JP2544090B2 - ファクタ―ｖｉｉ活性を有する蛋白質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は一般に血液凝固因子に
関し、そしてさらに詳しくは血液凝固のための生物学的
活性を有する蛋白質の発現に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固は、最終的にフィブリンクロッ
トを生じさせる種々の血液成分又は因子の複雑な相互作
用から成る過程である。一般に、凝固“カスケード”と
称される現象に関与する血液成分は酵素的に不活性な蛋
白質たるプロエンザイム（proenzyme ）又はザイモゲン
（zymogen ）であり、この蛋白質は、それ自体活性化さ
れた凝固因子であるアクチベーターの作用により蛋白質
分解酵素に転換される。このような転換を経験した凝固
因子は一般に“活性化された因子”と称され、そして小
文字の後付加記号“ａ”によって示される（例えば VII
ａ）。

【０００３】血液の凝固を助長しそしてそれによって正
常な止血に関与する２つの別個の系が存在する。これら
の系はイントリンシック（intrinsic ）凝固経路及びエ
キストリンシック（extrinsic ）凝固経路と称されてい
る。イントリンシック経路は血漿中にのみ存在する因子
の利用を介してトロンビン形成を導く反応を意味する。
イントリンシック経路における中間的現象としてファク
ターXIａ及びカルシウムイオンにより触媒される反応で
あるファクターIXのファクターIXａへの活性化がある。
次に、ファクターIXａは、ファクターVIIIａ、リン脂質
及びカルシウムイオンの存在下でファクターＸの活性化
に関与する。

【０００４】エキストリンシック経路は血漿因子、及び
組織抽出物中に存在する成分を用いる。前に言及したプ
ロエンザイムの１つであるファクターVII は、そのファ
クター VIIａへの活性化の後に、組織因子及びカルシウ
ムイオンの存在下でファクターＸをＸａに転換すること
により、血液凝固のエキシトリンシック経路に関与す
る。ファクターＸａは今度はファクターＶａ、カルシウ
ムイオン及びリン脂質の存在下でプロスロンビンをスロ
ンビンに転換する。

【０００５】ファクターＸのファクターＸａへの転換は
イントリンシック経路及びエキシトリンシック経路の両
者に共通の現象であるから、ファクターVIIIが不足して
いるか又はファクターVIIIの阻害物質を有する患者の治
療のためにファクター VIIａを使用することができる
（Thomas、米国特許No. ４，３８２，０８３）。さら
に、ファクター VIIａはファクターIXの活性化において
役割を演ずることによりイントリンシック経路に関与す
ることを示唆する証拠が存在する（Zur 及びNemerson,
J.Biol.Chem. 253 ：2203-2209, 1978 ）。

【０００６】実験的分析により、ヒト−ファクターVII
が約５０，０００ダルトンの分子量を有する単鎖糖蛋白
質であることが明らかにされている。この形態におい
て、この因子は不活性ザイモゲン（zymogen ）として血
液中を循環する。ファクターVII のファクター VIIａへ
の活性化は幾つかの異なる血漿プロテアーゼ、例えばフ
ァクター XIIａにより触媒される。ファクターVII の活
性化により２個のポリペプチド鎖が形成され、これらは
少なくとも１個のジスルフィド結合により一体化された
ヘビー鎖（Ｍｒ＝２８，０００）とライト鎖（Ｍｒ＝１
７，０００）とから成る。ファクターVII はまた、例え
ばThomas、米国特許No. ４，４５６，５９１により開示
された方法によりイン−ビトロで VIIａに活性化され
る。

【０００７】ファクターIXは分子量５７，０００の単鎖
前駆体として血液中を循環し、そしてファクターVIIIの
存在下でファクターXIａにより開裂された後活性なセリ
ンプロテアーゼ（ファクターIXａ）に転換される。ファ
クターIXａはそれぞれ１６，０００及び２９，０００の
分子量を有するライト鎖及びヘビー鎖から成る。凝固異
状（例えばファクターVIII及びIXの不足）を有する患者
に対する最近の治療の実際は、富化されたレベルの特定
の因子を含有するヒト血漿の冷却沈澱物（cryoprecpita
te）又は他の画分による置換療法（replacement therap
h ）を用いる。これらの調製物は従来プールされたヒト
血漿から得られていた。冷却沈澱物を調製するには出発
材料として比較的多量のヒト血漿を使用する必要があ
る。

【０００８】ファクターVII の療法的使用は、ファクタ
ーVII の不足を示す個体、並びにファクターVIII及びフ
ァクターIXが不足している個体群、及びVon Willebrand
病を有する固体の治療においてなされる。置換療法にお
いてファクターVIII及びIXを投与された個体はこれらの
蛋白質に対する抗体をしばしば生じさせる。これらの抗
体の存在のために連続治療は非常に困難である。この問
題を経験する患者は通常、ファクター VIIａを含む活性
凝固酵素及び不活性凝固酵素の混合物から成ることが知
られている活性化されたプロスロンビン複合体により治
療される。さらに、最近の研究により、少量（４０〜５
０μｇ）の注射されたファクター VIIａが、その血液中
に高レベルの抗体を有するファクターVIII不足の患者に
おける重症の進行する出血を抑制するために有効である
ことが示されている（Hedner及びKisiel, J.Clin.Inves
t. 71：1836-1841, 1983 ）。

【０００９】冷却沈澱物の調製に使用される血漿の入手
源が多様であるため、調製物を試験してそれらがウイル
ス汚染を含まないことを保証することは困難である。例
えば、冷却沈澱物を投与されたほとんどすべての者が肝
炎試験において陽性を示す。さらに、最近の報告によれ
ば、冷却沈澱物を投与された血友病患者において後天性
免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が生じた。さらに、これら
のファクターを多量に精製することは非常に困難であ
り、そして高価である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、ファクター V
IIａ及びファクターIXの純粋な調製物を比較的多量に製
造するための方法が必要である。この発明はこのような
必要を満たし、ウイルス感染の問題を好結果に除去し、
そして同時に、ファクターVIII及びファクターIXが不足
している患者並びにVon Willebrand病の個体を治療する
ための活性なファクター VIIａの一貫した且つ均質な入
手源を提供し、そしてさらに置換療法において使用する
ための精製されたファクターIX源を提供するものであ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】要約すれば、この発明は
少なくとも部分的にファクターVII をコードするヌクレ
オチド配列を含有するＤＮＡ造成物を開示する。このヌ
クレオチド配列はカルシウム結合ドメインをコードする
第１ヌクレオチド配列及び該第１ヌクレオチド配列の下
流に位置しこれと連結されている第２ヌクレオチド配列
を含んで成る。この第２ヌクレオチド配列はファクター
VIIａのセリンプロテアーゼ活性のための触媒ドメイン
をコードする。これらの連結された配列は、活性化後に
ファクター VIIａと実質上同一の血液凝固のための生物
学的活性を有する蛋白質をコードする。第１ヌクレオチ
ド配列は、実質的に、ファクターVII 、ファクターIX、
ファクターＸ、プロテインＣ、プロスロンビン又はプロ
テインＳをコードする遺伝子のそれである。さらに、第
１ヌクレオチドは前記遺伝子のそれぞれに対応するリー
ダーペプチドをもコードしていてもよい。

【００１２】特に、第１ヌクレオチド配列はファクター
VII のゲノムクローン又はｃＤＮＡクローンに由来する
ことができ、そしてファクターVII のリーダーペプチド
及びアミノ末端部分をコードすることができる。第１ヌ
クレオチド配列はさらに２本鎖オリゴヌクレオチドを含
有することができる。特に好ましい第１ヌクレオチド配
列はファクターIXのリーダーペプチド及びアミノ末端部
分をコードするそれである。

【００１３】さらに、この発明は哺乳類宿主細胞ＤＮＡ
中に取り込まれ得るプラスミドを開示する。これらのプ
ラスミドの１つはプロモーター、その下流に続く１組の
ＲＮＡスプライス部位、及びその下流に続く、少なくと
も部分的にファクターVII をコードするヌクレオチド配
列を含有する。このヌクレオチド配列はカルシウム結合
ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列、及び該第
１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれに連結されてい
る第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌクレ
オチド配列はファクター VIIａのセリンプロテアーゼ活
性のための触媒ドメインをコードする。これらの連結さ
れた配列は、活性化後にファクター VIIａと実質的に同
一の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコ
ードする。このヌクレオチド配列の下流にポリアデニレ
ーションシグナルが続く。

【００１４】上記の組換プラスミドと同様に、この発明
はさらに、プロモーター、その下流に続く１組のＲＮＡ
スプライス部位、及びその下流に続く、少なくとも部分
的にファクターIXをコードするヌクレオチド配列を含む
第２のプラスミドを開示する。このヌクレオチド配列は
カルシウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド
配列、及び該第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれ
に連結されている第２ヌクレオチド配列を含んで成る。
この第２ヌクレオチド配列はファクターIXのセリンプロ
テアーゼ活性のための触媒ドメインをコードする。これ
らの連結された配列はファクターIXと実質上同一の血液
凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコードす
る。このヌクレオチド配列の下流にはポリアデニレーシ
ョンシグナルが続く。

【００１５】この発明は第３の観点において、活性化後
にファクター VIIａと実質上同一の生物学的活性を有す
る蛋白質を生産するために安定にトランスフェクトされ
た哺乳類細胞を開示する。細胞が少なくとも部分的にフ
ァクターVII をコードするヌクレオチド配列を含有する
ＤＮＡ造成物によってトランスフェクトされる。このヌ
クレオチド配列はカルシウム結合ドメインをコードする
第１ヌクレオチド配列、及び該第１ヌクレオチド配列の
下流に位置しそれに連結されている第２ヌクレオチド配
列を含んで成る。この第２ヌクレオチド配列はファクタ
ー VIIａのセリンプロテアーゼ活性のための触媒ドメイ
ンをコードする。これらの連結された配列はファクター
VIIａと実質上同一の血液凝固のための生物学的活性を
有する蛋白質をコードする。

【００１６】この発明は他の観点において、ファクター
IXと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質を生産
するために安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞を
開示する。細胞が少なくとも部分的にファクターIXをコ
ードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成物によ
ってトランスフェクトされる。このヌクレオチド配列は
カルシウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド
配列、及び該第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれ
と連結されている第２ヌクレオチド配列を含んで成る。
この第２ヌクレオチド配列はファクターIXのセリンプロ
テアーゼ活性のための触媒ドメインをコードする。これ
らの連結された配列はファクターIXと実質的に同一の血
液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコードす
る。

【００１７】この発明はさらに、少なくとも部分的にフ
ァクターVII をコードするヌクレオチド配列を含有する
ＤＮＡ造成物を含む哺乳類細胞を樹立することによっ
て、ファクター VIIａにより中介される血液凝固のため
の生物学的活性を有する蛋白質の製造方法を提供する。
このヌクレオチド配列はカルシウム結合ドメインをコー
ドする第１ヌクレオチド配列、及び該第１配列の下流に
位置しそれに連結された第２ヌクレオチド配列を含んで
成る。この第２ヌクレオチド配列はファクター VIIａの
セリンプロテアーゼ活性のための触媒ドメインをコード
する。これらの連結された配列は、活性化後にファクタ
ー VIIａと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質
をコードする。次に、この哺乳類細胞を適当な培地中で
増殖せしめ、そして該ＤＮＡ造成物によりコードされて
おり且つ該哺乳動物細胞により生産された蛋白質生成物
を単離する。次にこの蛋白質生成物を活性化してファク
ターVIIａを生じさせる。

【００１８】この発明は他の観点において、ファクター
IXにより中介される血液凝固のための生物学的活性を有
する蛋白質の製造方法を開示する。この方法は、少なく
とも部分的にファクターIXをコードするヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ造成物を含む哺乳類宿主細胞を樹立
することを含んで成る。このヌクレオチド配列はカルシ
ウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列、
及び該第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれに連結
されている第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第
２ヌクレオチド配列はファクターIXのためのセリンプロ
テアーゼ活性のための触媒ドメインをコードする。これ
らの連結された配列はファクターIXと実質的に同一の血
液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコードす
る。次に、この哺乳類宿主細胞を適当な培地中で増殖せ
しめ、そして該宿主細胞によりコードされた蛋白質生成
物を単離する。上記の方法により製造される蛋白質も開
示される。

【００１９】この発明の他の観点において、ファクター
VII をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ造成物
を開示する。好ましい態様においては、このＤＮＡ配列
は図４〜図６中の第３６塩基対から第１４３３塩基対ま
でのｃＤＮＡ配列を含んで成る。他の好ましい態様にお
いては、ＤＮＡ配列は図９中の第３６塩基対から第９９
塩基対まで、及びその下流に続く第１６６塩基対から第
１４３３塩基対までのｃＤＮＡ配列を含んで成る。すぐ
上に記載したＤＮＡ配列を含んで成り、哺乳類宿主細胞
ＤＮＡ中に組込まれ得る組換プラスミドもまた開示され
る。

【００２０】ファクターVII をコードするＤＮＡ配列を
含んで成る組換体プラスミドにより安定にトランスフェ
クトされた哺乳類細胞もまた開示される。好ましい態様
においては、このＤＮＡ配列は図４〜図６中の第３６塩
基対から第１４３３塩基対までのｃＤＮＡ配列、又は図
４〜図６中の第３３塩基対から第９９塩基対まで及びそ
の下流に続く第１６６塩基対から第１４３３塩基対まで
のｃＤＮＡ配列を含んで成る。

【００２１】上記のＤＮＡ造成物を含有する哺乳類宿主
細胞を樹立することによって、ファクター VIIａにより
中介される血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白
質の製造方法もまた開示される。次に、哺乳類宿主細胞
を適当な培地中で増殖せしめ、そしてＤＮＡ造成物によ
りコードされている蛋白質生成物を単離する。次に、こ
の蛋白質生成物を活性化してファクター VIIａを生じさ
せる。

【００２２】この発明の他の観点は、以下の詳細な説明
及び添付図面により明らかになるであろう。

【００２３】

【具体的な説明】この発明を記載する前に、以下に使用
する幾つかの用語の定義を記載するのが発明の理解の助
けとなろう。相補的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ ：ｍＲＮＡ鋳型中に存在する
配列から酵素的に合成されたＤＮＡ分子又は配列であ
る。

【００２４】ＤＮＡ造成物：１本鎖又は２本鎖のＤＮＡ
分子又はこのような分子のクローンであって、天然の遺
伝子から単離することができるもの、又は天然には存在
しない態様で組合わされそして並置されるＤＮＡのセグ
メントを含むように変形されているものである。プラスミド又はベクター ：宿主細胞に挿入された場合に
複製することができ、遺伝情報を含有するＤＮＡ造成物
である。プラスミドは一般に、宿主細胞中で発現される
べき少なくとも１個の遺伝子配列、並びにプロモーター
及び転写開始部位を包含する、前記の遺伝子の発現を促
進する配列を含有する。これは線状分子であっても閉環
された分子であってもよい。

【００２５】連結：１つの配列の５′及び３′末端が隣
接する配列のそれぞれ３′及び５′末端にホスホジエス
テル結合によって付着されることを“連結される”と称
する。連結は、平滑末端又は接着末端のリガーゼ連結の
ごとき方法により、ｃＤＮＡクローニングによる連結さ
れた配列の合成により、又は指令された変異誘発（dire
cted mutagenesis）の方法による介在配列の除去により
達成することができる。

【００２６】リーダーペプチド：幾つかの蛋白質のアミ
ノ末端に存在しそしてプロセシング及び分泌の間に該蛋
白質から一般に切断されるアミノ酸配列である。リーダ
ーペプチドはその蛋白質を細胞の分泌経路に向ける配列
を含んで成る。この明細書において使用する場合、“リ
ーダーペプチド”なる語はさらに天然のリーダーペプチ
ドの部分をも意味する。

【００２７】ドメイン：その蛋白質のある生物学的活性
のために必要な構造要素の全部又は部分を含有する蛋白
質中の特定の複数のアミノ酸の３次元的自己集成的整列
である。生物学的活性 ：生物学的背景において（すなわち生物体
中で又はイン−ビトロの模倣において）分子によって達
成される１つの機能又は１組の機能である。蛋白質の生
物学的活性は触媒活性とエファクター活性とに分けるこ
とができる。凝固因子の触媒活性は一般に前駆体の特異
的開裂による他の因子の活性化を含む。エファクター活
性は、生物学的に活性な分子のカルシウムもしくは他の
小分子への、蛋白質のごとき巨大分子への、又は細胞へ
の特異的結合を含む。エファクター活性は生理的条件下
での触媒活性をしばしば増強し、又は触媒活性のために
必須である。触媒活性及びエファクター活性は幾つかの
場合には蛋白質の同一のドメイン内に存在する。

【００２８】ファクター VIIａについて、生物学的活性
はエキシトリンシック経路による血液凝固の仲介によっ
て特徴付けられるファクター VIIａはファクターＸをフ
ァクターＸａに活性化し、このファクターＸａは今度は
プロスロンビンをスロンビンに転換し、これによってフ
ィブリンクロットの形成が開始される。ファクターＸの
活性化は血液凝固のイントリンシック経路及びエキシト
リンシック経路に共通であるので、ファクター VIIａは
ファクターIX、ファクターVIII又はVon Willebrandファ
クターが不足している重症の個体の治療のために使用す
ることができる。

【００２９】ファクターIXの生物学的活性はイントリン
シック経路による血液凝固の仲介により特徴付けられ
る。ファクターIXはファクターXIａによりファクターIX
ａに活性化される。次に、ファクターIXａは、ファクタ
ーVIIIａ、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下でフ
ァクターＸをファクターＸａに活性化する。次に、ファ
クターＸａはプロスロンビンのスロンビンへの転換にお
いて機能し、フィブリンクロットの形成が開示される。

