CN116568317A - 用于癌症治疗的重组多肽和组合 - Google Patents

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Abstract

本公开提供通过给予需要其的受试者重组多肽、免疫细胞生长因子(例如FLT3L)、TNFa抑制剂(例如TNFα受体)、IL‑10抑制剂(例如干扰素γ)和/或免疫治疗剂(例如抗PD‑1抗体)来在受试者中预防癌症、延缓癌症的进展、治疗或减轻癌症的症状或以其他方式改善癌症的方法。

Description

用于癌症治疗的重组多肽和组合
序列表
本申请含有已经由EFS-Web以ASCII格式提交且特此通过参考以其全部结合的序列表。所述ASCII拷贝在2020年6月18日创建，名为“IMHC-003_F01WO_SeqListing_ST25.txt”，并且大小为41KB。
发明背景
免疫原性细胞死亡为细胞死亡或凋亡的一种形式。与主要为非免疫原性的传统凋亡不同，癌细胞中的免疫原性细胞死亡可通过活化树突细胞来诱导有效的抗肿瘤免疫应答。凋亡前状态被定义为胱天蛋白酶3/7活化(细胞凋亡的表现)之前的状态。免疫原性细胞死亡的特征为在濒死细胞表面上的凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)的表达。存在3种在免疫原性细胞死亡期间暴露于细胞表面的重要凋亡前DAMP：钙网蛋白(CRT)、HSP70和HSP90。这3种凋亡前DAMP信号在通过CRT的树突细胞募集和吞噬作用以及通过HSP70和HSP90的树突细胞成熟/活化中起重要作用，产生有效的抗肿瘤免疫应答。化学疗法和放射疗法的选定形式可诱导附带的免疫原性细胞死亡。尽管这些疗法可诱导3种凋亡前DAMP信号中的一种或两种，但它们并不诱导所有3种凋亡前DAMP信号的表达。此外，化学疗法和放射疗法为免疫抑制疗法，其减少淋巴细胞的数量并且还引起对周围非肿瘤细胞的附带损伤，分别导致不良的抗肿瘤免疫应答还有不良事件。
需要通过诱导所有3种凋亡前DAMP信号的表达而以提高的效率和效力诱导免疫原性细胞死亡，同时最小化不利影响的组合物和方法。需要通过诱导树突细胞介导的长期适应性免疫应答来进行个性化和通用癌症免疫疗法的组合物和方法。需要诱导具有新抗原广度的T细胞多克隆多样性以防止癌症发生而与癌症类型或肿瘤表型无关的组合物和方法。本公开解决了这些需求。
肿瘤浸润性(肿瘤内)CD11c+髓样树突细胞(mDC)、人类CD141+XCR1+DC或鼠CD103+XCR1+DC(Roberts等人，Cancer Cell,324–336,2016)在肿瘤微环境中为罕见的(Broz等人，Cancer Cell,638-652,2014)。这些XCR1+DC负责捕获肿瘤抗原，经由CCR7上调迁移至淋巴结，并将抗原交叉呈递至淋巴结中的T细胞以活化/扩增T细胞。鼠CD103+XCR1+DC高度表达CD40和TLR4两者。在T细胞免疫疗法中，HMGB1一般被用于在鼠模型中经由TLR4来活化/成熟CD103+XCR1+DC(Tesniere等人，Oncogene,482-491,2010)。然而，人类CD141+XCR1+DC高度表达CD40和TLR3，而无TLR4表达(Jongbloed等人，J.Exp.Med.,1247-1260,2010)。在“人类”T细胞免疫疗法中，HMGB1未能成熟、活化和扩增CD141+XCR1+DC。此外，为诱导DC的IL12以进行有效的癌症免疫疗法，CD40比Toll样受体更重要(TLR)(Chang等人，Cancer Research,10047-10057,2007；Pinzon-Charry等人，Br.J.Cancer,1251-1259,2007)。因此，存在对活化、成熟和扩增树突细胞以克服当前树突细胞活化和扩增的局限性的备选方法的需要。本发明解决了本领域中这种未满足的需求。
幼稚CD8+T细胞识别特定抗原的前体频率(概率)为每百万细胞约1-10个(Lammermann等人，Immunological Reviews,26-43,2008)。人类中的总幼稚CD8+T细胞为约4x1010个细胞(Boon等人，Annu.Rev.Immunol.,175-208,2006)。因此，假设人类幼稚CD8+T细胞识别人类肿瘤特异性抗原的前体频率为每百万细胞约～5个，那么识别肿瘤特异性抗原的人类幼稚CD8+T细胞数量为约2x105个细胞(4x1010 x5/106)。一个CD8+T细胞具有杀死2-3个靶肿瘤细胞的能力(Wiedemann等人，PNAS,10985-10990,2006；McGavern等人，NatureImmunol,918-925,2002)。
假设细胞直径为10μm，上皮肿瘤大小为约1x109个细胞/1cm3(Del Monte等人，CellCycle,505-506,2009)。平均细胞直径为约5-10μm(Del Monte等人，Cell Cycle,505-506,2009)。然而，肿瘤细胞直径可达到约20μm(Del Monte等人，Cell Cycle,505-506,2009,Backman等人，Nature,35-36,2000)。因此，假设细胞直径为20μm，上皮肿瘤大小可为约1.25x108个细胞/1cm3(Del Monte等人，Cell Cycle,505-506,2009)。由于一个CD8+T细胞具有仅杀死2-3个靶肿瘤细胞的能力(Wiedemann等人，PNAS,10985-10990,2006；McGavern等人，Nature Immunol,918-925,2002)，并且存在低频率的可识别特定肿瘤抗原的CD8+T，因此存在对于增加CD8+T细胞的数量和它们识别特定肿瘤抗原的频率两者以有效地靶向和杀死肿瘤的需要。本发明解决了本领域中这种未满足的需求。
T细胞启动导致CD8+T细胞在启动之后扩增为约10000倍(或约50000x：LCMV/LM感染)(Blattman等人，J.Exp.Med.,657-664,2002；Haring等人，Immunity,19-29,2006；Butler等人，Cellular Microbiology,925-933,2011；Arens等人，Immunol.Rev.,190-205,2010)。然而，在T细胞“启动”之后，人类一般需要90天的间隔以最佳地“加强”记忆性T细胞进一步扩增。(Sallusto,Immunity,451-463,2010,Epstein Science,475-80,2011,Walsh,J.Infect.Dis.,541-550,2016)。对于寿命有限和/或肿瘤大小较大的癌症患者，存在对有效地启动和加强抗原特异性T细胞的数量，从而改善免疫应答和癌症治疗的备选方法的需要。本发明提供了解决本领域中这种未满足的需求的组合物和方法。
发明概述
本公开提供包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸，以用于治疗癌症的方法，其中该方法包括给予：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和iv)包含重组多肽或核酸的第四组合物。
本公开提供用于治疗癌症的方法的免疫细胞生长因子，其中该方法包括给予：i)包含免疫细胞生长因子和任选地至少一种另外的免疫细胞生长因子的第一组合物；ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。
本公开提供用于治疗癌症的方法的IL-10抑制剂，其中该方法包括给予：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；ii)包含至少一种IL-10抑制剂和任选地至少一种另外的IL-10抑制剂的第二组合物；iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。
本公开提供用于治疗癌症的方法的肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂，其中该方法包括给予：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；iii)包含TNFa抑制剂和任选地至少一种另外的TNFa抑制剂的第三组合物；和iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。
本公开提供用于治疗癌症的方法的免疫治疗剂，其中该方法包括给予：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物；和v)包含免疫治疗剂的第五组合物。
在一些方面，用于治疗癌症的方法的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂或TNFa抑制剂进一步包括给予包含免疫治疗剂的第五组合物。
在一些方面，第一组合物在第二组合物或第三组合物之前至少约24小时进行给予。
在一些方面，给予第一组合物：(a)每天一次，持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天；或(b)每天一次，持续约7天-约12天；或(c)每天一次，持续约7天。
在一些方面，(a)第二组合物和第三组合物同时或序贯给予；或(b)第二组合物在第三组合物之前给予；或(c)第二组合物在第三组合物之后给予。
在一些方面，第四组合物作为多次输注给予，其中i)在第一次输注之后至少1天给予第二次输注；ii)在第一次输注之后至少4天给予第三次输注；iii)在第一次输注之后至少5天给予第四次输注；iv)在第一次输注之后至少8天给予第五次输注；和/或v)在第一次输注之后至少9天给予第六次输注。
在一些方面，第三组合物以及第四组合物的第一次输注同时或序贯给予。
在一些方面，给予第四组合物的第一次输注：(a)在给予第二组合物之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时；或(b)在给予第二组合物之后约3小时或约4小时。
在一些方面，用于治疗癌症的方法的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂进一步包括给予包含以下的治疗周期：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第六组合物；ii)受试者中包含至少一种IL-10抑制剂的第七组合物；iii)包含至少一种TNFa抑制剂的第八组合物；和iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第九组合物。
在一些方面，给予治疗周期：(a)至少1次、至少2次、至少3次、至少4次或至少5次；任选地其中给予治疗周期不多于5次；和/或(b)在第四组合物的第六次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天；任选地其中第一治疗周期在第四组合物的第六次输注之后约1天时给予。
在一些方面，给予第六组合物：(a)在第七组合物或第八组合物之前至少约24小时；和/或(b)每天一次，持续至少5、至少6、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天；或每天一次，持续总共约5天-约14天或约7天-约12天。
在一些方面，(a)第七组合物和第八组合物同时或序贯给予；或(b)第七组合物在第八组合物之前给予；或(c)第七组合物在第八组合物之后给予。
在一些方面，第九组合物作为多次输注给予，其中i)在第一次输注之后至少1天给予第二次输注；ii)在第一次输注之后至少4天给予第三次输注；和iii)在第一次输注之后至少5天给予第四次输注。
在一些方面，第八组合物以及第九组合物的第一次输注同时给予。
在一些方面，给予第九组合物的第一次输注：(a)在给予第七组合物之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时；或(b)在给予第七组合物之后约3小时或约4小时；或(c)在给予第七组合物之后约4小时。
在一些方面，第五组合物作为多次输注给予，并且其中第五组合物给予至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次或至少14次。
在一些方面，第五组合物的第一次输注在第四组合物的第六次输注之后和第九组合物的第一次输注之前给予。
在一些方面，给予第五组合物：(a)在第四组合物的第一次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天；或(b)在第四组合物的第一次输注之后约10天-约14天；或(c)在第四组合物的第一次输注之后约12天。
在一些方面，(a)第一组合物、第二组合物、第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物或第九组合物静脉内或皮下给予；和/或(b)第一组合物、第二组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物和第九组合物静脉内给予；和/或(c)第三组合物和第八组合物皮下给予。
在一些方面，至少一种免疫细胞生长因子为FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些方面，至少一种免疫细胞生长因子为FLT3L；任选地其中FLT3L呈以下的量：(a)约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、10μg/kg、约11μg/kg、约12μg/kg、约13μg/kg、约14μg/kg、约15μg/kg、约16μg/kg、约17μg/kg、约18μg/kg、约19μg/kg或约20μg/kg；或(b)约4μg/kg-约13μg/kg；或(c)约7μg/kg。
在一些方面，至少一种IL-10抑制剂在受试者体内将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM，其中重编程包括表面标志物表达的变化，其中MARCO和CD163为在M2 TAM上表达的表面标志物，和其中CD80为在M1 TAM上表达的表面标志物。
在一些方面，至少一种IL-10抑制剂为干扰素γ(IFNg)、IFNg拟似物、IFN激动剂或其组合；任选地其中该至少一种IL-10抑制剂为IFNg和其中IFNγ以约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg；或者约50μg-约100μg；或者约70μg的剂量进行给予。
在一些方面，TNFa抑制剂为TNFa受体(TNFaR)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)或依那西普(etanercept)；任选地其中给予TNFaR：(a)以约1mg、约2mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg或约10mg的剂量；或(b)以约4mg-约6mg的剂量；或(c)以约5mg的剂量。
在一些方面，(a)第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和/或第六次输注以及第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和/或第四次输注包含约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg或约35mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽；或(b)第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和第六次输注以及第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和第四次输注包含约10mg/kg-约30mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽；或(c)第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和第六次输注以及第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和第四次输注包含约20mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。
在一些方面，免疫治疗剂为检查点抑制剂，任选地其中检查点抑制剂为抗PD1抗体；任选地其中抗PD1抗体为纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)或西米普利单抗(cemiplimab)。在一些方面，抗PD1抗体以下面的剂量进行给予：(a)约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg；或(b)约0.1mg/kg-约7mg/kg；或(c)约3mg/kg。
在一些方面，癌症：(a)为实体瘤癌症；任选地其中实体瘤具有至少约0.2cm、至少约0.5cm、至少约1cm、至少约2cm、至少约3cm、至少约4cm、至少约5cm、至少约6cm、至少约7cm、至少约8cm、至少约9cm或至少约10cm的直径；和/或(b)为癌症早期表现的复发或为癌症早期表现的转移。
本公开提供在需要其的受试者中治疗癌症的方法，包括给予受试者：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；ii)在受试者包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和iv)包含含有与SEQID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ IDNO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。在一些方面，方法进一步包括给予包含免疫治疗剂的第五组合物。
在一些方面，第一组合物在第二组合物或第三组合物之前至少约24小时进行给予。
在一些方面，第一组合物给予每天一次，持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天。在一些方面，第一组合物给予每天一次，持续约7天-约12天。在优选的方面，第一组合物给予每天一次，持续约7天。
在一些方面，第二组合物和第三组合物同时或序贯给予。在一些方面，第二组合物在第三组合物之前给予。在一些方面，第二组合物在第三组合物之后给予。
在一些方面，第四组合物作为多次输注给予，其中i)在第一次输注之后至少1天给予第二次输注；ii)在第一次输注之后至少4天给予第三次输注；iii)在第一次输注之后至少5天给予第四次输注；iv)在第一次输注之后至少8天给予第五次输注；和/或v)在第一次输注之后至少9天给予第六次输注。
在一些方面，第三组合物以及第四组合物的第一次输注同时或序贯给予。
在一些方面，第四组合物的第一次输注在给予第二组合物之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时进行给予。在一些方面，第四组合物的第一次输注在给予第二组合物之后约3小时或约4小时进行给予。在优选的方面，第四组合物的第一次输注在给予第二组合物之后约4小时进行给予。
在一些方面，本公开的方法进一步包括给予包含以下的治疗周期：i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第六组合物；ii)受试者中包含至少一种IL-10抑制剂的第七组合物；iii)包含至少一种TNFa抑制剂的第八组合物；和iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第九组合物。
在一些方面，治疗周期给予至少1次、至少2次、至少3次、至少4次或至少5次。在优选的方面，治疗周期给予不多于5次。
在一些方面，第一治疗周期在第四组合物的第六次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天进行给予。在优选的方面，第一治疗周期在第四组合物的第六次输注之后约1天进行给予。
在一些方面，第六组合物在第七组合物或第八组合物之前至少约24小时进行给予。
在一些方面，第六组合物给予每天一次，持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天。在一些方面，第六组合物给予每天一次，持续总共约5天-约14天。在优选的方面，第六组合物给予每天一次，持续总共约7天-约12天。
在一些方面，第七组合物和第八组合物同时或序贯给予。在一些方面，第七组合物在第八组合物之前给予。在一些方面，第七组合物在第八组合物之后给予。
在一些方面，第九组合物作为多次输注给予，其中i)在第一次输注之后至少1天给予第二次输注；ii)在第一次输注之后至少4天给予第三次输注；和iii)在第一次输注之后至少5天给予第四次输注。
在一些方面，第八组合物以及第九组合物的第一次输注同时给予。
在一些方面，第九组合物的第一次输注在给予第七组合物之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时进行给予。
在一些方面，第九组合物的第一次输注在给予第七组合物之后约3小时或约4小时进行给予。在一些方面，第九组合物的第一次输注在给予第七组合物之后约4小时进行给予。
在一些方面，第五组合物作为多次输注给予，并且其中第五组合物给予至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次或至少14次。
在一些方面，第五组合物的第一次输注在第四组合物的第六次输注之后和第九组合物的第一次输注之前给予。
在一些方面，第五组合物在第四组合物的第一次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天进行给予。在一些方面，第五组合物在第四组合物的第一次输注之后约10天-约14天进行给予。
在优选的方面，第五组合物在第四组合物的第一次输注之后约12天进行给予。
在一些方面，第一组合物、第二组合物、第三组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物、第八组合物或第九组合物静脉内或皮下给予。在优选的方面，第一组合物、第二组合物、第四组合物、第五组合物、第六组合物、第七组合物和第九组合物静脉内给予。在优选的方面，第三组合物和第八组合物皮下给予。
在一些方面，至少一种免疫细胞生长因子为FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在优选的方面，至少一种免疫细胞生长因子为FLT3L。
在一些方面，FLT3L呈约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、10μg/kg、约11μg/kg、约12μg/kg、约13μg/kg、约14μg/kg、约15μg/kg、约16μg/kg、约17μg/kg、约18μg/kg、约19μg/kg、20μg/kg的量存在。在一些方面，FLT3L呈约4μg/kg-约13μg/kg的量。在优选的方面，FLT3L呈约7μg/kg的量。
在一些方面，至少一种IL-10抑制剂在受试者体内将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM，其中重编程包含表面标志物表达的变化，其中MARCO和CD163为在M2 TAM上表达的表面标志物，和其中CD80为在M1 TAM上表达的表面标志物。
在一些方面，至少一种IL-10抑制剂为干扰素γ(IFNg)、IFNg拟似物、IFNg激动剂或其组合。在优选的方面，至少一种IL-10抑制剂为IFNg。
在一些方面，IFNg以约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg的剂量进行给予。在一些方面，IFNγ以约50μg-约100μg的剂量进行给予。在优选的方面，IFNγ以约70μg的剂量进行给予。
在一些方面，TNFa抑制剂为TNFa受体(TNFaR)、英夫利昔单抗、阿达木单抗、培塞利珠单抗或戈利木单抗。在优选的方面，TNFa抑制剂为TNFaR。在优选的方面，TNFaR为依那西普。
在一些方面，TNFaR以约1mg、约2mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg或约10mg的剂量进行给予。在一些方面，TNFaR以约4mg-约6mg的剂量进行给予。在优选的方面，TNFaR以约5mg的剂量进行给予。
在一些方面，第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和/或第六次输注以及第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和/或第四次输注包含约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg或约35mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。在一些方面，第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和第六次输注以及第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和第四次输注包含约10mg/kg-约30mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。在优选的方面，第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和第六次输注以及第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和第四次输注包含约20mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。
在一些方面，免疫治疗剂为检查点抑制剂。在优选的方面，免疫治疗剂为抗PD1抗体。在一些方面，抗PD1抗体为纳武单抗、帕博利珠单抗或西米普利单抗。在一些方面，抗PD1抗体为纳武单抗。
在一些方面，抗PD1抗体以约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的剂量进行给予。在一些方面，抗PD1抗体以约0.1mg/kg-约7mg/kg的剂量进行给予。在优选的方面，抗PD1抗体以约3mg/kg的剂量进行给予。
在一些方面，癌症为实体瘤癌症。在一些方面，实体瘤具有至少约0.2cm、至少约0.5cm、至少约1cm、至少约2cm、至少约3cm、至少约4cm、至少约5cm、至少约6cm、至少约7cm、至少约8cm、至少约9cm或至少约10cm的直径。
在一些方面，癌症为癌症早期表现的复发或为癌症早期表现的转移。
任何以上方面可与任何其他方面组合。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文使用的，词语的单数形式也包括该词语的复数形式，除非上下文另外清楚地规定；作为实例，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”应被理解为单数或复数，并且术语“或”应被理解为包括性的。例如，“一个/种元素(an element)”意指一个/种或多个/种元素。
在整个说明书中，词语“包含(comprising)”或诸如“包含(comprises)”等变型应被理解为意指包括所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。在整个说明书中，词语“由…组成(consistingof)”或诸如“由…组成(consists of)”等变型应被理解为意指包括所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，并且排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。在整个说明书中，词语“基本上由…组成(consisting essentially of)”或诸如“基本上由…组成(consists essentially of)”等变型应被理解为意指包括所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，以及并不实质性影响要求保护的发明的基本和新型特征的任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。
约可被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外从上下文弄清楚，否则本文提供的所有数值均通过术语“约”进行修饰。
尽管与本文所述的方法和材料类似或等效的那些可被用于本公开的实践或测试，但以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过参考以其全部结合。本文引用的参考文献不被承认为要求保护的公开的现有技术。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并且不预期为限制性的。本公开的其他特征和优点从以下详述和权利要求将为显而易见的。
附图简述
图1为免疫原性细胞死亡的一些特征的示意性描绘。被标记为细胞死亡的肿瘤细胞具有诸如钙网蛋白(CRT)、HSP70和HSP90等凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)信号的细胞表面表达。树突细胞在识别DAMP信号后活化。成熟的树突细胞迁移至淋巴结，并可进而启动CD4+和CD8+T细胞，其对于介导免疫原性细胞死亡为重要的。
图2显示描绘如通过质谱法测定的约20kDa的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)的分子量的图表。
图3A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人类肺癌细胞系(HTB-174,ATCC)后表达CRT(钙网蛋白)的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下温育1小时。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb(Abcam)确定表达CRT的H441细胞。图3B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图4A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人类肺癌细胞系(HTB-177,ATCC)后表达CRT的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35和50μg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下温育30分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb(Abcam)确定表达CRT的H460细胞。图4B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图5A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人类结肠癌细胞系(CCL-225,ATCC)后表达CRT的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下温育55分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb(Abcam)确定表达CRT的HCT15细胞。图5B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图6A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人类乳腺癌细胞系(HTB-22,ATCC)后表达CRT的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下温育1小时10分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用CRT mAb(Abcam)确定表达CRT的MCF7细胞。图6B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图7A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人类肺癌细胞系(HTB-174,ATCC)后表达HSP70(70kDa热休克蛋白)的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下温育1小时50分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb(Enzo Life Sciences)确定表达Hsp70的H441细胞。图7B显示用于被量化的流式细胞术概况。
图8A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人类肺癌细胞系(HTB-177,ATCC)后表达HSP70的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35、50μg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下温育1小时15分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb(Enzo LifeSciences)确定表达Hsp70的H460细胞。图8B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图9A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人类结肠癌细胞系(CCL-225,ATCC)后表达HSP70的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下温育1小时50分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb(Enzo LifeSciences)确定表达Hsp70的HCT15细胞。图9B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图10A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人类乳腺癌细胞系(HTB-22,ATCC)后表达HSP70的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下温育1小时40分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp70 mAb(Enzo LifeSciences)确定表达Hsp70的MCF7细胞。图10B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图11A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人类肺癌细胞系(HTB-174,ATCC)后表达HSP90(90kDa热休克蛋白)的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下温育1小时40分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb(Enzo Life Sciences)确定表达Hsp90的H441细胞。图11B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图12A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人类肺癌细胞系(HTB-177,ATCC)后表达HSP90的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35、50μg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下温育1小时5分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb(Enzo LifeSciences)确定表达Hsp90的H460细胞。图12B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图13A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人类结肠癌细胞系(CCL-225,ATCC)后表达HSP90的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下温育1小时30分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb(Enzo LifeSciences)确定表达Hsp90的HCT15细胞。图13B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图14A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人类乳腺癌细胞系(HTB-22,ATCC)后表达HSP90的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下温育1小时45分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用Hsp90 mAb(Enzo LifeSciences)确定表达Hsp90的MCF7细胞。图14B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图15A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H441人类肺癌细胞系(HTB-174,ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50和75μg/ml的最终浓度，并将H441细胞在37℃下温育2小时45分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7(Invitrogen)测定来确定H441细胞。图15B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图16A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理H460人类肺癌细胞系(HTB-177,ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至0.1、1、10、25、35和50μg/ml的最终浓度，并将H460细胞在37℃下温育2小时45分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7(Invitrogen)测定来确定H460细胞。图16B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图17A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理HCT15人类结肠癌细胞系(CCL-225,ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将HCT15细胞在37℃下温育2小时30分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7(Invitrogen)测定来确定HCT15细胞。图17B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图18A显示量化在用各种浓度的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理MCF7人类乳腺癌细胞系(HTB-22,ATCC)后表达胱天蛋白酶3/7的细胞的百分比的条形图。将储备CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)稀释至35、50、75μg/ml的最终浓度，并将MCF7细胞在37℃下温育2小时45分钟。通过FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞术使用胱天蛋白酶3/7(Invitrogen)测定来确定MCF7细胞。图18B显示被用于量化的流式细胞术概况。
图19显示IL-6、IL-10和干扰素γ(IFNg)对STAT3和STAT1的影响的示意图。人类STAT1具有～24小时的半衰期。鼠STAT1具有～7.8小时的半衰期。STAT3和STAT1的平衡分别影响肿瘤发生和肿瘤抑制。
图20显示IL-10和IL-6途径的示意图。IL-10维持STAT3活化。IL-6通过自我抑制SOCS3瞬时活化STAT3。
图21显示测量的血清IL-10的％相对于IFNγ剂量的条形图。将不同剂量的IFNg静脉内注射给予B16F10荷瘤小鼠(对每个IFNg剂量n＝2)。IFNg注射之后3.5小时采血，并通过Luminex测定来确定血清IL-10。
图22显示CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)的鼠剂量方案的示意图。C57BL/6分别用MC38、E0771和B16F10细胞接种1x106个细胞进行激发。水平阴影箭头指示腹膜内或静脉内注射重组多肽的时机。斜向阴影箭头指示腹膜内或静脉内注射IFNg注射剂的时机。在第一个治疗方案之后具有完全缓解的小鼠在第一个治疗方案之前使用接种相同细胞类型的2x105个细胞进行再激发。
图23A-23D显示描绘在用重组肽和IFNg治疗之后MC38和E0771肿瘤小鼠中肿瘤体积的一系列线状图。图23A显示在MC38肿瘤激发(第0天1x106个细胞/小鼠)之后于重组多肽和IFNg治疗方案(第7天开始，n＝10只小鼠)或媒介物(n＝5只小鼠)之后的MC38肿瘤体积(mm3)和完全缓解(CR)率。图23B显示在MC38肿瘤再激发(第0天2x105个细胞/小鼠：CR后6个月)之后的MC38肿瘤体积和无复发存活(RFS)率(n＝12只来自两个肿瘤激发实验的CR小鼠)或媒介物(n＝5只小鼠)。图23C显示在E0771肿瘤激发(第0天1x106个细胞/小鼠)之后于重组多肽CRYA_1B/IFNg治疗(第10天开始，n＝10只小鼠)或媒介物(n＝5只小鼠)之后的E0771肿瘤体积和CR率。图23D显示在E0771肿瘤再激发(第0天2x105个细胞/小鼠：CR后6个月)之后的E0771肿瘤体积和RFS率(n＝10只来自两个肿瘤激发实验的CR小鼠)或媒介物(n＝5只小鼠)。在图23A和23C中显示4个独立实验。在图23C和23D中显示两个独立实验。
图24A-24B B6小鼠中的B1610肿瘤激发和再激发模型。图24A在B16F10肿瘤激发(第0天1x106个细胞/小鼠)之后于重组多肽CRYA_1B/IFNg治疗(第7天开始，n＝10只小鼠)或媒介物(n＝5只小鼠)之后的B16F10肿瘤体积和完全缓解(CR)率。图24B在B16F1010肿瘤再激发(第0天2×105个细胞/小鼠：CR后6个月)之后的B16F10肿瘤体积和无复发存活(RFS)率(n＝8只来自两个肿瘤激发实验的CR小鼠)或媒介物(n＝5只小鼠)。在图24A中显示4个独立实验。在图24B中显示两个独立实验。
图25PBMC活力。PBMC在不存在或存在各种浓度的重组多肽CRYA_1B的情况下温育3小时45分钟。之后，将细胞用CellEventTM胱天蛋白酶3/7染色并通过流式细胞术分析。PBMC活力与凋亡相反。结果为来自3个独立实验的一个代表性数据。
