JP2561677B2 - プロテインｃの発現 - Google Patents
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
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- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
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- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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- Y10S435/849—Escherichia coli
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は一般に血漿蛋白質及びそれらをコードする
DNA配列に関し、そしてさらに詳しくはヒトプロテイン
Ｃ又は活性化されたヒトプロテインＣと実質的に同一の
構造及び／又は活性を有する蛋白質に関する。
DNA配列に関し、そしてさらに詳しくはヒトプロテイン
Ｃ又は活性化されたヒトプロテインＣと実質的に同一の
構造及び／又は活性を有する蛋白質に関する。
プロテインＣは、生体内での血液凝固及びフィブリン
溶解活性の発生において重要な役割を演ずるセリンプロ
テアーゼのチモーゲン又は前駆体である。このものは肝
臓中で単鎖ポリペプチドとして合成され、このポリペプ
チドはかなりのプロセシングを受けてジスルフィド結合
により一緒に保持された重鎖（Mr＝40,000）及び軽鎖
（Mr＝21,000）を含んで成る２本鎖分子となる。循環中
のこの２本鎖中間体は、重鎖のアミノ末端からの12残基
ペプチドのトロンビン介在開裂により“活性化されたプ
ロテインC"（APC）として知られる生物学的に活性な形
の分子に転換される。この開裂反応は生体内において内
皮細胞補因子であるトロンボモドゥリン（thrombomodul
in）により増強される（Esmon及びOwen,Proc.Nati.Aca
d.Sci.USA 78:2249−2252,1981）。
溶解活性の発生において重要な役割を演ずるセリンプロ
テアーゼのチモーゲン又は前駆体である。このものは肝
臓中で単鎖ポリペプチドとして合成され、このポリペプ
チドはかなりのプロセシングを受けてジスルフィド結合
により一緒に保持された重鎖（Mr＝40,000）及び軽鎖
（Mr＝21,000）を含んで成る２本鎖分子となる。循環中
のこの２本鎖中間体は、重鎖のアミノ末端からの12残基
ペプチドのトロンビン介在開裂により“活性化されたプ
ロテインC"（APC）として知られる生物学的に活性な形
の分子に転換される。この開裂反応は生体内において内
皮細胞補因子であるトロンボモドゥリン（thrombomodul
in）により増強される（Esmon及びOwen,Proc.Nati.Aca
d.Sci.USA 78:2249−2252,1981）。
プロテインＣは、それぞれグルタミン酸及びアスパラ
ギン酸残基の翻訳後修飾によって形成されるおよそ９残
基のβ−カルボキシグルタミン酸（Gla）及び１残基の
β−ヒドロキシアスパラギン酸を含有するビタミンＫ−
依存性の糖蛋白質である。プロテインＣ中の特定のγ−
カルボキシグルタミン酸残基の翻訳後形成はビタミンＫ
を必要とする。これらの異常アミノ酸残基はカルシウム
イオンに結合し、そしてプロテインＣの生物学的活性の
ために必要とされるリン脂質と該蛋白質との相互作用を
担当するものと信じられる。
ギン酸残基の翻訳後修飾によって形成されるおよそ９残
基のβ−カルボキシグルタミン酸（Gla）及び１残基の
β−ヒドロキシアスパラギン酸を含有するビタミンＫ−
依存性の糖蛋白質である。プロテインＣ中の特定のγ−
カルボキシグルタミン酸残基の翻訳後形成はビタミンＫ
を必要とする。これらの異常アミノ酸残基はカルシウム
イオンに結合し、そしてプロテインＣの生物学的活性の
ために必要とされるリン脂質と該蛋白質との相互作用を
担当するものと信じられる。
ファクターVII、ファクターIX及びファクターＸのご
とき他のビタミンＫ依存性血漿蛋白質の凝固促進作用と
は対照的に活性化されたプロテインＣは限定された蛋白
質分解によるファクターV a及びファクターVIII aの不
活性化を介して凝固過程の制御剤として機能する。プロ
テインＣによるファクターV a及びVIII aの不活性化は
酸性リン脂質及びカルシウムイオンの存在に依存する。
プロテインＳはAPCで触媒されるアクターV aの蛋白質分
解を促進することによりこの活性化を制御するものと報
告されている（Walker,J.Biol.Chem. 255:5521〜5524,19
80）。
とき他のビタミンＫ依存性血漿蛋白質の凝固促進作用と
は対照的に活性化されたプロテインＣは限定された蛋白
質分解によるファクターV a及びファクターVIII aの不
活性化を介して凝固過程の制御剤として機能する。プロ
テインＣによるファクターV a及びVIII aの不活性化は
酸性リン脂質及びカルシウムイオンの存在に依存する。
プロテインＳはAPCで触媒されるアクターV aの蛋白質分
解を促進することによりこの活性化を制御するものと報
告されている（Walker,J.Biol.Chem. 255:5521〜5524,19
80）。
プロテインＣはまた組織型プラスミノーゲン活性化因
子の作用と関連している（Kisiel及びFujkawa,Behring
Inst.Mitt．73:29−42,1983）。ウシAPCのイヌへの注入
によりプラスミノーゲン活性化因子の活性が上昇する
（Comp及びEsmon,J.Clin.Invest.，68,1221−1228,198
1）。最近の研究（Sakata等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A，82:1121−1125,1985）によれば、培養された内皮細
胞へのAPCの添加は、該細胞によるウロキナーゼ関連プ
ラスミノーゲン活性化因子及び組織型プラスミノーゲン
活性化因子の両者の活性の上昇を反映して、条件化培地
中でのフィブリン溶解活性の急速な投与量依存的上昇を
導く。APC処理はまた、抗活性化因子の活性の量依存的
低下をもたらす。
子の作用と関連している（Kisiel及びFujkawa,Behring
Inst.Mitt．73:29−42,1983）。ウシAPCのイヌへの注入
によりプラスミノーゲン活性化因子の活性が上昇する
（Comp及びEsmon,J.Clin.Invest.，68,1221−1228,198
1）。最近の研究（Sakata等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A，82:1121−1125,1985）によれば、培養された内皮細
胞へのAPCの添加は、該細胞によるウロキナーゼ関連プ
ラスミノーゲン活性化因子及び組織型プラスミノーゲン
活性化因子の両者の活性の上昇を反映して、条件化培地
中でのフィブリン溶解活性の急速な投与量依存的上昇を
導く。APC処理はまた、抗活性化因子の活性の量依存的
低下をもたらす。
プロテインＣ不足は再発血栓性疾患と関連し（Broekm
ans等，New Eng.J.Med．309:340−344,1983:及びSeligs
ohn等，New Eng.J.Ned．310:559−562,1984）、そして
遺伝的欠陥から、又は肝疾患もしくは外科手術のごとき
障害から生ずるであろう。この状態は一般に経口抗凝固
剤により治療される。プロテインＣを含有する正常血漿
の注入によっても有利な効果が得られている（Gardiner
及びGriffin,Prog,in Hematology,Brown,Grune及びStra
tton編、NY,13:265−278を参照のこと）。さらに、若干
の研究者は、プロテインＣの抗凝固活性が静脈血栓症の
ごとき血栓性疾患の治療において有用であることを見出
した（Smith等、PCT公開No.WO85/00521）。世界のあち
こちで16,000の個体中およそ１固体がプロテインＣ不足
状態にあると推測される。
ans等，New Eng.J.Med．309:340−344,1983:及びSeligs
ohn等，New Eng.J.Ned．310:559−562,1984）、そして
遺伝的欠陥から、又は肝疾患もしくは外科手術のごとき
障害から生ずるであろう。この状態は一般に経口抗凝固
剤により治療される。プロテインＣを含有する正常血漿
の注入によっても有利な効果が得られている（Gardiner
及びGriffin,Prog,in Hematology,Brown,Grune及びStra
tton編、NY,13:265−278を参照のこと）。さらに、若干
の研究者は、プロテインＣの抗凝固活性が静脈血栓症の
ごとき血栓性疾患の治療において有用であることを見出
した（Smith等、PCT公開No.WO85/00521）。世界のあち
こちで16,000の個体中およそ１固体がプロテインＣ不足
状態にあると推測される。
最後に、外来プロテインＣはグラム陰性敗血症の凝血
異状効果及び致死的効果を防止することが示された（Ta
ylor等、J.Clin.Invest．79:918−925,1987）。ヒヒを
用いた研究から得られたデーターは、プロテインＣが敗
血症に対する保護において自然の役割を演ずることを示
している。
異状効果及び致死的効果を防止することが示された（Ta
ylor等、J.Clin.Invest．79:918−925,1987）。ヒヒを
用いた研究から得られたデーターは、プロテインＣが敗
血症に対する保護において自然の役割を演ずることを示
している。
天然プロテインＣは凝固因子濃縮物から（Marlar等、
Blood 59:1067−1072）又は血漿から（Kisrel,前掲）
精製することができようが、出発材料の入手の可能性が
限定されていること、血漿中のプロテインＣ濃度が低い
こと等のため、この方法は複雑且つ高価である。さら
に、ヒトの血液に由来する生成物の療法的使用は、例え
ば肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、又は後天性免
疫不全症候群（AIDS）の病原体による病気の伝染の危険
性を伴う。血栓性疾患の治療におけるプロテインＣの臨
床的適用の観点から、有用量のプロテインＣ及び活性化
されたプロテインＣを製造することは明らかに価値ある
ことである。
Blood 59:1067−1072）又は血漿から（Kisrel,前掲）
精製することができようが、出発材料の入手の可能性が
限定されていること、血漿中のプロテインＣ濃度が低い
こと等のため、この方法は複雑且つ高価である。さら
に、ヒトの血液に由来する生成物の療法的使用は、例え
ば肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、又は後天性免
疫不全症候群（AIDS）の病原体による病気の伝染の危険
性を伴う。血栓性疾患の治療におけるプロテインＣの臨
床的適用の観点から、有用量のプロテインＣ及び活性化
されたプロテインＣを製造することは明らかに価値ある
ことである。
要約すれば、この発明はヒトプロテインＣ又は活性化
されたヒトプロテインＣと実質的に同一の構造及び／又
は生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を
開示する。この発明の１つの観点に従えば、このDNA配
列はさらに、軽鎖及び重鎖の開裂部位におけるアミノ酸
配列（R1）ｎ−R2−R3−R4（式中、R1,R2,R3及びR4はLy
s又はArgであり、そしてｎは1,2,又は３である）をコー
ドする。好ましい態様においては、開裂部位における前
記アミノ酸配列はArg−Arg−Lys−Argである。この発明
の他の態様においては、この蛋白質はAla,Ser,Thr又はG
lyのごとき非一酸性アミノ酸残基による残基158（Asp）
の置き換えを含む。関連する観点において、この蛋白質
はLys又はArgのごとき塩基性アミノ酸残基による残基15
4（His）の置き換えを含む。他の観点において、この蛋
白質はLys−Lys又はArg−Argによる天然プロテインＣの
残基156−157のLys−Argの置き換えを含む。
されたヒトプロテインＣと実質的に同一の構造及び／又
は生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を
開示する。この発明の１つの観点に従えば、このDNA配
列はさらに、軽鎖及び重鎖の開裂部位におけるアミノ酸
配列（R1）ｎ−R2−R3−R4（式中、R1,R2,R3及びR4はLy
s又はArgであり、そしてｎは1,2,又は３である）をコー
ドする。好ましい態様においては、開裂部位における前
記アミノ酸配列はArg−Arg−Lys−Argである。この発明
の他の態様においては、この蛋白質はAla,Ser,Thr又はG
lyのごとき非一酸性アミノ酸残基による残基158（Asp）
の置き換えを含む。関連する観点において、この蛋白質
はLys又はArgのごとき塩基性アミノ酸残基による残基15
4（His）の置き換えを含む。他の観点において、この蛋
白質はLys−Lys又はArg−Argによる天然プロテインＣの
残基156−157のLys−Argの置き換えを含む。
この発明の他の観点は、ヒトプロテインＣ又は活性化
されたヒトプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性
を有する蛋白質をコードし、さらにファクターVII、フ
ァクターIX、ファクターＸ、プロトロンビン又はプロテ
インＳのごとき蛋白質のプレープロペプチドをコードす
るDNA配列に向けられる。
されたヒトプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性
を有する蛋白質をコードし、さらにファクターVII、フ
ァクターIX、ファクターＸ、プロトロンビン又はプロテ
インＳのごとき蛋白質のプレープロペプチドをコードす
るDNA配列に向けられる。
さらに、この発明は哺乳類宿主細胞のDNA中に組み込
まれ得る発現ベクターを開示し、このベクターはプロモ
ーター、及びこれに続きこの下流に存在する、ヒトプロ
テインＣ又は活性化されたヒトプロテインＣと実質的に
同一な構造及び／又は活性を有する蛋白質をコードする
前記のごとくDNA配列を含有し、該ヌクレオチド配列の
転写は前記プロモーターにより指令される。このヌクレ
オチド配列に続くその下流にポリアデニレーションシグ
ナルが存在する。１つの態様においては、前記ヌクレオ
チド配列とポリアデニレーションシグナルとの間に選択
マーカーを含有し、該選択マーカーの転写が前記プロモ
ーターにより指令される。この発現ベクターまたは一組
のRNAスプライス部位も含むことができる。
まれ得る発現ベクターを開示し、このベクターはプロモ
ーター、及びこれに続きこの下流に存在する、ヒトプロ
テインＣ又は活性化されたヒトプロテインＣと実質的に
同一な構造及び／又は活性を有する蛋白質をコードする
前記のごとくDNA配列を含有し、該ヌクレオチド配列の
転写は前記プロモーターにより指令される。このヌクレ
オチド配列に続くその下流にポリアデニレーションシグ
ナルが存在する。１つの態様においては、前記ヌクレオ
チド配列とポリアデニレーションシグナルとの間に選択
マーカーを含有し、該選択マーカーの転写が前記プロモ
ーターにより指令される。この発現ベクターまたは一組
のRNAスプライス部位も含むことができる。
この発明の関連する観点は、活性化されたヒトプロテ
インＣと実質的に同一の生物学的活性を活性化後に有す
る蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳
類細胞を開示する。哺乳類宿主細胞DNAに組み込まれ得
る発現ベクターにより哺乳類細胞がトランスフェクトさ
れ、この発現ベクターはプロモーター及びその下流に続
く前記のDNA配列を含有する。１つの具体例において、
選択マーカーがさらに細胞に導入され、そして安定にト
ランスフェクトされた細胞が選択される。活性化された
ヒトプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を有す
る蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳
類細胞も開示される。この発明において使用するために
好ましい宿主細胞はCOS細胞、BHK細胞及び293細胞であ
る。
インＣと実質的に同一の生物学的活性を活性化後に有す
る蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳
類細胞を開示する。哺乳類宿主細胞DNAに組み込まれ得
る発現ベクターにより哺乳類細胞がトランスフェクトさ
れ、この発現ベクターはプロモーター及びその下流に続
く前記のDNA配列を含有する。１つの具体例において、
選択マーカーがさらに細胞に導入され、そして安定にト
ランスフェクトされた細胞が選択される。活性化された
ヒトプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を有す
る蛋白質を発現するためにトランスフェクトされた哺乳
類細胞も開示される。この発明において使用するために
好ましい宿主細胞はCOS細胞、BHK細胞及び293細胞であ
る。
この発明の他の観点は、活性化されたヒトプロテイン
Ｃと実質的に同一の生物学的活性を活性化後に有する蛋
白質の製造方法を開示する。この方法は、（ａ）ヒトプ
ロテインＣと実質的に同一の構造及び／又は活性を有す
る蛋白質をコードする前記のDNA配列を含んで成る発現
ベクターを哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳類
宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）前
記DNA配列にコードされておりそして前記哺乳類動物細
胞により生産された蛋白質生成物を単離する、ことを含
んで成る。この方法に従って製造される蛋白質生成物も
開示される。活性化されたヒトプロテインＣと実質的に
同一の構造及び／又は生物学的活性を有する蛋白質の製
造方法もまた開示される。
Ｃと実質的に同一の生物学的活性を活性化後に有する蛋
白質の製造方法を開示する。この方法は、（ａ）ヒトプ
ロテインＣと実質的に同一の構造及び／又は活性を有す
る蛋白質をコードする前記のDNA配列を含んで成る発現
ベクターを哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳類
宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）前
記DNA配列にコードされておりそして前記哺乳類動物細
胞により生産された蛋白質生成物を単離する、ことを含
んで成る。この方法に従って製造される蛋白質生成物も
開示される。活性化されたヒトプロテインＣと実質的に
同一の構造及び／又は生物学的活性を有する蛋白質の製
造方法もまた開示される。
この発明において記載される蛋白質は活性療法物質と
して使用され、この使用には血液凝固の制御における使
用が含まれる。さらに、これらの蛋白質は生理的に許容
されるキャリャー及び／又は稀釈剤と混合され、適当な
医薬組成物が提供される。
して使用され、この使用には血液凝固の制御における使
用が含まれる。さらに、これらの蛋白質は生理的に許容
されるキャリャー及び／又は稀釈剤と混合され、適当な
医薬組成物が提供される。
この発明の他の観点は以後の詳細な記載及び添付され
た図面により明らかになるであろう。
た図面により明らかになるであろう。
この発明を記載するに先立ち、これ以後に使用する若
干の用語の定義を記載することが発明の理解に役立つで
あろう。
干の用語の定義を記載することが発明の理解に役立つで
あろう。
生物学的活性 生物学的関連において（すなわち、生物体において、
又はインビトロでの模倣において）分子により行われる
１つの機能又は一組の機能。蛋白質の生物学的活性は触
媒的活性とエフェクター活性に分けられる。ビタミンＫ
依存性血漿蛋白質の触媒活性は一般に他の血漿蛋白質の
特異的蛋白質分解的開裂による該基質の活性化又は不活
性化を含む。エフェクター活性は、カルシウム、リン脂
質もしくは他の小分子、巨大分子、例えば蛋白質、又は
細胞への生物学的に活性な分子の特異的結合を含む。エ
フェクター活性はしばしば、生理的条件下で触媒活性を
増強するか、又はそのために必須である。
又はインビトロでの模倣において）分子により行われる
１つの機能又は一組の機能。蛋白質の生物学的活性は触
媒的活性とエフェクター活性に分けられる。ビタミンＫ
依存性血漿蛋白質の触媒活性は一般に他の血漿蛋白質の
特異的蛋白質分解的開裂による該基質の活性化又は不活
性化を含む。エフェクター活性は、カルシウム、リン脂
質もしくは他の小分子、巨大分子、例えば蛋白質、又は
細胞への生物学的に活性な分子の特異的結合を含む。エ
フェクター活性はしばしば、生理的条件下で触媒活性を
増強するか、又はそのために必須である。
プロテインＣについては、生物学的活性はその抗凝固
活性及びフィブリン溶解性により特徴付けられる。プロ
テインＣは活性化された場合、リン脂質及びカルシウム
の存在下でファクターV a及びファクターVIII aを不活
性化する。プロテインＳはこの機能の制御に関与するよ
うである。（Walker、前掲）。活性化されたプロテイン
Ｃはまたフィブリン溶解を増強し、この効果はプラスミ
ノーゲン活性化因子阻害剤のレベルの低下により介在さ
れると信じられる（van Hinsbergh等，Blood 65:444−
451,1985）。あとで詳細に記載するように、プロテイン
ＣのエクソンVII及びVIIIによりコードされているプロ
テインＣの部分がこの触媒活性を主として担当する。
活性及びフィブリン溶解性により特徴付けられる。プロ
テインＣは活性化された場合、リン脂質及びカルシウム
の存在下でファクターV a及びファクターVIII aを不活
性化する。プロテインＳはこの機能の制御に関与するよ
うである。（Walker、前掲）。活性化されたプロテイン
Ｃはまたフィブリン溶解を増強し、この効果はプラスミ
ノーゲン活性化因子阻害剤のレベルの低下により介在さ
れると信じられる（van Hinsbergh等，Blood 65:444−
451,1985）。あとで詳細に記載するように、プロテイン
ＣのエクソンVII及びVIIIによりコードされているプロ
テインＣの部分がこの触媒活性を主として担当する。
プレープロペプチド 幾つかの蛋白質のアミノ末端に存在し、そして一般に
トランスロケーションの際に蛋白質から開裂されるアミ
ノ酸配列。プレープロペプチドは蛋白質を細胞の分泌経
路に向ける配列（シグナル配列）を含み、そして疎水性
アミノ酸のコアーの存在により特徴付けられる。これら
はまたプロセシングシグナルを含有する。この明細書に
おいて使用する場合、「プレープロペプチド」なる語は
また天然プレープロペプチドの部分をも意味する。
トランスロケーションの際に蛋白質から開裂されるアミ
ノ酸配列。プレープロペプチドは蛋白質を細胞の分泌経
路に向ける配列（シグナル配列）を含み、そして疎水性
アミノ酸のコアーの存在により特徴付けられる。これら
はまたプロセシングシグナルを含有する。この明細書に
おいて使用する場合、「プレープロペプチド」なる語は
また天然プレープロペプチドの部分をも意味する。
発現ユニット 注目の蛋白質をコードする一次ヌクレオチド配列を、
