PT1325115T - Recetor de citocina zcytor17 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO RECETOR DE CITOCINA ZCYTOR17

Hormonas e fatores de crescimento de polipéptido controlam proliferação e diferenciação de células de organismos multicelulares. Estas moléculas distribuíveis permitem que as células se comuniquem umas com as outras e atuem em harmonia para formar células e órgãosô e para reparar tecido danificado. Exemplos de hormonas e fatores de crescimento incluem as hormonas esteroides (por exemploô estrogénioô testosterona'ô hormona paratiroideô hormona estimulante de folículoô as interleucinasô fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF'ô fator de crescimento epidérmico (EGF'o fator estimulante de colónia de granulõcito-macrófago (GM-CSF'ô eritropoietina (EPO' e calcitonina.

As hormonas e os fatores de crescimento influenciam o metabolismo celular por meio da ligação a recetores. Os recetores podem ser proteínas de membrana integral que são ligados a vias de sinalização dentro da célulaô tais como sistemas de segundo mensageiro. Outras classes de recetores são moléculas solúveisô tais como os fatores de transcrição. De particular interesse são recetores para citocinasô moléculas que promovem a proliferação eúou diferenciação de células. Exemplos de citocinas incluem eritropoietina (EPO'ô que estimula o desenvolvimento de células sanguíneas vermelhas; trombopoietina (TPO'ô que estimula o desenvolvimento de células da linha de megacariócito; e fator estimulante de colónia de granulócito (G-CSF'ô que estimula o desenvolvimento de neutrófilos. Estas citocinas são úteis em restaurar níveis normais de células sanguíneas em pacientes que sofrem de anemiaô trombocitopeniaô e neutropenia ou que recebem quimioterapia contra cancro. 0 documento ΞΡ-Α-1188830 descreve ο recetor de hemopoietina NR10Ô implicada na regulação da hematopoiese do sistema imune in vivo, e as suas utilizações no rastreio de novos fatores hematopoiéticosô ou para o desenvolvimento de medicamentos para o tratamento de doenças do sistema imuneúhematopoiético.

As atividades in vivo demonstradas destas citocinas ilustram o enorme potencial clínico deô e a necessidade deô outras citocinasô agonistas de citocinaô e antagonistas de citocina. A presente invenção resolve estas necessidades proporcionando um novo recetor de citocina hematopoiéticoô bem como composições e métodos relacionados.

Um polinucleótido isolado que codifica um polipéptidoô em que a sequência de aminoãcidos do polipéptido é selecionada a partir do grupo de: (a) uma sequência de aminoãcidos que compreende os resíduos de aminoãcidos 1 (Met) a 732 (Vai) como mostrado na SEQ ID NO:2; (b) uma sequência de aminoãcidos que compreende os resíduos de aminoãcidos 20 (Ala) a 732 (Vai) como mostrado na SEQ ID NO: 2; (c) uma sequência de aminoãcidos que compreende os resíduos de aminoãcidos 544 (Lys) a 732 (Vai) como mostrado na SEQ ID NO: 2; (d) uma sequência de aminoãcidos que compreende os resíduos de aminoãcidos 1-239 da SEQ ID NO: 22; (e) uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 20 (Ala) a 227 (Pro) como mostrado na SEQ ID NO:2; (f) uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1 (Met) a 649 (Ile) como mostrado na SEQ ID NO:46; e (g) uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1-324 da SEQ ID NO: 18. A Figura 1 é um alinhamento múltiplo de sequências de polinucleótido zcytorl7 SEQ ID NO: 46Ô SEQ ID NO: 18Ô SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 22.

Dentro de um aspetoô a presente memória descritiva descreve um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos que é pelo menos 90 ® idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 227 (Pro'; (b' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 519 (Glu'; (c' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 54 3 (Leu' ; (d' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 544 (Lys' ao aminoácido número 732 (Vai'; (e' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 544 (Lys' ao aminoácido número 64 9 (lie'; (f' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 732 (Vai'; (g' a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 64 9 (lie' ; (h' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 732 (Vai' ; e (i' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 649 (He'. A presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que consiste em: a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 227 (Pro'; ou a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 649 (Ile'; ou que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos selecionados a partir de: a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoãcido número 544 (Lys' ao aminoácido número 732 (Vai' ; a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 732 (Vai'; e a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 732 (Vai'.

Numa outra forma de realizaçãoô o polinucleótido isolado revelado acima consiste numa sequência selecionada a partir de: um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: la partir do nucleótido número 228 ao aminoácido número 851; um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: 45 a partir do nucleótido número 162 ao aminoácido número 2108; e uma sequência de polinucleótidos complementar a estas sequências; ou compreende uma sequência selecionada a partir de: um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: 1 a partir do nucleótido número 1800 ao aminoácido número 2366; um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: 1 a partir do nucleótido número 228 ao aminoácido número 2366; um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: la partir do nucleótido número 171 ao aminoácido número 2366; e uma sequência de polinucleótidos complementar a estas sequências. Num outro aspeto o polinucleótido isolado revelado acima codifica um polipéptido que compreende ainda um domínio transmembrana que consiste nos resíduos 520 (lie' a 543 (Leu' da SEQ ID NO: 2. Num outro aspeto o polinucleótido isolado revelado acima codifica um polipéptido que compreende ainda um domínio intracelular que consiste nos resíduos 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2 ou 544 (Lys' a 649 (lie' da SEQ ID NO: 46. A memória descritiva proporciona ainda que o polinucleótido isolado revelado acima codifica um polipéptido que tem atividade conforme medido por proliferação celularô ativação de transcrição de um gene repórterô ou em que o polipéptido codificado pelo polinucleótido que se liga ainda a um anticorpoô em que o anticorpo é elevado a um polipéptido que compreende uma sequência de aminoãcidos a partir do grupo que consiste em: (a' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 227 (Pro' da SEQ ID NO: 2; (b' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 519 (Glu' da SEQ ID NO: 2; (c' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 543 (Leu' da SEQ ID NO: 2; (d' o polipéptido que compreende o aminoácido número 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; (e' o polipéptido que compreende o aminoácido número 544 (Lys' a 649 (Ile' da SEQ ID NO: 46; (f' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; (g' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 649 (lie' da SEQ ID NO: 46; (h' o polipéptido que compreende o aminoácido número 1 (Met' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; e (i' o polipéptido que compreende o aminoácido número 1 (Met' a 64 9 (lie' da SEQ ID NO: 46ô e em que a ligação do anticorpo ao polipéptido isolado é medida por um ensaio biológico ou bioquímico incluindo radioimunoensaioô radioimuno-precipitaçãoô Western blotô ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima.

Dentro de um segundo aspetoô a presente invenção proporciona um vetor de expressão que compreende os seguintes elementos operativamente ligados: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que codifica um polipéptido; e um terminador de transcriçãoô em que o promotor é operativamente ligado ao segmento de ADNô e o segmento de ADN é operativamente ligado ao terminador de transcrição; e em que a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i' uma sequência de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; (ii' uma sequência de aminoãcidos que consiste em que compreende os resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; e (iii' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO: 2. Numa forma de realização do vetor de expressão revelado acimaô o polipéptido codificado é como definido em (i' ou (ii' ô e o vetor de expressão compreende ainda uma sequência de sinal secretor operativamente ligada ao segmento de ADN.

Dentro de um terceiro aspetoô a presente invenção proporciona uma célula cultivada que compreende um vetor de expressão como revelado acimaô em que a célula expressa um polipéptido codificado pelo segmento de ADN. Num aspeto da revelaçãoô o vetor de expressão revelado acima compreende ainda um domínio transmembrana que consiste nos resíduos 520 (lie' a 543 (Leu' da SEQ ID NO: 2. Num outro aspeto da revelaçãoô o vetor de expressão revelado acima compreende ainda um domínio intracelular que consiste nos resíduos 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2ô ou resíduos 544 (Lys' a 649 (lie' da SEQ ID NO: 46.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona uma célula cultivada em que foi introduzido um vetor de expressão como definido nas reivindicaçõesô em que a célula expressa um polipéptido de recetor solúvel codificado pelo segmento de ADN.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona uma construção de ADN que codifica uma proteína de fusãoô a construção de ADN compreende: (i' um primeiro segmento de ADN que codifica um polipéptidoô em que a sequência de aminoãcidos do polipéptido é selecionada a partir do grupo de: (a' uma sequência de aminoãcidos que compreende os resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO:2; (b' uma sequência de aminoãcidos que compreende os resíduos de aminoãcidos 544 (Lys' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO:2; (c' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; e (d' uma sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO: 2; e (ii' pelo menos um outro segmento de ADN que codifica um polipéptido adicionalô em que o polipéptido adicional é uma proteína heteróloga selecionada a partir de: (a' uma região ou domínio de uma outra proteína da família de recetor de citocina humana; (b' um péptido de sinal secretor não ativo eúou não relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão; e (c' uma etiqueta de afinidade selecionada a partir de uma proteína de ligação a maltose ou um domínio de imunoglobulina; em que o primeiro segmento de ADN e outros segmentos de ADN são ligados em quadro; e em que o primeiro segmento de ADN e outros segmentos de ADN codificam a proteína de fusão.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um vetor de expressão que compreende os seguintes elementos operativamente ligados: um promotor de transcrição; uma construção de ADN que codifica uma proteína de fusão como definido nas reivindicações; e um terminador de transcriçãoô em que o promotor é operativamente ligado à construção de ADNô e a construção de ADN é operativamente ligada ao terminador de transcrição.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona uma célula cultivada que compreende um vetor de expressão como definido nas reivindicaçõesô em que a célula expressa um polipéptido codificado pela construção de ADN.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um método de produção de uma proteína de fusão que compreende: cultivar uma célula como revelado acima; e isolar o polipéptido produzido pela célula.

Dentro de um outro aspetoô a presente memória descritiva descreve um polipéptido isolado que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos que é pelo menos 90 ® idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 227 (Pro'; (b' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 519 (Glu'; (c' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 543 (Leu'; (d' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 544 (Lys' ao aminoácido número 732 (Vai'; (e' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 544 (Lys' ao aminoácido número 649 (Ile'; (f' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 732 (Vai'; (g' a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 649 (Ile'; (h' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 732 (Vai'; e (i' a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 46 a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 649 (He'. A presente invenção proporciona um polipéptido isolado que consiste em: a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 2 0 (Ala' ao aminoácido número 227 (Pro' ou a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 4 6 a partir do aminoácido número 1 (Met' ao aminoácido número 649 (Ile' ; ou que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos selecionados a partir de: a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 544 (Lys' ao aminoácido número 732 (Vai'; a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala' ao aminoácido número 732 (Vai'; e a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 1 {Met' ao aminoácido número 732 {Vai'. Num outro aspeto the polipéptido isolado revelado acima compreende ainda um domínio transmembrana que consiste nos resíduos 520 (lie' a 543 (Leu' da SEQ ID NO: 2. Num outro aspetoô the polipéptido isolado revelado acima compreende ainda um domínio intracelular que consiste nos resíduos 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2 ou 544 (Lys' a 649 (He' da SEQ ID NO: 46. A memória descritiva proporciona ainda que o polipéptido isolado revelado acima tem atividade conforme medido por proliferação celularô ativação de transcrição de um gene repórterô ou em que o polipéptido codificado pelo polinucleótido que se liga ainda a um anticorpoô em que o anticorpo é elevado a um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos a partir do grupo que consiste em: (a' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 227 (Pro' da SEQ ID NO: 2; (b' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 519 (Glu' da SEQ ID NO: 2; (c' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 543 (Leu' da SEQ ID NO: 2; (d' o polipéptido que compreende o aminoácido número 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; (e' o polipéptido que compreende o aminoácido número 544 (Lys' a 649 (He' da SEQ ID NO: 46; (f' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; (g' o polipéptido que compreende o aminoácido número 20 (Ala' a 649 (He' da SEQ ID NO: 46; (h' o polipéptido que compreende o aminoácido número 1 (Met' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; e (i' o polipéptido que compreende o aminoácido número 1 (Met' a 64 9 (Ile' da SEQ ID NO: 46ô e em que a ligação do anticorpo ao polipéptido isolado é medida por um ensaio biológico ou bioquímico incluindo radioimunoensaioô radioimuno-precipitaçãoô Western blotô ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um método de produção de um polipéptido de zcytorl7 que compreende: cultivar uma célula como revelado acima; e isolar o polipéptido de zcytorl7 produzido pela célula.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um polipéptido isolado que consiste em: a sequência de aminoãcidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoãcido número 20 (Ala' ao aminoãcido número 227 (Pro'; ou a sequência de aminoãcidos como é mostrada na SEQ ID NO: 18; ou que compreende a sequência de aminoãcidos como é mostrada na SEQ ID NO: 22; em que o polipéptido é substancialmente livre de domínios transmembrana e intracelular ordinariamente associados a recetores hematopoiéticos. Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um método de produção de um polipéptido de zcytorl7 que compreende: cultivar uma célula como revelado acima; e isolar o polipéptido de zcytorl7 produzido pela célula. Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um método de produção de um anticorpo a um polipéptido de zcytorl7 que compreende: inocular um animal com um polipéptido selecionado a partir do grupo que consiste em: um polipéptido que compreende aminoãcidos na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoãcido número 20 (Ala' ao aminoãcido número 732 (Vai'; um polipéptido que consiste em aminoãcido número 20 (Ala' a 227 (Pro' da SEQ ID NO: 2; um polipéptido que compreende o aminoãcido número 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; um polipéptido que compreende o aminoãcido número 20 (Ala' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; um polipéptido que compreende o aminoãcido número 1 (Met' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2; e um polipéptido que consiste em aminoãcido número 1 (Met' a 649 (lie' da SEQ ID NO: 46; e em que o polipéptido provoca uma resposta imune no animal para produzir o anticorpo; e isolar o anticorpo a partir do animal. Dentro de um outro aspetoô a presente revelação proporciona um anticorpo produzido pelo método como revelado acimaô que se liga especif icamente a um polipéptido de zcytorl7. Num aspeto o anticorpo revelado acima é um anticorpo monoclonal.

Dentro de um outro aspetoô a presente revelação proporciona um anticorpo que se liga especificamente a um polipéptido como revelado acima. Numa forma de realizaçãoô o anticorpo revelado acima liga-se a um polipéptido como revelado acima.

Dentro de um outro aspetoô a presente revelação proporciona um método de deteçãoô numa amostra de testeô da presença de um modulador de atividade de proteína zcytorl7ô que compreende: cultivar uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão como revelado acimaô em que a célula expressa a proteína codificada pelo segmento de ADN na presença e ausência de uma amostra de teste; e comparar níveis de atividade da proteína na presença e ausência de uma amostra de testeô por um ensaio biológico ou bioquímico; e determinar a partir da comparaçãoô a presença de modulador de atividade de proteína na amostra de testeô como indicado nas reivindicações.

Dentro de um outro aspetoô a presente invenção proporciona um método para detetar um ligando de recetor zcytorl7 dentro de uma amostra de testeô que compreende: colocar em contato uma amostra de teste com um polipéptido grupo que consiste em: a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 2 a partir do aminoácido número 20 (Ala) ao aminoácido número 227 (Pro) ; ou a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 18; ou colocar em contato uma amostra de teste com um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos como é mostrada na SEQ ID NO: 22; e detetar a ligação do polipéptido a um ligando na amostra. Numa forma de realização é proporcionado o método revelado acima em que o polipéptido é ligado à membrana dentro de uma célula cultivadaô e a etapa de deteção compreende medir uma resposta biológica na célula cultivada. Numa outra forma de realização é proporcionado o método revelado acima em que a resposta biológica é proliferação celular ou ativação de transcrição de um gene repórter.

Antes de expor a invenção em detalheô pode ser proveitoso para o entendimento da mesma definir os seguintes termos: 0 termo 13 etiqueta de afinidadeB é utilizado no preate documento para denotar um segmento de polipéptido que pode ser unido a um segundo polipéptido para proporcionar purificação ou deteção do segundo polipéptido ou proporcionar locais para união do segundo polipéptido a um substrato. Em principalô qualquer péptido ou proteína para que um anticorpo ou outro agente de ligação específico está disponível pode ser utilizado como uma etiqueta de afinidade. Etiquetas de afinidade incluem um trato de polihistidinaô proteína A (Nilsson et al.ô EMBO J. 4:10750 1985; Nilsson et al.ô Methods Enzymol. 198:3ô 1991'ô glutationa S transferase (Smith e Johnsonô Gene 67:31o 1988'ô etiqueta de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952-401985'ô substância Pô péptido Flag™ (Hopp et al.ô Biotechnology 6:1204-10Ô 1988'ô péptido de ligação a estreptavidinaô ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Veja-seô em geralô Ford et al.ô Protein Expression and Purification 2: 95-107Ô 1991. Etiquetas de afinidade que codificam ADN estão disponíveis de fornecedores comerciais (por exemploô Pharmacia Biotechô Piscatawayô NJ' . 0 termo 0 variante alélicaB é utilizado no presente documento para denotar qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge de forma natural através de mutaçãoô e pode ter como resultado polimorfismo fenotípico dentro de populações. Mutações génicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipéptido codificado' ou pode codificar polipéptidos que têm sequência de aminoãcido alterada. 0 termo variante alélica também é utilizado no presente documento para denotar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. 0 termos "amino-terminal" e "carboxil-terminal" são utilizados no presente documento para denotar posições dentro dos polipéptidos. Onde o contexto permiteô estes termos são utilizados com referência a uma particular sequência ou porção de um polipéptido para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemploô uma certa sequência posicionada carboxil-terminal com relação a uma sequência de referência dentro de um polipéptido está localizada proximal à terminação carboxilo da sequência de referênciaô mas não está necessariamente na terminação carboxilo do polipéptido completo. 0 termo "par complementoúanti-complemento" denota frações não idênticas que formam um par estável associado de forma não covalente sob condições apropriadas. Por exemploô biotina e avidina (ou estreptavidina' são membros prototípicos de um par complementoúanti-complemento. Outros pares complementoúanti-complemento exemplares incluem pares recetorúligandoô pares anticorpoúantigénio (ou hapteno ou epítopo'0 pares de polinucleótido senseúantissenseô e similares. Onde a dissociação subsequente do par complementoúanti-complemento é desej ávelô o par complementoúanti-complemento preferentemente tem uma afinidade de ligação de <109 M”1. 0 termo "complementos de uma molécula de polinucleótido" é uma molécula de polinucleótido que tem uma sequência de bases complementares e orientação reversa em comparação com uma sequência de referência. Por exemploô a sequência 50 ATGCACGGG 30 é complementar a 50 GTGCAT 30 . 0 termo "contig" denota um polinucleótido que tem um trecho contíguo de sequência idêntica ou complementar a outro polinucleótido. Diz-se que as sequências contíguas ãsobrepõeã um dado trecho de sequência de polinucleótido em sua totalidade ou ao longo de um trecho parcial do polinucleótido. Por exemploô contigs representativos da sequência de polinucleótido 5'-ATGGCTTAGCTT-3' sl o 5'-TAGCTTgagtct-3' e 3'-gtcgacTACCGA-5'. 0 termo ãsequência de nucleótidos degeneradaã denota uma sequência de nucleótidos que inclui um ou mais codões degenerados (em comparaç® o com uma molécula de polinucleótido de referência que codifica um polipéptido® . Codões degenerados contêm tripletes diferentes de nucleótidosô mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto éô tripletes GAU e GAC cada codificam Asp® . 0 termo ãvetor de express® oã é utilizado para deno&amp;r uma molécula de ADNô linear ou circularô que compreende um segmento que codifica um polipéptido de interesse ligado operativamente a segmentos adicionais que possibilitam sua transcriç® o. Tais segmentos adicionais incluem seqências promotoras e de terminaç® oô e podem também incluiruma ou mais origens de replicaç® oô um ou mais marcadores selecionáveisô um potenciadorô um sinal de poliadenilaç® oô etc. Vetores de express® o s® o geralmente derivadosle ADN de plasmídeo ou viralô ou pode conter elementos de ambos. 0 termo ãisoladoãô quando é aplicado a um polinucleótidoô denota que o polinucleótido foi retirado de seu ambiente genético natural e é assim livre de outras sequências codificantes estranhas ou η® o desejadasôe está numa forma adequada para utilizaç® o dentro sistemas de produç® o de proteínas modificadas por engenharia geética. Tais moléculas isoladas s® o aquelas que s® o separad de seu ambiente natural e incluem ADNc e clones genómicos. Moléculas isoladas de ADN da presente invenç® o s® divres de outros genes com que est® o ordinariamente assocàdosô mas podem incluir regiões η® o traduzidas que ocorra de forma natural 5' e 3' tal como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas será evidente a um perito comum na especialidade (veja-seô por exemploô Dynan e Tijanô Nature 316:774-780 1985'.

Um polipéptido ou proteína "isolado" é um polipéptido ou proteína que se encontra numa condição diferente de seu ambiente nativoô tal como fora do tecido animal e sangue. Numa forma preferidaô o polipéptido isolado é substancialmente livre de outros polipéptidosô particularmente outros polipéptidos de origem animal. É preferido proporcionar os polipéptidos numa forma altamente purificadaô isto éô superior a 95 % puraô mais preferentemente superior a 99 % pura. Quando é utilizado neste contextoô o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipéptido em formas físicas alternativasô tais como dímerosô multímerosô ou alternativamente formas glicosiladas ou derivatizadas. 0 termo "ligado operativamente"ô quando se refere a segmentos de ADNô indica que os segmentos são dispostos de modo que funcionam em harmonia para seus propósitos pretendidosô por exemploô a transcrição inicia no promotor e prossegue através do segmento de codificação até o terminador. 0 termo "ortólogo" denota um polipéptido ou proteína obtida de uma espécie que é a contraparte funcional de um polipéptido ou proteína de uma espécie diferente. Diferenças de sequência entre ortólogos são o resultado de especiação. "Parálogos" são proteínas distintasô mas estruturalmente relacionadas feitas por um organismo. Acredita-se que os parálogos surjam através da duplicação do gene. Por exemploô a-globinaô β-globinaô e mioglobina são parálogos entre si.

Um "polinucleótido" é um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleótido ou ribonucleótido lidos desde a extremidade 50 até a extremidade 30 .Os polinucleótidos incluem ARN e ADNô e podem ser isolados de fontes naturaisô sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. Os tamanhos de polinucleótidos são expressos como pares de bases (abreviados "pb"'ô nucleótidos ("nt"'ô ou quilobases ("kb"'. Onde o contexto permitaô os dois últimos termos podem descrever polinucleótidos que são de cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é utilizado para denotar o comprimento completo e será entendido que seja equivalente ao termo "pares de bases". Será reconhecido pelos peritos na especialidade que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem diferir ligeiramente em comprimento e que as extremidades do mesmo podem ser dispostas alternadamente como um resultado da clivagem enzimática; assim todos os nucleótidos dentro de uma molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não ser emparelhados.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácido unido por ligações peptídicasô tanto se for produzido de forma natural ou sinteticamente. Polipéptidos de menos de aproximadamente 10 resíduos de aminoácido são comummente denominados como "péptidos". "Sondas eúou iniciadores" como usado no presente documento pode ser ARN ou ADN. ADN pode ser ADNc ou ADN genómico. Sondas e iniciadores de polinucleótido são ADN ou ARN de cadeia simples ou duplaô geralmente oligonucleótidos sintéticosô mas podem ser gerados a partir de ADNc clonado ou sequências genõmicas ou seus complementos. Sondas analíticas geralmente terão pelo menos 20 nucleótidos de comprimentoô embora sondas alguma coisa mais curtas (14-17 nucleótidos' possam ser usadas. Iniciadores de PCR têm pelo menos 5 nucleótidos de comprimentoô preferentemente 15 ou mais ntô mais preferentemente 20-30 nt. Polinucleótidos curtos podem ser usados quando uma pequena região do gene seja tida como alvo para análise. Para uma análise grosseira de genesô uma sonda de polinucleõtido pode compreender um exão inteiro ou mais. As sondas podem ser marcadas para proporcionar um sinal detetávelô tal como com uma enzimaô biotinaô um radionuclídeoô fluoróforoô agente quimioluminescenteô partícula paramagnética e semelhantesô que estão comercialmente disponíveis junto a muitas fontesô tais como Molecular Probesô Inc.ô Eugeneô ORô e Amersham Corp.ô Arlington Heightsô ILô usando técnicas que são bem conhecidas na especialidade. 0 termo "promotor" é utilizado no presente documento pelo seu significado conhecido na especialidade para denotar uma porção de um gene que contém sequências de ADN que tratam da ligação de ARN polimerase e iniciação da transcrição. As sequências promotoras são comummenteô mas não sempreô encontradas nas regiões não codificantes 5' dos genes.