图26为所提出的钙网蛋白(CRT)介导的肿瘤内XCR1+树突细胞(CRT)募集途径的示意图。(1)FLT3L在血液中扩增XCR1+DC。(2)IFNg减少IL-10来重编程肿瘤微环境，以获得更好的DC功能。(3)IFNg同时将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程以变为M1 TAM。(4)CRT诱导剂经由CD91从肿瘤中诱导CRT以活化M1 TAM。(5)活化的M1 TAM产生IL-12、IL-15、IFNα(IFNa)和IFNβ(IFNb)。(6)IL-12/IL-15/IFNa/IFNb活化的NK产生大量XCL1。(7)XCL1充当化学引诱剂，以从血管向肿瘤部位募集XCR1+DC。(8)HSP70/90肽复合物经由CD40成熟/活化肿瘤内XCR1+DC，以与抗原一起迁移至淋巴结，并将抗原交叉呈递至淋巴结中的T细胞用于T细胞的启动/活化/扩增。
图27为描绘癌症患者中FLT3L和IL10/IgG比率的相关性的图表。20名晚期肺癌和胰腺癌患者，治疗前血清FLT3L比率为0.6-0.8x(相对于健康者)，每天用FLT3L静脉内注射连续12天以试验剂量(μg/kg)进行治疗以满足以下标准。来自癌症患者的PBMC中的HLA-DR+Lin-DC扩增率标准被设定为FLT3L治疗之后为至少12倍(与健康人类相似)，以确定必要的FLT3L剂量。回归线为y＝3.4x+0.78。
图28为显示用IFNγ处理单核细胞可将M2巨噬细胞重编程成M1巨噬细胞的条形图。健康人类CD14+单核细胞在存在M-CSF(1μg/mL)、IL-4(1μg/mL)和IL-10(1μg/mL)的情况下进行培养，以分化成M2样巨噬细胞。分化的M2巨噬细胞用IFNg(1ng/mL)脉冲1小时。4小时后，通过FACS分析细胞以确定M2巨噬细胞和M1巨噬细胞的比例。M2巨噬细胞高度表达MARCO和CD163，而M1巨噬细胞高度表达CD80。左侧的3个条形代表用IFNγ处理之前的M2巨噬细胞群。右侧的3个条形代表IFNγ处理后向M1巨噬细胞群的重编程。只有活化的M1巨噬细胞，而不是M2巨噬细胞，可产生促炎细胞因子，比如IL-12和IL-15。
图29为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞。对照(n＝5)、FLT3L/IFNg/CRYA_1B(n＝10)、FLT3L/CRYA_1B(n＝10)、IFNg/CRYA_1B(n＝10)和CRYA_1B(n＝10)。肿瘤在4天内达到约40-50mm3(第4天)。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L在示意图中显示的日期以4μg(560μg/m2)连续6天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在第一次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于CRYA_1B疗法，将作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和13.5mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。
图30为以使用FLT3L、IFNg和CRYA_1B(CRT诱导剂)的组合疗法治疗的小鼠的存活曲线。对每组的C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞：对照(n＝5)、FLT3L/IFNg/CRYA_1B(n＝10)、FLT3L/CRYA_1B(n＝10)、IFNg/CRYA_1B(n＝10)和CRYA_1B(n＝10)。小鼠根据图32中所示的剂量方案治疗。用FLT3L、IFNg和CRYA_1B治疗的所有小鼠均存活。
图31为显示FLT3L、IFNγ、TNFaR和重组多肽CRYA_1B与单一抗PD1(纳武单抗)阻断用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。对8组中的每组的雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞：IgG2a组：FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第18天的IgG2a(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第22天的IgG2a(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第30天的IgG2a(n＝5)和FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第37天的IgG2a(n＝5)；抗PD1组：FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第18天的抗PD1(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第22天的抗PD1(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第30天的抗PD1(n＝5)和FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与抗在第37天的PD1(n＝5)。对于抗PD1/IgG2a治疗，对抗PD1组的小鼠静脉内给予鼠抗PD1(大鼠IgG2a同种型)一次，或对对照组静脉内给予大鼠IgG2a一次，所有均在指定日期以3mg/kg给予。肿瘤在5天内达到约55mm3(第5天)。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在注射TNFaR(20μg，经由皮下注射)之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg，然后立即进行CRYA_1B治疗。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，第12天开始，将作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。对于加强T细胞的CRYA_1B疗法，第31天开始，将作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复两个周期。在第19、23、31和38天，从抗PD1和IgG2a两组收获小鼠的PBMC进行T细胞分析。
图32为显示FLT3L、IFNγ、TNFaR和重组多肽CRYA_1B与多重抗PD1(纳武单抗)阻断用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。对7组中的每组的雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞：FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22天的抗PD1x1(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22和25天的抗PD1x2(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22、25、28天的抗PD1x3(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22、25、28、31天的抗PD1x4(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22、25、28、31、34天的抗PD1x5(n＝5)、FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22、25、28、31、34、37天的抗PD1x6(n＝5)和FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22、25、28、31、34、37、40天的抗PD1x7(n＝5)。对于抗PD1治疗，将小鼠静脉内给予鼠抗PD1(大鼠IgG2a同种型)，所有均在指定日期以3mg/kg给予。肿瘤在5天内达到约55mm3(第5天)。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在注射TNFaR(20μg，经由皮下注射)之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg，然后立即进行CRYA_1B治疗。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，第12天开始，将作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。在第23、26、29、32、35、38和41天，从所有抗PD1组收获小鼠的PBMC进行T细胞分析。
图33为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B与IgG2a对照用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。T细胞启动-IgG2a-加强(x1)(对照)方案。
图34为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B与单一抗PD1(纳武单抗)阻断对照用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。T细胞启动-抗PD1-加强(x1)方案用于300mm3。
图35为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B与单一抗PD1(纳武单抗)阻断对照用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。T细胞启动-抗PD1-加强(x1)方案用于400mm3。
图36为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B与单一抗PD1(纳武单抗)阻断对照用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。T细胞启动-抗PD1-加强(x3)方案用于400mm3。
图37为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B与单一抗PD1(纳武单抗)阻断对照用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。T细胞启动-抗PD1-加强(x5)方案用于500mm3。
图38为描绘在用图37中所示的T细胞启动-抗PD1-加强(x5)方案处理后，经历抗原的CD44+CD8+T细胞的数量的计算的图解。
图39为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B组合疗法的体内剂量方案的示意图。将雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)用于FLT3L/IFNg/CRYA_1B方案，其在治疗周期的第一、第二天使用不同的CRYA_1B剂量(剂量d1；剂量d2)：25mg/kg；16mg/kg(n＝5)、25mg/kg；15mg/kg(n＝5)、22mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；20mg/kg(n＝5)、20mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；16mg/kg(n＝5)、20mg/kg；14mg/kg(n＝5)、20mg/kg；13mg/kg(n＝5)、20mg/kg；12mg/kg(n＝5)、19mg/kg；19mg/kg(n＝5)、18mg/kg；18mg/kg(n＝5)和18mg/kg；20mg/kg(n＝5)。肿瘤在6天内达到约80-90mm3(第6天)。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在第13天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg。对于启动T细胞的CRYA_1A疗法，将作为一个周期的两天治疗(剂量d1；剂量d2mg/kg经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。第30天，收获所有小鼠的PBMC进行T细胞分析。
图40为显示通过用重组多肽CRYA_1B处理活化先天免疫的下游效应的示意性流程图。
图41为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。对于FLT3/IFNg/CRYA_1B方案的体温测量。
图42为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。对于FLT3/IFNg/TNFaR/CRYA_1B方案的体温测量。
图43为显示FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。用TNFaR优化CRYA_1B剂量。将雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞用于FLT3L、IFNg、TNFaR和CRYA_1B方案，其在治疗周期的第一、第二天使用不同的CRYA_1B剂量(剂量d1；剂量d2)：25mg/kg；16mg/kg(n＝5)、25mg/kg；15mg/kg(n＝5)、22mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；20mg/kg(n＝5)、20mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；16mg/kg(n＝5)、20mg/kg；14mg/kg(n＝5)、20mg/kg；13mg/kg(n＝5)、20mg/kg；12mg/kg(n＝5)、19mg/kg；19mg/kg(n＝5)、18mg/kg；18mg/kg(n＝5)和18mg/kg；20mg/kg(n＝5)。肿瘤在6天内达到约80-90mm3(第6天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在注射TNFaR(20μg，经由皮下注射)之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg，然后立即在第13天进行首次CRYA_1B治疗。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，将作为一个周期的两天治疗(剂量d1；剂量d2(mg/kg)经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。第30天，收获所有小鼠的PBMC进行T细胞分析。
图44为显示FLT3L、IFNγ、TNFaR和重组多肽CRYA_1B与抗PD1(纳武单抗)阻断用于治疗黑色素瘤的组合疗法的体内剂量方案的示意图。启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)方案用于转移性大肿瘤。示意图显示FLT3L、IFNγ、TNFaR和CRYA_1B的时间线和剂量。在启动性周期中CRYA_1B的最后一次输注和加强性周期中FLT3L的第一次输注之间给予抗PD1至少一次。任选地，抗PD1可给予多于一次。
发明详述
本公开提供通过给予重组多肽、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂和免疫细胞生长因子来在受试者中预防癌症、延缓癌症的进展、治疗或减轻癌症的症状或以其他方式改善癌症的方法。该方法可进一步包括给予免疫治疗剂。
本公开提供包含表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。本公开还提供包含与表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开还提供包含表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成的酸性重组多肽变体，其中重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的。本公开还提供包含与表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性重组多肽变体。
“酸性变体”为目标多肽的变体，其比亲本或初始目标多肽更加酸性(例如如通过计算pI所确定)。多肽的“pI”或“等电点”是指多肽的正电荷平衡其负电荷的pH。pI可通过本领域已知的任何方式例如从多肽氨基酸残基的净电荷来计算，或者可通过等电聚焦来确定。
在一些方面，酸性变体通过进行氨基酸取代衍生自初始亲本序列。通过用酸性氨基酸(D或E)取代初始亲本序列的任何碱性氨基酸(K、R或H)、中性非极性氨基酸(G、A、V、L、I、M、F、W或P)或中性极性氨基酸(S、T、C、Y、N或Q)来作出第一突变取代。通过进行第一突变取代的反向突变取代来作出第二突变取代。例如，来自初始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基均用谷氨酸(E)残基取代(第一取代)。另外，来自初始亲本序列的所有谷氨酸(E)残基均用丝氨酸(S)残基取代(第二取代)。在一个方面，反向取代包含以下、基本上由其组成或由其组成：初始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基均突变为谷氨酸(E)且初始亲本序列的所有谷氨酸(E)残基均突变为丝氨酸(S)残基；初始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基均突变为天冬氨酸(D)且初始亲本序列的所有天冬氨酸(D)残基均突变为丝氨酸(S)残基；初始亲本序列的所有缬氨酸(V)残基均突变为天冬氨酸(D)且初始亲本序列的所有天冬氨酸(D)均突变为缬氨酸(V)残基；或初始亲本序列的所有丝氨酸(S)残基均突变为亮氨酸(L)残基且初始亲本序列的所有亮氨酸(L)残基均突变为丝氨酸(S)残基。在优选的方面，氨基酸取代导致其中天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在的重组多肽。在优选的方面，氨基酸取代导致具有亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)作为酸性变体的3种最丰富的氨基酸残基或者作为丰度大于或等于酸性变体的下一最丰富氨基酸残基的重组多肽。在一些方面，可作出氨基酸的多个反向突变取代。
本公开还提供包含表1A中所示的氨基酸序列中任何一种、基本上由其组成或由其组成的酸性重组多肽变体，其中重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的，其中重组肽变体的pI低于衍生该重组肽的肽序列的pI，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。本公开还提供包含表1A中所示的氨基酸序列中任何一种、基本上由其组成或由其组成的酸性重组多肽变体，其中重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性变体的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性变体的下一最丰富氨基酸残基。本公开还提供包含与表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性重组多肽变体。
表1A.重组多肽序列
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在优选的方面，本公开提供包含表1B中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。本公开还提供与表1B中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列的重组多肽。
表1B.重组多肽序列
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本公开提供包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自中国家鹅α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#XP_013036875.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自中国家鹅α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#XP_013036875.1)的氨基酸序列(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:1的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自中国家鹅α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#XP_013036875.1)的酸性变体，或者包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQID NO:9与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％序列同一性，SEQ ID NO:9如通过pI所确定的为酸性的，SEQ ID NO:9的pI低于SEQ ID NO:1的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:9内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在(即SEQ ID NO:9的173氨基酸序列中谷氨酸(E)为23个残基，亮氨酸(L)为15个残基和天冬氨酸(D)为14个残基，其中脯氨酸(P)(14个残基)为SEQ ID NO:9内的下一最多存在的氨基酸残基)。
本公开提供包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自美洲鸵α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#P02505.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自美洲鸵α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#P02505.1)的氨基酸序列(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:2的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自美洲鸵α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#P02505.1)的酸性变体，或者包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ IDNO:10与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％序列同一性，SEQ ID NO:10如通过pI所确定的为酸性的，SEQ ID NO:10的pI低于SEQ ID NO:2的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:10内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自绿头鸭α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#O12984.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自绿头鸭α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#O12984.1)的氨基酸序列(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:3的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自绿头鸭α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#O12984.1)的酸性变体，或者包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ IDNO:11与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％序列同一性，SEQ ID NO:11如通过pI所确定的为酸性的，SEQ ID NO:11的pI低于SEQ ID NO:3的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:11内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成、由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自绿头鸭α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank#Q05557.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自绿头鸭α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank#Q05557.1)的氨基酸序列(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:4的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自绿头鸭α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank#Q05557.1)的酸性变体，或者包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ IDNO:12与SEQ ID NO:4的多肽具有至少80％序列同一性，SEQ ID NO:12如通过pI所确定的为酸性的，SEQ ID NO:12的pI低于SEQ ID NO:4的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:12内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自智人α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#AAH69528.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自智人α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#AAH69528.1)的氨基酸序列(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:5的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自智人α-A-晶体蛋白(CRYAA)(GenBank#AAH69528.1)的酸性变体，或者包含与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ IDNO:13与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性，SEQ ID NO:13如通过pI所确定的为酸性的，SEQ ID NO:13的pI低于SEQ ID NO:5的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:13内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的HSP23重组多肽序列或衍生自黑腹果蝇HSP23(GenBank#AAA28637.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的HSP23重组多肽变体序列或衍生自黑腹果蝇HSP23(GenBank#AAA28637.1)的氨基酸序列(其中HSP23重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性HSP23重组多肽变体(其中HSP23重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:6的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性HSP23重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性HSP23重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自黑腹果蝇HSP23(GenBank#AAA28637.1)的酸性变体，或者包含与SEQ IDNO:14的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:14与SEQ IDNO:6的多肽具有至少80％序列同一性，SEQ ID NO:14如通过pI所确定的为酸性的，SEQ IDNO:14的pI低于SEQ ID NO:6的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:14内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的HSP22重组多肽序列或衍生自黑腹果蝇HSP22(GenBank#AAA28635.1)的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性HSP22重组多肽变体序列或衍生自黑腹果蝇HSP22(GenBank#AAA28635.1)的氨基酸序列(其中HSP22重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性HSP22重组多肽变体(其中HSP22重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:7的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性HSP22重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性HSP22重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自黑腹果蝇HSP22(GenBank#AAA28635.1)的酸性变体，或者包含与SEQ IDNO:15的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:15与SEQ IDNO:7的多肽具有至少65％序列同一性，SEQ ID NO:15如通过pI所确定的为酸性的，SEQ IDNO:15的pI低于SEQ ID NO:7的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:15内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的α晶体蛋白重组多肽序列或衍生自中国家鹅α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank#XP_013042703.1)的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。
本公开提供包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体序列或衍生自中国家鹅α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank#XP_013042703.1)的氨基酸序列(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)，或者包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的酸性α晶体蛋白重组多肽变体(其中α晶体蛋白重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的)。在一些方面，重组多肽的pI低于SEQ ID NO:8的pI。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。在一些方面，亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性α晶体蛋白重组多肽变体中的3种最丰富的氨基酸残基或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。
在优选的方面，重组多肽为包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的衍生自中国家鹅α-B-晶体蛋白(CRYAB)(GenBank#XP_013042703.1)的酸性变体，或者包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的重组多肽。例如，SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性，SEQ ID NO:16如通过pI所确定的为酸性的，SEQ ID NO:16的pI低于SEQ ID NO:8的pI，且天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)和亮氨酸(L)各自独立地以比SED ID NO:16内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。
本公开提供编码重组多肽的分离的核酸分子，所述重组多肽包含表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成。本公开还提供编码重组多肽的分离的核酸分子，所述重组多肽包含与表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开还提供编码重组多肽变体的分离的核酸分子，所述重组多肽变体包含表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成，其中重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的。本公开还提供编码重组多肽变体的分离的核酸分子，所述重组多肽变体包含与表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开还提供编码酸性重组多肽变体的分离的核酸分子，所述酸性重组多肽变体包含表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成，其中重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的，其中重组肽变体的pI低于衍生重组肽的肽序列的pI，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)各自独立地以比重组多肽序列内存在的任何其他氨基酸残基的量更大或与之相等的量存在。本公开还提供编码酸性重组多肽变体的分离的核酸分子，所述酸性重组多肽变体包含表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成，其中重组多肽变体如通过等电点(pI)所确定的为酸性的，且其中亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)为酸性变体的3种最丰富的氨基酸序列或者丰度大于或等于酸性α晶体蛋白重组多肽变体的下一最丰富氨基酸残基。本公开还提供编码酸性重组多肽变体的分离的核酸分子，所述酸性重组多肽变体包含与表1A中所示的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成。
本公开还提供分离的核酸分子，其包含表2A中所示的核酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成。本公开还提供核酸分子，其包含与表2A中所示的核酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
表2A.核酸序列
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在优选的方面，本公开提供分离的核酸分子，其包含表2B中所示的核酸序列中的任何一种、基本上由其组成或由其组成。本公开还提供核酸分子，其包含与表2B中所示的核酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核酸序列、基本上由其组成或由其组成。
表2B.核酸序列
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本公开的治疗方法涉及给予免疫细胞生长因子。免疫细胞生长因子作为增加免疫细胞数量的生长因子发挥作用。在一些方面，免疫细胞为树突细胞。在一些方面，免疫细胞生长因子为CD40L。在一些方面，免疫细胞生长因子为抗CD40抗体。在一些方面，免疫细胞生长因子为细胞因子。在一些方面，细胞因子包括但不限于FMS相关酪氨酸激酶配体(FLT3L)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在优选的方面，免疫细胞生长因子为FLT3L。
粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)为一种细胞因子，其作为白细胞生长因子发挥作用，刺激干细胞以产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。GM-CSF的多核苷酸序列可从公共数据库获得，登录号为Ml 1734(人类)、NM_009969(小鼠)、EU520303(鸡)、NM_001037660(大鼠Csf2 ra)和NM_133555(大鼠Csf2rb)，其序列通过参考结合至本文中。粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列可从公共数据库获得，登录号为AAA52122(人类)、NP_034099(小鼠)、ACBl 1534(鸡)、NP_001032749(大鼠Csf2ra)和NP 598239(Csf2rb)，其序列通过参考结合至本文中。
FLT3L：FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)为内源性小分子，其作为细胞因子和增加免疫细胞数量的生长因子发挥作用，所述免疫细胞尤其是树突细胞，包括髓源性DC(mDC)和浆细胞样源性DC(pDC)。人类HLA-DR+Lin-DC包括CD11c+CD123-髓源性DC(mDC)和CD11c-CD123+浆细胞样源性DC(pDC)。
可作为树突细胞、造血干细胞、祖细胞或其任何组合的生长因子发挥作用的FLT3L的多核苷酸序列可从公共数据库获得，登录号为U04806(人类)和NM_013520(小鼠)，其序列通过参考结合至本文中。FLT3/FLK2配体(Flt3L)的氨基酸序列可从公共数据库获得，登录号为AAAl7999(人类)和NP_038548(小鼠)，其序列通过参考结合至本文中。
如本文使用的，术语“树突细胞”或“DC”是指形成哺乳动物免疫系统一部分的免疫细胞。DC的主要功能为通过处理外来抗原并将其表面的抗原表位呈递给免疫系统的其他细胞来充当“抗原呈递细胞”。DC以少量存在于与外部环境接触的组织中，主要是皮肤(其中存在被称为朗格汉斯细胞的特化的树突细胞类型)以及鼻、肺、胃和肠的内层。在血液中也可发现未成熟状态的DC。一旦活化，它们就会迁移至淋巴组织，其中它们与T细胞和B细胞相互作用以启动适应性免疫应答。在某些发育阶段，DC生长出分支突起(树突)，这给予了细胞其名称。在一些实施方案中，DC可基于细胞表面标志物CD11c的表达而分化成两个子群。在一些实施方案中，CD11c+DC产生IL12并刺激淋巴细胞中的Th1应答，而CD11c-DC合成少量IL12，但却是α干扰素的主要来源，并刺激淋巴细胞产生Th2细胞因子。
如本文使用的，术语“细胞因子”是指由免疫系统的特定细胞分泌的一类蛋白、肽或糖蛋白分子，它们在细胞间传递信号。细胞因子为先天和适应性免疫应答两者的关键组成部分，并且通常由遇到病原体的免疫细胞分泌，以活化和募集另外的免疫细胞来提高系统对病原体的应答。细胞因子一般在病原体感染细胞的一般区域中释放，使得应答的免疫细胞到达该感染部位。每个单个细胞因子均有匹配的细胞表面受体。当细胞因子与其细胞表面受体结合时，胞内信号传导事件级联改变细胞的功能。这包括参与产生其他细胞因子的基因的上调和/或下调、其他分子表面受体的表达增加或通过反馈抑制对细胞因子本身的抑制。特定细胞因子对给定细胞的作用取决于细胞因子、其细胞外丰度、细胞表面互补受体的存在和丰度以及通过受体结合激活的下游信号。常见的细胞因子包括负责白细胞间通讯的白细胞介素、促进趋化的趋化因子以及具有诸如关闭宿主细胞中蛋白合成等抗病毒作用的干扰素。细胞因子的特征为相当“冗余”，因为许多细胞因子似乎共具相似的功能。例如，“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”(GM-CSF)和“Fms相关酪氨酸激酶3配体”(Flt3L)两者均为促进树突细胞生长和分化的细胞因子。
本公开的治疗方法涉及在受试者给予IL-10抑制剂。减少IL-10的示例性药剂包括但不限于干扰素γ(IFNg)、IFNg拟似物、IFNg激动剂或其组合。优选地，IL-10抑制剂为干扰素γ(IFNg)。在一些方面，IFNg减少IL-10并将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM。
本公开的治疗方法涉及给予TNFa抑制剂。在一些方面，TNFa抑制剂为肿瘤坏死因子α(TNFa)的抑制剂。示例性的TNFa抑制剂包括但不限于TNFa受体(TNFaR)、依那西普(恩利(Enbrel))、英夫利昔单抗(类克(Remicade))、阿达木单抗(修美乐(Humira))、培塞利珠单抗(希敏佳(Cimzia))和戈利木单抗(欣普尼(Simponi))。在一些实施方案中，TNFa抑制剂为TNFaR。在优选的方面，TNFa抑制剂为依那西普。
本公开的治疗方法涉及给予免疫治疗剂。在一些方面，免疫治疗剂为检查点抑制剂。术语“抑制”或“抑制剂”包括降低给定分子的某个参数，例如活性，例如免疫检查点抑制剂。例如，该术语包括将活性，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ的活性，抑制至少5％、10％、20％、30％、40％或以上。抑制水平不需要为100％。