該一次ヌクレオチド配列の転写を指令しそして調節する
他のヌクレオチド配列と共に含んで成るDNA造成物。発
現ユニットは少なくとも１個の一次ヌクレオチド配列、
並びに該一次ヌクレオチド配列の上流に位置しそしてそ
れに作用可能に連結されているプロモーター配列及び下
流に位置するポリアデニレーションシグナルから成る。
発現の効率を高めるために追加の遺伝子要素を含めるこ
ともできる。これらの要素にはエンハンサー配列、リー
ダー及びmRNAスプライス部位が含まれる。
該一次ヌクレオチド配列の転写を指令しそして調節する
他のヌクレオチド配列と共に含んで成るDNA造成物。発
現ユニットは少なくとも１個の一次ヌクレオチド配列、
並びに該一次ヌクレオチド配列の上流に位置しそしてそ
れに作用可能に連結されているプロモーター配列及び下
流に位置するポリアデニレーションシグナルから成る。
発現の効率を高めるために追加の遺伝子要素を含めるこ
ともできる。これらの要素にはエンハンサー配列、リー
ダー及びmRNAスプライス部位が含まれる。
発現ベクター 注目の蛋白質をコードするDNA配列を、プロモーター
及び該蛋白質の発現を促進する他の配列と共に含んでな
るDNA分子。発現ベクターはさらに、自律複製により又
は宿主のゲノムへの取り込みにより宿主細胞中での複製
をもたらす遺伝情報を含有する。組換DNAにおいて一般
に使用される発現ベクターの例としてプラスミド及び幾
つかのウイルスが挙げられるが、両者の要素を含むこと
もできる。これらはまた選択マーカーを含むことができ
る。
及び該蛋白質の発現を促進する他の配列と共に含んでな
るDNA分子。発現ベクターはさらに、自律複製により又
は宿主のゲノムへの取り込みにより宿主細胞中での複製
をもたらす遺伝情報を含有する。組換DNAにおいて一般
に使用される発現ベクターの例としてプラスミド及び幾
つかのウイルスが挙げられるが、両者の要素を含むこと
もできる。これらはまた選択マーカーを含むことができ
る。
前記のごとく、プロテインＣは肝臓で生産され、そし
てその生合成のためにビタミンＫを必要とする。ビタミ
ンＫは軽鎖のアミノ末端領域中の特定のγ−カルボキシ
グルタミン酸残基の形成のために必要である。これらの
アミノ酸残基は翻訳後修飾によって形成され、そしてリ
ン脂質へのカルシウム介在結合のために必要とされる。
さらに、プロテインＣは１個のβ−ヒドロキシアスパラ
ギン酸残基を含有し、このものもやはり翻訳後修飾によ
り形成される。しかしながら、このアミノ酸残基の役割
は知られていない。
てその生合成のためにビタミンＫを必要とする。ビタミ
ンＫは軽鎖のアミノ末端領域中の特定のγ−カルボキシ
グルタミン酸残基の形成のために必要である。これらの
アミノ酸残基は翻訳後修飾によって形成され、そしてリ
ン脂質へのカルシウム介在結合のために必要とされる。
さらに、プロテインＣは１個のβ−ヒドロキシアスパラ
ギン酸残基を含有し、このものもやはり翻訳後修飾によ
り形成される。しかしながら、このアミノ酸残基の役割
は知られていない。
プロテインＣの活性が特定のグルタミン酸残基のγ−
カルボキシル化を含む翻訳後修飾、及び２本鎖形への開
裂に依存し、そしてさらに特定のアスパラギン酸のヒド
ロキシル化に依存するとすれば、微生物でのプロテイン
Ｃのクローニング及び発現により活性な生成物を製造す
ることはできそうにない。
カルボキシル化を含む翻訳後修飾、及び２本鎖形への開
裂に依存し、そしてさらに特定のアスパラギン酸のヒド
ロキシル化に依存するとすれば、微生物でのプロテイン
Ｃのクローニング及び発現により活性な生成物を製造す
ることはできそうにない。
従って、この発明は、γ−カルボキシル化されており
活性化されたヒトプロテインＣの生物学的活性を活性化
後に有する蛋白質を、該蛋白質を安定に発現するように
トランクフェクトされた哺乳類細胞を用いて製造する方
法を提供する。
活性化されたヒトプロテインＣの生物学的活性を活性化
後に有する蛋白質を、該蛋白質を安定に発現するように
トランクフェクトされた哺乳類細胞を用いて製造する方
法を提供する。
この発明はさらに、γ−カルボキシル化されており、
そして活性化を必要とすることなく活性化されたヒトプ
ロテインＣの生物学的活性を有する蛋白質の製造方法を
提供する。
そして活性化を必要とすることなく活性化されたヒトプ
ロテインＣの生物学的活性を有する蛋白質の製造方法を
提供する。
ウシプロテインＣの軽鎖及び重鎖が配列決定されてい
る（Fernlund及びStenflo,J,Biol.Chem.257:12170−121
79,1982;並びにStenflo及びFernlund,J.Biol.Chem.257:
12180−12190,1982）。ヒトプロテインＣの単離及び特
徴付けがKisiel,J.Clin.Invest. 64:761−769,1979によ
り記載されている。ヒト及びウシの両者の酵素の抗凝固
活性は高度に種特異的であることが見出された。種特異
性はプロテインＳにより介在されると信じられる（Walk
er,Thromb.Res. 22:321−327,1981）。しかしながら、ヒ
ト及びウシの蛋白質は相互に、そしてプロトロンビン、
ファクターVII、ファクターIX及びファクターＸを含む
他のビタミンＫ−依存性血漿蛋白質と、かなりの全体的
構造相同性を示す。類似点は軽鎖中のGla残基の存在及
び重鎖中の活性部位セリンの存在、並びに軽鎖のアミノ
末端領域の他のアミノ酸配列の相同性を含む。
る（Fernlund及びStenflo,J,Biol.Chem.257:12170−121
79,1982;並びにStenflo及びFernlund,J.Biol.Chem.257:
12180−12190,1982）。ヒトプロテインＣの単離及び特
徴付けがKisiel,J.Clin.Invest. 64:761−769,1979によ
り記載されている。ヒト及びウシの両者の酵素の抗凝固
活性は高度に種特異的であることが見出された。種特異
性はプロテインＳにより介在されると信じられる（Walk
er,Thromb.Res. 22:321−327,1981）。しかしながら、ヒ
ト及びウシの蛋白質は相互に、そしてプロトロンビン、
ファクターVII、ファクターIX及びファクターＸを含む
他のビタミンＫ−依存性血漿蛋白質と、かなりの全体的
構造相同性を示す。類似点は軽鎖中のGla残基の存在及
び重鎖中の活性部位セリンの存在、並びに軽鎖のアミノ
末端領域の他のアミノ酸配列の相同性を含む。
この発明においては、ヒト肝mRNAからλgt11cDNAライ
ブラリーを調製した。次にこのライブラリーをヒトプロ
テインＣに対する125I−ラベル化抗体によりスクリーニ
ングした。抗体反応性クローンはさらに、λgt11ベクタ
ーにおけるβ−ガラクトシダーゼ及びプロテインＣの融
合蛋白質の合成について分析された。
ブラリーを調製した。次にこのライブラリーをヒトプロ
テインＣに対する125I−ラベル化抗体によりスクリーニ
ングした。抗体反応性クローンはさらに、λgt11ベクタ
ーにおけるβ−ガラクトシダーゼ及びプロテインＣの融
合蛋白質の合成について分析された。
クローンの１つが抗体プローブによる強いシグナルを
与え、そして約1400bpの挿入部を含有することが見出さ
れた。DNA挿入部のDNA配列分子は、Fernlund及びStenfl
o（J.Biol.Chem．257:12170−12179;並びにJ.Biol.Che
m．257:12180−12190）により決定されたウシプロテイ
ンＣの多くの部分と高度の相同性を示す推定アミノ酸配
列を示した。
与え、そして約1400bpの挿入部を含有することが見出さ
れた。DNA挿入部のDNA配列分子は、Fernlund及びStenfl
o（J.Biol.Chem．257:12170−12179;並びにJ.Biol.Che
m．257:12180−12190）により決定されたウシプロテイ
ンＣの多くの部分と高度の相同性を示す推定アミノ酸配
列を示した。
このDNA挿入部は、軽鎖のアミノ酸64から始まり、完
全な重鎖コード領域を含みそして終止コドンに至るプロ
テインＣのためのコード領域の大部分を含んでいた。さ
らに、重鎖の終止コドンに続き294塩基対の３′非コー
ド配列及び９塩基対のポリ（Ａ）テイルが存在した。プ
ロセシング又はポリアデニレーションシグナルＡ−Ａ−
Ｔ−Ａ−Ａ−ＡはこのcDNA挿入部のポリ（Ａ）テイルか
ら13塩基対上流に存在した。この配列は２個の可能性あ
るポリアデニレーション部位の１つであった。
全な重鎖コード領域を含みそして終止コドンに至るプロ
テインＣのためのコード領域の大部分を含んでいた。さ
らに、重鎖の終止コドンに続き294塩基対の３′非コー
ド配列及び９塩基対のポリ（Ａ）テイルが存在した。プ
ロセシング又はポリアデニレーションシグナルＡ−Ａ−
Ｔ−Ａ−Ａ−ＡはこのcDNA挿入部のポリ（Ａ）テイルか
ら13塩基対上流に存在した。この配列は２個の可能性あ
るポリアデニレーション部位の１つであった。
このcDNA配列はまた位置156−157（アミノ酸の番号は
第２図に示されている）のジペプチドLys−Argをコード
し、このジペプチドは軽鎖を重鎖から分離し、そしてプ
ロセシングの過程で蛋白質分解的開裂により除去され、
二本鎖分子の分泌をもたらす。トロンビンによる二本鎖
分子の活性化の後、ヒトプロテインＣの重鎖はアルギニ
ン169及びロイシン170の間で開裂し、活性化ペプチド
（第２図）を放出する。
第２図に示されている）のジペプチドLys−Argをコード
し、このジペプチドは軽鎖を重鎖から分離し、そしてプ
ロセシングの過程で蛋白質分解的開裂により除去され、
二本鎖分子の分泌をもたらす。トロンビンによる二本鎖
分子の活性化の後、ヒトプロテインＣの重鎖はアルギニ
ン169及びロイシン170の間で開裂し、活性化ペプチド
（第２図）を放出する。
類似の方法により、プレープロペプチド及びプロテイ
ンＣの最初の23アミノ酸のコード配列を欠く第二のcDNA
が単離された。このcDNAをハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いてコード配列の残りの部分をλシャロン
4A中ヒトゲノムDNAライブラリー（Foster等、Proc.Nat
l.Acad.Sci USA 82:4673−4677,1985）から得た。プロ
テインＣ遺伝子のオーバーラップする挿入部を含有する
これらの異るλシャロン4Aファージを単離した。
ンＣの最初の23アミノ酸のコード配列を欠く第二のcDNA
が単離された。このcDNAをハイブリダイゼーションプロ
ーブとして用いてコード配列の残りの部分をλシャロン
4A中ヒトゲノムDNAライブラリー（Foster等、Proc.Nat
l.Acad.Sci USA 82:4673−4677,1985）から得た。プロ
テインＣ遺伝子のオーバーラップする挿入部を含有する
これらの異るλシャロン4Aファージを単離した。
３個のファージクローン上のエクソンの位置が、これ
らのクローンの消化物と上記の1400bd cDNAから作られ
たプローグとのサザンハイブリダイゼーションにより決
定された。これらのクローン中のゲノムDNA挿入部を、
１回又は２回の制限酵素消化及びこれに続くアガロース
ゲル電気泳動、サザンブロッティング、並びにヒトプロ
テインＣのcDNAに由来する放射能ラベルされた５′プロ
ーブ及び３′プローブへのハイブリダイゼーションによ
り、第３図に示すようにマップした。
らのクローンの消化物と上記の1400bd cDNAから作られ
たプローグとのサザンハイブリダイゼーションにより決
定された。これらのクローン中のゲノムDNA挿入部を、
１回又は２回の制限酵素消化及びこれに続くアガロース
ゲル電気泳動、サザンブロッティング、並びにヒトプロ
テインＣのcDNAに由来する放射能ラベルされた５′プロ
ーブ及び３′プローブへのハイブリダイゼーションによ
り、第３図に示すようにマップした。
DNA配列決定研究はジデオキシ・チエイン−ターミネ
ーション法を用いて行った。第４図に示すように、ヒト
プロテインＣの遺伝子のヌクレオチド配列はおよそ11kb
のDNAにわたる。これらの研究はさらに42アミノ酸の可
能性あるプレープロペプチドを示した。このプレープロ
配列は位置−25のGly残基の後でジグナルペプチダーゼ
により開裂される。成熟蛋白質へのプロセシングは、残
基−１の後の追加の蛋白質分解的開裂によるアミノ末端
プロペプチドの除去、並びに残基155及び157における開
裂による、軽鎖と重鎖を連結するLys−Argジペプチドの
除去を含む。この最後のプロセシングが155アミノ酸の
軽鎖及び262アミノ酸の重鎖をもたらす。
ーション法を用いて行った。第４図に示すように、ヒト
プロテインＣの遺伝子のヌクレオチド配列はおよそ11kb
のDNAにわたる。これらの研究はさらに42アミノ酸の可
能性あるプレープロペプチドを示した。このプレープロ
配列は位置−25のGly残基の後でジグナルペプチダーゼ
により開裂される。成熟蛋白質へのプロセシングは、残
基−１の後の追加の蛋白質分解的開裂によるアミノ末端
プロペプチドの除去、並びに残基155及び157における開
裂による、軽鎖と重鎖を連結するLys−Argジペプチドの
除去を含む。この最後のプロセシングが155アミノ酸の
軽鎖及び262アミノ酸の重鎖をもたらす。
プロテインＣ遺伝子は25〜885ヌクレオチドのサイズ
の８個のエクソン、及び92〜2668ヌクレオチドのサイズ
の７個のイントロンから成る。エクソンＩ及びエソクン
IIの一部分がプレープロペプチドの42アミノ酸をコード
する。エクソンIIの残りの部分、エクソンIII、エクソ
ンIV、エクソンＶ、及びエクソンVIの一部分がプロテイ
ンＣの軽鎖をコードする。エクソンVIの残りの部分、エ
クソンVII、及びエクソンVIIIがプロテインＣの重鎖を
コードする。ヒトプロテインＣをコードするcDNAのDNA
配列及びアミノ酸配列を第２図に示す。
の８個のエクソン、及び92〜2668ヌクレオチドのサイズ
の７個のイントロンから成る。エクソンＩ及びエソクン
IIの一部分がプレープロペプチドの42アミノ酸をコード
する。エクソンIIの残りの部分、エクソンIII、エクソ
ンIV、エクソンＶ、及びエクソンVIの一部分がプロテイ
ンＣの軽鎖をコードする。エクソンVIの残りの部分、エ
クソンVII、及びエクソンVIIIがプロテインＣの重鎖を
コードする。ヒトプロテインＣをコードするcDNAのDNA
配列及びアミノ酸配列を第２図に示す。
プロテインＣの遺伝子のイントロンは主として、種々
の機能的ドメインの間に位置する。エクソンIIはペレー
プロペプチドの高度に保存された領域及びλ−カルボキ
シグルタミン酸（Gla）ドメインを含む。エクソンIIIは
Glaと増殖因子ドメインを結ぶ８個のアミノ酸を含む。
エクソンIV及びＶはそれぞれ可能性ある増殖因子ドメイ
ンを示し、他方エクソンVIを活性化ペプチドを含む連結
領域をカバーする。エクソンVII及びVIIIはすべてのセ
リンプロテアーゼに典型的な触媒的ドメインをカバーす
る。
の機能的ドメインの間に位置する。エクソンIIはペレー
プロペプチドの高度に保存された領域及びλ−カルボキ
シグルタミン酸（Gla）ドメインを含む。エクソンIIIは
Glaと増殖因子ドメインを結ぶ８個のアミノ酸を含む。
エクソンIV及びＶはそれぞれ可能性ある増殖因子ドメイ
ンを示し、他方エクソンVIを活性化ペプチドを含む連結
領域をカバーする。エクソンVII及びVIIIはすべてのセ
リンプロテアーゼに典型的な触媒的ドメインをカバーす
る。
ヒトプレープロテインＣのアミノ酸配列及び提案され
た構造を第５図に示す。プロテインＣが、軽鎖及び重鎖
を結ぶLys−Argジペプチドを伴わないで示されている。
７個のイントロン（Ａ〜Ｇ）の位置が実線で示されてい
る。既知の蛋白質分解的開裂部位を挟むアミノ酸が円で
囲んである。軽鎖中の第一アミノ酸、活性化ペプチド及
び重鎖が１番から始まる。この番号は第２図及び第４図
中に示される番号とは異る。
た構造を第５図に示す。プロテインＣが、軽鎖及び重鎖
を結ぶLys−Argジペプチドを伴わないで示されている。
７個のイントロン（Ａ〜Ｇ）の位置が実線で示されてい
る。既知の蛋白質分解的開裂部位を挟むアミノ酸が円で
囲んである。軽鎖中の第一アミノ酸、活性化ペプチド及
び重鎖が１番から始まる。この番号は第２図及び第４図
中に示される番号とは異る。
炭水化物付加部位は軽鎖中の残基97、並びに重鎖中の
残基79、144及び160に位置する。この番号は第５図によ
るものである。炭水化物成分はAsnに共有結合される。
多くの場合、炭水化物付加環境はAsn−Ｘ−Ser又はAsn
−Ｘ−Thr（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）により
表わすことができる。
残基79、144及び160に位置する。この番号は第５図によ
るものである。炭水化物成分はAsnに共有結合される。
多くの場合、炭水化物付加環境はAsn−Ｘ−Ser又はAsn
−Ｘ−Thr（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）により
表わすことができる。
前記のごとく、プロテインＣは凝固過程において制御
的役割を演ずる。エクソンVII及びVIIIによりコードさ
れる触媒ドメインは幾つかの血漿蛋白質（例えばファク
ターV a及びVIII a）を特異的に開裂せしめることによ
りこれらを不活性化するセリンプロテアーゼ活性を有す
る。この選択的蛋白質分解の結果として、プロテインＣ
は抗−凝固活性及びフィブリン溶解活性を示す。
的役割を演ずる。エクソンVII及びVIIIによりコードさ
れる触媒ドメインは幾つかの血漿蛋白質（例えばファク
ターV a及びVIII a）を特異的に開裂せしめることによ
りこれらを不活性化するセリンプロテアーゼ活性を有す
る。この選択的蛋白質分解の結果として、プロテインＣ
は抗−凝固活性及びフィブリン溶解活性を示す。
ゲノムクローン中に介在配列が存在するため、許容さ
れる発現ユニットを造成するためには単にゲノム配列と
cDNA配列とを連結して完全なコード配列を得るだけでは
十分でない。従って、発現ユニットの造成のためにゲノ
ムクローンを使用する場合、後でさらに詳細に記載する
理由により、これらの介在配列を除去することが必要で
ある。
れる発現ユニットを造成するためには単にゲノム配列と
cDNA配列とを連結して完全なコード配列を得るだけでは
十分でない。従って、発現ユニットの造成のためにゲノ
ムクローンを使用する場合、後でさらに詳細に記載する
理由により、これらの介在配列を除去することが必要で
ある。
５′コード領域はまた他の方法で得ることができ、そ
して介在配列を除去する必要性が排除される。既存のcD
NA又はゲノムクローン由来のプローブを用いて、追加の
ライブラリーから５′コード領域を得ることができる。
この方法により十分な長さのcDNAが得られた。さらに、
ビタミンＫ依存性血漿蛋白質のアミノ末端部分はそれら
のそれぞれのカルシウム結合活性を担当する。この機能
的相同性の結果として、これらの分子のカルシウム結合
ドメインは交換可能であり、そしてなお生ずる分子の触
媒ドメインに特異的な活性を維持することが見出され
た。例えば、1985年４月17日に出願された米国特許出願
No.724,311明細書に記載されており、そしてヨーロッパ
出願No,200,421として公開されているように、ファクタ
ーIXのアミノ末端部分（カルシウム結合ドメイン）をア
ミノ酸38においてファクターVIIに連結してファクターV
IIの活性を有する蛋白質を生成せしめることができる。
ファクターVII、ファクターIX、ファクターＸ、プロト
ロンビン及びプロテインＳは、このアミノ末端配列のプ
ロテインＣとの相同性を共有する。従って、これらの蛋
白質のいずれかの遺伝子の５′コード領域を含んで成る
コード配列をプロテインＣ遺伝子の対応する配列の代り
に使用することができよう。さらに、幾つかのビタミン
Ｋ依存性血漿蛋白質の既知のアミノ酸配列に基いて、又
はこの明細書に開示するプロテインＣの配列に基いて適
当なコード配列を合成することができる。合成ヌクレオ
チド配列を製造する方法は当業界においてよく知られて
いる。例えば、一組のオーバーラップするオリゴヌクレ
オチドを合成し、そしてアニールして対になりオーバー
ラップする接着末端を有する二本鎖断片を得ることがで
きる。次に、これらの断片を制限断片と同様にして連結
する。次に、得られる合成断片を便利な制限部位におい
てcDNAに連結する。連結配列は、必要であれば、オリゴ
ヌクレオチド指令変異誘発により変形することができ
る。
して介在配列を除去する必要性が排除される。既存のcD
NA又はゲノムクローン由来のプローブを用いて、追加の
ライブラリーから５′コード領域を得ることができる。
この方法により十分な長さのcDNAが得られた。さらに、
ビタミンＫ依存性血漿蛋白質のアミノ末端部分はそれら
のそれぞれのカルシウム結合活性を担当する。この機能
的相同性の結果として、これらの分子のカルシウム結合
ドメインは交換可能であり、そしてなお生ずる分子の触
媒ドメインに特異的な活性を維持することが見出され
た。例えば、1985年４月17日に出願された米国特許出願
No.724,311明細書に記載されており、そしてヨーロッパ
出願No,200,421として公開されているように、ファクタ
ーIXのアミノ末端部分（カルシウム結合ドメイン）をア
ミノ酸38においてファクターVIIに連結してファクターV
IIの活性を有する蛋白質を生成せしめることができる。
ファクターVII、ファクターIX、ファクターＸ、プロト
ロンビン及びプロテインＳは、このアミノ末端配列のプ
ロテインＣとの相同性を共有する。従って、これらの蛋
白質のいずれかの遺伝子の５′コード領域を含んで成る
コード配列をプロテインＣ遺伝子の対応する配列の代り
に使用することができよう。さらに、幾つかのビタミン
Ｋ依存性血漿蛋白質の既知のアミノ酸配列に基いて、又
はこの明細書に開示するプロテインＣの配列に基いて適
当なコード配列を合成することができる。合成ヌクレオ
チド配列を製造する方法は当業界においてよく知られて
いる。例えば、一組のオーバーラップするオリゴヌクレ
オチドを合成し、そしてアニールして対になりオーバー
ラップする接着末端を有する二本鎖断片を得ることがで
きる。次に、これらの断片を制限断片と同様にして連結
する。次に、得られる合成断片を便利な制限部位におい
てcDNAに連結する。連結配列は、必要であれば、オリゴ
ヌクレオチド指令変異誘発により変形することができ
る。
完全なコード配列を代表する複数のクローンが得られ
ており、必要であれば、適当な領域を連結して所望のコ
ード配列を生じさせることができる。１又は複数のライ
ブラリーから得られた複数の断片を適当な制限エンドヌ
クレアーゼで切断し、そして適切な方向に酸素的に連結
する。断片及び選択される適当な制限エンドヌクレアー
ゼに依存して、欠失変異の“プールアウド”法により、
又は制限酵素開裂と変異誘発との組合わせにより、不所
望のDNA配列を除去することが必要である。このように
して得られた配列は、好ましくは連続するオープンリー
ディングフレームの形であるべきである。すなわち、高
等真核性遺伝子中に一般に存在する介在配列（イントロ
ン）を欠いているべきである。クローン化された遺伝子
中のイントロンの存在は、遺伝子配列が哺乳類宿主細胞
を導入された場合に、メッセンジャーRNAの異状なスプ
ライシング及び／又は遺伝子発現の効果低下、又は増幅
の不安定化を導くであろう。この明に従って生成される
プロテインＣの適当なプロセシング及び分泌を促進する
ために、このコード配列がさらにプレープロペプチドを
コードすることが好ましい。プレープロペプチドはプロ
テインＣのそれでもよく、又はファクターIX、ファクタ
