JPH0824587B2 - フアクタ−▲ｖｉｉ▼をコ−ドするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は一般に血液凝固因子に関し、そしてさらに
詳しくは血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質
の発現に関する。

〔従来の技術〕

血液凝固は、最終的にフィブリンクロットを生じさせ
る種々の血液成分又は因子の複雑な相互作用から成る過
程である。一般に、凝固“カスケード”と称される現象
に関与する血液成分は酵素的に不活性な蛋白質たるプロ
エンザイム（proenzyme）又はザイモゲン（zymogen）で
あり、この蛋白質は、それ自体活性化された凝固因子で
あるアクチベーターの作用により蛋白質分解酵素に転換
される。このような転換を経験した凝固因子は一般に
“活性化された因子”と称され、そして小文字の後付加
記号“a"によって示される（例えばVIIa）。

血液の凝固を助長しそしてそれによって正常な止血に
関与する２つの別個の系が存在する。これらの系はイン
トリンシック（intrinsic）凝固経路及びエキストリン
シック（sxtrinsic）凝固経路と称されている。イント
リンシック経路は血漿中にのみ存在する因子の利用を介
してトロンビン形成を導く反応を意味する。イントリン
シック経路における中間的現象としてファクターXIa及
びカルシウムイオンにより触媒される反応であるファク
ターIXのファクターIXaへの活性化がある。次に、ファ
クターIXaは、ファクターVIIIa、リン脂資及びカルシウ
ムイオンの存在下でファクターＸの活性化に関与する。
エキストリンシック経路は血漿因子、及び組織抽出物中
に存在する成分を用いる。前に言及したプロエンザイム
の１つであるファクターVIIは、そのファクターVIIaへ
の活性化の後に、組織因子及びカルシウムイオンの存在
下でファクターＸをXaに転換することにより、血液凝固
のエキシトリンシック経路に関与する。ファクターXaは
今度はファクターVa、カルシウムイオン及びリン脂資の
存在下でプロスロンビンをスロンビンに転換する。ファ
クターＸのファクターXaへの転換はイントリンシック経
路及びエキシトリンシック経路の両者に共通の現象であ
るから、ファクターVIIIが不足しているか又はファクタ
ーVIIIの阻害物質を有する患者の治療のためにファクタ
ーVIIaを使用することができる（Thomas,米国特許No.4,
382,083）。さらに、ファクターVIIaはファクターIXの
活性化において役割を演ずることによりイントリンシッ
ク経路に関与することを示唆する証拠が存在する（Zur
及びNemerson,J.Biol.Chem. 253:2203−2209,1978）。

実験的分析により、ヒト−ファクターVIIが約50,000
ダルトンの分子量を有する単鎖糖蛋白質であることが明
らかにされている。この形態において、この因子は不活
性ザイモゲン（zymogen）として血液中を循環する。フ
ァクターVIIのファクターVIIaへの活性化は幾つかの異
る血漿プロテアーゼ、例えばファクターVIIaにより触媒
される。ファクターVIIの活性化により２個のポリペプ
チド鎖が形成され、これらは少なくとも１個のジスルフ
ィド結合により一体化されたヘビー鎖（Mr＝28,000）と
ライト鎖（Mr＝17,000）とから成る。ファクターVIIは
また、例えばThomas,米国特許No.4,456,591により開示
された方法によりイン−ビトロでVIIaに活性化される。

ファクターIXは分子量57,000の単鎖前駆体として血液
中を循環し、そしてファクターVIIIの存在下でファクタ
ーXIaにより開裂された後活性なセリンプロテアーゼ
（ファクターIXa）に転換される。ファクターIXaはそれ
ぞれ16,000及び29,000の分子量を有するライト鎖及びヘ
ビー鎖から成る。

凝固異状（例えばファクターVIII及びIXの不足）を有
する患者に対する最近の治療の実際は、富化されたレベ
ルの特定の因子を含有するヒト血漿の冷却沈澱物（cryo
precpitate）又は他の画分による置換療法（replacemen
t theraph）を用いる。これらの調製物は従来プールさ
れたヒト血漿から得られていた。冷却沈澱物を調製する
には出発材料として比較的多量のヒト血漿を使用する必
要がある。

ファクターVIIの療法的使用は、ファクターVIIの不足
を示す個体、並びにファクターVIII及びファクターIXが
不足している個体群、及びVonWillebrand病を有する固
体の治療においてなされる。置換療法においてファクタ
ーVIII及びIXを投与された個体はこれらの蛋白質に対す
る抗体をしばしば生じさせる。これらの抗体の存在のた
めに連続治療は非常に困難である。この問題を経験する
患者は通常、ファクターVIIaを含む活性凝固酵素及び不
活性凝固酵素の混合物から成ることが知られている活性
化されたプロスロンビン複合体により治療される。さら
に、最近の研究により、少量（40〜50μｇ）の注射され
たファクターVIIaが、その血液中に高レベルの抗体を有
するファクターVIII不足の患者における重症の進行する
出血を抑制するために有効であることが示されている
（Hedner及びKisiel,J.Clin.Invest. 71:1836−1841,198
3）。

冷却沈澱物の調製に使用される血漿の入手源が多様で
あるため、調製物を試験してそれらがウイルス汚染を含
まないことを保証することは困難である。例えば、冷却
沈澱物を投与されたほとんどすべての者が肝炎試験にお
いて陽性を示す。さらに、最近の報告によれば、冷却沈
澱物を投与された血友病患者において後天性免疫不全症
候群（AIDS）が生じた。さらに、これらのファクターを
多量に精製することは非常に困難であり、そして高価で
ある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、ファクターVIIa及びファクターIXの純粋な調
製物を比較的多量に製造するための方法が必要である。
この発明はこのような必要を満たし、ウイルス感染の問
題を好結果に除去し、そして同時に、ファクターVIII及
びファクターIXが不足している患者並びにVon Willebra
nd病の個体を治療するための活性なファクターVIIaの一
貫した且つ均質な入手源を提供し、そしてさらに置換療
法において使用するための精製されたファクターIX源を
提供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

要約すれば、この発明は少なくとも部分的にファクタ
ーVIIをコードするヌクレオチド配列を含有するDNA造成
物を開示する。このヌクレオチド配列はカルシウム結合
ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列及び該第１
ヌクレオチド配列の下流に位置しこれと連結されている
第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌクレオ
チド配列はファクターVIIaのセリンプロテアーゼ活性の
ための触媒ドメインをコードする。これらの連結された
配列は、活性化後にファクターVIIaと実質上同一の血液
凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコードす
る。第１ヌクレオチド配列は、実質的に、ファクターVI
I、ファクターIX、ファクターＸ、プロテインＣ、プロ
スロンビン又はプロテインＳをコードする遺伝子のそれ
である。さらに、第１ヌクレオチドは前記遺伝子のそれ
ぞれに対応するリーダーペプチドをもコードしていても
よい。

特に、第１ヌクレオチド配列はファクターVIIのゲノ
ムクローン又はcDNAクローンに由来することができ、そ
してファクターVIIのリーダーペプチド及びアミノ末端
部分をコードすることができる。第１ヌクレオチド配列
はさらに２本鎖オリゴヌクレオチドを含有することがで
きる。特に好ましい第１ヌクレオチド配列はファクター
IXのリーダーペプチド及びアミノ末端部分をコードする
それである。

さらに、この発明は哺乳類宿主細胞DNA中に取り込ま
れ得るプラスミドを開示する。これらのプラスミドの１
つはプロモーター、その下流に続く１組のRNAスプライ
ス部位、及びその下流に続く、少なくとも部分的にファ
クターVIIをコードするヌクレオチド配列を含有する。
このヌクレオチド配列はカルシウム結合ドメインをコー
ドする第１ヌクレオチド配列、及び該第１ヌクレオチド
配列の下流に位置しそれに連結されている第２ヌクレオ
チド配列を含んで成る。この第２ヌクレオチド配列はフ
ァクターVIIaのセリンプロテアーゼ活性のための触媒ド
メインをコードする。これらの連結された配列は、活性
化後にファクターVIIaと実質的に同一の血液凝固のため
の生物学的活性を有する蛋白質をコードする。このヌク
レオチド配列の下流にポリアデニレーションシグナルが
続く。

上記の組換プラスミドと同様に、この発明はさらに、
プロモーター、その下流に続く１組のRNAスプライス部
位、及びその下流に続く、少なくとも部分的にファクタ
ーIXをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラス
ミドを開示する。このヌクレオチド配列はカルシウム結
合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列、及び該
第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれに連結されて
いる第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌク
レオチド配列はファクターIXのセリンプロテアーゼ活性
のための触媒ドメインをコードする。これらの連結され
た配列はファクターIXと実質上同一の血液凝固のための
生物学的活性を有する蛋白質をコードする。このヌクレ
オチド配列の下流にはポリアデニレーションシグナルが
続く。

この発明は第３の観点において、活性化後にファクタ
ーVIIaと実質上同一の生物学的活性を有する蛋白質を生
産するために安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞
を開示する。細胞が少なくとも部分的にファクターVII
をコードするヌクレオチド配列を含有するDNA造成物に
よってトランスフェクトされる。このヌクレオチド配列
はカルシウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオチ
ド配列、及び該第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそ
れに連結されている第２ヌクレオチド配列を含んで成
る。この第２ヌクレオチド配列はファクターVIIaのセリ
ンプロテアーゼ活性のための触媒ドメインをコードす
る。これらの連結された配列はファクターVIIaと実質上
同一の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を
コードする。

この発明は他の観点において、ファクターIXと実質的
に同一の生物学的活性を有する蛋白質を生産するために
安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞を開示する。
細胞が少なくとも部分的にファクターIXをコードするヌ
クレオチド配列を含有するDNA造成物によってトランス
フェクトされる。このヌクレオチド配列はカルシウム結
合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列、及び該
第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれと連結されて
いる第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌク
レオチド配列はファクターIXのセリンプロテアーゼ活性
のための触媒ドメインをコードする。これらの連結され
た配列はファクターIXと実質的に同一の血液凝固のため
の生物学的活性を有する蛋白質をコードする。

この発明はさらに、少なくとも部分的にファクターVI
Iをコードするヌクレオチド配列を含有するDNA造成物を
含む哺乳類細胞を樹立することによって、ファクターVI
Iaにより中介される血液凝固のための生物学的活性を有
する蛋白質の製造方法を提供する。このヌクレオチド配
列はカルシウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオ
チド配列、及び該第１配列の下流に位置しそれに連結さ
れた第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌク
レオチド配列はファクターVIIaのセリンプロテアーゼ活
性のための触媒ドメインをコードする。これらの連結さ
れた配列は、活性化後にファクターVIIaと実質的に同一
の生物学的活性を有する蛋白質をコードする。次に、こ
の哺乳類細胞を適当な培地中で増殖せしめ、そして該DN
A造成物によりコードされており且つ該哺乳動物細胞に
より生産された蛋白質生成物を単離する。次にこの蛋白
質生成物を活性化してファクターVIIaを生じさせる。

この発明は他の観点において、ファクターIXにより中
介される血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質
の製造方法を開示する。この方法は、少なくとも部分的
にファクターIXをコードするヌクレオチド配列を含有す
るDNA造成物を含む哺乳類宿主細胞を樹立することを含
んで成る。このヌクレオチド配列はカルシウム結合ドメ
インをコードする第１ヌクレオチド配列、及び該第１ヌ
クレオチド配列の下流に位置しそれに連結されている第
２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌクレオチ
ド配列はファクターIXのためのセリンプロテアーゼ活性
のための触媒ドメインをコードする。これらの連結され
た配列はファクターIXと実質的に同一の血液凝固のため
の生物学的活性を有する蛋白質をコードする。次に、こ
の哺乳類宿主細胞を適当な培地中に増殖せしめ、そして
該宿主細胞によりコードされた蛋白質生成物を単離す
る。上記の方法により製造される蛋白質も開示される。

この発明の他の観点において、ファクターVIIをコー
ドするDNA配列を含んで成るDNA造成物を開示する。好ま
しい態様においては、このDNA配列は第1B図中の第36塩
基対から第1433塩基対までのcDNA配列を含んで成る。他
の好ましい態様においては、DNA配列は第2B図中の第36
塩基対から第99塩基対まで、及びその下流に続く第166
塩基対から第1433塩基剤までのcDNA配列を含んで成る。
すぐ上に記載したDNA配列を含んで成り、哺乳類宿主細
胞DNA中に組込まれ得る組換プラスミドもまた開示され
る。

ファクターVIIをコードするDNA配列を含んで成る組換
体プラスミドにより安定にトランスフェクトされた哺乳
類細胞もまた開示される。好ましい態様においては、こ
のDNA配列は第1B図中の第36塩基対から第1433塩基対ま
でのcDNA配列、又は第1B図中の第33塩基対から第99塩基
対まで及びその下流に続く第166塩基対から第1433塩基
対までのcDNA配列を含んで成る。

上記のDNA造成物を含有する哺乳類宿主細胞を樹立す
ることによって、ファクターVIIaにより中介される血液
凝固のための生物学的活性を有する蛋白質の製造方法も
また開示される。次に、哺乳類宿主細胞を適当な培地中
で増殖せしめ、そしてDNA造成物によりコードされてい
る蛋白質生成物を単離する。次に、この蛋白質生成物を
活性化してファクターVIIaを生じさせる。

この発明の他の観点は、以下の詳細な説明及び添付図
面により明らかになるであろう。

〔具体的な説明〕

この発明を記載する前に、以下に使用する幾つかの用
語の定義を記載するのが発明の理解の助けとなろう。

相補的DNA又はcDNA:mRNA鋳型中に存在する配列から酵素
的に合成されたDNA分子又は配列である。

DNA造成物:1本鎖又は２本鎖のDNA分子又はこのような分
子のクローンであって、天然の遺伝子から単離すること
ができるもの、又は天然には存在しない態様で組合わさ
れそして並置されるDNAのセグメントを含むように変形
されているものである。

プラスミド又はベクター：宿主細胞に挿入された場合に
複製することができ、遺伝情報を含有するDNA造成物で
ある。プラスミドは一般に、宿主細胞中で発現されるべ
き少なくとも１個の遺伝子配列、並びにプロモーター及
び転写開始部位を包含する、前記の遺伝子の発現を促進
する配列を含有する。これは線状分子であっても閉環さ
れた分子であってもよい。

連結:1つの配列の５′及び３′末端が隣接する配列のそ
れぞれ３′及び５′末端にホスホジエステル結合によっ
て付着されることを“連結される”と称する。連結は、
平滑末端又は接着末端のリガーゼ連結のごとき方法によ
り、cDNAクローニングによる連結された配列の合成によ
り、又は指令された変異誘発（directed mutagenesis）
の方法により介在配列の除去により達成することができ
る。

リーダーペプチド：幾つかの蛋白質のアミノ末端に存在
しそしてプロセシング及び分布の間に該蛋白質から一般
に切断されるアミノ酸配列である。リーダーペプチドは
その蛋白質を細胞の分泌経路に向ける配列を含んで成
る。この明細書において使用する場合、“リーダーペプ
チド”なる語はさらに天然のリーダーペプチドの部分を
も意味する。

ドメイン：その蛋白質のある生物学的活性のために必要
な構造要素の全部又は部分を含有する蛋白質中の特定の
複数のアミノ酸の３次元的自己集成的整列である。

生物学的活性：生物学的背景において（すなわち生物体
中で又はイン−ビトロの模倣において）分子によって達
成される１つの機能又は１組の機能である。蛋白質の生
物学的活性は触媒活性とエファクター活性とに分けるこ
とができる。凝固因子の触媒活性は一般に前駆体の特異
的開裂による他の因子の活性化を含む。エファクター活
性は、生物学的に活性な分子のカルシウムもしくは他の
小分子への、蛋白質のごとき巨大分子への、又は細胞へ
の特異的結合を含む。エファクター活性は生理的条件下
での触媒活性をしばしば増強し、又は触媒活性のために
必須である。触媒活性及びエファクター活性は幾つかの
場合には蛋白質の同一のドメイン内に存在する。