Uma "proteína" é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipéptidos. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicosô tais como grupos de hidratos de carbono. Hidratos de carbono e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzidaô e variará com o tipo de célula. As proteínas são definidas no presente documento em termos das suas estruturas principais de aminoácido; substituintes tais como grupos de hidratos de carbono não são geralmente especificadosô mas podem estar presentes mesmo assim. 0 termo "recetor" é usado no presente documento para denotar uma proteína associada à célulaô ou uma subunidade de polipéptido de tal proteínaô que se liga a uma molécula bioativa (o "ligando") e medeia o efeito do ligando sobre a célula. A ligação do ligando ao recetor tem como resultado uma mudança conformacional no recetor (eô em alguns casosô multimerização de recetorô isto éô associação de subunidades de recetor idênticos ou diferentes' que causa interações entre o(s' domínio(s' efetor(es' e outra(s' molécula(s' na célula. Estas interações por sua vez levam a alterações no metabolismo da célula. Eventos metabólicos que sâo ligados a interações recetor-ligando incluem transcrição de geneô fosforilaçãoô desfosforilaçãoô proliferação celularô aumentos na produção de AMP cíclicoô mobilização de cálcio celularô mobilização de lípidos de membranaô adesão celularô hidrólise de lípidos de inositol e hidrólise de fosfolípidos. Recetores de citocina de superfície celular são caraterizados por uma estrutura multi-domínio como discutido em mais detalhe a seguir. Estes recetores estão ancorados na membrana celular por um domínio transmembrana caraterizado por uma sequência de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (tipicamente cerca de 21-25 resíduos'ô que é comummente flanqueado por resíduos positivamente carregados (Lys ou Arg'. Em geralô os recetores podem ser recetor ligado à membranaô citossólico ou nuclear; monomérico (por exemploô recetor da hormona de estimulação da tireoideô recetor beta-adrenérgico' ou multimérico (por exemploô recetor do PDGFô recetor da hormona do crescimentoô recetor da IL-3Ô recetor do GM-CSFô recetor do G-CSFô recetor da eritropoietina e recetor da IL-6'. 0 termo "recetor polipéptido" é usado para denotar cadeias de polipéptido recetor completas e porções das mesmasô incluindo domínios funcionais isolados (por exemploô domínios de ligação a ligando'.

Um "sequência de sinal secretor" é uma sequência de ADN que codifica um polipéptido (um "péptido de secreção"' queô como um componente de um polipéptido maiorô direciona o polipéptido maior através de uma via de secreção de uma célula na qual é sintetizado. 0 péptido maior é comummente clivado para remover o péptido de secreção durante o trânsito através da via de secreção.

Um "recetor solúvel" é um polipéptido recetor que não é ligado a uma membrana celular. Recetores solúveis são o mais comummente polipéptidos recetores de ligação a ligando que não possuem domínios transmembrana e citoplasmãtico. Recetores solúveis podem compreender resíduos de aminoácido adicionaisô tal como etiquetas de afinidade que proporcionam a purificação do polipéptido ou proporcionam locais para união do polipéptido a um substratoô ou sequências de região constante de imunoglobulina. Muitos recetores de superfície celular têm contrapartes de ocorrência naturalô solúveis que são produzidos por proteólise. Diz-se que os polipéptidos recetores solúveis são substancialmente livres de segmentos de polipéptido transmembrana e intracelular quando não possuem suficientes porções destes segmentos para proporcionar ancoramento de membrana ou transdução de sinalô respetivamente. 0 termo "variante splice" é utilizado no presente documento para denotar formas alternativas de ARM transcritas de um gene. Variação splice surge de forma natural através da utilização de locais de splicing alternativo dentro de uma molécula de ARN transcritaô ou menos comummente entre moléculas de ARN separadamente transcritasô e pode ter como resultado diversos ARNm transcritos do mesmo gene. Variantes splice podem codificar polipéptidos que têm sequência de aminoácidos alterada. 0 termo variante splice é também usado no presente documento para denotar uma proteína codificado por um variante splice de um ARNm transcrito a partir de um gene.

Massas moleculares e comprimentos de polímeros determinados por meio de métodos analíticos imprecisos (por exemploô eletroforese em gel' serão entendidos como sendo valores aproximados. Quando tal valor é expresso como "aproximadamente" X ou "de maneira aproximada" Xô o valor indicado de X será entendido que seja exato a ±10 ®. A presente invenção baseia-seô em parteô na descoberta de uma nova sequência de ADN que codifica uma proteína que tem a estrutura de um recetor de citocina de classe I. A sequência de aminoácidos deduzida indicou que o recetor codificado pertence à subfamília de recetor que inclui gpl30ô LIFô IL-12Ô recetor de oncostatina M (OSM-R'ô recetores de WSX-1 (Sprecher CA et al.ô Biochem. Biophvs. Res. Comm. 246:81-90 (1998'ô DCRS2 (Publicação WIPO N° WOOOÚ73451'ô o recetor de IL-2 (subunidade β e o recetor comum β (isto éô IL3Ô 1L-5Ô e subunidades β de recetor de GM-CSF'. O polipéptido foi designado zcytorl7. A sequência de polinucleõtido zcytorl7 codifica toda a sequência codificante da proteína predita. Zcytorl7 é um novo recetor de citocina que pode estar envolvido na regulação imuneô uma via de célula apoptóticaô como uma molécula de sinalização célula-célulaô recetor de fator de crescimentoô ou proteína associada a matriz extracelular com atividade de hormona de fator de crescimentoô ou semelhantes. A sequência do polipéptido de zcytorl7 foi deduzida a partir do ADN genómico bem como clones identificados que continham sua sequência de polinucleõtidos correspondente. Os clones foram obtidos de uma biblioteca de próstata. Outras bibliotecas que poderiam também ser pesquisadas para tais sequências incluem PBLô testesô monõcitosô timoô baçoô gânglio linfáticoô medula õsseaô eritroleucemia humanaô pulmão (por exemploô células WI-38' e linhas de célula de leucemia monocítica agudaô outras linhas de célula hematopoiética e linfoideô e semelhantes.

Sequências de nucleótidos de ADN que codifica zcytorl7 representativo são descritas na SEQ ID NO: 1 (a partir do nucleótido 171 a 2366 'ô com sua sequência de 732 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 45 (a partir do nucleótido 162 a 2108'ô com sua sequência de 649 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO: 46.; e na SEQ ID NO: 53 (a partir do nucleótido 497 a 2482'ô com sua sequência de 662 aminoácidos deduzida descrita na SEQ ID NO:54. Na sua totalidadeô o polipéptido de zcytorl7 (SEQ ID NO: 2Ô SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 54' representa um segmento de polipéptido de comprimento completo (resíduo 1 (Met' a resíduo 732 (Val' da SEQ ID NO: 2; resíduo 1 (Met' a resíduo 649 (lie' da SEQ ID NO: 46; resíduo 1 (Met' a resíduo 662 (lie' da SEQ ID NO:54' . Os domínios e caraterística estrutural dos polipéptidos de zcytorl7 são descritos ainda a seguir. A análise do polipéptido de zcytorl7 codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 1 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 732 aminoãcidos (SEQ ID NO:2' que compreende um péptido de sinal secretor predito de 19 resíduos de aminoãcidos (resíduo 1 (Met' ao resíduo 19 (Ala' da SEQ ID NO: 2' ô e um polipéptido maduro de 713 aminoãcidos (resíduo 20 (Ala' ao resíduo 732 (Val' da SEQ ID NO:2'. A análise do polipéptido de zcytorl7 codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO:45 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 649 aminoãcidos (SEQ ID NO:46' que compreende um péptido de sinal secretor predito de 19 resíduos de aminoãcidos (resíduo 1 (Met' ao resíduo 19 (Ala' da SEQ ID NO:46'ô e um polipéptido maduro de 630 aminoãcidos (resíduo 20 (Ala' ao resíduo 649 (Ile' da SEQ ID NO:46'. A análise do polipéptido de zcytorl7 codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO:53 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 662 aminoãcidos (SEQ ID NO:54' que compreende um péptido de sinal secretor predito de 32 resíduos de aminoãcidos (resíduo 1 (Met' ao resíduo 32 (Ala' da SEQ ID N0:54'ô e um polipéptido maduro de 630 aminoãcidos (resíduo 33 (Ala' ao resíduo 662 (Ile' da SEQ ID NO: 54' . Além do motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3' (correspondente aos resíduos 211 a 215 da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46; e resíduos 224 a 228 da SEQ ID NO:54'ô o recetor compreende um domínio extracelular (resíduos 20 (Ala' a 519 (Glu' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; resíduos 33 (Ala' a 532 (Glu' da SEQ ID NO:54' que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 200 resíduos de aminoãcidos (resíduos 20 (AlaEI a 227 (ProEl da SEQ ID NO :2 e SEQCD NO:46; resíduos 33 (AlaB a 240 (ProEl da SEQ ID N04B ; um ligante de domínio (resíduos 122 (ThrH ao 125 (ProBda SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; resíduos 13 5 (ThrB a 13 8 (PoB da SEQ ID NO: 2'; uma penúltima região de cadeia (resíduos 194 (Phe' a 2 02 (Arg' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; resíduos 207 (Phe' a 215 (Arg' da SEQ ID NO: 54' ; um domínio de fibronectina do tipo III (resíduos 228 (Cys' a 519 (Glu' da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46; resíduos 241 (Cys' a 532 (Glu' da SEQ ID NO:54'; um domínio transmembrana (resíduos 520 (lie' a 543 (Leu' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; resíduos 533 (lie' a 556 (Leu' da SEQ ID NO:54'; domínio de sinalização intracelular completo (resíduos 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO:2; resíduos 544 (Lys' a 649 (Ile' da SEQ ID NO: 46; e resíduos 557 (Lys' a 662 (He' da SEQ ID NO: 54' que contém um local de sinalização "Caixa I" (resíduos 554 (Trp' a 560 (Pro' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO:46; resíduos 567 (Trp' a 573 (Pro' da SEQ ID NO:54'ô e um local de sinalização "Caixa II" (resíduos 617 (Gin' a 620 (Phe' da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46; resíduos 630 (Gin' a 633 (Phe' da SEQ ID NO:54'. Os peritos na especialidade reconhecerão que estes limites de domínio são aproximadosô e são com base em alinhamentos com proteínas conhecidas e predições de dobragem de proteínas. Além destes domíniosô caraterísticas de recetor conservado no recetor codificado incluem (como mostrado na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46' um resíduo Cys conservado na posição 30 (posição 43 como mostrado na SEQ ID NO: 54' ô motivo CXW (em que X é qualquer aminoácido' nas posições 40-42 (posições 53-55 como mostrado na SEQ ID NO: 54' ô resíduo Trp na posição 170 (posição 183 como mostrado na SEQ ID NO: 54' ô e um resíduo Arg conservado na posição 202 (posição 215 como mostrado na SEQ ID NO:54'. Os polinucleótidos correspondentes que codificam as regiõesô domíniosô motivosô resíduos e sequências de polipéptido de zcytorl7 descritos acima são como foram mostrados na SEQ ID NO: lô SEQ ID NO:4 5ô e SEQ ID NO :53.

Além dissoô formas truncadas do polipéptido de zcytorl7 parecem ser naturalmente expresso. Ambas as formas codificam recetores de zcytorl7 solúveis. Um polinucleótido que codifica uma "forma longa" do recetor zcytorl7 solúvelô truncado dentro do domínio de fibronectina do tipo IIIô é mostrado na SEQ ID NO: 17 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO:18. Esta forma truncada codifica os resíduos 1 (Met' até 324 (Lys' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO:46'ô e assim compreende uma sequência de sinal intatoô motivo WSXWS (SEQ ID NO:3'ô liganteô domínio de ligação a citocinaô penúltima cadeiaô e motivo conservadoô Cysô CXWô Trp e resíduos Arg como descrito acima. Um polinucleótido que codifica uma "forma curta" do recetor zcytorl7 solúvelô truncado na extremidade do domínio de ligação a citocina é mostrado na SEQ ID NO:21 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO:22. Esta forma truncada codifica um polipéptido de resíduo 239 que é idêntica aos resíduos 1 (Met' até 225 (Glu' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 e em seguida divergeô e assim compreende uma sequência de sinal intatoô motivo WSXWS (SEQ ID NO:3'ô liganteô domínio de ligação a citocinaô penúltima cadeiaô e motivo conservadoô Cysô CXWô Trp e resíduos Arg como descrito acima. Um alinhamento múltiplo das formas truncadas em comparação com as formas de comprimento completo de zcytorl7 é mostrado na Figura 1.

Além dissoô o ADNc de zcytorl7 da SEQ ID NO:lô SEQ ID NO:45Ô SEQ ID NO:17Ô e SEQ ID NO:21 codificam polipéptidos que podem usar uma metionina de iniciação alternativa (no nucleótido 75 da SEQ ID NO: lô no nucleótido 66 da SEQ ID NO:45ô no nucleótido 66 da SEQ ID NO:17ô e no nucleótido 66 da SEQ ID NO: 21' que codificaria um polipéptido na mesma grelha de leitura aberta (ORF' como os polipéptidos de zcytorl? da SEQ ID NO:2Ô SEQ ID NO:46ô SEQ ID NO :180 e SEQ ID NO :22. A utilização da metionina de iniciação alternativa adicionaria 32 aminoácidos (mostrado na SEQ ID NO: 48' em quadro à terminação N da SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46Ô SEQ ID NO: 18Ô e SEQ ID NO: 2 . Além dissoô O nucleótido 536 da SEQ ID NO:53 pode servir como uma metionina de iniciação alternativaô gerando assim a mesma terminação N (iniciando no aminoãcido 14 (Met' da SEQ ID NO:54' e sequência de polipéptido de sinalô como SEQ ID NO: 2Ô SEQ ID NO:46Ô SEQ ID N0:18Ô e SEQ ID NO :22. Além dissoô a segunda Met no aminoãcido número 2 nas sequências SEQ ID NO:2Ô SEQ ID NO:46Ô SEQ ID N0:18Ô e SEQ ID NO:22 (de igual modo no aminoãcido número 15 (Met' na SEQ ID NO: 54' pode também servir como uma metionina de iniciação alternativa para os polipéptidos. A presença de regiões transmembranaô e motivos conservados e baixa variância geralmente correlaciona com ou define importantes regiões estruturais em proteínas. Regiões de baixa variância (por exemploô agrupamentos hidrofóbicos' estão geralmente presentes em regiões de importância estrutural (Sheppardô P. et al.ô supra.'. Tais regiões de baixa variância com frequência contêm aminoácidos raros ou infrequentesô tal como Triptofano. As regiões que flanqueiam e entre tais motivos conservados e de baixa variância podem ser mais variáveisô mas são com frequência funcionalmente significativos porque podem relacionar a ou definir estruturas e atividades importantes tal como domínios de ligaçãoô atividade biológica e enzimáticaô transdução de sinalô interação célula-célulaô domínios de localização de tecido e semelhantes.

As regiões de resíduos conservados de aminoãcido em zcytorl7ô descritas anteriormenteô podem ser usadas como ferramentas para identificar novos membros da família. Por exemploô transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR' pode ser usada para amplificar sequências que codificam as regiões conservadas de ARN obtidas a partir uma variedade de fontes de tecido ou linhagens de células. Em particularô iniciadores altamente degenerados desenhados a partir de as sequências de zcytorl7 são úteis para este propósito. 0 desenho e utilização de tais iniciadores degenerados podem ser facilmente realizados por um perito na especialidade. A presente invenção proporciona moléculas de polinucleótidoô incluindo moléculas ADN e ARN que codificam os polipéptidos de zcytorl7ô como indicado nas reivindicações.

Os peritos na especialidade reconhecerão queô em vista de degeneração do código genéticoô uma variação considerável da sequência é possível entre estas moléculas de polinucleótido. A presente memória descritiva descreve SEQ ID NO: 4ô SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 55ô que degeneram sequências de ADN que abrangem todos os ADN que codificam o polipéptido de zcytorl7 da SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 54 respetivamente. Os peritos na especialidade reconhecerão que as sequências degeneradas da SEQ ID NO: 4ô SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 55 também proporcionam todas as sequências de ARN que codificam SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 54 por meio da substituição de U por T. Os polinucleótidos que codificam polipéptido de zcytorl7 que compreendem do nucleótido 1 a nucleõtido 2196 da SEQ ID NO: 4ô nucleótido 1 ao nucleõtido 1947 da SEQ ID NO: 47ô e nucleótido 1 ao nucleótido 1986 da SEQ ID NO: 55 e seus ARN equivalentes são descritos no presente documento. 0 Quadro 1 apresenta os códigos de uma letra utilizados dentro das SEQ ID NO: 4Ô SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 55 para denotar posições de nucleótido degeneradas. "Resoluções" são os nucleótidos denotados por uma letra de código. "Complemento" indica o código para o(s) nucleótido(s) complementar (es) . Por exemploô o código Y denota C ou Tô e o seu complemento R denota A ou Gô com A sendo complementar a Tô e G sendo complementar a C. QUADRO 1

Nucleôtido Resolução Complemento Resolução A ATT

C C G G

G G C C

T T A A

R A | G Y C|T

Y CjT R A [ G

M AjC K G | T

K G [ T Μ A | C

S C | G S C | G

W A [ T W A | T

H A[C j T D A[G|T

B C | G! T V A [ C | G

V AjCjG B C|G|T

D A | G! T Η A | C | T

N AjCjGjT N A|C|G|T

Os codões degenerados utilizados nas SEQ ID NO:4ô SEQ ID NO:47 e SEQ ID NO:55ô que abrangem todos os codões possíveis para um dado aminoãcidoô são indicados no Quadro 2 . QUADRO 2

Aminoácido Código de uma Letra_Codões_Codão Degenerado

Cys C TGC TGT TGY

Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN

Thr T ACA ACC ACG ACT ACN

Pro P CCA CCC CCG CCT CCN

Ala A GCA GCC GCG GCT GCN

Gly G GGA GGC GGG GGT GGN

Asn N AAC AAT AAY

Asp D GAC GAT GAY

Glu E GAA GAG GAR

Gin Q CAA CAG CAR

His H CAC CAT CAY

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN

Lys K AAA AAG AAR

Met M ATG ATG

He I ATA ATC ATT ATH

Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN

Vai V GTA GTC GTG GTT GTN

Phe F TTC TTT TTY

Tyr Y TACTAT TAY

Trp W TGG TGG

Ter . TAA TAG TGA TRR

Asn I Asp 3 RAY

GluI Gin Z SAR

Qualquer X NNN

Um perito na especialidade apreciará que alguma ambiguidade é introduzida na determinação de um codão degeneradoô representativo de todos os codões possíveis que codificam cada aminoãcido. Por exemploô o codão degenerado para serina (WSN' podeô em algumas circunstânciasô codificar arginina (AGR'ô e o codão degenerado para arginina (MGN' podeô em algumas circunstânciasô codificar serina (AGY'. Uma relação similar existe entre codões que codificam fenilalanina e leucina. Assimô alguns polinucleótidos abrangidos pela sequência degenerada podem codificar sequências de aminoãcido variantesô mas um perito na especialidade pode facilmente identificar tais sequências variantes por referência às sequências de aminoãcidos da SEQ ID NO:2Ô SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:54; OU SEQ ID NO:57 e SEQ ID NO:93. As sequências variantes podem ser prontamente testadas para funcionalidade como é descrito no presente documento.

Um perito na especialidade apreciará também que espécies diferentes podem exibir "utilização de codão preferencial". Em geralô veja-seô Granthamô et al.ô Nuc.

Acids Res. 8:1893-9120 1980; Haasô et al. Curr. Biol. 6:315-240 1996; Wain-Hobsonô et al.ô Gene 13:355-640 1981; Grosjean e Fiersô Gene 18:199-2090 1982; Holmô Nuc. Acids Res. 14:3075-870 1986; Ikemuraô J. Mol. Biol. 158:573-970 1982. Como é utilizado no presente documentoô o termo S utilização de codão preferenciais ou S codões preferenciaisã é um termo da especialidade que se refere a codões de traduçS o de proteínas que sS o utilizadosom mais frequência em células de uma certa espécieô favorecendo assim um ou alguns representativos dos codões possíveis que codificam cada aminoãcido (Veja-se Quadro 2' . Por exemploô o aminoãcido Treonina (Thr' pode ser codificado por ACAô ACCô ACGô ou ACTô mas em células de mamíferos ACC é o codS o utilizado mais comummente; em outras espéciesô por exemploô células de insetosô leveduraô vírus ou bactériasô codões Thr diferentes podem ser preferenciais. Codões preferenciais para uma espécie particular podem ser introduzidos nos polinucleótidos da presente invençB o por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A introduçlEI o de sequências de codS o preferenciais errADN recombinante podeô por exemploô aumentar a product o da proteína tornando a traduçS o da proteína mais efica dentro de uma espécie ou tipo de células particular. Portantoô as sequências de codIEl o degeneradas reveladas nas SEQ ID N0:4ô SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 55 servem como moldes para otimizar a express^ o de polinucleótidos de zcytorl7 em várias espécies ou tipos de células comummente utilizados na especialidade e revelados no presente documento. As sequências que contêm codões preferenciais podem ser testadas e otimizadas para a expressEI o em várias epéciesô e testadas para funcionalidade como é revelado no presente documento.

Os polinucleótidos isolados descritos no presente documento hibridarS o com regiões de tamanho semelhate da SEQ ID NO: lô SEQ ID NO: 45 OU SEQ ID NO: 54; ou SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93; ou uma sequência complementar à mesmaô sob condições restringentes. Em geralô condições restringentes são selecionadas para serem aproximadamente 5°C inferiores ao ponto de fusão térmico (TV para a sequência específica numa força iónica e pH definidos. A Tra é a temperatura (sob força iónica e pH definidos' na qual 50 % da sequência alvo híbrida a uma sonda emparelhada perfeitamente. Numerosas equações para calcular a Tm são conhecidas na técnicaô e são específicas para ADNô ARN e híbridos de ADN-ARN e sequências de sonda de polinucleõtido de comprimento variado (veja-seô por exemploô Sambrook et al.à Molecular Cloning: A Laboratory Manualô Segunda Edição (Cold Spring Harbor Press 1989'; Ausubel et al.ô (eds.'ô Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sonsô Inc. 1987'; Berger e Kimmel (eds.'o Guide to Molecular Cloning Techniquesô (Academic Pressô Inc. 1987'; e Wetmurô Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990''. Software de análise de sequência tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lakeô MN' e Iniciador Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Altoô CA'ô bem como sites na Internet estão disponíveis ferramentas para analisar uma dada sequência e calcular Tm com base nos critérios definidos pelo utilizador. Tais programas podem também analisar uma dada sequência sob condições definidas e identificar sequências de sonda adequadas. Tipicamenteô a hibridação de sequências de polinucleótido mais longas (por exemploô >50 pares de base' é realizada em temperaturas de cerca de 20-25 °C abaixo da Tra calculada. Para sondas menores (por exemploô <50 pares de base' a hibridação é tipicamente levada a cabo na Tm ou 5-10°C abaixo da Tm. Isto considera a taxa máxima de hibridação para híbridos de ADN-ADN e ADN-ARN. Graus mais altos de restringência em temperaturas mais baixas podem ser alcançados com a adição de formamida que reduz a Tm do híbrido cerca de 1 °C para cada 1 % de formamida na solução tampão. Condições de hibridação restringentes adequadas são equivalentes a cerca de uma incubação de 5 h até durante a noite em cerca de 42 °C numa solução que compreende: cerca de 40-50 ® de formamidaô até cerca de 6X SSCô cerca de 5X solução de Denhardtô zero até cerca de 10 ® de sulfato de dextranoô e cerca de 10-20 mgúml de ADN portador desnaturado comercialmente disponível. Geralmenteô tais condições restringentes incluem temperaturas de 20-70 °C e um tampão de hibridação contendo até 6x SSC e 0-50 ® de formamida; a hibridação é então seguida de filtros de lavagem em até cerca de 2X SSC. Por exemploô uma restringência de lavagem adequada é equivalente a 0Ô1X SSC a 2X SSCô Oôl ® de SDSô a 55 °C a 65 °C. Graus de restringência diferentes podem ser usados durante a hibridação e lavagem para alcançar a ligação específica máxima à sequência alvo. Tipicamenteô as lavagens em seguida à hibridação são realizadas em graus de restringência crescentes para remover sondas de polinucleótido não hibridadas dos complexos hibridados. Condições de hibridação e lavagem restringentes dependem do comprimento da sondaô refletidas no Tmô hibridação e soluções de lavagem usadosô e são habitualmente determinados empiricamente por um perito na especialidade.

