NO173741B - Dna-sekvens for modifisert protein c, vektor inneholdendedenne, pattedyrceller transfektert med vektorer, og fremgangsmaate for fremstilling av nevnte protein - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en DNA sekvens som koder for et modifisert protein med i det vesentlige den samme biologiske aktivitet som humanprotein C eller aktivert humanprotein C, hvori mutasjonen medfører øket spaltningseffek-tivitet ved spaltnings-setet mellom de lette og tunge kjeder,

og en ekspresjonsvektor med evne til integrering i pattedyrvertscelle-DNA som inneholder nevnte DNA-sekvens, pattedyrceller transfektert med vektoren, og en fremgangsmåte for fremstilling av et protein som etter aktivering har hovedsakelig den samme struktur og/eller biologiske aktivitet som humant aktivert protein C.

Protein C er et zymogen eller forstadium for en serin-protease som spiller en viktig rolle i reguleringen av blodkoagulering og frembringelse av fibrinolytisk aktivitet iri vivo. Det syntetiseres i leveren som et én-kjedet polypeptid som gjennomgår betydelige forandringer og gir opphav til et to-kjedet molekyl omfattende tunge (Mr = 4 0 000) og lette (Mr = 21 000) kjeder holdt sammen med en disulfidbinding. Det sirkulerende to-kjedede mellomprodukt omdannes i den biologisk aktive form av molekylet, kjent som "aktivert protein C" (APC) ved den trombinbevirkede spalting av et 12-resters peptid fra aminoenden av den tunge kjeden. Spaltningsreaksjonen påskyndes in vivo av trombomodulin, en endotelial celle-kofaktor (Esom og Owen, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 2249-2252, 1981).

Protein C er et vitamin K-avhengig glykoprotein som inneholder ca. 9 rester av gamma-karboksyglutaminsyre (Gla) og én ekvivalent av betahydroksyaspartinsyre som er dannet ved etter-translasjonelle modifikasjoner av glutaminsyre- og aspartinsyrerester henholdsvis. Den etter-translasjonelle dannelse av spesifikke gamma-karboksyglutaminsyrerester i protein C krever vitamin K. Disse uvanlige aminosyrerester binder seg til kalsiumioner og antas å være ansvarlige for proteinets samvirke med fosfolipid som kreves for den biologiske aktivitet av protein C.

I motsetning til den koaguleringsfremmende virkningen

til andre vitamin K-avhengige plasmaproteiner, såsom faktor VII, faktor IX og faktor X, virker aktivert protein C som en regulator for koaguleringsprosessen gjennom inaktivering av

faktor Va og faktor VIIIa ved begrenset proteolyse. Inakti-veringen av faktorer Va og Villa ved protein C er avhengig av tilstedeværelsen av sure fosfolipider og kalsiumioner. Protein S er blitt rapportert å regulere denne aktiviteten ved å aksellerere APC-katalysert proteolyse av faktor Va (Walker, J. Biol. Chein. 255, 5521-5524, 1980).

Protein C har også vært implisert i virkningen av vevs-type plasminogenaktivator (Kisiel og Fujikawa, Behrin<g> Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983). Infusjon av storfe APC i hunder fører til øket plasminogenaktivator-aktivitet (Comp og Esmon,

J. Clin. Invest. 68: 1221-1228), 1981). Nyere undersøkelser (Sakata et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 1121-1125, 1985) har vist at tilsetning av APC til dyrkede endoteliale celler fører til en rask, doseavhengig økning i fibrinolytisk aktivitet i de kondisjonerte medier som reflekterer økningen i aktiviteten for både urokinase-forbundede og vevstypeplasmino-genaktivatorer av cellene. APC-behandling fører også til en doseavhengig reduksjon i anti-aktivatoraktivitet.

Protein C-mangel har sammenheng med gjentatt trombotisk sykdom (Broekmans et al., New Eng. J. Med. 309: 340-344, 1983; og Seligsohn et al., New Eng. J. Med. 310: 559-562, 1984) og kan stamme fra genetiske forstyrrelser eller fra trauma såsom leversykdom eller kirurgi. Denne tilstanden behandles generelt med orale antikoagulanter. Fordelaktige virkninger har også blitt oppnådd gjennom infusjonen av protein C-holdig normal plasma (se Gardiner og Griffin i Prog. in Hematology, ed. Brown, Grune & Stratton, NY, 13.: 265-278) . I tillegg har noen forskere funnet at anti-koagulantaktiviteten til protein C er anvendelig ved behandling av tromboseforstyrrelser, såsom venøs trombose (Smith et al., PCT Publication No. WO 85/00521). I noen deler av verden anslås det at ca. 1 av 16 000 personer har protein C-mangel. Videre er en total mangel på protein C fatal hos nyfødte.

Til slutt er eksogen protein C blitt vist å forhindre koagulopatiske og letale virkninger av gram negativ septisemi (Taylor et al., J. Clin. Invest. 79: 918-925, 1987). Data som stammer fra studier med bavianer tyder på at protein C spiller en naturlig rolle ved beskyttelse mot septisemi.

Skjønt naturlig protein C kan renses fra sammenklump-ningsfaktor konsentrater (Marlar et al., Blood 59: 1067-1072) eller fra plasma (Kisiel, ibid.) ved en komplisert og kostbar prosess, som delvis skyldes den begrensede tilgjengelighet på utgangsmateriale og den lave konsentrasjonen av protein C i plasma. Videre medfører den terapeutiske anvendelse av produkter som stammer fra menneskeblod risiko for sykdomsover-føring med f.eks. hepatitt-virus, cytomegalovirus eller faktoren som medfører tilegnet immunsviktsyndrom (AIDS). I lys av protein Cs kliniske anvendelighet ved behandling av trombosesykdommer, er fremstillingen av anvendel mengder av protein C og aktivert protein C klart meget verdifull.

I korthet tilveiebringer foreliggende oppfinnelse som innledningsvis nevnt, DNA-sekvenser som koder for substitusjonen av rest 158 med en ikke-sur aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av Ala, Ser, Thr og Gly, substitusjonen av rest 154 med en basisk aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av Lys eller Arg og/eller substitusjon av Lys-Arg ved restene 156-157 med Lys-Lys eller Arg-Arg, og for aminosyre-sekvensen (R<1>)n-R<2->R<3->R<4> ved aminosyrer 154-157 av protein C som vist på figur 2, hvori R<1>, R<2>, R<3> og R<4> er Lys eller Arg og n=0, 1, 2 eller 3, ved spaltningssetet mellom de lette og tunge kjeder.

I tillegg gir foreliggende oppfinnelse ekspresjonsvektorer med evne til integrering i pattedyrsvertscelle-DNA inneholdende en promotor nedstrøms etterfulgt av DNA-sekvens som koder for et protein med hovedsakelig den samme struktur og/eller aktivitet som humant protein C eller humant aktivert protein C som angitt ovenfor, transkripsjon av nukleotidsekvensen dirigeres av promotoren. Nukleotidsekvensen etterfølges nedstrøms av et polyadenyleringsignal. I en utførelsesform inneholder ekspresjonsvektoren en selekterbar markør som befinner seg mellom nukleotidsekvensen og poly-adenyleringsignalet, og transkripsjonen av den selekterbare markør er dirigert av promotoren. Ekspresjonsvektoren kan også inneholde et sett RNA-spleisningsseter.

Et beslektet aspekt av den foreliggende oppfinnelse er pattedyrceller transfektert til å uttrykke et protein som etter aktivering har hovedsakelig den samme biologiske aktivitet som humant protein C. Pattedyrcellene transfekteres med en ekspresjonsvektor som kan integreres i pattedyrsvertscelle-DNA, og ekspresjonsvektoren inneholder en promotor nedstrøms etterfulgt av en DNA-sekvens som beskrevet ovenfor.

I én utførelsesform innføres også en selekterbar markør i cellene, og stabilt transfekterte celler selekteres. Pattedyrceller som er transfektert til å uttrykke et protein som har hovedsakelig den samme biologiske aktivitet som humant protein C er også beskrevet. Foretrukne vertsceller for bruk i den foreliggende oppfinnelse er COS, BHK og 293-celler.

Et videre aspekt av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et protein, som etter aktivering har hovedsakelig den samme biologiske aktivitet som humant aktivert protein C. Fremgangsmåten omfatter (a) innføring i en pattedyrsvertscelle av en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens som beskrevet ovenfor, hvilken koder for et protein med hovedsakelig den samme struktur og/eller aktivitet som humant protein C; (b) dyrkning av pattedyrsvertscellen i et riktig medium; og (c) isolering av proteinproduktet som kodes for av DNA-sekvensen og fremstilles av pattedyrsvertscellen. Proteinproduktet som produseres ifølge denne fremgangsmåten er også beskrevet. En fremgangsmåte for fremstilling av et protein som har hovedsakelig den samme struktur og/eller biologiske aktivitet som humant aktivert protein C er også beskrevet.

De beskrevne proteiner fremstilt ved foreliggende oppfinnelse kan brukes som aktive terapeutiske substanser, innbefattet anvendelse i reguleringen av blodkoagulering. Videre kan disse proteiner kombineres med en fysiologisk akseptabel bærer og/eller fortynningsmiddel og gi anvendelige farmasøytiske blandinger.

Andre aspekter ved oppfinnelsen fremkommer klart ved henvisning til den detaljerte beskrivelse og de vedlagte tegninger.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et delvis restriksjonskart av protein C-cDNA i pHC 6L. Kodeområdet er vist med en åpen boks. Fig. 2 illustrerer nukleotidsekvensen til det fullstendige protein C-cDNA og den deduserte aminosyresekvensen for protein C. Piler viser spaltningsseter for fjerning av uet

forbindende dipeptid og aktiveringspeptid.

Fig. 3 illustrerer et restriksjonsenzymkart for genomisk DNA som koder for humant protein C. Tallene under linjen viser lengden i kilobaser (kb). Fig. 4 illustrerer den fullstendige genomsekvens innbefattende eksoner og introner, for det humane protein C-genet. Pilhoder viser intron-ekson-spleisingsforbindelser. Polyadenylering eller behandlingssekvenser av A-T-T-A-A-A og A-A-T-A-A-A ved 3'-enden er rammet inn, potensielle karbo-hydrattilknytningsseter; åpenbare spaltningsseter for behandling av det forbindende dipeptid; sete for spaltning i den tunge kjede når protein C omdannes til aktivert protein C; sete for polyadenylering. Fig. 5 illustrerer en skjematisk todimensjonal modell for strukturen av humant protein C. Fig. 6 illustrerer subkloningen av 5'- og 3'-delene av et protein C-partielt cDNA-klon. Fig. 7 illustrerer fjerningen av intron A fra det genomiske klon som fører til fusjonen av eksonene I og II. Fig. 8 illustrerer fusjonen av eksonene I og II til den 5'-liggende del av cDNA-innsetningen på fig. 1. Fig. 9 illustrerer konstruksjonen av et plasmid omfattende den fullstendige kodede sekvens for protein C. Fig. 10 illustrerer ekspresjonsvektoren pD7C. Symboler som brukes er ori, adenovirus 5 0-1 kartenhetsekvens: E, SV4 0 forsterkeren, Ad2MLP, adenovirus 2 sen hovedpromotor; Ll-3, adenovirus 2 tripartittleder; 5'ss, 5' spleisningsseter; 3'ss, 3' spleisningsseter; pA, det SV40 tidlige polyadenyleringssignal; og A, det deleterte området av pBR322 "gift"-sekvensene. Fig. 11 illustrerer ekspresjonsvektoren pD5(PC-DHFRr) . DHFR<r> betegner metotreksatresistent mutant dihydrofolat reduk-tasegensekvens; pA betegner det SV4 0 sene polyadenyleringssignal. Andre symboler som brukes er som beskrevet for fig. 10. Fig. 12 illustrerer ekspresjonsvektoren pDX/PC. De brukte symboler er som beskrevet for fig. 11. Fig. 13 illustrerer resultatene av en måling for aktivert protein C på medieprøver fra transfekterte 293-

celler.