ーVIIもしくはプロトロンビンのごとき他の分泌される
蛋白質のそれでもよい。
ており、必要であれば、適当な領域を連結して所望のコ
ード配列を生じさせることができる。１又は複数のライ
ブラリーから得られた複数の断片を適当な制限エンドヌ
クレアーゼで切断し、そして適切な方向に酸素的に連結
する。断片及び選択される適当な制限エンドヌクレアー
ゼに依存して、欠失変異の“プールアウド”法により、
又は制限酵素開裂と変異誘発との組合わせにより、不所
望のDNA配列を除去することが必要である。このように
して得られた配列は、好ましくは連続するオープンリー
ディングフレームの形であるべきである。すなわち、高
等真核性遺伝子中に一般に存在する介在配列（イントロ
ン）を欠いているべきである。クローン化された遺伝子
中のイントロンの存在は、遺伝子配列が哺乳類宿主細胞
を導入された場合に、メッセンジャーRNAの異状なスプ
ライシング及び／又は遺伝子発現の効果低下、又は増幅
の不安定化を導くであろう。この明に従って生成される
プロテインＣの適当なプロセシング及び分泌を促進する
ために、このコード配列がさらにプレープロペプチドを
コードすることが好ましい。プレープロペプチドはプロ
テインＣのそれでもよく、又はファクターIX、ファクタ
ーVIIもしくはプロトロンビンのごとき他の分泌される
蛋白質のそれでもよい。
幾つかの場合、活性化されたプロテインＣを直接生産
し、これによって蛋白質生成物をインビトロ又はインビ
ボにおいて活性化する必要性を排除することが望ましい
であろう。プロテインＣの成熟及び活性化に関与する開
裂部位は知られている（Foster及びDavie、前掲）。オ
リゴヌクレチド指令欠失変異誘発により活性化ペプチド
コードする領域を除去することにより、APCをコードす
る配列を造成することができる。次に、こうして得られ
る蛋白質は、宿主細胞の分泌経路での正常の蛋白質分解
的プロセシングの間のLys−Argジペプチドの除去により
活性化されるであろう。活性化ペプチドを欠く蛋白質は
それにもかかわらず宿主細胞により適切にプロセシング
され、活性化されたプロテインＣの分泌がもたらされる
ことが見出された。
し、これによって蛋白質生成物をインビトロ又はインビ
ボにおいて活性化する必要性を排除することが望ましい
であろう。プロテインＣの成熟及び活性化に関与する開
裂部位は知られている（Foster及びDavie、前掲）。オ
リゴヌクレチド指令欠失変異誘発により活性化ペプチド
コードする領域を除去することにより、APCをコードす
る配列を造成することができる。次に、こうして得られ
る蛋白質は、宿主細胞の分泌経路での正常の蛋白質分解
的プロセシングの間のLys−Argジペプチドの除去により
活性化されるであろう。活性化ペプチドを欠く蛋白質は
それにもかかわらず宿主細胞により適切にプロセシング
され、活性化されたプロテインＣの分泌がもたらされる
ことが見出された。
組換プロテインＣのその二本鎖形への成熟に関与する
蛋白質分解的プロセシングを増強するため、プロセシン
グ部位周辺のアミノ酸配列を変更することが望ましいで
あろう。この様な変更がトランスフェクトされた細胞中
での組換プロテインＣの適切なプロセシングを促進する
ことが見出された。
蛋白質分解的プロセシングを増強するため、プロセシン
グ部位周辺のアミノ酸配列を変更することが望ましいで
あろう。この様な変更がトランスフェクトされた細胞中
での組換プロテインＣの適切なプロセシングを促進する
ことが見出された。
単鎖プロテインＣが血流中で活性化されることが知ら
れていないので、効果的な開裂が蛋白質の比活性を上昇
せしめるであろう。すでに記載したように、この成熟過
程はジペプチドLys−Arg（アミノ酸156−157）の除去を
含む（Foster及びDavie,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 81:4
766−4770,1984）。このプロセシング部位の近傍におけ
るアミノ酸配列の変更はアミノ酸置換及び／又は挿入を
含む。変更の１つのこの様な群は、配列（R1）ｎ−R2−
R3−R4（式中、R1,R2,R3及びR4はLys又はArgであり、そ
してｎは0,1,2又は３である）を天然のLys−Argジペプ
チドの代りに含有するようにアミノ酸配列を変更するこ
とである。この群の特に好ましい変更は配列Arg−Arg−
Lys−Argである。この配列は、トランスフェクトされた
BHK細胞中で組換プロテインＣのプロセシングを約５倍
増強することが見出された。変更の第２の群は、天然プ
ロテインＣのアミノ酸残基154（His）を塩基性アミノ酸
残基（すなわち、Lys又はArg）で置き換えて一般式R1−
Ｘ−R2−R3（式中、R1,R2及びR3はLys又はArgであり、
そしてＸはLys又はArg以外のアミノ酸、好ましくはLeu
である）のプロセシング部位配列を得ることを含む。変
更の第三群は、158位のAsp残基を非−酸性アミノ酸残基
で置き換えることを含む。小さい中性アミノ酸、例えば
Ala,Ser,Tyr又はGlyを使用するのが好ましい。変更の第
四群は天然プロテインＣのLys−ArgをLys−Lys又はArg
−Argにより置き換えることを含む。変更のこれらの群
の組合わせを行うこともできる。例えば、配列（R1）ｎ
−R2−R3−R4を有するプロセシング部位を含有するプロ
テインＣ分子中でアミノ酸158を置き変えることができ
る。これらの置き換えは野性形プロテインＣ又は活性化
されたプロテインＣの製造において使用することができ
る。
れていないので、効果的な開裂が蛋白質の比活性を上昇
せしめるであろう。すでに記載したように、この成熟過
程はジペプチドLys−Arg（アミノ酸156−157）の除去を
含む（Foster及びDavie,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 81:4
766−4770,1984）。このプロセシング部位の近傍におけ
るアミノ酸配列の変更はアミノ酸置換及び／又は挿入を
含む。変更の１つのこの様な群は、配列（R1）ｎ−R2−
R3−R4（式中、R1,R2,R3及びR4はLys又はArgであり、そ
してｎは0,1,2又は３である）を天然のLys−Argジペプ
チドの代りに含有するようにアミノ酸配列を変更するこ
とである。この群の特に好ましい変更は配列Arg−Arg−
Lys−Argである。この配列は、トランスフェクトされた
BHK細胞中で組換プロテインＣのプロセシングを約５倍
増強することが見出された。変更の第２の群は、天然プ
ロテインＣのアミノ酸残基154（His）を塩基性アミノ酸
残基（すなわち、Lys又はArg）で置き換えて一般式R1−
Ｘ−R2−R3（式中、R1,R2及びR3はLys又はArgであり、
そしてＸはLys又はArg以外のアミノ酸、好ましくはLeu
である）のプロセシング部位配列を得ることを含む。変
更の第三群は、158位のAsp残基を非−酸性アミノ酸残基
で置き換えることを含む。小さい中性アミノ酸、例えば
Ala,Ser,Tyr又はGlyを使用するのが好ましい。変更の第
四群は天然プロテインＣのLys−ArgをLys−Lys又はArg
−Argにより置き換えることを含む。変更のこれらの群
の組合わせを行うこともできる。例えば、配列（R1）ｎ
−R2−R3−R4を有するプロセシング部位を含有するプロ
テインＣ分子中でアミノ酸158を置き変えることができ
る。これらの置き換えは野性形プロテインＣ又は活性化
されたプロテインＣの製造において使用することができ
る。
プロテインＣ又は活性化されたプロテインＣのための
コード配列を、次に適当な発現ベクターに挿入し、今度
はこのベクターを用いて哺乳類セルラインをトランスフ
ェクトする。この発明を実施するための発現ベクターは
哺乳類細胞に導入された外来遺伝子の転写を指令するこ
とができるプロモーターを含むであろう。転写を指令す
る場合の効率のためウイルスプロモーターが好ましい。
特に好ましいプロモーターはアデノウイルス２からの主
要後期プロモーターである。この様な発現ベクターはま
た、好ましくは、プロモーターの下流であってプロテイ
ンＣ配列の挿入のための部位の上流に、又はプロテイン
Ｃ配列自体の中に位置する一セットのRNAスプライス部
位を含有するであろう。好ましいRNAスプライス部位は
アデノウイルス遺伝子及び／又は免疫グロブリン遺伝子
から得ることができる。挿入部位の下流に位置するポリ
アデニレーションシグナルも発現ベクター中に含まれ
る。ウイルスポリアデニレーションシグナル、例えばSV
40からの初期もしくは後期ポリアデニレーションシグナ
ル、又はアデノウイルス5EIb領域からのポリアデニレー
ションシグナルが特に好ましい。特に好ましい態様にお
いては、発現ベクターはさらに非コードウイルスリーダ
ー配列、例えばアデノウイルス２三分節（tripartite）
リーダーを、プロモーター及びRNAスプライス部位の間
に含む。好ましいベクターはさらにエンハンサー配列、
例えばSV40エンハンサー配列及びアデノウイルスVA RNA
をコードする配列を含有することができる。
コード配列を、次に適当な発現ベクターに挿入し、今度
はこのベクターを用いて哺乳類セルラインをトランスフ
ェクトする。この発明を実施するための発現ベクターは
哺乳類細胞に導入された外来遺伝子の転写を指令するこ
とができるプロモーターを含むであろう。転写を指令す
る場合の効率のためウイルスプロモーターが好ましい。
特に好ましいプロモーターはアデノウイルス２からの主
要後期プロモーターである。この様な発現ベクターはま
た、好ましくは、プロモーターの下流であってプロテイ
ンＣ配列の挿入のための部位の上流に、又はプロテイン
Ｃ配列自体の中に位置する一セットのRNAスプライス部
位を含有するであろう。好ましいRNAスプライス部位は
アデノウイルス遺伝子及び／又は免疫グロブリン遺伝子
から得ることができる。挿入部位の下流に位置するポリ
アデニレーションシグナルも発現ベクター中に含まれ
る。ウイルスポリアデニレーションシグナル、例えばSV
40からの初期もしくは後期ポリアデニレーションシグナ
ル、又はアデノウイルス5EIb領域からのポリアデニレー
ションシグナルが特に好ましい。特に好ましい態様にお
いては、発現ベクターはさらに非コードウイルスリーダ
ー配列、例えばアデノウイルス２三分節（tripartite）
リーダーを、プロモーター及びRNAスプライス部位の間
に含む。好ましいベクターはさらにエンハンサー配列、
例えばSV40エンハンサー配列及びアデノウイルスVA RNA
をコードする配列を含有することができる。
次に、クローン化された遺伝子配列を、例えばリン酸
カルシウム介在トランスフェクション（Wigler等，Cell
14:725,1978;Corsaro及びPearson,Somatic Cell Gene
tics7:603,1981;Giaham及びVan der Eb,Virology52:45
6,1973）により、培養された哺乳類細胞に導入する。DN
A及びリン酸カルシウムから沈澱を生成せしめ、そして
この沈澱を細胞に適用する。細胞の幾らかがDNAを取り
込み、そしてそれを数日間細胞内に保持する。これらの
細胞の小部分（典型的には10-4）がDNAをゲノムに組み
込む。これら組み込み体（integrant）を固定するた
め、選択表現型を支える遺伝子（選択マーカー）を注目
の遺伝子と共に細胞中に導入するのが一般的である。好
ましい選択マーカーは、薬剤、例えばネオマイシン、ハ
イグロマイシン、及びメトトレキセートに対する耐性を
付与する遺伝子を包含する。選択マーカーは注目の遺伝
子と同時に別個のプラスミド上で細胞に導入することが
でき、あるいはそれらは同一のプラスミド上で導入する
ことができる。同一のプラスミド上では選択マーカー及
び注目の遺伝子は異るプロモーター又は同一のプロモー
ターの制御のもとにあることができる。１つの態様にお
いては、両者の配列が同一のプロモーターにより制御さ
れるように選択マーカーがプロテインＣコード配列と同
じプラスミド上に置かれ、これはジシストロンメッセー
ジとして知られる配置である。このタイプの造成物は従
来技術において知られている（例えば、ヨーロッパ出願
公開No.117,058）。細胞に導入される混合物に“キャリ
ャーDNA"として知られる追加のDNAを加えることも有利
である。細胞がDNAを取り込んだ後、これらを一定時
間、典型的には１〜２日間増殖せしめて注目の遺伝子の
発現を開始せしめる。次に、薬剤選択を適用して適切に
選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択を
行う。この様な細胞のクローンをプロテインＣの発現に
ついてスクリーニングすることができる。
カルシウム介在トランスフェクション（Wigler等，Cell
14:725,1978;Corsaro及びPearson,Somatic Cell Gene
tics7:603,1981;Giaham及びVan der Eb,Virology52:45
6,1973）により、培養された哺乳類細胞に導入する。DN
A及びリン酸カルシウムから沈澱を生成せしめ、そして
この沈澱を細胞に適用する。細胞の幾らかがDNAを取り
込み、そしてそれを数日間細胞内に保持する。これらの
細胞の小部分（典型的には10-4）がDNAをゲノムに組み
込む。これら組み込み体（integrant）を固定するた
め、選択表現型を支える遺伝子（選択マーカー）を注目
の遺伝子と共に細胞中に導入するのが一般的である。好
ましい選択マーカーは、薬剤、例えばネオマイシン、ハ
イグロマイシン、及びメトトレキセートに対する耐性を
付与する遺伝子を包含する。選択マーカーは注目の遺伝
子と同時に別個のプラスミド上で細胞に導入することが
でき、あるいはそれらは同一のプラスミド上で導入する
ことができる。同一のプラスミド上では選択マーカー及
び注目の遺伝子は異るプロモーター又は同一のプロモー
ターの制御のもとにあることができる。１つの態様にお
いては、両者の配列が同一のプロモーターにより制御さ
れるように選択マーカーがプロテインＣコード配列と同
じプラスミド上に置かれ、これはジシストロンメッセー
ジとして知られる配置である。このタイプの造成物は従
来技術において知られている（例えば、ヨーロッパ出願
公開No.117,058）。細胞に導入される混合物に“キャリ
ャーDNA"として知られる追加のDNAを加えることも有利
である。細胞がDNAを取り込んだ後、これらを一定時
間、典型的には１〜２日間増殖せしめて注目の遺伝子の
発現を開始せしめる。次に、薬剤選択を適用して適切に
選択マーカーを発現している細胞の増殖について選択を
行う。この様な細胞のクローンをプロテインＣの発現に
ついてスクリーニングすることができる。
この発明において使用するために好ましい哺乳類セル
ラインにはCOSセルライン、BHKセルライン及び293セル
ラインが含まれる。さらに、この発明において多くの他
のセルラインを使用することができ、これらにはラット
Hep I細胞（ATCC CRL 1600）、ラットHep II細胞（ATCC
CRL1548）、TCMK細胞（ATCC CCL 139）、ヒト肝細胞
（ATCC CCL 75.1）、ヒト肝癌細胞（ATCC HTB−52）、H
ep G2細胞（ATCC HTB 8065）、マウス肝細胞（ATCC CC
29.1）、及びDUKX細胞（Urlaub及びChasin,Proc,Natl.A
cad.Sci.USA 77:4216−4220,1980）が含まれる。
ラインにはCOSセルライン、BHKセルライン及び293セル
ラインが含まれる。さらに、この発明において多くの他
のセルラインを使用することができ、これらにはラット
Hep I細胞（ATCC CRL 1600）、ラットHep II細胞（ATCC
CRL1548）、TCMK細胞（ATCC CCL 139）、ヒト肝細胞
（ATCC CCL 75.1）、ヒト肝癌細胞（ATCC HTB−52）、H
ep G2細胞（ATCC HTB 8065）、マウス肝細胞（ATCC CC
29.1）、及びDUKX細胞（Urlaub及びChasin,Proc,Natl.A
cad.Sci.USA 77:4216−4220,1980）が含まれる。
293セルライン（ATCC CRL 1573;Graham等、J.Gen.Vir
ol. 36:59−72,1977）が特に好ましい。プロテインＣを
二本鎖形に効率的にプロセシングするその能力のためで
ある。このセルラインはヒトアデノウイルス5DNAにより
形質転換され、そしてAd5 EIA遺伝子をゲノムに組み込
む。
ol. 36:59−72,1977）が特に好ましい。プロテインＣを
二本鎖形に効率的にプロセシングするその能力のためで
ある。このセルラインはヒトアデノウイルス5DNAにより
形質転換され、そしてAd5 EIA遺伝子をゲノムに組み込
む。
293細胞と共に使用するための好ましい発現ベクター
はアデノウイルスプロモーターを含有するであろう。ネ
オマイシン耐性が293細胞中で使用するための好ましい
選択マーカーである。好ましいBHKセルラインはtk-BHK
セルラインBHK570（Waechter及びBaserga,Proc.Natl．A
cad.Sci.USA 79:1106−1110,1982）である。
はアデノウイルスプロモーターを含有するであろう。ネ
オマイシン耐性が293細胞中で使用するための好ましい
選択マーカーである。好ましいBHKセルラインはtk-BHK
セルラインBHK570（Waechter及びBaserga,Proc.Natl．A
cad.Sci.USA 79:1106−1110,1982）である。
組み込まれた遺伝子配列のコピー数は、ある種の選択
マーカー（例えば、メトトレキセートに対する耐性を付
与するジヒドロフォレートレダクターゼ）の使用による
増幅を介して増加せしめることができる。選択マーカー
が注目の遺伝子と共に細胞に導入され、そして薬剤選択
が適用される。次に、薬剤濃度を段階的に増加せしめ、
各段階で耐性細胞を選択する。クローン化された配列の
コピー数の増加について選択することにより、コードさ
れた蛋白質の発現レベルが実質的に増加することができ
よう。
マーカー（例えば、メトトレキセートに対する耐性を付
与するジヒドロフォレートレダクターゼ）の使用による
増幅を介して増加せしめることができる。選択マーカー
が注目の遺伝子と共に細胞に導入され、そして薬剤選択
が適用される。次に、薬剤濃度を段階的に増加せしめ、
各段階で耐性細胞を選択する。クローン化された配列の
コピー数の増加について選択することにより、コードさ
れた蛋白質の発現レベルが実質的に増加することができ
よう。
この発明に従って製造されるプロテインＣは好ましく
は、例えば抗−プロテインＣ抗体カラム上でのアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製される。カラム溶
出物の追加の精製は常用の化学的精製手段、例えば高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）により達成することが
できる。
は、例えば抗−プロテインＣ抗体カラム上でのアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製される。カラム溶
出物の追加の精製は常用の化学的精製手段、例えば高速
液体クロマトグラフィー（HPLC）により達成することが
できる。
この発明に従って製造されるプロテインＣは重鎖のア
ミノ末端から活性化ペプチドを除去することにより活性
化することができる。活性化はα−トロンビン（Marlar
等、Blood 59:1067−1072,1982）、トリプシン（Marla
r等、前掲）、ルッセル（Russell）のまむし毒ファクタ
ーＸ活性化因子（Kisiel、前掲）、又は市販のヘビ毒由
来活性化因子Protac C（American Diagnostica）の存在
下でプロテインＣをインキュベートすることにより達成
することができる。
ミノ末端から活性化ペプチドを除去することにより活性
化することができる。活性化はα−トロンビン（Marlar
等、Blood 59:1067−1072,1982）、トリプシン（Marla
r等、前掲）、ルッセル（Russell）のまむし毒ファクタ
ーＸ活性化因子（Kisiel、前掲）、又は市販のヘビ毒由
来活性化因子Protac C（American Diagnostica）の存在
下でプロテインＣをインキュベートすることにより達成
することができる。
下記の例を要約すれば、例１はヒトプロテインＣをコ
ードするDNA配列のクローニングを記載する。例２は例
１において単離された配列からの、プロテインＣの全長
コード配列の造成を記載する。例３はプロテインC DNA
のための発現ベクター造成を記載する。例４はトランス
フェクトされた哺乳類細胞を用いるプロテインＣの製造
を記載する。例５はプロテインＣをコードする全長cDN
A、及びトランスフェクトされた哺乳類細胞でのその発
現を記載する。例６はBNK細胞及び293細胞中での活性化
されたプロテインＣの生産を記載する。例７は変形され
た開裂部位を有するプレカーサーからのプロテインＣの
製造を記載する。例８はトランスフェクトされた細胞か
らのプロテインＣの分泌を指令するファクターVIIプレ
−プロペプチド又はプロトロンビンプレ−プロペプチド
の使用を記載する。
ードするDNA配列のクローニングを記載する。例２は例
１において単離された配列からの、プロテインＣの全長
コード配列の造成を記載する。例３はプロテインC DNA
のための発現ベクター造成を記載する。例４はトランス
フェクトされた哺乳類細胞を用いるプロテインＣの製造
を記載する。例５はプロテインＣをコードする全長cDN
A、及びトランスフェクトされた哺乳類細胞でのその発
現を記載する。例６はBNK細胞及び293細胞中での活性化
されたプロテインＣの生産を記載する。例７は変形され
た開裂部位を有するプレカーサーからのプロテインＣの
製造を記載する。例８はトランスフェクトされた細胞か
らのプロテインＣの分泌を指令するファクターVIIプレ
−プロペプチド又はプロトロンビンプレ−プロペプチド
の使用を記載する。
例 制限エンドヌクレアーゼ、及び他のDNA修飾酵素（例
えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、ウシアルカリ性ホ
スファターゼ、Klenow DNA ポリメラーゼT4ポリヌクレ
オチドリガーゼ）はベセスダ・リサーチ・ラドラトリー
ス（BRL）及びニュー・イングランド・ビオラブスから
得られ、そして特にことわらない限り製造者の指示に従
って使用した。
えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、ウシアルカリ性ホ
スファターゼ、Klenow DNA ポリメラーゼT4ポリヌクレ
オチドリガーゼ）はベセスダ・リサーチ・ラドラトリー
ス（BRL）及びニュー・イングランド・ビオラブスから
得られ、そして特にことわらない限り製造者の指示に従
って使用した。
オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムス
・モデル380A DNA合成機により合成し、そして変性ゲル
上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する
ことができる。E.コリ（E.coli）の細胞はManiatis等
（Molecular Cloning:A Laboratory Manual、コールド
スプリング ハーバー・ラボラトリー、1982）に記載さ
れているようにして形質転換することができる。M13及