【００３０】上記のように、ヒト血漿からのファクター
VII の単離は長時間を要し且つ高価な工程である。なぜ
ならこのファクターは血液１ｌ中に約３００μｇの濃度
で存在するに過ぎない希少蛋白質だからである。さら
に、スロンビン、ファクターIX及びファクターＸから分
離することが困難であり、そして精製中の蛋白質分解的
攻撃に対して感受性である（Kisiel及びMcMullen、前
掲）。単鎖ヒトファクターVII は均一に精製されている
が（Kisiel及びMcMullen、前掲）、公表された精製方法
は一般に低収量及び／又は他の凝固因子による汚染によ
り限定される。

【００３１】ファクターVII 及びIXは肝臓により生産さ
れ、そしてその生合成のためにビタミンＫを必要とす
る。ビタミンＫはこれらのファクター中の特定のγ−カ
ルボキシグルタミン酸残基の形成のために必要である。
これらの異状なアミノ酸残基は翻訳後の変形によって形
成され、カルシウムイオンに結合し、そしてこの蛋白質
とリン脂質小胞との相互作用を担当する。さらに、ファ
クターVII 及びファクターIXはそれぞれ１個のβ−ヒド
ロキシアスパラギン酸残基を含有し、この残基も蛋白質
が翻訳された後に形成される。しかしながら、このアミ
ノ酸残基の役割は知られていない。

【００３２】ファクターVII 及びファクターIXの活性が
特定のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化を含む翻
訳後変化に依存し、そして又特定のアスパラギン酸残基
のヒドロキシル化に依存するであろうという事実を仮定
すれば、微生物中でのファクターVII 及びIXのクローニ
ング及び発現によって活性な生成物を製造することはで
きそうにない。

【００３３】従ってこの発明は、安定にトランスフェク
トされた哺乳類細胞を用いてファクター VIIａにより仲
介される血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質
を製造する方法を提供する。さらに、この発明はまた、
ファクターIXにより仲介される血液凝固のための生物学
的活性を有する蛋白質を製造する方法を提供する。前記
のごとく、ファクターVII 及びIXはその生合成のために
ビタミンＫを必要とする。さらに、血漿蛋白質であるプ
ロスロンビン、ファクターＸ、プロテインＣ、及びプロ
テインＳもそれらの生合成のためにビタミンＫを必要と
する。γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するこれ
らの蛋白質のアミノ末端部分は、アミノ酸配列及び生物
学的機能の両者において類似している（図８を参照のこ
と）。さらに、ファクターVII 、プロスロンビン、ファ
クターIX、ファクターＸ、及びプロテインＣのカルボキ
シ末端部分はそれらの特異的なセリンプロテアーゼ機能
を決定する。

【００３４】ファクターVII は微量血漿蛋白質であり、
そしてファクターVII をコードするｍＲＮＡは希少であ
ると信じられる。従って、広範囲の配列分析及び特徴付
けを可能にするのに十分な量で血漿からファクターVII
を精製することは困難なままである。プロテアーゼ阻害
剤の存在下においてさえ精製中にファクターVII が分解
されることがKisiel及びMcMullen（前掲）により観察さ
れた。これらの困難性のため、ファクターVII は血液凝
固系の他の一層豊富な成分に比べて十分に特徴付けられ
ていない。事実、Kisiel及びMcMullen（前掲）の研究は
ファクターVIIの各鎖のわずか１０残基について配列情
報をもたらし、そして各配列において２つの残基の同定
は仮定的であった。ウシ−ファクターVII についての部
分的アミノ酸配列データも公表されている（DiScipio
等、前掲）。

【００３５】ファクターVII ｍＲＮＡの予想される希少
さがファクターVII 遺伝子の知識の欠如に寄与してい
た。常用のｃＤＮＡクローニング技法の成功は鋳型とし
て使用するための十分な量のｍＲＮＡに依存する。逆転
写の早すぎる停止は５′末端を欠くｃＤＮＡクローンの
形成をもたらし、そしてこの状態は低いｍＲＮＡレベル
によって悪化する。豊富でないメッセンジャーＲＮＡの
ｃＤＮＡクローニングのための幾つかの方策が開発され
ている（Maniatis等、Molecular Cloning ：A Laborato
ry Manual 、コールルドスプリングハーバーラボラトリ
ー、１９８２）が、しかしながら注目の生成物のアミノ
酸配列についての知識の欠如がＤＮＡ配列を予想しそし
て適当なオリゴヌクレオチドプローブを設計することを
困難にしている。これらの改良された方法を用いて僅少
な蛋白質をコードする遺伝子の部分的ｃＤＮＡクローン
を得ることは比較的簡単であるが、ファクターVII のご
とき僅少な蛋白質をコードする遺伝子の十分な長さのｃ
ＤＮＡクローンを得ることは依然として困難である。

【００３６】ファクターVII に比べて、ファクターIXは
比較的豊富な蛋白質であり、そしてヒト−ファクターIX
遺伝子のｃＤＮＡクローンの配列は知られている（Kura
chi及び Davie, Proc.Natl.Acad.Sci. USA , 79：6461-
6464, 1982 ；及びAnson 等、EMBo J. , ３：1053-106
0, 1984 ）。ファクターIX遺伝子の構造は特徴付けられ
ており、そしてこの蛋白質のアミノ酸配列は既知のアミ
ノ酸配列に基いて決定されている。ヒト及びウシのファ
クターIXについての幾つかの蛋白質配列データも公表さ
れており、そして配列が分析されている（DiScipio等、
前掲）。

【００３７】この蛋白質のアミノ末端部分は１２個のグ
ルタミン酸残基を含有し、これらは成熟蛋白質中ではγ
−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基に転換されて
いる。ファクターIXの活性化に関与する開裂部位も同定
されている（Kurachi 及びDavie 、前掲）。ファクター
IX ｃＤＮＡクローンの５′末端における配列は、ほと
んどの分泌される蛋白質中に見出されるシグナル配列に
典型的なシグナル配列をコードしている（Kurachi 及び
Davie 、前掲）。組換ＤＮＡ法によるファクターIX遺伝
子の発現は今まで報告されていない。

【００３８】ファクターVII 遺伝子の十分な長さのｃＤ
ＮＡクローンを得ることが困難であるため、リーダーペ
プチドをコードする領域を含むコード配列の５′末端を
提供するために３種類の新しいアプローチを用いた。第
１の方法によれば、ファクターVII のための部分的ｃＤ
ＮＡクローンをファクターIXのリーダーペプチド及び
５′部分をコードする断片に連結する。このアプローチ
は、これら２つの分子のアミノ末端部分はそれぞれの蛋
白質のカルシウム結合活性を担当しているという観察、
及びファクターIXのカルシウム結合活性をファクターVI
I のそれのために置換することができるという発見に基
礎を置いている。

【００３９】凝固因子の特異的セリンプロテアーゼ活性
は分子のカルボキシ末端領域に存在するため、得られる
ポリペプチドは真正なファクターVII の生物学的活性を
保持している。第２のアプローチは、部分的ｃＤＮＡク
ローンと、ファクターVII のリーダー領域及びアミノ末
端領域をコードするＤＮＡ配列とを組合わせる。この明
細書に開示するファクターVII の部分的ｃＤＮＡ配列及
びアミノ酸配列は、ファクターVII 遺伝子の５′部分を
含んで成るクローンのｃＤＮＡライブラリー又はゲノム
性ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを可能にする。

【００４０】第３のアプローチは、部分的ｃＤＮＡクロ
ーンと、ファクターIXのリーダーペプチドをコードする
ｃＤＮＡ断片及びコンセンサス（consensus ）カルシウ
ム結合部位又はファクターVII の予想されるアミノ末端
配列を含んで成るハイブリドコード配列との連結を用い
る。ファクターVII のアミノ末端のためのコード配列
は、この明細書に開示される今まで公表されていないア
ミノ酸配列データにより確立された。コンセンサス配列
は、ファクターVII のデータ、及び他のビタミンＫ−依
存性血漿蛋白質について公表されている配列データから
導かれる。

【００４１】ファクターVII 遺伝子の５′部分を含んで
成るクローンのスクリーニングについて上に記載したア
プローチに従って、本発明者等は発現のために適当な十
分な長さの正しいｃＤＮＡを得ることに成功した。生じ
たｃＤＮＡクローンの内、“λVII ２４６３”と称する
クローンが最も長いファクターVII ｃＤＮＡ挿入部を含
有していた。このものはファクターVII の完全なコード
配列を含有していることが見出された。このクローンは
３５ヌクレオチドの５′非翻訳領域、６０アミノ酸のリ
ーダーをコードする１８０ヌクレオチド、４０６アミノ
酸の成熟蛋白質をコードする１２１８ヌクレオチド、終
止コドン、１０２６ヌクレオチドの３′非翻訳配列、及
び２０塩基のポリ（Ａ）テイル（２４６３位から始ま
る）を含有していた。このｃＤＮＡは両鎖について完全
に配列決定された。これと、クローンλVII ２１１５及
びλVIII９２３から初期に単離されたｃＤＮＡ挿入部と
の比較により、λVII ２４６３は１個のＥｃｏＲＩ断片
上に、ファクターVII リーダー及び成熟蛋白質配列をコ
ードするファクターVII ｃＤＮＡを含有することが明ら
かになった。

【００４２】第２のクローンλVII ５６５を単離した。
このクローンは、ヌクレオチド１００−１６５（図４）
が欠けている点を除きクローンλVII ２４６３のヌクレ
オチド９からヌクレオチド６３８までのｃＤＮＡと同じ
ｃＤＮＡ挿入部を含んでいた。ｃＤＮＡとファクターVI
I ゲノム性ＤＮＡとの比較において、存在しない配列は
１個のエクソン様領域に正確に対応した。従って、択一
的ｍＲＮＡスプライシング現象を反映した２個のファク
ターVII ｃＤＮＡが得られた。

【００４３】λVII ２４６３によりコードされるリーダ
ーは非常に長く（６０アミノ酸）、そしてファクターI
X、プロテインＣ及びプロスロンビンと比較した場合、
非常に異る疎水性プロフィールを有する。このリーダー
は−６０位及び−２６位に２個のメチオニンを含有す
る。翻訳開始は−６０位から始まると考えられる。なぜ
なら、シグナルペプチドに特徴的な疎水性領域は−２６
位に続くのではなく−６０位に続くからである。ゲノム
クローン中のエクソン様領域に正確に対応する、λVII
５６５中に存在しない配列はファクターIX、プロテイン
Ｃ及びプロスロンビンに一層類似する疎水性パターンを
有する３８アミノ酸のリーダーをもたらすことは興味深
いことである。

【００４４】前記のリーダーのいずれが（もしいずれか
だとすれば）真正であるか明らかでないため、追加のア
プローチにおいて５′末端配列を分析する様に努力し
た。要約すれば、このアプローチは、ヒトゲノムＤＮＡ
ライブラリーの造成及びスクリーニング、並びにファク
ターVII 遺伝子配列を含んで成るゲノムクローンの同定
を含む。次に、ゲノム配列の５′領域をｃＤＮＡに連結
して十分な長さのクローンを造成した。

【００４５】追加の造成において、リーダーのすべて及
び成熟コード配列の２９アミノ酸を含有するλVII ５６
５の５′ファクターVII ｃＤＮＡ断片を、λVII ２４６
３のｃＤＮＡの断片（成熟蛋白質の残部及び３′非翻訳
配列を含有する）に連結した。この“５６５−２４６
３”配列は十分な長さのファクターVII ｃＤＮＡ配列を
単一ＥｃｏＲＩ断片として含有する。

【００４６】次に、上記のＤＮＡ配列を適当な発現ベク
ターに挿入し、今度はこのベクターを用いて哺乳類セル
ラインをトランスフェクトした。この発明の実施におい
て使用するための発現ベクターはトランスフェクトされ
た哺乳類細胞中で外来性遺伝子の転写を指令することが
できるプロモーターを含んで成るであろう。ウイルス性
プロモーターが、転写を指令するそれらの効率のために
好ましい。特に好ましいこのようなプロモーターはアデ
ノウイルス２からの主要後期（major late）プロモータ
ーである。

【００４７】このような発現ベクターはさらに、プロモ
ーターから下流であり、且つ血液凝固のための生物学的
活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の挿入部位から
上流に位置する１組の複数のＲＮＡスプライス部位を含
有するであろう。好ましいＲＮＡスプライス部位配列は
アデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得
られるであろう。さらに、発現ベクター中には前記挿入
部位の下流に位置するポリアデニレーションシグナルを
含有する。

【００４８】ウイルス性ポリアデニレーションシグナ
ル、例えばＳＶ４０からの初期もしくは後期ポリアデニ
レーションシグナル、又はアデノウイルス５：ＥＩｂ領
域からのポリアデニレーションシグナルが好ましい。特
定の好ましい態様においては、発現ベクターはさらに、
プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する
ウイルスリーダー配列、例えばアデノウイルス２トリパ
ルタイトリーダーを含有する。好ましいベクターはさら
に、エンハンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサーを
含有することができる。

【００４９】次に、クローン化されたＤＮＡ配列を、リ
ン酸カルシウム介在トランスフェクションにより、培養
された哺乳動物細胞に導入する。（Wigler等、Cell, 1
4：725, 1978 ：Corsaro 及び Pearson, Somatic Cell
Genetice , ７：603, 1981 ；Graham及びVan der Eb, V
irology, 52, 456, 1973 。）ＤＮＡ及びリン酸カルシ
ウムの沈澱を生成せしめ、そしてこの沈澱を細胞に適用
する。細胞の一部がＤＮＡを取り込み、そしてそれを数
日間細胞内に保持する。細胞の小画分（典型的には１０
^-4）がＤＮＡをゲノムに安定に取り込む。これらの安定
な取り込みを同定するため、一般に、選択可能な表現型
（選択マーカー）を付与する遺伝子を目的遺伝子と共に
導入する。好ましい選択マーカーには薬剤例えばＧ−４
１８及びメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝
子が含まれる。

【００５０】選択マーカーは目的遺伝子と同時に別個の
プラスミドにより細胞に導入してもよく、又はこれらを
同じプラスミドにより導入してもよい。好ましい選択マ
ーカーは薬剤Ｇ−４１８に対する耐性の遺伝子であり、
これはプラスミドｐＫＯ−ｎｅｏ上に担持されている
（Southern及びBerg, J.Mol.Appl.Genet. , １：327-34
1, 1982 ）。細胞に導入される混合物に“キャリヤーＤ
ＮＡ”として知られている追加のＤＮＡを添加すること
も有利である。細胞がＤＮＡを取り込んだ後、これらを
一定期間、典型的には１〜２日間増殖せしめて、目的遺
伝子の発現を開始する。次に薬剤選択を適用して選択マ
ーカーが安定に発現している細胞の増殖について選択す
る。これらの細胞のクローンを、目的蛋白質の発現につ
いてスクリーニングする。

【００５１】形質転換された細胞により生産されたファ
クターVII 及びファクターIXは、クエン酸バリウムへの
吸着により細胞培養培地から取り出す。スペント培地を
クエン酸ナトリウム及び塩化バリウムと混合し、そして
沈澱を集める。次に、沈澱した材料を該当する凝固因子
の存在について測定する。免疫吸着によりさらに精製す
ることができる。免疫吸着カラムは高特異性モノクロー
ナル抗体を含んで成るのが好ましい。別の方法として、
クエン酸バリウムにより沈澱した材料の精製は、一層一
般に使用されている生化学的方法により、又は高速液体
クロマトグラフィーにより行うことができる。

【００５２】単鎖ファクターVII の活性な２本鎖ファク
ター VIIａへの転換は、Hedner及びKisiel（J.Clin.Inv
est , 71：1836-1841, 1983 ）により記載されているよ
うにファクター XIIａを使用して、又はトリプシン様特
異性を有する他のプロテアーゼ（Kisiel及びFujikawa,
Behring Inst.Mitt. 73：29-42, 1983 ）により達成す
ることができる。

【００５３】要約すれば、この発明は形質転換された哺
乳動物細胞を用いてビタミンＫ依存性血液凝固因子の活
性を有する蛋白質を製造する方法を提供する。凝固因子
の特定のセリンプロテアーゼドメインをコードする遺伝
子配列はｃＤＮＡライブラリーから単離される。リーダ
ー配列及びカルシウム結合ドメインをコードする配列は
ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから単離され、又
は合成されたオリゴヌクレオチドから造成される。次
に、これらの配列を適当な発現ベクター中で連結して、
血液凝固のための所望の生物学的活性を有する蛋白質を
コードするようにする。得られるベクター、及び薬剤耐
性マーカーを含有するプラスミドを適切な哺乳類組織培
養細胞に同時トランスフェクトする。次に、トランスフ
ェクトされた細胞を適当な薬剤、例えばＧ−４１８を添
加することにより選択する。次に、蛋白質生成物を血液
凝固アッセイにおける生物学的活性について測定し、ま
た真正なヒト凝固因子に対して調製された抗体を用いて
免疫学的交差反応性について測定する。

【００５４】次に記載する例を要約すれば、例１はファ
クターVII の十分な長さのｃＤＮＡ配列のクローニング
を開示する。例２は、アミノ酸末端の約３０個のアミノ
酸を含む、ヒト−ファクターVII の部分アミノ酸配列を
開示する。例３はヒト−ゲノムＤＮＡライブラリーの造
成及びスクリーニング、並びにファクターVII 遺伝子配
列を含んで成るゲノムクローンの同定を開示する。例４
は、ファクターIXのリーダーペプチドをコードするｃＤ
ＮＡ断片及びコンセンサスカルシウム結合ドメインをコ
ードする合成２本鎖断片をそれぞれが含有する２種類の
ハイブリドセグメントの造成を開示する。次に、ハイブ
リド配列をファクターVII の部分的ｃＤＮＡクローンに
連結する。

【００５５】次に、イン−ビトロ変異の誘発を用いて、
コンセンサス配列をファクターVIIの蛋白質配列データ
に一致するように変形した。例５は、ファクターIXのカ
ルシウム結合ドメイン及びファクターVII の特異的セリ
ンプロテアーゼドメインを含んで成る融合蛋白質をコー
ドする遺伝子配列の造成を記載する。図１３は、トラン
スフェクトされた哺乳類細胞中で血液凝固のための生物
学的活性を有する蛋白質を発現するのに使用するベクタ
ーｐＤ２の造成を記載する。例２に記載する遺伝子融合
体はこのベクターを用いて発現される。例７は、形質転
換された哺乳類細胞系中でファクターIXの遺伝子を発現
するためのベクターｐＤ２の使用を記載する。

