JP2922461B2 - ヒトプロテインｃの製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】この発明は一般に血漿蛋白質
及びそれらをコードするＤＮＡ配列に関し、そしてさら
に詳しくはヒトプロテインＣ又は活性化されたヒトプロ
テインＣと実質的に同一の構造及び／又は活性を有する
蛋白質に関する。 【０００２】 【従来の技術】プロテインＣは、生体内での血液凝固及
びフィブリン溶解活性の発生において重要な役割を演ず
るセリンプロテアーゼのチモーゲン又は前駆体である。
このものは肝臓中で単鎖ポリペプチドとして合成され、
このポリペプチドはかなりのプロセシングを受けてジス
ルフィド結合により一緒に保持された重鎖（Ｍｒ＝４
０，０００）及び軽鎖（Ｍｒ＝２１，０００）を含んで
成る２本鎖分子となる。循環中のこの２本鎖中間体は、
重鎖のアミノ末端からの１２残基ペプチドのトロンビン
介在開裂により“活性化されたプロテインＣ”（ＡＰ
Ｃ）として知られる生物学的に活性な形の分子に転換さ
れる。この開裂反応は生体内において内皮細胞補因子で
あるトロンボモドゥリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉ
ｎ）により増強される（Esmon 及びOwen, Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 78：2249−2252, 1981) 。 【０００３】プロテインＣは、それぞれグルタミン酸及
びアスパラギン酸残基の翻訳後修飾によって形成される
およそ９残基のβ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）
及び１残基のβ−ヒドロキシアスパラギン酸を含有する
ビタミンＫ−依存性の糖蛋白質である。プロテインＣ中
の特定のγ−カルボキシグルタミン酸残基の翻訳後形成
はビタミンＫを必要とする。これらの異常アミノ酸残基
はカルシウムイオンに結合し、そしてプロテインＣの生
物学的活性のために必要とされるリン脂質と該蛋白質と
の相互作用を担当するものと信じられる。 【０００４】ファクターVII 、ファクターIX及びファク
ターＸのごとき他のビタミンＫ依存性血漿蛋白質の凝固
促進作用とは対照的に活性化されたプロテインＣは限定
された蛋白質分解によるファクターＶａ及びファクター
VIIIａの不活性化を介して凝固過程の制御剤として機能
する。プロテインＣによるファクターＶａ及びVIIIａの
不活性化は酸性リン脂質及びカルシウムイオンの存在に
依存する。プロテインＳはＡＰＣで触媒されるアクター
Ｖａの蛋白質分解を促進することによりこの活性化を制
御するものと報告されている（Walker, J. Biol. Chem.
255：5521〜5524, 1980) 。 【０００５】プロテインＣはまた組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子の作用と関連している(Kisiel及びFujikaw
a, Behring Inst. Mitt. 73：29−42，1983) 。ウシＡ
ＰＣのイヌへの注入によりプラスミノーゲン活性化因子
の活性が上昇する（Comp及びEsmon, J. Clin. Inves
t., 68, 1221−1228, 1981) 。最近の研究 (Sakata等、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82：1121−1125, 1985)
によれば、培養された内皮細胞へのＡＰＣの添加は、該
細胞によるウロキナーゼ関連プラスミノーゲン活性化因
子及び組織型プラスミノーゲン活性化因子の両者の活性
の上昇を反映して、条件化培地中でのフィブリン溶解活
性の急速な投与量依存的上昇を導く。ＡＰＣ処理はま
た、抗活性化因子の活性の量依存的低下をもたらす。 【０００６】プロテインＣ不足は再発血栓性疾患と関連
し（Broekmans 等、New Eng. J. Me d . 309 ：340-344,
1983 ：及びSeligsohn 等、New Eng. J. Med . 310 ：
559-562, 1984)、そして遺伝的欠陥から、又は肝疾患も
しくは外科手術のごとき傷害から生ずるであろう。この
状態は一般に経口抗凝固剤により治療される。プロテイ
ンＣを含有する正常血漿の注入によっても有利な効果が
得られている（Gardiner及びGriffin, Prog. in Hemat
ology , Brown, Grune及びStratton編、NY, 13：265-27
8 を参照のこと) 。さらに、若干の研究者は、プロテイ
ンＣの抗凝固活性が静脈血栓症のごとき血栓性疾患の治
療において有用であることを見出した (Smith 等、ＰＣ
Ｔ公開No. ＷＯ８５／００５２１）。世界のあちこちで
１６，０００の個体中およそ１個体がプロテインＣ不足
状態にあると推測される。 【０００７】最後に、外来プロテインＣはグラム陰性敗
血症の凝血異状効果及び致死的効果を防止することが示
された（Taylor等、J. Clin. Invest . 79：918-925, 1
987)。ヒヒを用いた研究から得られたデーターは、プロ
テインＣが敗血症に対する保護において自然の役割を演
ずることを示している。天然プロテインＣは凝固因子濃
縮物から (Marlar等、Blood 59：1067−1072) 又は血
漿から (Kisrel, 前掲) 精製することができようが、出
発材料の入手の可能性が限定されていること、血漿中の
プロテインＣ濃度が低いこと等のため、この方法は複雑
且つ高価である。さらに、ヒトの血液に由来する生成物
の療法的使用は、例えば肝炎ウイルス、サイトメガロウ
イルス、又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原
体による病気の伝染の危険性を伴う。血栓性疾患の治療
におけるプロテインＣの臨床的適用の観点から、有用量
のプロテインＣ及び活性化されたプロテインＣを製造す
ることは明らかに価値あることである。 【０００８】 【発明の概要】要約すれば、この発明はヒトプロテイン
Ｃ又は活性化されたヒトプロテインＣと実質的に同一の
構造及び／又は生物学的活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を開示する。この発明の１つの観点に従え
ば、このＤＮＡ配列はさらに、軽鎖及び重鎖の開裂部位
におけるアミノ酸配列（Ｒ₁ ）_n −Ｒ₂ −Ｒ₃ −Ｒ
₄ （式中、Ｒ₁ ，Ｒ₂ ，Ｒ₃ 及びＲ₄ はＬｙｓ又はＡｒ
ｇであり、そしてｎは１，２又は３である）をコードす
る。好ましい態様においては、開裂部位における前記ア
ミノ酸配列はArg-Arg-Lys-Arg である。 【０００９】この発明の他の態様においては、この蛋白
質はＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ又はＧｌｙのごとき非一酸
性アミノ酸残基による残基１５８（Ａｓｐ）の置き換え
を含む。関連する観点において、この蛋白質はＬｙｓ又
はＡｒｇのごとき塩基性アミノ酸残基による残基１５４
（Ｈｉｓ）の置き換えを含む。他の観点において、この
蛋白質はＬｙｓ−Ｌｙｓ又はＡｒｇ−Ａｒｇによる天然
プロテインＣの残基１５６−１５７のＬｙｓ−Ａｒｇの
置き換えを含む。この発明の他の観点は、ヒトプロテイ
ンＣ又は活性化されたヒトプロテインＣと実質的に同一
の生物学的活性を有する蛋白質をコードし、さらにファ
クターVII 、ファクターIX、ファクターＸ、プロトロン
ビン又はプロテインＳのごとき蛋白質のプレ−プロペプ
チドをコードするＤＮＡ配列に向けられる。 【００１０】さらに、この発明は哺乳類宿主細胞のＤＮ
Ａ中に組み込まれ得る発現ベクターを開示し、このベク
ターはプロモーター、及びこれに続きこの下流に存在す
る、ヒトプロテインＣ又は活性化されたヒトプロテイン
Ｃと実質的に同一な構造及び／又は活性を有する蛋白質
をコードする前記のごとくＤＮＡ配列を含有し、該ヌク
レオチド配列の転写は前記プロモーターにより指令され
る。このヌクレオチド配列に続くその下流にポリアデニ
レーションシグナルが存在する。１つの態様において
は、前記ヌクレオチド配列とポリアデニレーションシグ
ナルとの間に選択マーカーを含有し、該選択マーカーの
転写が前記プロモーターにより指令される。この発現ベ
クターはまた一組のＲＮＡスプライス部位も含むことが
できる。 【００１１】この発明の関連する観点は、活性化された
ヒトプロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を活性
化後に有する蛋白質を発現するためにトランスフェクト
された哺乳類細胞を開示する。哺乳類宿主細胞ＤＮＡに
組み込まれる得る発現ベクターにより哺乳類細胞がトラ
ンスフェクトされ、この発現ベクターはプロモーター及
びその下流に続く前記のＤＮＡ配列を含有する。１つの
具体例において、選択マーカーがさらに細胞に導入さ
れ、そして安定にトランスフェクトされた細胞が選択さ
れる。活性化されたヒトプロテインＣと実質的に同一の
生物学的活性を有する蛋白質を発現するためにトランス
フェクトされた哺乳類細胞も開示される。この発明にお
いて使用するために好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞、Ｂ
ＨＫ細胞及び２９３細胞である。 【００１２】この発明の他の観点は、活性化されたヒト
プロテインＣと実質的に同一の生物学的活性を活性化後
に有する蛋白質の製造方法を開示する。この方法は、
（ａ）ヒトプロテインＣと実質的に同一の構造及び／又
は活性を有する蛋白質をコードする前記のＤＮＡ配列を
含んで成る発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入し；
（ｂ）この哺乳類宿主細胞を適当な培地中で増殖せし
め；そして（ｃ）前記ＤＮＡ配列にコードされておりそ
して前記哺乳類動物細胞により生産された蛋白質生成物
を単離する、ことを含んで成る。この方法に従って製造
される蛋白質生成物も開示される。活性化されたヒトプ
ロテインＣと実質的に同一の構造及び／又は生物学的活
性を有する蛋白質の製造方法もまた開示される。 【００１３】この発明において記載される蛋白質は活性
療法物質として使用され、この使用には血液凝固の制御
における使用が含まれる。さらに、これらの蛋白質は生
理的に許容されるキャリヤー及び／又は稀釈剤と混合さ
れ、適当な医薬組成物が提供される。この発明の他の観
点は以後の詳細な記載及び添付された図面により明らか
になるであろう。 【００１４】 【実施の態様】この発明を記載するに先立ち、これ以後
に使用する若干の用語の定義を記載することが発明の理
解に役立つであろう。生物学的活性 生物学的関連において（すなわち、生物体において、又
はインビトロでの模倣において）分子により行われる１
つの機能又は一組の機能。蛋白質の生物学的活性は触媒
的活性とエフェクター活性に分けられる。ビタミンＫ依
存性血漿蛋白質の触媒活性は一般に他の血漿蛋白質の特
異的蛋白質分解的開裂による該基質の活性化又は不活性
化を含む。エフェクター活性は、カルシウム、リン脂質
もしくは他の小分子、巨大分子、例えば蛋白質、又は細
胞への生物学的に活性な分子の特異的結合を含む。エフ
ェクター活性はしばしば、生理的条件下で触媒活性を増
強するか、又はそのために必須である。 【００１５】プロテインＣについては、生物学的活性は
その抗凝固活性及びフィブリン溶解性により特徴付けら
れる。プロテインＣは活性化された場合、リン脂質及び
カルシウムの存在下でファクターＶａ及びファクターVI
IIａを不活性化する。プロテインＳはこの機能の制御に
関与するようである。（Walker、前掲) 。活性化された
プロテインＣはまたフィブリン溶解を増強し、この効果
はプラスミノーゲン活性化因子阻害剤のレベルの低下に
より介在されると信じられる (van Hinsbergh等、Blood
65：444-451, 1985)。あとで詳細に記載するよう
に、プロテインＣのエクソンVII 及びVIIIによりコード
されているプロテインＣの部分がこの触媒活性を主とし
て担当する。 【００１６】プレ−プロペプチド 幾つかの蛋白質のアミノ末端に存在し、そして一般にト
ランスロケーションの際に蛋白質から開裂されるアミノ
酸配列。プレ−プロペプチドは蛋白質を細胞の分泌径路
に向ける配列（シグナル配列）を含み、そして疎水性ア
ミノ酸のコアーの存在により特徴付けられる。これらは
またプロセシングシグナルを含有する。この明細書にお
いて使用する場合、「プレ−プロペプチド」なる語はま
た天然プレ−プロペプチドの部分をも意味する。 【００１７】発現ユニット 注目の蛋白質をコードする一次ヌクレオチド配列を、該
一次ヌクレオチド配列の転写を指令しそして調節する他
のヌクレオチド配列と共に含んで成るＤＮＡ造成物。発
現ユニットは少なくとも１個の一次ヌクレオチド配列、
並びに該一次ヌクレオチド配列の上流に位置しそしてそ
れに作用可能に連結されているプロモーター配列及び下
流に位置するポリアデニレーションシグナルから成る。
発現の効率を高めるために追加の遺伝子要素を含めるこ
ともできる。これらの要素にはエンハンサー配列、リー
ダー及びｍＲＮＡスプライス部位が含まれる。 【００１８】発現ベクター 注目の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、プロモーター
及び該蛋白質の発現を促進する他の配列と共に含んでな
るＤＮＡ分子。発現ベクターはさらに、自律複製により
又は宿主のゲノムへの取り込みにより宿主細胞中での複
製をもたらす遺伝情報を含有する。組換ＤＮＡにおいて
一般に使用される発現ベクターの例としてプラスミド及
び幾つかのウイルスが挙げられるが、両者の要素を含む
こともできる。これらはまた選択マーカーを含むことが
できる。 【００１９】前記のごとく、プロテインＣは肝臓で生産
され、そしてその生合成のためにビタミンＫを必要とす
る。ビタミンＫは軽鎖のアミノ末端領域中の特定のγ−
カルボキシグルタミン酸残基の形成のために必要であ
る。これらのアミノ酸残基は翻訳後修飾によって形成さ
れ、そしてリン脂質へのカルシウム介在結合のために必
要とされる。さらに、プロテインＣは１個のβ−ヒドロ
キシアスパラギン酸残基を含有し、このものもやはり翻
訳後修飾により形成される。しかしながら、このアミノ
酸残基の役割は知られていない。 【００２０】プロテインＣの活性が特定のグルタミン酸
残基のγ−カルボキシル化を含む翻訳後修飾、及び２本
鎖形への開裂に依存し、そしてさらに特定のアスパラギ
ン酸のヒドロキシル化に依存するとすれば、微生物での
プロテインＣのクローニング及び発現により活性な生成
物を製造することはできそうにない。従って、この発明
は、γ−カルボキシル化されており活性化されたヒトプ
ロテインＣの生物学的活性を活性化後に有する蛋白質
を、該蛋白質を安定に発現するようにトランスフェクト
された哺乳類細胞を用いて製造する方法を提供する。こ
の発明はさらに、γ−カルボキシル化されており、そし
て活性化を必要とすることなく活性化されたヒトプロテ
インＣの生物学的活性を有する蛋白質の製造方法を提供
する。 【００２１】ウシプロテインＣの軽鎖及び重鎖が配列決
定されている（Fernlund及びStenflo, J. Biol. Chem.
257 ：12170-12179, 1982 ；並びにStenflo 及びFern
lund, J. Biol. Chem. 257 ：12180-12190, 1982)。ヒ
トプロテインＣの単離及び特徴付けがKisiel, J. Clin.
Invest. 64：761-769, 1979 により記載されている。
ヒト及びウシの両者の酵素の抗凝固活性は高度に種特異
的であることが見出された。種特異性はプロテインＳに
より介在されると信じられる（Walker, Thromb. Res.