在一些方面，检查点抑制剂为PD-1抑制剂。在一些方面，PD-1抑制剂为抗PD1抗体。在一些方面，PD-1抑制剂为抗PD-1单克隆抗体。示例性的抗PD-1单克隆抗体包括但不限于西米普利单抗(Libtayo)、纳武单抗(欧狄沃(Opdivo))、帕博利珠单抗(可瑞达(Keytruda))。在一些方面，检查点抑制剂为PD-L1抑制剂。示例性的PD-L1抑制剂包括但不限于阿维鲁单抗(avelumab)(巴文西亚(Bavencio))、德瓦鲁单抗(durvalumab)(英飞凡(Imfinzi))和阿替利珠单抗(atezolizumab)(泰圣奇(Tecentriq))。
术语“程序性死亡1”或“PD-1”包括所有同工型，哺乳动物例如人类PD-1、人类PD-1的物种同源物以及与PD-1包含至少一个共同表位的类似物。PD-1例如人类PD-1的氨基酸序列为本领域已知的，例如Shinohara T等人(1994)Genomics 23(3):704-6；Finger L R等人Gene(1997)197(1-2):177-87。
术语或“PD-配体1”或“PD-L”包括所有同工型，哺乳动物例如人类PD-1、人类PD-L1的物种同源物以及与PD-L1包含至少一个共同表位的类似物。PD-L1例如人类PD-L1的氨基酸序列为本领域已知的，例如Dong H等人(1999)Nat.Med.5(12):1365-1369；Freeman G等人(2000)J.Exp.Med.192(7):1027-1034。
本公开还提供包含本文公开的重组多肽或核酸的药用组合物。
将本发明的药用组合物配制为与其预期的给予途径相容。给予途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(局部)和经粘膜给予。被用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可包括以下组分：无菌稀释剂，比如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯类；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲剂，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，比如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱比如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可封装于安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一个方面，药用组合物可包含在药学上可接受的载剂中的本文公开的重组多肽中的任何一种、基本上由其组成或由其组成。在一些方面，将药用组合物配制为水性制剂。水性制剂可包含盐缓冲剂、基本上由其组成或由其组成，所述盐缓冲剂可选自但不限于NaCl、KCl和NaOAc。在一个方面，盐缓冲剂包含NaCl。在一个方面，NaCl浓度为约0.4M-约1.0M。在一个方面，缓冲溶液的pH在约7.5-约9.0之间。在一个方面，缓冲溶液的pH为约7.4。
本发明的化合物或药用组合物可以目前被用于化学治疗性治疗的许多众所周知的方法给予受试者。例如，为治疗癌症，可将本发明的化合物直接注射到肿瘤中、注射到血流或体腔中、经口或用贴剂通过皮肤施用。
如本文使用的，术语“治疗有效量”是指药用物质治疗、改善或预防鉴定的疾病或病症或者表现出可检测的治疗或抑制作用的量。该作用可通过本领域已知的任何测定方法来检测。用于受试者的确切有效量将取决于受试者的体重、大小和健康；病症的性质和程度；和选择用于给予的治疗剂或治疗剂的组合。用于给定情况的治疗有效量可通过处于临床医师的技术和判断内的常规实验来确定。在一个方面，待治疗的疾病或病症为细胞增殖性障碍。在优选的方面，待治疗的疾病或病症为癌症。
对于任何化合物，最初可在细胞培养测定(例如赘生性细胞的细胞培养测定)中或在动物模型(通常为大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效量。动物模型还可被用于确定适当的浓度范围和给予途径。然后，此类信息可被用于确定用于在人类中给予的有用剂量和途径。可通过在细胞培养或实验动物中的标准药用程序来确定治疗/预防效力和毒性，例如ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)和LD50(在50％群体中致死的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，并且其可被表示为比率LD50/ED50。表现出大的治疗指数的药用组合物为优选。剂量可在该范围内根据采用的剂型、患者的敏感性和给予途径而变化。
调整剂量和给予以提供足够水平的一种或多种活性剂或维持期望的作用。可考虑的因素包括疾病状态的严重程度，受试者的总体健康，受试者的年龄、体重和性别，饮食，给予的时间和频率，一种或多种药物组合，反应敏感性，和对疗法的耐受性/应答。
含有本发明活性化合物的药用组合物可以通常已知的方式制造，例如通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣、磨细、乳化、胶囊化、包埋或冻干方法。可使用一种或多种药学上可接受的载剂以常规方式配制药用组合物，所述载剂包括促进将活性化合物加工成可以药学上使用的制剂的赋形剂和/或助剂。当然，适当的制剂取决于所选择的给予途径。
适合于可注射使用的药用组合物包括无菌水溶液剂(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉末。对于静脉内给予，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须为无菌的并且应当为达到存在简单可注射性的程度的流体。其必须在制造和储存条件下为稳定的，并且必须针对诸如细菌和真菌等微生物的污染作用进行保存。载剂可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可实现对微生物的作用的预防。在许多情况下，将优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(比如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可引起可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液剂可通过以下来制备：根据需要将活性化合物以所需量与一种或一组以上列举的成分并入适当的溶剂中，然后为过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入到无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末的情况下，制备的方法为真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤溶液剂产生活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。
经口组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的药学上可接受的载剂。它们可被封装于明胶胶囊中或压制成片剂。为了经口治疗性给予的目的，可将活性化合物与赋形剂一起并入，并以片剂、含片剂或胶囊剂的形式使用。经口组合物也可使用流体载剂进行制备，以用作漱口剂，其中流体载剂中的化合物经口施用并漱口和啐出或吞咽。可包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、含片剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，比如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；崩解剂，比如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，比如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，比如胶体二氧化硅；甜味剂，比如蔗糖或糖精；或矫味剂，比如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。
药用组合物可包括本文所述的重组多肽和核酸中任何一种的共配制。
药用组合物可与给予说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本公开还提供包含本文公开的重组多肽和编码本文公开的重组多肽的核酸分子的质粒、表达载体和宿主细胞。在一个方面，本公开提供包含核酸分子的质粒或表达载体，所述分子含有SEQ ID NO:17-32中任何一种的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:17-32的核酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核酸序列，或其片段。在一个方面，本公开提供：包含重组多肽的宿主细胞，所述重组多肽包含SEQ ID NO:1-16中任何一种的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列或其片段；或者包含核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子包含SEQ ID NO:17-32中任何一种的核酸序列或与SEQ ID NO:17-32的核酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核酸序列或其片段。
如本文使用的，术语“转化”、“转染”和“转导”是指将核酸(即核苷酸聚合物)转移到细胞中。如本文使用的，术语“遗传转化”是指将DNA，尤其是重组DNA转移和并入到细胞中。转移的核酸可经由表达载体被引入到细胞中。
通过将所述分子置于载体中来增殖包含期望的多核苷酸序列的多核苷酸分子。可使用病毒和非病毒载体，包括质粒。质粒的选择将取决于在其中期望增殖的细胞类型以及增殖的目的。某些载体可用于扩增和制备大量期望的DNA序列。其他载体适合于在培养中的细胞中进行表达。仍然其他的载体适合于在完整动物或人中的细胞中进行转移和表达。适当载体的选择完全处于本领域技术之内。许多此类载体为市售可得的。一般通过DNA连接酶附接于载体中切割的限制性酶位点来将部分或全长多核苷酸插入到载体中。或者，可通过体内同源重组来插入期望的核苷酸序列。这一般是通过在期望的核苷酸序列的侧翼上将同源区域附接于载体来实现的。例如，通过寡核苷酸连接或通过使用引物的聚合酶链反应来添加同源区域，所述引物包含同源区域和期望的核苷酸序列的一部分两者。
对于表达，可采用表达盒或系统。为表达编码本文公开的多肽的核酸，将可操作地连接于调控序列的编码多肽的核酸分子引入到宿主细胞中，所述调控序列控制表达载体中的转录表达。除了诸如启动子和增强子等转录调控序列之外，表达载体可包括翻译调控序列和适合于选择携带表达载体的细胞的标记基因。由本公开的多核苷酸编码的基因产物在任何便利的表达系统中表达，所述系统包括例如细菌、酵母、昆虫、两栖动物和哺乳动物系统。在表达载体中，在适当时将多肽编码多核苷酸连接于调控序列以获得期望的表达特性。这些可包括启动子、增强子、终止子、操纵子、阻遏子和诱导物。启动子可为调节性(例如来自类固醇诱导型pIND载体(Invitrogen)的启动子)或组成性的(例如来自CMV、SV40、延伸因子或LTR序列的启动子)。使用以上描述的用于连接至载体的技术，将这些连接于期望的核苷酸序列。可使用本领域已知的任何技术。因此，表达载体将通常提供转录和翻译起始区，其可为诱导性或组成性的，其中编码区在转录起始区的转录控制下可操作地连接，以及转录和翻译终止区。
可将表达盒(“表达单元”)引入到各种载体，例如质粒、BAC、YAC、噬菌体(比如λ、P1、M13等)、植物或动物病毒载体(例如基于逆转录病毒的载体、腺病毒载体)等中，其中载体的特征通常为提供对包含表达载体的细胞的选择的能力。载体可提供染色体外维持，特别是作为质粒或病毒，或提供向宿主染色体内的整合。在期望染色体外维持的情况下，提供起始点序列用于复制质粒，其可为低或高拷贝数的。各种各样的标志物可用于选择，特别是针对毒素，更尤其是针对抗生素进行保护的那些。根据宿主的性质选择所选择的特定标志物，其中在一些情况下，关于营养缺陷型宿主可采用补充物。DNA构建体的引入可使用任何便利的方法，包括例如缀合、细菌转化、钙沉淀的DNA、电穿孔、融合、转染、用病毒载体的感染、基因枪等。
因此，用于在本公开内使用的多肽可根据常规技术在基因工程化宿主细胞中产生。合适的宿主细胞为可用外源性DNA转化或转染且在培养中生长的那些细胞类型，并且包括细菌、真菌细胞和培养的高级真核细胞(包括多细胞生物体的培养细胞)，特别是培养的哺乳动物细胞。用于操纵克隆的DNA分子和将外源性DNA引入到各种宿主细胞中的技术由以下文献公开：Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001)，和Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(第4版，John Wiley&Sons,1999)。例如，可从细菌大肠杆菌(Escherichia coli)细胞表达本公开的重组多肽。
为将重组多肽引导到宿主细胞的分泌途径中，可在表达载体中提供分泌信号序列(也被称为前导序列)。分泌信号序列可为重组蛋白天然形式的分泌信号序列，或者可源于另一种分泌蛋白或从头合成。分泌信号序列可操作地连接于编码多肽的DNA序列，即将两个序列在正确的阅读框中连接且定位以将新合成的多肽引导到宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常位于编码目标多肽的DNA序列的5’，尽管某些信号序列可位于目标DNA序列中的别处(参见例如Welch等人，美国专利号5,037,743；Holland等人，美国专利号5,143,830)。
培养的哺乳动物细胞可为适合于产生用于在本公开内使用的重组多肽的宿主。用于将外源性DNA引入到哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等人，Cell 14:725；Corsaro和Pearson,Somatic Cell Genetics 7:603,1981；Graham和Van derEb,Virology52:456,1973)、电穿孔(Neumann等人，EMBO J.1:841-845,1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等人，同上)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等人，Focus 15:73,1993；Ciccarone等人，Focus 15:80,1993)。培养的哺乳动物细胞中的重组多肽的产生由例如以下文献公开：Levinson等人，美国专利号4,713,339；Hagen等人，美国专利号4,784,950；Palmiter等人，美国专利号4,579,821；和Ringold，美国专利号4,656,134。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21、BHK-570；ATCC CRL 8544,ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44；CHO DXB11(Hyclone,Logan,UT)；也参见例如Chasin等人，Som.Cell.Molec.Genet.12:555,1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCCCRL 1658)。另外的合适的细胞系为本领域已知的，并且可从诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)等公共储藏库获得。可使用强转录启动子，比如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。参见例如美国专利号4,956,288号。其他合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的那些(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。
药物选择通常被用于选择其中已插入外来DNA的培养的哺乳动物细胞。此类细胞通常被称为“转染子”。已在存在选择剂的情况下培养且能够将目标基因传递给其后代的细胞被称为“稳定转染子”。示例性的选择标记包括：编码对抗生素新霉素的抗性的基因，其允许在存在诸如G-418等新霉素型药物的情况下进行选择；黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的gpt基因，其允许宿主细胞在存在霉酚酸/黄嘌呤的情况下生长；和提供对吉欧霉素(zeocin)、博来霉素(bleomycin)、杀稻瘟菌素(blastocidin)和潮霉素(hygromycin)的抗性的标记(参见例如Gatignol等人，Mol.Gen.Genet.207:342,1987；Drocourt等人，Nucl.Acids Res.18:4009,1990)。选择系统还可被用于增加目标基因的表达水平，即被称为“扩增”的过程。通过在存在低水平选择剂的情况下培养转染子，并且然后增加选择剂的量以选择产生高水平的引入基因的产物的细胞来进行扩增。示例性可扩增的选择标记为二氢叶酸还原酶，其赋予对氨甲蝶呤的抗性。还可使用其他药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。
还可使用其他高级真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞、植物细胞和禽类细胞。Sinkar等人，J.Biosci.(Bangalore)11:47-58,1987已综述了使用发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为用于在植物细胞中表达基因的载体。由Guarino等人，美国专利号5,162,222和WO 94/06463公开了昆虫细胞的转化和其中外来多肽的产生。
可用通常源于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。参见King和Possee,The Baculovirus ExpressionSystem:A Laboratory Guide(Chapman&Hall,London)；O’Reilly等人，BaculovirusExpression Vectors:A Laboratory Manual(Oxford University Press.,New York1994)；和Baculovirus Expression Protocols.Methods in Molecular Biology(Richardson ed.,Humana Press,Totowa,NJ,1995)。还可通过使用由Luckow等人(J.Virol.67:4566-4579,1993)描述的基于转座子的系统来产生重组杆状病毒。利用转移载体的该系统可以试剂盒形式市售获得(BAC-TO-BAC试剂盒；Life Technologies,Gaithersburg,MD)。转移载体(例如PFASTBAC1；Life Technologies)含有Tn7转座子，以将编码目标蛋白的DNA移动到杆状病毒基因组中，所述基因组作为被称为“杆粒”的大质粒维持于大肠杆菌中。参见Hill-Perkins和Possee,J.Gen.Virol.71:971-976,1990；Bonning等人，J.Gen.Virol.75:1551-1556,1994；和Chazenbalk和Rapoport,J.Biol.Chem.270:1543-1549,1995。另外，转移载体可包括如上文公开的与编码多肽延伸或亲和标签的DNA的框内融合。使用本领域已知的技术，将含有编码蛋白的DNA序列的转移载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，并针对含有指示重组杆状病毒的中断的lacZ基因的杆粒来筛选细胞。使用常用技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并将其用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞，比如Sf9细胞。随后产生表达目标蛋白的重组病毒。通过本领域通常使用的方法制备重组病毒储备物。
对于蛋白产生，可使用重组病毒感染宿主细胞，一般为源于秋粘虫，草地贪夜蛾(例如Sf9或Sf21细胞)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(例如HIGH FIVE细胞；Invitrogen,Carlsbad,CA)的细胞系。通常参见Glick和Pasternak,Molecular Biotechnology,Principles&Applications of Recombinant DNA(ASM Press,Washington,D.C.,1994)。还参见美国专利号5,300,435。使用无血清培养基来生长和维持细胞。合适的培养基配方为本领域已知的并且可得自商业供应商。使细胞从约2-5x105个细胞的接种密度生长至1-2x106个细胞的密度，此时以0.1-10，更一般地接近3的感染复数(MOI)添加重组病毒储备物。使用的程序一般描述于可获得的实验室手册中(参见例如King和Possee，同上；O’Reilly等人，同上；Richardson，同上)。
本公开内也可使用真菌细胞，包括酵母细胞。在这方面的酵母物种包括例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。用外源性DNA转化酿酒酵母细胞和由其产生重组多肽的方法由例如以下文献公开：Kawasaki，美国专利号4,599,311；Kawasaki等人，美国专利号4,931,373；Brake，美国专利号4,870,008；Welch等人，美国专利号5,037,743；和Murray等人，美国专利号4,845,075。通过由选择标记确定的表型来选择转化细胞，选择标记通常为抗药性或在不存在特定营养物(例如亮氨酸)的情况下生长的能力。用于酿酒酵母中的示例性载体系统为由Kawasaki等人(美国专利号4,931,373)公开的POT1载体系统，其允许通过在含有葡萄糖的培养基中生长来选择转化细胞。用于酵母中的合适的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(参见例如Kawasaki，美国专利号4,599,311；Kingsman等人，美国专利号4,615,974；和Bitter，美国专利号4,977,092)和乙醇脱氢酶基因的那些。还参见美国专利号4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。用于其他酵母，包括多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的转化系统为本领域已知的。参见例如Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132:3459-3465,1986；Cregg，美国专利号4,882,279；和Raymond等人，Yeast 14:11-23,1998。可根据McKnight等人，美国专利号4,935,349的方法利用曲霉属(Aspergillus)细胞。Sumino等人，美国专利号5,162,228公开了用于转化产黄枝顶孢霉(Acremonium chrysogenum)的方法。Lambowitz，美国专利号4,486,533公开了用于转化脉孢菌(Neurospora)的方法。美国专利号5,716,808、5,736,383、5,854,039和5,888,768中公开了甲醇毕赤酵母中重组蛋白的产生。
原核宿主细胞，包括细菌大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)和其他属的菌株，也为本公开内可用的宿主细胞。用于转化这些宿主和表达在其中克隆的外来DNA序列的技术为本领域众所周知的(参见例如Sambrook和Russell，同上)。当在诸如大肠杆菌等细菌中表达重组蛋白时，蛋白可被保留在细胞质中，一般作为不溶性颗粒，或者可通过细菌分泌序列而被引导至周质空间。在前者情况下，裂解细胞，且回收颗粒并使用例如异硫氰酸胍或尿素使其变性。然后，可通过稀释变性剂，比如通过针对尿素溶液及还原型和氧化型谷胱甘肽的组合进行透析，然后针对缓冲盐水溶液进行透析，将变性蛋白再折叠和二聚化。在另一情况下，蛋白可以可溶性形式从细胞质中回收，并在不使用变性剂的情况下分离。蛋白作为例如磷酸盐缓冲盐水中的水性提取物从细胞中回收。为捕获目标蛋白，将提取物直接应用于色谱介质，比如固定的抗体或肝素-Sepharose柱。可通过破坏细胞(通过例如声处理或渗透压冲击)以释放周质空间的内含物且回收蛋白，从而避免对变性和再折叠的需要，而从周质空间回收呈可溶性和功能形式的分泌蛋白。
根据常规程序在含有营养物和所选宿主细胞生长所需的其他组分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。各种合适的培养基，包括成分明确培养基和复合培养基，为本领域已知的，并且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基还可根据需要含有诸如生长因子或血清等组分。通常将通过例如药物选择或必需营养物缺乏来选择用于含有外源添加DNA的细胞的生长培养基，必需营养物通过表达载体上携带或共转染到宿主细胞中的选择标记来补充。
可通过常规蛋白纯化方法，一般通过色谱技术的组合来纯化重组多肽。通常参见Affinity Chromatography:Principles&Methods(Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala,Sweden,1988)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(Springer-Verlag,New York 1994)。可使用另外的纯化步骤，比如凝胶过滤，来获得期望的纯度水平或提供脱盐、缓冲液更换等。
本公开提供通过给予本文公开的任何重组多肽和任何IL-10抑制剂来在受试者中预防癌症、延缓癌症的进展、治疗或减轻癌症症状或以其他方式改善癌症的方法。
需要其的受试者可为具有细胞增殖性病症的受试者。可根据本公开的方法治疗的癌症包括原发性、进行性、转移性或复发性肿瘤。优选地，肿瘤为实体瘤。癌症包括例如中枢神经系统的肿瘤、胶质瘤肿瘤、肾癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、头颈癌肿瘤、肝癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、食道癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、输尿管癌肿瘤、肾盂癌肿瘤、尿路上皮细胞癌肿瘤、泌尿生殖器癌肿瘤、宫颈癌肿瘤、子宫内膜癌肿瘤、阴茎癌肿瘤、甲状腺癌肿瘤或前列腺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、黑色素瘤肿瘤、胶质瘤肿瘤、结肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肉瘤癌肿瘤或鳞状细胞肿瘤或前列腺癌肿瘤。在一个方面，受试者患有肺癌、结肠癌或乳腺癌。
在一个方面，用于在需要其的受试者中增强或诱导免疫应答的方法包括给予至少一种本公开的重组多肽或编码本公开重组多肽的核酸。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:1-8的重组多肽或与SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列或如本文所述的其酸性变体。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9-16的重组多肽或与SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。在优选的方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9的重组多肽。
在一个方面，增强或诱导“免疫应答”可为例如细胞因子释放应答或体液(抗原特异性)免疫应答。待增强的免疫应答例如可为先天免疫应答、局部免疫应答、粘膜免疫应答或全身免疫应答。如本文使用的，术语“增强(enhance)”或“增强(enhancing)”是指强化(加强)现有的免疫应答。术语“诱导”是指免疫应答的启动。
在一个方面，“免疫应答”是指“免疫原性细胞死亡”或“免疫原性凋亡”，其特征为针对由频死细胞表达的抗原的稳健免疫应答(图1)。频死细胞，比如癌细胞，可具有凋亡前损伤相关分子模式(DAMP)信号的增加表达，所述信号包括钙网蛋白(CRT)、HSP70、HSP90或其组合。在优选的方面，细胞具有CRT、HSP70和HSP90中每一种的增加表达。本领域技术人员已知的技术可被用于评价这些细胞表面标志物的表达。例如，可使用标准技术评价细胞表面标志物的表达，所述方法比如流式细胞术，免疫细胞化学(例如用组织特异性或细胞标志物特异性抗体染色)、荧光活化细胞分选(FACS)、磁活化细胞分选(MACS)或本领域已知的其他类似方法。荧光活化细胞分选(FACS)为用于基于颗粒的荧光特性分离颗粒(包括细胞)的众所周知的方法(Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165)。单个颗粒中荧光部分的激光激发产生小电荷，其允许正和负颗粒从混合物中的电磁分离。在一个方面，用独特的荧光标记物来标记细胞表面标志物-特异性抗体或配体。将细胞通过流式细胞仪进行处理，这允许基于细胞结合于所使用抗体的能力的细胞分离。在一个方面，本公开的方法诱导细胞表面(比如癌细胞表面)上的凋亡前HSP70、HSP90或钙网蛋白的表达。
在一个方面，“免疫原性细胞死亡”或“免疫原性凋亡”涉及树突细胞与细胞(比如癌细胞)的相互作用，导致更快速率的内源性树突细胞活化、树突细胞成熟和吞噬作用。树突细胞对凋亡前DAMP信号的识别触发“内源性树突细胞活化”，所述信号包括钙网蛋白(CRT)、HSP70、HSP90或其组合。这导致“树突细胞成熟”，其包括主要组织相容性复合物(MHC)分子从胞内内吞区室至树突细胞表面的重新分布，抗原内化的下调，共刺激分子(包括CD80和CD86)表面表达的增加，细胞骨架重组、趋化因子、细胞因子和蛋白酶的分泌，粘附分子的表面表达和趋化因子受体的表面表达。已暴露于因免疫原性细胞死亡而频死的癌细胞的成熟树突细胞可迁移至淋巴结并诱导大量的肿瘤特异性T淋巴细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)。这触发针对癌细胞的靶向T-细胞介导的应答。“免疫原性细胞死亡”或“免疫原性凋亡”的过程显示于图1中。本领域的技术人员将会意识到，并非所有已知诱导细胞死亡的技术均将必然诱导免疫原性细胞死亡。只有诱导免疫原性细胞死亡的药物将引发有效的内源性树突细胞活化。在一个方面，“免疫应答”是指内源性树突细胞活化、树突细胞成熟或T-细胞介导的应答或其组合。
在一个方面，“凋亡”为用于描述被称为程序性细胞死亡的细胞信号传导级联的术语。对于诱导凋亡的分子，存在各种治疗适应症(例如癌症)。可通过本领域已知且可获得的多种可获得技术中的任何一种来监测凋亡，所述技术包括例如测量DNA的片段化、膜不对称性的改变、凋亡胱天蛋白酶的活化和/或细胞色素C和AIF释放的测定。在一个方面，通过胱天蛋白酶3/7的活化和表达来测量凋亡。
本公开还提供用于在需要其的受试者中治疗、预防或减轻细胞增殖性障碍的至少一种症状的方法。在一个方面，方法为在需要其的受试者中减轻细胞增殖性障碍的至少一种症状。在一个方面，细胞增殖性障碍为癌症。在优选的方面，癌症为肺癌、结肠癌或乳腺癌。
在一个方面，用于在需要其的受试者中治疗、预防或减轻细胞增殖性障碍的至少一种症状的方法包括给予至少一种本公开的重组多肽或编码本公开重组多肽的核酸。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:1-8的重组多肽或与SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列或如本文所述的其酸性变体。在一个方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9-16的重组多肽。在优选的方面，至少一种本公开的重组多肽包含SEQ ID NO:9的重组多肽或与SEQ ID NO:9-16的氨基酸序列中的任何一种具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列。
如本文使用的，“受试者”可为任何哺乳动物，例如人类、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、猪、绵羊、山羊、骆驼。在优选的方面，受试者为人类。
在一个方面，“需要其的受试者”为具有细胞增殖性障碍的受试者，或相对于大多数群体具有发展细胞增殖性障碍的增加风险的受试者。在一个方面，需要其的受试者具有癌前病症。在优选的方面，需要其的受试者具有癌症。
如本文使用的“，治疗”描述为了对抗疾病、病症或障碍的目的而管理和护理患者，并且包括减少或减轻症状或并发症，或者消除疾病、病症或障碍。如本文使用的，“预防”描述停止疾病、病症或障碍的症状或并发症的发作。如本文使用的，“减轻”描述减少疾病、病症或障碍的症状或并发症。
如本文使用的，术语“细胞增殖性障碍”是指其中细胞的未调控或异常的生长，或这两者，可导致不希望的病症或疾病(可为癌性或非癌性)发展的病症。本公开的示例性细胞增殖性障碍涵盖其中细胞分裂不受调控的各种病症。示例性的细胞增殖性障碍包括但不限于赘生物、良性肿瘤、恶性肿瘤、癌前病症、原位肿瘤、包膜肿瘤、转移性肿瘤、液体瘤、实体瘤、免疫肿瘤、血液肿瘤、癌症、癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和快速分裂的细胞。如本文使用的，术语“快速分裂的细胞”被定义为以超过或大于在同一组织内邻近或并置的细胞之中预期或观察到的速率进行分裂的任何细胞。细胞增殖性障碍包括癌前病变(precancer)或癌前病症(precancerous condition)。细胞增殖性障碍包括癌症。优选地，本文提供的方法被用于治疗或减轻癌症的症状。术语“癌症”包括实体瘤以及血液肿瘤和/或恶性肿瘤。“癌前病变细胞”或“癌前细胞”为显现作为癌前病变或癌前病症的细胞增殖性障碍的细胞。“癌细胞(cancer cell)”或“癌细胞(cancerous cell)”为显现作为癌症的细胞增殖性障碍的细胞。任何可再现的测量方式均可被用于鉴定癌细胞或癌前细胞。可通过组织样品(例如活检样品)的组织学分型或分级来鉴定癌细胞或癌前细胞。可通过使用适当的分子标志物来鉴定癌细胞或癌前细胞。
示例性的非癌病症或障碍包括但不限于：类风湿性关节炎；炎症；自身免疫性疾病；淋巴增殖性病症；肢端肥大症；类风湿性脊椎炎；骨关节炎；痛风，其他关节炎病症；败血症；败血症性休克；内毒素休克；革兰氏阴性败血症；中毒性休克综合征；哮喘；成人呼吸窘迫综合征；慢性阻塞性肺疾病；慢性肺部炎症；炎性肠病；克罗恩病；银屑病；湿疹；溃疡性结肠炎；胰腺纤维化；肝纤维化；急性和慢性肾脏疾病；肠易激综合征；胃灼热(pyresis)；再狭窄；脑型疟疾；中风和缺血性损伤；神经创伤；阿尔茨海默病；亨廷顿病；帕金森病；急性和慢性疼痛；过敏性鼻炎；过敏性结膜炎；慢性心力衰竭；急性冠脉综合征；恶病质；疟疾；麻风病；利什曼病；莱姆病；赖特综合征；急性滑膜炎；肌肉变性、黏液囊炎；肌腱炎；腱鞘炎；椎间盘突出、破裂或脱出综合征；骨硬化病；血栓症；再狭窄；硅肺病；肺肉瘤病；骨吸收疾病，比如骨质疏松症；移植物抗宿主反应；多发性硬化；狼疮；纤维肌痛；AIDS和其他病毒性疾病，比如带状疱疹、单纯性疱疹I或II、流感病毒和巨细胞病毒；和糖尿病。
示例性的癌症包括但不限于：肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、肛门直肠癌、肛管癌、阑尾癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、胆道癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、泌尿膀胱癌、骨和关节癌症、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑癌、脑瘤、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视路和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、类癌瘤、胃肠道、神经系统癌症、神经系统淋巴瘤、中枢神经系统癌症、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性障碍、结肠癌、结直肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、淋巴样肿瘤、蕈样真菌病、塞泽里综合征(Seziary Syndrome)、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(eye cancer)、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、眼癌(ocular cancer)、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、肾癌(kidneycancer)、肾癌(renal cancer)、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstram macroglobulinemia)、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌、恶性间皮瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口癌(mouth cancer)、舌癌、多发性内分泌肿瘤综合征、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增殖性障碍、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口癌(oral cancer)、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤文肉瘤家族肿瘤、卡波西肉瘤、子宫癌、子宫肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃(stomach)(胃(gastric))癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管及其他泌尿器官的移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、子宫体癌、阴道癌、外阴癌和威尔姆氏瘤(Wilm’s Tumor)。
“肺癌”为涉及肺细胞的细胞增殖性障碍。在一个方面，肺癌包括影响肺细胞的所有形式的细胞增殖性障碍。在一个方面，肺癌包括肺癌、肺的癌前病变或癌前病症，肺的良性生长或病变，和肺的恶性生长或病变，以及除肺以外的身体组织和器官中的转移性病变。在优选的方面，本公开的方法可被用于治疗肺癌或肺的细胞增殖性障碍。在一个方面，肺癌包括所有形式的肺癌。在另一个方面，肺癌包括恶性肺肿瘤、原位癌、典型类癌瘤和非典型类癌瘤。在另一个方面，肺癌包括小细胞肺癌(“SCLC”)、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、大细胞癌、腺鳞状细胞癌和间皮瘤。在另一个方面，肺癌包括“瘢痕癌”、支气管肺泡癌、巨细胞癌、梭形细胞癌和大细胞神经内分泌癌。在一个方面，肺癌包括0、IA、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB和IV期肺癌。在另一个方面，肺癌包括具有组织和超结构异质性(例如混合细胞类型)的肺肿瘤。
在一个方面，肺癌包括影响肺细胞的所有形式的细胞增殖性障碍。在一个方面，肺的细胞增殖性障碍包括肺癌、肺的癌前病症。在一个方面，肺的细胞增殖性障碍包括肺的增生、化生和发育异常。在另一个方面，肺癌包括石棉诱导的增生、鳞状化生和良性反应性间皮化生。在另一个方面，肺的细胞增殖性障碍包括复层鳞状上皮替代柱状上皮和粘膜发育异常。在另一个方面，暴露于吸入的有害环境剂比如香烟烟雾和石棉的个体可处于发展肺的细胞增殖性障碍的增加风险下。在另一个方面，可能使个体易于发展肺的细胞增殖性障碍的先前肺病包括慢性间质性肺病、坏死性肺病、硬皮病、类风湿性疾病、结节病、间质性肺炎、结核病、反复性肺炎、特发性肺纤维化、肉芽肿、石棉沉着症、纤维化肺泡炎和霍奇金病。
“结肠癌”为涉及结肠细胞的细胞增殖性障碍。在优选的方面，本公开的方法可被用于治疗结肠癌或结肠的细胞增殖性障碍。在一个方面，结肠癌包括所有形式的结肠癌。在另一个方面，结肠癌包括散发性和遗传性结肠癌。在另一个方面，结肠癌包括恶性结肠肿瘤、原位癌、典型类癌瘤和非典型类癌瘤。在另一个方面，结肠癌包括腺癌、鳞状细胞癌和腺鳞状细胞癌。在另一个方面，结肠癌与选自以下的遗传性综合征相关：遗传性非息肉病性结直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、加德纳综合征(Gardner’s syndrome)、波伊茨-耶格综合征(Peutz-Jeghers syndrome)、特科特综合征(Turcot’s syndrome)和青少年息肉病。在另一个方面，结肠癌由选自以下的遗传性综合征引起：遗传性非息肉病性结直肠癌、家族性腺瘤性息肉病、加德纳综合征、波伊茨-耶格综合征、特科特综合征和青少年息肉病。
在一个方面，结肠癌包括影响结肠细胞的所有形式的细胞增殖性障碍。在一个方面，结肠癌包括结肠癌、结肠的癌前病症、结肠的腺瘤性息肉和结肠的异时性病变。在一个方面，结肠癌包括0、I、IIA、IIB、IIC、IIIA、IIIB、IIIC、IVA、IVB和IVC期结肠癌。在一个方面，结肠癌包括腺瘤。在一个方面，结肠癌的特征为结肠的增生、化生或发育异常。在另一个方面，可能使个体易于发展结肠的细胞增殖性障碍的先前结肠疾病包括先前结肠癌。在另一个方面，可能使个体易于发展结肠的细胞增殖性障碍的当前疾病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。在一个方面，结肠的细胞增殖性障碍与选自p53、ras、FAP和DCC的基因中的突变相关。在另一个方面，个体由于存在选自p53、ras、FAP和DCC的基因中的突变而具有发展结肠的细胞增殖性障碍的升高的风险。
“乳腺癌”为涉及乳房细胞的细胞增殖性障碍。在优选的方面，乳腺癌包括影响乳腺细胞的所有形式的细胞增殖性障碍。在一个方面，乳腺癌包括乳腺癌，乳房的癌前病变或癌前病症，乳房的良性生长或病变，和乳房的恶性生长或病变，以及除乳房以外的身体组织和器官中的转移性病变。在另一个方面，乳腺癌包括乳房的增生、化生和发育异常。
在一个方面，乳腺癌为乳房的癌前病症。在一个方面，本公开的方法可被用于治疗乳房的癌前病症。在一个方面，乳房的癌前病症包括乳房的非典型增生、导管原位癌(DCIS)、导管内癌、小叶原位癌(LCIS)、小叶肿瘤以及乳房的0期或0级生长或病变(例如0期或0级乳腺癌或原位癌)。在另一个方面，已经根据如美国癌症联合委员会(American JointCommittee on Cancer)(AJCC)接受的TNM分类方案对乳房的癌前病症进行分期，其中原发性肿瘤(T)已分配为T0或Tis期；和其中区域淋巴结(N)已分配为N0期；和其中远端转移(M)已分配为M0期。
