JPS62283A - フアクタ−７をコ−ドするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分骨〕 この発明は一般に血液凝固因子に関し、そしてさらに詳
しくは血液凝固の九めの生物学的活性を有する蛋白質の
発現に関する。 〔従来の技術〕 血液凝固は、最終的に７４プリンクロツトを生じさせる
種々の血液成分又は因子の複雑な相互作用から成る過程
である。一般に、凝固“カスケード“と称される現象に
関与する血液成分は酵素的に不活性な蛋白質たるグロエ
ンディム（ｐｒｏ＠ｎｚｙｍｅ）又はデイモｒン（ｚｙ
ｎａｏｇｅｎ）であり、この蛋白質は、それ自体活性化
された凝固因子であるアクチベーターの作用により蛋白
質分解酵素に転換される。このような転換を経験した凝
固因子は一般に１活性化された因子”と称され、そして
小文字の後付加記号＠ａ”によって示される（例えば■
亀）。 血液の凝固を助長しそしてそれによって正常な止血に関
与する２つの別個の系が存在する。これらの系はイント
リンシック（ｉｎｔｒ％ｎｍ１ａ）　ｌｉ固経絡及びエ
キストリンシック（・ｘｔｒｌｎ＋５ｌｃ）　＃固経路
と称されている。イントリンシック経路は血漿中にのみ
存在する因子の利用を介してトロンビン形成を導く反応
を意味する。イントリンシック経路における中間的現象
としてファクターＸ１ｍ及びカルシウムイオンによシ触
媒される反応であるファクター■のファクター■ａへの
活性化がある。 次に、ファクター■ａは、ファクター■ａ、リン脂質及
びカルシウムイオンの存在下で７アクターＸの活性化に
関与する。エキストリンシック経路は血漿因子、及び組
織抽出物中に存在する成分を用いる。前に言及したグロ
エンデイムの１つであるファクター■は、そのファクタ
ー■ａへの活性化の後に、組織因子及びカルシウムイオ
ンの存在下で７アクターＸをＸａに転換することにより
。 血液凝固のエキシトリンシック経路に関与する。 ファクターＸａは今度はファクターｖａ、カルシウムイ
オン及びリン脂質の存在下でプロスロンピンをメロ／ビ
ンに転換する。ファクターＸのファクターＸ＆への転換
はイントリンシック経路及びエキシトリンシック経路の
両者に共通の現象であるから、ファクター■が不足して
いるか又はファクター■の阻害物質を有する患者の治療
のためにファクター■轟を使用することが−できる（Ｔ
ｈｏｍａｓ。 米国特許４４，３８２，０８３　）。さらに、ファクタ
ー■ａはファクター■の活性化において役割を演するこ
とによりイントリンシック経路に関与することを示唆す
る証拠が存在する（　Ｚａｒ及びＮ＊ｍ＊ｒｇｏｎ　、
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ、　２５３−：　２２０
３−２２０９　、１９７８　）。 実験的分析により、ヒト−ファクター■が約５０．００
０ダルトンの分子量を有する単鎖糖蛋白質であることが
明らかにされている。この形態において、この因子は不
活性デイモダン（ｇｙｍｏｇｓｎ）として血液中を循環
する。ファクター■のファクター■ａへの活性化は幾つ
かのｎる血漿グロテアーゼ、例えばファクターＸ［Ｉａ
によシ触媒される。 ファクター■の活性化により２個の４リペプチド鎖が形
成され、これらは少なくとも１個のジスルフィド結合に
よシ一体化されたヘビー鎖（Ｍｒ　＝２８．０００）と
ライト鎖（Ｍｒ＝１７，０００）とから成る。ファクタ
ー■はまた１例えばＴｈｅｍａｓ＋米国特許４４，４５
６，５９１により開示された方法によりイン−ビトロで
■ａに活性化される。 ファクター■は分子量５７，０００の単鎖前駆体として
血液中を循環し、そしてファクター■の存在下でファク
ターＸ１ｍにより開裂された後活性なセリンゾロテアー
ゼ（ファクタｍ１ｈ）に転換される。ファクターＩＸｍ
はそれぞれ１６，０００及び２９．０００の分子量を有
するライト鎖及びヘビー鎖から成る。 凝固異状（例えばファクター■及び■の不足）を有する
患者に対する最近の治療の実際は、富化されたレベルの
特定の因子を含有するヒト血漿の冷却沈澱物（ａｒｙｏ
ｐｒ＠ｃｐｌ　ｔａｔ・）又は他の両分による置換療法
（ｒｅｐｌａｃｅｍ＠ｎｔ　ｔｈ＠ｒａｐｈ）　　を用
いる。これらの調製物は従来プールされたヒト血漿から
得られていた。冷却沈澱物を調製するには出発材料とし
て比較的多量のヒト血漿を使用する必要がある。 ファクター■の＊ａ的使用は、ファクター■の不足を示
す個体、並びにファクター■及びファクター■が不足し
ている個体群、及びＶｏ　ｎ　Ｗｉ　１１＠ｂｒａｎｄ
病を有する固体の治療においてなされる。置換療法にお
いてファクター■及びＩＸを投与された個体はこれらの
蛋白質に対する抗体をしばしば生じさせる。これらの抗
体の存在のために連続治療は非常に困錯である。この問
題をｆＪ！験する患者は通常。 ファクター■ａを含む活性凝固酵素及び不活性凝固酵素
の混合物から成ることが知られている活性化されたグロ
スロンピン複合体により治療される。 さらに、最近の研究により、少ｆ（４０〜５０μｙ）の
注射されたファクター■ａが、その血液中に高レベルの
抗体を有するファクター■不足の患者における重症の進
行する出血を抑制するために有効であることが示されて
いる（　Ｈ＠ｄｎ・ｒ及びＫ１５ｉｅｌ、　Ｊ、　Ｃｌ
１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７１　：　１８３６−１８４
１゜１９８３　）。 冷却沈澱物のｖ４製に使用される血漿の入手源が多様で
あるため、調製物を試験してそれらがウィルス汚染を含
まないことを保証することは困難である。例えば、冷却
沈澱物を投与されたほとんどすべての者が肝炎試験にお
いて陽性を示す。さらに、最近の報告によれば、冷却沈
澱物を投与され喪血友病患者において後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）が生じた。さらに、これらのファクタ
ーを多量に精製することは非常に困難であり、そして高
価である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従って、ファクター■ａ及びファクター■の純粋な調製
物を比較的多量に製造するための方法が必要である。こ
の発明はこのよ、うな必要を満たし、ウィルス感染の問
題を好結果に除去し、そして同時に、ファクター■及び
ファクター■が不足している患者並びにＷｏｎ　ＶＶｔ
ｌ　１＠ｂｒａｎｄ病の個体を治療する丸めの活性なフ
ァクター■ａの一貫し九且つ均質な入手源を提供し、そ
してさらに置換療法において使用するための精製され次
ファクター■源を提供するものである。 〔問題点を解決するための手段〕 要約すれば、この発明は実質的に、７アクターＶＩＩＩ
をコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成物
を開示する。このヌクレオチド配列はカルシウム結合ド
メインをコードする第１ヌクレオチド配列及び該第１ヌ
クレオチド配列の下流に位置しこれと連結されている第
２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌクレオチ
ド配列はファクター■ａのセリングロテアーゼ活性のた
めの触媒ドメイン金コードする。これらの連結された配
列は、活性化後にファクターＶＩＩａと実質上同一の血
液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコードす
る。第１ヌクレオチド配列は、実質的に、ファクター■
、ファクター■、ファクターＸ、プロテインＣ，プロス
ロンピン又ハブロチインＳをコードする遺伝子のそれで
ある。さらに。 第１ヌクレオチドは前記遺伝子のそれぞれに対応するリ
ーダー（デチドをもコードしていてもよい。 特に、第１ヌクレオチド配列はファクター■のｒツムク
ローン又はｅ　ＤＮＡクローンに由来することができ、
そしてファクター■のリーダー（グチド及びアミノ末端
部分をコードすることができる。 第１ヌクレオチド配列はさらに２本鎖オリゴヌクレオチ
ドを含有することができる。特に好ましい第１ヌクレオ
チド配列はファクター■のリーダー（ゾチド及びアミノ
末端部分をコードするそれである。 さらに、この発明は晴乳類宿主細ｔｌＤＮＡ中に取り込
まれ得るシラスミドを開示する。これらのプラスミドの
１つはプロモーター、その下流に続く１組のＲＮＡスゲ
ライス部位、及びその下流に続く。 実質的に、ファクターＶＩＩをコードするヌクレオチド
配列を含有する。このヌクレオチド配列はカルシウム結
合ドメインをコードするｍｌヌクレオチド配列、及び該
第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれに連結されて
いる第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌク
レオチド配列はファクター■ａのセリングロテアーゼ活
性のための触媒ドメインをコードする。これらの連結さ
れた配列は、活性化後にファクターＶＩＩａと実質的に
同一の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を
コードする。このヌクレオチド配列の下流にポリアデニ
レーションシグナルが続く。 上記の組換プラスミドと同様に、この発明はさらに、プ
ロモーター、その下流に続く１組のＲＮＡスプライス部
位、及びその下流に続く、実質的に、ファクターＩＸを
コードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドを
開示する。このヌクレオチド配列はカルシウム結合ドメ
インをコードする第１ヌクレオチド配列、及び該第１ヌ
クレオチド配列の下流に位置しそれに連結されている第
２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌクレオチ
ド配列はファクター■のセリンプロテアーゼ活性のため
の触媒ドメインをコードする。 これらの連結された配列はファクター■と実質上同一の
血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコード
する。このヌクレオチド配列の下流には／　１，１アゾ
ニレ−ジョンシグナルか続く。 この発明は第３の観点において、活性化後にファクター
Ｗａと実質上同一の生物学的活性を有する蛋白質を生産
するために安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞を
開示する。細胞が実質的に、ファクターＶＩＩＩをコー
ドするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成物によっ
てトランスフェクトされる。このヌクレオチド配列はカ
ルシウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配
列、及び該第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれに
連結されている第２ヌクレオチド配列を含んで成る。こ
の第２ヌクレオチド配列はファクターｖｉ凰のセリンプ
ロテアーゼ活性のための触媒ドメインをコードする。こ
れらの連結された配列はファクターＶＩＩａと実質上同
一の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコ
ードする。 この発明は他の観点において、ファクター■と実質的に
同一の生物学的活性′ｔ−有する蛋白質を生産する九め
に安定にトランスフェクトされｆｃ哨乳類細胞を開示す
る。細胞が実質的に、ファクターＩＸをコードするヌク
レオチド配列を含有するＤＮＡ造成物によってトランス
フェクトされる。 このヌクレオチド配列はカルシウム結合ドメイン１＆：
コードする第１ヌクレオチド配列、及び該第１ヌクレオ
チド配列の下流に位置しそれと連結されている第２ヌク
レオチド配列を含んで成る。この第２ヌクレオチド配列
はファクター■のセリンプロテアーゼ活性の次めの触媒
ドメインをコードする。これらの連結された配列はファ
クター■と実質的に同一の血液凝固のための生物学的活
性を有する蛋白質をコードする。 この発明はさらに、実質的に、ファクターＶＩＩをコー
ドするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成物を含む
哺乳類細胞を樹立することによって、ファクターＶＩＩ
ａにより中介されろ血液凝固のための生物学的活性を有
する蛋白質の製造方法を提供する。このヌクレオチド配
列はカルシウム結合ドメインをコードする第１ヌクレオ
チド配列、及び該第１配列の下流に位ｆｌそれに連結さ
れ次第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２ヌク
レオチド配列はファクター■ａのセリンプロテアーゼ活
性のための触媒ドメインをコードする。 これらの連結された配列は、活性化後にファクターＶＩ
Ｉａと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白質金コ
ードする。次に、この哺乳類細胞を適当な培地中で増殖
せしめ、そして該ＤＮＡ造成物によりコードされており
且つＲＩｆ、両孔動物細胞により生産された蛋白質生成
物を単離する。次にこの蛋白質生成物を活性化してファ
クター■ａを生じさせる。 この発明は他の観点において、ファクター■により中介
される血液凝固のための生物学的活性含有する蛋白質の
羨遣方法を開示する。この方法は。 実質的に、ファクターＩｎコードするヌクレオチド配列
を含有するＤＮＡ造成物を含む両孔類宿主細胞を樹立す
ることを含んで成る。このヌクレオチド配列はカルシウ
ム結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列、及
び該第１ヌクレオチド配列の下流に位置しそれに連結さ
れている第２ヌクレオチド配列を含んで成る。この第２
ヌクレオチド配列はファクター■の九めのセリンプロテ
アーゼ活性のための触媒ドメインをコードする。これら
の連結された配列はファクター■と実質的に同一の血液
凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコードする
。次に、この！ＩＷ乳類宿王細胞を適当な培地中で増殖
せしめ、そして該宿主細胞によりコードされ念蛋白質生
成物を単離する。 上記の方法によりｊＡ造される蛋白質も開示される。 この発明の他のも１点において、ファクターＶＩＩＩを
コードする［）ＫＡ配列を含んで成るＤＮＡ造成物を開
示する。好ましい態様においては、このＤＮＡ配列は第
１Ｂ図中の第３６塩基対から第１４３３塩基対までのｅ
ＤＮＡ配列を含んで成る。他の好ましい態様においては
、ＤＮＡ配列は第２Ｂ図中の第３６塩基対から第９９ｎ
ｉ基対まで、及びその下流に続く第１６６塩基対からＷ
、１４３３塩基剤までのｃ［）ＮＡ配列を含んで成る。 すぐ上に記載したＤＮＡ配列を含んで成り、１ｌｌＷ乳
類宿主細胞ＤＮＡ中に組込まれ得る組換プラスミドもま
た開示される。 ファクターＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を含んで成
る４１１換体シラスミドによシ安定にトランスフェクト
され之補乳類細胞もまた開示される。好ましい態様にお
いては、このＤＮＡ配列は第１Ｂ図中の第３６塩基対か
ら第１４３３塩基対までのｃ　ＤＮＡ配列、又は第１Ｂ
図中の第３３塩基対から第９９塩基対まで及びその下流
に続（８ｇ１６６塩基対から第１４３３塩基対までのｅ
　ＤＮＡ配列を含んで成る。 上記の０８人造成物を含有する捕乳類宿主細淘を樹立す
ることによって、ファクター■ａにより中介される血液
凝固のための生物学的活性を有する蛋白質の製造方法も
また開示される。次に、ｌｌ１１乳類宿主Ｆｄ胞を適当
な培地中で増殖せしめ、そしてＤＮＡ造成物によりコー
ドされている蛋白質生成物を単離する。次に、この蛋白
質生成物を活性化してファクター■ａを生じさせる。 この発明の他の観点は、以下の詳細な説明及び添付図面
により明らかになるであろう。 〔具体的な説明〕 この発明を記載する前に、以下に使用する幾つかの用語
の定義を記載するのが発明の理解の助けとなろう。 相補的ＤＮＡ又はｅＤＮＡ　：　ｍＲＮＡ闘型中に存在
する配列から酵素的に合成されたＤＮＡ分子又は配列で
ある。 ＤＮＡ造成造成物本１本鎖２本鎖のＤＮＡ分子又はこの
ような分子のクローンであって、天然の遺伝子から単離
することができるもの、又は天然には存在しない態様で
組合わされそして並置されるＤＮＡのセグメントを含む
ように変形されているものである。 プラスミド又はベクター：宿主＃ｌ）＠に挿入された場
合に複製することができ、遺伝情報を含有するＤＮＡ造
成物である。プラスミドは一般に、宿主細胞中で発現さ
れるべき少なくとも１個の遺伝子配列、並びにプロモー
ター及び転写開始部位を包含する。前記の遺伝子の発現
を促進する配列を含有する。これは線状分子であっても
閉環された分子であってもよい。 連結：１つの配列の５′及び３′末端が間抜する配列の
それぞれ３′及び５′末端にホスホジエステル結合によ
って付着されることを１連結される”と称する。連結は
、平滑末端又は接着末端のりガーゼ連結のごとき方法に
より、ｅＤＮＡクローニングによる連結された配列の合
成により、又は指令された変異誘発（ｄｉｒ＠ｅｔｅｄ
　ｍｕｔａ（＠ｎ＠ｓＩｍ　）の方法による介在配列の
除去により−ｊ！！成することができる。 リーダー（グチド：幾つかの蛋白質のアミノ末端に存在
しそしてプロセシング及び分泌の間に該蛋白質から一般
に切断されるアミノ酸配列である＠リーダーペプチドは
その蛋白質を細胞の分路経路に向ける配列を含んで成る
。この明細書にオメて使用する場合、＠リーダーペプチ
ドなる語はさらに天然のリーダーペプチドの部分をも意
味する。 ドメイン：その蛋白質のある生物学的活性の丸めに必要
な構造要素の全部又は部分を含有する蛋白質中の特定の
複数のアミノ酸の３次元的自己集成的整列である。 生物学的活性：生物学的背景において（すなわち生物体
中で又はイン−ビトロの模倣において）分子に２−、て
達成される１つの機能又は１組の機の触媒活性は一般に
前駆体の特異的開裂による他の因子の活性化を含む。エ
フアクタ−活性は、生物学的に活性な分子のカルシウム
