释(resolutions)”是代码字母所表示的核苷酸。“互补物”是指互补核苷酸的代码。例如,代码Y表示C或T,其互补物R表示A或G,其中A与T互补而G与C互补。
SEQ ID NO:46是简并DNA序列,其包含了编码SEQ ID NO:7的zcyto22多肽的所有DNA。本领域技术人员将明了,通过用U替代T,SEQ ID NO:46的简并序列还提供了编码SEQ ID NO:7的所有RNA序列。因此,包含SEQ ID NO:46的第1或64位至第615位核苷酸的编码zcyto22多肽的多核苷酸和其RNA等同物是本发明所考虑的。表3列出SEQ ID NO:46中用以指示简并核苷酸位置的单字母代码。“解释”是代码字母所表示的核苷酸。“互补物”是指互补核苷酸的代码。例如,代码Y表示C或T,其互补物R表示A或G,其中A与T互补而G与C互补。
表3
表4中给出了SEQ ID NO:3中使用的简并密码子,包括了给定氨基酸的所有可能密码子。
表4
本领域技术人员将明了,在确定代表编码每个氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时引入了某种不确定性。例如,丝氨酸的简并密码子(WSN)可以在某些情况下编码精氨酸(AGR),而精氨酸的简并密码子(MGN)可以在某些情况下编码丝氨酸(AGY)。类似的关系也存在于编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子间。因此,简并序列包括的某些多核苷酸可以编码变体氨基酸序列,但本领域技术人员通过参考SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7的氨基酸序列可以容易地鉴定出这些变体序列。变体序列的功能性可以容易地按照本文所述来测试。
本领域技术人员也将理解,不同物种可以表现出“优先密码子使用”。一般参见Grantham等,Nuc.Acids Res.8:1893-912,1980;Haas等,Curr.Biol.6:315-24,1996;Wain-Hobson等,Gene 13:355-64,1981;Grosjean和Fiers,Gene 18:199-209,1982;Holm,Nuc.Acids Res.14:3075-87,1986;Ikemura,J.Mol.Biol.158:573-97,1982。本文中,术语“优先密码子使用”或“优先密码子”是本领域的一个术语,指某个物种的细胞中最为频繁使用的蛋白质翻译密码子,因此在编码各种氨基酸的可能密码子中会偏向一种或几种代表性的密码子(见表3)。例如,苏氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT编码,但在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子;在其它物种中,例如,昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中,不同的Thr密码子可能是优先的。通过本领域已知的多种方法,可以将一个特定物种的优先密码子引入本发明多核苷酸中。将优先密码子序列引入重组DNA中可以例如通过使蛋白质在特定细胞类型或物种中的翻译更为有效来增强蛋白质的产生。因此,SEQ ID NO:3和46公开的简并密码子序列可以作为模板以优化多核苷酸在本领域常用的和本文公开的不同细胞类型和物种中的表达。可以按本文的公开对含有优先密码子的序列在不同物种中的表达进行测试和优化,并测试这些序列的功能性。
正如前面提及的,本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法是本领域熟知的。一般地,从产生大量zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25RNA的组织或细胞中分离RNA。这些组织和细胞可以通过Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201,1980)或通过根据对靶细胞或组织的活性筛选来自不同细胞类型的条件培养液来鉴定。一旦鉴定到产生该活性或RNA的细胞或组织后,就可以使用异硫氰酸胍抽提,之后在CsCl梯度中离心分离,制备总RNA(Chirgwin等,Biochemistry 18:52-94,1979)。使用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:1408-12,1972)从总RNA制备poly(A)+RNA。可以使用已知方法从poly(A)+RNA制备互补DNA。在另一可供选择的方案中,可以分离基因组DNA。然后通过例如杂交或PCR鉴定并分离编码zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的多核苷酸。
可以通过常规克隆方法获得编码zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的全长克隆。优选互补DNA(cDNA)克隆,但对于一些应用(例如在转基因动物中表达)可能优选使用基因组克隆,或对cDNA克隆进行修饰以包括至少一个基因组内含子。制备cDNA和基因组克隆的方法是熟知的并属于本领域普通技术人员的水平,它们包括使用本文公开的序列或其部分来作为探针筛选文库或作为引物来扩增文库。表达文库可以使用zcytor19受体的片断或其它特异性结合伙伴来探查。
本发明还提供来自其它物种的对应多肽和多核苷酸(定向进化同源物)。这些物种包括但不限于哺乳动物、鸟类、两栖动物、爬行动物、鱼类、昆虫和其它脊椎动物和无脊椎动物物种。尤其有意义的是来自其它哺乳动物物种的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽,包括鼠、猪、绵羊、牛、犬、猫、马和其它灵长类动物多肽。可以使用本发明提供的信息和组合物以及常规克隆技术克隆人zcyto20、zcyto21和zcyto22的定向进化同源物。例如,可以使用从表达本文公开的zcyto20、zcyto21和zcyto22的组织或细胞类型获得的mRNA克隆cDNA。mRNA的适宜来源可以通过用根据本文公开的序列设计的探针探查Northern印迹来鉴定。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。之后可以通过多种方法,例如用完整的或部分的人cDNA或用一组或多组基于公开的序列的简并探针进行探查,分离编码zcyto20、zcyto21和zcyto22的cDNA。还可以使用聚合酶链式反应或PCR(Mullis,美国专利4,683,202),使用根据本文公开的代表性人zcyto20序列设计的引物,克隆cDNA。在另一方法中,可以使用cDNA文库转化或转染宿主细胞,然后可以用zcyto20多肽的抗体、结合研究或活性测试方法检测目的cDNA的表达。类似的技术也可以应用于基因组克隆的分离。
本领域技术人员将意识到,SEQ ID NOS:1、4和6中公开的序列分别代表人zcyto20、zcyto21和zcyto22带的一种等位基因,而且预期可以出现等位变异和可变拼接。该序列的等位变体可以通过利用标准方法探查来自不同个体的cDNA或基因组文库进行克隆。SEQ ID NO:1、4和6所示DNA序列的等位变体,包括含有沉默突变的那些和其中的突变导致氨基酸序列改变的那些,均属于本发明的范围,作为SEQ IDNO:2、5和7的等位变体的蛋白质同样也属于本发明的范围。由可变拼接产生的mRNA制备的、仍保留了zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽性质的cDNA包括在本发明范围内,同样这些cDNA和mRNA编码的多肽也包括在本发明范围内。这些序列的等位变体和拼接变体可以通过使用本领域已知的标准方法探查来自不同个体或组织的cDNA或基因组文库进行克隆。
本发明还提供在诊断应用中有用的试剂。例如,zcyto20、zcyto21和zcyto22基因、包含zcyto20、zcyto21和zcyto22DNA或RNA或其亚序列的探针可以用于确定zcyto20、zcyto21和zcyto22基因是否存在于人染色体上,如19号染色体上,或是否有基因突变发生。Zcyto20、zcyto21和zcyto21定位在19号染色体的q13.13区。zcyto20、zcyto21和zcyto22基因座位上可检测的染色体畸变包括,但不限于,非整倍性、基因拷贝数改变、异质性丧失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位点改变和重排。可以通过使用分子遗传学技术,例如限制性片断长度多态性(RFLP)分析、利用PCR技术进行的短串联重复(STR)分析,和本领域已知的其它遗传学连锁分析技术(Sambrook等,同上;Ausubel等,同上;Marian,Chest108:255-65,1995),使用本发明多核苷酸来检测这些畸变。
基因位置的精确信息对于许多目的可能是有用的,包括:1)确定序列是否是现有重叠群的一部分并以多种形式例如YAC、BAC或cDNA克隆获得其它的周围遗传序列;2)为表现出与相同染色体区域连锁的遗传疾病提供可能的候选基因;和3)与模式生物(例如小鼠)相互参照,这可以帮助确定特定基因可能具有的功能。
例如,Delague等(Am.J.Hum.Genet.67:236-243,2000)鉴定到Charcot-Marie-Tooth疾病定位在19q13.1-13.3(Delague等,Am.J.Hum.Genet.67:236-243,2000)。
诊断可以帮助医师确定疾病类型和适当的相关治疗,或帮助遗传咨询。同样地,使用本领域已知的和本文描述的方法,按本文所述,本发明的抗zcyto20抗体、多核苷酸和多肽可以用于检测zcyto20多肽、mRNA或抗zcyto20抗体,由此充当标记,并可以直接用于检测遗传疾病或癌症。而且,可以使用zcyto20、zcyto21和zcyto22多核苷酸探针检测与如下情况相关的异常或基因型:染色体19q13.13中的人类疾病相关性缺失及易位、或涉及肿瘤的恶性发展的其它易位、或预期涉及恶性肿瘤或其它癌症中的染色体重排的其它19q13.13突变。类似地,可以使用zcyto20多核苷酸探针检测与如下情况有关的异常或基因型:与人类疾病或自然流产相关的染色体19q13.13三体性和染色体丢失。因此,zcyto20、zcyto21和zcyto22多核苷酸探针可以用于检测与这些缺陷有关的异常或基因型。
一般地,用于遗传连锁分析以检测患者的遗传畸变或异常的诊断方法是本领域已知的。分析性探针一般长至少20nt,但有时可以使用更短的探针(例如14-17nt)。PCR引物长至少5nt,优选15nt或更大,更优选20-30nt。对于基因或染色体DNA的总体分析,zcyto20多核苷酸探针可以包含完整的外显子或更多。本领域技术人员通过比较zcyto20、zcyto21、和zcyto22序列(分别是SEQ ID NOS:1、4和6)与zcyto20、zcyto21、和zcyto22的基因组DNA,可以容易地确定外显子。一般地,用于遗传连锁分析以检测患者的遗传畸变或异常的诊断方法是本领域已知的。大多数诊断方法包括步骤:(a)从可能患病的患者、患病的患者或隐性疾病等位基因的可能非患病携带者获得遗传样品;(b)通过在例如RFLP分析中将遗传样品与zcyto 20多核苷酸探针一起孵育(其中所述多核苷酸与互补多核苷酸序列杂交)或通过将遗传样品和有义及反义引物在PCR反应中在适当的PCR反应条件下一起孵育,产生第一反应产物;(c)通过凝胶电泳和/或其它已知方法显现第一反应产物,例如使用zcyto20多核苷酸探针(其中所述多核苷酸将与第一反应物中的互补多核苷酸序列杂交)显现第一反应产物;和(d)将显现到的第一反应产物和来自野生型患者的遗传样品的第二对照反应产物进行比较。第一反应产物和对照反应产物之间的差异将指示该患病的或可能患病的患者中的遗传异常,或非患病患者存在杂合隐性携带者表型、或病患者的肿瘤中存在遗传缺陷、或胎儿或植入前胚胎中存在遗传异常。例如,zcyto20遗传座位在限制性片断图、PCR产物长度、重复序列长度方面的差异将指示与正常野生型对照相比存在遗传异常、遗传畸变或等位差异。对照可以来自未受影响的家族成员或无关个体,这取决于所作试验及样品的可获得性。用于本发明的遗传样品包括从患者的任何组织或其它生物学样品(例如,但不限于,血液、唾液、精液、胚胎细胞、羊水等)分离的基因组DNA、mRNA和cDNA。多核苷酸探针或引物可以是RNA或DNA,并将包含SEQIDNO:1的部分、SEQ ID NO:1的互补分子、或其RNA等同物。进行人类疾病表型的遗传连锁分析的这些方法是本领域熟知的。对于基于PCR的诊断方法,一般参见Mathew(编),Protocols in Human MolecularGenetics(Humana Press,Inc.1991)、White(编),PCR Protocols:Current Methods and Applications(Humana Press,Inc.1993)、Cotter(编),Molecular Diagnosis of Cancer(Humana Press,Inc.1996)、Hanausek和Walaszek(编),Tumor Marker Protocols(HumanaPress Inc.1998)、Lo(编),Clinical Applications of PCR(HumanaPress,Inc.1998)和Meltzer(编),PCR in Bioanalysis(HumanaPress,Inc.1998))。
可以使用本发明核酸分子通过用于直接突变分析的标准方法,如限制性片断长度多态性分析、基于PCR技术的短串联重复分析、扩增不应突变系统分析(amplification-refractory mutation systemanalysis)、单链构象多态性检测、RNase切割方法、变性梯度凝胶电泳、借助荧光的错配分析和其它本领域已知的遗传分析技术(见,例如,Mathew(编),Protocols in Human Molecular Genetics(HumanaPress,Inc.1991),Marian,Chest 108:255(1995);Coleman和Tsongalis,Molecular Diagnosis(Humana Press,Inc.1996);Elles(编)Molecular Diagnosis of Genetic Diseases(Humana Press,Inc.1996);Landegren(编)LaboratoryProtocols for MutationDetection(Oxford University Press 1996);Birren等(编),GenomeAnalysis,第2卷:检测基因(Cold Spring Harbor Laboratory Press1998);Dracopoli等(编),Current Protocols in Human Genetics(John Wiley & Sons 1998);和Richards和Ward,“分子诊断检测”,《Principles of Molecular Medicine》第83-88页(Humana Press,Inc.1998)),检测与zcyto20、zcyto21和zcyto22座位有关的突变。对Zcyto20基因的突变的直接分析可以使用受试对象的基因组DNA来进行。扩增从例如外周血淋巴细胞获得的基因组DNA的方法是本领域技术人员熟知的(见,例如,Dracopoli等(编),Current Protocols inHuman Genetics,第7.1.6-7.1.7页(John Wiley & Sons 1998))。
在本发明实施方案中,分离的zcyto20编码核酸分子可以在严紧条件下与具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子杂交,与具有SEQ ID NO:1核苷酸第64-618位的核苷酸序列的核酸分子杂交,或与具有与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列的核酸分子杂交。一般地,选择的严紧条件为对于特定的序列在规定的离子强度和pH下比热熔解温度(Tm)低大约5℃。Tm是50%靶序列与完全匹配的探针发生杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。在本发明实施方案中,分离的zcyto22编码核酸分子可以在严紧条件下与具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列的核酸分子杂交,与具有SEQ ID NO:6核苷酸第64-618位的核苷酸序列的核酸分子杂交,或与具有与SEQ ID NO:6互补的核苷酸序列的核酸分子杂交。
如果一对核苷酸序列具有一定程度的互补性,则该核酸分子对,例如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA可以杂交。杂交体可以在双螺旋中耐受错配碱基对,但杂交体的稳定性受到错配程度的影响。错配的杂交体的Tm每1-1.5%碱基对错配降低1℃。改变杂交条件的严紧性使得可以控制杂交体中存在的错配程度。当杂交温度增加而杂交缓冲液的离子强度减少时,严紧程度增加。
使这些条件适用于具体的多核苷酸杂交体属于本领域技术人员的能力范围。特定靶序列的Tm是50%该靶序列与完全匹配的探针序列发生杂交时的温度(在规定的条件下)。影响Tm的那些条件包括:多核苷酸探针的大小和碱基对量、杂交溶液的离子强度和杂交溶液中去稳定剂的存在。用于计算Tm的许多等式是本领域已知的,它们对于DNA、RNA和DNA-RNA杂交体及不同长度的多核苷酸探针序列是特异的(见例如,Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press 1989);Ausubel等(编),CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Inc.1987);Berger和Kimmel(编),Guide to Molecular Cloning Techniques,(Academic Press,Inc.1987);和Wetmur,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26:227(1990))。序列分析软件如OLIGO6.0(LSR;Long Lake,MN)和Primer Premier 4.0(Premier Biosoft International;PaloAlto,CA)以及英特网上的站点,是公众可得到的工具,可基于用户定义的标准用于分析给定序列和计算Tm。这些程序也可以在规定的条件下分析给定的序列并确定适宜的探针序列。典型地,较长多核苷酸序列(>50个碱基对)的杂交在低于计算的Tm大约20-25℃的温度下进行。对于较小的探针(<50个碱基对),杂交典型地在Tm或低于计算的Tm5-10℃的温度下进行。这允许DNA-DNA和DNA-RNA杂交体以最大速率杂交。
杂交后,可以在严紧条件或在高度严紧条件下洗涤核酸分子以除去未杂交的核酸分子。典型的严紧洗涤条件包括在0.5×-2×SSC加0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中55-65℃洗涤。也就是说,编码zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽变体的核酸分子可以在严紧洗涤条件下分别与具有SEQ ID NOS:1、4和6的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)杂交,其中所述洗涤严紧性相当于0.5×-2×SSC加0.1%SDS在55-65℃下,包括0.5×SSC加0.1%SDS在55℃下或2×SSC加0.1%SDS在65℃下。本领域技术人员可以通过例如用SSPE代替洗涤溶液中的SSC,容易地设计出等同的条件。
典型的高度严紧洗涤条件包括在0.1×-0.2×SSC加0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中50-65℃洗涤。也就是说,编码zcyto20多肽变体的核酸分子可以在高度严紧洗涤条件下与具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)杂交,其中所述洗涤严紧性相当于0.1×-0.2×SSC加0.1%SDS在50-65℃下,包括0.1×SSC加0.1%SDS在50℃下或0.2×SSC加0.1%SDS在65℃下。
本发明还提供分别与SEQ ID NOS:2、5、7、9、11的多肽或它们的定向进化同源物具有基本上相似的序列一致性的分离的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽。术语“基本上相似的序列一致性”在本文中用于指分别与SEQ ID NOS:2、5、7、9、11所示序列或它们的定向进化同源物有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列一致性的多肽。本发明还包括含有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:7氨基酸残基第1至205位或第21至205位的序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%、96%、97%、98%、99%的序列一致性的氨基酸序列的多肽。本发明还包括编码这些多肽的核酸分子。确定一致性百分数的方法见如下描述。
本发明还考虑可以使用两个标准确定的zcyto20、zcyto21和zcyto22核酸分子变体:对所编码多肽分别与SEQ ID NOS:2、5、7、9、11的氨基酸序列的相似性的确定,和/或如上所述的杂交分析。这些zcyto20变体包括:(1)分别与具有SEQ ID NOS:1、4、6、8、10的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)在严紧洗涤条件下杂交的核酸分子,其中该洗涤严紧性相当于0.5×-2×SSC加0.1%SDS在55-65℃下;或(2)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列一致性的多肽的核酸分子。或者,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25变体可以表征为:(1)分别与具有SEQ ID NOS:1、4、6、8、10的核苷酸序列的核酸分子(或其互补分子)在高度严紧洗涤条件下杂交的核酸分子,其中该洗涤严紧性相当于0.1×-0.2×SSC加0.1%SDS在50-65℃下;和(2)编码分别与SEQ ID NOS:2、5、7、9、11的氨基酸序列有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或大于95%的序列一致性的多肽的核酸分子。
序列一致性百分数可通过常规方法确定。见例如Altschul等,Bull.Math.Bio.48:603(1986),和Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89;10915(1992)。简而言之,使用10的缺口(gap)开放罚分、1的缺口延伸罚分和Henikoff和Henikoff(同上)的“BLOSUM62”评分矩阵(见表4,氨基酸用标准单字母代码表示),将两个氨基酸序列对齐以优化比对分数。
表5
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
本领域技术人员明了,已有许多成熟的算法可以比对两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性检索算法是一个适宜的蛋白质比对方法,可用于检测本文公开的氨基酸序列和推测的zcyto20变体的氨基酸序列之间的一致性水平。FASTA算法描述在Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)及Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)。
简而言之,FASTA首先通过确定查询序列(例如SEQ ID NO:2)和测试序列共有的区域,即在不考虑保守氨基酸替代、插入或缺失的情况下具有最大的一致性密度(如果ktup变量为1)或具有成对的一致性(如果ktup=2)的区域,以表征序列相似性。然后使用氨基酸替代矩阵比较所有配对的氨基酸的相似性,对具有最大的一致性密度的10个区域进行重新评分,并“修剪”这些区域的末端以便仅包括对此最高分数有贡献的那些残基。如果有分数大于“截断值”(通过预先确定的公式基于序列长度和ktup值计算的)的几个区域,则检验这些经修剪的最初区域以确定这些区域是否可以结合缺口以形成近似对齐。最后,使用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444(1970);Sellers,SIAM J.Appl.Math.26:787(1974))(该算法允许氨基酸插入和缺失),对这两个氨基酸序列的最大得分区域进行比对。FASTA分析的优选参数是:ktup=1、缺口开放罚分=10、缺口延伸罚分=1和替代矩阵=BLOSUM62。这些参数可以通过修饰评分矩阵文件(“SMATRIX”)引入FASTA程序中,对此的解释参见Pearson,Meth.Enzymol.183;63(1990)的附录2。
使用上面公开的比例,FASTA还可以用于确定核酸分子的序列一致性。对于核苷酸序列比较,ktup值可以在1至6的范围内,优选3至6,最优选3,而其它参数设置为默认值。
zcyto20、zcyto21和zcyto22多肽变体或具有实质上相似的序列一致性的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸替代、缺失或插入。这些改变优选在性质上较小,即保守氨基酸替代(见表5)和不显著影响多肽的折叠或活性的其它替代;小的缺失,典型地一个至约30个氨基酸的缺失;氨基或羧基端延伸,例如氨基端甲硫氨酸残基,不超过约20-25个残基的小的接头肽或亲和标签。本发明因此提供包含与SEQ ID NO:2的相应区域有至少70%、优选至少90%、更优选95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的序列的具有约154-235个氨基酸残基的多肽。包含亲和标签的多肽还可以在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽与亲和标签之间含有蛋白酶剪切位点。优选的这些位点包括凝血酶切割位点和因子Xa切割位点。
表6
保守氨基酸替代
碱性: | 精氨酸 |
赖氨酸 | |
组氨酸 | |
酸性: | 谷氨酸 |
天冬氨酸 | |
极性: | 谷氨酰胺 |
天冬酰胺 | |
疏水: | 亮氨酸 |
异亮氨酸 | |
缬氨酸 | |
芳香: | 苯丙氨酸 |
色氨酸 | |
酪氨酸 | |
小的: | 甘氨酸 |
丙氨酸 | |
丝氨酸 | |
苏氨酸 | |
甲硫氨酸 |
可以确定包含对于维持结构完整性关键的区域或域的氨基酸残基。可以确定在这些区域中或多或少耐受改变而保持分子的整个三级结构的特定残基。分析序列结构的方法包括,但不限于具有高氨基酸或核苷酸一致性的多个序列的比对、二级结构倾向(propensity)、二元图(binary patterns)、互补堆积(complementary packing)和隐蔽的极性相互作用(Barton,Current Opin.Struct.Biol.5:372-376,1995;和Cordes等,Current Opin.Struct.Biol.6:3-10,1996)。一般地,当设计分子修饰或鉴定特定片断时,将在确定结构的同时评价修饰的分子的活性。
可以在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽中进行氨基酸序列改变以便最少破坏对于生物学活性必需的高级结构。例如,当zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽包含一个或多个螺旋时,将改变氨基酸残基以便不破坏螺旋的几何学和其中的构象改变将使一些关键功能(例如分子与其结合伙伴的结合)减弱的其它分子成分。氨基酸序列改变的效果可以通过例如以上公开的计算机模拟进行预测,或通过晶体结构分析进行测定(见例如Lapthorn等,Nat.Struct.Biol.2:266-268,1995)。本领域熟知的其它技术对变体蛋白和标准分子(例如天然蛋白)的折叠进行比较。例如,可以比较变体和标准分子中的半胱氨酸分布情况。质谱和使用还原和烷基化的化学修饰为测定与二硫键相关的或未形成这些键的半胱氨酸残基提供了方法(Bean等,Anal.Biochem.201:216-266,1992;Gray,Protein Sci.2:1732-1748,1993;和Patterson等,Anal.Chem.66:3727-3732,1994)。一般认为如果修饰的分子与标准分子具有不相同的半胱氨酸分布情况,则折叠受到影响。另一个用于测量折叠的被接受的熟知方法是园二色性(CD)。测量和比较修饰分子和标准分子产生的CD谱是常规的(Johnson,Proteins 7;205-214,1990)。晶体学是另一个分析折叠和结构的熟知方法。核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是分析折叠及蛋白质和多肽之间的结构相似性的已知方法(Schaanan等,Science257:961-964,1992)。
可以制备SEQ ID NO:2所示Zcyto20蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性分布图(Hopp等,Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828,1981;Hopp,J.Immun.Meth.88:1-18,1986和Triquier等,ProteinEngineering11:153-169,1998)。该分布图以滑动的六残基窗为基础。忽略隐蔽的G、S和T残基及暴露的H、Y和W残基。例如,在zcyto20中,亲水区域包括SEQ ID NO:2的第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸残基、SEQ ID NO:2的第54(Lys)至第59(Ala)位氨基酸残基、SEQID NO:2的第53(Phe)至第58(Asp)位氨基酸残基、SEQ ID NO:2的第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸残基、以及SEQ ID NO:2的第154(Pro)至第159(Arg)位氨基酸残基。