Como foi notado anteriormenteô os polinucleótidos isolados descritos no presente documento incluem ADN e ARN. Os métodos para preparar ADN e ARN são bem conhecidos na técnica. Em geralô ARN é isolado de um tecido ou célula que produz quantidades grandes de ARN de zcytorl71ig. Tais tecidos e células são identificadas por meio de Northern blotting (Thomasô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:52010 1980)0 e incluem PBLsô baçoô timoô medula ósseaô próstataô e tecidos linfáticosô linhas de células de eritro-leucemia humanaô linhas de células de leucemia monocítica agudaô outras linhas de células linfoides de hematopoiéticasô e semelhantes. 0 ARN total pode ser preparado usando extração de isotiocianato de guanidínio seguido por isolamento por meio de centrifugação num gradiente de CsCl (Chirgwin et al.ô Biochemistry 18:52-940 1979'. ARN poli (a'° é preparado a partir de ARN total utilizando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-120 1972'. ADN complementar (ADNc' é preparado a partir de ARN poli(a'° utilizando métodos conhecidos. Na alternativaô ADN genómico pode ser isolado. Polinucleótidos que codificam polipéptidos de zcytorl71ig são então identificados e isolado por meio deô por exemploô hibridação ou ou reação em cadeia da polimerase (PCR' (Mullisô Patente U.S. n° 4.683.202'.

Um clone de comprimento completo que codifica zcytorl7 pode ser obtido por meio de procedimentos de clonagem convencionais. Clones ADN complementar (ADNc' são preferidosô embora para algumas aplicações (por exemploô a expressão em animais transgénicos' pode ser preferível utilizar um clone genómicoô ou modificar um clone de ADNc para incluir pelo menos um intrão genómico. Os métodos para preparar ADNc e clones genómicos são bem conhecidos e dentro do nível de um perito ordinário na especialidadeô e incluem a utilização da sequência revelada no presente documentoô ou partes da mesmaô para sondar ou iniciação de uma biblioteca. Bibliotecas de expressão podem ser sondadas com anticorpos contra fragmentos de zcytorl7ô recetores de fragmentosô ou outros parceiros de ligação específica.

Os polinucleótidos da presente invenção podem também ser sintetizados usando máquinas síntese ADN. Atualmente o método de escolha é o método da fosforamidita. Se o ADN de cadeia dupla quimicamente sintetizado for requerido para uma aplicação tal como a síntese de um gene ou um fragmento de geneô então cada cadeia complementar é feita separadamente. A produção de polinucleótidos curtos (de 60 a 80 pb' é tecnicamente fácil e pode ser cumprida pela sintetização das cadeias complementares e então recozendo as mesmas. No entantoô para produzir polinucleótidos mais longos (>300 pb'ô estratégias especiais são usualmente utilizadasô porque a eficiência de acoplamento de cada ciclo durante síntese química de ADN é raramente 100 ®. Para superar este problemaô genes sintéticos (de cadeia dupla' são montados em forma modular a partir de fragmentos de cadeia simples que são desde 20 até 100 nucleótidos em comprimento.

Uma maneira alternativa para preparar um gene de comprimento completo é sintetizar um conjunto especificado de oligonucleótidos sobrepostos (de 40 a 100 nucleótidos'. Após as regiões complementares sobrepostas curtas 3' e 5' (de 6 a 10 nucleótidos' serem recozidasô grandes lacunas ainda permanecemô mas as regiões curtas de bases pareadas são tanto longas o suficiente como estáveis o suficiente para manter a estrutura junta. As lacunas são preenchidas e o duplex de ADN é completado via síntese enzimãtica de ADN por meio de ADN polimerase I de E. coli. Após a síntese enzimãtica ser completada os cortes são selados com T4 ADN ligase. De construções de cadeia dupla são sequencialmente ligadas entre si para formar a sequência de gene completa que é verificada por meio de análise de sequência de ADN. Veja-se Glick e Pasternakô Molecular Biotechnologyô Principles # Aplications of Recombinant DNAô (ASM Pressô Washingtonô D.C. 1994'; Itakura et al.ò Annu. Rev. Biochem. 53: 323-56Ô 1984 e Climie et al.ò Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:633-7ô 1990. Além dissoô outras sequências são geralmente adicionadas que contêm sinais para iniciação e terminação apropriada de transcrição e tradução. A presente invenção proporciona ainda polipéptidos e polinucleótidos equivalentes de outras espécies (ortôlogos'. Estas espécies incluemô mas não são limitadas aô espécies de mamíferosô avesô anfíbiosô répteisô peixesô inseto e outros vertebrados e invertebrados. De particular interesse são polipéptidos de zcytorl7 de outras espécies de mamíferosô incluindoô por exemploô polipéptidos murinosô porcinosô ovinosô bovinosô caninosô felinosô equinosô e outros polipéptidos de primata. Ortõlogos de zcytorl7 humano podem ser clonados utilizando informação e composições proporcionadas pela presente invenção em combinação com técnicas de clonagem convencionais. Por exemploô um ADNc pode ser clonado utilizando ARNm obtido de um tipo de célula ou tecido que expressa zcytorl7 como é revelado no presente documento. Fontes adequadas de ARNm podem ser identificadas pela sondagem de Northern blots com sondas desenhadas a partir das sequências reveladas no presente documento. Uma biblioteca é então preparada a partir de ARNm de um tecido ou linha de células positiva. Um ADNc que codifica zcytorl7 pode então ser isolado por uma variedade de métodosô tais como pela sondagem com um ADNc humano completo ou parcial ou com um ou mais conjuntos de sondas degeneradas com base nas sequências reveladas. Um ADNc pode também ser clonado utilizando a reação em cadeia da polimeraseô ou PCR (Mullisô supra'ô utilizando iniciadores desenhados a partir da sequência de zcytorl7 humano representativa revelada no presente documento. Dentro de um método adicionalô a biblioteca de ADNc pode ser utilizada para transformar ou transfetar células hospedeirasô e expressão do ADNc de interesse pode ser detetada com um anticorpo contra o polipéptido de zcytorl71igô estudos de ligação ou ensaios de atividade. Técnicas semelhantes podem também ser aplicadas ao isolamento de clones genómicos.

Uma sequência de polinucleótidos para o ortólogo de ratinho de zcytorl7 humano foi identificada e é mostrada na SEQ ID NO:56 e a sequência de aminoácidos correspondente mostrada na SEQ ID NO:57. A análise do polipéptido de zcytorl7 de ratinho codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO:56 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 662 aminoácidos (SEQ ID NO:57' que compreende um péptido de sinal secretor predito de 45 resíduos de aminoácidos

(resíduo 1 (MetS ao resíduo 45 (AlaS da SEQ ID N07i ô e um polipéptido maduro de 617 aminoácidos (resíduo46 (Vai' ao resíduo 662 (Cys' da SEQ ID NO:57'. Além dissoô um adicional Met resíduoô Met (28' pode ser usado como uma metionina de partida; que compreende um segundo péptido de sinal secretor predito de 18 resíduos de aminoácidos (resíduo 28 (Met' ao resíduo 45 (Ala' da SEQ ID NO:57'ô e o mesmo polipéptido maduro de 617 aminoácidos (resíduo 46 (Vai' ao resíduo 662 (Cys' da SEQ ID NO:57. Além do motivo WSXWS (SEQ ID NO:3' correspondente aos resíduos 224-228 da SEQ ID NO:57ô o recetor compreende um domínio extracelular dos resíduos 46 (Vai' a 533 (Glu' da SEQ ID NO: 57' que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 200 resíduos de aminoácidos (resíduos 46 (Vai' a 240 (Pro' da SEQ ID NO:57' e um domínio de fibronectina III (resíduos 241 (His' a 533 (Glu' da SEQ ID NO: 57' ; um motivo CXW (resíduos 66 (Cys' a 68 (Trp' da SEQ ID NO:57' ; um ligante de domínio (resíduos 142 (Thr' a 145 (Pro' da SEQ ID NO:57'; uma penúltima região de cadeia (resíduos 207 (Phe' a 215 (Arg' da SEQ ID NO:57'; um domínio transmembrana (resíduos 534 (lie' a 550 (lie' da SEQ ID NO: 57' ; domínio de sinalização intracelular completo (resíduos 551 (Lys' a 662 (Cys' da SEQ ID NO:57' que contém um local de sinalização "Caixa I" (resíduos 568 (Cys' a 574 (Pro' da SEQ ID NO:57'ô e um local de sinalização "Caixa II" (resíduos 628 (Glu' a 631 (leu' da SEQ ID NO: 57' . Resíduos conservados comuns a classe I recetores de citocinaô estão nos resíduos 56 (Cys'ô 187 (Trp'ô e 215 (Arg'. Uma comparação das sequências de aminoácidos humana e de ratinho revela que tanto os polipéptidos humanos e ortólogos contêm caraterísticas estruturais correspondentes descritas anteriormente. A sequência madura para o zcytorl7 de ratinho começa em Val46 (como é mostrado na SEQ ID NO: 57'ô que corresponde a Ala33 (como é mostrado na SEQ ID NO: 54' na sequência humana. Existe cerca de 61 % de identidade entre as sequências de ratinho e humana com relação a sequência de aminoácidos completa que corresponde a SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 57. A percentagem anterior de identidade foi determinada usando um programa FASTA com ktup * lô penalidade de abertura de lacuna * 12ô penalidade de extensão de lacuna * 2ô e matriz de substituição * BLOSUM62Ô com outros parâmetros ajustados como pré-definidos. Os polinucleótidos correspondentes que codificam as regiõesô domíniosô motivosô resíduos e sequências de polipéptido de zcytorl7 de ratinho descritas anteriormente são como mostrados na SEQ ID NO: 56.

Além dissoô uma forma solúvel truncada do recetor de polipéptido de zcytorl7 de ratinho parece ser naturalmente expresso. Uma sequência de polinucleótido para uma forma solúvel truncada do recetor zcytorl7 de ratinho foi identificada e é mostrada na SEQ ID NO:92 e a sequência de aminoácidos correspondente mostrada na SEQ ID NO:93. A análise do polipéptido de zcytorl7 de ratinho solúvel truncado codificado pela sequência de ADN da SEQ ID NO: 92 revelou uma grelha de leitura aberta que codifica 547 aminoácidos (SEQ ID NO:93' que compreende um péptido de sinal secretor predito de 45 resíduos de aminoácidos (resíduo 1 (Met' ao resíduo 45 (Ala' da SEQ ID NO:93'ô e um polipéptido maduro de 502 aminoácidos (resíduo46 (Vai' ao resíduo 547 (Vai' da SEQ ID NO:93'. Além dissoô um resíduo Met adicionalô Met (28' pode ser usado como uma metionina de partida; que compreende um segundo péptido de sinal secretor predito de 18 resíduos de aminoácidos (resíduo 28 (Met' ao resíduo 45 (Ala' da SEQ ID NO:93'ô e o mesmo polipéptido maduro de 502 aminoácidos (resíduo 46 (Vai' ao resíduo 547 (Vai' da SEQ ID NO: 93. Além do motivo WSXWS (SEQ ID NO:3' correspondente aos resíduos 224-228 da SEQ ID NO:93ô o recetor compreende um domínio extracelular dos resíduos 46 (Vai' a 533 (Trp' da SEQ ID NO: 93' que inclui um domínio de ligação a citocina de aproximadamente 200 resíduos de aminoácidos (resíduos 46 (Vai' a 240 (Pro' da SEQ ID NO:93' e um domínio de fibronectina III (resíduos 241 (His' a 533 (Trp' da SEQ ID NO: 93' ; um motivo CXW (resíduos 66 (Cys' a 68 (Trp' da SEQ ID NO: 93' ; um ligante de domínio (resíduos 142 (Thr' a 145 (Pro' da SEQ ID NO:93'; uma penúltima região de cadeia (resíduos 207 (Phe' a 215 (Arg' da SEQ ID NO: 93' ; e uma região de cauda C-terminal (dos resíduos 534 (Leu' ao 547 (Vai'. Resíduos conservados comuns a recetores de citocina de classe Iô estão nos resíduos 56 (Cys' ô 187 (Trp' ô e 215 (Arg'. Uma comparação dos sequências de aminoácidos humano e ratinhoô incluindo o zcytorl7 de ratinho solúvel truncadoô revela que tato os polipéptidos humanos como ortólogos contêm caraterísticas estruturais correspondentes descritas anteriormente. Os polinucleótidos correspondentes que codificam o regiõesô domíniosô motivosô resíduos e sequências de polipéptido de zcytorl7 de ratinho solúvel truncado descritas anteriormente são como mostrado na SEQ ID NO:92.

As subunidades de recetor de citocina são caraterizadas por uma estrutura multi-domínio que compreende um domínio extracelularô um domínio transmembrana que ancora o polipéptido na membrana celularô e um domínio intracelular. 0 domínio extracelular pode ser um domínio de ligação a ligandoô e o domínio intracelular pode ser um domínio efetor envolvido em transdução de sinalô embora funções de ligação a ligando e efectoras podem residir em subunidades separadas de um recetor multimérico. O próprio domínio de ligação a ligando pode ser uma estrutura de multi-domínio. Recetores multiméricos incluem homodímeros (por exemploô isoformas αα e ββ de recetor PDGFô recetor de eritropoietinaô MPLô e recetor de G-CSF'ô heterodímeros cujas subunidadesô cada umaô têm domínios de ligação a ligando e efetor (por exemploô isoforma αβ de recetor de PDGF'ô e multímeros que tem subunidades de componente com funções diferentes (por exemploô IL-2Ô IL-3Ô IL-4Ô IL-5Ô IL-6Ô IL-7Ô e recetores de GM-CSF'. Algumas subunidades de recetor são comuns a uma pluralidade de recetores. Por exemploô a subunidade AIC2BÔ que não pode ligar ligando por si próprioô mas inclui um domínio de transdução de sinal intracelularô é um componente de IL-3 e recetores de GM-CSF. Muitos recetores de citocina podem ser colocados em uma de quatro famílias relacionadas com base na estrutura e função. Recetores hematopoiéticosô por exemploô são caraterizados pela presença de um domínio que contém resíduos de cisteína conservados e o motivo WSXWS (SEQ ID NO: 3'. A estrutura do recetor de citocina foi revisto por Urdalô Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228ô 1991 e Cosmanô Cytokine 5:95-1060 1993. Sob pressão seletiva para organismos para adquirir novas funções biológicasô novos membros da família de recetor provavelmente surgirão a partir da duplicação de genes de recetor existentes que levam à existência de famílias multi-génicas. Membros da família assim contêm vestígios do gene ancestralô e estas caraterísticas particulares pode ser exploradas no isolamento e identificação de membros da família adicionais. Assimô a superfamília de recetor de citocina é subdividida em diversas famíliasô por exemploô a família da imunoglobulina (incluindo CSF-lô MGFô IL-lô e recetores de PDGF'; a família da hematopoietina (incluindo subunidade β do recetor de IL-2Ô subunidade α do recetor de GM-CSFô subunidade β do recetor de GM-CSF; e recetores de G-CSFô EPOô IL-3Ô IL-4Ô IL-5Ô IL-6Ô IL-7Ô e IL-9'; família de recetor de TNF (incluindo recetores de TNF (p80' TNF (p60'ô CD27Ô CD30Ô CD40Ô Fasô e recetor de NGF'. A análise da sequência zcytorl7 sugere que é um membro da mesma subfamília de recetor como o gpl30ô LIFô IL-12Ô WSX-lô subunidade β do recetor de IL-2Ô recetores de IL-3Ô IL-4Ô e IL-6. Certos recetores nesta subfamília (por exemploô G- CSF' associam para formar homodímeros que transduzem um sinal. Outros membros da subfamília (por exemploô gpl30ô IL-6Ô IL-llô e recetores de LIF' combinam com uma segunda subunidade (denominada uma subunidade β' para ligar ligando e transduzir um sinal. Subunidades β específicas associam a uma pluralidade de subunidades específicas de recetor de citocina. Por exemploô a subunidade β gpl30 (Hibi et al.ò Cell 63:1149-1157Ô 1990' associa a subunidades de recetor específicas para IL-6Ô IL-llô e LIF (Gearing et al.ò EMBO J. 10:2839-28480 1991; Gearing et al.ò Patente U.S. n° 5.284.755'. Oncostatina M liga-se a um heterodímero de recetor de LIF e gpl30. CNTF liga a recetores triméricos que compreendem recetor de CNTFô recetor de LIFô e subunidades de gpl30.

Os peritos na especialidade reconhecerão que as sequências reveladas na SEQ ID NO:lô SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO: 53 r representam alelos de zcytorl7 humano e essa variação alélica e splicing alternativo são esperados que ocorram. Variantes alélicas desta sequência podem ser clonadas por meio de sondagem bibliotecas ADNc ou genómico de diferentes indivíduos de acordo com procedimentos padrão. Variantes alélicas da sequência de ADN mostrada nas SEQ ID NO: 1Ô SEQ ID NO: 45 OU SEQ ID NO: 53Ô incluindo aqueles que contêm mutações silenciosas e aqueles em que as mutações resultam em mudanças de sequência de aminoácidosô são descritos no presente documentoô como são proteínas que são variantes alélicas da SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46ô SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 93 . ADNc gerados a partir de ARNm submetido a splicing alternativoô que retêm as propriedades do polipéptido de zcytorl7 são descritos no presente documentoô como são polipéptidos codificados por tais ADNc e ARNm. Variantes alélicas e variantes de splice destas sequências podem ser clonados por meio de sondagem ADNc ou bibliotecas genómicas a partir de diferentes indivíduos ou tecidos de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. Por exemploô a forma curta e forma longa de recetores solúveis de zcytorl7 descritos anteriormenteô e na SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 podem ser considerados variantes alélicas ou de splice de zcytorl7. A presente memória descritiva também descreve polipéptidos de zcytorl7 isolados que são substancialmente semelhantes aos polipéptidos da SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 54 e seus ortólogosô por exemploô SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93. 0 termo "substancialmente semelhante" é usado no presente documento para denotar polipéptidos que têm pelo menos 70 ®ô mais preferentemente pelo menos 80 ®ô identidade de sequência às sequências mostradas na SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 54 ou seus ortólogosô por exemploô SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93. Tais polipéptidos mais preferentemente serão pelo menos 90 ® idênticosô e o mais preferentemente 95 ® ou mais idênticos às SEQ ID NO: 2Ô SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 54 ou seus ortólogos.' A percentagem de identidade de sequência é determinada por meio de métodos convencionais. Veja-seô por exemploô Altschul et al.ô Bull. Math. Bio. 48: 603-616Ô 1986 e Henikoff e Henikoffô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919Ô 1992. De maneira breveô duas sequências de aminoácidos são alinhadas para otimizar as pontuações de alinhamento usando uma penalidade de abertura de lacuna de 100 uma penalidade de extensão de lacuna de lô e o "blosum 62" matriz de pontuação de Henikoff e Henikoff (ibid.' como é mostrado no Quadro 3 (aminoácidos são indicados pelos códigos de uma letra padrão'. A percentagem de identidade ê então calculada como:

Μ Ο Μ •ΰ rij è A identidade de sequência de moléculas de polinucleótido é determinada por meio de métodos semelhantes usando uma razão como revelada anteriormente.

Os peritos na especialidade apreciam que existem muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências de aminoácido. 0 algoritmo de pesquisa de similaridade ãFASTAã de Pearson e Lipman é um método de alinhamento de proteínas adequado para examinar o nível de identidade partilhada por uma sequência de aminoácido revelada no presente documento e a sequência de aminoácido de um zcytorl7 variante putativo. 0 algoritmo FASTA é descrito por Pearson e Lipmanô Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988'ô e por Pearsonô Meth. Enzymol. 183:63 (1990' .

De maneira breveô FASTA primeiro carateriza similaridade de sequências por meio da identificação de regiões partilhadas pela sequência de consulta (por exemploô SEQ ID NO:2ô SEQ ID NO:46Ô SEQ ID NO:54Ô SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93' e uma sequência de teste que têm a densidade mais alta de identidades (se a variável ktup for 1' ou pares de identidades (se ktup * 2'ô sem considerar substituiçõesô inserçõesô ou deleções de aminoácido conservativas. As dez regiões com a densidade mais alta de identidades são então repontuadas por meio da comparação da similaridade de todos os aminoácidos emparelhados utilizando uma matriz de substituição de aminoácidoô e as extremidades das regiões são 0 recortadas^ para inalr somente aqueles resíduos que contribuem à pontuação mais alta. Se existirem diversas regiões com pontuações superiores ao valor de 0 corteEi (calculados por umáórmula predeterminada com base no comprimento da sequência e o valor de ktup'ô então as regiões iniciais recortadas são examinadas para determinar se as regiões podem ser unidas para formar um alinhamento aproximado com espaços. Finalmenteô as regiões de pontuação mais altas das duas sequências de aminoácido são alinhadas utilizando uma modificação do algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman e Wunschô J. Mol. Biol. 48:444 (1970'; Sellersô SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974''ô que tem em consideração inserções e deleções de aminoácido. Os parâmetros preferidos para a análise FASTA são: ktup * lô penalidade de abertura de espaço * 10Ô penalidade de extensão de espaço * lô e matriz de substituição * BLOSUM62. Estes parâmetros podem ser introduzidos num programa FASTA por meio da modificação do arquivo de matriz de pontuação ("SMATRIX"'ô como foi explicado no Apêndice 2 de Pearsonô Meth. Enzymol. 183: 63 (1990'. FASTA pode também ser utilizado para determinar a identidade de sequência de moléculas de ácido nucleico utilizando uma razão como foi revelado acima. Para comparações de sequência de nucleótidosô o valor de ktup pode variar entre um a seisô preferentemente desde três até seisô mais preferentemente trêsô com outros parâmetros ajustados como padrão. 0 quadro de BLOSUM62 (Quadro 3' é uma matriz de substituição de aminoácidos derivada de cerca de 2.000 alinhamentos múltiplos locais de segmentos de sequência de proteínaô que representam regiões altamente conservadas de mais de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff e Henikof fô Proc. Nat Ί Acad. Sei. USA 89:10915 (1992". Consequentementeô as frequências substituição de BLOSUM62 podem ser usadas para definir substituições de aminoácido conservatives que podem ser introduzidas nas sequências de aminoácidos da presente invenção. Embora seja possível desenhar substituições de aminoácido com base somente em propriedades químicas (como discutido a seguir'ô a linguagem "substituição de aminoácido conservative" preferentemente refere-se a uma substituição representada por um valor de BLOSUM62 superior a -1. Por exemploô uma substituição de aminoácido é conservativa se a substituição é caraterizado por um valor de BLOSUM62 de Oô lô 2ô ou 3. De acordo com este sistemaô substituições de aminoácido conservativas preferidas são caraterizadas por um valor de BLOSUM62 de pelo menos 1 (por exemploô lô 2 ou 3'ô enquanto substituições de aminoácido conservativas mais preferidas são caraterizadas por um valor de BLQSUM62 de pelo menos 2 (por exemploô 2 ou 3' .

Polipéptidos variantes de zcytorl7 ou polipéptidos substancialmente homólogos de zcytorl7 são caraterizados como que tem uma ou mais substituiçõesô deleções ou adições de aminoácido. Estas mudanças são preferentemente de uma natureza menorô isto éô substituições de aminoácido conservativas (veja-se Quadro 4' e outras substituições que não afetam significativamente a dobragem ou atividade do polipéptido; deleções pequenasô tipicamente de um a aproximadamente 30 aminoãcidos; e pequenas extensões amino-ou carboxi1-terminalô tais como um resíduo de metionina amino-terminalô um péptido ligante pequeno de até aproximadamente 20-25 resíduosô ou uma etiqueta de afinidade. A presente memória descritiva assim descreve polipéptidos que compreendem uma sequência que é pelo menos 80 %ô preferentemente pelo menos 90 %ô e mais preferentemente 95 % ou mais idêntica à região correspondente da SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46Ô SEQ ID NO: 54ô SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 93 excluindo as etiquetasô extensãoô sequências de ligante e semelhantes. Os polipéptidos que compreendem etiquetas de afinidade podem compreender ainda um local de clivagem proteolítica entre o polipéptido de zcytorl7 e a etiqueta de afinidade. Locais adequados incluem local de clivagem trombina e local de clivagem de fator Xa.