もしくは他の小分子への、蛋白質のごとき巨大分子への
、又は細胞への特異的結合を含む。エフアクタ−活性は
生理的条件下での触媒活性をしばしば増強し、又は触媒
活性のために必須である。触媒活性及びエフアクタ−活
性は幾つかの場合には蛋白質の同一のドメイン内に存在
する。 ファクター■ａについて、生物学的活性はエキシトリン
シック経路による血液凝固の仲介によって特徴付けられ
るファクター■１はファクターＸをファクターＸａに活
性化し、このファクターＸａは今度はグロスロンピンを
スロンビンに転換し、これによってフィブリンクロット
の形成が開始される。ファクターＸの活性化は血液凝固
のインドリノシック経路及びエキシトリンシック経路に
共通であるので、ファクター■ａはファクター■、ファ
クター■又はＶｏｎ　Ｗｉｌｌ＠ｂｒａｎｄファクター
が不足している重症の個体の治療のために使用すること
ができる。 ファクター■の生物学的活性はイントリンシック経路に
よる血液凝固の仲介に工り特徴付けられる。ファクター
■はファクターＸ１によりファクター■ａに活性化され
る。次に、ファクター■ａは、ファクター■畠、リン脂
質及びカルシウムイオンの存在下でファクターＸをファ
クターＸａに活性化する。次に、ファクターＸＪＬはグ
ロスロンビンのスロンピンへの転換において機能し、フ
ィブリンクロットの形成が開始される。 上記のように、ヒト血漿からの７アクター■の単離は長
時間を要し且つ高価な工程である。なぜならこのファク
ターは血液ｌｔ中に約３００μｇの濃度で存在するに過
ぎない希少蛋白質だからである。さらに、スロンピン、
ファクター■及びファクターＸから分離することが困難
であり、そして精製中の蛋白質分解的攻撃に対して感受
性である（　Ｋ１ｍ１ｍ１及びＭｏＭｕｌｌｅｎ　、前
掲）。単鎖ヒトファクター■は均一に精製されているが
（Ｋｉｓｉｅｌ及びＭｃＭｕｌｌ＠ｎ　、前掲）、公表
された精製方法は一般に低収量及び／又は他の凝固因子
による汚染により限定される。 ファクター■及び■は肝誠により生産され、そしてその
生合成のためにビタミンＫを必要とする。 ビタミンにはこ、れらのファクター中の特定のγ−カル
？キシグルタミン酸残基の形成のために必要である。こ
れらの異状なアミノ酸残基は翻訳後の変形によって形成
され、カルシウムイオンに結合し、そしてこの蛋白質と
リン脂質小胞との相互作用を担当する。さらに、ファク
ター■及びファクター■はそれぞれ１個のβ−ヒドロキ
シアスノ’？ラギン酸残基を含有し、この残基も蛋白質
が翻訳された後に形成される。しかしながら、このアミ
ノ酸残基の役割は知られていない。 ファクター■及びファクター■の活性が特定のグルタミ
ン酸残基のｒ−力ル？キシル化金含む翻訳後変化に依存
し、そして又特定のアス・ぐライン酸残基のヒドロキシ
ル化に依存するであろうという事実を仮定すれば、微生
物中でのファクター■及び■のクローニング及び発現に
よって活性な生成物を製造することはできそうにない。 従ってこの発明は、安定にトランスフェクトされた哺乳
類細胞を用いてファクターＶＩＩａにより仲介される血
液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を製造する
方法を提供する。さらに、この発明はまた。ファクター
■により仲介される血液凝固のための生物学的活性を有
する蛋白質を製造する方法を提供する。 前記のごとく、７アクター■及び■はその生合成のため
にビタミンＫを必要とする。さらに、血漿蛋白質である
プロスロンビン、ファクターＸ％プロティンＣ１及びプ
ロティンＳもそれらの生合成のためにビタミンＫを必要
とする。ｒ−カル♂ギシグルタミン酸残基を含有するこ
れらの蛋白質のアミノ末端部分は、アミノ酸配列及び生
物学的機能の両者において類似している（第２Ａ図を参
照のこと）。さらに、７アクター■、プロスロンピン、
ファクターＥＫ　＊　７７クターＸ、及びプロティンＣ
のカル−キシ末端部分はそれらの特異的なセリンプロテ
アーゼ機能を決定する。 ファクター■は微量血漿蛋白質であり、そしてファクタ
ーＶＩＩＩをコードするｍＲＮＡは希少であると信じら
れる。従って、広範囲の配列分析及び特徴付けを可能に
するのに十分な倣で血漿からファクターＶＩＩＩを精製
することは困難な′ｔまである。グロテアーゼ阻害剤の
存在下においてさえＮ製中にファクター■が分解される
ことがＫ１１ｌａｌ及びＭｃＭｕｌｌ＠ｎ　（前掲）に
より観察された。これらの困難性のため、ファクター■
は血液凝固系の他の一層豊富な成分に比べて十分に特徴
付けられていない。事実、Ｋ１５ｌｅｌ及びＭｃＭｕｌ
ｌｅｎ　（前掲）の研究はファクター■の６鎖のわずか
１０残基について配列情報をもたらし、そして各配列に
おいて２つの残基の同定は仮定的であった。ウシ−ファ
クター■についての部分的アミノ酸配列データも公表さ
れている（　ＤＩＳｃｉｐｌｏ等、前掲）。 ファクター■ｍＲＮＡの予想される希少さがファクター
■遺伝子の知識の欠除に寄与していた。常用のｃＤＮ人
クローニング技法の成功はＨｑとして使用する九めの十
分な電のｍＲＮＡに依存する。逆転写の早すぎる停止は
５′末端を欠（ｃＤＮＡクローンの形成をもたらし、そ
してこの状態は低いｍＲＮＡレベルによって悪化する。 豊富でないメツセンツヤ−ＲＮＡのａＤＮＤＮＡクロー
ングめの幾つかの方策が開発されている（Ｍａｎｌａｔ
ｌｓ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、″−ルルドス
プリングハーパーラゲラトリー、１９８２）が、しかし
ながら注目の生成物のアミノ酸配列についての知識の欠
如がＤＮＡ配列を予想しそして適当なオリがヌクレオチ
ドプローブを設計することを困、難にしている。これら
の改良された方法を用いて僅少な蛋白質をコードする遺
伝子の部分的ａ　ＤＮＡクローンを得ることは比較的簡
単であるが。 ファクター■のごとき僅少な蛋白質をコードする遺伝子
の十分な長さのｃＤＮＡクローンを得ることは依然とし
て困難である。 ファクター■に比べて、ファクター■は比較的豊富な蛋
白質であり、そしてヒトーファクター■遺伝子のｃ　Ｄ
ＮＡクローンの配列は知られている１９８４　）。ファ
クター■遺伝子の構造は特徴付けられており、そしてこ
の蛋白質のアミノ酸配列は既知のアミノ酸配列に基いて
決定されている。ヒト及びウシのファクター■について
の晟つかの蛋白質配列データも公表されており、セして
配列が分析されている（　ＤＩＳａｌｐｌｏ等、前掲）
。この蛋白質のアミノ末端部分は１２個のグルタミン酸
残基を含有し、これらは成熟蛋白質中ではγ−カル７Ｉ
Ｃキシグルタミン酸（Ｇｌｍ）残基に転換されている０
フアクター■の活性化に関与する開裂部位も同定されて
いる（　Ｋｕｒａｅｈｉ及びＤａｖｉｅ　、前掲）０フ
アクター■ｃＤＮＡクローンの５′末端における配列は
、はとんどの分泌される蛋白質中に見出されるシグナル
配列に典壓的なシグナル配列をコードしている（　Ｋｕ
ｒａｃｈｌ及びＤａｖｉｅ　、前掲）。組換ＤＮＡ法に
よるファクター■遺伝子の発現は今まで報告されていな
い。 ファクター■遺伝子の十分な長さのｃ　ＤＮＡクローン
を得ることが困難であるため、リーダー（プチドをコー
ドする領域を含むコード配列の５′末端を提供するため
に３種類の新しいアプローチを用いた。第１の方法によ
れば、ファクター■のための部分的ｃ　ＤＮＡクローン
をファクター■のリーダーペプチド及び５′部分をコー
ドする断片に連載ずす−る。このアプローチは、これら
２つの分子のアミン末端部分はそれぞれの蛋白質のカル
シウム結合活性を担当しているという観察、及びファク
ター■のカルシウム結合活性をファクター■のそれのた
めに置換する−ことができるという発見て基礎を置いて
いる。凝園因子の特異的セリンプロテアーゼ活性は分子
のカル１ｔキシ末端領域に存在するため、得られるポリ
ーＩ！ゾチドは真正なファクター■の生物学的活性を保
持している。第２のアプローチは１部分的ｃ　ＤＮＡク
ローンと、ファクター■のリーダー領域及びアミノ末端
領域をコードするＤＮＡ配列とを組合わせる。この明細
書に開示するファクター■の部分的ａ　ＤＮＡ配列及び
アミノ酸配列は、ファクター■遺伝子の５′部分を含ん
で成るクローンのｃ　ＤＮＡライブラリー又はゲノム性
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを可能にする。第
３のアプローチは、部分的ｅ　ＤＮＡクローンと、ファ
クター■のリーダーペプチドをコードするｅＤＮＡ断片
及びコンセンサス（ｅｏｎｌｌ・旧■＠）カルシウム結
合部位又はファクター■の予想されるアミノ末端配列を
含んで成るバイブリドコード配列との連結を用いる。フ
ァクター■のアミノ末端のためのコード配列は、この明
細書に開示される今まで公表されていないアミノ酸配列
データにより確立された。コンセンサス配列は、ファク
ター■のｒ−タ、及び他のビタミンに一依存性血漿蛋白
質について公表されている配列データから導かれる。 ファクター■遺伝子の５′部分を含んで成るクローンの
スクリーニングについて上に記載したアプローチに従っ
て、本発明者等は発現のた゛めに適当な十分な長さの正
しいｃ　ＤＮＡを得ることに成功した。 生じたｅＤＮＡクローンの内、′λ■２４６３　”と称
するクローンが最も長いファクター■ｃＤＮＡ挿入部を
含有していた。このものはファクター■の完全なコード
配列を含有していることが見出された。このクローンは
３５ヌクレオチドの５′非翻訳領域、６０アミノ酸のリ
ーダーをコードする１８０ヌクレオチド％４０６アミノ
酸の成熟蛋白質をコードする＄２１８ヌクレオチド、終
止コドン、１０２６ヌクレオチドの３′非翻訳配列、及
び２０塩基の−９（４）テイル（２４６３位から始まる
）を含有していた。このｃ　ＤＮＡは両鎖について完全
に配列決定された。これと、クローンλ■２１１５及び
λ■９２３から初期に単離されｆｔ　ｅＯＮＡ挿入部と
の比較により、λ■２４６３は１個のＷｅｏＲＩ断片上
に、ファクター■リーダー及び成熟蛋白質配列をコード
するファクター■ｅ　ＤＮＡを含有することが明らかに
なった。 第２のクローンλ■５６５を単離した。このクローンは
、ヌクレオチド１００−１６５（第１Ｂ図）が欠けてい
る点を除きクローンλ■２４６３のヌクレオチド９から
ヌクレオチド６３８までのｃ　ＤＮＡと同じｅ　ＤＮＡ
挿入部を含んでいた。ｅＤＮＡとファクター〜ｌｒツム
性ＤＮＡとの比較において、存在しない配列は１個のエ
クソン様領域に正確に対応した。従って、択一的ｔｎＲ
ＮＡスプライシング現象を反映した２個のファクター■
ｅ　ＤＮＡが得られた。 λ■２４６３によりコードされるリーダーは非常に長く
（６０アミノ酸）、そしてファクター■。 プロティンＣ及びグロスロンビンと比較した場合、非常
に異る疎水性プロフィールを有する。このリーダーは一
６０位及び−２６位に２個のメチオニンを含有する。翻
訳開始は一６０位から始まると考えられろ。なぜなら、
シグナルペゾチドに特徴的な疎水性領域は一２６位に続
くのではなく一６０位に続くからである。ｒツムクロー
ン中のエクソン様領域に正確に対応する。λ■５６５中
に存在しない配列はファクター■、プロディンＣ及びプ
ロスロンピンに一層類似する疎水性・ぐターンを有する
３８アミン

【ｌのリーダー企もたらすことは興味深いこ
とである。 前記のリーダーのいずれが（もしいずれかだとすれば）
真正であるか明らかでないため、追加のアプローチにお
いて５′末端配列を分析する様に努力した。要約すれば
、このアプローチは、ヒトデツムＩ）ＮＡライブラリー
の造成及びスクリーニング、並びにファクター■遺伝子
配列を含んで成るｒツムクローンの同定を含む。次に、
ｒツム配列の５′領域’！Ｉ−ｃＤＮＡに連結して十分
な長さのクローンを造成した。 追加の造成において、リーダーのすべて及び成熟コード
配列の２９アミノ酸を含有するλ■５６５０５′ファク
ター■ｅＤＮＡ断片を、λ■２４６３のｅ　ＤＮＡの断
片（成熟蛋白質の残部及び３′非翻訳配列を含有する）
に連結し次。この“５６５−２４６３１配列は十分な長
さのファクター■ｅＤＮＡ配列を単−ＥｅｏｆＬＩ　ｌ
＃′ｒ片として含肩する。 次【、上記のＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに挿入し
、今度はこのベクターを用いて両孔類セルラインをトラ
ンスフェクトした。この発明の実施において使用するた
めの発現ベクターはトランスフェクトされた晴乳類細胸
中で外米性遺伝子の転写を指令することができるプロモ
ーターＹｒ：　含１ｖ　テ成るであろう。ウィルス性プ
ロモーターが、転写を指令するそれらの効率のために好
ましい。特に好ましいこのようなプロモーターはアデノ
ウィルス２からの主要後期（ｍａｊｏｒ　１ａｔｅ　）
プロモーターである。このような発現ベクターはさらに
、プロモーターから下流であり、且つ血液凝固のための
生物学的活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の挿入
部位から上流に位ｉｎする１咀の複数のＲＮＡスプライ
ス部位を含有するであろう。好１しイＲＮＡスプライス
部位配列はアデノウィルス及び／又は免疫グロブリン遺
伝子から得られるであろう。 さらに１発現ベクター中には前記挿入部位の下流に位置
するポリアゾニレ−ジョンシグナルを含有スル。ウィル
ス性Ｉリアｆニレーク、ンシグナル、例えば５ｖ４０か
らの初期もしくは後期ポリアデニレーションシグナル、
又はアデノウィルス５：ｇＩｂ領域からのポリアゾニレ
−ジョンシグナルが好ましい。特定の好ましい態様にお
いては１発現ベクターはさらに、プロモーターとＲＮＡ
スプライス部位との間に位置するウィルスリーダー配列
１例えばアデノウィルス２トリ・Ｌルタイトリーダーを
含有する。好ましいベクターはさらに、エンハンサ−配
列１例えばＳＶ４０工ｙハンサーを含イイすることがで
きる。 次に、クローン化されたＤＮＡ配列を、リン酸カルシウ
ム介在トランス７エクシ、ンにより、培養された１乳動
物細胞に導入する。（Ｗｉｇｌｅｒ等。 （’＠ｌｆ　、　１４　：　７２５　、１９７８　：　
Ｃｏｒａａｒｏ及び１９８１　：　Ｇｒａｈａｍ及びＶ
ａｎ　ｄｅｒＥｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。 ５２　、４５６　、１９７３゜）　ＤＮＡ及びリン酸カ
ルシウムの沈澱を生成せしめ、そしてこの沈殿を細胞に
適用する。細胞の一部がＤＮＡを取り込み、ぞしてそれ
を数日間紙川内に保持する。細胞の小画分（典型的には
１０　）がＤＮＡ　ｆｔｒツムに安定に取り込む。これ
らの安定な取り込みを同定するため、一般に、選択可能
な表現壓（選択マーカー）を付与する遺伝子を目的遺伝
子と共に導入する。好ましい選択マーカーには薬剤例え
ば（２−４１８及びメトトレキセートに対する耐性を付
与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは目的遺伝子と
同時に別個のプラスミドにより細胞に導入ルてもよく、
又はこれらを同じプラスミドにより導入してもよい。 好ましい選択マーカーは薬剤Ｇ−４１８に対する耐性の
遺伝子であり、これはプラスミドｐＫｏ−ｎｅ。 上に担持されている（　５ｏｕｔｈｅｒｎ及びａｅｒｇ
　。 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　ｐｌ、　Ｇ＠ｎｅｔ、　、　Ｌ　
：　３２７−３４１　。 １９８２　）。細胞に導入される混合物に１キヤリヤー
〇ＮＡ”として知られている追カロのＤＮＡを添加する
ことも有利である。細胞がＤＮＡを取り込んだ後。 これらを一定期間、典型的には１〜２日間増殖せしめて
、目的遺伝子の発現を開始する。次に薬剤選択を適用し
て選択マーカーが安定に発現している細胞の増殖につい
て選択する。これらの７０１胞のクローンを、目的蛋白
質の発現についてスクリーニングする。 形質転換され念細胞により生産されたファクター４及び
ファクター■は、クエン酸バリウムへの吸着によ＃）細
胞培養培地から＊、Ｖ出す。ス（ント培地をクエン酸ナ
トリウム及び塩化バリウムと混合し、そして沈澱を集め
ろ。次に、沈澱した材料を該尚する凝固因子の存在につ
いて測定する。免疫吸着によりさらにａ：ｉｖ　ｓする
ことができろ。免疫吸着カラムは高特異性モノクローナ
ル抗体を含んで成るのが好ましい。別の方法として、ク
エン酸バリウムにより沈澱し友材料のＨ製は、−ｊｄ一
般に期用されている生化学的方法により、又は高速液体
クロマトグラフィーにより行うことができる。 単鎖ファクター■の活性な２本領ファクター■ａへの転
換は、Ｈ＊ｄｎｅｒ及びＫｌｍｊｅｌ　（Ｊ。 Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ　　、７１　　：　１８３６−
１８４１　．１９８３）により記載されているようにフ
ァクターＭ息を使用して、又はトリグシン様特異性を有
する他のグロテアーゼ（Ｋｌｍｊｅｌ及びＦｕｊｌｋａ
ｗａ　、　ＢａｈｒｌｎｇＩｎｍｔ、　Ｍｉｔｔ、　７
３　：　２９−４２　、１９８３　）により達成するこ
とができる。 以下余白 要約すれば、この発明は形質転換された哺乳動物細胞を
用いてビタミンに依存性血痕凝固因子の活性を有する蛋
白質を製造する方法を提供する。 凝固因子の特定のセリングロテアーゼドメインｔコード
する遺伝子配列はｃＤＮＡクイ１ラリ−から単離される
。リーダー配列及びカルククム結合ドメインｔコードす
る配列はｅＤＮＡもしくはｒツムライブラリーから単離
され、又は合成され念オリプヌクレオチドから造成され
る。次に、これらの配列を適当な発現ベクター中で連結
して、血液凝固のための所望の生物学的活性を有する蛋
白質ｔコードすゐようにする。得られるベクター、及び
薬剤耐性マーカーを含有する！ラスミドを適切な哺乳類
組織培養細胞に同時トランスフェクトする。 次に、トランスフ、クトされた細胞な適当な薬剤、例え
ばＧ−４１８’に添加することによシ選択する。次に、
蛋白質生成物を血液凝固アッセイにおける生物学的活性
について測定し、ま九真正なヒト凝固因子に対して調製
された抗体を用いて免疫学的交差反応性について測定す
る。 次に記載する例を要約すれば１例１はファクター■の十
分な長さのｅＤＮＡ配列のクローニングを開示する。例
２．は、アミノ酸末端の約３０個のアミノ酸を含む、ヒ