可以制备SEQ ID NO:7所示Zcyto22蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性分布图(Hopp等,Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828,1981;Hopp,J.Immun.Meth.88:1-18,1986和Triquier等,ProteinEngineering11:153-169,1998)。该分布图以滑动的六残基窗为基础。忽略隐蔽的G、S和T残基及暴露的H、Y和W残基。例如,在zcyto22中,亲水区域包括SEQ ID NO:7的第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸残基、SEQ ID NO:7的第54(Lys)至第59(Ala)位氨基酸残基、SEQID NO:7的第53(Phe)至第58(Asp)位氨基酸残基、SEQ ID NO:7的第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸残基、以及SEQ ID NO:7的第154(Pro)至第159(Arg)位氨基酸残基。
本领域技术人员将明了,当在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的氨基酸序列中设计修饰时应考虑亲水性或疏水性,以便不破坏整体的结构和生物学情况。对于替代尤其有意义的是选自Val、Leu和Ile组成的组或选自Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp组成的组的疏水性残基。
从IFN-α与zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25家族的成员之间的序列相似性分析(显示在表1和2),也可以推断出哪些是必需氨基酸。使用如前述“FASTA”分析等方法,可以在蛋白质家族中鉴定高相似性区域,这些区域可以用于分析保守区域的氨基酸序列。基于结构鉴定变体多核苷酸的另一可选择的方法是按上述确定编码潜在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因变体的核酸分子是否可以和具有SEQ ID NOS:1、4、6、8或10的核苷酸序列的核酸分子杂交。
可鉴定本发明多肽中的必需氨基酸的其它方法是本领域已知的方法,例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science244:1081(1989),Bass等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4498(1991),Coombs和Corey,“定点诱变和蛋白质工程”,《Proteins:Analysis and Design》,Angeletti(编),第259-311页(AcademicPress,Inc.1998))。在后一技术中,在分子的每个残基位置引入单丙氨酸突变,并按下面的公开方法测试所获突变分子的生物学或生物化学活性以确定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。也参见Hilton等,J.Biol.Chem.271:4699(1996)。
本发明还包括zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的功能性片断和编码这些功能性片断的核酸分子。在本文中,“功能性”zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25或其片断的特征在于其增殖或分化活性、诱导或抑制特化细胞功能的能力或特异结合抗zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25抗体或zcytor19受体(可溶的或固定的)的能力。如本文前述,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的特征在于6螺旋束。因此,本发明还提供如下融合蛋白,其包括:(a)包含上述一个或多个螺旋的多肽分子;和(b)包含这些螺旋中的一个或多个螺旋的功能性片断。融合蛋白的另一多肽部分可以由另一螺旋束细胞因子或干扰素(如IFN-α)提供或由促进融合蛋白分泌的非天然的和/或无关的分泌信号肽提供。
本发明zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽,包括全长多肽、生物学活性片断和融合多肽,可以根据常规技术使用其中导入了编码该多肽的表达载体的细胞来制备。本文中,“其中导入了表达载体的细胞”包括直接接受操作引入了外源DNA分子的细胞和其含有该引入的DNA的后代。适宜的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染且可以培养生长的那些细胞类型,包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA引入多种宿主细胞的技术公开在Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989;和Ausubel等,编,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.NY,1987。
一般地,编码zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的DNA序列与对于其表达必需的其它遗传元件,一般包括转录启动子和终止子,在表达载体中可操作地连接。载体通常还含有一个或多个选择标记和一个或多个复制起点,但本领域技术人员将明了在某些系统中选择标记可以在分开的不同载体上提供,而且外源DNA的复制可以通过整合至宿主细胞基因组中来实现。启动子、终止子、选择标记、载体和其它元件的选择是属于本领域普通技术人员水平内的常规设计。这些元件中的许多在文献中已有描述,并可通过供应商获得。
为了引导zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽进入宿主细胞的分泌途径,可以在表达载体中提供分泌信号序列(又称作前导序列,前原序列(prepro sequence)或前序列(presequence))。该分泌信号序列可以是zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的分泌信号序列,或可以来源于另一分泌蛋白(例如t-PA;见美国专利5,641,655)或从头合成。将分泌信号序列与zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的DNA序列可操作地连接,即将两个序列在正确的阅读框中连接并放置在一定位置以指导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5’,但某些信号序列可以位于目的DNA序列的其它地方(见例如Welch等,美国专利5,037,743;Holland等,美国专利5,143,830)。
本发明中可以使用培养的哺乳动物细胞作为宿主。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等,Cell 14:725,1978;Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics7:603,1981;Graham和Vander Eb,Virology 52:456,1973)、电穿孔(Neumann等,EMBO J.1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等,同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等,Focus15:73,1993;Ciccarone等,Focus15:80,1993)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽公开在例如Levinson等,美国专利4,713,339;Hagen等,美国专利4,784,950;Palmiter等,美国专利4,579,821;和Ringold,美国专利4,656,134。适宜的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL1650)、COS-7(ATCC No.CRL1651)、BHK(ATCC No.CRL1632)、BHK570(ATCC No.CRL10314)、293(ATCCNo.CRL 1573;Graham等,J.Gen.Virol.36:59-72,1977)和中国仓鼠卵巢细胞系(例如CHO-K1,ATCC No.CCL61;或CHO DG44,Chasin等,Som.Cell Molec.Genet.12:555,1986)。其它适宜的细胞系是本领域已知的,并可以通过公共保藏单位(如美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA)获得。一般地,优选强转录启动子,如来自SV40或巨细胞病毒的启动子。见例如美国专利4,956,288。其它适宜的启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。用于哺乳动物细胞的表达载体包括pZP-1和pZP-9(它们保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA),保藏号分别是98669和98668)及其衍生物。
一般使用药物筛选以选择其中插入了外源DNA的培养的哺乳动物细胞。这些细胞通常被称作“转染子”。在选择剂存在下培养并能够将目的基因传递给其后代的细胞被称作“稳定转染子”。优选的选择标记是编码抗生素新霉素抗性的基因。选择在存在新霉素类药物,如G-418等时进行。还可以使用选择系统以增加目的基因的表达水平,该过程被称作“扩增”。扩增的实施方式是:在有低水平选择剂时培养转染子然后增加选择剂的量以选择产生高水平的引入基因之产物的细胞。优选的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶,该酶赋予对氨甲蝶呤的抗性。也可以使用其它药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多重抗药性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。
也可以将腺病毒系统用于体外蛋白质生产。通过在细胞不会快速分裂的条件下培养腺病毒感染的非293细胞,该细胞可以长时期产生蛋白质。例如,在细胞工厂中将BHK细胞培养至汇合,然后将其暴露于编码目的分泌蛋白的腺病毒载体。然后在无血清条件下培养细胞,在该条件下允许感染的细胞存活几周而不发生显著的细胞分裂。在另一可选择的方法中,可以将腺病毒感染的293细胞以贴壁细胞的形式或以悬浮培养物的形式培养至相对高的细胞密度以产生显著大量的蛋白质(见Garnier等,Cytotechnol.15:145-55,1994)。使用任一种方案,可以根据表达蛋白在细胞中的分布重复从细胞培养物上清液、裂解物或膜碎片中分离表达的分泌异源蛋白质。在使用感染的293细胞的生产方案中,还可以有效地获得非分泌的蛋白质。
可以用通常来源于苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒根据本领域已知的方法感染昆虫细胞。在优选方法中,通过使用基于转座子的系统(描述在Luckow等,J.Virol.67:4566-4579,1993)产生重组杆状病毒。该系统利用转移载体,并可以以试剂盒的形式购买得到(Bac-to-BacTM试剂盒;Life Technologies,Rockville,MD)。所述转移载体(例如pFastBaclTM;Life Technologies)含有Tn7转座子以便可以将编码目的蛋白质的DNA移入在大肠杆菌中作为所谓“杆粒”的大质粒维持的杆状病毒基因组中。见,Hill-Perkins和Possee,J.Gen.Virol.71:971-976,1990;Bonning等,J.Gen.Virol.75:1551-1556,1994;和Chazenbalk Rapoport,J.Biol.Chem.270:1543-1549,1995。此外,转移载体可以包括与编码上文公开的多肽延伸段或亲和标签的DNA的框内融合物。使用本领域已知技术,可以将含有zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25编码序列的转移载体转化至大肠杆菌宿主细胞中,筛选带有含中断的lacZ基因(指示重组杆状病毒)的杆粒的细胞。使用常规技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA,并用其转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞,如Sf9细胞。随后产生表达zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的重组病毒。通过本领域常用方法制备重组病毒原液。
为了产生蛋白质,可以使用该重组病毒感染宿主细胞,典型地来源于秋粘虫,草地贪夜蛾(如Sf9或Sf21细胞)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(如High FiveTM细胞;Invitrogen,Carlsbad,CA)的细胞系。见例如美国专利5,300,435。使用无血清培养基培养和维持细胞。适宜的培养基配方是本领域已知的,可以从供应商处获得。从大约2-5×105个细胞的接种密度将细胞培养至1-2×106个细胞的密度,此时加入感染复数(MOI)为0.1-10,更典型地近3的重组病毒原液。所用方法是本领域一般已知的。
还可以使用其它高等真核细胞作为宿主,包括植物细胞和鸟类细胞。关于毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为载体用于植物细胞中表达基因的综述见Sinkar等,J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987。
在本发明中还可以使用真菌细胞,包括酵母细胞。在此方面特别有意义的酵母种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和Pichia methanolica。用外源DNA转化酿酒酵母细胞和从其中制备重组多肽的方法公开在例如Kawassaki,美国专利4,599,311;Kawasaki等,美国专利4,931,373;Brake,美国专利4,870,008;Welch等,美国专利5,037,743;和Murray等,美国专利4,845,075。通过选择标记所确定的表型,通常是药物抗性或在缺少特定养分(例如亮氨酸)时的生长能力,选择转化细胞。用于酿酒酵母的优选载体系统是Kawasaki等(美国专利4,931,373)公开的POTI载体系统,该系统允许通过在含有葡萄糖的培养基中的生长选择转化细胞。用于酵母的适宜启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(见例如Kawasaki,美国专利4,599,311;Kingsman等,美国专利4,615,974;和Bitter,美国专利4,977,092)和醇脱氢酶的那些。也参见美国专利4,990,446;5,063,154;5,139,936和4,661,454。用于其它酵母,包括多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、Schizosaccharomyces pombe、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、季也蒙氏毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的转化系统也是本领域已知的。见例如Gleeson等,J.Gen.Microbiol.132:3459-3465,1986;Cregg,美国专利4,882,279;和Raymond等,Yeast 14,11-23,1998。可以根据McKnight等,美国专利4,935,349的方法使用曲霉属细胞。转化Acremonium chrysogenum的方法公开在Sumino等,美国专利5,126,228。转化链孢霉的方法公开在Lambowitz,美国专利4,486,533。在Pichia methanolica中制备重组蛋白公开在美国专利5,716,808、5,736,383、5,854,039和5,888,768。
原核宿主细胞,包括细菌大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)和其它属的菌株,也是本发明中有用的宿主细胞。转化这些宿主和表达克隆在其中的外源DNA序列的技术是本领域熟知的(见例如Sambrook等,同上)。当在细菌如大肠杆菌中表达zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽时,可以将多肽保留在细胞质中,典型地以不溶性颗粒的形式,或可以通过细菌分泌序列将其引导至周质间隙。在前面的情况下,裂解细胞,回收该颗粒并使用例如异硫氰酸胍或尿素进行变性。之后通过稀释该变性剂,例如通过对尿素溶液和还原及氧化谷胱甘肽的组合进行透析,随后对缓冲盐溶液进行透析,使该变性的多肽重折叠并二聚化。在后一情况下,可以从周质间隙中以可溶性功能形式回收该多肽,方式是破碎细胞(通过如超声或渗压震扰)释放周质间隙内容物并回收该蛋白质,这由此省去变性和重折叠的需要。
根据常规方法在含有养分和其它对于所选宿主细胞的生长必需的成分的培养基中培养转化的或转染的宿主细胞。多种适宜的培养基,包括已知成分培养基和复杂培养基,是本领域已知的,一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要,培养基还可以含有诸如生长因子或血清这样的成分。生长培养基一般通过例如药物筛选或缺少可由表达载体携带的或共转染至宿主细胞中的选择标记补充的必需养分来选择含有外源添加DNA的细胞。通过常规方式,如振摇小三角瓶或发酵罐喷气给液体培养物提供充足的空气。
优选纯化本发明多肽和蛋白质达到≥80%纯度,更优选≥90%纯度,甚至更优选≥95%纯度,尤其优选药物纯状态,即相对于污染的大分子,尤其是其它蛋白质和核酸而言大于99.9%的纯度,而且不含感染剂和致热剂。优选地,纯化的多肽或蛋白质基本上不含有其它多肽或蛋白质,尤其是动物来源的那些。
可以通过常规蛋白质纯化方法,典型地通过层析技术的组合,纯化表达的重组zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质(包括嵌合多肽和多体蛋白)。一般参见亲和层析:原则和方法(Affinity Chromatography:Principles & Methods),Pharmacia LKBBiotechnology,Uppsala,瑞典,1988;和Scopes,蛋白质纯化:原则和实践(Protein Purification:Principles and Practice),Springer-Verlag,纽约,1994。包含多聚组氨酸亲和标签(典型地约6个组氨酸残基)的蛋白质可以通过在镍螯合树脂上亲和层析进行纯化。见例如Houchuli等,Bio/Technol.6;1321-1325,1988。包含glu-glu标签的蛋白质可以根据常规方法通过免疫亲和层析纯化。见例如Grussenmeyer等,同上。麦芽糖结合蛋白融合物根据本领域已知的方法在直链淀粉柱上纯化。
Zcyto20、zcyto2l、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽还可以根据本领域已知的方法通过化学合成制备,包括完全固相合成、部分固相合成方法、片断缩合或经典的溶液合成。见例如Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149,1963;Stewart等,Solid Phase PeptideSynthesis(第2版),Pierce Chemical Co.,Rockford,IL,1984;Bayer和Rapp,Chem.Pept.Prot.3:3,1986;和Atherton等,SolidPhase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford,1989。体外合成对于制备较小的多肽是尤其有利的。
使用本领域已知方法,可以制备单体或多体;糖基化或未糖基化;PEG化(pegylated)或未PEG化(non-pegylated)形式的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质,这些蛋白质可以包括或可以不包括起始甲硫氨酸残基。
用于zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性分析的靶细胞包括,但不限于,血管细胞(尤其是内皮细胞和平滑肌细胞)、造血(髓样和淋巴样)细胞、肝脏细胞(包括肝细胞、有窗内皮细胞、枯否氏细胞和Ito细胞)、成纤维细胞(包括人皮肤成纤维细胞和肺成纤维细胞)、胎肺细胞、关节滑膜细胞、周细胞、软骨细胞、成骨细胞和前列腺上皮细胞。内皮细胞和造血细胞来源于共同的祖先细胞,即成血管细胞(hemangioblast)(Choi等,Development125:725-732,1998)。
本发明的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质可以通过其活性,即调节应答细胞类型的增殖、分化、迁移、粘着或代谢,进行表征。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质的生物学活性可以使用设计以检测细胞增殖、分化、迁移或粘着,或细胞代谢的改变(例如其它生长因子或其它大分子的产生)的体外或体内试验来测试。许多适宜的试验是本领域已知的,本文中公开了代表性试验。对于筛选,例如对于确定氨基酸替代、缺失或插入的效果,使用培养细胞进行的试验是最方便的。然而,鉴于发育过程(例如血管发生、伤口愈合)的复杂性,一般使用体内试验验证和进一步表征生物学活性。某些体外模型,例如Pepper等的三维胶原凝胶基质模型(Biochem.Biophys.Res.Comm.189:824-831,1992)足够复杂以致可测试组织学效果。可以使用外源产生的蛋白质进行试验,或可以使用表达目的多肽的细胞在体外或体内进行试验。可以使用单独的或与其它生长因子(例如VEGF家族成员)或造血细胞因子(如EPO、TPO、G-CSF、干细胞因子)结合的zcyto20蛋白质进行试验。代表性的试验公开如下。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的活性可以使用培养细胞体外测量,或通过将本发明分子施用于适当的动物模型来体内测量。测量细胞增殖或分化的试验是本领域熟知的。例如,测量增殖的试验包括例如对中性红染料的化学敏感性(Cavanaugh等,Investigational New Drugs 8:347-354,1990)、在增殖细胞的DNA中掺入放射性标记的核苷酸(公开在例如Rains和Ross,MethodsEnzymol.109:749-773,1985;Wahl等,Mol.Cell Biol.8:5016-5025,1988;和Cook等,Analytical Biochem.179:1-7,1989)、在增殖细胞的DNA中掺入5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(Porstmann等,J.Immunol.Methods 82:169-179,1985)、和使用四氮唑盐(Mosmann,J.Immunol.Methods 65:55-63,1983;Alley等,CancerRes.48:589-601,1988;Marshall等,Growth Reg.5:69-84,1995;和Scudiero等,Cancer Res.48:4872-4833,1988)。分化可以使用能被诱导分化出更成熟表型的适宜前体细胞来测试。测量分化的试验包括例如测量与组织的阶段特异性表达有关的细胞表面标记、酶活性、功能活性或形态学改变(Watt,FASEB,5:281-284,1991;Francis,Differentiation57:63-75,1994;Res,Adv.Anim.CellBiol.Technol.Bioprocesses,161-171,1989;所有文献均并入本文作为参考)。
还可以使用设计以检测zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25诱导的一种或多种其它生长因子或其它大分子的产生的试验来检测zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的活性。优选的该类试验包括确定肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、白细胞介素-6(IL-6)、VEGF、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管生成素和肝脏产生的其它大分子是否存在的那些试验。适宜的试验包括使用应答目的大分子的靶细胞进行的有丝分裂试验、受体结合试验、竞争结合试验、免疫学试验(例如ELISA)和本领域已知的其它形式。可以从经处理的原代人皮肤成纤维细胞、滑膜细胞和软骨细胞测量金属蛋白酶分泌。响应在zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质存在下培养而产生的胶原酶、明胶酶和基质溶解酶(stromalysin)的相对水平可以使用酶谱凝胶(Loita和Stetler-Stevenson,Cancer Biology 1:96-106,1990)测量。皮肤成纤维细胞和软骨细胞应答测试蛋白质而进行的原胶原/胶原合成可以使用3H-脯氨酸在新生的分泌胶原中的掺入来测量。3H-标记的胶原可以通过SDS-PAGE之后放射自显影进行观察(Unemori和Amento,J.Biol.Chem.265:10681-10685,1990)。从皮肤成纤维细胞和软骨细胞分泌的糖胺聚糖(GAG)可以使用1,9-二甲基亚甲蓝染料结合试验(Farndale等,Biochem.Biophys.Acta 883:173-177,1986)测量。胶原和GAG试验还可以在存在IL-1α或TGF-α时进行以检测zcyto20蛋白质修饰针对这些细胞因子建立的应答的能力。
包含zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的蛋白质家族的某些成员已被证实可以增加体内循环的单核细胞数量。活化单核细胞对于天然免疫和获得性免疫均是重要的。例如,已证实单核细胞的活化可以通过几种机制刺激抗原呈递。抗原呈递则促进T细胞(细胞毒性和辅助T细胞)的活化和增殖。树突细胞的成熟和活化也促进T细胞的激活和天然及获得性免疫。而且已证实活化的单核细胞和巨噬细胞的增加可以增加细胞裂解活性。因此,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用作抗感染剂,以增强天然的、细胞介导的和体液免疫应答。在CD14+单核细胞中观察到ICAM染色增强,提示zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在单核细胞的活化中有重要作用。尽管数据显示该家族成员可以促进对病毒的抗病毒应答,但也可以影响细菌和寄生虫。
可进行单核细胞活化试验以:(1)探测zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质进一步刺激单核细胞激活的能力,和(2)检测zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质调节由附着诱导的或由外毒素诱导的单核细胞活化的能力(Fuhlbrigge等,J.Immunol.138:3799-3802,1987)。响应活化产生的IL-1α和TNFα的水平可以通过ELISA(Biosource,Inc.Camarillo,CA)测量。单核细胞/巨噬细胞借助CD14(LPS受体)对外毒素极为灵敏,具有适当水平的外毒素样活性的蛋白质可以活化这些细胞。
单核细胞水平的增加提示,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以对骨髓中的髓样祖先细胞直接产生作用。髓样祖先细胞向单核细胞分化的增加是例如化疗后恢复免疫能力所必需的。因此,给接受化疗的患者施用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以促进患者的恢复和提高他们抵抗通常与化疗相关的感染的能力。因此,本发明提供通过如下方式扩增单核细胞或单核细胞祖先细胞的数量的方法:用本发明分子培养骨髓或外周血细胞以便体外或离体地实现单核细胞或单核细胞祖先细胞数量的增加。本发明还提供了给需要增加单核细胞或单核细胞祖先细胞的哺乳动物体内施用本发明分子的方法。单核细胞和单核细胞祖先细胞的增加可以使用临床医师、医师和本领域其它技术人员熟知的方法测量。单核细胞属于髓样造血细胞谱系,因此对该谱系中的其它细胞的影响并不是不寻常的。例如,当一种因子利于髓样或淋巴样谱系中的一类细胞的分化或增殖时,这也可以影响具有共同的祖先细胞或干细胞的其它细胞的产生。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质的造血活性可以在培养的多种造血细胞上进行测试。优选的测试方法包括原代骨髓集落分析和晚期谱系限制性集落分析,它们是本领域已知的(例如Holly等,WIPO公开文本WO95/21920)。将接种在适宜半固体培养基(例如含有15%胎牛血清、10%牛血清白蛋白和0.6%PSN抗生素混合物的50%甲基纤维素)上的髓细胞在存在测试多肽的情况下培养,然后显微镜检测集落形成。已知的造血因子用作对照。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽对造血细胞系的促有丝分裂活性可以按以上公开测量。