【００５６】例８は、ファクターVII に融合したファク
ターIXのリーダー配列を含んで成る一次翻訳生成物をコ
ードするＤＮＡ配列を含有するベクターｐＭ７１３５の
造成を記載する。このベクターはトランスフェクトされ
た哺乳類細胞系においてファクターVII の活性を有する
蛋白質を生産するために使用することができる。例９は
ｃＤＮＡ配列を使用するファクターVII の発現、及びゲ
ノムＤＮＡ−ｃＤＮＡハイブリド配列からのファクター
VII の発現を記載する。

【００５７】次に例によりこの発明をさらに具体的に説
明するが、これによりこの発明の範囲を限定するもので
はない。 （例）制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Bethesda Research Laboratories；BRL ）、及びニュ
ー・イングランド・バイオラブス（New England Biolab
s ）から入手し、そして特にことわらない限り製造者の
指示に従って使用した。オリゴヌクレオチドはアプライ
ド・バイオシステムス（Applied Biosystems）モデル３
８０Ａ ＤＮＡ合成機により合成し、そして変性ゲル上
でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
Ｅ．コリ（E.coli）の形質転換はManiatis等（Molecula
r Cloning ：A Laboratory Manual 、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー、１９８２）により記載
された方法により行った。Ｍ１３及びｐＵＣクローニン
グベクター、並びに宿主株はＢＲＬから入手した。ファ
クターVII はKisiel及びMcMullen（前掲）により記載さ
れた方法によりヒト血漿から調製した。

【００５８】例１．部分的ファクターVII ｃＤＮＡのク
ローニング Ａ．ヒト−肝臓ｃＤＮＡライブラリーの造成 Candra等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA , 80：1845-1848,
1983 の方法により、ヒト−肝臓ｍＲＮＡからｃＤＮＡ
ライブラリーを調製した。ｃＤＮＡ調製物をアルカリ性
シュークロースグラジエント（Monahan 等、Biochemist
ry, 15：223-233, 1976 ）により沈降せしめ、そして約
１０００ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドを含有す
る画分をプールした。

【００５９】第一鎖調製物を逆転写酵素を用いて２本鎖
にし（Chandra 等、１９８３）Ｓ１ヌクレアーゼで処理
し、そして残留する接着末端を４種類すべてのデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＤＮＡポ
リメラーゼＩ（Klenow断片）を用いてフィル−インした
（Maniatis等、Molecular Cloning ：A Laboratory Man
ual 、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、１９８２）。平滑末端化されたｃＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉメチラーゼで処理し、そしてＴ₄ ＤＮＡリガーゼを用
いてリン酸化されたＥｃｏＲＩリンカーに連結した（Ma
niatis等、前掲）。連結されたＤＮＡ調製物をＥｃｏＲ
Ｉにより十分に消化して過剰のリンカー配列を除去しそ
して約１０００塩基対より長い２本鎖ＤＮＡを中性シュ
ークロースグラジエント遠心により精製した（Maniatis
等、前掲）。天然λｇｔ１１ＤＮＡコンカテマー（conc
atemer）に連結し、そしてＥｃｏＲＩにより完全消化
し、そして５′末端のリン酸を細菌性アルカリ性ホスフ
ァターゼ処理により除去した。

【００６０】プールされたヒト−肝臓ｃＤＮＡをファー
ジＤＮＡに連結し、イン−ビトロでパッケージし（Mani
atis等、前掲）、そしてこれを用いてＥ．コリＹ１０８
８に感染させた（Young 及び Davis, Science , 222 ：
778-782, 1983 ）。このライブラリーにおいて約１４×
１０⁶ 個の一次ファージプラークが生じた。これは約２
×１０⁶ 個ずつの７つのライブラリーから成る。これら
の９０％以上がヒトＤＮＡ挿入部を含有する組換体であ
った。この結論はβ−ガラクトシダーゼ活性の欠失、並
びにＥｃｏＲＩによる２０個の無作動クローンの消化及
びこれに続くアガロースゲル電気泳動による特徴付けに
よるものである。ファージ粒子の形のｃＤＮＡライブラ
リーを塩化セシウムグラジエント遠心分離により精製
し、そしてＳＭ緩衝液（Maniatis等、前掲）中に貯蔵し
た。

【００６１】Ｂ．ヒト−肝臓ｃＤＮＡライブラリーのフ
ァクターVII クローンについてのスクリーニング 前記のヒト−肝臓発現ｃＤＮＡライブラリーを、精製さ
れたファクターVII を用いてBrown 等（J.Biol.Chem.,
225 ：4980-4983, 1980 ）の方法により調製した、 ¹²⁵
Ｉ−ラベルされたモノクローナルファクターVII 抗体を
用いて特異的抗原についてスクリーニングした（Young
及びDavis 、前掲）。６×１０⁶ 個のファージプラーク
のスクリーニングにより、抗体に対して陽性反応を与え
る１個の単離体が同定された。これをλVII ２１１５と
称する。

【００６２】このファージクローンλVII ２１１２を、
他の２種類の抗−ファクターVII モノクローナル抗体、
及びファクターVII に対するラビットポリクローナル抗
体に対して試験した。単離体λVII ２１１５はこれらす
べての抗−ファクターVII 抗体に対して陽性反応を示し
た。λVII ２１１５のプレート溶菌物（lysate）（Mani
atis等、６５−６６頁、１９８２）からＤＮＡを調製し
た。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することにより２１
３９塩基対の挿入部が遊離した。この挿入部をＭ１３フ
ァージベクター（Messing, Meth. in Enzymology , 10
1 , 20-77, 1983 ；及びNorrander 等、Gene：101-106,
1983 ）にサブクローニングしてチエインターミネーシ
ョンジデオキシＤＮＡ配列決定（Sanger等、Pro.Natl.A
cad.Sci. USA, 74：5463-5467, 1977）を行った。この
ｃＤＮＡ挿入部は２１４位、８３９位、及び１２０５位
にＰｓｔＩ部位を含有し（これらを図１〜図２）におい
て、それぞれＰｓｔＩａ，ＰｓｔＩｂ及びＰｓｔＩｃと
称する）、そして６１１位に位置するＳｍａＩ部位を含
有する。次のＭ１３鋳型を配列決定した。

【００６３】１）全長（２１３９塩基）ＥｃｏＲＩａ→
ＥｃｏＲＩｂ断片、Ｍ１３ｍｐ１８中（クローンＦ７−
１と称する）； ２）ＰｓｔＩａ→ＥｃｏＲＩａ２１４塩基断片、Ｍ１３
ｍｐ１９中（Ｆ７−２）； ３）ＰｓｔＩａ→ＰｓｔＩｂ６２５塩基断片、Ｍ１３ｍ
ｐ１８中（Ｆ７−３）； ４）ＰｓｔＩｂ→ＰｓｔＩａ６２５塩基断片、Ｍ１３ｍ
ｐ１８中（Ｆ７−７）；

【００６４】５）ＳｍａＩ→ＰｓｔＩｂ２２８塩基断
片、Ｍ１３ｍｐ１０中（Ｆ７−８）； ６）ＰｓｔＩｂ→ＰｓｔＩｃ３６６塩基断片、Ｍ１３ｍ
ｐ１８中（Ｆ７−９）； ７）ＰｓｔＩｃ→ＰｓｔＩｂ３６６塩基断片、Ｍ１３ｍ
ｐ１８中（Ｆ７−１０）； ８）ＰｓｔＩｃ→ＥｃｏＲＩｂ９３０塩基断片、Ｍ１３
ｍｐ１９中（Ｆ７−１１）；及び ９）ＥｃｏＲＩｂ→ＥｃｏＲＩａ全長断片、Ｍ１３ｍｐ
１８中（Ｆ７−１２）。

【００６５】（制限部位の名称は図１〜図３に関す
る。）このデータは両鎖上の配列において９１％のコー
ド領域及び１５％の３′非翻訳領域を確認し、そして残
りのコード領域の９％及び非コード領域の８５％につい
て単鎖配列情報をもたらした。ｃＤＮＡ配列から予想さ
れるアミノ酸配列と、Kisiel及びMcMullen（Thrombosis
Research, 22：375, 1981 の既知のアミノ酸配列デー
タ及び下記（例２）のアミノ酸配列との比較により、Ｄ
ＮＡ配列中４００位の近傍の３個のヌクレオチドの不存
在により説明することができる異状が示された。追加の
配列データを得るため、λVII ２１１５をＥｃｏＲＩで
消化し、そしてファクターVII コード断片を、ＥｃｏＲ
Ｉにより消化されたｐＵＣ１３（Vieira及び Messing,
Gene, 19, 259-268, 1982 ；及びMessing 、前掲）に挿
入した。

【００６６】ｐＵＣVII ２１１５と称する得られる組換
プラスミドを、３２８位で切断するＸｂａＩで消化し
た。消化されたサンプルを半分ずつに分け、半分をα³²
Ｐ ｄＣＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow断片）
によりラベルし（Englund, P.T. J.Mol.Bio., 66, 209,
1972 ）、他方の半分をγ³²Ｐ ＡＴＰ及びポリヌクレ
オチドキナーゼによりラベルした（Chaconas等、Bioche
m.Biophys.Res.Comn.,66：962 ：1975）。次に、ラベル
されたプラスミドをＰｓｔＩにより再切断して１１３塩
基対及び５０９塩基対の断片を得た。

【００６７】これらのそれぞれの断片の両鎖をMaxam 及
び Gilbert（Meth. in Enzymology, 74：560, 1980 ）
の方法により配列決定した。１１３塩基対はその全体に
わたって配列決定し、そして５０９塩基対断片中の２１
０塩基対を配列決定した。これらの配列はＤＮＡ配列デ
ータを蛋白質配列データと一致させる追加の３個の塩基
（１個のＣ及び２個のＧ）を示し、前記の異状な結果は
Ｇ及びＣを含む二次構造に基く配列決定ゲル上での圧縮
により生じたことが示された。両鎖上のコード領域の最
後の９％の配列も確認された。

【００６８】ｐＵＣVII ２１１５の配列をさらに分析す
ることにより、このクローン化断片がファクターVII の
開裂部位にあることが知られている１１アミノ酸の配列
をコードしていることが確認された（Kisiel及びMcMull
en, Thrombosis Research ,22：375, 1981 ）。この配
列とファクターIX（Davie 等、前掲）及びファクターＸ
（Leytus等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA , 81：3699-370
2, 1984 ）アミノ酸配列との比較により、このクローン
は成熟ファクターVII 蛋白質のアミノ酸３６をコードす
るヌクレオチド（およそ）から始まりおよそ１０００の
コードヌクレオチド及び１１００の非コードヌクレオチ
ド並びにポリＡ配列まで続くファクターVII の配列を含
有することが示唆された。さらに、このクローンは３′
コード配列にフレームシフト変異を有していた。

【００６９】正しい３′コード領域を得るため、７つの
λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーの１．４×１０⁶ 個の
クローンのすべてをプラークハイブリダイゼーションに
より（Benton及び David, Science , 196 ：180-181, 1
977 ）、λVII ２１１５のニック−トランスレートされ
たｃＤＮＡを用いてスクリーニングした（Maniatis等、
１０９−１１２頁、１９８２）。

【００７０】次に、７個の陽性単離体を、ｃＤＮＡ挿入
部がサブクローニングされたｐＵＣプラスミドのジデオ
キシ配列決定法によりスクリーニングした（Wallace
等、Gene, 16, 21, 1981）。λｇｔIIクローンをＥｃｏ
ＲＩで消化し、そしてファクターVII 断片を、ＥｃｏＲ
Ｉで開裂されたｐＵＣ１３に挿入した。これらの１つを
除くすべてがλVII ２１１５中の挿入部の塩基２１２に
対応する位置から出発し、１個の例外は３′非コード領
域のみから成ることが見出された。塩基２１２から始ま
るクローンの１つを分析のために選択し、クローンｐＵ
ＣVII １９２３と命名した。

【００７１】ｐＵＣVII ２１１５の分析により６５７位
と８１５位の間にフレームシフト変異が存在することが
示されたため、ｐＵＣVII １９２３をまずこの領域にお
いてMaxam-Gilbert 配列決定法により分析した。プラス
ミドｐＵＣVII １９２３をＮａｒＩ（図２中７７９位）
により消化した。切断されたＤＮＡをＤＮＡポリメラー
ゼＩ（Klenow断片）を用いてα³²Ｐ ｄＣＴＰによりラ
ベルし、そして次にＡｖａＩ（これは図１中ＳｍａＩと
同じ部位を開裂せしめる）及びＴａｑＩ（１０５９部
位）により消化してＮａｒＩ−ＡｖａＩ １６６bp断
片、及び２００bpＮａｒＩ−ＴａｑＩ断片を得た。これ
らのそれぞれを配列決定した。ｐＵＣVII２１１５中で
欠けているＣは６９７位に見出され、そしてやはりｐＵ
ＣVII ２１１５中で欠けている他方のＣは７９８位に見
出された。

【００７２】ｐＵＣVII １９２３のコード領域の配列の
残りの部分が正しいことが、ｐＵＣVII １９２３の全挿
入部のＭ１３サブクローン上でのジデオキシ法による配
列決定によって示された。ＬａｃプライマーＺＣ８７
（表１）を用いて２１２位（図１）から５１２位までの
配列を決定し、プライマーＺＣ２１８（CTCTGCCTGCCGAA
C ）を用いて７１５位から１１４０位までの配列を決定
し、そしてプライマーＺＣ２１７（ATGAGAAGCGCACGAAG
）を用いて７２０位から３５０位までを配列決定し
た。ｐＵＣVII ２１１５挿入部は１３位から６９５位ま
で正しく（１〜１２位は人工的リンカーを含む）、そし
てｐＵＣVII １９２３は２１２位から最後まで正しいの
で、この２者を継ぎ合わせて１３位（図１）から最後ま
で正しい分子を得た。この継ぎ合わせのために用いられ
る便利な点は３２８位のＸｂａＩ部位である。継ぎ合わ
された正しい分子を図１に示す。

【００７３】十分な長さのファクターVII クローンをｃ
ＤＮＡクローニングによって得ることは困難であったか
ら、欠けているコード配列、並びに必要なプロセシング
及びシグナル配列を得るために３つの方策を採用した。
第１の方策はヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、又は
ｃＤＮＡライブラリーの追加のスクリーニングにより必
要な配列を得ることであった。第２のアプローチは、フ
ァクターVII のアミノ酸配列データ（例２）及びビタミ
ンＫ−依存性凝固因子の公表されている配列（Kurachi
及びDavie 、前掲；及びDavie 等、前掲）に基いて必要
な５′コード配列を合成し、そしてこれをファクターIX
のプレプロ配列の部分に連結することであった。第３の
方策はファクターVII とファクターIXのアミノ末端の機
能的類似性に基く。ファクターIXのリーダー及びアミノ
末端部分のコード領域を含んで成る配列を造成した。次
にこれを部分的ファクターVII ｃＤＮＡに適切な方向に
融合せしめた。

【００７４】ファクターVII の完全ＤＮＡ配列を含んで
成るＤＮＡ配列を得るため、残りの５′ＤＮＡ配列を単
離することを試みた。これは、λVII ２１１５のｃＤＮ
Ａ挿入部からの５′末端０．３kb ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ
Ｉ断片を用いて２×１０⁶ ファージから成るｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングすることによって行った。
Gubler及び Hoffman（Gene 25：263-269, 1983 ）の方
法を適用してＨｅｐＧ２細胞からのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ
を用いてライブラリーを造成した。ＲＮＡを逆転写して
第１鎖ｃＤＮＡを生成せしめ、次にＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ及びＲＮアゼＨを用いて第２鎖の合成を行った。

【００７５】ＥｃｏＲＩメチル化及びセファロース６Ｂ
カラムの通過の後、Ｔ₄ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤ
ＮＡ末端を平滑化した。ＥｃｏＲＩリンカーを付加し、
そして過剰のリンカーをＥｃｏＲＩによる消化及びセフ
ァロースＣＬ２Ｂ上でのクロマトグラフィーにより除去
した。ボイドボリウム中のＤＮＡを集め、そしてＥｃｏ
ＲＩで消化されそしてウシ腸ホスファターゼで処理され
たλｇｔ１１に連結した。このＤＮＡをパッケージし、
そしてＥ．コリＹ１０８８中に感染させた。幾つかの陽
性クローンが観察され、そして次にＥｃｏＲＩ断片をＭ
１３ファージベクターにサブクローニングし、そしてＭ
１３ユニバーサルプライマー又はファクターVII 特異的
オリゴヌクレオチドを用いてジデオキシ配列決定を行っ
た。

【００７６】これらからファクターVII のｃＤＮＡクロ
ーン３個を得、そしてこれらの配列を完全に決定した。
λVII ２４６３と称するクローンからの、これらのｃＤ
ＮＡの内最長のものはファクターVII の完全なコード配
列を含有することが見出された。このクローンは、３５
ヌクレオチドの５′非翻訳領域、６０アミノ酸のリーダ
ーをコードする１８０ヌクレオチド、４０６アミノ酸の
成熟蛋白質をコードする１２１８ヌクレオチド、終止コ
ドン、３′非翻訳領域の１０２６ヌクレオチド、及び２
０塩基のポリ（Ａ）テイル（２４６３位から始まる）を
含有していた。このｃＤＮＡを両鎖について完全に配列
決定した。