ト−ファクタ■の部分アミノ酸配列を開示する。例３は
ヒトーｒツムＤＮＡライブラリーの造成及びスクリーニ
ング、並びにファクター■遺伝子配列を含んで成るｒツ
ムクローンの同定を開示する。例４は、ファクター■の
リーダ−ペプチドをコードするｅＤＮＡ断片及び響ルク
ウム結合ドメインをコードする合成２本積断片をそれぞ
れが含有する２ｍ類のハイグリドセグメントの造成を開
示する。次に、ハイ１リド配列ｔファクター■の部分的
＋！ＤＮＡクローーンに連結する。 次に、イン−ビトロ変異の訪発を用いて、コンセンサス
配列ｔファクター■の蛋白質配列ｒ−夕に一致するよう
に変形し友。例５は、ファクター■のカルクラム結合ド
メイン及びファクター■の特異的セリングｐテアーゼド
メインを含んで取る融合蛋白質をコードする遺伝子配列
の造成を記載する。、第６図は、トランス７８クトされ
次呻乳類細胸中で血液凝固の穴めの生物学的活性を有す
る蛋白質を発現するのに使用するベクター、Ｄ２の造成
を記載する。例２に記載する遺伝子融合体はこのベクタ
ーケ用いて発現される。例７は、形質転換された哺乳類
細胞系中でファクター■の遺伝子を発現するｔめのベク
ター、Ｄ２の使用を記載する。 例８は、ファクター■に融合し次ファクター■のリーダ
ー配列を含んで成る一次翻訳生成物ｔコードするＤＮＡ
配列を含有するベクター、Ｍ７１３５の造成を記載する
。このベクターはトランスフェクトされた哺乳類、１１
１１Ｉ胞系においてファクター■の活性ン有する蛋白質
を生産する究めに使用することができる。例９はｃ　Ｄ
ＮＡ配列を使用する７γクター■の発現、及びｒツムＤ
ＮＡ−ｅＤＮＡバイブリド配列からのファクター■の発
現′Ｉｔ記載する。 次に例によシこの発明をさらに具体的に説明するが、こ
れによシこの発明の範囲を限定するものではない。 （例） 制限酵素はベセスダ・リサーチ・？ｄｅラドリーズ（Ｂ
ｅｔｈ＠ａｄｍ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　：　ＢＲＬ　）。 及び二、−・イングランド・パイオラツス（Ｎ＠ｗＥｎ
ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｍｂｍ　）から入手し、そして特
にことわらない限シ製造者の指示に従って使用し友。 オリがヌクレオチドはアゲライド・パイオシステｂス（
Ａｐｐｌｉ＠ｄ　Ｂｉｏｓｙａｔ＠ｍｓ　）モデ／Ｌ／
３８０Ａ　ＤＮＡ合成機により合成し、そして変性ゲル
上での／　ＩＪアクリルアミド）ｆ／Ｉ／電気泳動によ
シ精製した。 Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｔ　）の形質転換はＭａｒｉＩａ
ｔｌ−等コールド・スゲリング・ハーバ−・う♂ラトリ
ー。 １９８２）によシ記載され次男法によシ行りた。 Ｍ１３及びｐＵＣクローニングベクター、並びに宿主株
はＢＲＬから入手し九。ファクターＷはＫ１５ｉｅｌ及
びＭｃＭｕｌｌ＠ｎ　（前掲）によシ記依され元方法に
よ）ヒト血漿からｖＩ４裂し念。 １８４５−１８４８．１９８３の方法によシ、ヒトー肝
Ｊｌｉｌ　ｍＲＮＡからｅＤＮＡライブラリー’ｔ’ｓ
製し１ａＤＮＡ調製物をアルカリ性シューク四−スグラ
ゾエント（Ｍｏｎａｈａｎ等、旧ｏｃｈｅｍｌａｔｒｙ
　＃　１５　：２２３−２３３．１９７６）によシ沈降
せしめ、そして約１０００ヌクレオチド以上のポリヌク
レオチドを含肩する画分をプールし九。第−鎖ａ１４製
物を逆転写ｒｓ素を用いて２本鎖にしく　Ｃｈａｎｄｒ
ａ等、１９８３）８１ヌクレアーゼで処理し、そして残
留する接着末端を４ｓ類すべてのデオキ７す？ヌクレオ
チドトリホスフェートの存在下でＤＮム拘メ４ヤＩ　（
Ｋ１＠ｎｏｗ断片）を用いてフィル−インＡ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−，１９８２）。平滑末端化さ
れたｅＤＮＡ　ｆ：　ＥｃｏＲＩメチ２−ゼで処理し、
そしてＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いてリン敵化されたＥ
ｃｏＲ［リンカ−に連結し−ｚ　（Ｍａｎｌａｔｉｓ等
、前掲）。 連結され７’ｊＤＮＡ調製物をｇｏｏＲｆにより十分に
消化して過剰のリンカ−配列を除去しそして約１０００
塩基対よ〕長い２本＠　ＤＮＡを中性り、−りμｍスグ
ラジエント遠心によシ精製した（Ｍ龜ｎｌａｔｉｍ等。 前掲）。天然λｇｔ　１１　ＤＮＡコンカテ−ｒ　−（
ｅｏｎｃｍｔ＠ｍ＠ｒ）に連結し、そしてＥｃｏＲｒに
よシ完全消化し、そして５′末端のす／α”ｒａｔｍ性
アルカリ性ホスファターゼ処理によシ除去した。プール
されたヒトー肝ｊ１偵ａＤＮＡ　Ｙ：ファージＤＮＡに
連結し、イン−ビトロでノ臂ツケージしく　Ｍａｎｌ鳳
ｔｌｓ等、前掲）、そしてこれｔ用いてＥ、コリＹ　１
０８８　Ｋ感染させた（Ｙｏｕ■１９８３）。この２イ
グラリーにおいて約１４８１０’個の一次７ァージグ２
−りが生じｔｏこれは約２×ｌＯ個ずつの７つのライブ
ラリーから成る。 これらの９０係以上がヒトＤＮＡ挿入部？含有する組換
体であった。この結論はβ−ガラクトクダーゼ活性の欠
失、並びにｇｃｏＲＩによる２０個の無作動クローンの
消化及びこれに続くアガロースゲル電気泳動による特虞
付けによるものである。７ア一ジ粒子の形のａＤＮＡラ
イ１９リーを塩化セフラムグラジェント遠心分離によシ
梢製し、そして８Ｍ緩衝液（Ｍａｎｌｍｔｌｍ等、前掲
）中に貯賦し几。 Ｂ、ヒトー肝蔵ｃＤＮＡライブラリーのファクタ前記の
ヒトー肝臓発１）ＬｃＤＮＡ　：ライブラリーｔ。 精製されたファクターＶＩＩＩを用いてＢｒｏｗｎ等（
Ｊ、　ＢＩｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ、　、　２２５　：　４９
８０　４９８３゜１９８０）の方法によ）調製し次、　
　■−２ベルされたモノクローナルファクター■抗体を
用いて特異的抗原についてスクリーニングしｆｔ　（Ｙ
ｏｕｎｇ及びＤａｖｌｓ＊前掲）。６　Ｘ　１０　個の
ファージグラークのスクリーニングによシ、抗体に対し
て陽性反応を与える１個の単離体が同定され友。 これｔλ■２１１５と称する。 この７丁−ノクローンλ■２１１１／、他１７）２４３
ｍ類の抗−フアクタ−■モノクμｍナル抗体、及びファ
クター■に対するラビットポリクローナル抗体に対して
試験した。単離体λ■２１１５はこれらすべての抗−フ
ァクター独抗体に対して陽性反応乞示した。 λ■２１１５のグレート溶菌物（１ｙｓａｔ・）（Ｍａ
ｎｌａｔｌａ等、６５−６６頁、１９８２）からＤＮＡ
　Ｙ調製し友。このＤＮＡンｇｅｏＲｆ　　で消化する
ことによシ２１３９塩基対の挿入部が遊離した。 この挿入部’＆Ｍ１３７アージベクター（Ｍ＠＊ａＩｎ
ｇ。 及びＮｏｒｒａｎｄ＠ｒ等磨Ｇｅｎｅ　：　１０１−１
０６−１９８３）にサブクローニングしてチェインター
イネ−７゜ンデオ午７ＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇ・”４
　多Ｐｒｏ・１９７７）ｔ−行った。このｅＤＮＡ挿入
部は２１４位、８３９位、及び１２０５位にＰ農ｔ１部
位χ含有しくこれら’ｅ第１４図において、それぞれＰ
ｓｔ　ｌａ　、　Ｐｓｔ　ｌｂ及びＰｓｔ　Ｉ（＋と称
する）、そして６１１位に位置するＳｍｍ　１部位を含
有する。 次のＭ１３鋳型を配列決定し次。 以下余白 １）全長（２１３９塩基）　Ｅｇｏ　Ｒｌａ　−＋　Ｅ
ｃｏ　Ｒｉｂ断片。 Ｍ１３ｍｐ１８中（りｐ−ンＦ７−１と称する）；２）
　Ｐａｔ　ｌａ→Ｅｅｏ　Ｒｌａ　２１４塩基断片。 Ｍ１３ｒｎｐ１９中（ＩＦ７−２）； ３）　Ｐａｔ　ｌａ　４　Ｐａｔ　ｊｂ　６２５塩基断
片。 Ｍ１３ｍｐ１８中（ｒ７−３）： ４）　Ｐａｔ　ｌｂ　−＊　Ｐａｔ　１ｍ　６２５塩基
断片。 Ｍ１３ｍｐ１８中（Ｆ７−７）： ５）　Ｓｍｍ　ｌ　−＋　Ｐａｔ　ｌｂ　２２８塩基断
片。 Ｍ１３ｍｐｌＯ中（Ｆ７−８）： ６）　Ｐａｔ　　ｌｂ　−４Ｐａｔ　ｌａ　Ｑ６塩基断
片。 Ｍ１３ｍｐ１８中（Ｆ７−９）ニ ア）　Ｐｓｔ　ｌｃ　−＊　Ｐａｔ　ｌｂ　３６６塩ｊ
ｉ；ｉ断片。 Ｍ１３ｍｐ１８中（Ｆ７−１０）： ８）　Ｐｓｔ　ｌｅ→Ｅｃｏ　Ｒｌｂ　９３０塩基断片
。 Ｍ１３ｍｐ１９中（Ｆ７−１１）：　及び９）　Ｅｅｏ
　ａｌｂ　４　Ｅｃｏ　Ｒ１ａ全長断片。 Ｍ１３＋ｔ＋ｐ１８中（Ｆ７−１２）。 （制限部位の名称は第１Ａ図に関する。）このデータは
両組上の配列において９１慢のコード領域及び１５％の
３′非Ｍ４訳領域を確認し、そして残りのコード領域の
９チ及び非コード領域の８５％について単鎖配列情報を
も九らした。 ｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列と、Ｋ１５ｌ
ｓｌ　　及びＭｃＭｕｌｌｓｎ　　（Ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓ　　Ｒ５５ｅａｒｃｈ。 ２２　：　３７５．１９８１の既知のアミノ酸配列デー
タ及び下記（例２）のアミノ酸配列との比較によシ、Ｄ
ＮＡ配列中４００位の近傍の３個のヌクレオチドの不存
在によシ説明することができる異状が示され友。追加の
配列データを得るため、λ■２１１５　ｆ　ＥｃｏＲｌ
で消化し、そしてファクター■コード断片Ｙ、　Ｅｃｏ
Ｒｌによシ消化され友、ＵＣｌ３（Ｖｌｅｌｒａ及びＭ
ａｓｓｉｎｇ　＃　Ｇ＠ｎ＠ａ　１９　＊　　２５９−
２６８．１９８２；及びＭ＠ｍｓｌｏｇ−前掲）に挿入
した。、ＵＣ■２１１５と称する得られる組換ｌラスミ
ドを、３２８位で切断するＸｂｍｌで消化した。 消化され友サンダルを半分ずつに分け、半分ｔα”Ｐ　
ｄＣＴＰ及びＤＮＡ　／リメラーゼｌ　（Ｋｌｅｎｏｗ
断片）によシラペルしく　Ｅｔｌｇｌｕｎｄ　＃　Ｐ、
’ｒｅ　　ＪＭｏｌ、Ｂｉｏ−ｅ　　６６−２０９　ｓ
　１９７２　）、他方の半分’ｉ’ｒＰＡＴＰ及びポリ
スクレオチドキナーゼによシラペルし７２　（Ｃｈａｃ
ｏｎａｓ等ｅ　Ｂ　ｌ　Ｇ　１！　ｈ　＠ｒｌｌ　ｍ次
に、ラベルされたｆ２スミド’ｇＰｓｔｌによ）再切断
して１１３塩基対及び５０９塩基対の断片を得九。これ
らのそれぞれの断片の両組ｇＭａｘａｍ５６０．１９８
０）の方法によシ配列決定し友。 １１３塩基対はその全体にわ九りて配列決定し、セして
５０９塩基対断片中の２１０塩基対を配列決定した。こ
れらの配列はＤＮＡ配列ｒ−タｌ蛋白質配列ｒ−夕と一
致させる追加の３個の塩基（１個のＣ及び２個のＧ）Ｙ
示し、前記の異状な結果はＧ及び０％を含む二次裕造に
基〈配列決定ゲル上での圧縮によシ生じたことが示され
友。両組上のコード領域の最後の９ｆｂの配列も確認さ
れ次。 、ＵＣ■２１１５の配列ｔさらに分析することにより、
このクローン化断片がファクター■の開裂部位にあるこ
とが知られている１１アミノ畝の配列？コードしている
ことが確認された（　Ｋ１５ｌ・ｌ及びＭｃＭｕｌｌｓ
ｎ　ａ　Ｔｈｒｏｒｎｂｏｓｌｍ　Ｒ＊ｓ＠ａｒｅｈ　
、　２２　：３７５．１９８１）。この配列と７アクタ
ー■（Ｄ畠マ鵞・等、前掲）及びファクターＸ　（Ｌｅ
ｙｔｕｉ３６９９−３７０２．１９８４　）アミノ酸配
列との比較によシ、このクローンは成熟ファクター■蛋
白質のアはノ酸３６ｔフードするヌクレオチド（およそ
）から始まシおよそ１０００のコードヌクレオチド及び
１１００の非コードヌクレオチド並びにＩすＡ配列まで
続くファクター■の配列を含有することが示唆された。 さらに、このクローンは３′コード領域にフレームシフ
ト変異Ｙ：有していた。 正しい３′コード領域を得るため、７つのλｇｔｌｌａ
ＤＮ人ライブラリーの１．４Ｘ１０　個のクローンのす
べてをグラークハイツリダイ−１，！１７．ンにより１
８１．１９７７）、λ■２１１５のニック−トランスレ
ートされｆｅ−ｃＤＮＡχ用いてスクリーニングし几（
ＭａｎｌａＮｓ　２４　ｓ　１０９−１１２頁、１９８
２）。 次に、７個の陽性単離体を、ａＤＮＡ挿入部がサラクロ
ーニングされた。ＵＣｆ　’）スミドのジテオキク配列
決定法によりスクリーニングし７ｔ−（Ｗａｌｌａｃ・
等、Ｑ＠ｎ＠ｓ　　ｌｅ　　ａ　　２１　＃　　１９８
１　）。λｇｔ■クローンχＥｃｏＲ１で消化し、そし
てファクター■断片を、ＥｅｏＲｌで開裂され念、ＵＣ
ｌ３に挿入し友。 これらの１つを除くすべてがλ■２１１５中の挿入部の
塩基２１２に対応する位置から出発し、１個の例外は３
′非コード領域のみから成ることが見出され友。塩基２
１２から始まるりｐ−ンの１つを分析のために選択し、
クローン、ＵＣＶｌ　１９２３と命名した。 ｐＵＣ■２１１５の分析によプロ５７位と８１５位の間
にフレームシフト変異が存在することが示され念次め、
ｐＵＣ■１９２３１ｊ！：まずこの領域においてＭａｘ
ａｒｎ−ＧＩｌｂ＠ｒｔ配列決定法により分析し次。プ
ラスミド、υＣ■１９２３１ｋ　Ｎａｒ　Ｉ　（第ｌＡ
薗中７７９位）により消化し友。切断されたＤＮＡ　ｆ
ｆ　ＤＮＡポリメ２−ゼＩ　（Ｋ１＠ｎｏｖ［片）を用
いてα５２Ｐ　ｄＣＴＰによシラベルし、そして次にＡ
ｖａ　Ｉ　（辷れはｒｉＳ　Ｉ人口中Ｓｍｍ　ｌと同じ
部位を開裂せしめる）及びＴａｑ　Ｉ　（１０ｓ　９部
位）によシ消化してＮａｒ　ｌ−ＡＶ＆　ｌ　　１６６
ｂｐ断片、及び２００ｂｐＮｍｒｌ−Ｔａｑ　ｌ断片を
得た。これらのそれぞれを配列決定し友。、ＵＣ■２１
１５中で欠けているＣは６９７位に見出され、そしてや
は、り　ｐＵＣＭＩ　２１１５中で欠けている他方のＣ
は７９８位に見出され友。 ｐＵＣ■１９２３のコード領域の配列の残シの部分が正
しいことが、ｐＵＣ■１９２３の全挿入部のＭ１３サブ
クローン上でのジｒオキク法による配列決定によって示
された。ＬａｅグライマーＺＣ８７（第１表）を用いて
２１２位（第１Ａ図）から５１２位ま、での配列を決定
し、グライーｒ−ＺＣ２１８（ＣＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣ
ＧＡＡＣ）　’＆用いて７１５位から１１４０位までの
配列を決定し、そしてブライマーＺＣ２１７（ＡＴＧＡ
ＧＡＡＧＣＧＣＡＣＧＡＡＧ　）Ｙ用いて７２０位から
３５０位までを配列決定した。、ＵＣＷ２１１５挿入部
は１３位から６９５位まで正しく（１−１２位は人工的
り／カーを含む）、そしてｐＵＣ■１９２３は２１２位
から最後まで正しいので、この２者を継ぎ合わせて１３
位（第１Ａ図）から最後まで正しい分子を得友。この継
ぎ合わせの次めに用いられる便利な点は３２８位のＸｂ
ａ１部位である。継ぎ合わされ比圧しい分子ン第１Ａ図
に示す。 十分な長さのファクター■クローンｆ　ｃＤＮＡクロー
ニングによって得ることは困舖でｈ　ｖ　ｆｔから、欠
けているコード配列、並びに必要なプロセシング及びシ
グナル配列を得るために３つの方策を採用し次。Ｍｌの
方策はヒトゲノムＤＮＡライブ２リーから、又はａＤＮ
Ａライブラリーの追加のスクリ第２のアゲ四−チは、フ
ァクターＷのアはノ改配列データ（例２）及びビタミン
に一依存性凝固因子の公表されている配列（Ｋｕｒａｅ
ｈｌ及びＤｉｖｅ・を前掲；及びＤａマｔ＠等、前掲）
に基いて必要な５′コ一ド配列を合成し、そしてこれン
ファクター■のグレグロ配列の部分に連結することでお
りｆｐ−０第３の方策はファクター■とファクター■の
アミノ末端の機能的類似性Ｉｌｃ基〈。ファクター■の
ｙ−イー及びアミノ末端部分のコード領域を含んで成る
配列を造成し友。次にこれを部分的ファクター■ｃＤＮ
Ａに適切な方向に融合せしめ友。 ファクター■の完全Ｉ）ＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配
列を得る次め、ＴＡｂの５’　ＤＮＡ配列を単離するこ
とを試み次。これは、λ■２１１５のｅＤＮＡ挿入部か
らの５′末端Ｑ、３　ｋｂ　ＥａｏＲｌ　−Ｘｂａ　ｌ
断片を用いて２Ｘ１０７アージから成るｃＤＮＡライブ
ラリーｔスクリーニングすることによって行った。 Ｇａｂｌ＠ｙ及びＨｏｒｆｒｎｍｎ　（Ｇ＠ｎ＠２５　
：　２６３−２６９゜１９８３）の方法を適用してＨ＠
ｐ　Ｇ２　、！ｌｌ胞からの１βす（４）ｍＲＮＡを用
いてライブ？リ−）Ｌ’造成し次。 ＲＮＡ　Ｙ逆転写して第１鎖ｃ　ＤＮＡを生成せしめ、
次にＤＮＡ　／リフ２−ゼ！及びＲＮアゼＨＹ用いて第
２鎖の合成χ行った。ｌｉ：ｃｏＲ１メチル化及８ファ
ロース６Ｂカラムの通過の後、　Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼン用いてＤＮＡ末端ン平滑化した。ＥｃｏＲ１リンカ
−を付加し、そして過剰のリンカ−′ｌ！：ＥｃｏＲＪ
による消化及びセファｐ−スＣＬ　２Ｂ上でのクロマド
グ２フイーによシ除去し友。？イドゲリウム中のＤＮＡ
　Ｙ集め、セしてＥａｏＲｌで消化されそしてクシ腸ホ
スファターゼで処理されたλｇｔ　１１　　に連結し九
。このＤＮＡ　ｇノナッケージし、そしてＥ、コリＹ　
１０８８中に感染させた。幾つかの１易性クローンが観
察され、そして次にＥａｏＲ［断片＠Ｍ１３ファージベ
クターにサブクローニングし、そしてＭ１３ユニパ〜す
／Ｉ／７’ライマー又はファクター■特異的オリコ°ヌ
クンオテドを用いて−，）７′オキシ配列決定を行つ几
・ これらからファクター■のｃＤＮＡクローン３個を得、
そしてこれらの配列を完全に決定し友。 λ■２４６３と称するクローンからの、これらのｃＤＮ
Ａの内最長のものはファクター■の完全なコード配列を
含有することが見出された。このクローンは、３５文ク
レオチドの５′非ｂＡ訳領域、６０アミノ酸のリーダー
をコードする１８０ヌクレオチド、４０６アミノ酸の成
熟蛋白質ｔコードする１２１８ヌクレオチド、終止コド
ン、３′非翻訳領域の１０２６ヌクレオテド、及び２０
塩基のポリ（４）テイル（２４６３位から始まる。）ヲ
含有していた。このｃＤＮＡ　’ｆ両鎖について完全に
配列決定した。これと、クローンλ■２１１５及びλ■
１９２３から前に単離した２つのａＤＮＡとの比軟によ
シ、クローンλ■２４６３はλ■２１１５中の挿入部の
上流に追加の３２１個のヌクレオチドを含有し、そして
λ■１９２３中の挿入部の上流に５１９ヌクレオチドン
含有することが示された。λ■２４６３ａＤＮＡ及びこ
れら２つのｃＤＮＡのファクター■配列のオーバーラッ
グが認められた。但し、λ■２４６３のｃＤＮＡは、λ
Ｖ１１２１１５のａＤＮＡ中に検出される１００５位及
び１１０６位における単−塩基欠％、含まない。従って
、λ■２４６３は単一のｇａｏＲ１断片上にファクター