在一个方面，本公开的方法可被用于治疗乳腺癌。在一个方面，乳腺癌包括所有形式的乳腺癌。在一个方面，乳腺癌包括原发性上皮乳腺癌。在另一个方面，乳腺癌包括其中乳房为其他肿瘤比如淋巴瘤、肉瘤或黑色素瘤所累及的癌症。在另一个方面，乳腺癌包括乳腺癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、乳腺未分化癌、乳腺叶状囊肉瘤、乳腺血管肉瘤和乳腺原发性淋巴瘤。在一个方面，乳腺癌包括I、II、IIIA、IIIB、IIIC和IV期乳腺癌。在一个方面，乳腺导管癌包括侵袭癌、以导管内组分为主的原位侵袭癌、炎性乳腺癌和具有选自以下组织类型的乳腺导管癌：粉刺性、粘液性(胶体状)、髓质、伴随淋巴细胞性浸润的髓质、乳头状、硬性和管状。在一个方面，乳腺小叶癌包括以原位组分为主的侵袭性小叶癌、侵袭性小叶癌和浸润性小叶癌。在一个方面，乳腺癌包括佩吉特病(Paget’s disease)、伴随导管内癌的佩吉特病和伴随侵袭性导管癌的佩吉特病。在另一个方面，乳腺癌包括具有组织和超结构异质性(例如混合细胞类型)的乳腺癌。
假设细胞直径为10μm，上皮肿瘤大小为约1x109个细胞/1cm3(Del Monte等人，CellCycle,505-506,2009)。正常细胞直径为5-10μm(Del Monte等人，Cell Cycle,505-506,2009)。肿瘤细胞直径可为～20μm(Del Monte等人，Cell Cycle,505-506,2009；Backman等人，Nature,35-36,2000)。因此，假设细胞直径为20μm，上皮肿瘤大小可为约1.25x108个细胞/1cm3(Del Monte等人，Cell Cycle,505-506,2009)。可使用以下公式计算典型的椭球体体积： /6x(长度)x(宽度)x(高度)(为简单起见，L＝W＝H)。与肿瘤大小相关的细胞数量的示例性计算如表2所示。
表2.根据肿瘤直径的肿瘤细胞数量
在一个方面，治疗癌症导致肿瘤大小的减小。肿瘤大小的减小也可被称为“肿瘤消退”。优选地，治疗之后，肿瘤大小相对于其治疗之前的大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤大小减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；和最优选地，减小大于75％或更多。肿瘤的大小可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，肿瘤的大小可测量为肿瘤的直径。
在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤体积的减小。优选地，治疗之后，肿瘤体积相对于其治疗之前的大小减小5％或更多；更优选地，肿瘤体积减小10％或更多；更优选地，减小20％或更多；更优选地，减小30％或更多；更优选地，减小40％或更多；甚至更优选地，减小50％或更多；和最优选地，减小大于75％或更多。肿瘤体积可通过任何可再现的测量方式来测量。
在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤数量的减少。优选地，治疗之后，肿瘤数量相对于治疗之前的数量减少5％或更多；更优选地，肿瘤数量减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；和最优选地，减少大于75％。肿瘤数量可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，肿瘤的数量可通过对肉眼或指定放大倍数下可见的肿瘤进行计数来测量。在优选的方面，指定放大倍数为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
在另一个方面，治疗癌症导致远离原发性肿瘤部位的其他组织或器官中的转移性病变的数量减少。优选地，治疗之后，转移性病变的数量相对于治疗之前的数量减少5％或更多；更优选地，转移性病变的数量减少10％或更多；更优选地，减少20％或更多；更优选地，减少30％或更多；更优选地，减少40％或更多；甚至更优选地，减少50％或更多；和最优选地，减少大于75％。转移性病变的数量可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，转移性病变的数量可通过对肉眼或指定放大倍数下可见的转移性病变进行计数来测量。在优选的方面，指定放大倍数为2x、3x、4x、5x、10x或50x。
在另一个方面，与仅接受载剂的群体相比较，治疗癌症导致受治疗受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加多于30天；更优选地，多于60天；更优选地，多于90天；和最优选地，多于120天。群体平均存活时间的增加可通过任何可再现的方式来测量。在优选的方面，群体平均存活时间的增加可例如通过针对群体计算开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。在另一个优选的方面，群体平均存活时间的增加还可例如通过针对群体计算完成第一轮用活性化合物的治疗后的平均存活长度来测量。
在另一个方面，与未治疗的受试者群体相比较，治疗癌症导致受治疗受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加多于30天；更优选地，多于60天；更优选地，多于90天；和最优选地，多于120天。群体平均存活时间的增加可通过任何可再现的方式来测量。在优选的方面，群体平均存活时间的增加可例如通过针对群体计算开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。在另一个优选的方面，群体平均存活时间的增加还可例如通过针对群体计算完成第一轮用活性化合物的治疗后的平均存活长度来测量。
在另一个方面，与接受不是本公开重组多肽的疗法的群体相比较，治疗癌症导致受治疗受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加多于30天；更优选地，多于60天；更优选地，多于90天；和最优选地，多于120天。群体平均存活时间的增加可通过任何可再现的方式来测量。在优选的方面，群体平均存活时间的增加可例如通过针对群体计算开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。在另一个优选的方面，群体平均存活时间的增加还可例如通过针对群体计算完成第一轮用活性化合物的治疗后的平均存活长度来测量。
在另一个方面，与仅接受载剂的群体相比较，治疗癌症导致受治疗受试者群体的死亡率降低。在另一个方面，与未治疗的群体相比较，治疗癌症导致受治疗受试者群体的死亡率降低。在进一步的方面，与接受用不是本公开重组多肽的药物的单一疗法的群体相比较，治疗癌症导致受治疗受试者群体的死亡率降低。优选地，死亡率降低多于2％；更优选地，多于5％；更优选地，多于10％；和最优选地，多于25％。在优选的方面，受治疗受试者群体的死亡率降低可通过任何可再现的方式来测量。在另一个优选的方面，群体死亡率的降低可例如通过针对群体计算开始用活性化合物治疗后的每单位时间疾病相关死亡的平均数量来测量。在另一个优选的方面，群体死亡率的降低还可例如通过针对群体计算完成第一轮用活性化合物的治疗后的每单位时间疾病相关死亡的平均数量来测量。
在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤生长速率降低。优选地，治疗之后，肿瘤生长速率相对于治疗之前的数量降低至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低至少10％；更优选地，降低至少20％；更优选地，降低至少30％；更优选地，降低至少40％；更优选地，降低至少50％；甚至更优选地，降低至少50％；和最优选地，降低至少75％。肿瘤生长速率可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，肿瘤生长速率根据每单位时间肿瘤直径的变化来测量。
在另一个方面，治疗癌症导致肿瘤再生长减少。优选地，治疗之后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；和最优选地，小于75％。肿瘤再生长可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，肿瘤再生长例如通过测量治疗后的先前肿瘤缩小之后肿瘤直径的增加来测量。在另一个优选的方面，肿瘤再生长的减少通过治疗已停止之后肿瘤不能再发生来指示。
在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致细胞增殖速率降低。优选地，治疗之后，细胞增殖速率降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；和最优选地，至少75％。细胞增殖速率可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，细胞增殖速率例如通过测量每单位时间组织样品中分裂细胞的数量来测量。
在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致增殖细胞的比例降低。优选地，治疗之后，增殖细胞的比例降低至少5％；更优选地，至少10％；更优选地，至少20％；更优选地，至少30％；更优选地，至少40％；更优选地，至少50％；甚至更优选地，至少50％；和最优选地，至少75％。增殖细胞的比例可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，增殖细胞的比例例如通过量化组织样品中分裂细胞的数量相对于非分裂细胞的数量来测量。在另一个优选的方面，增殖细胞的比例相当于有丝分裂指数。
在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致细胞增殖的面积或区域的大小减小。优选地，治疗之后，细胞增殖的面积或区域的大小相对于其治疗之前的大小减小至少5％；更优选地，减小至少10％；更优选地，减小至少20％；更优选地，减小至少30％；更优选地，减小至少40％；更优选地，减小至少50％；甚至更优选地，减小至少50％；和最优选地，减小至少75％。细胞增殖的面积或区域的大小可通过任何可再现的测量方式来测量。在优选的方面，细胞增殖的面积或区域的大小可测量为细胞增殖的面积或区域的直径或宽度。
在另一个方面，治疗、预防或减轻癌症导致具有异常外观或形态的细胞数量或比例减少。优选地，治疗之后，具有异常形态的细胞数量相对于其治疗之前的大小减少至少5％；更优选地，减少至少10％；更优选地，减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；甚至更优选地，减少至少50％；和最优选地，减少至少75％。异常细胞外观或形态可通过任何可再现的测量方式来测量。在一个方面，异常细胞形态通过例如使用倒置组织培养显微镜的显微术来测量。在一个方面，异常细胞形态采取核多态性的形式。
在一个方面，治疗癌症或细胞增殖性障障导致细胞死亡，并且优选地，细胞死亡导致群体中的细胞数量减少至少10％。更优选地，细胞死亡意指减少至少20％；更优选地，减少至少30％；更优选地，减少至少40％；更优选地，减少至少50％；最优选地，减少至少75％。群体中的细胞数量可通过任何可再现的方式来测量。在一个方面，群体中的细胞数量通过荧光活化细胞分选(FACS)来测量。在另一个方面，群体中的细胞数量通过免疫荧光显微术来测量。在另一个方面，群体中的细胞数量通过光学显微术来测量。在另一个方面，测量细胞死亡的方法如Li等人，(2003)Proc Natl Acad Sci U S A.100(5):2674-8中所示。在优选的方面，细胞死亡通过免疫原性细胞死亡发生。
如本文使用的，术语“受试者”、或“个体”或“患者”是指患有疾病或障碍或者疑似患有疾病或障碍的个体等。受试者、个体或患者可在本公开中互换使用，并且涵盖哺乳动物和非哺乳动物。受试者为儿科患者或成人患者。
哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人类、非人灵长类动物比如黑猩猩以及其他猿类和猴物种；农场动物，比如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，比如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，比如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本文提供的方法和组合物的一些方面，哺乳动物为人类。
本公开的治疗方法涉及体内给予受试者重组多肽。重组多肽可给予通过任何合适方法给予的受试者，可全身地(例如经口、静脉内)或局部地(例如腹膜内、鞘内、脑室内、直接注射到疾病或障碍发生的组织或器官中)给予。优选地，重组多肽静脉内给予。
重组多肽以单剂量或多剂量进行给予，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30或更多剂量给予。在一些方面，第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和/或第六次输注中重组多肽的有效量包含约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg或约35mg/kg。在一些方面，第一次输注和第二次输注的总剂量不多于40mg/kg。在一些方面，第三次输注和第四次输注的总剂量不多于40mg/kg。在一些方面，第五次输注和第六次输注的总剂量不多于40mg/kg。在一些方面，第一次输注、第三次输注和/或第五次输注的剂量为约20mg/kg-约22mg/kg。在一些方面，第二次输注、第四次输注和/或第六次输注的剂量为约14mg/kg-约20mg/kg。在一些方面，第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和/或第六次输注中重组多肽的有效量包含约10mg/kg-约30mg/kg。在优选的方面，第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和/或第六次输注中重组多肽的有效量包含约20mg/kg。
如本文使用的，术语“输注(infusion)”或“输注(infusions)”是指通过针或导管给予任何药剂或化合物。输注(infusion)或输注(infusions)可包括将任何药剂或化合物注射到静脉或组织中，例如给予可为静脉内、皮下、肌内或硬膜外。
本公开的治疗方法涉及体内给予受试者IL-10抑制剂。IL-10抑制剂可给予通过任何合适的方法给予的受试者，可全身地(例如经口、静脉内)或局部地(例如腹膜内、鞘内、脑室内、直接注射到疾病或障碍发生的组织或器官中)给予。优选地，IL-10抑制剂静脉内给予。
在一个实施方案中，重组多肽、重组多肽剂量和方案包括本领域已知的那些，比如美国专利号10,150,801、10,323,071、10,351,607、10,301,364和10,370,421；美国专利申请号16/551,659和16/443,517号；和PCT申请号PCT/SG2019/050420和PCT/SG2017/050648中所述的那些，其每一项均通过参考以其全部结合至本文中。
IL-10抑制剂可为干扰素γ(IFNg)、IFNg拟似物、IFNg激动剂或其组合。优选地，减少IL-10的药剂为干扰素γ(IFNg)。在一些方面，IFNg以约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100或更多μg的剂量进行给予。在一些方面，IFNg以约50μg-约100μg的剂量进行给予。在优选的方面，IFNg以约70μg的剂量进行给予。
本公开的治疗方法涉及体内给予受试者免疫细胞生长因子。免疫细胞生长因子可给予通过任何合适的方法给予的受试者，可全身地(例如经口、静脉内)或局部地(例如腹膜内、鞘内、脑室内、直接注射到疾病或障碍发生的组织或器官中)给予。优选地，免疫细胞生长因子静脉内给予。
在一些方面，至少一种免疫细胞生长因子为FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些方面，至少一种免疫细胞生长因子为FLT3L。在一些方面，FLT3L以约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、10μg/kg、约11μg/kg、约12μg/kg、约13μg/kg、约14μg/kg、约15μg/kg、约16μg/kg、约17μg/kg、约18μg/kg、约19μg/kg、20μg/kg的量进行给予。在一些方面，FLT3L呈约4μg/kg-约13μg/kg的量。在一些方面，FLT3L呈约7μg/kg的量。
本公开的治疗方法涉及体内给予受试者TNFa抑制剂。TNFa抑制剂可给予通过任何合适的方法给予的受试者，可全身地(例如经口、静脉内)或局部地(例如腹膜内、鞘内、脑室内、直接注射到疾病或障碍发生的组织或器官中)给予。优选地，TNFa抑制剂皮下给予。
在一些方面，TNFa抑制剂为肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂。在一些方面，TNFa抑制剂为TNFaR。在一些方面，TNFa抑制剂为TNFaR、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、培塞利珠单抗或戈利木单抗。在优选的方面，TNFaR为依那西普。在一些方面，TNFaR以约1mg、约2mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg或约10mg的剂量进行给予。在一些方面，TNFaR以约4mg-约6mg的剂量进行给予。在优选的方面，TNFaR以约5mg的剂量进行给予。
在一个实施方案中，如本文公开的治疗癌症受试者的方法包括给予免疫治疗剂。在一个实施方案中，免疫治疗剂为免疫细胞，比如NK细胞或包含工程化嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的T细胞。在一个实施方案中，免疫治疗剂为重组多肽或编码重组多肽的核酸。在一个实施方案中，免疫治疗剂为抗体、检查点抑制剂、干扰素、白细胞介素、溶瘤病毒、癌症疫苗或其组合。在一个实施方案中，免疫治疗剂的给予并不不引起可能在受试者体内发生的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。在一个实施方案中，免疫治疗剂的给予引起可能在受试者体内发生的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。在一个实施方案中，CRS、sCRS或细胞因子风暴作为免疫治疗剂给予的结果发生。在一个实施方案中，“细胞因子级联”或“高细胞因子血症”为更严重形式的细胞因子释放综合征。在一个实施方案中，“高细胞因子血症”为持续3天的细胞因子风暴。
在一个实施方案中，严重细胞因子释放综合征(sCRS)的特征为几种炎性细胞因子水平升高、多器官功能障碍和发热。在一个实施方案中，在细胞因子释放综合征中测量的细胞因子为IL-6。在一个实施方案中，发热为短暂的。在一个实施方案中，发热持续至少一天或多天的持续时间。在一个实施方案中，发热持续3天的持续时间。在一个实施方案中，发热为至少约38℃。在一个实施方案中，发热的温度为至少约38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。在一个实施方案中，来自sCRS患者的血液中C-反应蛋白(CRP)水平为至少约170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189或190mg/L。在优选的实施方案中，CRP水平为至少约180mg/mL。在一个实施方案中，单日事件可能不会导致sCRS。
在一个实施方案中，两天的细胞因子风暴在第三天发展成sCRS。
在一个实施方案中，高细胞因子血症的特征为几种炎性细胞因子水平升高和发热。在一个实施方案中，在细胞因子释放综合征中测量的细胞因子为IL-6。在一个实施方案中，发热为短暂的。在一个实施方案中，发热发生至少一天或多天的持续时间。在一个实施方案中，发热为至少约40℃。在一个实施方案中，发热的温度为至少约38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。在一个实施方案中，来自高细胞因子血症患者的血液中C-反应蛋白(CRP)水平为至少约191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230mg/L。在优选的实施方案中，CRP水平为约200-约220mg/mL。
在一个实施方案中，危及生命的多器官功能障碍和不良事件的特征为严重细胞因子风暴。在一个实施方案中，在细胞因子释放综合征中测量的细胞因子为IL-6。在一个实施方案中，发热为至少约40℃。在一个实施方案中，发热的温度为至少约38℃、39℃、40℃、41℃或42℃。在一个实施方案中，发热持续至少一天或多天的持续时间。在一个实施方案中，发热持续3天的持续时间。在一个实施方案中，来自特征为严重细胞因子风暴的危及生命的不良事件的受试者的血液中C-反应蛋白(CRP)水平为至少约220mg/mL。在一个实施方案中，来自特征为严重细胞因子风暴的危及生命的多器官功能障碍的受试者的血液中C-反应蛋白(CRP)水平为至少约220mg/mL。
在一个实施方案中，治疗癌症受试者的方法可包括用于减少细胞因子释放的另外药剂。在一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂为皮质类固醇。在一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括凋亡细胞或包含所述凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括碲基化合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和碲基化合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫调节剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和免疫调节剂。
技术人员将会意识到，降低毒性细胞因子释放或毒性细胞因子水平包括降低或抑制受试者体内毒性细胞因子的产生水平，或者抑制或降低受试者体内细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，在CRS或细胞因子风暴期间，毒性细胞因子水平降低。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子的产生水平包括治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子的产生水平包括预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子的产生水平包括减轻CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子的产生水平包括改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，毒性细胞因子包括促炎细胞因子。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包括IL-6。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包括IL-1β。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包括TNF-a。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包括IL-6、IL-1β或TNF-a或其任何组合。
对于用T细胞免疫疗法治疗的患者，经常观察到细胞因子释放综合征(CRS)(尤其是细胞因子IL6、IFNg和TNFa)(Suntharalingam等人，N.Engl.J.Med.,1018-1028,2006；Turtle等人，J.Clin.Invest.,2123-2138,2016)。此外，细胞因子释放综合征的特征为体温过高(≥38℃)(来自IL6和/或IFNg)(Davila等人，Sci.Transl.Med.,1-10,2014)和/或体温过低(≤35℃)(来自TNFa)(Brady等人，Clin.Transl.Immunology,1-7,2014；Alegre等人，Eur.J.Immunol,707-710,1990)。
在一个实施方案中，调整给予受试者的免疫治疗剂的给药时间表和免疫治疗剂的量，以防止危及生命的不良影响、CRS、细胞因子风暴、sCRS和/或高细胞因子血症。在一个实施方案中，使用受试者体内的C-反应蛋白(CRP)水平来确定待提供的免疫治疗剂的量。在一个实施方案中，第一量的免疫治疗剂并不在受试者体内诱导危及生命的不良事件。在一个实施方案中，第一量的免疫治疗剂以有效获得来自受试者的血液中C-反应蛋白(CRP)水平为至少约170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229或230mg/L的量提供。在优选的实施方案中，CRP水平为约200-约220mg/mL。在一个实施方案中，第一量的免疫治疗剂诱导约38℃、39℃、40℃、41℃或42℃的短暂发热。在一个实施方案中，免疫治疗剂诱导1-2小时持续时间的短暂发热。在一个实施方案中，免疫治疗剂诱导1-5小时持续时间的短暂发热。
在一个实施方案中，第二量的免疫治疗剂并不诱导高细胞因子血症。在一个实施方案中，第二量的免疫治疗剂并不在受试者体内诱导危及生命的不良事件。在一个实施方案中，第二量的免疫治疗剂以有效获得来自受试者的血液中C-反应蛋白(CRP)水平为至少约130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179或180mg/mL的量提供。在优选的实施方案中，CRP水平为约159-约169mg/mL。在一个实施方案中，第二量的免疫治疗剂并不诱导高细胞因子血症，也不诱导特征为细胞因子风暴的危及生命的多器官功能障碍和不良事件。
在一个实施方案中，细胞因子释放综合征的特征为受试者体内几种炎性细胞因子水平升高和不良身体反应，比如低血压、高烧和颤抖。在一个实施方案中，炎性细胞因子包括IL-6、IL-Ιβ和TNF-a。在另一个实施方案中，CRS的特征为IL-6、IL-1β或TNF-a或其任何组合的水平升高。在另一个实施方案中，CRS的特征为IL-8或IL-13或其任何组合的水平升高。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为TNFα、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IL-5、分形趋化因子(fracktaline)或其组合或其子集的增加。在仍然另一个实施方案中，IL-6包括CRS或细胞因子风暴的标志物。在另一个实施方案中，IFN-γ包括CRS或细胞因子风暴的标志物。在另一个实施方案中，具有较大肿瘤负担的患者具有较高的细胞因子释放综合征的发生率和严重程度。
在另一个实施方案中，30个人和小鼠体内CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子可包括以下表1和2中列出的细胞因子的任何组合。
表3：人类和/或小鼠体内CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子组
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在一个实施方案中，表3的细胞因子Flt-3L、分形趋化因子、GM-CSF、IFN-γ、IL-Iβ、IL-2、IL-2Ra、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12和IL-13被认为在CRS或细胞因子风暴中具有重要意义。在另一个实施方案中，表3的IFN-a、5IFN-β、IL-1和IL-1Ra似乎在CRS或细胞因子风暴中是重要的。在另一个实施方案中，M-CSF具有未知的重要性。在另一个实施方案中，表3中列出的任何细胞因子或其组合可被用作CRS或细胞因子风暴的标志物。
表4：人类和/或小鼠体内CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子组
在一个实施方案中，表2的IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IP-10、MCP-1、MIP1a、5ΜΙΡ-Ιβ和TNF-a被认为在CRS或细胞因子风暴中具有重要意义。在另一个实施方案中，表4的IL-27、MCP-3、PGE2、RANTES、TGF-β、TNF-aR1和MIG似乎在CRS或细胞因子风暴中是重要的。在另一个实施方案中，IL-23和IL-25具有未知的重要性。在另一个实施方案中，表4中列出的任何细胞因子或其组合可被用作CRS或细胞因子风暴的标志物。
技术人员将会意识到，术语“细胞因子”可涵盖细胞因子(例如干扰素γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α)、趋化因子(例如MIP1α、MIP1β、RANTES)和其他可溶性炎症介质，比如活性氧和一氧化氮。
在一个实施方案中，特定细胞因子的释放增加，无论所述细胞因子是具有重要意义、重要还是具有未知的重要性，并不先验地(a prion)意指特定细胞因子为细胞因子风暴的一部分。在一个实施方案中，至少一种细胞因子的增加不是细胞因子风暴或CRS的结果。在另一个实施方案中，CAR-T细胞可为特定的一种细胞因子或一组细胞因子水平增加的来源。
在另一个实施方案中，细胞因子释放综合征的特征为任何或所有以下症状：发热伴或不伴有寒战、不适、疲劳、厌食、肌痛、关节痛、恶心、呕吐、头痛、皮疹、恶心、呕吐、腹泻、呼吸急促、低氧血症、心血管性心动过速、脉压增宽、低血压、心输出量增加(早期)、潜在心输出量减少(晚期)、D-二聚体升高、低纤维蛋白原血症伴或不伴有出血、氮质血症、肝转氨酶升高、高胆红素血症、头痛、精神状态改变、混乱、谵妄、唤词困难或坦率失语症(wordfinding difficulty or frank aphasia)、幻觉、震颤、辨距不良、步态改变、抽搐发作(seizure)。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为IL-2释放和淋巴增殖。在一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为从免疫治疗剂释放的细胞因子增加。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为由CAR-T细胞释放的细胞因子增加。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为由除CAR-T细胞以外的细胞释放的细胞因子增加。
在另一个实施方案中，细胞因子风暴导致潜在危及生命的并发症，包括心脏功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、神经毒性、肾和/或肝衰竭以及弥散性血管内凝血。
技术人员将会意识到，估计细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的特征会在CRS或细胞因子风暴触发后几天至几周发生。在一个实施方案中，免疫治疗剂为CRS或细胞因子风暴的触发因。在一个实施方案中，CAR-T细胞为CRS或细胞因子风暴的触发因素。在另一个实施方案中，CRS或细胞因子风暴的触发因素不是CAR-T细胞。
在一个实施方案中，细胞因子水平或浓度的测量，作为细胞因子风暴的指标，可被表示为细胞因子水平或浓度的倍数增加、百分比(％)增加、净增加或变化率。在另一个实施方案中，高于某一水平或浓度的绝对细胞因子水平或浓度可为受试者经受或即将经历细胞因子风暴的指示。在另一个实施方案中，处于某一水平或浓度的绝对细胞因子水平或浓度，例如在未经受CAR-T细胞疗法的对照受试者中通常发现的水平或浓度，可为用于抑制或减少经受CAR-T细胞的受试者中细胞因子风暴发生率的方法的指示。
技术人员将会意识到，术语“细胞因子水平”可涵盖浓度的测量、倍数变化的测量、百分比(％)变化的测量或变化率的测量。进一步地，用于测量血液、唾液、血清、尿液和血浆中细胞因子的方法为本领域众所周知的。
在一个实施方案中，尽管认识到细胞因子风暴与几种炎性细胞因子的升高相关，但可使用IL-6水平作为细胞因子风暴的常用量度和/或细胞因子风暴治疗有效性的常用量度。技术人员将会意识到，可使用其他细胞因子作为细胞因子风暴的标志物，例如可使用TNF-a、IB-la、IL-6、IL-8、IL-13或INF-γ中的任何一种或以上任何组合作为CRS或细胞因子风暴的标志物。进一步地，用于测量细胞因子的测定方法为本领域众所周知的。技术人员将会意识到，影响细胞因子风暴的方法可类似地影响细胞因子释放综合征(CRS)。
在一个实施方案中，将细胞因子释放综合征分级。在另一个实施方案中，1级描述其中症状不危及生命并且仅需要对症治疗的细胞因子释放综合征，例如发热、恶心、疲劳、头痛、肌痛、不适。在另一个实施方案中，2级症状需要适度干预并对其做出反应，所述干预比如氧气、液体或用于低血压的血管加压剂。在另一个实施方案中，3级症状需要积极干预并对其作出反应。在另一个实施方案中，4级症状为危及生命的症状并需要呼吸机，且患者显示器官毒性。
在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为IL-6和干扰素γ释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为IL-6释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为干扰素γ释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为表1和2中列出的任何细胞因子或其组合的释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征为本领域已知的任何细胞因子或其组合的释放。
在一个实施方案中，在开始输注免疫治疗剂之后数分钟至数小时，症状开始发作。在另一个实施方案中，症状与峰值细胞因子水平相符合。
在一个实施方案中，治疗癌症的方法包括给予免疫治疗剂。在一个实施方案中，免疫治疗剂为CAR-T细胞。在一个实施方案中，在经受CAR-T细胞癌症疗法的受试者中抑制或减少细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括给予另外的药剂。在另一个实施方案中，另外的药剂可助于CAR-T细胞疗法。在另一个实施方案中，另外的药剂可助于抑制或减少CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，另外的药剂可助于治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，另外的药剂可助于预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，另外的药剂可助于改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，另外的药剂可助于减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括凋亡细胞或包含所述凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括碲基化合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和碲基化合物。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫调节剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和免疫调节剂。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括Treg细胞。在另一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的另外药剂包括免疫治疗剂和Treg细胞。
在另一个实施方案中，如本文公开的方法利用CAR-T细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂比如伊匹木单抗(Ipilimumab)的组合疗法。在另一个实施方案中，CTLA-4为助于维持自身耐受的有效的T细胞活化抑制剂。在另一个实施方案中，给予抗CTLA-4阻断剂产生T细胞活化的净效应，所述阻断剂在另一个实施方案中为抗体。在另一个实施方案中，如本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、CAR-T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的组合疗法。
在另一个实施方案中，由CAR-T细胞或NK细胞给予产生的可通过如本文公开的组合物和方法进行治疗、预防、抑制、改善、降低发生率或减轻的其他毒性包括B细胞发育不全(B cell aplasia)或肿瘤溶解综合征(TLS)。
在一个实施方案中，在经受CAR-T细胞癌症疗法的受试者中抑制或减少细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法不影响CAR-T细胞疗法的效力。在另一个实施方案中，在经受CAR-T细胞癌症疗法的受试者中抑制或减少CRS或细胞因子风暴的发生率的方法确实使CAR-T细胞疗法的效力降低多于约5％。在另一个实施方案中，在经受CAR-T细胞癌症疗法的受试者中抑制或减少CRS或细胞因子风暴的发生率的方法确实使CAR-T细胞疗法的效力降低多于约10％。在另一个实施方案中，在经受CAR-T细胞癌症疗法的受试者中抑制或减少CRS或细胞因子风暴的发生率的方法确实使CAR-T细胞疗法的效力降低多于约15％。在另一个实施方案中，在经受CAR-T细胞癌症疗法的受试者中抑制或减少CRS或细胞因子风暴的发生率的方法确实使CAR-T细胞疗法的效力降低多于约20％。
可使用任何适当的量化细胞毒性的方法来确定经修饰以表达CAR的免疫细胞中的活性是否保持基本上不变。例如，细胞毒性可使用基于细胞培养的测定来进行量化，所述测定比如实施例中描述的细胞毒性测定。细胞毒性测定可采用优先染色死亡细胞DNA的染料。在其他情况下，可使用测量细胞群体中活细胞和死亡细胞的相对数量的荧光和发光测定。对于此类测定，蛋白酶活性充当细胞活力和细胞毒性的标志物，并且标记的细胞渗透肽产生与样品中的活细胞数量成比例的荧光信号。用于各种细胞毒性测定的试剂盒可从制造商比如Promega和Life Technologies市售获得。在另一个实施方案中，细胞毒性的测量可为定性的。在另一个实施方案中，细胞毒性的测量可为定量的。在进一步的实施方案中，细胞毒性的测量可与细胞毒性细胞因子的表达变化有关。
在一个方面，本文公开的治疗癌症受试者的方法导致识别肿瘤上特定抗原的CD8+T细胞增加。幼稚CD8+T细胞识别特定抗原的前体频率(概率)为每百万细胞约1-10个(Lammermann等人，Immunological Reviews,26-43,2008)。人类中的总幼稚CD8+T细胞为约4x1010个细胞(Boon等人，Annu.Rev.Immunol.,175-208,2006)。小鼠(C57BL/6)中的总幼稚CD8 T细胞为约3x107个细胞(Blattman等人，J.Exp.Med.,657-664,2002)。因此，假设人类幼稚CD8+T细胞识别人类肿瘤特异性抗原的前体频率为每百万细胞约～5个，那么识别肿瘤特异性抗原的人类幼稚CD8+T细胞数量为约2x105个细胞(4x1010 x 5/106)。
启动之后CD8+T细胞扩增约≥10000倍(50000x:LCMV/LM感染)(Blattman等人，J.Exp.Med.,657-664,2002；Haring等人，Immunity,19-29,2006；Butler等人，CellularMicrobiology,925-933,2011；Arens等人，Immunol.Rev.,190-205,2010)。一个CD8 T细胞杀死2-3个目标肿瘤细胞(Wiedemann等人，PNAS,10985-10990,2006；McGavern等人，NatureImmunol,918-925,2002)。
在一个方面，本文公开的治疗癌症受试者的方法导致识别肿瘤上特定抗原的CD8+T细胞增加。在一些实施方案中，T细胞为中央记忆性T细胞(CD8+CD44+CD127+KLRG1-CD62L+)、效应记忆性T细胞(CD8+CD44+CD127+KLRG1+CD62L-)和效应T细胞(CD8+CD44+CD127-KLRG1+CD62L-)。在优选的实施方案中，T细胞为中央记忆性T细胞。
在一些方面，用本公开的方法处理之后，识别肿瘤上特定抗原的CD8+T细胞的百分比相对于处理之前增加1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约10.5倍、约11倍、约11.5倍、约12倍、约12.5倍、约13倍、约13.5倍、约14倍、约14.5倍、约15倍、约15.5倍、约16倍、约16.5倍、约17倍、约17.5倍、约18倍、约18.5倍、约19倍、约19.5倍或约20倍。
在一些方面，用本公开的方法处理之后，中央记忆性T细胞(CD8+CD44+CD127+KLRG1-CD62L+)的百分比相对于处理之前增加1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约10.5倍、约11倍、约11.5倍、约12倍、约12.5倍、约13倍、约13.5倍、约14倍、约14.5倍、约15倍、约15.5倍、约16倍、约16.5倍、约17倍、约17.5倍、约18倍、约18.5倍、约19倍、约19.5倍或约20倍。
在一些方面，用本公开的方法处理之后，CD8+CD44+CD127+KLRG1+CD62L-(效应记忆性细胞)的百分比相对于治疗之前增加1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约10.5倍、约11倍、约11.5倍、约12倍、约12.5倍、约13倍、约13.5倍、约14倍、约14.5倍、约15倍、约15.5倍、约16倍、约16.5倍、约17倍、约17.5倍、约18倍、约18.5倍、约19倍、约19.5倍或约20倍。
在一些方面，用本公开的方法处理之后，CD8+CD44+CD127-KLRG1+CD62L-(效应)的百分比相对于治疗之前增加1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约10.5倍、约11倍、约11.5倍、约12倍、约12.5倍、约13倍、约13.5倍、约14倍、约14.5倍、约15倍、约15.5倍、约16倍、约16.5倍、约17倍、约17.5倍、约18倍、约18.5倍、约19倍、约19.5倍或约20倍。