Quadro 4 _Substituições de aminoácido conservativas_ Básico: arginina lisina histidina Ácido: ácido glutâmico ácido aspártico Polar: glutamina asparagina

Hidrof óJoico: leucina isoleucina valina

Aromático: fenilalanina triptofano tirosina

Pequeno: glicina alanina serina treonina metionina A presente memória descritiva descreve ainda uma variedade de outras fusões de polipéptido e proteínas multiméricas relacionadas que compreendem uma ou mais fusões de polipéptido. Por exemploô um polipéptido de zcytorl7 pode ser preparado como uma fusão a uma proteína dimerizante como revelado em Patentes U.S. n° 5.155.027 e 5.567.584. As proteínas dimerizantes preferidas com relação a isso incluem domínios de região constante de imunoglobulina. Fusões de imunoglobulina-polipéptido de zcytorl7 podem ser expressas em células modificadas por engenharia genética para produzir uma variedade de análogos multiméricos de zcytorl7. Domínios auxiliares podem ser fusionados a polipéptidos de zcytorl7 para direcionar os mesmos para células específicasô tecidosô ou macromoléculas (por exemploô colagénio'. Um polipéptido de zcytorl7 pode ser fusionado a duas ou mais fraçõesô tal como uma etiqueta de afinidade para purificação e um domínio de direcionamento. Fusões de polipéptido podem também compreender um ou mais locais de clivagemô particularmente entre domínios. Veja-seô Tuan et al.ô Connective tissue Research 34:1-90 1996.

As proteínas da presente invenção podem também compreender resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente. Aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluemô sem limitaçãoô trans-3-metilprolinaô 2Ô4 -metanoprolinaô cis-4-hidroxiprolinaô trans-4-hidroxiprolinaô N-metilglicinaô alo-treoninaô metiltreoninaô hidroxietilcisteínaô hidroxietilhomocisteínaô nitroglutaminaô homoglutaminaô ácido pipecólicoô ácido tiazolidina carboxílicoô dehidroprolinaô 3- e 4-metilprolinaô 3ô3-dimetilprolinaô terc-leucinaô norvalinaô 2-azafenilalaninaô 3-azafenilalaninaô 4-azafenilalaninaô e 4-fluorofenilalanina. Diversos métodos são conhecidos na técnica para incorporar resíduos de aminoácido que não ocorrem naturalmente em proteínas. Por exemploô um sistema in vitro pode ser utilizado em que mutações nonsense são suprimidas usando ARNt supressores quimicamente aminoacilados. Métodos para sintetizar aminoácidos e aminoacilar ARNt são conhecidos na técnica. A transcrição e a tradução de plasmídeos que contêm mutações nonsense são levadas a cabo num sistema livre de células que compreende um extrato S30 de E. coli e enzimas comercialmente disponíveis e outros reagentes. Proteínas são purificadas por meio de cromatografia. Veja-seô por exemploô Robertson et al.ô J. Am. Chem. Soc. 113:2722o 1991; Ellman et al.ô Methods Enzymol. 202:3010 1991; Chung et al.ô Science 259:806-90 1993; e Chung et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10145-90 1993'. Num segundo métodoô tradução é levada a cabo em oócitos de Xenopus por meio de microinj ecção de ARNm mutado e ARNt supressor quimicamente aminoacilado (Turcatti et al.ô J. Riol. Chem. 271:19991-80 1996'. Dentro de um terceiro métodoô células de E. coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural é que para ser recolocado (por exemploô fenilalanina' e na presença do(s' aminoácido(s' que não ocorrem naturalmente desejados (por exemploô 2-azafenilalaninaô 3-azafenilalaninaô 4-azafenilalaninaô ou 4-fluorofenilalanina' . 0 aminoácido que não ocorre naturalmente é incorporado na proteína em lugar de seu equivalente natural. Veja-seô Koide et al.ô Biochem. 33:7470-74760 1994. Resíduos de aminoãcido que ocorrem de forma natural podem ser convertidos a espécies que não ocorrem de forma natural por modificação química in vitro. A modificação química pode ser combinada com mutagénese dirigida ao local para expandir adicionalmente o intervalo de substituições (Wynn e Richardsô Protein Sei. 2:395 (1993'

Um número limitado de aminoáeidos não conservativosô aminoácidos que não são codificados pelo código genéticoô aminoáeidos que não ocorrem naturalmenteô e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoãcido de zcytorl7.

Aminoácidos essenciais nos polipéptidos da presente invenção podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnicaô tal como mutagénese dirigida ao local ou mutagénese de exame de alanina (Cunningham e Wellsô Science 244: 1081-5Ô 1989; Bass et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4498-5020 1991'. Na última técnicaô mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo na moléculaô e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica ou bioquímica como é revelado a seguir para identificar resíduos de aminoãcido que são críticos à atividade da molécula. Veja-se tambémô Hilton et al.ô J. Biol. Chem. 271:4699 (1996'. Locais de ligando-recetorô proteína-proteína ou outra interação biológica podem também ser determinados por meio de análise de estrutura físicaô como determinadas por meio de tais técnicas como ressonância magnética nuclearô cristalografiaô difração de eletrões ou marcação de fotoafinidadeô em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Veja-seô por exemploô de Vos et al.ô Science 255:306-3120 1992; Smith et al.ô J. Mol. Biol. 224:899-9040 1992; Wlodaver et al.ô FEBS

Lett. 309:59-640 1992. As identidades de aminoãcidos essenciais podem também ser deduzidas a partir da análise de homologias com recetores relacionados. A determinação de resíduos de aminoácido que estão dentro regiões ou domínios que são críticos à manutenção da integridade estrutural pode ser realizada. Dentro destas regiões alguém pode determinar resíduos específicos que serão mais ou menos tolerantes à mudança e manutenção da estrutura terciária global da molécula. Os métodos para analisar a estrutura de sequência incluemô mas não são limitados aô alinhamento de sequências múltiplas com identidade de aminoácido ou nucleótido e análise por computador usando software disponível (por exemploô as ferramentas de modelagem de homologia e visualização Insight II®; MSIô San Diegoô CA'ô propensões de estrutura secundáriaô padrões bináriosô empacotamento complementar e interações polares enterradas (Bartonô Current Opin. Struct. Biol. 5:372-3760 1995 e Cordes et al.ô Current Opin. Struct. Biol. 6:3-100 1996'. Em geralô ao desenhar modificações a moléculas ou identificar fragmentos específicosô a determinação de estrutura será acompanhada pela avaliação da atividade de moléculas modificadas.

As mudanças da sequência de aminoácido são feitas em polipéptidos de zcytorl7 de modo a minimizar disrupção da estrutura de ordem mais alta essencial à atividade biológica. Por exemploô quando o polipéptido de zcytorl7 compreende uma ou mais hélicesô mudanças em resíduos de aminoácido serão feitas de modo a não quebrar a geometria da hélice e outros componentes da molécula onde mudanças na conformação abatem alguma função críticaô por exemploô ligação da molécula aos seus parceiros de ligação. Os efeitos das mudanças de sequência de aminoácido podem ser preditos por meio deô por exemploô modelagem por computador como foi revelado acima ou determinados por análise da estrutura cristalina (veja-seô por exemploô Lapthorn et al.ô Nat. Struct. Biol. 2:266-2680 1995'. Outras técnicas que são bem conhecidas na especialidade comparam a dobragem de uma proteína variante a uma molécula padrão (por exemploô a proteína nativa'. Por exemploô a comparação da cisteína padrão numa variante e moléculas padrão pode ser feita. Espectrometria de massa e modificação química utilizando redução e alquilação proporcionam métodos para determinar resíduos de cisteína que são associados a pontes dissulfureto ou são livres de tais associações (Bean et al.ô Anal. Biochem. 201:216-2260 1992; Grayô Protein Sei. 2:1732-17480 1993; e Patterson et al.ô Anal. Chem. 66:3727-3732Ô 1994'. Acredita-se geralmente que se uma molécula modificada não tem o mesmo padrão de ponte de dissulfureto que a molécula padrãoô a dobragem seria afetada. Outro método bem conhecido e aceitado para medir a dobragem é dicroísmo circular (DC'. A medição e comparação dos espectros de DC gerados por uma molécula modificada e molécula padrão é rotina (Johnsonô Proteins 7:205-2140 1990'. A cristalografia é outro método bem conhecido para analisar a dobragem e estrutura. A ressonância magnética nuclear (RMN'ô mapeamento de péptido e mapeamento de epítopo digestivo são também métodos conhecidos para analisar a dobragem e similaridades de maneira estrutural entre proteínas e polipéptidos (Schaanan et al.ô Science 257 : 961-964Ô 1992' .

Um perfil de hidrofilicidade de HoppÚWoods da sequência de proteína de zcytorl7 como é mostrado na SEQ ID NO: 2Ô SEQ ID NO: 46Ô SEQ ID NO: 54Ô SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93 pode ser gerado (Hopp et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. 78:3824-38280 1981; Hoppô J. Immun. Met. 88:1-180 1986 e Triquier et al.ô Proteína Engineering 11:153-1690 1998'. Veja-seô Figura 1. 0 perfil está baseado numa janela deslizante de seis resíduos. Resíduos Gô Sô e T enterrados e resíduos Hô Yô e W expostos foram ignorados. Por exemploô em zcytorl7ô regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 43 a 48 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (do resíduos 56 a 61 da SEQ ID NO: 54' ô dos resíduos de aminoácido 157 a 162 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 6 (dos resíduos 170a 175 da SEQ ID NO: 54'ô dos resíduos de aminoácido 158 a 163 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 6 (dos resíduos 171 a 176 da SEQ ID NO: 54'ô dos resíduos de aminoácido 221 a 226 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (dos resíduos 234 a 239 da SEQ ID NO: 54'ô e dos resíduos de aminoácido 426 a 431 da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46 (dos resíduos 439 a 444 da SEQ ID NO: 54'.

Os peritos na especialidade reconhecerão que hidrofilieidade ou hidrofobicidade serão levados em consideração ao desenhar modificações na sequência de aminoácido de um polipéptido de zcytorl7ô de modo a não quebrar o perfil biológico e estrutural global. De particular interesse para recolocação são resíduos hidrofóbicos selecionados a partir do grupo que consiste em Valô Leu e Ile ou o grupo que consiste em Metô Glyô Serô Alaô Tyr e Trp. Por exemploô resíduos tolerantes de substituição poderiam incluir tais resíduos como é mostrado na SEQ ID NO: 2ô SEQ ID NO: 46Ô SEQ ID NO: 54ô SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93. No entantoô os resíduos de cisteína seriam relativamente intolerantes a substituição.

As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser inferidas a partir da análise da similaridade de sequências entre membros da família do recetor de citocina de classe I com zcytorl7. Utilizando métodos tais como análise "FASTA" descritos anteriormenteô as regiões de alta similaridade são identificadas dentro de uma família de proteínas e utilizadas para analisar a sequência de aminoácido para regiões conservadas. Uma abordagem alternativa para identificar um polinucleótido de zcytorl7 variante com base na estrutura é para determinar se uma molécula de ácido nucleico que codifica um potencial polinucleótido de zcytorl7 variante pode hibridar a uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: lô SEQ ID NO: 4 5 ou SEQ ID NO: 53ô como discutido anteriormente.

Outros métodos de identificar aminoácidos essenciais nos polipéptidos da presente invenção são procedimentos conhecidos na técnicaô tal como mutagénese dirigida ao local ou mutagénese de exame de alanina (Cunningham e Wellsô Science 244:1081 (1989'ô Bass et al.ô Proc. Natl Acad. Sei. USA 88:4498 (1991'ô Coombs e Coreyô "Local-Direted Mutagenesis and Protein Engineering1^ em Proteins: Analysis and Designô Angeletti (ed.'ô páginas 259-311 (Academic Pressô Inc. 1998''. Na última técnicaô mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo na moléculaô e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica ou bioquímica como é revelado a seguir para identificar resíduos de aminoácido que são críticos à atividade da molécula. Veja-se tambémô Hilton et al.ô J. Biol. Chem. 271:4699 (1996'. A presente invenção também inclui polipéptidos que se correspondem a fragmentos funcionais de polipéptidos de zcytorl7 e moléculas de ácido nucleico que codificam tais fragmentos funcionaisô como definido nas reivindicações. Um zcytorl7 "funcional" ou fragmento do mesmo definido no presente documento é caraterizado por sua atividade proliferativa ou diferenciaçãoô por sua capacidade para induzir ou inibir funções celulares especializadasô ou por sua capacidade de ligar especificamente a um anticorpo anti-zcytorl7 ou ligando zcytorl7 (solúvel ou imobilizado'. Além dissoô fragmentos funcionais também incluem o péptido sinalô domínio de sinalização intracelularô e semelhantes. Como anteriormente descrito no presente documentoô zcytorl7 é caraterizado por uma estrutura de recetor de citocina de classe I. A presente memória descritiva descreve ainda proteínas de fusão que abrangem: (a' moléculas de polipéptido que compreende um domínio extracelularô domínio de ligação a citocinaô ou domínio intracelular descrito no presente documento; e (b' fragmentos funcionais que compreendem um ou mais destes domínios. A outra porção de polipéptido da proteína de fusão pode ser contribuída por um outro recetor de citocina de classe lô por exemploô gpl30ô LIFô IL-12Ô WSX-lô subunidade β do recetor de IL-2 e o recetor comum β (isto éô subunidades β dos recetores de IL3Ô IL-5Ô e GM-CSF'ô ou por um péptido sinal não nativo eúou um de secreção não relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão.

Análises de deleção de rotina de moléculas de ácido nucleico podem ser realizadas para obter fragmentos funcionais de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de zcytorl7. Como uma ilustraçãoô Moléculas de ADN que tem a sequência de nucleótido da SEQ ID NO: lô SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO: 53 ou fragmentos dos mesmosô pode ser digerido com Bal31 nuclease para obter uma série de deleções aninhadas. Estes Fragmentos de ADN são então inseridos em vetores de expressão em grelha de leitura apropriadaô e os polipéptidos expressos são isolados e testados para atividade de zcytor!7ô ou para a capacidade para ligar anticorpos anti-zcytorl7 ou ligando de zcytorl7. Uma alternativa a digestão de exonuclease é utilizar mutagénese dirigida a oligonucleõtido para introduzir deleções ou codões de terminação para especificar a produção de um fragmento de zcytor!7 desejado. Alternativamenteô fragmentos particulares de um polinucleótido de zcytorl7 podem ser sintetizados usando a reação em cadeia da polimerase. Métodos padrão para identificar domínios funcionais são bem conhecidos aos peritos na especialidade. Por exemploô estudos sobre o truncamento num ou ambos os terminais de interferões foram sumarizados por Horisberger e Di Marcoô Pharmac. Ther. 66:507 (1995'. Além dissoô técnicas padrão para a análise funcional de proteínas são descritas porô por exemploô Treuter et al.ô Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993'; Content et al.ô ® Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon® ô em Biological Interfeon Systemsô Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systemsô Cantell (ed.'o páginas 65-72 (Nijhoff 1987'; Herschmanô 0 the EGF Receptor® ô em Control of AnimaEell Proliferation lô Boynton et al.ô (eds.' páginas 169-199 (Academic Press 1985'; Coumailleau et al.ô J. Biol. Chem. 270:29270 (1995'; Fukunaga et al.ô J. Biol. Chem. 270:25291 (1995'; Yamaguchi et al.ô Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995'; e Meisel et al.ô Plant Molecô Biol. 30:1 (1996'.

Substituições de aminoácido múltiplas podem ser feitas e testadas utilizando métodos conhecidos de mutagénese e rastreioô tais como aqueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer Science 241:53 (1988'' ou Bowie e

Sauer (Proc. Nat® 1 Acad. Sei. USA 86:2152 (1989''. De maneira breveô estes autores revelam métodos para aleatorizar simultaneamente duas ou mais posições num polipéptidoô selecionar para polipéptido funcionalô e então sequenciar os polipéptidos mutagenizados para determinar o espectro de substituições permissíveis em cada posição. Outros métodos que podem ser utilizados incluem apresentação em fago (por exemploô Lowman et al.ô Biochem. 30:10832 (1991'ô Ladner et al.ô Patente US N° 5.223.409Ô

Huseô Publicação internacional N° WO 92Ú06204'ô e mutagénese direcionada a região (Derbyshire et al.ô Gene 46:145 (1986'Ô e Ner et al.ô ADN 7:127Ô (1988''.

Variantes das sequências de polipéptido e nucleótido de zcytorl71ig reveladas podem também ser geradas através de rearranjo de ADN como foi revelado por Stemmerô Nature 3 7 0:389 (1994'ô Stemmerô Proc. Natl Acad. Sei. USA 91:10747 (1994'ô e Publicação do WIPO N° WO 97Ú20078. De maneira breveô moléculas de ADN variantes são geradas por recombinação homóloga in vitro por meio de fragmentação aleatória de um ADN parental seguido por remontagem utilizando PCRô tendo como resultado mutações ponto aleatoriamente introduzidas. Esta técnica pode ser modificada utilizando uma família de moléculas de ADN parentaisô tais como variantes alélicas ou moléculas de ADN de espécies diferentesô para introduzir variabilidade adicional no processo. Seleção ou rastreio para a atividade desejadaô seguido por iterações adicionais de mutagénese e ensaio trata de "evolução" rápida das sequências por meio da seleção de mutações desejáveis ao mesmo tempo que seleciona simultaneamente contra mudanças prejudiciais.

Os métodos de mutagénese como são revelados no presente documento podem ser combinados com métodos de rastreio automatizados e de alto rendimento para detetar a atividade de polipéptidos de recetor zcytorl7 mutagenizadosô clonados em células hospedeiras. Ensaios preferidos com relação a isso incluem ensaios de proliferação celular e ensaios de ligação a ligando com base em biossensorô que são descritos a seguir. As moléculas de ADN mutagenizadas que codificam recetores ativos ou porções dos mesmos (por exemploô fragmentos de ligação a ligandoô domínios de sinalizaçãoô e semelhantes' podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas utilizando equipamento moderno. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individuais num polipéptido de interesseô e podem ser aplicados a polipéptidos de recetor solúvel de zcytorl7.

Além dissoô as proteínas da presente memória descritiva (ou fragmentos de polipéptido das mesmas' podem ser unidas a outras moléculas bioativasô particularmente recetores de citocinaô para proporcionar moléculas multifuncionais. Por exemploô um ou mais domínios do recetor solúvel de zcytorl7 podem ser unidos a outros recetores solúveis de citocina aumentar as suas propriedades biológicas ou eficácia de produção. A presente memória descritiva descreve uma série de novas moléculas híbridas em que um segmento que compreende uma ou mais dos domínios de zcytorl? é fusionado a outro polipéptido. Fusão é preferentemente feita por splicing no nível de ADN para permitir a expressão de moléculas quiméricas em sistemas de produção recombinante. As moléculas resultantes são então ensaiadas para tais propriedades como solubilidade melhoradaô estabilidade melhoradaô semivida de depuração prolongadaô expressão melhorada e níveis de secreçãoô e farmacodinâmica. Tais moléculas híbridas podem compreender ainda resíduos de aminoácido adicionais (por exemploô um ligante de polipéptido' entre as proteínas ou polipéptidos de componente.

Usando os métodos discutidos no presente documentoô um perito na especialidade pode identificar eúou preparar uma variedade de fragmentos ou variantes do polipéptido da SEQ ID NO:2Ô SEQ ID NO:46Ô SEQ ID NO:54Ô SEQ ID NO:57 e SEQ ID NO: 93 que retêm a transdução de sinal ou atividade de ligação a ligando. Por exemploô um pode fazer um "recetor solúvel" de zcytorl7 preparando uma variedade de polipéptidos que são substancialmente homólogos ao domínio de ligação a citocina (dos resíduos 20 (Ala' a 227 (Pro' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; resíduos 33 (Ala' a 24 (Pro' da SEQ ID NO: 54 'ô o domínio extracelular (resíduos 2 0 (Ala' a 519 (Glu' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; resíduos 33 (Ala' a 532 (Glu' da SEQ ID NO: 2'ô ou variantes alélicas ou espécies ortólogos dos mesmos (por exemploô veja-se SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 93 e fragmentos funcionais das mesmas como descrito no presente documento'' e retêm atividade de ligação a ligando da proteína de zcytorl7 de tipo selvagem. Além dissoô recetores de zcytorl7 solúveis variantes tais como aqueles mostrados na SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 22 podem ser isolados. Tais polipéptidos podem incluir aminoãcidos adicionais deô por exemploô parte ou a totalidade dos domínios transmembrana e intracelular. Tal polipéptidos pode também incluir segmentos adicionais de polipéptido como geralmente revelado no presente documento tal como marcadoresô etiquetas de afinidadeô e semelhantes.

For qualquer polipéptido de zcytorl7ô incluindo variantesô recetores solúveisô e polipéptidos de fusão ou proteínasô um perito na especialidade pode facilmente gerar uma sequência de polinucleótido completamente degenerada que codifica essa variante usando a informação expostas nos Quadros 1 e 2 anteriores.

Os polipéptidos de zcytorl? da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem ser produzidos em células hospedeiras modificadas por engenharia genética de acordo com técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de células que podem ser transformadas ou transfetadas com ADN exógeno e crescidas em culturaô e incluem bactériasô células fúngicasô e células eucarióticas superiores cultivadas. As células eucarióticasô particularmente células cultivadas de organismos multicelularesô são preferidas. Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introdução de ADN exógeno numa variedade de células hospedeiras são reveladas por Sambrook et al.ô Molecular Cloning: A Laboratory Manualô 2a ed.ô Cold Spring Harbor Laboratory Pressô Cold Spring Harborô NYô 1989Ô e Ausubel et al.ô eds.ô Current Protocols in Molecular Biologyô John Wiley e Sonsô Inc.ô NYô 1987.

Em geralô uma sequência de ADN que codifica um polipéptido de zcytorl7 é ligada operativamente a outros elementos genéticos requeridos para a sua expressãoô incluindo geralmente um promotor e terminador de transcriçãoô dentro de um vetor de expressão. 0 vetor conterá também comummente um ou mais marcadores selecionáveis e uma ou mais origens de replicaçãoô embora os peritos na especialidade reconhecessem que dentro de certos sistemasô marcadores selecionáveis podem ser proporcionados em vetores separadosô e replicação do ADN exógeno pode ser proporcionada pela integração no genoma da célula hospedeira. A seleção de promotoresô terminadoresô marcadores selecionáveisô os vetores e outros elementos é um assunto de desenho de rotina dentro do nível de um perito ordinário na especialidade. Muitos de tais elementos são descritos na literatura e estão disponíveis através de fornecedores comerciais.

Para direcionar um polipéptido de zcytorl7 na via de secreção de uma célula hospedeiraô uma sequência sinal de secretor (também conhecida como uma sequência líderô sequência prepro ou sequência pre' é proporcionada no vetor de expressão. A sequência sinal de secretor pode ser essa de zcytorl7ô ou pode ser derivada de outra proteína segregada (por exemploô t-PA' ou sintetizada de novo. A sequência de sinal de secretor é ligada operativamente à sequência de ADN de zcytorl7ô isto éô as duas sequências são unidas na grelha de leitura correta e posicionadas para direcionar o polipéptido sintetizado recentemente na via de secreção da célula hospedeira. As sequências sinal de secreção são comummente posicionadas 50 à sequênciade ADN que codifica o polipéptido de interesseô embora certas sequências sinal de secreção possam ser posicionadas em qualquer lugar na sequência de ADN de interesse (veja-seô por exemploô Welch et al.ô Patente US N° 5.037.743; Holland et al.ô Patente US N° 5.143.830'.