■リーダー及び成熟蛋白質配列をコードするファクター
■ｃＤＮＡＹ含有する。 追加のｃＤＮＡ　ｆ　彦わちλ■５６５ヲ単敵した。そ
してこれは５′末端フアクタ一穆配列を含有するが、し
かしコード配列内で切断されていることが西！スされ友
。その５′末端はヌクレオチド９に位置する（第１８図
）お 十分な長さのλ■２４６３と比較した場合、λ■５６５
はリーダー配列内の１つのエクソン様領域に対応する配
列を欠くことが見出され次。塩基１０〇−１６５がλ■
５６５には存在しない（第１Ｂ図）。 この存在しない配列は、ゲノム配列データ（例３中に記
載されている）との比較によシ、１つのエクソン様領域
に正確に対応する。従って、λ■５６５はリーダー配列
中での択一的なスプライン／が現象の結果であろう。 λ■２４６３によシコードされるリーダーは非常に長く
（６０アミノ酸）、そしてファクター■、グロテインＣ
及びグロスロンビンと比軟し次場合非常に異る疎水性プ
ロフィールを有する。このリーダーは一６０位及び−２
６位に２個のＭ＠ｔｔ名有する。シグナルペグテドに典
形寅な疎水性領域は一２６位のＭａｔではなく一６０位
のＭ・ｔに欣くので、！４１ｏＭｅｔから開始されるよ
うである。ゲノムクローン中のエクソン鶴領域に正確に
対応する、λ■５６５中の不存在領域が上記の蛋白質に
一層類似し九疎水性パターンを有する３８アミノ酸リー
ダーχもたらすことは興味あることである。 仮定的なｅＤＮＡクローンの同定を確認し、ファクター
■ｃＤＮＡの配列を実証し、５′配列を含有するクロー
ンについてｅＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリ
ーをスクリーニングする九めの特異的オリがヌクレオチ
ドグローブの合成′？！−可能にする情報を得、そして
ファクター■のアミノ末端部分ｔコードする合成断片を
造成するために、ヒト−ファクター■のアミノ酸配列Ｚ
解明することが望ましい。Ｋ１５ｌｓｌ及びＭｅＭｕｌ
Ｌｅｎ　（前掲）によシ限られたアミノ酸配列が与えら
れ九が、よシ多くの情報が必要であった。 精製されたヒト−７アクターＶｌｌａ（Ｋ１５ｌｓｌ及
びＭｅＭｕｌＬｅｎ　ｅ前掲）を還元し、そしてＣｒｓ
＊ｔＨ＊１ｄ等、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ、　、
　　２３８　、６２２゜１９６３の方法によシカ／ｌ／
　Ｍ　Ｊ？クメテル化し友。 カルメキクメテル化されたファクター１／ｌｌａのライ
トポリイグテド鎖及びヘビーポリペグチド鎖ン、ずクロ
ノ４ツクＣ１８逆相カラム（バリアン社）上で高速液体
り四マトグ２フィー（ＨＰＬＣ）によシ分離し次。この
場合、蒸留水中０．１　饅ＴＦＡ（Ａ）、及びアセトニ
トリル中０．１チＴＦＡ（Ｂ）を用いて、５分間に０〜
４０１ＯＢ、２５分間に４０〜８０％（１りＢ、及び５
分間に８０〜１００％のＢから成るグラジェントによシ
溶出し九。約３００　ｐｍｏｌ・の各イグチド鎖な、ガ
ス−フェーズ・クロテイン・シーケンサ−（アゲ２イド
・バイオシステムス社）を用いて自動化されたエドマン
分解によシ分析した。ヘビーポリペグテド偵及びライト
？リペグテド鎖のアミノ末端において、それぞれ１８残
基及び２９残基が同定された。ファクター■ａのヘビー
鎖のアミン末端配列はｅＤＮＡクローン、ＵＣ■２１１
５によシ推定されるそれ（第２Ｂ図）と一致し次。アミ
ノ酸配列は第２Ａ図及びｍ２Ｂ図中で１文字ニードによ
シ次のように示される。 以下余白 Ａ　　　　　アラニン Ｃシステイン Ｄ　　　　　アスパラギン酸 Ｅ　　　　　ゲルタイ／酸 Ｆ　　　　　フェニルアラニン Ｇ　　　　　ダリクン Ｈヒスチジン ！　　　　　イソロイシン Ｋ　　　　　リジン Ｉ、　　　　　　ａイクン Ｍ　　　　　メチオニン Ｎ　　　　　アスパラギン Ｐ　　　　　　クロリン Ｑ　　　　　グルタばン Ｒア、Ａ／イエン Ｓ　　　　セリン Ｔ　　　　　スレオニン Ｖ　　　　バリン Ｗ　　　　　　トリプトファン Ｙ　　　　　チロシン Ｘ　　　　　未知残基 ｔた、＊は、既知の凝固因子の構造との類似性及びこれ
らの位置における他の７エールテオヒダントインーアミ
ノ酸の不存在によシ、Ｇｌａ残基（ｒ）が割尚てられ九
。配列間の最良の整列を与える九めにギャップ（→が置
かれている。さらに、この情製は、５位及び９位のアミ
ノ酸がリジンであって、すでに報告されている（旧ｍｌ
・ｌ及びＭａＭｕ　ｆｌ＠ａ　。 前掲）ように、それぞれスレオニン及びアルギニンでは
ないことｔ示し友。ファクター■のアミノ末端領域に由
来するファクター■ａのライト鎖の配列分析はｅＤＮＡ
クローンｐＴＪＣ■２１１５の５′末端によシコードさ
れた構造とオーバラッグするのに約６１Ａ基不足してい
た。 追加の配列ｒ−タを得るため、２ｎｒｎｏｌ・のカルが
キシメチル化されたライト鎖’ｋ　Ｏ，Ｉ　Ｍ炭酸水素
アンモニウム中ｐＨ７，８，３７℃にて１２時間、ラフ
−キモトリブタン（１：１００ｗ／ｖ、酵素：基質）に
よシ消化し友。生じ次断片？！−ミクロパックＣ１８逆
相カラム上でのＨＰＬＣによシ精製した。 前記の溶剤？用い、５分間で０〜３０％のＢ。 ２５分間で３０〜６０係のＢ、及び１０分子ｌ＋Ｉで６
０〜８０ｓのＢから成るグラジェントによシ溶出し次、
ポリベグテドｔ、その２２０　ｎｍ及び２８０ｎｍにお
けるＷ吸収によシ同定し次。凍結乾燥されたペグテド（
約１ｔ＋ｍｏｌｅずつ）をエドマン分解によシ分析し次
。その結果（第２Ｂ図）は、クローｙｐＵＣ■２１１５
の対応領域中のａＤＮＡ配列の多くｔ確認した。ファク
ター■ａのライト鎖イプデドの１５２残基中合計１１３
残基（７５チ）が同定された・この配列は知られている
ａＤＮＡ　構造によシコードされるそれと同一である。 間接的証明によシ、Ａｇｏ　１４＄が炭水化物付加部位
であることが示される。 ｃＤＮＡに欠けている５′末端配列を得るためのｌりの
アプローチとして、ヒト胎児肝臓ＤＮＡ　Ｙ含むλフア
ージライブラリー（Ｌａｗｎ４！３；、　Ｃａ１ｌ　、
　１５：１１５７−１１７４）ン、ニックトランスレー
トされたファクター■ｃＤＮ人によシスクリーニングし
几。ゲノムライブラリーの一部χＥ、コリＬＥ３９２　
（ＡＴＣＣ３３５７２）上にグレートして合計７．２Ｘ
１０　個のグラ−クン化じさせｆｉ　（Ｍａｎｌａｔｌ
ｓ等、前掲、３２０−３２１頁）。ファージグラークを
グレートからニトロセルロース上にａ着せしめ、そして
Ｂ＠ｎｔｏａ及びＤａｖｉｍ　（５ａｌｅ＋ａｃｖ　、
　１９５：１８０．１９７７）の方法に従りて、　ｐ−
ｙベルされｆｔ−ｅＤＮＡとハイブリダイズせしめた。 ８個のクローンを得、そしてプラークを精製した。 ファクター■ｅＤＮ人（λ■２１１５　）の５′末九か
らのＤＮＡ断片（ＥｅｏＲｌａ　−Ｘｂａ　ｌ　＃　ｍ
　１図）及び標準的方法（Ｍａｎｌａｔｌｍ等、前掲）
を用いて、５′末末端列χ含有するｒツムクローンを同
定した。 これらのファージＹ７ｍｌ、７ｍ３、及び７ｍ３と命名
した。これらの組換体ファージからＤＮＡを調製し、そ
して予備的なエンドヌクレアーゼ地図を得た。最も強い
ハイプリダイゼーク四ンシグナルを与える７ア一ジ７ｍ
ｌ’ｇ用いて一層広範囲制限地図を作成し、そしてＥｃ
ｏＲｌ　−Ｘｂａ　１ｃＤＮＡ断片ｔサザンプａｙティ
ング（５ｏｕｔｈｅｒｎ　、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、。 ９８：５０３，１９７５）によシこの地図上におい九〇 ファーシフｍｌがファクター■蛋白質のアミ・ノ末端ア
ミノ酸をコードするＤＮ人配列ン含有するか否かを決定
する友め、７アージＤＮＡ制限消化物のサザンプロット
ｔ、その配列がファクター■アミノ末端アミノ酸配列か
ら推定されたオリゴヌクレオチドの混合物とノ１イプリ
ダイズせしめた。オリがヌクレオチドｚＣ１８８、ＺＣ
３６０、及びＺＣ４０１（力１表）７Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いて放射性ラベルし、そしてそれらの
’ｒｍ以下て数℃において７アーノＤＮＡ　ｆ　Ｉｆラ
クトハイブリダイズせしめた（　Ｗａｌｌａｃ＠、　Ｒ
，Ｂ、等、　Ｎｕｅ、Ａｅｌｄｓ。 Ｒ＠１．−６　：　３５４３−３５５７．１９７９　）
　。この分析の結果によシ、７ｆＥ１１の３．７　ｋｂ
　Ｓａｔ　ｌ　＠片がこれらのオリゴヌクレオチドとハ
イプ−リダイズする配列を含むことが示された。このＳ
ｓｔ１Ｍ片Ｙ　ＤＮＡ配列分析のためＭ１３にサックロ
ーン化し次。配列決定用プライマーとしてＺＣ３６０Ｙ
用いて得られｔ結果によシ、アミン末端蛋白質配列デー
タに対応するおよそ６０ヌクレオデドの長さの領域が同
定された。 以下余白 ｒツムクローン７ｍｌはエクソン２の上流の７ｋｂ配列
を含有することが知られた友め、このクローンはファク
ター■５′非翻訳配列及び−１７位のアミノ酸までのリ
ーダー配列を含廟するものと予想された。ｒツムクロー
ン７ｍｌ内にエクソ／１がコードされていることヲ確認
する友め、クローンλＷ　２４６３及びλＶｌｌ　５６
５からのリーダー配列情報を用いて下に示すオリゴヌク
レオチドＺＣ５２ｇ及びＺＣ５２９？：設計した。 これらＹ用いて７ｍ１ＤＮＡ’Ｌ’グローブし、そして
サブクローン７ＳＤが両オリゴヌクレオチドとハイブリ
ダイズすることが見出された。エクソンｌは２個のエク
ソン性配列、すなわちＺＣ５２８（λ鳩２４６３中ヌク
レオチド１〜３０に対応する）にハイブリダイズするエ
クソンｌａ、及びＺＣ５２Ｂ。 （λ■２４６３中ヌクレオチド１１９〜１４８に対応す
る）にハイブリダイズするエクソン１ｂから成ることが
決定された。エクソン１ｍ及びエクソン１ｂの両者ン挾
むイントロン配列が配列決定された。ｌａは該エクソン
の３′末端にコンセンサススゲライスドナー配列な含み
、そしてｌｂは各末端においてコンセンサススプライス
アクセプター（ｌｂの上流）又はドナー（ｌｂの下流）
配列を官有する。ケノムクｐ−７７ｍ１内のエクソン１
ｍの位置は正確にマツプされたが、エクソンｉｂのそれ
は定義された領域内にマツプされ友。エクソン性配列１
ｊはλ■２４６３中に存在し、他方λ■５６５は１ｂ工
クソン配列ｔ、／Ｉ／−ピングアウトしてエクソン１ａ
とエクソン２とのｊｌ、ｊでスプライスされたＲＮＡに
由来するようである。 、ＵＣ及びＭ１３ベクター中のｄ々の７ｍｌサブクロー
ン’ａ−調製して残りのエクソンの配列決定を促進した
。エクソ／１〜７に対応する、ｅＤＮＡ配列から設計さ
れ友適当なオリゴヌクレオチドｌ：Ｆｒｊいて最終エク
ソン以外のすべて音配列決定した。ｒツム配列はこれら
の領域にわたるａＤＮＡ配列に正確に対応する。さらに
、エクソン１〜７のイントロン／エクソン境界が決定さ
れ、そしてほとんどがクローン７ｍｌ内に正確に配置さ
れる。ファクター■遺伝子内のイントロンのサイズ及び
位置ン第２表に挙げる。 第２表 Ａ　　　　　　　−３９＞０．２ Ｂ　　　　　　　−１７＞１．０ Ｃ３７／３８　　　　　　　１．９２ Ｄ　　　　　　　　４６　　　　　　　０．０６８Ｅ　
　　　　　　　８４　　　　　　　″２Ｆ　　　　　　
１３１　　　　　　″ＩＧ　　　　１６７／１６８　　
　　　　　０．５６Ｈ２０９１，３１ 以下余白 ファージ７ｍｌはエクソン８を含むファクター■３′末
端！欠くことが知られた。これらの配列を得るため、ヒ
ト皮膚−次線維芽細胞由来のλＬ　４７．１（Ｌｏｅｎ
ｓｎ及びＢａｍ１ｌｌ　＊　　Ｇｏｎ＠、　１０　ａ　
２４９　＊１９８０　：　Ｍａｎｌａｔｌｍ　Ａ５　、
前掲）中１２〜１３ｋｂが編線されたＢａｍ１ｌｌ　ラ
イブラリー乞２８１ｍのニックトランスレートされたフ
ァクター■’ｃＤＮＡＰａｔ　ｌ断片（エクソン７中の
配列及び３′非翻訳配列に対応する）によりグローブし
た。内グローブによ、ｉり７ＤＣ１と称するクローンが
検出された。これに続く制限エンドヌクレアーゼ分析及
びサザンプロット分析によシ、クローン７０Ｃ１はクロ
ーン７ｍｌとオーバラッグし、そしてその末端の技に約
３ＳＦｂ伸びること、及びこのものはエクソン８を含む
ことが確立された。エクソン８ン官有する７ＤＣＩ　　
ＤＮＡからの３．９　ｋｂ　（Ｘｂａ　ｌ　−ＢａｍＨ
Ｉ　）断片ｙｌ！１−Ｍ１３にサブクローニングし、そ
してその５′及び３′末交１ｊに相補的なオリゴヌクレ
オチドを用いて配列分析を行った。完全なエクソン配列
がこのクローン中に存在する。 例４０合成ココード列χ含有するファクター■−ファク
ター■の５′コ一ド配列を得るためのＦＡ＆２の方法は
、ファクター■のアミノ末端アミノ酸配列、他のビタミ
ンに一依存性凝固因子のアミノ酸配列、及び他のビクば
ンに一依存性凝固因子遺伝子（Ｋｕｒａｃｈｉ及びｊ）
ａｖｌｅ　＊前掲；　Ａｎａｏｎ　％　。 及びＤ息マ鵞・等、前Ｊ４）に基いて進定されるヌクレ
オチド配列を用いて適当な２本餉断片を合成することで
８り几。成熟ファクター〜Ｉｎ似体の分泌の■ｃＤＮＡ
クローン由来の２つのリーダー配列の１つに述結し友。 このストラテジー乞第３図中に要約する。 ヒト−ファクターに’ｌｔブードするｃＤＮＡ　’％：
ヒトー肝１；威からのｍＲＮＡから造凧されたライブラ
リー（Ｋｕｒａｃｈｉ及びＤａｖｌｅｓ前掲）から得友
。ファクター■配列を、ＢＲ３２２ベクターからＰａｔ
　Ｉ消化によシ単熱し、そしてｐＵＣ１３のＰａｔ　１
部位に挿入した。このプラスミドＹ　ＦＩＸ　−、ＵＣ
１３と命名し次。ｃＤＮＡクローニングの結果としてフ
ァクター■挿入部の５′末端に存在するＧ　−ＩＪッテ
領域を除去するため、合成オリがヌクレオデドアダプタ
ーによりクローン化所片の５′末尾を置倶した。 オリがヌクレオチドＺＣ２１２及びＺＣ２１３（第１表
）を合成し、そしてこれら馨アニールして２２塩基対オ
ーバー２ツグ乞生じさせ、断片の末Ｉ４ｉ馨フィルーイ
ンし、そして適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、
そして得られた断片ｔファクター■配列に連結し友。 アダプターを造成するためｓ　１００１００ｐ＠ずりＯ
ＺＣ２１２及びＺＣ２１３’に凍結乾燥し、そして１０
μｌのＩＯＸキナーゼ／リガーゼ緩ｔｌｉ　＆　（６０
０ｍＭＴｒｉｍ　、　ＩＪ（３，Ｑ　、　１００ｍＭ　
ＭｇＣｌ２．１００ｎ１００ｎ　）及び８６μｊの水中
に再ｇ＋濁した。アニール反応？６５℃にて１０分間行
い、この混合物を徐々に室温に冷去し、そして氷上に置
い友。この混合物に４μｌの２．５　ｍＭ　ｄＮＴＰ混
合物及び１μ１（８ｚニツト）のＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼを加えた。反応”２１４℃にて４０分間行っ九。次に
、１０μノの５Ｍ　ＮＨ４０Ａｃ　Ｙ：加え、そしてＤ
ＮＡ　Ｙ：　７　ｓノール／ＣＨＣｔ、によ＃）１回、
そしてＣｌＩＣ２２によシ２回抽出し、そしてエタノー
ルによシ沈鹸せしめた。 ＤＮＡ　Ｙ：遠心分離し、１００１１１のメゾ、ウムサ
ルトａ歯Ｖｊ、（Ｍｍｎｌａｔｌｓ等、前掲、１００頁
）中に再懸濁し、９ユニツトのＰ謳ｔｌ及、び８ユニツ
トのＣｆｏ　ｌで消化し、そして上記のようにして抽出
した。 次に、０．１６ｐｍｏｌ−の合成Ｐａｔ　ｌ　−Ｃ１ｏ
　ｌアダプター断片、０．１４　ｐ　ｒｒ＋ｏｌｅのＦ
ＩＸ　−ｐＵＣ１３由来Ｃｆｏ　ｌ　−Ｉ３ａｍＨｌ３
ｏクター■断片、及び０．１４　ｐｍｏｌｅの２．７　
ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｐａｔ　Ｉ　ｐＵＣ１３ベクタ一
断片ｆ、６　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−Ｈ（ｔｅ　ｐ）１７
．５　ａｌ　０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ
　、及びＱ、９ユ＝、７トのＴ４１Ｊガーゼを含有する
２０μｌの反応混合物中で混合することによシ変形され
たファクター■配列を造成した。この反応混合物を室温
にて３時間インキュベートし、そしてこれｔ用いてコン
ピテントＥ、コリＪＭ８３　（Ｍｅａｓｌｎｇ　、　Ｒ
＠ｃｏｍｂｌｎａｎｔＤＮＡ　　’ｒｅｅｈｎ１ｃｍｌ
　　Ｂｕｌｌｅｔｌｎ　　ａ　　ＮｆＨＰｕｂｌｌｅａ
ｔｌｏｎＡ７９−９９−２−４２，４３−４８−１９７
９　）ン形質転換し友。これらの細胞を５０μＩの２チ
Ｘ　−ｇａｌ　（５プロモー４−クロロ−３インドリル
−β−Ｄ−ガラクトシド）と共に、４０ｐｌ／ｒｎｉの
アンピンリンン含廟するＬ−プ四ス上にプレートし、そ
して３７℃にて一部インキーベートシ友。 白色コロニーｔ、アンピシリンを含有する他のグレート
に拾い上げ、そして３７℃にて一夜増殖せシメ友。コロ
ニー７ワツトマン５４０（−１４−にプロットし、そし
てこのベーノ１−ｙＷａｌｌａｃ＠等（Ｇｏｎｏ　、１
６：２１．１９８１）の方法によるハイグリダイゼーク
、ンのために用意した。但し、クロ２ムフエニコールグ
レート上での一改のイ／キーベー７．ンは省略し友。イ
ー　／や−を、４４℃にて２時間、０．９　Ｍ　ＮａＣ
ｔ−０，０９Ｍ　　Ｔｒｌｓ　−ＨＣ２＃ｐ１４７．５
　、６　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　０．５　％ノニガット
（Ｎｏｎ１ｄｅｔ　）　Ｐ　−４０＋　１５０μｉ／、
ｄ　Ｅ、コリｔＲＮＡ中でインキ−ベートし友。ペー／
４−′％：、変形された５′末端配列に特異的な１４−
　ｍ＠ｒである５２ｐ　−？ベルされ友ＺＣ２３５（ゐ
日光）によりグローブした。フィルター当シｌ〜２　Ｘ
　１０’　ｃｐｍ　”用いるハイプリダイゼーシ、ン馨
４４℃にて前ハイプリダイゼーク、ン緩衝液中で一部行
った。次に、フィルターを、６ｘＳＳＣ，０，１係ＳＤ
Ｓ中４℃にて３回、及び２ＸＳＳＣ，０，１係ＳＤＳ中
４４℃にて３回洗浄し、そしてＸ線フィルムに暴露した
。 ２個の陽性クローンが得られ次。これらのクローンの１
つ”２ＦＫ（−Ｇ）→、ＵＣｌ３　と命名し友。 Ｆ■（−Ｇ）→、ＵＣｌ３造成物の７アクタ一■部分の
変形された領域の配列ｙ！−確Ｊするため、ＢＲＬ逆！
ライマーＺ用いるｐＵＣｆｙススミド上直接にノデオキ
ク配列決定ｔ％Ｗａ　１１　ａ　ｅ・等、１９８１（前
掲）の方法により、Ｃｈａｅｏｎｉ等（前掲）の方法に
よ＃）ポリヌクレオチドキナーゼ及びｒ　Ｐ−ＡＴＰＹ
用いて末ｇにラベルされ友グライマ−を用いて行っ之。 配列は予想通シであう几。 生ずる組換ゲラスミＰは３個のｌａｇ　［１開裂部位？