细胞迁移基本上按Kahler等(Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology 17:932-939,1997)公开的方法测定。如果一个蛋白质诱导细胞从低蛋白浓度的区域向高蛋白浓度的区域迁移,则该蛋白被认为具有趋化性。典型的试验使用修饰的Boyden室(用聚苯乙烯膜分开两室)(Transwell;Corning Costar Corp.)进行。将稀释在含有1%BSA的培养基中的测试样品加入含Transwell的24孔板的下部室中。然后,将细胞放在预先用0.2%明胶处理的Transwell插入物上。37℃孵育4小时后测量细胞迁移。除去Transwell膜顶部的非迁移细胞,并固定附着在膜下表面上的细胞,用0.1%结晶紫染色。然后用10%乙酸提取染色的细胞,并于600nm测量吸光度。然后从标准标定曲线计算迁移。还可以使用Grant等(“血管发生是上皮-间充质相互作用的一个成分”,Goldberg和Rosen,Epithelial-Mesenchymal Interaction in Cancer,BirkhauserVerlag,1995,235-248;Baatout,Anticancer Research 17:451-456,1997)的matrigel方法测量细胞迁移。
细胞粘着活性基本上按照LaFleur等(J.Biol.Chem.272:32798-32803,1997)公开的方法测定。简而言之,用测试蛋白质包被微量滴定板,用BSA封闭非特异位点,并以大约104-105个细胞/孔的密度接种细胞(如平滑肌细胞、白细胞或内皮细胞)。在37℃孵育这些孔(典型地大约60分钟),然后通过温和洗涤除去未贴壁的细胞。通过常规方法(例如用结晶紫染色、裂解细胞并测定裂解物的光密度)定量贴壁细胞的数量。对照孔用已知的粘着蛋白,如纤连蛋白或玻连蛋白包被。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质的活性可以用硅基生物传感显微生理计(microphysiometer)(其测量与受体结合及随后的细胞生理反应有关的细胞外酸化速率或质子排出)测量。此类装置的一个例子是Molecular Devices(Sunnyvale,CA)制造的CytosensorTM显微生理计。多种细胞应答,如细胞增殖、离子运输、能量产生、炎症应答、调节和受体激活等均可以通过此方法测量。见,例如,McConnell等,Science 257:1906-1912,1992;Pitchford等,Meth.Enzymol.228:84-108,1997;Arimilli等,J.Immunol.Meth.212:49-59,1998;和Van Liefde等,Eur.J.Pharmacol.346:87-95,1998。显微生理计可以用于分析粘着或非粘着真核细胞或原核细胞。通过测量细胞培养基中细胞外酸化随时间推移的改变,显微生理计可以直接测量出细胞对多种刺激(包括Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白、它们的激动剂和拮抗剂)的应答。优选使用显微生理计测量相对于不应答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的对照真核细胞,Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25应答性真核细胞的反应。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25应答性真核细胞包括通过转染Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受体而产生的应答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的细胞、以及天然应答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的细胞。通过细胞外酸化的改变(如增加或减少)测量到的暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的细胞与对照(未暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)在反应方面的差异,是对Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25调节的细胞应答的直接测量。而且,由Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25调节的此类应答还可以在多种刺激物下进行测定。因此,本发明提供鉴定Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白的激动剂和拮抗剂的方法,包括提供应答Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的细胞,将这些细胞的第一部分在无测试化合物时进行培养,将这些细胞的第二部分在有测试化合物时进行培养,和检测第二部分细胞相对于第一部分细胞在细胞应答方面的改变,如增加或减少。细胞应答的改变表现为可测量的细胞外酸化速率的改变。将上述细胞的第三部分在有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白但无测试化合物的情况下进行培养,这为Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25应答性细胞提供了阳性对照,并为比较测试化合物的激动剂活性与Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的活性提供了对照。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的拮抗剂可以通过使细胞在有和无测试化合物的情况下暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白进行鉴定,籍此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25刺激活性的降低指示测试化合物具有拮抗剂活性。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多核苷酸在动物中的表达为进一步研究体内过量产生或抑制蛋白质的生物学效应提供了模型。可以使用病毒载体或裸DNA将Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的编码多核苷酸和反义多核苷酸引入测试动物,如小鼠中,或可以制备转基因动物。
测试本发明蛋白质的一个体内方法利用了病毒递送系统。用于此目的的实例病毒包括腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和腺相关病毒(AAV)。腺病毒,一种双链DNA病毒,是目前研究得最好的递送异源核酸的基因转移载体。综述见Becker等,Meth.Cell Biol.43:161-89,1994;和Douglas和Curiel,Science & Medicine 4:44-53,1997。腺病毒系统有几个优点。腺病毒可以(i)容纳相当大的插入DNA;(ii)生长至高滴度;(iii)感染广谱的哺乳动物细胞类型;和(iv)与许多不同的启动子,包括遍在的、组织特异性的和可调节的启动子一起使用。由于腺病毒在血流中是稳定的,故它们可以通过静脉注射给药。
通过缺失部分腺病毒基因组,可以容纳更大的异源DNA插入片断(多达7kb)。可以通过直接连接或通过和共转染的质粒同源重组,将这些插入片断整合在病毒DNA中。在一个示例性系统中,从病毒载体中缺失必需的E1基因,这样除非宿主细胞(如人293细胞系)提供E1基因,否则该病毒将不能复制。当通过静脉内方式施用给完整动物时,腺病毒主要靶向肝。如果腺病毒递送系统具有E1基因缺失,则该病毒不能在宿主细胞中复制。然而,宿主组织(例如肝)将表达和加工(并且,如果存在信号序列,分泌)该异源蛋白质。分泌的蛋白质将在高度血管化的肝中进入循环系统,并可以测定它对感染动物的作用。
基因递送的另一备选方法包括采取机体的细胞并以裸DNA质粒的形式将载体引入该细胞中。然后将转化的细胞重新植入机体。将裸DNA载体引入宿主细胞的方法是本领域已知的,包括转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运者。见,Wu等,J.Biol.Chem.263:14621-14624,1988;Wu等,J.Biol.Chem.267:963-967,1992;和Johnston和Tang,Meth.Cell Biol.43:353-365,1994。
还可以制备(Lowell等,Nature366:740-742,1993)经工程化表达Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因的转基因小鼠、和表现出完全缺失Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因功能的小鼠,后者被称作“敲除小鼠(knockout mice)”(Snouwaert等,Science 257:1083,1992)。可以利用这些小鼠在体内系统中研究Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因和由此编码的蛋白质。转基因小鼠对于研究Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白在早期发育中的作用尤其有用,因为它们允许鉴定由于特异因子的过度或不足表达引起的发育异常或中断。也参见Maisonpierre等,Science 277:55-60,1997和Hanahan,Science 277:48-50,1997。转基因表达的优选启动子包括来自金属硫蛋白和白蛋白基因的启动子。
对肌肉收缩的正常抑制性控制的丧失与选择的分泌γ氨基丁酸的神经元的损伤或紊乱有关。例如,僵人综合征表现出显著的肌肉系统僵硬,这被认为是通过干扰产生γ氨基丁酸(GABA)的神经元的功能来介导的。其它相关的神经肌肉疾病包括肌强直、代谢性肌病、艾萨克综合征、肌张力障碍和强直性痉挛(Valldeoriola,J.Neurol.246:423-431,1999)。
类似地,可以在经历肿瘤进展的组织或细胞中对Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽、或它们在组织中的表达丧失进行直接测量。与正常组织相比,癌前或癌性情况下细胞侵入性和运动性的增加、或Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25表达的获得或丧失可以用于诊断肿瘤进程中的转化、侵入和转移。就这一点而论,有关肿瘤进展或转移阶段的信息将帮助医师针对给定的独特癌症患者选择最适当的治疗或治疗侵袭性。用于测量(mRNA或蛋白质的)表达获得和丧失的方法是本领域熟知的并描述在本文中,可以将它们应用于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的表达。例如,可以使用调节细胞运动性的多肽的出现或消失来帮助诊断前列腺癌和进行预后(Banyard,J.和Zetter,B.R.,Cancer andMetast.Rev.17:449-458,1999)。作为细胞运动性的效应子或作为肝特异性标志,Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的表达获得或丧失可以用于诊断脑癌和其它癌症。而且,类似于前列腺特异性抗原(PSA),相对于正常对照,患者中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的水平增加或抗zcyto20、抗zcyto21、抗zcyto22、抗zcyto24和抗zcyto25抗体可以指示脑癌和其它癌症(见例如Mulders,TMT等,Eur.J.Surgical Oncol.16:37-41,1990)。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25在正常发现不表达这些多核苷酸的组织中的强表达可以用于诊断细胞或组织类型中的异常、癌性肝组织向非肝组织的侵入或转移,并可以帮助医师指导进一步的测试或研究或帮助医师指导治疗。
此外,Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多核苷酸探针、抗Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25抗体、及对组织中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25存在的检测也可以用于评价是否存在正常表达Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的脑或其它组织,例如,在涉及切除患病的或癌性肝或神经组织的手术后进行评价。在这点上,本发明的多核苷酸、多肽和抗体可以用于帮助确定手术后(例如,脑和其它癌的手术后)是否所有的组织都被切除。在这些情况中,尤其重要的是除去所有潜在的患病组织以便在癌症后实现最大的恢复和最小的复发。优选的实施方案包括可以组织学或原位使用的荧光的、放射性标记的或量热方式标记的抗zcyto20抗体和Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽结合伙伴。
而且,可以体内测量Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的活性和对肿瘤进展及转移的影响。几个同基因小鼠模型已被开发用于研究多肽、化合物或其它治疗对肿瘤进展的影响。在这些模型中,将传代培养的肿瘤细胞植入与肿瘤供体相同品系的小鼠中。细胞将在受体小鼠中发育成具有相似特征的肿瘤,而且在某些模型中会发生转移。对于我们的研究,适当的肿瘤模型包括尤其是Lewis肺癌(ATCC No.CRL-1642)和B16黑素瘤(ATCC No.CRL-6323)。这两个均是常用的肿瘤系,与C57BL6小鼠同基因,易于在体外培养和操作。由植入其中任一个细胞系引起的肿瘤能够在C57BL6小鼠中向肺转移。Lewis肺癌模型近来被用于小鼠中鉴定血管生成抑制剂(O’Reilly MS等,Cell 79:315-328,1994)。通过每日注射重组蛋白、激动剂或拮抗剂或一次性注射重组腺病毒用试验剂处理C57BL6/J小鼠。此处理后3天,将105至106个细胞移植在背部皮肤之下。或者,可以在移植前用重组腺病毒(例如表达Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的重组腺病毒)感染细胞本身,以便在肿瘤位置或在细胞内而不是在全身合成该蛋白质。该小鼠正常在5日内长出可见的肿瘤。允许该肿瘤生长多达3个星期,在此期间它们在对照处理组中可以达到1500-1800mm3大小。在整个实验过程中仔细监测肿瘤的尺寸和体重。处死时,与肺和肝一起取出肿瘤并称重。肺重显示出与转移的肿瘤负荷十分相关。作为另一种测量方法,计数肺表面转移瘤。使用本领域已知的和本文中描述的方法处理切下的肿瘤、肺和肝以便进行组织病理学检查、免疫组织化学分析和原位杂交。由此可以评价表达的目的多肽,例如Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25对肿瘤募集血管系统和进行转移的能力的影响。此外,除了使用腺病毒外,还可以用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25瞬时转染植入的细胞。应用稳定的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25转染子以及应用诱导型启动子体内激活Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25表达是本领域已知的,而且可以将它们用于该系统中以评价zcyto20对转移的诱导。而且,可以直接将纯化的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25或Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的条件培养基注射至该小鼠模型中,并由此用于该系统。一般地参见,O’Reilly MS等,Cell 79:315-328,1994;和Rusciano D等,肝转移的鼠模型,Invasion Metastasis 14:349-361,1995。
可以使用反义方法学抑制zcyto20基因转录以检测该抑制的体内效应。设计与Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的编码多核苷酸(例如SEQ ID NO:1中所示多核苷酸)的区段互补的多核苷酸,以便其与Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的编码mRNA结合并抑制该mRNA翻译。这些反义寡核苷酸还可以用于细胞培养物中抑制Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的编码基因的表达。
大多数细胞因子以及活化淋巴细胞产生的其它蛋白质对于整个身体的细胞分化、激活、募集和细胞稳态有重要的生物学作用。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25及其活性的抑制剂预期具有多种治疗用途。这些治疗用途包括治疗需要免疫调节的疾病,包括自身免疫病如类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮和糖尿病。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25对于炎症调节可能是重要的,因此可以用于治疗类风湿性关节炎、哮喘和败血症。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可能在介导肿瘤发生中有作用,由此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25拮抗剂可以用于治疗癌症。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用于调节免疫系统,由此,可以使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25及Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的拮抗剂降低移植排斥、预防移植物抗宿主疾病、增强对感染性疾病的免疫、治疗无免疫应答的患者(例如HIV+患者)或改善疫苗。
本发明蛋白质家族的成员已证实具有与干扰素α相似的抗病毒作用。在美国,干扰素已被批准用于治疗自身免疫病、尖锐湿疣、慢性丙型肝炎、膀胱癌、宫颈癌、喉乳头状瘤病、蕈样肉芽肿病、慢性乙型肝炎、感染人免疫缺陷病毒的患者中的卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、毛细胞白血病和多发性硬化。此外,Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以通过抑制细胞增殖用于治疗各种形式的动脉硬化,如动脉粥样硬化。因此,本发明考虑具有zcyto20活性的蛋白质、多肽和肽在治疗这些疾病以及治疗视网膜病中的用途。本发明还考虑具有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的蛋白质、多肽和肽在治疗淋巴增生性疾病(包括B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病)中的用途。
干扰素还被证实可以诱导培养细胞表达抗原(见例如,Auth等,Hepatology 18:546(1993),Guadagni等,Int.J.Biol.Markers9:53(1994),Girolomoni等,Eur.J.Immunol.25:2163(1995),和Maciejewski等,Blood 85:3183(1995))。此活性增强了体外鉴定新肿瘤相关抗原的能力。而且,干扰素提高人肿瘤抗原的表达水平的能力说明干扰素能够作为佐剂用于免疫治疗中或增强使用抗肿瘤抗原抗体进行的免疫闪烁照相术(immunoscintigraphy)(Guadagni等,Cancer Immunol.Immunother.26:222(1988);Guadagni等,Int.J.Biol.Markers 9:53(1994))。因此,本发明包括具有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的蛋白质、多肽和肽作为佐剂用于免疫治疗或用于改善使用抗肿瘤抗原抗体进行的免疫闪烁照相术的用途。
检测和诊断病毒感染的方法是本领域技术人员熟知的。用于测量响应本发明分子的施用引起的病毒下降的确切方法将取决于患者、病毒感染类型等。例如,方法包括,但不限于,测量CD4细胞数量的改变、血清学试验、通过常规实时定量聚合酶链式反应试验测量病毒DNA和病毒RNA、病毒诱导的抗体水平、免疫荧光和酶联免疫吸附试验、致细胞病毒效应和组织学。
而且,Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以结合CD4或另外的白细胞受体,并表现出抗病毒作用,例如抗人免疫缺陷病毒(HIV)或人T细胞嗜淋巴细胞病毒(Human T-cell lymphotropicvirus,HTLV)。或者,zcyto20多肽可以和病毒竞争病毒受体或共同受体以阻断病毒感染。Zcyto20可以胃肠外给药以预防病毒感染或降低正在进行的病毒复制和再感染(Gayowski,T.等,Transplantation64:422-426,1997)。因此,zcyto20可以用作抗病毒治疗剂,例如治疗病毒性白血病(HTLV)、AIDS(HIV),或由如轮状病毒、杯状病毒(例如,Norwalk Agent)和某些致病性腺病毒株引起的胃肠道病毒感染、乙型肝炎和丙型肝炎。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25还可以用于治疗心肌炎,一种当心脏涉及炎症过程时引起的疾病。淋巴细胞浸润和肌细胞裂解被认为是病毒、细菌、真菌或寄生虫感染后的结果(见例如,Brodison等,J.Infection 37:99(1998))。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以通过静脉内或皮下途径注射以治疗与心肌炎有关的感染。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25还可以通过静脉内途径作为免疫调节性细胞因子给药以治疗自身免疫性心肌炎。干扰素的剂量可以使用A/J小鼠心肌炎自身免疫模型来推断(Donemeyer等,J.Exp.Med.182:1291(1995))。
给绵羊外源性施用干扰素τ可以增加妊娠率(Aggarwal,HumanCytokines III,(B1ackwell Science 1997))。正如本文所述,zcyto20mRNA在胎盘中表达。因此,本发明包括Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25,如本文公开的人Zcyto20、zcyto21和zcyto22,在促进和保护胎儿生长方面的用途。作为举例说明,可以使用Zcyto20、zcyto21和zcyto22保护发育的胎儿免受病毒(例如人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒等)感染。此外,Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以用于促进体外受精。
近来的报道提示,I型干扰素可以在病毒感染早期通过在胰腺β细胞中诱导强抗病毒状态起到预防病毒诱导的糖尿病的作用(Flodstroem等,Nature Immunology 3,373-382(2002))。这可以防止由于病毒诱导的细胞死亡以及伴随发生的自身免疫引起的β细胞丧失。Zcyto20、21和22还可以在表达它们的受体zcytor19的细胞中诱导抗病毒状态。Zcytor19在胰腺组织中高表达,因此,zcyto20-22可以起到预防因β细胞死亡引起的病毒诱导性糖尿病的作用。此外,还可以将I型干扰素在预防病毒诱导性糖尿病中的作用扩展至其它病毒诱导的自身免疫疾病,因此,zcyto20-22也可能起到预防其它疾病(如肌硬化(muscular sclerosis)、狼疮和在表达zcyto20-22受体zcytor19的组织中病毒诱导的自身免疫病)的作用。
I型干扰素的慢性系统性表达还与I型糖尿病的病理有关。由于I型干扰素和zcyto20-22在生物学活性和基因诱导方面的相似性,zyto20、21或22的慢性系统性表达也可能在I型糖尿病的病理中有作用。因此,zcyto20-22活性的抑制剂在胰腺中可能对于预防I型糖尿病是有益的。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽可以单独或联合其它脉管生成剂或血管生成剂(包括VEGF)一起给药。当与其它药剂联合使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25时,对于所治疗的具体疾病,可以适当地同时或相继施用这两种化合物。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25对于治疗肿瘤发生是有用的,因此可以用于治疗癌症。zcyto20可以抑制抗IgM刺激的正常B细胞,在B细胞肿瘤系中观察到类似效果,这提示使用Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25治疗患者以诱导B细胞肿瘤细胞进入增殖较不活跃的状态可以具有治疗益处。可以将该配体和其它已应用的药剂(包括常规化疗药剂以及免疫调节剂如干扰素α)联合给药。α/β干扰素已被证实可以有效地治疗某些白血病和动物疾病模型,而且对于B细胞肿瘤来源的细胞系,干扰素α和zcyto20的生长抑制作用可以相加。
本发明提供降低赘生性B或T细胞增殖的方法,包括给具有B或T细胞赘生物的哺乳动物施用给药量足以降低赘生性B或T细胞增殖的zcyto20组合物。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25可以刺激来自骨髓祖先细胞的裂解性NK细胞并在抗原受体活化后刺激T细胞增殖,这将增强对接受同种异型骨髓移植的患者的治疗,因此,在输注或不输注供体淋巴细胞的情况下,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25均可以增强抗肿瘤应答的产生。
另一方面,本发明提供降低赘生性B或T细胞增殖的方法,包括给具有B或T细胞赘生物的哺乳动物施用给药量足以降低赘生性B或T细胞增殖的zcyto20拮抗剂组合物。而且,该zcyto20拮抗剂可以是配体/毒素融合蛋白。
可以使用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25与皂草素的融合毒素对抗一组类似的白血病和淋巴瘤,从而扩大了可以用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25治疗的白血病范围。融合毒素介导的zcyto20受体激活为抑制靶细胞生长提供了两个独立方式,第一个方式与单独使用配体时观察到的效应一样,而第二个方式是由于通过受体内化递送毒素。
对于药物应用,可以根据常规方法对zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质进行配制以便局部或胃肠外,尤其是静脉内或皮下给药。一般,药物制剂包括zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽和可药用载体,如盐水、缓冲盐水、5%葡聚糖水溶液等。制剂还可以包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止蛋白质丢失在瓶表面上的白蛋白等。配制方法是本领域熟知的,公开在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第19版,1995。zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25优选以大约10至100μg/ml总体积的浓度使用,但也可以使用1ng/ml至1000μg/ml的浓度。对于局部使用,例如为了促进伤口愈合,可以按0.1-10μg/cm2伤口面积使用该蛋白质,确切的剂量由临床医师根据接受的标准,考虑待治疗疾病的性质和严重性、患者的特性等来确定。剂量的确定属于本领域普通技术人员的水平。可以在治疗期间每日或间歇地给药。可以在一至几个小时的典型时间期限内通过快速注射或灌注进行静脉给药。还可以使用缓释制剂。一般,zcyto20的治疗有效量是指足以造成所治疗疾病出现临床上显著改变(例如造血或免疫功能方面的临床显著改变、发病率的显著降低或组织学评分的显著增加)的量。
zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质、激动剂和拮抗剂可以用于调节应答性细胞类型的扩增、增殖、激活、分化、迁移或代谢,这些细胞类型包括原代细胞和培养的细胞系。在这方面尤其有意义的是造血细胞、间充质细胞(包括干细胞和成熟髓样细胞和淋巴样细胞)、内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、肝细胞、神经细胞和胚胎干细胞。将zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽加入这些细胞类型的组织培养基中,浓度为约10pg/ml至约100ng/ml。本领域技术人员将明了,可以在培养基中有利地联合使用zcyto20蛋白质和其它生长因子。
在实验室研究领域,zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白还可以用作分子量标准或在测定该蛋白质的循环水平的分析中用作试剂,如用于诊断以过量或低量产生zcyto20蛋白质为特征的疾病或分析细胞表型。
还可以用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质鉴定它们活性的抑制剂。将测试化合物加入上述试验中以鉴定抑制zcyto20蛋白质活性的化合物。除了上述试验外,还可以在多种设计用来测量受体结合或zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25依赖性细胞应答的刺激/抑制的试验中测试样品对zcyto20活性的抑制。例如,可以用响应zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25所刺激的细胞途径的报道基因结构转染zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25应答性细胞系。该类报道基因结构是本领域已知的,一般包括可操作地与编码可检测蛋白质(如萤光素酶)的基因连接的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25激活的血清效应元件(SRE)。在靶细胞上测试候选化合物、溶液、混合物或提取物抑制zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的能力,这可以通过zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25刺激的报道基因表达的减少来证实。此类试验可以检测直接阻断zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25与细胞表面受体结合的化合物以及阻断发生在受体-配体结合后的细胞途径中的过程的化合物。在备选方法中,可以使用连接有可检测标记(例如125I、生物素、辣根过氧化物酶、FITC等)的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25,测试直接阻断zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25与受体结合的化合物或其它样品。在此类试验中,测试样品抑制标记的zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25与受体结合的能力指示了抑制活性,这可以通过别的试验进行验证。用于结合试验中的受体可以是细胞受体或分离的固定化受体。
本文中,术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其抗原结合片断如F(ab’)2和Fab片断、单链抗体等,其中包括遗传工程化抗体。非人抗体可以通过在人构架和恒定区上嫁接非人CDR、或通过整合完整的非人可变区(任选地通过替换暴露的残基用人样表面“遮蔽”它们,其结果是“镶饰”抗体)实现人源化。在一些情况中,人源化抗体可以在人可变区构架域中保留非人残基以增加正确的结合特征。通过使抗体人源化可以增加生物学半衰期,并减少在施用于人后出现不良免疫应答的可能性。本领域技术人员可以用特定和不同的恒定区(即不同的Ig亚型)制备人源化抗体以促进或抑制与特定抗体恒定区有关的不同免疫功能。如果抗体与Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽或蛋白质的结合亲和力比抗体与对照(非Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)多肽或蛋白质的结合亲和力高至少10倍,则该抗体被定义为发生特异结合。本领域普通技术人员可以容易地测定单克隆抗体的亲和力(见,例如Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.51:660-627,1949)。
制备单克隆和多克隆抗体的方法是本领域熟知的(见例如Hurrell,J.G.R.编,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques andApplications,CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL,1982,并入本文作为参考)。尤其有意义的是制备针对亲水性抗原性位点的抗体,所述抗原性位点包括例如SEQ ID NO:2第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸残基,SEQ ID NO:2第54(Lys)至59(Ala)位氨基酸残基,SEQ ID NO:2第53(Phe)至58(Asp)位氨基酸残基,SEQ ID NO:2第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸残基,及SEQ ID NO:2第154(Pro)至159(Arg)位氨基酸残基。例如,zcyto22中,亲水区域包括SEQ ID NO:7第169(Glu)至174(Glu)位氨基酸残基,SEQ ID NO:7第54(Lys)至59(Ala)位氨基酸残基、SEQ ID NO:7第53(Phe)至58(Asp)位氨基酸残基,SEQ IDNO:7第168(Gln)至173(Lys)位氨基酸残基,及SEQ ID NO:7第154(Pro)至159(Arg)位氨基酸残基,它们将是有用的。本领域普通技术人员将明了,多克隆抗体可以从多种温血动物如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠制备。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的免疫原性可以通过使用佐剂如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂来加强。用于免疫的多肽还包括融合多肽,如Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”,则该部分可以有利地与大分子载体(如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
制备或筛选抗体的备选技术包括体外使淋巴细胞暴露于Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽、和在噬菌体或类似载体中筛选抗体展示文库(例如通过使用固定化的或标记的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽)。人抗体可以在已经通过工程化而含有人免疫球蛋白基因的转基因非人动物中制备,见WIPO公开文本WO98/24893中的公开。优选通过例如同源重组的方式失活或清除这些动物中的内源性免疫球蛋白基因。
本领域技术人员已知的多种试验均可以用于检测特异结合Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽的抗体。示例性试验详细描述在Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lane(编),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988。此类试验的代表性例子包括:并行免疫电泳(concurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点印迹分析、Western印迹分析、抑制或竞争试验和三明治试验。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的抗体可以用于亲和纯化这些蛋白质,在诊断试验中用于确定这些蛋白质的循环水平;用于检测或定量作为潜在病理学或疾病的标志的可溶性Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽;用于在整体动物或组织切片中免疫定位,包括免疫诊断应用;用于免疫组织化学;和用作拮抗剂以体内和体外阻断蛋白质活性。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的抗体还可以用于标记表达Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的细胞;用于亲和纯化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽和蛋白质;用于使用FACS的分析方法中;用于筛选表达文库;和用于制备抗独特型抗体。可以使用已知方法使抗体和其它化合物,包括治疗性和诊断性药剂连接,以使这些化合物可以靶向表达Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受体的细胞。对于某些应用,包括体外和体内诊断应用,有利的是使用标记的抗体。适宜的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等;间接标签或标记可以类似使用生物素-亲和素或其它互补物/反互补物对作为中间体。本发明抗体还可以直接或间接地与药物、毒素、放射性核素等偶连,而且这些偶连物可以用于体内诊断或治疗应用(例如抑制细胞增殖)。一般见Ramakrishnan等,Cancer Res.56:1324-1330,1996。
本发明多肽和蛋白质可以用于鉴定和分离受体。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的受体可能参与肝脏中的生长调节、血管形成和其它发育过程。例如,可以将Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25蛋白质和多肽固定在柱子上,然后使膜制品过柱(一般见Immbolized Affinity Ligand Techniques,Hermanson等编,Academic Press,San Diego,CA,1992,第195-202页)。还可以对蛋白质和多肽进行放射性标记(Methods Enzymol.第182卷,“蛋白质纯化指南”,M.Deutscher编,Academic Press,SanDiego,1990,721-737)或光亲和标记(Brunner等,Ann.Rev.Biochem.62:483-514,1993和Fedan等,Biochem Pharmacol.33:1167-1180,1984),并可以将其用于标记特异的细胞表面蛋白质。类似地,可以在结合试验中使用cDNA表达文库转染的细胞,利用放射性标记的zcyto20蛋白质和多肽克隆同源受体。
Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽还可以用于教导分析技术,例如质谱、园二色性以确定尤其是四α螺旋的构象,x射线晶体学以在原子细节上确定三维结构,核磁共振光谱分析以揭示蛋白质在溶液中的结构。例如,可以给学生含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的试剂盒用于分析。由于氨基酸序列是教导者已知的,因此可以给予学生该蛋白质作为确定或发展学生技能的试验,然后教导者将知道学生是否正确地分析了该多肽。由于每个多肽都是独特的,因此教学利用zcyto20本身将具有独特性。
与Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25特异结合的抗体可以用作教学辅助工具以教导学生如何制备亲和层析柱以纯化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25,以及克隆和测序编码该抗体的多核苷酸并由此作为实践课用于教导学生如何设计人源化抗体。Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25基因、多肽或抗体可以由试剂公司包装并出售给教学机构以便学生掌握分子生物学领域的技能。由于每个基因和蛋白质都是独特的,因此在实验课中每个基因和蛋白质对于学生来说都构成了独特的挑战和学习经验。这些含有ZCYTO20基因、多肽或抗体的教学试剂盒被认为属于本发明范围。
总之,本发明提供与选自下组的多肽具有至少80%或95%或100%一致性的分离的多肽:(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基至第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基至第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基至第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基至第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
另一实施方案中,该分离的多肽结合SEQ ID NOS:24、27或29所示的单体或同二聚体受体形式的受体或SEQ ID NOS:24、27或29与SEQ ID NO:41组合的异二聚体受体。
在另一方面,本发明包括含有SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基至第205位氨基酸残基所示或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基至第205位氨基酸残基所示的氨基酸序列的分离多肽。
另一方面,本发明包括含有SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基至第205位氨基酸残基所示或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基至第205位氨基酸残基所示的氨基酸序列的分离多肽。
另一方面,本发明包括含有SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基至第202位氨基酸残基所示或SEQ ID NO:9第1位氨基酸残基至第202位氨基酸残基所示的氨基酸序列的分离多肽。
另一方面,本发明包括含有SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基至第202位氨基酸残基所示或SEQ ID NO:11第1位氨基酸残基至第202位氨基酸残基所示的氨基酸序列的分离多肽。
另一方面,本发明包括具有SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基至第205位氨基酸残基中或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基至第205位氨基酸残基中的至少14个连续氨基酸的分离多肽,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答(antigenic response)。
另一方面,本发明包括具有SFQ ID NO:7第22位氨基酸残基至第205位氨基酸残基中或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基至第205位氨基酸残基中的至少14个连续氨基酸的分离多肽,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
另一方面,本发明包括具有SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基至第202位氨基酸残基中或SEQ ID NO:9第1位氨基酸残基至第202位氨基酸残基中的至少14个连续氨基酸的分离多肽,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
另一方面,本发明包括具有SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基至第202位氨基酸残基中或SEQ ID NO:11第1位氨基酸残基至第202位氨基酸残基中所示至少14个连续氨基酸的分离多肽,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
本发明包括在可药用载体中含有本文所述多肽的药物组合物。
本发明还包括含有本文所述多肽的融合蛋白。
在其它方面,本发明包括编码多肽的分离的多核苷酸,其中该核酸分子选自:(a)含有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的多核苷酸;(b)在严紧洗涤条件后仍与由SEQ ID NO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。
另一实施方案中,本发明包括编码多肽的分离多核苷酸,其中该核酸分子选自:(a)含有SEQ ID NO:36的核苷酸序列的多核苷酸;(b)在严紧洗涤条件后仍与由SEQ ID NO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID NO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。
另一方面,本发明包括包含SEQ ID NO:1第64位核苷酸至第618位核苷酸所示或SEQ ID NO:1第1位核苷酸至第618位核苷酸所示核苷酸序列的分离多核苷酸。
在另一实施方案中,本发明包括包含SEQ ID NO:6第64位核苷酸至第618位核苷酸所示或SEQ ID NO:6第1位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列的分离多核苷酸。
在另一实施方案中,本发明包括包含SEQ ID NO:8第67位核苷酸至第606位核苷酸所示或SEQ ID NO:1第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列的分离多核苷酸。
在另一实施方案中,本发明包括包含SEQ ID NO:10第67位核苷酸至第606位核苷酸所示或SEQ ID NO:10第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列的分离多核苷酸。
本发明提供包含本文所述分离的核酸分子和转录启动子及转录终止子的表达载体,其中该启动子与该核酸分子可操作地连接,且该核酸分子与该转录终止子可操作地连接。
本发明提供包含本文所述表达载体的重组宿主细胞,其中该宿主细胞选自细菌、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。
另一方面,本发明提供制备多肽的方法,包括步骤:培养包含本文所述表达载体并产生该多肽的重组宿主细胞。
本发明提供特异性地与本文所述多肽结合的抗体或抗体片断。
另一方面,本发明提供扩增单核细胞或单核细胞祖先细胞的方法,包括用包含本文所述多肽的组合物培养骨髓或外周血细胞,其中本文所述多肽的量足以造成骨髓或外周血细胞中单核细胞或单核细胞祖先细胞数量相对于在未施用多肽时培养的骨髓或外周血细胞而言发生增加。
本发明还提供刺激暴露于抗原或病原体的哺乳动物的免疫应答的方法,包括:(1)测定抗原或病原体特异性抗体的水平;(2)施用在可药用载体中包含有本文所述多肽的组合物;(3)测定施用后抗原或病原体特异性抗体的水平;(4)比较步骤(1)中的抗体水平和步骤(3)中的抗体水平,其中抗体水平增加指示刺激了免疫应答。
其它方面,本发明提供在哺乳动物中产生抗病毒应答的方法,包括给感染病毒的哺乳动物施用用量足以引起病毒减少的本文所述多肽的组合物。
由此对本发明作了一般性的描述,而参考如下实施例可以更容易理解本发明,这些实施例以举例说明的方式提供并不旨在限制本发明。
实施例
实施例1
哺乳动物表达质粒
含有编码Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的多核苷酸的表达质粒可以通过同源重组构建。使用5’和3’末端侧翼区相应于包围zcyto20插入位点的载体序列的SEQ ID NO:1多核苷酸序列,通过PCR分离cDNA片断,如zcyto20 cDNA。引物ZC40923和ZC40927分别显示在SEQ ID NO:12和13中。
在1%琼脂糖凝胶上电泳PCR反应混合物,并使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)凝胶提取相应于插入片断大小的条带。质粒pZMP21是哺乳动物表达载体,其包含具有MPSV启动子、用于插入编码序列的多个限制性位点、终止密码子、大肠杆菌(E.coli)复制起点的表达盒;包含SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单位;和在酿酒酵母(S.cerevisiae)中进行选择和复制所必需的URA3和CEN-ARS序列。该质粒是使用取自pRS316(保藏在美国典型培养物保藏中心,10801University boulevard,Manassas,VA20110-2209,保藏号77145)的酵母遗传元件、来自脊髓灰质炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)元件、和在跨膜域C末端发生截短的CD8细胞外域从pZP9(保藏在美国典型培养物保藏中心,10801 University boulevard,Manassas,VA20110-2209,保藏号98668)构建的。用BglII消化质粒pZMP21,将其用于和PCR插入片断重组。
将100μl酵母(酿酒酵母)感受态细胞分别与10μl以上的各种DNA混合物混合,并转移至0.2cm电穿孔杯中。使用电源(BioRadLaboratories,Hercules,CA)设定0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆、25μF,电冲击酵母/DNA混合物。每个杯中加入600μl 1.2M山梨糖醇,将酵母以两个300μl等分试样接种在两个URA-D平板上,并在30℃孵育。约48小时后,将来自单个平板的Ura+酵母转化体重悬在1ml H2O中,短暂旋转以沉淀酵母细胞。将细胞沉淀重悬在1ml裂解缓冲液(2%Triton X-100、1%SDS、100mM NaCl、10mM Tris,pH8.0、1mM EDTA)中。将500μl裂解混合物加入含有300μl酸洗涤的玻璃珠和200μl酚-氯仿的Eppendorf管中,涡旋1分钟,2或3次,然后以最大速率在Eppendorf离心机中离心5分钟。将300μl水相转移至新管中,用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA,之后4℃离心10分钟。将DNA沉淀重悬在10μl H2O中。
使用0.5-2ml酵母DNA制备物和40μl细胞转化电感受态的大肠杆菌宿主细胞(Electromax DH10BTM细胞;获自Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)。以1.7kV、25μF和400欧姆对细胞进行电脉冲。电穿孔后,将1ml SOC(2%BatoTM胰蛋白胨(Difco,Detroit,MI)、0.5%酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)加入250μl等分试样中,然后接种在4个LB AMP平板(LB液体培养基(Lennox)、1.8%BactTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。
通过限制性消化鉴定包含正确的zcyto20表达结构的各个克隆,以便验证zcyto20插入片断的存在和证实各个DNA序列均已正确地彼此连接。对阳性克隆的插入片断进行序列分析。使用商业试剂盒(QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒,Qiagen,Valencia,CA)根据厂商说明书更大规模地分离质粒DNA。正确的构建体命名为zcyto20-CEE/pZMP21。
含有zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的质粒使用核苷酸特异性引物以相似方式制备。
实施例2
在中国仓鼠卵巢细胞中表达
将CHO DG44细胞(Chasin等,Som.Cell Molec.Genet.12:555-666,1986)接种在10cm组织培养皿中,使之在37℃及5%CO2下于Ham氏F12/FBS培养基(Ham氏F12培养基(Life Technology)、5%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、1%L-谷氨酰胺(JRH Bioscience,Lenexa,KS)、1%丙酮酸钠(Life Technologies))中过夜生长至大约50%至70%汇合。然后通过脂质体介导的转染,用3:1(w/w)聚阳离子脂2,3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙亚胺鎓三氟乙酸盐和中性脂二油酰基磷脂酰乙醇胺在膜过滤水中的脂质体制剂(LipofectamineTMReagent,Life Technologies),在无血清(SF)培养基制剂(Ham氏F12、10mg/ml转铁蛋白、5mg/ml胰岛素、2mg/ml胎球蛋白、1%L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠)中,用含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的质粒,如zcyto20/pZMP6,转染细胞。用SF培养基将zcyto20/pZMP6稀释在15ml管中至640μl的总最终体积。使35μlLipofectamineTM和605μl SF培养基混合。将所获混合物加入DNA混合物中,使之在室温孵育约30分钟。向DNA:LipofectamineTM混合物中加入5ml SF培养基。用5ml SF培养基洗涤细胞一次,将之吸出,之后加入DNA:LipofectamineTM混合物。37℃孵育细胞5小时,然后向每个平板加入6.4ml Ham氏F12/10%FBS、1%PSN培养基。平板在37℃孵育过夜,第二天用新鲜的5%FBS/Ham氏F12更换DNA:LipofectamineTM混合物。在转染后第三天,将细胞分开,放入T-175摇瓶的生长培养基中。在转染后第7天,用FITC-抗CD8单克隆抗体(Pharmingen Biotec,Auburn,CA),之后用抗FITC偶连的磁珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)染色细胞。使用商品柱(mini-MACS柱;Miltenyi Biotec)根据厂商指导分离CD8阳性细胞,将其放入无核苷但有50nM氨甲蝶呤的DMEM/Ham氏F12/5%FBS(选择培养基)中。
以每孔0.5、1和5个细胞的密度将细胞接种在96孔平皿的选择培养基中以便进行亚克隆,使细胞生长大约2周。检查孔中培养基的蒸发,在该过程中如果必要可以使每孔恢复到200μl。当平板上大多数集落接近汇合时,从每个孔收集100μl培养基用于点印迹分析,并给细胞添加新鲜选择培养基。在点印迹装置中将上清液加载在硝酸纤维素滤膜上,然后真空炉中100℃处理该滤膜以变性蛋白质。滤膜在625mM Tris-甘氨酸(pH9.1)、5mM β-巯基乙醇中65℃孵育10分钟,然后在2.5%脱脂干奶粉的Western A缓冲液(0.25%明胶、50mMTris-HCl pH7.4、150mM NaCl、5mM EDTA、0.05% Igepal CA-630)中于旋转摇床上4℃孵育过夜。室温下于旋转摇床上在2.5%脱脂干奶粉的Western A缓冲液中用抗体-HRP缀合物孵育滤膜1小时。然后室温下在添加有0.01%Tween20的PBS中洗涤滤膜三次,每次15分钟。用化学发光试剂(ECLTM直接标记试剂盒;Amersham Corp.,ArlingtonHeights,IL)根据厂商指导显色滤膜,然后将其对胶片(HyperfilmECL,Amersham Corp.)曝光约5分钟。用胰蛋白酶处理96孔皿中的阳性克隆,将之转移至6孔皿的选择培养基中以便放大和用于Western印迹分析。
实施例3
在幼仓鼠肾细胞中表达
在BHK细胞中产生全长zcyto24和zcyto25蛋白质。例如,用zcyto24-CEE/pZMP21或zcyto25-CEE/pZMP21(实施例1)转染BHK细胞。将BHK570细胞(ATCC CRL-10314)接种在T75组织培养瓶中,使之在37℃和5%CO2下于生长培养基(SL7V4,5%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT),1%青霉素/链霉素)中过夜生长至大约50%至70%汇合。然后通过脂质体介导的转染(使用LipofectamineTM;LifeTechnologies)在无血清(SF)培养基中用zcyto24-CEE/pZMP21或zcyto25-CEE/pZMP21转染细胞。用SF培养基将质粒稀释在1.5ml管中至640μl的总最终体积。将35μl脂混合物和605μlSF培养基混合,室温孵育所获混合物大约30分钟。然后将6ml SF培养基加入DNA/脂混合物中。用5ml SF培养基洗涤细胞一次,将之吸出,然后加入DNA/脂混合物。细胞在37℃孵育5小时,然后向每个平板加入15ml生长培养基。37℃孵育平板过夜,第二天用选择培养基(SL7V4,5%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、1%青霉素/链霉素、1μM MTX)更换DNA/脂混合物。转染后大约7-10天,胰蛋白酶处理抗氨甲蝶呤的集落,将细胞重新接种在T-162摇瓶中然后转移至大规模培养。