【００７７】これと、クローンλVII ２１１５及びλVI
I １９２３から前に単離した２つのｃＤＮＡとの比較に
より、クローンλVII ２４６３はλVII ２１１５中の挿
入部の上流に追加の３２１個のヌクレオチドを含有し、
そしてλVII １９２３中の挿入部の上流に５１９ヌクレ
オチドを含有することが示された。λVII ２４６３ｃＤ
ＮＡ及びこれら２つのｃＤＮＡのファクターVII 配列の
オーバーラップが認められた。但し、λVII ２４６３の
ｃＤＮＡは、λVII ２１１５のｃＤＮＡ中に検出される
１００５位及び１１０６位における単一塩基欠落を含ま
ない。従って、λVII ２４６３は単一のＥｃｏＲＩ断片
上にファクターVII リーダー及び成熟蛋白質配列をコー
ドするファクターVII ｃＤＮＡを含有する。

【００７８】追加のｃＤＮＡすなわちλVII ５６５を単
離した。そしてこれは５′末端ファクターVII 配列を含
有するが、しかしコード配列内で切断されていることが
観察された。その５′末端はヌクレオチド９に位置する
（図４）。十分な長さのλVII ２４６３と比較した場
合、λVII ５６５はリーダー配列内の１つのエクソン様
領域に対応する配列を欠くことが見出された。塩基１０
０−１６５がλVII ５６５には存在しない（図４）。こ
の存在しない配列は、ゲノム配列データ（例３中に記載
されている）との比較により、１つのエクソン様領域に
正確に対応する。従って、λVII ５６５はリーダー配列
中での択一的なスプライシンが現象の結果であろう。

【００７９】λVII ２４６３によりコードされるリーダ
ーは非常に長く（６０アミノ酸）、そしてファクターI
X、プロテインＣ及びプロスロンビンと比較した場合非
常に異る疎水性プロフィールを有する。このリーダーは
−６０位及び−２６位に２個のＭｅｔを含有する。シグ
ナルペプチドに典形質な疎水性領域は−２６位のＭｅｔ
ではなく−６０位のＭｅｔに続くので、第１のＭｅｔか
ら開始されるようである。ゲノムクローン中のエクソン
様領域に正確に対応する、λVII ５６５中の不存在領域
が上記の蛋白質に一層類似した疎水性パターンを有する
３８アミノ酸リーダーをもたらすことは興味あることで
ある。

【００８０】例２．ヒト−ファクターVII のアミノ酸配
列 仮定的なｃＤＮＡクローンの同定を確認し、ファクター
VII ｃＤＮＡの配列を実証し、５′配列を含有するクロ
ーンについてｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラ
リーをスクリーニングするための特異的オリゴヌクレオ
チドプローブの合成を可能にする情報を得、そしてファ
クターVII のアミノ末端部分をコードする合成断片を造
成するために、ヒト−ファクターVII のアミノ酸配列を
解明することが望ましい。Kisiel及びMcMullen（前掲）
により限られたアミノ酸配列が与えられたが、より多く
の情報が必要であった。

【００８１】精製されたヒト−ファクター VIIａ（Kisi
el及びMcMullen、前掲）を還元し、そしてCrestfield
等、J.Biol.Chem., 238, 622, 1963 の方法によりカル
ボキシメチル化した。カルボキシメチル化されたファク
ター VIIａのライトポリペプチド鎖及びヘビーポリペプ
チド鎖を、ミクロパックＣ１８逆相カラム（バリアン
社）上で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り分離した。この場合、蒸留水中０．１％ＴＦＡ
（Ａ）、及びアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（Ｂ）を
用いて、５分間に０〜４０％のＢ、２５分間に４０〜８
０％のＢ、及び５分間に８０〜１００％のＢから成るグ
ラジエントにより溶出した。

【００８２】約３００pmole の各ペプチド鎖を、ガス−
フェーズ・プロテイン・シーケンサー（アプライド・バ
イオシステムス社）を用いて自動化されたエドマン分解
により分析した。ヘビーポリペプチド鎖及びライトポリ
ペプチド鎖のアミノ末端において、それぞれ１８残基及
び２９残基が同定された。ファクター VIIａのヘビー鎖
のアミノ末端配列はｃＤＮＡクローンｐＵＣVII ２１１
５により推定されるそれ（図９）と一致した。アミノ酸
配列は図８及び図９中で１文字コードにより次のように
示される。

【００８３】 Ａ アラニン Ｃ システイン Ｄ アスパラギン酸 Ｅ グルタミン酸 Ｆ フェニルアラニン Ｇ グリシン Ｈ ヒスチジン Ｉ イソロイシン Ｋ リジン Ｌ ロイシン Ｍ メチオニン Ｎ アスパラギン Ｐ プロリン Ｑ グルタミン Ｒ アルギニン Ｓ セリン Ｔ スレオニン Ｖ バリン Ｗ トリプトファン Ｙ チロシン Ｘ 未知残基

【００８４】また、＊は、既知の凝固因子の構造との類
似性及びこれらの位置における他のフェニルチオヒダン
トイン−アミノ酸の不存在により、Ｇｌａ残基（γ）が
割合てられた。配列間の最良の整列を与えるためにギャ
ップ（−）が置かれている。さらに、この情製は、５位
及び９位のアミノ酸がリジンであって、すでに報告され
ている（Kisiel及びMcMullen、前掲）ように、それぞれ
スレオニン及びアルギニンではないことを示した。ファ
クターVII のアミノ末端領域に由来するファクター VII
ａのライト鎖の配列分析はｃＤＮＡクローンｐＵＣVII
２１１５の５′末端によりコードされた構造とオーバラ
ップするのに約６残基不足していた。

【００８５】追加の配列データを得るため、２nmole の
カルボキシメチル化されたライト鎖を０．１Ｍ炭酸水素
アンモニウム中pH７．８、３７℃にて１２時間、ウシ−
キモトリプシン（１：１００ｗ／ｗ、酵素：基質）によ
り消化した。生じた断片をミクロパックＣ１８逆相カラ
ム上でのＨＰＬＣにより精製した。前記の溶剤を用い、
５分間で０〜３０％のＢ、２５分間で３０〜６０％の
Ｂ、及び１０分間で６０〜８０％のＢから成るグラジエ
ントにより溶出した。

【００８６】ポリペプチドを、その２２０nm及び２８０
nmにおけるＵＶ吸収により同定した。凍結乾燥されたペ
プチド（約１nmole ずつ）をエドマン分解により分析し
た。その結果（図９）は、クローンｐＵＣVII ２１１５
の対応領域中のｃＤＮＡ配列の多くを確認した。ファク
ター VIIａのライト鎖ペプチドの１５２残基中合計１１
残基（７５％）が同定された。この配列は知られている
ｃＤＮＡ構造によりコードされるそれと同一である。間
接的証明により、Ａｓｎ１４５が炭水化物付加部位であ
るとが示される。

【００８７】例３．ゲノム性ファクターVII 配列のクロ
ーニング ｃＤＮＡに欠けている５′末端配列を得るための１つの
アプローチとして、ヒト胎児肝臓ＤＮＡを含むλファー
ジライブラリー（Lawn等、Cell, 15：1157−1174）を、
ニックトランスレートされたファクターVII ｃＤＮＡに
よりスクリーニングした。ゲノムライブラリーの一部を
Ｅ．コリＬＥ３９２（ＡＴＣＣ３３５７２）上にプレー
トして合計７．２×１０⁶ 個のプラークを生じさせた
（Maniatis等、前掲、３２０−３２１頁）。ファージプ
ラークをプレートからニトロセルロース上に吸着せし
め、そしてBenton及び Davis（Science ，196 ：180, 1
977 ）の方法に従って、³²Ｐ−ラベルされたｃＤＮＡと
ハイブリダイズせしめた。８個のクローンを得、そして
プラークを精製した。

【００８８】ファクターVII ｃＤＮＡ（λVII ２１１
５）の５′末端からのＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩａ−Ｘｂ
ａＩ、図１）及び標準的方法（Maniatis等、前掲）を用
いて、５′末端配列を含有するゲノムクローンを同定し
た。これらのファージを７ｍ１，７ｍ２、及び７ｍ３と
命名した。これらの組換体ファージからＤＮＡを調製
し、そして予備的なエンドヌクレアーゼ地図を得た。最
も強いハイブリダイゼーションシグナルを与えるファー
ジ７ｍ１を用いて一層広範囲制限地図を作成し、そして
ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ ｃＤＮＡ断片をサザンブロッテ
ィング（Southern,J.Mol. Biol., 98：503, 1975 ）
によりこの地図上においた。

【００８９】ファージ７ｍ１がファクターVII 蛋白質の
アミノ末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含有する
か否かを決定するため、ファージＤＮＡ制限消化物のサ
ザンブロットを、その配列がファクターVII アミノ末端
アミノ酸配列から推定されたオリゴヌクレオチドの混合
物とハイブリダイズせしめた。オリゴヌクレオチドＺＣ
１８８，ＺＣ３６０、及びＺＣ４０１（表１及び表２）
をＴ₄ ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性ラベル
し、そしてそれらのＴ_m 以下で数℃においてファージＤ
ＮＡブロットにハイブリダイズせしめた（Wallace, R.
B. 等、Nuc.Acids.Res., ６：3543−3557, 1979）。

【００９０】この分析の結果により、７ｍ１の３．７kb
のＳｓｔＩ断片がこれらのオリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズする配列を含むことが示された。このＳｓｔＩ
断片をＤＮＡ配列分析のためＭ１３にサブクローン化し
た。配列決定用プライマーとしてＺＣ３６０を用いて得
られた結果により、アミノ末端蛋白質配列データに対応
するおよそ６０ヌクレオチドの長さの領域が同定され
た。

【００９１】

【表１】

【００９２】

【表２】

【００９３】ゲノムクローン７ｍ１はエクソン２の上流
の７kb配列を含有することが知られたため、このクロー
ンはファクターVII ５′非翻訳配列及び−１７位のアミ
ノ酸までのリーダー配列を含有するものと予想された。
ゲノムクローン７ｍ１内にエクソン１がコードされてい
ることを確認するため、クローンλVII ２４６３及びλ
VII ５６５からのリーダー配列情報を用いて下に示すオ
リゴヌクレオチドＺＣ５２８及びＺＣ５２９を設計し
た。 ＺＣ５２８ ５′TCA ACA GGC AGG GGC AGC ACT GCA GA
G ATT ３′ ＺＣ５２９ ５′TTC CAC GGC ATG TCC CGT GTT TCT CC
T CCT ３′ これらを用いて７ｍ１ ＤＮＡをプローブし、そしてサ
ブクローン７ＳＤが両オリゴヌクレオチドとハイブリダ
イズすることが見出された。エクソン１は２個のエクソ
ン性配列、すなわちＺＣ５２８（λVII ２４６３中ヌク
レオチド１〜３０に対応する）にハイブリダイズするエ
クソン１ａ、及びＺＣ５２８（λVII ２４６３中ヌクレ
オチド１１９〜１４８に対応する）にハイブリダイズす
るエクソン１ｂから成ることが決定された。

【００９４】エクソン１ａ及びエクソン１ｂの両者を挾
むイントロン配列が配列決定された。１ａは該エクソン
の３′末端にコンセンサススプライスドナー配列を含
み、そして１ｂは各末端においてコンセンサススプライ
スアクセプター（１ｂの上流）又はドナー（１ｂの下
流）配列を含有する。ゲノムクローン７ｍ１内のエクソ
ン１ａの位置は正確にマップされたが、エクソン１ｂの
それは定義された領域内にマップされた。エクソン１ｂ
配列はλVII ２４６３中に存在し、他方λVII ５６５は
１ｂエクソン配列をルーピングアウトしてエクソン１ａ
とエクソン２との間でスプライスされたＲＮＡに由来す
るようである。

【００９５】ｐＵＣ及びＭ１３ベクター中の種々の７ｍ
１サブクローンを調製して残りのエクソンの配列決定を
促進した。エクソン１〜７に対応する、ｃＤＮＡ配列か
ら設計された適当なオリゴヌクレオチドを用いて最終エ
クソン以外のすべてを配列決定した。ゲノム配列はこれ
らの領域にわたるｃＤＮＡ配列に正確に対応する。さら
に、エクソン１〜７のイントロン／エクソン境界が決定
され、そしてほとんどがクローン７ｍ１内に正確に配置
される。ファクターVII 遺伝子内のイントロンのサイズ
及び位置を表３に挙げる。

【００９６】

【表３】

【００９７】ファージ７ｍ１はエクソン８を含むファク
ターVII ３′末端を欠くことが知られた。これらの配列
を得るため、ヒト皮膚一次線維芽細胞由来のλＬ４７．
１（Loenen及び Brammer, Gene, 10, 249, 1980；Mani
atis等、前掲）中１２〜１３kbが濃縮されたＢａｍＨＩ
ライブラリーを２種類のニックトランスレートされたフ
ァクターVII ｃＤＮＡ ＰｓｔＩ断片（エクソン７中の
配列及び３′非翻訳配列に対応する）によりプローブし
た。両プローブにより７ＤＣ１と称するクローンが検出
された。

【００９８】これに続く制限エンドヌクレアーゼ分析及
びサザンブロット分析により、クローン７ＤＣ１はクロ
ーン７ｍ１とオーバラップし、そしてその末端の後に約
３kb伸びること、及びこのものはエクソン８を含むこと
が確立された。エクソン８を含有する７ＤＣ１ ＤＮＡ
からの３．９kb（ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ）断片をＭ１３
にサブクローニングし、そしてその５′及び３′末端に
相補的なオリゴヌクレオチドを用いて配列分析を行っ
た。完全なエクソン配列がこのクローン中に存在する。

【００９９】例４．合成コード配列を含有するファクタ
ーIX−ファクターVII ハイブリド遺伝子 Ａ．ハイブリドファクターIXリーダー−合成ファクター
VII ５′コード配列 ファクターVII の５′コード配列を得るための第２の方
法は、ファクターVIIのアミノ末端アミノ酸配列、他の
ビタミンＫ−依存性凝固因子のアミノ酸配列、及び他の
ビタミンＫ−依存性凝固因子遺伝子（Kurachi 及び Dav
ie、前掲； Anson等、EMBO J., ３：1053−1060, 198
4；及び Davie等、前掲）に基いて推定されたヌクレオ
チド配列を用いて適当な２本鎖断片を合成することであ
った。成熟ファクターVII 類似体の分泌のために必要な
分泌及びプロセシングシグナルを得るため、この合成断
片（コンセンサス配列）をファクターIX ｃＤＮＡクロ
ーン由来の２つのリーダー配列の１つに連結した。この
ストラテジーを図１０中に要約する。

【０１００】ヒト−ファクターIXをコードするｃＤＮＡ
をヒト−肝臓からのｍＲＮＡから造成されたライブラリ
ー（Kurachi 及び Davie、前掲）から得た。ファクター
IX配列をｐＢＲ３２２ベクターからＰｓｔＩ消化により
単離し、そしてｐＵＣ１３のＰｓｔＩ部位に挿入した。
このプラスミドをＦIX−ｐＵＣ１３と命名した。ｃＤＮ
Ａクローニングの結果としてファクターIX挿入部の５′
末端に存在するＧ−リッチ領域を除去するため、合成オ
リゴヌクレオチドアダプターによりクローン化断片の
５′末端を置換した。オリゴヌクレオチドＺＣ２１２及
びＺＣ２１３（表１）を合成し、そしてこれらをアニー
ルして２２塩基対オーバーラップを生じさせ、断片の末
端をフィル−インし、そして適当な制限エンドヌクレア
ーゼで切断し、そして得られた断片をファクターIX配列
に連結した。

【０１０１】アダプターを造成するため、１００pmole
ずつのＺＣ２１２及びＺＣ２１３を凍結乾燥し、そして
１０μｌの１０Ｘキナーゼ／リガーゼ緩衝液（６００mM
Ｔｒｉｓ、pH８．０、１００mM ＭｇＣｌ₂ 、１００
nM ＤＴＴ）及び８６μｌの水中に再懸濁した。アニー
ル反応を６５℃にて１０分間行い、この混合物を徐々に
室温に冷去し、そして氷上に置いた。この混合物に４μ
ｌの２．５mM ｄＮＴＰ混合物及び１μｌ（８ユニッ
ト）のＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼを加えた。反応を１４℃
にて４０分間行った。次に、１０μｌの５Ｍ ＮＨ₄ Ｏ
Ａｃを加え、そしてＤＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ₃ に
より１回、そしてＣＨＣｌ₂ により２回抽出し、そして
エタノールにより沈澱せしめた。ＤＮＡを遠心分離し、
１００μｌのメデュウムサルト緩衝液（Maniatis等、前
掲、１００頁）中に再懸濁し、９ユニットのＰｓｔＩ及
び８ユニットのＣｆｏＩで消化し、そして上記のように
して抽出した。

【０１０２】次に、０．１６pmole の合成ＰｓｔＩ−Ｃ
ｆｏＩアダプター断片、０．１４pmole のＦIX−ｐＵＣ
１３由来ＣｆｏＩ−ＢａｍＨＩファクターIX断片、及び
０．１４pmole の２．７kb ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ ｐ
ＵＣ１３ベクター断片を、６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１０mM ＤＴＴ、及び
０．９ユニットのＴ₄ リガーゼを含有する２０μｌの反
応混合物中で混合することにより変形されたファクター
IX配列を造成した。この反応混合物を室温にて３時間イ
ンキュベートし、そしてこれを用いてコンピテントＥ．
コリＪＭ８３（Messing, Recombinant DNA Technical B
ulletin, NIH Publication No.79-99, 2, No.2, 43-48,
1979 ）を形質転換した。

【０１０３】これらの細胞を５０μｌの２％Ｘ−ｇａｌ
（５ブロモ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド）と共に、４０μｇ／mlのアンピシリンを含有
するＬ−ブロス上にプレートし、そして３７℃にて一夜
インキュベートした。白色コロニーを、アンピシリンを
含有する他のプレートに拾い上げ、そして３７℃にて一
夜増殖せしめた。コロニーをワットマン５４０ペーパー
にブロットし、そしてこのペーパーを Wallace等 (Gen
e, 16：21, 1981）の方法によるハイブリダイゼーショ
ンのために用意した。但し、クロラムフェニコールプレ
ート上での一夜のインキュベーションは省略した。