ファクターVIIaについて、生物学的活性はエキシトリ
ンシック経路による血液凝固の仲介によって特徴付けら
れるファクターVIIaはファクターＸをファクターXaに活
性化し、このファクターXaは今度はプロスロンビンをス
ロンビンに転換し、これによってフィブリンクロットの
形成が開始される。ファクターＸの活性化は血液凝固の
イントリンシック経路及びエキシトリンシック経路に共
通であるので、ファクターVIIaはファクターIX、ファク
ターVIII又はVon Willebrandファクターが不足している
重症の個体の治療のために使用することができる。

ファクターIXの生物学的活性はイントリンシック経路
による血液凝固の仲介により特徴付けられる。ファクタ
ーIXはファクターXIaによりファクターIXaに活性化され
る。次に、ファクターIXaは、ファクターVIIIa、リン脂
質及びカルシウムイオンの存在下でファクターＸをファ
クターXaに活性化する。次に、ファクターXaはプロスロ
ンビンのスロンビンへの転換において機能し、フィブリ
ンクロットの形成が開始される。

上記のように、ヒト血漿からのファクターVIIの単離
は長時間を要し且つ高価な工程である。なぜならこのフ
ァクターは血液１中に約300μｇの濃度で存在するに
過ぎない希少蛋白質だからである。さらに、スロンビ
ン、ファクターIX及びファクターＸから分離することが
困難であり、そして精製中の蛋白質分解的攻撃に対して
感受性である（Kisiel及びMcMullen,前掲）。単鎖ヒト
ファクターVIIは均一に精製されているが（Kisiel及びM
cMullen,前掲）、公表された精製方法は一般に低収量及
び／又は他の凝固因子による汚染により限定される。

ファクターVII及びIXは肝臓により生産され、そして
その生合成のためにビタミンＫを必要とする。ビタミン
Ｋはこれらのファクター中の特定のγ−カルボキシグル
タミン酸残基の形成のために必要である。これらの異状
なアミノ酸残基は翻訳後の変形によって形成され、カル
シウムイオンに結合し、そしてこの蛋白質とリン脂質小
胞との相互作用を担当する。さらに、ファクターVII及
びファクターIXはそれぞれ１個のβ−ヒドロキシアスパ
ラギン酸残基を含有し、この残基も蛋白質が翻訳された
後に形成される。しかしながら、このアミノ酸残基の役
割は知られていない。

ファクターVII及びファクターIXの活性が特定のグル
タミン酸残基のγ−カルボキシル化を含む翻訳後変化に
依存し、そして又特定のアスパラギン酸残基のヒドロキ
シル化に依存するであろうという事実を仮定すれば、微
生物中でのファクターVII及びIXのクローニング及び発
現によって活性な生成物を製造することはできそうにな
い。

従ってこの発明は、安定にトランスフェクトされた哺
乳類細胞を用いてファクターVIIaにより仲介される血液
凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を製造する方
法を提供する。さらに、この発明はまた、ファクターIX
により仲介される血液凝固のための生物学的活性を有す
る蛋白質を製造する方法を提供する。

前記のごとく、ファクターVII及びIXはその生合成の
ためにビタミンＫを必要とする。さらに、血漿蛋白質で
あるプロスロンビン、ファクターＸ、プロテインＣ、及
びプロテインＳもそれらの生合成のためにビタミンＫを
必要とする。γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有す
るこれらの蛋白質のアミノ末端部分は、アミノ酸配列及
び生物学的機能の両者において類似している（第2A図を
参照のこと）。さらに、ファクターVII、プロスロンビ
ン、ファクターIX、ファクターＸ、及びプロテインＣの
カルボキシ末端部分はそれらの特異的なセリンプロテア
ーゼ機能を決定する。

ファクターVIIは微量血漿蛋白質であり、そしてファ
クターVIIをコードするmRNAは希少であると信じられ
る。従って、広範囲の配列分析及び特徴付けを可能にす
るのに十分な量で血漿からファクターVIIを精製するこ
とは困難なままである。プロテアーゼ阻害剤の存在下に
おいてさえ精製中のファクターVIIが分解されることがK
isiel及びMcMullen（前掲）により観察された。これら
の困難性のため、ファクターVIIは血液凝固系の他の一
層豊富な成分に比べて十分に特徴付けられていない。事
実、Kisiel及びMcMullen（前掲）の研究はファクターVI
Iの各鎖のわずか10残基について配列情報をもたらし、
そして各配列において２つの残基の同定は仮定的であっ
た。ウシ−ファクターVIIについての部分的アミノ酸配
列データも公表されている（DiScipio等，前掲）。

ファクターVIImRNAの予想される希少さがファクターV
II遺伝子の知識の欠除に寄与していた。常用のcDNAクロ
ーニング技法の成功は鋳型として使用するための十分な
量のmRNAに依存する。逆転写の早すぎる停止は５′末端
を欠くcDNAクローンの形成をもたらし、そしてこの状態
は低いmRNAレベルによって悪化する。豊富でないメッセ
ンジャーRNAのcDNAクローニングのための幾つかの方策
が開発されている（Maniatis等，Molecular Cloning:A
Laboratory Manual，コールルドスプリングハーバーラ
ボラトリー,1982）が、しかしながら注目の生成物のア
ミノ酸配列についての知識の欠如がDNA配列を予想しそ
して適当なオリゴヌクレオチドプローブを設計すること
を困難にしている。これらの改良された方法を用いて僅
少な蛋白質をコードする遺伝子の部分的cDNAクローンを
得ることは比較的簡単であるが、ファクターVIIのごと
き僅少な蛋白質をコードする遺伝子の十分な長さのcDNA
クローンを得ることは依然として困難である。

ファクターVIIに比べて、ファクターIXは比較的豊富
な蛋白質であり、そしてヒト−ファクターIX遺伝子のcD
NAクローンの配列は知られている（Kurachi及びDavie,P
roc.Nati.Acad.Sci.USA，79:6461−6464,1982;及びAnso
n等，EMBo J.,3:1053−1060,1984）。ファクターIX遺伝
子の構造は特徴付けられており、そしてこの蛋白質のア
ミノ酸配列は既知のアミノ酸配列に基いて決定されてい
る。ヒト及びウシのファクターIXについての幾つかの蛋
白質配列データも公表されており、そして配列が分析さ
れている（DiScipio等，前掲）。この蛋白質のアミノ末
端部分は12個のグルタミン酸残基を含有し、これらは成
熟蛋白質中ではγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）残
基に転換されている。ファクターIXの活性化に関与する
開裂部位も同定されている（Kurachi及びDavie,前
掲）。ファクターIXcDNAクローンの５′末端における配
列は、ほとんどの分泌される蛋白質中に見出されるシグ
ナル配列に典型的なシグナル配列をコードしている（Ku
rachi及びDavie,前掲）。組換DNA法によるファクターIX
遺伝子の発現は今まで報告されていない。

ファクターVII遺伝子の十分な長さのcDNAクローンを
得ることが困難であるため、リーダーペプチドをコード
する領域を含むコード配列の５′末端を提供するために
３種類の新しいアプローチを用いた。第１の方法によれ
ば、ファクターVIIのための部分的cDNAクローンをファ
クターIXのリーダーペプチド及び５′部分をコードする
断片に連結する。このアプローチは、これら２つの分子
のアミノ末端部分はそれぞれの蛋白質のカルシウム結合
活性を担当しているという観察、及びファクターIXのカ
ルシウム結合活性をファクターVIIのそれのために置換
することができるという発見に基礎を置いている。凝固
因子の特異的セリンプロテアーゼ活性は分子のカルボキ
シ末端領域に存在するため、得られるポリペプチドは真
正なファクターVIIの生物学的活性を保持している。第
２のアプローチは、部分的cDNAクローンと、ファクター
VIIのリーダー領域及びアミノ末端領域をコードするDNA
配列とを組合わせる。この明細書に開示するファクター
VIIの部分的cDNA配列及びアミノ酸配列は、ファクターV
II遺伝子の５′部分を含んで成るクローンのcDNAライブ
ラリー又はゲノム性DNAライブラリーのスクリーニング
を可能にする。第３のアプローチは、部分的cDNAクロー
ンと、ファクターIXのリーダーペプチドをコードするcD
NA断片及びコンセンサス（consensus）カルシウム結合
部位又はファクターVIIの予想されるアミノ末端配列を
含んで成るハイブリドコード配列との連結を用いる。フ
ァクターVIIのアミノ末端のためのコード配列は、この
明細書に開示される今まで公表されていないアミノ酸配
列データにより確立された。コンセンサンス配列は、フ
ァクターVIIのデータ、及び他のビタミンＫ−依存性血
漿蛋白質について公表されている配列データから導かれ
る。

ファクターVII遺伝子の５′部分を含んで成るクロー
ンのスクリーニングについて上に記載したアプローチに
従って、本発明者等は発現のために適当な十分な長さの
正しいcDNAを得ることに成功した。

生じたcDNAクローンの内、“λVII2463"と称するクロ
ーンが最も長いファクターVIIcDNA挿入部を含有してい
た。このものはファクターVIIの完全なコード配列を含
有していることが見出された。このクローンは35ヌクレ
オチドの５′非翻訳領域、60アミノ酸のリーダーをコー
ドする180ヌクレオチド、406アミノ酸の成熟蛋白質をコ
ードする1218ヌクレオチド、終止コドン、1026ヌクレオ
チドの３′非翻訳配列、及び20塩基のポリ（Ａ）テイル
（2463位から始まる）を含有していた。このcDNAは両鎖
について完全に配列決定された。これと、クローンλVI
I2115及びλVIII923から初期に単離されたcDNA挿入部と
の比較により、λVII2463は１個のEcoRI断片上に、ファ
クターVIIリーダー及び成熟蛋白質配列をコードするフ
ァクターVIIcDNAを含有することが明らかになった。

第２のクローンλVII565を単離した。このクローン
は、ヌクレオチド100−165（第1B図）が欠けている点を
除きクローンλVII2463のヌクレオチド９からヌクレオ
チド638までのcDNAと同じcDNA挿入部を含んでいた。cDN
AとファクターVIIゲノム性DNAとの比較において、存在
しない配列は１個のエクソン様領域に正確に対応した。
従って、択一的mRNAスプライシング現象を反映した２個
のファクターVIIcDNAが得られた。

λVII2463によりコードされるリーダーは非常に長く
（60アミノ酸）、そしてファクターIX、プロテインＣ及
びプロスロンビンと比較した場合、非常に異る疎水性プ
ロフィールを有する。このリーダーは−60位及び−26位
に２個のメチオニンを含有する。翻訳開始は−60位から
始まると考えられる。なぜなら、シグナルペプチドに特
徴的な疎水性領域は−26位に続くのではなく−60位に続
くからである。ゲノムクローン中のエクソン様領域に正
確に対応する。λVII565中に存在しない配列はファクタ
ーIX、プロテインＣ及びプロスロンビンに一層類似する
疎水性パターンを有する38アミノ酸のリーダーをもたら
すことは興味深いことである。

前記のリーダーのいずれが（もしいずれかだとすれ
ば）真正であるか明らかでないため、追加のアプローチ
において５′末端配列を分析する様に努力した。要約す
れば、このアプローチは、ヒトゲノムDNAライブラリー
の造成及びスクリーニング、並びにファクターVII遺伝
子配列を含んで成るゲノムクローンの同定を含む。次
に、ゲノム配列の５′領域をcDNAに連結して十分な長さ
のクローンを造成した。

追加の造成において、リーダーのすべて及び成熟コー
ド配列の29アミノ酸を含有するλVII565の５′ファクタ
ーVIIcDNA断片を、λVII2463のcDNAの断片（成熟蛋白質
の残部及び３′非翻訳配列を含有する）に連結した。こ
の“565−2463"配列は十分な長さのファクターVIIcDNA
配列を単一EcoRI断片として含有する。

次に、上記のDNA配列を適当な発現ベクターに挿入
し、今度はこのベクターを用いて哺乳類セルラインをト
ランスフェクトした。この発明の実施において使用する
ための発現ベクターはトランスフェクトされた哺乳類細
胞中で外来性遺伝子の転写を指令することができるプロ
モーターを含んで成るであろう。ウイルス性プロモータ
ーが、転写を指令するそれらの効率のために好ましい。
特に好ましいこのようなプロモーターはアデノウイルス
２からの主要後期（majlor late）プロモーターであ
る。このような発現ベクターはさらに、プロモーターか
ら下流であり、且つ血液凝固のための生物学的活性を有
する蛋白質をコードする遺伝子の挿入部位から上流に位
置する１組の複数のRNAスプライス部位を含有するであ
ろう。好ましいRNAスプライス部位配列はアデノウイル
ス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得られるであろ
う。さらに、発現ベクター中には前記挿入部位の下流に
位置するポリアデニレーションシグナルを含有する。ウ
イルス性ポリアデニレーションシグナル、例えばS_V40か
らの初期もしくは後期ポリアデニレーションシグナル、
又はアデノウイルス5:EIb領域からのポリアデニレーシ
ョンシグナルが好ましい。特定の好ましい態様において
は、発現ベクターはさらに、プロモーターとRNAスプラ
イス部位との間に位置するウイルスリーダー配列、例え
ばアデノウイルス２トリパルタイトリーダーを含有す
る。好ましいベクターはさらに、エンハンサー配列、例
えばSV40エンハンサーを含有することができる。

次に、クローン化されたDNA配列を、リン酸カルシウ
ム介在トランスフェクションにより、培養された哺乳動
物細胞に導入する。（Wigler等，Cell，14:725,1978:Co
rsaro及びPearson,Somatic Cell Genetics，7:603,198
1;Graham及びVan der Eb,Virology，52,456,1973。）DN
A及びリン酸カルシウムの沈澱を生成せしめ、そしてこ
の沈殿を細胞に適用する。細胞の一部がDNAを取り込
み、そしてそれを数日間細胞内に保持する。細胞の小画
分（典型的には10^-4）がDNAをゲノムに安定に取り込
む。これらの安定な取り込みを同定するため、一般に、
選択可能な表現型（選択マーカー）を付与する遺伝子を
目的遺伝子と共に導入する。好ましい選択マーカーには
薬剤例えばＧ−418及びメトトレキセートに対する耐性
を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは目的遺伝
子と同時に別個のプラスミドにより細胞に導入してもよ
く、又はこれらを同じプラスミドにより導入してもよ
い。好ましい選択マーカーは薬剤Ｇ−418に対する耐性
の遺伝子であり、これはプラスミドpKO−neo上に担持さ
れている（Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Genet.，1:32
7−341,1982）。細胞に導入される混合物に“キャリヤ
−DNA"として知られている追加のDNAを添加することも
有利である。細胞がDNAを取り込んだ後、これらを一定
期間、典型的には１〜２日間増殖せしめて、目的遺伝子
の発現を開始する。次に薬剤選択を適用して選択マーカ
ーが安定に発現している細胞の増殖について選択する。
これらの細胞のクローンを、目的蛋白質の発現について
スクリーニングする。

形質転換された細胞により生産されたファクターVII
及びファクターIXは、クエン酸バリウムへの吸着により
細胞培養培地から取り出す。スペント培地をクエン酸ナ
トリウム及び塩化バリウムと混合し、そして沈澱を集め
る。次に、沈澱した材料を該当する凝固因子の存在につ
いて測定する。免疫吸着によりさらに精製することがで
きる。免疫吸着カラムは高特異性モノクローナル抗体を
含んで成るのが好ましい。別の方法として、クエン酸バ
リウムにより沈澱した材料の精製は、一層一般に使用さ
れている生化学的方法により、又は高速液体クロマトグ
ラフィーにより行うことができる。