Fig. 14 illustrerer ekspresjonsvektorene pDX/PC962 og PC229/962. Fig. 15 illustrerer antikoagulantaktiviteten for protein C fremstilt ifølge visse utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse.

Før oppfinnelsen fremlegges kan det være nyttig for en forståelse av den å angi definisjoner for visse uttrykk som skal brukes i det følgende.

Biologisk aktivitet: En funksjon eller sett av funk-sjoner som utføres av et molekyl i en biologisk sammenheng (dvs. i en organisme eller i en in vitro-faksimile). Biologiske aktiviteter for proteiner kan deles i katalytiske og effektoraktiviteter. Katalytiske aktiviteter for de vitamin K-avhengige plasmaproteiner medfører generelt den spesifikke proteolytiske spaltning av andre plasmaproteiner, som fører til aktivering eller deaktivering av substratet. Effektoraktiviteter medfører spesifikk binding av det biologiske aktive molekyl til kalsium, fosfolipider eller andre små molekyler, til makromolekyler såsom proteiner, eller til celler. Effektoraktivitet hjelper hyppig, eller er vesentlig for, katalytisk aktivitet under fysiologiske forhold.

For protein C er biologisk aktivitet karakterisert ved dets antikoagulant- og fiberinolytiske egenskaper. Når det er aktivert, inaktiverer protein C faktor Va og faktor Villa i nærværet av fosfolipid og kalsium. Protein S synes å inngå i reguleringen av denne funksjonen (Walker, ibid.). Aktivert protein C øker også fibrinolyse, en effekt som antas å skyldes senkning av plasminogenaktivatornivåene (van Hinsbergh et al., Blodd 65: 444-451, 1985). Som nærmere beskrevet nedenunder er den del av protein C som kodes for av eksonene VII og VIII i protein C-genet primært ansvarlig for dets katalytiske aktiviteter.

Pre- pro- peptid: En aminosyresekvens som opptrer på aminoenden hos noen proteiner og generelt spaltes fra protein under translokering. Pro-pro-peptider omfatter sekvenser som fører proteinet i sekresjonsbanen til cellen (signalsekvenser) og er karakterisert ved nærværet av en kjerne av hydrofobe aminosyrer. De kan også omfatte behandlingssignaler. Slik det her brukes, kan uttrykket "pre-pro-peptid" også bety en del av et naturlig forekommende pre-pro-peptid.

Ekspresj onsenhet: En DNA-konstruksjon omfattende en primær nukleotidsekvens som koder for et protein av interesse sammen med andre nukleotidsekvenser som dirigerer og kontrol-lerer transkripsjonen av den primære nukleotidsekvensen. En ekspresjonsenhet består av minst den primære nukleotidsekvensen og en promotorsekvens som befinner seg oppstrøms fra og operabelt bundet til den primære nukleotidsekvens og et polyadenyleringssignal som befinner seg nedstrøms. Ytter-ligere genetiske elementer kan også inngå for å øke ekspresj onsef f ektiviteten. Disse elementer inneholder forsterkede elementer, ledere og mRNA-spleisningsseter.

Ekspresjonsvektor: Et DNA-molekyl som bl.a. inneholder en DNA-sekvens som koder for et protein av interesse sammen med en promotor og andre sekvenser som letter ekspresjon av proteinet. Ekspresjonsvektorer inneholder videre genetisk informasjon som sørger for deres replikasjon i en vertscelle, enten ved autonom replikasjon eller ved integrering i verts-genomet. Eksempler på ekspresjonsvektorer som vanlig brukes for rekombinant DNA er plasmider og visse virus, skjønt de kan inneholde elementer av begge. De kan også inneholde en selekterbar markør.

Som ovenfor angitt produseres protein C i leveren og krever vitamin K for sin biosyntese. Vitamin K er nødvendig for dannelsen av spesifikke gamma-karboksyglutaminsyrerester i det amino-terminale området av den lette kjeden. Disse aminosyrerester dannes ved en post-translasjonell modifikasjon, og er nødvendig for kalsiumbetinget binding til fosfolipid. I tillegg inneholder protein C en beta-hydroksyaspartinsyrerest som også dannes i en post-translasjonell modifikasjon. Imidlertid er rollen til denne aminosyreresten ikke kjent.

Forutsatt at aktiviteten til prodein C avhenger av post-translasjonelle modifikasjoner som medfører gamma-karboksyler-ingen av spesifikke glutaminsyrerester og spaltning til den to-kjedede form, og også kan være avhengig av hydroksyleringen av en spesifikk aspartinsyrerest, er det usannsynlig at et aktivt produkt kunne dannes gjennom kloningen og ekspresjonen av protein C i en mikroorganisme.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å fremstille protein som er gamma-karboksy-lert og etter aktivering har den biologiske aktiviteten til humant aktivert protein C gjennom bruk av pattedyrceller transfektert til å stabilt uttrykke proteinet.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å produsere et protein som er gammakarboksylert og har den biologiske aktiviteten til humant aktivert protein C uten å måtte aktiveres.

De lette og tunge kjedene av storfeprotein C har blitt sekvensbestemt (Fernlund og Stenflo, J. Biol. Chem. 257: 12170-12179, 1982; og Stenflo og Fernlund, J. Biol. Chem. 257: 12180-12190, 1982). Isolering og karakterisering av humant protein C har blitt beskrevet av Kisiel, J. Clin. Invest. 64: 761-769, 1979. Antikoagulantaktivitetene til både human- og storfeenzymer ble funnet å være meget arts-spesifikke. Arts-spesifitet antas å være betinget av protein S (Walker, Throm. Res. 22: 321-327, 1981). Imidlertid viser human- og storfe-proteinene betydelig total strukturell homologi med hverandre og andre vitamin K-avhengige plasmaproteiner innbefattende protrombin, faktor VII, faktor IX og faktor X. Likheter er tilstedeværelsen av Gla-restene i den lette kjeden og det aktive setet serin i den tunge kjeden, samt annen amino-sekvenshomologi i det aminoterminale området av den lette kj eden.

I foreliggende oppfinnelse ble et \ gtll cDNA-bibliotek fremstilt fra humant lever-mRNA. Dette bibliotek ble så under-søkt med <125>I-merket antistoff mot humant protein C. Antistoff-reaktive kloner ble analysert videre for syntesen av et fusjonsprotein av /3-galaktosidase <p>g protein C i \ gtll-vektoren.

Et av klonene ga et sterkt signal med antistoffproben og ble funnet å inneholde en innsetning på ca. 1400 bp. DNA-sekvensanalyse av DNA-innsetningen avslørte en forutsagt aminosyresekvens som viste en høy grad av homologi med hoveddeler av storfeprotein C som fastslått av Fernlund og Stenflo ( J . Biol. Chem. 257: 12170-12179; J. Biol. Chem. 257: 12180-12190).

DNA-innsetningen inneholdt hoveddelen av det kodende område for protein C .som begynner med aminosyre 64 i den lette kjeden, inneholder hele det tunge-kjede-kodende området og fortsetter til avslutningskodonet. Videre var det etter stoppkodonet til den tunge kjeden 294 basepar av 3' ikke-kodende sekvens og en poly (A)-hale på 9 basepar. Behandlings-eller polyadenyleringssignalet A-A-T-A-A-A forelå 13 basepar oppstrøms fra poly (A)-halen i denne cDNA-innsetningen. Denne sekvensen var én av to potensielle polyadenyleringsseter.

cDNA-sekvensen koder også for dipeptide Lys-Arg ved stillingen 156-157 (nummerering av aminosyrer er vist på fig. 2), som skiller den lette kjede fra den tunge kjede og fjernes under behandlingen med proteolytisk spaltning som fører til sekresjon av det to-kjedede molekyl. Etter aktivering av det to-kjedede molekyl med trombin spaltes den tunge kjede av humant protein C mellom arginin-169 og leucin-170 og frigjør aktiveringspeptidet (fig. 2).

Ved en lignende metode ble et andre cDNA som manglet kodesekvensen for pre-pro-peptidet og de første 23 aminosyrene til protein C isolert. Ved å bruke dette cDNA som en hybridiseringsprobe, erholdtes resten av kodesekvensen fra et humant genomisk DNA-bibliotek i X Charon 4A (Foster et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82; 4673-4677)1985). Tre forskjellige X Charon 4A-fager ble isolert som inneholdt overlappende innsetninger for protein C-genet.

Posisjonene av eksoner på de tre fagkloner ble bestemt ved Southern blot-hybridisering av spaltningsprodukter av disse kloner med prober fremstilt fra 1400 bp cDNA beskrevet ovenfor. De genomiske DNA-innsetninger i disse kloner ble kartlagt ved enkelt- og dobbeltrestriksjonsenzymspaltning etterfulgt av agarosegelelektroforese, Southern blotting og hybridisering til radioaktivt merket 5' og 3' prober som stammet fra cDNA for humant protein C, som vist i fig. 3.

DNA-sekvensstudier ble utført ved bruk av dideoksykjede-avslutningsmetoden. Som vist på fig. 4 spenner nukleotidsekvensen for genet for humant protein C over ca. 11 kb DNA. Disse undersøkelser avslørte videre et potensielt pre-pro-peptid på 42 aminosyrer. Pre-pro-sekvensen spaltes med en signalpeptidase etter Gly-resten ved posisjon -25. Behandling av det ferdige protein medfører ytterligere proteolytisk spaltning etter rest -1 for å fjerne det amino-terminale propeptid, og ved rester 155 og 157 for å fjerne Lys-Arg-dipeptidet som forbinder de lette og tunge kjeder. Denne sluttbehandlingen gir en lett kjede med 155 aminosyrer og en tung kjede med 2 62 aminosyrer.

Protein C-genet består av åtte eksoner som varierer i størrelse fra 25-885 nukleotider, og syv introner som varierer i størrelse fra 92-2668 nukleotider. Ekson I og en del av ekson II koder for det 42 aminosyrers pre-pro-peptid. Den gjenværende del av ekson II, ekson II, ekson IV, ekson V og en del av ekson VI koder for den lette kjeden av protein C. Den gjenværende del av ekson VI, ekson VII og ekson VIII koder for den tunge kjeden av protein C. Aminosyren og DNA-sekvensene for et cDNA som koder for humant protein C vises på fig. 2.

Intronene i genet for protein C befinner seg primært mellom forskjellige funksjonelle områder. Ekson II spenner over det sterkt konserverte området til pre-pro-peptidet og gamma-karboksyglutaminsyre(Gla)-området. Ekson III inneholder en strekning på åtte aminosyrer som forbinder Gla og vekst-faktorområder. Eksoner IV og V representerer hver et potensielt vekstfaktorområde, mens ekson VI dekker et forbindelses-område som inneholder aktiveringspeptidet. Eksoner VII og VIII dekker det typiske katalytiske området for alle serin-proteaser.

Aminosyresekvensen og den foreslåtte struktur for humant pre-pro protein C er vist på fig. 5. Protein C er vist uten Lys-Arg-dipeptidet, som forbinder de lette og tunge kjeder. Lokaliseringen av de syv introner (A t.o.m. G) er vist med faste staver. Aminosyrer som flankerer kjente proteolytiske spaltningsseter er innsirklet. ♦ angir potensielle karbo-hydratbindingsseter. Den NB første aminosyren i den lette kjeden, aktiveringspeptid og tung kjede starter med nr. 1. Denne nummereringen avviker fra den som er vist på fig. 2 og 4 .

Karbohydrattilknytningssetet befinner seg på resten 97 i den lette kjeden og restene 79, 144 og 160 i den tunge kjeden ifølge nummereringsskjemaet på fig. 5. Karbohydratresten er kovalent bundet til Asn. I hoveddelen av tilfellene kan karbo-hydrattilknytningsmiljøet representeres ved Asn-X-Ser eller

Asn-X-Thr, hvor X = hvilken som helst aminosyre.