实施例4
腺病毒载体的构建
为了构建腺病毒载体,使用分别在5’和3’末端添加了PmeI和AscI限制性位点的引物通过PCR扩增Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的蛋白质编码区。使用全长cDNA模板按如下在PCR反应中进行扩增:95℃ 5分钟进行一个循环;之后95℃ 1分钟、61℃ 1分钟、72℃ 1.5分钟进行15个循环;之后72℃ 7分钟;之后4℃保温。将PCR反应产物加载至TAE缓冲液(0.04M Tris乙酸,0.001M EDTA)中的1.2%低熔点琼脂糖凝胶上。从凝胶上切下PCR产物,并用包含硅胶膜离心柱的商业试剂盒 PCR纯化试剂盒和凝胶提纯试剂盒;Qiagen,Inc.)按照试剂盒说明进行纯化。然后用PmeI和AscI消化、酚/氯仿抽提、EtOH沉淀PCR产物,之后重新在20mM TE(Tris/EDTA pH8.0)中水合。然后将zcyto20片断连接至转基因载体pTG12-8的PmeI-AscI位点中,并通过电穿孔转化大肠杆菌DH10BTM感受态细胞。载体pTG12-8通过在Nru I位点插入大鼠胰岛素II内含子(大约200bp)和多接头(Fse I/Pme I/AscI)来源于p2999B4(Palmiter等,Mol.Cell Biol.13:5266-5275,1993)。该载体包含被10kb MT-15’侧翼序列和7kb MT-13’侧翼序列包围的小鼠金属硫蛋白(MT-1)启动子(大约750bp)和人生长激素(hGH)非翻译区及聚腺苷酸化信号(大约650bp)。将cDNA插在胰岛素II和hGH序列之间。含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25cDNA的克隆通过质粒DNA小量制备,之后用PmeI和AscI消化进行鉴定。测序阳性克隆以确保构建体中无缺失或其它异常。
使用商业试剂盒(Maxi试剂盒,Qiagen,Inc.)制备DNA,并使用PmeI和AscI酶从pTG12-8载体中释放cDNA。在1%低熔点琼脂糖凝胶上分离该cDNA并从凝胶上将之切下。切下的胶条在70℃溶化,用等体积Tris缓冲的酚抽提DNA两次,用EtOH沉淀,然后将之重悬在10μl H2O中。
将该cDNA克隆至修饰的pAdTrack-CMV(He,T-C.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2509-2514,1998)的EcoRV-AscI位点中。该构建体含有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因。将驱动GFP表达的CMV启动子替换成SV40启动子,并用人生长激素聚腺苷酸化信号替代SV40的聚腺苷酸化信号。此外,用FseI、EcoRV和AscI位点替换原来的多接头。该修饰形式的pAdTrack-CMV被命名为pZyTrack。使用商业DNA连接和筛选试剂盒(Fast-Link试剂盒;Epicentre Technologies,Madison,WI)进行连接。通过用FseI和AscI消化小量制备的DNA,鉴定含有zcyto20的克隆。为了线性化该质粒,用PmeI消化约5μg的所获pZyTrack zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25质粒。大约1μg线性化质粒和200ng超螺旋pAdEasy(He等,同上)共转化大肠杆菌BJ 5183细胞(He等,同上)。使用Bio-Rad基因脉冲仪在2.5kV、200欧姆和25μFa时进行共转化。将所有的共转化混合物铺在4个含有25μg/ml卡那霉素的LB平板上。挑取最小的菌落并在LB/卡那霉素中扩增,通过标准DNA小量制备方法鉴定重组腺病毒DNA。用小量制备的重组腺病毒DNA转化大肠杆菌DH10BTM感受态细胞中,并使用Maxi试剂盒(Qiagen,Inc.)根据试剂盒说明制备DNA。
用PacI酶(New England Biolabs)37℃消化约5μg重组腺病毒DNA3小时,其中反应体积为100μl,含有20-30U PacI。消化的DNA用等体积酚/氯仿抽提两次,并用乙醇沉淀。将DNA沉淀重悬在10μl蒸馏水中。用PacI消化的DNA对前一天接种并生长至60%-70%汇合的T25摇瓶中的QBI-293A细胞(Quantum Biotechnologies,Inc.,Montreal,Qc.加拿大)进行转染。用无菌HBS(150mM NaCl,20mMHEPES)将PacI消化的DNA稀释至50μl总体积。在单独的管中,用HBS将20μl 1mg/ml N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐(DOTAP)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)稀释至100μl总体积。在DOTAP中加入DNA,通过上下抽吸温和地混匀,然后置室温下15分钟。从293A细胞中除去培养基,并用5ml含有1mM丙酮酸钠、0.1mM MEM非必需氨基酸和25mM HEPES缓冲液(从LifeTechnologies,Gaithersburg,MD获得的试剂)的无血清极限必需培养基(MEM)α洗涤。在293A细胞中加入5ml无血清MEM,并置于37℃。向T25摇瓶中的293A细胞滴加DNA/脂混合物,温和混合,并37℃孵育4小时。4小时后,吸出含有DNA/脂混合物的培养基,并更换为含有5%胎牛血清的5ml完全MEM。监测转染细胞的GFP表达和转化灶(病毒斑)的形成。
用重组腺病毒DNA转染293A细胞后7天,细胞表达GFP蛋白并开始形成病灶(病毒“斑”)。使用细胞刮棒收集粗病毒裂解物以便收集所有的293A细胞。将裂解物转移至50ml锥形管中。为了将大多数病毒颗粒从细胞中释放出来,在干冰/乙醇浴和37℃水浴中进行3个冻/融循环。
扩增(初次(1°)扩增)粗裂解物以获得zcyto20 rAdV裂解物的工作“原液”。预先培养20小时以得到其中293A细胞接近汇合(80%-90%)的10个10cm平板,向每个10cm平板加入200ml粗rAdV裂解物,然后在白光显微镜下监测细胞的CPE(致细胞病变效应)48至72小时,并在荧光显微镜下监测GFP的表达。当所有的293A细胞表现出CPE时,收集此原液裂解物并按上述进行冻融循环。
然后二次(2°)扩增zcyto20 rAdV。预备20个15cm组织培养皿的293A细胞以便细胞达到80-90%汇合。仅留下20ml5%MEM培养基,并用300-500ml初次扩增的rAdV裂解物接种每个平板。48小时后,由于病毒生产,293A细胞裂解,将裂解物收集在250ml聚丙烯离心瓶中,纯化rAdV。
向粗裂解物的瓶中加入NP-40去污剂,达到0.5%的终浓度,以便裂解所有细胞。将瓶子放置在旋转平台上10分钟,在不翻转瓶子的情况下尽可能快地进行摇动。20,000×G离心15分钟以沉淀碎片。将上清液转移至250ml聚碳酸酯离心瓶中,然后加入0.5体积的20%PEG8000/2.5M NaCl溶液。在冰上振摇瓶子过夜。20,000×G离心瓶子15分钟,然后将上清液丢弃至漂白溶液中。使用无菌细胞刮棒,将2个瓶子的白色病毒/PFG沉淀重悬在2.5ml PBS中。将所获病毒溶液置于2ml微量离心管中,在微量离心机中14,000×G离心10分钟以除去所有的其它细胞碎片。将来自2ml微量离心管的上清液转移至一个15ml聚丙烯具有保护帽盖的管中并用CsCl调节至1.34g/ml密度。将该溶液转移至3.2ml聚碳酸酯薄壁离心管,在25℃以348,000×G离心3-4小时。病毒形成白色条带。使用宽孔吸头收集病毒带。
使用商业离子交换柱(例如预先填充了G-25M的PD-10柱;Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)对病毒制品进行脱盐处理。该柱用20ml PBS平衡。加载病毒然后使之过柱。将5ml PBS加入柱中,然后按8-10滴收集馏分。在分光光度计上测定每个馏分的1:50稀释物在260nm的光密度。汇集峰值馏分,测定1:25稀释物的光密度(OD)。使用公式:(260nm的OD)(25)(1.1×1012)=毒粒/ml,将OD转化成病毒浓度。
为了储存病毒,向纯化的病毒中加入甘油达到15%终浓度,温和但有效地混合,并等分后储存在-80μC。
按照Quantum Biotechnologies,Inc.(Montreal,加拿大)发展的实验方案测量重组病毒感染性。简而言之,对于每个待测重组病毒,按每孔1×104个293A细胞将细胞接种在两个96孔组织培养板的MEM(含有2%胎牛血清)中。24小时后在含有2%胎牛血清的MEM中制得每个病毒的10倍稀释物(从1×10-2至1×10-14)。在20个孔的每个孔中各加入一种稀释物(100μl)。37℃孵育5天后,观察孔的CPE是阳性或阴性,并计算“噬斑形成单位/ml”(PFU)的值。
实施例5
zcyto20、zcyto22、zcyto24和zcyto25的克隆
A:zcyto20和zcyto22
在预测的编码序列中设计zcyto20和zcyto22共有的PCR引物。它们被命名为ZC39339(SEQ ID NO:47)和ZC39393(SEQ ID NO:48)。在一组来自不同组织的人cDNA文库上进行PCR。在脑、胰岛(胰腺)、前列腺、胎盘、睾丸、HPVS(前列腺上皮)和CD3+文库中观察到产物。然后根据zcyto20的起始甲硫氨酸5’基因组序列和终止密码子3’基因组序列(与zcyto22高度相似)设计PCR引物。将它们命名为ZC39340(SEQ ID NO:49)和ZC39341(SEQ ID NO:50)。在以上文库上进行PCR。4个文库含有全长克隆。对来自这些克隆的PCR产物进行测序,结果3个文库含有zcyto22(前列腺、睾丸和CD3+),一个文库含有zcyto20(HPVS(前列腺上皮))。还使用特异针对zcyto22的预测编码序列的引物进行PCR。这些引物称为ZC39295(SEQ ID NO:51)和ZC39298(SEQ ID NO:52)。该PCR的阳性文库是脑、前列腺、CD3+和睾丸。测序证实了B zcyto20序列。
B:zcyto24和zcyto25
在预测的编码序列中设计zcyto24和zcyto25共有的PCR引物。这些命名为ZC39687(SEQ ID NO:53)和ZC39741(SEQ ID NO:54)。在一组来自不同组织的小鼠cDNA文库上进行PCR。在如下文库中观察到产物:心脏、肺、胎盘、Torres前列腺、皮肤、小肠、睾丸和胸腺。然后设计起始甲硫氨酸5’和终止密码子位置的PCR引物。5’引物命名为ZC39732(SEQ ID NO:55),其与zcyto24和zcyto25序列均匹配。Zcyto243’引物命名为ZC39701(SEQ ID NO:56)。Zcyto253’引物命名为ZC39688(SEQ ID NO:57)。在上述阳性文库上进行PCR。对于zcyto24,除了心脏和Torres前列腺外所有的文库均是阳性。测序证实了来自胎盘、睾丸和小肠文库的zcyto24序列。对于zcyto25,除了心脏和Torres前列腺外所有的文库均是阳性。测序证实了来自肺文库的zcyto25序列。
实施例6
在杆状病毒中表达
A:用于表达z cyto20的构建体
制备表达载体pzBV37L:zCyto20以在昆虫细胞中表达zcyto20多肽。使用引物ZC41932(SEQ ID NO:14)及ZC41933(SEQ ID NO:15)和Expand High Fidelity PCR系统(Boerhinger Mannheim)按照厂商说明书从质粒zcyto20PCR扩增含有zcyto20的序列并在5’和3’末端分别编码BspEl和XbaI限制性位点的536bp片断。PCR条件如下:94℃4分钟进行1个循环;94℃ 30秒、50℃30秒和72℃ 1分钟进行30个循环;74℃ 4分钟进行1个循环;之后4℃保温。通过凝胶电泳(1% NuSieve琼脂糖)观察小量PCR产物,证实片断长度大约550bp。剩余反应混合物通过Qiagen PCR纯化试剂盒按照厂商说明纯化,并将之稀释在30μl水中。在36μl体积中使用BspeI和XbaI(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)在适当的缓冲液条件下37℃消化该cDNA。通过1%琼脂糖TAE凝胶电泳分离消化的PCR产物带,将之切下并用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen,Cat.No.28704)提取,然后稀释在30μl EB缓冲液中。将消化的zcyto20PCR产物连接在载体pZBV37L多克隆位点的BspeI和XbaI位点处。pZBV37L载体是修饰的pFastBaclTM(Life Technologies)表达载体,其中已经除去多角体启动子并在MCS上游替换为晚期活化碱性蛋白启动子和EGT前导信号序列。将5μl限制性酶消化的zcyto20 PCR片断和4μl相应的pZBV37L载体在20μl体积中适当的缓冲液条件下15℃连接72小时。通过在400欧姆、2.00kV和25μF下2mm间隔电穿孔杯(BTX,Model No.620)中进行电穿孔,用5μl连接混合物转化33μlElectoMAXTM DH12sTM细胞(Life Technologies,Cat.No.18312-017)。将转化的细胞稀释在500μl LB培养基,在37℃生长1小时,将10μl和20μl稀释物铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。PCR分析克隆,并选择阳性克隆,接种并进行测序。然后验证序列。
B.带标签的zcyto20的构建和表达
制备表达载体pZBV32L:zCyto20cee以在昆虫细胞表达zcyto20cee多肽。设计pZBV32L:zCyto20cee以表达带有C端GLU-GLU标签(SEQ ID NO:16)的zcyto20多肽。可以使用该构建体以确定切除信号肽后zcyto20的N端氨基酸序列。
1.pZBV32L:zCyto20cee的构建
使用引物zc40240和zc40241(分别为SEQ ID NOS:17和18)从含有zcyto20cDNA的质粒PCR扩增产生5’和3’末端分别含有BamHI和XbaI限制性位点的625bp zcyto20片断。PCR条件如下:在含有5%DMSO的100μl体积反应物中利用Expand High Fidelity PCR系统(Boehringer Mannheim),94℃4分钟进行1个循环;94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 60秒进行30个循环;72℃ 4分钟进行1循环;之后4℃保温。凝胶电泳(1% NuSieve琼脂糖)观察5μl PCR片断。剩余的反应混合物通过Qiagen PCR纯化试剂盒按照厂商说明书纯化,并稀释在30μl水中。使用BamHI和XbaI(New England Biolabs,Beverly,MA)在适当缓冲液条件下35μl体积中37℃消化该cDNA2小时。通过1%琼脂糖TAE凝胶电泳分离消化的PCR产物带,将之切下并使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取,然后稀释在30μl水中。将纯化的消化zCyto20cee PCR产物连接在预先制备并限制性酶消化(BamHI和XbaI)的载体pZBV32L的多克隆位点中。载体pZBV32L是修饰的pFastBaclTM(Life Technologies)表达载体,其中已经除去多角体启动子并替换为晚期活化碱性蛋白启动子,并将Glu-Glu标签(SEQID NO:10)及终止信号的编码序列插在多克隆区域的3’末端。在20μl体积中16℃过夜连接5μl限制性消化的zCyto20插入片断和40ng相应的pZBV32L载体。以400欧姆、2.00kV和25μF在2mm间隔电穿孔杯中通过电穿孔,用5μl连接混合物转化50μl ElectoMAXTM DH12sTM细胞(Life Technologies)。将转化的细胞稀释在500μl SOC培养基(2%Bacto胰蛋白胨、0.5%Bacto酵母提取物、10ml 1M NaCl、1.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4和20mM葡萄糖)中,将50μl稀释物铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。通过PCR和限制性消化分析克隆。选择阳性克隆并接种用于测序。一旦证实了正确的序列,通过在42℃加热块中热休克45秒用25ng阳性克隆DNA转化66μl DH10BacTMMAX Efficiency感受态细胞(GIBCO-BRL)。将转化的DB10BacTM细胞稀释在600μl SOC培养基(2%Bacto胰蛋白胨、0.5%Bacto酵母提取物、10ml 1M NaCl、1.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4和20mM葡萄糖)中并37℃生长1小时,然后将100μl铺在含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、40μg/ml IPTG和200μg/ml Bluo Gal的Luria琼脂平板上。37℃孵育平板48小时。使用颜色选择以鉴定具有转座的病毒DNA(称作“杆粒”)的那些细胞。挑取白色菌落进行分析。PCR分析菌落并选择阳性菌落(含有期望的杆粒)进行培养,随后纯化杆粒DNA。使用针对杆粒中转座元件的引物:ZC447(SEQ ID NO:19)和ZC976(SEQ ID NO:20),通过PCR扩增DNA筛选具有正确分子量插入片断的克隆。PCR反应条件如下:94℃ 4分钟进行1个循环;94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 2.5分钟进行25个循环;72℃ 4分钟进行1个循环;之后4℃保温。在1%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物以验证插入片断的大小。具有正确大小的插入片断的那些用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera Frugiperda)(Sf9)细胞。
2.转染
以每孔1×106个细胞将Sf9细胞接种在6孔板中,并使之在27℃贴壁1小时。用Sf-900II SFM(Life Technologies)将大约5μg杆粒DNA稀释至100μl。用Sf-900II SFM将20μl LipofectamineTM试剂(Life Technologies)稀释至100μl。温和地混合杆粒DNA和脂溶液,然后室温孵育45分钟。将800μl Sf-900II SFM加入脂-DNA混合物中。吸出孔中培养基并在细胞中加入1ml DNA-脂混合物。27℃孵育细胞过夜。吸出每个孔中的DNA-脂混合物,并替换为2ml Sf-900II培养基。27℃、90%湿度下孵育平板大约7天,之后收获病毒。
3.扩增
按每孔1×106个细胞将Sf9细胞接种在6孔板上。将来自转染平板的500μl病毒加入孔中,然后27℃、90%湿度下孵育平板96小时,之后收获病毒(初次扩增)。
将100μl来自上述初次扩增平板的病毒转移至含有1×106个细胞/孔的孔中,从而进行第二轮扩增。收获前孵育平板96小时。
进行再一轮扩增(第三次扩增)。在250ml摇瓶的50ml Sf-900IISFM中使Sf9细胞生长至大约1×106个细胞/ml的密度。然后用来自上述平板的1ml病毒原液感染之,然后27℃孵育6天,此后收获病毒。
通过生长抑制曲线滴定病毒原液,允许指示1的感染复数(MOI)的滴定培养进行总共48小时。使用特异针对Glu-Glu标签的单克隆一抗,随后使用HRP-偶联的山羊抗鼠二抗,通过还原Western分析上清液。结果显示大约20kDa的一条带。上清液还被用于活性分析。
然后通过如下方法制备大量病毒原液:在2800ml摇瓶的1LSf-900II SFM中将Sf9细胞培养至大约1×106个细胞/ml的密度。然后用来自上述摇瓶的5ml病毒原液感染之,27℃孵育4天,此后收获病毒。
完成更大规模的感染以为下游纯化提供材料。
类似地,在杆状病毒中表达了zcyto21和zcyto22。
实施例7
蛋白质纯化
对于本文所述的任何一种蛋白质而言,均可以制备重组蛋白质。
A.zcyto20的纯化
从重组杆状病毒感染的昆虫细胞、稳定或瞬时的BHK细胞系制备羧基端带有Glu-G1u标签的重组zcyto20。收获培养物,并使用0.2μm滤器无菌过滤培养基。
通过联合使用抗Glu-Glu(抗-EE)肽抗体亲和层析和Superdex75凝胶排阻层析,从条件培养液纯化蛋白质。将来自BV的培养基(pH6.0,导电率7mS)调节至pH6.7。然后向BV和BHK培养基中均加入NaCl至300mM,之后以2-5m1/分钟的流速将其加载在10×70mm(5-ml柱体积)Poros蛋白A抗-EE抗体亲和柱上。然后用5倍柱体积(CV)的5×PBS(pH7.2)洗涤柱子。用0.5M乙酸、0.5M NaCl(pH3.0)洗脱结合的蛋白质。按2ml收集馏分,加入2M Tris以中和洗脱物。从抗-FE抗体亲和柱得到的样品通过SDS-PAGE用银染和western印迹分析zcyto20蛋白质的存在。将含有zcyto20蛋白质的馏分汇合,并使用Biomax-5浓缩器(Millipore)浓缩至大约2ml,然后加载至16×600mmSuperdex×75凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。将含有纯化的zcyto20蛋白质的馏分汇合,通过0.2μm滤器过滤,等分成100μl小份,然后冰冻在-80℃。通过BCA试验(Pierce,Rockford,IL)和HPLC-氨基酸分析测定最终纯化的蛋白质的浓度。
B.SDS-PAGE和Western印迹分析zcyto20蛋白质
通过SDS-PAGE(Nupage 4-12%Bis-Tris,Invitrogen,Calsbad,CA)以银染方法(Fast Silver,GenoTechnology,Inc.,St.Louis,MO)及用抗EE抗体进行的Western印迹分析重组zcyto20蛋白质。使用Xcell IITMMINI-CELL(Invitrogen,Calsbad,CA)电泳条件培养液或纯化的蛋白质,室温下在搅拌同时使用Xce1l IITM印迹组件(Invitrogen)按照仪器手册提供的指导将之转移至硝酸纤维素(0.2_m;Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)上。转移在含有25mM Tris碱、200mM甘氨酸和20%甲醇的缓冲液中500mA进行45分钟。然后用10%脱脂干奶粉的PBS溶液室温封闭滤膜10分钟。快速洗涤该硝酸纤维素膜,然后加入在含有2.5%脱脂干奶粉的PBS中的一抗。温和摇动下,该印迹在室温孵育2小时或4℃孵育过夜。孵育后,PBS中洗涤印迹三次,每次10分钟。加入1:2000稀释在含有2.5%脱脂干奶粉的PBS中的二抗(偶联辣根过氧化物酶的兔抗小鼠IgG;获自PierceChemical Co.,Rockford,IL),然后,温和摇动下,室温孵育印迹两小时。之后在PBS中洗涤印迹三次,每次10分钟,然后在H2O中快速洗涤。使用商业化学发光底物试剂(SuperSignalULTRA试剂1和2的1:1混合物;试剂获自Pierce Chemical Co.)显色印迹,使用Lumi-Imager’s Lumi Analyst 3.0软件(Boehringer Mannheim GmbH,德国)经10秒至5分钟或按需要的时间捕获信号。
C.对蛋白质纯化和分析的总结
来自BV培养基的纯化的zcyto20-CEE蛋白质在4-12%Bis-Tris凝胶上迁移为一21kDa的单体,然而还观察到微弱的36kDa二体带。二体蛋白质在使用还原剂还原时变成单体,提示zcyto20-CEE通过二硫键二聚体化,而且这与半胱氨酸残基的奇数数目(总共7个)是一致的,从而导致链间二硫键。
以相似方式纯化了zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多肽。
实施例8
zcyto20的干扰素样转录调节区
对已表征的IFN-α、IFN-β、IFN-γ启动子及许多其它细胞因子的启动子与zcyto20、zcyto21和zcyto24的上游区域进行局部序列比对,以鉴定这些基因是否是共调节的。假说是:基因调节的共同性质应反映在基因上游区域的序列相似性上。
由于TF的低结合特异性,各结合位点的预测具有高比例的假阳性。因此,为了鉴定在体内具有功能作用的结合位点,孤立的位点预测是没有用的。然而,可能具有序列特异性功能的预测的结合位点可以通过基于保守性的过滤进行选择:物种之间调节区通常比其它非编码区要保守许多,可以对这一生物学观察结果进行量化以揭示称作系统发生足迹(phylogenetic footprints)的保守模式(Fickett等,Curr.Opin.Biotechnol.11:19-24,2000)。尤其是,人-啮齿类动物的比较证实对于鉴定功能性调节元件是一个有价值的资源(Wasserman等,Nat.Genet.26:225-228,2000)。
比对主要在不同的IFN-α基因的启动子之间揭示出显著的匹配,而基于该分析几乎没有zcyto20-22和其它细胞因子的启动子之间具有相似性的证据。
用DBA(Jareborg等,Genome Res.9:815-824,1999)进行成对序列比对。用标准位置权重矩阵(Fickett,Mol.Cell Biol.16;437-441,1996)(来自TRANSFAC数据库(3.0版,Wingender等,Nucleic Acids Res.28:316-319,2000))对各转录因子结合位点进行检索,并用SSEARCH(3.1t12版,Pearson,Genomics 11;635-650,1991)计算区域1-4的比对情况。基于公开的关于其它TF组的研究,可以预期小鼠和人之间充分保守的大多数天然结合位点可以在所用的评分范围内检测到(Fickett,Mol.Cell Biol.16;437-441,1996;Wasserman等,J.Mol.Biol.278:167-181,1998)。
计算的结果提示,通过序列相似性反映出的zcyto20家族和其它细胞因子在调节上所共有的特征将预期出现在单个的结合位点水平上,而非大范围的匹配。
基于一组(32个)TF的结合位点的检索,鉴定公知参与干扰素转录调节的有限数量的因子的推测位点。比较的结果证实在IFN-β[NF-κB,ISRE(结合IRF的元件)]和IFN-γ(AP-1,CREB,GATA,NF-κB,NF-AT)的转录调节中有重要作用的TF的推测结合位点也存在于保守的非编码区中。例如,区域1中一对相邻的AP-1/NF-AT位点是出现在许多细胞因子启动子中的一个得到很好阐明的协同结合的例子(Holloway等,Mol.Immunol.38;567-580,2000)。
TF的结合位点已经被确定对于细胞因子的调节是关键的,提示zcyto20启动子区域中的转录因子结合位点簇是候选的功能区域。
区域2与该组已知细胞因子的比对的结果是:在AK155启动子中,在相对于AK155的转录起始位点(Knapper等给出,J.Virol.74:3881-3887,2000)的-415位有匹配。Zcyto20启动子在该位置上有推测的NF-KB结合位点的这一事实说明AK155启动子中可能存在NF-KB位点。
实施例9
转基因动物
使用成年能育雄性(种鼠)(B6C3f1,2-8月龄(Taconic Farms,Germantown,NY))、切除输精管的雄性(去势鼠)(CD1,2-8月龄(Taconic Farms))、性成熟前的能育雌性(供体)(B6C3f1,4-5周龄(Taconic Farms))和成年能育雌性(受体)(CD1,2-4月龄(TaconicFarms)),制备表达zcyto21基因的转基因动物。
使供体适应环境1周,然后每只小鼠腹膜内(I.P.)注射大约8IU妊娠母马的血清促性腺激素(Sigma,St.Louis,MO),46-47小时后每只小鼠腹膜内(I.P.)注射大约8IU人绒毛膜促性腺激素(hCG(Sigma))以诱导超排卵。使供体和种鼠交配,随后注射激素。排卵一般发生在注射hCG后13小时内。通过交配后早上阴道栓的存在证实交配发生。
在手术显微镜(Leica MZ12 Stereo Microspcope,Leica,Wetzlar,DE)下收集受精卵。收集输卵管并将卵释放至含有透明质酸酶(Sigma)的尿分析(urinanalysis)玻片上。卵在透明质酸酶中洗涤一次,在Whitten氏W640培养基(表7)(已经在5%CO2、5%O2和90%N2中37℃孵育过)洗涤两次。然后在显微注射前将卵储存在37℃/5%CO2孵箱中。
将10-20μg含有zcyto21基因的cDNA的质粒DNA线性化,凝胶纯化并重悬在10mM Tris pH7.4、0.25mM EDTA pH8.0中,终浓度为每微升5-10ng用于显微注射。
将质粒DNA显微注射至包含于一滴W640培养基中的收获的卵中,之上覆盖CO2平衡的温暖石蜡油。将DNA吸入注射针(从0.75mmID,1mm OD硼硅酸盐玻璃毛细管牵拉),然后注射入各卵中。对于所有的卵,注射针均穿刺入一个或两个单倍体原核中。
将皮升DNA注射至原核中,撤出注射针并且不接触核仁。重复该过程直到所有卵都已完成注射。将成功显微注射的卵转移至含有预先放气(pregassed)的W640培养基的器官组织培养皿中,在37℃/5%CO2孵箱中保存过夜。
第二天,将来自前一天注射的12-17个健康2细胞胚胎植入受体。定位壶腹,固定住壶腹和粘液囊(bursa)之间的输卵管,用28G针头在靠近粘液囊的位置在输卵管上造成一个切口,同时确保不戳破壶腹或粘液囊。通过此切口植入胚胎,然后通过固定在腹膜壁上,引导生殖器官回到腹腔内。
将受体成对放回笼中,允许其妊娠19-21天。注射了zcyto21cDNA的动物在出生前死亡。
表7
WHITTEN氏640培养基
mgs/200m | mgs/500/ml | |
NaCl | 1280 | 3200 |
KCl | 72 | 180 |
KH2PO4 | 32 | 80 |
MgSO4·7H2O | 60 | 150 |
葡萄糖 | 200 | 500 |