Alternativamenteô a sequência de sinal secretora contida nos polipéptidos descritos no presente documento é usada para direcionar outros polipéptidos na via de secreção. Tais polipéptidos de fusão são descritos no presente documento. Um polipéptido de fusão de sinal pode ser feito em que uma sequência de sinal secretor derivada do aminoácido 1 (Met' ao aminoácido 19 (Ala' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46Ô ou era que uma sequência de sinal secretor derivada a partir do aminoácido 1 (Met' a aminoácido 32 (Ala' da SEQ ID NO: 54ô ou aminoácido 1 (Met' a aminoácido 45 (Ala' da SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 93' ô ou aminoácido 28 (Met' ao resíduo 45 (Ala' da SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 93'ô é ligada operativamente a outro polipéptido usando métodos conhecidos na técnica e revelados no presente documento. A sequência de sinal secretor contida nos polipéptidos de fusão descritos no presente documento é preferentemente fusionada amino-terminalmente a um péptido adicional para direcionar o péptido adicional na via de secreção. Tais construções têm numerosas aplicações conhecidas na técnica. Por exemploô estas novas construções de fusão de sequência sinal de secreção podem direcionar a secreção de um componente ativo de uma proteína normalmente não segregada. Tais fusões podem ser utilizadas in vivo ou in vitro para direcionar péptidos através da via de secreção. Células de mamíferos cultivadas são hospedeiros adequados dentro da presente invenção. Os métodos para introduzir ADN exógeno em células de mamíferos hospedeiras incluem transfeção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al.ô Cell 14:7250 1978; Corsaro e Pearsonô Somatic Cell Genetics 7:603o 1981: Graham e Van der Ebô Virology 52:4560 1973'ô eletroporaçâo (Neumann et al.ô EMBO J. 1:841-50 1982'ô transfeção mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al.ô ibid.'ô e transfeção mediada por lipossoma (Haw-ley-Nelson et al.ô Focus 15:73ô 1993; Ciccarone et al.ô Focus 15:800 1993Ô e vetores virais (Miller e Rosmanô Bio-Técnicas 7:980-900 1989; Wang e Finerô Nature Med. 2:714-60 1996'. A produção de polipéptidos recombinantes em células de mamíferos cultivadas é reveladaô por exemploô por Levinson et al.ô Patente US N° 4.713.33 9; Hagen et al.ô Patente US N° 4.784.950; Palmiter et al.ô Patente US N° 4.579.821; e Ringoldô Patente US N° 4.656.134. As células de mamíferos cultivadas adequadas incluem as linhas de células COS-1 (N° de ATCC CRL 1650'ô COS-7 (N° de ATCC CRL 1651'ô BHK (N° de ATCC CRL 1632' ô BHK 570 (N° de ATCC CRL 10314'ô 293 (N° de ATCC CRL 1573; Graham et al.ô J. Gen. Virol. 36:59-720 1977' e ovário de hamster chinês (por exemploô CHO-K1; N° de ATCC CCL 61'. As linhas de células adequadas adicionais são conhecidas na técnica e disponíveis de centros depositários públicos tais como a Coleção Americana de Culturas Celularesô Rockvilleô Mariland. Em geralô promotores de transcrição fortes são preferidosô tais como promotores de SV-40 ou citomegalovírus. Veja-seô por exemploô a Patente US N° 4.956.288. Outros promotores adequados incluem aqueles de genes de metalotioneína (Patentes US N° 4.579.821 e 4.601.978' e o promotor tardio principal de adenovirus. A seleção de fármaco é utilizada geralmente para selecionar células de mamíferos cultivadas em que ADN estranho foi inserido. Tais células são comummente denominadas como "transfetantes". As células que foram cultivadas na presença do agente seletivo e são capazes de passar o gene de interesse à sua progénie são denominadas como "transfetantes estáveis". Um marcador selecionável preferido é um gene que codifica resistência ao antibiótico neomicina. A seleção é levada a cabo na presença de um fármaco do tipo neomicinaô tal como G-418 ou semelhantes. Os sistemas de seleção podem também ser utilizados para aumentar o nível de expressão do gene de interesseô um processo denominado como "amplificação". A amplificação é levada a cabo pela cultura de transfetantes na presença de um nível baixo do agente seletivo e aumentando então a quantidade de agente seletivo para selecionar células que produzem níveis altos dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador selecionável amplificãvel preferido é dihidrofolato reductaseô que confere resistência a metotrexato. Outros genes de resistência a fãrmaco (por exemploô resistência a higromicinaô resistência a múltiplos fãrmacosô puromicina acetiltransferase' podem também ser utilizados. Marcadores alternativos que introduzem um fenótipo alteradoô tal como proteína fluorescente verdeô ou proteínas de superfície celular tais como CD4ô CD8Ô MHC de Classe Iô fosfatase alcalina placentãria podem ser utilizados para separar células transfetadas de células não transfetadas por tais meios como tecnologia de separação FACS ou pérola magnética.

Outras células eucarióticas superiores podem também ser utilizadas como hospedeirosô incluindo células vegetaisô células de insetos e células de aves. A utilização de Agrobaterium rhizogenes como um vetor para expressar genes em células vegetais foi revisto por Sinkar et al.ô J. Biosci. (Bangalore' 11:47-580 1987. A transformação de células de insetos e produção de polipéptidos estranhos nas mesmas é revelada por Guarino et al.ô Patente US N° 5.162.222 e publicação WIPO N° WO 94Ú06463. As células de insetos podem ser infetadas com baculovírus recombinanteô comummente derivado de vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (Ac-NPV'. Veja-seô Kingô L.A. e Possee. R.D.ô The Baculovírus Expression System: A Laboratory Guideô Londonô Chapman # Hall; OReillyô D.R. et al. ; Baculovírus Expression Vetors: A Laboratory Manualô Nova lorqueô Oxford University Press.ô 1994; e Richardsonô C.D.ô Ed.ô Baculovírus Expression Protocols. Methods in Molecular Biologyô Totowaô NJô Humana Pressô 1995. 0 segundo método de preparação baculovírus recombinante utiliza um sistema à base de transposon descrito por Luckow (Luckowô V.Aô et al.ô J Virol 67:4566-79ô 1993'. Este sistema é vendido no kit Bac-to-Bac™ (Life Technologiesô Rockvilleô MD'. Este sistema utiliza um vetor de transferênciaô pFastBacl™ (Life Technologies' que contém um transposon Tn7 para mover o ADN que codifica o polipéptido de zcytorl7 num genoma de baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo chamado um ãbacmídeoã. Veja-seô Hill-Perkinsô M.S. e Posseeô R.D.ô J Gen Virol 71: 971-6Ô 1990; Bonningô B.C. et al.ô J Gen Virol 75:1551-60 19 94; eô Chazenbalquô G.D.ô e Rapoportô B.ô J Biol Chem 270:1543-90 1995. Além dissoô os vetores de transferência podem incluir uma fusS o dentro da grelha com ADN qa codifica uma etiqueta de epítopo na terminaçS o C ouN do polipéptido de zcytorl71ig expressoô por exemploô uma etiqueta de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyerô T. et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952-40 1985'. Usando uma técnica conhecida na técnicaô u um vetor de transferência que contém zcytorl71ig é transformado em E. Coliô e rastreado para baemídeos que contêm um gene lacZ interrompido indicativo baculovírus de recombinante. 0 ADN de baemídeo que contém o genoma de baculovírus recombinante é isoladoô utilizando técnicas comunsô e utilizado para transfetar células de Spodotera frugiperdaô por exemploô células Sf9. 0 vírus recombinante que expressa zcytorl71ig é produzido subsequentemente. Reservas virais recombinantes sB o feitas por meio de métodos comummente utilizados na técnica. 0 vírus recombinante é utilizado para infetar células hospedeirasô tipicamente uma linha celular derivada do lagarta-do-cartucho-do-milhoô Spodotera frugiperda. Veja-seô em geralô Glick e Pasternakô Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNAô ASM Pressô Washingtonô D.C.ô 1994. Outra linha celular adequada é a linha celular High FiveO™ (Invitrogen' derivada de Trichoplusia ni (Patente US N° 5.300.435'. Meios livres de soro comercialmente disponíveis sE o usados para crecer e manter as células. Meios adequados sM o Sf9G0 II™ (life Technologies' ou ESF 921™ (Expression Systems' para as células Sf 9; e Ex-cellO405™ (JRH Biosciencesô Lenexaô KS' ou Express FiveO™ (Life Technologies' para as células T. ni. Procedimentos usados sS o geralmente descritos m manuais de laboratório disponíveis (Kingô L. A. e Posseeô R.D.ô ibid.; 0'Reillyô D.R. et al.ô ibid.; Richardsonô C. D.ô ibid.' . A purificação subsequente do polipéptido de zcytorl? a partir do sobrenadante pode ser conseguida usando métodos descritos no presente documento.

Também podem ser utilizados células fúngicasô incluindo células de levedura dentro da presente invenção. As espécies de levedura com um interesse particular a este respeito incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Revelam-se métodos para transformar células de S. cerevisiae com ADN exógeno e produzir polipéptidos recombinantes a partir das mesmasô por exemplo por Kawasakiô Patente US N° 4.599.311; Kawasaki et al.ô Patente US N° 4.931.373; Brakeô Patente US N° 4.870.008; Welch et al.ô Patente US N° 5.037.743; e Murmy et al.ô Patente US N° 4.845.075. As células transformadas são selecionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador selecionávelô comummente resistência a fármacos ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular (por exemploô leucina'. Um sistema de vetor preferido para utilização em Saccharomyces cerevisiae ê o sistema de vetor PGT1 revelado por Kawasaki et al. (Patente US N° 4.931.373'ô que permite selecionar as células transformadas por crescimento em meio que contém glicose. Os promotores e terminadores adequados para utilização em levedura incluem os de genes de enzimas glicolíticas (veja-seô por exemploô Kawasakiô Patente US N° 4.599.311; Kingsman et al.ô Patente US N° 4.615.974; e Bitterô Patente US N° 4.977.092' e genes de álcool desidrogenase. Vejam-se também as Patentes US N° 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 e 4.661.454. Na técnica conhecem-se sistemas de transformação para outras levedurasô incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces latis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa.

Veja-seô por exemploô Gleeson et al.ô J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65Ô 1986 e Creggô Patente US N° 4.882.279. Podem utilizar-se células de Aspergillus de acordo com os métodos de McKnight et al.ô Patente US N° 4.935.349. Revelam-se métodos para transformar Acremonitum chrysogenum por Sumino et al.ô Patente US N° 5.162.228. Revelam-se métodos para transformar Neurospora por Lambowitzô Patente US N° 4.486.533. A utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é revelada nas Publicações WIPO N° WO 97Ú17450Ô WO 97Ú17451Ô WO 98Ú02536 e WO 98Ú02565. As moléculas de ADN para utilização na transformação de P. methanolica comummente serão preparadas como plasmídeos circularesô de cadeia duplaô que são alinhadas preferentemente antes da transformação. Para a produção de polipéptidos em P. methanolicaô prefere-se que o promotor e terminador no plasmídeo sejam esses de um gene de P. methanolicaô tal como um gene de utilização de álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2! . Outros promotores úteis incluem esses da dihidroxiacetona sintase (DELAS'ô formiato desidrogenase (FMD'o e catalase (CAT'. Para facilitar a integração do ADN no cromossoma do hospedeiroô prefere-se ter o segmento de expressão inteiro do plasmídeo flanqueado nas duas extremidades por sequências de ADN do hospedeiro. Um marcador de seleção preferido para utilização em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolicaô que codifica a fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilase (AIRC; EC 4.1. 1.21'ô que permite que as células hospedeiras ade2 cresçam na ausência de adenina. Para os processos industriais em larga escala em que é desejável minimizar a utilização de metanolô prefere-se utilizar células hospedeiras de proteínas segregadasô preferem-se células hospedeiras deficientes em genes de proteases vacuolares (PEP4 e PRB1'. Utiliza-se eletroporação para facilitar a introdução de um plasmídeo que contém ADN que codifica um polipéptido de interesse em células de P. methanolica. Prefere-se transformar as células de P. methanolica por eletroporação utilizando um campo elétrico de pulsosô que se reduz exponencialmenteô que tem uma intensidade de campo de 2ô5 a 4ô5 kVÚcmô preferentemente de aproximadamente 3Ô75 kVÚcm e uma constante de tempo (t' de 1 a 40 milissegundosô mais preferentemente de aproximadamente 20 milissegundos. São também células hospedeiras úteisô células hospedeiras procariotasô incluindo estirpes da bactéria Escherichia coli, Bacillus e outros géneros dentro da presente invenção. Neste campo são bem conhecidas técnicas para transformar estes hospedeiros e expressar sequências de ADN estranhas clonadas no seu interior (veja-seô por exemploô Sambrook et al.ô ibid. ' . Quando é expresso um polipéptido de zcytorl7 em bactérias tais como E. coliô o polipéptido pode ficar retido no citoplasmaô tipicamente como grânulos insolúveisô ou pode dirigir-se ao espaço periplasmãtico por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro casoô as células são lisadasô e os grânulos são recuperados e desnaturados utilizandoô por exemploô isotiocianato de guanidina ou ureia. 0 polipéptido desnaturado depois pode ser redobrado e dimerizado por meio da diluição do desnaturanteô tal como por diãlise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutatião reduzido e oxidadoô seguido de diálise contra uma solução salina tamponada. No último casoô o polipéptido pode ser recuperado do espaço periplasmãtico numa forma solúvel e funcional rompendo as células (por exemploô por sonicação ou choque osmõtico' para libertar o conteúdo do espaço periplasmãtico e recuperar a proteínaô evitando desta maneira a necessidade de desnaturação e redobragem.

As células hospedeiras transformadas ou transfetadas são cultivadas de acordo com os procedimentos convencionais num meio de cultura que contém nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células hospedeiras escolhidas. Na técnica conhece-se uma variedade de meios adequadosô incluindo meios definidos e meios complexosô e geralmente incluem uma fonte de carbonoô uma fonte de azotoô aminoácidos essenciaisô vitaminas e minerais. Os meios também podem conter componentes tais como fatores de crescimento ou soroô quando for necessário. 0 meio de crescimento geralmente selecionará as células que contêm o ADN adicionado exogenamenteô por exemploô por seleção com fãrmacos ou deficiência num nutriente essencial que é complementado pelo marcador de seleção que possui o vetor de expressão ou co-transfetado na célula hospedeira. As células de P. methanolica são cultivadas num meio que compreende fontes de carbono adequadasô azoto e nutrientes de oligoelementos a uma temperatura de aproximadamente 25 °C a 35 °C. As culturas líquidas são proporcionadas com suficiente aeração por meios convencionaisô tais como agitação de pequenos balões ou pulverização de fermentadores. Um meio de cultura preferido para P. methanolica é YEPD (2 ® de D-glicoseô 2 ® de Bato™ Peptona (Difco Laboratoriesô Detroitô MI'ô 1 ® de extrato de levedura Bato™ (Difco Laboratories'ô 0Ô004 ® de adenina e 0Ô006 ® de L-leucina'.

Dentro de um aspeto da presente memória descritiva um recetor de citocina zcytorl? (incluindo domínios transmembrana e intracelular' é produzido por uma célula cultivadaô e a célula é usada para rastrear por ligandos para o recetorô incluindo o ligando naturalô bem como agonistas e antagonistas do ligando natural. Para resumir esta abordagemô um ADNc ou gene que codifica o recetor é combinado com outros elementos genéticos requeridos para sua expressão (por exemploô um promotor de transcrição'ô e o vetor de expressão resultante é inserido em uma célula hospedeira. Células que expressam o ADN e produzem recetor funcional são selecionadas e usadas dentro de uma variedade de sistemas de rastreio. Células de mamífero adequadas para uso na expressão dos novos polipéptidos de recetor da presente invenção e transdução um sinal mediado por recetor incluem células que expressa uma subunidade βό tal como gpl30ô e células que co-expressam recetor de gpl30 e LIF (Gearing et al.ô EMBO J. 10:2839-28480 1991; Gearing et al.ô Patente U.S. n° 5.284.755'. Com relação a isso é geralmente preferido utilizar uma célula é que responsiva a outras citocinas que ligam a recetores na mesma subfamíliaô tal como IL-6 ou LIFô porque tais células conterão a(s' via(s' transdução de sinal necessárias. Células preferidas deste tipo incluem células BaF3 (Palacios e Steinmetzô Cell 41: 727-734Ô 1985; Mathey-Prevot et al.ô Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135Ô 1986'ô a linha celular TF-1 humana (ATCC número CRL-2003' e a linha celular DA-1 (Branch et al.ô Blood 69: 1782Ô 1987; Broudy et al.ô Blood 75:1622-16260 1990'. Na alternativaô células hospedeiras adequadas podem ser modificadas por engenharia para produzir uma subunidade β ou outro componente celular necessário para resposta celular desejada. Por exemploô a linha celular murina BaF3 (Palacios e Steinmetzô Cell 41:727-7340 1985; Mathey-Prevot et al.ô Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135Ô 1986'ô uma linha celular rim de hamster bebé (BHK'ô ou a linha celular CTLL-2 (ATCC TIB-214' pode ser transfetada para expressar a subunidade gp!30 de ratinhoô ou recetor de gpl30 e LIF de ratinhoô além de zcytorl7. É geralmente preferido utilizar uma célula hospedeira e recetor(es' da mesma espécieô no entanto esta abordagem permite que linhas de células sejam modificadas por engenharia para expressar múltiplas subunidades de recetor de qualquer espécieô deste modo superando limitações potenciais que surgem de especificidade de espécie. Em alternativaô homólogos de espécie do ADNc de recetor humanos podem ser clonados e usados dentro linhas de células da mesma espécieô tal como um ADNc de ratinho na linha de células BaF3. Linhas de células que são dependentes de um fator de crescimento hematopoiéticoô tal como IL-3Ô podem assim ser modificadas por engenharia para se tornar dependente de um ligando de zcytorl? ou anticorpo anti-zcytorl?. Células que expressam zcytorl? funcional são usadas dentro de ensaios de rastreio. Uma variedade de ensaios adequados é conhecida na técnica. Estes ensaios são com base na deteção de uma resposta biológica na célula alvo. Tal ensaio é um ensaio de proliferação celular. Células são cultivadas na presença ou ausência de um composto de testeô e a proliferação celular é detetada porô por exemploô medição da incorporação de timidina tritiada ou por ensaio colorimétrico com base na redução ou quebra metabólica de Alymar Blue™ (AccuMedô Chicagoô IL' ou brometo de 3-(405-dimetiltiazol-2-il'-2ô5-difenil tetrazolio (MTT' (Mosmanô J. Immunol. Met. 65:55-630 1983'. Um formato de ensaio alternativo usa células que são adicionalmente modificadas por engenharia para expressar um gene repórter. 0 gene repórter é ligado a um elemento promotor que é responsive à via ligada a recetorô e o ensaio deteta a ativação de transcrição do gene repórter. Um elemento promotor preferido com relação a isso é um elemento de resposta a soroô STAT ou SRE (veja-seô por exemploô Shaw et al.ô Cell 56:563-5720 1989'. Tal gene repórter preferido é um gene de luciferase (de Wet et al.ô Mol. Cell. Biol. 7:7250 1987'. Expressão do gene de luciferase é detetada por meio de luminescência usando métodos conhecidos na técnica (por exemploô Baumgartner et al.ô J. Biol. Chem. 269:19094-29101Ô 1994; Schenborn e Goiffinô Promega Notes 41:!lô 1993'. Kits de ensaio de luciferase são comercialmente disponíveis deô por exemploô Promega Corp.ô Madisonô WI. Linhas de células alvo deste tipo podem ser usadas para rastrear bibliotecas de produtos químicosô meios de cultura condicionados por célulasô caldos fúngicosô amostras de soloô amostras de ãguaô e semelhantes. Por exemploô um banco de amostras de meio condicionado de célula ou tecido pode ser ensaiado numa célula alvo para identificar células que produzem ligando. Células positivas são então usadas para produzir uma biblioteca de ADNc num vetor de expressão de célula de mamíferoô que é dividido em agrupamentosô transfetados em células hospedeirasô e expresso. Amostras de meios das células transfetadas são então ensaiadasô com subsequente divisão de agrupamentosô retransfeçãoô subcultivoô e re-ensaio de células positivas para isolar uma linha celular clonal que expressa o ligando. Amostras de meios condicionados por rimô fígadoô baçoô timoô outros tecidos linfoidesô ou células T são preferidas fontes de ligando para uso em procedimentos de rastreio.

Um ligando natural para zcytorl? pode também ser identificado por meio de mutagénese de uma linha celular dependente de citocina que expressam zcytorl7 e cultivar a mesma sob condições que selecionam crescimento autócrino. Veja-se publicação do WIPO WO 95Ú21930. Dentro de um procedimento típicoô células que expressam zcytorl? são mutagenizadasô tal como com EMS. As células são então permitidas que se recuperem na presença da citocina requeridaô então transferidas a um meio de cultura que não possui a citocina. As células que sobrevivem são rastreadas para a produção de um ligando para zcytorl7ô tal como pela adição de polipéptido de recetor solúvel que compreende o domínio de ligação a citocina de zcytorl7ô como descrito no presente documento ao meio de cultura para competir contra o ligando ou por meio de ensaio de meios condicionados em células de tipo selvagem em comparação com células transfetadas que expressam o recetor zcytorl7. Linhas de células preferidas para utilização dentro deste método incluem células que são transfetadas para expressar gpl30 ou gpl30 em combinação com recetor LIF. Tais linhas de células hospedeiras incluem células CTLL-2 transfetadass (Gillis e Smithô Nature 268:154-1560 1977' e células BaF3 transfetadas.

Além dissoô um método de captura de secreção que utiliza polipéptido de zcytorl? de recetor solúvel pode ser usado para isolar um ligando de zcytorl7 (Aldrichô et al, Cell 87: 1161-1169Ô 1996'. Uma biblioteca de expressão de ADNc preparada a partir uma fonte conhecida ou suspeita é transfetada em células COS-7. A biblioteca de vetor de ADNc geralmente tem uma origem 5V40 para amplificação em células C0S-7Ô e um promotor CMV para alta expressão. As células COS-7 transfetadas são crescidas numa monocamada e então fixas e permeabilizadas. Recetor solúvel de zcytorl7 etiquetado ou marcado com biotinaô descrito no presente documentoô é então colocado em contato com a camada de célula e permitido que se ligue as células na monocamada que expressam uma molécula anti-complementarô isto éô um ligando de zcytorl7. Uma célula que expressa um ligando assim será ligado com moléculas de recetor. Um anticorpo anti-etiqueta (anti-Ig para fusões de Igô M2 ou anti-FLAG para fusões etiquetadas com FLAGô estreptavidinaô etiqueta anti-Glu-Gluô e semelhantes' que é conjugado com peroxidase de rábano (HRP' é usado para visualizar estas células a que o recetor solúvel de zcytorl7 etiquetado ou marcado com biotina foi ligado. A HRP catalisa deposição de um reagente de tiramidaô por exemploô tiramida-FTTC. Um kit comercialmente disponível pode ser usado para esta detecção (por exemploô Kit Renaissance TSA-Diret™; NEN Life Science Productsô Bostonô MA' . Células que expressam ligando de recetor zcytorl7 serão identificados sob microscopia de fluorescência como células verdes e colhidos para subsequente clonagem do ligando usando procedimentos para resgate de plasmídeo como observado em Aldrichô et alo supra.ô seguido por ciclos subsequente de ensaio de captura de secreçãoô ou rastreio convencional de agrupamentos de biblioteca de ADNcô até que clones individuais são identificados.

Como um recetorô a atividade de polipéptido de zcytorl7 pode medir-se por um microfisiõmetro biossensor à base de silício que mede a velocidade de acidificação extracelular ou a excreção de protões associada à ligação ao recetor e as posteriores respostas celulares fisiológicas. Um dispositivo exemplar é o Microfisiõmetro Cytosensor™ fabricado por Molecular Devicesô Sunnyvaleô CA. Pode medir-se uma variedade de respostas celularesô tais como a proliferação celularô o transporte iónicoô a produção de energiaô respostas inflamatóriasô atividade reguladora e de recetores e semelhantes por este método. Veja-seô por exemploô McConnellô H.M. et al.ô Science 257:1906-19120 1992; Pitchfordô S. et al.ô Met. Enzymol. 228:84-1080 1997; Arimilliô S. et al.ô J. Immunol. Met. 212:49-590 1998; Van Liefdeô I. Et al.ô Eur. J. Pharmacol. 346:87-950 1998. 0 microfisiõmetro pode ser usado para ensaiar células eucarióticaô procariõticaô aderente ou não aderente. Pela medição de mudanças de acidificação extracelular em meio celular ao longo do tempoô o microfisiõmetro diretamente mede respostas celulares a vários estímulosô incluindo agonistasô ligandosô ou antagonistas do polipéptido de zcytorl7. Preferentementeô o microfisiõmetro é usado para medir respostas de uma célula eucariótica que expressam Zcytorl7ô em comparação com uma célula eucariótica de controlo que não expressa polipéptido de zcytorll. Células eucariõticas que expressam Zcytorl7 compreendem células em que zcytorl7 foi transfetado ou infetado via vetor adenovírusô e semelhantesô como descrito no presente documentoô criando uma célula é que responsiva a estímulos que modulam zcytorl7ô ou são células que expressam naturalmente zcyt.orl7ô tal como células que expressam zcytorl7 derivadas de tecido linfoideô de baçoô de timo ou PBLs. Diferençasô medidas por um aumento ou diminuição em acidificação extracelularô na resposta de células que expressam zcytorl7ô com relação a um controloô são uma medida direta de respostas celulares moduladas por zcytorl7. Além dissoô tal respostas moduladas por zcytorl? podem ser ensaiadas sob uma variedade de estímulos. Tambémô usando o microfisiómetroô é proporcionado um método de identificar agonistas e antagonistas de polipéptido de zcytorl7ô que compreende proporcionar células que expressam um polipéptido de zcytorl7ô cultivar uma primeira porção das células na ausência de um composto de testeô cultivar uma segunda porção das células na presença de um composto de testeô e detetar um aumento ou uma diminuição numa resposta celular da segunda porção das células em comparação com a primeira porção das células. Antagonistas e agonistasô incluindo o ligando natural para polipéptido de zcytorl7ô pode ser rapidamente identificado usando este método.