Som ovenfor angitt spiller protein C en regulerende rolle i koaguleringsprosessen. Det katalytiske området som kodes for av eksoner VII og VIII har serinproteaseaktivitet som spesifikt spalter bestemte plasmaproteiner (dvs. faktorer Va og Villa), hvilket fører til desaktivering av dem. Som et resultat av denne selektive proteolyse viser protein C antikoagulant og fibrinolytiske aktiviteter.

Fordi mellomliggende sekvenser er tilstede i det genomiske klon, er bare kobling av de genomiske- og cDNA-sekvenser for å gi en fullstendig kodesekvens ikke tilstrek-kelige for å konstruere en akseptabel ekspresjonsenhet. Det er derfor nødvendig å deletere disse mellomliggende sekvenser av grunner som skal beskrives mer fullstendig nedenunder hvis et genomisk klon brukes til å konstruere ekspresjonsenheten.

Det 5'-kodende område kan også oppnås ved alternative metoder og følgelig eliminere behovet for å deletere mellomliggende sekvenser. Det 5'-kodende område kan oppnås ved å bruke prober som stammer fra eksisterende cDNA eller genomiske kloner til å probe ytterligere bibliotek. Ved denne metoden ble et cDNA med full lengde isolert. Videre er de amino-terminale deler av de vitamin K-avhengige plasmaproteiner ansvarlige for deres respektive kalsium-bindingsaktiviteter. Det er blitt funnet at som en følge av denne funksjonelle homologi kan de kalsiumbindende områder av disse molekyler utskiftes og fortsatt beholde den spesifikke aktiviteten for det katalytiske området av det resulterende molekyl. Som f.eks. beskrevet i US patentsøknad nr. 724.311 innsendt 17. april 1985 og publisert som europeisk patentpublikasjon 200.421, kan den amino-terminale delen (kalsiumbindings-området) av faktor IX koblet til faktor VII på aminosyre 3 8 og gi et protein med aktiviteten til faktor VII. Faktor VII, faktor IX, faktor X, protrombin og protein S deler denne amino-terminale sekvenshomologi med protein C. Følgelig kan en klonet sekvens omfattende det 5'-kodende område til genet for hver av disse proteiner være innsatt istedet for den tilsvarende sekvens av protein C-genet. I tillegg kan egnede kodingssekvenser syntetiseres basert på de kjente aminosyre-sekvenser for flere av de vitamin K-avhengige plasmaproteiner eller på sekvensen av protein C, som her er beskrevet. Teknikker for å fremstille syntetiske nukleotidsekvenser er velkjente på området. F.eks. kan et sett av overlappende oligonukleotider syntetiseres og sammensveises parvis og gi dobbeltkjedede fragmenter med overlappende heftende ender. Disse fragmenter ligeres deretter, slik hvilke som helst restriksjonsfragmenter ville bli. Det resulterende syntetiske fragment ligeres deretter til cDNA-et på et vanlig restrik-sjonssete. Skjøtesekvensen kan modifiseres etter behov ved oligonukleotidrettet mutagenese.

Når kloner som representerer hele kodesekvensen har blitt oppnådd, kan de riktige områder skjøtes sammen etter behov og gi den ønskede kodesekvens. Oppnådde fragmenter fra ett eller flere bibliotek skjæres med tilsvarende restriksjonsendonukleaser og kobles enzymatisk sammen i den korrekte orientering. Avhengig av fragmentene og de spesielle restriksjonsendonukleaser som velges, kan det være nødvendig å fjerne uønskede DNA-sekvenser gjennom en "loop out"-prosess for deleteringsmutagenese eller gjennom en kombinasjon av restriksjonsendonukleasespaltning og mutagenese. Den således oppnådde sekvens burde fortrinnsvis være i form av en kontinuerlig, åpen leseramme, dvs. at den mangler de mellomliggende sekvenser (introner) som generelt finnes i høyere eukaryotiske gener. Nærværet av introner i klonede gener kan føre til villfarende spleising av budbærer-RNA og/eller redusert effektivitet av genekspresjonen eller ustabilitet etter forsterkning når gensekvensene innføres i en pattedyrvertscelle. Det foretrekkes at denne kodesekvensen videre koder for et pre-pro-peptid for å lette riktig behandling og utskillelse av det protein C som produseres ifølge foreliggende oppfinnelse. Pre-pro-peptidet kan være for protein C eller et annet utskilt protein, såsom faktor XI, faktor VII eller protrombin.

Under visse omstendigheter kan det være ønskelig å produsere aktivert protein C direkte og derved unngå behovet for å aktivere proteinproduktet enten in vitro eller in vivo. Spaltningssetene som inngår i modningen og aktiveringen av protein C er kjente (Foster and Davie, ibid.). En sekvens som koder for APC kan konstrueres ved å deletere det området som koder for aktiveringspeptidet gjennom oligonukleotidrettet delesjonsmutagenese. Det resulterende protein vil da bli aktivert ved å fjerne Lys-Arg-dipeptidet under normal proteolytisk behandling i vertscellens sekresjonsvei. Det er blitt funnet at proteiner som mangler aktiveringspeptider ikke desto mindre behandles korrekt av vertscellene, hvilket fører til utskillelse av aktivert protein C.

For å forsterke den proteolytiske behandling som inngår i fullføringen av det rekombinante protein C til den to-kjedede form, kan det være ønskelig å modifisere aminosyre-sekvensen rundt behandlingsstedet. Slike modifikasjoner er blitt funnet å lette den korrekte behandling av rekombinant protein C i transfekterte celler.

Effektiv spaltning kan øke proteinets spesifikke aktivitet, forutsatt at enkelt-kjedet protein C ikke er kjent å aktiveres i blodstrømmen. Som forut angitt medfører denne modningsprosessen fjerning av dipeptidet Lys-Arg (aminosyrer 156-157) (Foster og Davie, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 4766-4770, 1984). Modifikasjoner av aminosyreseksvensen i nærheten av dette behandlingssted medfører substitusjon og/eller innsetning av aminosyrer. En slik modifikasjonsgruppe er forandringen av aminosyresekvensen for å innta sekvensen (R1)n-R2-R3-R/(, hvor Rlf R2, R3 og R4 er Lys eller Arg og n = 0, 1, 2 eller 3, istedet for det opprinnelige Lys-Arg dipeptid. En spesielt foretrukken modifikasjon av denne gruppen er sekvensen Arg-Arg-Lys-Arg. Denne sekvensen har blitt funnet å forsterke behandlingen av rekombinant protein C ca. 4-5 ganger hos transfekterte BHK-celler. En andre gruppe modifikasjoner er substitusjonen av aminosyreresten 154 (His) i opprinnelig protein C med basisk aminosyrerest (dvs. Lys eller Arg) som gir en behandlingsstedsekvens med den generelle formel R!-X-R2-R3, hvor Rlf R2 og R3 er Lys eller Arg, og X er en aminosyre forskjellig fra Lys eller Arg, fortrinnsvis Leu. En tredje gruppe modi-fikasjoner er substitusjon av Asp-resten i 158-stilling med en ikke-sur aminosyrerest. Bruk av en liten, nøytral aminosyre såsom Ala, Ser, Thr eller Gly foretrekkes. En fjerde gruppe modifika-sjoner er å anvende Lys-Lys eller Arg-Arg istedet for Lys-Arg i naturlig protein C. Kombina-sjoner av disse grupper av modifikasjoner kan også foretas, f.eks. kan aminosyre 158 substitueres i et protein C-molekyl som inneholder et behandlingssted med sekvensen (R:)n-R2-R3-RR4. Disse modifikasjoner kan også brukes til å fremstille villtype protein C eller aktivert protein C.

Kodesekvensen for protein C eller aktivert protein C innsettes så i en passende ekspresjonsvektor, som igjen brukes til å transfektere en pattedyrcellelinje. Ekspresjonsvektorer for bruk ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse vil omfatte promotor som er istand til å dirigere transkripsjonen av et fremmed gen innført i en pattedyrcelle. Viruspromotorer foretrekkes fordi de er effektive ved dirigering av transkripsjon. En spesielt foretrukket promotor er den sene hovedpromotor fra adenovirus 2. Slike ekspresjonsvektorer vil også fortrinnsvis inneholde et sett RNA-spleisningssteder som befinner seg nedstrøms fra promotoren og oppstrøms fra innsetningsstedet for protein C-sekvensen eller innenfor selve protein C-sekvensen. Foretrukne RNA-spleisningssteder kan oppnås fra adenovirus og/eller immunoglobulingener. Ekspresjonsvektorene inneholder også et polyadenyleringssignal som befinner seg nedstrøms for innsetningsstedet. Virale polyadenyleringssignaler foretrekkes spesielt, såsom de tidlige eller sene polyadenyleringssignaler fra SV40 eller polyadenyleringssignaler fra adenovirus 5 Elb-området. I en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter ekspresjonsvektoren også en ikke-kodende virusledersekvens, såsom adenovirus 2 tripartitt-lederen, som befinner seg mellom promotoren og RNA-spleisningsstedene. Foretrukne vektorer kan også inneholde forsterkersekvenser, slik som SV40-forsterkeren og sekvensene som koder for adenovirus VA RNA-er.

Klonede gensekvenser kan deretter innføres i dyrkede pattedyrceller ved, f.eks., kalsiumfosfat-bevirket transfeksjon (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). En felling dannes fra DNA'et og kalsiumfosfatet, og denne fellingen påføres cellene. Noen av cellene tar opp DNA'et og holder det inne i cellen i flere dager. En liten del av disse cellene (typisk IO"<4>) integrerer DNA'et i genomet. For å identifisere disse integrantene innføres generelt et gen som gir en selekterbar fenotype (en selekterbar markør) i cellene sammen med genet som er av interesse- Foretrukne selekterbare markører er gener som gir resistens mot legemidler såsom neomycin, hygromycin og metotreksat. Selekterbare markører kan innføres i cellen på et separat plasmid samtidig som genet av interesse, eller det kan innføres i det samme plasmidet. Hvis det er på det samme plasmidet, kan den selekterbare markør og genet av interesse være under kontroll av forskjellige promotorer eller den samme promotor. I en utførelsesform plasseres den selekterbare markør på det samme plasmid med sekvensen som koder for protein C, slik at begge sekvenser kontrolleres av den samme promotor, en anordning kjent som en disistronisk melding. Konstruksjoner av denne type er tidligere kjente (f.eks. europeisk patentpublikasjon 117.058). Det kan også være fordelaktig å tilsette ytterligere DNA, kjent som "bærer DNA", til blandingen som innføres i cellene. Etter at cellene har tatt opp DNA'et, får det vokse i en tid, typisk 1-2 dager, så de begynner å uttrykke genet av interesse. Legemiddelseleksjon anvendes så for å selektere for veksten av celler som uttrykker den selekterbare markør på en stabil måte. Kloner av slike celler kan undersøkes etter ekspresjon av protein C.

Foretrukne pattedyrcellelinjer for bruk i den foreliggende oppfinnelse er COS, BHK og 293 cellelinjer. I tillegg kan en rekke andre celler brukes i foreliggende oppfinnelse, innbefattende Rat Hep I (ATCC CRL 1600), Rat Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), menneskelunge (ATCC CCL 75,1), human hepatoma (ATCC HTB-52), Hep G2 (ATCC HTB 8065), muselever (ATCC CC 29,1) og DUKX-celler (Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77; 4216-4220, 1980).

293-cellelinjen (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36; 59-72, 1977) foretrekkes spesielt på grunn av sin evne til effektivt å behandle protein C til to-kjedeformen. Denne cellelinjen transformeres med human adenovirus 5 DNA og har Ad5 ElA-genet integrert ^ sitt genom. Foretrukne ekspresjonsvektorer for bruk med 293-celler vil inneholde en adenovirus-promotor. Neomycinresistens er en foretrukket selekterbar markør for bruk i 293-celler. En foretrukket BHK-cellelinje er tk" BHK-cellelinjen BHK570 (Waechter og Baserga, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79; 1106-1110, 1982).