在一个实施方案中，如本文公开的方法包括在克服同种异体供体细胞排异中有用的另外步骤。在一个实施方案中，方法包括在给予CAR-T细胞之前的完全或部分淋巴耗竭的步骤，所述细胞在一个实施方案中为同种异体CAR-T细胞。在另一个实施方案中，调整淋巴耗竭，使得其延迟移植物抗宿主反应一段时间，所述一段时间足以允许所述同种异体T细胞攻击它们所指向的肿瘤，但程度不足以需要通过骨髓移植拯救宿主免疫系统。在另一个实施方案中，延缓同种异体T细胞从淋巴结转移的药剂，比如2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇(FTY720)、5-[4-苯基-5-(三氟甲基)噻吩-2-基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]l,2,4-二唑(SEW2871)、3-(2-(-己基苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)丙酸(W123)、2-铵基-4-(2-氯-4-(3-苯氧基苯基硫代)苯基)-2-(羟基甲基)丁基磷酸氢盐(KRP-203磷酸盐)或本领域已知的其他药剂，可被用作如本文公开的组合物和方法的一部分，以允许使用具有效力且缺乏移植物抗宿主病起始的同种异体CAR-T细胞。在一个实施方案中，同种异体T细胞的MHC表达被沉默以减少同种异体细胞的排异。在另一个实施方案中，凋亡细胞可防止同种异体细胞的排异。
在一个实施方案中，如本文公开的治疗癌症受试者的方法包括给予免疫治疗剂。在一个实施方案中，免疫治疗剂为CAR-T细胞。在一个实施方案中，CAR-T细胞与受试者为异源的。在一个实施方案中，CAR-T细胞源于一个或多个供体。在一个实施方案中，CAR-T细胞源于一个或多个骨髓供体。在另一个实施方案中，CAR-T细胞源于一个或多个血库捐赠物。在一个实施方案中，供体为匹配供体。在一个实施方案中，CAR-T细胞为通用同种异体CAR-T细胞。在另一个实施方案中，CAR-T细胞为同基因CAR-T细胞。在另一个实施方案中，CAR-T细胞来自不匹配的第三方供体。在另一个实施方案中，CAR-T细胞来自汇集的第三方供体T细胞。在一个实施方案中，供体为骨髓供体。在另一个实施方案中，供体为血库供体。在一个实施方案中，如本文公开的组合物和方法的CAR-T细胞包含一种或多种MHC非限制性肿瘤定向的嵌合受体。在一个实施方案中，非自体T细胞可根据本领域已知的方案工程化或给予以防止或最小化自身免疫反应，比如美国专利申请号20130156794中所述的，所述专利申请通过参考以其全部结合至本文中。
在另一个实施方案中，CAR-T细胞为受试者自体的。在一个实施方案中，使用患者自己的细胞。在该实施方案中，如果使用患者自己的细胞，则在免疫治疗剂之后给予CAR-T细胞疗法。
根据一些实施方案，CAR-T细胞被全身地给予受试者。在另一个实施方案中，给予为经由静脉内途径。或者，CAR-T细胞可根据各种其他途径给予受试者，所述其他途径包括但不限于肠胃外、腹膜内、关节内、肌内和皮下途径。如本文公开的，每种可能性代表单独的实施方案。
根据一些实施方案，CAR-T细胞和减少细胞因子风暴的另外药剂被全身地给予受试者。在另一个实施方案中，给予为经由静脉内途径。或者，CAR-T细胞和减少细胞因子风暴的另外药剂可根据各种其他途径给予受试者，所述其他途径包括但不限于肠胃外、腹膜内、关节内、肌内和皮下途径。如本文公开的，每种可能性代表单独的实施方案。
在一个实施方案中，制剂以局部而非全身方式给予，例如经由将制剂直接注射到患者身体的特定区域。在另一个实施方案中，特定区域包括肿瘤或癌症。
在另一个实施方案中，给予受试者悬浮于合适的生理缓冲剂(比如但不限于盐水溶液、PBS、HBSS等)中的免疫治疗剂。另外，悬浮介质可进一步包含助于维持细胞活力的补充剂。在另一个实施方案中，给予受试者悬浮于合适的生理缓冲剂(比如但不限于盐水溶液、PBS、HBSS等)中的另外药剂。
根据一些实施方案，药用组合物静脉内给予。根据另一个实施方案，药用组合物以单剂量进行给予。根据备选实施方案，药用组合物以多剂量进行给予。根据另一个实施方案，药用组合物以2个剂量进行给予。根据另一个实施方案，药用组合物以3个剂量进行给予。根据另一个实施方案，药用组合物以4个剂量进行给予。根据另一个实施方案，药用组合物以5个或更多个剂量进行给予。根据一些实施方案，配制药用组合物用于静脉内注射。
在一个实施方案中，任何适当的向受试者提供经修饰的表达CAR的免疫细胞的方法可被用于本文描述的方法。在一个实施方案中，用于向受试者提供细胞的方法包括造血细胞移植(HCT)、向癌症患者输注供体来源的NK细胞或其组合。
本公开提供用重组多肽(例如重组多肽CRYA_1B)、受试者体内的IL-10抑制剂(例如IFNg)、免疫细胞生长因子(例如FLT3L)、TNFa抑制剂(例如TNFaR)和任选地免疫治疗剂(例如抗PD1抗体)治疗患有癌症的受试者的给药方案。重组多肽、IL-10抑制剂、免疫细胞生长因子、TNFa抑制剂和免疫治疗剂的剂量在本文中同上所述。
在一些方面，重组多肽静脉内给予。在一些方面，重组多肽皮下给予。在一些方面，受试者体内的IL-10抑制剂静脉内给予。在一些方面，受试者体内的IL-10抑制剂皮下给予。在一些方面，免疫细胞生长因子静脉内给予。在一些方面，免疫细胞生长因子皮下给予。在一些方面，TNFa抑制剂静脉内给予。在一些方面，TNFa抑制剂皮下给予。
在一些方面，免疫治疗剂作为多次输注给予。在一些方面，免疫治疗剂给予至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次或至少14次。在一些方面，免疫治疗剂给予一次。
在一些方面，免疫治疗剂的第一次输注为在启动性治疗周期的重组多肽的第六次输注之后和在加强性治疗周期中重组多肽的第一次输注之前给予。在一些方面，免疫治疗剂的第一次输注在启动性治疗周期中重组多肽的第一次输注之后至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天进行给予。在一个方面，免疫治疗剂在启动性治疗周期中重组多肽的第一次输注之后约10天-约14天进行给予。在优选的方面，免疫治疗剂在启动性治疗周期中重组多肽的第一次输注之后约12天进行给予。
在一个方面，剂量方案包括治疗周期，其包括给予免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂和重组多肽。在一些方面，治疗周期增加受试者体内T细胞的数量。在一些方面，治疗周期增加识别肿瘤相关抗原的T细胞的数量。在一些方面，治疗周期增加受试者体内CD8+中央记忆性T细胞的数量。在一些方面，治疗周期增加CD8+效应记忆性细胞的数量。在一些方面，治疗周期增加CD8+效应细胞的数量。在一个方面，治疗周期为启动性治疗周期。在一些方面，治疗周期为加强性周期。
在一个方面，剂量方案包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个启动性治疗周期。在优选的方面，剂量方案包括1个启动性治疗周期。在一个方面，剂量方案包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个加强性治疗周期。在一个方面，剂量方案包括不多于5个加强性治疗周期。在优选的方面，剂量方案包括1个启动性治疗周期和至少1个加强性周期。在优选的方面，剂量方案包括1个启动性周期和不多于5个加强性治疗周期。
在一个方面，免疫细胞生长因子在IL-10抑制剂或TNFa抑制剂之前至少约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约25小时、约26小时、约27小时、约28小时、约29小时或约30小时进行给予。在优选的方面，免疫细胞生长因子在IL-10抑制剂或TNFa抑制剂之前至少约24小时进行给予。
在一个方面，免疫细胞生长因子给予每天至少一次，持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天。在一个方面，免疫细胞生长因子给予每天一次，持续约7天-约12天。在优选的方面，免疫细胞生长因子给予每天一次，持续约7天。
在一个方面，IL-10抑制剂和TNFa抑制剂同时给予。在一个方面，IL-10抑制剂和TNFa抑制剂序贯给予。在一个方面，IL-10抑制剂在TNFa抑制剂之前给予。在一个方面，IL-10抑制剂在TNFa抑制剂之后给予。
在一个方面，重组多肽作为多次输注给予。在一些实施方案中，第二次输注在第一次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天进行给予。在优选的实施方案中，第二次输注在第一次输注之后至少1天进行给予。在一个方面，第三次输注在第一次输注之后至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天进行给予。在优选的方面，第三次输注在第一次输注之后至少4天进行给予。在一个方面，第四次输注在第一次输注之后至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天、至少8天、至少9天或至少10天进行给予。在优选的方面，第四次输注在第一次输注之后至少5天进行给予。在一个方面，第五次输注在第一次输注之后至少6天或至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天或至少13天进行给予。在优选的方面，第五次输注在第一次输注之后至少8天进行给予。在一个方面，第六次输注在第一次输注之后至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天进行给予。
在一个方面，TNFa抑制剂和重组多肽同时给予。在一个方面，TNFa抑制剂和重组多肽序贯给予。在一个方面，TNFa抑制剂在重组多肽之前给予。在一个方面，TNFa抑制剂在重组多肽之后给予。
在一个方面，重组多肽的第一次输注在给予IL-10抑制剂之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时进行给予。在一些方面，重组多肽的第一次输注在给予IL-10抑制剂之后约3小时-约4小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第一次输注在给予IL-10抑制剂之后约4小时进行给予。
在一个方面，IL-10抑制剂的第一次剂量和重组多肽的第一次剂量同时或序贯给予。在一个方面，重组多肽的第一次剂量在IL-10抑制剂的第一次剂量之后的一段时间给予。在一个方面，第一次重组多肽在给予IL-10抑制剂的第一次剂量之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第一次剂量在给予IL-10抑制剂的第一次剂量之后约3小时或4小时进行给予。在一个方面，重组多肽的第二次剂量在给予重组多肽的第一次剂量之后约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第二次剂量在给予第一次重组多肽之后约24小时进行给予。
在一个方面，重组多肽的第四次剂量在给予重组多肽的第三次剂量之后约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第四次剂量在给予第三次重组多肽之后约24小时进行给予。
在一个方面，重组多肽的第六次剂量在给予重组多肽的第五次剂量之后约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第六次剂量在给予第五次重组多肽之后约24小时进行给予。
在本公开的一个方面，重组多肽的第二次剂量在给予重组多肽的第一次剂量之后约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第二次剂量在给予重组多肽的第一次剂量之后约24小时进行给予。
在一个方面，重组多肽的第三次剂量在重组多肽的第二次剂量之后约1、2、3、4、5、6或7天进行给予。在优选的方面，重组多肽的第三次剂量在重组多肽的第二次剂量之后约3天进行给予。在一个方面，重组多肽的第四次剂量在给予重组多肽的第三次剂量之后约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第四次剂量在给予重组多肽的第三次剂量之后约24小时进行给予。
在一个方面，重组多肽的第五次剂量在重组多肽的第四次剂量之后约1、2、3、4、5、6或7天进行给予。在优选的方面，重组多肽的第五次剂量在重组多肽的第四次剂量之后约3天进行给予。在一个方面，重组多肽的第六次剂量在给予重组多肽的第五次剂量之后约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时进行给予。在优选的方面，重组多肽的第六次剂量在给予重组多肽的第五次剂量之后约24小时进行给予。
任何以上方面可与如本文公开的任何其他方面组合。
实施例
实施例1：产生重组多肽的方法
材料和方法
产生本公开重组多肽的方法利用表4中公开的PCR引物。
表4.引物序列
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模板DNA的制备
在使用Pfu聚合酶的PCR反应中扩增来自中国家鹅的全长CRYAA序列(SEQ ID NO:17)。在PCR反应中使用A1引物(SEQ ID NO:33)和A2引物(SEQ ID NO:34)。使用制造商的方案，将基因克隆到pET24a载体(Novagen)中的NdeI和HindIII位点。将连接混合物转化到大肠杆菌DH5α细胞中，并在LB氨苄青霉素板上选择转化体。从几个转化体分离质粒DNA，并通过NdeI和HindIII位点的限制性消化进行筛选。鉴定含有中国家鹅CRYAA(SEQ ID NO:17)的序列验证的克隆并将其用作模板。
含有CRYA_1B重组多肽序列的质粒的克隆
按以下方式制备含有CRYA_1B(SEQ ID NO:25)的重组质粒。使用上述模板DNA、正向引物IoE1(SEQ ID NO:35)和反向引物IoE2(SEQ ID NO:36)进行PCR。将PCR温度和时间编程如下：在95℃下变性5分钟；然后为30个循环的PCR反应，其中在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，和在72℃下延伸1分钟；在72℃下最终延伸10分钟。所有PCR扩增均用PfuUltra聚合酶(Stratagene)进行。将PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。使用GFXTMPCR DNA和凝胶结合纯化试剂盒(GE Healthcare)从凝胶中提取DNA片段，并将其连接到pET24a(Novagen)载体中。将连接混合物转化到DH5α大肠杆菌菌株中，并在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。从转化体中分离质粒DNA。序列验证的克隆，质粒_1，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_1、正向引物IoE3(SEQ ID NO:37)和反向引物IoE4(SEQ ID NO:38)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，32个循环的(95℃持续30秒，65℃持续30秒，72℃持续1分钟)，然后在72℃下5分钟。纯化PCR产物，并使用NdeI和HindIII限制性位点将其克隆至pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_2，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_2、正向引物IoE5(SEQ ID NO:39)和反向引物IoE6(SEQ ID NO:40)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在35个循环中95℃持续30秒、58℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_3，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_3、正向引物IoE7(SEQ ID NO:41)和反向引物IoE8(SEQ ID NO:42)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在28个循环中95℃持续30秒、55℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_4，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_4、正向引物IoE9(SEQ ID NO:43)和反向引物IoE10(SEQ ID NO:44)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在33个循环中95℃持续30秒、53℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_5，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_5、正向引物IoE11(SEQ ID NO:45)和反向引物IoE12(SEQ ID NO:46)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在30个循环中95℃持续30秒、57℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_6，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_6、正向引物IoE13(SEQ ID NO:47)和反向引物IoE14(SEQ ID NO:48)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在32个循环中95℃持续30秒、51℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_7，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_7、正向引物IoE15(SEQ ID NO:49)和反向引物IoE16(SEQ ID NO:50)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在32个循环中95℃持续30秒、54℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。序列验证的克隆，质粒_8，被用作用于下一轮PCR扩增的模板。
使用质粒_8、正向引物IoE17(SEQ ID NO:51)和反向引物IoE18(SEQ ID NO:52)进行PCR扩增。使用上述程序和以下PCR条件进行PCR扩增和克隆：95℃持续5分钟，然后在32个循环中95℃持续30秒、52℃持续30秒、72℃持续1分钟，最后在72℃下延伸5分钟。PCR产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色。将DNA片段从凝胶中切下，提取并克隆到pET24a质粒中。将连接混合物转化到大肠杆菌细胞的DH5α菌株中，并在含有氨苄青霉素的LB板上选择转化体。序列验证的克隆，质粒_9，在正确阅读框中含有
CRYA_1B(SEQ ID NO:25)。
重组多肽CRYA_1B的表达
将质粒_9转化到表达型大肠杆菌菌株BL21中，并选择氨苄青霉素抗性菌落。CRYA_1B重组多肽的预期分子量为20kDa(图2)。选择来自补充有100μg/ml氨苄青霉素的卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Betani)(LB)琼脂板的单个菌落。在该制备中，含有3ml LB培养基(每L10g胰蛋白胨、10g NaCl和5g酵母提取物)和100μg/ml氨苄青霉素的50ml锥形管用单个菌落进行接种，并在设定为37℃和200RPM的振荡温育箱中生长过夜。通过将3ml培养物添加到含有100ml的2YT培养基(每L16g胰蛋白胨、15g酵母提取物和8g NaCl)和100μg/ml氨苄青霉素的无菌500ml爱伦美氏烧瓶中来进一步扩增培养物，并在设定为37℃和200RPM的振荡温育箱中使其生长过夜。这产生种子培养物。
使用6L生物反应器来进一步扩增种子培养物。将4L含有100μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基用在设定为37℃和200RPM的振荡温育箱中生长过夜的100ml种子培养物接种。在生物反应器中，将培养物在37℃、2SLPM(标准升(liners)/分钟)和200RPM的气流和搅动下温育。当OD600达到0.65-0.75时，用1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白过表达。使细胞生长7-8小时，并将搅动速度、温度和气流分别设定为400RPM、28℃和4SLPM。为控制发泡，根据需要添加聚二醇P-2000消泡剂。在诱导7-8小时之后，通过在4℃下以8000rpm离心15分钟来收获细胞。将细胞团块冷冻并储存于-80℃下。
重组多肽CRYA_1B的纯化
在该制备中，将相当于6g CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)的团块重悬于40ml缓冲液A(50mM Tris-HCl缓冲液)中，并通过在冰上声处理(28个循环的10-s脉冲与30-s间隔，30％幅度，使用超声细胞破碎仪Misonix Ultrasonic Liquid Processors S-4000,USA)来破坏，以得到总蛋白提取物用于溶解度分析。使用Sorvall RC5C Plus(USA)超速离心机，使用SS-34型转子，将总蛋白提取物在4℃下以14,000rpm离心45min。将上清液通过0.45μm过滤器(Millipore)过滤，并加载到在相同缓冲液中平衡的Q-Sepharose阴离子交换柱上。将Q-Sepharose装入到C 26/40柱(GE Healthcare)中至20cm的床高。使用AKTA FPLC(GEHealthcare)以5ml/min的流速将40mL体积的含有CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)的上清液加载到柱上。通过使用含有50mM Tris-HCl、NaCl缓冲液的平衡缓冲液通过浓度梯度洗脱CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)，并基于A280吸光度收集单峰用于疏水相互作用柱上的进一步应用。通过15％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析收集的洗脱液。
疏水相互作用色谱
在离子交换色谱之后，将洗脱的CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)合并在一起，通过Amicon Ultra 15ml离心过滤器(Merck)浓缩，并随后添加至饱和硫酸铵缓冲液(50mMTris-HCl，3.8M硫酸铵，1mM DTT和1mM EDTA)，导致最终浓度为1.2M硫酸铵。将添加有硫酸铵的浓缩产物使用0.45μm针筒式过滤器(Millipore)过滤，并以2ml/min的流速加载至疏水相互作用色谱柱(C 10/20柱,Ge Healthcare)。将Source 15PHE(G E Healthcare)装入到C10/20柱(GE Healthcare)中至10cm的床高，并用缓冲液A(50mM Tris-HCl、1.2M硫酸铵、10％甘油、1mM DTT和1mM EDTA)预平衡。将该柱用缓冲液A洗涤，并用硫酸铵减少且甘油增加的线性梯度来实现使用缓冲液B(50mM Tris-HCl、10％甘油、1mM DTT和1mM EDTA)洗脱蛋白。通过15％SDS-PAGE分析洗脱的蛋白。通过Amicon Ultra 15ml离心过滤器(Merck)进一步浓缩级分。
使用凝胶过滤的缓冲液交换
通过使用Sephadex G-25柱将纯化的重组多肽进一步交换到PBS缓冲液中。将Sephadex G-25装入到C 26/100柱(GE Healthcare)中至85cm的床高，并用PBS缓冲液以1ml/min的流速预平衡。浓缩的蛋白在2.5小时之后洗脱，并通过15％ SDS-PAGE进行分析。然后通过Amicon Ultra 15ml离心过滤器(Merck)浓缩所得洗脱液。
实施例2：诱导或增强免疫应答的方法
用CRYA_1B重组多肽(SEQ ID NO:9)处理癌细胞系，将CRYA_1B重组多肽稀释至各种浓度，并与人类癌细胞系H441(肺癌，HTB-174，ATCC)、H460(肺癌，HTB-177，ATCC)、HCT15(结肠癌，CCL-225，ATCC)和MCF7(乳腺癌，HTB-22，ATCC)一起，全部在37℃下温育。关于CRT、HSP70、HSP90和胱天蛋白酶3/7测定，重组多肽温育时间对于H441分别为60min、1hr 50min、1hr 40min和2hr 45min，对于H460分别为30min、1hr 15min、1hr 5min和2hr 30min，对于HCT15分别为55min、1hr 50min、1hr 30min和2hr 30min，和对于MCF7分别为1hr 10min、1hr40min、1hr 45min和2hr 45min。流式细胞术被用于评价用CRYA_1B重组多肽处理的细胞和未处理的对照细胞中的钙网蛋白(CRT)(图3-6)、HSP70(图7-10)、HSP90(图11-14)和胱天蛋白酶3/7(图15-18)的细胞表面表达。这分别使用CRT mAb(Abcam)、HSP70 mAb(Enzo LifeSciences)、HSP90 mAb(Enzo Life Sciences)和胱天蛋白酶3/7(Invitrogen assay)，使用FACS Calibur(BD Biosciences)进行。
癌症可在肿瘤内(瘤内异质性)，而且可在肿瘤之间(瘤间异质性)经受广泛的遗传和表型变异。通常源于原发性肿瘤的隐蔽亚克隆的复发性肿瘤为癌症死亡率的主要原因。类似地，转移，即癌症进展的致死晚期，从原发性肿瘤继承多个遗传上独特的早期亚克隆。然而，与原发性肿瘤相比较，转移性肿瘤表现出较少瘤内异质性。瘤间异质性的主要原因源于原发性肿瘤的瘤内异质性。因为癌症免疫编辑过程，所以肿瘤可发展出减弱的免疫原性，并产生免疫抑制性微环境，以防止肿瘤被宿主免疫系统根除。
癌细胞具有隐藏肿瘤危险信号的能力，通过Th2细胞引起肿瘤微环境的慢性炎症，所述Th2细胞释放(白细胞介素(IL)-4和IL-10)，导致癌症受试者体内的血清IL-10水平与正常健康受试者相比更高。IL-10为诱导STAT3信号传导(图19和20)并抑制DC活化和功能的抗炎细胞因子。IL-10导致由髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和调节性T细胞(Treg)组成的肿瘤微环境，导致肿瘤逃逸。这最终导致适应性免疫活化降低。相对地，细菌和病毒感染暴露危险信号，这导致通过Th1细胞的急性炎症，所述Th1细胞将IL-12和IFNg(图19)免疫刺激细胞因子释放到微环境中，导致适应性免疫活化。
钙网蛋白(CRT)为募集树突细胞(DC)以摄入肿瘤和病原体的危险信号。HSP70和HSP90为诱导树突细胞成熟或活化，进而产生IL-12和IL-6的危险信号。树突细胞然后可在MHC-I和MHC-II的情况下向淋巴结中的T细胞呈递抗原。活化的DC可产生IL-12，其为促进T细胞活化，进而产生IL-2和IFNg的Th1细胞因子。来自活化DC的急性瞬时高IL-6引起急性炎症，导致发热，这促进免疫T细胞的活化。IL-6的慢性表达会导致慢性炎症，从而阻碍免疫活化。
实施例3：干扰素γ对血清IL-10的影响
与正常健康受试者相比较，癌症患者体内的血清IL-10水平升高。例如，肺癌III-IV期人类患者和正常健康受试者体内的血清IL-10分别为17.7pg/mL和9.2pg/mL(IL-10比率为1.924)。患有B16F10黑色素瘤的鼠C57BL/6和对照健康小鼠体内的血清IL-10分别为95pg/mL和50pg/mL(IL-10比率为1.9)。患有B16F10黑色素瘤的鼠C57BL/6和对照健康小鼠体内的血清IgG分别为1200和650MFI(IgG比率为1.846)。患有MC38(结肠癌)的鼠C57BL/6和对照健康小鼠体内的血清IL-10分别为70pg/mL和50pg/mL(IL-10比率为1.4)。患有E0771(乳腺癌)的鼠C57BL/6和对照健康小鼠体内的血清IL-10分别为70pg/mL和50pg/mL(IL-10比率为1.4)。
由于IFNg抑制血清IL-10水平，给予B16F10荷瘤小鼠静脉内注射IFNg，以确定对血清IL-10的影响。IFNg注射之后3.5小时采血，并通过Luminex测定确定血清IL-10。表5和图21显示IFNg剂量增加导致小鼠体内的血清IL-10水平降低。
表5.IFNg注射后血清IL-10水平百分比
体内IFNg剂量(μg/m2) 血清IL-10剩余水平
600 14％
300 35％
150 55％
100 70％
75 75％
50 80％
25 90％
0 100％
实施例4：MC38、E0771和B16F10体内肿瘤激发和再激发方法及剂量方案
方法.根据国际实验动物护理评估和认可委员会(Association for Assessmentand Accreditation of Laboratory Animal International Care)的指南，将雌性10-12周龄C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories,USA)饲养和维持在无病原体条件下。
将C57BL/6小鼠用100μl PBS中的1×106个MC38/E0771/B16F10细胞皮下接种到侧腹。肿瘤体积用卡尺进行测量并使用公式(A×B2)/2进行计算[A：最大直径；B：肿瘤最小直径]。当肿瘤达到约100mm3时，我们根据图22的治疗计划经由腹膜内注射开始重组多肽和IFNγ治疗。
结果.MC38为用于转移模型的化学诱导的III级SMAD4丢失的转移性结直肠腺癌，而E0771为用于复发模型的三阴性癌症低claudin自我更新的自发性乳腺腺癌。对癌症的适应性免疫的标志为具有免疫记忆的长寿的新抗原特异性T细胞在再次遇到同一新抗原时反应更加快速和稳健，以防止癌症复发。为证明长期适应性免疫记忆，我们将来自肿瘤激发实验的完全缓解(CR)小鼠合并在一起，并然后用活肿瘤细胞再激发这些CR小鼠，在原发性肿瘤完全排斥之后6个月，在原发性肿瘤的相对部位，通过外部强制活肿瘤细胞注射模拟自发性肿瘤复发。当没有肿瘤生长的迹象时，表明成功的鼠6个月的适应性免疫，相当于人类约15-20年。MC38具有SMAD4丢失的表型，这与结肠癌患者的转移和存活率不良有关。MC38肿瘤激发实验显示，在初始自发性部分肿瘤消退之后原发性肿瘤变体开始急剧生长，并且约40％的小鼠会发展出1或2个局部区域转移。对于重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)治疗之后的CR小鼠，转移将首先经受完全消退，而原发性肿瘤将首先经受部分消退并然后最终完全消退。我们假设1)在重组多肽CRYA_1B治疗之前，预先存在的T细胞对优势性新抗原的免疫选择导致原发性肿瘤的初始自发性部分消退，并且持续的免疫压力最终导致优势性新抗原丢失和/或MHC-I缺陷型肿瘤变体的自然选择；2)然后，原发性肿瘤变体突然急剧生长并发展出局部区域转移(免疫逃逸)；3)在重组多肽CRYA_1B治疗之后，药物诱导的新抗原主要来自转移，因为与较大的原发性肿瘤变体相比较，较小的转移具有更高的药物浓度覆盖；4)转移通过多个仅属转移的亚优势性新抗原和假定的一种共享的亚优势性新抗原而经受完全消退，而原发性肿瘤变体并行地通过一种共享的亚优势性新抗原而经受有限的部分消退；5)在转移的CR之后，随后剂量的重组多肽CRYA_1B除了共享的亚优势性新抗原之外还诱导多个仅属原发性的亚优势性新抗原；6)原发性肿瘤变体最终经受完全消退。相比之下，如果DC介导的基于新抗原的疫苗仅利用从患者TIL或外周血单核细胞(PBMC)中离体筛选的免疫优势性新抗原，而不包含亚优势性新抗原的话，那么由于肿瘤变体的逃逸，将不可能完全根除转移和原发性肿瘤。
MC38肿瘤激发模型的总CR率在重组多肽CRYA_1B治疗之后为70％，以及CR小鼠的无复发存活率为100％，肿瘤再激发之后具有长期免疫，无肿瘤复发(图23A和23B)。三阴性乳腺癌具有广泛的瘤内异质性，E0771具有低claudin的肿瘤表型，具有富含肿瘤起始(干细胞样)CD44+CD24-/低细胞的特征，尤其是在用于人类乳腺癌患者中的复发的药物治疗之后。鉴于E0771的干细胞样肿瘤起始能力，我们将其用于自发性肿瘤复发模型。重组多肽CRYA_1B治疗之后，我们在E0771肿瘤激发模型达到了60％的CR率(图23C)。我们观察了6个月，并且CR之后没有自发性E0771肿瘤复发的迹象。我们假设，重组多肽CRYA_1B同时诱导E0771衍生的优势性新抗原和多个亚优势性新抗原，包括癌症干细胞亚克隆的那些，其新抗原的多重性阻止了E0771的自发性复发。此外，我们用活E0771肿瘤细胞再激发CR小鼠，作为外部强迫的肿瘤复发，并且再激发之后没有肿瘤生长的迹象，表明成功的持久的适应性免疫记忆(图23D)。有趣的是，我们观察到对于MC38和E0771肿瘤模型两者，在重组多肽CRYA_1B治疗之后存在两种不同的肿瘤消退模式，一种伴随持续的肿瘤消退直至CR(图23A)，而另一种伴随暂时性肿瘤闪烁(tumour flare)并然后肿瘤消退直至CR(图23C)。用B16F10鼠黑色素瘤模型进行相同的肿瘤激发和肿瘤再激发实验。B16F10肿瘤激发模型的总CR率在治疗方案之后为40％，以及CR小鼠的无复发存活率为100％，肿瘤再激发之后具有长期免疫，无肿瘤复发(图24A和24B)。我们假设，免疫疗法之后可能会发生肿瘤闪烁，因为免疫系统的启动是复杂的并且可能延迟，而肿瘤可能会短暂地生长和/或大量免疫细胞可能会短暂地浸润肿瘤，从而导致在该时间段期间肿瘤大小的增加。
另外，重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)在健康免疫活性B6小鼠(n＝7)中以1.6倍临床剂量连续7天每天给予，药物血清峰值浓度为～800μg/ml，在实验结束时，显示行为、体重、食物摄入和关键血清化学参数没有显著变化，除第一剂之后体重和食物消耗明显下降之外，但通常之后在2-3天内恢复，第一剂之后不受后续剂量的太多影响。
通过测量胱天蛋白酶3/7，还对由先天和适应性免疫细胞组成的正常人类PBMC(3名健康供体)研究了体外毒性。我们的结果显示，即使在800μg/mL注射重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)时，PBMC活力也没有显著降低(图25)，这证实了在可比药物血清峰值浓度下没有不良事件的体内安全特性。总之，这表明重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)有效地活化长期适应性免疫，没有癌症复发和明显的不良事件。
讨论.尽管用于实体瘤的检查点阻断癌症免疫疗法比如抗PD-1疗法取得了临床成功，但仅有限的具有PD-L1+肿瘤表型的患者子集对抗PD-1疗法有反应，并且相当数量的有反应患者会经受复发(平均复发时间：624天)，主要是由于由重复免疫疗法治疗的免疫压力产生的新抗原丢失和/或MHC-I缺陷型肿瘤变体的自然选择。为了不受肿瘤表型限制的更好的治疗效力和更广泛的患者覆盖，个体化DC介导的基于新抗原的疫苗，比如离体DC疫苗、长肽疫苗、RNA疫苗和DNA疫苗，引起了从头发生的多克隆T细胞免疫应答，结果令人鼓舞。尽管多克隆T细胞可降低来自新抗原丢失变体的肿瘤自然生长(outgrowth)风险，但由β2-微球蛋白缺乏产生的MHC-I呈递的完全丧失仍然是有效的肿瘤逃逸机制。此外，来自患者的可切除肿瘤样品的离体经计算机新抗原预测的准确性的挑战、无法手术肿瘤的问题、耗时(约3-5个月)和昂贵的GMP制造仍然是待解决的艰巨问题。相对地，瘤内溶瘤病毒(OV)疗法，一种无离体新抗原预测的抗原不可知疫苗，使用具有复制能力的适应病毒，以经由坏死性凋亡(程序性坏死)选择性地感染、增殖和裂解肿瘤细胞，这经由内源性DC引起免疫原性细胞死亡的细胞膜的渗透性以及肿瘤抗原和DAMP的释放。尽管如此，有效治疗远端转移性肿瘤需要全身静脉内输注OV；然而，此类全身输注会导致OV在循环中被快速稀释，被血清因子中和并隔离于肝脏和脾脏中。因此，OV的IV输注将需要显著更高的剂量，服从于制造技术能力，超过两个数量级，以达到与瘤内注射相似的效力，除非具有潜在的剂量限制的4级毒性。此外，每个临床级OV均需要生物安全监管批准，并且所需的高临床IV剂量的制造技术能力仍为一项挑战。相对地，重组多肽CRYA_1B为使用标准生物制造工艺的重组蛋白。此外，重组多肽CRYA_1B可全身地诱导多种个体化原位新抗原，以减轻新抗原丢失变体的逃逸，经由HSP70/HP90肽协同活化CD4+T细胞，和经由CD4+辅助细胞的白细胞介素-2协同活化NK细胞，启动对表达HSP70的肿瘤细胞的有效识别，以根除MHC-I缺陷型(NK细胞易感)变体，并有效地触发CD70-CD27连接以减少T细胞上的PD-1表达，从而最小化PD-1/PD-L1介导的免疫外周耐受。因此，鉴于减弱的免疫原性，比如新抗原丢失、MHC-I缺陷型变体和PD-1/PD-L1介导的免疫耐受，以及免疫抑制性肿瘤微环境成分，比如髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞，我们选择首先关注如何重编程免疫抑制性肿瘤微环境以更好地活化DC。在写此文时，我们筛选、鉴定并验证了一种这样的佐剂，其与重组多肽CRYA_1B协同作用，用于重塑肿瘤微环境，导致在免疫活性小鼠体内MC38和E0771结直肠和乳腺同源肿瘤模型两者的CR分别都增加。总之，首创的重组α-结晶蛋白重组多肽CRYA_1B显示出对凋亡前个体化肿瘤来源的CRT肽、HSP70肽和HSP90肽的有效的、全身性、实时和原位的诱导，而与实体瘤癌症类型和肿瘤表型无关，引发具有T细胞多克隆多样性的抗肿瘤长期免疫以防止癌症复发，并且显示出分别对正常细胞和宿主的最小的毒性和不良事件。
实施例5-树突细胞(DC)的FLT3L扩增
树突细胞的FLT3L扩增
本领域存在对通过在肿瘤部位扩增树突细胞来改善免疫应答的备选方法的需要，所述树突细胞负责捕获肿瘤抗原并将抗原呈递给T细胞以进行T细胞活化/扩增。测试了FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)在肿瘤部位扩增罕见的人类CD141+XCR1+DC或鼠CD103+XCR1+DC的能力。6名健康志愿者连续14天用安慰剂(n＝2)或FLT3L(n＝4；以20μg/kg/d皮下注射)治疗。来自安慰剂和FLT3L治疗组的PBMC中的HLA-DR+Lin-DC群(最后一次FLT3L/安慰剂注射之后2天)分别为1.5％和18.8％(表6)。FLT3L治疗之后DC扩增率为12.33倍。因此，皮下注射FLT3L可使来自健康志愿者的人类PBMC中的HLA-DR+Lin-DC扩增。
表6.用FLT3L治疗后的HLA-DR+Lin-DC(树突细胞)群
将6只健康恒河猴用安慰剂(n＝2)或FLT3L(n＝4；以560μg/m2皮下注射)连续7天进行治疗。来自安慰剂和FLT3L治疗组的PBMC中的HLA-DR+Lin-DC群(最后一次FLT3L/安慰剂注射之后2天)分别为1.0％和12.6％(表6)。FLT3L治疗之后DC扩增率为12.6倍。因此，静脉内注射FLT3L可使来自健康恒河猴的PBMC中的HLA-DR+Lin-DC扩增。
将治疗前血清FLT3L比率：0.5-0.6x(相对于健康者)的6名晚期肺癌患者用安慰剂(n＝2)或FLT3L(n＝4；以20μg/kg/d皮下注射)连续14天进行治疗。来自安慰剂和FLT3L治疗组的PBMC中的HLA-DR+Lin-DC群(最后一次FLT3L/安慰剂注射之后2天)分别为1.6％和7.25％。癌症患者的FLT3L治疗之后，DC扩增率为4.53倍。因此，FLT3L使来自癌症患者的人类PBMC中的HLA-DR+Lin-DC扩增，但低于健康人类中的扩增倍数(12.33倍)。
癌症患者FLT3L静脉内给药持续时间的测定
将治疗前IL-10/IgG比率：1.45-1.6x(相对于健康者)的20名晚期肺癌患者每天以6μg/kg用FLT3L静脉内注射持续不同时间进行治疗，以确定达到HLA-DR+Lin-DC至少12倍的扩增(在以上实验中于健康人类中观察到倍数增加)所需的总给药时间长度。通过ELISA测定血清FLT3L水平。通过Luminex测定来测定IL-10/IgG水平。表7显示该实验的结果。
表7.FLT3L比率(相对于健康者)
血清FLT3L比率(相对于健康者) FLT3L静脉内给药持续时间(天数)
1x 7
0.9x 10
0.8x 12
0.7x 12
0.6x 12
0.5x 14
0.4x 16
0.3x 18
0.2x 20
0.1x 23
为了确定癌症患者的FLT3L静脉内剂量测定，将治疗前血清FLT3L比率：0.6-0.8x(相对于健康者)的20名晚期肺癌和胰腺癌患者每天以试验剂量(μg/kg)连续12天用FLT3L静脉内注射进行治疗以满足以下标准。来自癌症患者的PBMC中的HLA-DR+Lin-DC扩增率标准被设定为FLT3L治疗之后至少12倍(类似于健康人类)，以确定必要的FLT3L剂量。通过ELISA测定血清FLT3L水平。通过Luminex测定来测定血清IL10/IgG水平。图27显示FLT3L静脉内剂量与相对于健康者的IL10/IgG比率之间相关性，其中回归线确定为y＝3.4X+0.78。
从以上实验中，常规人类FLT3L治疗(经由皮下注射)使用740μg/m2(20μg/kg)的剂量持续14天。7天FLT3L治疗(12.6x，经由静脉内注射560μg/m2的剂量)达到与健康受试者14天治疗(12.33x，经由皮下注射740μg/m2的剂量)类似的DC扩增效果。在DC扩增能力有限(癌症患者：4.53x相对于健康者：12.33x)且寿命有限的癌症患的情况下，使用更有效的静脉内注射用优化的剂量和持续时间进行FLT3L治疗。
实施例6-IFNγ对人类PBMC中IL-10和CTLA-4表达水平的影响
对健康人类志愿者测试最大血清干扰素γ(IFNg)浓度(Cmax)和半衰期。将6名健康志愿者以规定剂量用安慰剂或IFNg进行静脉内注射，并测量IFNg的Cmax水平(表8)。50和70μg剂量的Cmax分别为1ng/ml和1.75ng/ml。IFNg的血清半衰期为约30min。50μg剂量的1小时平均浓度Cavg(1hr)为0.6ng/ml[(1+0.5+0.25)/3＝0.58]，而70μg剂量的Cavg(1hr)为1ng/ml[(1.75+0.875+0.4375)/3＝1.02]。通过ELISA测定血清IFNg的Cmax水平。
表8.IFNγ对健康人类体内CTLA4表达的影响
测量来自静脉内注射IFNg的人类健康志愿者的人类PBMC中的CTLA4表达。将6名健康志愿者以规定剂量用安慰剂或IFNg
进行静脉内注射，并测量CTLA4表达(表8)。通过FACS分析评价CTLA-4表达MFI(平均荧光强度)。相对于安慰剂计算倍数变化。来自健康志愿者的PBMC中的CTLA-4表达与注射的IFNg剂量呈正相关。
测量从静脉内注射IFNg的人类健康志愿者分离的PBMC中的IL-2产生。将6名健康志愿者以规定剂量用安慰剂或IFNg进行静脉内注射，并测量IL-2产生(表8)。将PBMC细胞与抗CD3 mAb/CD80-Ig包被的珠粒一起温育48小时，以活化T细胞。通过ELISA测定IL-2水平。来自健康志愿者的PBMC中的IL-2产生与注射的IFNg剂量及CTLA-4表达呈负相关。
为了刺激IL-10产生，将人类PBMC细胞与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)cowan 1菌株(SAC)一起以1:200稀释度温育48小时。该温育后，以不同浓度加入IFNg，持续1小时。通过ELISA测定IL-10表达，并且将其显示于表9中。这些结果显示干扰素γ(IFNg)降低人类PBMC中的IL-10。
表9.PBMC细胞与SAC一起温育后的IL-10浓度
治疗 IL-10浓度ng/ml 作为对照百分比的IL-10浓度
对照 4.1 100
0.6ng/ml IFNγ 3.9 95
1.0ng/ml IFNγ 2.74 67
因此，以上实验显示，干扰素γ(IFNg)在人类PBMC中降低IL-10，重编程肿瘤微环境以获得更好的树突细胞功能，但同时上调CTLA-4，阻碍T细胞活化。为最小化两种相互冲突的影响，确定IFNg的最佳剂量为70μg(具有Cmax：1.75ng/mL；Cavg(1hr)：1ng/mL的固定剂量)，其在不因活化T细胞损害IL-2产生的情况下将IL-10下调33％。