【０１０４】ペーパーを、４４℃にて２時間、０．９Ｍ
ＮａＣｌ、０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．
５、６mM ＥＤＴＡ、０．５％ノニデット（Nonidet ）
Ｐ−４０、１５０μｇ／ml Ｅ．コリｔＲＮＡ中でイン
キュベートした。ペーパーを、変形された５′末端配列
に特異的な１４−ｍｅｒである³²Ｐ−ラベルされたＺＣ
２３５（表１）によりプローブした。フィルター当り１
〜２×１０⁶cpmを用いるハイブリダイゼーションを４４
℃にて前ハイブリダイゼーション緩衝液中で一夜行っ
た。次に、フィルターを、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
中４℃にて３回、及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中４
４℃にて３回洗浄し、そしてＸ線フィルムに暴露した。
２個の陽性クローンが得られた。これらのクローンの１
つをＦIX（−Ｇ）→ｐＵＣ１３と命名した。

【０１０５】ＦIX（−Ｇ）−ｐＵＣ１３造成物のファク
ターIX部分の変形された領域の配列を確認するため、Ｂ
ＲＬ逆プライマーを用いるｐＵＣプラスミド上で直接に
ジデオキシ配列決定を、 Wallace等、１９８１（前掲）
の方法により、Chaconas等（前掲）の方法によりポリヌ
クレオチドキナーゼ及びγ³²Ｐ−ＡＴＰを用いて末端ラ
ベルされたプライマーを用いて行った。配列は予想通り
であった。

【０１０６】生ずる組換プラスミドは３個のＨａｅIII
開裂部位を含み、第１の部位はファクターIX配列中の３
９位（番号は、 Anson等、前掲、の公表された配列に基
き第１ＡＴＧから始まる）に位置し、第２の部位は１３
０位に位置し、そして第３の部位はｐＵＣ１３ポリリン
カー中に位置する。１３０部位はプレプロ−ファクター
IX分子のＬｙｓ−Ａｒｇプロセシング部位のコドンから
１塩基対上流である。最終ファクターIX−ファクターVI
I ハイブリド造成物中で、３９位又は１３０位で終るフ
ァクターIXリーダー配列を、予想コンセンサス配列及び
ファクターIXリーダー配列の最後の３コドンを含んで成
る合成２本鎖断片に連結した。

【０１０７】合成コンセンサス断片は、オリゴヌクレオ
チドＺＣ２８６〜ＺＣ２８９（表２）を組合わせて２本
鎖断片を形成することにより調製した。１００pmole ず
つのオリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、そして２０μｌ
の１Ｘキナーゼ緩衝液中に再懸濁し、そして４℃にて一
夜インキュベートし、次に６５℃にて１０分間加熱し
た。キナーゼ処理されたオリゴヌクレオチドを用いて２
つのプールを作った。プール１はＺＣ２８６＋ＺＣ２８
７を含み、プール２はＺＣ２８８＋ＺＣ２８９を含有し
た。プールされた対を６５℃にて１０分間アニールし、
そして２時間にわたって室温に冷却し、そして氷上に３
０分間置いた。

【０１０８】変形されたファクターIX断片をＦIX（−
Ｇ）→ｐＵＣ１３からＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片と
して取り出した。約２０μｇのプラスミドを、４μｇの
ＲＮアーゼＡを含有する１００μｌのＨｉｎｄIII 緩衝
液（ＢＲＬ）中３０ユニットずつのＨｉｎｄIII 及びＥ
ｃｏＲＩにより３７℃にて一夜消化した。６５℃にて１
０分間加熱することにより反応を停止し、そしてベクタ
ー及びファクターIX断片を１％アガロースゲル上で電気
泳動し、そして電気溶出により精製した。ファクターIX
断片をエタノールで沈澱せしめ、１００μｇ／μｌのＲ
ＮアーゼＡを含有する緩衝液中に再懸濁し、そして９ユ
ニットのＨａｅIII を用いて３７℃にて一夜消化した。

【０１０９】ＨｉｎｄIII −ＨａｅIII ３９塩基対ファ
クターIX断片をこの消化物から１．５％アガロースゲル
上での電気泳動及びそれに続く電気溶出により単離し
た。ＨｉｎｄIII −ＨａｅIII １３０塩基対ファクター
IX断片を得るため、ＦIX−ｐＵＣ１３をＥｃｏＲＩ及び
ＨｉｎｄIII で消化し、そしてファクターIX断片を上記
のようにして単離した。約３μｇのこのＨｉｎｄIII −
ＥｃｏＲＩ断片を６ユニットのＨａｅIII により３７℃
にて消化し、そしてアリコートを５分間隔で３０分間に
わたり、５０mM ＥＤＴＡを含有する溶液を取り出し
た。アリコートをプールし、そしてＨｉｎｄIII −Ｈａ
ｅIII １３０塩基対断片を５％アクリルアミドゲル上で
の電気泳動及びそれに続く電気溶出により精製した。

【０１１０】最終ファクターIX−コンセンサス配列ハイ
ブリドを、４部連結において、オリゴヌクレオチドプー
ル１及び２、ファクターIX ＨｉｎｄIII −ＨａｅIII
（３９又は１３０塩基対）、並びにｐＵＣ１３ Ｈｉｎ
ｄIII −ＥｃｏＲＩを連結することにより調製した。得
られるプラスミドを用いてＥ．コリＨＢ１０１（ＡＴＣ
Ｃ３３６９４）を形質転換した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄIII により消化することによりコロニーをク
リーニングした。合成コンセンサス配列に連結した３９
塩基対ファクターIX配列を含んで成る配列をｍｉｎｉ−
ＦIX−ＦVII と称する。

【０１１１】この造成物を含有するプラスミドをｐＭ７
２００（−Ｃ）と称する。合成コンセンサス配列に連結
された１３０塩基対ファクターIX配列を含んで成る配列
をｍａｘｉ−ＦIX−ＦVII と称する。この造成物を含有
するプラスミドをｐＭ７１００（−Ｃ）と称する。この
コンセンサス配列は、アミノ酸配列 Ala-Asn-Ala-Phe-L
eu-Gla-Gla-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-Gla-Arg-Gla-Cys-Lys
-Gla-Gln-Cys-Ser-Phe-Gla-Gla-Ala-Arg-Gla-Ile-Phe-G
la-Gly-Leu-Asn-Arg-Thr-Lys-Leuを含んで成るポリペプ
チドをコードする。

【０１１２】Ｂ．ファクターIX−コンセンサス配列ハイ
ブリド断片のファクターVII ｃＤＮＡクローンへの連結 ファクターIX−コンセンサス配列ハイブリド（ｍｉｎｉ
又はｍａｘｉ）を、３部連結において、ファクターVII
ｃＤＮＡの５′部分及びベクターｐＵＣ１３に連結した
（図１１及び図１２）。ＲＮアーゼＡ（４００ng／μ
ｌ）を含有するＨｉｎｄIII 緩衝液中で６μｇのｐＵＣ
１３を１０ユニットずつのＸｂａＩ及びＨｉｎｄIII で
消化することによりベクター断片を得た。上記のように
２μｇのｐＭ７２００（−Ｃ）を１０ユニットずつのＨ
ｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩにより消化してｍｉｎｉ−Ｆ
IX−ＦVII 断片を調製した。

【０１１３】同様にしてｐＭ７１００（−Ｃ）からｍａ
ｘｉ−ＦIX−ＦVII 断片を調製した。ｐＵＣ１３にサブ
クローニングされたｐＵＣVII ２１１５のＥｃｏＲＩ−
ＸｂａＩ ５′断片を含んで成るプラスミドｐＵＣ７０
５から、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによる消化によって、
ファクターVII ｃＤＮＡの５′部分を調製した。この消
化は３７℃にて２時間行い、そして生成物を１．５％ア
ガロースゲル上での電気泳動により分離した。目的とす
る断片を電気溶出し、フェノール／ＣＨＣｌ₃及びＣＨ
Ｃｌ₃ で抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。

【０１１４】次に、３断片、すなわちｐＵＣ１３／Ｘｂ
ａＩ−ＨｉｎｄIII 、ファクターIX−ファクターVII
（ｍｉｎｉ又はｍａｘｉ）／ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲ
Ｉ、及び５′ファクターVII ／ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
を、２μｌの２０mM ＡＴＰ及び０．９ユニットのＴ₄
ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液２０μｌ中で
４℃にて一夜連結した。ＨｉｎｄIII 及びＸｂａＩによ
る制限分析によってコロニーをスクリーニングした。ｍ
ｉｎｉ−又はｍａｘｉ−ＦIX−ＦVII 配列を含有する組
換プラスミドをそれぞれｐＭ７２００及びｐＭ７１００
と命名した（図１１）。

【０１１５】正しいイン−フレームコード配列を形成す
るため、ファクターVII ｃＤＮＡの調製において使用し
たリンカーに基いて融合配列内に変形を行わなければな
らなかった。ｍｉｎｉ−融合体及びｍａｘｉ−融合体の
両者は、ファクターIX−コンセンサス配列ハイブリドと
ファクターVII ｃＤＮＡとの間の連結部にＥｃｏＲＩ部
位を含有する（ｃＤＮＡクローニング過程の人工物であ
る）。さらに、ｍｉｎｉ−融合体は、ＨａｅIII 部位に
おいて配列を５′AGGCCA３′から５′AGGCCCA３′に変
え、そしてこの配列の下流に正しいリーディングフレー
ムを確立するために、Ｃの付加を必要とする。

【０１１６】これらの訂正は、Zoller及び Smith（Manu
al for Advanced Techniques in Molecular Cloning Co
urse, コールドスプリングハーバーラボラトリー、１９
８３により２プライマー法について記載されているのと
実質的に同様の方法により、オリゴヌクレオチド指令部
位特定変異誘発により行った。ｍｉｎｉ−−ＦIX−ＦVI
I 断片をｐＭ７２００からＨｉｎｄIII 及びＸｂａＩに
よる消化により取り出し、そしてＭ１３ｍｐ１９に挿入
した。ｍａｘｉ−ＦIX−ＦVII 断片を、同様にしてｐＭ
７１００から精製し、そしてサブクローニングした。Ｅ
ｃｏＲＩ部位の除去及び塩基の挿入のために、それぞれ
変異誘発プライマーＺＣ３３３及びＺＣ３３６（表２を
参照のこと）を使用した。

【０１１７】各場合に、第２プライマーとしてユニバー
サルプライマーＺＣ８７を使用した。変異誘発プライマ
ーは４０pmole のプライマー及び６０pmole のＡＴＰを
１ユニットのＴ₄ ＤＮＡキナーゼと共に６０℃にて一夜
リン酸化した。ｍａｘｉ−ＦIX−ＦVII ハイブリドから
ＥｃｏＲＩ部位を除去するため、１μｇのＭ１３単鎖鋳
型を２０pmole ずつのＺＣ３３３及びＺＣ８７と、全溶
１０μｌ中で一緒にした。プライマーを６０℃にて１０
分間鋳型とアリールし、５分間室温に冷却し、次に５分
間氷上に置いた。ＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow断片）
を用いてプライマーを延長した。

【０１１８】ｍｉｎｉ−ＦIX−ＦVII ハイブリド中のＥ
ｃｏＲＩ部位を除去しそしてリーディングフレームを正
しくするため、１μｇの該当するＭ１３単鎖鋳型を２０
pmole ずつのＺＣ３３３，ＺＣ３３６及びＺＣ８７と一
緒にした。上記のようにしてアニーリング及びプライマ
ー延長反応を行った。プラークリフトを、³²Ｐ−ラベル
プライマー（ＺＣ３３３又はＺＣ３３６）を用いて６０
℃にてスクリーニングし、そしてジデオキシ配列決定法
により配列を確認した。ｍａｘｉ−ＦIX−ＦVII 又はｍ
ａｘｉ−ＦIX−ＦVII を含んで成る造成物をそれぞれｐ
Ｍ７１１１及びｐＭ７２１１と命名した。

【０１１９】コンセンサス配列は、ファクターVII につ
いて得られた蛋白質配列データと一致しない幾つかの領
域を含有する（図８及び図９）。ファクターVII のアミ
ノ末端部分との一層大きな相同性を有するポリペプチド
をコードする配列を得るため、コンセンサス配列をオリ
ゴヌクレオチド指令部位特定変異誘発により変形した。
この変形は８位におけるＬｅｕの挿入、１８位（８位の
挿入後のアミノ酸位置に関する）におけるＬｙｓとＩｌ
ｅの置換、２６位におけるＡｌａとＡｓｎの置換、及び
３２−３４位における Gly-Leu-Asnと Ala-Ser-Aspの置
換（仮のアミノ酸配列データに基く）から成る。

【０１２０】８位及び１８位の配列変化は鋳型としてｐ
Ｍ７１１１（センス鎖）を用いて行った。前記のように
してプライマーＺＣ３５２（５′CCC AGG TCT CAG CTC
CTCCAG ３′）及びＺＣ３５３（５′CTG CTC CTC CTT A
CA CTC TCT ３′）を鋳型にアニールし、そして延長し
た。得られるファージクローンをｐＭ７１１４と命名し
た。ｐＭ７１１４中の挿入部の配列をジデオキシ配列決
定法により確認した。

【０１２１】同様にして、位置２６−３４の変化をｐＭ
７１１４鋳型（センス鎖）上で、変異誘発プライマーＺ
Ｃ３６６（５′CAG CTT CGT CCT GTT CAG GCC CTC GAA
GATCTC GCG GGC CTC CTC GAA ３′）を用い、ＺＣ８７
（表１）を第２プライマーとして行った。得られた造成
物をｐＭ７１１５と命名した。Ｍ１３ベクター中の全５
５０bp挿入部の配列をジデオキシ法により決定し、そし
て正しいことを見出した。

【０１２２】例５．ファクターIX−ファクターVII ｃＤ
ＮＡ融合体の造製 ファクターIX−ファクターVII ｃＤＮＡ融合体を、 Kur
achi及び Davie（前掲）により記載されているようにし
てヒト−肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得られたファク
ターIX ｃＤＮＡと例１に記載したファクターVII ｃＤ
ＮＡ配列とを使用して調製した。

【０１２３】ハイブリド蛋白質について選択された融合
点はファクターIXのアミノ酸＋３８（スレオニン）とフ
ァクターVII ｃＤＮＡ配列によりコードされる第１リジ
ンとの間であった。この蛋白質は、ファクターIX ｃＤ
ＮＡの最初の２５２bp及びｐＵＣVII ２１１５ファクタ
ーVII ｃＤＮＡ配列の最初の２コドンを除くすべてから
成る配列によりコードされるであろう。このハイブリド
配列を造成するため、便利な制限部位を用いてファクタ
ーIX配列をまずｐＵＣVII ２１１５に融合せしめた。こ
の融合は、完全ファクターVII ｃＤＮＡ配列に連結され
たファクターIXｃＤＮＡの最初の３１０bpを含有するプ
ラスミドＦIX／VII ／１２（下に記載する）をもたら
す。ハイブリド蛋白質のために望ましい正確な連結を達
成するため、介在（intervening ）塩基対をオリゴヌク
レオチド指令変異誘発により除去した。

【０１２４】ファクターIX ｃＤＮＡ配列とファクター
VII ｃＤＮＡ配列との連結を、ＦIX（−Ｇ）−ｐＵＣ１
３（例４）の０．３kb ＨｉｎｄIII −ＡｈａIII 断片
とｐＵＣVII ２１１５（図１２）からの４．７kb Ｓｍ
ａＩ−ＨｉｎｄIII 断片とを連結することにより達成し
た。４０μｌのメデュウムサルト緩衝液（Maniatis等、
前掲）中で３μｇのＦIX（−Ｇ）−ｐＵＣ１３を４０ユ
ニットのＨｉｎｄIIIで３７℃にて４時間消化すること
によりＨｉｎｄIII −ＡｈａIII 断片を調製した。

【０１２５】次に容積を１００μｌのメデュウムサルト
緩衝液に増加し、そして５ユニットのＡｈａIII を加
え、そしてインキュベーションを３７℃にて１８時間続
けた。ＤＮＡ断片を上記のようにして１％アガロース上
での電気泳動により分離し、そして０．３kbのバンドを
単離した。３μｇのｐＵＣVII ２１１５を３０μｌの反
応容積中で２５℃にて１時間、４．８ユニットのＳｍａ
Ｉと共にインキュベートすることによりｐＵＣVII ２１
１５のＳｍａＩ部分消化を行った。６５℃にて１５分間
のインキュベーションにより反応を停止した。次にサン
プルを同容量のフェノールで抽出し、そしてエタノール
沈澱を行った。

【０１２６】１０分間のミクロフュージスピンによって
沈澱を集め、７０％のエタノールですすぎ、そして空気
乾燥した。ＤＮＡを３０μｌのメデュウムサルト緩衝液
に再溶解し、そして３０ユニットのＨｉｎｄIII により
３７℃にて３時間消化した。ＤＮＡを上記のようにして
０．７％アガロース中での電気泳動にかけ、そして４．
７kb Ｈｉｎｄ−ＳｍａＩ断片を単離した。Ｐ等モル量
の２つの断片（０．０４８pmole ）を、５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM Ｄ
ＴＴ、１mM ＡＴＰ、及び３ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガ
ーゼを含有する１０μｌの反応溶液中で連結し、そして
コンピテントＥ．コリＲＲ１（ＡＴＣＣ３１３４３）を
形質転換した。細胞をアンピシリンプレート上で増殖せ
しめ、そして生ずるコロニーの内の１２個を制限酵素消
化により目的プラスミド造成物の存在についてスクリー
ニングした。コロニー１２からのＤＮＡ（ＦIX／VII ／
１２）が予想通りの制限酵素消化パターンをもたらし、
そして次のハイブリド遺伝子造成の段階で使用した。