Kopitallet av den integrerte gensekvensen kan økes gjennom forsterkning ved å bruke bestemte selekterbare markører (f.eks. dihydrofolat reduktase, som gir resistens mot metotreksat). Den selekterbare markør innføres i cellene sammen med genet av interesse, og legemiddelseleksjonen utføres. Legemiddelkonsentrasjonen økes deretter trinnvis med seleksjon av resistente celler ved hvert trinn. Ved å selektere for øket kopiantall av klonede sekvenser kan ekspresjonsnivåer av det kodede protein økes vesentlig.

Protein C fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis renset som ved affinitetskromatografi på en anti-protein C antistoffkolonne. Ytterligere rensning av kolonne-eluatet kan oppnås ved vanlige kjemiske rensemidler såsom high-performance liquid chromatography (HPLC).

Protein C fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse kan aktiveres ved fjerning av aktiveringspeptidet fra aminoenden av den tunge kjeden. Aktivering kan oppnås ved å inkubere protein C i nærvær av a-trombin (Marlar et al., Blood 59: 1067-1072, 1982), trypsin (Marlar et al., ibid.), Russells viper venom faktor X aktivator (Kisiel, ibid.) eller det i handelen tilgjengelige aktivator Protac C (American Diagnostica) som stammet fra venom.

For å sammenfatte eksemplene som følger beskriver eksempel 1 kloningen av DNA-sekvenser som koder for humant protein C. Eksempel 2 beskriver konstruksjonen av en full lengdes kodesekvens for protein C fra sekvensen som er isolert i eksempel 1. Eksempel 3 beskriver konstruksjonen av ekspresjonsvektorer for protein C DNA. Eksempel 4 beskriver fremstillingen av protein C ved bruk av transfekterte pattedyrceller. Eksempel 5 beskriver et full-lengde cDNA som koder for protein C og dets ekspresjon i transfekterte pattedyrceller. Eksempel 6 beskriver fremstillingen av aktivert protein C i BHK og 293-celler. Eksempel 7 beskriver fremstillingen av protein C fra et forstadium med et modi-fisert spaltningssted. Eksempel 8 beskriver bruken av faktor VII pre-pro-peptidet eller protrombin pre-pro-peptidet til å dirigere sekresjonen av protein C fra transfekterte celler.

Eksempler

Restriksjonsendonukleaser og andre DNA modifikasjons-enzymer (f.eks. T4 polynukleotidkinase, alkalisk kalvefos-fatase, Klenow DNA polymerase, T\ polynukleotidligase) fikk man fra Bethesda Research Laboratories (BRL) og New England Biolabs og ble brukt etter fabrikantens anvisninger, med mindre annet er angitt.

Oligonukleotider kan syntetiseres på en Applied Biosystems Model 380 A DNA syntetisator og renses ved polyakrylamidgelelektroforese på denaturende geler. E. coli-celler kan transformeres som beskrevet av Maniatis et al.

( Molecular doning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). M13 og pUC kloningsvektorer og vertsstammer fikk man fra BRL.

Eksempel 1

Kloning av DNA- sekvenser som koder for humant protein C

Et cDNA som koder for en del av humant protein C ble fremstilt som beskrevet av Foster og Davie (ibid.). I korthet ble et gtll cDNA-bibliotek fremstilt fra humant lever-mRNA ved vanlige metoder. Kloner ble undersøkt ved å bruke <125>J-merket affinitets-renset antistoff mot humant protein C, og fag ble fremstilt fra positive kloner ved platelysatmetoden (Maniatis et al., ibid.), etterfulgt av bånddannelse på en cesiumkloridgradient. cDNA-innsetningene ble fjernet ved å bruke Eco RI og underklonet i plasmid pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982). Restriksjonsfragmenter ble subklonet i fag-vektorene M13mpl0 og M13mpll (Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983) og sekvensbestemt ved dideoksy-metoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74.: 5463-54 67, 1977). Et klon ble utvalgt som inneholdt DNA tilsvarende den kjente partielle sekvens for humant protein C (Kisiel, ibid.) og kodet for protein C ved å begynne med aminosyre 64 i den lette kjede og gå gjennom den tunge kjede og inn i det 3' ikke-kodende område. Dette klonet ble kalt \ HC1375. Et andre cDNA-klon som kodet for protein C fra aminosyre 24 ble identifisert. Innsetningen fra dette klon ble subklonet i pUC9 og plasmidet kalt pHCX6L (fig. 1). Dette klon koder for en hoveddel av protein C innbefattende det tungkjedede kodeområde, avslutningskodon og 3' ikke-kodende område.

cDNA-innsetningen fra XHC1375 ble nick-translatert ved bruk av a-<32>p dNTP's og brukt til å prøve et humant genom-bibliotek i fag X Charon 4A (Maniatis et al., Cell 15: 687-702, 1978) ved å bruke plaque-hybridiseringsteknikken til Benton og Davis ( Science 196: 181-182, 1977) som modifisert av Woo ( Meth. in Enzymology 68: 381-395, 1979). Positive kloner ble isolert og plaque-renset (Foster et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 4673-4677, 1985). Fag-DNA fremstilt fra positive kloner (Silhavy et al., i Experiments with Gene Fusion. Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) ble spaltet med Eco Ri eller Bgl II og de genomiske innsetninger renset og subklonet i pUC9. Innsetnings-restriksjonsfragmenter ble subklonet i M13-vektorer og sekvensbestemt for å fastslå deres identitet og klarlegge DNA-sekvensen til hele genet.

cDNA-innsetningen i pHC 6L ble nick-translatert og brukt til å prøve ut fag X Charon 4A-biblioteket. Et genomisk klon ble identifisert som hybridiserte til prober fremstilt fra 5'-og 3'-endene av cDNA'et. Dette fagklonet ble spaltet med Eco RI og et 4,4 kb fragment tilsvarende 5'-enden av protein C-genet, ble underklonet til pUC9. Det resulterende rekombinante plasmid ble kalt pHCR4.4. Fullstendig DNA-sekvensanalyse viste at innsetningen i pHCR4.4 omfattet to eksoner på 70 og 167 basepar adskilt med et intron på 1263 bp. Det første ekson koder aminosyrer -42 til -19; det andre koder for aminosyrer - 19 til 37. Sekvensanalyse bekreftet DNA-sekvensen til hele protein C-genet.

Som angitt ovenfor er det da nødvendig å fjerne intronet for å bruke et genomisk klon til å konstruere en akseptabel kodesekvens for bruk i den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 2

Konstruksjon av en kodesekvens med full lengde for protein C

En kodesekvens med full lengde for protein C inneholdende pre-pro-peptidet konstrueres ved å skjøte sammen de tilsvarende fragmenter av cDNA'et og genomiske kloner. Dette oppnås ved å fjerne intronet fra det genomiske klon (pHCR4.4) og skjøte sammen de sammensmeltede eksoner til cDNA'et (fra pHC 6L) på passende restriksjonssteder. Den ønskede genomiske cDNA-skjøten dannes så ved å skylle ut uønskede sekvenser ved oligonukleotidrettet delesjonsmutagenese.

Plasmid pHCX6L inneholder protein C-partielt cDNA klonet i Eco Ri-setet for pUC9 (fig. 1). cDNA-innsetningen under-klones i to fragmenter for å forberede for skjøting til det 5'-fjerneste kodeområde fra det genomiske klon. Plasmid pHC\6L spaltes med Eco RI og Sal I, og reaksjonsblandingen ekstraheres med fenom og CHC13 og etanolutfelles deretter. De resulterende DNA-fragmenter gjenoppslemmes i ligeringsbuffer, og TA-DNA-ligase tilsettes. Ligeringsblandingen inkuberes ved 15°C i 14 timer. En alikvot av ligeringsblandingen brukes til å transformere E. coli JM83, og cellene pleteres på LB-agar inneholdende X-gal. Hvite kolonier utvelges, og plasmid DNA fremstilles. DNA'et analyseres ved restriksjonsenzymspaltning for å identifisere kloner som inneholder 3'-delen av cDNA'et (ca. 1450 bp innsetning) og 5'- delen av cDNA'et (ca. 65 bp innsetning). Disse kloner kalles p9C3' og p9C5' henholdsvis (fig. 6).

Det 5'-kodende område som mangler fra cDNA'et forefinnes i eksonene I og II av det genomiske klonet pHCR4.4. Dette plasmid inneholder en innsetning på ca. 4400 basepar og slutter på 3' enden sin med et Eco RI-sete som befinner seg i intron B.

For å fjerne kodesekvensene fra pHCR4.4, spaltes plasmidet med Pstl og Eco RI, og de resulterende fragmenter skilles ved elektroforese i en agarosegel. Det ca. 2540 bp lange fragment som inneholder eksoner I og II isoleres fra gelen og ekstraheres med CTAB (Langridge et al., Analyt♦ Biochem. 103: 264, 1980). Dette fragment, som kalles 5'P-R, subklones i pUC9 og gir plasmid p5'P-R (fig. 7).

Intronet i p5'P-R (kalt intron A) fjernes i en to-trinns prosess (fig. 7). Plasmidet spaltes med Apa I, som spalter ved et eneste sted i intronet og gir tilbake 3'-overhengende ender. Det lineariserte plasmid behandles så med Bal 31 endo-nuklease eller T4 polymerase for å fjerne ca. 500 bp fra hver ende, og de resulterende fragmentender avstumpes med Sl nuklease. Det lineariserte plasmid resirkuleres med ligase og brukes til å transformere E. coli JM83. Plasmid DNA ekstraheres og analyseres for nærværet av Sma I og Sst I restrik-

sjonsseter i intron A, og et plasmid med et Sna I-Sstl-

fragment redusert to 300-400 bp velges og kalles p5'-P A aR.

Resten av intron A fjernes med oligonukleotid-rettet delesjonsmutagenese, hovedsakelig som beskrevet av Zoller og Smith ( Manual for Advanced Techniques in Molecular doning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983) for to-primermetoden. p5'P A aR spaltes med Pst I og Eco RI, og protein C-fragmentet subklones i Pst I + Eco Ri-spaltet M13mp9. Plusskjedefag-DNA fremstilles som mal og knyttes til oligonukleotidmut-1 (tabell 1) . Dette mutagene oligonukleotid omfatter komplementære sekvenser til eksonet I- og II-sekvensene som skal skjøtes. Den M13 universale sekvensprimer 3' til mut-1 på den samme mal. Primerne forlenges ved bruk av DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og nukleosidtrifosfater i nærvær av TA DNA-ligase. De resulterende dupleks DNA-sirkler transformeres til E. coli JM103, og de resulterende plaquer siktes under stringente hybridiseringsbetingelser ved bruk av dete <32>P-merkede mutagene oligonukleotid som probe. DNA fra positive plaquer isoleres og sekvensbestemmes ved bruk av oligonukleotid-primer-1 (tabell 1), som primer i ekson II og tillater bestemmelsen av DNA-sekvensen tvers igjennom dele-sjonsskjøten. Et molekyl med den korrekte i-ramme-fusjon av eksoner I og II selekteres. Pstl-EcoRI-fragmentet isoleres fra M13-replikatformet ved restriksjonsendonukleasespaltning og agarosegelelektroforese og subklones i pUC9 og gir plasmid p5'-I-II (fig. 7).