単鎖ファクターVIIの活性な２本鎖ファクターVIIaへ
の転換は、Hedner及びKisiel（J.Clin.Invest，71:1836
−1841,1983）により記載されているようにファクターV
IIaを使用して、又はトリプシン様特異性を有する他の
プロテアーゼ（Kisiel及びEujikawa,Behring Inst.Mit
t. 73:29−42,1983）により達成することができる。

要約すれば、この発明は形質転換された哺乳動物細胞
を用いてビタミンＫ依存性血液凝固因子の活性を有する
蛋白質を製造する方法を提供する。凝固因子の特定のセ
リンプロテアーゼドメインをコードする遺伝子配列はcD
NAライブラリーから単離される。リーダー配列及びカル
シウム結合ドメインをコードする配列はcDNAもしくはゲ
ノムライブラリーから単離され、又は合成されたオリゴ
ヌクレオチドから造成される。次に、これらの配列を適
当な発現ベクター中で連結して、血液凝固のための所望
の生物学的活性を有する蛋白質をコードするようにす
る。得られるベクター、及び薬剤耐性マーカーを含有す
るプラスミドを適切な哺乳類組織培養細胞に同時にトラ
ンスフェクトする。次に、トランスフェクトされた細胞
を適当な薬剤、例えばＧ−418を添加することにより選
択する。次に、蛋白質生成物を血液凝固アッセイにおけ
る生物学的活性について測定し、また真正なヒト凝固因
子に対して調製された抗体を用いて免疫学的交差反応性
について測定する。

次に記載する例を要約すれば、例１はファクターVII
の十分な長さのcDNA配列のクローニングを開示する。例
２は、アミノ酸末端の約30個のアミノ酸を含む、ヒト−
ファクタVIIの部分アミノ酸配列を開示する。例３はヒ
ト−ゲノムDNAライブラリーの造成及びスクリーニン
グ、並びにファクターVII遺伝子配列を含んで成るゲノ
ムクローンの同定を開示する。例４は、ファクターIXの
リーダーペプチドをコードするcDNA断片及びコンセンサ
スカルシウム結合ドメインをコードする合成２本鎖断片
をそれぞれが含有する２種類のハイブリドセグメントの
造成を開示する。次に、ハイブリド配列をファクターVI
Iの部分的cDNAクローンに連結する。次に、イン−ビト
ロ変異の誘発を用いて、コンセンサス配列をファクター
VIIの蛋白質配列データに一致するように変形した。例
５は、ファクターIXのカルシウム結合ドメイン及びファ
クターVIIの特異的セリンプロテアーゼドメインを含ん
で成る融合蛋白質をコードする遺伝子配列の造成を記載
する。第６図は、トランスフェクトされた哺乳類細胞中
で血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を発現
するのに使用するベクター_pD2の造成を記載する。例２
に記載する遺伝子融合体はこのベクターを用いて発現さ
れる。例７は、形質転換された哺乳類細胞系中でファク
ターIXの遺伝子を発現するためのベクター_pD2の使用を
記載する。例８は、ファクターVIIに融合したファクタ
ーIXのリーダー配列を含んで成る一次翻訳生成物をコー
ドするDNA配列を含有するベクター_pM7135の造成を記載
する。このベクターはトランスフェクトされた哺乳類細
胞系においてファクターVIIの活性を有する蛋白質を生
産するために使用することができる。例９はcDNA配列を
使用するファクターVIIの発現、及びゲノムDNA−cDNAハ
イブリド配列からのファクターVIIの発現を記載する。

次に例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

（例） 制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Be
thesda Research Laboratories;BRL）、及びニュー・イ
ングランド・バイオラブス（New England Biolabs）か
ら入手し、そして特にことわらない限り製造者の指示に
従って使用した。オリゴヌクレオチドはアプライド・バ
イオシステムス（Applied Biosystems）モデル380A DNA
合成機により合成し、そして変性ゲル上でのポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により精製した。

E.コリ（E.coli）の形質転換はManiatis等（Molecular
Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー,1982）により記載された方
法により行った。M13及び_pUCクローニングベクター、並
びに宿主株はBRLから入手した。ファクターVIIはKisiel
及びMcMullen（前掲）により記載された方法によりヒト
血漿から調製した。

例1.部分的ファクターVIIcDNAのクローニング A.ヒト−肝臓cDNAライブラリーの造成 Candra等、Proc.Natl.Acad.Sei.USA，80:1845−1848,
1983の方法により、ヒト−肝臓mRNAからcDNAライブラリ
ーを調製した。cDNA調製物をアルカリ性シュークロース
グラジエント（Monahan等，Biochemistry，15:223−23
3,1976）により沈降せしめ、そして約1000ヌクレオチド
以上のポリヌクレオチドを含有する画分をプールした。
第一鎖調製物を逆転写酵素を用いて２本鎖にし（Chandr
a等,1983）S1ヌクレアーゼで処理し、そして残留する接
着末端を４種類すべてのデオキシリボヌクレオチドトリ
ホスフェートの存在下でDNAポリメラーゼＩ（Klenow断
片）を用いてフィル−インした（Maniatis等，Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー,1982）。平滑末端化され
たcDNAをEcoRIメチラーゼで処理し、そしてT₄DNAリガー
ゼを用いてリン酸化された EcoRIリンカーに連結した（Maniatis等、前掲）。連結
されたDNA調製物をEcoRIにより十分に消化して過剰のリ
ンカー配列を除去しそして約1000塩基対より長い２本鎖
DNAを中性シュークロースグラジェント遠心により精製
した（Maniatis等，前掲）。天然λ_gt11DNAコンカテマ
ー（concatemer）に連結し、そしてEcoRIにより完全消
化し、そして５′末端のリン酸を細菌性アルカル性ホス
ファターゼ処理により除去した。プールされたヒト−肝
臓cDNAをファージDNAに連結し、イン−ビトロでパッケ
ージし（Maniatis等、前掲）、そしてこれを用いてE.コ
リY1088に感染させた（Young及びDavis,Science，222:7
78−782,1983）。このライブラリーにおいて約14×10⁶
個の一次ファージプラークが生じた。これは約２×10⁶
個ずつの７つのライブラリーから成る。これらの90％以
上がヒトDNA挿入部を含有する組換体であった。この結
論はβ−ガラクトシダーゼ活性の欠失、並びにEcoRIに
よる20個の無作動クローンの消化及びこれに続くアガロ
ースゲル電気泳動による特徴付けによるものである。フ
ァージ粒子の形のcDNAライブラリーを塩化セシウムグラ
ジエント遠心分離により精製し、そしてSM緩衝液（Mani
atis等，前掲）中に貯蔵した。

B.ヒト−肝臓cDNAライブラリーのファクターVIIクロー
ンについてのスクリーニング 前記のヒト−肝臓発現cDNAライブラリーを、精製され
たファクターVIIを用いてBrown等（J.Biol.Chem.,225:4
980−4983,1980）の方法により調製した。¹²⁵Ｉ−ラベ
ルされたモノクローナルファクターVII抗体を用いて特
異的抗原についてスクリーニングした（Young及びDavi
s,前掲）。６×10⁶個のファージプラークのスクリーニ
ングにより、抗体に対して陽性反応を与える１個の単離
体が同定された。これをλVII2115と称する。

このファージクローンλVII2112を、他の２種類の抗
−ファクターVIIモノクローナル抗体、及びファクターV
IIに対するラビットポリクローナル抗体に対して試験し
た。単離体λVII2115はこれらすべての抗−ファクターV
II抗体に対して陽性反応を示した。

λVII2115のプレート溶菌物（lysate）（Maniatis等,
65−66頁,1982）からDNAを調製した。このDNAをEcoRIで
消化することにより2139塩基対の挿入部が遊離した。こ
の挿入部をM13ファージベクター（Mesaing,Meth.in Enz
ymology，101,20−77,1983;及びNorrander等，Gene:101
−106,1983）にサブクローニングしてチエインターミネ
ーションジデオキシDNA配列決定（Sanger等，Pro. Natl.
Acad.Sci.USA，74:5463−5467,1977）を行った。このcD
NA挿入部は214位、839位、及び1205位にPstI部位を含有
し（これらを第14図において、それぞれPst Ia,Pst Ib
及びPst Icと称する）、そして611位に位置するSmaI部
位を含有する。次のM13鋳型を配列決定した。

１）全長（2139塩基）Eco RIa→Eco RIb断片,M13mp18中
（クローンF7−１と称する）； ２）Pst Ia→Eco RIa 214塩基断片， M13mp19中（F7−２）； ３）Pst Ia→Pst Ib 625塩基断片， M13mp18中（F7−３）； ４）Pst Ib→Pst Ia 625塩基断片， M13mp18中（F7−７）； ５）Sma I→Pst Ib 228塩基断片， M13mp10中（F7−８）； ６）Pst Ib→Pst Ic 366塩基断片， M13mp18中（F7−９）； ７）Pst Ic→Pst Ib 366塩基断片， M13mp18中（F7−10）； ８）Pst Ic→Eco RIb 930塩基断片， M13mp19中（F7−11）；及び ９）Eco RIb→Eco RIa全長断片， M13mp18中（F7−12）。

（制限部位の名称は第1A図に関する。） このデータは両鎖上の配列において91％のコード領域及
び15％の３′非翻訳領域を確認し、そして残りのコード
領域の９％及び非コード領域の85％について単鎖配列情
報をもたらした。

cDNA配列から予想されるアミノ酸配列と、Kisiel及び
McMullen（Thrombosis Research，22:375,1981の既知
のアミノ酸配列データ及び下記（例２）のアミノ酸配列
との比較により、DNA配列中400位の近傍の３個のヌクレ
オチドの不存在により説明することができる異状が示さ
れた。追加の配列データを得るため、λVII2115をEcoRI
で消化し、そしてファクターVIIコード断片を、EcoRIに
より消化された_pUC13（Vieira及びMessing,Gene，19,25
9−268,1982;及びMessing,前掲）に挿入した。_pUCVII21
15と称する得られる組換プラスミドを、328位で切断す
るXbalで消化した。消化されたサンプルを半分ずつに分
け、半分をα³²p dCTP及びDNAポリメラーゼＩ（Klenow
断片）によりラベルし（Englund,P.T.J.Mol.Bio.，66,2
09,1972）、他方の半分をγ³²P ATP及びポリヌクレオチ
ドキナーゼによりラベルした（Chaconas等，Biochem.Bi
ophys.Res.Comn.，66:962:1975）。次に、ラベルされた
プラスミドをPstIにより再切断して113塩基対及び509塩
基対の断片を得た。これらのそれぞれの断片の両鎖をMa
xam及びGilbert（Meth.in Enzymology，74:560,1980）
の方法により配列決定した。113塩基対はその全体にわ
たって配列決定し、そして509塩基対断片中の210塩基対
を配列決定した。これらの配列はDNA配列データを蛋白
質配列データと一致させる追加の３個の塩基（１個のＣ
及び２個のＧ）を示し、前記の異状な結果はＧ及びＣを
含む二次構造に基く配列決定ゲル上での圧縮により生じ
たことが示された。両鎖上のコード領域の最後の９％の
配列も確認された。

_pUCVII 2115の配列をさらに分析することにより、こ
のクローン化断片がファクターVIIの開裂部位にあるこ
とが知られている11アミノ酸の配列をコードしているこ
とが確認された（Kisiel及びMcMullen,Thrombosis Rese
arch，22:375,1981）。この配列とファクターIX（Davie
等，前掲）及びファクターＸ（Leytus等，Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA，81:3699−3702,1984）アミノ酸配列との比
較により、このクローンは成熟ファクターVII蛋白質の
アミノ酸36をコードするヌクレオチド（およそ）から始
まりおよそ1000のコードヌクレオチド及び1100の非コー
ドヌクレオチド並びにポリＡ配列まで続くファクターVI
Iの配列を含有することが示唆された。さらに、このク
ローンは３′コード領域にフレームシフト変異を有して
いた。

正しい３′コード領域を得るため、７つのλgt11cDNA
ライブラリーの1.4×10⁶個のクローンのすべてをプラー
クハイブリダイゼーションにより（Benton及びDavid,Sc
ience，196:180−181,1977）、λVII2115のニック−ト
ランスレートされたcDNAを用いてスクリーニングした
（Meniatis等,109−112頁,1982）。

次に、７個の陽性単離体を、cDNA挿入部がサブクロー
ニングされた_pUCプラスミドのジデオキシ配列決定法に
よりスクリーニングした（Wallace等，Gene，16,21,198
1）。λgtIIクローンをEcoRIで消化し、そしてファクタ
ーVII断片を、EcoRIで開裂された_pUC13に挿入した。こ
れらの１つを除くすべてがλVII2115中の挿入部の塩基2
12に対応する位置から出発し、１個の例外は３′非コー
ド領域のみから成ることが見出された。塩基212から始
まるクローンの１つを分析のために選択し、クローン_pU
C VII 1923と命名した。

_pUC VII 2115の分析により657位と815位の間にフレー
ムシフト変異が存在することが示されたため、_pUC VII
1923をまずこの領域においてMaxam−Gilbert配列決定法
により分析した。プラスミド_pUC VII 1923をNarI（第1A
図中779位）により消化した。切断されたDNAをDNAポリ
メラーゼＩ（Klenow断片）を用いてα³²P dCTPによりラ
ベルし、そして次にAva I（これは第1A図中Sma Iと同じ
部位を開裂せしめる）及びTaq I（1059部位）により消
化してNar I−Ava I 166bp断片、及び200bp Nar I−Taq
I断片を得た。これらのそれぞれを配列決定した。_pUC
VII 2115中で欠けているＣは697位に見出され、そして
やはり_pUC VII 2115中で欠けている他方のＣは798位に
見出された。

_pUC VII 1923のコード領域の配列の残りの部分が正し
いことが、_pUC VII 1923の全挿入部のM13サブクローン
上でのジデオキシ法による配列決定によって示された。
LacプライマーZC87（第１表）を用いて212位（第1A図）
から512位までの配列を決定し、プライマーZC218（CTCT
GCCTGCCGAAC）を用いて715位から1140位までの配列を決
定し、そしてプライマーZC217（ATGAGAAGCGCACGAAG）を
用いて720位から350位までを配列決定した。_pUC VII 21
15挿入部は13位から695位まで正しく（１〜12位は人工
的リンカーを含む）、そして_pUC VII 1923は212位から
最後まで正しいので、この２者を継ぎ合わせて13位（第
1A図）から最後まで正しい分子を得た。この継ぎ合わせ
のために用いられる便利な点は328位のXba I部位であ
る。継ぎ合わされた正しい分子を第1A図に示す。

十分な長さのファクターVIIクローンをcDNAクローニ
ングによって得ることは困難であったから、欠けている
コード配列、並びに必要なプロセシング及びシグナル配
列を得るために３つの方策を採用した。第１の方策はヒ
トゲノムDNAライブラリーから、又はcDNAライブラリー
の追加のスクリーニングにより必要な配列を得ることで
あった。第２のアプローチは、ファクターVIIのアミノ
酸配列データ（例２）及びビタミンＫ−依存性凝固因子
の公表されている配列（Kurachi及びDavie,前掲；及びD
avie等，前掲）に基いて必要な５′コード配列を合成
し、そしてこれをファクターIXのプレプロ配列の部分に
連結することであった。第３の方策はファクターVIIと
ファクターIXのアミノ末端の機能的類似性に基く。ファ
クターIXのリーダー及びアミノ末端部分のコード領域を
含んで成る配列を造成した。次にこれを部分的ファクタ
ーVIIcDNAに適切な方向に融合せしめた。