【０１２７】オリゴヌクレオチド指令変異誘発法を単鎖
ＤＮＡ鋳型上で行った。すなわち、融合したファクター
IX／ファクターVII 配列をＭ１３ｍｐ１９中にクローニ
ングすることが必要であった。便利な小ＤＮＡ断片を得
るため、ＦIX／VII ／１２から６４０bp ＨｉｎｄIII
−ＸｂａＩ断片を単離した。この断片はファクターIXｃ
ＤＮＡの５′末端の３１０bp及びファクターVII 断片の
３３０bpを含有する。１μｇのＭ１３ｍｐ１９ ＲＦ
ＤＮＡを４０μｌのメデュウムサルト緩衝液中で２０ユ
ニットのＨｉｎｄIII 及び２０ユニットのＸｂａＩで３
７℃にて１８時間消化することによりベクターを調製し
た。ＤＮＡを前記のようにして１．２％アガロース中で
の電気泳動にかけ、そして線状６．４kb断片をゲルから
単離した。

【０１２８】５μｇのＦIX／VII ／１２ ＤＮＡを４０
μｌのメデュウムサルト緩衝液中で１０ユニットのＸｂ
ａＩにより３７℃にて１８時間消化した。２０ユニット
のＨｉｎｄIII を加え、そして消化を３７℃にてさらに
７時間続けた。生ずる断片を前記のようにして１．２％
アガロース中での電気泳動により分離し、そして６４０
bp断片を溶出した。１０ngの線状化されたＭ１３ｍｐ１
９及び１ngの６４０bpを１４℃にて１時間連結し、そし
て次にコンピテントＥ．コリＪＭ１０１を形質転換した
（Messing, Meth.in Enzymology、前掲）。細胞をＸ−
ｇａｌ及びＩＰＴＧと共にプレートし（Messing, Meth.
in Enzymology 、前掲）そして８個の淡青色のプラーク
を拾い、そしてＥ．コリＪＭ１０３の培養物（Ａ₆₀₀ ＝
０．３）２．５mlに感染させた。

【０１２９】３７℃にて１８時間の増殖の後、細胞を室
温臨床遠心分離機中での遠心分離により収得し、そして
Ｍ１３ファージを含有する上清２０μｌを１０μｇ／ｌ
のエチジウムブロミドと混合した。既知の標準との比較
により、８個のクローンのそれぞれはほぼ正しいサイズ
の挿入部を有していた。次に、Messing (Meth.in Enzym
ology 前掲）により記載されていたようにして１．５ml
の上清から単鎖ＤＮＡを調製した。次に、プライマーと
してオリゴヌクレオチドＺＣ８７を用いてジデオキシ法
によりこの造成物を配列決定し、挿入連結部が正しいこ
とを確認した。正しいクローンの１つ（＃４）を鋳型と
して使用してオリゴヌクレオチド指令変異誘発により機
能的ファクターIX−ファクターVII 融合体を調製した。

【０１３０】オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
１０bpの目的とするファクターIX配列及び１０bpの目的
とするファクターVII 配列から成る２０−ｍｅｒ（表１
及び表２）を変異誘発プライマーとして使用した。Ｍ１
３ｍｐ１９配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
ドＺＣ８７を第２プライマーとして使用した。使用した
変異誘発法はZoller及び Smith（前掲）の方法の変化で
あった。アニーリング反応のため、２０pmole のＺＣ２
４９を、２０μｌの６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．
０、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM ＤＴＴ、１mM ＡＴ
Ｐ、１ユニットのＴ₄ キナーゼ中で４℃にて一夜インキ
ュベートすることによりリン酸化した。６５℃にて１５
分間加熱することにより反応を停止し、そしてサンプル
を凍結乾燥した。

【０１３１】１pmole の単鎖クローン＃４鋳型及び２０
pmole のＺＣ８７を１０μｌのアニーリング緩衝液（２
００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１００mM Ｍｇ
Ｃｌ ₂ 、５００mM ＮａＣｌ、１０mM ＤＴＴ）に加え
た。サンプルを６５℃にて１０分間加熱し、室温にて５
分間インキュベートし、そして次に氷上に置いた。１０
μｌの次の溶液を新しく調製し、そしてサンプルに加え
た。２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂ 、１０mM ＤＴＴ、１mM ｄＮＴＰ、１mM Ａ
ＴＰ、０．１５ユニット／μｌのＴ₄ ＤＮＡリガーゼ、
０．２５ユニット／μｌのＥ．コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（Klenow断片）。次に、反応混合物を１５℃にて３時
間インキュベートし、そしてこのサンプルを使用してコ
ンピテントＥ．コリＪＭ１０１を形質転換した（Messin
g, Meth.in Enzymology 、前掲）。

【０１３２】生ずるファージをニトロセルロース上に上
げ、そして³²Ｐ−ラベルＺＣ２４９にハイブリダイズせ
しめることによりスクリーニングした。乾燥したＢＡ８
５フィルター（シュリーヒェル＆シュール、０．４５μ
ｍ）を寒天プレート上に置き、そしてファージを５分間
吸着させた。フィルターを取りはずし、そして５分間乾
燥させ、０．５Ｎ ＮａＯＨ及び１．５Ｍ ＮａＣｌで
飽和されたワットマン３ＭＭペーパー上に５分間置き、
３分間空気乾燥し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）及
び１．５Ｍ ＮａＣｌで飽和されたワットマンペーパー
上に５分間置き、そして３分間空気乾燥した。Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌの段階を反復し、そしてフィルターを１００ml
の６×ＳＳＣ中で室温にて２分間すすいだ。空気乾燥し
た後、フィルターを８０℃にて２分間加熱し、４７℃
（ＺＣ２４９のＴｍ−４℃）にて一夜、６．７×ＳＳ
Ｃ、pH６．２、２mg／mlのＥ．コリｔＲＮＡ、並びに
０．２ｗ／ｖ％ずつのＢＳＡ、フィコール及びポリビニ
ルピロリドン中で前ハイブリダイズせしめた。

【０１３３】前ハイブリダイゼーション段階の後、フィ
ルターを２．５×１０⁶cpm／フィルターのラベルされた
ＺＣ２４９と共に同じＳＳＣハイブリダイゼーション緩
衝液中で４７℃にて一夜インキュベートした。ハイブリ
ダイゼーションの後、フィルターを５〜１０分間ずつ３
回室温にて６×ＳＳＣ中で洗浄し、そしてＸ線フィルム
に暴露した。仮定の陽性プラークを再プレートし、そし
て上記のようにしてスクリーニングした。次に個々のプ
ラークを拾い上げ、そして再鎖ＤＮＡを調製し、そして
プライマーとしてＺＣ２７５を使用して配列決定した。
オリゴヌクレオチドＺＣ２７５は、同じ鎖上のＺＣ２４
９の５′方向の配列４０bpに対応する（表１）。

【０１３４】４個の陽性プラークが同定された。１個の
クローンについてＭ１３ｍｐ１９中の全挿入部を、オリ
ゴヌクレオチドＺＣ８７及びＺＣ２７５を用いてジデオ
キシ法により配列決定し、そして正しいことを決定し
た。確認された配列は図１４中塩基１−５６７により示
される。次に、このクローンからのＲＦ ＤＮＡをハイ
ブリド遺伝子の造成の最終段階において使用した。

【０１３５】最終造成を行うために次の３断片を使用し
た。融合したIX／VII 配列を含有するＦIX／VII −９か
らの０．６kb ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片；ｐＵＣVI
I １９２３からの１．７kb ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩファ
クターVII ｃＤＮＡ断片；及びｐＵＣ１３の２．７kb
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片である。３μｇのＦIX／
VII −９（ＲＦ ＤＮＡ）を５０μｌの容積中で４５ユ
ニットのＸｂａＩにより３７℃にて６時間消化した。Ｄ
ＮＡをエタノールで沈澱せしめ、再懸濁し、そして５０
ユニットのＨｉｎｄIII により３７℃にて４時間消化し
た。サンプルを１％アガロース中での電気泳動にかけ、
そして０．６kbのバンドをＮＡ４５ペーパー（シュリー
ヒェル＆シュール）上に電気溶出した。ＤＮＡをこのペ
ーパーから１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、pH８、１mM ＥＤＴＡにより溶出し、フェノール
抽出し、そしてエタノールで沈澱せしめた。

【０１３６】残りのファクターVII ｃＤＮＡ配列を得る
ため、５μｇのｐＵＣVII １９２３を４０μｌのメデュ
ウムサルト緩衝液中で３６ユニットのＸｂａＩにより３
７℃にて３時間消化した。次に、８μｌの１０倍塩緩衝
液、２８μｌの水、及び４μｌ（４０ユニット）のＢａ
ｍＨＩを加え、そして反応混合物を３７℃にて３時間イ
ンキュベートした。ＤＮＡ断片を、１％アガロース中で
の電気泳動により分離し、そして上記のようにして１．
７kb断片を単離した。

【０１３７】１μｇのｐＵＣ１３を２０μｌのメデュウ
ムサルト緩衝液中で１０ユニットのＨｉｎｄIII により
３７℃にて１時間消化することによりベクター断片を調
製した。次に、２μｌの１０倍高塩緩衝液及び１０ユニ
ットのＢａｍＨＩを加え、そしてインキュベーションを
さらに２時間続けた。上記のようにして、ＤＮＡを１％
アガロースゲル上で精製した。

【０１３８】等モル量（およそ０．５６pmole ）の３種
類の断片を室温にて４５分間、１０μｌの５０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、pH７．５、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM
ＤＴＴ、１mM ＡＴＰ及び３ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガ
ーゼ中で連結した。この反応混合物を用いてコンピテン
トＥ．コリＪＭ８３を形質転換した。細胞を、５０μｌ
／プレートの２％Ｘ−ｇａｌが添加された、４０μｇ／
mlのアンピシリンを含有する培地上にプレートした。７
個の白色コロニーからＤＮＡを調製し、そして次に制限
酵素消化によりスクリーニングした。正しいパターンを
示すクローンの１つをＦIX／VII →ｐＵＣ１３と命名し
た。

【０１３９】例６．生物学的に活性なファクターVII 類
似体の発現 哺乳類細胞発現ベクターｐＤ２を、トランスフェクトさ
れた動物細胞中でのＦIX／VII 遺伝子の発現のために選
択した。これは、プラスミドｐＤＨＦＲ−III（Berkner
及び Sharp, Nuc.Acids Res., 13，841-857, 1985 ）
から、次のようにして造成された。ｐＤＨＦＲIII 中の
ＤＨＦＲ ｃＤＮＡに隣接するＰｓｔＩ部位を、常用の
リンカー付加法（Scheller, R.H., Dickerson.R.E., Bo
yer, H.W., Riggs，A.D., 及びItakura, K., Science,
196 ：177-180, 1977 ）によりＢａｍＨＩ部位に転換
した。ｐＤＨＦＲIII ＤＮＡを１０mM Ｔｒｉｓ、pH
７．６、６mM β−ＭＳＨ、６mM ＮａＣｌ、１０mM
ＭｇＣｌ₂ 及び２．５ユニットのＰｓｔＩと共に３７℃
にて１０分間インキュベートし、次にフェノール抽出及
びエタノール沈澱を行った。ＰｓｔＩ接着末端を、Ｔ₄
ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。

【０１４０】フェノール抽出、及び１０mM Ｔｒｉｓ、
pH８．０、１mM ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＮａＣｌに対す
る透析の後、ＤＮＡをエタノール沈澱せしめた。ＤＮＡ
を２０μｌの１．４mM ＡＴＰ、５０mM Ｔｒｉｓ、pH
７．６、１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ジチオスレイトー
ル中に再懸濁し、そして次に５ngのＴ₄ ポリヌクレオチ
ドキナーゼ処理されたＢａｍＨＩリンカー（ニューイン
グランドビオラブス）及び２００ユニットのＴ₄ ポリヌ
クレオチドリガーゼと共に１２℃にて１２時間インキュ
ベートし、次にフェノール沈澱及びエタノール沈澱を行
った。

【０１４１】ＤＮＡを９０ユニットのＢａｍＨＩにより
３７℃にて１時間消化し、次に１．４％アガロースゲル
により電気泳動した。４．９kb ＤＮＡ断片（ＤＨＦＲ
ｃＤＮＡ及びＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル
を欠くｐＤＨＦＲIII ＤＮＡに相当する）を電気溶出
し、そしてポリヌクレオチドリガーゼにより再環化し、
そして次にＥ．コリＨＢ１０１にトランスフェクトし
た。アンピシリン感受性コロニーを迅速プレプ分析（Bi
rnboim, H.C., 及び Doly, J., Nucleic Acids Researc
h, 7：1513−1523）によりスクリーニングし、そして正
しいクローンを増殖させて大規模プラスミドＤＮＡ調製
を行った。

【０１４２】生ずるプラスミドを２０ユニットのＢａｍ
ＨＩで開裂せしめ、そして２．５μｇのウシ腸ホスファ
ターゼで処理し、そして１．４％アガロースゲル上で電
気溶出した。２５μｇのｐＳＶ４０（ｐＢＲ３２２のＢ
ａｍＨＩ部位に挿入されたＳＶ４０ ＤＮＡのクロー
ン）を２５ユニットのＢｃｌＩにより５０℃にて１時間
消化し、次に２５ユニットのＢａｍＨＩを添加し、そし
て３７℃にて１時間インキュベーションを続けた。次
に、このＤＮＡを１．４％アガロースゲル上で電気泳動
した。

【０１４３】ＢａｍＨＩ切断ベクター（すなわち、ポリ
アデニレーションシグナルを欠くベクター）を、後期ポ
リアデニレーションシグナルを含有するＳＶ４０ ＤＮ
Ａ断片（０．１４−０．１９マップユニット〔 Tooze
等、J.編、"DNA Tomor Viruses, Molecular Biology of
Tumor Viruses" 〕に、ゲル精製された断片（０．１μ
ｇずつ）を２０μｌの５０mM Ｔｒｉｓ、pH７．６、１
０mM ＭｇＣｌ₂ 、１mMジチオスレイトール、１．４mM
ＡＴＰ及び１００ユニットのＴ₄ ポリヌクレオチドリ
ガーゼ中で１２℃にて４時間インキュベートすることに
より連結し、そしてＥ．コリＲＲ１を形質転換した。陽
性クローンを迅速プレプ分析により同定し、そして正し
いＤＮＡ、すなわちｐＤ２の大規模調製を行った。

【０１４４】ファクターIX／VII 発現造成物を作成する
ため、１μｇのｐＤ２を２０ユニットのＢａｍＨＩによ
り２０μｌの高塩緩衝液中で３７℃にて１時間消化し
た。次に、２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH
８、１mM ＥＤＴＡ及び１ユニットのウシアルカリ性ホ
スファターゼ（ベーリンガー）を加えた。反応混合物を
３７℃にて１時間インキュベートし、そして７５℃にて
１０分間加熱することにより停止した。１０μｇのＦIX
／VII →ｐＵＣ１３を１５０μｌの高塩緩衝液中で１５
０ユニットのＢａｍＨＩにより３７℃にて２時間消化し
た。

【０１４５】ＤＮＡ断片を１．２％アガロース中での電
気泳動により分離し、そして２．３kb断片を単離した。
等モル量（０．０１５pmole ）の２．３kb ＢａｍＨＩ
断片及びｐＤ２ベクター断片を１４℃にて２．５時間上
記のようにして連結した。この反応混合物を用いてＥ．
コリＲＲ１細胞を形質転換し、次にこれを１０μｇ／ml
のアンピシリンを含有する培地上にプレートした。プラ
スミドＤＮＡを生じたコロニーの内の１２個から調製
し、そして制限酵素消化によりスクリーニングした。正
しい酵素消化パターンを示すクローンの１つをＦIX／VI
I ／ｐＤ２と命名した（図１３）。ＦIX／VII ／ｐＤ２
により形質転換されたＥ．コリＲＲ１は No.５３０６８
としてＡＴＣＣに寄託された。

【０１４６】ＦIX／VII ／ｐＤ２により幼ハムスター腎
臓（ＢＨＫ）細胞（アメリカン・タイプ・カルチュア・
コレクションから受託番号ＣＣＬ１０として入手可能で
ある）をトランスフェクトする方法は、公表されている
方法（例えば、Wigler等、Cell, 14：725, 1978 ； Cor
saro及び Pearson, Somatic Cell Genetics, 7： 603,
1981；Graham及び Vander Eb, Virology, 52：456, 197
3 ）に類似する。ＢＨＫ細胞を６０mm組織培養ペトリ皿
中、ドルベコの培地（＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清
並びにグルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシ
ン）中で３７℃、５％ＣＯ₂ にて、２０％のコンフルエ
ンスまで増殖せしめた。

【０１４７】６０mmペトリ皿１枚のトランスフェクトの
ために合計１０μｇのＤＮＡ、すなわち３．７５μｇの
ＦIX／VII ／ｐＤ２、１．２５μｇのｐＫＯ−ｎｅｏ
（Southern及びBerg, J.Mol.Appl.Genet., 1：327-341,
1982 ）、及び５μｇのサケ精子ＤＮＡを使用した。Ｄ
ＮＡを０．３Ｍ ＮａＯＡｃ、７５％のエタノール中で
沈澱せしめ、７０％のエタノールですすぎ、そして２０
μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８、１mM ＥＤＴ
Ａに再溶解した。ＤＮＡを４４０μｌの水及び５００μ
ｌの２８０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＮａＨＰＯ₄ 、１
２mMデキストロース、５０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．１２
中に再溶解した。６０μｌの２Ｍ ＣａＣｌ₃ を上記の
混合物に滴加し、そして溶液を室温にて３０分間置い
た。次に、この溶液を細胞に加え、そして細胞を３７℃
にもどして４時間置いた。培地を除去し、そして血清を
含有するドルベコ培地中２０％ＤＭＳＯを５ml室温にて
２分間にわたり加えた。次に、皿を培地で２回交換して
迅速に洗浄し、そして新鮮な培地中で一夜インキュベー
トした。ＤＮＡを加えてから２４時間後、培地を除去
し、そして選択培地（血清を含有するドルベコ培地中１
０mg／mlのＧ４１８、４９８μｇ／mg、ギブコ）を加え
た。１０日及び１３日の後、ｐＫＯ−ｎｅｏ遺伝子を含
有しそしてそれ故にＧ４１８に対して耐性である細胞を
代表する個々のクローンを９６ウエル（又は２４ウエ
ル）プレートに移し、そして蛋白質測定のために増殖せ
しめた。