22：321-327, 1981)。しかしながら、ヒト及びウシの蛋
白質は相互に、そしてプロトロンビン、ファクターVII
、ファクターIX及びファクターＸを含む他のビタミン
Ｋ−依存性血漿蛋白質と、かなりの全体的構造相同性を
示す。類似点は軽鎖中のＧｌａ残基の依存及び重鎖中の
活性部位セリンの存在、並びに軽鎖のアミノ末端領域の
他のアミノ酸配列の相同性を含む。 【００２２】この発明においては、ヒト肝ｍＲＮＡから
λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを調製した。次にこの
ライブラリーをヒトプロテインＣに対する ¹²⁵Ｉ−ラベ
ル化抗体によりスクリーニングした。抗体反応性クロー
ンはさらに、λｇｔ１１ベクターにおけるβ−ガラクト
シダーゼ及びプロテインＣの融合蛋白質の合成について
分析された。クローンの１つが抗体プローブによる強い
シグナルを与え、そして約１４００bpの挿入部を含有す
ることが見出された。ＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列分子
は、Fernlund及びStenflo(J. Biol. Chem. 257 ：1217
0-12179 ；並びにJ. Biol. Chem. 257 ：12180-12190)
により決定されたウシプロテインＣの多くの部分と高度
の相同性を示す推定アミノ酸配列を示した。 【００２３】このＤＮＡ挿入部は、軽鎖のアミノ酸６４
から始まり、完全な重鎖コード領域を含みそして終止コ
ドンに至るプロテインＣのためのコード領域の大部分を
含んでいた。さらに、重鎖の終止コドンに続き２９４塩
基対の３′非コード配列及び９塩基対のポリ（Ａ）テイ
ルが存在した。プロセシング又はポリアデニレーション
シグナルＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−ＡはこのｃＤＮＡ挿入部
のポリ（Ａ）テイルから１３塩基対上流に存在した。こ
の配列は２個の可能性あるポリアデニレーション部位の
１つであった。 【００２４】このｃＤＮＡ配列（配列番号：１）はまた
位置１５６−１５７（アミノ酸の番号は図２に示されて
いる）のジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇをコードし、このジ
ペプチドは軽鎖を重鎖から分離し、そしてプロセシング
の過程で蛋白質分解的開裂により除去され、二本鎖分子
の分泌をもたらす。トロンビンによる二本鎖分子の活性
化の後、ヒトプロテインＣの重鎖はアルギニン１６９及
びロイシン１７０の間で開裂し、活性化ペプチド（図
２）を放出する。 【００２５】類似の方法により、プレ−プロペプチド及
びプロテインＣの最初の２３アミノ酸のコード配列を欠
く第二のｃＤＮＡが単離された。このｃＤＮＡをハイブ
リダイゼーションプローブとして用いてコード配列の残
りの部分をλシャロン４Ａ中ヒトゲノムＤＮＡライブラ
リー（Foster等、Proc. Natl. Acad. Sci USA 82：46
73−4677, 1985) から得た。プロテインＣ遺伝子のオー
バーラップする挿入部を含有するこれらの異るλシャロ
ン４Ａファージを単離した。 【００２６】３個のファージクローン上のエクソンの位
置が、これらのクローンの消化物と上記の１４００bp
ｃＤＮＡから作られたプローブとのサザンハイブリダイ
ゼーションにより決定された。これらのクローン中のゲ
ノムＤＮＡ挿入部を、１回又は２回の制限酵素消化及び
これに続くアガロースゲル電気泳動、サザンブロッティ
ング、並びにヒトプロテインＣのｃＤＮＡに由来する放
射能ラベルされた５′プローブ及び３′プローブへのハ
イブリダイゼーションにより、図５に示すようにマップ
した。 【００２７】ＤＮＡ配列決定研究はジデオキシ・チエイ
ン−ターミネーション法を用いて行った。図６〜９（配
列番号：２）に示すように、ヒトプロテインＣの遺伝子
のヌクレオチド配列はおよそ１１kgｂのＤＮＡにわた
る。これらの研究はさらに４２アミノ酸の可能性あるプ
レ−プロペプチドを示した。このプレ−プロ配列は位置
−２５のＧｌｙ残基の後でシグナルペプチダーゼにより
開裂される。成熟蛋白質へのプロセシングは、残基−１
の後の追加の蛋白質分解的開裂によるアミノ末端プロペ
プチドの除去、並びに残基１５５及び１５７における開
裂による、軽鎖と重鎖を連結するＬｙｓ−Ａｒｇジペプ
チドの除去を含む。この最後のプロセシングが１５５ア
ミノ酸の軽鎖及び２６２アミノ酸の重鎖をもたらす。 【００２８】プロテインＣ遺伝子は２５〜８８５ヌクレ
オチドのサイズの８個のエクソン、及び９２〜２６６８
ヌクレオチドのサイズの７個のイントロンから成る。エ
クソンＩ及びエクソンIIの一部分がプレ−プロペプチド
の４２アミノ酸をコードする。エクソンIIの残りの部
分、エクソンIII 、エクソンIV、エクソンＶ、及びエク
ソンVIの一部分がプロテインＣの軽鎖をコードする。エ
クソンVIの残りの部分、エクソンVII 、及びエクソンVI
IIがプロテインＣの重鎖をコードする。ヒトプロテイン
ＣをコードするｃＤＮＡのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列
を図２〜４（配列番号：１）に示す。 【００２９】プロテインＣの遺伝子のイントロンは主と
して、種々の機能的ドメインの間に位置する。エクソン
IIはペレ−プロペプチドの高度に保存された領域及びγ
−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含む。
エクソンIII はＧｌａと増殖因子ドメインを結ぶ８個の
アミノ酸を含む。エクソンIV及びＶはそれぞれ可能性あ
る増殖因子ドメインを示し、他方エクソンVIは活性化ペ
プチドを含む連結領域をカバーする。エクソンVII 及び
VIIIはすべてのセリンプロテアーゼに典型的な触媒的ド
メインをカバーする。 【００３０】ヒトプレ−プロテインＣのアミノ酸配列及
び提案された構造を図１０に示す。プロテインＣが、軽
鎖及び重鎖を結ぶＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドを伴わない
で示されている。７個のイントロン（Ａ〜Ｇ）の位置が
実線で示されている。既知の蛋白質分解的開裂部位を挟
むアミノ酸が円で囲んである。軽鎖中の第一アミノ酸、
活性化ペプチド及び重鎖が１番から始まる。この番号は
図２〜４（配列番号：１）及び図６〜９（配列番号：
２）中に示される番号とは異る。炭水化物付加部位は軽
鎖中の残基９７、並びに重鎖中の残基７９，１４４及び
１６０に位置する。この番号は図１０によるものであ
る。炭水化物成分はＡｓｎに共有結合される。多くの場
合、淡水化物付加環境はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ
−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）によ
り表わすことができる。 【００３１】前記のごとく、プロテインＣは凝固過程に
おいて制御的役割を演ずる。エクソンVII 及びVIIIによ
りコードされる触媒ドメインは幾つかの血漿蛋白質（例
えばファクターＶａ及びVIIIａ) を特異的に開裂せしめ
ることによりこれらを不活性化するセリンプロテアーゼ
活性を有する。この選択的蛋白質分解の結果として、プ
ロテインＣは抗−凝固活性及びフィブリン溶解活性を示
す。ゲノムクローン中に介在配列が存在するため、許容
される発現ユニットを造成するためには単にゲノム配列
とｃＤＮＡ配列とを連結して完全なコード配列を得るだ
けでは十分でない。従って、発現ユニットの造成のため
にゲノムクローンを使用する場合、後でさらに詳細に記
載する理由により、これらの介在配列を除去することが
必要である。 【００３２】５′コード領域はまた他の方法で得ること
ができ、そして介在配列を除去する必要性が排除され
る。既存のｃＤＮＡ又はゲノムクローン由来のプローブ
を用いて、追加のライブラリーから５′コード領域を得
ることができる。この方法により十分な長さのｃＤＮＡ
が得られた。さらに、ビタミンＫ依存性血漿蛋白質のア
ミノ末端部分はそれらのそれぞれのカルシウム結合活性
を担当する。この機能的相同性の結果として、これらの
分子のカルシウム結合ドメインは交換可能であり、そし
てなお生ずる分子の触媒ドメインに特異的な活性を維持
することが見出された。 【００３３】例えば、１９８５年４月１７日に出願され
た米国特許出願No. ７２４，３１１明細書中に記載され
ており、そしてヨーロッパ出願No. ２００，４２１とし
て公開されているように、ファクターIXのアミノ末端部
分（カルシウム結合ドメイン）をアミノ酸３８において
ファクターVII に連結してファクターVII の活性を有す
る蛋白質を生成せしめることができる。ファクターVII
、ファクターIX、ファクターＸ、プロトロンビン及び
プロテインＳは、このアミノ末端配列のプロテインＣと
の相同性を共有する。従って、これらの蛋白質のいずれ
かの遺伝子の５′コード領域を含んで成るコード配列を
プロテインＣ遺伝子の対応する配列の代りに使用するこ
とができよう。 【００３４】さらに、幾つかのビタミンＫ依存性血漿蛋
白質の既知のアミノ酸配列に基いて、又はこの明細書に
開示するプロテインＣの配列に基いて適当なコード配列
を合成することができる。合成ヌクレオチド配列を製造
する方法は当業界においてよく知られている。例えば、
一組のオーバーラップするオリゴヌクレオチドを合成
し、そしてアニールして対になりオーバーラップする接
着末端を有する二本鎖断片を得ることができる。次に、
これらの断片を制限断片と同様にして連結する。次に、
得られる合成断片を便利な制限部位においてｃＤＮＡに
連結する。連結配列は、必要であれば、オリゴヌクレオ
チド指令変異誘発により変形することができる。 【００３５】完全なコード配列を代表する複数のクロー
ンが得られており、必要であれば、適当な領域を連結し
て所望のコード配列を生じさせることができる。１又は
複数のライブラリーから得られた複数の断片を適当な制
限エンドヌクレアーゼで切断し、そして適切な方向に酵
素的に連結する。断片及び選択される適当な制限エンド
ヌクレアーゼに依存して、欠失変異の“プールアウド”
法により、又は制限酵素開裂と変異誘発との組合わせに
より、不所望のＤＮＡ配列を除去することが必要であ
る。このようにして得られた配列は、好ましくは連続す
るオープンリーディングフレームの形であるべきであ
る。すなわち、高等真核性遺伝子中に一般に存在する介
在配列（イントロン）を欠いているべきである。 【００３６】クローン化された遺伝子中のイントロンの
存在は、遺伝子配列が哺乳類宿主細胞に導入された場合
に、メッセンジャーＲＮＡの異状なスプライシング及び
／又は遺伝子発現の効率低下、又は増幅の不安定化を導
くであろう。この発明に従って生産されるプロテインＣ
の適当なプロセシング及び分泌を促進するために、この
コード配列がさらにプレ−プロペプチドをコードするこ
とが好ましい。プレ−プロペプチドはプロテインＣのそ
れでもよく、又はファクターIX、ファクターVII もしく
はプロトロンビンのごとき他の分泌される蛋白質のそれ
でもよい。 【００３７】幾つかの場合、活性化されたプロテインＣ
を直接生産し、これによって蛋白質生成物をインビトロ
又はインビボにおいて活性化する必要性を排除すること
が望ましいであろう。プロテインＣの成熟及び活性化に
関与する開裂部位は知られている（Foster及びDavie 、
前掲) 。オリゴヌクレオチド指令欠失変異誘発により活
性化ペプチドコードする領域を除去することにより、Ａ
ＰＣをコードする配列を造成することができる。次に、
こうして得られる蛋白質は、宿主細胞の分泌経路での正
常の蛋白質分解的プロセシングの間のＬｙｓ−Ａｒｇジ
ペプチドの除去により活性化されるであろう。活性化ペ
プチドを欠く蛋白質はそれにもかかわらず宿主細胞によ
り適切にプロセシングされ、活性化されたプロテインＣ
の分泌がもたらされることが見出された。 【００３８】組換プロテインＣのその二本鎖形への成熟
に関与する蛋白質分解的プロセシングを増強するため、
プロセシング部位周辺のアミノ酸配列を変更することが
望ましいであろう。この様な変更がトランスフェクトさ
れた細胞中での組換プロテインＣの適切なプロセシング
を促進することが見出された。単鎖プロテインＣが血流
中で活性化されることが知られていないので、効果的な
開裂が蛋白質の比活性を上昇せしめるであろう。すでに
記載したように、この成熟過程はジペプチドＬｙｓ−Ａ
ｒｇ（アミノ酸１５６−１５７）の除去を含む（Foster
及びDavie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：4766−
4770，1984）。このプロセシング部位の近傍におけるア
ミノ酸配列の変更はアミノ酸の置換及び／又は挿入を含
む。変更の１つのこの様な群は、配列（Ｒ₁ ）_n −Ｒ₂
−Ｒ₃ −Ｒ₄ （式中、Ｒ₁ ，Ｒ₂ ，Ｒ₃ 及びＲ₄ はＬｙ
ｓ又はＡｒｇであり、そしてｎは０，１，２又は３であ
る）を天然のＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドの代りに含有す
るようにアミノ酸配列を変更することである。 【００３９】この群の特に好ましい変更は配列Arg-Arg-
Lys-Arg である。この配列は、トランスフェクトされた
ＢＨＫ細胞中で組換プロテインＣのプロセシングを約５
倍増強することが見出された。変更の第２の群は、天然
プロテインＣのアミノ酸残基１５４（Ｈｉｓ）を塩基性
アミノ酸残基（すなわち、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）で置き換
えて一般式Ｒ₁ −Ｘ−Ｒ₂ −Ｒ₃ （式中、Ｒ₁ ，Ｒ₂ 及
びＲ₃ はＬｙｓ又はＡｒｇであり、そしてＸはＬｙｓ又
はＡｒｇ以外のアミノ酸、好ましくはＬｅｕである）の
プロセシング部位配列を得ることを含む。 【００４０】変更の第三群は、１５８位のＡｓｐ残基を
非−酸性アミノ酸残基で置き換えることを含む。小さい
中性アミノ酸、例えばＡｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ又はＧｌ
ｙを使用するのが好ましい。変更の第四群は天然プロテ
インＣのＬｙｓ−ＡｒｇをＬｙｓ−Ｌｙｓ又はＡｒｇ−
Ａｒｇにより置き換えることを含む。変更のこれらの群
の組合わせを行うこともできる。例えば、配列（Ｒ₁ ）
_n −Ｒ₂ −Ｒ₃ −Ｒ₄を有するプロセシング部位を含有
するプロテインＣ分子中でアミノ酸１５８を置き換える
ことができる。これらの置き換えは野性形プロテインＣ
又は活性化されたプロテインＣの製造において使用する
ことができる。 【００４１】プロテインＣ又は活性化されたプロテイン
Ｃのためのコード配列を、次に適当な発現ベクターに挿
入し、今度はこのベクターを用いて哺乳類セルラインを
トランスフェクトする。この発明を実施するための発現
ベクターは哺乳類細胞に導入された外来遺伝子の転写を
指令することができるプロモーターを含むであろう。転
写を指令する場合の効率のためウイルスプロモーターが
好ましい。特に好ましいプロモーターはアデノウイルス
２からの主要後期プロモーターである。この様な発現ベ
クターはまた、好ましくは、プロモーターの下流であっ
てプロテインＣ配列の挿入のための部位の上流に、又は
プロテインＣ配列自体の中に位置する一セットのＲＮＡ
スプライス部位を含有するであろう。 【００４２】好ましいＲＮＡスプライス部位はアデノウ
イルス遺伝子及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得る
ことができる。挿入部位の下流に位置するポリアデニレ
ーションシグナルも発現ベクター中に含まれる。ウイル
スポリアデニレーションシグナル、例えばＳＶ４０から
の初期もしくは後期ポリアデニレーションシグナル、又
はアデノウイルス５ＥＩｂ領域からのポリアデニレーシ
ョンシグナルが特に好ましい。特に好ましい態様におい
ては、発現ベクターはさらに非コードウイルススリーダ
ー配列、例えばアデノウイルス２三分節（ｔｒｉｐａｒ
ｔｉｔｅ）リーダーを、プロモーター及びＲＮＡスプラ
イス部位の間に含む。好ましいベクターはさらにエンハ
ンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサー配列及びアデ
ノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含有するこ
とができる。 【００４３】次に、クローン化された遺伝子配列を、例
えばリン酸カルシウム介在トランスフェクション（Wigl
er等、Cell 14：725, 1978 ；Corsaro 及びPearson,
Somatic Cell Genetics ７：603, 1981 ；Graham及び
Van der Eb, Virology 52：456, 1973 ）により、培養
された哺乳類細胞に導入する。ＤＮＡ及びリン酸カルシ
ウムから沈澱を生成せしめ、そしてこの沈澱を細胞に適
用する。細胞の幾らかがＤＮＡを取り込み、そしてそれ
を数日間細胞内に保持する。これらの細胞の小部分（典
型的には１０^-4）がＤＮＡをゲノムに組み込む。 【００４４】これら組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）
を固定するため、選択表現型を支える遺伝子（選択マー
カー）を注目の遺伝子と共に細胞中に導入するのが一般
的である。好ましい選択マーカーは、薬剤、例えばネオ
マイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートに
対する耐性を付与する遺伝子を包含する。選択マーカー
は注目の遺伝子と同時に別個のプラスミド上で細胞に導
入することができ、あるいはそれらは同一のプラスミド
上で導入することができる。同一のプラスミド上では選
択マーカー及び注目の遺伝子は異るプロモーター又は同
一のプロモーターの制御のもとにあることができる。 【００４５】１つの態様においては、両者の配列が同一
のプロモーターにより制御されるように選択マーカーが
プロテインＣコード配列と同じプラスミド上に置かれ、
これはジシストロンメッセージとして知られる配置であ
る。このタイプの造成物は従来技術において知られてい
る（例えば、ヨーロッパ出願公開No. １１７，０５
８）。細胞に導入される混合物に“キャリャーＤＮＡ”
として知られる追加のＤＮＡを加えることも有利であ
る。細胞がＤＮＡを取り込んだ後、これらを一定時間、
典型的には１〜２日間増殖せしめて注目の遺伝子の発現
を開始せしめる。次に、薬剤選択を適用して適切に選択
マーカーを発現している細胞の増殖について選択を行
う。この様な細胞のクローンをプロテインＣの発現につ
いてスクリーニングすることができる。 【００４６】この発明において使用するために好ましい
哺乳類セルラインにはＣＯＳセルライン、ＢＨＫセルラ
イン及び２９３セルラインが含まれる。さらに、この発
明において多くの他のセルラインを使用することがで
き、これらにはラットＨｅｐＩ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６００）、ラットＨｅｐII細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５４８）、ＴＣＭＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３
９）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５．１）、ヒ
ト肝癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５２）、ＨｅｐＧ２細
胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ８０６５）、マウス肝細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＣ ２９．１）、及びＤＵＫＸ細胞（Urlaub
及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216−42
20, 1980）が含まれる。 【００４７】２９３セルライン（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １
５７３；Graham等、J. Gen. Virol. 36：59−72, 1977）
が特に好ましい。プロテインＣを二本鎖形に効率的にプ
ロセシングするその能力のためである。このセルライン
はヒトアデノウイルス５ＤＮＡにより形質転換され、そ
してＡｄ５ ＥＩＡ遺伝子をゲノムに組み込む。２９３
細胞と共に使用するための好ましい発現ベクターはアデ
ノウイルスプロモーターを含有するであろう。ネオマイ
シン耐性が２９３細胞中で使用するための好ましい選択
マーカーである。好ましいＢＨＫセルラインはｔＫ^- Ｂ