ファクターVIIの完全DNA配列を含んで成るDNA配列を
得るため、残りの５′DNA配列を単離することを試み
た。これは、λVII 2115のcDNA挿入部からの５′末端0.
3 kb EcoRI−Xba I断片を用いて２×10⁶ファージから成
るcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって
行った。Gubler及びHoffman（Gene 25:263−269,198
3）の方法を適用してHep G2細胞からのポリ（Ａ）mRNA
を用いてライブラリーを造成した。RNAを逆転写して第
１鎖cDNAを生成せしめ、次にDNAポリメラーゼＩ及びRN
アゼＨを用いて第２鎖の合成を行った。EcoRIメチル化
及びセファロース6Bカラムの通過の後、T₄DNAポリメラ
ーゼを用いてDNA末端を平滑化した。EcoRIリンカーを付
加し、そして過剰のリンカーをEcoRIによる消化及びセ
ファロースCL2B上でのクロマトグラフィーにより除去し
た。ポイドポリウム中のDNAを集め、そしてEcoRIで消化
されそしてウシ腸ホスファターゼで処理されたλgt 11
に連結した。このDNAをパッケージし、そしてE.コリY10
88中に感染させた。幾つかの陽性クローンが観察され、
そして次にEcoRI断片をM13ファージベクターにサブクロ
ーニングし、そしてM13ユニバーサルプライマー又はフ
ァクターVII特異的オリゴヌクレオチドを用いてジデオ
キシ配列決定を行った。

これらからファクターVIIのcDNAクローン３個を得、
そしてこれらの配列を完全に決定した。λVII 2463と称
するクローンからの、これらのcDNAの内最長のものはフ
ァクターVIIの完全なコード配列を含有することが見出
された。このクローンは、35ヌクレオチドの５′非翻訳
領域、60アミノ酸のリーダーをコードする180ヌクレオ
チド、406アミノ酸の成熟蛋白質をコードする1218ヌク
レオチド、終止コドン、３′非翻訳領域の1026ヌクレオ
チド、及び20塩基のポリ（Ａ）テイル（2463位から始ま
る）を含有していた。このcDNAを両鎖について完全に配
列決定した。これと、クローンλVII 2115及びλVII 19
23から前に単離した２つのcDNAとの比較により、クロー
ンλVII 2463はλ VII 2115中の挿入部の上流に追加の3
21個のヌクレオチドを含有し、そしてλ VII 1923中の
挿入部の上流に519ヌクレオチドを含有することが示さ
れた。λ VII 2463cDNA及びこれら２つのcDNAのファク
ターVII配列のオーバーラップが認められた。但し、λ
VII 2463のcDNAは、λ VII 2115のcDNA中に検出される1
005位及び1106位における単一塩基欠落を含まない。従
って、λ VII 2463は単一のEcoRI断片上にファクターVI
Iリーダー及び成熟蛋白質配列をコードするファクターV
IIcDNAを含有する。

追加のcDNAすなわちλ VII 565を単離した。そしてこ
れは５′末端ファクターVII配列を含有するが、しかし
コード配列内で切断されていることが観察された。その
５′末端はヌクレオチド９に位置する（第1B図）。

十分な長さのλ VII 2463と比較した場合、λ VII 56
5はリーダー配列内の１つのエクソン様領域に対応する
配列を欠くことが見出された。塩基100−165がλ VII 5
65には存在しない（第1B図）。この存在しない配列は、
ゲノム配列データ（例３中に記載されている）との比較
により、１つのエクソン様領域に正確に対応する。従っ
て、λ VII 565はリーダー配列中での択一的なスプライ
シンが現象の結果であろう。

λ VII 2463によりコードされるリーダーは非常に長
く（60アミノ酸）、そしてファクターIX、プロテインＣ
及びプロスロンビンと比較した場合非常に異る疎水性プ
ロフィールを有する。このリーダーは−60位及び−26位
に２個のMetを含有する。シグナルペプチドに典形質な
疎水性領域は−26位のMetではなく−60位のMetに続くの
で、第１のMetから開始されるようである。ゲノムクロ
ーン中のエクソン様領域に正確に対応する、λ VII 565
中の不存在領域が上記の蛋白質に一層類似した疎水性パ
ターンを有する38アミノ酸リーダーをもたらすことは興
味あることである。

例2.ヒト−ファクターVIIのアミノ酸配列 仮定的なcDNAクローンの同定を確認し、ファクターVI
IcDNAの配列を実証し、５′配列を含有するクローンに
ついてcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーをスク
リーニングするための特異的オリゴヌクレオチドプロー
ブの合成を可能にする情報を得、そしてファクターVII
のアミノ末端部分をコードする合成断片を造成するため
に、ヒト−ファクターVIIのアミノ酸配列を解明するこ
とが望ましい。Kisiel及びMeMullen（前掲）により限ら
れたアミノ酸配列が与えられたが、より多くの情報が必
要であった。

精製されたヒト−ファクターVIIa（Kisiel及びMcMull
en,前掲）を還元し、そしてCrestfield等，J.Biol.Che
m.，238,622,1963の方法によりカルボキシメチル化し
た。カルボキシメチル化されたファクターVIIaのライト
ポリペプチド鎖及びヘビーポリペプチド鎖を、ミクロパ
ックC18逆相カラム（バリアン社）上で高速液体クロマ
トグラフィー（HPLC）により分離した。この場合、蒸留
水中0.1％TFA（Ａ）、及びアセトニトリル中0.1％TFA
（Ｂ）を用いて、５分間に０〜40％のＢ、25分間に40〜
80％のＢ、及び５分間に80〜100％のＢから成るグラジ
エントにより溶出した。約300pmoleの各ペプチド鎖を、
ガス−フェーズ・プロテイン・シーケンサー（アプライ
ド・バイオシステム社）を用いて自動化されたエドマン
分解により分析した。ヘビーポリペプチド鎖及びライト
ポリペプチド鎖のアミノ末端において、それぞれ18残基
及び29残基が同定された。ファクターVIIaのヘビー鎖の
アミノ末端配列はcDNAクローン_pUC VII 2115により推定
されるそれ（第2B図）と一致した。アミノ酸配列は第2A
図及び第2B図中で１文字コードにより次のように示され
る。

Ａ アラニン Ｃ システイン Ｄ アスパラギン酸 Ｅ グルタミン酸 Ｆ フェニルアラニン Ｇ グリシン Ｈ ヒスチジン Ｉ イソロイシン Ｋ リジン Ｌ ロイシン Ｍ メチオニン Ｎ アスパラギン Ｐ プロリン Ｑ グルタミン Ｒ アルギニン Ｓ セリン Ｔ スレオニン Ｖ バリン Ｗ トリプトファン Ｙ チロシン Ｘ 未知残基 また、＊は、既知の凝固因子の構造との類似性及びこれ
らの位置における他のフェニルチオヒダントイン−アミ
ノ酸の不存在により、Gla残基（γ）が割当てられた。
配列間の最良の整列を与えるためにギャップ（−）が置
かれている。さらに、この精製は、５位及び９位のアミ
ノ酸がリジンであって、すでに報告されている（Kisiel
及びMcMullen,前掲）ように、それぞれスレオニン及び
アルギニンではないことを示した。ファクターVIIのア
ミノ末端領域に由来するファクターVIIaのライト鎖の配
列分析はcDNAクローン_pUC VII 2115の５′末端によりコ
ードされた構造とオーバラップするのに約６残基不足し
ていた。

追加の配列データを得るため、2nmoleのカルボキシメ
チル化されたライト鎖を0.1M炭酸水素アンモニウム中pH
7.8、37℃にて12時間、ウシ−キモトリプシン（1:100w/
w、酵素：基質）により消化した。生じた断片をミクロ
パックC18逆相カラム上でのHPLCにより精製した。前記
の溶剤を用い、５分間で０〜30％のＢ、25分間で30〜60
％のＢ、及び10分間で60〜80％のＢから成るグラジエン
トにより溶出した。ポリペプチドを、その220nm及び280
nmにおけるUV吸収により同定した。凍結乾燥されたペプ
チド（約1nmoleずつ）をエドマン分解により分析した。
その結果（第2B図）は、クローン_pUC VII 2115の対応領
域中のcDNA配列の多くを確認した。ファクターVIIaのラ
イト鎖ペプチドの152残基中合計113残基（75％）が同定
された。この配列は知られているcDNA構造によりコード
されるそれと同一である。間接的証明により、Asn 145
が炭水化物付加部位であることが示される。

例3.ゲノム性ファクターVII配列のクローニング cDNAに欠けている５′末端配列を得るための１つのア
プローチとして、ヒト胎児肝臓DNAを含むλファージラ
イブラリー（Lawn等，Cell，15:1157−1174）を、ニッ
クトランスレートされたファクターVIIcDNAによりスク
リーニングした。ゲノムライブラリーの一部をE.コリLE
392（ATCC 33572）上にプレートして合計7.2×10⁶個の
プラークを生じさせた（Maniatis等、前掲、320−321
頁）。ファージプラークをプレートからニトロセルロー
ス上に吸着せしめ、そしてBenton及びDavis（Science，
196:180,1977）の方法に従って、³²P−ラベルされたcDN
Aとハイブリダイズせしめた。８個のクローンを得、そ
してプラークを精製した。

ファクターVIIcDNA（λ VII 2115）の５′末端からの
DNA断片（EcoRIa−XbaI,第１図）及び標準的方法（Mani
atis等，前掲）を用いて、５′末端配列を含有するゲノ
ムクローンを同定した。これらのファージを7m1、7m2、
及び7m3と命名した。これらの組換体ファージからDNAを
調製し、そして予備的なエンドヌクレアーゼ地図を得
た。最も強いハイブリダイゼーションシグナルを与える
ファージ7m1を用いて一層広範囲制限地図を作成し、そ
してEcoRI−XbaI cDNA断片をサザンブロッティング（So
uthern,J. Mol.Biol.，98:503,1975）によりこの地図上
においた。

ファージ7m1がファクターVII蛋白質のアミノ末端アミ
ノ酸をコードするDNA配列を含有するか否かを決定する
ため、ファージDNA制限消化物のサザンブロットを、そ
の配列がファクターVIIアミノ末端アミノ酸配列から推
定されたオリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズ
せしめた。オリゴヌクレオチドZC188、ZC360、及びZC40
1（第１表）をT₄ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放
射性ラベルし、そしてそれらのT_m以下で数℃においてフ
ァージDNAブロットにハイブリダイズせしめた（Wallac
e,R.B.等，Nuc.Acids.Res.，6:3543−3557,1979）。こ
の分析の結果により、7m1の3.7kb Sst I断片がこれらの
オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含むこ
とが示された。このSst I断片をDNA配列分析のためM13
にサブクローン化した。配列決定用プライマーとしてZC
360を用いて得られた結果により、アミノ末端蛋白質配
列データに対応するおよそ60ヌクレオチドの長さの領域
が同定された。

ゲノムクローン7m1はエクソン２の上流の7kb配列を含
有することが知られたため、このクローンはファクター
VII5′非翻訳配列及び−17位のアミノ酸までのリーダー
配列を含有するものと予想された。ゲノムクローン7m1
内にエクソン１がコードされていることを確認するた
め、クローンλ VII 2463及びλ VII 566からのリーダ
ー配列情報を用いて下に示すオリゴヌクレオチドZC528
及びZC529を設計した。

ZC528 ⁵′TCA ACA GGC AGG GGC AGC ACT GCA GAG AT
T³′ ZC529 ⁵′TTC CAC GGC ATG TCC CGT GTT TCT CCT CC
T³′ これらを用いて7m1DNAをプローブし、そしてサブクロー
ン7SDが両オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ
とが見出された。エクソン１は２個のエクソン性配列、
すなわちZC528（λ VII 2463中ヌクレオチド１〜30に対
応する）にハイブリダイズするエクソン1a、及びZC528
（λ VII 2463中ヌクレオチド119〜148に対応する）に
ハイブリダイズするエクソン1bから成ることが決定され
た。エクソン1a及びエクソン1bの両者を挾むイントロン
配列が配列決定された。1aは該エクソンの３′末端にコ
ンセンサススプライスドナー配列を含み、そして1bは各
末端においてコンセンサススプライスアクセプター（1b
の上流）又はドナー（1bの下流）配列を含有する。ケノ
ムクローン7m1内のエクソン1aの位置は正確にマップさ
れたが、エクソン1bのそれは定義された領域内にマップ
された。エクソン1b配列はλ VII 2463中に存在し、他
方λ VII 565は1bエクソン配列をルーピングアウトして
エクソン1aとエクソン２との間でスプライスされたRNA
に由来するようである。

_pUC及びM13ベクター中の種々の7m1サブクローンを調
製して残りのエクソンの配列決定を促進した。エクソン
１〜７に対応する。cDNA配列から設計された適当なオリ
ゴヌクレオチドを用いて最終エクソン以外のすべてを配
列決定した。ゲノム配列はこれらの領域にわたる。cDNA
配列に正確に対応する。さらに、エクソン１〜７のイン
トロン／エクソン境界が決定され、そしてほとんどがク
ローン7m1内に正確に配置される。ファクターVII遺伝子
内のイントロンのサイズ及び位置を第２表に挙げる。

ファージ7m1はエクソン８を含むファクターVII3′末
端を欠くことが知られた。これらの配列を得るため、ヒ
ト皮膚一次線維芽細胞由来のλL47.1（Loenen及びBramm
er,Gene，10,249,1980;Maniatia等，前掲）中12〜13kb
が濃縮されたBam H1ライブラリーを２種類のニックトラ
ンスレートされたファクターVIIcDNA Pst I断片（エク
ソン７中の配列及び３′非翻訳配列に対応する）により
プローブした。両プローブにより7DC1と称するクローン
が検出された。これに続く制限エンドヌクレアーゼ分析
及びサザンブロット分析により、クローン7DC1はクロー
ン7m1とオーバラップし、そしてその末端の後に約3kb伸
びること、及びこのものはエクソン８を含むことが確立
された。エクソン８を含有する7DC1 DNAからの3.9kb（X
ba I−BamHI）断片をM13にサブクローニングし、そして
その５′及び３′末端に相補的なオリゴヌクレオチドを
用いて配列分析を行った。完全なエクソン配列がこのク
ローン中に存在する。

例4.合成コード配列を含有するファクターIX−ファクタ
ーVIIハイブリド遺伝子 A.ハイブリドファクターIXリーダー−合成ファクターVI
I5′コード配列 ファクターVIIの５′コード配列を得るための第２の
方法は、ファクターVIIのアミノ末端アミノ酸配列、他
のビタミンＫ−依存性凝固因子のアミノ酸配列、及び他
のビタミンＫ−依存性凝固因子遺伝子（Kurachi及びDav
ie,前掲;Anson等，EMBO J.，3:1053−1060,1984;及びDa
vie等，前掲）に基いて推定されるヌクレオチド配列を
用いて適当な２本鎖断片を合成することであった。成熟
ファクターVII類似体の分泌のために必要な分泌及びプ
ロセシングシグナルを得るため、この合成断片（コンセ
ンサス配列）をファクターIX cDNAクローン由来の２つ
のリーダー配列の１つに連結した。このストラテジーを
第３図中に要約する。

ヒト−ファクターIXをコードするcDNAをヒト−肝臓か
らのmRNAから造成されたライブラリー（Kurachi及びDav
ie,前掲）から得た。ファクターIX配列を_pBR322ベクタ
ーからPst I消化により単離し、そして_pUC13のPst I部
位に挿入した。このプラスミドをFIX−_pUC13と命名し
た。cDNAクローニングの結果としてファクターIX挿入部
の５′末端に存在するＧ−リッチ領域を除去するため、
合成オリゴヌクレオチドアダプターによりクローン化断
片の５′末端を置換した。オリゴヌクレオチドZC212及
びZC213（第１表）を合成し、そしてこれらをアニール
して22塩基対オーバーラップを生じさせ、断片の末端を
フィル−インし、そして適当な制限エンドヌクレアーゼ
で切断し、そして得られた断片をファクターIX配列に連
結した。