含み１品１の部位はファクター■配列中の３９位（ｒｔ
号は、Ａｎａｏｎ等、前掲、の公表され交配列に寒き第
１　ＡＴＧから始まる）に位１シシ、ム１，２の部位は
１３０位に位置し、そして第３の部位はｐＵＣ１３？リ
リンカー中に位置する。１３０部位はブレグローファク
ター■分子のＬｙｓ　−Ａｒｇ　７’ロセ７ング部位の
コドンから１塩基対上流である。最終ファクター■−フ
ァクター■ハイグリド造成物中で、３９位又は１３０位
で終るファクター■リーダー配列を、予ＩＪＪＷａ列及
びファクター■リーダー配列の最後の３コドンを含んで
取る合成２本鎖断片に連結した。 合扁斤片は、オリゴ９ヌクレオチドＺＣ２８６〜ＺＣ２
８９（ム′ＩＪ１表）を組合わせて２本鎖断片を形成す
ることによ＃）調製した。１００ｐ１００ｐずつのオリ
がヌクレオチドｌ凍結乾燥し、そして２０μｌのＩＸキ
ナーゼ緩衝液中に再ｊＭ濁し、そして４℃にて一夜イン
キユベートし、次に６５℃にて１０分間加熱し次。Φナ
ーゼ処理され次オリゴヌクレオチドＺ用いて２つのプー
ルを作り九。グー／Ｉ／１はＺＣ２８６＋ＺＣ２８７’
ｆ含み、ゾール２はＺＣ２８８＋ＺＣ２８９を含イＪし
次。ゾールされた対Ｆ！−６５℃にて１０分間アニール
し、そして２時間にわ友って室温に冷却し、そして氷上
に３０分間１；・ｔ　いフ１＝、。 変形されたファクター■断片をＦＤ＜（−Ｇ）→、ＵＣ
ｌ３からＨｌｎｄ　［１−ＥａｏＲｌ　ｔＡ片として取
り出した。 約２０μＩのプラスミドを、４μＩのＲＮアーゼＡを含
有する１００μｌのＨｌｎｄ　ｍ　ｔｌｌ’１ＪｉＫ　
（ＢＲＬ）中３　Ｑ　ｚ　ニットずつのＴＩｆｎｄｌ［
ｌ及びＥａｏＲ（によシ３７℃にて一夜消化した。６５
℃にて１０分間加熱することによシ反応を停止し、そし
てベクター及びファク！−■断片ｔ１％アガロースｒル
上で電気泳動し、そして電気溶出により４４製した◎フ
ァクターＩＸＭ片ｔエタノールで沈澱せしめ、　　ｉｏ
。 μＩ／μｌのＲＮアーゼＡ’に含有するＵ山叡中に再Ｎ
ｉＡし、そして９ユニツトのＨａ＊ＩＩｌ’に用いて３
７℃にて一夜消化し７ｔ、　Ｈｌｎｄ　Ｉｌｌ　−）（
ａｓ　Ｉｌｌ　３９塩基対フアクタ一■断片乞この消化
Ｃ吻から１．５９６７ガロースゲル上での電気泳動及び
それに続く電気溶出によシ単紐した。ｌ１ｌｎｄ　ｎｌ
　−Ｈａｓ　ｍ　１３０　ｊ、ａ基対ファクター■断片
ン得る友め、Ｆ■−、ＵＣｌ３７ＥａｏＲ１及び）（Ｉ
ｎｄ　ＩＩＩで消化し、そしてファクターに断片！上記
のようにして単離した。約３μ９のこのＨｌｎｄ　ｌ［
−Ｆ’ｃｏ　ＩＲ断片ン６ユニットのＨａ・■によシ３
７℃にて消化し、そしてアリコート乞５分間融で３０分
間にわたシ、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　’ｆ７會有する溶
液に取り出した。アリコートｔｆ−ルし、そしてＢｉｎ
ｄ　ｌ［−Ｈａｓ　ｉｌｌ　１３０塩基対断片な５係ア
クリルアミドｒ、／Ｉ／上での電気泳動及びそれに続く
電気溶出により相呉した。 最終ファクター■−コンセンサス配列ハイグリドｔ、４
部連結において、オリコ″′×クレオチドプール１及び
３、ファクター■Ｈ１ｎｄ川−）ｉａｅ　［１（３９又
は１３０塩基対）、並びにｐ　ＵＣ１３Ｈ１ｎ　ｄ　　
　′［Ｉ−ＥｃｏＲｌを連結することによシ調製した。 得られるプラスミドな用いてＥ、コリＨＢＩＯＩ　（Ａ
ＴＣＣ３３６９４）　Ｙｔ形質転換した。ＤＮＡをＥｃ
ｏＲｌ及びＨｌｎｄ　ｌｉによシ消化することによシコ
ロ二一をスクリーニングした。合成コンセンサス配列に
連結し比３９塩基対ファクター■配列？含んで成る配列
をｍ１ｎｉ　−Ｆ（Ｋ　−Ｆ■と称する。この造成物を
含有するプラスミド−ｐ、；　ｐＭ　７２００（−Ｃ）
と称する。 合成コンセンサス配列に連結された１３０塩基対ファク
ター■配列？含んで成る配列Ｙ　ｍａｘｉ　−ＦＥＫ−
Ｆ■と称する。この造成物ン含有するプラスミドｙ、−
ｐＭ　７１００（−Ｃ）と称する。このコンセンサス配
列は、アミノ酸配列Ａｌｅ−Ａｓｎ−Ａｉｍ−Ｐｈａ−
レ■−Ｇｌａ−Ｇｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−８＠
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｍ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｇｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−８＠ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌａ−
Ｇｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｍ−１１ｅ−Ｐｈｓ−Ｇ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙ
ａ−Ｌ＠ｕ　　Ｙ含んで成るポリペプチドをコードする
。 以下余白 ファクター■−コンセンサス配列バイブリド（ｍ１ｎｉ
又はｍａｘｉ　）を、３部連結において、ファクター■
ｅ　ＤＮＡの５′部分及び々クターｐＵＣ１３Ｋ連結し
た（第４図及び第５図）。ＲＮアーゼＡ（４００ｎＪ　
／μｌ）を含有するＨｌｎｄ　ｌ［緩″衝液中で６μＪ
のｐＵＣ１３を１０ユニツトずつのＸｂａ　１及びＨｌ
ｎｄ　Ｉｌｌで消化することによりベクター断片を得た
。上記のように２μｌのｐＭ７２００（−Ｃ）ｔｌｏユ
ニットずつのＨｆｎｄｌ（及びＥｃｏＲＩ　Ｋより消化
してｍ１ｎｉ−Ｆ［−Ｆ■断片を調製した。同様にして
９Ｍ７１００（−Ｃ’）からｍａｘｉ−Ｆ■−Ｆ■断片
を調製した。ｐＵＣ１３にサブクローニングされたｐＵ
ｃ■２１１５のＥｃｏＲｌ　−Ｘｂａ　ｌ　５’断片を
含んで成るプラスミドｐＬＩＣ７０５から、Ｘｂａｌ及
びＥｃｏＲＩによる消化によって、ファクター■ｃ　Ｄ
ＮＡの５′部分を調製した。この消化は３７℃にて２時
間行い、そして生成物を１．５俤アがロースダル上での
電気泳動により分離した。目的とする断片を電気浴出し
、フェノール／ＣＨＣ２３及びＣＩ（Ｃｌ３で抽出し、
そしてエタノールで沈澱させた。次に、３断片、すなわ
ちｐＵｃ１３　／　Ｘｂａ、Ｉ　−Ｈｉｎｄ　［１、フ
ァクター■−ファクター■（ｍ１ｎｉ又はｍａｘｉ　）
　／　Ｈｌ　ｎｄ　［［−ＥｅｏＲＩ、及び５′フアク
ター■／　ＥｅｏＲＩ　−Ｘｂａ　１を、２μｌの２０
　ｍＭ　ＡＴＰ及び０．９ユニツトのＴ４ＤＮＡ　ＩＪ
ガーゼを含有するりガーゼ緩衝液２０μｇ中で４℃にて
一夜連結した。ＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＸｂａｌによる制限
分析によってコロニーをスクリーニングした。ｍ１ｎｌ
−又はｍａｘｉ　−Ｆ　■−Ｆ■配列を含有する組換プ
ラスミドをそれぞれｐＭ７２００及び９Ｍ７１００　（
！：　命名ｔ、＊　ｒ拠４　ｒＭ）。 正しいイン−フレームコード配列を形成するため、ファ
クター■ｃＤＮＡの調製において使用したリンカ−に基
いて融合配列内に変形を行わ々ければならなかった。ｍ
１ｎｔ−融合体及びｍａｘし融合体の両者は、ファクタ
ー■−コンセンサス配列バイブリドとファクターｖＩＩ
ｃＤＮＡとの間の連結部ＫＥｃｏＲ１部位を含有する（
　ｃＤＮＡコローニング過程の人工物である）。さらに
、ｍ１ｎｉ−融合体は、Ｈａｅｌ［部位において配列を
５’　ＡＧＧＣＣ’Ａ　３’から５’　ＡＧＧＣＣＣＡ
　３’　に変え、そしてこの配列の下流に正しいリーデ
ィングフレームを確立するために、Ｃの付加を必要とす
る。これらの訂正は、Ｚｏｌｌｅｒングハーパーラ？ラ
トリー、１９８３Ｖｃより２プライマー法について記載
されているのと実質的に同様の方法により、オリゴヌク
レオチド指令部位特定変異誘発により行った。ｍ１ｎｉ
−Ｆｌｌ（−Ｆ■断片をｐＭ７２００からＨｉｎｄｉ［
及びＸｂａ［Ｋよる消化により取り出し、そしてＭ１３
ｍｐ１９に挿入した。 ｍａｘｉ−Ｆ■−ＦＶｎ＃！ｆｒ片を、同様にして９Ｍ
７１００から精製し、そしてサブクローニングした。Ｅ
ｃａＲ１部位の除去及び塩基の挿入の念めに、それぞれ
変異訪発ノライマーＺＣ３３３及びＺＣ３３６（第１表
を参照のこと）を使用した。各場合に、第２プライマー
としてユニバーサルブライマーＺＣ８７を１吏用し次、
変異誘発プライマーは４０　ｐｍｏｌｅのプライマー及
び６０　ｐｍｏｌｅのＡＴＰをｌ　ユニ７トのＴ４ＤＮ
Ａキナーゼと共に６０℃にて一層リン酸化した。 ｍ轟ＸＩ−ＦＸＩ−Ｆ■バイブリドからＥｃｏＲ１部位
を除去するため、１μ、ｊｉ＋（７）Ｍ１３単鎖鋳型を
２０　ｐｍｏｌｅずつのＺＣ３３３及びＺＣ８７と、金
箔１０μｌ中で一緒にした。プライマーを６０℃にて１
０分間鋳型と了り−ルし、５分間室温に冷却し、次に５
分間氷上に置いた。ＤＮＡポリメラーゼｌ　（Ｋｌｅｎ
ｏｗ断片）を用いてプライマーを延長した。ｍ１ｎｔ−
Ｆ■−Ｆ■バイブリド中のＥｃ　ｏＲ１部位を除去しそ
してリーディングフレームを正しくするため、１μＩの
該当するＭ１３単鎖鋳型を２０　ｐｍｏｌｅずつのＺＣ
３３３、ＺＣ３３６及びＺＣ８７と一緒にした。上記の
ようにしてアニーリング及びプライマー延長反応を行っ
た。 ブラークリットを、　　Ｐ−ラベルブライマー（ＺＣ３
３３又はＺＣ３３６）を用いて６０℃にてスクリーニン
グし、そしてジデオキシ配列決定法により配列を確認し
た。ｍａｘｉ　−ＦＩＸ−ＦＶＩＩ又はｍａｘｉ　−Ｆ
！Ｘ−Ｆ■Ｉｔ＝含んで成る造成物をそれぞれｐＭ７１
１］及び９Ｍ７２１１と命名した。 コンセンサス配列は、ファクター■について得られた蛋
白質配列データと一致しない幾つかの領域を含有する（
第２図）。ファクター■のアミノ末端部分との一層大き
な相同性を有するポリペプチドをコードする配列を得る
ため、コンセンサス配列をオリゴヌクレオチド指令部位
特定変異誘発により変形した。この変形は８位における
Ｌａｕの挿入、１８位（８位の挿入後のアミノ酸位置に
関する）におけるＬｙｇとＩｌｅの置換、２６位におけ
るＡｌａとＡｓｎの置換、及び３２−３４位におけるＧ
ｌｙ−Ｌｅｕ−ＡｓｎとＡｌａ−８ｅｒ−Ａａｐの置換
（仮のアミノ酸配列データに基く）から成る。 ８位及び１８位の配列変化は鋳型として９Ｍ７１１１　
（センス鎖）を用いて行った。前記のようにしてプライ
？　−ＺＣ３５２（”’ＣＣＣＡＧＧ　Ｔ’ＣＴＣＡＧ
　ＣＴＣＣＴＣＣＡＧ５′）及０：　ＺＣ３５３（５′
ＣＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＣＴＴ　ＡＣＡ　ＣＴＣＴＣＴ３
′）を鋳型にアニールし、そして延長した。得られるフ
ァージクローンを９Ｍ７１１４と命名した。ｐＭ７１１
４中の挿入部の配列をジデオキシ配列決定法により確認
した。 同様にして、位置２６−３４の変化をｐＭ７１１４鋳型
（センス鎖）上で、変異誘発プライマーＺＣ３６６（”
　ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＣＧＴ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　
ＧＣＣＣＴＣＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧＣＧ　ＧＧＣＣ
ＴＣＣＴＣＧＡＡ”　）を用い、ＺＣ８７（第１表）を
第２プライマーとして行った。得られた造成物をｐＭ７
１１５と命名した。 Ｍ１３ベクター中の全５５０ｂｐ挿入部の配列をジデオ
キシ法により決定し、そして正しいことを見出した。 の造裂 ファクター■−ファクター■ｃＤＮＡ融合体を、Ｋｕｒ
ａｃｈｉ及び［１ａｖ１ｅ　　（前掲）により記載され
ているようにしてヒトー肝臓ｃＤＮＡライブラリーから
得られたファクターｒｆ、　ｃＤＮＡと例１に記載した
ファクター■ｃＤＮＡ配列とを使用して％Ｗした。 バイブリド蛋白質について選択された融合点はファクタ
ー■のアミノ酸＋３８（スレオニン）トファクター■ｃ
　ＤＮＡ配列によりコードされる第１リジンとの間であ
った。この蛋白質は、ファクターｌ；（ｃ［）ＮＡの最
初の２５２　ｂｐ及びｐＵＣｖｌＩ２１１５ファクター
■ｃＤＮＡ配列の最初の２コドンを除くすべてから成る
配列にエリコーＰされるであろう。 このバイブリド配列を造成するため、便利な制限部位を
用いてファクター■配列をまずｐＵＣ■２１１５に融合
せしめた。この融合は、完全ファクターＶＨｃＤＮＡ配
列に連結されたファクターＷ　ｃＤＮＡ　Ｌニア＞最初
の３１０ｂｐを含有するプラスミドＦＷ／■／１２（下
に記載する）をもたらす。バイブリド蛋白質のために望
ましい正確な連結を達成するため、介在（ｉｎｔｅｒｖ
ｅｎｉｎｇ　）塩基対をオリゴヌクレオチド指令変異誘
発により除去した。 ファクターｆ／、　ｃＤＮＡ配列とファクター■ｃＤＮ
Ａ配列との連結を、Ｆｌ）：（−Ｇ）→ＰＵＣ１３（例
４）の０．３　ｋｐ　ＨＩｎｄｌｌｌ　−Ａｈａ　ＩＩ
Ｉ断片とｐＵＣ■２１１５（、’１５図）からの４．７
　ｋｂ　Ｓｍａ　ｌ　−Ｈｉｎｄ　ｉｌｌ断片とを連結
することにより達成した。４０μノのメディウムサルト
緩衝液（ＭａｌｌａｔＬｓ等、前掲）中で３μＪのＩｉ
’ｌＫ、（−Ｇ）−＋ｐＵＣ１３を４　Ｑ　ユニ７トの
Ｈｌｎｄ　１で３７℃にて４時間消化することによりＨ
ｌｎｄｌｌｌ−Ａｈａｌ（［断片を調製した。次に容積
を１００μｌのメデュウムサルト緩衝液に増加し、そし
て５ユニツトのＡｈａ［を加え、そしてインキュベーシ
ョンを３７℃にて１８時間続けた。ＤＮＡ断片を上記の
ようにして１優アガロース上での電気泳動により分離し
、そしてＯ１３ｋｂのバンドを単離し念。３μｇのｐＵ
Ｃ■２１１５を３０μｌの反応容積中で２５℃にて１時
間、４．８ユニツトのＳｍａ　ｌと共にインキュベート
することによりｐＵＣ■２１１５のＳｍａ　Ｉ　ｆｍ　
発情化を行った。６５℃にて１５分間のインキュベーシ
ョンにより反応を停止した。次にサンプルを同容８のフ
ェノールで抽出し、そしてエタノール沈澱を行った。 １０分間のミクロツユ−ジスピンによって沈澱を集め、
７０俤のエタノールですすぎ、そして空気乾燥した。Ｄ
ＮＡを３０μｌ　のメデュウムサルト緩衝液に再溶解し
、そして３０ユニツトのＨｌｎｄｍにより３７℃にて３
時間消化した。ＤＮＡを上記のようにして０．７％アガ
ロース中での電気泳動にかけ、そして４．７　ｋｂ　Ｈ
ｉｎｄ−８ｍａｌ断片を単離した。 Ｐ等モル量の２つの断片（０，０４８ｐｍｏｌｅ　）を
。 ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｔ、ｐ）１７．５　、１０
ｍＭＭｇｅｔ２゜１　ｍＭ　ＤＴＴ　、　１　ｍＭ　Ａ
ＴＰ　、及び３ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有す
る１０μｌの反応溶液中で連結し、そしてコンピテント
Ｅ、コリＲＲＩ　（ＡＴＣＣ３１３４３）を形質転換し
た。細胞をアンピシリングレート上で増殖せしめ、そし
て生ずるコロニーの内の１２個を制限酵素消化により目
的プラスミド造成物の存在についてスクリーニングした
。コロニー１２からノＤＮＡ（ＦＩＸ／■／１２）が予
想通りの制限酵素消化・母ターンをもたらし、そして次
のバイブリド遺伝子造成の段階で使用した。 オリゴヌクレオチド指令変異誘発法を単鎖ＤＮＡ鋳型上
で行った。すなわち、融合したファクター■／ファクタ
ー■配列ｆ：Ｍ１３ｍｐ１９中にクローニングすること
が必要であった。便利な小ＤＮＡ断片を得るため、ＦＩ
Ｘ／■／１２から６４０　ｂｐ　Ｈｌｎｄｍ　−Ｘｂａ
　Ｉ断片を単離した。この断片はファクター■ｃＤＮＡ
の５′末端の３１０ｂｐ及びファクター■断片の３３０
ｂｐを含Ｍする。１　μｉのＭ１３ｍｐ１９ＲＦ　ＤＮ
Ａを４０μｌのメデュウムサルト緩衝液中で２０−Ｌニ
ットのＨｌｎｄ［［及び２０ユニツトのＸｂａｌで３７
℃にて１８時間消化することによりベクターを調製した
。ＤＮＡを前記のようにして１．２憾アガロース中での
電気泳動にかけ、そし線状６．４ｋｂ断片をグルから単
離した。５μｓのＦＩＸ／■／１２ＤＮＡを４０μｇの
メデーウムサルト緩衝液中で１０ユニツトのＸｂａ’）
により３７℃にて１８時間消化した。２０ユニツトのＨ
ｌｎｄｌ［ｌを加え、そして消化を３７℃にてさらに７
時間続けた。生ずる断片を前記のようにして１．２チア
ガロース中での電気泳動により分離し、セして６４０　
ｂｐ断片を溶出した。１０　ｎｇの線状化されたＭ１３
ｍｐ１９及びＩｎ、ｌｉｔの６４０　ｂｐ断片を１４℃
にて１時間連結し、そして次にコンピテントＥ、コリＪ
ＭＩ　０１を形質転換した（　Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｍ
ｏｔｈ、　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、前掲）。 細胞’ｚＸ−ｇａｌ及びＩ　ＰＴＧと共にプレートしく
　Ｍａｓｓｉｎｇ　、　Ｍｅｔｈ、　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　＋前掲）、そして８個の淡背色のプラーク
を拾い、そしてＥ、コリ　ＪＭ１０３の培養物（Ａ６ｏ
ｏ　＝　０．３　）　２．５　ｍｌに感染させた。３７
℃にて１８時間の増殖の後、細胞を室温臨床遠心分離機
中での遠心分離により収得し、そしてＭ１３ファージを
含有する上清２０μ！を１０μＩ／ｌのエチジウムプロ
ミドと混合した。既知の標準との比較により、８個のク
ローンのそれぞれはほぼ正しいサイズの挿入部を有して
前掲）により記載されていたようにして、１．５　ｒｎ
ｌの上清から単ｇ　ＤＮＡを調製した。次に、プライマ
ーとしてオリゴヌクレオチドＺＣ８７を用いてジデオキ
シ法によりこの造成物を配列決定し、挿入連結部が正し
いことを確認した。正しいクローンの１つ（＃４）を鋳
型として使用してオリゴヌクレオチド指令変異誘発によ
り機能的ファクター■−ファクター■融合体を調書した
。 オリゴヌクレオチドプライマー、すなわち１０ｂｐの目
的とするファクター■配列及びＩ　ＣＬｂｐの目的とす
るファクター■配列から成る２　０−　ｍａｒ（第１表
）を変異誘発プライマーとして使用した。 Ｍ１３ｍｐ１９配列とハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドＺＣ８７を第２ｆライマーとして使用した。 使用した変異誘発法けＺｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ（前