乳酸钙 | 106 | 265 |
K Penn(青霉素钾) | 15 | 37.5 |
硫酸链霉素 | 10 | 25 |
NaHCO3 | 380 | 950 |
丙酮酸钠 | 5 | 12.5 |
H2O | 200 | 500 |
EDTA | 100μl | 250μl |
5%酚红 | 200μl | 500μl |
BSA | 600 | 1500 |
所有试剂均可获自Sigma。
实施例10
抗体制备
A:zcytor19多克隆抗体
用纯化的重组蛋白质huzcytor19/MBP-6H免疫2只雌性新西兰白兔,以制备多克隆抗体。每只兔最初腹膜内(ip)注射200μg完全弗氏佐剂中的纯化蛋白质,随后每3周腹膜内加强注射100μg不完全弗氏佐剂中的肽。第二次加强注射后7-10天(总共注射3次),采取动物血液并收集血清。然后每3周加强动物并采血一次。
使用CNBr-SEPHAROSE4B蛋白柱(Pharmacia LKB,Peapack,N.J.)使huzcytor19/MBP-6H特异性兔血清预先与抗MBP抗体吸附,所述蛋白柱是按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg纯化的重组MBP制备的。使用CNBr-SEPHAROSE4B蛋白柱(使用10mg纯化的重组蛋白质特异性抗原huzcytor19/MBP-6H,随后在PBS中20×透析过夜制备的)从兔血清中亲和纯化huzcytor19-特异性多克隆抗体。使用500ng/ml纯化的重组蛋白质huzcytor19/MBP-6H或huzcytor19-Fc4作为抗体靶标在ELISA中表征huzcytor19特异性抗体。测定兔抗huzcytor19/MBP-6H亲和纯化的抗体对其特异性纯化的重组抗原huzcytor19/MBP-6H及对纯化的重组huzcytor19-Fc4的检测下限(LLD)。
B:Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25多克隆抗体
用纯化的重组蛋白质zcyto20/MBP-6H、zcyto21/MBP-6H和zcyto22/MBP-6H以及小鼠zcyto24/MBP-6H或zcyto25/MBP-6H,通过免疫雌性新西兰白兔制备多克隆抗体。每只兔最初腹膜内(ip)注射200μg完全弗氏佐剂中的纯化蛋白质,随后每3周腹膜内加强注射100μg不完全弗氏佐剂中的肽。第二次加强注射后7-10天(总共注射3次),采取动物血液并收集血清。然后每3周加强动物并采血一次。
可以使用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia LKB,Peapack,N.J.)使zcyto20/MBP-6H、zcyto21/MBP-6H、zcyto22/MBP-6H、zcyto24/MBP-6H或zcyto25/MBP-6H特异性兔血清预先与抗MBP抗体吸附,所述蛋白柱是按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg纯化的重组MBP制备的。使用CNBr-SEPHAROSE4B蛋白柱(使用10mg纯化的重组蛋白质特异性抗原,随后在PBS中20×透析过夜制备的)从兔血清中亲和纯化Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的特异性多克隆抗体。使用500ng/ml纯化的重组蛋白质作为抗体靶标在ELISA中表征抗体。测定纯化的抗体对其纯化的特异性重组抗原的检测下限(LLD)。
使用类似的方法通过用CEE标签的zcyto21蛋白质免疫兔制备zcyto21的多克隆抗体,并纯化该抗体。
实施例11
聚肌苷酸-聚胞苷酸诱导的Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24
和zcyto25基因表达
A:各种细胞类型
在存在聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C;100μg/ml)(SIGMA;St.Louis,MO)情况下或在单纯的培养基中生长原代细胞(正常人支气管上皮细胞、正常人皮肤成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞、人微血管内皮细胞和人平滑肌细胞;CLONETICS公司;Walkersville,MD)和人绒毛膜癌细胞系(Jar,BeWo,和3A-SubE细胞;ATCC,Manassas,VA)的培养物。在一些情况下,还检测了10ng/ml hTNFa或10ng/ml hIL1b。孵育4小时后,分离细胞的总RNA,用无RNase的DNase处理。使用Advantage RT-for-PCR试剂盒按厂商建议(Clontech,Palo Alto,CA),使用1μg总RNA合成第一链cDNA。使用如下引物对:zcyto20,ZC40134(SEQ ID NO:30)和ZC40214(SEQ ID NO:31);zcyto21,ZC40209(SEQ ID NO:32)和ZC40213(SEQ ID NO:33);zcyto22,ZC39295(SEQ ID NO:34)和ZC39298(SEQ ID NO:35),按厂商建议(Clontech)使用5%cDNA反应物进行聚合酶链式反应。针对G3PDH的引物用作对照。
在所有测试细胞类型中均检测到低水平的zcyto20 mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、HUVEC、JAR、3-A Sub E和BeWo细胞中观察到zcyto20mRNA水平增加。在所有测试细胞类型中均检测到低水平的zcyto22mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、JAR、3-A Sub E和BeWo细胞中观察到zcyto22 mRNA水平增加。这些结果说明,已知干扰素诱导剂聚I:C可以刺激zcyto20和zcyto22mRNA合成。
在所有测试细胞类型中均检测到低水平的zcyto21 mRNA。在用聚I:C刺激的NHBE、HUVEC、NHDF、SMC、HMVEC、JAR、3-A Sub E和BeWo细胞中观察到zcyto21mRNA水平增加。在IL1b处理的3-A Sub E胎盘细胞中也观察到zcyto21 mRNA水平增加。这些结果说明,已知干扰素诱导剂聚I:C可以刺激zcyto21 mRNA合成,并且在某些细胞类型中细胞因子IL1b也可以刺激其合成。
B:外周血单个核细胞
使用Ficoll Hypaque从人血液中分离全外周血单个核细胞。从外周血单个核细胞利用VarioMacs阳性筛选柱按照厂商说明书(Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA)纯化T细胞。对来自各群体的样品进行染色,并通过荧光抗体细胞分拣(FACS)(Bectin Dickinson,SanJose,CA)分析法分析以确定富集百分数。CD3+T细胞为大约95%纯度。在聚I:C(100μg/ml)或在单纯的培养基中培养全外周血白细胞或CD3+T细胞。孵育4小时后,分离细胞的总RNA,用无RNase的DNase处理。使用Superscript一步RT-PCR和Platinum Taq试剂盒(Invitrogen,Frederick,MD)以100ng总RNA作为模板进行RT-PCR以合成cDNA。所用引物对如下:zcyto20:ZC40134(SEQ ID NO:30)和ZC40214(SEQ ID NO:31);zcyto21:ZC40209(SEQ ID NO:32)和ZC40213(SEQ ID NO:33);zcyto22:ZC39295(SEQ ID NO:34)和ZC39298(SEQ ID NO:35)。对每一种RNA的等分试样,还以特异于I类MHC的引物对(Clontech)作为对照进行了检测。
在聚I:C刺激的全外周血单个核细胞中检测到zcyto20 mRNA。此结果表明已知的干扰素刺激剂聚I:C可以刺激外周血单个核细胞合成zcyto20 mRNA。
在聚I:C刺激的全外周血单个核细胞和CD3+T细胞中检测到zcyto21mRNA。此结果表明已知干扰素刺激剂聚I:C可以刺激外周血单个核细胞(包括CD3+T细胞)合成zcyto21 mRNA。
在聚I:C刺激的全外周血单个核细胞和CD3+T细胞中检测到zcyto22 mRNA。此结果表明已知干扰素刺激剂聚I:C可以刺激外周血单个核细胞(包括CD3+T细胞)合成zcyto22 mRNA。
这些结果表明聚I:C对zcyto24和zcyto25以及其它家族成员都将有作用。
实施例12
使用RT-PCR对人原代免疫细胞和免疫细胞系进行的表达分析
使用RT-PCR筛选一组原代人免疫细胞群和入免疫细胞系的RNA,以筛查zcyto21、zcyto21和zcyto22的表达。该组RNA是自制的,包含来自下述16种不同的静息和活化细胞的RNA。所有的原代免疫细胞群是从几个匿名供体的血液中分离得到的。然后使用标记的Microbeads和磁性细胞分离系统(Miltenyi Biotec)分离各种免疫细胞亚型(CD3+、CD14+、CD19+和CD56+)。使用RNeasey MidiprepTM试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)按厂商说明书制备RNA。CD56+NK细胞RNA分离自静息态的这些细胞。联合使用500ng/ml离子霉素和5.0ng/ml PMA(12-豆蔻酸13-乙酸佛波酯)活化一个CD3+群体。另一个CD3+群体使用来自Conconavalin A刺激的大鼠脾细胞的上清液(已知富含细胞因子和生长因子的介质)进行刺激。在0、4和16小时的活化时间收集CD3+细胞用于RNA分离。从人扁桃体分离CD19+样品并用0.5μg/ml离子霉素和10ng/ml PMA活化。然后在0、4和24小时收集细胞并分离RNA。用0.1ng/ml脂多糖(LPS)或1.0ng/ml LPS活化人CD14+单核细胞20小时。然后收集静息和活化的细胞,并分离RNA。此外,从静息和活化的人单核细胞系HL-60、THP-1和U937分离RNA。HL-60细胞用10ng/ml PMA活化过夜。THP-1细胞用1.0ng/mlLPS+10ng/ml IFNγ活化过夜。最后U937细胞用10ng/ml PMA活化过夜。用Superscript一步RT-PCR和Platinum Taq试剂盒(Invitrogen),并使用100ng总RNA作为模板进行RT-PCR以合成cDNA。所用PCR引物对如下:zcyto20:ZC40632(SEQ ID NO:36)和ZC40633(SEQ ID NO:37);zcyto21:ZC40209(SEQ ID NO:32)和ZC40213(SEQID NO:33);zcyto22:ZC40638(SEQ ID NO:38)和ZC40639(SEQ IDNO:39)。对每一种RNA的等分试样,还以特异于I类MHC的引物对(Clontech)作为对照进行了检测。
在LPS和干扰素γ处理的THP-1细胞中检测到zcyto20 mRNA。在PMA处理4小时的CD3+细胞中也检测到zcyto20 mRNA。在静息U937细胞和静息THP-1细胞中检测到低水平的zcyto21 mRNA。用LPS和干扰素γ处理THP-1细胞时zcyto21 mRNA水平增加。在PMA处理4小时的CD3+细胞中也检测到zcyto21 mRNA。用LPS和干扰素γ处理的THP-1细胞中检测到zcyto22 mRNA。在PMA处理4小时和16小时的CD3+细胞中以及在用Conconavalin A处理4小时和16小时的CD3+细胞中也检测到zcyto22 mRNA。这些结果表明,活化单核细胞系和原代CD3+免疫细胞可以刺激zcyto20、zcyto21和zcyto22 mRNA的合成。
这些结果说明,聚I:C将会对zcyto24和zcyto25以及其它家族成员产生影响。
实施例13
抗病毒活性:在Hela和L929细胞中的致细胞病变效应
对抗病毒活性的最初功能性试验是使用来自瞬时转染的人胚胎肾(HEK)细胞的条件培养基进行的。该条件培养基的制备如下。使用标准方法将zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的全长cDNA克隆至pzp7Z载体中。用此Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25构建体转染293HFK细胞。简而言之,对于每个构建体,在转染前约18小时将700,000个细胞/孔(6孔板)接种在2mlDMEM+10%胎牛血清中。对每个孔,向总共100μl DMEM中的6μl Fugene6试剂(Roche Biochemicals)中添加1.5μg Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25 DNA和0.5μg pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。单独的2μg pIRES2-EGFP DNA用作阴性对照。30分钟后将这些转染混合物加入预先接种的293细胞中。24小时后,除去细胞培养基并加入DMEM+0.1%牛血清白蛋白。48小时后收集条件培养基,通过0.45微米滤器过滤,然后用于抗病毒和报道试验。
使用人宫颈癌细胞(HeLa)和小鼠成纤维细胞(L929)实施抗病毒试验。在第一天,稀释含有zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25的条件培养基(见实施例10)并与50,000个细胞一起接种在96孔平底微量滴定板中。37℃孵育24小时后,除去培养基并更换为含有感染复数0.1的脑心肌炎病毒的培养基。再次于37℃孵育细胞24小时。然后在4分等级上通过观察对培养细胞中致细胞病变效应的存在评分,然后将之转化成%CPE,见表8所示。将来自仅转染了GFP和纯化的人干扰素a-2a或鼠干扰素α的细胞的条件培养基包括在内作为对照。
表8:致细胞病变效应的测定
标示 | 致细胞病变效应(CPE)的观察情况 |
无CPE | |
+/- | 可能有CPE(大约1%单层表面) |
+ | 局限在一个噬斑中的CEP(大约5%表面) |
+1 | 局限在三个噬斑中的CEP,影响少于25%的单层 |
1 | 25%CPE |
1-2 | 37%CPE |
2 | 50%CPE |
2-3 | 62%CPE |
33 | 75%CPE |
3-4 | 87%CPE |
4 | 100%CPE |
表9显示,含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的条件培养基以剂量依赖性方式抑制了病毒对HeLa细胞的感染(%CPE),而对照GFP条件培养基没有显著阻断致细胞病变效应的出现。如表10所示,含有Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的条件培养基并不抑制病毒对L929细胞的感染。纯化的干扰素在两个试验中都显示出阳性抗病毒活性。
表9:使用条件培养基(CM)时HeLa细胞中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的致细胞病变效应百分数
表10:使用条件培养基(CM)时L929细胞中Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的致细胞病变效应百分数
作为进一步研究,将来自感染了表达Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25的杆状病毒的Sf9细胞的条件培养基用于抗病毒试验。使用来自野生型杆状病毒感染的Sf9细胞的条件培养基作为对照。
使用来自杆状病毒的条件培养基进行的抗病毒试验的结果与使用瞬时转染的293的条件培养基时的结果类似。表11显示,杆状病毒来源的含有zcyto21的条件培养基以剂量依赖方式抑制病毒对HeLa细胞的感染,而对照杆状病毒条件培养基不能阻断致细胞病变效应的出现。
表11:使用来源于杆状病毒的zcyto21条件培养基(CM)时HeLa细胞中的致细胞病变效应百分数
杆状病毒构建体和条件培养基的制备如上述。
实施例14
抗人干扰素α受体2β链抗体不能阻断抗病毒活性
使用人宫颈癌细胞(HeLa)进行了另一些抗病毒试验。在第一天,将抗人IFN受体MAb(Research Diagnostics Inc.)和同种型匹配的阴性对照MAb稀释在96孔平底微量滴定板中。加入来自表达zcyto20、zcyto21或zcyto22的杆状病毒感染的Sf9细胞的条件培养基,得到0.0625×CM的终浓度,然后每孔接种50,000HeLa细胞。37℃孵育24小时后,除去培养基并更换为含有感染复数0.1的脑心肌炎病毒的培养基。再次37℃孵育细胞24小时。然后按表8所示,通过观察对培养细胞中致细胞病变效应(CPE)的存在进行评分。浓度0.01ng/ml的纯化人干扰素-a-2a被包括在内作为阳性对照。
表12显示,含有zcyto20、zcyto21和zcyto22的条件培养基在有或无抗人干扰素α受体2β链的中和抗体存在时在HeLa细胞中都具有抗病毒活性(由0%CPE所证实)。相反,在抗人干扰素α受体2β链的中和抗体存在时,干扰素-a-2a的抗病毒活性以剂量依赖性方式特异地受到抑制。这些数据表明,zcyto20、zcyto21和zcyto22与不同于人干扰素α受体的受体相互作用,或者它与人干扰素α受体以不同于人干扰素-a-2a与人干扰素α受体相互作用的机制相互作用。
表12:使用zcyto20、zcyto21或zcyto22条件培养基(CM)及抗人干扰素α受体2β链的中和抗体时HeLa细胞中的致细胞病变效应百分数
实施例15
使用BAF3细胞系进行抗增殖试验
使用BaF3以确定zcyto20是否具有抗增殖性质。用在zcyto20cDNA或称作Zα30的无关cDNA上游含有CMV启动子及内含子A的表达载体,通过BRL lipofectamine稳定转染幼仓鼠肾(BHK)细胞。将稳定转染的细胞接种在细胞工厂的无血清培养基中,培养3天后收获条件培养基,然后在5K滤器中将其浓缩10倍。将浓缩的条件培养基样品储存在4℃。
使用如下试验在BaF3上测试抗增殖活性。在96孔板上,用单纯的生长培养基(RPMI 1640,10%胎牛血清,1mM丙酮酸钠,2mM L-谷氨酰胺)或鼠IL-3(生长培养基中起始50pg/ml)配制成终体积100μl的8个1:2系列稀释物。将如下50微升物质加入单纯的生长培养基或mIL-3稀释的道中:人干扰素α(100ng/ml,10ng/ml或1ng/ml,稀释在生长培养基中)、人干扰素β(100ng/ml,10ng/ml或1ng/ml,稀释在生长培养基中)、鼠干扰素α(100ng/ml,10ng/ml或1ng/ml,稀释在生长培养基中)、鼠干扰素β(100ng/ml,10ng/ml或1ng/ml,稀释在生长培养基中)、zcyto20(2.5×,0.5×或0.1×)和鼠Zα20(2.5×,0.5×或0.1×)。
在生长培养基中洗涤BaF3细胞系三次,沉淀重悬在生长培养基中,计数细胞并将之稀释在生长培养基中至5,000个细胞/50μl。然后向每个样品稀释物中加入50μl稀释的细胞。试验板在37℃孵箱中孵育3至4天。然后每孔加入20μl Alomar蓝,平板37℃孵育过夜。在荧光平板读数器上以544激发波长和590发射波长对平板进行读数。
实施例16
通过干扰素应答途径的信号传导
1型干扰素和其特异性受体相互作用将对许多负责抗病毒/抗增殖活性的基因产生诱导。这些基因包括2’-5’寡腺苷酸合成酶(2-5A合成酶)、双链RNA依赖性Pkr激酶(Pkr)、磷脂scramblase和细胞间粘着分子-1(ICAM-1)。还诱导目前仍未知功能的基因,如干扰素刺激的56kDa基因产物(ISG-56k)。为了确定zcyto20处理细胞时是否会诱导其中一些或所有的基因,用来自表达zcyto20的杆状病毒感染的Sf9细胞的条件培养基处理人Daudi B淋巴样细胞72小时。使用来自野生型杆状病毒感染的Sf9细胞的条件培养基作为阴性对照。处理后,收集细胞并裂解以分离总RNA。使用逆转录酶将1μg总RNA转化成cDNA,并将其作为模板并使用特异针对上述人干扰素刺激的基因的寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应。针对人甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的寡核苷酸引物被用作非干扰素刺激的基因对照。结果显示,用zcyto20处理细胞后明显诱导了ISG-56k、Pkr、2-5A合成酶和磷脂scramblase。没有观察到对ICAM-1或非干扰素刺激的基因对照G3PDH的诱导。
实施例17:作为zcyto21受体的zcytor19的鉴定
A:COS细胞转染和分泌诱捕
测试生物素化的zcyto21与已知的或孤儿细胞因子受体的结合。用含有细胞因子受体(包括人IFNαR1,IFNβR2,IFNαR1,IFNβR2,IL-10R,CRF2-4,zcytoR7,DIRS1,zcytor19和组织因子)的cDNA的pZP7表达载体转染COS细胞,并使用下述分泌诱捕试验测试生物素化的zcyto20与转染的COS细胞的结合。在该试验中阳性结合显示了受体-配体对。
COS细胞转染
按如下转染COS细胞:将COS细胞接种(1×105个细胞/孔)在纤连蛋白包被的12孔组织培养板(Becton Dickinson,Bedford,MA)上,并37℃孵育过夜。将细胞因子受体DNA(0.75μg)与50μl无血清DMEM培养基(500ml DMEM中55mg丙酮酸钠,146mg L-谷氨酰胺,5mg转铁蛋白,2.5mg胰岛素,1μg硒和5mg胎球蛋白)混合,然后与45μl无血清DMEM培养基中的5μl LipofectamineTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合,并室温孵育30分钟。再加入400μl无血清DMEM培养基。用无血清DMEM洗涤细胞,并加入500μl DNA混合物。37℃孵育细胞5小时,在此期间再加入500μl 20%FBS DMEM培养基(500ml DMEM中100mlFBS,55mg丙酮酸钠和146mg L-谷氨酰胺),然后孵育细胞过夜。
分泌诱捕试验
按如下进行分泌捕获:吸出培养基,用PBS中的1%BSA洗涤细胞。用水中的TNB(0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl和0.5%封闭剂(NENRenaissance TSA-Direct试剂盒,NEN Life Science Products,Boston,MA))封闭细胞1小时。细胞与TNB中的3μg/ml生物素化的zcyto21蛋白质(实施例27)一起孵育1小时。然后用PBS中的1%BSA洗涤细胞3次,然后与TNB中的1:300稀释的链霉亲和素-HRP(NEN试剂盒)一起再孵育1小时。再次用PBS中的1%BSA洗涤细胞3次,然后用PBS中的1.8%甲醛固定15分钟。然后用TNT(水中0.1M Tris-HCl,0.15M NaCl和0.05%Tween-20)洗涤细胞3次。
用1∶50稀释在稀释缓冲液(NEN试剂盒)中的荧光素tyramide试剂检测阳性结合,孵育4.5分钟后用TNT洗涤。用1:5稀释在TNT中的Vectashield Mounting介质(Vector Labs Burlingame,CA)保存细胞。使用FITC滤光片在荧光显微镜下观察细胞。
在转染了人zcytor19cDNA并与生物素化的zcyto21一起孵育过的细胞上检测到阳性结合。其它转染的受体没有一个与zcyto21结合,而且zcytor19不与对照生物素化的蛋白质结合。这些数据表明zcytor19是zcyto21的受体。
其它实验表明人和鼠zcytor19与生物素化的zcyto21均有阳性结合。在转染了人zcytor19cDNA并与生物素化的zcyto20和zcyto24一起孵育的细胞上也检测到阳性结合。
实施例18
信号转导报道试验
可以使用信号转导报道试验确定zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25与zcytor19的功能性相互作用。在有或无含有II类细胞因子受体(包括人DIRS1、IFNαR1、IFNαR2和zcytor19(SEQ IDNOS:23和26))的cDNA的pZP7表达载体存在时,用含有干扰素刺激应答元件(ISRE)的报道质粒转染人胚胎肾(HEK)细胞,所述ISRE驱动萤光素酶报道基因转录。在用II类配体(包括zcyto20(SEQ ID NO:1)、zcyto21(SEQ ID NO:4)、zcyto22(SEQ ID NO:6)、zcyto10、人IL10和人IFNa-2a)刺激转染细胞后的萤光素酶活性反映了配体与细胞表面上转染的和天然的细胞因子受体的相互作用。结果和方法如下。
细胞转染
如下转染293HEK细胞:转染前约18小时将700,00个293细胞/孔(6孔板)接种在2ml DMEM+10%胎牛血清中。对于每个孔,向总共100μl DMEM中的9μl Fugene 6试剂(Roche Biochemicals)中加入1μgpISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)、1μg细胞因子受体DNA和1μgpIRES2-EGFP DNA(Clontech)。当不包括细胞因子受体DNA在内时,使用2μg pIRES2-EGFP DNA。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。24小时后,使用胰蛋白酶-EDTA从平板上剥离转染细胞,然后按约25,000个细胞/孔将之重新接种在96孔微量滴定板中。配体刺激前大约18小时,将培养基改变为DMEM+0.5%FBS。
信号转导报道试验
按如下进行信号转导报道试验:在DMEM+0.5%FBS中37℃孵育18小时后,用如下II类配体的稀释物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激转染细胞:zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto10、人IL10(huIL10)和人IFN-a-2a(huIFNa-2a)。37℃孵育4小时后,裂解细胞,并在加入萤光素酶底物后在光度计上测量相对光单位(RLU)。所获结果显示为实验样品的RLU相对于单纯培养基对照的RLU的诱导倍数(实验样品的RLU/单纯培养基的RLU=诱导倍数)。表14显示,在ISRE-萤光素酶转染的293细胞中zcyto20、zcyto21和zcyto22诱导了ISRE信号转导,与单纯培养基相比产生15-17倍的萤光素酶活性诱导。向转染混合物中加入zcytor19DNA导致zcyto20、zcyto21和zcyto22诱导的ISRE信号转导再提高6-8倍,从而总共产生104至125倍诱导。所有的其它转染的II类细胞因子受体DNA均未导致ISRE信号转导增加。这些结果说明,zcyto20、zcyto21和zcyto22与zcytor19细胞因子受体发生功能性相互作用。表13还显示,人IFNa-2a可以在ISRE-萤光素酶转染的293细胞中诱导ISRE信号转导,与单纯培养基相比产生205倍萤光素酶活性诱导。然而,向转染物中加入zcytor19DNA导致ISRE信号转导降低11倍(与单纯的ISRE-萤光素酶DNA相比),提示zcytor19的过量表达会负面影响干扰素信号转导,相反,zcytor19的过量表达会对zcyto20、zcyto21和zcyto22信号转导产生正面影响。
表13:II类细胞因子刺激后转染的293细胞的干扰素刺激应答元件(ISRE)信号转导(诱导倍数)
配体 | ISRE-萤光素酶 | ISRE-萤光素酶/Zcytor19 |
Zcyto20(125ng/ml) | 15 | 125 |
Zcyto21(125ng/ml) | 17 | 108 |
Zcyto22(125ng/ml) | 17 | 104 |
HuIFNa-2a(100ng/ml) | 205 | 18 |
Zcyto10(125ng/ml) | 1.3 | 1 |
HuIL10(100ng/ml) | 1 | 0.5 |
实施例19:鉴定作为zcytor19的受体亚基的IL10Rb(CRF2-4)
A:IL10Rb中和抗体抑制ISRE信号转导
使用信号转导报道实验测定zcyto20、zcyto21和zcyto22与zcytor19及IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。用含有干扰素刺激应答元件(ISRE)的报道质粒转染人胚胎肾(HEK)细胞或稳定过量表达人zcytor19的人胚胎肾(HEK)细胞,该ISRE将驱动萤光素酶报道分子转录。用II类配体(包括zcyto20、zcyto21、zcyto22和人IFNa-2a)在有或无IL10Rb(CRF2-4)的中和抗体时刺激转染细胞后的萤光素酶活性反映了配体与细胞表面上细胞因子受体的相互作用。结果和方法如下。
细胞转染:
为了制备稳定过量表达人zcytor19的293HEK细胞,按如下转染293细胞:在转染前约6小时将300,000个293细胞/孔(6孔板)接种在2ml DMEM+10%胎牛血清。对于每个孔,向总共100μl DMEM中的6μl Fugene 6试剂(Roche Biochemicals)中加入2μg含有人zcytor19的cDNA(SEQ ID NO:23)的pZP7表达载体。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。48小时后,将转染细胞置于2μg/ml嘌呤霉素选择之下。嘌呤霉素抗性细胞表现为细胞群。
按如下转染293HEK细胞(野生型或过量表达人zcytor19):在转染前约18小时将700,000个293细胞/孔(6孔板)接种在2ml DMEM+10%胎牛血清中。对于每个孔,在总共100μl DMEM内的6μl Fugene 6试剂(Roche Biochemicals)中加入1μg pISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)和1μg pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的293细胞中。24小时后使用胰蛋白酶-EDTA将转染细胞从平板上剥离下来,然后按约25,000个细胞/孔将之重新接种在96孔微量滴定板中。配体刺激前大约18小时,将培养基改变为DMEM+0.5%FBS。