Under henvisning til fig. 8, isolerer man for å skjøte det 5'-kodende område til cDNA'et ved ca. 1277 bp Pst I-Eco RI-fragment av p5'-I-II fra et Pst I + Eco RI-spaltningsprodukt av plasmidet og renser ved agarosegelelektroforese. Det 65 bp 5'-fjerneste cDNA-fragment isoleres fra et Sal I + Eco RI-spaltningsprodukt av p9C5' og renses ved elektroforese på en akryl-amidgel. De to fragmenter ligeres på sine Eco RI-ender, og det resulterende ca. 1330 bp i-st I-Sal I-fragment subklones i Pst I + Sal I-spaltet M13mp9 (fig. 8.). Pluss-kjedefag DNA fremstilles som mal for oligonukleotidrettet delesjonsmutagenese. Oligonukleotidmut-2 (tabell 1) kobles til malen, og oligonukleotidmut-3 (tabell 1) kobles oppstrøms som andre primer. Primerne forlenges som beskrevet ovenfor. 01igonukleotidmut-2 dirigerer fusjonen av ekson II-sekvenser som koder for aminosyrer 23-26 til cDNA ved kodon 27. Den andre primer (mut-3) innfører et Eco RI-sete 35 bp oppstrøms fra translasjonsstarten. Den resulterende fag under-søkes om den mangler Nco I- og Xho I-seter og om et Eco RI-sete er innført. Fag-DNA som viser det ønskede restriksjonsmønster sekvensbestemmes ved bruk av primer-2 (tabell 1) for å bekrefte nærværet av den korrekte skjøt mellom ekson II og cDNA'et. Fag-DNA med den riktige sekvens selekteres, og Pst I-Sal I-fragmentet omfattende det 5'-kodende område isoleres fra den replikative form av M13-rekombinantfagen. Fragmentet renses ved agarosegel-elektrof orese og innsettes i Pst I + Sal I-spaltet pUC9 og gir plasmid pC5'-ende.

Under henvisning til fig. 9 spaltes plasmid-pC5'-enden med EcoRI og Sal I, og 5' protein C-fragmentet renses ved agarosegel-elektrof orese og ekstraksjon med CTAB. Resten av cDNA'et isoleres som et Sal I -Eco RI-fragment fra p9C3'. De to fragmenter kobles i en tredelt ligering til Eco Ri-spaltet pUC9. Ligeringsblandingen brukes til å transformere E. coli JM83, cellene pleteres på LB + X-gal, og plasmid DNA isoleres fra hvite kolonier. Det resulterende plasmid kalles pMMC. Det inneholder den fullstendige kodesekvensen for humant protein C på ca. 1500 bp Eco RI-f rag-ment.

Eksempel 3

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer for protein C

Den protein C-kodende innsetning fjernes fra pMMC som et Eco RI-fragment og innsettes i et passende pattedyrcelleekspre-sjonsvektor.. Et eksempel på vektor er pD7 omfattende SV4 0-forsterkeren og den hovedsakelig sene adenovirus 2 promotor og tripartittleder.

Plasmid pD7 dannes fra plasmid pDHFRIII (Berkner og Sharp,

Nuc. Acids. Res. 13: 841-857, 1985). Pst I-setet umiddelbart oppstrøms for DHFR-sekvensen i pDHFRIII ble overført i et Bel I-sete ved å spalte 10 /ug plasmid med 5 enheter Pst I i 10 minutter ved 37°C i 100 /il buffer A (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 6 mM CaCl, 7 mM /3-MSH) . DNA'et ble f enolekstrahert, EtOH-utfelt og gjenoppslemmet i 40 /ul buffer B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCl2, 7 mM /i-MSH) som inneholdt 10 mM dCTP og 16 enheter T4-DNA-polymerase og inkubert ved 12 °C i 60 minutter. Etter EtOH-felling ble DNA'et ligert til 2,5 /ig kinasebehandlede Bel I-linkere i 14 /il buffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP) inneholdende 400 enheter t4 polynukleotidligase i 12 timer ved 12°C. Etter fenolekstraksjon og EtOH-felling ble DNA'et gjenoppslemmet i 120 /xl buffer D (75 mM KC1, 6 mM Tris pH 7,5. 10 mM MgCl2, 1 mM DTT), spaltet med 80 enheter Bel I i 60 minutter ved 50°C, deretter elektroforesebehandlet gjennom agarose. Form III plasmid DNA (10 /i<3) ble isolert fra gelen og ligert i 10 /il buffer C inneholdende 50 enheter TA polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C og brukt til å transformere E. coli HB101. Positive kolonier ble identifisert ved hurtig-DNA-prepareringsanalyse, og plasmid-DNA (kalt pDHFR') fremstilt fra positive kolonier ble transformert til dAM" E. coli.

Plasmid pD2' ble så dannet ved spaltning av pDHFR' (15 /ig) og pSV40 (omfattende Barn HI-spaltet SV40 DNA klonet i Bam HI-setet av pML-1) (25 fig) i 100 /il buffer D med 25 enheter Bel I i 60 minutter ved 50°C, etterfulgt av tilsetningen av 50 enheter Bam HI og ytterligere inkubering ved 37°C i 60 minutter. DNA-fragmenter ble oppløst ved agarosegelelektroforese, og 4,9 kb pDHFR' fragmentet og 0,2 kb SV4 0-fragmentet ble isolert. Disse fragmenter (200 ng pDHFR' DNA og 100 ng SV40 DNA) ble inkubert i 10 /il buffer C inneholdende 100 enheter T4 polynukleotidligase i 4 timer ved 12°C, og den resulterende konstruksjon (pD2') ble brukt til å transformere E. coli RRI.

Plasmid pD2' ble modifisert ved å deletere "gift"-sekvensene i pBR3 22-området (Lusky og Botchan, Nature 293: 79-81, 1981). Plasmidene pD2' (6,6 fig) og pML-1 (Lusky og Botchan, ibid.) (4fig) ble inkubert i 50 /il A med 10 enheter hver Eco RI og Nru I i 2 timer ved 3 7°C, etterfulgt av agarosegelelektroforese. Det 1,7 kb pD2'-fragment og 1,8 kb pML-1-fragment ble isolert og ligert sammen (50 ng hver) i 20 fil buffer C inneholdende 100 enheter T4 polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C, etterfulgt av transformering til E. coli HB101. Kolonier inneholdende den ønskede konstruksjon (kalt pD2) ble identifisert ved hurtig preparasjonsanalyse. Ti fig pD2 ble deretter ligert med 20 enheter av Eco RI og Bgl II hver, i 50 fil buffer A i 2 timer ved 37°C. DNA'et ble elektroforesebehandlet gjennom agarose, og det ønskede 2,8 kb-fragment (fragment C) omfattende pBR322, 3'-spleisningsstedet og poly A-sekvensene ble isolert.

For å danne de gjenværende fragmenter som ble brukt ved konstruksjonen av pD3, ble pDHFRIII modifisert for å omdanne Sac II (Sst II)-setet i et enten Hind III- eller Kpn I-sete. Ti fig pDHFRIII ble spaltet med 20 enheter Sst II i 2 timer ved 37°C, etterfulgt av fenolekstraksjon og etanolfelling. Gjenoppslemmet DNA ble inkubert i 100 fil buffer B inneholdende 10 mM dCTP og 16 enheter TA-DNA-polymerase i 60 minutter ved 12°C, fenolekstrahert, dialysert og etanolfelt. DNA (5 fig) ble ligert med 50 ng kinasebehandlet Hind III- eller Kpn I-linkere i 20 fil buffer C inneholdende 400 enheter TA—DNA—1igase i 10 timer ved 12"C, fenolekstrahert og etanolfelt. Etter gjenoppslemming i 50 fil buffer A ble de resulterende plasmidene spalter med 50 enheter Hind III eller Kpn I etter behov, og elektroforesebehandlet gjennom agarose. Gel-isolert DNA (250 ng) ble ligert i 30 fil buffer C inneholdende 4 00 enheter T4-DNA-ligaser i 4 timer ved 12°C og brukt til å transformere E. coli RRI. De resulterende plasmider ble kalt pDHFRIII (Hind III) og pDHFRIII (Kpn I). Et 700 bp Kpn I-Bgl II-fragment (fragment A) ble deretter renset fra pDHFRIII (Kpn I) ved spaltnaing med Bgl II og Kpn I, etterfulgt av agarosegelelektroforese.

SV40 forsterkersekvensen ble innsatt i pDHFRIII (Hind III) som følger: 50 fig SV4 0 DNA ble inkubert i 120 fil buffer A med 50 enheter Hind III i 2 timer ved 37°C, og Hind III C SV40-fragmentet (5089-968 bp) ble gelrenset. Plasmid pDHFRIII (Hind III) (10 fig) ble behandlet med 2 50 ng kalvetarmfosfatase i 1 time ved 37°C, fenolekstrahert og etanolfelt. Det lineariserte plasmid (50 ng) ble ligert med 250 ng Hind III C SV40 i 16 fil buffer C i 3 timer ved 12 "C ved bruk av 200 enheter T4 polynukleotid-ligase og transformert i E. coli HB 101. Et 700 basepar Eco RI-Kpn I-fragment (fragment B) ble deretter isolert fra dette plasmidet.

For den endelige konstruksjon av pD3 ble fragmenter A og B (50 ng hver) ligert med 10 ng fragment C med 200 enheter TA polynukleotid-ligase i 4 timer ved 12°C, etterfulgt av transfeksjon av E. coli RRI. Positive kolonier ble påvist ved hurtig-prepareringsanalyse, og et preparat av pD3 i stor skala ble fremstilt.

Plasmid pD3 modifiseres til å akseptere innsetningen av protein C-sekvensen ved å overføre Bel I-innsetningssetet i et Eco RI-sete. Det er først nødvendig å fjerne Eco RI-setet som er tilstede i pD3 ved den ytterste venstre ende av adenovirus 5 0-1 kartenhetsekvenser ved å omdanne den til et Bam HI-sete gjennom vanlige linker-metoder. Kort sagt spaltes plasmidet med Eco RI, og det lineariserte DNA behandles med TA-DNA-polymerase og alle fire deoksynukleotidtrifosfater for å danne stumpe ender. Plasmidet ligeres så til oktonukleotider, omfattende Bam HI-restriksjonssetet, DNA'et spaltes med Bam HI for å fjerne overskudd av linkere, og fragmentet omfattende pattedyrcelle-ekspresjonssekvensene klones i Bam HI-setet til pML-1. Det resulterende plasmid transformeres til E. coli HB101, og plasmid DNA fremstilles og undersøkes etter den korrekte omdannelse. På lignende måte omdannes Bel I-setet til et Eco RI-sete ved bruk av tilsvarende oktonukleotidlinkere. Den resulterende vektor er kjent som pD7. 1,5 kb protein C Eco RI-fragmentet fra pMMC innsettes så i Eco RI-setet til pD7 og gir ekspresjonsvektoren pD7C (fig. 10).

En vektor med evne til ekspresjon av protein C-sekvensen fra en polysistronikkmelding konstrueres ved å bruke pD5, et lignende plasmid til pD3, som inneholder et DHFR-kodesekvens som mangler mesteparten av det 5' ikke-kodende område. DHFR-sekvensen modifiseres videre for å redusere sin bindingsaffinitet til metotreksat.

Vektoren pD5 konstrueres ved en analog fremgangsmåte som beskrevet for pD3, og skiller seg bare fra pD3 ved at et Bam HI-sete er innsetningssetet for heterologe DNa'er, og at Bel I-Baur HI SV40-fragmentet som inneholder SV40 polyadenylerlignssignalet befinner seg i den sene orientering.

DHFR-sekvensen modifiseres ved først å spalte pDHFRIII med

Pst I og Sst I og isolere 400 bp DHFR-fragmentet. Dette underklo-nes i en M13 fagvektor og mutageniseres som beskrevet av Simonsen og Levinson ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80: 2495-2499, 1983). Mutagenese fører til en enkelbaseparforandring i DHFR-sekvensen. Det endrede fragment gjeninnsettes deretter i pDHFRIII og gir plasmidet pDHFR<r>III.

det 5' ikke-kodende område av DHFR-sekvensen fjernes deretter. Plasmid pDHFR<r>III spaltes med Fnu 4HI, som deler plasmidet på ca. 20 steder, behandles så med T4-DNA-polymerase og alle fire deoksynukleotidtrifosfater så man får stumpe ender. Bam HI-linkere ligeres til endene, og blandingen spaltes med Bam HI og Nco I. Et 0,6 kb Bam HI-Nco I-fragment omfattende DHFR<r> cDNA isoleres. Plasmid pDHFRIII spaltes med Nco I og Bam HI, og 0,2 kb fragmentet omfattende SV40-polyadenyleringssignalet isoleres. Polyadenyleringssignalet i den tidlige orientering ligeres så til DHFR<r->fragmentet. Etter spaltning med Bam HI innsettes så det resulterende Bam HI-fragment i Bam HI-setet til pD5, og ligeringsblandingen brukes til å transformere E. coli HB101. Plasmid DNA fremstilles og undersøkes etter restriksjonsendunuklease-spalting. Et plasmid med DHFR<r->innsetningen gir riktig orientering for transkripsjon fra den sene Ad2 hovedpromotor kalles pD5 (DHFR<r>) .