【０１４８】細胞を、５μｇ／mlのビタミンＫ（フィト
ナジオン、メルク）を含有する、１０％ウシ胎児血清が
補充されたドルベコの培地に増殖せしめた。培地を遠心
分離により細胞及び細胞片から分離し、そしてファクタ
ーVII ポリペプチド（ＥＬＩＳＡによる）、及び生物学
的活性について測定した。細胞をトリプシンによりプレ
ートから取り出し、新鮮な培地で洗浄し、遠心分離し、
そして−２０℃にて凍結した。次に、細胞ペレットをＰ
ＢＳ中で洗浄し、ペレット化し、そして０．２５はトリ
トンＸ−１００を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。サン
プルを稀釈し、そしてポリペプチド及び活性について測
定した。

【０１４９】ファクターVII についてのＥＬＩＳＡを次
のようにして行った。ヒト−ファクターVII に対するモ
ノクローナル抗体（０．１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 、pH９．６
中５μｌ／ml）２００μｌを９６ウエルミクロタイター
プレートの各ウエル中で３７℃にて２時間インキュベー
トした。次にウエルを２２０μｌのＰＢＳ（pH７．２）
中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％ト
ウィーン２０と共に３７℃にて２時間インキュベートし
た。プレートを水ですすぎ、空気乾燥し、そして４℃に
て貯蔵した。サンプルを測定するため、２００μｌのサ
ンプルを、抗体がコートされたウエル中で室温にて１時
間インキュベートした。次に、ウエルを０．０５％のト
ウィーン２０を含有する２００μｌのＰＢＳで４回すす
いだ。

【０１５０】次に、ウエルを、ファクターVII に対する
ラビット−ポリクローナル抗血清のＩｇＧ画分（１％の
ＢＳＡ及び０．０５％のトウィーン２０を含有するＰＢ
Ｓ中５μｇ／ml）２００μｌと共に室温にて１時間イン
キュベートした。次に、アルカリ性ホスファターゼと結
合したヤギ抗−ラビットＩｇＧとインキュベートした。
次に、ウエルを０．０５％のトウィーン２０を含有する
ＰＢＳにより４回すすいだ。ウエルに、５６mg／ｌのＭ
ｇＣｌ₂ を含有するジエタノールアミン緩衝液（９６ml
／ｌ）、pH９．８中に溶解したｐ−ニトロフェニルホス
フェート（３０mg）２００μｌを加えた。３７℃にて酵
素反応を行い、そして黄色の発生をＥＬＩＳＡプレート
リーダーを用いて４０５nmでモニターした。細胞培地に
ついて得られた結果を表４に示す。

【０１５１】ファクターVII の生物学的活性はQuick (H
emorragic Disease and Thrombosis, 第３版、Leat Feb
iger, フィラデルフィア、１９６６）により記載された
ワン−ステージ・クロッティングアッセイにより測定し
た。細胞培地について得られた結果を表４に示す。

【０１５２】

【表４】

【０１５３】例７．ファクターIXの発現 １４μｇのＦIX（−Ｇ）→ｐＵＣ１３を３０μｌの高塩
緩衝液中で３０ユニットのＢａｍＨＩにより３７℃にて
３時間消化した。次に、ＤＮＡを１％アガロースゲル中
での電気泳動にかけ、そしてファクターIX配列を含有す
る１．４kbバンドをゲルから単離した。

【０１５４】３μｇのベクターｐＤ２を３０μｌの高塩
緩衝液中で３０ユニットのＢａｍＨＩにより３７℃にて
３時間消化した。ＤＮＡを１％アガロース中での電気泳
動にかけ、そして線状１．５kb断片を単離した。次に、
ＤＮＡを３０μｌの１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８、１
mM ＥＤＴＡ中で０．１２ユニットのウシアルカリ性ホ
スファターゼにより３７℃にて３０分間処理した。塩を
０．３Ｍ ＮａＯＡｃに調製し、そしてサンプルをフェ
ノールにて２回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、そ
してＤＮＡをエタノール沈澱せしめた。ペレットを７０
％エタノール中ですすぎ、乾燥し、そして２０μｌの１
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８、１mMＥＤＴＡ中に再溶
解した。

【０１５５】等モル量（０．０２pmole ）の２つの断片
を上記のようにして１０ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガーゼ
により連結した。反応混合物を使用してＥ．コリＲＲ１
細胞を形質転換した。生じたアンピシリン耐性コロニー
の内の１２コロニーからのＤＮＡを制限酵素消化により
スクリーニングした。正しい方向に挿入された１．４kb
断片を有するクローンの１つをＦIX（−Ｇ）−ｐＤ２と
命名した。ＦIX（−Ｇ）−ｐＤ２により形質転換された
Ｅ．コリＲＲ１は No.５３０６７としてＡＴＣＣに寄託
された。

【０１５６】ＢＨＫ細胞を、上記のようにしてＦIX（−
Ｇ）−ｐＤ２及びｐＫＯ−ｎｅｏにより同時トランスフ
ェクトした。薬剤耐性細胞を選択し、そして例６に記載
したようにしてＥＬＩＳＡ及び活性測定のために用意し
た。生物学的活性の試験は、ファクターIX不足患者から
の血漿の凝固時間を短縮するファクターIXの能力に基
く。これは Proctor及びRapaport, Amer.J.Clin.Path.,
36：212, 1961 により記載されたようにして行った。
結果を表５に示す。

【０１５７】

【表５】

【０１５８】ファクターIXポリペプチドの量は例６に記
載したのと実質上同様にしてファクターIXに対するポリ
クローナルラビット抗血清を使用してＥＬＩＳＡ法によ
り決定した。ウエルをファクターIX含有サンプルと共に
インキュベートした後、ウエルを洗浄し、そして１％の
ＢＳＡ０．０５％のトウィーン２０を含有するＰＢＳ中
１：１０００稀釈された、アルカリ性ホスファターゼと
接合したアフィニティー精製されたラビットポリクロー
ナル抗−ファクターIXの２００μｌと共に室温にて１時
間インキュベートした。次に、ウエルを、０．０５％の
トウィーン２０を含有するＰＢＳで４回すすぎ、そして
酵素基質を上記のように添加した。４℃にて一夜、又は
３７℃にて２時間、インキュベーションを行った。

【０１５９】表５に示すように、ファクターIXの７０〜
８０％が培地中に分泌され、そしてその約５０％が生物
学的に活性であった。細胞ペレット中にはファクターIX
活性は検出されなかった。細胞培養培地に１〜１０mg／
mlの濃度でビタミンＫ（フィトナジオン、メルク）を補
充することにより最も高レベルの活性が達成された。

【０１６０】細胞が真正なファクターIXを分泌すること
を証明するため幾つかの追加の分析を行った。上記の測
定に従ってファクターIX活性を含有するサンプルをファ
クターVII 不足血漿とインキュベートしたが凝固時間に
は影響を与えず、活性が非特異的凝固剤ではなく真正な
ファクターIXに基くことが示された。この結果はさらに
特異的異体によりファクターIX活性がサンプルから涸渇
することにより確認された。ファクターIX活性の９７〜
９８％が、ファクターIXに対するラビットポリクローナ
ル抗体により細胞上清から免疫沈澱した。この抗体はま
た正常血漿からファクターIX活性の９９％以上を沈澱せ
しめた。エリスロポイエチンに対するラビットポリクロ
ーナル抗体によっては上清からファクターIX活性が除去
されなかった。

【０１６１】例８．ファクターVII のための発現ベクタ
ーの造成 部分的ファクターVII ｃＤＮＡに連結された合成ファク
ターVII ５′コード領域を含んで成る発現ベクターを造
成した。ｐＭ７１１５からのファクターIXリーダー−
５′ファクターVII 配列、及びＦIX／VII ／ｐＤ２から
の３′ファクターVII 配列を、ＳＶ４０エンハンサー並
びにアデノウイルス２主要後期プロモーター及びトリパ
ルタイトリーダーを含むプラスミドｐＤ３に挿入するこ
とによりｐＭ７１３５と称するベクターを生じさせた。

【０１６２】プラスミドｐＤ３はプラスミドｐＤＨＦＲ
III から得られた。ｐＤＨＦＲIII中のＤＨＦＲ配列か
らすぐ上流のＰｓｔＩ部位を次のようにしてＢｃｌＩ部
位に転換した。１０μｇのプラスミドを１００μｌの緩
衝液Ａ（１０mM Ｔｒｉｓ、pH８、１０mM ＭｇＣ
ｌ₂ 、６mM ＮａＣｌ、７mM β−ＭＳＨ）中で３７℃
にて１０分間５ユニットのＰｓｔＩにより消化した。

【０１６３】ＤＮＡをフェノール抽出し、ＥｔＯＨ沈澱
せしめ、そして１０mM ｄＣＴＰ及び１６ユニットのＴ
₄ ＤＮＡポリメラーゼを含有する４０μｌの緩衝液Ｂ
（５０mM Ｔｒｉｓ pH８、７mM ＭｇＣｌ₂ 、７mM
β−ＭＳＨ）中に再懸濁し、そして１２℃にて６０分間
インキュベートした。ＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮＡを、４
００ユニットのＴ₄ ポリヌクレオチドリガーゼを含有す
る１４μｌの緩衝液Ｃ（１０mM Ｔｒｉｓ、pH８、１０
mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM ＤＴＴ、１．４mM ＡＴＰ）中
で２．５μｇのキナーゼ処理されたＢｃｌＩリンカー
に、１２℃にて１２時間連結した。フェノール抽出及び
ＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮＡを１２０μｌの緩衝液Ｄ（７
５mM ＫＣｌ、６mM Ｔｒｉｓ、pH７．５、１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂ 、１mM ＤＴＴ）中に再懸濁し、８０ユニット
のＢｃｌＩで５０℃にて６０分間消化し、そしてアガロ
ースで電気泳動した。フォームIII プラスミドＤＮＡ
（１０μｇ）をゲルから単離し、そして５０ユニットの
Ｔ₄ ポリヌクレオチドリガーゼを含有する１０μｌの緩
衝液Ｃ中で１２℃にて２時間連結し、そしてこれを用い
てＥ．コリＨＢ１０１を形質転換した。陽性クローンを
迅速ＤＮＡ調製分析により同定し、そして陽性コロニー
から調製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＨＦＲ′と称す
る）をｄＡＭ^- Ｅ．コリに形質転換した。

【０１６４】次に、下記のようにしてプラスミドｐＤ
２′を得た。ｐＤＨＦＲ′（１５μｇ）及びｐＳＶ４０
（２５μｇ）を１００μｌの緩衝液Ｄ中で２５ユニット
のＢｃｌＩを用いて５０℃にて６０分間開裂せしめ、次
に５０ユニットのＢａｍＨＩを加えて３７℃にて６０分
間さらにインキュベートした。ＤＮＡ断片をアガロース
ゲル電気泳動により分離し、そして４．９kb ｐＤＨＦ
Ｒ′断片及び０．２kbＳＶ４０断片を単離した。これら
の断片（２００ngのｐＤＨＦＲ′及び１００ngのＳＶ４
０ ＤＮＡ）を１００ユニットのＴ₄ ポリヌクレオチド
リガーゼを含有する１０μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて
４時間インキュベートし、そして生成した造成物（ｐＤ
２′）を用いてＥ．コリＲＲ１を形質転換した。ｐＢＲ
３２２領域中の“毒性（poison）”配列（Lusky 及びBo
tcham, Nature,293, 79−81, 1981）を除去することに
よりプラスミドｐＤ２′を変形した。プラスミドｐＤ
２′（６．６μｇ）及びｐＭＬ−１（Lusky 及びBotcha
m 、前掲）（４μｇ）を５０μｌの緩衝液Ａ中で１０ユ
ニットずつのＥｃｏＲＩ及びＮｒｕＩにより３７℃にて
２時間インキュベートし、そしてアガロースゲル電気泳
動を行った。１．７kb ｐＤ２′断片及び１．８kb ｐ
ＭＬ−１断片を単離し、そして１００ユニットのＴ₄ ポ
リヌクレオチドリガーゼを含有する２０μｌの緩衝液Ｃ
中で１２℃にて２時間相互に連結し、次にＥ．コリＨＢ
１０１に形質転換した。目的とする造成物（ΔｐＤ２と
称する）を含有するコードを迅速調製分析により同定し
た。次に１０μｇのΔｐＤ２を５０μｌの緩衝液Ａ中で
２０ユニットずつのＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIにより３７
℃にて２時間消化した。ＤＮＡをアガロースにより電気
泳動し、そしてｐＢＲ３２２の３′スプライス部位及び
ポリＡ配列を含有する目的の２．８kb断片（断片Ｃ）を
単離した。

【０１６５】ｐＤ３の造成において使用される残りの断
片を得るため、ＳａｃII（ＳｓｔII）部位をＨｉｎｄII
I 部位又はＫｐｎＩ部位のいずれかに転換するようにｐ
ＤＨＦＲIII を変形した。１０μｇのｐＤＨＦＲIII を
２０ユニットのＳｓｔIIにより３７℃にて２時間消化
し、そして次にフェノール抽出及びエタノール沈澱を行
った。再懸濁したＤＮＡを１０mM ｄＣＴＰ及び１６ユ
ニットのＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌ
の緩衝液Ｂ中で１２℃にて６０分間インキュベートし、
フェノール抽出し、透析し、そしてエタノール沈澱し
た。ＤＮＡ（５μｇ）を４００ユニットのＴ₄ ＤＮＡリ
ガーゼを含有する２０μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて１
０時間、５０μｇのキナーゼ処理されたＨｉｎｄIII 又
はＫｐｎＩリンカーと連結し、フェノール抽出し、そし
てエタノール沈澱せしめた。

【０１６６】５０μｌの緩衝液Ａ中に再懸濁した後、得
られたプラスミドを適当であれば５０ユニットのＨｉｎ
ｄIII 又はＫｐｎＩで消化し、そしてアガロースにより
電気泳動した。ゲル−単離したＤＮＡ（２５０ng）を４
００ユニットのＴ₄ ＤＮＡリガーゼを含有する３０μｌ
の緩衝液Ｃ中で１２℃にて４時間連結し、そしてこれを
用いてＥ．コリＲＲ１を形質転換した。得られたプラス
ミドをｐＤＥＦＲIII（ＨｉｎｄIII ）及びｐＤＨＦＲI
II （ＫｐｍＩ）と命名した。次に、７００bpＫｐｎＩ
−ＢｇｌII断片（断片Ａ）をｐＤＨＦＲIII （Ｋｐｎ
Ｉ）から、ＢｇｌII及びＫｐｎＩによる消化並びにこれ
に続くアガロースゲル電気泳動により精製した。

【０１６７】ＳＶ４０エンハンサー配列を次のようにし
てｐＤＨＦＲIII （ＨｉｎｄIII ）に挿入した。５０μ
ｇのＳＶ４０ ＤＮＡを１２０μｌの緩衝液Ａ中で５０
ユニットのＨｉｎｄIII と共に３７℃にて２時間インキ
ュベートし、そしてＨｉｎｄIII Ｃ ＳＶ４０断片（５
０８９−９６８bp）をゲル精製した。プラスミドｐＤＨ
ＦＲIII （ＨｉｎｄIII ）（１０μｇ）を２５０ngのウ
シ小腸ホスファターゼにより３７℃にて１時間処理し、
フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱せしめた。線
状化されたプラスミド（５０ng）を、１６μｌの緩衝液
Ｃ中で１２℃にて３時間、２００ユニットのＴ₄ ポリヌ
クレオチドリガーゼを用いて、２５０ngのＨｉｎｄIII
Ｃ ＳＶ４０と連結し、そしてＥ．コリＨＢ１０１に形
質転換した。次に、７００塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ
Ｉ断片（断片Ｂ）をこのプラスミドから単離した。

【０１６８】ｐＤ３の最終造成のため、断片Ａ及びＢ
（５０ngずつ）を、２００ユニットのＴ₄ ポリヌクレオ
チドリガーゼを用いて１２℃にて４時間、１０ngの断片
Ｃと連結し、次にＥ．コリＲＲ１を形質転換した。陽性
コロニーを迅速調製分析により検出し、そしてｐＤ３の
大規模調製を行った。次に、発現ベクターｐＭ７１３５
を造成した。ｐＭ７１１５の複製形をＢａｍＨＩ及びＸ
ｂａＩで消化し、そしてファクターIXリーダー及び５′
ファクターVII 配列を含有する５５０塩基対断片をゲル
精製した。プラスミドＦIX／VII ／ｐＤ２をＸｂａＩ及
びＢａｍＨＩで消化し、そしてファクターVII ｃＤＮＡ
の３′部分を含んで成る１７００bp断片をゲル精製し
た。プラスミドｐＤ３をＢｃｌＩで消化し、ウシアルカ
リ性ホスファターゼで処理し、そして３個の断片を三重
連結により連結した。得られた造成物を２０００塩基対
ＸｂａＩ断片の存在についてスクリーニングした。正し
い配列を有するプラスミドを選択し、そしてｐＭ７１３
５と命名した（図１８）。

【０１６９】例９．ｃＤＮＡクローンからのファクター
VII の発現 ファクターVII リーダーを含有するファクターVII ｃＤ
ＮＡを発現するため、λVII ２４６３、又はλVII ５６
５及びλVII ２４６３からのＤＮＡを、Ａｄ２主要後期
プロモーター、ＳＶ４０エンハンサー配列、Ａｄ２トリ
パルタイトリーダー、スプライスセット、及びＳＶ４０
ポリアデニレーションシグナルを含有する発現ベクター
にクローニングした。このベクターは、ｃＤＮＡの挿入
の部位としてユニークＥｃｏＲＩ配列を含有するように
適合されている。６０アミノ酸のリーダーをコードする
λVII ２４６３からの配列の発現、及び−１８から−３
９までのアミノ酸のコドンを欠き、そしてそれ故に３８
アミノ酸の長さのリーダーをコードするλVII ５６５及
びλVII ２４６３からの配列の発現を評価した。