ＨＫセルラインＢＨＫ５７０（Waechter及びBaserga,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：1106−1110，1982）
である。 【００４８】組み込まれた遺伝子配列のコピー数は、あ
る種の選択マーカー（例えば、メトトレキセートに対す
る耐性を付与するジヒドロフォレートレダクターゼ）の
使用による増幅を介して増加せしめることができる。選
択マーカーが注目の遺伝子と共に細胞に導入され、そし
て薬剤選択が適用される。次に、薬剤濃度を段階的に増
加せしめ、各段階で耐性細胞を選択する。クローン化さ
れた配列のコピー数の増加について選択することによ
り、コードされた蛋白質の発現レベルが実質的に増加す
ることができよう。 【００４９】この発明に従って製造されるプロテインＣ
は好ましくは、例えば抗−プロテインＣ抗体カラム上で
のアフィニティークロマトグラフィーにより精製され
る。カラム溶出物の追加の精製は常用の化学的精製手
段、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より達成することができる。この発明に従って製造され
るプロテインＣは重鎖のアミノ末端から活性化ペプチド
を除去することにより活性化することができる。活性化
はα−トロンビン（Marlar等、Blood 59：1067−107
2, 1982）、トリプシン（Marlar等、前掲) 、ルッセル
（Russell)のまむし毒ファクターＸ活性化因子（Kisie
l、前掲) 、又は市販のヘビ毒由来活性化因子Ｐｒｏｔ
ａｃ Ｃ（American Diagnostica) の存在下でプロテイ
ンＣをインキュベートすることにより達成することがで
きる。 【００５０】下記の例を要約すれば、例１はヒトプロテ
インＣをコードするＤＮＡ配列のクローニングを記載す
る。例２は例１において単離された配列からの、プロテ
インＣの全長コード配列の造成を記載する。例３はプロ
テインＣ ＤＮＡのための発現ベクター造成を記載す
る。例４はトランスフェクトされた哺乳類細胞を用いる
プロテインＣの製造を記載する。例５はプロテインＣを
コードする全長ｃＤＮＡ、及びトランスフェクトされた
哺乳類細胞でのその発現を記載する。例６はＢＮＫ細胞
及び２９３細胞中での活性化されたプロテインＣの生産
を記載する。例７は変形された開裂部位を有するプレカ
ーサーからのプロテインＣの製造を記載する。例８はト
ランスフェクトされた細胞からのプロテインＣの分泌を
指令するファクターVII プレ−プロペプチド又はプロト
ロンビンプレ−プロペプチドの使用を記載する。 【００５１】例 制限エンドヌクレアーゼ、及び他のＤＮＡ修飾酵素（例
えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウシアルカリ性
ホスファターゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ、
Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）はベセスダ・リサーチ
・ラドラトリース（ＢＲＬ）及びニュー・イングランド
・ビオラブスから得られ、そして特にことわらない限り
製造者の指示に従って使用した。 【００５２】オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオ
システムス・モデル３８０Ａ ＤＮＡ合成機により合成
し、そして変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気
泳動により精製することができる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）の細胞はManiatis等 (Molecular Cloning ：A La
boratory Manual 、コールドスプリング ハーバー・ラ
ボラトリー、１９８２）に記載されているようにして形
質転換することができる。Ｍ１３及びｐＵＣクローニン
グベクター並びに宿主株はＢＲＬから入手した。 【００５３】例１． ヒトプロテインＣをコードするＤ
ＮＡ配列のクローニング ヒトプロテインＣの一部分をコードするｃＤＮＡを、Fo
ster及びDavie(前掲）により記載されている様にして調
製した。要約すれば、常法に従ってヒト肝臓ｍＲＮＡか
らλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ヒトプ
ロテインＣに対する、アフィニティー精製され ¹²⁵Ｉ−
ラベル化された抗体を用いてクローンをスクリーニング
し、そしてプレート溶解法（Maniatis等、前掲) 及びこ
れに続く塩化セシウム勾配上でのバンド化により、陽性
クローンからファージを調製した。ＥｃｏＲＩを用いて
ｃＤＮＡ挿入部を取り出し、そしてプラスミドｐＵＣ９
（Vieira及びMessing, Gene 19 ：259-268, 1982)にサ
ブクローニングした。制限断片をファージベクターＭ１
３mp１０及びＭ１３mp１１（Messing, Meth in Enzymo
logy 101：20−77, 1983) にサブクローニングし、そし
てジデオキシ法 (Sanger等、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 74：5463−5467, 1977) により配列決定した。 【００５４】ヒトプロテインＣの既知の部分配列（Kisi
el、前掲) に対応しそして軽鎖のアミノ酸６４から始ま
りそして重鎖を通って３′−非コード領域に伸びるプロ
テインＣをコードするＤＮＡを含有する１個のクローン
を選択した。このクローンをλＨＣ１３７５と命名し
た。アミノ酸２４からのプロテインＣをコードする第二
のｃＤＮＡクローンを同定した。このクローンからの挿
入部をｐＵＣ９にサブクローニングし、そしてこのプラ
スミドをｐＨＣλ６Ｌ（図１）と称した。このクローン
は、重鎖コード領域、終止コドン及び３′非コード領域
を含むプロテインＣの大部分をコードしている。 【００５５】λＨＣ１３７５からのｃＤＮＡ挿入部をα
³²ＰｄＮＴＰを用いてニックトランスレーションし、そ
してWoo(Meth. in Enzymology 68：381-395, 1979)に
より改変されたBenton及びDavis(Science 196 ：181-
182, 1977)のプラークハイブリダイゼーション法を用い
てファージλシャロン４Ａ（Maniatis等、Cell 15：68
7-702, 1978)中のヒトゲノムライブラリーをプローブす
るために使用した。陽性クローンを単離し、そしてプラ
ーク精製した (Foster等、Proc. Natl. Acad.Sci. USA
82：4673−4677，1985、引用によりこの明細書に組み
入れる）。 【００５６】陽性クローンから調製したファージＤＮＡ
（Silhavy 等、Experiments with Gene Fusion), Cold
Spring Harbor Laboratory, 1984) をＥｃｏＲＩ又はＢ
ｇ１IIにより消化し、そしてゲノム性挿入部を精製しそ
してｐＵＣ９にサブクローニングした。挿入部の制限断
片をＭ１３ベクターにサブクローニングし、そして配列
決定することによりそれらの同一性を確認しそして完全
な遺伝子のＤＮＡ配列を確立した。 【００５７】ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ挿入部をニックト
ランスレーションし、そしてファージλシャロン４Ａラ
イブラリーをプローブするために用いた。このｃＤＮＡ
の５′末端及び３′末端から作られたプローブにハイブ
リダイズする１個のゲノム性クローンが同定された。こ
のファージクローンをＥｃｏＲＩにより消化し、そして
プロテインＣ遺伝子の５′末端に対応する４．４kb断片
をｐＵＣ９にサブクローニングした。得られる組換プラ
スミドをｐＨＣＲ４．４と命名した。 【００５８】完全なＤＮＡ配列分析により、ｐＨＣＲ
４．４中の挿入部が１２６３bpのイントロンにより分離
された７０塩基対及び１６７塩基対の２個のエクソンを
含むことが示された。第一エクソンはアミノ酸−４２〜
−１７をコードし、そして第二エクソンはアミノ酸−１
９〜３７をコードする。配列分析により完全なプロテイ
ンＣ遺伝子のＤＮＡ配列が確保された。前記のように、
ゲノム性クローンを使用してこの発明において使用する
ための許容されるコード配列を造成するためには、次に
イントロンを除去する必要がある。 【００５９】例２． プロテインＣのための全長コード
配列の造成 プレ−プロペプチドを含むプロテインＣのための全長コ
ード配列は適切なｃＤＮＡ断片とゲノム性クローンを連
結することにより造成される。これは、ゲノム性クロー
ン（ｐＨＣＲ４．４）からイントロンを除去し、そして
融合されたエクソンを便利な制限部位においてｃＤＮＡ
（ｐＨＣλ６Ｌから）に連結することにより達成され
る。所望のゲノムＤＮＡ：ｃＤＮＡ連結部は、オリゴヌ
クレオチド指令除去変異誘発により不所望の配列をプー
ルアウトすることにより生じさせる。 【００６０】プラスミドｐＨＣλ６Ｌは、ｐＵＣ９のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローニングされたプロテインＣの部分
的ｃＤＮＡを含有する。このｃＤＮＡ挿入部を２個の断
片としてサブクローニングしてゲノム性クローンの最も
５′側のコード領域に連結するために用意する。プラス
ミドｐＨＣλ６ＬをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにより消化
し、そして反応混合物をフェノール及びＣＨＣｌ₃ によ
り抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。得られるＤ
ＮＡ断片を連結緩衝液中に再懸濁し、そしてＴ４ＤＮＡ
リガーゼを加える。この連結混合物を１５℃にて１４時
間インキュベートする。この連結混合物のアリコートを
使用して、Ｅ．コリＪＭ８３を形質転換し、そして細胞
をＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天上にプレートする。白
色コロニーを選択し、そしてプラスミドＤＮＡを調製す
る。 【００６１】ＤＮＡを制限酵素消化により分析すること
によりｃＤＮＡの３′部分（約１４５０bpの挿入部）を
含有するクローン、及びｃＤＮＡの５′部分（約６５bp
の挿入部）を含有するクローンを同定する。これらのク
ローンをそれぞれｐ９Ｃ３′及びｐ９Ｃ５′と命名する
（図１１）。このｃＤＮＡから欠けている５′コード領
域はゲノム性クローンｐＨＣＲ４．４のエクソンＩ及び
II中に含まれている。このプラスミドは約４４００bpの
挿入部を含有し、そしてイントロンＢ中に位置するＥｃ
ｏＲＩ部位におけるその３′末端において終る。 【００６２】ｐＨＣＲ４．４からコード配列を取り出す
ため、プラスミドをＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、
そして生ずる断片をアガロースゲル中での電気泳動によ
り分離する。エクソンＩ及びIIを含有する約２５４０bp
の断片をゲルから単離し、そしてＣＴＡＢにより抽出す
る（Langridge 等、Analyt. Biochem. 103：264, 198
0)。５′Ｐ−Ｒと称するこの断片をｐＵＣ９にサブクロ
ーニングしてプラスミドｐ５′−Ｐ−Ｒを生成せしめる
（図１２）。 【００６３】ｐ５′Ｐ−Ｒ中のイントロン（イントロン
Ａと称する）を２段階法により除去する（図１２）。プ
ラスミドをＡｐａＩで消化する。ＡｐａＩはイントロン
中のユニーク部位で開裂せしめそして３′オーバハング
末端を残す。次に、線状化されたプラスミドをＢａｌ
３１エキソヌクレアーゼ又はＴ４ポリメラーゼにより処
理して各末端から約４００bpを除去し、そして生ずる断
片をＳ１ヌクレアーゼにより平滑末端化する。線状化さ
れたプラスミドをリガーゼにより再環化し、そしてこれ
を用いてＥ．コリＪＭ８３を形質転換する。プラスミド
ＤＮＡを抽出し、そしてイントロンＡ中のＳｍａＩ及び
ＳｓｔＩ制限部位の存在について分析し、そして３００
〜４００bpに短縮されたＳｍａＩ−ＳｓｔＩ断片を有す
るプラスミドを選択し、そしてｐ５′ＰΔａＲと命名す
る。 【００６４】イントロンＡの残りを、２−プライマー法
についてZoller及びSmith(Manual for Advanced Techni
ques in Molecular Cloning Course、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー、１９８３）により記載されて
いるのと実質的に同じオリゴヌクレオチド−指令除去変
異誘発により除去する。ｐ５′ＰΔａＲをＰｓｔＩ及び
ＥｃｏＲＩで消化し、そしてプロテインＣ断片を、Ｐｓ
ｔＩとＥｃｏＲＩで消化したＭ１３mp９にサブクローニ
ングする。正鎖ファージＤＮＡを鋳型として調製し、そ
してオリゴヌクレオチドｍｕｔ−１（第１表）にアニー
ルする。この変異原オリゴヌクレオチドは、連結される
べきエクソンＩ及びIIの配列に対して相補的な配列を含
有する。 【００６５】Ｍ１３ユニバーサル配列決定用プライマー
を同じ鋳型上のｍｕｔ−１の３′側にアニールする。こ
れらのプライマーをＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenow断
片) 及びヌクレオシドトリホスフェートを用いてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼの存在下で延長せしめる。生ずるデュプレ
ックスＤＮＡ環をＥ．コリＪＭ１０３に形質転換し、そ
して生ずるプラークをストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で³²Ｐ−ラベル化変異原オリゴヌクレ
オチドをプローブとして用いてスクリーニングする。陽
性プラークからのＤＮＡを単離し、そしてオリゴヌクレ
オチドプライマー１（第１表）を用いてスクリーニング
する。このプライマーはエクソンIIにおいてプライム
し、除去連結部を含むＤＮＡ配列の決定を可能にする。
エクソンＩ及びIIの正しいインフレーム融合を有する分
子を選択する。Ｍ１３複製形から、制限エンドヌクレア
ーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動によりＰｓｔＩ−
ＥｃｏＲＩ断片を単離し、そしてこれをｐＵＣ９にサブ
クローニングしてプラスミドｐ５′Ｉ−IIを生成せしめ
る（図１２）。 【００６６】図１３に関し、５′コード領域をｃＤＮＡ
に連結するため、前記プラスミドのＰｓｔＩ及びＥｃｏ
ＲＩにより消化によって約１２７７bpのＰｓｔＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を単離し、そしてアガロース電気泳動により
精製する。ｐ９Ｃ５′をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化
することにより６５bpの最も５′側のｃＤＮＡ断片を単
離し、そしてアクリルマミドゲル上での電気泳動により
精製する。２個の断片をそれらのＥｃｏＲＩ末端におい
て連結し、そして得られた約１３３０bpのＰｓｔＩ−Ｓ
ａｌＩ断片を、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化したＭ１３
mp９にサブクローニングする（図１３）。正鎖ファージ
ＤＮＡをオリゴヌクレオチド指令除去変異誘発のための
鋳型として調製する。オリゴヌクレオチドｍｕｔ−２
（第１表）をこの鋳型にアニールし、そしてオリゴヌク
レオチドｍｕｔ−３（第１表）を第二プライマーとして
上流にアニールする。 【００６７】これらのプライマーを前記のようにして延
長する。オリゴヌクレオチドｍｕｔ−２はアミノ酸２３
−２６をコードするエクソンII配列のｃＤＮＡへのコド
ン２７における融合を指令する。第二プライマー（ｍｕ
ｔ−３）は翻訳開始部から３５bp上流にＥｃｏＲＩ部位
を導入する。生ずるファージを、ＮＣＯ Ｉ部位及びＸ
ｂｏＩ部位の不存在並びに導入されたＥｃｏＲＩ部位の
存在についてスクリーニングする。所望の制限パターン
を示すファージＤＮＡを、プライマー−２（第２表）を
用いて配列決定することによりエクソンIIとｃＤＮＡと
の間の正しい連結部の存在を確認する。正しい配列を有
するファージＤＮＡを選択し、そして５′コード領域を
含むＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片をＭ１３組換ファージの複
製形から単離する。この断片をアガロースゲル電気泳動
により精製し、そしてＰｓｔＩとＳａｌＩで消化したｐ
ＵＣ９に挿入してプラスミドｐＣ５′ｅｎｄを生成せし
める。 【００６８】図１４に関し、プラスミドｐＣ５′ｅｎｄ
をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、そして５′プロテ
インＣ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、そ
してＣＴＡＢにより抽出する。ｃＤＮＡの残りを、ｐ９
Ｃ３′からＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片として単離する。
２個の断片を三元連結により、ＥｃｏＲＩで消化したｐ
ＵＣ９に連結する。連結混合物を用いてＥ．コリＪＭ８
３を形質転換し、細胞をＬＢ＋Ｘ−ｇａｌ上にプレート
し、そして白色コロニーからプラスミドＤＮＡを単離す
る。得られたプラスミドをｐＭＭＣと命名する。このプ
ラスミドは約１５００bpのＥｃｏＲＩ断片上にヒトプロ
テインＣの完全なコード配列を含有する。 【００６９】 【表１】 【００７０】例３． プロテインＣのための発現ベクタ
ーの造成 プロテインＣをコードする挿入部をｐＭＭＣからＥｃｏ
ＲＩ断片として取り出し、そして適当な哺乳類細胞発現
ベクターに挿入する。ベクターの例としてｐＤ７が挙げ
られ、このものはＳＶ４０エンハンサー並びにアデノウ
イルス２主要後期プロモーター及び三分節（ｔｒｉｐａ
ｒｔｉｔｅ）リーダーを含んで成る。 【００７１】プラスミドｐＤ７はプラスミドｐＤＨＦＲ
III (Berkner 及びSharp, Nuc. Acids Res. 13：841-
857, 1985)に由来する。ｐＤＨＦＲ III中のＤＨＦＲ配
列のすぐ上流のＰｓｔＩ部位をＢｃｌＩ部位に転換す
る。これは次の様にして行う。１０μｇのプラスミドを
５ユニットのＰｓｔＩにより３７℃にて１０分間１００
μｌの緩衝液Ａ（１０mM Ｔｒｉｓ，pH８，１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂ ，６mM ＮａＣｌ，７mMβ−ＭＳＨ）中で消化
した。ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈澱せし
め、そして１０mM ｄＣＴＰ及び１６ユニットのＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを含有する緩衝液Ｂ（５０mM Ｔｒｉ
ｓ，pH８，７mM ＭｇＣｌ₂ ，７mMβ−ＭＳＨ）４０μ
ｌ中に再懸濁し、そして１２℃にて６０分間インキュベ
ートする。 【００７２】エタノール沈澱の後、４００ユニットのＴ
４ポリヌクレオチドリガーゼを含有する緩衝液Ｃ（１０
mM Ｔｒｉｓ，pH８，１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴ
Ｔ，１．４mM ＡＴＰ）１４μｌ中でＤＮＡを２．５μ
ｇのキナーゼ処理ＢｃｌＩリンカーに１２℃にて１２時
間連結せしめた。フェノール抽出及びエタノール沈殿の
後、ＤＮＡを１２０μｌの緩衝液Ｄ（７５mM ＫＣｌ，
６mM Ｔｒｉｓ，pH７．５，１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM
ＤＴＴ）に再懸濁し、８０ユニットのＢｃｌＩにより
５０℃にて６０分間消化し、そしてアガロース中で電気
泳動した。フォーム IIIプラスミドＤＮＡ（１０μｇ）
をゲルから単離し、そして５０ユニットのポリヌクレオ
チドリガーゼを含有する１０μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃
にて２時間連結せしめ、そしてこれを用いてＥ．コリＨ
Ｂ１０１を形質転換した。迅速ＤＮＡ調製分析により陽
性コロニーを単離し、そして陽性コロニーから調製した
プラスミドＤＮＡ（ｐＤＨＦＲ′と称する）をｄＡＭ^-
Ｅ．コリに形質転換した。 【００７３】次に、プラスミドｐＤ２′を次の様にして
調製した。ｐＤＨＦＲ′（１５μｇ）及びｐＳＶ４０
（ｐＭＬ−１のＢａｍＨＩ部位にクローニングされた。
ＢａｍＨＩ消化されたＳＶ４０のＤＮＡを含んで成る）
（２５ng）を１００μｌの緩衝液中で２５ユニットのＢ
ｃＩＩを用いて６０分間５０℃にて開裂せしめ、次に５
０ユニットのＢａｍＨＩを添加した。そして追加のＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、そして