掲）゛の方法の変化であった。アニーリング反応のため
、　２０　ｐｍｏｌｅのＺＣ２４９を、２０　ｔｔｌの
６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨｓ、ｏ　、　１０ｍ
ＭＭｇＣ４３、１ｍＭ　ＤＴＴ。 １　ｍＭ　ＡＴＰ　、　１ユニツトのＴ４キナーゼ中で
４℃にて一部インキユペートすることによりリン酸化し
た。６５℃にて１５分間加熱することにより反応を停止
し、そしてサンプルを凍結乾燥した。１ｐｍｏｌｅの単
鎖クローン＃４鋳型及び２０　ｐｍｏｌｅのＺＣ８７を
１０μｌのアニーリング緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｔ、　ｐＨ７，５、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜５
００　ｍＭ　ＮａＣｔ　、　１０　ｍＭ　ＤＴＴ　　）
に加えた。サンプルを６５℃にて１０分間加熱し、室温
にて５分間インキュベートし、そして次に氷上に置いた
。 １０μｌの次の溶液を新しく調製し、そしてサンプルに
加えた。２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ７，５
、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、　１
　ｍＭ　ｄＮＴＰ　、　１　ｍＭＡＴＰ　、　０．１５
ユニツト／μｊのＴ４ＤＮＡリガーゼ、０．２５ユニツ
ト／μｌのＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎ
ｏｗ断片）。次に、反応混合物を１５℃にて３時間イン
キュベートし、そしてこのサンプルを使用してコンピテ
ントＥ、コリＪＭＩ　０１を形質転前掲）。 生ずるファージをニトロセルロース上に上げ、そして　
Ｐ−ラベルＺＣ２４９にハイブリダイズせしめることに
よりスクリーニングした。乾燥したＢＡ８５フィルター
（シュリーヒエル＆ジュール。 ０．４５μｔｎ　）を寒天プレート上に置き、そしてフ
ァージを５分間吸着させた。フィルターを取りはずし、
そして５分間乾燥させ、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ及び１、
５　Ｍ　ＮａＣ１で飽和されたワットマン３ＭＭペーパ
ー上に５分間置き、３分間空気乾燥し、ＩＭＴｒｉｌＩ
−ＨＣｔ（ｐＨ８）及び１．５　Ｍ　ＮａＣ２で飽和さ
れたワットマンベー・！−上に５分間置き、そして３分
間空気乾燥し友。Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｔの段階を反復し
、そしてフィルターを１００＋Ｊの６　ｘ　ｓｓｃ中で
室温にて２分間すすいだ。空気乾燥した後、フィルター
を８０℃にて２分間加熱し、４７℃（ＺＣ２４９のＴｍ
　−４℃）にて−夜、　６．７　Ｘ　ＳＳＣ、ｐＨ６，
３、２ｍｙ　／　ｍｌのＥ、コリｔ　ＲＮＡ、並びに０
．２　ｗ／ｖ　％ずつのＢＳＡ、フィコール及びＩリビ
ニルビロリドン中テ前ハイブリダイズせしめた。 前ハイブリダイゼーション段階の後、フィルターを２．
５Ｘ１０　　ｃｐｍ／フィルターのラベルされたＺＣ２
４９と共に同じＳＳｃハイブリダイゼーション緩衝液中
で４７℃にて一部インキーペートした。 ハイブリダイゼーションの後、フィルターを５〜１０分
間ずつ３回室瀉にて６　ｘ　ｓｓｃ中で洗浄し、そして
Ｘ＃ｉ！フィルムに暴露した。仮定の陽性プラークを再
プレートし、そして上記のようにしてスクリーニングし
た。次に個々のプラークを拾い上げ、そして再録ＤＮＡ
を調製し、そしてプライマーとしてＺＣ２７５を使用し
て配列決定した。オリゴヌクレオチドＺＣ２７５は、同
じ釦上のＺＣ２４９の５′方向の配列４０　ｂｐに対応
する（第１表）。 ４個の・陽性プラークが同定された。１個のクローンに
ついてＭ１３ｍｐ１９中の全挿入部を、オリゴヌクレオ
チドＺＣ８７及びＺＣ２７５を用いてジデオキシ法によ
り配列決定し、そして正しいことを決定した。確認され
た配列は第７図中塩基１−５６７により示される。次に
、このクローンからのＲＦＤＮＡをバイブリド遺伝子の
造成の最終段階において使用した。 道路造成を行うために次の３断片を使用した。 融合した■／■配列を金石するＦＩＸ／■−９からの０
．６　ｋｂ　Ｈｌｎｄ　ｍ　−Ｘｂａ　■断片：　ｐＵ
Ｃ■１９２３からの１．７　ｋｂ　Ｋｂａ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩファクターＷｃ　ＤＮＡ断片；及びｐｔｒｃ　１
３の２．７　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−ＨＩｎｄｌ［断片で
ある。３４のＦｆｆ／■−９（ＲＥ’ＤＮＡ　）を５０
μｌの容積中で４５ユニツトのＸｂａＩにより３７℃に
て６時間消化した。ＤＮＡをエタノールで沈澱せしめ、
再懸濁し、そして５０ユニツトのＨｌｎｄｌｌｌにより
３７℃にて４時間消化した。 サンプルを１チアガロース中での電気泳動にかけ、そし
て０．６ｋｂのバンドをＮＡ　４５ペーパー（シュリー
ヒエル＆ジュール）上に電気溶出した。ＤＮＡをこのペ
ーパーから１．５　Ｍ　ＮａＣ！　、　５０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｔ、　ｐＨ８、１ｍＭ　ＥＤＴＡにより溶
出し、フェノール抽出し、そしてエタノールで沈澱せし
めた。 残りのファクター”ｆｌ　ｃＤＮＡ配列を得るなめ、５
μｇのｐＵＣ■１９２３を４０μｌ　のメデュウムサル
ト緩衝液中で３６ユニツトのＸｂａＪにより３７℃にて
３時間消化した。次に、８μｌの１０倍塩緩衝液、２８
μｌの水、及び４μ１（４０ユニツト）のＢａｍＨＩを
加え、そして反応混合物を３７℃にて３時間インキ−ベ
ートした。ＤＮＡ断片を、１チアガロース中での電気泳
動により分離し、そして上記のようにして１．７ｋｂ断
片を単離した。 １μｇのｐＵｏ　１３を２０μｌのメデュウムサルト緩
衝液中で１０ユニツトのＨｉｎｄ　［［により３７℃に
て１時間消化することによりベクター断片を調製した。 次に、２　Ｉｌｌの１０．倍高塩緩衝液及び］０ユニッ
トのＢａｍＨＩを加え、そしてインキュページ。 ンをさらに２時間続は念。上記のようにして、ＤＮＡを
１係アガロースダル上で精製した。 等モル量（およそ０．５６　ｐｍｏｌｅ　）の３種類の
断片を室温にて４５分間、１０　ｔｒｉの５０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５、１０ｍＭＭｇｅｔ２．
１　ｍＭ　ＤＴＴ、　　１ｍＭ　ＡＴＰ及び３ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼ中で連結し念。この反応混合物を
用いてコンピテントＥ、コｌＪＪＭ８３を形質転換した
。細胞を、５０μｌ／グレートの２４　Ｘ−ｇａｌが添
加された、４０４／１１ノアンピシリンを含有する培地
上にグレートした。７個の白色コロニーからＤＮＡを調
製し、そして次に制限酵素消化によりスクリーニングし
た。 正しいパターンを示すクローンの１つをＦｌｌ（／■→
ｐＵｃ１３と命名した。 現 哺乳類細胞発現ベクターｐＤ２を、トランスフェクトさ
れた動物細胞中でのＦＩＸ／■遺伝子の発現のために選
択した。これは、プラスミドｐＤＨＦＲ−ｍ　（Ｂｓｒ
ｋｎｅｒ及び５ｈａｒｐ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅａ、。 １３、８４１−８５７．　１９８５）から、次のように
して造成された。ｐＤＨＦＲＩｌｌ中のＤＨＦＲｃＤＮ
Ａに隣接するＰｓｔ１部位を、常用のリンカ−付加法（
５ｃｈｅｌｌｅｒ。 Ｒ，Ｈ−＋　Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ｅ、、　Ｂｏ
ｙｅｒ、　Ｈ，Ｗ、。 Ｒｉｇｇｇ、　Ａ、Ｄ、　、及びＩｔａｋｕｒａ、　Ｋ
、、　５ｃｉｅｎｃｅ。 １９６　：　１７７−１８０．１９７７　）によりＢｔ
ｒｎＨ１部位に転換した。ｐＤＨＦＲＴ［ｒ　ＤＮＡを
１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ、　ｐＨ７，６。 ６ｍＭβ−ＭＳＨ，６ｍＭ　ＮａＣＬ、　１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣＬ２及び２．５ユニツトのＰｓｔｌと共に３７℃に
て１０分間インキュベートし、次にフェノール抽出及び
エタノール沈澱を行った。Ｐｓｔｊ接着末端を、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。フェノール
抽出、及び１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　、　ｐＦ（８，０、
１ｍＭ　ＴＩ）ＴＡ。 ０、３　Ｍ　ＮａＣＬに対する透析の後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱せしめた。ＤＮＡを２０ｔｔｌの１．４　ｍ
Ｍ　ＡＴＰ　。 ５０ｍＭＴｒｉｓ　、ｐＨ７，６、ｌ　ＯｒｒＭＭｇＣ
１３、Ｉ　ｍＶジチオスレイトール中に再懸濁し、そし
て次に５４のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理された
ＢｉｍＨＩリンカ−にューイングランドビオラブス）及
び２００ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドリが−ゼと共
ＶＣｌ２℃にて１２時間インキーペートレ。 次にフェノール沈澱及びエタノール沈澱を行っ友。 ＤＮＡを９０ユニツトのＢａｍＨＩ　Ｋよ＃）３７℃に
て１時間消化し、次に１．４係アガロースダルによ＃）
電気泳動した。４．９　ｋｂ　ＤＮＡ断片（ＤＨＦＲ（
！ＤＮＡ及びＳＶ４０ポリアデニレーシｌンシグナルヲ
欠くｐＤＨＦＲＩ［ｒ　ＤＮＡに相当する）を電気溶出
し、そしてポリヌクレオチドリガーゼにより再環化し、
そして次にＥ５コリＨＢＩＯ】にトランスフェクトした
。 アンピシリン感受性コロニーを迅速プレプ分析（Ｂｌｒ
ｎｂｏｌｍ、　Ｈ，Ｃ，、及びＤｏｌｙ、　、Ｊ、＊　
Ｎｕｃｌｅｌｃスクリーニングし、そして正しいクロー
ンを増殖させて大規模シラスミドＤＮＡ調製を行った。 生ずるプラスミドを２０ユニツトのＢａｍＨＩで開裂せ
しめ、そして２．５μｇのウシ腸ホスフγターゼで処理
し、そして１．４チアガロースグル上で電気溶出した。 ２５４のｐｓＶ４０　（ｐＢＲ３２２のＢａｒｒｆ（１
部位に挿入された５Ｖ４０ＤＮＡのクローン）全２５ユ
ニツトのＢｃｌｌＫより５０℃にて１時間消化し、次に
２５ユニツトのＢａｍＨＩを添加し、そして３７℃にて
１時間インキュペーシヨンを続けた。次に、このＤＮＡ
−全１．４％アガロースゲル上で電気泳動した。Ｂａｍ
ＨＩ切断ベクター（すなわち、ポリアデニレーションシ
グナルを欠くベクター）ヲ、後期デリアデニレーション
シグナルｋ　含ＭするＳＶ４０ＤＮＡ断片（０，１４−
０，１９マツプユニツト（Ｔｏｏｚａ等、Ｊ１編＋　”
　ＤＮＡ　Ｔｏｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏ
ｒ　Ｖｌｒｕｇｅｓ　’　）に、ｒル精製された断片（
０，１μｇずつ）を２０ｔＪの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、
ｐｉ（７，６、１０ｍＭＭｇｅｔ２゜１ｍＭ）、チオス
レイトール、　１．４　ｍＭ　ＡＴＰ及び１００ユニツ
トのＴ４？リヌクレオチドリガーゼ中で１２℃にて４時
間インキュベートすることにより連結し、そしてＥ、コ
リＲＲＩを形質転換した。 陽性クローンを迅速ゾレプ分析により同定し、そして正
しいＤＮＡ、すなわちｐＤ２の大規模調製を行った。 ファクターＩＸ、／■発現造成物を作成するため、ｌ　
ｔｔｆｌのｐＤ２を２０ユニツトのＢａｍＨＩにより２
０μｌの高塩緩衝液中で３７℃にて１時間消化した。 次に、２０μ！の１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　、　
ｐＨ８、１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１ユニツトのウシアルカ
リ性ホスファターゼ（ペーリンガー）を加えた。反応混
付物を３７℃にて１時間インキュベートし、そして７５
℃にて１０分間加熱することにより停止した。 １０μｙのＦｆｆ／■→ｐＵＣ１３を１５０μノの高専
緩衝液中で１５０ユニツトのＢａｍＨＩにより３７℃に
て２時間消化した。ＤＮＡ断片を１．２チアガロース中
での電気泳動により分離し、そして２．３　ｋｂ断片を
単離した。等モル童（０，０１５ｐｍｏｌｅ　）の３、
３　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片及びｐＤ２ベクター断片を１
４℃にて２．５時間上記のようにして連結した。この反
応混合物を用いてＥ、コＩＪＲＲＩ細胞を形質転換し、
次にこれを１０μｊｉ　／ｌｎｌのアンピシリンを含有
する培地上にプレートした。プラスミドＤＮＡ　２生じ
たコロリーの内の１２個から調製し、そして制限酵素消
化によりスクリーニングした。正しい酵素消化・母ター
ンを示すクローンの１つをＦＸ／■／ｐＤ２と命名した
（第６図）。Ｆ［／■／　ｐＤ２により形質転換された
Ｅ、コＩＪＲＲＩは７５５３０６８としてＡＴＣＣに寄
託され友。 ＦＩＸ／■／　ｐＤ２により幼ハムスター腎臓（ＢＨＫ
）細胞（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ
ンから受託番号ＣＣＬＩ　Ｏとして入手可能である）を
トランスフェクトする方法は、公表されている方法（例
えば、Ｗｉ　ｇ　１　ｅ　ｒ等、　Ｃａ１１．１４　：
　７２５　。 する。ＢＨＫ細胞を６０＋ｏ＋ｉ織培養ペトリ皿中、ド
ルベコの培地（＋１０％熱不活性化ウシ胎つ血清並びに
グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシン）中で
３７℃、５１　Ｃｏ２にて、２０係のコンフルエンスま
で増殖せしめた。。６０　ｍ　”！　）υ皿１枚のトラ
ンスフェクトのために合計ｌＯμＩのＤＮＡ、すなわち
３．７５　ｐｉ　（７）　Ｆ　！に／　ｖＩＩ／　ｐＤ
２．１，２５４のｐＫＱ−ｎｅｏ　（５ｏｕｔｈｅｒｎ
及びＢｅｒｇ　、　Ｊ、　Ｍｏｌ　。 Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　　１　：　３２７−３４
１．　１９８２　）、及び５μｌのサケ精子ＤＮＡを使
用した。ＤＮＡを０．３ＭＮａ０Ａｃ　　、　７５　％
エタノール中で沈澱せしめ、７０係のエタノールですす
ぎ、そして２０μｌの１０　ｍＭ　Ｔｒ　ｒ　ｓ　−Ｈ
ＣＬ　＊　ｐＨ８＋　１　ｎＭ　ＥＤＴＡに再溶解した
。ＤＮＡを４４０μｌの水及び５００　＃の２８０ｍＭ
　ＮａＣｔ、　１．５　ｍＭ　ＮａＨＰＯ４，１２ｍＭ
デキストロース、５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　、　ＰＩ３
７．１２中に再ｔ６解した。 ６０μｌの２　Ｍ　ＣａＣｌ２を上記の混合物に滴加し
、そして溶液を室温にて３０分分間−た。次に、この溶
液を細胞に加え、そして細胞を３７℃にもどして４時装
置いた。培地を除去し、そして血清を含有するドルベコ
培地中２０１　ＤＭＳＯを５ｍ！！室温にて２分間にわ
たり加えた。次に、皿を培地を２回交換して迅速に洗浄
し、そして新鮮な培地中で一部インキーペートした。Ｄ
ＮＡを加えてから２４時間後、媒地を除去し、そして選
択培地（血清を含有するドルベコ培地中１０ｍ９／ｍｌ
のＧ４１８゜４９８μｇ為、ギブコ）を加えた。１０日
及び１３日の後、ｐＫｏ−ｎｅｏ遺伝子を含有しそして
それ故に０４１８に対して耐性である細胞を代表する個
々のクローンを９６ウエル（又は２４ウエル）プレート
に移し、そして蛋白質測定のために増殖せしめた。 細胞を、５μｇ／ｍｌのビタミンＫ（フィトナジオン、
メルク）を含有する、１０チウシ胆児血清が補充された
ドルベコの培地中に増殖せしめた。培地を遠心分離によ
り細胞及び細胞片から分離し、そしてファクター■ポリ
ー′−２７°チド（ＥＬＩＳＡによる）、及び生物学的
活性について測定し念。細胞をトリプシンによりプレー
トから取り出し、新鮮な培地で洗浄し、遠心分離し、そ
して−２０℃にて凍結。 した。次に、細胞ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、ペレッ
ト化し、そして０．２５％トリトンＸ−１００を含有す
るＰＢＳ中に再懸濁した。サンプルを稀釈し、そしてポ
リペプチド及び活性について測定した。 ファクター■についてのＥＬ　Ｉ　ＳＡを次のようにし
て行った。ヒト−ファクター■に対するモノクローナル
抗体（０，１ＭＮａ２ＣＯ３，ＰＩ″１９．６中５μｌ
／ｍ）２００μｌを９６ウエルミクロタイタープレート
の各ウェル中で３７℃にて２時間インキュベートした。 次にウェルを２２０μｌのＰＢＳ（ＰＩ−１７，２）中
１俤ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）及び０゜０５％ト
ウィーン２０と共に３７℃にて２時間インキ−ベートし
た。プレートを水ですすぎ、空気乾燥し、そして４℃に
て貯蔵した。サングルを測定するため、２００μｌのサ
ンプルを、抗体がコートされたウェル中で室温にて１時
間インキュベートした。 次に、ウェルを０．０５％のトウィーン２０を含有する
２００μｌのＰＢＳで４回すすいだ。次に、ウェルを、
ファクター■に対するラビット−ポリクローナル抗血清
の１ｍ１画分（１係のＢＳＡ及び０．０５係のトウィー
ン２０を含有するＰＢＳＢＳＡｇ／１１１１＞２００μ
ｌと共に室温にて１時間インキュベートした。次に、ア
ルカリ性ホスファターゼと結合したヤギ抗−ラビットＩ
ｇＧとインキュベートした。次に、ウェル＝ｉ０．０５
係のトウィーン２０を含有するＰＢＳにより４回すすい
だ。ウェルに、５５１Ｉ１９　／ｌのＦｉ’ＩｇＣＬ２