びpUCクローニングベクター並びに宿主株はBRLから入手
した。
・モデル380A DNA合成機により合成し、そして変性ゲル
上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製する
ことができる。E.コリ（E.coli）の細胞はManiatis等
（Molecular Cloning:A Laboratory Manual、コールド
スプリング ハーバー・ラボラトリー、1982）に記載さ
れているようにして形質転換することができる。M13及
びpUCクローニングベクター並びに宿主株はBRLから入手
した。
例1.ヒトプロテインＣをコードするDNA配列のクローニ
ング ヒトプロテインＣの一部分をコードするcDNAを、Fost
er及びDavie（前掲）により記載されている様にして調
製した。要約すれば、常法に従ってヒト肝臓mRNAからλ
gt11 cDNAライブラリーを調製した。ヒトプロテインＣ
に対する、アフィニティー精製され125I−ラベル化され
た抗体を用いてクローンをスクリーニングし、そしてプ
レート溶解法（Maniatis等、前掲）及びこれに続く塩化
セシウム勾配上でのバンド化により、陽性クローンから
ファージを調製した。EcoR Iを用いてcDNA挿入部を取り
出し、そしてプラスミドpUC9（Vieira及びMessing,Gene
19:259−268,1982）にサブクローニングした。制限断片
をファージベクターM13mp10及びM13mp11（Messing,Meth
in Enzymology101:20−77,1983）にサブクローニング
し、そしてジデオキシ法（Sanger等、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 74:5463−5467,1977）により配列決定した。ヒ
トプロテインＣの既知の部分配列（Kisiel、前掲）に対
応しそして軽鎖のアミノ酸64から始まりそして重鎖を通
って３′−非コード領域に伸びるプロテインＣをコード
するDNAを含有する１個のクローンを選択した。このク
ローンをλHC1375と命名した。アミノ酸24からのプロテ
インＣをコードする第二のcDNAクローンを同定した。こ
のクローンからの挿入部をpUC9にサブクローニングし、
そしてこのプラスミドをpHCλ6L（第１図）と称した。
このクローンは、重鎖コード領域、終止コドン及び３′
非コード領域を含むプロテインＣの大部分をコードして
いる。
ング ヒトプロテインＣの一部分をコードするcDNAを、Fost
er及びDavie（前掲）により記載されている様にして調
製した。要約すれば、常法に従ってヒト肝臓mRNAからλ
gt11 cDNAライブラリーを調製した。ヒトプロテインＣ
に対する、アフィニティー精製され125I−ラベル化され
た抗体を用いてクローンをスクリーニングし、そしてプ
レート溶解法（Maniatis等、前掲）及びこれに続く塩化
セシウム勾配上でのバンド化により、陽性クローンから
ファージを調製した。EcoR Iを用いてcDNA挿入部を取り
出し、そしてプラスミドpUC9（Vieira及びMessing,Gene
19:259−268,1982）にサブクローニングした。制限断片
をファージベクターM13mp10及びM13mp11（Messing,Meth
in Enzymology101:20−77,1983）にサブクローニング
し、そしてジデオキシ法（Sanger等、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 74:5463−5467,1977）により配列決定した。ヒ
トプロテインＣの既知の部分配列（Kisiel、前掲）に対
応しそして軽鎖のアミノ酸64から始まりそして重鎖を通
って３′−非コード領域に伸びるプロテインＣをコード
するDNAを含有する１個のクローンを選択した。このク
ローンをλHC1375と命名した。アミノ酸24からのプロテ
インＣをコードする第二のcDNAクローンを同定した。こ
のクローンからの挿入部をpUC9にサブクローニングし、
そしてこのプラスミドをpHCλ6L（第１図）と称した。
このクローンは、重鎖コード領域、終止コドン及び３′
非コード領域を含むプロテインＣの大部分をコードして
いる。
λHC1375からのcDNA挿入部をα32PdNTPを用いてニッ
クトランスレーションし、そしてWoo（Meth.in Enzymol
ogy 68:381−395,1979）により改変されたBenton及びD
avis（Science 196:181−182,1977）のプラークハイブ
リダイゼーション法を用いてファージλシャロン4A（Ma
niatis等、Cell 15:687−702,1978）中のヒトゲノムラ
イブラリーをプローブするために使用した。陽性クロー
ンを単離し、そしてプラーク精製した（Foster等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:4673−4677,1985、引用によ
りこの明細書に組み入れる）。陽性クローンから調製し
たファージDNA（Silhavy等、Experiments with Gene Fu
sion）、Cold Spring Harboar Laboratory,1984）をEco
R I又はBgl IIにより消化し、そしてゲノム性挿入部を
精製してそしてpUC9にサブロクローニングした。挿入部
の制限断片をM13ベクターにサブークローニングし、そ
して配列決定することによりそれらの同一性を確認しそ
して完全な遺伝子のDNA配列を確立した。
クトランスレーションし、そしてWoo（Meth.in Enzymol
ogy 68:381−395,1979）により改変されたBenton及びD
avis（Science 196:181−182,1977）のプラークハイブ
リダイゼーション法を用いてファージλシャロン4A（Ma
niatis等、Cell 15:687−702,1978）中のヒトゲノムラ
イブラリーをプローブするために使用した。陽性クロー
ンを単離し、そしてプラーク精製した（Foster等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:4673−4677,1985、引用によ
りこの明細書に組み入れる）。陽性クローンから調製し
たファージDNA（Silhavy等、Experiments with Gene Fu
sion）、Cold Spring Harboar Laboratory,1984）をEco
R I又はBgl IIにより消化し、そしてゲノム性挿入部を
精製してそしてpUC9にサブロクローニングした。挿入部
の制限断片をM13ベクターにサブークローニングし、そ
して配列決定することによりそれらの同一性を確認しそ
して完全な遺伝子のDNA配列を確立した。
pHCλ6LのcDNA挿入部をニックトランスレーション
し、そしてファージλシャロン4Aライブラリーをプロー
ブするために用いた。このcDNAの５′末端及び３′末端
から作られたプローブにハイブリダイズする１個のゲノ
ム性クローンが同定された。このファージクローンをEc
oR Iにより消化し、そしてプロテインＣ遺伝子の５′末
端に対応する4.4kb断片をpUC9にサブクローニングし
た。得られる組換プラスミドをpHCR4.4と命名した。完
全なDNA配列分析により、pHCR4.4中の挿入部が1263bpの
イントロンにより分離された70塩基対及び167塩基対の
２個のエクソンを含むことが示された。第一エクソンは
アミノ酸−42〜−17をコードし、そして第二エクソンは
アミノ酸−19〜37をコードする。配列分析により完全な
プロテインＣ遺伝子のDNA配列が確保された。
し、そしてファージλシャロン4Aライブラリーをプロー
ブするために用いた。このcDNAの５′末端及び３′末端
から作られたプローブにハイブリダイズする１個のゲノ
ム性クローンが同定された。このファージクローンをEc
oR Iにより消化し、そしてプロテインＣ遺伝子の５′末
端に対応する4.4kb断片をpUC9にサブクローニングし
た。得られる組換プラスミドをpHCR4.4と命名した。完
全なDNA配列分析により、pHCR4.4中の挿入部が1263bpの
イントロンにより分離された70塩基対及び167塩基対の
２個のエクソンを含むことが示された。第一エクソンは
アミノ酸−42〜−17をコードし、そして第二エクソンは
アミノ酸−19〜37をコードする。配列分析により完全な
プロテインＣ遺伝子のDNA配列が確保された。
前記のように、ゲノム性クローンを使用してこの発明
において使用するための許容されるコード配列を造成す
るためには、次にイントロンを除去する必要がある。
において使用するための許容されるコード配列を造成す
るためには、次にイントロンを除去する必要がある。
例2.プロテインＣのための全長コード配列の造成 プレ−プロペプチドを含むプロテインＣのための全長
コード配列は適切なcDNA断片とゲノム性クローンを連結
することにより造成される。これは、ゲノム性クローン
（pHCR4.4）からイントロンを除去し、そして融合され
こエクソンを便利な制限部位においてcDNA（pHCλ6Lか
ら）に連結することにより達成される。所望のゲノムDN
A:cDNA連結部は、オリゴヌクレオチド指令除去変異誘発
により不所望の配列をプールアウトすることにより生じ
させる。
コード配列は適切なcDNA断片とゲノム性クローンを連結
することにより造成される。これは、ゲノム性クローン
（pHCR4.4）からイントロンを除去し、そして融合され
こエクソンを便利な制限部位においてcDNA（pHCλ6Lか
ら）に連結することにより達成される。所望のゲノムDN
A:cDNA連結部は、オリゴヌクレオチド指令除去変異誘発
により不所望の配列をプールアウトすることにより生じ
させる。
プラスミドpHCλ6Lは、pUC9のEcoR I部位にクローニ
ングされたプロテインＣの部分的cDNAを含有する。この
cDNA挿入部を２個の断片としてサブクローニングしてゲ
ノム性クローンの最も５′側のコード領域に連結するた
めに用意する。プラスミドpHCλ6LをEcoR I及びSfI Iに
より消化し、そして反応混合物をフェノール及びCHCl3
により抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。得られ
るDNA断片を連結緩衝液中に再懸濁し、そしてT4DNAリガ
ーゼを加える。この連結混合物を15℃にて14時間インキ
ュベートする。この連結混合物のアリコートを使用し
て、E.コリJM83を形質転換し、そして細胞をＸ−galを
含有するLB寒天上にプレートする。白色コロニーを選択
し、そしてプラスミドDNAを調製する。
ングされたプロテインＣの部分的cDNAを含有する。この
cDNA挿入部を２個の断片としてサブクローニングしてゲ
ノム性クローンの最も５′側のコード領域に連結するた
めに用意する。プラスミドpHCλ6LをEcoR I及びSfI Iに
より消化し、そして反応混合物をフェノール及びCHCl3
により抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。得られ
るDNA断片を連結緩衝液中に再懸濁し、そしてT4DNAリガ
ーゼを加える。この連結混合物を15℃にて14時間インキ
ュベートする。この連結混合物のアリコートを使用し
て、E.コリJM83を形質転換し、そして細胞をＸ−galを
含有するLB寒天上にプレートする。白色コロニーを選択
し、そしてプラスミドDNAを調製する。
DNAを制限酵素消化により分析することによりcDNAの
３′部分（約1450bpの挿入部）を含有するクローン、及
びcDNAの５′部分（約65bpの挿入部）を含有するクロー
ンを同定する。これらのクローンをそれぞれp9C3′及び
p9C5′と命名する（第６図）。
３′部分（約1450bpの挿入部）を含有するクローン、及
びcDNAの５′部分（約65bpの挿入部）を含有するクロー
ンを同定する。これらのクローンをそれぞれp9C3′及び
p9C5′と命名する（第６図）。
このcDNAから欠けている５′コード領域はゲノム性ク
ローンpHCR4.4のエクソンＩ及びII中に含まれている。
このプラスミドは約4400bpの挿入部を含有し、そしてイ
ントロンＢ中に位置するEcoR I部位におけるその３′末
端において終る。
ローンpHCR4.4のエクソンＩ及びII中に含まれている。
このプラスミドは約4400bpの挿入部を含有し、そしてイ
ントロンＢ中に位置するEcoR I部位におけるその３′末
端において終る。
pHCR4.4からコード配列を取り出すため、プラスミド
をPst I及びEcoR Iで消化し、そして生ずる断片をアガ
ロースゲル中での電気泳動により分離する。エクソンＩ
及びIIを含有する約2540bpの断片をゲルから単離し、そ
してCTABにより抽出する（Langridge等、Analyt.Bioche
m.103:264,1980）。５′Ｐ−Ｒと称するこの断片をpUC9
にサブクローニングしてプラスミドp5′Ｐ−Ｒを生成せ
しめる（第７図）。
をPst I及びEcoR Iで消化し、そして生ずる断片をアガ
ロースゲル中での電気泳動により分離する。エクソンＩ
及びIIを含有する約2540bpの断片をゲルから単離し、そ
してCTABにより抽出する（Langridge等、Analyt.Bioche
m.103:264,1980）。５′Ｐ−Ｒと称するこの断片をpUC9
にサブクローニングしてプラスミドp5′Ｐ−Ｒを生成せ
しめる（第７図）。
p5′Ｐ−Ｒ中のイントロン（イントロンＡと称する）
を２段階法により除去する（第７図）。プラスミドをAp
a Iで消化する。Apa Iはイントロン中のユニーク部位で
開裂せしめそして３′オーバーハング未満を残す。次
に、線状化されたプラスミドをBal 31エキソヌクレアー
ゼ又はT4ポリメラーゼにより処理して各末端から約400b
pを除去し、そして生ずる断片をS1ヌクレアーゼにより
平滑末端化する。線状化されたプラスミドをリガーゼに
より再環化し、そしてこれを用いてE.コリJM83を形質転
換する。プラスミドDNAを抽出し、そしてイントロンＡ
中のSma I及びSst I制限部位の存在について分析し、そ
して300〜400bpに短縮されたSma I−Sst I断片を有する
プラスミドを選択し、そしてp5′ＰΔaRと命名する。
を２段階法により除去する（第７図）。プラスミドをAp
a Iで消化する。Apa Iはイントロン中のユニーク部位で
開裂せしめそして３′オーバーハング未満を残す。次
に、線状化されたプラスミドをBal 31エキソヌクレアー
ゼ又はT4ポリメラーゼにより処理して各末端から約400b
pを除去し、そして生ずる断片をS1ヌクレアーゼにより
平滑末端化する。線状化されたプラスミドをリガーゼに
より再環化し、そしてこれを用いてE.コリJM83を形質転
換する。プラスミドDNAを抽出し、そしてイントロンＡ
中のSma I及びSst I制限部位の存在について分析し、そ
して300〜400bpに短縮されたSma I−Sst I断片を有する
プラスミドを選択し、そしてp5′ＰΔaRと命名する。
イントロンＡの残りを、２−プライマー法についてZo
ller及びSmith（Manual for Advanced Techniques in M
olecular Cloning Course、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー、1983）により記載されているのと実質
的に同じオリゴヌクレオチド−指令除去変異誘発により
除去する。
ller及びSmith（Manual for Advanced Techniques in M
olecular Cloning Course、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー、1983）により記載されているのと実質
的に同じオリゴヌクレオチド−指令除去変異誘発により
除去する。
p5′ＰΔaRをPst I及びEcoR Iで消化し、そしてプロ
テインＣ断片を、Pst IとEcoR Iで消化したM13mp9にサ
ブクローニングする。正鎖ファージDNAを鋳型として調
製し、そしてオリゴヌクレオチドmut−１（第１表）に
アニールする。この変異原オリゴヌクレオチドは、連結
されるべきエクソンＩ及びIIの配列に対して相補的な配
列を含有する。M13ユニバーサル配列決定用プライマー
を同じ鋳型上のmut−１の３′側にアニールする。これ
らのプライマーをDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）及
びヌクレオシドトリホスフェートを用いてT4DNAリガー
ゼの存在下で延長せしめる。生ずるデュプレックスDNA
環をE.コリJM103に形質転換し、そして生ずるプラーク
をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
32P−ラベル化変異原オリゴヌクレオチドをプローブと
して用いてスクリーニングする。陽性プラークからのDN
Aを単離し、そしてオリゴヌクレオチドプライマー１
（第１表）を用いてスクリーニングする。このプライマ
ーはエクソンIIにおいてプライムし、除去連結部を含む
DNA配列の決定を可能にする。エクソンＩ及びIIの正し
いインフレーム融合を有する分子を選択する。
テインＣ断片を、Pst IとEcoR Iで消化したM13mp9にサ
ブクローニングする。正鎖ファージDNAを鋳型として調
製し、そしてオリゴヌクレオチドmut−１（第１表）に
アニールする。この変異原オリゴヌクレオチドは、連結
されるべきエクソンＩ及びIIの配列に対して相補的な配
列を含有する。M13ユニバーサル配列決定用プライマー
を同じ鋳型上のmut−１の３′側にアニールする。これ
らのプライマーをDNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）及
びヌクレオシドトリホスフェートを用いてT4DNAリガー
ゼの存在下で延長せしめる。生ずるデュプレックスDNA
環をE.コリJM103に形質転換し、そして生ずるプラーク
をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
32P−ラベル化変異原オリゴヌクレオチドをプローブと
して用いてスクリーニングする。陽性プラークからのDN
Aを単離し、そしてオリゴヌクレオチドプライマー１
（第１表）を用いてスクリーニングする。このプライマ
ーはエクソンIIにおいてプライムし、除去連結部を含む
DNA配列の決定を可能にする。エクソンＩ及びIIの正し
いインフレーム融合を有する分子を選択する。
M13複製形から、制限エンドヌクレアーゼ消化及びア
ガロースゲル電気泳動によりPst I−EcoR I断片を単離
し、そしてこれをpUC9にサブクローニングしてプラスミ
ドp5′Ｉ−IIを生成せしめる（第７図）。
ガロースゲル電気泳動によりPst I−EcoR I断片を単離
し、そしてこれをpUC9にサブクローニングしてプラスミ
ドp5′Ｉ−IIを生成せしめる（第７図）。
第８図に関し、５′コード領域をcDNAに連結するた
め、前記プラスミドのPst I及びEcoR Iにより消化によ
って約1277bpのPst I−EcoR I断片を単離し、そしてア
ガロース電気泳動により精製する。p9C5′をSal I及びE
coR Iで消化することにより65bpの最も５′側のcDNA断
片を単離し、そしてアクリルマミドゲル上での電気泳動
により精製する。２個の断片をそれらのEcoR I未満にお
いて連結し、そして得られた約1330bpのPst I−Sal I断
片を、Pst I及びSal Iで消化したM13mp9にサブクローニ
ングする（第８図）。正鎖ファージDNAをオリゴヌクレ
オチド指令除去変異誘発のための鋳型として調製する。
オリゴヌクレオチドmut−２（第１表）をこの鋳型にア
ニールし、そしてオリゴヌクレオチドmut−３（第１
表）を第二プライマーとして上流にアニールする。これ
らのプライマーを前記のようにして延長する。オリゴヌ
クレオチドmut−２はアミノ酸23−26をコードするエク
ソンII配列のcDNAへのコドン27における融合を指令す
る。第二プライマー（mut−３）は翻訳開始部から35bp
上流にEcoR I部位を導入する。生ずるファージを、NCO
I部位及びXbo I部位の不存在並びに導入されたEcoR I部
位の存在についてスクリーニングする。所望の制限パタ
ーンを示すファージDNAを、プライマー−２（第２表）
を用いて配列決定することによりエクソンIIとcDNAとの
間の正しい連結部の存在を確認する。正しい配列を有す
るファージDNAを選択し、そして５′コード領域を含むP
st I−Sal I断片をM13組換ファージの複製形から単離す
る。この断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、
そしてPst IとSal Iで消化したpUC9に挿入してプラスミ
ドpC5′endを生成せしめる。
め、前記プラスミドのPst I及びEcoR Iにより消化によ
って約1277bpのPst I−EcoR I断片を単離し、そしてア
ガロース電気泳動により精製する。p9C5′をSal I及びE
coR Iで消化することにより65bpの最も５′側のcDNA断
片を単離し、そしてアクリルマミドゲル上での電気泳動
により精製する。２個の断片をそれらのEcoR I未満にお
いて連結し、そして得られた約1330bpのPst I−Sal I断
片を、Pst I及びSal Iで消化したM13mp9にサブクローニ
ングする（第８図）。正鎖ファージDNAをオリゴヌクレ
オチド指令除去変異誘発のための鋳型として調製する。
オリゴヌクレオチドmut−２（第１表）をこの鋳型にア
ニールし、そしてオリゴヌクレオチドmut−３（第１
表）を第二プライマーとして上流にアニールする。これ
らのプライマーを前記のようにして延長する。オリゴヌ
クレオチドmut−２はアミノ酸23−26をコードするエク
ソンII配列のcDNAへのコドン27における融合を指令す
る。第二プライマー（mut−３）は翻訳開始部から35bp
上流にEcoR I部位を導入する。生ずるファージを、NCO
I部位及びXbo I部位の不存在並びに導入されたEcoR I部
位の存在についてスクリーニングする。所望の制限パタ
ーンを示すファージDNAを、プライマー−２（第２表）
を用いて配列決定することによりエクソンIIとcDNAとの
間の正しい連結部の存在を確認する。正しい配列を有す
るファージDNAを選択し、そして５′コード領域を含むP
st I−Sal I断片をM13組換ファージの複製形から単離す
る。この断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、
そしてPst IとSal Iで消化したpUC9に挿入してプラスミ
ドpC5′endを生成せしめる。
第９図に関し、プラスミドpC5′endをEcoR I及びSal
Iで消化し、そして５′プロテインＣ断片をアガロース
ゲル電気泳動により精製し、そしてCTABにより抽出す
る。cDNAの残りを、p9C3′からSal I−EcoR I断片とし
て単離する。２個の断片を三元連結により、EcoR Iで消
化したpUC9に連結する。連結混合物を用いてE.コリJM83
を形質転換し、細胞をLB＋Ｘ−gal上にプレートし、そ
して白色コロニーからプラスミドDNAを単離する。得ら
れたプラミドをpMMCと命名する。このプラスミドは約15
00bpのEcoR I断片上にヒトプロテインＣの完全なコード
配列を含有する。