４．９kbのｐＤＨＦＲ′断片及び０．２kbのＳＶ４０断
片を単離した。これらの断片（２００ngのｐＤＨＦＲ′
ＤＮＡ及び１００mgのＳＶ４０ ＤＮＡ）を、１００ユ
ニットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含有する１０
μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて４時間インキュベート
し、そして生じた造成物（ｐＤ２′）を用いてＥ．コリ
ＲＲＩを形質転換した。 【００７４】プラスミドｐＤ２′を、ｐＢＲ３２２領域
中の“毒性”配列を除去することにより変形した（Lusk
y 及びBotchan, Nature 293 ：79−81，1981）。プラス
ミドｐＤ２′（６．６μｇ）及びｐＭＬ−１（Lusky 及
びBotchan 、前掲) を５０μｌの緩衝液Ａ中で１０ユニ
ットずつのＥｃｏＲＩ及びＮｒｕＩと共に３７℃にて２
時間インキュベートし、次にアガロースゲル電気泳動に
かけた。１．７kbのｐｄ２′断片及び１．８kbのｐＭＬ
−１断片を単離し、そして１００ユニットのＴ４ポリヌ
クレオチドリガーゼを含有する２０μｌの緩衝液Ｃ中で
１２℃にて２時間連結し、そして次にこれを用いてＥ．
コリＨＢ１０１を形質転換した。 【００７５】所望の造成物（ｐＤ２と称する）を含有す
るコロニーを迅速調製分析により同定した。次に、１０
μｇのｐＤ２を２０ユニットずつのＥ_COＲＩ及びＢｇｌ
IIにより５０μｌの緩衝液Ａ中で３７℃にて２時間消化
した。ＤＮＡをアガロース電気泳動し、そして目的とす
る、ｐＢＲ３２２ ３′スプライス部位及びポリＡ配列
を含有する２．８kg断片（断片Ｃ）を単離した。ｐＤ３
の造成において使用される残りの断片を得るため、ｐＤ
ＨＦＲ IIIを変形してＳａｃII（ＳｓｔII）部位をＨｉ
ｎｄ III部位又はＫｐｎＩ部位のいずれかに転換した。
１０μｇのｐＤＨＦＲ IIIを２０ユニットのＳｓｔIIに
より３７℃にて２時間消化し、次にフェノール抽出及び
エタノール沈殿を行った。再懸濁されたＤＮＡを、１０
mM ｄＣＴＰ及び１６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼを含有する１００μｌの緩衝液Ｂ中で１２℃にて６０
分間インキュベートし、フェノール抽出し、透析し、そ
してエタノール沈殿した。 【００７６】ＤＮＡ（５μｇ）を、４００ユニットのＴ
４ＤＮＡリガーゼを含有する２０μｌの緩衝液Ｃ中で、
キナーゼ処理されたＨｉｎｄ III又はＫｐｎエリンカー
５０mgと１２℃にて１０時間連結し、フェノール抽出
し、そしてエタノール沈殿した。５０μｌの緩衝液Ａに
再懸濁した後、生ずるプラスミドを、適当であれば５０
ユニットのＨｉｎｄ III又はＫｐｎＩにより消化し、そ
してアガロース電気泳動した。ゲル単離されたＤＮＡ
（２５０mg）を、４００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ
を含有する３０mlの緩衝液Ｃ中で１２℃にて４時間連結
し、そしてこれを用いてＥ．コリＲＲＩを形質転換し
た。生ずるプラスミドをｐＤＨＦＲ III（Ｈｉｎｄ II
I) 及びｐＤＨＦＲ III（ＫｐｎＩ）と命名した。次
に、ｐＤＨＦＲ III（ＫｐｎＩ）からＢｇｌ II及びＫ
ｐｎＩによる消化並びにこれに続くアガロースゲル電気
泳動により７００bpのＫｐｎＩ−ＢｇｌＩ断片（断片
Ａ）を精製した。 【００７７】ＳＶ４０エンハンサー配列を次の様にして
ｐＤＨＦＲ III（Ｈｉｎｄ III）に挿入した。５０μｇ
のＳＶ４０ ＤＮＡを１２０μｌの緩衝液Ａ中で５０ユ
ニットのＨｉｎｄ IIIと共に３７℃にて２時間インキュ
ベートし、そしてＨｉｎｄ IIIＣ ＳＶ４０断片（５０
８９−９６８bp）をゲル精製した。プラスミドｐＤＨＦ
Ｒ III（Ｈｉｎｄ III）（１０μｇ）を２５０ngのウシ
腸ホスファターゼにより３７℃にて１時間処理し、フェ
ノール抽出し、そしてエタノール沈殿せしめた。線状化
されたプラスミド（５０ng）を、２００ユニットのＴ４
ポリヌクレオチドリガーゼを用いて１６μｌの緩衝液Ｃ
中で１２℃にて３時間、２５０ngのＨｉｎｄ IIIＣ Ｓ
Ｖ４０と連結し、そしてＥ．コリＨＢ１０１に形質転換
した。次に、このプラスミドから７００bpのＥｃｏＲＩ
−ＫｐｎＩ断片（断片Ｂ）を単離した。 【００７８】ｐＤ３の最終的造成のため、断片Ａ及びＢ
（５０ngずつ）を、２００ユニットのＴ４ポリヌクレオ
チドリガーゼを用いて１２℃にて４時間、１０ngの断片
Ｃと連結し、そして次にＥ．コリＲＲＩの形質転換を行
った。陽性クローンを迅速調製法により検出し、そして
ｐＤＳの大量調製を行った。ＢｃｌＩ制限部位をＥｃｏ
ＲＩ部位に転換することによってプロテインＣ配列の挿
入を受け入れるようにプラスミドｐＤ３を変形する。ま
ず、常用のリンカー付加法によってＥｃｏＲＩをＢａｍ
ＨＩに転換することにより、アデノウイルス５ ０−１
マップユニットの最左端においてｐＤ３中に存在するＥ
ｃｏＲＩ部位を除去する必要がある。要約すれば、プラ
スミドをＥｃｏＲＩで消化し、そして線状化されたＤＮ
ＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類すべてのデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートにより処理することに
より平滑末端を生じさせる。 【００７９】次に、プラスミドをＢａｍＨＩ制限部位を
含むオクタヌクレオチドに連結し、このＤＮＡをＢａｍ
ＨＩで消化して過剰のリンカーを除去し、そして哺乳類
細胞発現配列を含有する断片をｐＭＬ−１のＢａｍＨＩ
部位にクローン化する。生ずるプラスミドをＥ．コリＨ
Ｂ１０１にトランスフェクトし、そしてプラスミドＤＮ
Ａを調製し、そして正しい変更についてスクリーニング
する。同様にして、ＢｃｌＩ部位を、オクトヌクレオチ
ドリンカーを用いてＥｃｏＲＩ部位に転換する。得られ
るベクターはｐＤ７として知られる。次に、ｐＭＭＣか
らの１．５kbプロテインＣ ＥｃｏＲＩ断片をｐＤ７の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入して発現ベクターｐＤ７Ｃ（図１
５）を生成せしめる。 【００８０】プロテインＣ配列の発現が可能なベクター
をポリシストロンメッセージからｐＤ５を使用すること
により造成する。ｐＤ５はｐＤ３に類似しており、５′
−非コード領域のほとんどが欠けておりＤＨＦＲコード
配列を含有する。ＤＨＦＲ配列をさらに変形してメトト
レキセートに対するその結合親和性を低下せしめる。ｐ
Ｄ３について記載したのと同様にしてベクターｐＤ５を
造成する。但し、ＢａｍＨＩ部位が異種性ＤＮＡの挿入
部位であり、そしてＳＶ４０ポリアデニレーションシグ
ナルを含有するＢａｌＩ−Ｂａｍ III ＳＶ４０断片が
後の方向にある点においてｐＤ５はｐＤ３と異る。 【００８１】ＤＨＦＲ配列を変形するまでｐＤＨＦＲ I
IIをＰｓｔＩ及びＳｃｔＩにより消化し、そして４００
bpのＤＨＦＲ断片を単離する。これをＭ１３ファージベ
クターにサブクローニングし、そしてSim onsem 及びLe
vinson (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 80：2495−2499,
1983) により記載されたようにして変量せしめる。こ
の変量はＤＨＦＲ配列中の１塩基対の変化をもたらす。
次に、変形された断片をｐＤＨＦＲ IIIに再挿入してプ
ラスミドｐＤＨＦＲ^r IIIを生成せしめる。次に、ＤＨ
ＦＲ配列の５′非−コード領域を除去する。プラスミド
ｐＤＨＦＲ^r IIIをＦｎｕ４ＨＩ（これはプラスミドを
約２０個の部位で切断する）で開裂せしめ、次にＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ及び４種類すべてのデオキシヌクレオ
チドトリホスフェートで処理して平滑末端を生じさせ
る。 【００８２】この末端にＢａｍＨＩリンカーを連結し、
そしてこの混合物をＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩにより消化
する。ＤＨＦＲ^r ｃＤＮＡを含む０．６kbのＢａｍＨＩ
−ＮｃｏＩ断片が単離される。プラスミドｐＤＨＦＲ I
IIをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、そしてＳＶ４０
ポリアデニレーションシグナルを含む０．２kb断片を単
離する。前方向にあるポリアデニレーションシグナルを
次にＤＨＦＲ^r 断片に連結する。ＢａｍＨＩで消化した
後、生ずるＢａｍＨＩ断片をｐＤ５のＢａｍＨＩ部位に
挿入し、そしてこの連結混合物を用いてＥ．コリＨＢ１
０１を形質転換する。プラスミドＤＮＡを調製し、そし
て制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングす
る。Ａｄ２主要後期プロモーターからの転写のために正
しい方向にＤＨＦＲ^r 挿入部を有するプラスミドをｐＤ
５（ＤＨＦＲ^r ）と命名する。 【００８３】プラスミドｐＤ５（ＤＨＦＲ^r ）を用いて
プロテインＣを発現せしめるため、ｐＭＭＣをＥ_COＲＩ
で消化し、そして１．５kbプロテインＣ断片を単離す
る。ＥＣＯＲＩ末端をリンカー付加によりＢｃｌＩ末端
に転換する。プラスミドｐＤ５（ＤＨＦＲ^r ）をＢａｍ
ＨＩで部分消化することにより、これをＤＨＦＲ^r 配列
５′末端において開裂せしめ、そしてプロテインＣ断片
に連結する。プラスミドＤＮＡを適切な方向及びプロテ
インＣ断片の挿入についてスクリーニングする。ｐＤ５
（ＰＣ−ＤＨＦＲ^r ）と称する得られたベクターを図１
６に示す。 【００８４】例４． トランスフェクトされた哺乳類細
胞でのプロテインＣの発現 子ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１
０）をｐｄ７Ｃを用いてリン酸カルシウム同時沈殿によ
りトランスフェクトする（Wigler等、Cell 14：725, 1
978 ；Corsaro 及びPearson, Somatic Cell Genetics
７：603, 1981 ；並びにGraham及びVan der Eb, Virolo
gy 52：456, 1973)。細胞を３７℃、５％ＣＯ₂ にてダ
ルベコの培地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清を添加
し、そしてＬ−グルタミン及びペニシリン−ストレプト
マイシンを補充したもの）中、６０mmの組織培養ペトリ
血中で２０％のコンコルエンシーまで増殖せしめる。合
計１０μｇのＤＮＡを用いて１枚の６０mm血をトランス
フェクトする：３．７５μｇのｐＤ７Ｃ、１．２５μｇ
のｐＫＯ−ｎｅｏ（Southern及びBerg, J. Mol. Appl.
Genet １：327-341, 1982)及び５μｇのサケ精子ＤＮ
Ａ。 【００８５】ＤＮＡを０．３Ｍ ＮａＯＡｃ、７５％エ
タノール中で沈殿せしめ、７０％エタノールで洗浄し、
そして２０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８）、
１mMＥＤＴＡ中に再溶解する。ＤＮＡを４４０μｌの
水、及び５００μｌの２８０mM ＮａＣｌ、１．５mM
ＮａＨＰＯ₄ 、１２mMデキストローヌ、５０mM ＨＥＰ
ＥＳ（pH７．１２）と混合する。上記の混合物に６０μ
ｌの２５０mM ＣａＣｌ₂ を滴加し、そしてこの溶液を
室温にて３０分間放置する。次にこの溶液を細胞に加
え、そして細胞３７℃にもどして４時間置く。培地を除
去し、そして血清を含むダルベコ培地中２０％ＤＭＳＯ
を５ml室温にて２分間にわたって加える。 【００８６】次に血を培地により２回迅速に洗浄し、そ
して新鮮な培地中で一夜インキュベートする。ＤＮＡを
添加して２４時間後、培地を除去し、そして選択培地
（血清を含有するダルベコ培地中１０mg／mlのＧ４１
８、４９８μ／mlのギブコ）を加える。約１０〜１３日
間の後、ｐＫＯ−ｎｅｏ遺伝子を取り込みそしてそれ故
にＧ４１８に対して耐性である細胞を代表する個々のク
ローンを９６−ウエルプレートに移し、そして１０％ウ
シ胎児血清を含有するダルベコ培地中で蛋白質アッセイ
のために増殖せしめる。 【００８７】プロテインＣを測定するため、培地を遠心
分離によって細胞及び細胞片から分離し、そしてプロテ
インＣポリペプチド及び生物学的活性についてアッセイ
する。トリプシンにより細胞をプレートから離し、新鮮
な培地で洗浄し、遠心し、そして−２０℃にて凍結す
る。測定のため、細胞ペレットをＰＢＳ中で解凍し、ペ
レット化し、そして０．２５％トリトンＸ−１００を含
有するＰＢＳ中に再懸濁する。サンプルを稀釈し、そし
てポリペプチド及び活性についてアッセイする。 【００８８】プロテインＣのためのエンザイム−リンク
ト・イムノソルベンド・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を次の
様にして行う。ヒトプロテインＣに対する、アフィニテ
ィ精製した抗体（１００μｌの０．１Ｍ Ｎａ₂ Ｃ
Ｏ₃ ，pH９．６、中１μｇ／ml）を９６−ウエルミクロ
タイタープレートの各ウエルに加え、そしてプレートを
４℃にて一夜インキュベートする。次に、ウエルを３
回、０．０５％トウィーン２０を含有するＰＢＳ（５mM
リン酸緩衝液、pH７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）で洗
浄し、そして次にＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン、
０．０５％トウィーン２０を１００μｌと共に４℃にて
一夜インキュベートする。次にプレートをＰＢＳにより
数回すすぎ、空気乾燥し、そして４℃にて貯蔵する。 【００８９】サンプルを測定するため、１００μｌの各
サンプルを、コートされたウエル中で３７℃にて１時間
インキュベートしそしてウエルをＰＢＳ中０．０５％ト
ウィーン２０ですすぐ。次に、プレートを、１％ウシ血
清アルブミン及び０．０５％トウィーン２０を含有する
ＰＢＳ中、プロテインＣに対するビオチン−接合ヒツジ
ポリクローナル抗体（３０ng／ml）と共に３７℃にて１
時間インキュベートする。ウエルをＰＢＳですすぎ、そ
して１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％トウィーン
２０を含有するＰＢＳ中アルカリ性ホスファターゼに接
合したアビジンと共に３７℃にて１時間、再度インキュ
ベートする。 【００９０】次に、ウエルをＰＢＳですすぎ、そして
０．３mM ＭｇＣｌ₂ を含有する１０％ジエタノールア
ミン（pH９．８）中ホスファターゼ基質（シグマ１０
４；６００μｇ／ml）１００μｌの添加によりアルカリ
性ホスファターゼ活性を測定する。４０５nmでの吸光を
ミクロタイタープレートリーダー上で読み取る。例５Ｃ
において記載する活性化後に血漿のカオリン−ケファリ
ン凝固時間を延長するその能力によりプロテインＣの生
物学的活性を測定する。 【００９１】例５． プロテインＣをコードする全長ｃ
ＤＮＡの発現 Ａ．ｃＤＮＡの単離 プロテインＣのプレ−プロペプチドのアミノ酸−４２〜
−１９に対応するエクソン（図６においてエクソン１）
を含有するゲノム断片を単離し、ニックトランスレート
し、そしてこれをプローブとして用いて、Gubler及びHo
ffman (Gene 25：263-269, 1983)の技法によりＨＥＰＧ
２細胞からのｍＲＮＡを用いて造成されたｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングした。このセルラインはヒト
肝細胞に由来し、そしてすでに示されているようにプロ
テインＣを合成する（Fair及びBahnak, Blood 64：194-
204, 1984)。ファージλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位に挿
入されている。 【００９２】ｃＤＮＡを含有する陽性クローンを単離
し、そしてプロテインＣ遺伝子の５′非−コード領域に
対応するオリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニ
ングした。１個のクローンがこのプローブによっても陽
性であり、そしてその全ヌクレオチド配列を決定した。
このｃＤＮＡは７０bpの５′−非翻訳配列、ヒトプレプ
ロ−プロテインＣの完全なコード配列、及び第二ポリア
デニレーション部位に対応する完全な３′−非コード領
域を含有していた（図２〜４）。 【００９３】Ｂ．発現ベクターの造成 プロテインＣ ｃＤＮＡの発現をベクターｐＤＸ中で達
成した。このベクターはｐＤ３（例３において記載し
た）及びｐＤ３′から誘導された。ｐＤ３′ベクターは
ｐＤ３と同じであるが、但しＳＶ４０ポリアデニレーシ
ョンシグナル（すなわちＳＶ４０ ＢａｍＨＩ〔２５３
３bp〕−ＢｃｌＩ〔２７７０bp〕断片が後方向にある点
において異る。すなわち、ｐＤ３′は遺伝子挿入部とし
てＢａｍＨＩ部位を含有する。 【００９４】ｐＤＸを得るため、ｐＤ３′をＥｃｏＲＩ
で開裂せしめ、ＳＩヌクレアーゼと共にインキュベート
し、そして次にＢａｌＩリンカーに連結することによ
り、ｐＤ３′中のＥｃｏＲＩ部位をＢｃｌＩ部位に転換
した。陽性と同定されたコロニーからＤＮＡを調製し、
そして変化した制限部位を含有する１．９kbのＸｈｏＩ
−ＰｓｔＩ断片をアガロースゲル電気泳動により調製し
た。第二の変形において、ｐＤ３をキナーゼ処理された
ＥｃｏＲＩ−ＢａｌＩアダプター（オリゴヌクレオチド
ＺＣ５２５：５′ＧＧＡＡＴＴＣＴ３′（配列番号：
８）；及びＺＣ５２６：５′ＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣ
３′（配列番号：９）から造成）に連結して、発現ベク
ターに遺伝子を挿入するための位置としてＥｃｏＲＩ部
位を生じさせた。 【００９５】制限エンドヌクレアーゼ分析により陽性ク
ローンを同定し、そしてこのクローンからのＤＮＡを用
いて変形された制限部位を含有する２．３kbのＸｈｏＩ
−ＰｓｔＩ断片を単離した。上記の２個の断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼと共にインキュベートし、Ｅ．コリＨＢ１
０１を形質転換し、そして陽性コロニーを制限分析によ
り同定した。このプラスミドは外来遺伝子を挿入するた
めのユニークＥｃｏＲＩ部位を含有する。 【００９６】次に、プロテインＣのｃＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉ断片としてｐＤＸに挿入した。組換プラスミドを制限
分析によりスクリーニングして、プロモーター要素に対
して正しい方向にプロテインＣ挿入部を有するプラスミ
ドを同定し、そして正しいクローンからプラスミドＤＮ
Ａ（ｐＤＸ／ＰＣと称する）を調製した（図１７）。ｐ
ＤＸ／ＰＣ中のｃＤＮＡ挿入部は５′非コード領域にＡ
ＴＧコドンを含有する（図２を参照のこと）ため、トラ
ンスフェクション及び発現実験に先立ってｃＤＮＡ上に
除去変異を行った。オリゴヌクレオチド指令変異誘発の
標準的方法に従って３塩基対の除去を行った。変形され
たｃＤＮＡを含有するｐＤＸを基礎とするベクターをｐ
５９４と称する。 【００９７】Ｃ．ｃＤＮＡの発現 プラスミドｐ５９４をリン酸カルシウム沈殿法によりＣ
ＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ １６５０）細胞、ＢＨＫ細
胞、及び２９３細胞にトランスフェクトした。４時間
後、新鮮な培地（５μｇ／mlのビタミンＫを補充したも
の）を加えた。適当な時点（通常４８時間又は７２時
間）で培地を収得し、そして細胞を集めそして細胞を溶
解した。 【００９８】ｃＤＮＡクローンの最初の同定に使用した
のと同じアフィニティー精製されたポリクローナル抗体
を用いるＥＬＩＳＡにより、培地中に分泌されたプロテ
インＣを測定した。ＣＯＳ−１細胞のアッセイも作っ
た。組換蛋白質のγ−カルボキシル化の程度を測定する
ため、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈殿にかけ
た。この方法はγ−カルボキシル化蛋白質のみを血漿か
ら選択的に沈殿せしめる方法である（Bajaj 等、J. Bio
l. Chem. 256：253-259, 1981)。プロテインＣ抗原性物
質の７０％以上がクエン酸バリウムにより沈殿した。 【００９９】組換プロテインＣを、凝固を長びかせるそ
の能力を測定することにより抗凝固活性について測定し
た。透析された培地サンプルをプロタック（Ｐｒｏｔａ
ｃ）Ｃ（アメリカンダイアグノスチカ）で処理すること
によりプロテインＣを活性化した。次に、サンプルをイ
ンビトロ凝固アッセイ（Sugo等、J. Biol. Chem. 260：
10453, 1985)に加えた。要約すれば、５０μｌずつの正
常血のヒト血漿、ラビット脳ケファリン〔ＴＢＳ（５０