を含有するジェタノールアミン緩衝液（９６ゴ＃）、ｐ
）１９．８中に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェ−
）（３０ｒｎｇ）２０αμｌを加えた。３７℃にて酵素
反応を行い、そして黄色の発生をＥＬＩ　ＳＡプレート
リーダーを用いて４０５ｎｍでモニターした。細胞培地
について得られた結果を第３表に示す。 ファクター■の生物学的活性はＱｕｉｃｋ（Ｈｅｍｏｒ
ｒａｇｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉａ　＋第３版、　Ｌｅａｔ　Ｆｅｂｉｇｅｒ、フイ
ラデルフイア。 １９６６）により記載されたワン−ステージ・クロッテ
ィングアッセイにより測定した。細胞培地について得ら
れた結果を第３表に示す。 第３表 ２・８　　　　　　４７　　　　　　１５．ｇ３　　　
　１．９６ ２．２６　　　　１６０　　　　　９３４　　　　４．
７１ ４．１４　　　　５５０　　　　　３００５　　　　８
．７９ １１．２８　　　　７２５　　　　　５３１８．４　　
　　　９７５　　　　　６００１４μＩのＦＩＸ（−Ｇ
）→ｐＵｃ１３を３０μｇの高塩緩衝液中で３０ユニツ
トのＢａｍＨＩにより３７℃にて３時間消化した。次に
、　ＤＮＡを１チアガロースｒル中での電気泳動にかけ
、そしてファクター■配列を含有する１、４ｋｂバンド
をダルから単離した。 ３μｇのベクターｐＤ２を３０μｌの高塩緩衝液中で３
０ユニツトのＢａｍＨＩにより３７℃にて３時間消化し
た。ＤＮＡを１％アガロース中での電気泳動にかけ、そ
して線状１．５ｋｂ断片を単離した。次に、ＤＮＡを３
０　ｔｔｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＡ！　、　ｐ
Ｈ８、１ｍＭＥＤＴＡ中で０．１２ユニツトのウシアル
カリ性ホスファターゼにより３７℃にて３０分間処理し
た。 塩を０．３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃに調製し、そしてサングル
をフェノールにて２回抽出し、クロロホルムで１回抽出
し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱せしめた。ペレット
を７０係エタノール中ですすぎ、乾燥し、そして２０μ
ｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉａ−ＨＣｔ、　ｐ＋！　８　、
１　ｍＭＥＤＴＡ中に再溶解した。等モルｎ　（０，０
２ｐｍｏｌｅ）の２つの断片を上記のようにして１０ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼにより連結した。反応
混合物を使用してＥ、コＩＪＲＲＩ細胞を形質転換した
。生じたアンピシリン耐性コロニーの内の１２コロニー
からのＤＮＡを制限酵素消化によりスクリーニングした
。正しい方向に挿入された１、４ｋｂ断片を有するクロ
ーンの１つをＦ　ＩＸ　（−Ｇ）／ｐＤ２と命名した。 Ｆ　ＩＸ　（−Ｇ）／　ｐＤ２　により形質転換された
Ｅ、コリＲＲＩけ＆　５３０６７としてＡＴＣＣに寄託
された。 Ｂ［細胞を、上記のようにしてＦＭ（−Ｇ）／ｐＤ２及
びｐＫｏ−ｎｅｏにより同時トランスフェクトした。薬
剤耐性細胞を選択し、そして例６に記載したようにして
ＥＬＩＳＡ及び活性測定のために用意した。 生物学的活性の試験は、ファクター■不足患者からの血
漿の凝固時間を短縮するファクター■の能力に基〈。こ
れはＰｒｏｃｔｏｒ及びＲａｐａｐｏｒｔ　＋Ａｍａｒ
、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、、３６　：　２１２．１９
６１により記載されたようにして行った。結果を第４表
に示す。 以下余白 ファクター■ポリベグチドの量は例６に記載し念のと実
質上同様にしてファクター■に対するポリクローナルラ
ビット抗血清を使用してＥＬＩＳＡ法により決定した。 ウェルをファクター■含有サンプルと共にインキュベー
トした後、ウェルを洗浄し、そして１チのＢＳＡ　Ｏ，
０５係のトウィーン２０を含有するＰＢＳ中１　：　１
０００稀釈された、アルカリ性ホスファターゼと接合し
たアフィニティー精製されたラビットポリクローナル抗
−フアクタ−Ｖの２００μｌと共に室温にて１時間イン
キ−々−トした。次に、ウェルを、０．０５’ｆｉのト
ウィーン２０を含有するＰＢＳで４回すすぎ、そして酵
素基質を上記のように添加した。４℃にて一夜、又は３
７℃にて２時間、インキュベーションを行った。 第４表に示すように、ファクター■の７０〜８０チが培
地中に分泌され、そしてその約５０係が生物学的に活性
であった。細胞ペレット中にはファクター■活性は検出
されなかった・ 細胞培養培地に１〜ｘｏｔｎｑ／ｍｌの濃度でビタミン
Ｋ（フィトナジオン、メルク）を補充することにより最
も高レベルの活性が達成された。 細胞が真正なファクター仄を分泌することを証明するた
め幾つかの９．１加の分析を行った。上記の測定に従っ
てファクター■活性を含有するサンプルをファクター■
不足血漿とインキ−ベートしたが凝固時間には影響を与
えず、活性が非特異的凝固剤では彦く真正なファクター
Ｖに基くことが示された。この結果はさらに特異的異体
によりファクター■活性がサンプルから涸渇することに
より確認され念。ファクター■活性の９７〜９８チが、
ファクター■に対するラビットポリクローナル抗体によ
り細胞上清から免疫沈澱した。この抗体はまた正常血漿
から７アク４−［活性の９９係以上を沈澱せしめた。エ
リスロポイエチンに対するラビットポリクローナル抗体
によっては上清からファクター■活性が除去されなかっ
た。 部分的ファクター■ｃ　ＤＮＡに連結された合成ファク
ターｖＩ１５′コード領域を含んで成る発現ベクターを
造成した。９Ｍ７１１５からのファクター■リ−グー−
５′フアクター■配列、及びＦｌ）ｎ／■／　ｐＤ２か
らの３′フアクタ一■配列を、５ｖ４０エンハンサ−並
びにアデノウィルス２主要後期プロモーター及びトリパ
ルタイトリーダーを含むシラスミドｐＤ３に挿入するこ
とにより９Ｍ７１３５と称するベクターを生じさせた。 シラスミドｐＤ３はプラスミドｐＤＨＦＲ［［から得ら
れた。ｐ　ＤＨＦＲＩｌＩ中のＤＨＦＲ配列からすぐ上
流のＰｓｔＩ部位を次のようにしてＢｅ１１部位に転換
した。１０縛のプラスミドを１００μｌの緩衝液Ａ（１
０ｍＭ　Ｔｒｉｍ　、ｐＨ８、１０ｍＭＭｇＣｌ２　、
６ｍＭＮａＣｔ＃　７　ｎＩＭβ−ＭＳＨ）中で３７℃
にて１０分間５ユニツトのＰｓｔｌにより消化した。Ｄ
ＮＡをフェノール抽出し、ＥｔＯＨ沈澱せしめ、そして
１０ｍＭｄｃＴＰ及び１６ユニツトのＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼを含有する４０μｌの緩衝液Ｂ　（５０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　ｐＨ８，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．７　ｍＭβ−Ｍ
ＳＨ）中に再懸濁し、そして１２℃にて６０分間インキ
ュベートした。 ＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮＡを、４００ユニツトのＴ４ポ
リヌクレオチドリガーゼを含有する１４μｇの緩衝液Ｃ
（１０ｍＭＴｒｉｓ　、ｐｔ（８，１０ｍＭＭｇＣｌ２
゜１　ｍＭ　ＤＴＴ　、　１．４　ｍＭ　ＡＴＰ　）中
で２．５μｇのキナーゼ処理されたＢｃｌ　ｌリンカ−
に、１２℃にて１２時間連結した。フェノール抽出及び
ＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮＡを１２０μｌの緩衝液Ｄ　（
７５ｍＭ　ＫＣＬ　。 ６　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　、　ｐＨ７，５、１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．１　ｍｌｌ／ＩＤＴＴ　）中に再懸濁し、８０
ユニツトのＢｃｌ）で５０℃にて６０分間消化し、そし
てアがロースで電気泳動した。フオーム■プラスミドＤ
ＮＡ　（１０μｇ）をダルから単離し、そして５０ユニ
ツトのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含有する１０μ
ｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて２時間連結し、そしてこれ
を用いてＥ、コ！Ｊ　ＨＢＩＯＩ　を形質伝声した。陽
性クローンを迅速ＤＮＡ調裏分析により同定し、そして
陽性コロニーから調製されたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＨ
ＦＲ’　　と称する）をｄＡＭ−Ｅ、コリに形質転換し
た。 次に、下記のようにしてプラスミドｐＤ２’を得た。 ｐＤＨＦＲ’　（１５Ａｊｊ　）及びｐｓＶ４０　（２
５４）　ｆ１００μｌの緩衝液り中で２５ユニツトのＢ
ｅ１ｌを用いて５０℃にて６０分間開裂せしめ、次に５
０ユニントのＢａｍＨｌを加えて３７℃にて６０分間さ
らにインキュベートした。ＤＮＡ断片をアガロースデル
電気泳動によシ分離し、そして４．９ｋｂ　ｐＤＨＦ＊
断片及び０．２　ｋｂ　ＳＶ４０断片を単離した。これ
らの断片（２００ｎ、ｉｉｒのｐＤＨＦ’Ｒ’及び１０
０ｎ、ｌｉｌの５Ｖ４０ＤＮＡ　）　ｆ、１１００ユニ
ツトのＴ４ポリヌクレオチドリが−ゼを含有する。１０
μ！の緩衝液Ｃ中で１２℃にて４時間インキ−Ｒ−トし
、そして生成した造成物（ｐＤ２’　）を用いてＥ、コ
！ＪＲＲＩを形質転換した。 ｐ１３Ｒ３２２領域中の″毒性（ｐｏｉｓｏｎ　）″配
列（Ｌｕ５ｋｙ及びＢｏｔｃｈａ＋ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ
、　２９：Ｌ　７９−８Ｌ１９８１　　）’ｉｋ除去す
ることによりプラスミドｐＤ２’を変形した。プラスミ
ドｐＤ２’　（６，６μｇ）及びｐＭＬ−１（Ｌｕ５ｋ
ｙ及びＢｏｔｃｈａｍ　、前掲）（４μｇ）？、５０μ
ノの緩衝液Ａ中で１０ユニツトずつのＥｃｏＲＩ及びＮ
ｒｕ　ｌにより３７℃にて２時間インキ−ベートし、セ
してアガロースゲル電気泳動ヲ行った。１．７　ｋｂ　
ｐＤ２’断片及び１．８　ｋｂ　ｐＭＬ−１断片を単離
し、そして１００ユニツトのＴ４？リヌクレオチドリが
−ゼを含有する２０μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて２時
間相互に連結し、次にＥ、コリＨＢＩＯＩに形質転換し
た。目的とする造成物（ΔｐＤ２と称する）を含有する
コロニーを迅速調製分析により同定した。次に１０μｇ
のΔｐＤ２を５０μｌの緩衝液Ａ中で２０ユニツトずつ
のＥｃｏＲＩ及びＢｇｌｌｌにより３７℃にて２時間消
化した。 ＩＮＡをアがロース【より電気泳動し、そしてｐＢＲ３
２２の３′スプライス部位及びポＩＪ　Ａ配列を含有す
る目的の２．８ｋｂ断片（断片Ｃ）を単離した。 ｐＤ３の造成において使用される残りの断片を得るため
、５ａｃＵ　（５ｓｔｌｌ　）部位をＨｉｎｄｌ１１部
位又はＫｐｎ　１部位のいずれかに転換するようにｐＤ
ＨＦＲｌｌを変形した。１０μＩのｐＤＨＦＲＩＩＩ　
’ｋ　２０ユニツトのＳ＋５ｔｌｌにより３７℃にて２
時間消化し、そして次にフェノール抽出及びエタノール
沈澱を行った。 再懸濁したＤＮＡを１０　’ｍＭ　ｄＣＴＰ及び１６ユ
ニツトのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌ
の緩衝液Ｂ中で１２℃にて６０分間インキ−ベートし、
フェノール抽出し、透析し、そしてエタノール沈澱した
。ＤＮＡ　（５μｇ）を４００ユニツトのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含有する２０μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて１
０時間、５０μｇのキナーゼ処理されたＨｌｎｄｌＵ又
はＫｐｎＩリンカ−と連結し、フェノール抽出し、そし
てエタノール沈澱せしめた。５０μｌの緩衝液Ａ中に再
懸濁した後、得られたプラスミドを適当であれば５０ユ
、ニットのＨｌｎｄｌｌ又はＫｐｎｌで消化し、そして
アガロースによし電気泳動した。ｊ’シル−離したＤＮ
Ａ　（２５０ｎｇ　）を４００ユニツトのＴ０ｎ）ＮＡ
リガーゼを含有する３０μｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にで
４時間連結し、そしてこれを用いてＥ、コ！ＪＲＲＩを
形質転換した。得られたプラスミドをｐＤＥＦＲＩＩＩ
　（Ｈｌｎｄ　ｉｌｌ　）及びｐＤＨＦＲ［［（Ｋｐｍ
ｌ）と命名した。次に、７００　ｈｐ　Ｋｐｎ　ｌ　−
Ｂｇｌ　Ｉｔ断片（断片Ａ、）をｐＤＨＦＲＩｆｆ　（
Ｋｐｎ　Ｉ　）から、Ｂｇｌｌｌ及びＫｐｎｌによる消
化並びにこれに続くアガロースダル電気泳動によりＭ裂
した。 ＳＶ４０エンハンサ−配列を次のようにしてｐＤＨＦＲ
ＩＩ［（Ｈｉｎｄ　Ｉｆｆ　）に挿入した。５０４のＳ
Ｖ４０　ＤＮＡ　ｆ　１２０　μｉの緩衝液Ａ中で５０
二ニツトのＨｌｎｄｌｌＩと共に３７℃にて２時間イン
キユベートシ、そしてＨｌｎｄ　ｌｌＩｃ　ＳＶ４０断
片（５０８９−９６８ｂｐ　）をｒル精製した。プラス
ミドｐＤＩ（ＦＲ１ｌｌ（ＨｌｎｄＩＩＩ）（１０μｇ
）を２５０　ｎｇのウシ小腸ホスファターゼにより３７
℃にて１時間処理し、フェノール抽出し、そしてエタノ
ール沈澱せしめた。 線状化され之プラスミド（ｓ　ｏ　ｎｙ）　ｔ、１６μ
ｌの緩衝液Ｃ中で１２℃にて３時間、２００ユニツトの
Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼを用いて、２５０ｎ、！
ｉｉｌのＨｉｎｄｌＩＩ　ＣＳＶ４０と連結し、そして
Ｅ、コリＨＢＩＯＩに形質転換した。次に、７００塩基
対のＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎ　ｌ断片（断片Ｂ）をこのプ
ラスミドから単離した。 ｐＤ３の最終造成のため、断片Ａ及びＢ（５０ｎＪずつ
）′ｆ！ｃ、２００ユニットのＴ４ポリヌクレオチドリ
ガーゼを用いて１２℃にて４時間、１０ｎ、９の断片Ｃ
と連結し、次にＥ、コリＲＲ１’を形質転換した。 陽性コロニーを迅速調製分析により検出し、セしてｐＤ
３の大規模調製を行った。 次に、発現ベクターｐＭ７１３５　ｔ−造成した。 ９Ｍ７１１．５の複響形をＢａｍＨｌ及びＸｂａｌで消
化し。 そしてファクター■リーダー及び５′フアクタ一■配列
を含有する５５０塩基対断片をダル精製し念。 プラスミドＦＩＸ／■／　ｐＤ２　ｆ　Ｘｂａ　（及び
ＢａｍＨｌで消化【７、そしてファクター■ｃ　ＤＮＡ
の３′部分を含んで成る１７００ｂｐ断片をダル精製し
た。プラスミドｐＤ３をＢｅ１ｌで消化し、ウシアルカ
リ性ホスファターゼで処理し、そして３個の断片を三重
連結により連結した。得られた造成物を２０００塩基対
Ｘｂａｌ断片の存在についてスクリーニングした。正し
い配列を有するプラスミドを選択し。 セして９Ｍ７１３５と命名した（第８図）。 例９．　　ｃＤＮＡクローンからのファクター■の発現
ファクター■リー°イーを含有するファクター■ｃ　Ｄ
ＮＡを発現するため、λ■２４６３、又はλ■５６５及
びλＶＩ１２４６３からのＤＮＡを、Ａｄ２主要後期プ
ロモーター、ＳＶ４０エンハンサ−配列、Ａｄ２）す／
ｆルタイトリーダー、スプライスセット、及び５Ｖ４Ｑ
ポリアゾニレ−ジョンシグナルを含有する発現ベクター
にクローニングした。このベクターは、ｃＤＮＡの挿入
の部位としてユニークＥｃｏＲＩ配列を含有するように
適合されている。６０アミノ酸ノリーダーをコードする
λ■２４６３からの耐冷の発現、及び−１８から−３９
までのアミノ酸のコドンを欠き、そしてそれ故に３８ア
ミノ酸の長さのリーダーをコードするλ■５６５及びλ
■２４６３からの配列の発現を評価した。ファクター■
リーダーの構造はｅＤＮＡクローニングによってのみ同
定されているため、及び２つの異る５’−末端ｃＤＮＡ
を得ることによりて生じるあいまいさのため、本発明者
等はさらにダノムーｃＤＮＡファクター■配列を造成し
た。λ■２４６３の３′部分（エクソン２中のＢｇｌｉ
部位からポリ（Ａ）ティルへの３′リンカ−のＥｃｏＲ
１部位まで）を、エクソンＩａ、１ｂ及びエクソン２の
残りをコードするクローン７ｍｌのサプダノム断片に連
結した。ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｍ４．４ｋｂ断片として再
構成されたこのサブｒツム断片をλ■２４６３　ｃＤＮ
Ａに連結し、そして哺乳類発現ベクターにクローニング
した。 要約すれば、サブクローンを造成するため、λ■２４６
３のファクター■ｅＤＮＡ　ＥｃｏＲ１断片をｐＵｃ１
８のＩＥｃｏＲ１部位にクローニングし、そしてｐＶｌ
［２４６３と命名した。同様にして、λ■５６５のＥｃ
ｏＲｌ　ｃＤＮＡ挿入部ｔ−ｐＵｃ１８にサブクローニ
ングし、そしてｐ■５６５と命名した。クローンｐ■５
６５のファクター■配列の５′部位とｐ■２４６３のフ
ァクター■ＤＮＡの３′セグメントの間のバイブリドを
、次のようにして造成し念。すなわち、ｐ■５６５の最
も５′のＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌファクター■断片、及
びｐ■２４６３のＢｇｌ　ｌ［−Ｈｌｎｄｌ［ファクタ
ー■断片（ｐ■２４６３のポリリンカー中のＨｌｎｄ　
ｌ［部位）をＫｃｏＲＩ及びＨｌｎｄ　ＩＩＩで消化さ
れたｐＵｃ１８にクローニングした。この造成物をｐ■
２３９７と命名した。 ｐ　ｌ　２４６３及びｐ■２３９７の挿入部をＥｃｏＲ
Ｉ消化により取り出し、そしてグル濾過して、下記のよ
うにして哺乳類発現ベクターに挿入した。 Ａ、十分な長濱のファクター■ｃ　ＤＮＡの発現ファク
ター■の発現をベクターｐＤＸ中で達成した。このベク
ターはｐＤ３　（例８に記載した）及びｐＤ３’　［こ
のベクターはｐＤ３と同じであるが、但しＳＶ４０ポリ
アゾニレ−ジョンシグナル（−ｔなわち、ＳＶ４０　Ｂ
ａｍＨＩ　（２５３３ｂｐ　］　−ＢｃｌＩ　Ｃ２７７