Iで消化し、そして５′プロテインＣ断片をアガロース
ゲル電気泳動により精製し、そしてCTABにより抽出す
る。cDNAの残りを、p9C3′からSal I−EcoR I断片とし
て単離する。２個の断片を三元連結により、EcoR Iで消
化したpUC9に連結する。連結混合物を用いてE.コリJM83
を形質転換し、細胞をLB＋Ｘ−gal上にプレートし、そ
して白色コロニーからプラスミドDNAを単離する。得ら
れたプラミドをpMMCと命名する。このプラスミドは約15
00bpのEcoR I断片上にヒトプロテインＣの完全なコード
配列を含有する。
例3.プロテインＣのための発現ベクターの造成 プロテインＣをコードする挿入部をpMMCからEcoR I断
片として取り出し、そして適当な哺乳類細胞発現ベクタ
ーに挿入する。ベクターの例としてpD7が挙げられ、こ
のものはSV40エンハンサー並びにアデノウイルス２主要
後期プロモーター及び三分節（tripartite）リーダーを
含んで成る。
片として取り出し、そして適当な哺乳類細胞発現ベクタ
ーに挿入する。ベクターの例としてpD7が挙げられ、こ
のものはSV40エンハンサー並びにアデノウイルス２主要
後期プロモーター及び三分節（tripartite）リーダーを
含んで成る。
プラスミドpD7はプラスミドpDHFR III（Berkner及びS
harp,Nuc,Acids Res．13:841−857,1985）に由来する。
pDHFR III中のDHFR配列のすぐ上流のPst I部位をBcl I
部位に転換する。これは次の様にして行う。10μｇのプ
ラスミドを５ユニットのPst Iにより37℃にて10分間100
μの緩衝液Ａ（10mM Tris、pH8、10mM MgCl2、6mM Na
Cl、7mMβ−MSH）中で消化した。DNAをフェノール抽出
し、エタノール沈澱せしめ、そして10mM dCTP及び16ユ
ニットのT4DNAポリメラーゼを含有する緩衝液Ｂ（50mM
Tris、pH8、7mM MgCl2、7mMβ−MSH）40μ中に再懸濁
し、そして12℃にて60分間インキュベートする。エタノ
ール沈澱の後、400ユニットのT4ポリヌクレオチドリガ
ーゼを含有する緩衝液Ｃ（10mM Tris、pH8、10mM MgC
l2、1mM DTT、1.4mM ATP）14μ中でDNAを2.5μｇのキ
ナーゼ処理Bcl Iリンカーに12℃にて12時間連結せしめ
た。フェノール抽出及びエタノール沈澱の後、DNAを120
μの緩衝液Ｄ（75mM KCl、6mM Tris、pH7.5、10mM Mg
Cl2、1mM DTT）に再懸濁し、80ユニットのBcl Iにより5
0℃にて60分間消化し、そしてアガロース中で電気泳動
した。フォームIIIプラスミドDNA（10μｇ）をゲルから
単離し、そして50ユニットのポリヌクレオチドリガーゼ
を含有する10μの緩衝液Ｃ中で12℃にて２時間連結せ
しめ、そしてこれを用いてE.コリHB101を形質転換し
た。迅速DNA調製分析により陽性コロニーを単離し、そ
して陽性コロニーから調製したプラスミドDNA（pDHFR′
と称する）をdAM-E.コリに形質転換した。
harp,Nuc,Acids Res．13:841−857,1985）に由来する。
pDHFR III中のDHFR配列のすぐ上流のPst I部位をBcl I
部位に転換する。これは次の様にして行う。10μｇのプ
ラスミドを５ユニットのPst Iにより37℃にて10分間100
μの緩衝液Ａ（10mM Tris、pH8、10mM MgCl2、6mM Na
Cl、7mMβ−MSH）中で消化した。DNAをフェノール抽出
し、エタノール沈澱せしめ、そして10mM dCTP及び16ユ
ニットのT4DNAポリメラーゼを含有する緩衝液Ｂ（50mM
Tris、pH8、7mM MgCl2、7mMβ−MSH）40μ中に再懸濁
し、そして12℃にて60分間インキュベートする。エタノ
ール沈澱の後、400ユニットのT4ポリヌクレオチドリガ
ーゼを含有する緩衝液Ｃ（10mM Tris、pH8、10mM MgC
l2、1mM DTT、1.4mM ATP）14μ中でDNAを2.5μｇのキ
ナーゼ処理Bcl Iリンカーに12℃にて12時間連結せしめ
た。フェノール抽出及びエタノール沈澱の後、DNAを120
μの緩衝液Ｄ（75mM KCl、6mM Tris、pH7.5、10mM Mg
Cl2、1mM DTT）に再懸濁し、80ユニットのBcl Iにより5
0℃にて60分間消化し、そしてアガロース中で電気泳動
した。フォームIIIプラスミドDNA（10μｇ）をゲルから
単離し、そして50ユニットのポリヌクレオチドリガーゼ
を含有する10μの緩衝液Ｃ中で12℃にて２時間連結せ
しめ、そしてこれを用いてE.コリHB101を形質転換し
た。迅速DNA調製分析により陽性コロニーを単離し、そ
して陽性コロニーから調製したプラスミドDNA（pDHFR′
と称する）をdAM-E.コリに形質転換した。
次に、プラスミドpD2′を次の様にして調製した。pDH
FR′（15μｇ）及びpSV40（pML−１のBamH I部位にクロ
ーン化された、BamH I消化されたSV40 DNAを含んでな
る）（25ng）を100μの緩衝液Ｄ中で25ユニットのBcl
Iを用いて60分間50℃にて開裂せしめ、次に50ユニット
のBamH Iを添加した。そして追加のDNA断片をアガロー
スゲル電気泳動により分離し、そして4.9kbのpDHFR′断
片及び0.2kbのSV40断片を単離した。これらの断片（200
ngのpDHFR′DNA及び100mgのSV40DAN）を、100ユニット
のT4ポリヌクレオチドリガーゼを含有する10μの緩衝
液Ｃ中で12℃にて４時間インキュベートし、そして生じ
た造成物（pD2′）を用いてE.コリRR Iを形質転換し
た。
FR′（15μｇ）及びpSV40（pML−１のBamH I部位にクロ
ーン化された、BamH I消化されたSV40 DNAを含んでな
る）（25ng）を100μの緩衝液Ｄ中で25ユニットのBcl
Iを用いて60分間50℃にて開裂せしめ、次に50ユニット
のBamH Iを添加した。そして追加のDNA断片をアガロー
スゲル電気泳動により分離し、そして4.9kbのpDHFR′断
片及び0.2kbのSV40断片を単離した。これらの断片（200
ngのpDHFR′DNA及び100mgのSV40DAN）を、100ユニット
のT4ポリヌクレオチドリガーゼを含有する10μの緩衝
液Ｃ中で12℃にて４時間インキュベートし、そして生じ
た造成物（pD2′）を用いてE.コリRR Iを形質転換し
た。
プラスミドpD2′を、pBR322領域中の“毒性”配列を
除去することにより変形した（Lusky及びBotchan,Natur
e293:79−81,1981）。プラスミドpD2′（6.6μｇ）及び
pML−１（Lusky及びBotchan,前掲）を50μの緩衝液Ａ
中で10ユニットずつのEcoR I及びNru Iと共に37℃にて
２時間インキュベートし、次にアガロースゲル電気泳動
にかけた。1.7kbのpd2′断片及び1.8kbのpML−１断片を
単離し、そして100ユニットのT4ポリヌクレオチドリガ
ーゼを含有する20μの緩衝液Ｃ中で12℃にて２時間連
結し、そして次にこれを用いてE.コリHB101を形質転換
した。所望の造成物（pD2と称する）を含有するコロニ
ーを迅速調製分析により同定した。次に、10μｇのpD2
を20ユニットずつのECOR I及びBgl IIにより50μの緩
衝液Ａ中で37℃にて２時間消化した。DNAをアガロース
電気泳動し、そして目的とする、pBR322 3′スプライス
部位及びポリＡ配列を含有する2.8kg断片（断片Ｃ）を
単離した。
除去することにより変形した（Lusky及びBotchan,Natur
e293:79−81,1981）。プラスミドpD2′（6.6μｇ）及び
pML−１（Lusky及びBotchan,前掲）を50μの緩衝液Ａ
中で10ユニットずつのEcoR I及びNru Iと共に37℃にて
２時間インキュベートし、次にアガロースゲル電気泳動
にかけた。1.7kbのpd2′断片及び1.8kbのpML−１断片を
単離し、そして100ユニットのT4ポリヌクレオチドリガ
ーゼを含有する20μの緩衝液Ｃ中で12℃にて２時間連
結し、そして次にこれを用いてE.コリHB101を形質転換
した。所望の造成物（pD2と称する）を含有するコロニ
ーを迅速調製分析により同定した。次に、10μｇのpD2
を20ユニットずつのECOR I及びBgl IIにより50μの緩
衝液Ａ中で37℃にて２時間消化した。DNAをアガロース
電気泳動し、そして目的とする、pBR322 3′スプライス
部位及びポリＡ配列を含有する2.8kg断片（断片Ｃ）を
単離した。
pD3の造成において使用される残りの断片を得るた
め、pDHFR IIIを変形してSac II（Sst II）部位をHind
III部位又はKpn I部位のいずれかに転換した。10μｇの
pDHFR IIIを20ユニットのSst IIにより37℃にて２時間
消化し、次にフェノール抽出及びエタノール沈殿を行っ
た。再懸濁されたDNAを、10mMdCTP及び16ユニットのT4D
NAポリメラーゼを含有する100μの緩衝液Ｂ中で12℃
にて60分間インキュベートし、フェノール抽出し、透析
し、そしてエタノール沈殿した。DNA（５μｇ）を、400
ユニットのT4DNAリガーゼを含有する20μの緩衝液Ｃ
中で、キナーゼ処理されたHind III又はKpnエリンカー5
0mgと12℃にて10時間連結し、フェノール抽出し、そし
てエタノール沈殿した。50μの緩衝液Ａに再懸濁した
後、生ずるプラスミドを、適当であれば50ユニットのHi
nd III又はKpn Iにより消化し、そしてアガロース電気
泳動した。ゲル単離されたDNA（250mg）を、400ユニッ
トのT4DNAリガーゼを含有する30mlの緩衝液Ｃ中で12℃
にて４時間連結し、そしてこれを用いてE.コリRRIを形
質転換した。生ずるプラスミドをpDHFR III（Hind II
I）及びPDHFR III（Kpn I）と命名した。次に、pDHFR I
II（Kpn I）からBgl II及びKpn Iによる消化並びにこれ
に続くアガロースゲル電気泳動により700bpのKpn I−Bg
l I断片（断片Ａ）を精製した。
め、pDHFR IIIを変形してSac II（Sst II）部位をHind
III部位又はKpn I部位のいずれかに転換した。10μｇの
pDHFR IIIを20ユニットのSst IIにより37℃にて２時間
消化し、次にフェノール抽出及びエタノール沈殿を行っ
た。再懸濁されたDNAを、10mMdCTP及び16ユニットのT4D
NAポリメラーゼを含有する100μの緩衝液Ｂ中で12℃
にて60分間インキュベートし、フェノール抽出し、透析
し、そしてエタノール沈殿した。DNA（５μｇ）を、400
ユニットのT4DNAリガーゼを含有する20μの緩衝液Ｃ
中で、キナーゼ処理されたHind III又はKpnエリンカー5
0mgと12℃にて10時間連結し、フェノール抽出し、そし
てエタノール沈殿した。50μの緩衝液Ａに再懸濁した
後、生ずるプラスミドを、適当であれば50ユニットのHi
nd III又はKpn Iにより消化し、そしてアガロース電気
泳動した。ゲル単離されたDNA（250mg）を、400ユニッ
トのT4DNAリガーゼを含有する30mlの緩衝液Ｃ中で12℃
にて４時間連結し、そしてこれを用いてE.コリRRIを形
質転換した。生ずるプラスミドをpDHFR III（Hind II
I）及びPDHFR III（Kpn I）と命名した。次に、pDHFR I
II（Kpn I）からBgl II及びKpn Iによる消化並びにこれ
に続くアガロースゲル電気泳動により700bpのKpn I−Bg
l I断片（断片Ａ）を精製した。
SV40エンハンサー配列を次の様にしてpDHFR III（Hin
d III）に挿入した。50μｇのSV40DNAを120μの緩衝
液Ａ中で50ユニットのHind IIIと共に37℃にて２時間イ
ンキュベートし、そしてHind III CSV40断片（5089−96
8pb）をゲル精製した。プラスミドpDHFR III（Hind II
I）（10μｇ）を250ngのウシ腸ホスファターゼにより37
℃にて１時間処理し、フェノール抽出し、そしてエタノ
ール沈殿せしめた。線状化されたプラスミド（50ng）
を、200ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用い
て16μの緩衝液Ｃ中で12℃にて３時間、250ngのHind
III C SV40と連結し、そしてE.コリHB101に形質転換し
た。次に、このプラスミドから700bpのEcoR I−Kpn I断
片（断片Ｂ）を単離した。
d III）に挿入した。50μｇのSV40DNAを120μの緩衝
液Ａ中で50ユニットのHind IIIと共に37℃にて２時間イ
ンキュベートし、そしてHind III CSV40断片（5089−96
8pb）をゲル精製した。プラスミドpDHFR III（Hind II
I）（10μｇ）を250ngのウシ腸ホスファターゼにより37
℃にて１時間処理し、フェノール抽出し、そしてエタノ
ール沈殿せしめた。線状化されたプラスミド（50ng）
を、200ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用い
て16μの緩衝液Ｃ中で12℃にて３時間、250ngのHind
III C SV40と連結し、そしてE.コリHB101に形質転換し
た。次に、このプラスミドから700bpのEcoR I−Kpn I断
片（断片Ｂ）を単離した。
pD3の最終的造成のため、断片Ａ及びＢ（50ngずつ）
を、200ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用い
て12℃にて４時間、10ngの断片Ｃと連結し、そして次に
E.コリRRIの形質転換を行った。陽性クローンを迅速調
製法により検出し、そしてpDSの大量調製を行った。
を、200ユニットのT4ポリヌクレオチドリガーゼを用い
て12℃にて４時間、10ngの断片Ｃと連結し、そして次に
E.コリRRIの形質転換を行った。陽性クローンを迅速調
製法により検出し、そしてpDSの大量調製を行った。
Bcl I制限部位をEcoR I部位に転換することによって
プロテインＣ配列の挿入を受け入れるようにプラスミド
pD3を変形する。まず、常用のリンカー付加法によってE
coR IをBamH Iに転換することにより、アデノウイルス
５ ０−１マップユニットの最左端においてpD3中に存
在するEcoR I部位を除去する必要がある。要約すれば、
プラスミドをEcoR Iで消化し、そして線状化されたDNA
をT4DNAポリメラーゼ及び４種類すべてのデオキシヌク
レオチドトリホスフェートにより処理することにより平
滑末端を生じさせる。次に、プラスミドをBamH I制限部
位を含むオクタヌクレオチドに連結し、このDNAをBamH
Iで消化して過剰のリンカーを除去し、そして哺乳類細
胞発現配列を含有する断片をpML−１のBamH I部位にク
ローン化する。生ずるプラスミドをE.コリHB101にトラ
ンスフェクし、そしてプラスミドDNAを調製し、そして
正しい変更についてスクリーニングする。同様にして、
Bcl I部位を、オクトヌクレオチドリンカーを用いてEco
R I部位に転換する。得られるベクターはpD7として知ら
れる。次に、pMMCからの1.5kbプロテインC EcoR I断片
をpD7のEcoR I部位に挿入して発現ベクターpd7C（第10
図）を生成せしめる。
プロテインＣ配列の挿入を受け入れるようにプラスミド
pD3を変形する。まず、常用のリンカー付加法によってE
coR IをBamH Iに転換することにより、アデノウイルス
５ ０−１マップユニットの最左端においてpD3中に存
在するEcoR I部位を除去する必要がある。要約すれば、
プラスミドをEcoR Iで消化し、そして線状化されたDNA
をT4DNAポリメラーゼ及び４種類すべてのデオキシヌク
レオチドトリホスフェートにより処理することにより平
滑末端を生じさせる。次に、プラスミドをBamH I制限部
位を含むオクタヌクレオチドに連結し、このDNAをBamH
Iで消化して過剰のリンカーを除去し、そして哺乳類細
胞発現配列を含有する断片をpML−１のBamH I部位にク
ローン化する。生ずるプラスミドをE.コリHB101にトラ
ンスフェクし、そしてプラスミドDNAを調製し、そして
正しい変更についてスクリーニングする。同様にして、
Bcl I部位を、オクトヌクレオチドリンカーを用いてEco
R I部位に転換する。得られるベクターはpD7として知ら
れる。次に、pMMCからの1.5kbプロテインC EcoR I断片
をpD7のEcoR I部位に挿入して発現ベクターpd7C（第10
図）を生成せしめる。
プロテインＣ配列の発現が可能なベクターをポリシス
トロン メッセージからpD5を使用することにより造成
する。pD5はpD3に類似しており、５′−非コード領域の
ほとんどが欠けておりDHFRコード配列を含有する。DHFR
配列をさらに変形してメトトレキセートに対するその結
合親和性を低下せしめる。
トロン メッセージからpD5を使用することにより造成
する。pD5はpD3に類似しており、５′−非コード領域の
ほとんどが欠けておりDHFRコード配列を含有する。DHFR
配列をさらに変形してメトトレキセートに対するその結
合親和性を低下せしめる。
pD3について記載したのと同様にしてベクターpD5を造
成する。但し、BamH I部位が異種性DNAの挿入部位であ
り、そしてSV40ポリアデニレーションシグナルを含有す
るBal I−Bam III SV40断片が後の方向にある点におい
てpD5はpD3と異る。
成する。但し、BamH I部位が異種性DNAの挿入部位であ
り、そしてSV40ポリアデニレーションシグナルを含有す
るBal I−Bam III SV40断片が後の方向にある点におい
てpD5はpD3と異る。
DHFR配列を変形するまでpDHFR IIIをPst I及びSct I
により消化し、そして400bpのDHFR断片を単離する。こ
れをM13ファージベクターにサブクローニングし、そし
てSim onsem及びLevinson（Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:
2495−2499,1983）により記載されたようにして変量せ
しめる。この変量はDHFR配列中の１塩基対の変化をもた
らす。次に、変形された断片をpDHFR IIIに再挿入して
プラスミドpDHFRr IIIを生成せしめる。
により消化し、そして400bpのDHFR断片を単離する。こ
れをM13ファージベクターにサブクローニングし、そし
てSim onsem及びLevinson（Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:
2495−2499,1983）により記載されたようにして変量せ
しめる。この変量はDHFR配列中の１塩基対の変化をもた
らす。次に、変形された断片をpDHFR IIIに再挿入して
プラスミドpDHFRr IIIを生成せしめる。
次に、DHFR配列の５′非−コード領域を除去する。プ
ラスミドpDHFRr IIIをFnu4H I（これはプラスミドを約2
0個の部位で切断する）で開裂せしめ、次にT4DNAポリメ
ラーゼ及び４種類すべてのデオキシヌクレオチドトリホ
スフェートで処理して平滑末端を生じさせる。この末端
にBamH Iリンカーを連結し、そしてこの混合物をBamH I
及びNco Iにより消化する。DHFRrcDNAを含む0.6kbのBam
H I−Nco I断片が単離される。プラスミドpDHFR IIIをN
co I及びBamH Iで消化し、そしてSV40ポリアデニレーシ
ョンシグナルを含む0.2kb断片を単離する。前方向にあ
るポリアデニレーションシグナルを次にDHFRr断片に連
結する。
ラスミドpDHFRr IIIをFnu4H I（これはプラスミドを約2
0個の部位で切断する）で開裂せしめ、次にT4DNAポリメ
ラーゼ及び４種類すべてのデオキシヌクレオチドトリホ
スフェートで処理して平滑末端を生じさせる。この末端
にBamH Iリンカーを連結し、そしてこの混合物をBamH I
及びNco Iにより消化する。DHFRrcDNAを含む0.6kbのBam
H I−Nco I断片が単離される。プラスミドpDHFR IIIをN
co I及びBamH Iで消化し、そしてSV40ポリアデニレーシ
ョンシグナルを含む0.2kb断片を単離する。前方向にあ
るポリアデニレーションシグナルを次にDHFRr断片に連
結する。
BamH Iで消化した後、生ずるBamH I断片をpD5のBamH
I部位に挿入し、そしてこの連結混合物を用いてE.コリH
B101を形質転換する。プラスミドDNAを調製し、そして
制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングす
る。Ad2主要後期プロモーターからの転写のために正し
い方向にDHFRr挿入部を有するプラスミドをpD5（DHF
Rr）と命名する。
I部位に挿入し、そしてこの連結混合物を用いてE.コリH
B101を形質転換する。プラスミドDNAを調製し、そして
制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングす
る。Ad2主要後期プロモーターからの転写のために正し
い方向にDHFRr挿入部を有するプラスミドをpD5（DHF
Rr）と命名する。
プラスミドpD5（DHFRr）を用いてプロテインＣを発現
せしめるため、pMMCをECOR Iで消化し、そして1.5kbプ
ロテインＣ断片を単離する。ECOR I末端をリンカー付加
によりBcl I末端に転換する。プラスミドpD5（DHFRr）
をBamH Iで部分消化することにより、これをDHFRr配列
５′未満において開裂せしめ、そしてプロテインＣ断片
に連結する。プラスミドDNAを適切な方向及びプロテイ
ンＣ断片の挿入についてスクリーニングする。pD5（PC
−DHFRr）と称する得られたベクターを第11図に示す。
せしめるため、pMMCをECOR Iで消化し、そして1.5kbプ
ロテインＣ断片を単離する。ECOR I末端をリンカー付加
によりBcl I末端に転換する。プラスミドpD5（DHFRr）
をBamH Iで部分消化することにより、これをDHFRr配列
５′未満において開裂せしめ、そしてプロテインＣ断片
に連結する。プラスミドDNAを適切な方向及びプロテイ
ンＣ断片の挿入についてスクリーニングする。pD5（PC
−DHFRr）と称する得られたベクターを第11図に示す。
例4.トランスフェクトされた哺乳類細胞でのプロテイン
Ｃの発現 子ハムスター腎（BHK）細胞（ATCC CCL10）をpd7C
を用いてリン酸カルシウム同時沈殿によりトランスフェ
クトする（Wigler等、Cell14:725,1978;Corsaro及びPea
rson,Somatic Cell Genetics7:603,1981;並びにGraham
及びVan der Eb,Virology52:456,1973）。細胞を37℃、
５％CO2にてダルベコの培地（10％の熱不活性化ウシ胎
児血清を添加し、そしてＬ−グルタミン及びペニシリン
−ストレプトマイシンを補充したもの）中、60mmの組織
培養ペトリ血中で20％のコンコルエンシーまで増殖せし
める。合計10μｇのDNAを用いて１枚の60mm血をトラン
スフェクトする:3.75μｇのpD7C、1.25μｇのpKO−neo
（Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Genet1:327−341,198