实施例7-IFNγ重编程M2 TAM
接下来，我们测试了IFNγ是否能诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1TAM，其负责在钙网蛋白介导的活化之后IL-12、IL-15、IFNα和IFNβ的分泌。健康人类CD14+单核细胞在存在M-CSF(1μg/mL)、IL-4(1μg/mL)和IL-10(1μg/mL)的情况下培养，以分化为M2样巨噬细胞。将分化的M2巨噬细胞用干扰素γ(IFNg)(1ng/mL)脉冲1小时。4小时后，测量M2细胞和M1细胞的水平。通过FACS分析测量表面表达标志物CD80(M1巨噬细胞)的上调以及MARCO和CD163(M2巨噬细胞)的下调，并将其显示于图28中。M2巨噬细胞高度表达MARCO和CD163，而M1巨噬细胞高度表达CD80。只有活化的M1巨噬细胞而不是M2巨噬细胞才能产生促炎细胞因子，比如IL-12和IL-15。总之，这显示IFNg可将M2巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞。具体地讲，这显示在钙网蛋白介导的活化后，70μg的低静脉内注射剂量(具有C avg(1hr)：1ng/mL的固定剂量)的干扰素γ(IFNg)可将M2样肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程以变为M1 TAM，并诱导IL-12、IL-15、IFNα和IFNβ的分泌。此外，IFNg降低IL-10，重编程肿瘤微环境以获得更好的树突细胞功能。
实施例8-XCL1将FLT3L扩增的XCR1+树突细胞募集至肿瘤部位
趋化因子(C基序)配体(XCL1)为趋化因子受体“C”亚家族(XCR1，也被称为GPR5)的配体，充当XCR1+DC至肿瘤部位的化学引诱剂。为测试XCL1是否将XCR1+DC募集至B16F10或MC38黑色素瘤肿瘤部位，使C57BL/6小鼠首先分别接种2x106个B16F10细胞或2x106个MC38细胞以诱导黑色素瘤。小鼠用XCL1或用空载体转导，并且全部从肿瘤细胞接种开始持续6天以4μg(560μg/m2)静脉内注射FLT3L。在接种之后7天(最后一次FLT3L注射之后1天)分离肿瘤。表10显示XRC1+DC细胞向两种类型肿瘤部位的募集。
表10.XCR1+树突细胞向B16F10和MC38黑色素瘤部位的募集
因此，这些结果表明在用FLT3L治疗后，扩增的XCR1+DC保留在血液循环系统中，并且XCL1将XCR1+DC从血管募集至肿瘤部位。
实施例9-重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)活化巨噬细胞和NK细胞以释放XCL1
细胞因子活化的NK细胞释放XCL1
为确定用细胞因子处理的NK细胞是否释放XCL1，使用NK细胞分离试剂盒从C57BL/6小鼠的脾细胞纯化NK细胞。NK细胞由IL-12(80ng/ml)或IL-15(80ng/ml)或IFNα(1000IU/ml)或IFNβ(1000IUg/ml)或其组合活化，持续20分钟。XCL1 MFI(平均荧光强度)通过FACS分析进行评价，并显示于表11中。与对照相比较，用IL-12、IL-15、IFNα和IFNβ治疗导致来自NK细胞的XCL1释放的倍数增加最高(增加12倍)。
表11.用细胞因子治疗后来自NK细胞的XCL1释放
XCL1 MFI(倍数变化)
对照 1x
IL-12 3.5x
IL-15 3.5x
IFNα 2.5x
IFNβ 2.5x
IL-12+IL-15 8.5x
IL-12+IL-15+IFNα+IFNβ 12x
钙网蛋白(CRT)活化的巨噬细胞产生IL12、IL15、IFNa和IFNb
为确定钙网蛋白(CRT)活化的巨噬细胞是否释放细胞因子IL12、IL15、IFNα(IFNa)和IFNβ(IFNb)，将RAW264.7巨噬细胞(M1)细胞用钙网蛋白(10μg/ml)脉冲20分钟。通过FACS分析评价IL-12、IL-15、IFNa和IFNb的平均荧光强度(MFI)作为细胞因子释放的量度(表12)。IL-12、IL-15、IFNa和IFNb均由钙网蛋白活化的巨噬细胞产生。用钙网蛋白处理后，IFNa和IFNb具有最高的释放水平。
表12.用钙网蛋白处理M1巨噬细胞后的细胞因子释放
钙网蛋白介导的巨噬细胞和NK细胞协同地将XCR1+DC募集至肿瘤部位
接下来，我们测试了钙网蛋白(CRT)介导的巨噬细胞是否能活化NK细胞，以促进XCL1释放及XCR1+DC募集至MC38(结肠癌)或C1498(急性髓性白血病)肿瘤部位。CRT为CD91的配体，其在巨噬细胞上大量地表达。XCL1为XCR1的配体，充当XCR1+DC的化学引诱剂。使C57BL/6小鼠接种2x106个MC38结肠癌细胞(n＝3)或MC38.CRT(n＝18；MC38细胞与3μg/106个细胞的重组CRT一起在PBS中温育30min，并且然后洗涤3次)。将MC38.CRT(表达表面CRT的MC38细胞)荷瘤小鼠进一步分成6组：MC38.CRT、MC38.CRT/抗XCL1(XCL1耗竭)、MC38.CRT/抗NK1.1(NK细胞耗竭)、MC38.CRT/抗F4/80(巨噬细胞耗竭)、MC38.CRT/抗CD91(CD91受体阻断)和MC38.CRT/抗CRT(CRT耗竭)。另外，从肿瘤接种开始，使所有小鼠持续6天静脉内注射FLT3L(4μg:560μg/m2/d)。在接种之后7天(最后一次FLT3L注射之后1天)分离肿瘤。表13显示被募集至肿瘤部位的XCR1+树突细胞的数量。尽管MC38.CRT显示XCR1+树突细胞募集增加，但XCL1耗竭、NK细胞耗竭、巨噬细胞耗竭、CD91受体阻断、CRT耗竭则没有，表明CRT介导NK细胞的活化，以促进XCL1释放和XCR1+树突细胞募集至结肠癌肿瘤部位。
表13.用CRT治疗后XCR1+树突细胞募集至MC38结肠癌部位.
瘤内XCR1+树突细胞的数量(105/克肿瘤)
MC38 0.8
MC38.CRT 2
MC38.CRT/抗XCL1(XCL1耗竭) 0.8
MC38.CRT/抗NK1.1(NK细胞耗竭) 0.8
MC38.CRT/抗F4/80 0.84
MC38.CRT/抗CD91(CD91受体阻断) 0.81
MC38.CRT/抗CRT(CRT耗竭) 0.8
接下来，使C57BL/6小鼠接种2x106个C1498急性髓性白血病细胞(n＝3)或C1498.CRT(n＝18；C1498细胞与3μg/106个细胞的重组CRT一起在PBS中温育30min，并然后洗涤3次)。将C1498.CRT(表达表面CRT的C1498细胞)荷瘤小鼠进一步分成6组：C1498.CRT、C1498.CRT/抗XCL1(XCL1耗竭)、C1498.CRT/抗NK1.1(NK细胞耗竭)、C1498.CRT/抗F4/80(巨噬细胞耗竭)、C1498.CRT/抗CD91(CD91受体阻断)和C1498.CRT/抗CRT(CRT耗竭)。另外，从肿瘤接种开始，使所有小鼠持续6天静脉内注射FLT3L(4μg:560μg/m2/d)。在接种之后7天(最后一次FLT3L注射之后1天)分离肿瘤。表14显示被募集至肿瘤部位的XCR1+树突细胞的数量。尽管C1498.CRT显示XCR1+树突细胞募集增加，但XCL1耗竭、NK细胞耗竭、巨噬细胞耗竭、CD91受体阻断、CRT耗竭则没有，表明CRT介导NK细胞的活化，以促进XCL1释放和XCR1+树突细胞募集至AML肿瘤部位。
表14.用CRT治疗后XCR1+树突细胞募集至C1498急性髓性白血病肿瘤部位
瘤内XCR1+树突细胞的数量(105/克肿瘤)
C1498 0.7
C1498.CRT 1.82
C1498.CRT/抗XCL1(XCL1耗竭) 0.7
C1498.CRT/抗NK1.1(NK细胞耗竭) 0.7
C1498.CRT/抗F4/80 0.76
C1498.CRT/抗CD91(CD91受体阻断) 0.71
C1498.CRT/抗CRT(CRT耗竭) 0.7
重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)诱导钙网蛋白(CRT)在癌细胞系上的表达
为确定重组多肽CRYA_1B(SEQ ID NO:9)是否在鼠B16F10黑色素瘤、人类HCT15结肠癌和人类MCF7乳腺癌细胞系中诱导钙网蛋白(CRT)，将4x105个细胞铺板于12孔板中，并且第二天用CRYA_1B处理细胞60min。通过FACS分析评价表达CRT的细胞的百分比。表14显示与对照相比较，CRYA_1B增加每种类型细胞的CRT表达。
表15.用重组多肽CRYA_1B处理后CRT在癌细胞系上的表达
CRYA_1B诱导HSP70在癌细胞系上的表达
为确定CRYA_1B是否在鼠B16F10黑色素瘤、人类HCT15结肠癌和人类MCF7乳腺癌细胞系中诱导HSP70，将4x105个细胞铺板于12孔板中，并且第二天用CRYA_1B处理细胞110min。通过FACS分析评价表达HSP70的细胞的百分比。表16显示与对照相比较，CRYA_1B增加每种类型细胞的HSP70表达。
表16.用重组多肽CRYA_1B处理后HSP70在癌细胞系上的表达
CRYA_1B诱导HSP90在癌细胞系上的表达
为确定CRYA_1B是否在鼠B16F10黑色素瘤、人类HCT15结肠癌和人类MCF7乳腺癌细胞系中诱导HSP90，将4x105个细胞铺板于12孔板中，并且第二天用CRYA_1B处理细胞110min。通过FACS分析评价表达HSP90的细胞的百分比。表17显示与对照相比较，CRYA_1B增加每种类型细胞的HSP90表达。
表17.用重组多肽CRYA_1B处理后HSP90在癌细胞系上的表达
因此，总体上重组多肽CRYA_1B对于鼠和人类肿瘤两者均为有效钙网蛋白(CRT)诱导剂。CRYA_1B诱导肿瘤上的CRT表达。CRT进而经由与CD91结合并诱导IL12、IL15、IFNα和IFNβ的产生来活化M1肿瘤相关巨噬细胞。细胞因子的这种组合活化瘤内NK细胞，导致XCL1的产生，所述XCL1为XCR1受体的配体。因此，XCL1从血管中向肿瘤部位募集XCR1+DC。在肿瘤上诱导CRT表达后，CRYA_1B还诱导肿瘤上HSP70/90的表达，所述HSP70/90进而作用以成熟和活化瘤内XCR1+DC，并诱导这些树突细胞与捕获的抗原一起迁移至淋巴结，以启动和扩增T细胞。因此，用CRYA_1B治疗为一种用于诱导树突细胞成熟和扩增，从而启动免疫细胞应答的新方法。
实施例10-使用FLT3L、IFNγ和重组多肽CRYA_1B用于治疗B16F10黑色素瘤的体内组合疗法
为了测试FLT3L、IFNg和CRYA_1B在体内小鼠模型中的作用，设计了FLT3L、IFNg和CRYA_1B(CRT诱导剂)的组合疗法。图29显示各种对照和组合治疗的示意图。每组的C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良且侵袭性表型的黑色素瘤细胞)：对照(n＝5)、FLT3L/IFNg/CRYA_1B(n＝10)、FLT3L/CRYA_1B(n＝10)、IFNg/CRYA_1B(n＝10)和CRYA_1B(n＝10)。肿瘤在4天内达到约40-50mm3(第4天)。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续6天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于CRYA_1B疗法，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg和13.5mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。
实施例11-使用FLT3L、IFNγ、TNFα受体、重组多肽CRYA_1B和PD1(纳武单抗)阻断用于治疗B16F10黑色素瘤的体内组合疗法
我们假设，TNFα受体(TNFaR)佐剂可通过放宽时间窗口来增强抗PD1治疗，其治疗可处于启动阶段或任何加强阶段(1°-5°加强)。我们还假设，TNFaR也可加快中央记忆性T细胞形成的速度，导致缩短启动-加强间隔。为测试FLT3L、IFNg、TNFα受体(TNFaR)、CRYA_1B和单剂量的PD1(纳武单抗)阻断在体内黑色素瘤小鼠模型中的作用，设计了FLT3L、IFNg、CRYA_1B(CRT诱导剂)和单剂量PD-1阻断的组合疗法(图31)。将雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)。IgG2a组：
1)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第18天的IgG2a(n＝5)，
2)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第22天的IgG2a(n＝5)，
3)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第30天的IgG2a(n＝5)，和4)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第37天的IgG2a(n＝5)；
抗PD1组：
1)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第18天的抗PD1(n＝5)，
2)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第22天的抗PD1(n＝5)，
3)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第30天的抗PD1(n＝5)，和4)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B与在第37天的抗PD1(n＝5)。
对于抗PD1/IgG2a治疗组，将抗PD1组的小鼠静脉内给予一次鼠抗PD1(大鼠IgG2a同种型)，或将IgG2a对照组静脉内给予一次大鼠IgG2a，全部均在指定日期以3mg/kg给予。肿瘤在5天内达到约55mm3(第5天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。小鼠在注射TNFaR(20μg，经由皮下注射)之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg，然后立即进行CRYA_1B治疗。*：从人类固定剂量70μg转换[假设人类60kg，70/60x37(人类Km)**x0.007(小鼠体表面积)**＝0.3μg]。CRYA_1B被用于启动和加强T细胞两者。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，从第12天开始，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射分别提供20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。对于加强T细胞的CRYA_1B疗法，从第31天开始，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射分别提供20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗重复两个周期。图31显示给药方案的示意图。根据Nair等人，J.Basic Clin Pharm,,27-31,201计算动物和人类之间的剂量守恒。在第19、23、31和38天，收获来自抗PD1和IgG2a组两者的小鼠的PBMC并通过流式细胞术进行分析，以确定群体中CD8+CD44+(经受抗原的)T细胞的比例。对于所有抗PD1组，中央记忆性T细胞(CD8+CD44+CD127+KLRG1-CD62L+)、效应记忆性T细胞(CD8+CD44+CD127+KLRG1+CD62L-)和效应T细胞(CD8+CD44+CD127-KLRG1+CD62L-)均大致均等地划分，中央记忆性T细胞占34％(表18)。对于所有IgG2a组，优势性群体为效应记忆性T细胞(70％)，中央记忆性T细胞占5％。
表18.用抗PD1抗体或IgG2a对照治疗后的T细胞群
对于注射单一抗PD1剂量的组，经受抗原的中央记忆性T细胞的百分比为无抗PD1治疗的组的6.6倍(33-34％相对于5％w/o抗PD1)。效应记忆性向中央记忆性T细胞的转换可经由CD62L的上调和KLRG1的下调实现。
实施例12-使用FLT3L、IFNg、TNFα受体、重组多肽CRYA_1B和多种PD1(纳武单抗)阻断剂量用于治疗B16F10黑色素瘤的体内组合疗法
为了测试FLT3L、IFNg、TNFα受体(TNFaR)、CRYA_1B和多剂量PD1阻断在体内小鼠模型中的作用，设计了组合疗法(图32)。使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)。治疗组：
1)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22天的抗PD1x1(n＝5)，
2)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22/25天的抗PD1x2(n＝5)，
3)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22/25/28天的抗PD1x3(n＝5)，
4)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22/25/28/31天的抗PD1x4(n＝5)，
5)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22/25/28/31/34天的抗PD1x5(n＝5)，
6)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22/25/28/31/34/37天的抗PD1x6(n＝5)，和
7)FLT3L/IFNg/TNFaR/CRYA_1B/在第22/25/28/31/34/37/40天的抗PD1x7(n＝5)。
对于抗PD1治疗，使小鼠静脉内给予鼠抗PD1(大鼠IgG2a同种型)，均在指定日期以3mg/kg给予。肿瘤在5天内达到约55mm3(第5天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。小鼠在注射TNFaR(20μg，经由皮下注射)之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg，然后立即进行CRYA_1B治疗。*：从人类固定剂量70μg转换[假设人类60Kg，70/60x37(人类Km)**x0.007(小鼠体表面积)**＝0.3]。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，第12天开始，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射分别提供20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。根据Nair等人，J.Basic ClinPharm,,27-31,201计算动物和人类之间的剂量保持。在第23、26、29、32、35、38和41天，收获来自所有抗PD1组的小鼠的PBMC并进行分析，以确定CD8+CD44+(经受抗原的)T细胞的比例。将T细胞比例绘制为与单一抗PD1治疗的相对百分比。CD8+CD44+细胞的相对百分比显示于表19中。
表19.使用抗PD1进行多剂量治疗后的CD8+CD44+T细胞比例
如所讨论的，CRYA_1B可被用于启动和加强T细胞两者。如这些结果所示，需要具有“更短”间隔的优化的T细胞启动至加强，以使T细胞在加强阶段快速增殖。具体地讲，这允许加强先前启动的中央记忆性T细胞，并允许进一步增加宿主内经受抗原的T细胞的总数。启动和加强识别肿瘤相关抗原的T细胞特别是对于寿命缩短或有限的癌症患者和肿瘤大小较大的患者特别地有利。
尽管在启动或任何加强阶段(1°-5°加强)的任何单一抗PD1治疗之后，CD8+中央记忆性的百分比都几乎相同(约33％)，但在T细胞启动阶段期间的抗PD1治疗导致CD8+中央记忆性T细胞的绝对数量比在T细胞加强阶段中更高。这是因为启动阶段的T细胞总体扩增率(≥10000倍，相当于>13次细胞分裂)显著高于任何加强阶段(5-8次细胞分裂)(Haring等人，Immunity,19-29,2006；Fraser等人，Immunity,171-183,2013)。最多“7次”抗PD1注射为可耐受的。但是，如上所示，单一抗PD1治疗比多重抗PD1治疗实现更高的CD8+CD44+T细胞绝对数量，并进而实现更多的CD8+中央记忆性T细胞。这是因为延长的PD1抑制损害T细胞的存活。(Odorizzi等人，J.Exp.Med.,1125-1137,2015)。因此，我们确定单一抗PD1治疗的最佳时间窗口位于启动阶段最后一次注射重组多肽CRYA_1B和第一加强阶段期间第一次注射CRYA_1B之间。
实施例13-T细胞启动和T细胞加强方案
T细胞启动-IgG2a-加强(x1)(对照)
使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)(n＝10)(图33)。肿瘤在5天内达到约50-55mm3(第5天)以开始实验。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于扩增树突细胞的FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于减少IL10并将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1TAM的IFNg治疗，小鼠在第12天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于启动T细胞的CRYA_1B，将作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。第23天，小鼠以3mg/kg静脉内注射大鼠IgG2a作为对照。第25天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第32天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，通过引入作为一个周期的CRYA_1B两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来进行T细胞加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)(图33)。第40天，肿瘤完全消退(CR)率为100％。T细胞启动-加强效力：治愈效力根据100％ CR(肿瘤完全消退率)时的最大治愈肿瘤体积相对于以上启动-IgG2a-加强方案(对照)来确定。使用启动-IgG2a-加强(x1，单一加强)方案作为对照，确定基线肿瘤体积，在100％ CR时为～50mm3。
T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x1)用于300mm3肿瘤
使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)(n＝10)。肿瘤在约13天内达到约300-310mm3(第13天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。图34显示给药方案的示意图。对于扩增树突细胞的FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于减少IL10并将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1TAM的IFNg治疗，小鼠在第20天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于启动T细胞的CRYA_1B，将作为一个周期的两天治疗(分别经由静脉内注射20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。第31天，小鼠以3mg/kg静脉内注射鼠抗PD1。第45天(从抗PD1注射起14天)，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第52天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，CRYA_1B T细胞加强方案通过使用作为一个周期的两天治疗(分别经由静脉内注射20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗来引入，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。图34显示给药方案。第60天，肿瘤完全消退(CR)率为100％。
启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x1)对300mm3肿瘤的效力：治愈效力根据100％CR(肿瘤完全消退率)时的最大治愈肿瘤体积相对于启动-IgG2a-加强(对照)在100％ CR时的～50mm3来确定。使用在CRYA_1B启动和CRYA_1B加强(单次加强)之间的单次抗PD1注射用于治疗～300mm3的肿瘤，根据治愈肿瘤体积，我们获得了约6倍治愈效力(～300mm3相对于～50mm3)。如先前所示，这与加强可得到的6.6倍中央记忆性T细胞相关(33％的启动/抗PD1相对于5％的启动/IgG2a)。
T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x1)用于400mm3肿瘤使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)(n＝10)。剂量方案显示于图35中。肿瘤在～14天内达到约400-410mm3(第14天)以开始实验。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于扩增树突细胞的FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于减少IL10并将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM的IFNg治疗，小鼠在第21天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于启动T细胞的CRYA_1B，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。第32天，小鼠以3mg/kg静脉内注射鼠抗PD1。第46天(从抗PD1注射起14天)，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第53天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第70天，肿瘤完全消退(CR)率为50％。
治愈效力根据100％ CR(肿瘤完全消退率)时的最大治愈肿瘤体积相对于启动-IgG2a-加强(对照)在100％ CR时的～50mm3来确定。使用在CRYA_1B启动和CRYA_1B加强(x1，单次加强)之间的单次抗PD1注射用于400mm3肿瘤，仅获得～50％ CR而不是100％ CR。这是由于肿瘤体积更大，由于肿瘤的侵袭性迁移，导致小鼠体内的转移，以及效应T细胞在单次加强之后的自然收缩。因此，小鼠无法维持足够高的CD8+CD44+T细胞来消除所有肿瘤转移。为避免持续的T细胞自然收缩达到最终稳态，给予多次加强(2-5次加强)以维持高水平的经受抗原的CD8+CD44+T细胞。持续而无损失的CD8+CD44+T细胞数量对于完全根除宿主体内的肿瘤转移非常重要。然而，在重复加强之后，完全分化的T细胞易受再刺激诱导的细胞死亡的影响(Show等人，Immunological Reviews,68-82,2010)。因此，最多可进行5个加强性周期，以防止T细胞过度刺激导致T细胞突然死亡。
T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x3)用于400mm3肿瘤
使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)(n＝10)。图36显示给药方案的示意图。肿瘤在～14天内达到约400-410mm3(第14天)以开始实验。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x Lx W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于扩增树突细胞的FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于减少IL10并将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM的IFNg治疗，小鼠在第21天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于启动T细胞的CRYA_1B，将作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗重复3个周期。第32天，小鼠以3mg/kg静脉内注射鼠抗PD1。第46天(从抗PD1注射起14天)，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第53天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第61天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第68天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第76天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第83天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第90天，肿瘤完全消退(CR)率为100％。
启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x3)对400mm3肿瘤的效力：治愈效力根据100％CR(肿瘤完全消退率)时的最大治愈肿瘤体积相对于启动-IgG2a-加强(对照)在100％ CR时的～50mm3来确定。使用在CRYA_1B启动和CRYA_1B加强之间的单次抗PD1注射，对于～400mm3肿瘤用总共3次加强，根据治愈肿瘤体积，我们获得了约8倍治愈效力(～400mm3相对于～50mm3)。
T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)用于～500mm3肿瘤
使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)(n＝10)。给药方案的示意图显示于图37中。肿瘤在～15天内达到约500-515mm3(第15天)以开始实验。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5xL x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于扩增树突细胞的FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于减少IL10并将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM的IFNg治疗，小鼠在第22天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg静脉内注射IFNg。对于启动T细胞的CRYA_1B，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。第33天，小鼠以3mg/kg静脉内注射鼠抗PD1。第47天(从抗PD1注射起14天)，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第54天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第62天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第69天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第77天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第84天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg和14mg/kg)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第92天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第99天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1 TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第107天，通过以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内来重复FLT3L治疗以扩增树突细胞。第114天，通过以0.3μg静脉内注射到小鼠体内来重复IFNg治疗以减少IL10并将M2 TAM重编程为M1TAM。4小时后，我们通过作为一个周期的两天治疗(分别为20mg/kg和14mg/kg，经由静脉内注射)然后是两天非治疗来开始CRYA_1B T细胞的加强，其中仅重复两个周期(相对于启动的3个周期)。第122天，肿瘤完全消退(CR)率为100％。
启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)对～500mm3肿瘤方案的治愈效力根据100％CR(肿瘤完全消退率)时的最大治愈肿瘤体积相对于启动-IgG2a-加强(对照)在100％ CR时的～50mm3来确定。使用在CRYA_1B启动和CRYA_1B加强方案之间的单次抗PD1注射，对于～500mm3肿瘤用总共5次加强，根据治愈肿瘤体积，获得了约10倍治愈效力(～500mm3相对于～50mm3)。值得注意的是，启动-抗PD1-加强(x5)的治愈效力相对于仅启动的方案为12.5倍(～500mm3相对于～40mm3)*。
实施例14-T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)用于人类转移性大肿瘤的治愈效力
使用以下假设，进行在启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)方案后的CD44+CD8+T细胞总数的计算(图37)。假设：人类总幼稚CD8+T细胞(4x1010个细胞)(Boon等人，Annu.Rev.Immunol.,175-208,2006)。人类幼稚CD8+T细胞对肿瘤抗原的平均前体频率(百万分之5)(Lammermann等人，Immunological Reviews,26-43,2008)。人类幼稚CD8+T细胞启动扩增(≥10000倍)(Haring等人，Immunity,19-29,2006)。人类记忆性CD8+T细胞第一加强扩增(40-倍；5-8次细胞分裂)(Williams等人，Nature,890-893,2006；Fraser等人，Immunity,171-183,2013)。人类记忆性CD8+T细胞第2-5加强扩增(～3倍；～1-2次细胞分裂)(Williams等人，Nature,890-893,2006；Rai等人，J.of.Immunol.,5652-5659,2014)。人类单个CD8+T细胞杀死2-3个目标(Wiedemann等人，PNAS,10985-10990,2006；McGavern等人，Nature Immunol,918-925,2002)。为简单起见，将CD4+T细胞活化排除在治愈效力评估之外。
按照人类T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)治疗方案，由多次加强导致的持续经受抗原的CD44+CD8+T细胞为～2.64x1010个，其可推定杀死～6.6x1010个肿瘤细胞，相当于约10cm直径的肿瘤大小。然而，在人类仅启动的治疗后，经受抗原的CD44+CD8+T细胞为～2x109个，其可推定杀死～5x109个肿瘤细胞，相当于约4.3cm直径的肿瘤大小。根据治愈肿瘤体积的效力，人类T细胞启动-PD1(纳武单抗)阻断-加强(x5)治疗具有相对于人类仅启动的治疗为12.58倍的治愈效力(103/4.33＝12.58)，与鼠模型的12.5倍治愈效力一致。
实施例15-CRYA_1B剂量优化
1)总CD3+CD8+T细胞的最大CD8+CD44+T细胞(经受抗原的CD8+T细胞)(Baaten等人，Front.Immunol.,1-12,2012)百分比和2)总CD8+CD44+T细胞的最小CD8+CD44+PD1+TIM3+T细胞(T细胞失能或耗竭)(Chikuma等人，J.Immunol.,6682-6689,2009；Martinez等人，Immunity,265-278,2015；Wang等人，J.Hepatol.,731-741,2019)百分比，作为确定最佳剂量方案的标准，其百分比相对物种不变。
设计实验以确定CRYA_1B剂量优化，并且给药策略的示意图显示于图39中。使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)用于FLT3L/IFNg/CRYA_1B方案，其在治疗周期的第一、第二天使用不同的CRYA_1B剂量(剂量d1；剂量d2)：25mg/kg；16mg/kg(n＝5)、25mg/kg；15mg/kg(n＝5)、22mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；20mg/kg(n＝5)、20mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；16mg/kg(n＝5)、20mg/kg；14mg/kg(n＝5)、20mg/kg；13mg/kg(n＝5)、20mg/kg；12mg/kg(n＝5)、19mg/kg；19mg/kg(n＝5)、18mg/kg；18mg/kg(n＝5)和18mg/kg；20mg/kg(n＝5)。肿瘤在6天内达到约80-90mm3(第6天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在第13天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg。*：从人类固定剂量70μg转换[假设人类60Kg，70/60x37(人类Km)x0.007(小鼠体表面积)＝0.3]。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射剂量d1；剂量d2 mg/kg)然后是两天非治疗重复3个周期。第30天，收获所有小鼠的PBMC用于CD8+CD44+(经受抗原的)T细胞百分比测定。表20显示实验的结果。
表20.用CRYA_1B剂量优化治疗后的T细胞比例
CRYA_1B剂量优化计算
根据物种不变的最大CD8+CD44+/最小PD1+TIM3+T细胞百分比测定，CRYA_1B剂量的规则/最大值如下：
1)剂量第1天+剂量第2天≤40mg/kg
2)剂量第1天≤22mg/kg
3)剂量第1天≥剂量第2天
当剂量第1天+剂量第2天>40mg/kg或剂量第1天>22mg/kg时，CD8+CD44+PD1+TIM3+T细胞百分比显著增加(25/16mg/kg或25/15mg/kg的15％相对于22/18mg/kg的5％)，其原因是T细胞过度刺激，导致T细胞耗竭伴随TOX基因上调，导致PD1和TIM3的高表达(Wang等人，J.Hepatol.,731-741,2019)。
当剂量第1天<剂量第2天(例如18mg/kg；20mg/kg相对于20mg/kg；18mg/kg)时，CD8+CD44+T细胞百分比显著减少(18/20mg/kg的28％相对于20/18mg/kg的35％)(表20)。我们得到了一系列最佳剂量，比如分别为22mg/kg；18mg/kg、20mg/kg；20mg/kg、20mg/kg；18mg/kg、20mg/kg；16mg/kg和20mg/kg；14mg/kg，全部均在启动之后具有35％的CD8+CD44+T细胞和仅具有～5％的CD8+CCD44+PD1+TIM3+T细胞(表20)。
因此，最佳剂量满足以下条件。
1)剂量第1天+剂量第2天≤40mg/kg
2)20mg/kg≤剂量第1天≤22mg/kg
3)14mg/kg≤剂量第2天≤20mg/kg
当CD8+CD44+T细胞百分比为35％时，我们观察到非常稳健的治疗作用，其中的这种百分比与具有10-40％活化的CD8+T细胞的非常有效的Dryvax(人类天花)疫苗一致(Miller等人，Immunity,710-722,2008)。
20mg/kg和14mg/kg分别显示出有效的治疗结果。之后确定了一系列新的优化剂量。
物种不变的CD8+CD44+T细胞百分比剂量优化，来自
1)剂量第1天+剂量第2天≤40mg/kg，
2)20mg/kg≤剂量第1天≤22mg/kg，
3)14mg/kg≤剂量第2天≤20mg/kg，
确定了更广泛范围的最佳剂量，比如分别为22mg/kg；18mg/kg、20mg/kg；20mg/kg、20mg/kg；18mg/kg、20mg/kg；16mg/kg、20mg/kg；14mg/kg。
实施例16-测定使用用于治疗B16F10黑色素瘤使用FLT3L、IFNγ、TNFα受体和重组多肽CRYA_1B的体内组合疗法对体温的副作用
人类正常温度为约36.5-37.5℃。C57BL/6小鼠正常温度为约36.5-38℃。人类和C57BL/6小鼠具有相似的体温动力学。人类和C57BL/6小鼠两者均可产生急性炎症应答，分别伴随人类CRP和鼠SAP的稳健上调，这些均由IL6诱导，而BALB/c小鼠仅能通过鼠SAP的适度上调来应答(Mortenson等人，J.Immunol,885-889,1983)，其缺陷将无法预测在人类T细胞癌症免疫疗法中经常观察到的IL6细胞因子风暴。CRYA_1B诱导先天免疫的稳健和急性的活化，导致长期的适应性免疫(图40)。我们检测了CRYA_1B 20mg/kg；20mg/kg治疗在启动阶段的体温波动。目的是观察任何潜在不良事件的迹象。
用FLT3L、IFNg和重组多肽CRYA_1B的体内组合治疗的体温时间过程
使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)用于FLT3L/IFNg/CRYA_1B方案，其治疗周期的第一、第二天使用CRYA_1B的20mg/kg；20mg/kg(n＝5)(图41)。肿瘤在6天内达到约80-90mm3(第6天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在第13天首次CRYA_1B治疗之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg。为监测体温，在第13天，我们给予CRYA_1B进行两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg；20mg/kg)。*：从人类固定剂量70μg转换[假设人类60Kg，70/60x37(人类Km)x0.007(小鼠体表面积)＝0.3]。表21显示体温的结果。不良事件：在组合治疗中没有TNFaR佐剂情况下的中度(2级)体温过低。
表21.在FLT3L、IFNγ和CRYA_1B治疗之后癌症宿主的体温