For å uttrykke protein C ved bruk av plasmidet pD5(DHFR<r>), spaltes pMMC med Eco RI, og 1,5 kb protein C-fragmentet isoleres. Eco RI-endene omdannes til. Bel I-ender ved sammenbinding. Plasmid pD5(DHFR<r>) spaltes delvis med Bam HI for å spalte det ved 5'-enden av DHFR<r->sekvensen og ligeres til protein C-f ragmentet. Plasmid DNA undersøkes med hensyn til riktig orientering og innsetning av protein C-fragmentet. Den resulterende vektor, kalt pD5 (PC-DHFRr) , er illustrert på fig. 11.

Eksempel 4

Ekspresjon av protein C i transfektere patted<y>rceller

Hamsterungenyre(BHK)-celler (American Type Culture Collec-tion accession number CCL10) transfekteres med pD7C ved kalsium-fosf atko-felling. (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics Z' 603, 1981; og Graham og Van der Eb, Viroloqy 52: 456, 1973). Cellene dyrkes ved 37°C, 5% C02 i Culbeccos medium (pluss 10% varme-inaktivert kalvefosterserum og tilsatt L-glutamin og penicillin-streptomycin) i 60 mm vevskultur Petriskåler til en sammenflytning på 2 0%. Totalt 10 /ug DNA brukes til å transfektere en 60 mm's skål: 3,75 /ug pD7C, 1,25 /ug pKO-neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Genet 1: 327-341, 1982) og 5 /ug laksesperm-DNA. DNA'ene felles i 0,3 M NaOAc, 75% etanol, renses med 75% etanol og gjenoppløses i 20 /ul 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. DNA'et kombineres med 440 jul H20 og 500 /ul 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHPOA, 12 mM dektrose, 50 mM HEPES pH 7,12. 60 /ul 250 mM CaCl2 settes dråpevis til ovennevnte blanding, og løsningen får stå ved romtemperatur i 30 minutter. Løsningen settes så til cellene, og cellene tilbakeføres til 37°C i 4 timer. Mediet fjernes og 5 ml 2 0% DMSO i Dulbeccos med serum tilsettes i 2 minutter ved romtemperatur. Skålen vaskes deretter raskt med 2 utskiftninger medium og inkuberes i friskt medium natten over. 24 timer etter tilsetningen av DNA'et fjernes mediet, og selektivt medium (10 mg/ml G418, 498 /u/mg, Gibco, i Dulbeccos med serum) tilsettes. Etter ca. 10-13 dager overføres enkeltkloner som representerer celler som har innsatt pKO-neo-genet og således er resistende mot G418, til 96-brønners plater og dyrkes opp for proteinmålinger i Dulbeccos pluss 10% kalvefosterserum.

For å måle protein C skilles mediet fra cellene og celle-avfall ved sentrifugering, og protein C polypeptid og biologisk aktivitet måles. Cellene fjernes fra platene med trypsin, vaskes med friskt medium, sentrifugeres og fryses ved -20°C. For måling tines celleklumpene i PBS, pelleteres og gj enoppslemmes i PBS inneholdende 0,25% Triton X-100. Prøver fortynnes og måles for polypeptid og aktivitet.

Den enzym-bundede immunosorbentmåling (ELISA) for protein C utføres som følger: Affinitetsrenset polyklonalt antistoff mot humant protein C (100 /ul 1 ug/ ml i 0,1 M Na2C03, pH 9,6) tilsettes hver brønn i 96-brønners mikrotiterplater, og platene inkuberes natten over ved 4°C. Brønnene vaskes deretter tre ganger med PBS (5 mM f osf atbuf f er, pH 7 , 5, 0,15 NaCl) inneholdende 0,05% Tween-20 og inkuberes så med 100 /ul 1% storfeserumalbumin, 0,05% Tween 20 i PBS ved 4°C natten over. Platene renses deretter flere ganger med PBS, lufttørkes og lagres ved 4°C. For å måle prøver inkuberes 100 /il av hver prøve i 1 time ved 37 °C i de belagte brønner, og brønnene renses med 0,05% Tween-2 0 i PBS. Platene inkuberes deretter i 1 time ved 37°C med et biotin-konjugert polyklonalt saueantistoff mot protein C (30 ng/ml) i PBS inneholdende 1% storfeserumalbumin og 0,05% Tween-2 0. Brønnene renses med PBS og inkuberes igjen i 1 time ved 37"C med avidin konjugert til alkalisk fosfatase i PBS inneholdende 1% storfeserumalbumin og 0,05% Tween-2 0. Brønnene renses deretter med PBS, og alkalisk fosfataseaktivitet måles ved tilsetningen av 100 fil f osf atasesubstrat (Sigma 104; 600 /zg/ml) i 10% dietanol-amin, pH 9,8, inneholdende 0,3 mM MgCl2- Absorbansen ved 4 05 nm avleses på en mikrotiterplateleser.

Protein C-biologisk aktivitet måles ved dens evne til å forlenge kaolin-sefalinklumpningstiden til plasma etter dets aktivering, som beskrevet i eksempel 5C.

Eksempel 5

Ekspresjon av et full- lengdes cDNA som koder for protein C

A. Isolering av cDNA. Et genomisk fragment som inneholdt et ekson tilsvarende aminosyrene -42 til -19 i pre-pro-peptidet (ekson I på fig. 4) av protein C ble isolert, nick-translatert og brukt som en probe til å utprøve et cDNA-bibliotek konstruert ved teknikken til Gubler og Hoffman ( Gene 25: 263-269, 1983) ved å bruke mRNA fra HepG2-celler. Denne cellelinje ble avledet fra humane hepatocytter og var tidligere kjent for å syntetisere protein C (Fair og Bahnak, Blood 64; 194-204, 1984). Ti positive kloner omfattende cDNA innsatt i Eco Ri-setet til fag gtll ble isolert og undersøkt med en oligonukleotidprobe tilsvarende det 5' ikke-kodende område av protein C-genet. Et klon var også positivt med denne proben, og hele dets nukleotidsekvens ble bestemt. dDNA'et inneholdt 70 bp 5' ikke-translatert sekvens, hele kodesekvensen for humant pre-pro-protein C, og hele det 3' ikke-kodende område tilsvarende det andre polyadenyleringssetet (fig. 2).

B. Ekspresjonsvektorkonstruksjon. Ekspresjonen av protein C cDNA ble oppnådd i vektoren pDX. Denne vektoren stammet fra pD3 (beskrevet i eksempel 3 ovenfor) og pD3', en identisk vektor med pD3 unntatt at SV40 polyadenyleringssignalet (dvs. SV40 Bam HI

[2533 bp] til Bell [2770 bp]-fragmentet) befinner seg i den sene orientering. Således inneholder pD3' et Bam HI-sete som sete for geninnsetning.

For å danne pDX ble Eco RI-setet i pD3' omdannet til et Bcll-sete ved Eco RI-spaltning, inkubering med Sl nuklease og etterfølgende ligering med Bel I-linkere. DNA ble fremstilt fra en positivt identifisert koloni, og 1,9 kb Xhi I-Pst I-fragmentet som inneholdt det forandrede restriksjonssetet ble fremstilt gjennom agarosegelelektroforese. I en andre modifisering ble Bel I-spaltet pD3 ligert med kinasebehandlede Eco RI-Bcl I-adaptorer (konstruert fra oligonukleotiden ZC525, 5'GGAATTCT3'; og ZC526, 5'GATCAGAATTCC3') for å frembringe et Eco RI-sete som posisjonen for innsetningen av et gen i ekspresjonsvektoren. Positive kolonier ble identifisert ved restriksjonsendonukleaseanalyse, og DNA fra dette ble brukt til å isolere et 2,3 kb Xhi I-Pst I-fragment som inneholdet det modifiserte restriksjonssetet. De to ovenfor beskrevne DNA-fragmenter ble inkubert sammen med t4-DNA-ligase, transformert i E. coli HB101 og positive kolonier ble identifisert med restriksjonsanalyse. Et preparat av slikt DNA, kalt pDX, ble deretter fremstilt. Dette plasmid inneholder et eneste Eco RI-sete for innsetting av fremmede gener.

Protein C-DNA'et ble deretter innsatt i pDX som et Eco RI-fragment. Rekombinante plasmider ble utprøvet ved restriksjonsanalyse for å identifisere dem som hadde protein C-innsetninger i den riktige orientering i forhold til promotorelementene, og plasmid DNA (kalt pDX/PC) ble fremstilt fra et korrekt klon (fig. 12). Fordi cDNA-innsetningen i pDX/PC inneholder et ATG-kodon i det 5' ikke-kodende område (se fig. 2), ble delesjonsmutagenese utført på cDNA'et ført transfeksjon og ekspresjonseksperimenter. Delesjon av de tre basepar ble utført ifølge standardmetoder for oligonukleotidrettet mutagenese. Den pDX-baserte vektor som inneholdt det modifiserte cDNA ble kalt p594. C. cDNA- ekspresjon. Plasmid p594 ble transfektert i COS-1 (ATCC CRL1650), BHK og 293-celler med kalsiumfosfatfelling. Fire timer senere ble friskt kulturmedium (tilsatt 5 /xg/ml vitamin K) tilsatt. Ved passende tidspunkter (normalt 48 eller 72 timer) ble kulturmediene høstet, og cellene ble samlet og lyset.

Det utskilte protein C i kulturmediet ble målt med ELISA med bruk av det samme affinitetsrensede polyklonale antistoff som ble brukt i begynnelsesidentifiseringen av cDNA-klonene. Resultater av målingene av COS-1- og 293-celler (tabell 2) viste at protein C ble utskilt fra de transfekterte celler. Det ble funnet at 293-celler ga gjennomgående høyere protein-C-nivåer enn COS-celler.

For å bestemme gamma-karboksyleringsgraden i det rekombinante protein, ble prøver av kulturmediet underkastet bariumsit-ratfelling, en fremgangsmåte som selektivt utfeller bare gammakarboksylerte proteiner fra plasma (Bajaj et al., J. Biol. Chem. 256: 253-259, 1981). Over 70% av det protein C-antigene materiale kunne felles med bariumsitrat.

Det rekombinante protein C ble målt med hensyn til antikoagulantaktivitet ved å måle dets evne til å forlenge koagulering. Dialyserte medieprøver ble behandlet med Protac C (American Diagnostica) for å aktivere protein C. Prøvene ble så satt til en in vitro-sammenklumpningsbestemmelse (Sugo et al., J. Biol. Chem. 260: 10453, 1985). I korthet ble 50 /il hver av normalt sammen-slått humanplasma, kaninhjerne, sefalin (10 mg/ml i TBS [50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl]) og kaolinsuspensjon (5 mg/ml i TBS) blandet i et silikonisert glassrør. Etter forinkubering ved 37"C i 2 minutter ble 100 /il aktivert protein C fortynnet i TBS tilsatt, og 37°C inkuberingen fortsatte i ytterligere 2 minutter. Sammenklumpning ble så igangsatt ved tilsetning av 50 /il 25 mM CaCl2, og sammenklumpningstiden ble registrert. Aktiviteten til det rekombinante materiale ble vist å være hovedsakelig det samme som for naturlig forekommende protein C.