2）及び５μｇのサケ精子DNA。DNAを0.3M NaOAc、75％
エタノール中で沈殿せしめ、70％エタノールで洗浄し、
そして20μの10mM Tris−HCl（pH8）、1mM EDTA中に
再溶解する。DNAを440μの水、及び500μの280mM M
aCl、1.5mM NaHPO4、12mMデキストローヌ、50mM HEPES
（pH7.12）と混合する。上記の混合物に60μの250mM
CaCl2を滴加し、そしてこの溶液を室温にて30分間放置
する。次にこの溶液を細胞に加え、そして細胞37℃にも
どして４時間置く。培地を除去し、そして血清を含むダ
ルベコ培地中20％DMSOを5ml室温にて２分間にわたって
加える。次に血を培地により２回迅速に洗浄し、そして
新鮮な培地中で一夜インキュベートする。DNAを添加し
て24時間後、培地を除去し、そして選択地（血清を含有
するダルベコ培地中10mg/mlのG418、498μ/mlのギブ
コ）を加える。約10〜13日間の後、pKO−neo遺伝子を取
り込みそしてそれ故にG418に対して耐性である細胞を代
表する個々のクローンを96−ウエルプレートに移し、そ
して10％ウシ胎児血清を含有するダルベコ培地中で蛋白
質アッセイのために増殖せしめる。
Ｃの発現 子ハムスター腎（BHK）細胞（ATCC CCL10）をpd7C
を用いてリン酸カルシウム同時沈殿によりトランスフェ
クトする（Wigler等、Cell14:725,1978;Corsaro及びPea
rson,Somatic Cell Genetics7:603,1981;並びにGraham
及びVan der Eb,Virology52:456,1973）。細胞を37℃、
５％CO2にてダルベコの培地（10％の熱不活性化ウシ胎
児血清を添加し、そしてＬ−グルタミン及びペニシリン
−ストレプトマイシンを補充したもの）中、60mmの組織
培養ペトリ血中で20％のコンコルエンシーまで増殖せし
める。合計10μｇのDNAを用いて１枚の60mm血をトラン
スフェクトする:3.75μｇのpD7C、1.25μｇのpKO−neo
（Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Genet1:327−341,198
2）及び５μｇのサケ精子DNA。DNAを0.3M NaOAc、75％
エタノール中で沈殿せしめ、70％エタノールで洗浄し、
そして20μの10mM Tris−HCl（pH8）、1mM EDTA中に
再溶解する。DNAを440μの水、及び500μの280mM M
aCl、1.5mM NaHPO4、12mMデキストローヌ、50mM HEPES
（pH7.12）と混合する。上記の混合物に60μの250mM
CaCl2を滴加し、そしてこの溶液を室温にて30分間放置
する。次にこの溶液を細胞に加え、そして細胞37℃にも
どして４時間置く。培地を除去し、そして血清を含むダ
ルベコ培地中20％DMSOを5ml室温にて２分間にわたって
加える。次に血を培地により２回迅速に洗浄し、そして
新鮮な培地中で一夜インキュベートする。DNAを添加し
て24時間後、培地を除去し、そして選択地（血清を含有
するダルベコ培地中10mg/mlのG418、498μ/mlのギブ
コ）を加える。約10〜13日間の後、pKO−neo遺伝子を取
り込みそしてそれ故にG418に対して耐性である細胞を代
表する個々のクローンを96−ウエルプレートに移し、そ
して10％ウシ胎児血清を含有するダルベコ培地中で蛋白
質アッセイのために増殖せしめる。
プロテインＣを測定するため、培地を遠心分離によっ
て細胞及び細胞片から分離し、そしてプロテインＣポリ
ペプチド及び生物学的活性についてアッセイする。トリ
プシンにより細胞をプレートから離し、新鮮な培地で洗
浄し、遠心し、そして−20℃にて凍結する。測定のた
め、細胞ペレットをPBS中で解凍し、ペレット化し、そ
して0.25％トリトンＸ−100を含有するPBS中に再懸濁す
る。サンプルを欷釈し、そしてポリペプチド及び活性に
ついてアッセイする。
て細胞及び細胞片から分離し、そしてプロテインＣポリ
ペプチド及び生物学的活性についてアッセイする。トリ
プシンにより細胞をプレートから離し、新鮮な培地で洗
浄し、遠心し、そして−20℃にて凍結する。測定のた
め、細胞ペレットをPBS中で解凍し、ペレット化し、そ
して0.25％トリトンＸ−100を含有するPBS中に再懸濁す
る。サンプルを欷釈し、そしてポリペプチド及び活性に
ついてアッセイする。
プロテインＣのためのエンザイム−リンクト・イムノ
ソルベンド・アッセイ（ELISA）を次の様にして行う。
ヒトプロテインＣに対する、アフィニティ精製した抗体
（100μの0.1M Na2CO3,pH9.6、中１μg/ml）を96−ウ
エルミクロタイタープレートの各ウエルに加え、そして
プレートを４℃にて一夜インキュベートする。次に、ウ
エルを３回、0.05％トウィーン20を含有するPBS（5mMリ
ン酸緩衝液、pH7.5、0.15M NaCl）で洗浄し、そして次
にPBS中１％ウシ血清アルブミン、0.05％トウィーン20
を100μと共に４℃にて一夜インキュベートする。次
にプレートをPBSにより数回すすぎ、空気乾燥し、そし
て４℃にて貯蔵する。サンプルを測定するため、100μ
の各サンプルを、コートされたウエル中で37℃にて１
時間インキュベートしそしてウエルをPBS中0.05％トウ
ィーン20ですすぐ。次に、プレートを、１％ウシ血清ア
ルブミン及び0.05％トウィーン20を含有するPBS中、プ
ロテインＣに対するビオチン−接合ヒツジポリクローナ
ル抗体（30ng/ml）と共に37℃にて１時間インキュベー
トする。ウエルをPBSですすぎ、そして１％ウシ血清ア
ルブミン及び0.05％トウィーン20を含有するPBS中アル
カリ性ホスファターゼに接合したアビジンと共に37℃に
て１時間、再度インキュベートする。次に、ウエルをPB
Sですすぎ、そして0.3mM MgCl2を含有する10％ジエタノ
ールアミン（pH9.8）中ホスファターゼ基質（シグマ10
4;600μg/ml）100μの添加によりアルカリ性ホスファ
ターゼ活性を測定する。405nmでの吸光をミクロタイタ
ープレートリーダー上で読み取る。
ソルベンド・アッセイ（ELISA）を次の様にして行う。
ヒトプロテインＣに対する、アフィニティ精製した抗体
（100μの0.1M Na2CO3,pH9.6、中１μg/ml）を96−ウ
エルミクロタイタープレートの各ウエルに加え、そして
プレートを４℃にて一夜インキュベートする。次に、ウ
エルを３回、0.05％トウィーン20を含有するPBS（5mMリ
ン酸緩衝液、pH7.5、0.15M NaCl）で洗浄し、そして次
にPBS中１％ウシ血清アルブミン、0.05％トウィーン20
を100μと共に４℃にて一夜インキュベートする。次
にプレートをPBSにより数回すすぎ、空気乾燥し、そし
て４℃にて貯蔵する。サンプルを測定するため、100μ
の各サンプルを、コートされたウエル中で37℃にて１
時間インキュベートしそしてウエルをPBS中0.05％トウ
ィーン20ですすぐ。次に、プレートを、１％ウシ血清ア
ルブミン及び0.05％トウィーン20を含有するPBS中、プ
ロテインＣに対するビオチン−接合ヒツジポリクローナ
ル抗体（30ng/ml）と共に37℃にて１時間インキュベー
トする。ウエルをPBSですすぎ、そして１％ウシ血清ア
ルブミン及び0.05％トウィーン20を含有するPBS中アル
カリ性ホスファターゼに接合したアビジンと共に37℃に
て１時間、再度インキュベートする。次に、ウエルをPB
Sですすぎ、そして0.3mM MgCl2を含有する10％ジエタノ
ールアミン（pH9.8）中ホスファターゼ基質（シグマ10
4;600μg/ml）100μの添加によりアルカリ性ホスファ
ターゼ活性を測定する。405nmでの吸光をミクロタイタ
ープレートリーダー上で読み取る。
例5Cにおいて記載する活性化後に血漿のカオリン−ケ
ファリン凝固時間を延長するその能力によりプロテイン
Ｃの生物学的活性を測定する。
ファリン凝固時間を延長するその能力によりプロテイン
Ｃの生物学的活性を測定する。
例5.プロテインＣをコードする全長cDNAの発現 A,cDNAの単離 プロテインＣのプレープロペプチドのアミノ酸−42〜
−19に対応するエクソン（第４図においてエクソン１）
を含有するゲノム断片を単離し、ニックトランスレート
し、そしてこれをプローブとして用いて、Gubler及びHo
ffman（Gene25:263−269,1983）の技法によりHEPG2細胞
からのmRNAを用いて造成されたcDNAライブラリーをスク
リーニングした。このセルラインはヒト肝細胞に由来
し、そしてすでに示されているようにプロテインＣを合
成する（Fair及びBahnak,Blood64:194−204,1984）。フ
ァージλgt11のEcoR I部位に挿入されている。cDNAを含
有する陽性クローンを単離し、そしてプロテインＣ遺伝
子の５′非−コード領域に対応するオリゴヌクレオチド
プローブによりスクリーニングした。１個のクローンが
このプローブによっても陽性であり、そしてその全ヌク
レオチド配列を決定した。このcDNAは70bpの５′−非翻
訳配列、ヒトプレプロ−プロテインＣの完全なコード配
列、及び第二ポリアデニレーション部位に対応する完全
な３′−非コード領域を含有していた（第２図）。
−19に対応するエクソン（第４図においてエクソン１）
を含有するゲノム断片を単離し、ニックトランスレート
し、そしてこれをプローブとして用いて、Gubler及びHo
ffman（Gene25:263−269,1983）の技法によりHEPG2細胞
からのmRNAを用いて造成されたcDNAライブラリーをスク
リーニングした。このセルラインはヒト肝細胞に由来
し、そしてすでに示されているようにプロテインＣを合
成する（Fair及びBahnak,Blood64:194−204,1984）。フ
ァージλgt11のEcoR I部位に挿入されている。cDNAを含
有する陽性クローンを単離し、そしてプロテインＣ遺伝
子の５′非−コード領域に対応するオリゴヌクレオチド
プローブによりスクリーニングした。１個のクローンが
このプローブによっても陽性であり、そしてその全ヌク
レオチド配列を決定した。このcDNAは70bpの５′−非翻
訳配列、ヒトプレプロ−プロテインＣの完全なコード配
列、及び第二ポリアデニレーション部位に対応する完全
な３′−非コード領域を含有していた（第２図）。
B.発現ベクターの造成 プロテインC cDNAの発現をベクターpDX中で達成し
た。このベクターはpD3（例３において記載した）及びp
D3′から誘導された。pD3′ベクターはpD3と同じである
が、但しSV40ポリアデニレーションシグナル（すなわち
SV40 BamH I〔2533bp〕−Bcl I〔2770bp〕断片が後方向
にある点において異る。すなわち、pD3′は遺伝子挿入
部としてBamH I部位を含有する。
た。このベクターはpD3（例３において記載した）及びp
D3′から誘導された。pD3′ベクターはpD3と同じである
が、但しSV40ポリアデニレーションシグナル（すなわち
SV40 BamH I〔2533bp〕−Bcl I〔2770bp〕断片が後方向
にある点において異る。すなわち、pD3′は遺伝子挿入
部としてBamH I部位を含有する。
pDXを得るため、pD3′をEcoR Iで開裂せしめ、SIヌク
レアーゼと共にインキュベートし、そして次にBal Iリ
ンカーに連結することにより、pD3′中のEcoR I部位をB
cl I部位に転換した。陽性と同定されたコロニーからDN
Aを調製し、そして変化した制限部位を含有する1.9kbの
Xho I−Pst I断片をアガロースゲル電気泳動により調製
した。第二の変形において、pD3をキナーゼ処理されたE
coR I−Bal Iアダプター（オリゴヌクレオチドZC525:
5′GGAATTCT3′；及びZC526:5′GATCAGAATTCC3′から造
成）に連結して、発現ベクターに遺伝子を挿入するため
の位置としてEcoR I部位を生じさせた。制限エンドヌク
レアーゼ分析により陽性クローンを同定し、そしてこの
クローンからのDNAを用いて変形された制限部位を含有
する2.3kbのXho I−Pst I断片を単離した。上記の２個
の断片をT4DNAリガーゼと共にインキュベートし、E.コ
リHB101を形質転換し、そして陽性コロニーを制限分析
により同定した。このプラスミドは外来遺伝子を挿入す
るためのユニークEcoR I部位を含有する。
レアーゼと共にインキュベートし、そして次にBal Iリ
ンカーに連結することにより、pD3′中のEcoR I部位をB
cl I部位に転換した。陽性と同定されたコロニーからDN
Aを調製し、そして変化した制限部位を含有する1.9kbの
Xho I−Pst I断片をアガロースゲル電気泳動により調製
した。第二の変形において、pD3をキナーゼ処理されたE
coR I−Bal Iアダプター（オリゴヌクレオチドZC525:
5′GGAATTCT3′；及びZC526:5′GATCAGAATTCC3′から造
成）に連結して、発現ベクターに遺伝子を挿入するため
の位置としてEcoR I部位を生じさせた。制限エンドヌク
レアーゼ分析により陽性クローンを同定し、そしてこの
クローンからのDNAを用いて変形された制限部位を含有
する2.3kbのXho I−Pst I断片を単離した。上記の２個
の断片をT4DNAリガーゼと共にインキュベートし、E.コ
リHB101を形質転換し、そして陽性コロニーを制限分析
により同定した。このプラスミドは外来遺伝子を挿入す
るためのユニークEcoR I部位を含有する。
次に、プロテインＣのcDNAをEcoR I断片としてpDXに
挿入した。組換プラスミドを制限分析によりスクリーニ
ングして、プロモーター要素に対して正しい方向にプロ
テインＣ挿入部を有するプラスミドを同定し、そして正
しいクローンからプラスミドDNA（pDX/PCと称する）を
調製した（第12図）。pDX/PC中のcDNA挿入部は５′非コ
ード領域にATGコドンを含有する（第２図を参照のこ
と）ため、トランスフェクション及び発現実験に先立っ
てcDNA上に除去変異を行った。オリゴヌクレオチド指令
変異誘発の標準的方法に従って３塩基対の除去を行っ
た。変形されたcDNAを含有するpDXを基礎とするベクタ
ーをp594と称する。
挿入した。組換プラスミドを制限分析によりスクリーニ
ングして、プロモーター要素に対して正しい方向にプロ
テインＣ挿入部を有するプラスミドを同定し、そして正
しいクローンからプラスミドDNA（pDX/PCと称する）を
調製した（第12図）。pDX/PC中のcDNA挿入部は５′非コ
ード領域にATGコドンを含有する（第２図を参照のこ
と）ため、トランスフェクション及び発現実験に先立っ
てcDNA上に除去変異を行った。オリゴヌクレオチド指令
変異誘発の標準的方法に従って３塩基対の除去を行っ
た。変形されたcDNAを含有するpDXを基礎とするベクタ
ーをp594と称する。
C.cDNAの発現 プラスミドp594をリン酸カルシウム沈殿法によりCOS
−１（ATCC CRL 1650）細胞、BHK細胞、及び293細胞に
トランクフェクトした。４時間後、新鮮な培地（５μg/
mlのビタミンＫを補充したもの）を加えた。適当な時点
（通常48時間又は72時間）で培地を収得し、そして細胞
を集めそして細胞を溶解した。
−１（ATCC CRL 1650）細胞、BHK細胞、及び293細胞に
トランクフェクトした。４時間後、新鮮な培地（５μg/
mlのビタミンＫを補充したもの）を加えた。適当な時点
（通常48時間又は72時間）で培地を収得し、そして細胞
を集めそして細胞を溶解した。
cDNAクローンの最初の同定に使用したのと同じアフィ
ニティー精製されたポリクローナル抗体を用いるELISA
により、培地中に分泌されたプロテインＣを測定した。
COS−１細胞のアッセイも作った。
ニティー精製されたポリクローナル抗体を用いるELISA
により、培地中に分泌されたプロテインＣを測定した。
COS−１細胞のアッセイも作った。
組換蛋白質のγ−カルボキシル化の程度を測定するた
め、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈殿にかけた。
この方法はγ−カルボキシル化蛋白質のみを血漿から選
択的に沈殿せしめる方法である（Bajaj等、J.Biol.Che
m.256:253−259,1981）。プロテインＣ抗原性物質の70
％以上がクエン酸バリウムにより沈殿した。
め、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈殿にかけた。
この方法はγ−カルボキシル化蛋白質のみを血漿から選
択的に沈殿せしめる方法である（Bajaj等、J.Biol.Che
m.256:253−259,1981）。プロテインＣ抗原性物質の70
％以上がクエン酸バリウムにより沈殿した。
組換プロテインＣを、凝固を長びかせるその能力を測
定することにより抗凝固活性について測定した。透析さ
れた培地サンプルをプロタック（Protac）Ｃ（アメリカ
ンダイアグノスチカ）で処理することによりプロテイン
Ｃを活性化した。次に、サンプルをインビトロ凝固アッ
セイ（Sugo等、J.Biol.Chem.260:10453,1985）に加え
た。要約すれば、50μずつの正常血のヒト血漿、ラビ
ット脳ケファリン〔TBS（50mM This,pH7.5,150mM NaC
l）中10mg/ml〕、及びカオリン懸濁液（TBS中5mg/ml）
をシリコン処理ガラスチューブ中で混合した。37℃にて
２分間のプレインキュベートの後、TBS中に欷釈された1
00μの活性化されたプロテインＣを加え、そしてイン
キュベーションを37℃にてさらに２分間続けた。次に、
50μの25mM CaCl2を添加することにより凝固を開始
し、そして凝固時間を記録した。組換物質の活性は天然
プロテインＣのそれと本質的に同じであることが示され
た。
定することにより抗凝固活性について測定した。透析さ
れた培地サンプルをプロタック（Protac）Ｃ（アメリカ
ンダイアグノスチカ）で処理することによりプロテイン
Ｃを活性化した。次に、サンプルをインビトロ凝固アッ
セイ（Sugo等、J.Biol.Chem.260:10453,1985）に加え
た。要約すれば、50μずつの正常血のヒト血漿、ラビ
ット脳ケファリン〔TBS（50mM This,pH7.5,150mM NaC
l）中10mg/ml〕、及びカオリン懸濁液（TBS中5mg/ml）
をシリコン処理ガラスチューブ中で混合した。37℃にて
２分間のプレインキュベートの後、TBS中に欷釈された1
00μの活性化されたプロテインＣを加え、そしてイン
キュベーションを37℃にてさらに２分間続けた。次に、
50μの25mM CaCl2を添加することにより凝固を開始
し、そして凝固時間を記録した。組換物質の活性は天然
プロテインＣのそれと本質的に同じであることが示され
た。
トランスフェクトされたBNK細胞及び293細胞により生
産されたプロテインＣをウエスタンブロッティングによ
りさらに分析した。培地サンプルを変性ゲル上で電気泳
動し、そしてブロットを調製し、そしてプロテインＣに
対する放射性ラベル化抗体によりプローブした。その結
果、BHK細胞からのプロテインＣの約20％が二本鎖形で
あり、他方293細胞からのプロテインＣの約90％が二本
鎖形であった。
産されたプロテインＣをウエスタンブロッティングによ
りさらに分析した。培地サンプルを変性ゲル上で電気泳
動し、そしてブロットを調製し、そしてプロテインＣに
対する放射性ラベル化抗体によりプローブした。その結
果、BHK細胞からのプロテインＣの約20％が二本鎖形で
あり、他方293細胞からのプロテインＣの約90％が二本
鎖形であった。
例6.活性化されたプロテインＣの発現 プロテインＣのcDNAを部位特定変異誘発により変更し
て活性化ペプチドをコードする部位を除去した。次に、
変形された配列をBHK細胞及び293細胞にトランスフェク
トし、そして安定にトランクフェクトされた細胞を選択
した。両セルラインからの培地サンプル中の活性プロテ
インＣを検出した。
て活性化ペプチドをコードする部位を除去した。次に、
変形された配列をBHK細胞及び293細胞にトランスフェク
トし、そして安定にトランクフェクトされた細胞を選択
した。両セルラインからの培地サンプル中の活性プロテ
インＣを検出した。
活性化ペプチドコード配列を除去するため、プラスミ
ドp594をSst Iで消化し、そして約880bpの断片を精製
し、そしてM13mp10のSst I部位に挿入した。12個の活性
化ペプチドコドンを、変異原オリゴヌクレオチド５′CT
GAAACGACTCATTGAT3′を用いてオリゴヌクレオチド指令
除去変異誘発（Zoller等Smith,DNA3:479−488,1984）に
より除去した。変異ファージクローンから複製形DNAを
調製し、そしてSst Iにより消化した。プロテインＣ断
片（約840bp）を単離し、そしてSst Iで消化されたp594
に挿入した。生ずるプラスミドを、BgI IIを用いる制限
酵素マッピングによりSst I断片の正しい方向について
スクリーニングした。正しいプラスミドを選択し、そし
てpPC829と命名した。プラスミドpPC829を配列決定して
目的とするコード配列の存在を確認した。
ドp594をSst Iで消化し、そして約880bpの断片を精製
し、そしてM13mp10のSst I部位に挿入した。12個の活性
化ペプチドコドンを、変異原オリゴヌクレオチド５′CT
GAAACGACTCATTGAT3′を用いてオリゴヌクレオチド指令
除去変異誘発（Zoller等Smith,DNA3:479−488,1984）に
より除去した。変異ファージクローンから複製形DNAを
調製し、そしてSst Iにより消化した。プロテインＣ断
片（約840bp）を単離し、そしてSst Iで消化されたp594
に挿入した。生ずるプラスミドを、BgI IIを用いる制限
酵素マッピングによりSst I断片の正しい方向について
スクリーニングした。正しいプラスミドを選択し、そし
てpPC829と命名した。プラスミドpPC829を配列決定して
目的とするコード配列の存在を確認した。
プラスミドpPC829をBHK細胞に〔プラスミドpSVDHFR
（Lee等、Nature294:228−232,1981）と共に〕、又は29
3細胞〔pKO−neo（Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Gene
t. １:327−341,1982）と共に〕、リン酸カルシウム同時
沈殿法（Graham及びvan der Eb,Virology52:456−467,1
973）により同時トランクフェクト（co−transfect）し
た。48時間後、培地を収得し、そしてELISAによりプロ
テインＣについてアッセイした。結果を第３表に示す。
選択培地存在下で10日後、安定にトランスフェクトされ
たコロニーをプロテインＣの生産についてイムノフィル
ターアッセイ（McCrachen及びBrown,Bio Techniques,82
−87,1984年３月/4月）によりスクリーニングした。プ
レートをPBS又は非−血清培地（ダルベコ培地＋ペニシ
リン−ストレプトマイシン、５μg/mlビタミンＫ）です
すいた。次に、テフロン網を細胞上に置いた。ニトロセ
ルロースフィルターを、適当であればPBS又は非血清培
地で湿し、そして前記の綱の上に開いた。37℃にて４時
間のインキュベーションの後、フィルターをはずし、そ
して緩衝液Ａ（50mM Tris,pH7.4,5mM EDTA,0.05％NP−4