用FLT3L、IFNg、TNFaR和重组多肽CRYA_1B的体内组合治疗的体温时间过程
使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10细胞(免疫原性不良的侵袭性黑色素瘤细胞)用于FLT3L、IFNg、TNFaR和CRYA_1B方案，其在三周期治疗的第一、第二天使用CRYA_1B的20mg/kg、20mg/kg(n＝5)(图42)。肿瘤在6天内达到约80-90mm3(第6天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在第13天固定低剂量TNFaR(Enbrel)治疗(以20μg**皮下注射)之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg。*：从人类固定剂量70μg转换[假设人类60Kg,，0μg/60x37(人类Km)***x0.007(小鼠体表面积)***＝0.3μg]。**：鼠20μg相当于人类5mg[假设小鼠20g，20μg/0.02x3(小鼠Km)***x1.62(人类体表面积)***＝～5mg]。***：Nair,J.Basic Clin Pharm.,27-31,201。为监测体温，在第13天，我们在TNFaR注射之后立即给予CRYA_1B进行作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射20mg/kg；20mg/kg)然后是两周非治疗，其中重复3个周期。表22显示实验的结果。
表22.在FLT3L、IFNγ、TNFaR和CRYA_1B治疗之后癌症宿主的体温
确定由于用CRYA_1B治疗所致的不良事件(体温过低相对于体温过高)
对于用T细胞免疫疗法治疗的患者，经常观察到细胞因子释放综合征(CRS)(尤其是细胞因子IL6、IFNg和TNFa)(Suntharalingam等人，N.Engl.J.Med.,1018-1028,2006；Turtle等人，J.Clin.Invest.,2123-2138,2016)。此外，细胞因子释放综合征的特征为体温过高(≥38℃)(来自IL6和/或IFNg)(Davila等人，Sci.Transl.Med.,1-10,2014)和/或体温过低(≤35℃)(来自TNFa)(Brady等人，Clin.Transl.Immunology,1-7,2014；Alegre等人，Eur.J.Immunol,707-710,1990)。
如上所述，CRYA_1B给予期间癌症宿主的体温波动发生在启动阶段。在没有TFNaR佐剂(Enbrel)的情况下，在CRYA_1B临床剂量的一周期给予期间，癌症宿主将经受2级不良事件(AE)(美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)：不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE)5.0版，美国国立卫生研究院(National institute of Health)，2017)，即中度体温过低(32-35℃)，稳态处于37℃。在CRYA_1B临床剂量的三周期给予期间用吸收TNFa(体温过低的原因)的TFNaR佐剂(Enbrel)，癌症宿主将经受2级不良事件(美国国家癌症研究所：不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版，美国国立卫生研究院，2017)，即中度发热(39-40℃)，稳态处于37℃。在没有TNFaR治疗的情况下(中度体温过低)并未观察到该体温调节。全身性自然发热范围的体温过高(38-41℃)加强癌症免疫疗法的免疫活化/应答(Evans等人，Nat.Rev.Immunol.,335-349,2015；Fisher等人，J.of Clin.Invest.,3846-3859,2011)。长时间不受控制的严重(4级AE)(美国国家癌症研究所：不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版，美国国立卫生研究院，2017)体温过低或体温过高而不恢复至37℃将增加发病率和死亡率。但是，对于患者来说，体温过低为比体温过高更严重的风险因素(Bota等人，Intensive Care Med.,811-816,2004；Laupland等人，Crit.Care Med.,145-151,2012)。因此，对于疗法，比如会导致诸如由治疗中各种细胞因子水平升高引起的发烧或感冒等不可避免的不良症状的T细胞免疫疗法，体温过高的发热范围(38-41℃)比体温过低更可取。
无论体温过低还是体温过高的中度(2级)不良事件，在最佳CRYA_1B治疗剂量范围内(22mg/kg；18mg/kg、20mg/kg；20mg/kg、20mg/kg；14mg/kg等)，未观察到癌症宿主行为的显著变化或发病率增加的迹象，这主要是由于小鼠保持体温自限性恢复至37℃的能力。然而，TNFaR(Enbrel)在不损害癌症治愈效力的情况下作为总体方案的一部分被包括在内，以调节体温并防止不良事件比如体温过低至体温过高，从而允许更好地管理发病风险(Bota等人，Intensive Care Med.,811-816,2004；Laupland等人，Crit.Care Med.,145-151,2012)和允许增强癌症免疫疗法治疗(Evans等人，Nat.Rev.Immunol.,335-349,2015；Fisher等人，J.of Clin.Invest.,3846-3859,2011)。
实施例17-组合疗法-TNFaR的体内CRYA_1B剂量优化
设计剂量方案以确定与TNFaR组合治疗的CRYA_1B剂量优化(图43)。使雌性C57BL/6小鼠皮下接种1x106个B16F10免疫原性不良的侵袭性黑素瘤细胞用于FLT3L、IFNg、TNFaR和CRYA_1B方案，其在治疗周期的第一、第二天使用不同的CRYA_1B剂量(剂量d1；剂量d2)：25mg/kg；16mg/kg(n＝5)、25mg/kg；15mg/kg(n＝5)、22mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；20mg/kg(n＝5)、20mg/kg；18mg/kg(n＝5)、20mg/kg；16mg/kg(n＝5)、20mg/kg；14mg/kg(n＝5)、20mg/kg；13mg/kg(n＝5)、20mg/kg；12mg/kg(n＝5)、19mg/kg；19mg/kg(n＝5)、18mg/kg；18mg/kg(n＝5)和18mg/kg；20mg/kg(n＝5)。肿瘤在6天内达到约80-90mm3(第6天)。使用卡尺在两个维度上测量肿瘤大小，并按以下公式确定体积：V＝0.5x L x W2，其中L和W分别为肿瘤的长直径和短直径。对于FLT3L治疗，然后将FLT3L以4μg(560μg/m2)连续7天每天静脉内注射到小鼠体内。对于IFNg治疗，小鼠在第13天注射TNFaR(20μg，经由皮下注射)之前4小时以0.3μg*静脉内注射IFNg，然后立即进行CRYA_1B治疗。对于启动T细胞的CRYA_1B疗法，将作为一个周期的两天治疗(经由静脉内注射剂量d1；剂量d2(mg/kg))然后是两天非治疗重复3个周期。第30天，收获并分析所有小鼠中的PBMC以确定CD8+CD44+(经受抗原的)T-细胞在群体中的比例。
表23.用CRYA_1B剂量优化治疗后的T细胞比例
因此，用另外的TNFaR佐剂，CRYA_1B的最佳剂量满足以下条件。
1)剂量第1天+剂量第2天≤40mg/kg
2)20mg/kg≤剂量第1天≤22mg/kg
3)14mg/kg≤剂量第2天≤20mg/kg
总之，TNFaR佐剂被用于体温调节和防止不良事件，比如体温过低和体温过高的自然发热范围(38-41℃)。其并不对优化的剂量和总体治愈效力具有负面影响。
因此，考虑到每种组分的剂量优化，确定了用于治疗转移性大肿瘤的体内组合免疫疗法方案(图44)。图44显示启动-PD1-(纳武单抗)阻断-增强(x5)方案以及方案中FLT3L、IFNγ、TNFaR、CRYA_1B和PD-1(纳武单抗)阻断的剂量和时间。
鉴于本公开，可在没有过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，可将变化应用于本文所述的方法、步骤或方法的步骤序列中，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地讲，显而易见的是，化学和生理上都相关的某些药剂可取代本文所述的药剂，同时可获得相同或类似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这种类似取代和修改均被视为处于如所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110> Imunami Laboratories Pte. Ltd.
<120> 用于癌症治疗的重组多肽和方法
<130> IMHC-003/F01WO 338748-2022
<160> 52
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 173
<212> PRT
<213> 鸿雁(Anser cygnoides)
<400> 1
Met Asp Ile Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Ala Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Leu Leu
20 25 30
Glu Tyr Asp Leu Leu Pro Leu Phe Ser Ser Thr Ile Ser Pro Tyr Tyr
35 40 45
Arg Gln Ser Leu Phe Arg Ser Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Glu Val
50 55 60
Arg Ser Asp Arg Asp Lys Phe Thr Ile Met Leu Asp Val Lys His Phe
65 70 75 80
Ser Pro Glu Asp Leu Ser Val Lys Ile Ile Asp Asp Phe Val Glu Ile
85 90 95
His Gly Lys His Ser Glu Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Ser Arg
100 105 110
Glu Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ala Asn Val Asp Gln Ser Ala
115 120 125
Ile Thr Cys Ser Leu Ser Gly Asp Gly Met Leu Thr Phe Ser Gly Pro
130 135 140
Lys Val Pro Ser Asn Met Asp Pro Thr His Ser Glu Arg Pro Ile Pro
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser
165 170
<210> 2
<211> 173
<212> PRT
<213> 美洲鸵(Rhea americana)
<400> 2
Met Asp Ile Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Ala Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Leu Leu
20 25 30
Glu Tyr Asp Leu Leu Pro Leu Phe Ser Ser Thr Ile Ser Pro Tyr Tyr
35 40 45
Arg Gln Ser Leu Phe Arg Ser Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser Glu Val
50 55 60
Arg Ser Asp Arg Glu Lys Phe Thr Ile Met Leu Asp Val Lys His Phe
65 70 75 80
Ser Pro Glu Asp Leu Ser Val Lys Ile Ile Asp Asp Phe Val Glu Ile
85 90 95
His Gly Lys His Ser Glu Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Ser Arg
100 105 110
Glu Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ser Asn Val Asp Gln Ser Ala
115 120 125
Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Asp Gly Met Leu Thr Phe Ser Gly Pro
130 135 140
Lys Val Gln Ala Asn Met Asp Pro Ser His Ser Glu Arg Pro Ile Pro
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser
165 170
<210> 3
<211> 149
<212> PRT
<213> 绿头鸭(Anas platyrhynchos)
<400> 3
Arg Ala Leu Gly Pro Leu Ile Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe
1 5 10 15
Gly Glu Gly Leu Leu Glu Tyr Asp Leu Leu Pro Leu Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ile Ser Pro Tyr Tyr Arg Gln Ser Leu Phe Arg Ser Val Leu Glu Ser
35 40 45
Gly Ile Ser Glu Val Arg Ser Asp Arg Asp Lys Phe Thr Ile Met Leu
50 55 60
Asp Val Lys His Phe Ser Pro Glu Asp Leu Ser Val Lys Ile Ile Asp
65 70 75 80
Asp Phe Val Glu Ile His Gly Lys His Ser Glu Arg Gln Asp Asp His
85 90 95
Gly Tyr Ile Ser Arg Glu Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ala Asn
100 105 110
Val Asp Gln Ser Ala Ile Thr Cys Ser Leu Ser Gly Asp Gly Met Leu
115 120 125
Thr Phe Ser Gly Pro Lys Val Pro Ser Asn Met Asp Pro Thr His Ser
130 135 140
Glu Arg Pro Ile Pro
145
<210> 4
<211> 174
<212> PRT
<213> 绿头鸭
<400> 4
Met Asp Ile Thr Ile His Asn Pro Leu Ile Arg Arg Pro Leu Phe Ser
1 5 10 15
Trp Leu Ala Pro Ser Arg Ile Phe Asp Gln Ile Phe Gly Glu His Leu
20 25 30
Gln Glu Ser Glu Leu Leu Pro Ala Ser Pro Ser Leu Ser Pro Phe Leu
35 40 45
Met Arg Ser Pro Ile Phe Arg Met Pro Ser Trp Leu Glu Thr Gly Leu
50 55 60
Ser Glu Met Arg Leu Glu Lys Asp Lys Phe Ser Val Asn Leu Asp Val
65 70 75 80
Lys His Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Asp Met
85 90 95
Val Glu Ile His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Phe
100 105 110
Ile Ala Arg Glu Phe Asn Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Asp Val Asp
115 120 125
Pro Leu Thr Ile Thr Ser Ser Leu Ser Leu Asp Gly Val Leu Thr Val
130 135 140
Ser Ala Pro Arg Lys Gln Ser Asp Val Pro Glu Arg Ser Ile Pro Ile
145 150 155 160
Thr Arg Glu Glu Lys Pro Ala Ile Ala Gly Ala Gln Arg Lys
165 170
<210> 5
<211> 173
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Met Asp Val Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Thr Leu Gly Pro
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Leu Phe
20 25 30
Glu Tyr Asp Leu Leu Pro Phe Leu Ser Ser Thr Ile Ser Pro Tyr Tyr
35 40 45
Arg Gln Ser Leu Phe Arg Thr Val Leu Asp Ser Gly Ile Ser Glu Val
50 55 60
Arg Ser Asp Arg Asp Lys Phe Val Ile Phe Leu Asp Val Lys His Phe
65 70 75 80
Ser Pro Glu Asp Leu Thr Val Lys Val Gln Asp Asp Phe Val Glu Ile
85 90 95
His Gly Lys His Asn Glu Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Ser Arg
100 105 110
Glu Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ser Asn Val Asp Gln Ser Ala
115 120 125
Leu Ser Cys Ser Leu Ser Ala Asp Gly Met Leu Thr Phe Cys Gly Pro
130 135 140
Lys Ile Gln Thr Gly Leu Asp Ala Thr His Ala Glu Arg Ala Ile Pro
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser
165 170
<210> 6
<211> 186
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)
<400> 6
Met Ala Asn Ile Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ala Asp Asp Leu Gly Arg
1 5 10 15
Met Ser Met Val Pro Phe Tyr Glu Pro Tyr Tyr Cys Gln Arg Gln Arg
20 25 30
Asn Pro Tyr Leu Ala Leu Val Gly Pro Met Glu Gln Gln Leu Arg Gln
35 40 45
Leu Glu Lys Gln Val Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala Val Ser
50 55 60
Lys Ile Gly Lys Asp Gly Phe Gln Val Cys Met Asp Val Ser His Phe
65 70 75 80
Lys Pro Ser Glu Leu Val Val Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Leu Val
85 90 95
Glu Gly Asn His Glu Glu Arg Glu Asp Asp His Gly Phe Ile Thr Arg
100 105 110
His Phe Val Arg Arg Tyr Ala Leu Pro Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Lys
115 120 125
Val Ala Ser Thr Leu Ser Ser Asp Gly Val Leu Thr Ile Lys Val Pro
130 135 140
Lys Pro Pro Ala Ile Glu Asp Lys Gly Asn Glu Arg Ile Val Gln Ile
145 150 155 160
Gln Gln Val Gly Pro Ala His Leu Asn Val Lys Glu Asn Pro Lys Glu
165 170 175
Ala Val Glu Gln Asp Asn Gly Asn Asp Lys
180 185
<210> 7
<211> 174
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇
<400> 7
Met Arg Ser Leu Pro Met Phe Trp Arg Met Ala Glu Glu Met Ala Arg
1 5 10 15
Met Pro Arg Leu Ser Ser Pro Phe His Ala Phe Phe His Glu Pro Pro
20 25 30
Val Trp Ser Val Ala Leu Pro Arg Asn Trp Gln His Ile Ala Arg Trp
35 40 45
Gln Glu Gln Glu Leu Ala Pro Pro Ala Thr Val Asn Lys Asp Gly Tyr
50 55 60
Lys Leu Thr Leu Asp Val Lys Asp Tyr Ser Glu Leu Lys Val Lys Val
65 70 75 80
Leu Asp Glu Ser Val Val Leu Val Glu Ala Lys Ser Glu Gln Gln Glu
85 90 95
Ala Glu Gln Gly Gly Tyr Ser Ser Arg His Phe Leu Gly Arg Tyr Val
100 105 110
Leu Pro Asp Gly Tyr Glu Ala Asp Lys Val Ser Ser Ser Leu Ser Asp
115 120 125
Asp Gly Val Leu Thr Ile Ser Val Pro Asn Pro Pro Gly Val Gln Glu
130 135 140
Thr Leu Lys Glu Arg Glu Val Thr Ile Glu Gln Thr Gly Glu Pro Ala
145 150 155 160
Lys Lys Ser Ala Glu Glu Pro Lys Asp Lys Thr Ala Ser Gln
165 170
<210> 8
<211> 174
<212> PRT
<213> 鸿雁
<400> 8
Met Asp Ile Thr Ile His Asn Pro Leu Ile Arg Arg Pro Leu Phe Ser
1 5 10 15
Trp Leu Ala Pro Ser Arg Ile Phe Asp Gln Ile Phe Gly Glu His Leu
20 25 30
Gln Glu Ser Glu Leu Leu Pro Ala Ser Pro Ser Leu Ser Pro Phe Leu
35 40 45
Met Arg Ser Pro Ile Phe Arg Met Pro Ser Trp Leu Glu Thr Gly Leu
50 55 60
Ser Glu Met Arg Leu Glu Lys Asp Lys Phe Ser Val Asn Leu Asp Val
65 70 75 80
Lys His Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Asp Met
85 90 95
Val Glu Ile His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Phe
100 105 110
Ile Ala Arg Glu Phe Asn Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Asp Val Asp
115 120 125
Pro Leu Thr Ile Thr Ser Ser Leu Ser Leu Asp Gly Val Leu Thr Val
130 135 140
Ser Ala Pro Arg Lys Gln Ser Asp Val Pro Glu Arg Ser Ile Pro Ile
145 150 155 160
Thr Arg Glu Glu Lys Pro Ala Ile Ala Gly Ala Gln Arg Lys
165 170
<210> 9
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 9
Met Asp Ile Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Ala Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Glu Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Ser Gly Leu Leu
20 25 30
Ser Tyr Asp Leu Leu Pro Leu Phe Glu Glu Thr Ile Glu Pro Tyr Tyr
35 40 45
Arg Gln Glu Leu Phe Arg Glu Val Leu Ser Glu Gly Ile Glu Ser Val
50 55 60
Arg Glu Asp Arg Asp Lys Phe Thr Ile Met Leu Asp Val Lys His Phe
65 70 75 80
Glu Pro Ser Asp Leu Glu Val Lys Ile Ile Asp Asp Phe Val Ser Ile
85 90 95
His Gly Lys His Glu Ser Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Glu Arg
100 105 110
Ser Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ala Asn Val Asp Gln Glu Ala
115 120 125
Ile Thr Cys Glu Leu Glu Gly Asp Gly Met Leu Thr Phe Glu Gly Pro
130 135 140
Lys Val Pro Glu Asn Met Asp Pro Thr His Glu Ser Arg Pro Ile Pro
145 150 155 160
Val Glu Arg Ser Ser Lys Pro Thr Glu Ala Pro Glu Glu
165 170
<210> 10
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 10
Met Asp Ile Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Ala Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Glu Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Ser Gly Leu Leu
20 25 30
Ser Tyr Asp Leu Leu Pro Leu Phe Glu Glu Thr Ile Glu Pro Tyr Tyr
35 40 45
Arg Gln Glu Leu Phe Arg Glu Val Leu Ser Glu Gly Ile Glu Ser Val
50 55 60
Arg Glu Asp Arg Ser Lys Phe Thr Ile Met Leu Asp Val Lys His Phe
65 70 75 80
Glu Pro Ser Asp Leu Glu Val Lys Ile Ile Asp Asp Phe Val Ser Ile
85 90 95
His Gly Lys His Glu Ser Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Glu Arg
100 105 110
Ser Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Glu Asn Val Asp Gln Glu Ala
115 120 125
Ile Thr Cys Glu Leu Glu Glu Asp Gly Met Leu Thr Phe Glu Gly Pro
130 135 140
Lys Val Gln Ala Asn Met Asp Pro Glu His Glu Ser Arg Pro Ile Pro
145 150 155 160
Val Glu Arg Ser Ser Lys Pro Thr Glu Ala Pro Glu Glu
165 170
<210> 11
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 11
Arg Ala Leu Gly Pro Leu Ile Pro Glu Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe
1 5 10 15
Gly Ser Gly Leu Leu Ser Tyr Asp Leu Leu Pro Leu Phe Glu Glu Thr
20 25 30
Ile Glu Pro Tyr Tyr Arg Gln Glu Leu Phe Arg Glu Val Leu Ser Glu
35 40 45
Gly Ile Glu Ser Val Arg Glu Asp Arg Asp Lys Phe Thr Ile Met Leu
50 55 60
Asp Val Lys His Phe Glu Pro Ser Asp Leu Glu Val Lys Ile Ile Asp
65 70 75 80
Asp Phe Val Ser Ile His Gly Lys His Glu Ser Arg Gln Asp Asp His
85 90 95
Gly Tyr Ile Glu Arg Ser Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ala Asn
100 105 110
Val Asp Gln Glu Ala Ile Thr Cys Glu Leu Glu Gly Asp Gly Met Leu
115 120 125
Thr Phe Glu Gly Pro Lys Val Pro Glu Asn Met Asp Pro Thr His Glu
130 135 140
Ser Arg Pro Ile Pro
145
<210> 12
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 12
Met Ser Ile Thr Ile His Asn Pro Leu Ile Arg Arg Pro Leu Phe Asp
1 5 10 15
Trp Leu Ala Pro Asp Arg Ile Phe Ser Gln Ile Phe Gly Glu His Leu
20 25 30
Gln Glu Asp Glu Leu Leu Pro Ala Asp Pro Asp Leu Asp Pro Phe Leu
35 40 45
Met Arg Asp Pro Ile Phe Arg Met Pro Asp Trp Leu Glu Thr Gly Leu
50 55 60
Asp Glu Met Arg Leu Glu Lys Ser Lys Phe Asp Val Asn Leu Ser Val
65 70 75 80
Lys His Phe Asp Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Met
85 90 95
Val Glu Ile His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Ser Glu His Gly Phe
100 105 110
Ile Ala Arg Glu Phe Asn Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Ser Val Ser
115 120 125
Pro Leu Thr Ile Thr Asp Asp Leu Asp Leu Ser Gly Val Leu Thr Val
130 135 140
Asp Ala Pro Arg Lys Gln Asp Ser Val Pro Glu Arg Asp Ile Pro Ile
145 150 155 160
Thr Arg Glu Glu Lys Pro Ala Ile Ala Gly Ala Gln Arg Lys
165 170
<210> 13
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 13
Met Asp Val Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Thr Leu Gly Pro
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Glu Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Ser Gly Leu Phe
20 25 30
Ser Tyr Asp Leu Leu Pro Phe Leu Glu Glu Thr Ile Glu Pro Tyr Tyr
35 40 45
Arg Gln Glu Leu Phe Arg Thr Val Leu Asp Glu Gly Ile Glu Ser Val
50 55 60
Arg Glu Asp Arg Asp Lys Phe Val Ile Phe Leu Asp Val Lys His Phe
65 70 75 80
Glu Pro Ser Asp Leu Thr Val Lys Val Gln Asp Asp Phe Val Ser Ile
85 90 95
His Gly Lys His Asn Ser Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Glu Arg
100 105 110
Ser Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Glu Asn Val Asp Gln Glu Ala
115 120 125
Leu Glu Cys Glu Leu Glu Ala Asp Gly Met Leu Thr Phe Cys Gly Pro
130 135 140
Lys Ile Gln Thr Gly Leu Asp Ala Thr His Ala Ser Arg Ala Ile Pro
145 150 155 160
Val Glu Arg Ser Ser Lys Pro Thr Glu Ala Pro Glu Glu
165 170
<210> 14
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 14
Met Ala Asn Ile Pro Leu Leu Leu Ser Leu Ala Val Val Leu Gly Arg
1 5 10 15
Met Ser Met Asp Pro Phe Tyr Glu Pro Tyr Tyr Cys Gln Arg Gln Arg
20 25 30
Asn Pro Tyr Leu Ala Leu Asp Gly Pro Met Glu Gln Gln Leu Arg Gln
35 40 45
Leu Glu Lys Gln Asp Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ala Asp Ser
50 55 60
Lys Ile Gly Lys Val Gly Phe Gln Asp Cys Met Val Asp Ser His Phe
65 70 75 80
Lys Pro Ser Glu Leu Asp Asp Lys Asp Gln Val Asn Ser Asp Leu Asp
85 90 95
Glu Gly Asn His Glu Glu Arg Glu Val Val His Gly Phe Ile Thr Arg
100 105 110
His Phe Asp Arg Arg Tyr Ala Leu Pro Pro Gly Tyr Glu Ala Val Lys
115 120 125
Asp Ala Ser Thr Leu Ser Ser Val Gly Asp Leu Thr Ile Lys Asp Pro
130 135 140
Lys Pro Pro Ala Ile Glu Val Lys Gly Asn Glu Arg Ile Asp Gln Ile
145 150 155 160
Gln Gln Asp Gly Pro Ala His Leu Asn Asp Lys Glu Asn Pro Lys Glu
165 170 175
Ala Asp Glu Gln Val Asn Gly Asn Val Lys
180 185
<210> 15
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 15
Met Arg Leu Ser Pro Met Phe Trp Arg Met Ala Glu Glu Met Ala Arg
1 5 10 15
Met Pro Arg Ser Leu Leu Pro Phe His Ala Phe Phe His Glu Pro Pro
20 25 30
Asp Trp Leu Asp Ala Ser Pro Arg Asn Trp Gln His Ile Ala Arg Trp
35 40 45
Gln Glu Gln Glu Ser Ala Pro Pro Ala Thr Asp Asn Lys Val Gly Tyr
50 55 60
Lys Ser Thr Ser Val Asp Lys Val Tyr Leu Glu Ser Lys Asp Lys Asp
65 70 75 80
Ser Val Glu Leu Asp Asp Ser Asp Glu Ala Lys Leu Glu Gln Gln Glu
85 90 95
Ala Glu Gln Gly Gly Tyr Leu Leu Arg His Phe Ser Gly Arg Tyr Asp
100 105 110
Ser Pro Val Gly Tyr Glu Ala Val Lys Asp Leu Leu Leu Ser Leu Val
115 120 125
Val Gly Asp Ser Thr Ile Leu Asp Pro Asn Pro Pro Gly Asp Gln Glu
130 135 140
Thr Ser Lys Glu Arg Glu Asp Thr Ile Glu Gln Thr Gly Glu Pro Ala
145 150 155 160
Lys Lys Leu Ala Glu Glu Pro Lys Val Lys Thr Ala Leu Gln
165 170
<210> 16
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多肽
<400> 16
Met Ser Ile Thr Ile His Asn Pro Leu Ile Arg Arg Pro Leu Phe Asp
1 5 10 15
Trp Leu Ala Pro Asp Arg Ile Phe Ser Gln Ile Phe Gly Glu His Leu
20 25 30
Gln Glu Asp Glu Leu Leu Pro Ala Asp Pro Asp Leu Asp Pro Phe Leu
35 40 45
Met Arg Asp Pro Ile Phe Arg Met Pro Asp Trp Leu Glu Thr Gly Leu
50 55 60
Asp Glu Met Arg Leu Glu Lys Ser Lys Phe Asp Val Asn Leu Ser Val
65 70 75 80
Lys His Phe Asp Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Met
85 90 95
Val Glu Ile His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Ser Glu His Gly Phe
100 105 110
Ile Ala Arg Glu Phe Asn Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Ser Val Ser
115 120 125
Pro Leu Thr Ile Thr Asp Asp Leu Asp Leu Ser Gly Val Leu Thr Val
130 135 140
Asp Ala Pro Arg Lys Gln Asp Ser Val Pro Glu Arg Asp Ile Pro Ile
145 150 155 160
Thr Arg Glu Glu Lys Pro Ala Ile Ala Gly Ala Gln Arg Lys
165 170
<210> 17
<211> 519
<212> DNA
<213> 鸿雁
<400> 17
atggatatta ccattcagca tccgtggttt aaacgcgcgc tgggcccgct gattccgagc 60
cgcctgtttg atcagttttt tggcgaaggc ctgctggaat atgatctgct gccgctgttt 120
agcagcacca ttagcccgta ttatcgccag agcctgtttc gcagcgtgct ggaaagcggc 180
attagcgaag tgcgcagcga tcgcgataaa tttaccatta tgctggatgt gaaacatttt 240
agcccggaag atctgagcgt gaaaattatt gatgattttg tggaaattca tggcaaacat 300
agcgaacgcc aggatgatca tggctatatt agccgcgaat ttcatcgccg ctatcgcctg 360
ccggcgaacg tggatcagag cgcgattacc tgcagcctga gcggcgatgg catgctgacc 420
tttagcggcc cgaaagtgcc gagcaacatg gatccgaccc atagcgaacg cccgattccg 480