アダプターを造成するため、100pmoleずつのZC212及
びZC213を凍結乾燥し、そして10μｌの10Xキナーゼ／リ
ガーゼ緩衝液（600mM Tris,pH8.0,100mM MgCl₂,100nM D
TT）及び86μｌの水中に再懸濁した。アニール反応を65
℃にて10分間行い、この混合物を徐々に室温に冷去し、
そして氷上に置いた。この混合物に４μｌの2.5mM dNTP
混合物及び１μｌ（８ユニット）のT₄DNAポリメラーゼ
を加えた。反応を14℃にて40分間行った。次に、10μｌ
の5M NH₄OAcを加え、そしてDNAをフェノール／CHCl₃に
より１回、そしてCHCl₂により２回抽出し、そしてエタ
ノールにより沈澱せしめた。DNAを遠心分離し、100μｌ
のメデュウムサルト緩衝液（Maniatis等，前掲,100頁）
中に再懸濁し、９ユニットのPst I及び８ユニットのCfo
Iで消化し、そして上記のようにして抽出した。

次に、0.16pmoleの合成Pst I−Cfo Iアダプター断
片、0.14p moleのF IX−_pUC13由来Cfo I−Bam HIファク
ターIX断片、及び0.14pmoleの2.7kb BamHI−Pst I _pUC1
3ベクター断片を、60mM Tris−HCl,pH7.5,10mM MgCl₂,1
0mM DTT、及び0.9ユニットのT₄リガーゼを含有する20μ
ｌの反応混合物中で混合することにより変形されたファ
クターIX配列を造成した。この反応混合物を室温にて３
時間インキュベートし、そしてこれを用いてコンピテン
トE.コリJM83（Messing,Recombinant DNA Technical Bu
lletin,NIH Publication No.79−99,2,No.2,43−48,197
9）を形質転換した。これらの細胞を50μｌの２％Ｘ−g
al（５ブロモ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド）と共に、40μg/mlのアンピシリンを含有す
るＬ−ブロス上にプレートし、そして37℃にて一夜イン
キュベートした。白色コロニーを、アンピシリンを含有
する他のプレートに拾い上げ、そして37℃にて一夜増殖
せしめた。コロニーをワットマン540ペーパーにブロッ
トし、そしてこのペーパーをWallace等（Gene,16:21,19
81）の方法によるハイブリダイゼーションのために用意
した。但し、クロラムフェニコールプレート上での一夜
のインキュベーションは省略した。ペーパーを、44℃に
て２時間、0.9M NaCl,0.09M Tris−HCl,pH7.5,6mM EDT
A,0.5％ノニデット（Nonidet）Ｐ−40,150μg/ml E.コ
リtRNA中でインキュベートした。ペーパーを、変形され
た５′末端配列に特異的な14−merである³²P−ラベルさ
れたZC235（第１表）によりプローブした。フィルター
当り１〜２×10⁶cpmを用いるハイブリダイゼーションを
44℃にて前ハイブリダイゼーション緩衝液中で一夜行っ
た。次に、フィルターを、６×SSC,0.1％SDS中４℃にて
３回、及び2XSSC,0.1％SDS中４℃にて３回洗浄し、そし
てＸ線フイルムに暴露した。２個の陽性クローンが得ら
れた。これらのクローンの１つをF IX（−Ｇ）→_pUC13
と命名した。

F IX（−Ｇ）→_pUC13造成物のファクターIX部分の変
形された領域の配列を確認するため、BRL逆プライマー
を用いる_pUCプラスミド上で直接にジデオキシ配列決定
を、Wallace等,1981（前掲）の方法により、Chaconas等
（前掲）の方法によりポリヌクレオチドキナーゼ及びγ
³²P−ATPを用いて末端ラベルされたプライマーを用いて
行った。配列は予想通りであった。

生ずる組換プラスミドは３個のHae III開裂部位を含
み、第１の部位はファクターIX配列中の39位（番号は、
Anson等，前掲，の公表された配列に基き第1ATCから始
まる）に位置し、第２の部位は130位に位置し、そして
第３の部位は_pUC13ポリリンカー中に位置する。130部位
はプレプロ−ファクターIX分子のLys−Argプロセシング
部位のコドンから１塩基対上流である。最終ファクター
IX−ファクターVIIハイブリド造成物中で、39位又は130
位で終るファクターIXリーダー配列を、予想コンセンサ
ス配列及びファクターIXリーダー配列の最後の３コドン
を含んで成る合成２本鎖断片に連結した。

合成コンセンサス断片は、オリゴヌクレオチドZC286
〜ZC289（第１表）を組合わせて２本鎖断片を形成する
ことにより調製した。100pmoleずつのオリゴヌクレオチ
ドを凍結乾燥し、そして20μｌの1Xキナーゼ緩衝液中に
再懸濁し、そして４℃にて一夜インキュベートし、次に
65℃にて10分間加熱した。キナーゼ処理されたオリゴヌ
クレオチドを用いて２つのプールを作った。プール１は
ZC286＋ZC287を含み、プール２はZC288＋ZC289を含有し
た。プールされた対を65℃にて10分間アニールし、そし
て２時間にわたって室温に冷却し、そして氷上に30分間
置いた。

変形されたファクターIX断片をF IX（−Ｇ）→_pUC13
からHind III−EcoRI断片として取り出した。約20μｇ
のプラスミドを、４μｇのRNアーゼＡを含有する100μ
ｌのHind III緩衝液（BRL）中30ユニットずつのHind II
I及びEcoRIにより37℃にて一夜消化した。65℃にて10分
間加熱することにより反応を停止し、そしてベクター及
びファクターIX断片を１％アガロースゲル上で電気泳動
し、そして電気溶出により精製した。ファクターIX断片
をエタノールで沈澱せしめ、100μg/μｌのRNアーゼＡ
を含有する緩衝液中に再懸濁し、そして９ユニットのHa
e IIIを用いて37℃にて一夜消化した。Hind III−Hae I
II 39塩基対ファクターIX断片をこの消化物から1.5％ア
ガロースゲル上での電気泳動及びそれに続く電気溶出に
より単離した。Hind III−Hae III 130塩基対ファクタ
ーIX断片を得るため、F IX−_pUC13をEcoRI及びHind III
で消化し、そしてファクターIX断片を上記のようにして
単離した。約３μｇのこのHind III−EcoIR断片を６ユ
ニットのHae IIIにより37℃にて消化し、そしてアリコ
ートを５分間融で30分間にわたり、50mM EDTAを含有す
る溶液に取り出した。アリコートをプールし、そしてHi
nd III−Hae III 130塩基対断片を５％アクリルアミド
ゲル上での電気泳動及びそれに続く電気溶出により精製
した。

最終ファクターIX−コンセンサス配列ハイブリドを、
４部連結において、オリゴヌクレオチドプール１及び
２、ファクターIX Hind III−Hae III（39又は130塩基
対）、並びに_pUC13 Hind III−EcoRIを連結することに
より調製した。得られるプラスミドを用いてE.コリHB10
1（ATCC33694）を形質転換した。DNAをEcoRI及びHind I
IIにより消化することによりコロニーをスクリーニング
した。合成コンセンサス配列に連結した39塩基対ファク
ターIX配列を含んで成る配列をmini−F IX−F VIIと称
する。この造成物を含有するプラスミドを_pM7200（−
Ｃ）と称する。合成コンセンサス配列に連結された130
塩基対ファクターIX配列を含んで成る配列をmaxi−F IX
−F VIIと称する。この造成物を含有するプラスミドを_p
M7100（−Ｃ）と称する。このコンセンサス配列は、ア
ミノ酸配列Ala−Asn−Ala−Phe−Leu−Gla−Gla−Arg−
Pro−Gly−Ser−Leu−Gla−Arg−Gla−Gys−Lys−Gla−
Gln−Cys−Ser−Phe−Gla−Gla−Ala−Arg−Gla−Ile−
Phe−Gla−Gly−Leu−Asn−Arg−Thr−Lys−Leuを含ん
で成るポリペプチドをコードする。

B.ファクターIX−コンセンサス配列ハイブリド断片のフ
ァクターVIIcDNAクローンへの連結 ファクターIX−コンセンサス配列ハイブリド（mini又
はmaxi）を、３部連結において、ファクターVIIcDNAの
５′部分及びベクター_pUC13に連結した（第４図及び第
５図）。RNアーゼＡ（400ng/μｌ）を含有するHind III
緩衝液中で６μｇの_pUC13を10ユニットずつのXba I及び
Hind IIIで消化することによりベクター断片を得た。上
記のように２μｇのpM7200（−Ｃ）を10ユニットずつの
Hind III及びEcoRIにより消化してmini−F IX−F VII断
片を調製した。同様にしてpM7100（−Ｃ）からmaxi−F
IX−F VII断片を調製した。_pUC13にサブクローニングさ
れた_pUCVII2115のEcoRI−XbaI5′断片を含んで成るプラ
スミド_pUC705から、Xba I及びEcoRIによる消化によっ
て、ファクターVIIcDNAの５′部分を調製した。この消
化は37℃にて２時間行い、そして生成物を1.5％アガロ
ースゲル上での電気泳動により分離した。目的とする断
片を電気溶出し、フェノール／CHCl₃及びCHCl₃で抽出
し、そしてエタノールで沈澱させた。次に、３断片、す
なわち_pUC13/Xba I−Hind III、ファクターIX−ファク
ターVII（mini又はmaxi）/Hind III−EcoRI、及び５′
ファクターVII/EcoRI−Xba Iを、２μｌの20mM ATP及び
0.9ユニットのT₄DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液
20μｌ中で４℃にて一夜連結した。Hind III及びXba I
による制限分析によってコロニーをスクリーニングし
た。mini−又はmaxi−F IX−F VII配列を含有する組換
プラスミドをそれぞれpM7200及びpM7100と命名した（第
４図）。

正しいイン−フレームコード配列を形成するため、フ
ァクターVII cDNAの調製において使用したリンカーに基
いて融合配列内に変形を行わなければならなかった。mi
ni−融合体及びmaxi−融合体の両者は、ファクターIX−
コンセンサス配列ハイブリドとファクターVII cDNAとの
間の連結部にEcoRI部位を含有する（cDNAコローニング
過程の人工物である）。さらに、mini−融合体は、Hae
III部位において配列を５′AGGCCA3′から５′AGGCCCA
3′に変え、そしてこの配列の下流に正しいリーディン
グフレームを確立するために、Ｃの付加を必要とする。
これらの訂正は、Zoller及びSmith（Manual for Advanc
ed Techniques in Molecular Cloning Course，コール
ドスプリングハーバーラボラトリー,1983により２プラ
イマー法について記載されているのと実質的に同様の方
法により、オリゴヌクレオチド指令部位特定変異誘発に
より行った。mini−FIX−F VII断片をpM7200からHind I
II及びXbalによる消化により取り出し、そしてM13mp19
に挿入した。maxi−FIX−FVII断片を、同様にしてpM710
0から精製し、そしてサブクローニングした。EcoRI部位
の除去及び塩基の挿入のために、それぞれ変異誘発プラ
イマーZC333及びZC336（第１表を参照のこと）を使用し
た。各場合に、第２プライマーとしてユニバーサルプラ
イマーZC87を使用した。変異誘発プライマーは40pmole
のプライマー及び60pmoleのATPを１ユニットのT₄DNAキ
ナーゼと共に60℃にて一夜リン酸化した。maxi−F XI−
F VIIハイブリドからEcoRI部位を除去するため、１μｇ
のM13単鎖鋳型を20pmoleずつのZC333及びZC87と、全溶1
0μｌ中で一緒にした。プライマーを60℃にて10分間鋳
型とアリールし、５分間室温に冷却し、次に５分間氷上
に置いた。DNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）を用いて
プライマーを延長した。mini−FIX−FVIIハイブリド中
のEcoRI部位を除去しそしてリーディングフレームを正
しくするため、１μｇの該当するM13単鎖鋳型を20pmole
ずつのZC333、ZC336及びZC87と一緒にした。上記のよう
にしてアニーリング及びプライマー延長反応を行った。
プラークリフトを³²P−ラベルプライマー（ZC333又はZC
336）を用いて60℃にてスクリーニングし、そしてジデ
オキシ配列決定決により配列を確認した。maxi−FIX−F
VII又はmaxi−FIX−FVIIを含んで成る造成物をそれぞれ
pM7111及びpM7211と命名した。

コンセンサス配列は、ファクターVIIについて得られ
た蛋白質配列データと一致しない幾つかの領域を含有す
る（第２図）。ファクターVIIのアミノ末端部分との一
層大きな相同性を有するポリペプチドをコードする配列
を得るため、コンセンサス配列をオリゴヌクレオチド指
令部位特定変異誘発により変形した。この変形は８位に
おけるLeuの挿入、18位（８位の挿入後のアミノ酸位置
に関する）におけるLysとIleの置換、26位におけるAla
とAsnの置換、及び32−34位におけるGly−Leu−AsnとAl
a−Ser−Aspの置換（仮のアミノ酸配列データに基く）
から成る。

８位及び18位の配列変化は鋳型としてpM7111（センス
鎖）を用いて行った。前記のようにしてプライマーZC35
2（⁵′CCC AGG TCT CAG CTC CTC CAG³′）及びZC35
3（⁵′CTG CTC CTC CTT ACA CTC TCT³′）を鋳型にアニ
ールし、そして延長した。得られるファージクローンを
pM7114と命名した。pM7114中の挿入部の配列をジデオキ
シ配列決定法により確認した。

同様にして、位置26−34の変化をpM7114鋳型（センス
鎖）上で、変異誘発プライマーZC365（⁵′CAG CTT CGT
CCT GTT CAG GCC CTC GAA GAT CTC GCG GGC CTC CTC GA
A³′）を用い、ZC87（第１表）を第２プライマーとして
行った。得られた造成物をpM7115と命名した。M13ベク
ター中の全550bp挿入部の配列をジデオキシ法により決
定し、そして正しいことを見出した。

例5.ファクターIX−ファクターVII cDNA融合体の造製 ファクターIX−ファクターVII cDNA融合体を、Kurach
i及びDavie（前掲）により記載されているようにしてヒ
ト−肝臓cDNAライブラリーから得られたファクターIX c
DNAと例１に記載したファクターVII cDNA配列とを使用
して調製した。

ハイブリド蛋白質について選択された融合点はファク
ターIXのアミノ酸＋38（スレオニン）とファクターVII
cDNA配列によりコードされる第１リジンとの間であっ
た。この蛋白質は、ファクターIX cDNAの最初の252bp及
び_pUCVII2115ファクターVII cDNA配列の最初の２コドン
を除くすべてから成る配列によりコードされるであろ
う。このハイブリド配列を造成するため、便利な制限部
位を用いてファクターIX配列をまず_pUCVII 2115に融合
せしめた。この融合は、完全ファクターVII cDNA配列に
連結されたファクターIX cDNAの最初の310bpを含有する
プラスミドFIX/VII/12（下に記載する）をもたらす。ハ
イブリド蛋白質のために望ましい正確な連結を達成する
ため、介在（intervening）塩基対をオリゴヌクレオチ
ド指令変異誘発により除去した。

ファクターIX cDNA配列とファクターVII cDNA配列と
の連結を、FIX（−Ｇ）→_pUC13（例４）の0.3kp Hind I
II−Aha III断片と_pUC VII 2115（第５図）からの4.7kb
Sma I−Hind III断片とを連結することにより達成し
た。40μｌのメディウムサルト緩衝液（Maliatis等、前
掲）中で３μｇのFIX（−Ｇ）→_pUC13を40ユニットのHi
nd IIIで37℃にて４時間消化することによりHind III−
Aha III断片を調製した。次に容積を100μｌのメデュウ
ムサルト緩衝液に増加し、そして５ユニットのAha III
を加え、そしてインキュベーションを37℃にて18時間続
けた。DNA断片を上記のようにして１％アガロース上で
の電気泳動により分離し、そして0.3kbのバンドを単離
した。３μｇの_pUCVII 2115を30μｌの反応容積中で25
℃にて１時間、4.8ユニットのSma Iと共にインキュベー
トすることにより_pUCVII2115のSma I部分消化を行っ
た。65℃にて15分間のインキュベーションにより反応を
停止した。次にサンプルを同容量のフェノールで抽出
し、そしてエタノール沈澱を行った。