mM Ｔｒｉｓ，pH７．５，１５０mM ＮａＣｌ）中１０
mg／ml〕、及びカオリン懸濁液（ＴＢＳ中５mg／ml）を
シリコン処理ガラスチューブ中で混合した。３７℃にて
２分間のプレインキュベートの後、ＴＢＳ中に稀釈され
た１００μｌの活性化されたプロテインＣを加え、そし
てインキュベーションを３７℃にてさらに２分間続け
た。次に、５０μｌの２５mM ＣａＣｌ₂ を添加するこ
とにより凝固を開始し、そして凝固時間を記録した。組
換物質の活性は天然プロテインＣのそれと本質的に同じ
であることが示された。 【０１００】トランスフェクトされたＢＮＫ細胞及び２
９３細胞により生産されたプロテインＣをウエスタンブ
ロッティングによりさらに分析した。培地サンプルを変
性ゲル上で電気泳動し、そしてブロットを調製し、そし
てプロテインＣに対する放射性ラベル化抗体によりプロ
ーブした。その結果、ＢＨＫ細胞からのプロテインＣの
約２０％が二本鎖形であり、他方２９３細胞からのプロ
テインＣの約９０％が二本鎖形であった。 【０１０１】 【表２】 【０１０２】例６． 活性化されたプロテインＣの発現 プロテインＣのｃＤＮＡを部位特定変異誘発により変更
して活性化ペプチドをコードする部位を除去した。次
に、変形された配列をＢＨＫ細胞及び２９３細胞にトラ
ンスフェクトし、そして安定にトランクフェクトされた
細胞を選択した。両セルラインからの培地サンプル中の
活性プロテインＣを検出した。活性化ペプチドコード配
列を除去するため、プラスミドｐ５９４をＳｓｔＩで消
化し、そして約８８０bpの断片を精製し、そしてＭ１３
ｍｐ１０のＳｓｔＩ部位に挿入した。 【０１０３】１２個の活性化ペプチドコドンを、変異原
オリゴヌクレオチド５′CTGAAACGACTCATTGAT３′（配列
番号：１０）を用いてオリゴヌクレオチド指令除去変異
誘発（Zoller等 Smith, DNA 3 : 479-488, 1984 ）によ
り除去した。変異ファージクローンから複製形ＤＮＡを
調製し、そしてＳｓｔＩにより消化した。プロテインＣ
断片（約８４０bp）を単離し、そしてＳｓｔＩで消化さ
れたｐ５９４に挿入した。生ずるプラスミドを、Ｂｇｌ
IIを用いる制限酵素マッピングによりＳｓｔＩ断片の正
しい方向についてスクリーニングした。正しいプラスミ
ドを選択し、そしてｐＰＣ８２９と命名した。プラスミ
ドｐＰＣ８２９を配列決定して目的とするコード配列の
存在を確認した。 【０１０４】プラスミドｐＰＣ８２９をＢＨＫ細胞に
〔プラスミドｐＳＶＤＨＦＲ（Lee 等、Nature 294：22
8-232, 1981 ）と共に〕、又は２９３細胞に〔pKO-neo
(Southern 及びBerg, J.Mol.Appl.Genet. １：327-341,
1982 ）と共に〕、リン酸カルシウム同時沈殿法（Grah
am及びvan der Eb, Virology 52 : 456-467, 1973 ）に
より同時トランクフェクト（co-transfect）した。４８
時間後、培地を収得し、そしてＥＬＩＳＡによりプロテ
インＣについてアッセイした。結果を第３表に示す。選
択培地の存在下で１０日後、安定にトランスフェクトさ
れたコロニーをプロテインＣの生産についてイムノフィ
ルターアッセイ（McCrachen 及び Brown,Bio Technique
s, 82-87 、1984年３月／４月）によりスクリーニング
した。 【０１０５】プレートをＰＢＳ又は非−血清培地（ダル
ベコ培地＋ペニシリン−ストレプトマイシン、５μｇ／
mlビタミンＫ）ですすいだ。次に、テフロン網を細胞上
に置いた。ニトロセルロースフィルターを、適当であれ
ばＰＢＳ又は非血清培地で湿し、そして前記の網の上に
置いた。３７℃にて４時間のインキュベーションの後、
フィルターをはずし、そして緩衝液Ａ（５０mM Ｔｒｉ
ｓ、pH７．４、５mMＥＤＴＡ、０．０５％ ＮＰ−４
０、１５０mM ＮａＣｌ、０．２５％ゼラチン）中に室
温にて３０分間置いた。 【０１０６】フィルターを室温にて１時間、振とうしな
がら、緩衝液Ａ中プロテインＣに対するビオチン−ラベ
ル化ヒツジポリクローナル抗体（１μｇ／ml）でインキ
ュベートした。次に、フィルターを緩衝液Ａ中で洗浄
し、そして室温にて１時間振とうしながら、緩衝液Ａ中
アビジン接合西洋ワサビパーオキシダーゼ（ベーリンガ
ー−マンハイム）（１：１０００）中でインキュベート
した。フィルターを緩衝液Ｂ中で、次に水中で洗浄し、
そして発色試薬（１００mlの５０mM Ｔｒｉｓ、pH７．
４、１５０mM ＮａＣｌ中６０mg ＨＲＰ発色試薬〔ビ
オ−ラド〕、２０mlメタノール、１００μｌ Ｈ
₂ Ｏ₂ ）中でインキュベートした。フィルターを水中に
移すことにより反応を停止した。 【０１０７】陽性コロニーを拾い上げ、そして選択培地
（適当であれば５００μｇ／ml Ｇ４１８又は２５０nM
メトトレキセートを含有する）を１０日間増殖せしめ
た。培地を発色アッセイによりＡＰＣ活性についてアッ
セイした。５０mM Ｔｒｉｓ、pH７．５、１５０mM Ｎ
ａＣｌ中０．２mMスペクトロチーム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚ
ｙｍｅ）ＰＧａ（アメリカンダイアグノスチカ＃３３
６）１００μｌを収容するミクロタイターウエルに培地
サンプルを加えた。プレートを３７℃にてインキュベー
トし、そして種々の時間間隔においてＡ₄₀₅ を測定し
た。１つのトランスフェクトされた２９３セルライン
（８２９−２０と称する）からの代表的な結果を図１８
に示す。セルライン８２９−１０の陽性コロニーからの
培地は、同じ時間（１０日間）にわたりトランスフェク
トされない２９３細胞と共にインキュベートされた対照
培地に比べて、ＡＰＣのための発色基質を用いて、一貫
して高い活性を示した。 【０１０８】 【表３】 【０１０９】例７． プロテインＣプロセシング部位の
変形 Ａ．部位特定変異誘発 単鎖プロテインＣの二本鎖プロテインＣ形へのプロセシ
ングを増強するため、蛋白質に２個の追加のアルギニン
残基を導入して４個の塩基性アミノ酸から成る開裂部位
を形成せしめた。プロテインＣの得られた変異体前駆体
をＰＣ９６２と称する。このものは開裂部位に配列Ser-
His-Leu-Arg-Arg-Lys-Arg-Asp を含有する。Arg-Asp 結
合でのプロセシングが二本鎖プロテインＣ分子をもたら
す。 【０１１０】変異系オリゴヌクレオチドＺＣ９６２
（５′AGTCACCTGAGAAGAAAACGAGACA ３′）（配列番号：
１１）を用いる部位特定変異誘発（Zoller及び Smith,
DAN ３：479-488, 1984 により２プライマー法につい
て記載されたのと実質的に同じ方法）によりクローン化
ｃＤＮＡを変形することによって変異体分子を生成せし
めた。プラスミドｐ５９４をＳｓｔＩで消化し、そして
約８７bp断片をＭ１３ｍｐ１１にクローニングし、そし
て単鎖鋳型ＤＮＡを単離した。変異誘発の後、正しいク
ローンを配列決定により同定した。複製型ＤＮＡを単離
し、ＳｓｔＩで消化し、そしてプロテインＣ断片を、Ｓ
ｓｔＩで切断されたｐ５９４に挿入した。所望の方向に
挿入されたＳｓｔＩ断片を有するクローンを制限酵素マ
ッピングにより同定した。得られた発現ベクターをｐＤ
Ｘ／ＰＣ９６２と命名した（図１９）。 【０１１１】Ｂ．プロテインＣの発現及び特徴付け プラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２をｐＳＶ２−ＤＨＦＲ
（Subramani 等、Mol.Cell.Biol. 1：854-864, 1981 ）
と共にリン酸カルシウム法（Graham及びvan derEb、前
掲、により記載された方法と実質的に同じ方法）により
ｔｋ^- ＢＨＫ細胞に同時トランスフェクトした。トラン
スフェクトされた細胞を、１０％ウシ胎児血清、１×Ｐ
ＳＮ抗生物質混合物（ギブコ６００−５６４０）、２．
０mM Ｌ−グルタミン及びビタミンＫ（５μｇ／ml）を
含有するダルベコの改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で増
殖せしめた。 【０１１２】細胞を２５０nMメトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）中で１４日間選択し、そして得られたコロニーをイ
ム／フィルターアッセイ（例６）によりスクリーニング
した。最も強く反応するコロニー６個をシリンダークロ
ーニングにより拾い上げ、そして１０cmプレート中に個
々に増殖せしめた。培養物がコンフルエントに近ずいた
時、プロテインＣの生産レベルをＥＬＩＳＡにより測定
した。結果を第４表に示す。 【０１１３】 【表４】 【０１１４】クローンＢＨＫ／９６２−１を大規模培養
で増殖せしめ、そしてヒトプロテインＣに対するヒツジ
ポリクローナル抗体７mgを２ｇのＣＮＢｒ−活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア社、ピスカタウェイ，Ｎ
Ｊ）に連結することにより調製したカラム上でのアフィ
ニティークロマトグラフィーにより数百mgのプロテイン
Ｃを精製した。細胞培養培地をカラムに適用し、このカ
ラムを１００mlのＴＢＳで洗浄し、そして３Ｍ ＫＳＣ
Ｎを含有するＴＢＳにより又はpH１１．５の緩衝液によ
りプロテインＣを溶出した。ウエスタンブロット分析に
よれば、天然配列によりトランスフェクトされたＢＨＫ
細胞から得られたプロテインＣの約２０％が二本鎖プロ
テインＣであったのに対して、変異体プロテインＣは約
９５％が二本鎖形であった。 【０１１５】ＰＣ９６２変異体蛋白質を発現する安全な
ＢＨＫ細胞クローンから、又は野性型プロテインＣを発
現する安定な２９３細胞クローンから、プロテインＣの
カルシウム−誘導コンフィグレーションに対して特異的
なモノクローナル抗体を用いてmg量のプロテインＣを精
製した。細胞培養培地を５mM ＣａＣｌ₂ の存在下でカ
ラムに適用し、５mM ＣａＣｌ₂ を含有するＴＢＳでカ
ラムを洗浄し、そして１０mM ＥＤＴＡを含有するＴＢ
ＳによりプロテインＣを溶出した。この精製法の使用に
より、変性条件に暴露することなく完全に活性なプロテ
インＣを精製することが可能であった。精製されたプロ
テインＣをＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びこれに続く銀染色によ
り分析した。純度が９５％より高いことが示された。 【０１１６】ＢＨＫにより生産されたＰＣ９６２蛋白質
を、アミドリシス活性及び抗−凝固活性の両方を示す形
態に活性化され得るその能力についてアッセイした。ア
フィニティー精製された蛋白質サンプルをＴＢＳに対し
て十分に透析し、次に０．１容量の１ユニット／mlプロ
タク（Ｐｒｏｔａｃ）Ｃ（アメリカンダイアグノスティ
クス）と共に３７℃にて１時間インキュベートすること
により活性化した。 【０１１７】活性化混合物のアリコートをミクロタイタ
ーウエル中の１００μｌの１mMプロテインＣ基質（スペ
クトロチームＰＣａ、アメリカンダイアグノスチカ）に
加え、そしてＡ₄₀₅ の変化を経時的にミクロタイタープ
レートリーダーを用いて測定することにより、アミドリ
シス活性を測定した。活性化されたプロテインＣの抗−
凝固活性はSugo等（前掲）に記載されているようにして
測定した。アフィニティー精製されたＰＣ９６２は、ア
ミドリシス測定及び抗−凝固測定の両方において十分に
活性であることが証明された。pH１１．５の緩衝液によ
る抗体カラムからの溶出により、３Ｍ ＫＳＣＮ溶出に
より得られる蛋白質より高い活性を有する蛋白質が得ら
れた。 【０１１８】ｐＤＸ／ＰＣ９６２をＢＨＫ細胞にトラン
スフェクトすることにより得られるクローン化セルライ
ンを限界欷釈法によっても得た。ＭＴＸで選択されたコ
ロニーのプレート１枚（約３００コロニー）をトリプシ
ン処理し、計数し、そして平均０．５細胞／ウエルでミ
クロタイタープレートに再プレートした。これらを２５
０nM ＭＴＸを含有する選択培地中で増殖せしめた。約
５０％のウエルがコロニーを含有していた。同定可能な
コロニー（直径１〜２mm）を含むウエルを培地中のプロ
テインＣレベルについてＥＬＩＳＡによりアッセイし
た。このアッセイのため、すべてのウエルに新鮮な培地
を加え、７５分間インキュベートし、次に取り出しそし
てアッセイした。７５分間で５０ng／ml（１０００ng／
ml／日に相当する）より多くを蓄積する５個のコロニー
を、より大規模な培養のために１０cmプレートに分け
た。これらのクローンのプロテインＣ生産レベルは１．
１〜２．８pg／細胞／日であった。 【０１１９】ＰＣ９６２のｃＤＮＡをプラスミドＺｅｍ
２９９に挿入することによりＰＣ９６２／２２９と称す
る第二のプラスミドを造成した。Ｚｅｍ２２９はｐＵＣ
１８を基礎とする発現ベクターであって、マウスメタロ
チオネイン−ＩプロモーターとＳＶ４０転写ターミネー
ターとの間に外来ＤＮＡを挿入するためのユニークＢａ
ｍＨＩ部位を含有する。Ｚｅｍ２２９はさらに、ＳＶ４
０初期プロモーター、マウスジヒドロフォレートレダク
ターゼ遺伝子及びＳＶ４０ターミネーターを含有する。
ｐＤＸ／ＰＣ９６２からのＰＣ９６２ ｃＤＮＡを含有
するＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ合成オ
リゴヌクレオチドアダプターを用いて、ＢａｍＨＩで切
断されそしてホスファターゼで処理されたＺｅｍ２２９
に連結した。得られるベクターをＰＣ９６２／２２９と
称し、図１９に示す。 【０１２０】プラスミドＰＣ９６２／２２９をリン酸カ
ルシウム法によりＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。
１０％ウシ胎児血清及び５μｇ／mlビタミンＫを含有す
るダルベコのＭＥＭ中で培養した。このトランスフェク
ションからの４８時間の一時的発現レベルは約２５ng／
mlであった。２日後、トランスフェクトされた細胞を２
５０nM ＭＴＸを含有する選択培地に分け、そしてさら
に１４時間培養した。約２００コロニーずつを含有する
このトランスフェクションからの３枚のプレートをイム
／フィルターアッセイによってスクリーニングし、そし
て２４個の最も強く反応するコロニーをシリンダークロ
ーニングにより拾い上げた。これらを１０cmプレート中
で個別に増殖せしめ、そしてこれらのプロテインＣ生産
レベルを測定した。１．１〜２．３pg／細胞／日を生産
するコロニーを用いて安定なプロテインＣ生産セルライ
ンの調製を行った。 【０１２１】発現ベクターｐＤＸ／ＰＣ９６２及びプラ
スミドｐＫＯ−ｎｅｏをリン酸カルシウム法により２９
３細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクト
された細胞を４８時間後に５００μｇ／mlのＧ４１８を
含有する培地に分けた。選択培地中で１０日間の後、イ
ム／フィルターアッセイを行いそしてシリンダークロー
ニングにより２個のコロニーを拾った。プロテインＣ生
産は１〜２pg／細胞／日であることが見出された。培養
をスケールアップし、そしてプロテインＣをイムノ−ア
フィニティークロマトグラフィーにより精製した。プロ
テインＣの９５％より多くが二本鎖形であることが見出
された。 【０１２２】ＢＨＫ細胞及び２９３細胞から調製された
９６２変異体蛋白質の構造を、２９３細胞から及び血漿
からの野性型プロテインＣの構造と比較した。ＳＤＳ／
ＰＡＧＥ及びこれに続く銀染色による分析によれば、す
べての組換蛋白質が、血漿蛋白質の重鎖及び軽鎖と同時
泳動する重鎖及び軽鎖を含有していた。２９３細胞中で
合成された野性型プロテインＣは有意量（約２０％）の
Ｍｒ＝６６，０００の単鎖のプロセシングされていない
蛋白質を含有しており、他方いずれの細胞型において生
産された変異体蛋白質も本質的に完全に二本鎖にプロセ
シングされていた。 【０１２３】Ｎ−末端配列分析によれば、組換野性型蛋
白質及びＢＨＫ／ＰＣ９６２変異体蛋白質の軽鎖及び重
鎖の両者は適切にプロセシングされていた。組換蛋白質
のγ−カルボキシル化の程度を２つの異なるＥＬＩＳＡ
系により測定した。第一の系は蛋白質のγ−カルボキシ
ル化された形態及びカルボキシル化されていない形態の
両者を認識し、他方第二の系は、カルシウムの存在下で
ｇｌａ−誘導コンホーメーション変化を受けたプロテイ
ンＣのみを認識する特異的抗体を用いる。この分析によ
れば、ＢＨＫ細胞において生産された組換プロテインＣ
の約６０％及び２９３細胞において生産されたそれの９
０〜９５％が、特異的抗体に認識されるために十分にγ
−カルボキシル化されていた。 【０１２４】３種類の組換蛋白質をさらにアミドリシス
活性及び抗凝固活性についても分析し、そして結果を血
漿プロテインＣの活性と比較した。ＢＨＫ細胞からのＰ
Ｃ９６２及び２９３細胞からの野性型プロテインＣの両
者が十分なアミドリシス活性を示した。抗凝固アッセイ
において、ＢＨＫ細胞からのプロテインＣは血漿プロテ
インＣと本質的に同じ比活性を有し、他方２９３細胞か
らの野性型蛋白質及びＰＣ９６２変異体蛋白質は一貫し
て約４０％高い比活性を示した。 【０１２５】Ｃ．活性化されたプロテインＣプロセシン
グ部位の変形 プロセシング部位配列Arg-Arg-Lys-Arg を有する活性化
されたプロテインＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列を、
野性型プロテインＣ配列の変異誘発により造成した。生
ずる配列はｐＰＣ９６２中のそれと類似していたが、し
かし活性化ペプチドをコードする部分を欠いていた。プ
ラスミドｐ５９４中に存在するプロテインＣ配列を１回
の変異誘発により変形して活性化ペプチドのコドンを除
去しそしてプロセシング部位のArg-Arg コドンを挿入し
た。変異誘発は、配列５′CGC AGT CAC CTG AGA AGA AA
A CGA CTC ATT GAT GGG ３′（配列番号：１２）を有す
るオリゴヌクレオチドを用いて例７Ａに記載したのと実
質的に同様にして、ｐ５９４からの８７０bp ＳｓｔＩ
断片上で行った。 【０１２６】変異した配列を用いて発現ベクターｐＤＸ
／ＰＣ１０５８を造成し、そしてこのベクターを例７Ｂ
に記載したようにしてＢＨＫ細胞に同時トランスフェク
トした。蛋白質をポリクローナル抗体カラム上でpH１
１．５の緩衝液を溶離剤として用いて精製した。１０５
８蛋白質の活性を活性化された血漿プロテインＣ及び活
性化されたＰＣ９６２と比較した。血漿プロテインＣ及
びＰＣ９６２（５μｇ／ml）は１／１０容量のプロタッ
クＣ（アメリカンダイアグノスチカ）で２時間処理する
ことにより活性化した。 【０１２７】５０μｌのヒト血漿を５０μｌの活性化さ
れたプロテインＣと混合し、そしてこの混合物を３８℃
にて１５０秒間インキュベートすることにより抗凝固活
性をアッセイした。この混合物に５０μｌの活性化され
たセファロプラスチン（アメリカン・サイエンティフィ
ック・プロダクツ，マクガウパーク，ＩＬ）を加え、そ
してこの混合物を３７℃にて３００秒間インキュベート
した。１００μｌの２０mM ＣａＣｌ₂ を加え、そして
凝固時間を記録した。データーを図２０に示す。 【０１２８】例８． プロテインＣを分泌せしめるため
のファクターVII 及びプロトロンビンのプレープロペプ
チドの使用 適切にプロセシングされたプロテインＣの一層の高収量
のため、プロテインＣプレープロペプチドの代わりにフ
ァクターVII プレープロペプチドを用いた。次に、これ
らのハイブリド造成分を適当な発現ベクターに挿入し、
そして哺乳類セルラインにトランスフェクトする。ファ
クターVII をコードするｃＤＮＡは記載されている（Ha
gen 等、Proc.Nstl.Acad.Sci. USA 83：2412-2416, 1
986 ）。クローンＨＶII５６５は３８アミノ酸のプレー
プロペプチドのためのコード配列を含む。このコード配
列を１４０bpのＥｃｏＲＩ−ＨｈａＩ断片として単離し
た。 【０１２９】プロテインＣ配列をｐ５９４からＳｓｔＩ
による部分開裂及びＥｃｏＲＩによる完全消化により単
離した。コドン＋７のＳｓｔ部位からｃＤＮＡの３′側
のＥｃｏＲＩまで延びる１５４０bpの断片を単離した。
次に、ファクターVII 配列及びプロテインＣ配列を、フ
ァクターVII プレープロペプチドのアミノ酸−３〜−１
及びプロテインＣのアミノ酸１−８のコード配列を完成
するオリゴヌクレオチドリンカーにより連結した。この
リンカーは、配列５′CCGGCGCGCCAACTCCTTCCTGGAGGAGCT
３′（配列番号：１３）、及び５′CCTCCAGGAAGGAGTTGG
CGCGCCGGCG３′（配列番号：１４）を有する２個のオリ
ゴヌクレオチドから調製した。 【０１３０】２個のオリゴヌクレオチドをアニールし、
そして四元連結によりファクターVII プレープロ配列、
プロテインＣ ｃＤＮＡ、及びＥｃｏＲＩにより開裂さ
れそして細菌アルカリ性ホスファターゼにより処理され
たｐＵＣ９に連結した。連結されたＤＮＡを使用して
Ｅ．コリ（ＪＭ １０１）を形質転換した。プラスミド
ＤＮＡを調製し、そして１７１０bpのＥｃｏＲＩ断片の
存在についてスクリーニングした。正しいクローンをｐ