0,150mM NaCl、0.25％ゼラチン）中に室温にて30分間置
いた。フィルターを室温にて１時間、振とうしながら、
緩衝液Ａ中プロテインＣに対するビオチン−ラベル化ヒ
ツジポリクローナル抗体（１μg/ml）でインキュベート
した。次に、フィルターを緩衝液Ａ中で洗浄し、そして
室温にて１時間振とうしながら、緩衝液Ａ中アビジン接
合西洋ワサビバーオキシダーゼ（ベーリンガー−マンハ
イム）（1:1000）中でインキュベートした。フィルター
を緩衝液Ｂ中で、次に水中で洗浄し、そして発色試薬
（100mlの50mM Tris,pH7.4,150mM NaCl中60mgHRP発色試
薬〔ビオ−ラド〕、20mlメタノール、100μH2O2）中
でインキュベートした。フィルターを水中に移すことに
より反応を停止した。
（Lee等、Nature294:228−232,1981）と共に〕、又は29
3細胞〔pKO−neo（Southern及びBerg,J.Mol.Appl.Gene
t. １:327−341,1982）と共に〕、リン酸カルシウム同時
沈殿法（Graham及びvan der Eb,Virology52:456−467,1
973）により同時トランクフェクト（co−transfect）し
た。48時間後、培地を収得し、そしてELISAによりプロ
テインＣについてアッセイした。結果を第３表に示す。
選択培地存在下で10日後、安定にトランスフェクトされ
たコロニーをプロテインＣの生産についてイムノフィル
ターアッセイ（McCrachen及びBrown,Bio Techniques,82
−87,1984年３月/4月）によりスクリーニングした。プ
レートをPBS又は非−血清培地（ダルベコ培地＋ペニシ
リン−ストレプトマイシン、５μg/mlビタミンＫ）です
すいた。次に、テフロン網を細胞上に置いた。ニトロセ
ルロースフィルターを、適当であればPBS又は非血清培
地で湿し、そして前記の綱の上に開いた。37℃にて４時
間のインキュベーションの後、フィルターをはずし、そ
して緩衝液Ａ（50mM Tris,pH7.4,5mM EDTA,0.05％NP−4
0,150mM NaCl、0.25％ゼラチン）中に室温にて30分間置
いた。フィルターを室温にて１時間、振とうしながら、
緩衝液Ａ中プロテインＣに対するビオチン−ラベル化ヒ
ツジポリクローナル抗体（１μg/ml）でインキュベート
した。次に、フィルターを緩衝液Ａ中で洗浄し、そして
室温にて１時間振とうしながら、緩衝液Ａ中アビジン接
合西洋ワサビバーオキシダーゼ（ベーリンガー−マンハ
イム）（1:1000）中でインキュベートした。フィルター
を緩衝液Ｂ中で、次に水中で洗浄し、そして発色試薬
（100mlの50mM Tris,pH7.4,150mM NaCl中60mgHRP発色試
薬〔ビオ−ラド〕、20mlメタノール、100μH2O2）中
でインキュベートした。フィルターを水中に移すことに
より反応を停止した。
陽性コロニーを拾い上げ、そして選択培地（適当であ
れば500μg/mlG418又は250nMメトトレキセートを含有す
る）を10日間増殖せしめた。培地を発色アッセイにより
APC活性についてアッセイした。50mM Tris,pH7.5,150mM
NaCl中0.2mMスペクトロチーム（Spectrozyme）PGa（ア
メリカンダイアグノスチカ＃336）100μを収容するミ
クロタイターウエルに培地サンプルを加えた。プレート
を37℃にてインキュベートし、そして種々の時間間隔に
おいてA405を測定した。１つのトランスフェクトされた
293セルライン（829−20と称する）からの代表的な結果
を第13図に示す。セルライン829−10の陽性コロニーか
らの培地は、同じ時間（10日間）にわたりトランスフェ
クトされない293細胞と共にインキュベートされた対照
培地に比べて、APCのための発色基質を用いて、一貫し
て高い活性を示した。
れば500μg/mlG418又は250nMメトトレキセートを含有す
る）を10日間増殖せしめた。培地を発色アッセイにより
APC活性についてアッセイした。50mM Tris,pH7.5,150mM
NaCl中0.2mMスペクトロチーム（Spectrozyme）PGa（ア
メリカンダイアグノスチカ＃336）100μを収容するミ
クロタイターウエルに培地サンプルを加えた。プレート
を37℃にてインキュベートし、そして種々の時間間隔に
おいてA405を測定した。１つのトランスフェクトされた
293セルライン（829−20と称する）からの代表的な結果
を第13図に示す。セルライン829−10の陽性コロニーか
らの培地は、同じ時間（10日間）にわたりトランスフェ
クトされない293細胞と共にインキュベートされた対照
培地に比べて、APCのための発色基質を用いて、一貫し
て高い活性を示した。
例7.プロテインＣプロセシング部位の変形 A.部位特定変異誘発 単鎖プロテインＣの二本鎖プロテインＣ形へのプロセ
シングを増強するため、蛋白質に２個の追加のアルギニ
ン残基を導入して４個の塩基性アミノ酸から成る開裂部
位を形成せしめた。プロテインＣの得られた変異体前駆
体PC962と称する。このものは開裂部位に配列Ser−His
−Leu−Arg−Arg−Lys−Arg−Aspを含有する。Arg−Asp
結合でのプロセシングが二本鎖プロテインＣ分子をもた
らす。
シングを増強するため、蛋白質に２個の追加のアルギニ
ン残基を導入して４個の塩基性アミノ酸から成る開裂部
位を形成せしめた。プロテインＣの得られた変異体前駆
体PC962と称する。このものは開裂部位に配列Ser−His
−Leu−Arg−Arg−Lys−Arg−Aspを含有する。Arg−Asp
結合でのプロセシングが二本鎖プロテインＣ分子をもた
らす。
変異系オリゴヌクレオチドZC962（５′AGTCACCTGAGAA
GAAAACGAGACA 3′）を用いる部位特定変異誘発（Zoller
及びSmith,DNA ３:479−488,1984により２プライマー
法について記載されたのと実質的に同じ方法）によりク
ローン化cDNAを変形することによって変異体分子を生成
せしめた。プラスミドp594をSst Iで消化し、そして約8
7bp断片をM13mp11にクローニングし、そして単鎖鋳型DN
Aを単離した。変異誘発の後、正しいクローン配列決定
により同定した、複製形DNAを単離し、Sst Iで消化し、
そしてプロテインＣ断片を、Sst Iで切断されたp594に
挿入した。所望の方向に挿入されたSst I断片を有する
クローンを制限酵素マッピングにより同定した。得られ
た発現ベクターをpDX/PC962と命名した（第14図）。
GAAAACGAGACA 3′）を用いる部位特定変異誘発（Zoller
及びSmith,DNA ３:479−488,1984により２プライマー
法について記載されたのと実質的に同じ方法）によりク
ローン化cDNAを変形することによって変異体分子を生成
せしめた。プラスミドp594をSst Iで消化し、そして約8
7bp断片をM13mp11にクローニングし、そして単鎖鋳型DN
Aを単離した。変異誘発の後、正しいクローン配列決定
により同定した、複製形DNAを単離し、Sst Iで消化し、
そしてプロテインＣ断片を、Sst Iで切断されたp594に
挿入した。所望の方向に挿入されたSst I断片を有する
クローンを制限酵素マッピングにより同定した。得られ
た発現ベクターをpDX/PC962と命名した（第14図）。
B.プロテインＣの発現及び特徴付け プラスミドpDX/PC962をpSV2−DHFR（Subramani等、Mo
l.Cell.Biol.1:854−864,1981）と共にリン酸カルシウ
ム法（Graham及びvan der Eb,前掲、により記載された
方法と実質的に同じ方法）によりtk-BHK細胞に同時トラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10
％ウシ胎児血清、１×PSN抗生物質混合物（ギブコ600−
5640）、2.0mM L−グルタミン及びビタミンＫ（５μg/m
l）を含有するダルベコの改変イーグル培地（MEM）鋳で
増殖せしめた。細胞を250nMメトトレキセート（MTX）中
で14日間選択し、そして得られたコロニーをイム／フィ
ルターアッセイ（例６）によりスクリーニングした。最
も強く反応するコロニー６個をシリンダークローニング
により拾い上げ、そして10cmプレート中に個々に増殖せ
しめた。培養物がコンフルエントに近ずいた時、プロテ
インＣの生産レベルをELISAにより測定した。結果を第
４表に示す。
l.Cell.Biol.1:854−864,1981）と共にリン酸カルシウ
ム法（Graham及びvan der Eb,前掲、により記載された
方法と実質的に同じ方法）によりtk-BHK細胞に同時トラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10
％ウシ胎児血清、１×PSN抗生物質混合物（ギブコ600−
5640）、2.0mM L−グルタミン及びビタミンＫ（５μg/m
l）を含有するダルベコの改変イーグル培地（MEM）鋳で
増殖せしめた。細胞を250nMメトトレキセート（MTX）中
で14日間選択し、そして得られたコロニーをイム／フィ
ルターアッセイ（例６）によりスクリーニングした。最
も強く反応するコロニー６個をシリンダークローニング
により拾い上げ、そして10cmプレート中に個々に増殖せ
しめた。培養物がコンフルエントに近ずいた時、プロテ
インＣの生産レベルをELISAにより測定した。結果を第
４表に示す。
クローンBHK/962−１を大規模培養で増殖せしめ、そ
してヒトプロテインＣに対するヒツジポリクローナル抗
体7mgを2gのCNBr−活性化セファロース4B（ファルマシ
ア社、ピスカタウェイ、NJ）に連絡することにより調製
したカラム上でのアフイニテイークロマトグラフイーに
より数百mgのプロテインＣを精製した。細胞培養培地を
カラムに通用し、このカラムを100mlのTBSで洗浄し、そ
して3M KSCNを含有するTBSにより又はpH11.55の緩衝液
によりプロテインＣを溶出した。ウエスタンブロット分
析によれば、天然配列によりトランスフェクトされたBH
K細胞から得られたプロテインＣの約20％が二本鎖プロ
テインＣであったのに対して、変異体プロテインＣは約
95％が二本鎖形であった。
してヒトプロテインＣに対するヒツジポリクローナル抗
体7mgを2gのCNBr−活性化セファロース4B（ファルマシ
ア社、ピスカタウェイ、NJ）に連絡することにより調製
したカラム上でのアフイニテイークロマトグラフイーに
より数百mgのプロテインＣを精製した。細胞培養培地を
カラムに通用し、このカラムを100mlのTBSで洗浄し、そ
して3M KSCNを含有するTBSにより又はpH11.55の緩衝液
によりプロテインＣを溶出した。ウエスタンブロット分
析によれば、天然配列によりトランスフェクトされたBH
K細胞から得られたプロテインＣの約20％が二本鎖プロ
テインＣであったのに対して、変異体プロテインＣは約
95％が二本鎖形であった。
PC962変異体蛋白質を発現する安全なBHK細胞クローン
から、又は野性型プロテインＣを発現する安定な293細
胞クローンから、プロテインＣのカルシウム−誘導コン
フィグレーションに対して特異的なモノクローナル抗体
を用いてmg量のプロテインＣを精製した。細胞培養培地
を5mM CaCl2の存在下でカラムに適用し、5mM CaCl2を含
有するTBSでカラムを洗浄し、そして10mM EDTAを含有す
るTBSによりプロテインＣを溶出した。この精製法の使
用により、変性条件に暴露することなく完全に活性なプ
ロテインＣを精製することが可能であった。精製された
プロテインＣをSDS/PAGE及びこれに続く銀染色により分
析した。純度が95％より高いことが示された。
から、又は野性型プロテインＣを発現する安定な293細
胞クローンから、プロテインＣのカルシウム−誘導コン
フィグレーションに対して特異的なモノクローナル抗体
を用いてmg量のプロテインＣを精製した。細胞培養培地
を5mM CaCl2の存在下でカラムに適用し、5mM CaCl2を含
有するTBSでカラムを洗浄し、そして10mM EDTAを含有す
るTBSによりプロテインＣを溶出した。この精製法の使
用により、変性条件に暴露することなく完全に活性なプ
ロテインＣを精製することが可能であった。精製された
プロテインＣをSDS/PAGE及びこれに続く銀染色により分
析した。純度が95％より高いことが示された。
BHKにより生産されたPC962蛋白質を、アミドリシス活
性及び抗−凝固活性の両方を示す形態に活性化され得る
その能力についてアッセイした。アフィニティー精製さ
れた蛋白質サンプルをTBS対して十分に透析し、次に0.1
容量の１ユニット/mlプロタク（Protac）Ｃ（アメリカ
ンダイアグノスティクス）と共に37℃にて１時間インキ
ュベートすることにより活性化した。活性化混合物のア
リコートをミクロタイターウェル中の100μの1mMプロ
テインＣ基質（スペクトロチームPCa、アメリカンダイ
アグノスチカ）に加え、そしてA405の変化を経時的にミ
クロタイタープレートリーダーを用いて測定することに
より、アミドリシス活性を測定した。活性化されたプロ
テインＣの抗−凝固活性はSugo等（前掲）に記載されて
いるようにして測定した。アフィニティー精製されたPC
962は、アミドリシス測定及び抗−凝固測定の両方にお
いて十分に活性であることが証明された。pH11.5の緩衝
液による抗体カラムからの溶出により、3M KSCN溶出に
より得られる蛋白質より高い活性を有する蛋白質が得ら
れた。
性及び抗−凝固活性の両方を示す形態に活性化され得る
その能力についてアッセイした。アフィニティー精製さ
れた蛋白質サンプルをTBS対して十分に透析し、次に0.1
容量の１ユニット/mlプロタク（Protac）Ｃ（アメリカ
ンダイアグノスティクス）と共に37℃にて１時間インキ
ュベートすることにより活性化した。活性化混合物のア
リコートをミクロタイターウェル中の100μの1mMプロ
テインＣ基質（スペクトロチームPCa、アメリカンダイ
アグノスチカ）に加え、そしてA405の変化を経時的にミ
クロタイタープレートリーダーを用いて測定することに
より、アミドリシス活性を測定した。活性化されたプロ
テインＣの抗−凝固活性はSugo等（前掲）に記載されて
いるようにして測定した。アフィニティー精製されたPC
962は、アミドリシス測定及び抗−凝固測定の両方にお
いて十分に活性であることが証明された。pH11.5の緩衝
液による抗体カラムからの溶出により、3M KSCN溶出に
より得られる蛋白質より高い活性を有する蛋白質が得ら
れた。
pDX/PC962をBHK細胞にトランスフェクトすることによ
り得られるクローン化セルラインを限界欷釈法によって
も得た。MTXで選択されたコロニーのプレート１（約300
コロニー）をトリプシン処理し、計数し、そして平均0.
5細胞／ウエルでミクロタイタープレートに再プレート
した。これらを250nM MTXを含有する選択培地中で増殖
せしめた。約50％のウエルがコロニーを含有していた。
同定可能なコロニー（直径１〜2mm）を含むウエルを培
地中のプロテインＣレベルについてELISAによりアッセ
イした。このアッセイのため、すべてのウエルに新鮮な
培地を加え、75分間インキュベートし、次に取り出しそ
してアッセイした。75分間で50ng/ml（1000ng/ml/日に
相当する）より多くを蓄積する５個のコロニーを、より
大規模な培養のために10cmプレートに分けた。これらの
クローンのプロテインＣ生産レベルは1.1〜2.8pg/細胞
／日であった。
り得られるクローン化セルラインを限界欷釈法によって
も得た。MTXで選択されたコロニーのプレート１（約300
コロニー）をトリプシン処理し、計数し、そして平均0.
5細胞／ウエルでミクロタイタープレートに再プレート
した。これらを250nM MTXを含有する選択培地中で増殖
せしめた。約50％のウエルがコロニーを含有していた。
同定可能なコロニー（直径１〜2mm）を含むウエルを培
地中のプロテインＣレベルについてELISAによりアッセ
イした。このアッセイのため、すべてのウエルに新鮮な
培地を加え、75分間インキュベートし、次に取り出しそ
してアッセイした。75分間で50ng/ml（1000ng/ml/日に
相当する）より多くを蓄積する５個のコロニーを、より
大規模な培養のために10cmプレートに分けた。これらの
クローンのプロテインＣ生産レベルは1.1〜2.8pg/細胞
／日であった。
PC962のcDNAをプラスミドZem299に挿入することによ
りPC962/229と称する第二のプラスミドを造成した。Zem
229はpUC18を基礎とする発現ベクターであって、マウス
メタロチオネイン−ＩプロモーターとSV40転写ターミネ
ーターとの間に外来DNAを挿入するためのユニークBamH
I部位を含有する。Zem229はさらに、SV40初期プロモー
ター、マウスジヒドロフォレートダクターゼ遺伝子及び
SV40ターミネーターを含有する。pDX/PC962からのPC962
cDNAを含有するEcoR I断片を、EcoR I−BamH I合成オ
リゴヌクレオチドアダプターを用いて、BamH Iで切断さ
れそしてホスファターゼで処理されたZem229に連結し
た。得られるベクターをPC962/229と称し、第14図に示
す。
りPC962/229と称する第二のプラスミドを造成した。Zem
229はpUC18を基礎とする発現ベクターであって、マウス
メタロチオネイン−ＩプロモーターとSV40転写ターミネ
ーターとの間に外来DNAを挿入するためのユニークBamH
I部位を含有する。Zem229はさらに、SV40初期プロモー
ター、マウスジヒドロフォレートダクターゼ遺伝子及び
SV40ターミネーターを含有する。pDX/PC962からのPC962
cDNAを含有するEcoR I断片を、EcoR I−BamH I合成オ
リゴヌクレオチドアダプターを用いて、BamH Iで切断さ
れそしてホスファターゼで処理されたZem229に連結し
た。得られるベクターをPC962/229と称し、第14図に示
す。
プラスミドPC962/229をリン酸カルシウム法によりBHK
細胞にトランスフェクトした。10％ウシ胎児血清及び５
μg/mlビタミンＫを含有するダルベコのMEM中で培養し
た。このトランスフェクションからの48時間の一時的発
現レベルは約25ng/mlであった。２日後、トランスフェ
クトされた細胞を250nM MTXを含有する選択培地に分
け、そしてさらに14時間培養した。約200コロニーずつ
を含有するこのトランスフェクションからの３枚のプレ
ートをイム／フィルターアッセイによってスクリーニン
グし、そして24個の最も強く反応するコロニーをシリン
ダークローニングにより拾い上げた。これらを10cmプレ
ート中で個別に増殖せしめ、そしてこれらのプロテイン
Ｃ生産レベルを測定した。1.1〜2.3pg/細胞／日を生産
するコロニーを用いて安定なプロテインＣ生産セルライ
ンの調製を行った。
細胞にトランスフェクトした。10％ウシ胎児血清及び５
μg/mlビタミンＫを含有するダルベコのMEM中で培養し
た。このトランスフェクションからの48時間の一時的発
現レベルは約25ng/mlであった。２日後、トランスフェ
クトされた細胞を250nM MTXを含有する選択培地に分
け、そしてさらに14時間培養した。約200コロニーずつ
を含有するこのトランスフェクションからの３枚のプレ
ートをイム／フィルターアッセイによってスクリーニン
グし、そして24個の最も強く反応するコロニーをシリン
ダークローニングにより拾い上げた。これらを10cmプレ
ート中で個別に増殖せしめ、そしてこれらのプロテイン
Ｃ生産レベルを測定した。1.1〜2.3pg/細胞／日を生産
するコロニーを用いて安定なプロテインＣ生産セルライ
ンの調製を行った。
発現ベクターpDX/PC962及びプラスミドpKO−neoをリ
ン酸カルシウム法により293細胞に同時トランスフェク
トした。トランスフェクトされた細胞を48時間後に500
μg/mlのG418を含有する培地に分けた。選択培地中で10
日間の後、イム／フィルターアッセイを行いそしてシリ
ンダークローニングにより２個のコロニーを拾った。プ
ロテインＣ生産は１〜2pg/細胞／日であることが見出さ
れた。培養をスケールアップし、そしてプロテインＣを
イムノーアフィニティークロマトグラフィーにより精製
した。プロテインＣの95％より多くが二本鎖形であるこ
とが見出された。
ン酸カルシウム法により293細胞に同時トランスフェク
トした。トランスフェクトされた細胞を48時間後に500
μg/mlのG418を含有する培地に分けた。選択培地中で10
日間の後、イム／フィルターアッセイを行いそしてシリ
ンダークローニングにより２個のコロニーを拾った。プ
ロテインＣ生産は１〜2pg/細胞／日であることが見出さ
れた。培養をスケールアップし、そしてプロテインＣを
イムノーアフィニティークロマトグラフィーにより精製
した。プロテインＣの95％より多くが二本鎖形であるこ
とが見出された。
BHK細胞及び293細胞から調製された962変異体蛋白質
の構造を、293細胞から及び血漿からの野性型プロテイ
ンＣの構造と比較した。SDS/PAGE及びこれに続く銀染色
による分析によれば、すべての組換蛋白質が、血漿蛋白
質の重鎖及び軽鎖と同時泳動する重鎖及び軽鎖を含有し
ていた。
の構造を、293細胞から及び血漿からの野性型プロテイ
ンＣの構造と比較した。SDS/PAGE及びこれに続く銀染色
による分析によれば、すべての組換蛋白質が、血漿蛋白
質の重鎖及び軽鎖と同時泳動する重鎖及び軽鎖を含有し
ていた。
293細胞中で合成された野性型プロテインＣは有意量
（約20％）のMr＝66,000の単鎖のプロセシングされてい
ない蛋白質を含有しており、他方いずれの細胞型におい
て生産された変異体蛋白質も本質的に完全に二本鎖にプ
ロセシングされていた。Ｎ−末端配列分析によれば、組
換野性型蛋白質及びBHK/PC962変異体蛋白質の軽鎖及び
重鎖の両者は適切にプロセシングされていた。組換蛋白
質のγ−カルボキシル化の程度を２つの異なるELISA系
により測定した。第一の系は蛋白質のγ−カルボキシル
化された形態及びカルボキシル化されたいない形態の両
者を認識し、他方第二の系は、カルシウムの存在下でgl
a−誘導コンホーメーション変化を受けたプロテインＣ
のみを認識する特異的抗体を用いる。この分析によれ
ば、BHK細胞において生産された組換プロテインＣの約6
0％及び293細胞において生産されたそれの90〜95％が、
特異的抗体に認識されるために十分にγ−カルボキシル
化されていた。
（約20％）のMr＝66,000の単鎖のプロセシングされてい
ない蛋白質を含有しており、他方いずれの細胞型におい
て生産された変異体蛋白質も本質的に完全に二本鎖にプ
ロセシングされていた。Ｎ−末端配列分析によれば、組
換野性型蛋白質及びBHK/PC962変異体蛋白質の軽鎖及び
重鎖の両者は適切にプロセシングされていた。組換蛋白
質のγ−カルボキシル化の程度を２つの異なるELISA系
により測定した。第一の系は蛋白質のγ−カルボキシル
化された形態及びカルボキシル化されたいない形態の両
者を認識し、他方第二の系は、カルシウムの存在下でgl
a−誘導コンホーメーション変化を受けたプロテインＣ
のみを認識する特異的抗体を用いる。この分析によれ
ば、BHK細胞において生産された組換プロテインＣの約6
0％及び293細胞において生産されたそれの90〜95％が、
特異的抗体に認識されるために十分にγ−カルボキシル
化されていた。
３種類の組換蛋白質をさらにアミドリシス活性及び抗