Ensaios adicionais descritos no presente documento incluem a utilização de polipéptidos híbridos de recetor. Estes polipéptidos híbridos estão em duas classes gerais. Dentro da primeira classeô o domínio intracelular de zcytorl7ô que compreende aproximadamente dos resíduos 544 (Lys' a 732 (Vai' da SEQ ID NO: 2ô resíduos 544 (Lys' a 649 (lie' da SEQ ID NO: 46ô ou resíduos 557 (Lys' a 662 (Ile' da SEQ ID NO: 54ô ou resíduos 551 (Lys' a 662 (Cys' da SEQ ID NO: 57 é unido ao domínio de ligação a ligando de um segundo recetor. É preferido que o segundo recetor ser um recetor de citocina hematopoiéticoô tal comoô recetor mpl (Souyri et al.ô Cell 63:1137-11470 1990'. 0 recetor híbrido compreenderá ainda um domínio transmembranaô que pode ser derivado de recetor. Uma construção de ADN que codifica o recetor híbrido é então inserida numa célula hospedeira. Células que expressam o recetor híbrido são cultivadas na presença de um ligando para o domínio de ligação e ensaiadas para uma resposta. Este sistema proporciona um meio para analisar transdução de sinal mediada por zcytorl7 enquanto usar ligandos facilmente disponíveis. Este sistema pode também ser usado para determinar se linhas de células particulares são capazes de responder a sinais transduzidos por zcytorl7. Uma segunda classe de polipéptidos recetores híbridos compreende o domínio extracelular (ligação a ligando' (aproximadamente dos resíduos 20 (Ala' a 519 (Glu' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; aproximadamente resíduos 33 (Ala' a 532 (Glu' da SEQ ID NO: 54' ou domínio de ligação a citocina de zcytorl7 (aproximadamente resíduos 20 (Ala' a 22 7 (Pro' da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 46; OU aproximadamente resíduos 33 (Ala' a 240 (Pro' da SEQ ID NO: 54; aproximadamente resíduos 46 (Vai' a 533 (Glu' da SEQ ID NO: 57; ou aproximadamente resíduos 46 (Vai' a 533 (Trp' da SEQ ID NO: 93' com um domínio citoplasmático de um segundo recetorô preferentemente um recetor de citocinaô e um domínio transmembrana. O domínio transmembrana pode ser derivado de recetor. Recetores híbridos desta segunda classe são expressos em células conhecidas por serem capazes de responder a sinais transduzidos pelo segundo recetor. Juntasô estas duas classes de recetores híbridos permitem a utilização de um amplo espectro de tipos de célula dentro de sistemas de ensaio com base em recetor.

As células que expressam um ligando para zcytorl7 são então usadas para preparar uma biblioteca de ADNc a partir do qual o ADNc que codifica ligando pode ser isolado como revelado acima. A presente memória descritiva assim descreveô além de novo polipéptidos de recetorô métodos para clonar ligandos de polipéptido para os recetores. A estrutura de zcytorl7 e expressão em tecidos sugere um papel no desenvolvimento hematopoiético precoce ou de timõcitos e regulação da resposta imune ou inflamação. Estes processos envolvem a estimulação da proliferação celular e a diferenciação em resposta à ligação de uma ou mais citocinas aos seus recetores cognatos. Em vista da distribuição tissular observada para este recetorô os agonistas (incluindo o ligando natural' e os antagonistas têm um enorme potencial em aplicações tanto in vitro como in vivo. Os compostos identificados como agonistas de recetor sâo úteis para estimular a proliferação e desenvolvimento de células alvo in vitro e in vivo. Por exemploô compostos agonistas ou anticorpos anti-zcytorl7ô são úteis como componentes de um meio de cultura celular definidoô e podem utilizar-se em separado ou em combinação com outras citocinas e hormonas para substituir o soro que é utilizado comummente nas culturas celulares. Desta maneiraô os agonistas são úteis para promover especif icamente o crescimento etJou desenvolvimento ou ativação de monócitosô células Tô células Bô e outras células dos linhagens linfoide e mieloideô e células hematopoiéticas em cultura.

Ligandos agonistas para zcytorl7ô ou anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligaçãoô podem ser úteis para estimular a imunidade mediada por células e para estimular a proliferação de linfócitosô tal como no tratamento de infeções que envolvem imunossupressãoô incluindo certas infeções virais. Outras utilizações incluem a supressão tumoralô em que transformação maligna tem como resultado células tumorais que são antigénicas. Ligandos agonistas ou anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligação poderiam utilizar-se para induzir citotoxicidadeô que pode estar mediada pela ativação de células efetoras tais como linfócitos Tô células NK (citolíticas naturais' ou células LAK (destruidoras ativadas por linfoide'ô ou induzir-se diretamente por meio de vias apoptóticas. Ligandos agonistasô anticorpos anti- zcytorl7 e parceiros de ligação podem também ser úteis para tratar leucopenias aumentando os níveis do tipo celular afetadoo e para aumentar a regeneração do repertório de linfócitos T depois do transplante de medula óssea; ou para aumentar a proliferação ou ativação de monócitosô e para diagnóstico e outras utilizações descritas no presente documento.

Ligandos antagonistasô compostosô ou anticorpos anti-zcytorl7 podem encontrar utilidade na supressão do sistema imuneô tal como no tratamento de doenças autoimunesô incluindo artrite reumatoideô esclerose múltiplaô diabetes mellitusô doença inflamatória do intestinoô doença de Crohnô etc. A supressão imune pode ser utilizada também para reduzir a rejeição de transplante e enxertos de tecidos ou órgãos e para tratar leucemias ou linfomas específicos de linfócitos Tô linfócitos B ou monócitosô e outros cancros de célula imuneô por meio da inibição da proliferação do tipo celular afetado. Além dissoô polinucleótidos de zcytorl7ô anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligação podem ser usados para detetar monócitosô e ajudar no diagnóstico de tal doença autoimuneô particularmente em estados de doença onde monócitos são elevados ou ativados.

Polipéptidos de zcytorl7 podem também ser usados dentro de sistemas de diagnóstico para a deteção de níveis circulantes de ligando. Dentro de um aspeto relacionadoô anticorpos ou outros agentes que se ligam especificamente a polipéptidos de recetor zcytorl7 podem ser usados para detetar polipéptidos de recetor circulantes. Zcytorl7 parece ser expresso naturalmente como um recetor solúvel como mostrado pelas formas de recetor solúvel mostradas na SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO :22. A elevação ou redução dos níveis de ligando ou polipéptidos de recetor pode ser indicativa de estados patológicosô incluindo cancro. Polipéptidos de recetor solúveis podem contribuir a processos patológicos e podem ser um marcador indireto de uma doença subjacente. Por exemploô os níveis elevados de recetor de IL-2 solúvel em soro humano foram associados a uma ampla variedade de afeções inflamatórias e neoplãsicasô tais como enfarto de miocárdioô asmaô miastenia graveô artrite reumatoideô leucemia aguda de linfócitos Tô linfomas de linfócitos Bô leucemia linfocítica crónicaô cancro de cólonô cancro de mama e cancro de ovário (Heaney et al.ô Blood 87:847-8570 1996'. De forma similarô o zcytorl7 está elevado em monócitos ativados eô portantoô o zcytorl7 eúou seus recetores solúveis podem estar associados ou servir como um marcador de afeções inflamatórias e neoplãsicas associadas ao mesmo.

Um polipéptido de ligação a ligando de um recetor zcytorl7ô ou "recetor solúvelô" pode ser preparado por meio da expressão de um ADN truncado que codifica o domínio de ligação a citocina de zcytorl7 (aproximadamente resíduo 20 (Ala' até o resíduo 227 (Pro' do recetor humano SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46; aproximadamente resíduo 33 (Ala' até o resíduo 240 (Pro' do recetor humano SEQ ID NO:54'ô ou o domínio extracelular (aproximadamente resíduo 20 (Ala' até O resíduo 519 (Glu' da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46; aproximadamente resíduo 33 (Ala' até o resíduo 532 (Glu' da SEQ ID NO:54'ô ou a região correspondente de um recetor não humanoô por exemploô tal como as regiões correspondentes descritas no presente documento para SEQ ID NO:57 e SEQ ID NO :93. É preferido que o domínio extracelular ser preparado numa forma substancialmente livre de segmentos de polipéptido transmembrana e intracelular. Além dissoô fragmentos de polipéptido de ligação a ligando dentro do domínio de ligação a citocina de zcytorl7ô descritos acimaô podem também servir como recetores solúveis zcytorl7 para as utilizações descritas no presente documento. Para direcionar a exportação de um polipéptido de recetor da célula hospedeiraô o ADN recetor é ligado a um segundo segmento de ADN que codifica um péptido secretorô tal como um péptido secretor t-PA ou um péptido secretor zcytorl7. Para facilitar a purificação do polipéptido de recetor segregadoô uma extensão C-terminalô tal como uma etiqueta poli-histidinaô péptido de etiqueta Glu-Gluô substância Pô péptido Flag™ (Hopp et al.ô BioÚTechnology 6:1204-12100 1988; disponível junto à Eastman Kodak Co.ô New Havenô CT' ou um outro polipéptido ou proteína para o qual um anticorpo ou outro agente de ligação específica está disponívelô pode ser fusionado ao polipéptido de recetor.

Numa abordagem alternativaô um domínio extracelular de recetor pode ser expresso como uma fusão com regiões constantes de cadeia pesada de imunoglobulinaô tipicamente um fragmento Fc (por exemploô Fc4'ô que contém dois domínios de região constante e não possui a região variável. Tais fusões são tipicamente segregadas como moléculas multiméricas em que as porções Fc são ligadas por dissulfureto uma à outra e dois polipéptidos de recetor são arranjados em estreita proximidade um ao outro. Fusões deste tipo podem ser usadas para purificar por afinidade o ligando cognato da soluçãoô como uma ferramenta de ensaio in vitroô para bloquear sinais in vitro por meio da retirada por titulação especificamente do ligandoô e como antagonistas in vivo por meio da administração parentericamente aos mesmos para ligar o ligando em circulação e retirá-lo da circulação. Para purificar o ligandoô uma quimera zcytorl7-Ig é adicionada a uma amostra contendo o ligando (por exemploô meios de cultura condicionados com células ou extratos de tecido' sob condições que facilitam ligação de ligando a recetor (tipicamente temperatura próxima à fisiológicaô pHô e força iónica'. 0 complexo quimera-ligando é então separado por meio de mistura usando proteína Aô que é imobilizado num suporte sólido (por exemploô esferas de resina insolúveis'. 0 ligando é então eluído usando técnicas químicas convencionaisô tais como com um gradiente de sal ou pH. Na alternativaô a própria quimera pode ser ligada a um suporte sólidoô com a ligação e eluição levadas a cabo como acima. As frações colhidas podem ser re-fracionadas até que o nível de pureza desejado seja atingido.

Além dissoô recetores solúveis zcytorl? podem ser usados como um "dissipador de ligandoô" isto éô antagonistaô para ligar-se a ligando in vivo ou in vitro em aplicações terapêuticas ou outras aplicações onde a presença do ligando não é desejada. Por exemploô em cancros que estão a expressar uma grande quantidade de ligando de zcytorl7 bioativoô recetores solúveis zcytorl7 podem ser usados como um antagonista direto do ligando in vivo, e podem ajudar na redução da progressão e sintomas associados à doença. Além dissoô o recetor solúvel de zcytorl7 pode ser usado para desacelerar a progressão de cancros que sobre-expressam recetores zcytorl7ô por meio da ligação a ligando in vivo que aumentaria de outro modo a proliferação daqueles cancros. Aplicações in vitro semelhantes para um recetor solúvel de zcytorl7 podem ser usadasô por exemploô como uma seleção negativa para selecionar linhas de células que crescem na ausência de ligando de zcytorl7.

Além dissoô o recetor solúvel de zcytorl7 pode ser usado in vivo ou em aplicações de diagnóstico para detetar zcytorl7 cancros que expressam ligando in vivo ou em amostras de tecido. Por exemploô o recetor solúvel de zcytorl7 pode ser conjugado a um radiomarcador ou marcador fluorescente como descrito no presente documentoô e usado para detetar a presença do ligando numa amostra de tecido usando um ensaio de ligação do tipo ligando-recetor in vitroô ou ensaio de formação de imagem fluorescente. Além dissoô um recetor solúvel de zcytorl7 radiomarcado poderia ser administrado in vivo para detetar tumores sólidos que expressam ligando através de um método de radioimageamento conhecido na especialidade.

Os polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô têm utilidade particular no braço de monócitosúmacrófagos do sistema imune. Por exemploô o interferão gama (IFNy) é um potente ativador de fagõcitos mononucleares. 0 aumento na expressão de zcytorl7 após a ativação de células THP-1 (N° do ATCC TIB-202) com interferão gama sugere que este recetor está envolvido na ativação de monócitos. Os monócitos são células incompletamente diferenciadas que migram a diversos tecidos em que maduram e se convertem em macrófagos. Os macrõfagos desempenham um papel fundamental na resposta imune ao apresentar o antigénio aos linfócitos e desempenham um papel de apoio como células auxiliares aos linfócitos ao segregar numerosas citocinas. Os macrófagos podem internalizar moléculas extracelulares e após a ativação têm uma maior capacidade de destruir microrganismos intracelulares e células tumorais. Os macrófagos ativados também estão envolvidos na estimulação da inflamação aguda ou local. Além dissoô mostra-se que a função de monócitos-macrõfagos é anormal numa variedade de estados patológicos. Por exemploô veja-se Johnstonô RBô New Eng. J. Med. 318:747-7520 1998.

Um perito na especialidade reconhecerá que são úteis os agonistas de zcytorl7. Por exemploô relatou-se uma migração reduzida de monócitos em populações com uma predisposição a infeçõesô tais como bebés recém-nascidosô pacientes que recebem corticosteroides ou outra terapêutica imunosupressoraô e pacientes com diabetes mellitusô queimaduras ou SIDA. Os agonistas para zcytorl7ô tais como anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligaçãoô bem como o ligando naturalô poderiam produzir um aumento na capacidade dos monócitos de migrar e possivelmente prevenir a infeção nestas populações. Também existe um profundo defeito de destruição fagocítica pelos fagõcitos mononucleares de pacientes com doença granulomatosa crónica. Isto tem como resultado a formação de abscessos subcutâneosô assim como abscessos no fígadoô pulmõesô baço e gânglios linfáticos. Um agonista de zcytorl7 tal como anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligaçãoô bem como o ligando naturalô poderiam corrigir ou melhorar este defeito fagocítico. Além dissoô relatou-se uma citotoxicidade defeituosa de monócitos em pacientes com cancro e síndrome de Wiskott-Aldrich (eczemaô trombocitopenia e infeções recorrentes'. A ativação de monócitos por agonistas do recetor zcytor!7 tais como zcytorl71ig poderia ajudar no tratamento destas afeções. 0 sistema de monócitos-macrófagos está envolvido de forma proeminente em várias doenças de armazenamento de lípidos (esfingolipidose' tais como a doença de Gaucher. A resistência à infeção pode ser afetada por um defeito na função dos macrófagosô que poderia tratar-se por agonistas para zcytor!7 tais como anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligaçãoô bem como o ligando natural.

Além dissoô um perito na especialidade reconhecerá que são úteis os antagonistas de zcytor!7. Por exemploô em lesões aterosclerõticasô uma das primeiras anormalidades é a localização de monócitosúmacrófagos em células endoteliais. Estas lesões poderiam ser prevenidas por meio da utilização de antagonistas de zcytorl7. Os anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligação podem também ser usados como antagonistas ao ligando natural de zcytorl7. Além dissoô a leucemia monoblástica está associada a uma variedade de anormalidades clínicas que refletem a libertação dos produtos biológicos dos macrófagosô os exemplos incluem altos níveis de lisozima no soro e urina e febres elevadas. Além dissoô ditas leucemias apresentam um aumento anormal de células monocíticas. Estes efeitos possivelmente poderiam ser prevenidos por antagonistas para zcytorl7ô tal como descrito no presente documento. Além dissoô os anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligação podem ser conjugados com moléculas tais como resíduos tóxicos e citocinasô como é descrito no presente documentoô para dirigir a destruição de células monocíticas de leucemia.

Utilizando métodos conhecidos na técnica e revelados no presente documentoô um perito poderia avaliar facilmente a atividade de agonistas e antagonistas de zcytorl7 nos estados patológicos revelados no presente documentoô inflamaçãoô cancro ou infeção assim como em outros estados patológicos que envolvem células monocíticas. Além dissoô como zcytorl7 é expresso de uma maneira específica de monócitosô e estas doenças envolvem anormalidades em células monocíticasô tais como proliferaçãoô funçãoô localização e ativação celularô os polinucleótidosô polipéptidosô e anticorpos da presente invenção podem ser usados como diagnósticos para detetar as ditas anormalidades de células monocíticasô e indicar a presença de doença. Tais métodos envolvem tomar uma amostra biológica de um pacienteô tal como sangueô saliva ou biopsiaô e a comparação da mesma com uma amostra de controlo normal. Podem utilizar-se métodos histológicosô citológicosô citometria de fluxoô métodos bioquímicos e outros métodos para determinar os níveis relativos ou a localização de zcytorlVô ou células que expressam zcytorl7ô isto éô monócitosô na amostra do paciente em comparação com o controlo normal. Uma mudança no nível (aumento ou redução' da expressão de zcytorl7ô ou uma mudança no número de localização de monõcitos (por exemploô aumento ou infiltração de células monocíticas em tecidos em que normalmente não estão presentes' em comparação com um controlo indicaria doença. Tais métodos de diagnóstico também podem incluir a utilização de marcadores radiométricosô fluorescentes e colorimétricos associados aos polinucleótidosô polipéptidos ou anticorpos da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos 11a técnica e são revelados no presente documento.

Podem utilizar-se sequências de aminoãcidos que têm atividade de zcytorl7 para modular o sistema imune por ligação ao ligando de zcytorl7ô e portantoô prevenir a ligação de ligando de zcytorl7 com o recetor zcytorl7 endógeno. Também podem ser utilizados antagonistas de zcytorl7ô tais como anticorpos anti- zcytorl7 para modular o sistema imune por inibição da ligação de ligando de zcytorl? com o recetor zcytorl7 endógeno. Por conseguinteô a presente memória descritiva descreve a utilização de proteínasô polipéptidos e péptidos que têm atividade de zcytorl? (tais como polipéptidos de zcytorl7ô análogos de zcytorl7 (por exemploô anticorpos anti-idiotipo anti-zcytorl7' e proteínas de fusão de zcytorl?' a um indivíduo que carece de uma quantidade adequada deste polipéptidoô ou que produz um excesso de ligando de zcytorl?. Também podem ser utilizados antagonistas de zcytorl? (por exemploô anticorpos anti-zcytorl7' para tratar a um indivíduo que produz um excesso de ligando de zcytorl7 ou zcytorl7. Os indivíduos adequados incluem mamíferosô tais como seres humanos.

Mostra-se que zcytorl7 é expresso positivamente em células de monócitosô e pode estar envolvido na regulação da inflamação. Como talô os polipéptidos da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem ser ensaiados e utilizados por sua capacidade de modificar a inflamação ou podem ser utilizados como um marcador de inflamação. Na técnica conhecem-se métodos para determinar qualidades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias de zcytorl7 e analisam-se no presente documento. Além dissoô pode estar envolvido na regulação positiva da produção de reagentes de fase agudaô tais como amiloide A de soro (SAA'ô ocl-antiquimotripsina e haptoglobinaô e a expressão de ligando de zcytorl? pode estar aumentada após a injeção de lipopolissacárido (LPS' in vivo que está envolvido na resposta inflamatória (Dumoutierô L. et al.ô Proc. NatS 1. Acad. Sei. 97:10144-101490 2000'. A produção de proteínas de fase agudaô tais como SAAô é considerada um mecanismo de sobrevivência a curto prazo em que a inflamação é benéfica; no entantoô a manutenção de proteínas de fase aguda durante períodos mais prolongados contribui à inflamação crónica e pode ser prejudicial para a saúde humana. Como revisãoô veja-se Uhlarô CM e Whiteheadô ASô Eur. J. Biochem. 265:501-5230 1999Ô e Baumann H. e Gauldieô J. Immunology Today 15:74-800 1994. Além dissoô a proteína SAA de fase aguda está envolvida na patogénese de várias doenças inflamatórias crónicasô está envolvida na aterosclerose e artrite reumatoideô e é o precursor da proteína A amiloide depositada na amiloidose (Uhlarô CM e Whiteheadô supra.'. Desta maneiraô quando há um ligando para zcytorl7 que atua como molécula pró-inflamatória e induz a produção de SAAô os antagonistas seriam úteis para tratar a doença inflamatória e outras doenças associadas a proteínas de resposta de fase aguda induzidas pelo ligando. Tais antagonistas são descritos no presente documento. Por exemploô um método de redução de inflamação compreende administrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de uma composição de recetor que compreende zcytorl7 solúvelô ou anticorpo anti-zcytorl7 que é suficiente para reduzir a inflamação. Além dissoô um método de supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação pode compreender: (1' a determinação de um nível de proteína amiloide A em soro; (2' a administração de uma composição que compreende um polipéptido de recetor de citocina zcytorl7 solúvel como descrito no presente documento num veículo farmacêutico aceitável; (3' a determinação do nível posterior à administração de proteína amiloide A em soro; (4' a comparação do nível de proteína A amiloide em soro na etapa (1' com o nível de proteína A amiloide em soro da etapa (3'ô em que a ausência de um aumento ou uma redução no nível em soro de proteína A amiloide é indicativa de supressão de uma resposta inflamatória. A presente memória descritiva descreve recetores que incluem pelo menos uma subunidade de recetor zcytorl7. Um segundo polipéptido de recetor incluído no recetor heterodimérico solúvel pertence à subfamília de recetores que inclui as subunidades de recetor de citocinas de classe I. Além de um polipéptido recetor zcytorl7 monomérico ou homodiméricoô um recetor zcytorl? heterodimérico solúvelô como é exemplificado por uma forma de realização que compreende um recetor zcytorl7 solúvel 0 componente heterodimérico de recetor solúvel de classe lô pode atuar como antagonista do ligando natural de zcytorl?. A memória descritiva também descreve recetores multiméricos solúveis que compreendem zcytorl7. A análise da distribuição tissular do ARNm que corresponde ao ADNc de zcytorl? mostrou que o nível de ARNm era máximo em monócitos e células de próstataô e está elevado em monócitos ativadosô e células CD4° ativadasô CD8° ativadas e CD3° ativadas. Desta maneiraô zcytor!7 está implicado na indução de resposta inflamatória e imune. A presente memória descritiva descreve a utilização de heterodímeros de zcytorl7 solúvel como antagonistas em doenças ou condições inflamatórias e imunes tais como pancreatiteô diabetes do tipo I (IDDM'o cancro pancreáticoô pancreatiteô Doença de Gravesô doença inflamatória do intestino (IBD'ô Doença de Crohnô cancro do cólon e intestinalô diverticuloseô doença autoimuneô sepseô transplante de órgão ou medula óssea; inflamação devido a traumaô cirurgia ou infeção; amiloidose; esplenomegalia; doença do enxerto versus hospedeiro; e quando há inibição de inflamaçãoô supressão imuneô redução da proliferação de células hematopoiéticasô imunesô inflamatórias ou linfoidesô macrõfagosô linfócitos T (incluindo células Thl e Th2ô células CD4° e CD8°'ô supressão da resposta imune a um agente patogénico ou antigénio. Além dissoô a presença de expressão de zcytorl78 em células imunes ativadas tais como células CD40 e CD 19° ativadas mostrou que zcytorl7 pode estar envolvido nas reações defensivas imunes do corpo contra invasores estranhos: tais como microrganismos e detritos celularesô e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante a inflamação e a formação de cancros. Como talô anticorposô da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô são agonistas ou antagonistas da função do zcytorl? podem utilizar-se para modificar a resposta imune e a inflamação.