７／Ｃ−１０と称する。ファクターVII ／プロテインＣ
融合蛋白質を２９３細胞中で発現せしめた。プラスミド
ｐ７／Ｃ−１０からのＥｃｏＲＩ挿入部をＥｃｏＲＩで
消化したｐＤＸに連結した。生ずる発現ベクターを用い
て前記の様にして２９３細胞を同時トランスフェクトし
た。２４時間の発現レベルをＥＬＩＳＡにより測定し、
そして野性型プロテインＣ発現造成物によりトランスフ
ェクトされた２９３細胞及びトランスフェクトされてい
ない細胞の発現レベルと比較した。結果を第５表に示
す。 【０１３１】 【表５】 【０１３２】プロトロンビンリーダー配列を第６表に示
すオリゴヌクレオチドから調製し、そして成熟プロテイ
ンＣコード配列に融合せしめた。１ｍ ＭＡＴＰを含有
する２０μｌのキナーゼ緩衝液中で５０ngの各オリゴヌ
クレオチドを１ユニットの＋４キナーゼと混合すること
によりオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理した。３７℃
にて３０分間反応を進行せしめ、次に混合物を６５℃に
て１０分間加熱してキナーゼを不活性化した。 【０１３３】 【表６】【０１３４】次に、プロトロンビンリーダーを組み立て
た。ＥｃｏＲＩ及びＳｓｔＩで切断された５０ngのＭＢ
ｍｐ１９を２．５ngずつのキナーゼ処理されたオリゴヌ
クレオチドと、１ｍ ＭＡＴＰ及び４ユニットのＴ４リ
ガーゼを含有する２０μｌの１×リガーゼ緩衝液中で混
合した。この混合物を１５℃にて４８時間インキュベー
トし、そしてコンピテントＥ．コリＪＭ１０１細胞にト
ランスフェクトした。透明なプラークを選択し、そして
ファージＤＮＡを調製した。ＤＮＡの配列決定により正
しい配列が造成されたことが確認された。 【０１３５】次に、プロトロンビンリーダーをプロテイ
ンＣ配列に連結した。合成されたリーダーを含有するフ
ァージクローンからＲＦ ＤＮＡを調製し、そして１５
０bpのＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ断片を単離した。プラスミ
ドｐ５９４をＥｃｏＲＩで完全消化し、そしてＳｓｔＩ
で完全消化し、そして１５４０bpのプロテインＣ断片を
回収した。これらの断片をＥｃｏＲＩで切断したｐＤＸ
と連結し、そして連結混合物を用いてコンピテントＥ．
コリＨＢ１０１細胞を形質転換した。形質転換体コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを単離し、そして制限酵素消化
により分析し、断片が正しい方向で組立てられたことを
確認した。以上、特定の例によりこの発明を具体的に説
明したが、この発明の範囲がこれらの例に限定されるも
のではない。 【０１３６】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 GGCTGTCATG GCGGCAGGAC GGCGAACTTG CAGTATCTCC ACGACCCGCC CCTGTGCCAG 60 TGCCTCCAGA ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG CTG TTC GTG GCC ACC 109 MET Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr -40 -35 -30 TGG GGA ATT TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTG TTC TCC AGC 157 Trp Gly Ile Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser -25 -20 -15 AGC GAG CGT GCC CAC CAG GTG CTG CGG ATC CGC AAA CGT GCC AAC TCC 205 Ser Glu Arg Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser -10 -5 -1 1 TTC CTG GAG GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG 253 Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu 5 10 15 GAG ATC TGT GAC TTC GAG GAG GCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT 301 Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp 20 25 30 35 GAC ACA CTG GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG 349 Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu 40 45 50 【０１３７】 GTC TTG CCC TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC 397 Val Leu Pro Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly 55 60 65 ACG TGC ATC GAC GGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC 445 Thr Cys Ile Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly 70 75 80 TGG GAG GGC CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG 493 Trp Glu Gly Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser 85 90 95 CTG GAC AAC GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG 541 Leu Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp 100 105 110 115 CGG CGC TGT AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG 589 Arg Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu 120 125 130 CAG TGT CAC CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGT GGG AGG CCC TGG AAG CGG 637 Gln Cys His Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg 135 140 145 ATG GAG AAG AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA GAC ACA GAA GAC CAA GAA 685 Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu 150 155 160 GAC CAA GTA GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA 733 Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly 165 170 175 GAC AGC CCC TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC 781 Asp Ser Pro Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala 180 185 190 195 【０１３８】 TGC GGG GCA GTG CTC ATC CAC CCC TCC TGG GTG CTG ACA GCG GCC CAC 829 Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His 200 205 210 TGC ATG GAT GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC 877 Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp 215 220 225 CTG CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC 925 Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val 230 235 240 TTC GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA 973 Phe Val His Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala 245 250 255 CTG CTG CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC 1021 Leu Leu His Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro 260 265 270 275 ATC TGC CTC CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC 1069 Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala 280 285 290 GGC CAG GAG ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC AGC AGC CGA GAG 1117 Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu 295 300 305 AAG GAG GCC AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC ATC AAG ATT 1165 Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile 310 315 320 CCC GTG GTC CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG 1213 Pro Val Val Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val 325 330 335 【０１３９】 TCT GAG AAC ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC CGG CAG GAT GCC 1261 Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala 340 345 350 355 TGC GAG GGC GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACC 1309 Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr 360 365 370 TGG TTC CTG GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT 1357 Trp Phe Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu 375 380 385 CAC AAC TAC GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG ATC 1405 His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile 390 395 400 CAT GGG CAC ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT 1453 His Gly His Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 405 410 415 TAG CGACCCTCCC TGCAGGGCTG GGCTTTTGCA TGGCAATGGA TGGGACATTA 1506 AAGGGACATG TAACAAGCAC ACCGGCCTGC TGTTCTGTCC TTCCATCCCT CTTTTGGGCT 1566 CTTCTGGAGG GAAGTAACAT TTACTGAGCA CCTGTTGTAT GTCACATGCC TTATGAATAG 1626 AATCTTAACT CCTAGAGCAA CTCTGTGGGG TGGGGAGGAG CAGATCCAAG TTTTGCGGGG 1686 TCTAAAGCTG TGTGTGTTGA GGGGGATACT CTGTTTATGA AAAAGAATAA AAAACACAAC 1746 CACGAAAAAA 1756 【０１４０】配列番号：２ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 【０１４１】 AGTGAATCTG GGCGAGTAAC ACAAAACTTG AGTGTCCTTA CCTGAAAAAT 50 AGAGGTTAGA GGGATGCTAT GTGCCATTGT GTGTGTGTGT TGGGGGTGGG 100 GATTGGGGGT GATTTGTGAG CAATTGGAGG TGAGGGTGGA GCCCAGTGCC 150 CAGCACCTAT GCACTGGGGA CCCAAAAAGG AGCATCTTCT CATGATTTTA 200 TGTATCAGAA ATTGGGATGG CATGTCATTG GGACAGCGTC TTTTTTCTTG 250 TATGGTGGCA CATAAATACA TGTGTCTTAT AATTAATGGT ATTTTAGATT 300 TGACGAAATA TGGAATATTA CCTGTTGTGC TGATCTTGGG CAAACTATAA 350 TATCTCTGGG CAAAAATGTC CCCATCTGAA AAACAGGGAC AACGTTCCTC 400 CCTCAGCCAG CCACTATGGG GCTAAAATGA GACCACATCT GTCAAGGGTT 450 TTGCCCTCAC CTCCCTCCCT GCTGGATGGC ATCCTTGGTA GGCAGAGGTG 500 GGCTTCGGGC AGAACAAGCC GTGCTGAGCT AGGACCAGGA GTGCTAGTGC 550 CACTGTTTGT CTATGGAGAG GGAGGCCTCA GTGCTGAGGG CCAAGCAAAT 600 ATTTGTGGTT ATGGATTAAC TCGAACTCCA GGCTGTCATG GCGGCAGGAC 650 GGCGAACTTG CAGTATCTCC ACGACCCGCC CCTGTGAGTC CCCCTCCAGG 700 CAGGTCTATG AGGGGTGTGG AGGGAGGGCT GCCCCCGGGA GAAGAGAGCT 750 AGGTGGTGAT GAGGGCTGAA TCCTCCAGCC AGGGTGCTCA ACAAGCCTGA 800 GCTTGGGGTA AAAGGACACA AGGCCCTCCA CAGGCCAGGC CTGGCAGCCA 850 CAGTCTCAGG TCCCTTTGCC ATGCGCCTCC CTCTTTCCAG GCCAAGGGTC 900 CCCAGGCCCA GGGCCATTCC AACAGACAGT TTGGAGCCCA GGACCCTCCA 950 TTCTCCCCAC CCCACTTCCA CCTTTGGGGG TGTCGGATTT GAACAAATCT 1000 CAGAAGCGGC CTCAGAGGGA GTCGGCAAGA ATGGAGAGCA GGGTCCGGTA 1050 GGGTGTGCAG AGGCCACGTG GCCTATCCAC TGGGGAGGGT TCCTTGATCT 1100 CTGGCCACCA GGGCTATCTC TGTGGCCTTT TGGAGCAACC TGGTGGTTTG 1150 GGGCAGGGGT TGAATTTCCA GGCCTAAAAC CACACAGGCC TGGCCTTGAG 1200 TCCTGGCTCT GCGAGTAATG CATGGATGTA AACATGGAGA CCCAGGACCT 1250 TGCCTCAGTC TTCCGAGTCT GGTGCCTGCA GTGTACTGAT GGTGTGAGAC 1300 CCTACTCCTG GAGGATGGGG GACAGAATCT GATCGATCCC CTGGGTTGGT 1350 【０１４２】 GACTTCCCTG TGCAATCAAC GGAGACCAGC AAGGGTTGGA TTTTTAATAA 1400 ACCACTTAAC TCCTCCGAGT CTCAGTTTCC CCCTCTATGA AATGGGGTTG 1450 ACAGCATTAA TAACTACCTC TTGGGTGGTT GTGAGCCTTA ACTGAAGTCA 1500 TAATATCTCA TGTTTACTGA GCATGAGCTA TGTGCAAAGC CTGTTTTGAG 1550 AGCTTTATGT GGACTAACTC CTTTAATTCT CACAACACCC TTTAAGGCAC 1600 AGATACACCA CGTTATTCCA TCCATTTTAC AAATGAGGAA ACTGAGGCAT 1650 GGAGCAGTTA AGCATCTTGC CCAACATTGC CCTCCAGTAA GTGCTGGAGC 1700 TGGAATTTGC ACCGTGCAGT CTGGCTTCAT GGCCTGCCCT GTGAATCCTG 1750 TAAAAATTGT TTGAAAGACA CCATGAGTGT CCAATCAACG TTAGCTAATA 1800 TTCTCAGCCC AGTCATCAGA CCGGCAGAGG CAGCCACCCC ACTGTCCCCA 1850 GGGAGGACAC AAACATCCTG GCACCCTCTC CACTGCATTC TGGAGCTGCT 1900 TTCTAGGCAG GCAGTGTGAG CTCAGCCCCA CGTAGAGCGG GCAGCCGAGG 1950 CCTTCTGAGG CTATGTCTCT AGCGAACAAG GACCCTCAAT TCCAGCTTCC 2000 GCCTGACGGC CAGCACACAG GGACAGCCCT TTCATTCCGC TTCCACCTGG 2050 GGGTGCAGGC AGAGCAGCAG CGGGGGTAGC ACTGCCCGGA GCTCAGAAGT 2100 CCTCCTCAGA CAGGTGCCAG TGCCTCCAGA ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG 2154 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu -40 -35 CTG TTC GTG GCC ACC TGG GGA ATT TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT G 2200 Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu -30 -25 -20 GTAAGGCCAC CCCACCCCTA CCCCGGGACC CTTGTGGCCT CTACAAGGCC 2250 CTGGTGGCAT CTGCCCAGGC CTTCACAGCT TCCACCATCT CTCTGAGCCC 2300 TGGGTGAGGT GAGGGGCAGA TGGGAATGGC AGGAATCAAC TGACAAGTCC 2350 CAGGTAGGCC AGCTGCCAGA GTGCCACACA GGGGCTGCCA GGGCAGGCAT 2400 GCGTGATGGC AGGGAGCCCC GCGATGACCT CCTAAAGCTC CCTCCTCCAC 2450 ACGGGGATGG TCACAGAGTC CCCTGGGCCT TCCCTCTCCA CCCACTCACT 2500 CCCTCAACTG TGAAGACCCC AGGCCCAGGC TACCGTCCAC ACTATCCAGC 2550 【０１４３】 ACAGCCTCCC CTACTCAAAT GCACACTGGC