０ｂｐ）断片が後方向（１ａｔｅ　ｏｒ１ｅｎｔａ目ｏ
ｎ）にある〕から誘導し死。従って、ｐＤ３’は遺伝子
挿入の部位としてＢａｍＨ１部位を含有−する。 ｐＤＸを形成するため、ｐＤ３’中のＥｃｏＲ−ｉ部位
を、ｇｃｏＲＩによる開裂、Ｓ１ヌクレアーゼによるイ
ンキュベーション、及びこれに続（Ｂｃｌ　ｌリンカ−
との連結により、Ｂｃｌｉ部位に転換した。ＤＮＡを陽
性に同定されたコロニーから調製し、そして変化した制
限部位を含有する１、９　ｋｂ　Ｘｈｏｌ−Ｐａｔ　Ｉ
断片をアがロースグル電気泳動により調製した。第２の
変形において、Ｄｅｌ’ｉで開裂され−たｐＤ３をキナ
ーゼ処理されたＥｅｏＲＩ　−Ｂｃｌ　Ｉアダプター（
オリゴヌクレオチドＺＣ５２５、５’　ＧＧＡＡＴＴＣ
Ｔ３’　：及びＺＣ５２６、５’　ＧＡＴＣＡＧＡＡＴ
ＴＣＣ３’から造成される）と連結して、発現ベクター
に遺伝子を挿入するための部位としてＥｃｏＲ１部位を
生じさせた。陽性コロニーヲ制限エンドヌクレアーゼ分
析により同定し、そしてこれからのＤＮＡを使用して変
形され比制限部位を含有する３、　３　ｋｂ　Ｘｈｏｌ
−ＰｓｔＩ断片を単離した。上記の２つのＤＮＡ断片を
Ｔ４ＤＮＡすが−ゼと共に一緒にインキ−ベートし、Ｅ
、コリＨＢＩＯＩに形質転換し、そして陽性コロニーを
制限分析により同定し念。ｐＤＸと称するこのようなり
ＮＡの調與を行っ念（第１２図）。このＤＮＡをＥｃ　
ｏＲ（で開裂せしめ、そして次にウジ小腸ホスファター
ゼと共にインキュベートした。次に、精製され７’ＣＤ
ＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ及びｐ■２４６３からのファ
クター■ＥｅｏＲＩ断片と、又はｐ■２３９７に由来す
る、ファクター■ＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡ断片とインキ−
ベートした。 生ずるクローンをそれぞれＦ■（２４６３）　／　ｐＤ
Ｘ。 及びＦ■（５６５＋２４６３　）／ｐＤＸと命名した。 Ｅ。 コｌＪＪＭ８３に形質転換し、次に制限酵素分析により
同定した後、プラスミドＤＮＡの調製を行い、広範囲の
制限エンドヌクレアーゼ消化によってチェックした。ｆ
ラスミドＦ■（２４６３）／ｐＤＸ、及びＦｖＩｒ（５
６５＋２４６３　）／ｐＤＸｉ１７メ！Ｊ　カン−タイ
ｆ−カルチーアー・コレクションに寄託され、それぞれ
受託番号Ａ４０２０６、及びＡ４０２’０５が与えられ
た。 Ｆ■（２４６３）／ＰＤＸ及びＦ■（５６５＋　２４６
３）／ｐＤＸ　（１０μＩずつ）のそれぞれを、１０μ
ｓのサケ精子キャリヤーＤＮＡと共に、ＢＩ（Ｋ　ｔｋ
″″ｔ１３細胞（Ｆｌｏｒｏｓ等、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｃ
１！Ｉｌｌ　Ｒ＠１１．１３２：２１５−２２３．１９
８１）又はＣＯＳ細胞のいずれかに、標準的リン酸カル
シウム沈澱法を用いてトランスフェクトした。トランス
フェクシヨンに続き、細胞を５μｍ７７ｍ１のビタミン
Ｋを含有する適当な培地に２日間培養した。この時点で
、ファクター■に対するモノクローナル抗体を用いて、
上清をｌ１ＬｘｓＡｌｌｊｌｒ性材料についてアッセイ
した。Ｆ■（２４６３）／ｐＤＸ及びＦ■（５６５＋　
２４６３　）　／　ｐＤＸの両者はファクター■ポリペ
プチドの生産を指令し、これはＣＯ８細胞上清中に検出
され、セしてＦ■（５６５＋２４６３　）　ｐＤＸから
のファクター■はＢＨＫ細胞細胞上忙中察された。Ｓｈ
ａｍ　−トランスフェクトされたＢ［細胞又はＣＯ８細
胞は検出可能なレベルの、ファクターＶＩＩをもたらさ
なかった（第５表）。 以下余白 第５表 Ｆ■（２４６３）／ｐＤＸ　　ＣＯ８２Ｘ　１０　１５
躍（５６５＋２４６３）／ｐＤＸ　　Ｃ０８２ｘ　１０
６１２対照　　　Ｃ０８２Ｘ１０６＜２ Ｆ■（２４６３）／ｐＤＸ　　　　　ＢＨＫ　　９　Ｘ
　１０’　　　６２ＦＶ１１（５６５＋２４６３）／ｐ
ＤＸ　　ＢＨＫ　　９　Ｘ　１０’　　　　６対照　　
　ＢＨＫ　９Ｘ１０　　＜２ フアクター■の一時的な発現も第６表に挙げる幾つかの
他の細胞系において試験した。 以下余白 第　　６　表 ２゜Ｒａｔ　Ｈｏｐ　■　ラット肝癌Ｈ４−１ｆ−Ｅ　
　　ＣＲＬ　１５４８ＣＭＫ−１ ５、ヒト肝癌　　　ヒト肝腺癌５Ｋ−ＨＥＰ−Ｉ　　Ｈ
ＴＢ−５２７、マウス肝　　　ＮＣＴＣクローン１４６
９　０Ｃ２９，１１０，２９３ヒト胎児腎／Ａｄ形質転
　ＣＲＬ　１５７３換 細胞を、１０μｙのＦ■（２４６３）／ｐＤＸ又けＦ■
（５６５＋２４６３　）／ｐＤＸのいずれか、並びにク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
を含んで成るシラスミド１μｇ（同時トランスフェクト
された細胞の同定を可能にするため）及び１０μｇのサ
ケ精子ＤＮＡによシ同時トランスフェクトした。６日後
にスペント培地をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を第
７表に示す。 以下余白 Ｆ■（２４６３）／ｐＤＸ（１０μｓ）又はＦ■（５６
５＋２４６３）／ｐＤＸ（１ｏμ！ｑ）を、１０μＩの
サケ精子ＤＮＡ及び哺乳類発現ベクター中ジヒドロフオ
レートリダクターゼの耐性形（Ｓｌｍｏｎｓｏｎ及びＬ
ｅｖｉｎｓｏｎ　＋　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　８０　
：　２４９５−２４９９　。 １９８３　）をコードするプラスミド１μｓと共にＢＨ
Ｋ　ｔｋ−ｔ１３細胞に同時トランスフェクトした。 ２日後、細胞を１：１４に分け、２５０ｎＭ又は１００
０　ｎＭメトトレキセー）　（ＭＴＸ　）、及び５μ９
７ａｔのビタミンＫ（フェタジオン、メルク）を含有す
る選択培地に入れた。２週間後、コロニーヲ単離し、そ
して５０〜９０俤コンフルエンシーに増殖させた。次に
上清をＥＩＪＳＡによりファクター■ポリペプチドにつ
いて測定した、２５個の陽性クローンの内２２個をさら
に分析した。細胞を、５Ｘ１０’（グループＩ）又はＩ
　Ｘ　１０５（グループ■）で、５μｇ／ゴのビタミン
に、及び２５０ｎＭ又は１０００ｍＭメトトレキセート
を含有する１０ｍの皿にグレートした。５日後、速く増
殖するクローン（第８表中＊印を付す）を１：２に分け
　そして２４時間後すべてのグレート上の培地を交換し
た。２３時間後（グループ■）又は２０時間後（グルー
プ■）、上清を収得し、そして各クローンについて細胞
を計数し念。培地をＥＬＩＩＳＡ又はワン−ステージク
ロッティングアッセイの両方により測定した。 以下余白 １５　　　の　　ｏ　　ｏｏ　　　の　　ロ　　へ　　
ト　　へ　　ψ　　Φ　　中　　寸−トト　　　寸　　
（）　　　−ｊ：Ｑ　　　ＱＱ　　　ト　　　寸　　膿
　　梢　　哨一一 ＝コニ　藁：＝＝＝　ロ　真　ニー　号の　　−り　　
−　　φ　　の　　−！　　Φ　　寸　　−−−へ　　
ＣＶＩ　　　　　　寸　　−−寸　　−の　　。　　の
　　トＢ、ファクター■ｒツム−ｅ　ＤＮＡバイブリド
の発現ファクター■ｒツム５′−末端を代表するゲノム
配列及びファクター■遺伝子３′−末端からのｃ　ＤＮ
Ａ配列を含んでなる発現ベクターヲ次のようにして調製
し次。ゲノムプラスミド７ｍｌの３つのサプクＯ−７，
７９Ｂｍ、　７　ＳＤ及び７８Ｅｆ、用イテ５′−末端
を再構成した。プラスミド７　ＢａｍはｐＵＣ１２にサ
ブクローニングされた、エクソン１ａを含有する３゜６
　ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片である。エクソ７
１３を含有する０、　７　ｋｂ　ＥｅｏＲＩ−Ｘｂａｌ
断片をこのサブクローンから単離した。これを断片ａと
称する。プラスミド７　ＳＤは、ｐｔｒｃ　１８にサブ
クローニングされた、エクソン１ｂを含有する３、７　
ｋｂＳａｔ　ｌ断片である。エクソン１ｂ含Ｍ　３．１
　ｋｂ　Ｘｂａｌ−ＳｓＬＩ断片をこのサブクローンか
ら単離した。 これを断片すと称する。！ラスミド７８Ｅは、Ｍｌ　３
ｍｐ　１９にサブクローニングされ次、エクソ／２−４
を含有する３、９ｋｂ　Ｓｓｔ［断片である。エクソン
２の５′部分を含有するＳｓＬＩ−ＢｇｌｌＴ　（０，
６ｋｂ　）　ＦＦｒ片をグル単離した。これを断片Ｃと
称する。３′−ファクター■ｃＤＮＡの残り（断片ｄ）
はｐＬＴＶＩＩ２４６３から２　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片として得た。断片ａ−ｄを、ｌｉ：ｅｏＲ
Ｉで開裂されそしてウシ小腸ホスファターゼ処理された
ｐＤＸと連結し、そしてＥ、コリＪＭ８３又はＨＢ　１
０１に形質転換した。陽性コロニーを制限酵素分析によ
り同定し、そしてこれらのコロニーからプラスミドＤＮ
Ａを調製した。 ファクター■の発現のため、プラスミドＤＮＡを前記の
ようにしてＢＨＫ又はＣＯ８に同時トランスフェクトし
た。トランスフェクトされた細胞をビタミンに一含有培
地中で２日間培養し、培地をＥＬＩＳｋによりファクタ
ー■について測定した。 以上、この発明を具体的に説明したが、この発明の範囲
内において多くの変更を行うことが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、ｃＤＮＡクローンλ■２１１５及びλ■１
９２３の部分を連結することにより形成された部分的フ
ァクター■ｃＤＮＡ配列を示す。 第１Ｂ図はλ■２４６３のファクターｖＩ［ｃＤＮＡ配
列を示す。矢印はλ■５６５の配列中の欠失の範囲を示
す。配列の上方の番号はアミノ酸を示し、下方の番号は
ヌクレオチドを示す。 ｉ２Ａ図は、幾つかの凝固因子のアミン末端領域のアミ
ノ酸配列を示す。 ｍ２Ｂ図は、蛋白質配列決定から得られたファクター■
のアミノ酸配列とｃＤＮＡによりコードされているそれ
との比較を示す。 第３図はファクター■リーダー配列とコンセンサスカル
シウム結合ドメインとの連結を示す。 第４図はファクター■−コンセンサス配列バイブリドと
部分的ファクター■ｃ　ＤＮＡとの連結によるイン−フ
レーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ　）コード配列の形成を示す
。 第５図はファクター■／ファクター■融合蛋白質をコー
ドする配列を含有するプラスミドの造成を示す。 第６図は発現ベクターＦＩＸ／Ｖ■／　ｐＤ２を示す。 使用されている記号は、Ａｄ２　ｋＬＰはアデノウィル
ス２からの主要後期（ｍａｊｏｒ　１ａｔｅ　）ブロモ
−ターであり：Ｌ１−３はアデノウィルス２トリパルタ
イト（ｔｒｌｐｒａｔｌｔｓ　）リーダー配列であり：
５’ａｍは５′スゾライス部位であり；　３／、ｓは３
′スプライス部位であり；そしてｐＡはＳＶ４０からの
後期ポリ了デニレーシ、ンシグナルでアル。 第７図はファクター■／ファクター■ｃＤＮＡ融合体の
ヌクレオチド配列を示す。 第８図は発現ベクターｐＭ７１３５を示す。使用されて
いる記号は、ＥはＳＶ４０エンハンサ−であり：ａｒｔ
は０−１マツグユニツトＡｄ５であり：ｐＡはＳＶ４０
からの前記ポリアゾニレ−ジョンシグナルであり；Δは
ｐＢＲ３２２”毒性（ｐｏｌｓ（Ｈ）　”配列の欠失領
域であり：そして他の記号は第６図に記載した通りであ
る。 第９図は２４６３　ｂｐのファクター■ｃ　ＤＮＡのサ
ブクローニングを示す。 第１０図は５６５　ｂｐのファクター■ｃ　ＤＮＡのサ
ブクローニングを示す。 第１１図はｐ■５６５の５′末端とｐＵｃ１８中のｐ）
ｍ２４６３の３′末端との連結によるｐ■２３９７の形
成を示す。 第１２図は発現プラスミドＦ■（２４６３）／Ｉ）ＤＸ
及びＦ■（５６５＋２４６３）／　ｐＤＸの造成を示す
。ｐＡは、例９に示すように、前期又は後期方向に卦け
る５Ｖ４３からのボリアデニレーショ７シグナルを示す
。他の記号は第８図について記載したのと同じである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性化後にファクターVIIIａと同一の又は実質的に
   同一の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を
   コードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成物。 ２、前記ヌクレオチド配列が少なくとも部分的にファク
   ターVIIをコードし、該ヌクレオチド配列はカルシウム
   結合ドメインをコードする第１ヌクレオチド配列を含ん
   で成り、該第１配列はその下流に位置する第２ヌクレオ
   チド配列に連結されており、該第２ヌクレオチド配列は
   ファクターVIIａのセリンプロテアーゼ活性のための触
   媒ドメインをコードしており、これらの連結された配列
   が、活性化後にファクターVIIａと同一の又は実質的に
   同一の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質を
   コードしている特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ造
   成物。 ３、前記第１ヌクレオチド配列が実質的に、ファクター
   VIIをコードする遺伝子、ファクターIXをコードする遺
   伝子、ファクターＸをコードする遺伝子、プロテインＣ
   をコードする遺伝子、プロスロンビンをコードする遺伝
   子、及びプロテインＳをコードする遺伝子から成る群か
   ら選ばれた遺伝子のそれである特許請求の範囲第２項に
   記載のＤＮＡ造成物。 ４、前記第１ヌクレオチド配列がさらにリーダ−ペプチ
   ドをコードしている特許請求の範囲第２項に記載のＤＮ
   Ａ造成物。 ５、前記第１ヌクレオチド配列が合成された２本鎖オリ
   ゴヌクレオチドを含有する特許請求の範囲第２項に記載
   のＤＮＡ造成物。 ６、前記合成された２本鎖オリゴヌクレオチドがファク
   ターVIIIのアミノ末端部分を実質上コードしている特許
   請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ造成物。 ７、前記ヌクレオチド配列がファクターVIIIをコードし
   ている特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ造成物。 ８、前記ヌクレオチド配列の少なくとも部分がファクタ
   ーVIIのｃＤＮＡクローン又はゲノムクローンに由来す
   る特許請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ造成物。 ９、ファクターVIIのｃＤＮＡクローン又はゲノムクロ
   ーンに由来する第１ヌクレオチド配列を含んで成り、該
   第１ヌクレオチド配列がその下流に位置する第２ヌクレ
   オチド配列に連結されており、該第２ヌクレオチド配列
   がファクターVIIのｃＤＮＡクローンに由来し、そして
   これらの連結された配列が、活性化後にファクターVII
   ａと同一の又は実質的に同一の血液凝固のための生物学
   的活性を有する蛋白質をコードしている特許請求の範囲
   第７項に記載のＤＮＡ造成物。 １０、前記ヌクレオチド配列が第１Ｂ図中の第３６塩基
   対から第１４３３塩基対までのｃＤＮＡ配列を含んで成
   る特許請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ造成物。 １１、前記ヌクレオチド配列が第１Ｂ図中の第３６塩基
   対から第９９塩基対まで、及びそれに続く第１６６塩基
   対から第１４３３塩基対までのｃＤＮＡ配列を含んで成
   る特許請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ造成物。 １２、哺乳類動物宿主細胞ＤＮＡ中に取り込まれ得る組
   換プラスミドであって、プロモーター、該プロモーター
   に続きその下流に、活性化後にファクターVIIａと同一
   の又は実質的に同一の血液凝固のために生物学的活性を
   有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、及びこれ
   に続きその下流にポリアデニレーションシグナルを含有
   しているプラスミド。 １３、哺乳類動物宿主細胞ＤＮＡ中（取り込まれ得る組
   換プラスミドであって、プロモーター、該プロモーター
   に続きその下流に、活性化後にファクターVIIａと同一
   の又は実質的に同一の血液凝固のための生物学的活性を
   有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、及びこれ
   に続きその下流にポリアデニレーションシグナルを含有
   しているプラスミドによりトランスフェクトされた哺乳
   類細胞。 １４、ファクターVIIａにより介在される血液凝固のた
   めの生物学的活性を有する蛋白質の製造方法であって、 活性化後にファクターVIIａと同一の又は実質的に同一
   の血液凝固のための生物学的活性を有する蛋白質をコー
   ドするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ造成物を含む
   哺乳類宿主細胞を樹立し；該哺乳類宿主細胞を適当な培
   地中で増殖せしめ；該哺乳類宿主細胞により生産された
   、前記ＤＮＡ造成物によりコードされている蛋白質生成
   物を単離し；そして、該蛋白質生成物を活性化して、フ
   ァクターVIIａと同一の又は実質的に同一の血液凝固の
   ための生物学的活性を有する蛋白質を生じさせる；こと
   を含んで成る方法。 １５、前記宿主細胞にジヒドロフォレートレダクターゼ
   をコードする遺伝子を同時にトランスフェクトし、前記
   適当な培地にメトトレキセートを含有せしめることによ
   り前記ＤＮＡ造成物を増幅することを含む特許請求の範
   囲第１４項に記載の方法。 １６、前記蛋白質生成物を、ファクターＸIIａ、ファク
   ターIXａ、カリクレイン、ファクターＸａ、及びトロン
   ビンから成る群から選ばれた蛋白質分解酵素と反応せし
   めることにより該蛋白質生成物を活性化する特許請求の
   範囲第１４項に記載の方法。 １７、特許請求の範囲第１４項に記載の蛋白質を含んで
   成る出血疾患の治療のための医薬。