Protein C fremstilt ved transfektert BHK og 293-celler ble videre analysert med Western-blotting. Medieprøver ble elektroforesebehandlet på denaturerende geler og blotter ble fremstilt og probet med radioaktivt merket antistoff mot protein C. Resultatene viser at ca. 2 0% av protein C fra BHK-celler forelå i den to-kjedede form, mens ca. 90% av det fra 293-celler ble behandlet til den to-kjedede form.

Eksempel 6

Ekspresjon av aktivert protein C

cDNA-sekvensen for protein C ble forandret ved steds-spesifikk mutagenese for å deletere den del som koder for aktiveringspeptidet. Den forandrede sekvens ble deretter transfektert til BHK og 293-celler og stabilt transfekterte celler ble utvalgt. Aktivt protein C ble påvist i dyrkningsmedieprøver fra begge cellelinjer.

For å deletere aktiveringspeptidkodesekvensen ble plasmid p594 spaltet med Sst i, og -88 0 bp-fragmentet ble renset og innsåt i Sst I-setet til M13mpl0. De 12 aktiveringspeptidkodonene ble deletert ved oligonukleotid-rettet delsjonsmutagenese (Zoller og Smith, DNA 3: 479-488, 1984) ved bruk av det mutagene oligonukleotid 5 CTGAAACGACTCATTGAT3'. Replikativform DNA ble fremstilt fra mutantfagkloner og spaltet med Sst I. Protein C-fragment (-840 bp) ble isolert og innsatt i Sst I-spaltet p594. De resulter-ende plasmider ble undersøkt etter riktig orientering av Sst I-fragmentet ved restriksjonskartlegging ved bruk av Bgl II. Et korrekt plasmid ble utvalgt og kalt pPC829. Plasmidet pPC829 ble sekvensbestemt for å bekrefte nærværet av den ønskede kodesekvens.

Plasmid pPC829 ble kotransfektert i BHK-celler (med plasmidet pSVDHFR (Lee et al., Nature 294: 228-232, 1982) og 293-celler (med pKO-neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341, 1982)) ved kalsiumfosfatkoutfelling (Graham og van der Eb, Virology 52: 456-467, 1973). Etter 48 timer ble dyrknings-mediene høstet og målt etter protein C med ELISA. Resultatene er vist i tabell 3. Samtidig ble kulturer spaltet 1:5 i medier inneholdende 500 /xg/ml G418 (293-celler) eller 250 nM metotreksat (BHK-celler). Etter 10 dager i nærvær av selektive medier ble stabilt transfekterte kolonier undersøkt etter protein C-produk-sjon ved immunofiltermåling (McCracken og Brown, BioTechniques, 82-87, mars/april 1984). Plater ble renset med PBS eller No Serum-medium (Dulbeccos pluss penicillin-streptomycin), 5 /ig/ml vitamin K). "Teflon"-netting ble plassert over cellene. Nitro-cellulosefiltre ble fuktet med PBS eller No Serum-medium etter behov og plassert over nettingen. Etter fire timers inkubasjon ved 37°C ble filtrene fjernet og plassert i buffer A (50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% gelatin) i 30 minutter ved romtemperatur. Filtrene ble inkubert i 1 time i romtemperatur under rysting i biotinmerker polyklonale saueanti-sto.ffer mot protein C, 1 /ig/ml i buffer A. Filtrene ble deretter vasket i buffer A og inkubert i 1 time i romtemperatur under rysting i avidinkonjugert pepperrotperoksidase (Boehringer-Mannheim), 1:1000 i buffer A. Filtrene ble vasket i buffer A, deretter i H20 og inkubert i fargereagens (60 mg HRP fargefrem-kallingsreagens [Bio-Rad] , 20 ml metanol, 100 /il H202 i 100 ml 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl). Reaksjonen ble stoppet ved overfø-ring av filtrene til H20.

Positive kolonier ble utplukket og dyrket i selektive medier (inneholdende 500 /ig/ml G418 eller 250 nN metotreksat etter behov) i 10 dager. Dyrkningsmediet ble målt etter APC-aktivitet ved kromogenmåling. Medieprøver ble satt til mikroti-terbrønner inneholdende 100 /il 0,2 mM Spectrozym PCa (American Diagnostica No.336) i 50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl. Platene ble inkubert ved 37°C og AA05 målt ved forskjellige tidsrom. Repre-sentative resultater fra en transfektert 293-cellelinje (kalt 829-20) er vist på fig. 13. Medier fra positive kolonier av linje 829-20 viste stadig høyere aktivitet med det kromogene substrat for APC enn kontrollmediene gjorde, som var blitt inkubert med ikke-transfekterte 293-celler i like langt tidsrom (10 dager).

Eksempel 7

Modifikasjon av protein C behandlingssetet

A. Sete- spesifikk mutagenese. For å forbedre behandlingen av enkelt-kjedet protein C til den to-kjedede form ble to ytterligere argininrester innført i proteinet, hvilket førte til et spaltningssted bestående av fire basiske aminosyrer. Det resulterende mutantforstadium for protein C ble kalt PC962. Det inneholder sekvensen Ser-His-Leu-Arg-Arg-Lys-Arg-Asp ved spalt-ningsstedet. Behandling ved Arg-Asp-båndet fører til et to-kjedet protein C-molekyl.

Mutantmolekylet ble frembragt ved å forandre det klonede cDNA ved setespesifikk mutagenese (hovedsakelig som beskrevet av Zoller og Smith, DNA 3: 479-488, 1984, for to-primer-metoden) ved bruk av det mutagene oligonukleotidet ZC9 62

(5 AGTCACCTGAGAAGAAAACGAGACA3 ) . Plasmidet p594 ble spaltet med Sst I og det ca. 87 bp lange fragment ble klonet i M13mpll og enkelt-kjedet mal DNA ble isolert. Etter mutagenese ble et korrekt klon identifisert ved sekvensbestemmelse. DNA av replika-tiv form ble isolert, spaltet med Sst I, og protein C-fragmentet ble innsatt i Sst I-kappet p594. Kloner med Sst I-fragmentet innsatt i den ønskede orientering ble identi-fisert ved restrik-sjonsenzymkartlegging. Den resulterende ekspresjonsvektor ble kalt pDX/PC962 (fig. 14) .

B. Ekspresjon og karakterisering av protein C.

Plasmid pDX/PC962 ble ko-transfektert i tk~ BHK-celler med pSV2-DHFR (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1: 854-864, 1981) ved kalsiumfosfatmetoden (hovedsakelig som beskrevet av Graham og van der Eb, ibid.). De transfekterte celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (MEM) inne-holdende 10% kalvefosterserum , IX PSN antibiotikablanding (Gibco 600-5640), 2,0 mM L-glutamin og vitamin K (5 /jg/ml) . Cellene ble selektert i 250 nM metotreksat (MTX) i 14 dager, og de resulterende kolonier ble undersøkt ved immunofilter-målingen (eksempel 6) . Seks av de sterkest reagerende koloniene ble plukket ut ved sylinderkloning og dyrket enkeltvis i 10 cm's plater. Når kulturene nesten var sammenflytende, ble protein C-produksjonsnivåene målt med ELISA. Resultatene er gitt i tabell 4.

Klonet BHK/962-1 ble dyrket i større skalakultur, og flere hundre mikrogram protein C ble renset ved affinitetskromatografi på en kolonne fremstilt ved å koble 7 mg polyklonalt saueantistoff mot humant protein C til 2 g CNBr-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ). Cellukulturmedie ble satt på kolonnen, kolonnen ble vasket med 100 ml TBS, og protein C ble eluert med TBS inneholdende 3 M KSCN eller med pH 11,5-buffer. Wester-blot-analyse viste at mutantprotein C forelå omtrent 9 5% i to-kjedet form, sammenlignet med ca. 2 0% to-kjedet protein C erholdt fra BHK-celler transfektert med den naturlige sekvens.

Milligrammengder av protein C ble renset fra enten stabile BHK-cellekloner som uttrykte PC962 mutantprotein eller stabile 293-cellekloner som uttrykte villtypeprotein C (p594 transfekterte celler) ved bruk av en monoklonal antistoff-kolonne spesifikk for den kalsiuminduserte konformasjon av protein C. Celle-kulturmedier ble satt på kolonnen i nærvær av 5 mM CaCl2, kolonnen ble vasket med TBS inneholdende 5 mM CaCl2, og protein C ble eluert med TBS inneholdende 10 mM EDTA. Bruken av denne rensemetoden muliggjorde rensing av full-stendig aktivt protein C uten utsettelse for denaturerende betingelser. Det rensede protein C ble analysert ved SDS/PAGE etterfulgt av sølvfarging og ble vist å være >95% rent.

Det BHK-produserte PC962-protein ble målt med hensyn til sin evne til å aktiveres til en form som viser både amido-lytiske og antikoagulante aktiviteter. Affinitetsrensede proteinprøver ble uttømmende dialysert mot TBS og deretter aktivert ved inkubering ved 37 °C i 1 time med 0,1 volumdel 1 enhet/ml Protac C (American Diagnostica). Amidolytisk aktivitet ble målt ved å tilsette adekvoter av aktiverings-blandingen til 100 /il 1 mM protein C-substrat (Spectrozym PCa, American Diagnostica) i en mikrotiterbrønn og måle forand-ringen i A405 over tid ved bruk av en mikrotiterplateavleser. Antikoagulant aktivitet av det aktiverte protein C ble målt som beskrevet av Suge et al.

(ibid.). Det affinitetsrensede PC962-protein ble vist å være fullstendig aktivt i både amidolytiske og antikoagulante målin-ger. Eluering fra antistoff kolonnen ved pH 11,5 buffer ble vist å gi et protein med høyere aktivitet enn det som oppnås ved å bruke 3 M KSCN-eluering.

Klonale cellelinjer fra pDX/PC962-transfeksjon i BHK-celler ble også isolert ved en fremgangsmåte for begrensende fortynning. En plate av MTX-selekterte kolonier (ca. 3 00 kolonier) ble trypsinbehandlet, talt og repletert i mikrotiterbrønner ved et gjennomsnitt på 0,5 celler/brønn. Disse ble dyrket opp i et selektivt medium inneholdende 250 nM MTX. Ca. 50% av brønnene inneholdt kolonier. Brønner som inneholdt identifiserbare kolonier (1-2 mm diameter) ble målt med ELISA med hensyn til protein C-konsentrasjon i mediet. For denne måling ble friskt medium satt til alle brønnene, lot inkubere i 75 minutter, ble så fjernet og målt. Fem kolonier som ga 75-minutters akumuleringer på større enn 50 ng/ml (tilsvarende over 1000 ng/ml/dag) ble spaltet i 10 cm's plater for dyrkning i større skala. Protein C-produksjonsmengder for disse kloner varierte fra 1,1-2,8 pg/celle/dag.

Et andre plasmid kalt PC229/962 ble konstruert ved å innsette PC962 cDNA i plasmid Zem229. Zem 229 er en pUC18-basert ekspresjonsvektor som inneholder et eneste Bam HI-sete for innsetning av fremmed DNA mellom muse-metallotionein-I-promotoren og SV4 0-transkripsjonsterminatoren. Zem229 inneholder også en ekspresjonsenhet for SV4 0-tidlig-promotor, muse-dihydrofolat-reduktasegen og SV4 0-terminator. Et Eco RI-fragment inneholdende PC962 cDNA fra pDX/PC962 ble ligert med Eco RI-Bah HI syntetiske oligonukleotidadaptorer til Zem229, som var blitt kappet med Bam HI og behandlet med fosfatase. Den resulterende vektor er PC229/962, illustrert på fig. 14.