【０１７０】ファクターVII リーダーの構造はｃＤＮＡ
クローニングによってのみ同定されているため、及び２
つの異る５′−末端ｃＤＮＡを得ることによって生じる
あいまいさのため、本発明者等はさらにゲノム−ｃＤＮ
ＡファクターVII 配列を造成した。λVII ２４６３の
３′部分（エクソン２中のＢｇｌII部位からポリ（Ａ）
テイルへの３′リンカーのＥｃｏＲＩ部位まで）を、エ
クソン１ａ，１ｂ及びエクソン２の残りをコードするク
ローン７mlのサブゲノム断片に連結した。ＥｃｏＲＩ−
ＢｇｌII４．４kb断片として再構成されたこのサブゲノ
ム断片をλVII ２４６３ ｃＤＮＡに連結し、そして哺
乳類発現ベクターにクローニングした。

【０１７１】要約すれば、サブクローンを造成するた
め、λVII ２４６３のファクターVIIｃＤＮＡ Ｅｃｏ
ＲＩ断片をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にクローニング
し、そしてｐVII ２４６３と命名した。同様にして、λ
VII ５６５のＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ挿入部をｐＵＣ１８
にサブクローニングし、そしてｐVII ５６５と命名し
た。クローンｐVII ５６５のファクターVII 配列の５′
部位とｐVII ２４６３のファクターVII ＤＮＡの３′セ
グメントの間のハイブリドを、次のようにして造成し
た。すなわち、ｐVII ５６５の最も５′のＥｃｏＲＩ−
ＢｇｌIIファクターVII 断片、及びｐVII ２４６３のＢ
ｇｌII−ＨｉｎｄIII ファクターVII 断片（ｐVII ２４
６３のポリリンカー中のＨｉｎｄIII 部位）をＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄIII で消化されたｐＵＣ１８にクローニ
ングした。この造成物をｐVII ２３９７と命名した。ｐ
VII ２４６３及びｐVII ２３９７の挿入部をＥｃｏＲＩ
消化により取り出し、そしてゲル濾過し、下記のように
して哺乳類発現ベクターに挿入した。

【０１７２】Ａ．十分な長さのファクターVII ｃＤＮＡ
の発現 ファクターVII の発現をベクターｐＤＸ中で達成した。
このベクターはｐＤ３（例８に記載した）及びｐＤ３′
〔このベクターはｐＤ３と同じであるが、但しＳＶ４０
ポリアデニレーションシグナル（すなわち、ＳＶ４０
ＢａｍＨＩ〔２５３３bp〕−ＢｃｌＩ〔２７７０bp〕断
片が後方向（late orientation）にある〕から誘導し
た。従って、ｐＤ３′は遺伝子挿入の部位としてＢａｍ
ＨＩ部位を含有する。

【０１７３】ｐＤＸを形成するため、ｐＤ３′中のＥｃ
ｏＲＩ部位を、ＥｃｏＲＩによる開裂、Ｓ１ヌクレアー
ゼによるインキュベーション、及びこれに続くＢｃｌＩ
リンカーとの連結により、ＢｃｌＩ部位に転換した。Ｄ
ＮＡを陽性に同定されたコロニーから調製し、そして変
化した制限部位を含有する１．９kb ＸｈｏＩ−Ｐｓｔ
Ｉ断片をアガロースゲル電気泳動により調製した。第２
の変形において、ＢｃｌＩで開裂されたｐＤ３をキナー
ゼ処理されたＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩアダプター（オリゴ
ヌクレオチドＺＣ５２５、５′GGAATTCT３′；及びＺＣ
５２６、５′GATCAGAATTCC３′から造成される）と連結
して、発現ベクターに遺伝子を挿入するための部位とし
てＥｃｏＲＩ部位を生じさせた。

【０１７４】陽性コロニーを制限エンドヌクレアーゼ分
析により同定し、そしてこれからのＤＮＡを使用して変
形された制限部位を含有する２．３kb ＸｈｏＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片を単離した。上記の２つのＤＮＡ断片をＴ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼと共に一緒にインキュベートし、Ｅ．コリ
ＨＢ１０１に形質転換し、そして陽性コロニーを制限分
析により同定した。ｐＤＸと称するこのようなＤＮＡの
調製を行った（図２２）。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで開
裂せしめ、そして次にウシ小腸ホスファターゼと共にイ
ンキュベートした。次に、精製されたＤＮＡをＴ₄ ＤＮ
Ａリガーゼ及びｐVII ２４６３からのファクターVII Ｅ
ｃｏＲＩ断片と、又はｐVII ２３９７に由来する、ファ
クターVII ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡ断片とインキュベート
した。

【０１７５】生ずるクローンをそれぞれＦVII （２４６
３）／ｐＤＸ、及びＦVII （５６５＋２４６３）／ｐＤ
Ｘと命名した。Ｅ．コリＪＭ８３に形質転換し、次に制
限酵素分析により同定した後、プラスミドＤＮＡの調製
を行い、広範囲の制限エンドヌクレアーゼ消化によって
チェックした。プラスミドＦVII （２４６３）／ｐＤ
Ｘ、及びＦVII （５６５＋２４６３）／ｐＤＸはアメリ
カン・タイプ・カルチュアー・コレクションに寄託さ
れ、それぞれ受託番号 No.４０２０６、及び No.４０２
０５が与えられた。

【０１７６】ＦVII （２４６３）／ｐＤＸ及びＦVII
（５６５＋２４６３）／ｐＤＸ（１０μｇずつ）のそれ
ぞれを、１０μｇのサケ精子キャリヤーＤＮＡと共に、
ＢＨＫｔｋ^- ｔ１３細胞（Floros等、Exper.Cell Res.
132 ：215-223, 1981 ）又はＣＯＳ細胞のいずれかに、
標準的リン酸カルシウム沈澱法を用いてトランスフェク
トした。トランスフェクションに続き、細胞を５μｇ／
mlのビタミンＫを含有する適当な培地に２日間培養し
た。この時点で、ファクターVII に対するモノクローナ
ル抗体を用いて、上清をＥＬＩＳＡ陽性材料についてア
ッセイした。ＦVII （２４６３）／ｐＤＸ及びＦVII
（５６５＋２４６３）／ｐＤＸの両者はファクターVII
ポリペプチドの生産を指令し、これはＣＯＳ細胞上清中
に検出され、そしてＦVII （５６５＋２４６３）ｐＤＸ
からのファクターVII はＢＨＫ細胞上清中に観察され
た。Ｓｈａｍ−トランスフェクトされたＢＨＫ細胞又は
ＣＯＳ細胞は検出可能なレベルのファクターVII をもた
らさなかった（表６）。

【０１７７】

【表６】

【０１７８】ファクターVII の一時的な発現も表７に挙
げる幾つかの他の細胞系において試験した。

【０１７９】

【表７】

【０１８０】細胞を、１０μｇのＦVII （２４６３）／
ｐＤＸ又はＦVII （５６５＋２４６３）／ｐＤＸのいず
れか、並びにクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含んで成るプラスミド１μｇ（同時ト
ランスフェクトされた細胞の同定を可能にするため）及
び１０μｇのサケ精子ＤＮＡにより同時トランスフェク
トした。６日後にスペント培地をＥＬＩＳＡにより測定
した。結果を表８及び表９に示す。

【０１８１】

【表８】

【０１８２】

【表９】

【０１８３】ＦVII （２４６３）／ｐＤＸ（１０μｇ）
又はＦVII （５６５＋２４６３）／ｐＤＸ（１０μｇ）
を、１０μｇのサケ精子ＤＮＡ及び哺乳類発現ベクター
中ジヒドロフォレートリダクターゼの耐性形（Simonson
及びLevinson, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80：2495−24
99, 1983）をコードするプラスミド１μｇと共にＢＨＫ
ｔｋ^- ｔ１３細胞に同時トランスフェクトした。２日
後、細胞を１：１４に分け、２５０nM又は１０００nMメ
トトレキセート（ＭＴＸ）、及び５μｇ／mlのビタミン
Ｋ（フェタジオン、メルク）を含有する選択培地に入れ
た。２週間後、コロニーを単離し、そして５０〜９０％
コンフルエンシーに増殖させた。次に上清をＥＬＩＳＡ
によりファクターVII ポリペプチドについて測定した。

【０１８４】２５個の陽性クローンの内２２個をさらに
分析した。細胞を、５×１０⁴ （グループＩ）又は１×
１０⁵ （グループII）で、５μｇ／mlのビタミンＫ、及
び２５０nM又は１０００mMメトトレキセートを含有する
１０cmの皿にプレートした。５日後、速く増殖するクロ
ーン（表１０及び１１中＊印を付す）を１：２に分け、
そして２５時間後すべてのプレート上の培地を交換し
た。２３時間後（グループＩ）又は２０時間後（グルー
プII）、上清を収得し、そして各クローンについて細胞
を計数した。培地をＥＬＩＳＡ又はワン−ステージクロ
ッティングアッセイの両方により測定した。

【０１８５】

【表１０】

【０１８６】

【表１１】

【０１８７】Ｂ．ファクターVII ゲノム−ｃＤＮＡハイ
ブリドの発現 ファクターVII ゲノム５′−末端を代表するゲノム配列
及びファクターVII 遺伝子３′−末端からのｃＤＮＡ配
列を含んでなる発現ベクターを次のようにして調製し
た。ゲノムプラスミド７mlの３つのサブクローン、７Ｂ
ａｍ、７ＳＤ及び７ＳＥを用いて５′−末端を再構成し
た。プラスミド７ＢａｍはｐＵＣ１２にサブクローニン
グされた、エクソン１ａを含有する３．６kb ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片である。エクソン１ａを含有する
０．７kb ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をこのサブクロー
ンから単離した。これを断片ａと称する。プラスミド７
ＳＤは、ｐＵＣ１８にサブクローニングされた、エクソ
ン１ｂを含有する３．７kb ＳｓｔＩ断片である。

【０１８８】エクソン１ｂ含有３．１kb ＸｂａＩ−Ｓ
ｓｔＩ断片をこのサブクローンから単離した。これを断
片ｂと称する。プラスミド７ＳＥは、Ｍ１３ｍｐ１９に
サブクローニングされた、エクソン２−４を含有する
３．９kb ＳｓｔＩ断片である。エクソン２の５′部分
を含有するＳｓｔＩ−ＢｇｌII（０．６kb）断片をゲル
単離した。これを断片ｃと称する。３′−ファクターVI
I ｃＤＮＡの残り（断片ｄ）はｐＵVII ２４６３から２
kb ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ断片として得た。断片ａ−ｄ
を、ＥｃｏＲＩで開裂されそしてウシ小腸ホスファター
ゼ処理されたｐＤＸと連結し、そしてＥ．コリＪＭ８３
又はＨＢ１０１に形質転換した。陽性コロニーを制限酵
素分析により同定し、そしてこれらのコロニーからプラ
スミドＤＮＡを調製した。

【０１８９】ファクターVII の発現のため、プラスミド
ＤＮＡを前記のようにしてＢＨＫ又はＣＯＳに同時トラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をビタ
ミンＫ−含有培地中で２日間培養し、培地をＥＬＩＳＡ
によりファクターVII について測定した。以上、この発
明を具体的に説明したが、この発明の範囲内において多
くの変更を行うことが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｃＤＮＡクローンλVII ２１１５及び
λVII １９２３の部分を連結することにより形成された
部分的ファクターVII ｃＤＮＡ配列を示す。

【図２】図２は、ｃＤＮＡクローンλVII ２１１５及び
λVII １９２３の部分を連結することにより形成された
部分的ファクターVII ｃＤＮＡ配列を示す。

【図３】図３は、ｃＤＮＡクローンλVII ２１１５及び
λVII １９２３の部分を連結することにより形成された
部分的ファクターVII ｃＤＮＡ配列を示す。

【図４】図４はλVII ２４６３のファクターVII ｃＤＮ
Ａ配列を示す。矢印はλVII ５６５の配列中の欠失の範
囲を示す。配列の上方の番号はアミノ酸を示し、下方の
番号はヌクレオチドを示す。

【図５】図５はλVII ２４６３のファクターVII ｃＤＮ
Ａ配列を示す。

【図６】図６はλVII ２４６３のファクターVII ｃＤＮ
Ａ配列を示す。

【図７】図７はλVII ２４６３のファクターVII ｃＤＮ
Ａ配列を示す。

【図８】図８は、幾つかの凝固因子のアミノ末端領域の
アミノ酸配列を示す。

【図９】図９は、蛋白質配列決定から得られたファクタ
ーVII のアミノ酸配列とｃＤＮＡによりコードされてい
るそれとの比較を示す。

【図１０】図１０はファクターIXリーダー配列とコンセ
ンサスカルシウム結合ドメインとの連結を示す。

【図１１】図１１はファクターIX−コンセンサス配列ハ
イブリドと部分的ファクターVIIｃＤＮＡとの連結によ
るイン−フレーム（in-frame）コード配列の形成を示
す。

【図１２】図１２はファクターIX／ファクターVII 融合
蛋白質をコードする配列を含有するプラスミドの造成を
示す。

【図１３】図１３は発現ベクターＦIX／VII ／ｐＤ２を
示す。使用されている記号は、Ａｄ２ ＭＬＰはアデノ
ウイルス２からの主要後期（major tate）プロモーター
であり；Ｌ１−３はアデノウイルス２トリパルタイト
(tripartite）リーダー配列であり；５′ｓｓは５′ス
プライス部位であり；３′ｓｓは３′スプライス部位で
あり；そしてｐＡはＳＶ４０からの後期ポリアデニレー
ションシグナルである。

【図１４】図１４はファクターIX／ファクターVII ｃＤ
ＮＡ融合体のヌクレオチド配列を示す。

【図１５】図１５はファクターIX／ファクターVII ｃＤ
ＮＡ融合体のヌクレオチド配列を示す。

【図１６】図１６はファクターIX／ファクターVII ｃＤ
ＮＡ融合体のヌクレオチド配列を示す。

【図１７】図１７はファクターIX／ファクターVII ｃＤ
ＮＡ融合体のヌクレオチド配列を示す。

【図１８】図１８は発現ベクターｐＭ７１３５を示す。
使用されている記号は、ＥはＳＶ４０エンハンサーであ
り；ｏｒｉはＯ−１マップユニットＡｄ５であり；ｐＡ
はＳＶ４０からの前記ポリアデニレーションシグナルで
あり；ΔはｐＢＲ３２２“毒性（poison）”配列の欠失
領域であり；そして他の記号は第６図に記載した通りで
ある。

【図１９】図１９は２４６３bpのファクターVII ｃＤＮ
Ａのサブクローニングを示す。

【図２０】図２０は５６５bpのファクターVII ｃＤＮＡ
のサブクローニングを示す。

【図２１】図２１はｐVII ５６５の５′末端とｐＵＣ１
８中のｐVII ２４６３の３′末端との連結によるｐVII
２３９７の形成を示す。

【図２２】図２２は発現プラスミドＦVII （２４６３）
／ｐＤＸ及びＦVII （５６５＋２４６３）／ｐＤＸの造
成を示す。ｐＡは、例９に示すように、前期又は後期方
向におけるＳＶ４３からのポリアデニレーションシグナ
ルを示す。他の記号は図１８について記載したのと同じ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャーロン ジェイ．バズビー アメリカ合衆国，ワシントン 98103, シアトル，メリディアン ノース，4109 (72)発明者 キャスリーン エル．バークナー アメリカ合衆国，ワシントン 98199, シアトル，トウェンティセカンド アベ ニュ ウエスト，3032 (72)発明者 マーガレット ワイ．インスレー アメリカ合衆国，ワシントン 98072, ウッディンビル，ノース イースト，ワ ンハンドレットフィフティース ストリ ート，16860 (72)発明者 リチャード ジー．ウッドベリー アメリカ合衆国，ワシントン 98155, シアトル，ノース イースト，テンス アベニュ，15464 (72)発明者 チャールズ エル．グレイ アメリカ合衆国，ワシントン 98115, シアトル，ノース イースト，フォーテ ィファースト アベニュ，8014

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ファクター VIIａにより介在される血液
   凝固のための生物学的活性を有する蛋白質の製造方法で
   あって、次のアミノ酸配列： Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu -60 -55 -50 Gln Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly -45 -40 -35 Glu Thr Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe -30 -25 -20 Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg -15 -10 -5 -1 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile 20 25 30 Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser 35 40 45 Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser 50 55 60 Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala 65 70 75 Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile 80 85 90 Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His 95 100 105 Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu 110 115 120 Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys 125 130 135 Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln 140 145 150 Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro 155 160 165 Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly 170 175 180 Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe 185 190 195 Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu 200 205 210 His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val 215 220 225 Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr 245 250 255 Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu 260 265 270 Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly 275 280 285 Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu 290 295 300 Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg 305 310 315 Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 320 325 330 Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly 335 340 345 Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 350 355 360 Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly 365 370 375 Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu 380 385 390 Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe 395 400 405 Pro を有するファクター VIIａと同一の又は実質的に同一の
   血液凝固のための生物学的活性を活性化後に有する蛋白
   質をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成
   物を含む哺乳類宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；
   該哺乳類宿主細胞により生産された、前記ＤＮＡ造成物
   によりコードされている蛋白質生成物を単離し；そし
   て、 該蛋白質生成物を活性化して、ファクター VIIａと同一
   の又は実質的に同一の血液凝固のための生物学的活性を
   有する蛋白質を生じさせる；ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 前記宿主細胞にジヒドロフォレートレダ
   クターゼをコードする遺伝子を同時にトランスフェクト
   し、前記適当な培地にメトトレキセートを含有せしめる
   ことにより前記ＤＮＡ造成物を増幅することを含む請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記蛋白質生成物を、ファクター XII
   ａ、ファクターIXａ、カリクレイン、ファクターＸａ、
   及びトロンビンから成る群から選ばれた蛋白質分解酵素
   と反応せしめることにより該蛋白質生成物を活性化する
   請求項１に記載の方法。