Além dissoô anticorpos ou polipéptidos de ligação que se ligam a polipéptidos de zcytorl7ô monómerosô homodímerosô heterodímeros e multímeros descritos no presente documento eúou polipéptidos de zcytorl7ô monómerosô homodímerosô heterodímeros e multímeros por si mesmos são úteis para: 1' Antagonizar ou bloquear a sinalização através dos recetores zcytorl7 no tratamento da inflamação agudaô inflamação como resultado de traumatismoô lesão tissularô cirurgião sepsia ou infeçãoô e doenças inflamatórias crónicas tais como asmaô doença inflamatória do intestino (DlI'ô colite crónicaô esplenomegaliaô artrite reumatoideô episódios inflamatórios agudos recorrentes (por exemploô tuberculose' e tratamento de amiloidose e ateroscleroseô doença de Castlemanô asma e outras doenças associadas à indução de resposta de fase aguda. 2' Antagonizar ou bloquear a sinalização através de recetores que compreendem os recetores zcytorl7 no tratamento de doenças autoimunes tais como IDDMô esclerose múltipla (EM'ô lúpus eritematoso sistémico (LES'ô miastenia graveô artrite reumatoide e DII para prevenir ou inibir a sinalização em células imunes (por exemplo linfõcitosô monócitosô leucócitos' por meio de o recetor zcytorl7 (Hughes C et al.ô J. Immunol 153: 3319-3325Ô 1994'. Como alternativaô também podem ser utilizados anticorposô tais como anticorpos monoclonais (AcM' contra recetores que compreendem zcytorl7ô como antagonistas para reduzir células imunes indesejadas para tratar uma doença autoimune. A asmaô a alergia e outras doenças atõpicas podem ser tratados com um AcM contraô por exemploô recetores solúveis zcytorl7 ou heterodímeros zcytorl7ÚCRF2-4ô para inibir a resposta imune ou reduzir as células ofensivas. 0 bloqueio ou inibição cia sinalização através de zcytorl? utilizando os polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô também podem ser benéficos para doenças do pâncreasô rimô hipófise e células neuronais. Podem beneficiar-se a IDDM (diabetes mellitus dependente de insulina'ô NIDDM (diabetes mellitus não dependente de insulina'ô pancreatite e carcinoma pancreãtico. 0 zcytorl? pode servir como alvo para a terapêutica com AcM de cancros em que um AcM antagonista inibe o crescimento do cancro e se dirige a destruição mediada pelo sistema imune. (Holliger Pô e Hoogenboomô H: Nature Biotech. 16: 1015-1016Ô 1998'. Os AcM contra monómerosô homodímerosô heterodímeros e multímeros de recetor zcytorl? solúvel também podem ser úteis para tratar nefropatias tais como glomeruloescleroseô neuropatia membranosaô amiloidose (que também afeta ao rim entre outros tecidos'ô arteriosclerose renalô glomerulonefrite de diversas origensô doenças fibroproliferativas do rimô assim como disfunção renal associada a LESô IDDM (diabetes mellitus dependente de insulina'ô diabetes de tipo II (NIDDM'ô tumores renais e outras doenças. 3' Agonizar ou iniciar a sinalização através dos recetores zcytorl? no tratamento de doenças autoimunes tais como IDDMô EMô LESô miastenia graveô artrite reumatoide e DII. 0 zcytorl? pode sinalizar aos linfócitos ou outras células imunes para que se diferenciemô alterem a proliferação ou mudem a produção de citocinas ou proteínas da superfície celular que melhorem a autoimunidade. Especificamenteô a modulação de uma resposta de linfócitos T auxiliares a um padrão alternativo de secreção de citocinas pode desviar uma resposta autoimune para melhorar a doença (Smith JA et al.ô J. Immunol. 160:4841-48490 1998'. De forma similarô

Anticorpos monoclonais anti-zcytorl7ô anti-heterodímero e multímero podem ser utilizados para sinalizarô reduzir e desviar células imunes envolvidas na asmaô alergia e doenças atópicas. A sinalização através do zcytorl7 também pode ser benéfico para doenças do pâncreasô rimô pituitária e células neuronais. Podem beneficiar-se a IDDMô NIDDMô pancreatite e carcinoma pancreãtico. 0 zcytorl7 pode servir como alvo para a terapêutica com AcM de cancro pancreático quando a sinalização de um AcM inibe o crescimento do cancro e se dirige à destruição mediada pelo sistema imune (Tuttô AO et al.ô J Immunol. 161: 3175-3185Ô 1998). De forma similarô podem ser tratados com anticorpos monoclonais da presente invençãoô tais como aqueles indicados nas reivindicaçõesô leucemias específicas de linfócitos Tô linfomasô e carcinomas.

Os polipéptidos monoméricosô homodiméricosô heterodiméricos e multiméricos de zcytorl7 solúvel descritos no presente documento podem ser utilizados para neutralizar/bloquear a atividade do ligando de zcytorl7 no tratamento de doenças autoimunesô doença atópicaô NIDDMô pancreatite e disfunção renal como foi descrito anteriormente. Pode utilizar-se uma forma solúvel do zcytorl7 para promover uma resposta imune mediada por linfócitos T e/ou promover a produção de IL-4 ou outras citocinas por linfócitos ou outras células imunes.

Os polipéptidos de recetor que compreendem zcytorl7 solúvel da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô são úteis como antagonistas do seu ligando natural. Tais efeitos antagonistas podem ser alcançados pela neutralização direta ou ligação do seu ligando natural. Além de utilizações antagonistasô os polipéptidos de recetor solúveis da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem ligar-se a ligando de zcytorl7 e atuar como proteínas portadoras para o ligandoô com a finalidade de transportar o ligando a diferentes tecidosô órgãosô e células dentro do corpo. Como talô os polipéptidos de recetor solúveis da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem fusionar-se ou acoplar-se a moléculasô polipéptidos ou resíduos químicos que dirigem o complexo recetor solúvel-ligando a um local específicoô tal como um tecidoô célula imune específicaô monócitos ou tumor. Por exemploô na infeção aguda ou alguns cancrosô podem ser obtidos benefícios pela indução de inflamação e proteínas de resposta local de fase aguda. Assimô os polipéptidos de recetor solúveis da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem ser usados para direcionar especificamente a ação de um ligando pró-inflamatório. Veja-seô Cosmanô D. Citocina 5: 95-106Ô 19 93 ; e Fernandez- Botranô R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-5130 2000.

Além dissoô os polipéptidos de recetor solúveis da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem ser usados para estabilizar o ligando de zcytorl7ô para aumentar a biodisponibilidadeô longevidade terapêutica eúou eficácia do Ligando por meio da estabilização do Ligando contra a degradação ou eliminaçãoô ou por meio do direcionamento do ligando a um local de ação dentro do corpo. Por exemploô o complexo IL-6ÚIL6-R solúvel natural estabiliza a IL-6 e pode sinalizar através do recetor gpl30. Veja-se Cosmanô D. supra.ô e Fernandez-Botranô R. supra. Além dissoô zcytorl7 pode ser combinado com um ligando cognato tal como o seu ligando para compreender um complexo ligandoúrecetor solúvel. Ditos complexos podem ser utilizados para estimular respostas de células que apresentam uma subunidade de recetor de companhia. A especificidade celular dos complexos de zcytorl7Úligando pode diferir da observada do ligando administrado somente. Além dissoô os complexos podem ter propriedades farmacocinéticas distintas tais como um efeito sobre a semividaô doseúresposta e especificidade de órgão ou tecidoô desta maneiraô os complexos de zcytorl7Úligando podem ter atividade agonista para aumentar uma resposta imune ou estimular às células mesangiais ou estimular às células hepáticas. Como alternativaô somente os tecidos que expressam uma subunidade de sinalização que forma heterodímero com o complexo podem ser afetados de forma análoga à resposta aos complexos IL6ÚIL6R (Hirota H. et al.ô Proc. Nat'l. Acad. Sei. 92:4862-48660 1995; Hiranoô T. em Thomasonô A. (Ed.0 "The Cytokine Hanbook"ô 3a Edô p. 208-2090 . Os complexos de recetor solúvelÚcitocina para IL12 e CNTF apresentam atividades parecidas.

Os polipéptidos homodiméricosô heterodiméricos e multiméricos de recetor zcytorl? podem também ser usados dentro de sistemas de diagnóstico para a deteção de níveis circulantes de ligandoô e na deteção de resposta inflamatória em fase aguda. Dentro de uma forma de realização relacionadaô os anticorpos da presente invençãoô como indicado nas reivindicações podem ser usados para detetar polipéptidos de recetor circulantes; pelo contrárioô recetores solúveis zcytorl7 por si mesmos podem ser usados para detetar polipéptidos de ligando circulante ou de ação local. Os níveis elevados ou reduzidos de polipéptidos de ligando ou recetor podem ser indicativos de estados patológicosô incluindo inflamação ou cancro. Além dissoô a deteção de proteínas ou moléculas de fase aguda tais como ligando de zcytorl7 pode ser indicativa de um estado inflamatório crónico em certos estados patológicos (por exemplo artrite reumatoideS . A deteção de dita afeções serve para ajudar ao diagnóstico da doença além de ajudar ao médico a escolher uma terapêutica apropriada. A diferenciação é um processo progressivo e dinâmicoô que começa com as células estaminais pluripotentes e termina com as células diferenciadas terminalmente. As células estaminais pluripotentes que podem ser regeneradas sem o comprometimento de uma linhagem expressam uma série de marcadores de diferenciação que se perdem quando é feito o comprometimento de uma linhagem celular. As células progenitoras expressam uma série de marcadores de diferenciação que podem ou não continuar a se expressar de acordo com progresso das células à via da linhagem celular em direção à maduração. Os marcadores de diferenciação que se expressam exclusivamente pelas células maduras normalmente são propriedades funcionais tais como produtos celularesô enzimas para produzir produtos celulares e recetores. 0 estágio de diferenciação de uma população celular é monitorizado pela identificação de marcadores presentes na população celular. Acredita-se que os miócitosô osteoblastosô adipõcitosô condrócitosô fibroblastos e células reticulares se originem de uma célula estaminal mesenquimal comum (Owen et al.ô Giba Fdn. Sump. 136:42-46. 1988'. Os marcadores para as células estaminais mesenquimais ainda não foram bem identificados (Owen et al.ô J. of Cell Sci. 87:731-7380 1987'ô de modo que a identificação é usualmente feita nos estágios de células progenitoras e maduras. Os novos polipéptidos da presente invençãoô tal como é referido nas reivindicaçõesô podem ser úteis para estudos de isolar as células estaminais mesenquimais e miõcitos ou outras células progenitorasô tanto in vivo como ex vivo. Há evidências que sugerem que os fatores que estimulam ou regulam tipos específicos de células negativamente uma via em direção à diferenciação terminal ou desdiferenciação afetam a população de células inteira proveniente de um precursor comum ou células estaminaisô e podem ser utilizados para estimular ou inibir a proliferação de células linfoidesô células hematopoiéticas e células endoteliais. Assimô os polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô tal como exposto nas reivindicaçõesô podem ter utilização na inibição de células tumoraisô e em particular células linfoidesô hematopoiéticasô de próstataô endoteliais e de tumores da tiroide.

Os ensaios que medem a diferenciação incluemô por exemploô medição de marcadores celulares associados à expressão específica de estágio de um tecidoô atividade enzimãticaô atividade funcional ou alterações morfológicas (Wattô FASEBô 5:281-2840 1991; Francisô Differentiation 57:63-750 1994; Raesô Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocessesô 161-17101989'. Alternativamenteô o próprio polipéptido de zcytorl7 pode servir como uma superfície celular adicional ou marcador segregado associado à expressão específica de estágio de um tecido. Como talô a medição direta do polipéptido de zcytorl7ô ou a sua perda de expressão num tecidoô uma vez que se diferenciaô pode servir como um marcador para identificação ou diferenciação deô por exemploô o tecido da próstataô ou células de monócitos.

De igual modoô a medição direta do polipéptido de zcytorl7ô ou a sua perda de expressão num tecido pode ser determinada num tecido ou célulasô uma vez que sofram progressão tumoral. Aumentos na capacidade invasiva e motilidade das célulasô ou o ganho ou perda de expressão de zcytorl7 num estado pré-canceroso ou cancerosoô em comparação com o tecido normalô podem servir como um diagnóstico para a transformaçãoô invasão e metástase em progressão tumoral. Como talô o conhecimento do estágio de tumor de progressão ou metástase ajudará o médico na escolha da terapêutica mais adequadaô ou a agressividade do tratamentoô para um determinado paciente com cancro individual. Métodos de medição de ganho e perda de expressão (de ARNm ou proteína' são bem conhecidos na especialidade e descritos no presente documento e podem ser aplicados à expressão de zcytorl7. Por exemploô o aparecimento ou desaparecimento de polipéptidos que regulam a motilidade celular pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico e prognóstico de cancro da próstata (Banyardô J. e Zetterô B.R.ô Cancer and Metast. Rev. 17:449-4580 1999'. Como efetor da motilidade celularô a ativaçãoô proliferaçãoô ou diferenciaçãoô ganho ou perda de zcytorl7 de expressão pode servir como um diagnóstico para cancros linfoidesô hematopoiéticosô da prõstataô endoteliaisô e da tiroide e outros cancros.

Além dissoô como zcytorl7 é específico de monócitos e da próstataô as sondas de polinucleótidosô anticorpos anti-zcytorl7ô e deteção da presença de polipéptidos de zcytorl7 em tecidos podem ser utilizados para avaliar se os monócitos ou tecido da próstata estão presentesô por exemploô após a cirurgia que envolve a excisão de uma próstata doente ou cancerosaô ou na avaliação da infiltração de monócitos nos tecidos doentes ou infetados ou cancros de monócitos. Como talô os polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô tal como exposto nas reivindicaçõesô podem ser utilizados como uma ajuda para determinar se todo o tecido da próstata é excisado após a cirurgião por exemploô após a cirurgia para cancro da próstata. Em tais casosô é especialmente importante remover todo o tecido potencialmente doente para maximizar a recuperação do cancroô e para minimizar a recorrência. Além dissoô os polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô tal como exposto nas reivindicaçõesô podem ser utilizados como uma ajuda para determinar se a infiltração de monócitos está presente em tecidos doentes (por exemploô inflamado ou infetado' para monitorizar a recuperação de doença ou cancros. Formas de realização preferidas incluem fluorescenteô radiomarcadoô ou calorimetricamente marcado anticorpos anti-zcytorl7 e parceiros de ligação de polipéptido de zcytorl7ô que podem ser usados histologicamente ou in situ.

Além dissoô a atividade e o efeito de zcytorl7 sobre a expressão tumoral e a metástase podem ser medidos in vivo.

Criaram-se vários modelos de ratinho singénico para estudar a influência de polipéptidosô compostos ou outros tratamentos sobre a progressão tumoral. Nestes modelosô implantam-se células tumorais submetidas a passadas em cultura em ratinhos da mesma estirpe que o dador do tumor. As células desenvolverão tumores com características similares nos ratinhos recetoresô e também será produzida a metãstase em alguns dos modelos. Os modelos tumorais apropriados para os estudos dos presentes inventores incluem o carcinoma de pulmão de Lewis (N° de ATCC CRL-1642' e o Melanoma B16 (N° de ATCC CRL-6323'ô entre outros. Estes são duas linhas tumorais utilizadas comummenteô singénicas para o ratinho C57BL6ÚJÔ que são cultivadas e manipuladas facilmente in vitro. Os tumores resultantes da implantação de quaisquer destas linhas celulares podem produzir metãstase no pulmão em ratinhos C57BL6ÚJ. 0 modelo de carcinoma de pulmão de Lewis foi utilizado recentemente em ratinhos para identificar um inibidor da angiogénese (00 Reilly MSô et al. Cell 79: 315-328Ô 1994'. Tratam-se ratinhos C57BL6ÚJ com um agente experimental por meio de uma injeção diária de proteína recombinanteô agonista ou antagonista ou uma injeção diária de adenovirus recombinante. Três dias depois deste tratamentoô implantam-se de 10b a 106 células em baixo da pele dorsal. Como alternativaô as próprias células podem ser infetadas com adenovirus recombinanteô tal como um que expresse zcytorl7ô antes da implantação de forma que a proteína seja sintetizada no local do tumor ou intracelularmenteô ao invés de sistemicamente. Os ratinhos normalmente desenvolvem tumores visíveis em 5 dias. Os tumores são deixados a crescer durante um período de até 3 semanasô durante o qual podem alcançar um tamanho de 1500 - 1800 m3 no grupo tratado de controlo. 0 tamanho do tumor e o peso corporal são monitorizados cuidadosamente ao longo de toda a experiência. Mo momento do sacrifícioô retira-se o tumor e pesa-se junto com os pulmões e o fígado. Mostra-se que ο peso do pulmão se correlaciona bem com a carga tumoral metastãtica. Como medida adicionalô contam-se as metãstases da superfície do pulmão. 0 tumor ressecadoô os pulmões e o fígado são preparados para o exame histopatológicoô imunohistoquímica e hibridação in situo utilizando métodos conhecidos 11a técnica e descritos 110 presente documento. A influência do polipéptido expresso em questãoô por exemploô zcytorlTô sobre a capacidade do tumor de adquirir o sistema vascular e passar por metástase pode ensaiar-se desta maneira. Além dissoô aparte de utilizar adenovírusô as células implantadas podem ser transfetadas de forma transitória com zcytorl7. A utilização de transfetantes de zcytorl7 estáveis assim como a utilização de promotores induzíveis para ativar a expressão de zcytorl7 in vivo são conhecidas na técnica e podem utilizar-se neste sistema para avaliar a indução de metástase por zcytorl7. Além dissoô pode injetar-se diretamente zcytorl7 purificado ou meio acondicionado de zcytor!7 neste modelo de ratinhoô e portanto utilizar-se neste sistema. Como referência geralô veja-se O'Reilly MSô et al, Cell 79:315-3280 1994; e Rusciano Dô et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-3610 1995. A atividade de zcytorl7 e seus derivados (conjugados^ no crescimento e disseminação de células tumorais derivadas de malignidades hematológicas humanas também pode ser medida in vivo em modelo de xenoenxerto. Diversos modelos de ratinhos têm sido desenvolvidos em que as células de tumores humanos são implantadas em ratinhos imunodeficientesô coletivamente referidos como modelos de xenoenxerto. Veja-se Cattanô AR e Douglasô E Leuk. Res. 18:513-220 1994; e Flavellô DJô Hematological Ontology 14:67-820 1996. As caraterísticas do modelo de doença variam de acordo com o tipo e quantidade de células entregues ao rato. Tipicamenteô as células tumorais proliferarão rapidamente e podem ser encontradas em circulação no sangue e popular vários sistemas de órgãos. Estratégias terapêuticas adequadas para testar em tal modelo incluem toxicidade induzida por anticorpoô conjugados de ligando-toxina ou terapêuticas à base de células. 0 último métodoô vulgarmente designado como imunoterapêutica adotivaô envolve o tratamento do animal com componentes do sistema imunitário humano (isto éô linfócitosô células NK' e pode incluir a incubação ex vivo de células com zcytorl? ou outros agentes imunomoduladores. 0 ARNm correspondente a este novo ADN mostrou expressão em tecidos linfoidesô incluindo o timoô é expresso na medula óssea e próstataô monócitosô e monócitos ativadosô células B CD19°ô e pode ser expresso no baçoô nódulos linfáticosô e leucócitos de sangue periférico. Estes dados indicam um papel para o recetor zcytorl7 na proliferaçãoô diferenciação eúou ativação de células do sistema imuneô e sugerem um papel no desenvolvimento e regulação de respostas imunes. Os dados também sugerem que a interação de zcytorl? com o seu ligando podem estimular a proliferação e desenvolvimento de células mieloides e podeô tal como a IL-2Ô IL-6Ô LIFô IL-llô IL-12 e OSM (Baumann et al.ô J. Biol. Chem. 268:8414-84170 1993'ô induzir a síntese de proteínas de fase aguda em hepatócitos, É preferido purificar os polipéptidos da presente invenção a > 80 ® de purezaô mais preferentemente a > 90 ® de purezaô ainda mais preferentemente > 95 ® de purezaô e particularmente preferido é um estado farmaceuticamente puroô que é maior que 9 9Ô9 ® puro com relação a macromoléculas contaminantesô particularmente outras proteínas e ácidos nucleicosô e livre de agentes infeciosos e pirogénicos. Preferentementeô um polipéptido purificado é substancialmente livre de outro polipéptidosô particularmente outros polipéptidos de origem animal.

Os polipéptidos de zcytorl7 recombinantes expressos (ou polipéptidos de fusão ou quiméricos de zcytorl7' podem ser purificados utilizando fracionamento elJou métodos e meios de purificação convencionais. Pode utilizar-se precipitação com sulfato de amónio e extração com ácido ou caótropo para o fracionamento das amostras. As etapas de purificação exemplares podem incluir hidroxiapatitaô exclusão por tamanhoô FPLC e cromatografia líquida de fase inversa de alta resolução. Os meios cromatográficos adequados incluem dextranos derivatizadosô agaroseô celuloseô poliacrilamidaô especialmente sílicas e semelhantes. Preferem-se PEIô DEAEô QAE e derivados de Q. Os meios cromatográficos exemplares incluem os meios derivatizados com grupos feniloô butilo ou octiloô tais como Phenil-Sepharose FF (Pharmacia'ô Toyopearl butyl 650 (Toso Haasô Montgomeryvilleô PA'ô Octyl-Sepharose (Pharmacia' e semelhantes; ou resinas poliacrílicas tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas' e semelhantes. Os suportes sólidos adequados incluem pérolas de vidroô resinas baseadas em sílicaô resinas celulósicasô pérolas de agaroseô pérolas de agarose reticuladaô resinas de poliacrilamida reticulada com pérolas de poliestireno e semelhantes que são insolúveis nas condições nas quais estão a serem utilizadas. Estes suportes podem modificar-se com grupos reativos que permitem a ligação de proteínas por grupos aminoô grupos carboxiloô grupos sulfidriloô grupos hidroxilo eúou resíduos de hidrato de carbono. Os exemplos de químicas de acoplamento incluem ativação com brometo de cianogénioô ativação com N-hidroxisuccinimidaô ativação com epõxidoô ativação com sulfidriloô ativação com hidrazina e derivados de carboxilo e amino para químicas de acoplamento de carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e são utilizados amplamente na técnicaô e estão disponíveis de fornecedores comerciais. Os métodos para ligar polipéptidos recetores a meios de suporte são bem conhecidos na técnica. A seleção de um método particular é questão de um desenho de rotina e determina-se em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Veja-seô por exemploô Affinity Chromatography Principles # Methodsô Pharmacia LKB Biotechnologyô Uppsalaô Suéciaô 1988.

Os polipéptidos da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem ser isolados por exploração das suas propriedades físicas ou bioquímicas. Por exemploô pode utilizar-se cromatografia de adsorção por ião metálico imobilizado (IMAC' para purificar proteínas ricas em histidinaô incluindo essas que compreendem marcadores de polihistidina. De maneira breveô um gel primeiro é carregado com iões metálicos divalentes para formar um quelato (Sulkowskiô Trends in Biochem. 3: l-7ô 1985'. Nesta matriz serão adsorvidas proteínas ricas em histidina com diferentes afinidadesô dependendo do ião metálico utilizadoô e serão eluídas por eluição competitivaô reduzindo o pHô ou por meio da utilização de agentes quelantes fortes. Outros métodos de purificação incluem purificação de proteínas glicosiladas por cromatografia de afinidade de lectina e cromatografia de permuta iónica (Methods in Enzymol.ô Vol. 182ô "Guide to Protein Purification'^ M. Deutscherô (ed.'ô Acad. Pressô San Diegoô 1990Ô págs. 529-39' e utilização do recetor zcytorl7 solúvel. Pode construir-se uma fusão do polipéptido de interesse e um marcador de afinidade (por exemploô proteína de ligação de maltoseô um domínio de imunoglobulina' para facilitar a purificação.

Além dissoô usando métodos descritos na especialidadeô fusões de polipéptidosô ou proteínas de zcytorl7 híbridas são construídas utilizando regiões ou domínios do zcytorl7 da invenção em combinação com aquelas de outras proteínas da família de citocinas humanas (por exemplo interleucinas ou GM-CSF'ô ou proteínas heterõlogas (Sambrook et al.ô ibid.ô Altschul et al.ô ibid.ô Picardô Cur. Opin. Biologyô 5: 511-5Ô 1994Ô e referências citadas neste documento'.