CTCATGGCTG CCCTGCCCCA 2600 ACCCCTTTCC TGGTCTCCAC AGCCAACGGG AGGAGGCCAT GATTCTTGGG 2650 GAGGTCCGCA GGCACATGGG CCCCTAAAGC CACACCAGGC TGTTGGTTTC 2700 ATTTGTGCCT TTATAGAGCT GTTTATCTGC TTGGGACCTG CACCTCCACC 2750 CTTTCCCAAG GTGCCCTCAG CTCAGGCATA CCCTCCTCTA GGATGCCTTT 2800 TCCCCCATCC CTTCTTGCTC ACACCCCCAA CTTGATCTCT CCCTCCTAAC 2850 TGTGCCCTGC ACCAAGACAG ACACTTCACA GAGCCCAGGA CACACCTGGG 2900 GACCCTTCCT GGGTGATAGG TCTGTCTATC CTCCAGGTGT CCCTGCCCAA 2950 GGGGAGAAGC ATGGGGAATA CTTGGTTGGG GGAGGAAAGG AAGACTGGGG 3000 GGATGTGTCA AGATGGGGCT GCATGTGGTG TACTGGCAGA AGAGTGAGAG 3050 GATTTAACTT GGCAGCCTTT ACAGCAGCAG CCAGGGCTTG AGTACTTATC 3100 TCTGGGCCAG GCTGTATTGG ATGTTTTACA TGACGGTCTC ATCCCCATGT 3150 TTTTGGATGA GTAAATTGAA CCTTAGAAAG GTAAAGACAC TGGCTCAAGG 3200 TCACACAGAG ATCGGGGTGG GGTTCACAGG GAGGCCTGTC CATCTCAGAG 3250 CAAGGCTTCG TCCTCCAACT GCCATCTGCT TCCTGGGGAG GAAAAGAGCA 3300 GAGGACCCCT GCGCCAAGCC ATGACCTAGA ATTAGAATGA GTCTTGAGGG 3350 GGCGGAGACA AGACCTTCCC AGGCTCTCCC AGCTCTGCTT CCTCAGACCC 3400 CCTCATGGCC CCAGCCCCTC TTAGGCCCCT CACCAAGGTG AGCTCCCCTC 3450 CCTCCAAAAC CAG AC TCA GTG TTC TCC AGC AGC GAG CGT GCC CAC CAG 3498 Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg Ala His Gln -15 -10 GTG CTG CGG ATC CGC AAA CGT GCC AAC TCC TTC CTG GAG GAG CTC CGT 3546 Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg -5 -1 1 5 CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAG TGC ATA GAG GAG ATC TGT GAC TTC GAG 3594 His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu 10 15 20 25 【０１４４】 GAG GCC AAG GAA ATT TTC CAA AAT GTG GAT GAC ACA GTAAGGCCAC 3640 Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr 30 35 CATGGGTCCA GAGGATGAGG CTCAGGGGCG AGCTGGTAAC CAGCAGGGGC 3690 CTCGAGGAGC AGGTGGGGAC TCAATGCTGA GGCCCTCTTA GGAGTTGTGG 3740 GGGTGGCTGA GTGGAGCGAT TAGGATGCTG GCCCTATGAT GTCGGCCAGG 3790 CACATGTGAC TGCAAGAAAC AGAATTCAGG AAGAAGCTCC AGGAAAGAGT 3840 GTGGGGTGAC CCTAGGTGGG GACTCCCACA GCCACAGTGT AGGTGGTTCA 3890 GTCCACCCTC CAGCCACTGC TGAGCACCAC TGCCTCCCCG TCCCACCTCA 3940 CAAAGAGGGG ACCTAAAGAC CACCCTGCTT CCACCCATGC CTCTGCTGAT 3990 CAGGGTGTGT GTGTGACCGA AACTCACTTC TGTCCACATA AAATCGCTCA 4040 CTCTGTGCCT CACATCAAAG GGAGAAAATC TGATTGTTCA GGGGGTCGGA 4090 AGACAGGGTC TGTGTCCTAT TTGTCTAAGG GTCAGAGTCC TTTGGAGCCC 4140 CCAGAGTCCT GTGGACGTGG CCCTAGGTAG TAGGGTGAGC TTGGTAACGG 4190 GGCTGGCTTC CTGAGACAAG GCTCAGACCC GCTCTGTCCC TGGGGATCGC 4240 TTCAGCCACC AGGACCTGAA AATTGTGCAC GCCTGGGCCC CCTTCCAAGG 4290 CATCCAGGGA TGCTTTCCAG TGGAGGCTTT CAGGGCAGGA GACCCTCTGG 4340 CCTGCACCCT CTCTTGCCCT CAGCCTCCAC CTCCTTGACT GGACCCCCAT 4390 CTGGACCTCC ATCCCCACCA CCTCTTTCCC CAGTGGCCTC CCTGGCAGAC 4440 ACCACAGTGA CTTTCTGCAG GCACATATCT GATCACATCA AGTCCCCACC 4490 GTGCTCCCAC CTCACCCATG GTCTCTCAGC CCCAGCAGCC TTGGCTGGCC 4540 TCTCTGATGG AGCAGGCATC AGGCACAGGC CGTGGGTCTC AACGTGGGCT 4590 GGGTGGTCCT GGACCAGCAG CAGCCGCCGC AGCAGCAACC CTGGTACCTG 4640 GTTAGGAACG CAGACCCTCT GCCCCCATCC TCCCAACTCT GAAAAACACT 4690 GGCTTAGGGA AAGGCGCGAT GCTCAGGGGT CCCCCAAAGC CCGCAGGCAG 4740 AGGGAGTGAT GGGACTGGAA GGAGGCCGAG TGACTTGGTG AGGGATTCGG 4790 GTCCCTTGCA TGCAGAGGCT GCTGTGGGAG CGGACAGTCG CGAGAGCAGC 4840 ACTGCAGCTG CATGGGGAGA GGGTGTTGCT CCAGGGACGT GGGATGGAGG 4890 【０１４５】 CTGGGCGCGG GCGGGTGGCG CTGGAGGGCG GGGGAGGGGC AGGGAGCACC 4940 AGCTCCTAGC AGCCAACGAC CATCGGGCGT CGATCCCTGT TTGTCTGGAA 4990 GCCCTCCCCT CCCCTGCCCG CTCACCCGCT GCCCTGCCCC ACCCGGGCGC 5040 GCCCCTCCGC ACACCGGCTG CAGGAGCCTG ACGCTGCCCG CTCTCTCCGC 5090 AG CTG GCC TTC TGG TCC AAG CAC GTC G GTGAGT GCGTTCTAGA 5133 Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val 40 45 TCCCCGGCTG GACTACCGGC GCCCGCGCCC CTCGGGATCT CTGGCCGCTG 5183 ACCCCCTACC CCGCCTTGTG TCGCAG AC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG 5232 Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu 50 CCC TTG GAG CAC CCG TGC GCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC 5280 Pro Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys 55 60 65 ATC GAC GGC ATC GGC AGC TTC AGC TGC GAC TGC CGC AGC GGC TGG GAG 5328 Ile Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu 70 75 80 85 GGC CGC TTC TGC CAG CGC G GTGAGGG GGAGAGGTGG ATGCTGGCGG 5374 Gly Arg Phe Cys Gln Arg 90 GCGGCGGGGC GGGGCTGGGG CCGGGTTGGG GGCGCGGCAC CAGCACCAGC 5424 TGCCCGCGCC CTCCCCTGCC CGCAG AG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCT CTG 5475 Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu 95 100 GAC AAC GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC CTA GAG GAG GTG GGC TGG CGG 5523 Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg 105 110 115 【０１４６】 CGC TGT AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GAC CTC CTG CAG 5571 Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln 120 125 130 TGT CAC CCC GCA G GTGAGAAGCC CCCAATACAT CGCCCAGGAA TCACGCTGGG 5624 Cys His Pro Ala 135 TGCGGGGTGG GCAGGCCCCT GACGGGCGCG GCGCGGGGGG CTCAGGAGGG 5674 TTTCTAGGGA GGGAGCGAGG AACAGAGTTG AGCCTTGGGG CAGCGGCAGA 5724 CGCGCCCAAC ACCGGGGCCA CTGTTAGCGC AATCAGCCCG GGAGCTGGGC 5774 GCGCCCTCCG CTTTCCCTGC TTCCTTTCTT CCTGGCGTCC CCGCTTCCTC 5824 CGGGCGCCCC TGCGACCTGG GGCCACCTCC TGGAGCGCAA GCCCAGTGGT 5874 GGCTCCGCTC CCCAGTCTGA GCGTATCTGG GGCGAGGCGT GCAGCGTCCT 5924 CCTCCATGTA GCCTGGCTGC GTTTTTCTCT GACGTTGTCC GGCGTGCATC 5974 GCATTTCCCT CTTTACCCCC TTGCTTCCTT GAGGAGAGAA CAGAATCCCG 6024 ATTCTGCCTT CTTCTATATT TTCCTTTTTA TGCATTTTAA TCAAATTTAT 6074 ATATGTATGA AACTTTAAAA ATCAGAGTTT TACAACTCTT ACACTTTCAG 6124 CATGCTGTTC CTTGGCATGG GTCCTTTTTT CATTCATTTT CATAAAAGGT 6174 GGACCCTTTT AATGTGGAAA TTCCTATCTT CTGCCTCTAG GGCATTTATC 6224 ACTTATTTCT TCTACAATCT CCCCTTTACT TCCTCTATTT TCTCTTTCTG 6274 GACCTCCCAT TATTCAGACC TCTTTCCTCT AGTTTTATTG TCTCTTCTAT 6324 TTCCCATCTC TTTGACTTTG TGTTTTCTTT CAGGGAACTT TCTTTTTTTT 6374 CTTTTTTTTT GAGATGGAGT TTCACTCTTG TTGTCCCAGG CTGGAGTGCA 6424 ATGACGTGAT CTCAGCTCAC CACAACCTCC GCCTCCTGGA TTCAAGCGAT 6474 TCTCCTGCCG CAGCCTCCCG AGTAGCTGGG ATTACAGGCA TGCGCCACCA 6524 CGCCCAGCTA ATTTTGTGTT TTTAGTAGAG AAGGGGTTTC TCCGTGTTGG 6574 TCAAGCTGGT CTTGAACTCC TGACCTCAGG TGATCCACCT GCCTTGGCCT 6624 CCTAAAGTGC TGGGATTACA GGCGTGAGCC ACCGCGCCCA GCCTCTTTCA 6674 GGGAACTTTC TACAACTTTA TAATTCAATT CTTCTGCAGA AAAAAATTTT 6724 【０１４７】 TGGCCAGGCT CAGTAGCTCA GACCAATAAT TCCAGCACTT TGAGAGGCTG 6774 AGGTGGGAGG ATTGCTTGAG CTTGGGAGTT TGAGACTAGC CTGGGCAACA 6824 CAGTGAGACC CTGTCTCTAT TTTTAAAAAA AGTAAAAAAA GATCTAAAAA 6874 TTTAACTTTT TATTTTGAAA TAATTAGATA TTTCCAGGAA GCTGCAAAGA 6924 AATGCCTGGT GGGCCTGTTG GCTGTGGGTT TCCTGCAAGG CCGTGGGAAG 6974 GCCCTGTCAT TGGCAGAACC CCAGATCGTG AGGGCTTTCC TTTTAGGCTG 7024 CTTTCTAAGA GGACTCCTCC AAGCTCTTGG AGGATGGAAG ACGCTCACCC 7074 ATGGTGTTCG GCCCCTCAGA GCAGGGTGGG GCAGGGGAGC TGGTGCCTGT 7124 GCAGGCTGTG GACATTTGCA TGACTCCCTG TGGTCAGCTA AGAGCACCAC 7174 TCCTTCCTGA AGCGGGGCCT GAAGTCCCTA GTCAGAGCCT CTGGTTCACC 7224 TTCTGCAGGC AGGGAGAGGG GAGTCAAGTC AGTGAGGAGG GCTTTCGCAG 7274 TTTCTCTTAC AAACTCTCAA CATGCCCTCC CACCTGCACT GCCTTCCTGG 7324 AAGCCCCACA GCCTCCTATG GTTCCGTGGT CCAGTCCTTC AGCTTCTGGG 7374 CGCCCCCATC ACGGGCTGAG ATTTTTGCTT TCCAGTCTGC CAAGTCAGTT 7424 ACTGTGTCCA TCCATCTGCT GTCAGCTTCT GGAATTGTTG CTGTTGTGCC 7474 CTTTCCATTC TTTTGTTATG ATGCAGCTCC CCTGCTGACG ACGTCCCATT 7524 GCTCTTTTAA GTCTAGATAT CTGGACTGGG CATTCAAGGC CCATTTTGAG 7574 CAGAGTCGGG CTGACCTTTC AGCCCTCAGT TCTCCATGGA GTATGCGCTC 7624 TCTTCTTGGC AGGGAGGCCT CACAAACATG CCATGCCTAT TGTAGGAGCT 7674 CTCCAAGAAT GCTCACCTCC TTCTCCCTGT AATTCCTTTC CTCTGTGAGG 7724 AGCTCAGCAG CATCCCATTA TGAGACCTTA CTAATCCCAG GGATCACCCC 7774 CAACAGCCCT GGGGTACAAT GAGCTTTTAA GAAGTTTAAC CACCTATGTA 7824 AGGAGACACA GGCAGTGGGC GATGCTGCCT GGCCTGACTC TTGCCATTGG 7874 GTGGTACTGT TTGTTGACTG ACTGACTGAC TGACTGGAGG GGGTTTGTAA 7924 TTTGTATCTC AGGGATTACC CCCAACAGCC CTGGGGTACA ATGAGCCTTC 7974 AAGAAGTTTA ACAACCTATG TAAGGACACA CAGCCAGTGG GTGATGCTGC 8024 CTGGTCTGAC TCTTGCCATT CAGTGGCACT GTTTGTTGAC TGACTGACTG 8074 ACTGACTGGC TGACTGGAGG GGGTTCATAG CTAATATTAA TGGAGTGGTC 8124 【０１４８】 TAAGTATCAT TGGTTCCTTG AACCCTGCAC TGTGGCAAAG TGGCCCACAG 8174 GCTGGAGGAG GACCAAGACA GGAGGGCAGT CTCGGGAGGA GTGCCTGGCA 8224 GGCCCCTCAC CACCTCTGCC TACCTCAG TG AAG TTC CCT TGT GGG AGG CCC 8275 Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro 140 TGG AAG CGG ATG GAG AAG AAG CGC AGT CAC CTG AAA CGA GAC ACA GAA 8323 Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu 145 150 155 160 GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC 8371 Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr 165 170 175 AGG CGG GGA GAC AGC CCC TGG CAG GTGGGAGGCG AGGCAGCACC GGCTCGTCAC 8425 Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln 180 GTGCTGGGTC CGGGATCACT GAGTCCATCC TGGCAGCTAT GCTCAGGGTG 8475 CAGAAACCGA GAGGGAAGCG CTGCCATTGC GTTTGGGGGA TGATGAAGGT 8525 GGGGGATGCT TCAGGGAAAG ATGGACGCAA CCTGAGGGGA GAGGAGCAGC 8575 CAGGGTGGGT GAGGGGAGGG GCATGGGGGC ATGGAGGGGT CTGCAGGAGG 8625 GAGGGTTACA GTTTCTAAAA AGAGCTGGAA AGACACTGCT CTGCTGGCGG 8675 GATTTTAGGC AGAAGCCCTG CTGATGGGAG AGGGCTAGGA GGGAGGGCCG 8725 GGCCTGAGTA CCCCTCCAGC CTCCACATGG GAACTGACAC TTACTGGGTT 8775 CCCCTCTCTG CCAGGCATGG GGGAGATAGG AACCAACAAG TGGGAGTATT 8825 TGCCCTGGGG ACTCAGACTC TGCAAGGGTC AGGACCCCAA AGACCCGGCA 8875 GCCCAGTGGG ACCACAGCCA GGACGGCCCT TCAAGATAGG GGCTGAGGGA 8925 GGCCAAGGGG AACATCCAGG CAGCCTGGGG GCCACAAAGT CTTCCTGGAA 8975 GACACAAGGC CTGCCAAGCC TCTAAGGATG AGAGGAGCTC GCTGGGCGAT 9025 GTTGGTGTGG CTGAGGGTGA CTGAAACAGT ATGAACAGTG CAGGAACAGC 9075 ATGGGCAAAG GCAGGAAGAC ACCCTGGGAC AGGCTGACAC TGTAAAATGG 9125 【０１４９】 GCAAAAATAG AAAACGCCAG AAAGGCCTAA GCCTATGCCC ATATGACCAG 9175 GGAACCCAGG AAAGTGCATA TGAAACCCAG GTGCCCTGGA CTGGAGGCTG 9225 TCAGGAGGCA GCCCTGTGAT GTCATCATCC CACCCCATTC CAG GTG GTC