Plasmid PC229/962 ble transfektert til BHK-celler med kalsiumfosfatmetoden. Celler ble dyrket i Dulbeccos MEM inneholdende 10% kalvef osterserum og 5 /xg/ml vitamin K. Det 48 timers overgangsekspresjonsnivå denne transfeksjonen var ca. 25 ng/ml. Etter to dager ble transfekterte celler delt i selektive medier inneholdende 250 nM MTX og dyrket i ytter-ligere 14 dager. Tre plater fra denne transfeksjonen, som inneholdt ca. 200 kolonier hver, ble undersøkt med immuno-filtermålingen, og de 24 sterkest reagerende koloniene ble plukket ut med sylinderkloning. Disse ble dyrket enkeltvis i 10 cm's plater, og deres protein C-produksjonsnivåer ble målt. Kolonier som produserer mellom 1,1 og 2-3 pg/celle/dag ble brukt for produksjonen av stabile protein C-produserende cellelinjer.

Ekspresjonsvektoren pDX/PC962 og plasmid pKO-neo ble ko-transfektert ved kalsiumfosfatmetoden til 293-celler. Transfekterte celler ble spaltet i medier inneholdende 500 jzg/ml G418 etter 48 timer. Etter 10 dager i selektive medier ble immunofil-termålinger foretatt, og to kloner ble plukket ut ved sylinderkloning. Protein C-produksjonen ble funnet å variere fra 1-2 pg/celle/dag. Kulturene ble oppskalert, og protein C ble renset ved immunoaffinitetskromatografi. Mer enn 95% av protein C ble funnet å foreligge i to-kjedeformen.

Strukturen til 962 mutantproteinet fremstilt fra BHK og 293-celler ble sammenlignet med villtype protein C fra 293-celler og fra plasma. Analyse med SDS/PAGE etterfulgt av sølvfarging viste at alle de rekombinante proteiner inneholdt tunge og lette kjeder som vandret sammen med dem fra plasmaproteinet. Villtype protein C syntetisert i 293-celler inneholdt en betydeling mengde (ca. 20%) av enkelt-kjedet, ubehandlet protein med Mr = 66 000, mens mutantproteinet produsert i hver celletype var hovedsakelig fullstendig bearbeidet til to kjeder. N-terminal sekvensanalyse viste at både den lette og den tunge kjeden av den rekombinante villtype og BHK/PC962-mutantproteinene var riktig behandlet. Graden av gammakarboksylering i de rekombinante proteiner ble målt med to adskilte ELISA-systemer. Det første system gjenkjenner både gammakarboksylerte og ikke-karboksylerte former av proteinet, mens den andre anvender spesifikke antistoffer som bare gjenkjenner protein C som har undergått en gla-indusert konformasjonsforandring i nærvær av kalsium. Analyser viste at ca. 60% av det rekombinante protein C fremstilt i BHK-celler og 90%-95% av det som produseres i 293-celler var tilstrekkelig gammakarboksylert til å gjenkjennes av de spesifikke antistoffer.

De tre rekombinante proteiner ble også analysert med hensyn til aminolytisk og antikoagulant aktivitet, og resultatene ble sammenlignet med aktiviteten av plasma protein C. PC962 fra BHK-celler og villtype protein C fra 293-celler viste begge full amidolytisk aktivitet. I antikoagulant-målingen hadde protein C fra BHK-celler hovedsakelig den samme spesifikke aktivitet som plasmaprotein C, mens både villtype og PC962 mutantproteiner fra 293-celler stadig viste ca. 40% større spesifikk aktivitet.

C. Modifisering av aktivert protein C- behandlingssete

En DNA-sekvens som koder for et aktivert protein C-forstadium med behandlingssetesekvensen Arg-Arg-Lys-Arg ble konstruert ved mutagenese av villtype protein C-sekvensen. Den resulterende sekvens var analog med den i pPC962, men manglet delen som kodet for aktiveringspeptidet.

Protein C-sekvensen som forelå i plasmid p594 ble forandret i en enkelt mutagenese for å deletere kodonene for aktiveringspeptidet og innsette Arg-Arg-kodonene ved behandlingssetet. Mutagenesen ble utført på 870 bp Sst I-fragmentet fra p594, hovedsakelig som beskrevet i eksempel 7, ved å bruke oligonukleotid med sekvensen 5' CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA CTC ATT GAT GGG 3'.

Den mutageniserte sekvensen ble brukt til å konstruere ekspresjonsvektoren pDX/PC1058, og vektoren ble kotransfektert i BHK-celler som beskrevet i eksempel 7. Proteinet ble renset på en polyklonal antistoffkolonne eluert med pH 11,5 buffer.

Aktiviteten til 1058-proteinet ble sammenlignet med den for aktivert plasmaprotein C og aktivert PC962. Plasmaprotein C og PC962 (5 jug/ml) ble aktivert ved behandling med 1/10 volum Protac C (American Diagnostica) i to timer. Antikoagulantaktivitet ble bestemt ved å kombinere 50 /ul humant plasma med 50 /ul aktivert protein C og inkubere blandingen ved 38°C i 150 sekunder. Denne blandingen ble tilsatt 50 /ul aktivert sefaloplastin (American Scientific Products, McGaw Park, IL), og blandingen ble inkubert ved 37°C i 300 sekunder. 100 /ul 20 mM CaCl2 ble tilsatt, og sammenklumpningstiden ble registrert. Data er angitt i fig. 15.

Eksempel 8

Bruk av faktor VII og Protrombin pre- pro- peptidene

til å utskille protein C

Faktor VII pre-pro-peptidet ble anvendt i stedet for protein C pre-pro-peptidet i et forsøk på å oppnå høyere utbytter av korrekt behandlet protein C. Disse hybridkonstruk-sjonene innsettes deretter i passende ekspresjonsvektorer og transfekteres til pattedyrcellelinjer.

En cDNA-kodende faktor VII er blitt beskrevet (Hagen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83: 2412-2416, 1986). Klon X HVII565 omfatter kodesekvensen for et 38 aminosyrer pre-pro-pept id. Denne kodesekvensen ble isolert som et Eco RI-Hha I-fragment på 140 bp.

Protein C-sekvensen ble isolert fra p594 ved delvis spaltning med Sst I og fullstendig spaltning med Eco RI. Et 1540 bp fragment som strakk seg fra Sst I-setet ved kodon +7 til Eco RI-setet 3' for cDNA'et ble isolert.

Faktor VII og protein C-sekvensene ble deretter sammen-skjøtet ved hjelp av et oligonukleotidiinker som kompletterer kodesekvensen for aminosyrer -3 til -1 i faktor VII pre-pro-peptidet og aminosyrer 1-8 i protein C. Linkeren ble konstruert fra to oligonukleotider med sekvensene

5' CCGGCGCGCCAACTCCTTCCTGGACCAGCT3' og <5> CCTCCAGGAAGGAGTTGGCGCGCCGGCG<3> . De to oligonukleotider ble ført sammen og sammenskjøtt i en fire-delers ligering til faktor VII pre-pro-sekvensen, protein C cDNA og pUC9 som hadde blitt spaltet med Eco RI og behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase. Det ligerte DNA ble brukt til å transformere E. coli (JM 101). Plasmid DNA ble fremstilt og undersøkt med hensyn til nærvær av et 1710 bp Eco RI-fragment. Et korrekt klon ble kalt p7/C-l0.

Faktor VII/protein C-fusjonen ble uttrykt i 293-celler. Eco

RI-innsetningen fra plasmidet p7/C-10 ble ligert til Eco RI-spaltet pDX. Den resulterende ekspresjonsvektor ble brukt til å ko-transfektere 293-celler som forut beskrevet. 48 timers ekspresjonsnivåer ble bestemt med ELISA sammenlignet med sådanne for 293-celler transfektert med villtype protein C ekspresjons-konstruksjonen og ikke-transfekterte celler. Resultater er presentert i tabell 5.

Protrombinledersekvensen ble konstruert fra oligonukleoti-dene som er oppført i tabell 6 og sammensmeltet til den ferdige protein C-kodesekvensen. 01igonukleotidene ble kinasebehandlet ved å kombinere 50 ng av hvert oligonukleotid med 1 enhet T4-kinase i 10 /il kinasebuffer inneholdende 1 mM ATP. Reaksjonen fikk forløpe ved 37'C i 30 minutter, deretter ble blandingen oppvarmet til 65°C i 10 minutter for å inaktivere kinasen.

Protrombinlederen ble så satt sammen. 50 ng Eco RI, Sst I-kappet M13mpl9 ble kombinert med 2,5 ng hver av de kinasebehandlede oligonukleotider i 20 /ul lx ligasebuffer inneholdende 1 mM ATP og fire enheter T^-ligase. Blandingen ble inkubert ved 15°C i 48 timer og transformert til kompetente E. coli JMlOl-celler. En klar plaque ble utvalgt, og fag DNA ble fremstilt. DNA-sekvensbestemmelse bekreftet at den riktige sekvens hadde blitt konstruert.

Protrombinlederen ble deretter skjøtt til protein C-sekvensen. RF DNA ble fremstilt fra fagklonet som inneholdt den syntetiserte leder, og et 150 bp Eco RI-Sst I-fragment ble isolert. Plasmid p594 ble spaltet fullstendig med Eco RI og delvis spaltet med Sst I, og 1540 bp protein C-fragmentet ble utvunnet. Disse fragmentene ble ligert med Eco RI-kappet pDX, og ligeringsblandingen ble brukt til å transformere kompetent E. coli HBlOl-celler. Plasmid DNA ble isolert fra transfor-mantkolonier og analysert ved restriksjonsspaltning for å bekrefte at fragmentene hadde blitt sammensatt i den riktige orientering.

Oppfinnelsestanken er definert i de følgende krav.

Claims (7)

1. DNA sekvens som koder for et modifisert protein med i det vesentlige den samme biologiske aktivitet som humanprotein C eller aktivert humanprotein C, hvori mutasjonen medfører øket spaltnings-effektivitet ved spaltningssetet mellom de lette og tunge kjeder, karakterisert ved at sekvensen koder for substitusjon av rest 158 med en ikke-sur aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av Ala, Ser, Thr og Gly, substitusjonen av rest 154 med en basisk aminosyrerest valgt fra gruppen bestående av Lys eller Arg, og/eller substitusjon av Lys-Arg ved restene 156-157 med Lys-Lys eller Arg-Arg, og for aminosyresekvensen (R<1>)n-R2-R3-R4 ved aminosyrer 154-157 av protein C som vist på figur 2, hvori R<1>, R2, R<3> og R<4> er Lys eller Arg og n=0, 1, 2 eller 3, ved spaltningssetet mellom de lette og tunge kjeder.

2. DNA sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen er Arg-Arg-Lys-Arg, ved aminosyrer 156-157 som representerer spaltningssetet mellom de lette og tunge kjeder.

3. Ekspresjonsvektor med evne til integrering i pattedyrvertscelle-DNA, karakterisert ved at den inneholder en promotor etterfulgt nedstrøms av en DNA-sekvens ifølge et av kravene 1 og 2, hvilken DNA-sekvens etterfølges nedstrøms av et polyadenyl-eringssignal, hvor transkripsjonen av DNA-sekvensen er dirigert av promotoren, og at vektoren i en transformert vertcelle kan uttrykke DNA-sekvensen ifølge krav 1 og 2.

4. Pattedyrcelle, karakterisert ved at den er transfektert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 3, og er istand til å uttrykke DNA-sekvensen ifølge krav 1 og 2.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein som etter aktivering har hovedsakelig den samme struktur og/eller biologiske aktivitet som humant aktivert protein C, karakterisert ved at man innfører i en pattedyrvertscelle en ekspresjonsvektor ifølge krav 3; dyrker pattedyrvertscellen i et passende medium; og isolerer proteinproduktet som kodes f. r av ekspresjonsvektoren og produseres av pattedyrvertscellen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man videre aktiverer proteinproduktet og får et protein med hovedsakelig den samme biologiske aktivitet som humant aktivert protein C.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at aktiveringstrinnet omfatter spaltning av proteinproduktet med en protease valgt fra gruppen bestående av alfa-trombin, trypsin og venom-aktivatorer.