10分間のミクロフュージスピンによって沈澱を集め、
70％のエタノールですすぎ、そして空気乾燥した。DNA
を30μｌのメデュウムサルト緩衝液に再溶解し、そして
30ユニットのHind IIIにより37℃にて３時間消化した。
DNAを上記のようにして0.7％アガロース中での電気泳動
にかけ、そして4.7kb Hind−Sma I断片を単離した。Ｐ
等モル量の２つの断片（0.048pmole）を、50mM Tris−H
Cl,pH7.5,10mM MgCl₂,1mM DTT,1mM ATP、及び３ユニッ
トのT₄DNAリガーゼを含有する10μｌの反応溶液中で連
結し、そしてコンピテントE,コリRR1（ATCC 31343）を
形質転換した。細胞をアンピシリンプレート上で増殖せ
しめ、そして生ずるコロニーの内の12個を制限酵素消化
により目的プラスミド造成物の存在についてスクリーニ
ングした。コロニー12からのDNA（FIX/VII/12）が予想
通りの制限酵素消化パターンをもたらし、そして次のハ
イブリド遺伝子造成の段階で使用した。

オリゴヌクレオチド指令変異誘発法を単鎖DNA鋳型上
で行った。すなわち、融合したファクターIX/ファクタ
ーVII配列をM13mp19中にクローニングすることが必要で
あった。便利な小DNA断片を得るため、FIX/VII/12から6
40bp Hind III−Xba I断片を単離した。この断片はファ
クターIX cDNAの５′末端の310bp及びファクターVII断
片の330bpを含有する。１μｇのM13mp19 RF DNAを40μ
ｌのメデュウムサルト緩衝液中で20ユニットのHind III
及び20ユニットのXba Iで37℃にて18時間消化すること
によりベクターを調製した。DNAを前記のようにして1.2
％アガロース中での電気泳動にかけ、そし線状6.4kb断
片をゲルから単離した。５μｇのFIX/VII/12DNAを40μ
ｌのメデュウムサルト緩衝液中で10ユニットのXba Iに
より37℃にて18時間消化した。20ユニットのHind IIIを
加え、そして消化を37℃にてさらに７時間続けた。生ず
る断片を前記のようにして1.2％アガロース中での電気
泳動により分離し、そして640bp断片を溶出した。10ng
の線状化されたM13mp19及び1ngの640bp断片を14℃にて
１時間連結し、そして次にコンピテントE.コリJM101を
形質転換した（Messing,Meth.in Enzymology，前掲）。
細胞をＸ−gal及びIPTGと共にプレートし（Messing,Met
h.in Enzymology,前掲）、そして８個の淡青色のプラー
クを拾い、そしてE.コリJM103の培養物（A₆₀₀＝0.3）2.
5mlに感染させた。37℃にて18時間の増殖の後、細胞を
室温臨床遠心分離機中での遠心分離により収得し、そし
てM13ファージを含有する上清20μｌを10μg/lのエチジ
ウムブロミドと混合した。既知の標準との比較により、
８個のクローンのそれぞれはほぼ正しいサイズの挿入部
を有していた。次に、Messing（Meth.in Enzymology前
掲）により記載されていたようにして1.5mlの上清から
単鎖DNAを調製した。次に、プライマーとしてオリゴヌ
クレオチドZC87を用いてジデオキシ法によりこの造成物
を配列決定し、挿入連結部が正しいことを確認した。正
しいクローンの１つ（＃４）を鋳型として使用してオリ
ゴヌクレオチド指令変異誘発により機能的ファクターIX
−ファクターVII融合体を調製した。

オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち10bpの目的
とするファクターIX配列及び10bpの目的とするファクタ
ーVII配列から成る20−mer（第１表）を変異誘発プライ
マーとして使用した。M13mp19配列とハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドZC87を第２プライマーとして使用
した。

使用した変異誘発法はZoller及びSmith（前掲）の方
法の変化であった。アニーリング反応のため、20pmole
のZC249を、20μｌの60mM Tris−HCl,pH8.0,10mM MgC
l₂,1mM DTT,.1mM ATP,1ユニットのT₄キナーゼ中で４℃
にて一夜インキュベートすることによりリン酸化した。
65℃にて15分間加熱することにより反応を停止し、そし
てサンプルを凍結乾燥した。1pmoleの単鎖クローン＃４
鋳型及び20pmoleのZC87を10μｌのアニーリング緩衝液
（200mM Tris−HCl,pH7.5,100mM MgCl₂,500mM NaCl,10m
M DTT）に加えた。サンプルを65℃にて10分間加熱し、
室温にて５分間インキュベートし、そして次に氷上に置
いた。10μｌの次の溶液を新しく調製し、そしてサンプ
ルに加えた。20mM Tris−HCl,pH7.5,10mM MgCl₂,10mM D
TT,1mM dNTP,1mM ATP,0.15ユニット／μｌのT₄DNAリガ
ーゼ、0.25ユニット／μｌのE.コリDNAポリメラーゼＩ
（Klenow断片）。次に、反応混合物を15℃にて３時間イ
ンキュベートし、そしてこのサンプルを使用してコンピ
テントE.コリJM101を形質転換した（Messing,Meth.in E
nzymology，前掲）。

生ずるファージをニトロセルロース上に上げ、そして
³²P−ラベルZC249にハイブリダイズせしめることにより
スクリーニングした。乾燥したBA85フィルター（シュリ
ーヒュル＆シュール,0.45μｍ）を寒天プレート上に置
き、そしてファージを５分間吸着させた。フィルターを
取りはずし、そして５分間乾燥させ、0.5N NaOH及び1.5
M NaClで飽和されたワットマン3MMペーパー上に５分間
置き、３分間空気乾燥し、1M Tris−HCl（pH8）及び1.5
M NaClで飽和されたワットマンペーパー上に５分間置
き、そして３分間空気乾燥した。Tris−HClの段階を反
復し、そしてフィルターを100mlの６×SSC中で室温にて
２分間すすいだ。空気乾燥した後、フィルターを80℃に
て２分間加熱し、47℃（ZC249のTm−４℃）にて一夜、
6.7×SSC,pH6.2,2mg/mlのE.コリtRNA、並びに0.2w/v％
ずつのBSA、フィコール及びポリビニルピロリドン中で
前ハイブリダイズせしめた。

前ハイブリダイゼーション段階の後、フィルターを2.
5×10⁶cpm/フィルターのラベルされたZC249と共に同じS
SCハイブリダイゼーション緩衝液中で47℃にて一夜イン
キュベートした。ハイブリダイゼーションの後、フィル
ターを５〜10分間ずつ３回室温にて６×SSC中で洗浄
し、そしてＸ線フィルムに暴露した。仮定の陽性プラー
クを再プレートし、そして上記のようにしてスクリーニ
ングした。次に個々のプラークを拾い上げ、そして再鎖
DNAを調製し、そしてプライマーとしてZC275を使用して
配列決定した。オリゴヌクレオチドZC275は、同じ鎖上
のZC249の５′方向の配列40bpに対応する（第１表）。

４個の陽性プラークが同定された。１個のクローンに
ついてM13mp19中の全挿入部を、オリゴヌクレオチドZC8
7及びZC275を用いてジデオキシ法により配列決定し、そ
して正しいことを決定した。確認された配列は第７図中
塩基１−567により示される。次に、このクローンから
のRF DNAをハイブリド遺伝子の造成の最終段階において
使用した。

最終造成を行うために次の３断片を使用した。融合し
たIX/VII配列を含有するF IX/VII−９からの0.6kb Hind
III−Xba I断片；_pUCVII1923からの1.7kb Kba I−BamH
IファクターVII cDNA断片；及びpUC13の2.7kb BamH I
−Hind III断片である。３μｇのFIX/VII−９（RFDNA）
を50μｌの容積中で45ユニットのXba Iにより37℃にて
６時間消化した。DNAをエタノールで沈澱せしめ、再懸
濁し、そして50ユニットのHind IIIにより37℃にて４時
間消化した。サンプルを１％アガロース中での電気泳動
にかけ、そして0.6kbのバンドをNA45ペーパー（シュリ
ーヒェル＆シュール）上に電気溶出した。DNAをこのペ
ーパーから1.5M NaCl,50mM Tris−HCl,pH8,1mM EDTAに
より溶出し、フェノール抽出し、そしてエタノールで沈
澱せしめた。

残りのファクターVII cDNA配列を得るため、５μｇの
pUC VII 1923を40μｌのメヂュウムサルト緩衝液中で36
ユニットのXba Iにより37℃にて３時間消化した。次
に、８μｌの10倍塩緩衝液、28μｌの水、及び４μｌ
（40ユニット）のBamHIを加え、そして反応混合物を37
℃にて３時間インキュベートした。DNA断片を、１％ア
ガロース中での電気泳動により分離し、そして上記のよ
うにして1.7kb断片を単離した。

１μｇのpUC13を20μｌのメデュウムサルト緩衝液中
で10ユニットのHind IIIにより37℃にて１時間消化する
ことによりベクター断片を調製した。次に、２μｌの10
倍高塩緩衝液及び10ユニットのBamHIを加え、そしてイ
ンキュベーションをさらに２時間続けた。上記のように
して、DNAを１％アガロースゲル上で精製した。

等モル量（およそ0.56pmole）の３種類の断片を室温
にて45分間、10μｌの50mM Tris−HCl,pH7.5,10mM MgCl
₂,1mM DTT,1mM ATP及び３ユニットのT₄DNAリガーゼ中で
連結した。この反応混合物を用いてコンピテントE.コリ
JM83を形質転換した。細胞を、50μl/プレートの２％Ｘ
−galが添加された。40μg/mlのアンピシリンを含有す
る培地上にプレートした。７個の白色コロニーからDNA
を調製し、そして次に制限酵素消化によりスクリーニン
グした。正しいパターンを示すクローンの１つをF IX/V
II→pUC13と命名した。

例6.生物学的に活性なファクターVII類似体の発現 哺乳類細胞発現ベクターpD2を、トランスフェクトさ
れた動物細胞中でのFIX/VII遺伝子の発現のために選択
した。これは、プラスミドpDHFR−III（Berkner及びSha
rp,Nuc.Acids Res.，13,841−857,1985）から、次のよ
うにして造成された。pDHFR III中のDHFR cDNAに隣接す
るPst I部位を、常用のリンカー付加法（Scheller,R.
H.,Dickerson.R.E.,Boyer,H.W.,Riggs,A.D.、及びItaku
ra,K.,Science，196:177−180,1977）によりBamHI部位
に転換した。pDHFR III DNAを10mM Tris,pH7.6,6mMβ−
MSH,6mM NaCl,10mM MgCl₂及び2.5ユニットのPst Iと共
に37℃にて10分間インキュベートし、次にフェノール抽
出及びエタノール沈澱を行った。Pst I接着末端を、T₄D
NAポリメラーゼを用いて平滑末端化した。フェノール抽
出、及び10mM Tris,pH8.0,1mM EDTA,0.3M NaClに対する
透析の後、DNAをエタノール沈澱せしめた。DNAを20μｌ
の1.4mM ATP,50mM Tris,pH7.6,10mM MgCl₂,1mMジチオス
レイトール中に再懸濁し、そして次に5ngのT₄ポリヌク
レオチドキナーゼ処理されたBamHIリンカー（ニューイ
ングランドビオラブス）及び200ユニットのT₄ポリヌク
レオチドリガーゼと共に12℃にて12時間インキュベート
し、次にフェノール沈澱及びエタノール沈澱を行った。
DNAを90ユニットのBamHIにより37℃にて１時間消化し、
次に1.4％アガロースゲルにより電気泳動した。4.9kb D
NA断片（DHFR cDNA及びSV40ポリアデニレーションシグ
ナルを欠くpDHFRIII DNAに相当する）を電気溶出し、そ
してポリヌクレオチドリガーゼにより再環化し、そして
次にE.コリHB101にトランスフェクトした。アンピシリ
ン感受性コロニーを迅速プレプ分析（Birnboim,H.C.、
及びDoly,J.,Nucleic Acids Research，7:1513−1523）
によりスクリーニングし、そして正しいクローンを増殖
させて大規模プラスミドDNA調製を行った。

生ずるプラスミドを20ユニットのBamHIで開裂せし
め、そして2.5μｇのウシ腸ホスファターゼで処理し、
そして1.4％アガロースゲル上で電気溶出した。25μｇ
のpSV40（pBR322のBamHI部位に挿入されたSV40DNAのク
ローン）を25ユニットのBc1 Iにより50℃にて１時間消
化し、次に25ユニットのBamHIを添加し、そして37℃に
て１時間インキュベーションを続けた。次に、このDNA
を1.4％アガロースゲル上で電気泳動した。BamHI切断ベ
クター（すなわち、ポリアデニレーションシグナルを欠
くベクター）を、後期ポリアデニレーションシグナルを
含有するSV40DNA断片（0.14−0.19マップユニット〔Too
ze等,J.編，“DNA Tomor Viruses,Molecular Biology o
f Tumor Viruses"〕に、ゲル精製された断片（0.1μｇ
ずつ）を20μｌの50mM Tris,pH7.6,10mM MgCl₂,1mMジチ
オスレイトール,1.4mM ATP及び100ユニットのT₄ポリヌ
クレオチドリガーゼ中で12℃にて４時間インキュベート
することにより連結し、そしてE.コリRR1を形質転換し
た。陽性クローンを迅速プレプ分析により同定し、そし
て正しいDNA、すなわちpD2の大規模調製を行った。

ファクターIX/VII発現造成物を作成するため、１μｇ
のpD2を20ユニットのBamHIにより20μｌの高塩緩衝液中
で37℃にて１時間消化した。次に、20μｌの10mM Tris
−HCl,pH8,1mM EDTA及び１ユニットのウシアルカリ性ホ
スファターゼ（ベーリンガー）を加えた。反応混合物を
37℃にて１時間インキュベートし、そして75℃にて10分
間加熱することにより停止した。10μｇのFIX/VII→pUC
13を150μｌの高塩緩衝液中で150ユニットのBamHIによ
り37℃にて２時間消化した。DNA断片を1.2％アガロース
中での電気泳動により分離し、そして2.3kb断片を単離
した。等モル量（0.015pmole）の2.3kb BamHI断片及びp
D2ベクター断片を14℃にて2.5時間上記のようにして連
結した。この反応混合物を用いてE.コリRR1細胞を形質
転換し、次にこれを10μg/mlのアンピシリンを含有する
培地上にプレートした。プラスミドDNAを生じたコロリ
ーの内の12個から調製し、そして制限酵素消化によりス
クリーニングした。正しい酵素消化パターンを示すクロ
ーンの１つをFIX/VII/pD2と命名した（第６図）。FIX/V
II/pD2により形質転換されたE.コリRR1はNo.53068とし
てATCCに寄託された。