CTG CTG 9280 Val Val Leu Leu 185 GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA GTG CTC ATC CAC CCC TCC 9328 Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro Ser 190 195 200 TGG GTG CTG ACA GCG GCC CAC TGC ATG GAT GAG TCC AAG AAG CTC CTT 9376 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu 205 210 215 220 GTC AGG CTT G GTATGGGCTG GAGCCAGGCA GAAGGGGGCT GCCAGAGGCC 9426 Val Arg Leu TGGGTAGGGG GACCAGGCAG GCTGTTCAGG TTTGGGGGAC CCCGCTCCCC 9476 AGGTGCTTAA GCAAGAGGCT TCTTGAGCTC CACAGAAGGT GTTTGGGGGG 9526 AAGAGGCCTA TGTGCCCCCA CCCTGCCCAC CCATGTACAC CCAGTATTTT 9576 GCAGTAGGGG GTTCTCTGGT GCCCTCTTCG AATCTGGGCA CAGGTACCTC 9626 CACACACATG TTTGTGAGGG GCTACACAGA CCTTCACCTC TCCACTCCCA 9676 CTCATGAGGA GCAGGCTGTG TGGGCCTCAG CACCCTTGGG TGCAGAGACC 9726 AGCAAGGCCT GGCCTCAGGG CTGTGCCTCC CACAGACTGA CAGGGATGGA 9776 GCTGTACAGA GGGAGCCCTA GCATCTGCCA AAGCCACAAG CTGCTTCCCT 9826 AGCAGGCTGG GGGCTCCTAT GCATTGGCCC CGATCTATGG CAATTTCTGG 9876 AGGGGGGGTC TGGCTCAACT CTTTATGCCA AAAAGAAGGC AAAGCATATT 9926 GAGAAAGGCC AAATTCACAT TTCCTACAGC ATAATCTATG CCAGTGGCCC 9976 CGTGGGGCTT GGCTTAGAAT TCCCAGGTGC TCTTCCCAGG GAACCATCAG 10026 TCTGGACTGA GAGGACCTTC TCTCTCAGGT GGGACCCGGC CCTGTCCTCC 10076 【０１５０】 CTGGCAGTGC CGTGTTCTGG GGGTCCTCCT CTCTGGGTCT CACTGCCCCT 10126 GGGGTCTCTC CAGCTACCTT TGCTCCATGT TCCTTTGTGG CTCTGGTCTG 10176 TGTCTGGGGT TTCCAGGGGT CTCGGGCTTC CCTGCTGCCC ATTCCTTCTC 10226 TGGTCTCACG GCTCCGTGAC TCCTGAAAAC CAACCAGCAT CCTACCCCTT 10276 TGGATTGACA CCTGTTGGCC ACTCCTTCTG GCAGGAAAAG TCACCGTTGA 10326 TAGGGTTCCA CGGCATAGAC AGGTGGCTCC GCGCCAGTGC CTGGGACGTG 10376 TGGGTGCACA GTCTCCGGGT GAACCTTCTT CAGGCCCTCT CCCAGGCCTG 10426 CAGGGGCACA GCAGTGGGTG GGCCTCAGGA AAGTGCCACT GGGGAGAGGC 10476 TCCCCGCAGC CCACTCTGAC TGTGCCCTCT GCCCTGCAG GA GAG TAT GAC CTG 10529 Gly Glu Tyr Asp Leu 225 CGG CGC TGG GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAC ATC AAG GAG GTC TTC 10577 Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe 230 235 240 GTC CAC CCC AAC TAC AGC AAG AGC ACC ACC GAC AAT GAC ATC GCA CTG 10625 Val His Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu 245 250 255 260 CTC CAC CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTG CCC ATC 10673 Leu His Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile 265 270 275 TGC CTC CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC GGC 10721 Cys Leu Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly 280 285 290 CAG GAG ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC CAC AGC AGC CGA GAG AAG 10769 Gln Glu Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys 295 300 305 【０１５１】 GAG GCC AAG AGA AAC CGC ACC TTC GTC CTC AAC TTC ATC AAG ATT CCC 10817 Glu Ala Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro 310 315 320 GTG GTC CCG CAC AAT GAG TGC AGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT 10865 Val Val Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser 325 330 335 340 GAG AAC ATG CTG TGT GCG GGC ATC CTC GGG GAC CGG CAG GAT GCC TGC 10913 Glu Asn Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys 345 350 355 GAG GGC GAC AGT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACC TGG 10961 Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp 360 365 370 TTC CTG GTG GGC CTG GTG AGC TGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT CAC 11009 Phe Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His 375 380 385 AAC TAC GGC GTT TAC ACC AAA GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG ATC CAT 11057 Asn Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His 390 395 400 GGG CAC ATC AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG 11105 Gly His Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro STOP 405 410 415 CGACCCTCCC TGCAGGGCTG GGCTTTTGCA TGGCAATGGA TGGGACATTA 11155 AAGGGACATG TAACAAGCAC ACCGGCCTGC TGTTCTGTCC TTCCATCCCT 11205 CTTTTGGGCT CTTCTGGAGG GAAGTAACAT TTACTGAGCA CCTGTTGTAT 11255 GTCACATGCC TTATGAATAG AATCTTAACT CCTAGAGCAA CTCTGTGGGG 11305 TGGGGAGGAG CAGATCCAAG TTTTGCGGGG TCTAAAGCTG TGTGTGTTGA 11355 GGGGGATACT CTGTTTATGA AAAAGAATAA AAAACACAAC CACGAAGCCA 11405 CTAGAGCCTT TTCCAGGGCT TTGGGAAGAG CCTGTGCAAG CCGGGGATGC 11455 TGAAGGTGAG GCTTGACCAG CTTTCCAGCT AGCCCAGCTA TGAGGTAGAC 11505 ATGTTTAGCT CATATCACAG AGGAGGAAAC TGAGGGGTCT GAAAGGTTTA 11555 CATGGTGGAG CCAGGATTCA AATCTAGGTC TGACTCCAAA ACCCAGGTGC 11605 TTTTTTCTGT TCTCCACTGT CCTGGAGGAC AGCTGTTTCG ACGGTGCTCA 11655 GTGTGGAGGC CACTATTAGC TCTGTAGGGA AGCAGCCAGA GACCCAGAAA 11705 GTGTTGGTTC AGCCCAGAAT 11725 【０１５２】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CGACGAGAAC TGAGTCACAA 20 【０１５３】配列番号：４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CTGAAGCTCC TCCGGTTCCT TTAA 24 【０１５４】配列番号：５ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GGAGGAATTC TGAGC 15 【０１５５】配列番号：６ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 TTTGCGGATC CGCAG 15 【０１５６】配列番号：７ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CGACGTGCTT GGACC 15 【０１５７】配列番号：８ 配列の長さ：８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GGAATTCT 8 【０１５８】配列番号：９ 配列の長さ：12 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 GATCAGAATT CC 12 【０１５９】配列番号：10 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CTGAAACGAC TCATTGAT 18 【０１６０】配列番号：11 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 AGTCACCTGA GAAGAAAACG AGACA 25 【０１６１】配列番号：12 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CGCAGTCACC TGAGAAGAAA ACGACTCATT GATGGG 36 【０１６２】配列番号：13 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CCGGCGCGCC AACTCCTTCC TGGAGGAGCT 30 【０１６３】配列番号：14 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CCTCCAGGAA GGAGTTGGCG CGCCGGCG 28 【０１６４】配列番号：15 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CCTCCAGGAA GGAGTTGGCT CGCCGGA 27 【０１６５】配列番号：16 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CGCGTCCGGC GAGCCAACTC CTTCCTGGAG GAGCT 35 【０１６６】配列番号：17 配列の長さ：126 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 AATTCCACCA TGGCTCATGT GAGAGGACTG CAACTGCCTG GCTGCCTGGC TCTGGCTGCT 60 CTGTGCAGCC TGGTGCACAG CCAGCATGTG TTCCTGGCTC CTCAGCAGGC CAGGAGCCTG 120 CTGCAA 126 【０１６７】配列番号：18 配列の長さ：126 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 CGCGTTGCAG CAGGCTCCTG GCCTGCTGAG GAGCCAGGAA CACATGCTGG CTGTGCACCA 60 GGCTGCACAG AGCAGCCAGA GCCAGGCAGC CAGGCAGTTG CAGTCCTCTC ACATGAGCCA 120 TGGTGG 126

【図面の簡単な説明】 【図１】図１はｐＨＣλ６Ｌ中のプロテインＣ ｃＤＮ
Ａの部分的制限地図である。コード領域は空箱で示され
ている。 【図２】図２は完全なプロテインＣ ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列及びプロテインＣの推定アミノ酸配列の上流
部分を示す図である。矢印は連結ジペプチド及び活性化
ペプチドの除去のための開裂部位を示す。 【図３】図３は完全なプロテインＣ ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列及びプロテインＣの推定アミノ酸配列の中間
部分を示す図である。 【図４】図４は完全なプロテインＣ ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列及びプロテインＣの推定アミノ酸配列の下流
部分を示す図である。 【図５】図５はヒトプロテインＣをコードするゲノムＤ
ＮＡの制限酵素地図を示す図である。線の下の数値は長
さキロベース（kb）を示す。 【図６】図６はヒトプロテインＣ遺伝子のエクソン及び
イントロンを含む完全なゲノム配列の上流部分を示す図
である。矢印はイントロン−エクソンのスプライス連結
部を示す。 【図７】図７はヒトプロテインＣ遺伝子のエクソン及び
イントロンを含む完全なゲノム配列の図６に続く部分を
示す図である。矢印はイントロン−エクソンのスプライ
ス連結部を示す。◆は可能性ある炭水化物付着部位を示
す。 【図８】図８はヒトプロテインＣ遺伝子のエクソン及び
イントロンを含む完全なゲノム配列の図７に続く部分を
示す図である。矢印はイントロン−エクソンのスプライ
ス連結部を示す。◆は可能性ある炭水化物付着部位、斜
下向きの太い矢印は連結ジペプチドのプロセシングのた
めの見かけ上の開裂部位、↓はプロテインＣが活性化さ
れたプロテインＣに転換される際の開裂部位を示す。 【図９】図９はヒトプロテインＣ遺伝子のエクソン及び
イントロンを含む完全なゲノム配列を示す図である。
３′末端のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ−Ａ
−Ａ−Ａのポリアデニレーション又はプロセシング配列
が箱で示されている。◆は可能性ある炭水化物付着部位
を示し、そして●はポリアデニレーションの部位を示
す。 【図１０】図１０はヒトプロテインＣの構造の概略の二
次元モデルを示す図である。 【図１１】図１１はプロテインＣの部分的ｃＤＮＡクロ
ーンの５′部分及び３′部分のサブクローニングを示す
図である。 【図１２】図１２はゲノムクローンからのイントロンＡ
の除去によるエクソンＩとエクソンIIの融合を示す図で
ある。 【図１３】図１３は図１のｃＤＮＡ挿入部の５′末端へ
のエクソンＩ及びIIの融合を示す図である。 【図１４】図１４はプロテインＣの完全なコード配列を
含んで成るプラスミドの造成を示す図である。 【図１５】図１５は発現ベクターｐＤ７Ｃを示す図であ
る。使用されている記号は、ｏｒｉ＝アデノウイルス５
０−１マップユニット配列；Ｅ＝ＳＶ４０エンハンサ
ー；Ａｄ２ＭＬＰ＝アデノウイルス２主要後期プロモー
ター；Ｌ１−３＝アデノウイルス２三分節（ｔｒｉｐａ
ｒｔｉｔｅ）リーダー；５′ｓｓ＝５′スプライス部
位；３′ｓｓ＝３′スプライス部位；ｐＡ＝ＳＶ４０初
期ポリアデニレーションシグナル；及びΔ＝ｐＢＲ３２
２“毒性”配列の除去された部分を示す。 【図１６】図１６は発現ベクターｐＤ５（ＰＣ−ＤＨＦ
Ｒ^r ）を示す図である。ＤＨＦＲ^r はメトトレキセート
耐性変異ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子配列を
示し；そしてｐＡはＳＶ４０後期ポリアデニレーション
シグナルを示す。他の記号は図１５について記載した通
りである。 【図１７】図１７は発現ベクターｐＤＸ／ＰＣを示す図
である。記号は図１６について記載した通りである。 【図１８】図１８はトランスフェクトされた２９３細胞
からの培地サンプルでの活性化されたプロテインＣのア
ッセイの結果を示すグラフである。 【図１９】図１９は発現ベクターｐＤＸ／ＰＣ９６２及
びＰＣ９６２／２２９を示す図である。 【図２０】図２０はこの発明の幾つかの態様に従って製
造されたプロテインＣの抗凝固活性を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャスリーン エル，バークナー アメリカ合衆国，ワシントン 98199, シアトル，トゥエンティセカンド アベ ニュ ウェスト 3032 (56)参考文献 欧州公開200421（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒトプロテインＣ又は活性化されたヒトプロテイン
   Ｃと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質であっ
   て、残基１５４がＬｙｓ及びＡｒｇから成る群から選ば
   れた塩基性アミノ酸残基により置き換えられているもの
   をコードするＤＮＡ。 ２．哺乳類宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る発現ベク
   ターであって、プロモーター、該プロモーターに続きそ
   の下流にヒトプロテインＣ又は活性化されたヒトプロテ
   インＣと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質で
   あって、残基１５４がＬｙｓ及びＡｒｇから成る群から
   選ばれた塩基性アミノ酸残基により置き換えられている
   ものをコードするＤＮＡ配列が存在し、該ＤＮＡ配列に
   続いてその下流にポリアデニレーションシグナルが存在
   し、該ＤＮＡ配列の転写が前記プロモーターにより指令
   される、前記発現ベクター。 ３．哺乳類宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る発現ベク
   ターであって、プロモーター、該プロモーターに続きそ
   の下流にヒトプロテインＣ又は活性化されたヒトプロテ
   インＣと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質で
   あって、残基１５４がＬｙｓ及びＡｒｇから成る群から
   選ばれた塩基性アミノ酸残基により置き換えられている
   ものをコードするＤＮＡ配列が存在し、該ＤＮＡ配列に
   続いてその下流にポリアデニレーションシグナルが存在
   し、該ＤＮＡ配列の転写が前記プロモーターにより指令
   される、前記発現ベクターによりトランクフェクトされ
   た哺乳類細胞。 ４．前記細胞がＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ラットＨｅｐ
   Ｉ細胞、ラットＨｅｐII細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝癌細
   胞、ＨｅｐＧ２細胞、マウス肝細胞、ＤＵＫＸ細胞及び
   ２９３細胞から成る群から選ばれたものである特許請求
   の範囲第３項に記載の細胞。