信号转导报道试验
按如下进行信号转导报道试验:在DMEM+0.5%FBS中37℃孵育18小时后,用IL10Rb的中和多克隆山羊抗体(对于zcytor21,2.5μg/ml;对于zcyto20和zcyto22,8μg/ml,R&D Systems)或PBS37℃预先处理转染细胞1小时。对于涉及zcyto20和zcyto22的实验,还用IFNAR1的非中和多克隆山羊抗体(8μg/ml,R&D Systems)作为抗体对照预先处理稳定过量表达人zcytoR19的人胚胎肾(HEK)细胞。用如下II类配体的稀释物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激预先处理的细胞:zcyto20、zcyto21或zcyto22。每个实验中使用人IFNa-2a作为对照。37℃孵育4小时后,裂解细胞,并在加入萤光素酶底物后在光度计上测量相对光单位(RLU)。所获结果显示为与单纯培养基对照相比实验样品的RLU的诱导倍数(实验样品的RLU/单纯培养基的RLU=诱导倍数)。
表14和15显示,用IL10Rb的中和抗体预先处理野生型293细胞或过量表达人zcytoR19的293细胞可以抑制zcyto20对ISRE信号转导的诱导。几乎或完全观察不到对人IFNa-2a诱导的ISRE信号转导的抑制。这些结果说明,对于ISRE信号转导的最大诱导,zcyto20需要与IL10Rb(CRF2-4)相互作用,而且zcyto20的受体是zcytoR19和IL10Rb(CFR2-4)的异二聚体组合。
表14:II类细胞因子刺激后转染的野生型293细胞的ISRE信号转导的IL10Rb抑制(诱导倍数)
细胞因子浓度(ng/ml) | Zcyto20 | Zcyto20+IL10Rb中和抗体 | HuIFNa-2a | HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体 |
100 | 8.4 | 0.8 | 152 | 102 |
10 | 4 | 0.9 | 160 | 117 |
1 | 1 | 0.9 | 90 | 69 |
0.1 | 1 | 1 | 12 | 6 |
0.01 | 1 | 0.8 | 1.2 | 1 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表15:II类细胞因子刺激后过量表达zcytoR19的转染293细胞的ISRE信号转导的IL10Rb抑制(诱导倍数)
细胞因子浓(ng/ml) | Zcytoo20 | Zcyto20+IL10Rb中alizing | HuIFNa-2a | HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体 |
100 | 91 | 60 | 16 | 16 |
10 | 97 | 23 | 14 | 15 |
1 | 68 | 1.3 | 8 | 8.4 |
0.1 | 6 | 1.1 | 1.5 | 1.9 |
0.01 | 1.1 | 1.2 | 1.2 | 1.3 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表16和17显示,用IL10Rb的中和抗体预先处理野生型293细胞或过量表达人zcytoR19的293细胞可以抑制zcyto21引起的ISRE信号转导。对于人IFNa-2a诱导的ISRE信号转导,没有观察到抑制。这些结果说明,为了最大诱导ISRE信号转导,zcyto21需要与IL10Rb(CRF2-4)相互作用,而且zcyto21的受体是zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的异二聚体组合。
表16:II类细胞因子刺激后转染的野生型293细胞的ISRE信号转导的IL10Rb抑制(诱导倍数)
细胞因子浓度(ng/ml) | Zcyto21 | Zcyto21+IL10Rb中和抗体 | HuIFNa-2a | HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体 |
100 | 4.1 | 1.8 | 31 | 30 |
10 | 3.2 | 1.4 | 32 | 31 |
1 | 1.5 | 1.3 | 16.3 | 15 |
0.1 | 1.1 | 1.3 | 1.4 | 2 |
0.01 | 1.2 | 1.3 | 1.1 | 1.2 |
0.001 | 1.2 | 1.3 | 0.9 | 2.1 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表17:II类细胞因子刺激后过量表达zcytoR19的转染293细胞的ISRE信号转导的IL10Rb抑制(诱导倍数)
细胞因子浓度(ng/ml) | Zcyto21 | Zcyto21+IL10Rb中和抗体 | HuIFNa-2a | HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体 |
100 | 45 | 31 | 9 | 7.7 |
10 | 48 | 28 | 9 | 8.5 |
1 | 35 | 5.8 | 4.3 | 4.3 |
0.1 | 3.5 | 1 | 1.4 | 1.3 |
0.01 | 1.5 | 1.1 | 0.9 | 1.2 |
0.001 | 1.1 | 1 | 1.2 | 1 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表18和19显示,用IL10Rb的中和抗体预先处理野生型293细胞或过量表达人zcytoR19的293细胞可以抑制zcyto22引起的ISRE信号转导。对于人IFNa-2a诱导的ISRE信号转导,没有或几乎没有观察到抑制。这些结果说明,为了最大诱导ISRE信号转导,zcyto22需要与IL10Rb(CRF2-4)相互作用,而且zcyto21的受体是zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的异二聚体组合。
表18:II类细胞因子刺激后转染的野生型293细胞的ISRE信号转导的IL10Rb抑制(诱导倍数)
细胞因子浓度(ng/ml) | Zcyto22 | Zcyto22+IL10Rb中和抗体 | HuIFNa-2a | HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体 |
100 | 11 | 1.2 | 152 | 102 |
10 | 8 | 1 | 160 | 117 |
1 | 1.8 | 0.8 | 90 | 69 |
0.1 | 1.2 | 0.8 | 12 | 6 |
0.01 | 0.9 | 0.9 | 1.2 | 1 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表19:II类细胞因子刺激后过量表达zcytoR19的转染293细胞的ISRE信号转导的IL10Rb抑制(诱导倍数)
细胞因子浓度(ng/ml) | Zcyto22 | Zcyto22+IL10Rb中和抗体 | HuIFNa-2a | HuIFNa-2a+IL10Rb中和抗体 |
100 | 82 | 76 | 16 | 16 |
10 | 97 | 39 | 14 | 15 |
1 | 69 | 2.3 | 8 | 84 |
0.1 | 8.4 | 1.1 | 1.5 | 1.9 |
0.01 | 1 | 1.3 | 1.2 | 1.3 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
B:抗IL10Rb抗体阻断抗病毒活性
进行抗病毒试验以确定抗IL10Rb抗体阻断zcyto20的抗病毒活性的能力。该试验使用293HEK细胞(野生型或过量表达人zcytoR19)进行。第一天,按5μg/ml将抗体(抗人IL10Rβ、抗人Leptin受体,R&DSystems)稀释在细胞培养基中,然后与50,000个细胞/孔一起接种在96孔板中。37℃孵育1小时后,将zcyto20-CEE(来自实施例3)(200ng/ml用于野生型293细胞、0.5ng/ml用于过量表达人zcytoR19的293细胞)或人干扰素a-2a(1ng/ml用于野生型293细胞、100ng/ml用于过量表达人zcytor19的293细胞)加入孔中,并37℃孵育过夜。第二天,除去培养基并更换为含有感染复数0.1的脑心肌炎病毒(EMCV)的培养基。然后37℃将细胞孵育过夜。随后,每孔中加入25μl5mg/ml甲基噻唑四唑鎓(MTT)(Sigma),37℃孵育2小时,然后用100μl抽提缓冲液(12.5%SDS,45%DMF)抽提各孔。37℃孵育过夜后,在Spectromax平板读数器(Molecular Devices,CA)上测量570nM的光密度。光密度(570nm)降低表明细胞存活减少(抗病毒活性丧失)。对于不同的试验条件,光密度(570nm)显示在下表20中。结果显示,封闭人IL10受体β特异地抑制了zcyto20的抗病毒活性,但不影响干扰素-a-2a的活性。这说明,人IL10受体β是参与zcyto20抗病毒活性的受体复合物(包括人zcytor19)的一部分。
表20:ECMV感染的经细胞因子处理的细胞的光密度(570nm)
细胞因子 | 野生型293细胞:抗IL10Rb | 野生型293细胞:抗LeptinR | 过量表达人zcytor19的293细胞:抗IL10Rb | 过量表达人zcytor19的293细胞:抗LeptinR |
zcyto20-CEE | .94 | .88 | .95 | .24 |
人IFNa-2a | .58 | .4 | .18 | .05 |
C:zcytoR19和IL10Rb的共表达可增加zcyto20、zcyto21和
zcyto22的信号转导
使用信号转导报道试验测定zcyto20、zcyto21和zcyto22与zcytor19及IL10Rb(CRF2-4)的功能性相互作用。在有或无含有II类细胞因子受体zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)的cDNA的pZP7表达载体时,用含有用干扰素刺激应答元件(ISRE)的报道质粒转染仓鼠肾(BHK)细胞,该ISRE将驱动萤光素酶报道基因转录。用II类配体(包括zcyto20、zcyto21和zcyto22)刺激转染细胞后的萤光素酶活性反映了配体与细胞表面上转染的和天然的细胞因子受体的相互作用。结果和方法如下。
细胞转染:
按如下转染BHK-570细胞:在转染前约5小时将200,000个BHK细胞/孔(6孔板)接种在2ml DMEM+5%胎牛血清中。对于每个孔,在总共100μl DMEM内的9μl Fugene6试剂(Roche Biochemicals)中加入1μg pISRE-萤光素酶DNA(Stratagene)、1μg细胞因子受体DNA和1μg pIRES2-EGFP DNA(Clontech)。当不包含细胞因子受体DNA时使用2μg pIRES2-EGFP DNA。30分钟后将该转染混合物加入预先接种的BHK细胞中。24小时后使用胰蛋白酶-EDTA将转染细胞从平板上剥离下来,然后按约25,000个细胞/孔将之重新接种在96孔微量滴定板中。配体刺激前大约18小时,将培养基改变为DMEM+0.5%FBS。
信号转导报道试验
按如下进行信号转导报道试验:在DMEM+0.5%FBS中37℃孵育18小时后,用zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24或zcyto25配体的稀释物(在DMEM+0.5%FBS中)刺激转染细胞。37℃孵育4小时后,裂解细胞,并在加入萤光素酶底物后在光度计上测量相对光单位(RLU)。所获结果显示为与单纯培养基对照相比实验样品的RLU的诱导倍数(实验样品的RLU/单纯培养基的RLU=诱导倍数)。表21显示,zcyto20、zcyto21和zcyto22在ISRE-萤光素酶和zcytor19转染的BHK细胞中以剂量依赖性方式诱导ISRE信号转导。向转染混合物中加入IL10Rb(CRF2-4)DNA导致以低10-100倍的细胞因子剂量得到信号转导最大诱导量的一半。单纯使用ISRE转染时未观察到反应。这些结果说明,zcyto20、zcyto21和zcyto22通过干扰素刺激应答元件传导信号的能力可以被zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的共表达加强,表明zcyto20、zcyto21和zcyto22的受体是zcytoR19和IL10Rb(CRF2-4)的异二聚体组合。
表21:II类细胞因子刺激后转染的BHK细胞的干扰素刺激应答元件(ISRE)信号转导(诱导倍数)
II类配体浓度(ng/ml) | zcyto20/单纯zcytor19转染的细胞 | zcyto20/zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)转染的细胞 | zcyto21/单纯zcytor19转染的细胞 | zcyto21/zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)转染的细胞 | zcyto22/单纯zcytor19转染的细胞 | zcyto22/zcytor19和IL10Rb(CRF2-4)转染的细胞 |
1000 | 2.25 | 2.1 | 3.3 | 2.2 | 1.8 | 2.2 |
100 | 2.2 | 2.6 | 2.6 | 2.5 | 2 | 2.2 |
10 | 2.1 | 2.4 | 2.4 | 2.6 | 1.9 | 2.7 |
1 | 1.3 | 2.5 | 2 | 2.5 | 1.5 | 2.7 |
0.1 | 1.25 | 2.1 | 1.4 | 2.2 | 1.1 | 2.4 |
0.01 | 1.2 | 1.6 | 1.4 | 1.6 | 1.2 | 1.7 |
0.001 | 1.4 | 1.5 | 1.3 | 1.3 | 1.2 | 1.3 |
0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
实施例20
构建表达zcytor19可溶性受体:zcytor19CEE、zcytor19CFLG、zcytor19CHIS和zcytor19-Fc4的哺乳动物表达载体
为了表达zcytor19多肽的可溶性细胞外域,制备表达载体pC4zcytor19CEE,其中对该构建体进行设计以便表达包含预测的起始甲硫氨酸且在预测的跨膜域处附近截短的带有C端Glu-Glu标签(SEQID NO:16)的zcytor19多肽。
使用PCR构建包含本文所述zcytor19细胞外域或zcytor19的细胞因子结合域的zcytor19DNA片断,并用标准方法纯化。将切下的DNA亚克隆至质粒表达载体中,该载体具有信号肽(如天然zcytor19信号肽)并将Glu-Glu标签(SEQ ID NO:16)加至zcytor19多肽C端的编码核苷酸序列上。该哺乳动物表达载体含有带哺乳动物启动子、用于插入编码序列的多克隆位点、终止密码子和哺乳动物终止子的表达盒。该质粒还可以具有大肠杆菌的复制起点、哺乳动物选择标记表达单位(具有SV40启动子、增强子和复制起点、DHRF基因和SV40终止子)。
限制性消化的zcytor19插入片断与预先消化的载体使用标准分子生物学技术进行连接,然后按照厂商说明书电穿孔至感受态细胞如DH10B感受态细胞(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)中,之后接种在含有50mg/ml氨苄青霉素的LB平板上并孵育过夜。通过限制性分析从各个菌落制备出的DNA,筛选菌落。阳性克隆的插入序列通过序列分析验证。使用大量制备试剂盒(Qiagen)根据厂商说明大规模制备质粒。
使用相同方法制备带有C端his标签(由一排6个His残基组成)的zcytor19可溶性受体;和带有C端FLAG标签(SEQ ID NO:42)的zcytor19CFLAG。为了构建这些构建体,将前述载体中的glu-glu标签(SEQ ID NO:16)替换为C-HIS或FLAG标签。
制备表达载体zcytor19/Fc4/pzmp20以在BHK细胞中表达C端带有Fc4标签的可溶性zcytor19版本(人zcytor19-Fc4)。将包括zcyotr19受体细胞外域的多核苷酸序列的zcytor19cDNA片断与Fc4多核苷酸序列(SEQ ID NO:43)在阅读框中融合以产生zcytor19-Fc4融合物。pzmp20载体是哺乳动物表达载体,含有Fc4多核苷酸序列和允许使用标准分子生物学技术快速构建C端Fc4融合物的克隆位点。
通过PCR产生含有人zctor19细胞外域以及在5’和3’末端分别编码有BamHI和Bgl2位点的一段630碱基对片断。该PCR片断使用引物ZC37967(SEQ ID NO:44)和ZC37972(SEQ ID NO:45)通过扩增人脑cDNA文库来制备。该PCR反应条件如下:94℃ 20秒和68℃ 2分钟进行30个循环;68℃ 4分钟进行1个循环;之后10℃保温。用BamHI和Bgl2限制性内切酶消化该片断,随后通过1%凝胶电泳纯化,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行条带纯化。所获纯化DNA室温下与预先用Bgl2消化的pzmp20载体(其在Bgl2位点3’含有Fc4)连接5小时。
在37μl DH10B电感受态大肠杆菌(Gibco)中根据厂商指导用1μl连接混合物进行电穿孔。将转化的细胞稀释在400μl LB培养基中,并铺在含有l00μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。通过限制性消化分析克隆,阳性克隆进行DNA测序以验证融合构建体的序列。
实施例21
哺乳动物表达人zcytor19可溶性受体:zcytor19/Fc4
将BHK570细胞(ATCC NO:CRL-10314)接种在T-75组织培养瓶中,使之37℃和5%CO2下在DMEM/FBS培养基(DMEM,Giboco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL,Gaithersburg,MD),5%胎牛血清,1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences,Lenea,KS),1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中生长至大约50%至70%汇合。然后用质粒zcytor19/Fc4/pzmp20(实施例4B)和LipofectamineTM(Gibco BRL),在无血清(SF)培养基制品(DMEM,10mg/ml转铁蛋白,5mg/ml胰岛素,2mg/ml胎球蛋白,1%L-谷氨酰胺和1%丙酮酸钠)中转染细胞。用SF培养基将10μg质粒DNAzcytor19/Fc4/pmzp20(实施例4B)稀释在15ml管中至500μl终体积。使50μlLipofectamine与450μl SF培养基混合。向DNA混合物中加入该Lipofectamine混合物,然后在室温下孵育约30分钟。将4ml SF培养基加入该DNA:Lipofectamine混合物中。用5ml SF培养基洗涤细胞一次,吸出然后加入该DNA:Lipofectamine混合物。37℃孵育细胞5小时,然后加入5ml DMEM/10%FBS培养基。摇瓶在37℃孵育过夜,之后将细胞分开按1:2、1:10和1:50加入150mm平板的选择培养基(上述DMEM/FBS培养基加上1μM氨甲蝶呤(Sigma Chemical Co.St.Louis,MO.))中。转染后大约10天,将1个150mm平板中的1μM氨甲蝶呤抗性集落用胰蛋白酶处理,汇合细胞,然后将其中一半细胞重新接种在10μM氨甲蝶呤中;以便进一步扩大zcytor19/Fc4蛋白质的表达。使用SDS-PAGE和Western分析测试从该汇合的扩增细胞得到的条件培养基样品,以确定表达水平。
还可以使用标准技术分离、筛选表达该可溶性受体的单个克隆,并将之培养在细胞培养基中,然后进行纯化。此外,对于这些目的,CHO细胞也是适宜的细胞。
实施例22
使用ORIGEN试验评价zcytor19受体异二聚化
根据厂商操作方案通过与5倍摩尔过量的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce,Inc.,Rockford,IL)反应对可溶性zcytor19受体进行生物素化。可溶性zcytor19受体和另一可溶性受体亚基(例如可溶性II类细胞因子受体,如CRF2-4(SEQ ID NO:40))根据厂商操作方案用5倍摩尔过量的Ru-BPY-NHS(Igen,Inc.,Gaithersburg,MD)标记。该生物素化的和Ru-BPY-NHS标记形式的可溶性zcytor19受体可以分别命名为Bio-zcytor19受体和Ru-zcytor19;另一可溶性受体亚基的该生物素化形式和Ru-BPY-NHS标记形式可以类似地命名。使用条件培养基或使用纯化的配体进行试验。
对于最初对可溶性受体结合的表征,测试上述细胞因子或条件培养基以确定它们是否可以介导zcytor19受体的同二聚体化以及它们是否能介导zcytor19与上述可溶性受体亚基的异二聚体化。为了达到此目的,将50μl条件培养基或含有纯化细胞因子的TBS-B与含有如400ng/mlRu-zcytor19受体和Bio-zcytor19、或400ng/mlRu-zcytor19和如Bio-CRF2-4、或400ng/ml如Ru-CRF-4和Bio-zcytor19的50μl TBS-B(20mM Tris,150mM NaCl,1mg/ml BSA,pH7.2)混合。室温孵育1小时后,加入30μg链霉亲和素包被的2.8mm磁珠(Dynal,Inc.,Oslo,Norway),并室温再孵育该反应物1小时。然后加入200μl ORIGEN试验缓冲液(Igen,Inc.Gaithersburg,MD),并使用M8 ORIGEN分析仪(Igen,Inc.)测量受体结合的程度。
实施例23
用于制备zcytor19受体异二聚体的构建体
表达分泌的人zcytor19异二聚体的载体是通过将zcytor19的细胞外细胞因子结合域与IgGγ1重链融合,并将异聚(heteromeric)细胞因子受体亚基(例如II类细胞因子受体,如CRF2-4)的细胞外部分与人κ轻链融合来构建的。
a.构建IgGγ1和人κ轻链融合载体
将IgGγ1重链克隆在Zem229R哺乳动物表达载体(ATCC保藏号69447)中以便可以在其中克隆具有5’EcoRI和3’NheI位点的任何期望的细胞因子受体细胞外域,导致形成N端细胞外域-C端IgGγ1融合物。用于该构建体中的IgGγ1片断是通过PCR从作为模板的Clontech人胎肝cDNA文库中分离出IgGγ1序列而制备的。使用本文所述方法纯化PCR产物,并用MluI和EcoRI(Boehringer-Mannheim)消化,乙醇沉淀,并使用本文公开的标准分子生物学技术将之与含有MluI/EcoRI接头的寡聚物一起连接至预先用EcoRI消化的Zem229R中。
将人κ轻链克隆在Zem228R哺乳动物表达载体(ATCC保藏号69446)中以便可以在其中克隆具有5’EcoRI和3’KpnI位点的任何期望的细胞因子受体细胞外域,导致形成N端细胞因子细胞外域-C端人κ轻链融合物。由于有一个KpnI位点位于人κ轻链序列中,故设计特异引物以将期望的细胞因子受体细胞外域的3’端克隆至该KpnI位点中:对该引物进行设计以便所获PCR产物含有期望的细胞因子细胞外域和到该KpnI位点之前的一段人κ轻链。该引物优选包含与人κ轻链5’端在阅读框中融合的期望细胞因子细胞外域3’末端的至少10个核苷酸的部分。用于该构建体中的人κ轻链片断是通过PCR从用于上面的同样Clontech人胎肝cDNA文库中分离出人κ轻链序列而制备的。使用本文所述方法纯化PCR产物,并用MluI和EcoRI(Boehringer-Mannheim)消化,乙醇沉淀,并使用本文公开的标准分子生物学技术将其与MluI/EcoRI接头一起连接至预先用EcoRI消化的Zem228R中。
b.将zcytor19受体或异二聚化的亚基细胞外域插入融合载体构建体中
使用上述构建载体,制备zcytor19与IgGγ1融合的构建体。通过标准方法使用提供EcoRI和NheI限制性位点的寡聚物经PCR从前列腺cDNA文库(Clontech)或活化的淋巴细胞cDNA文库扩增本文所述zcytor19受体的细胞外域或细胞因子结合域,从而实现此构建。按本文所述,所获PCR产物用EcoRI和NheI消化,凝胶纯化,并连接至预先用EcoRI和NheI消化并经带纯化的上述Zem229R/IgGγ1中。对所获载体测序以验证该zcytor19/IgGγ1融合物(zcytor19/Ch1 IgG)是正确的。
按上述还构建了另一独立结构,该结构具有与κ轻链融合的异二聚体化的细胞因子受体亚基(即CRF2-4)的细胞外域。按上述通过PCR用标准方法和提供EcoRI和KpnI限制性位点的寡聚物从例如淋巴细胞cDNA文库(Clontech)扩增,进行细胞因子受体/人κ轻链的构建。用EcoRI和KpnI消化所获PCR产物,然后将该产物连接至预先EcoRI和KpnI消化并经带纯化的上述Zem228R/人κ轻链载体中。测序所获载体以证实细胞因子受体亚基/人κ轻链融合物是正确的。
c.zcytor19和异二聚体化细胞因子受体亚基细胞外域的共表达
利用LipofectaminePlusTM试剂(Gibco/BRL),按制造商的说明,用上述每个载体大约15μg共转染哺乳动物细胞,如BHK-570细胞(ATCC No.CRL-10314)。在含有1μM氨甲蝶呤(MTX)(Sigma,St.Louis,MO)和0.5mg/ml G418(Gibco/BRL)的DMEM+5%FBS(Gibco/BRL)中选择转染细胞10天。所获转染子库在10μM MTX和0.5mg/ml G418中再次选择10天。
使用所获二次选择的细胞库制备蛋白质。利用该库的3个工厂(Nunc.丹麦)制备10L无血清条件培养基。使该条件培养基通过1ml蛋白A柱,然后洗脱在约10,750μl馏分中。将具有最高蛋白质浓度的馏分汇合,并对PBS透析(10kD MW截断值)。最后,使用常规方法对该透析物进行氨基酸分析(AAA)。
d.体外重建zcytor19受体
为了鉴定参与zcytor19信号转导复合物的成分,按如下进行受体的重建研究。例如,使用本文所述标准方法转染了萤光素酶报道哺乳动物表达载体质粒的BHK 570细胞(ATCC No.CRL-10314)可以用作生物分析细胞系以测量在zcytor19配体存在时从转染的zcytor19受体复合物到萤光素酶报道分子的信号转导应答。因为BHK细胞不内源性表达zcytor19受体,故可以使用BHK细胞。也可以使用其它细胞系。一个示例性萤光素酶报道哺乳动物表达载体是KZ134质粒,该质粒是使用含有来自4个基因的STAT转录因子结合元件的互补寡核苷酸构建的。修饰的c-fos Sis诱导型元件(m67SIE或hSIE)(Sadowski,H等,Science 261:1739-1744,1993)、来自p21WAF1基因的p21SIE1(Chin,Y.等,Science 261:1739-1744,1996)、β-酪蛋白基因的乳腺应答元件(Schmitt-Ney,M.等,Mol.Cell Biol.11:3745-3755,1991)和Fcg RI基因的STAT诱导型元件(Seidel,H.等,Proc.Natl.Acad.Sci.92:3041-3045,1995)。这些寡核苷酸含有Asp718-XhoI相容性末端,使用标准方法将其连接入用相同酶消化过的、具有c-Fos启动子并含有新霉素选择标记的受体萤火虫萤光素酶报道载体(Poulsen,L.K.等,J.Biol.Chem.273;6229-6232,1998)。通过标准转染和选择方法,使用KZ134质粒稳定转染BHK或BaF3细胞,以分别制备BHK/KZ134或BaF3/KZ134细胞系。
用单独的zcytor19受体转染该生物分析细胞系,或用zcytor19和多种其它已知受体亚基中的一种一起共转染该细胞系。受体复合物包括但不限于单纯的zcytor19受体、zcytor19与II类细胞因子受体(如干扰素γ、α和β链和干扰素α/β受体α和β链、zcytor11(共同拥有的美国专利5,965,704)、CRF2-4、DIRS1、zcytor7(共同拥有的美国专利5,945,511)受体)的各种组合。然后在存在细胞因子条件培养基或纯化的细胞因子时分析每种独立的受体复合物细胞系,并使用常规方法测量萤光素酶活性。未转染的生物分析细胞系作为对照以得到背景萤光素酶活性,由此用作基线以便于比较不同的受体复合物组合的信号转导。在正确受体复合物存在时与zcytor19受体结合的条件培养基或细胞因子预期将给出相对于背景大约5倍或更多的萤光素酶读数。
作为备选方案,可以进行类似试验,其中按本文所述共转染Baf3/zcytor19细胞系并使用诸如标准Alamar Blue增殖试验等已知试验测量增殖。
实施例24
配体与可溶性受体的结合
可以使用碘珠标记方法测试配体(Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25)与可溶性受体的结合。例如,125I标记的zcyto21-CEE是标记的(1.2×107CPM/ml;1.5ng/μl;和8.6×106CPM/μg)。
将50ng125I标记的zcyto21-CEE(见实施例3)(399,600CPM)与1000ng冷zcytor19/Fc4同二聚体受体、1000ng冷zcytor19/CRF2-4异二聚体受体或1000ng对照II类细胞因子受体/Fc4受体以及作为竞争者的约10,000ng冷zcyto21混合。将样品在4℃孵育2小时,之后向每个样品中加入30μlG蛋白(Zymed San Francisco.CA)。4℃孵育样品1小时,然后用PBS洗涤3次。使用γ计数器(PackardInstruments,Downers Grove,IL)测量洗涤后G蛋白的放射活性。
实施例25
用zcyto20和zcyto21-生物素流式细胞术染色人单核细胞