FIX/VII/pD2により幼ハムスター腎臓（BHK）細胞（ア
メリカン・タイプ・カルチュア・コレクションから受託
番号CCL10として入手可能である）をトランスフェクト
する方法は、公表されている方法（例えば、Wigler等，
Cell，14:725,1978;Corsaro及びPearson,Somatic Cell
Genetics，7:603,1981;Graham及びVander Eb,Virolog
y，52:456,1973）に類似する。BHK細胞を60mm組織培養
ペトリ皿中、ドルベコの培地（＋10％熱不活性化ウシ胎
児血清並びにグルタミン及びペニシリン−ストレプトマ
イシン）中で37℃、５％CO₂にて、20％のコンフルエン
スまで増殖せしめた。60mmペトリ皿１枚のトランスフェ
クトのために合計10μｇのDNA、すなわち3.75μｇのFIX
/VII/pD2、1.25μｇのpKO−neo（Southern及びBerg,J.M
ol.Appl.Genet.，1:327−341,1982）、及び５μｇのサ
ケ精子DNAを使用した。DNAを0.3M NaOAc,75％エタノー
ル中で沈澱せしめ、70％のエタノールですすぎ、そして
20μｌの10mM Tris−HCl,pH8,1mM EDTAに再溶解した。D
NAを440μｌの水及び500μｌの280mM NaCl,1.5mM NaHPO
₄、12mMデキストロース、50mM HEPES,pH7.12中に再溶解
した。60μｌの2M CaCl₃を上記の混合物に滴加し、そし
て溶液を室温にて30分間置いた。次に、この溶液を細胞
に加え、そして細胞を37℃にもどして４時間置いた。培
地を除去し、そして血清を含有するドルベコ培地中20％
DMSOを5ml室温にて２分間にわたり加えた。次に、皿を
培地を２回交換して迅速に洗浄した、そして新鮮な培地
中で一夜インキュベートした。DNAを加えてから24時間
後、媒地を除去し、そして選択培地（血清を含有するド
ルベコ培地中10mg/mlのG418,498μg/mg、ギブコ）を加
えた。10日及び13日の後、pKO−neo遺伝子を含有しそし
てそれ故にG418に対して耐性である細胞を代表する個々
のクローンを96ウエル（又は24ウエル）プレートに移
し、そして蛋白質測定のために増殖せしめた。

細胞を、５μg/mlのビタミンＫ（フィトナジオン，メ
ルク）を含有する、10％ウシ胆児血清が補充されたドル
ベコの培地中に増殖せしめた。培地を遠心分離により細
胞及び細胞片から分離し、そしてファクターVIIポリペ
プチド（ELISAによる）、及び生物学的活性について測
定した。細胞をトリプシンによりプレートから取り出
し、新鮮な培地で洗浄し、遠心分離し、そして−20℃に
て凍結した。次に、細胞ペレットをPBS中で洗浄し、ペ
レット化し、そして0.25％トリトンＸ−100を含有するP
BS中に再懸濁した。サンプルを稀釈し、そしてポリペプ
チド及び活性について測定した。

ファクターVIIについてのELISAを次のようにして行っ
た。ヒト−ファクターVIIに対するモノクローナル抗体
（0.1M Na₂CO₃,pH9.6中５μl/ml）200μｌを96ウエルミ
クロタイタープレートの各ウエル中で37℃にて２時間イ
ンキュベートした。次にウエルを220μｌのPBS（pH7.
2）中１％ウシ血清アルブミン（BSA）及び0.05％トウィ
ーン20と共に37℃にて２時間インキュベートした。プレ
ートを水ですすぎ、空気乾燥し、そして４℃にて貯蔵し
た。サンプルを測定するため、200μｌのサンプルを、
抗体がコートされたウエル中で室温にて１時間インキュ
ベートした。次に、ウエルを0.05％のトウィーン20を含
有する200μｌのPBSで４回すすいだ。次に、ウエルを、
ファクターVIIに対するラビット−ポリクローナル抗血
清のIgG画分（１％のBSA及び0.05％のトウィーン20を含
有するPBS中５μg/ml）200μｌと共に室温にて１時間イ
ンキュベートした。次に、アルカリ性ホスファターゼと
結合したヤギ抗−ラビットIgGとインキュベートした。
次に、ウエルを0.05％のトウィーン20を含有するPBSに
より４回すすいだ。ウエルに、56mg/lのMgCl₂を含有す
るジエタノールアミン緩衝液（96ml/l）、pH9.8中に溶
解したｐ−ニトロフェニルホスフェート（30mg）200μ
ｌを加えた。37℃にて酵素反応を行い、そして黄色の発
生をELISAプレートリーダーを用いて405nmでモニターし
た。細胞培地について得られた結果を第３表に示す。

ファクターVIIの生物学的活性はQuick（Hemorragic D
isease and Thrombosis，第３版,Leat Febiger,フィラ
デルフィア,1966）により記載されたワン−ステージ・
クロッティングアッセイにより測定した。細胞培地につ
いて得られた結果を第３表に示す。

例7.ファクターIXの発現 14μｇのFIX（−Ｇ）→pUC13を30μｌの高塩緩衝液中
で30ユニットのBamHIにより37℃にて３時間消化した。
次に、DNAを１％アガロースゲル中での電気泳動にか
け、そしてファクターIX配列を含有する1.4kbバンドを
ゲルから単離した。

３μｇのベクターpD2を30μｌの高塩緩衝液中で30ユ
ニットのBamHIにより37℃にて３時間消化した。DNAを１
％アガロース中での電気泳動にかけ、そして線状1.5kb
断片を単離した。次に、DNAを30μｌの10mM Tris−HCl,
pH8,1mM EDTA中で0.12ユニットのウシアルカリ性ホスフ
ァターゼにより37℃にて30分間処理した。塩を0.3M NaO
Acに調製し、そしてサンプルをフェノールにて２回抽出
し、クロロホルムで１回抽出し、そしてDNAをエタノー
ル沈澱せしめた。ペレットを70％エタノール中ですす
ぎ、乾燥し、そして20μｌの10mM Tris−HCl,pH8,1mM E
DTA中に再溶解した。等モル量（0.02pmole）の２つの断
片を上記のようにして10ユニットのT₄DNAリガーゼによ
り連結した。反応混合物を使用してE.コリRR1細胞を形
質転換した。生じたアンピシリン耐性コロニーの内の12
コロニーからのDNAを制限酵素消化によりスクリーニン
グした。正しい方向に挿入された1.4kb断片を有するク
ローンの１つをFIX−（Ｇ）/pD2と命名した。FIX（−
Ｇ）/pD2により形質転換されたE.コリRR1はNo.53067と
してATCCに寄託された。

BHK細胞を、上記のようにしてFIX（−Ｇ）/pD2及びpK
O−neoにより同時トランスフェクトした。薬剤耐性細胞
を選択し、そして例６に記載したようにしてELISA及び
活性測定のために用意した。

生物学的活性の試験は、ファクターIX不足患者からの
血漿の凝固時間を短縮するファクターIXの能力に基く。
これはProctor及びRapaport,Amer.J.Clin.Path.，36:21
2,1961により記載されたようにして行った。結果を第４
表に示す。

ファクターIXポリペプチドの量は例６に記載したのと
実質上同様にしてファクターIXに対するポリクローナル
ラビット抗血清を使用してELISA法により決定した。ウ
エルをファクターIX含有サンプルと共にインキュベート
した後、ウエルを洗浄し、そして１％のBSA0.05％のト
ウィーン20を含有するPBS中1:1000稀釈された、アルカ
リ性ホスファターゼと接合したアフィニティー精製され
たラビットポリクローナル抗−ファクターIXの200μｌ
と共に室温にて１時間インキュベートした。次に、ウエ
ルを、0.05％のトウィーン20を含有するPBSで４回すす
ぎ、そして酵素基質を上記のように添加した。４℃にて
一夜、又は37℃にて２時間、インキュベーションを行っ
た。

第４表に示すように、ファクターIXの70〜80％が培地
中に分泌され、そしてその約50％が生物学的に活性であ
った。細胞ペレット中にはファクターIX活性は検出され
なかった。

細胞培養培地に１〜10mg/mlの濃度でビタミンＫ（フ
ィトナジオン，メルク）を補充することにより最も高レ
ベルの活性が達成された。

細胞が真正なファクターIXを分泌することを証明する
ため幾つかの追加の分析を行った。上記の測定に従って
ファクターIX活性を含有するサンプルをファクターVII
不足血漿とインキュベートしたが凝固時間には影響を与
えず、活性が非特異的凝固剤ではなく真正なファクター
IXに基くことが示された。この結果はさらに特異的異体
によりりファクターIX活性がサンプルから涸渇すること
により確認された。ファクターIX活性の97〜98％が、フ
ァクターIXに対するラビットポリクローナル抗体により
細胞上清から免疫沈澱した。この抗体はまた正常血漿か
らファクターIX活性の99％以上を沈澱せしめた。エリス
ロポイエチンに対するラビットポリクローナル抗体によ
っては上清からファクターIX活性が除去されなかった。

例8.ファクターVIIのための発現ベクターの造成 部分的ファクターVII cDNAに連結された合成ファクタ
ーVII5′コード領域を含んで成る発現ベクターを造成し
た。pM7115からのファクターIXリーダー−５′ファクタ
ーVII配列、及びFIX/VII/pD2からの３′ファクターVII
配列を、SV40エンハンサー並びにアデノウイルス２主要
後期プロモーター及びトリパルタイトリーダーを含むプ
ラスミドpD3に挿入することによりpM7135と称するベク
ターを生じさせた。

プラスミドpD3はプラスミドpDHFR IIIから得られた。
pDHFR III中のDHFR配列からすぐ上流のPst I部位を次の
ようにしてBcl I部位に転換した。10μｇのプラスミド
を100μｌの緩衝液Ａ（10mM Tris,pH8,10mM MgCl₂,6mM
NaCl,7mM β−MSH）中で37℃にて10分間５ユニットのP
st Iにより消化した。DNAをフェノール抽出し、EtOH沈
澱せしめ、そして10mMdCTP及び16ユニットのT₄DNAポリ
メラーゼを含有する40μｌの緩衝液Ｂ（50mM Tris pH8,
7mM MgCl₂,7mM β−MSH）中に再懸濁し、そして12℃に
て60分間インキュベートした。EtOH沈澱の後、DNAを、4
00ユニットのT₄ポリヌクレオチドリガーゼを含有する14
μｌの緩衝液Ｃ（10mM Tris,pH8,10mM MgCl₂,1mM DTT,
1.4mM ATP）中で2.5μｇのキナーゼ処理されたBc1 Iリ
ンカーに、12℃にて12時間連結した。フェノール抽出及
びEtOH沈澱の後、DNAを120μｌの緩衝液Ｄ（75mM KCl,6
mM Tris,pH7.5,10mM MgCl₂,1mM DTT）中に再懸濁し、80
ユニットのBc1 Iで50℃にて60分間消化し、そしてアガ
ロースで電気泳動した。フォームIIIプラスミドDNA（10
μｇ）をゲルから単離し、そして50ユニットのT₄ポリヌ
クレオチドリガーゼを含有する10μｌの緩衝液Ｃ中で12
℃にて２時間連結し、そしてこれを用いてE.コリHB101
を形質転換した。陽性クローンを迅速DNA調製分析によ
り同定し、そして陽性コロニーから調製されたプラスミ
ドDNA（pDHFR′と称する）をdAM^-E.コリに形質転換し
た。

次に、下記のようにしてプラスミドpD2′を得た。pDH
FR′（15μｇ）及びpSV40（25μｇ）を100μｌの緩衝液
Ｄ中で25ユニットのBc1 Iを用いて50℃にて60分間開裂
せしめ、次に50ユニットのBamHIを加えて37℃にて60分
間さらにインキュベートした。DNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動により分離し、そして4.9kb pDHFR′断片及
び0.2kb SV40断片を単離した。これらの断片（200ngのp
DHFR′及び100ngのSV40DNA）を100ユニットのT₄ポリヌ
クレオチドリガーゼを含有する。10μｌの緩衝液Ｃ中で
12℃にて４時間インキュベートし、そして生成した造成
物（pD2′）を用いてE.コリRR1を形質転換した。

pBR322領域中の“毒性（poison）”配列（Lusky及びB
otcham,Nature,293,79−81,1981）を除去することによ
りプラスミドpD2′を変形した。プラスミドpD2′（6.6
μｇ）及びpML−１（Lusky及びBotcham,前掲）（４μ
ｇ）を50μｌの緩衝液Ａ中で10ユニットずつのEcoRI及
びNru Iにより37℃にて２時間インキュベートし、そし
てアガロースゲル電気泳動を行った。1.7kb pD2′断片
及び1.8kb pML−１断片を単離し、そして100ユニットの
T₄ポリヌクレオチドリガーゼを含有する20μｌの緩衝液
Ｃ中で12℃にて２時間相互に連結し、次にE.コリHB101
に形質転換した。目的とする造成物（ΔpD2と称する）
を含有するコロニーを迅速調製分析により同定した。次
に10μｇのΔpD2を50μｌの緩衝液Ａ中で20ユニットず
つのEcoRI及びBg1 IIにより37℃にて２時間消化した。D
NAをアガロースにより電気泳動し、そしてpBR322の３′
スプライス部位及びポリＡ配列を含有する目的の2.8kb
断片（断片Ｃ）を単離した。

pD3の造成において使用される残りの断片を得るた
め、Sac II（Sst II）部位をHind III部位又はKpn I部
位のいずれかに転換するようにpDHFR IIIを変形した。1
0μｇのpDHFR IIIを20ユニットのSst IIにより37℃にて
２時間消化し、そして次にフェノール抽出及びエタノー
ル沈澱を行った。再懸濁したDNAを10mM dCTP及び16ユニ
ットのT₄DNAポリメラーゼを含有する100μｌの緩衝液Ｂ
中で12℃にて60分間インキュベートし、フェノール抽出
し、透析し、そしてエタノール沈澱した。DNA（５μ
ｇ）を400ユニットのT₄DNAリガーゼを含有する20μｌの
緩衝液Ｃ中で12℃にて10時間、50μｇのキナーゼ処理さ
れたHind III又はKpnIリンカーと連結し、フェノール抽
出し、そしてエタノール沈澱せしめた。50μｌの緩衝液
Ａ中に再懸濁した後、得られたプラスミドを適当であれ
ば50ユニットのHindIII又はKpn Iで消化し、そしてアガ
ロースにより電気泳動した。ゲル−単離したDNA（250n
g）を400ユニットのT₄DNAリガーゼを含有する30μｌの
緩衝液Ｃ中で12℃にて４時間連結し、そしてこれを用い
てE.コリRR1を形質転換した。得られたプラスミドをpDE
FRIII（Hind III）及びpDHFRIII（Kpm I）と命名した。
次に、700bp Kpn I−Bg1 II断片（断片Ａ）をpDHFRIII
（Kpn I）から、Bg1 II及びKpn Iによる消化並びにこれ
に続くアガロースゲル電気泳動により精製した。

SV40エンハンサー配列を次のようにしてpDHFRIII（Hi
nd III）に挿入した。50μｇのSV40DNAを120μｌの緩衝
液Ａ中で50ユニットのHind IIIと共に37℃にて２時間イ
ンキュベートし、そしてHind IIIC SV40断片（5089−96
8bp）をゲル精製した。プラスミドpDHFR III（Hind II
I）（10μｇ）を250ngのウシ小腸ホスファターゼにより
37℃にて１時間処理し、フェノール抽出し、そしてエタ
ノール沈澱せしめた。線状化されたプラスミド（50ng）
を、16μｌの緩衝液Ｃ中で12℃にて３時間、200ユニッ
トのT₄ポリヌクレオチドリガーゼを用いて、250ngのHin
d III C SV40と連結し、そしてE.コリHB101に形質転換
した。次に、700塩基対のEcoRI−Kpn I断片（断片Ｂ）
をこのプラスミドから単離した。

pD3の最終造成のため、断片Ａ及びＢ（50ngずつ）
を、200ユニットのT₄ポリヌクレオチドリガーゼを用い
て12℃にて４時間、10ngの断片Ｃと連結し、次にE.コリ
RR1を形質転換した。陽性コロニーを迅速調製分析によ
り検出し、そしてpD3の大規模調製を行った。

次に、発現ベクターpM7135を造成した。

pM7115の複製形をBamHI及びXbaIで消化し、そしてファ
クターIXリーダー及び５′ファクターVII配列を含有す
る550塩基対断片をゲル精製した。プラスミドFIX/VII/p
D2をXba I及びBamHIで消化し、そしてファクターVII cD
NAの３′部分を含んで成る1700bp断片をゲル精製した。
プラスミドpD3をBc1 Iで消化し、ウシアルカリ性ホスフ
ァターゼで処理し、そして３個の断片を三重連結により
連結した。得られた造成物を2000塩基対Xba I断片の存
在についてスクリーニングした。正しい配列を有するプ
ラスミドを選択し、そしてpM7135と命名した（第８
図）。