gtgagccgcg aagaaaaacc gaccagcgcg ccgagcagc 519
<210> 18
<211> 519
<212> DNA
<213> 美洲鸵
<400> 18
atggatatta ccattcagca tccgtggttt aaacgcgcgc tgggcccgct gattccgagc 60
cgcctgtttg atcagttttt tggcgaaggc ctgctggaat atgatctgct gccgctgttt 120
agcagcacca ttagcccgta ttatcgccag agcctgtttc gcagcgtgct ggaaagcggc 180
attagcgaag tgcgcagcga tcgcgaaaaa tttaccatta tgctggatgt gaaacatttt 240
agcccggaag atctgagcgt gaaaattatt gatgattttg tggaaattca tggcaaacat 300
agcgaacgcc aggatgatca tggctatatt agccgcgaat ttcatcgccg ctatcgcctg 360
ccgagcaacg tggatcagag cgcgattacc tgcagcctga gcagcgatgg catgctgacc 420
tttagcggcc cgaaagtgca ggcgaacatg gatccgagcc atagcgaacg cccgattccg 480
gtgagccgcg aagaaaaacc gaccagcgcg ccgagcagc 519
<210> 19
<211> 447
<212> DNA
<213> 绿头鸭
<400> 19
cgcgcgctgg gcccgctgat tccgagccgc ctgtttgatc agttttttgg cgaaggcctg 60
ctggaatatg atctgctgcc gctgtttagc agcaccatta gcccgtatta tcgccagagc 120
ctgtttcgca gcgtgctgga aagcggcatt agcgaagtgc gcagcgatcg cgataaattt 180
accattatgc tggatgtgaa acattttagc ccggaagatc tgagcgtgaa aattattgat 240
gattttgtgg aaattcatgg caaacatagc gaacgccagg atgatcatgg ctatattagc 300
cgcgaatttc atcgccgcta tcgcctgccg gcgaacgtgg atcagagcgc gattacctgc 360
agcctgagcg gcgatggcat gctgaccttt agcggcccga aagtgccgag caacatggat 420
ccgacccata gcgaacgccc gattccg 447
<210> 20
<211> 522
<212> DNA
<213> 绿头鸭
<400> 20
atggatatta ccattcataa cccgctgatt cgccgcccgc tgtttagctg gctggcgccg 60
agccgcattt ttgatcagat ttttggcgaa catctgcagg aaagcgaact gctgccggcg 120
agcccgagcc tgagcccgtt tctgatgcgc agcccgattt ttcgcatgcc gagctggctg 180
gaaaccggcc tgagcgaaat gcgcctggaa aaagataaat ttagcgtgaa cctggatgtg 240
aaacatttta gcccggaaga actgaaagtg aaagtgctgg gcgatatggt ggaaattcat 300
ggcaaacatg aagaacgcca ggatgaacat ggctttattg cgcgcgaatt taaccgcaaa 360
tatcgcattc cggcggatgt ggatccgctg accattacca gcagcctgag cctggatggc 420
gtgctgaccg tgagcgcgcc gcgcaaacag agcgatgtgc cggaacgcag cattccgatt 480
acccgcgaag aaaaaccggc gattgcgggc gcgcagcgca aa 522
<210> 21
<211> 519
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
atggatgtga ccattcagca tccgtggttt aaacgcaccc tgggcccgtt ttatccgagc 60
cgcctgtttg atcagttttt tggcgaaggc ctgtttgaat atgatctgct gccgtttctg 120
agcagcacca ttagcccgta ttatcgccag agcctgtttc gcaccgtgct ggatagcggc 180
attagcgaag tgcgcagcga tcgcgataaa tttgtgattt ttctggatgt gaaacatttt 240
agcccggaag atctgaccgt gaaagtgcag gatgattttg tggaaattca tggcaaacat 300
aacgaacgcc aggatgatca tggctatatt agccgcgaat ttcatcgccg ctatcgcctg 360
ccgagcaacg tggatcagag cgcgctgagc tgcagcctga gcgcggatgg catgctgacc 420
ttttgcggcc cgaaaattca gaccggcctg gatgcgaccc atgcggaacg cgcgattccg 480
gtgagccgcg aagaaaaacc gaccagcgcg ccgagcagc 519
<210> 22
<211> 558
<212> DNA
<213> 黑腹果蝇
<400> 22
atggcgaaca ttccgctgct gctgagcctg gcggatgatc tgggccgcat gagcatggtg 60
ccgttttatg aaccgtatta ttgccagcgc cagcgcaacc cgtatctggc gctggtgggc 120
ccgatggaac agcagctgcg ccagctggaa aaacaggtgg gcgcgagcag cggcagcagc 180
ggcgcggtga gcaaaattgg caaagatggc tttcaggtgt gcatggatgt gagccatttt 240
aaaccgagcg aactggtggt gaaagtgcag gataacagcg tgctggtgga aggcaaccat 300
gaagaacgcg aagatgatca tggctttatt acccgccatt ttgtgcgccg ctatgcgctg 360
ccgccgggct atgaagcgga taaagtggcg agcaccctga gcagcgatgg cgtgctgacc 420
attaaagtgc cgaaaccgcc ggcgattgaa gataaaggca acgaacgcat tgtgcagatt 480
cagcaggtgg gcccggcgca tctgaacgtg aaagaaaacc cgaaagaagc ggtggaacag 540
gataacggca acgataaa 558
<210> 23
<211> 522
<212> DNA
<213> 黑腹果蝇
<400> 23
atgcgcagcc tgccgatgtt ttggcgcatg gcggaagaaa tggcgcgcat gccgcgcctg 60
agcagcccgt ttcatgcgtt ttttcatgaa ccgccggtgt ggagcgtggc gctgccgcgc 120
aactggcagc atattgcgcg ctggcaggaa caggaactgg cgccgccggc gaccgtgaac 180
aaagatggct ataaactgac cctggatgtg aaagattata gcgaactgaa agtgaaagtg 240
ctggatgaaa gcgtggtgct ggtggaagcg aaaagcgaac agcaggaagc ggaacagggc 300
ggctatagca gccgccattt tctgggccgc tatgtgctgc cggatggcta tgaagcggat 360
aaagtgagca gcagcctgag cgatgatggc gtgctgacca ttagcgtgcc gaacccgccg 420
ggcgtgcagg aaaccctgaa agaacgcgaa gtgaccattg aacagaccgg cgaaccggcg 480
aaaaaaagcg cggaagaacc gaaagataaa accgcgagcc ag 522
<210> 24
<211> 522
<212> DNA
<213> 鸿雁
<400> 24
atggatatta ccattcataa cccgctgatt cgccgcccgc tgtttagctg gctggcgccg 60
agccgcattt ttgatcagat ttttggcgaa catctgcagg aaagcgaact gctgccggcg 120
agcccgagcc tgagcccgtt tctgatgcgc agcccgattt ttcgcatgcc gagctggctg 180
gaaaccggcc tgagcgaaat gcgcctggaa aaagataaat ttagcgtgaa cctggatgtg 240
aaacatttta gcccggaaga actgaaagtg aaagtgctgg gcgatatggt ggaaattcat 300
ggcaaacatg aagaacgcca ggatgaacat ggctttattg cgcgcgaatt taaccgcaaa 360
tatcgcattc cggcggatgt ggatccgctg accattacca gcagcctgag cctggatggc 420
gtgctgaccg tgagcgcgcc gcgcaaacag agcgatgtgc cggaacgcag cattccgatt 480
acccgcgaag aaaaaccggc gattgcgggc gcgcagcgca aa 522
<210> 25
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 25
atggatatta ccattcagca tccgtggttt aaacgcgcgc tgggcccgct gattccggaa 60
cgcctgtttg atcagttttt tggcagcggc ctgctgagct atgatctgct gccgctgttt 120
gaagaaacca ttgaaccgta ttatcgccag gaactgtttc gcgaagtgct gagcgaaggc 180
attgaaagcg tgcgcgaaga tcgcgataaa tttaccatta tgctggatgt gaaacatttt 240
gaaccgagcg atctggaagt gaaaattatt gatgattttg tgagcattca tggcaaacat 300
gaaagccgcc aggatgatca tggctatatt gaacgcagct ttcatcgccg ctatcgcctg 360
ccggcgaacg tggatcagga agcgattacc tgcgaactgg aaggcgatgg catgctgacc 420
tttgaaggcc cgaaagtgcc ggaaaacatg gatccgaccc atgaaagccg cccgattccg 480
gtggaacgca gcagcaaacc gaccgaagcg ccggaagaa 519
<210> 26
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 26
atggatatta ccattcagca tccgtggttt aaacgcgcgc tgggcccgct gattccggaa 60
cgcctgtttg atcagttttt tggcagcggc ctgctgagct atgatctgct gccgctgttt 120
gaagaaacca ttgaaccgta ttatcgccag gaactgtttc gcgaagtgct gagcgaaggc 180
attgaaagcg tgcgcgaaga tcgcagcaaa tttaccatta tgctggatgt gaaacatttt 240
gaaccgagcg atctggaagt gaaaattatt gatgattttg tgagcattca tggcaaacat 300
gaaagccgcc aggatgatca tggctatatt gaacgcagct ttcatcgccg ctatcgcctg 360
ccggaaaacg tggatcagga agcgattacc tgcgaactgg aagaagatgg catgctgacc 420
tttgaaggcc cgaaagtgca ggcgaacatg gatccggaac atgaaagccg cccgattccg 480
gtggaacgca gcagcaaacc gaccgaagcg ccggaagaa 519
<210> 27
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 27
cgcgcgctgg gcccgctgat tccggaacgc ctgtttgatc agttttttgg cagcggcctg 60
ctgagctatg atctgctgcc gctgtttgaa gaaaccattg aaccgtatta tcgccaggaa 120
ctgtttcgcg aagtgctgag cgaaggcatt gaaagcgtgc gcgaagatcg cgataaattt 180
accattatgc tggatgtgaa acattttgaa ccgagcgatc tggaagtgaa aattattgat 240
gattttgtga gcattcatgg caaacatgaa agccgccagg atgatcatgg ctatattgaa 300
cgcagctttc atcgccgcta tcgcctgccg gcgaacgtgg atcaggaagc gattacctgc 360
gaactggaag gcgatggcat gctgaccttt gaaggcccga aagtgccgga aaacatggat 420
ccgacccatg aaagccgccc gattccg 447
<210> 28
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 28
atgagcatta ccattcataa cccgctgatt cgccgcccgc tgtttgattg gctggcgccg 60
gatcgcattt ttagccagat ttttggcgaa catctgcagg aagatgaact gctgccggcg 120
gatccggatc tggatccgtt tctgatgcgc gatccgattt ttcgcatgcc ggattggctg 180
gaaaccggcc tggatgaaat gcgcctggaa aaaagcaaat ttgatgtgaa cctgagcgtg 240
aaacattttg atccggaaga actgaaagtg aaagtgctgg gcagcatggt ggaaattcat 300
ggcaaacatg aagaacgcca gagcgaacat ggctttattg cgcgcgaatt taaccgcaaa 360
tatcgcattc cggcgagcgt gagcccgctg accattaccg atgatctgga tctgagcggc 420
gtgctgaccg tggatgcgcc gcgcaaacag gatagcgtgc cggaacgcga tattccgatt 480
acccgcgaag aaaaaccggc gattgcgggc gcgcagcgca aa 522
<210> 29
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 29
atggatgtga ccattcagca tccgtggttt aaacgcaccc tgggcccgtt ttatccggaa 60
cgcctgtttg atcagttttt tggcagcggc ctgtttagct atgatctgct gccgtttctg 120
gaagaaacca ttgaaccgta ttatcgccag gaactgtttc gcaccgtgct ggatgaaggc 180
attgaaagcg tgcgcgaaga tcgcgataaa tttgtgattt ttctggatgt gaaacatttt 240
gaaccgagcg atctgaccgt gaaagtgcag gatgattttg tgagcattca tggcaaacat 300
aacagccgcc aggatgatca tggctatatt gaacgcagct ttcatcgccg ctatcgcctg 360
ccggaaaacg tggatcagga agcgctggaa tgcgaactgg aagcggatgg catgctgacc 420
ttttgcggcc cgaaaattca gaccggcctg gatgcgaccc atgcgagccg cgcgattccg 480
gtggaacgca gcagcaaacc gaccgaagcg ccggaagaa 519
<210> 30
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 30
atggcgaaca ttccgctgct gctgagcctg gcggtggtgc tgggccgcat gagcatggat 60
ccgttttatg aaccgtatta ttgccagcgc cagcgcaacc cgtatctggc gctggatggc 120
ccgatggaac agcagctgcg ccagctggaa aaacaggatg gcgcgagcag cggcagcagc 180
ggcgcggata gcaaaattgg caaagtgggc tttcaggatt gcatggtgga tagccatttt 240
aaaccgagcg aactggatga taaagatcag gtgaacagcg atctggatga aggcaaccat 300
gaagaacgcg aagtggtgca tggctttatt acccgccatt ttgatcgccg ctatgcgctg 360
ccgccgggct atgaagcggt gaaagatgcg agcaccctga gcagcgtggg cgatctgacc 420
attaaagatc cgaaaccgcc ggcgattgaa gtgaaaggca acgaacgcat tgatcagatt 480
cagcaggatg gcccggcgca tctgaacgat aaagaaaacc cgaaagaagc ggatgaacag 540
gtgaacggca acgtgaaa 558
<210> 31
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 31
atgcgcctga gcccgatgtt ttggcgcatg gcggaagaaa tggcgcgcat gccgcgcagc 60
ctgctgccgt ttcatgcgtt ttttcatgaa ccgccggatt ggctggatgc gagcccgcgc 120
aactggcagc atattgcgcg ctggcaggaa caggaaagcg cgccgccggc gaccgataac 180
aaagtgggct ataaaagcac cagcgtggat aaagtgtatc tggaaagcaa agataaagat 240
agcgtggaac tggatgatag cgatgaagcg aaactggaac agcaggaagc ggaacagggc 300
ggctatctgc tgcgccattt tagcggccgc tatgatagcc cggtgggcta tgaagcggtg 360
aaagatctgc tgctgagcct ggtggtgggc gatagcacca ttctggatcc gaacccgccg 420
ggcgatcagg aaaccagcaa agaacgcgaa gataccattg aacagaccgg cgaaccggcg 480
aaaaaactgg cggaagaacc gaaagtgaaa accgcgctgc ag 522
<210> 32
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 32
atgagcatta ccattcataa cccgctgatt cgccgcccgc tgtttgattg gctggcgccg 60
gatcgcattt ttagccagat ttttggcgaa catctgcagg aagatgaact gctgccggcg 120
gatccggatc tggatccgtt tctgatgcgc gatccgattt ttcgcatgcc ggattggctg 180
gaaaccggcc tggatgaaat gcgcctggaa aaaagcaaat ttgatgtgaa cctgagcgtg 240
aaacattttg atccggaaga actgaaagtg aaagtgctgg gcagcatggt ggaaattcat 300
ggcaaacatg aagaacgcca gagcgaacat ggctttattg cgcgcgaatt taaccgcaaa 360
tatcgcattc cggcgagcgt gagcccgctg accattaccg atgatctgga tctgagcggc 420
gtgctgaccg tggatgcgcc gcgcaaacag gatagcgtgc cggaacgcga tattccgatt 480
acccgcgaag aaaaaccggc gattgcgggc gcgcagcgca aa 522
<210> 33
<211> 50
<212> DNA
<213> 鸿雁
<400> 33
ggggggcata tggacattac catccagcac ccctggttca agcgcgctct 50
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> 鸿雁
<400> 34
ggggggaagc ttttactcct caggcgcctc ggtgggctt 39
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 35
cctctgttcg aggagactat cgagccctac ta 32
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 36
tagtagggct cgatagtctc ctcgaacaga gg 32
<210> 37
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 37
accggcagga gctgttccgc gaggtgctgt cggagggcat tgagtcggtg agggaggacc 60
ggga 64
<210> 38
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 38
tcccggtcct ccctcaccga ctcaatgccc tccgacagca cctcgcggaa cagctcctgc 60
cggt 64
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 39
actatgctgg acgtaaaaca ctttgagcct tcggacctgg aggtgaagat ta 52
<210> 40
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 40
taatcttcac ctccaggtcc gaaggctcaa agtgttttac gtccagcatg at 52
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 41
aagattatcg acgactttgt gtcgatccat ggc 33
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 42
gccatggatc gacacaaagt cgtcgataat ctt 33
<210> 43
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 43
ggcaagcacg agtcgagaca ggacgaccac ggctacatcg agcggtcgtt tcaccgc 57
<210> 44
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 44
gcggtgaaac gaccgctcga tgtagccgtg gtcgtcctgt ctcgactcgt gcttgcc 57
<210> 45
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 45
gcggaccagg aggccatcac ctgcgagctg gagggcgacg g 41
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 46
ccgtcgccct ccagctcgca ggtgatggcc tcctggtcca c 41
<210> 47
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 47
ttcgaccagt ttttcggatc gggtctgctg tcgtatgacc tgctgcctct gttc 54
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 48
ggggaccttg gggccctcga aggtcagcat gccgtcgcc 39
<210> 49
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 49
ttcaagcgcg ctctgggacc cctgattcca gagcgtctgt tcgaccagtt tttcgga 57
<210> 50
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 50
cacggggatg ggcctcgact cgtgggtggg gtccatgttc tcggggacct tgggg 55
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 51
atggacatta ccatccag 18
<210> 52
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工多核苷酸
<400> 52
aagcttttac tcctcaggcg cctcggtggg cttcgacgac cgctccacgg ggatgggcct 60

Claims (32)

1.用于治疗癌症的方法的包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸，其中所述方法包括给予：
i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；
ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；
iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和
iv)包含所述重组多肽或所述核酸的第四组合物。
2.用于治疗癌症的方法的免疫细胞生长因子，其中所述方法包括给予：
i)包含所述免疫细胞生长因子和任选地至少一种另外的免疫细胞生长因子的第一组合物；
ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；
iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和
iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。
3.用于治疗癌症的方法的IL-10抑制剂，其中所述方法包括给予：
i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；
ii)包含所述IL-10抑制剂和任选地至少一种另外的IL-10抑制剂的第二组合物；
iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；和
iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。
4.用于治疗癌症的方法的肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂，其中所述方法包括给予：
i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；
ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；
iii)包含所述TNFa抑制剂和任选地至少一种另外的TNFa抑制剂的第三组合物；和
iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物。
5.权利要求1-4中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂或TNFa抑制剂，其中所述方法进一步包括给予包含免疫治疗剂的第五组合物。
6.用于治疗癌症的方法的免疫治疗剂，其中所述方法包括给予：
i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第一组合物；
ii)包含至少一种IL-10抑制剂的第二组合物；
iii)包含至少一种肿瘤坏死因子α(TNFa)抑制剂的第三组合物；
iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第四组合物；和
v)包含所述免疫治疗剂的第五组合物。
7.根据权利要求1-6中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中第一组合物在第二组合物或第三组合物之前至少约24小时进行给予。
8.权利要求1-7中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中给予第一组合物：
(a)每天一次，持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天；或
(b)每天一次，持续约7天-约12天；或
(c)每天一次，持续约7天。
9.根据权利要求1-8中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中：
(a)所述第二组合物和所述第三组合物同时或序贯给予；或
(b)所述第二组合物在所述第三组合物之前给予；或
(c)所述第二组合物在所述第三组合物之后给予。
10.根据权利要求1-9中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述第四组合物作为多次输注给予，其中
i)在第一次输注之后至少1天给予第二次输注；
ii)在所述第一次输注之后至少4天给予第三次输注；
iii)在所述第一次输注之后至少5天给予第四次输注；
iv)在所述第一次输注之后至少8天给予第五次输注；和/或
v)在所述第一次输注之后至少9天给予第六次输注。
11.根据权利要求10的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述第三组合物以及所述第四组合物的第一次输注同时或序贯给予。
12.根据权利要求10或权利要求11的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中给予所述第四组合物的第一次输注：
(a)在给予所述第二组合物之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时；或
(b)在给予所述第二组合物之后约3小时或约4小时。
13.根据权利要求1-12中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其进一步包括给予包含以下的治疗周期：
i)包含至少一种免疫细胞生长因子的第六组合物；
ii)受试者中包含至少一种IL-10抑制剂的第七组合物；
iii)包含至少一种TNFa抑制剂的第八组合物；和
iv)包含含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或编码包含与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽的核酸的第九组合物。
14.根据权利要求13的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中给予所述治疗周期：
(a)至少1次、至少2次、至少3次、至少4次或至少5次；任选地其中给予所述治疗周期不多于5次；和/或
(b)在所述第四组合物的第六次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天；任选地其中所述第一治疗周期在所述第四组合物的第六次输注之后约1天时给予。
15.根据权利要求13-14中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中给予所述第六组合物：
(a)在所述第七组合物或所述第八组合物之前至少约24小时；和/或
(b)每天一次，持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天或至少23天；或每天一次，持续总共约5天-约14天或约7天-约12天。
16.根据权利要求13-15中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中：
(a)所述第七组合物和所述第八组合物同时或序贯给予；或
(b)所述第七组合物在所述第八组合物之前给予；或
(c)所述第七组合物在所述第八组合物之后给予。
17.根据权利要求13-16中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述第九组合物作为多次输注给予，其中
i)在第一次输注之后至少1天给予第二次输注；
ii)在所述第一次输注之后至少4天给予第三次输注；和
iii)在所述第一次输注之后至少5天给予第四次输注。
18.根据权利要求17的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述第八组合物以及所述第九组合物的第一次输注同时给予。
19.根据权利要求17或权利要求18的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中给予所述第九组合物的第一次输注：
(a)在给予所述第七组合物之后至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少11小时、至少12小时、至少13小时、至少14小时、至少15小时、至少16小时、至少17小时、至少18小时、至少19小时、至少20小时、至少21小时、至少22小时、至少23小时、至少24小时、至少25小时、至少26小时、至少27小时或至少28小时；或
(b)在给予所述第七组合物之后约3小时或约4小时；或
(c)在给予所述第七组合物之后约4小时。
20.根据权利要求5-19中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述第五组合物作为多次输注给予，并且其中所述第五组合物给予至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次或至少14次。
21.根据权利要求5-20中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述第五组合物的第一次输注在所述第四组合物的第六次输注之后和所述第九组合物的第一次输注之前给予。
22.根据权利要求5-21中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中给予所述第五组合物：
(a)在所述第四组合物的第一次输注之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天；或
(b)在所述第四组合物的第一次输注之后约10天-约14天；或
(c)在所述第四组合物的第一次输注之后约12天。
23.根据权利要求1-22中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中：
(a)所述第一组合物、所述第二组合物、所述第三组合物、所述第四组合物、所述第五组合物、所述第六组合物、所述第七组合物、所述第八组合物或所述第九组合物静脉内或皮下给予；和/或
(b)所述第一组合物、所述第二组合物、所述第四组合物、所述第五组合物、所述第六组合物、所述第七组合物和所述第九组合物静脉内给予；和/或
(c)所述第三组合物和所述第八组合物皮下给予。
24.根据权利要求1-23中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述至少一种免疫细胞生长因子为FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
25.根据权利要求1-24中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述至少一种免疫细胞生长因子为FLT3L；任选地其中所述FLT3L呈以下的量：
(a)约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、10μg/kg、约11μg/kg、约12μg/kg、约13μg/kg、约14μg/kg、约15μg/kg、约16μg/kg、约17μg/kg、约18μg/kg、约19μg/kg或约20μg/kg；或
(b)约4μg/kg-约13μg/kg；或
(c)约7μg/kg。
26.根据权利要求1-25中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述至少一种IL-10抑制剂在所述受试者体内将M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)重编程为M1 TAM，其中重编程包括表面标志物表达的变化，其中MARCO和CD163为在M2 TAM上表达的表面标志物，和其中CD80为在M1 TAM上表达的表面标志物。
27.根据权利要求1-26中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述至少一种IL-10抑制剂为干扰素γ(IFNg)、IFNg拟似物、IFN激动剂或其组合；任选地其中
所述至少一种IL-10抑制剂为IFNg和其中所述IFNγ以约10μg、约15μg、约20μg、约25μg、约30μg、约35μg、约40μg、约45μg、约50μg、约55μg、约60μg、约65μg、约70μg、约75μg、约80μg、约85μg、约90μg、约95μg或约100μg；或者约50μg-约100μg；或者约70μg的剂量进行给予。
28.根据权利要求1-27中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述TNFa抑制剂为TNFa受体(TNFaR)、英夫利昔单抗、阿达木单抗、培塞利珠单抗、戈利木单抗或依那西普；任选地其中给予所述TNFaR：
(a)以约1mg、约2mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg或约10mg的剂量；或
(b)以约4mg-约6mg的剂量；或
(c)以约5mg的剂量。
29.根据权利要求1-28中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中：
(a)所述第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和/或第六次输注以及所述第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和/或第四次输注包含约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg或约35mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽；或
(b)所述第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和第六次输注以及所述第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和第四次输注包含约10mg/kg-约30mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽；或
(c)所述第四组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注、第四次输注、第五次输注和第六次输注以及所述第九组合物的第一次输注、第二次输注、第三次输注和第四次输注包含约20mg/kg含有与SEQ ID NO:9的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。
30.根据权利要求5-29中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述免疫治疗剂为检查点抑制剂；任选地其中所述检查点抑制剂为抗PD1抗体；任选地其中所述抗PD1抗体为纳武单抗、帕博利珠单抗或西米普利单抗。
31.根据权利要求30的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述抗PD1抗体以下面的剂量进行给予：
(a)约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg；或
(b)约0.1mg/kg-约7mg/kg；或
(c)约3mg/kg。
32.根据权利要求1-31中任何一项的用于使用的重组多肽、核酸、免疫细胞生长因子、IL-10抑制剂、TNFa抑制剂或免疫治疗剂，其中所述癌症：
(a)为实体瘤癌症；任选地其中所述实体瘤具有至少约0.2cm、至少约0.5cm、至少约1cm、至少约2cm、至少约3cm、至少约4cm、至少约5cm、至少约6cm、至少约7cm、至少约8cm、至少约9cm或至少约10cm的直径；和/或
(b)为癌症早期表现的复发或为癌症早期表现的转移。
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