凝固活性についても分析し、そして結果を血漿プロテイ
ンＣの活性と比較した。BHK細胞からのPC962及び293細
胞からの野性型プロテインＣの両者が十分なアミドリシ
ス活性を示した。抗凝固アッセイにおいて、BHK細胞か
らのプロテインＣは血漿プロテインＣと本質的に同じ比
活性を有し、他方293細胞からの野性型蛋白質及びPC962
変異体蛋白質は一貫して約40％高い比活性を示した。
凝固活性についても分析し、そして結果を血漿プロテイ
ンＣの活性と比較した。BHK細胞からのPC962及び293細
胞からの野性型プロテインＣの両者が十分なアミドリシ
ス活性を示した。抗凝固アッセイにおいて、BHK細胞か
らのプロテインＣは血漿プロテインＣと本質的に同じ比
活性を有し、他方293細胞からの野性型蛋白質及びPC962
変異体蛋白質は一貫して約40％高い比活性を示した。
C.活性化されたプロテインＣプロセシング部位の変形 プロセシング部位配列Arg−Arg−Lys−Argを有する活
性化されたプロテインＣ前駆体をコードするDNA配列
を、野性型プロテインＣ配列の変異誘発により造成し
た。生ずる配列はPC962中のそれと類似していたが、し
かし活性化ペプチドをコードする部分を欠いていた。
性化されたプロテインＣ前駆体をコードするDNA配列
を、野性型プロテインＣ配列の変異誘発により造成し
た。生ずる配列はPC962中のそれと類似していたが、し
かし活性化ペプチドをコードする部分を欠いていた。
プラスミドp594中に存在するプロテインＣ配列を１回
の変異誘発により変形して活性化ペプチドのコドンを除
去しそしてプロセシング部位のArg−Argコドンを挿入し
た。変異誘発は、配列５′CGC AGT CAC CTG AGA AGA AA
A CGA CTC ATT GAT GGG 3′を有するオリゴヌクレオチ
ドを用いて例7Aに記載したのと実質的に同様にして、p5
94からの870bpSst I断片上で行った。
の変異誘発により変形して活性化ペプチドのコドンを除
去しそしてプロセシング部位のArg−Argコドンを挿入し
た。変異誘発は、配列５′CGC AGT CAC CTG AGA AGA AA
A CGA CTC ATT GAT GGG 3′を有するオリゴヌクレオチ
ドを用いて例7Aに記載したのと実質的に同様にして、p5
94からの870bpSst I断片上で行った。
変異した配列を用いて発現ベクターpDX/PC1058を造成
し、そしてこのベクターを例7Bに記載したようにしてBH
K細胞に同時トランスフェクトした。蛋白質をポリクロ
ーナル抗体カラム上でpH11.5の緩衝液を溶離剤として用
いて精製した。
し、そしてこのベクターを例7Bに記載したようにしてBH
K細胞に同時トランスフェクトした。蛋白質をポリクロ
ーナル抗体カラム上でpH11.5の緩衝液を溶離剤として用
いて精製した。
1058蛋白質の活性を活性化された血漿プロテインＣ及
び活性化されたPC962と比較した。血漿プロテインＣ及
びPC962（５μg/ml）は1/10容量のプロタックＣ（アメ
リカンダイアグノスチカ）で２時間処理することにより
活性化した。50μのヒト血漿を50μの活性化された
プロテインＣと混合し、そしてこの混合物を38℃にて15
0秒間インキュベートすることにより抗凝固活性をアッ
セイした。この混合物に50μの活性化されたセファロ
プラスチン（アメリカン・サイエンティフィック・プロ
ダクツ、マクガウパーク、IL）を加え、そしてこの混合
物を37℃にて300秒間インキュベートした。100μの20
mM CaCl2を加え、そして凝固時間を記録した。データー
を第15図に示す。
び活性化されたPC962と比較した。血漿プロテインＣ及
びPC962（５μg/ml）は1/10容量のプロタックＣ（アメ
リカンダイアグノスチカ）で２時間処理することにより
活性化した。50μのヒト血漿を50μの活性化された
プロテインＣと混合し、そしてこの混合物を38℃にて15
0秒間インキュベートすることにより抗凝固活性をアッ
セイした。この混合物に50μの活性化されたセファロ
プラスチン（アメリカン・サイエンティフィック・プロ
ダクツ、マクガウパーク、IL）を加え、そしてこの混合
物を37℃にて300秒間インキュベートした。100μの20
mM CaCl2を加え、そして凝固時間を記録した。データー
を第15図に示す。
例8.プロテインＣを分泌せしめるためのファクターVII
及びプロトロンビンのプレープロペプチドの使用 適切にプロセシングされたプロテインＣの一層の高収
量のため、プロテインＣプレープロペプチドの代わりに
ファクターVIIプレープロペプチドを用いた。次に、こ
れらのハイブリド造成分を適当な発現ベクターに挿入
し、そして哺乳類セルラインにトランスフェクトする。
及びプロトロンビンのプレープロペプチドの使用 適切にプロセシングされたプロテインＣの一層の高収
量のため、プロテインＣプレープロペプチドの代わりに
ファクターVIIプレープロペプチドを用いた。次に、こ
れらのハイブリド造成分を適当な発現ベクターに挿入
し、そして哺乳類セルラインにトランスフェクトする。
ファクターVIIをコードするcDNAは記載されている（H
agen等，Proc.Nstl.Acad.Sci.USA 83:2412−2416,198
6）。クローンHV II565は38アミノ酸のプレープロペプ
チドのためのコード配列を含む。このコード配列を140b
pのEcoR I−Hha I断片として単離した。
agen等，Proc.Nstl.Acad.Sci.USA 83:2412−2416,198
6）。クローンHV II565は38アミノ酸のプレープロペプ
チドのためのコード配列を含む。このコード配列を140b
pのEcoR I−Hha I断片として単離した。
プロテインＣ配列をp594からSst Iによる部分開裂及
びEcoR Iによる完全消化により単離した。コドン＋７の
Sst部位からcDNAの３′側のEcoR Iまで延びる1540bpの
断片を単離した。
びEcoR Iによる完全消化により単離した。コドン＋７の
Sst部位からcDNAの３′側のEcoR Iまで延びる1540bpの
断片を単離した。
次に、ファクターVII配列及びプロテインＣ配列を、
ファクターVIIプレープロペプチドのアミノ酸−３〜−
１及びプロテインＣのアミノ酸１−８のコード配列を完
成するオリゴヌクレオチドリンカーにより連結した。こ
のリンカーは、配列５′CCGGCGCGCCAACTCCTTCCTGGAGGAG
CT3′、及び５′CCTCCAGGAAGGAGTTGGCGCGCCGGCG3′を有
する２個のオリゴヌクレオチドから調製した。２個のオ
リゴヌクレオチドをアニールし、そして四元連結により
ファクターVIIプレープロ配列、プロテインC cDNA、及
びEcoR Iにより開裂されそして細菌アルカリ性ホスファ
ターゼにより処理されたpUC9に連結した。連結されたDN
Aを使用してE.コリ（JM 101）を形質転換した。プラス
ミドDNAを調製し、そして1710bpのEcoR I断片の存在に
ついてスクリーニングした。正しいクローンをp7/C−10
と称する。
ファクターVIIプレープロペプチドのアミノ酸−３〜−
１及びプロテインＣのアミノ酸１−８のコード配列を完
成するオリゴヌクレオチドリンカーにより連結した。こ
のリンカーは、配列５′CCGGCGCGCCAACTCCTTCCTGGAGGAG
CT3′、及び５′CCTCCAGGAAGGAGTTGGCGCGCCGGCG3′を有
する２個のオリゴヌクレオチドから調製した。２個のオ
リゴヌクレオチドをアニールし、そして四元連結により
ファクターVIIプレープロ配列、プロテインC cDNA、及
びEcoR Iにより開裂されそして細菌アルカリ性ホスファ
ターゼにより処理されたpUC9に連結した。連結されたDN
Aを使用してE.コリ（JM 101）を形質転換した。プラス
ミドDNAを調製し、そして1710bpのEcoR I断片の存在に
ついてスクリーニングした。正しいクローンをp7/C−10
と称する。
ファクターVII/プロテインＣ融合蛋白質を293細胞中
で発現せしめた。プラスミドp7/C−10からのEcoR I挿入
部をEcoR Iで消化したpDXに連結した。生ずる発現ベク
ターを用いて前記の様にして293細胞を同時トランスフ
ェクトした。24時間の発現レベルをELISAにより測定
し、そして野性型プロテインＣ発現造成物によりトラン
スフェクトされた293細胞及びトランスフェクトされて
いない細胞の発現レベルと比較した。結果を第５表に示
す。
で発現せしめた。プラスミドp7/C−10からのEcoR I挿入
部をEcoR Iで消化したpDXに連結した。生ずる発現ベク
ターを用いて前記の様にして293細胞を同時トランスフ
ェクトした。24時間の発現レベルをELISAにより測定
し、そして野性型プロテインＣ発現造成物によりトラン
スフェクトされた293細胞及びトランスフェクトされて
いない細胞の発現レベルと比較した。結果を第５表に示
す。
プロトロンビンリーダー配列を第６表に示すオリゴヌ
クレオチドから調製し、そして成熟プロテインＣコード
配列に融合せしめた。1m MATPを含有する20μのキナ
ーゼ緩衝液中で50ngの各オリゴヌクレオチドを１ユニッ
トの＋４キナーゼと混合することによりオリゴヌクレオ
チドをキナーゼ処理した。37℃にて30分間反応を進行せ
しめ、次に混合物を65℃にて10分間加熱してキナーゼを
不活性化した。
クレオチドから調製し、そして成熟プロテインＣコード
配列に融合せしめた。1m MATPを含有する20μのキナ
ーゼ緩衝液中で50ngの各オリゴヌクレオチドを１ユニッ
トの＋４キナーゼと混合することによりオリゴヌクレオ
チドをキナーゼ処理した。37℃にて30分間反応を進行せ
しめ、次に混合物を65℃にて10分間加熱してキナーゼを
不活性化した。
次に、プロトロンビンリーダーを組み立てた。EcoR I
及びSst Iで切断された50ngのMBmp19を2.5ngずつのキナ
ーゼ処理されたオリゴヌクレオチドと、1m MATP及び４
ユニットのT4リガーゼを含有する20μの１×リガーゼ
緩衝液中で混合した。この混合物を15℃にて48時間イン
キュベートし、そしてコンピテントE.コリJM101細胞に
トランスフェクトした。透明なプラークを選択し、そし
てファージDNAを調製した。DNAの配列決定により正しい
配列が造成されたことが確認された。
及びSst Iで切断された50ngのMBmp19を2.5ngずつのキナ
ーゼ処理されたオリゴヌクレオチドと、1m MATP及び４
ユニットのT4リガーゼを含有する20μの１×リガーゼ
緩衝液中で混合した。この混合物を15℃にて48時間イン
キュベートし、そしてコンピテントE.コリJM101細胞に
トランスフェクトした。透明なプラークを選択し、そし
てファージDNAを調製した。DNAの配列決定により正しい
配列が造成されたことが確認された。
次に、プロトロンビンリーダーをプロテインＣ配列に
連結した。合成されたリーダーを含有するファージクロ
ーンからRF DNAを調製し、そして150bpのEcoR I−Sst I
断片を単離した。プラスミドp594をEcoR Iで完全消化
し、そしてSst Iで完全消化し、そして1540bpのプロテ
インＣ断片を回収し。これらの断片をEcoR Iで切断した
pDXと連結し、そして連結混合物を用いてコンピテント
E.コリHB101細胞を形質転換した。形質転換体コロニー
からプラスミドDNAを単離し、そして制御酵素消化によ
り分析し、断片が正しい方向で組立てられたことを確認
した。
連結した。合成されたリーダーを含有するファージクロ
ーンからRF DNAを調製し、そして150bpのEcoR I−Sst I
断片を単離した。プラスミドp594をEcoR Iで完全消化
し、そしてSst Iで完全消化し、そして1540bpのプロテ
インＣ断片を回収し。これらの断片をEcoR Iで切断した
pDXと連結し、そして連結混合物を用いてコンピテント
E.コリHB101細胞を形質転換した。形質転換体コロニー
からプラスミドDNAを単離し、そして制御酵素消化によ
り分析し、断片が正しい方向で組立てられたことを確認
した。
以上、特定の例によりこの発明を具体的に説明した
が、この発明の範囲がこれらの例に限定されるものでは
ない。
が、この発明の範囲がこれらの例に限定されるものでは
ない。
第１図はpHCλ6L中のプロテインC cDNAの部分的制限地
図である。コード領域は空箱で示されている。 第２−１図〜第２−３図は完全なプロテインC cDNAのヌ
クレオチド配列及びプロテインＣの推定アミノ酸配列を
示す。矢印は連結ジペプチド及び活性化ペプチドの除去
のための開裂部位を示す。 第３図はヒトプロテインＣをコードするゲノムDNAの制
限酵素地図を示す。線の下の数値は長さキロベース（k
b）を示す。 第４−１図〜第４〜４図はヒトプロテインＣ遺伝子のエ
クソン及びイントロンを含む完全なゲノム配列を示す。
矢印はイントロン−エクソンのスプライス連結部を示
す。３′末端のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ
−Ａ−Ａ−Ａのポリアデニレーション又はプロセシング
配列が箱で示されている。◆：可能性ある炭水化物付着
部位、 連結ジペプチドのプロセシングのための見かけ上の開裂
部位、↓：プロテインＣが活性化されたプロテインＣに
転換される際の開裂部位、及び●：ポリアデニレーショ
ンの部位が示されている。 第５図はヒトプロテインＣの構造の概略の二次元モデル
を示す。 第６図はプロテインＣの部分的cDNAクローンの５′部分
及び３′部分のサブクローニングを示す。 第７図はゲノムクローンからのイントロンＡの除去によ
るエクソンＩとエクソンIIの融合を示す。 第８図は第１図のcDNA挿入部の５′末端へのエクソンＩ
及びIIの融合を示す。 第９図はプロテインＣの完全なコード配列を含んで成る
プラスミドの造成を示す。 第10図は発現ベクターpD7Cを示す。使用されている記号
は、ori＝アデノウイルス５ ０−１マップユニット配
列;E＝SV40エンハンサー;Ad2MLP＝アデノウイルス２主
要後期プロモーター;L1−３＝アデノウイルス２三分節
（tripartite）リーダー;5′ss＝５′スプライス部位;
3′ss＝３′スプライス部位;pA＝SV40初期ポリアデニレ
ーションシグナル；及びΔ＝pBR322“毒性”配列の除去
された部分、を示す。 第11図は発現ベクターpD5（PC−DHFRr）を示す。DHFRr
はメトトレキセート耐性変異ジヒドロフォレートレダク
ターゼ遺伝子配列を示し；そしてpAはSV40後期ポリアデ
ニレーションシグナルを示す。他の記号は第10図につい
て記載した通りである。 第12図は発現ベクターpDX/PCを示す。記号は第11図につ
いて記載した通りである。 第13図はトランスフェクトされた293細胞からの培地サ
ンプルでの活性化されたプロテインＣのアッセイの結果
を示す。 第14図は発現ベクターpDX/PC962及びPC962/229を示す。 第15図はこの発明の幾つかの態様に従って製造されたプ
ロテインＣの抗凝固活性を示す。
図である。コード領域は空箱で示されている。 第２−１図〜第２−３図は完全なプロテインC cDNAのヌ
クレオチド配列及びプロテインＣの推定アミノ酸配列を
示す。矢印は連結ジペプチド及び活性化ペプチドの除去
のための開裂部位を示す。 第３図はヒトプロテインＣをコードするゲノムDNAの制
限酵素地図を示す。線の下の数値は長さキロベース（k
b）を示す。 第４−１図〜第４〜４図はヒトプロテインＣ遺伝子のエ
クソン及びイントロンを含む完全なゲノム配列を示す。
矢印はイントロン−エクソンのスプライス連結部を示
す。３′末端のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ
−Ａ−Ａ−Ａのポリアデニレーション又はプロセシング
配列が箱で示されている。◆：可能性ある炭水化物付着
部位、 連結ジペプチドのプロセシングのための見かけ上の開裂
部位、↓：プロテインＣが活性化されたプロテインＣに
転換される際の開裂部位、及び●：ポリアデニレーショ
ンの部位が示されている。 第５図はヒトプロテインＣの構造の概略の二次元モデル
を示す。 第６図はプロテインＣの部分的cDNAクローンの５′部分
及び３′部分のサブクローニングを示す。 第７図はゲノムクローンからのイントロンＡの除去によ
るエクソンＩとエクソンIIの融合を示す。 第８図は第１図のcDNA挿入部の５′末端へのエクソンＩ
及びIIの融合を示す。 第９図はプロテインＣの完全なコード配列を含んで成る
プラスミドの造成を示す。 第10図は発現ベクターpD7Cを示す。使用されている記号
は、ori＝アデノウイルス５ ０−１マップユニット配
列;E＝SV40エンハンサー;Ad2MLP＝アデノウイルス２主
要後期プロモーター;L1−３＝アデノウイルス２三分節
（tripartite）リーダー;5′ss＝５′スプライス部位;
3′ss＝３′スプライス部位;pA＝SV40初期ポリアデニレ
ーションシグナル；及びΔ＝pBR322“毒性”配列の除去
された部分、を示す。 第11図は発現ベクターpD5（PC−DHFRr）を示す。DHFRr
はメトトレキセート耐性変異ジヒドロフォレートレダク
ターゼ遺伝子配列を示し；そしてpAはSV40後期ポリアデ
ニレーションシグナルを示す。他の記号は第10図につい
て記載した通りである。 第12図は発現ベクターpDX/PCを示す。記号は第11図につ
いて記載した通りである。 第13図はトランスフェクトされた293細胞からの培地サ
ンプルでの活性化されたプロテインＣのアッセイの結果
を示す。 第14図は発現ベクターpDX/PC962及びPC962/229を示す。 第15図はこの発明の幾つかの態様に従って製造されたプ
ロテインＣの抗凝固活性を示す。
フロントページの続き (72)発明者 キャスリーン エル，バークナー アメリカ合衆国，ワシントン 98199, シアトル，トゥエンティセカンド ア ベニュ ウェスト 3032
Claims (5)
- 【請求項１】ヒトプロテインＣ又は活性化されたヒトプ
ロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白
質をコードし、さらに軽鎖及び重鎖間の開裂部位にある
アミノ酸配列（R1）ｎ−R2−R3−R4（式中、R1,R2,R3、
及びR4はLys又はArgであり、そしてｎは0,1,2又は３で
ある）をコードするDNA。 - 【請求項２】前記アミノ酸配列が軽鎖及び重鎖の間の開
裂部位にあるArg−Arg−Lys−Argである特許請求の範囲
第１項に記載のDNA。 - 【請求項３】哺乳類宿主細胞DNA中に組み込まれ得る発
現ベクターであって、プロモーター、該プロモーターに
続きその下流に、ヒトプロテインＣ又は活性化されたヒ
トプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を有する
蛋白質をコードし、さらに軽鎖及び重鎖間の開裂部位に
あるアミノ酸配列（R1）ｎ−R2−R3−R4（式中、R1,R2,
R3、及びR4はLys又はArgであり、そしてｎは0,1,2又は
３である）をコードするDNA配列が存在し、該DNA配列に
続いてその下流にポリアデニレーションシグナルが存在
し、該DNA配列の転写が前記プロモーターにより指令さ
れる、前記発現ベクター。 - 【請求項４】哺乳類宿主細胞DNA中に組み込まれ得る発
現ベクターであって、プロモーター、該プロモーターに
巻きその下流に、ヒトプロテインＣ又は活性化されたヒ
トプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を有する
蛋白質をコードし、さらに軽鎖及び重鎖間の開裂部位に
あるアミノ酸配列（R1）ｎ−R2−R3−R4（式中、R1,R2,
R3、及びR4はLys又はArgであり、そしてｎは0,1,2又は
３である）をコードするDNA配列が存在し、該DNA配列に
続いてその下流にポリアデニレーションシグナルが存在
し、該DNA配列の転写が前記プロモーターにより指令さ
れる、前記発現ベクターによりトランクフェクトされた
哺乳類細胞。 - 【請求項５】前記細胞がCOS細胞、BHK細胞、ラットHep
I細胞、ラットHep II細胞、ヒト肺細胞、ヒト肺癌細
胞、HepG2細胞、マウス肝細胞、DUKX細胞及び293細胞か
ら成る群から選ばれたものである特許請求の範囲第４項
に記載の細胞。
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| AT402263B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Pharmazeutische präparation enthaltend eine thrombolytisch wirkende substanz |
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| DE4229933A1 (de) * | 1992-09-08 | 1994-03-10 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Bestimmung von Thrombose verursachenden Lupus-anticoagulant-Antikörpern |
| US5618714A (en) * | 1993-12-15 | 1997-04-08 | Eli Lilly And Company | Methods for producing protein C |
| AT403167B (de) * | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Immuno Ag | Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems |
| US5905185A (en) * | 1995-11-30 | 1999-05-18 | Ppl Therapeutics | Protein C production in non-human transgenic mammals |
| US6111081A (en) * | 1996-05-31 | 2000-08-29 | Baylor College Of Medicine | Lactoferrin variants and uses thereof |
| AU730133B2 (en) * | 1996-11-08 | 2001-02-22 | Oklahoma Medical Research Foundation | Modified protein C and methods of use thereof |
| US6165771A (en) * | 1997-06-10 | 2000-12-26 | Smithkline Beecham, P.L.C. | Compounds |
| US6924359B1 (en) * | 1999-07-01 | 2005-08-02 | Yale University | Neovascular-targeted immunoconjugates |
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| WO2004113385A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Maxygen Holdings Ltd. | Protein c propeptide variants |
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