例9.cDNAクローンからのファクターVIIの発現 ファクターVIIリーダーを含有するファクターVII cDN
Aを発現するため、λ VII2463、又はλVII565及びλVII
2463からのDNAを、Ad2主要後期プロモーター、SV40エン
ハンサー配列、Ad2トリパルタイトリーダー、スプライ
スセット、及びSV40ポリアデニレーションシグナルを含
有する発現ベクターにクローニングした。このベクター
は、cDNAの挿入の部位としてユニークEcoRI配列を含有
するように適合されている。60アミノ酸のリーダーをコ
ードするλ VII2463からの配冷の発現、及び−18から−
39までのアミノ酸のコドンを欠き、そしてそれ故に38ア
ミノ酸の長さのリーダーをコードするλ VII565及びλ
VII2463からの配列の発現を評価した。ファクターVIIリ
ーダーの構造はcDNAクローニングによってのみ同定され
ているため、及び２つの異る５′−末端cDNAを得ること
によって生じるあいまいさのため、本発明者等はさらに
ゲノム−cDNAファクターVII配列を造成した。λ VII246
3の３′部分（エクソン２中のBg1 II部位からポリ
（Ａ）テイルへの３′リンカーのEcoRI部位まで）を、
エクソン1a、1b及びエクソン２の残りをコードするクロ
ーン7mlのサブゲノム断片に連結した。EcoRI−BgIII4.4
kb断片として再構成されたこのサブゲノム断片をλ VII
2463 cDNAに連結し、そして哺乳類発現ベクターにクロ
ーニングした。

要約すれば、サブクローンを造成するため、λ VII24
63のファクターVII cDNA EcoRI断片をpUC18のEcoRI部位
にクローニングし、そしてpVVII2463と命名した。同様
にして、λ VII565のEcoRI cDNA挿入部をpUC18にサブク
ローニングし、そしてp VII565と命名した。クローンp
VII 565のファクターVII配列の５′部位とp VII 2463の
ファクターVII DNAの３′セグメントの間のハイブリド
を、次のようにして造成した。すなわち、p VII 565の
最も５′のEcoRI−Bg1 IIファクターVII断片、及びp VI
I 2463のBg1 II−Hind IIIファクターVII断片（p VII 2
463のポリリンカー中のHind III部位）をEcoRI及びHind
IIIで消化されたpUC18にクローニングした。この造成
物をp VII2397と命名した。p VII2463及びp VII 2397の
挿入部をEcoRI消化により取り出し、そしてゲル過し
て、下記のようにして哺乳類発現ベクターに挿入した。

A.十分な長さのファクターVII cDNAの発現 ファクターVIIの発現をベクターpDX中で達成した。こ
のベクターはpD3（例８に記載した）及びpD3′〔このベ
クターはpD3と同じであるが、但しSV40ポリアデニレー
ションシグナル（すなわち、SV40 BamHI〔2533bp〕−Bc
1I〔2770bp〕断片が後方向（late orientation）にあ
る〕から誘導した。従って、pD3′は遺伝子挿入の部位
としてBamHI部位を含有する。

pDXを形成するため、pD3′中のEcoRI部位を、EcoRIに
よる開裂、S1ヌクレアーゼによるインキュベーション、
及びこれに続くBc1 Iリンカーとの連結により、Bc1 I部
位に転換した。DNAを陽性に同定されたコロニーから調
製し、そして変化した制限部位を含有する1.9kb XhoI−
Pst I断片をアガロースゲル電気泳動により調製した。
第２の変形において、Bc1 Iで開裂されたpD3をキナーゼ
処理されたEcoRI−Bc1 Iアダプター（オリゴヌクレオチ
ドZC525,5′GGAATTCT3′；及びZC526,5′GATCAGAATTCC
3′から造成される）と連結して、発現ベクターに遺伝
子を挿入するための部位としてEcoRI部位を生じさせ
た。陽性コロニーを制限エンドヌクレアーゼ分析により
同定し、そしてこれからのDNAを使用して変形された制
限部位を含有する2.3kb XhoI−PstI断片を単離した。上
記の２つのDNA断片をT₄DNAリガーゼと共に一緒にインキ
ュベートし、E.コリHB101に形質転換し、そして陽性コ
ロニーを制限分析により同定した。pDXと称するこのよ
うなDNAの調製を行った（第12図）。このDNAをEcoRIで
開裂せしめ、そして次にウシ小腸ホスファターゼと共に
インキュベートした。次に、精製されたDNAをT₄DNAリガ
ーゼ及びpVII2463からのファクターVIIEcoRI断片と、又
はpVII2397に由来する、ファクターVIIEcoRI cDNA断片
とインキュベートした。生ずるクローンをそれぞれF VI
I（2463）/pDX、及びF VII（565＋2463）/pDXと命名し
た。E.コリJM83に形質転換し、次に制限酵素分析により
同定した後、プラスミドDNAの調製を行い、広範囲の制
限エンドヌクレアーゼ消化によってチェックした。プラ
スミドF VII（2463）/pDX、及びF VII（565＋2463）/pD
Xはアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション
に寄託され、それぞれ受託番号No.40206、及びNo.40205
が与えられた。

F VII（2463）/pDX及びF VII（565＋2463）/pDX（10
μｇずつ）のそれぞれを、10μｇのサケ精子キャリヤー
DNAと共に、BHK tk^-t13細胞（Floros等，Exper.Cell Re
s. 132:215−223,1981）又はCOS細胞のいずれかに、標準
的リン酸カルシウム沈澱法を用いてトランスフェクトし
た。トランスフェクションに続き、細胞を５μg/mlのビ
タミンＫを含有する適当な培地に２日間培養した。この
時点で、ファクターVIIに対するモノクローナル抗体を
用いて、上清をELISA陽性材料についてアッセイした。F
VII（2463）/pDX及びF VII（565＋2463）/pDXの両者は
ファクターVIIポリペプチドの生産を指令し、これはCOS
細胞上清中に検出され、そしてF VII（565＋2463）pDX
からのファクターVIIはBHK細胞上清中に観察された。Sh
am−トランスフェクトされたBHK細胞又はCOS細胞は検出
可能なレベルのファクターVIIをもたらさなかった（第
５表）。

ファクターVIIの一時的な発現も第６表に挙げる幾つ
かの他の細胞系において試験した。

細胞を、10μｇのF VII（2463）/pDX又はF VII（565
＋2463）/pDXのいずれか、並びにクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んで成るプラス
ミド１μｇ（同時トランスフェクトされた細胞の同定を
可能にするため）及び10μｇのサケ精子DNAにより同時
トランスフェクトした。６日後にスペント培地をELISA
により測定した。結果を第７表に示す。

FVII（2463）/pDX（10μｇ）又はFVII（565＋2463）/
pDX（10μｇ）を、10μｇのサケ精子DNA及び哺乳類発現
ベクター中ジヒドロフォレートリダクターゼの耐性形
（Simonson及びLevinson,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,80:2
495−2499,1983）をコードするプラスミド１μｇと共に
BHK tk^-t13細胞に同時トランスフェクトした。２日後、
細胞を1:14に分け、250nM又は1000nMメトトレキセート
（MTX）、及び５μg/mlのビタミンＫ（フェタジオン，
メルク）を含有する選択培地に入れた。２週間後、コロ
ニーを単離し、そして50〜90％コンフルエンシーに増殖
させた。次に上清をELISAによりファクターVIIポリペプ
チドについて測定した。25個の陽性クローンの内22個を
さらに分析した。細胞を、５×10⁴（グループＩ）又は
１×10⁵（グループII）で、５μg/mlのビタミンＫ、及
び250nM又は1000mMメトトレキセートを含有する10cmの
皿にプレートした。５日後、速く増殖するクローン（第
８表中＊印を付す）を1:2に分け、そして24時間後すべ
てのプレート上の培地を交換した。23時間後（グループ
Ｉ）又は20時間後（グループII）、上清を収得し、そし
て各クローンについて細胞を計数した。培地をELIISA又
はワン−ステージクロッティングアッセイの両方により
測定した。

B.ファクターVIIゲノム−cDNAハイブリドの発現 ファクターVIIゲノム５′−末端を代表するゲノム配
列及びファクターVII遺伝子３′−末端からのcDNA配列
を含んでなる発現ベクターを次のようにして調製した。
ゲノムプラスミド7mlの３つのサブクローン、7 Bam、7
SD及び7 SEを用いて５′−末端を再構成した。プラスミ
ド7 BamはpUC12にサブクローニングされた、エクソン1a
を含有する3.6kb EcoRI−BamHI断片である。エクソン1a
を含有する0.7kb EcoRI−XbaI断片をこのサブクローン
から単離した。これを断片ａと称する。プラスミド7 SD
は、pUC18にサブクローニングされた、エクソン1bを含
有する3.7kb Sst I断片である。エクソン1b含有3.1kb X
ba I−SstI断片をこのサブクローンから単離した。これ
を断片ｂと称する。プラスミド7 SEは、M13mp19にサブ
クローニングされた、エクソン２−４を含有する3.9kb
SstI断片である。エクソン２の５′部分を含有するSstI
−Bg1II（0.6kb）断片をゲル単離した。これを断片ｃと
称する。３′−ファクターVII cDNAの残り（断片ｄ）は
pUVII2463から2kb Bg1II−EcoRI断片として得た。断片
ａ−ｄを、EcoRIで開裂されそしてウシ小腸ホスファタ
ーゼ処理されたpDXと連結し、そしてE.コリJM 83又はHB
101に形質転換した。陽性コロニーを制限酵素分析によ
り同定し、そしてこれらのコロニーからプラスミドDNA
を調製した。

ファクターVIIの発現のため、プラスミドDNAを前記の
ようにしてBHK又はCOSに同時トランスフェクトした。ト
ランスフェクトされた細胞をビタミンＫ−含有培地中で
２日間培養し、培地をELISAによりファクターVIIについ
て測定した。

以上、この発明を具体的に説明したが、この発明の範
囲内において多くの変更を行うことが可能である。

【図面の簡単な説明】

第1A図は、cDNAクローンλ VII 2115及びλ VII 1923の
部分を連結することにより形成された部分的ファクター
VIIcDNA配列を示す。 第1B図はλ VII 2463のファクターVII cDNA配列を示
す。矢印はλ VII 565の配列中の欠失の範囲を示す。配
列の上方の番号はアミノ酸を示し、下方の番号はヌクレ
オチドを示す。 第2A図は、幾つかの凝固因子のアミノ末端領域のアミノ
酸配列を示す。 第2B図は、蛋白質配列決定から得られたファクターVII
のアミノ酸配列とcDNAによりコードされているそれとの
比較を示す。 第３図はファクターIXリーダー配列とコンセンサスカル
シウム結合ドメインとの連結を示す。 第４図はファクターIX−コンセンサス配列ハイブリドと
部分的ファクターVII cDNAとの連結によるイン−フレー
ム（in−frame）コード配列の形成を示す。 第５図はファクターIX/ファクターVII融合蛋白質をコー
ドする配列を含有するプラスミドの造成を示す。 第６図は発現ベクターFIX/VII/pD2を示す。使用されて
いる記号は、Ad2 MLPはアデノウィルス２からの主要後
期（major tate）プロモーターであり:L1−３はアデノ
ウイルス２トリパルタイト（tripratite）リーダー配列
であり;5′ssは５′スプライス部位であり;3′ssは３′
スプライス部位であり；そしてpAはSV40からの後期ポリ
アデニレーションシグナルである。 第７図はファクターIX/ファクターVII cDNA融合体のヌ
クレオチド配列を示す。 第８図は発現ベクターpM7135を示す。使用されている記
号は、ＥはSV40エンハンサーであり;oriは０−１マップ
ユニットAd5であり;pAはSV40からの前記ポリアデニレー
ションシグナルであり；ΔはpBR322“毒性（poison）”
配列の欠失領域であり；そして他の記号は第６図に記載
した通りである。 第９図は2463 bpのファクターVII cDNAのサブクローニ
ングを示す。 第10図は565 bpのファクターVII cDNAのサブクローニン
グを示す。 第11図はp VII565の５′末端とpUC18中のp VII 2463の
３′末端との連結によるp VII 2397の形成を示す。 第12図は発現プラスミドF VII（2463）/pDX及びF VII
（565＋2463）/pDXの造成を示す。pAは、例９に示すよ
うに、前期又は後期方向におけるSV43からのポリアデニ
レーションシグナルを示す。他の記号は第８図について
記載したのと同じである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャーロン ジェイ．バズビー アメリカ合衆国 ワシントン 98103 シ アトル，メリディアン ノース 4109 (72)発明者 キャスリーン エル．バークナー アメリカ合衆国 ワシントン 98199 シ アトル，トウェンティセカンド アベニュ ウエスト 3032 (72)発明者 マーガレット ワイ．インスレー アメリカ合衆国 ワシントン 98072 ウ ッディンビル，ノース イースト，ワンハ ンドレットフィフティース ストリート 16860 (72)発明者 リチャード ジー．ウッドベリー アメリカ合衆国 ワシントン 98155 シ アトル，ノース イースト，テンス アベ ニュ 15464 (72)発明者 チャールズ エル．グレイ アメリカ合衆国 ワシントン 98115 シ アトル，ノース イースト，フォーティフ ァースト アベニュ 8014 (56)参考文献 Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ 22（３）（1981）Ｐ．375−380

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列： を有するファクターVIIaの血液凝固のための生物学的活
   性を活性化後に有する蛋白質をコードするヌクレオチド
   配列を含有するDNA造成物。
2. 【請求項２】前記ヌクレオチド配列の少なくとも部分が
   ファクターVIIのcDNAクローン又はゲノムクローンに由
   来する特許請求の範囲第１項に記載のDNA造成物。
3. 【請求項３】ファクターVIIのcDNAクローン又はゲノム
   クローンに由来する第１ヌクレオチド配列を含んで成
   り、該第１ヌクレオチド配列がその下流に位置する第２
   ヌクレオチド配列に連結されており、該第２ヌクレオチ
   ド配列がファクターVIIのcDNAクローンに由来し、そし
   てこれらの連結された配列が、活性化後にファクターVI
   Iaの血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコ
   ードしている特許請求の範囲第１項に記載のDNA造成
   物。
4. 【請求項４】前記第１ヌクレオチド配列がさらにリーダ
   ーペプチドをコードしている特許請求の範囲第３項に記
   載のDNA造成物。
5. 【請求項５】前記第１ヌクレオチド配列が合成された２
   本鎖オリゴヌクレオチドを含有する特許請求の範囲第３
   項に記載のDNA造成物。
6. 【請求項６】前記合成された２本鎖オリゴヌクレオチド
   がファクターVIIのアミノ末端部分を実質上コードして
   いる特許請求の範囲第５項に記載のDNA造成物。
7. 【請求項７】哺乳類動物宿主細胞DNA中に取り込まれ得
   る組換プラスミドであって、プロモーター、該プロモー
   ターに続きその下流に、次のアミノ酸配列： を有するファクターVIIaの血液凝固のために生物学的活
   性を活性化後に有する蛋白質をコードするヌクレオチド
   配列、及びこれに続きその下流にポリアデニレーション
   シグナルを含有しているプラスミド。
8. 【請求項８】哺乳類動物宿主細胞DNA中に取り込まれ得
   る組換プラスミドであって、プロモーター、該プロモー
   ターに続きその下流に、次のアミノ酸配列： を有するファクターVIIaの血液凝固のための生物学的活
   性を活性化後に有する蛋白質をコードするヌクレオチド
   配列、及びこれに続きその下流にポリアデニレーション
   シグナルを含有しているプラスミドによりトランスフェ
   クトされた哺乳類細胞。