用Ficoll Hypaque(Amersham,瑞典)分离方法从肝素化人血中分离外周血白细胞(PBL)。37℃在标准培养基中以1×10e6个细胞/ml的密度在6孔组织培养板中培养PBL。过夜孵育后,收获PBL并用浓度10μg/ml的生物素化zcyto20-cee和zcyto21-cee(见实施例18)染色。用按1:1000稀释制备的藻红蛋白标记的链霉亲和素(Pharmingen,CA,USA)检测染色。染色后将PBL在2%多聚甲醛中固定,在Facscaliber(Becton Dickinson,San Diego,CA)上读数。使用Cellquest软件(Becton Dickinson)分析数据。结果显示,生物素化的zcyto20-cee和zcyto21-cee均染色处于外周血白细胞的骨髓门(myeloid gate)中的细胞。淋巴门(lymphoid gate)中的细胞不与zcyto20-cee和zcyto21-cee结合。
实施例26
zcyto21-CEE对PBL上活化标记的表达的影响
通过Ficoll Hypaque分离方法从肝素化人血液中分离外周血白细胞(PBL)。然后用来自如下的纯化蛋白或培养基对照刺激PBL:1)zcyto21-CEE(2μg/ml);2)zcyto21-cee(1μg/ml);3)单纯培养基;4)A141F阴性对照蛋白(2μg/ml);或5)IFNα-A(1ng/ml)(PBLBiomedical NJ,USA)。经过刺激的PBL在37℃及5%CO2下按1×10e6个细胞/ml细胞密度培养。24小时和48小时收获培养物,并对活化标记进行染色。
用PBS洗涤PBL,然后用Facs缓冲液(HBSS+2%正常山羊血清、2%BSA、0.2%NaN3)中的正常小鼠IgG封闭,之后用针对如下标记的抗体进行染色:CD19、CD14、CD3、HLA-DR、CD54、HLA-ABC(Pharmingen,CA,USA和Immunotech,法国)。洗涤细胞,然后在2%多聚甲醛中固定,然后在Facscaliber(Becton Dickinson,CA,USA)上分析。所获数据使用Cellquest软件(Becton Dickinson,CA,USA)分析。
结果说明,与单纯培养基对照相比,用zcyto21-cee刺激的单核细胞上表面CD54(ICAM)表达在24和48小时增加。用zcyto21-cee刺激也导致在第24小时B细胞上主要组织相容性复合体I的表达增加和在第48小时B细胞和单核细胞上MHCI的表达增加。
实施例27
配体的生物素化
按如下Pierce Chemical公司提出的修饰方案用Sulfo-NHS-LC-生物素对zcyto21CEE进行生物素化。将250μg zcyto21CEE(在0.5mlPBS中)加入8.4μl S-NHS-生物素原液(84μg)中,摇动下室温孵育2小时。孵育步骤后,加入20μl 2M TrisHCl(pH8),摇动下室温孵育混合物20分钟。然后将此生物素化的配体混合物储存在4℃。按基本上相同的方法制备zcyto20CEE、zcyto22CEE和zcyto24CEE。
实施例28
Northern分析zcytor19的表达
探测Northern印迹以确定zcytor19的组织分布。使用PCR和基因特异性引物,即5’ZC40285(显示在SEQ ID NO:21)和3’ZC40286(显示在SEQ ID NO:22),获得人zcytor19cDNA片断。模板是克隆的人zcytor19cDNA(SEQ ID NO:23)。凝胶纯化PCR片断,用P32α-dCTP和Prime-ItRmT随机引物标记试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)标记大约25ng。
探测如下Northern印迹(Clontech,Pal Alto,CA)以检测zcytor19mRNA的表达:(1)人癌细胞系印迹C,其含有来自如下各癌细胞系的RNA样品:早幼粒细胞白血病HL-60、HELA S3、慢性骨髓性白血病k-562、淋巴母细胞白血病MOLT-4、伯基特氏淋巴瘤RAJI、结肠直肠腺癌SW480、肺癌A549和黑素瘤G-361;(2)人MIN H印迹,其含有来自如下组织的mRNA:心脏、全脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺;(3)人MTN H3,其含有来自如下组织的mRNA:胃、甲状腺、脊髓、淋巴结、气管、肾上腺和骨髓;和(4)人MTN H4,其含有来自如下组织的mRNA:脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、子宫、小肠、结肠和外周血白细胞。除了将额外的0.2mg/ml鲑精DNA加入杂交和预杂交缓冲液中以减低非特异性杂交外,杂交均在ULTRAhybTM超灵敏杂交缓冲液(Ambion,Austin,TX)中根据厂家推荐进行。杂交后,通过用0.1×SSC/0.5%SDS在50℃处理,除去非特异性放射信号。使用BioMaxMR胶片和增感屏(Eastman Kodak,Rochester,NY)按厂家推荐曝光印迹3天。
一个~4.5kb转录本在心脏、骨骼肌、胰腺和前列腺组织,以及伯基特淋巴瘤(RAJI)细胞系中表达量最大。在多种其它组织中观察到较低水平。此外,还有一个~2kb转录本,其一般比上述该较大转录本丰度小,但也存在于许多组织和细胞系中。除了具有该2和4.5kb转录本外,睾丸组织中还可能具有约4kb和1.4kb转录本。肾上腺表现出该4.5kb和2kb转录本的表达水平相等。
实施例29
原位分析zcytor19的表达
分离特定人组织并原位杂交筛查zcytor19的表达。制备多种人组织,切片并进行原位杂交,这些组织包括正常和癌性结肠、宫颈癌、子宫内膜癌、正常和癌性卵巢、正常和赘生性皮肤、胎肝、肺、心脏和MFH(肌肉肉瘤)。使用标准技术在10%缓冲的甲醛中固定组织,并石蜡包埋。将组织切成4至8微米切片。使用标准方案制备组织。简而言之,用(National Diagnostics,Atlanta,GA)给组织切片脱石蜡,然后用乙醇脱水。接着,用蛋白酶K(50μg/ml)(Boehringer Diagnostics,Indianapolis,IN)37℃消化切片2至7分钟。该步骤后对组织进行乙酰化和重现水化。
使用标准方法针对人zcytor19(变体×1)序列(INC7128744,见SEQ ID NO:25)(含有zcytor19的3’UTR)设计了一个原位探针。使用T7聚合酶产生反义探针。使用体外转录系统(体外转录系统,Promega,Madison,WI),除了使用地高配基辛探针代替放射标记的rCTP以及调节水以适应rNTP的减少体积外,按照厂家说明标记探针。使用地高辛配基标记的zcytor19探针(上述)进行原位杂交。以1至5pmol/ml将探针加至载玻片上,60℃12至16小时。随后在2×SSC和0.1×SSC中55℃洗涤载玻片。使用TSATM(Tyramide SignalAmplification;PerkinElmer Life Sciences Inc.,Boston,MA)扩大信号,并用VECTOR红底物试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)按厂家指导进行显色。然后用苏木精复染载玻片。
在几种测试的组织中观察到信号:结肠癌组织中,在癌细胞和几个免疫浸润区观察到弱信号。然而,在正常结肠和小肠中,包括固有层、上皮、免疫节中的细胞和外周神经节神经细胞,没有观察到阳性信号。在宫颈癌组织中,在癌细胞及免疫节的一些细胞中有弱信号。在子宫内膜癌组织中,在癌细胞中有弱信号。在正常子宫组织中,没有观察到阳性信号。在卵巢癌样品中,一些癌细胞为弱阳性。在正常卵巢样品中,一些毛细血管内皮和大滤泡的上皮可能是弱阳性的。在皮肤癌样品中,癌性颗粒上皮(granular epithelium)为强阳性,而正常皮肤中没有观察到阳性信号。在胎肝中,在窦状隙内的单个核细胞混合群体中观察到信号。在肺中,zcytor19在II型肺泡上皮中似乎为阳性。偶尔支气管上皮也可以是弱阳性。间质组织中的巨噬细胞样单个核细胞也是阳性。心脏中,肌细胞是阴性,而一些循环单个核细胞是zcytor19阳性。在其中一个样品中,血管内皮可能是弱阳性。测试的其它组织,包括MFH(肌肉肉瘤)样品和卡波西肉瘤皮肤样品。这些组织中没有明确的阳性信号。
实施例30
基于RT-PCR分析刺激的细胞相对未刺激的细胞中人zcytor19的
表达
使用RT-PCR分析如下细胞类型以检测zcytor19的基因表达:Hela、293、Daudi、CD14+、U937和HL-60。
使用用于RT-PCR的商业第一链合成系统(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)从总RNA合成第一链cDNA。使用分别产生806bp和892bp产物的zcytor19×1(SEQ ID NO:23)和zcytor19×2(SEQ ID NO:28)及特异寡聚引物ZC40288(SEQ ID NO:58)和ZC40291(SEQ ID NO:59)、Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶和缓冲液(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)、GeneAmp dNTP(AppliedBiosystems,Foster City,CA)、RediLoadTM染料(Research Genetics,Inc.,Huntville,AL)和2μl来自各细胞类型的第一链cDNA(10%第一链反应物),设置随后的PCR反应。PCR循环条件如下:初始1个循环:95℃变性15分钟;35个循环:94℃变性45秒、63℃退火1分钟和72℃延伸15秒;随后最后1个循环:72℃延伸7分钟。在2%琼脂糖凝胶(EM Science,Gibbstown,NJ)上电泳分离反应物,并通过溴化乙锭染色进行显色。
在Hela±IFN-β(仅892bp带)、293+亲代Adv、Daudi±IFN-β、Daudi±IFN-α、活化的CD14+、活化的HL-60中观察到正确大小的条带。在静息CD14+、静息和活化的U937和静息HL-60中没有观察到条带。这些结果显示,当单核细胞或单核细胞系活化或分化时诱导zcytor19表达。
实施例31
RAW细胞中NFKB报道分子的刺激
使用小鼠单核细胞/巨噬细胞报道细胞系测试Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25通过NFκβ信号转导途径传递信号的能力。该细胞系是通过用含有驱动萤光素酶报道基因转录的NFκβ应答元件的KZ170逆转录病毒报道分子转导RAW264.7细胞制备的。
起初测试Zcyto20、zcyto21、zcyto22、zcyto24和zcyto25活性的报道试验是使用描述用于抗病毒分析的瞬时转染293的条件培养基进行的。收获RAW264.7/KZ170细胞,并按50,000个细胞/孔的密度接种在96孔平板中。37℃下在RPMI+10%FBS中孵育细胞过夜。第二天,从贴壁细胞中除去培养基,然后向细胞中加入未稀释的zcyto20-25条件培养基或zcyto20-25条件培养基的稀释物(稀释在RPMI+0.1%BSA中)。37℃孵育5小时后,裂解细胞,加入萤光素酶底物后在光度计上进行读数。通过将zcyto20-25条件培养基的相对光单位(RLU)与未转染细胞的条件培养基的相对光单位进行比较,分析结果。与未稀释的未转染细胞的条件培养基相比,未稀释的zcyto20-25条件培养基诱导的萤光素酶表达高4-9倍。这些结果表明,在小鼠单核细胞/巨噬细胞细胞系中zcyto20-25能够通过NFκβ信号转导途径传递信号。
作为进一步研究,在该报道试验中使用来自感染了表达zcyto20、zcyto21或zcyto22的杆状病毒的Sf9细胞的条件培养基。野生型杆状病毒用作阴性对照。杆状病毒构建体和条件培养基的制备如上述。
使用杆状病毒来源的条件培养基进行的RAW264.7 NFkb-受体试验的结果与使用瞬时转染293条件培养基时得到的结果相似。含有zcyto20-22的杆状病毒来源的条件培养基以剂量依赖方式诱导萤光素酶表达,而相应对照条件培养基无此现象。
实施例32
体内结果
将zcyto24的毒性和生物学活性与另一II类细胞因子、亲代腺病毒载体以及未注射的小鼠比较。按如下注射4组(每组8只)C57B16小鼠(雌性,9周龄):
组1:每只小鼠注射1×1011个Adzcyto24颗粒;
组2:按1×1011个颗粒注射II类细胞因子(Adzcyto);
组3:按1×1011个颗粒注射亲代腺病毒载体(Adzpar);和
组4:未处理的。
在-1天将温度发送器放置在小鼠身上,在第0天注射病毒。笼子方便食物摄取,每5天检测一次体重,第10天采血(最大0.25ml)用于试验,包括CBC和Abbot血液分析。在第20天处死所有小鼠。
在第10天采取Adzcyto24(组1)处理的小鼠的血液,测试血清以检测是否存在zcyto24生物活性。病毒试验证实对于Adzcyto24组的每只小鼠在1:500最大稀释下有显著抗病毒活性。这相应于大约160ng/ml纯化的zcyto24CEE。用于检测小鼠干扰素的抗病毒试验在Adzcyto24组中未检测到活性。使用具有IRSE的报道分子进行的生物分析也在Adzcyto24注射的小鼠的血清中检测到显著的zcyto24活性,而在其它组中则没有检测到。
温度探头显示,组2的平均体温到第10天降低了5℃以上,而Adzcyto24(组1)组的平均体温减低了2℃以上。对照组的体温在整个实验过程中表现出不到1℃的改变。
Adzcyto24(组1)小鼠在20天的实验中体重表现出轻微增加,与对照组(组3和4)相同。组2小鼠体重下降:到第10天组2的平均体重降低约8%。
对第10天和第20天采取的血液进行的Abbot血液分析仪分析揭示,组1和2中白细胞计数显著改变。图1显示了Adzcyto24处理的小鼠相对于其它组而言单核细胞计数明显增加。Adzcyto24注射的小鼠与亲代载体(Adzpar)注射的小鼠相比,单核细胞计数高2.77倍。到第20天,单核细胞计数稍微下降,但仍显著高于亲代载体注射的小鼠的单核细胞计数。图2显示,用编码II类细胞因子的腺病毒(Adzcyto)而非用编码zcyto24的腺病毒注射时,导致在第10天嗜中性粒细胞计数增加。
为了验证Abbot血液分析仪检测到的细胞类型的性质,使用谱系特异性Mab(单克隆抗体)对实验第20天采取的血液实施流式细胞术分析。图3显示了每只小鼠外周血中CD11b阳性细胞,即单核细胞的百分数。将每组的平均值作图,图4显示,用带zcyto24的腺病毒注射的组与亲代载体感染的组相比,单核细胞百分数显著增加(p=0.05)。这与之前使用Abbot血液分析仪观察到的改变是相符的。
用针对粒细胞(GR-1)的特异性MAb对同样血液样品进行的分析显示,Adzcyto24注射的小鼠中粒细胞(即,主要是嗜中性粒细胞)百分数没有显著增加。PBL还用B细胞(B220)特异的Mabs进行了染色,相对于其它组,Adzcyto24注射小鼠没有观察显著不同。
值得注意的是,使用Adzcyto24时,与Adzcyto注射相关的寒战和重量减轻并不明显。在第10天和20天通过Abbot血液分析仪检测到的单核细胞明显增加,得到用谱系特异的MAbs对第20天的血液进行的流式细胞分析的证实。注射了Adzcyto24的小鼠的PBL中单核细胞百分数的明显增加好象是腺病毒感染情况下zcyto24直接或间接介导的独特活性。注射了Adzcyto24的小鼠中显著水平表达的zcyto24可能通过从周围组织募集和动员单核细胞或通过刺激从骨髓或肝来源的祖先细胞产生单核细胞而促进抗病毒反应。该证据提示,单核细胞/巨噬细胞被zcyto24和zcyto21激活。
根据以上的描述应当理解,尽管为了举例说明的目的这里描述了本发明的具体实施方案,仍可以进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此,本发明只受所附权利要求书的限制。
本申请还公开了如下内容:
1.分离的多肽,其与选自如下组的多肽有至少80%的一致性:
(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和
(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
2.项目1的分离的多肽,其中所述多肽特异地结合如下受体:SEQID NOS:24、27或29的单体或同二聚体受体,或SEQ ID NOS:24、27或29联合SEQ ID NO:41的异二聚体受体。
3.分离的多肽,其与选自如下组的多肽有至少95%的一致性:
(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和
(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
4.项目3的分离的多肽,其中所述多肽特异地结合如下受体:SEQID NOS:24、27或29的单体或同二聚体受体,或SEQ ID NOS:24、27或29联合SEQ ID NO:41的异二聚体受体。
5.分离的多肽,包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列。
6.分离的多肽,包含SEQ ID NO:7列第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列。
7.分离的多肽,包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:9列第1位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序。
8.分离的多肽,包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:11第1位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列。
9.分离的多肽,其是SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列中的至少14个连续氨基酸,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
10.分离的多肽,其是SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列中的至少14个连续氨基酸,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
11.分离的多肽,其是SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:9第1位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列中的至少14个连续氨基酸,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
12.分离的多肽,其是SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:11第1位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列中的至少14个连续氨基酸,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
13.药物组合物,其在可药用载体中包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列。
14.药物组合物,其在可药用载体中包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列。
15.包含至少两个多肽的融合蛋白,其中至少一个多肽包含选自如下组的多肽:
(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和
(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
16.编码多肽的分离的多核苷酸,其中该核酸分子选自:
(a)包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的多核苷酸;
(b)在严紧洗涤条件后仍与由SEQ ID NO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互补分子组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。
17.编码多肽的分离的多核苷酸,其中该核酸分子选自:
(a)包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列的多核苷酸;
(b)在严紧洗涤条件后仍与由SEQ ID NO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID NO:6第64至618位核苷酸的核苷酸序列的互补分子组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。
18.编码选自如下组的多肽的分离的多核苷酸:
(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和
(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
19.项目18的分离的多核苷酸,其中所述核酸分子编码的氨基酸序列和相应的氨基酸序列之间的任何差异均是由于保守氨基酸替代引起的。
20.分离的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:1第64位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:1第1位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列。
21.分离的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:6第64位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:6第1位核苷酸至第618位核苷酸所示的核苷酸序列。
22.分离的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:8第67位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:1第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列。
23.分离的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:10第67位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:10第1位核苷酸至第606位核苷酸所示的核苷酸序列。
24.表达载体,其包含项目20、项目21、项目22或项目23的分离的核酸分子、转录启动子和转录终止子,其中所述启动子与所述核酸分子可操作地连接,并且所述核酸分子与所述转录终止子可操作地连接。
25.重组宿主细胞,其包含项目24的表达载体,其中所述宿主细胞选自:细菌、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。
26.制备多肽的方法,该方法包括步骤:培养包含项目24的表达载体并产生所述多肽的重组宿主细胞,和从所培养的宿主细胞中分离该多肽。
27.与项目9、项目10、项目11或项目12的多肽特异结合的抗体或抗体片断。
28.检测生物样品中基因表达是否存在的方法,包括步骤:
(a)在杂交条件下使核酸探针和(1)分离自该生物样品的测试RNA或(2)从该分离的RNA分子合成的核酸分子接触,其中该探针由包含SEQ ID NO:1核苷酸序列、SEQ ID NO:1核苷酸序列的互补分子的一部分;SEQ ID NO:6核苷酸序列、SEQ ID NO:6核苷酸序列的互补分子的一部分的核苷酸序列组成,和
(b)检测核酸探针和测试RNA分子或合成的核酸分子形成的杂交体,
其中该杂交体的存在指示了生物样品中存在该RNA,
或
(a’)使该生物样品与项目27的抗体或抗体片断接触,其中所述接触在允许该抗体或抗体片断与该生物样品结合的条件下进行,和
(b)检测所有结合的抗体或结合的抗体片断。
29.扩增单核细胞或单核细胞的祖先细胞的方法,包括用包含项目9、项目10、项目11和项目12的多肽的组合物培养骨髓或外周血细胞,其中所述多肽在组合物中的量足以造成所述骨髓或外周血细胞与在未给予多肽的情况下培养的骨髓或外周血细胞相比其中的单核细胞或单核细胞的祖先细胞数量增加。
30.在暴露于抗原或病原体的哺乳动物中刺激免疫应答的方法,包括:
(1)确定抗原或病原体特异的抗体的水平;
(2)给予在可药用载体中含有项目9、项目10、项目11或项目12的多肽的组合物;
(3)确定给药后抗原或病原体特异的抗体的水平;
(4)将步骤(1)中的抗体水平和步骤(3)中的抗体水平进行比较,其中抗体水平增加表明刺激了免疫应答。
序列表
<110>ZymoGenetics,InC.
<120>细胞因子蛋白质ZCYT020
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<151>2001-04-20
<160>59
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人
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<213>人工序列
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<211>23
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<213>人工序列
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<223>寡核苷酸引物ZC39295
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<211>22
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>22
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<213>人工序列
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<223>寡核苷酸引物ZC39732
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>56
<210>57
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>寡核苷酸引物ZC40288
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<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物ZC40291
<400>59
Claims (10)
1.分离的多肽,其与选自如下组的多肽有至少80%的一致性:
(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和
(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
2.权利要求1的分离的多肽,其中所述多肽特异地结合如下受体:SEQ ID NOS:24、27或29的单体或同二聚体受体,或SEQ ID NOS:24、27或29联合SEQ ID NO:41的异二聚体受体。
3.分离的多肽,其与选自如下组的多肽有至少95%的一致性:
(a)包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(b)包含SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;
(c)包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽;和
(d)包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽。
4.权利要求3的分离的多肽,其中所述多肽特异地结合如下受体:SEQ ID NOS:24、27或29的单体或同二聚体受体,或SEQ ID NOS:24、27或29联合SEQ ID NO:41的异二聚体受体。
5.分离的多肽,包含SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列。
6.分离的多肽,包含SEQ ID NO:7列第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列。
7.分离的多肽,包含SEQ ID NO:9第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:9列第1位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序。
8.分离的多肽,包含SEQ ID NO:11第29位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:11第1位氨基酸残基到第202位氨基酸残基所示氨基酸序列。
9.分离的多肽,其是SEQ ID NO:2第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:2第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列中的至少14个连续氨基酸,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
10.分离的多肽,其是SEQ ID NO:7第22位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列或SEQ ID NO:7第1位氨基酸残基到第205位氨基酸残基所示氨基酸序列中的至少14个连续氨基酸,其中所述多肽刺激哺乳动物的抗原性应答。
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