Estes métodos permitem a determinação da importância biológica de domínios ou regiões de maior tamanho num polipéptido de interesse. Ditos híbridos podem alterar a cinética de reaçãoô a ligaçãoô reduzir ou expandir a especificidade do substratoô ou alterar a localização tissular e celular de um polipéptidoô e pode aplicar-se a polipéptidos de estrutura desconhecida.

Os polipéptidos de fusão ou proteínas podem ser preparados por métodos conhecidos dos peritos na especialidade através da preparação de cada componente da proteína de fusão e conjugando-os quimicamente. Alternativamenteô um polinucleõtido que codifica um ou mais componentes da proteína de fusão no quadro de leitura adequado pode ser gerado utilizando técnicas conhecidas e expressos pelos modos descritos no presente documento. Por exemploô parte ou a totalidade de um domínio ou mais domínios que conferem uma função biológica pode ser trocada entre zcytorl? da presente invenção com o (s' domínio(s' funcionalmente equivalente(s' a partir de outro membro da família de citocinas. Tais domínios incluemô mas não estão limitados aô a sequência de sinal de secreçãoô domínio extracelularô domínio de ligação de citocinaô domínio de fibronectina de tipo IIIô domínio transmembrana e domínio de sinalização intracelularô locais de Caixa I e Caixa IIô como revelado no presente documento. Seria esperado que tais proteínas de fusão tivessem um perfil funcional biológico que é o mesmo ou semelhante a polipéptidos da presente invenção ou outras proteínas conhecidas da famíliaô dependendo da fusão construída. Além dissoô tais proteínas de fusão podem apresentar outras propriedadesô como revelado no presente documento.

As técnicas de biologia molecular padrão e de clonagem podem ser usadas para trocar os domínios equivalentes entre o polipéptido de zcytorl? e aqueles polipéptidos aos quais são fusionados. Em geralô um segmento de ADN que codifica um domínio de interesseô por exemploô um domínio de zcytorl7 descrito no presente documentoô está operativamente ligado em grelha com pelo menos um outro segmento de ADN que codifica um polipéptido adicional (por exemploô um domínio ou região de outro recetor de citocinaô tal como a gpl30ô LIFô IL-12Ô WSX-lô IL-2 ou outro recetor de citocina de classe I'ô e inserido num vetor de expressão adequadoô tal como descrito no presente documento. Em geralô as construções de ADN são feitas de tal forma que os diversos segmentos de ADN que codificam as regiões correspondentes de um polipéptido estão ligados operativamente em grelha para fazer uma única construção que codifica toda a proteína de fusãoô ou uma porção funcional da mesma. Por exemploô uma construção de ADN que codificaria a partir de N-terminal a C-terminal de uma proteína de fusão que compreende um polipéptido de sinal seguido de um domínio de ligação de citocinaô seguido de um domínio transmembranaô seguido de um domínio de sinalização intracelular. Tais proteínas de fusão podem ser expressasô isoladas e ensaiadas quanto à atividadeô tal como descrito no presente documento. Além dissoô tais proteínas de fusão podem ser utilizadas para expressar e segregar fragmentos do polipéptido de zcytorl7ô a ser utilizadoô por exemploô para inocular um animal para produzir anticorpos anti-zcytorl7 tal como descrito no presente documento. Por exemploô uma sequência de sinal secretora pode ser operativamente ligada ao domínio de ligação de citocinaô domínio transmembranaô domínio de sinalização intracelular ou subfragmento do mesmoô ou uma combinação do mesmo (por exemploô polipéptidos operativamente ligados que compreendem o domínio de ligação de citocina extracelular fusionado com um domínio transmembranaô ou fragmentos de polipéptido de zcytorl7 descritos no presente documento'ô para segregar um fragmento de polipéptido de zcytorl7 que pode ser purificadoô tal como descrito no presente documento e servir como um antigénio a ser inoculado num animal para produzir anticorpos anti-zcytorl7ô como descrito no presente documento.

Os polipéptidos de zcytorl7 ou fragmentos dos mesmos podem também ser preparados através de síntese química. Os polipéptidos de zcytorl7 podem ser monómeros ou muitímeros; glicosilados ou não glicosilados; peguilados ou não peguilados; e podem ou não incluir um resíduo de aminoãcido metionina inicial.

Os polipéptidos da presente invençãoô como indicado nas reivindicaçõesô podem também ser sintetizados por síntese em fase sólida exclusivaô métodos em fase sólida parcialô condensação de fragmentos ou síntese de solução clássica. Métodos para a síntese de polipéptidos são bem conhecidos na especialidade. Veja-seô por exemploô Merrifieldô J. Am. Chem. Soc. 85:21490 1963; Kaiser et al.ô Anal. Biochem, 34:5950 1970. Depois de toda a síntese do péptido desejado num suporte sólidoô o péptido-resina é com um reagente que cliva o polipéptido a partir da resina e remove a maioria dos grupos protetores de cadeia lateral. Tais métodos são bem conhecidos na especialidade. A atividade de polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invenção pode ser medida usando uma variedade de ensaios que medem a diferenciação e proliferação celular. Tais ensaios são bem conhecidos na especialidade.

As proteínas da presente invençãoô tal como é referido nas reivindicaçõesô são úteis por exemploô no tratamento e diagnóstico de distúrbios linfoidesô imunesô inflamatóriosô esplénicosô do sangue ou dos ossosô e podem ser medidas in vitro utilizando células cultivadas ou in vivo por meio da administração de moléculas da presente invenção para o modelo animal apropriado. Por exemploô as células hospedeiras que expressam um polipéptido de recetor solúvel °zcytorl7 podem ser incorporadas num ambiente de alginato e injetadas (implantadas' em animais recetores. A microencapsulação de alginato-poli-L-lisinaô encapsulação de membrana de permeabilidade seletiva e câmaras de difusão são um meio para reter as células de mamífero transfetadas ou células de mamífero primárias. Estes tipos de "encapsulações" não imunogénicas permitem a difusão de proteínas e outras macromoléculas segregadas ou libertadas pelas células capturadas para o animal recetor. Mais importante aindaô as cápsulas mascaram e protegem as células incrustadas estranhas da resposta imune do animal recetor. Tais encapsulações podem prolongar a vida útil das células injetadas desde algumas horas ou dias (células nuas' a várias semanas (células incrustadas'. Fios de alginato proporcionam um meio simples e rápido para gerar células incrustadas.

Os materiais necessários para gerar os fios de alginato são conhecidos na especialidade. Num procedimento exemplificativoô 3 % de alginato são preparados em H20 estérilô e esterilizados por filtração. Justo antes da preparação de fios de alginatoô a solução de alginato é filtrada de novo. Uma suspensão de células aproximadamente a 50 % (contendo cerca de 5 x 105 a cerca de 5 x 107 célulasúml' é misturada com a solução de alginato a 3 %. Um ml da suspensão de alginatoúcélula é extrudado numa solução de CaCl2 filtrada estéril a 100 mM sobre um período de tempo de ~15 minô formando um "fio" . 0 fio extrudado é então transferido numa solução de CaCl2 a 50 mMô e então numa solução de CaCl2 a 25 mM. 0 fio é então enxaguado com água desionizada antes de revestir o fio por meio de incubação numa solução a 0Ô01 % de poli-L-lisina. Finalmenteô o fio é enxaguado com Solução de Ringer Lactada e arrastado da solução num tambor de seringa (sem agulha'. Uma agulha de calibre grande é então ligada à seringaô e o fio é injetado por via intraperitoneal num recipiente num volume mínimo da Solução de Ringer Lactada.

Uma abordagem in vivo para ensaiar proteínas da presente invenção envolve sistemas de libertação virais. Os vírus exemplares para este propósito incluem adenovírusô herpesvírusô retrovírusô vaccinia vírus e vírus adeno-associados (VAA'. 0 adenovírusô um vírus de ADN de cadeia duplaô atualmente é o vetor de transferência genica melhor estudado para a administração de um ácido nucleico heterólogo (como revisãoô veja-se T.C. Becker et al.ô Meth. Cell Biol. 43: 161-89Ô 1994; e J.T. Douglas e D.T. Curielô Science &amp; Medicine 4: 44-53Ô 1997'. 0 sistema de adenovirus proporciona várias vantagens: (i' os adenovirus podem acomodar relativamente grandes inserções de ADN; (ii' podem ser cultivados a título elevado; (iii' infetam uma ampla gama de tipos de células de mamíferos; e (iv' podem ser utilizados com um grande número de diferentes promotores incluindoô promotores ubíquosô específicos a tecidoô e reguláveis. Além dissoô devido a que os adenovirus são estáveis na corrente sanguíneaô podem ser administrados por injeção intravenosa.

Usando vetores de adenovirus em que as porções do genoma do adenovirus são suprimidasô inserções estão incorporadas no ADN virai pela ligadura direta ou por recombinação homóloga com um plasmídeo co-transfetado. Num sistema exemplarô o gene EI essencial foi deletado do vetor viralô e o vírus não replicará a não ser que o gene EI seja proporcionado pela célula hospedeira (a linha de células 293 humana é exemplar'. Quando administrado por via intravenosa a animais intatosô o adenovirus tem como alvo principalmente o fígado. Se o sistema de libertação adenoviral possuir uma deleção no gene Elô o vírus não pode se replicar nas células hospedeiras. No entantoô o tecido do hospedeiro (por exemploô fígado' expressará e processará (eô se uma sequência de sinal de secreção estiver presenteô segregará' a proteína heteróloga. As proteínas segregadas entrarão na circulação no fígado altamente vascularizadoô e os efeitos sobre o animal infetado podem ser determinados.

Além dissoô os vetores adenovirais contendo várias deleções de genes virais podem ser usados numa tentativa de reduzir ou eliminar as respostas imunes para o vetor. Tais adenovirus têm EI deletadoô eô além disso contêm deleções de E2A ou E4 (Luskyô M. et al.ô J. Virol. 72:2022-20320 1998; Raperô S.E. et al.ô Human Gene Terapêutica 9:671-6790 1998'. Além dissoô relata-se que a deleção de E2b reduz respostas imunes (Amalfitanoô A. et al.ô J. Virol. 72:926-933Ô 1998' . Além dissoô por meio da deleção de todo o genoma do adenovírusô inserções muito grandes de ADN heterólogo podem ser acomodadas. A geração de adenovirus denominados "sem intestino" em que todos os genes virais são deletados é particularmente vantajosa para a inserção de grandes inserções de ADN heterólogo. Para uma revisãoô veja-se Yehô P. e Perricaudetô M.ô FASEB J. 11:615-6230 1997 . 0 sistema de adenovirus também pode ser utilizado para a produção de proteínas in vitro. Através da cultura de células não-293 infetadas com adenovirus sob condições em que as células não estão em divisão rãpidaô as células podem produzir proteínas durante períodos de tempo prolongados. Por exemploô as células BHK são crescidas até a confluência em fábricas de célulasô em seguidaô expostas ao vetor adenoviral que codifica a proteína segregada de interesse. As células são então crescidas sob condições isentas de soroô o que permite que as células infetadas sobrevivam durante várias semanasô sem divisão celular significativa. Alternativamenteô as células 293 infetadas com vetor de adenovirus podem ser cultivadas como células aderentes ou em cultura em suspensão a uma densidade de células relativamente elevada para produzir quantidades significativas de proteína (Veja-se Garnier et al.ô Cytotechnol. 15:145-550 1994'. Com qualquer protocoloô uma proteína heteróloga segregada expressa pode ser isolada repetidamente a partir do sobrenadante de cultura celularô lisadoô ou frações de membranaô dependendo da disposição da proteína expressa na célula. Dentro do protocolo de produção de células 293 infetadasô proteínas não segregadas também podem ser obtidas de forma eficaz.

Em vista da distribuição em tecidos observada para zcytorl7ô os agonistas (incluindo o ligando naturalúsubstratoúcofatorúetc.' e antagonistas têm um enorme potencial tanto em aplicações in vitro como in vivo. Os compostos identificados como agonistas de zcytorl7 são úteis para estimular o crescimento de células imunes e hematopoiéticas in vitro e in vivo. Por exemploô recetores solúveis zcytorl7ô e compostos agonistas são úteis como componentes de meios de cultura celular definidosô e podem ser utilizados em separado ou em combinação com outras citocinas e hormonas para substituir o soro que é normalmente utilizado na cultura de células. Os agonistas são assim úteis na promoção especificamente do crescimento eúou desenvolvimento de células Tô células Bô e outras células das linhagens linfoides e mieloides em cultura. Além dissoô o recetor solúvel zcytorl7ô agonista ou antagonista pode ser utilizado in vitro num ensaio para medir a estimulação da formação de colónias a partir de culturas de medula óssea primária isoladas. Tais ensaios são bem conhecidos na especialidade.

Os antagonistas são também úteis como reagentes de pesquisa para a caraterização de locais de interação de ligando-recetor. Os inibidores da atividade de zcytorl7 (antagonistas de zcytorl7' incluem os anticorpos anti-zcytorl7 e recetores solúveis zcytor!7ô bem como outros agentes peptídicos e não peptídicos (incluindo ribozimas'.

Zcytorl7 também pode ser utilizado para identificar moduladores (por exemploô antagonistas' da sua atividade. Os compostos de teste são adicionados aos ensaios revelados no presente documento para identificar compostos que inibem a atividade de zcytorl7. Além daqueles ensaios revelados no presente documented as amostras podem ser testadas quanto à inibição da atividade de zcytorl7 dentro de uma variedade de ensaios concebidos para medir a ligação de zcytorl7ô oligomerizaçãoô ou a estimulaçãoúinibição de respostas celulares dependentes de zcytorl7. Por exemploô as linhas de células que expressam zcytorl7 podem ser transfetadas com uma construção de gene repórter que responde a uma via celular estimulada por zcytorl7. As construções de gene repórter deste tipo são conhecidas na especialidadeô e compreendem geralmente um elemento de resposta de zcytorl7-ADN operativamente ligado a um gene que codifica uma proteína detetável de ensaioô tal como luciferase. Os elementos de resposta de ADN podem incluirô mas não se limitam aô elementos de resposta a AMP cíclico (CRE'o elementos de resposta a hormona (HRE' elemento de resposta a insulina (IRE' (Nasrin et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 5273-7Ô 1990' e elementos de resposta a soro (SRE' (Shaw et al. Célula 56: 563-72Ô 1989'. Os elementos de resposta a AMP cíclico s® o revistos em Roestleret al.ô J. Biol. Chem. 263 (19':9063-6; 1988 e Habenerô Molec. Endocrinol. 4 (8': 1087-94; 1990. Os elementos de resposta a hormona sS o revistos em Beatoô Cell 56:335-44; 189. Os compostos candidatosô soluçõesô misturas ou extratos ou meios condicionados a partir de vários tipos de células são testados quanto à capacidade para aumentar a atividade do recetor zcytorl7 como evidenciado por um aumento em estimulação de zcytorl7 da expressão do gene repórter. Ensaios deste tipo detetarão compostos que estimulam diretamente a atividade de transdução de sinal de zcytorl7 através da ligação ao recetor ou por outro tipo de parte estimulante da cascata de sinal. Como talô é proporcionado um método de identificação de agonistas de polipéptido de zcytorl7ô que compreende proporcionar células que respondem a um polipéptido de zcytorl7ô cultivar uma primeira porção das células na ausência de um composto testeô cultivar uma segunda porção das células na presença de um composto de testeô e detetar um aumento numa resposta celular da segunda porção das células em comparação com a primeira porção das células. Além dissoô uma terceira célulaô contendo a construção de gene repórter descrito acimaô mas que não expressa recetor zcytorl7ô pode ser utilizada como uma célula de controlo para avaliar a estimulação não-específicaô ou não mediada por zcytorl? do repórter. Os agonistasô incluindo o ligando naturalô sãoô portantoô úteis para estimular ou aumentar a função de polipéptido de zcytorl?.

Um polipéptido de ligação a ligando de zcytorl?ô tal como o domínio extracelular ou domínio de ligação a citocina revelado no presente documentoô pode também ser usado para a purificação de ligando. 0 polipéptido é imobilizado num suporte sólidoô tal como pérolas de agaroseô agarose reticuladaô vidroô resinas celulósicasô resinas baseadas em sílicaô poliestirenoô poliacrilamida reticulada ou materiais semelhantes que são estáveis nas condições de utilização. Ma técnica conhecem-se métodos para ligar polipéptidos a suportes sólidos e incluem química de aminaô ativação com brometo de cianogénioô ativação com N-hidroxisuccinimidaô ativação com epõxidoô ativação com sulfidriloô e ativação com hidrazina. 0 meio resultante será configurado geralmente em forma de uma colunaô e os fluidos que contêm ligandos passam através da coluna uma ou mais vezes para permitir que o ligando se ligue ao polipéptido recetor. 0 ligando é eluído depois utilizando mudanças na concentração de salô agentes caotrópicos (HC1 de guanidina' ou o pH para romper a ligação ligando-recetor.

Vantajosamente pode utilizar-se um sistema de ensaio que utiliza um recetor de ligação a ligando (ou um anticorpoô um membro de um par complementoúanticomplemento' ou um fragmento de ligação do mesmoô e um instrumento biossensor disponível comercialmente (por exemploô BIAcore™ô Pharmacia Biosensorô Piscatawayô NJ; ou SELDI™ technologyô Ciphergenô Inc.ô Paio Altoô CA'. Tal recetorô anticorpoô membro de par complementoúanticomplemento ou fragmento é imobilizado na superfície de um chip recetor. É revelada a utilização deste instrumento por Karlssonô J. Imunol. Methods 145:229-2400 1991 e Cunningham e Wellsô J. Mol. Biol. 234:554-630 1993. Um recetorô anticorpoô membro ou fragmento liga-se covalentementeô utilizando química de amina ou sulfidriloô a fibras de dextrano que estão ligadas a um filme de ouro dentro da célula de fluxo. Passa-se uma amostra de ensaio através da célula. Se na amostra estiver presente um ligandoô um epítopo ou membro oposto do par complementoúanticomplementoô será ligado ao recetorô anticorpo ou membro imobilizadoô respetivamenteô provocando uma mudança no índice de refração do meioô que se deteta como uma mudança na ressonância de plasmão superficial do filme de ouro. Este sistema permite a determinação de velocidades de associação e dissociaçãoô a partir das quais pode ser calculada a afinidade de ligaçãoô e a avaliação da estequiometria de ligação.

Os polipéptidos de recetor de ligação a ligando podem também ser usados dentro de outros sistemas de ensaio conhecidos na especialidade. Tais sistemas incluem análise de Scatchard para a determinação de afinidade de ligação (veja-se Scatchardô Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-6720 1949' e ensaios calorimétricos (Cunningham et al.ô Science 253:545-48ô 1991; Cunningham et al.ô Science 245:821-250 1991'.

Os polipéptidos de zcytorl7 podem também ser usados para preparar anticorpos que se ligam a epítoposô péptidos ou polipéptidos de zcytorl7. 0 polipéptido de zcytorl7 ou um fragmento do mesmo serve como um antigénio (imunogénio' para inocular um animal e provocar uma resposta imune. Um perito na especialidade reconheceria que polipéptidos antigénicosô que portam epítopo contêm uma sequência de pelo menos 6ô preferentemente pelo menos 9ô e mais preferentemente pelo menos 15 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos contíguos de um polipéptido de zcytorl7 (por exemploô SEQ ID NO:54ô SEQ ID NO:57ô e semelhantes'. Os polipéptidos que compreendem uma porção maior de um polipéptido de zcytorl7ô isto éô de 30 a 100 resíduos até o comprimento total da sequência de aminoácidos são incluídos. Antigénios ou epítopos imunogénicos podem também incluir etiquetas unidasô adjuvantes e portadoresô como descrito no presente documento. Antigénios adequados incluem o polipéptido de zcytorl7 codificado por SEQ ID NO: 2 a partir do aminoãcido número 2 0 (Ala' ao aminoãcido número 732 (Val'ô ou um fragmento de aminoãcido contíguo 9 a 713Ô ou 30 ou 50 a 713 do mesmo; e SEQ ID NO:46 a partir do aminoãcido número 20 (Ala' ao aminoãcido número 649 (Ile'ô ou um fragmento de aminoãcido contíguo 9 a 630Ô ou 30 ou 50 a 630 do mesmo; e SEQ ID NO: 54 a partir do aminoãcido número 33 (Ala' ao aminoãcido número 662 (Ile'ô ou um fragmento de aminoãcido contíguo 9 a 630Ô ou 30 ou 50 a 630 do mesmo. Péptidos preferidos para utilização como antigénios são o domínio extracelularô domínio de ligação a citocinaô domínio de fibronectina do tipo IIIô domínio de sinalização intracelularô locais Caixa I e Caixa II ou outros domínios e motivos revelados no presente documentoô ou uma combinação dos mesmos; e péptidos hidrofílicos de zcytorl7 tais como aqueles preditos por um perito na especialidade de um gráfico de hidrofobicidadeô determinadoô por exemploô a partir de um perfil de hidrofilicidade de HoppÚWoods com base numa janela de seis resíduos deslizantesô com resíduos Gô Sô e T enterrados e resíduos Hô Yô e W expostos ignorados. Péptidos hidrofílicos de zcytorl7 incluem péptidos que compreendem sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: (1' resíduos de aminoácidos 43 até 48 da SEQ ID N0:2 e SEQ ID NQ:46 (resíduos 56 até 61 da SEQ ID NO: 54' ; (2' resíduos de aminoãcidos 157 até 162 da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46 (resíduos 170 até 175 de SEQ ID NO:54'; (3' resíduos de aminoácidos 158 até 163 de SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO:4 6 (171 até 176 de SEQ ID NO:54'; (4' resíduos de aminoácidos 221 até 226 de SEQ ID NO :2 e SEQ ID NO :46 (234 até 239 de SEQ ID NO:54'; e (5' resíduos de aminoãcidos 426 até 431 de SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:46 (resíduos 439 até 444 da SEQ ID NO:54'. Além dissoô epítopos hidrofílicos preditos de um gráfico de Jameson-Wolfô por exemploô usando o programa DNASTAR Protean (DNASTARô Inc.ô Madisonô WI' ô são também antigénios adequados. Além dissoô motivos conservadosô e regiões variáveis entre motivos conservados de zcytorl7 são antigénios adequados. Os anticorpos gerados a partir desta resposta imune podem ser isolados e purificados como descrito no presente documento. Métodos para preparar e isolar anticorpos policlonais e monoclonais são bem conhecidos na especialidade. Veja-seô por exemploô Current Protocols in Imunologyô Cooliganô et al. (eds.'ô National Institutes of Healthô John Wiley e Sonsô Inc.ô 1995; Sambrook et al.ô Molecular Cloning: A Laboratory Manualô Segunda Ediçãoô Cold Spring Harborô NYô 1989; e Hurrellô J. G. R.ô Ed.ô Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applicationsô CRC Pressô Inc.ô Boca Ratonô FLô 1982.

Como será evidente para um perito na especialidadeô podem gerar-se anticorpos policlonais por inoculação de uma variedade de animais de sangue quente tais como cavalosô vacasô cabrasô ovelhasô cãesô galinhasô coelhosô ratinhos e ratos com um polipéptido zcytorl7 ou um fragmento do mesmo. A imunogenicidade de um recetor de citocina multimérico pode ser aumentada por meio da utilização de um adjuvanteô tal como alúmen (hidróxido de alumínio' ou adjuvante completo ou incompleto de Freund. Recetores de citocina multiméricos úteis for imunização também incluem polipéptidos de fusãoô tal como fusões de zcytorl7ô OSMRbetaô eúou WSX-lô ou uma porção dos mesmos com um polipéptido de imunoglobulina ou com proteína de ligação a maltose. 0 imunogénio polipeptídico pode ser uma molécula de comprimento completo ou uma parte da mesma. Se a parte de polipéptido for de "tipo hapteno"ô dita parte pode ligar-se vantajosamente ou associar-se a um suporte macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH'ô albumina de soro bovino (BSA' ou toxoide tetânico' para imunização.

Como é utilizado no presente documentoô o termo "anticorpos" inclui anticorpos policlonaisô anticorpos policlonais purificados por afinidadeô anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação a antigénioô tais como fragmentos proteolíticos F(ab''2 e Fab. Também se incluem anticorpos intatos modificados por engenharia genética ou fragmentosô tais como anticorpos quiméricosô fragmentos Fvô anticorpos de cadeia simples e semelhantesô assim como péptidos e polipéptidos de ligação a antigénio sintéticos. Os anticorpos não humanos podem ser humanizados por enxerto de CDR não humanas em regiões framework e constantes humanasô ou por incorporação dos domínios variáveis não humanos inteiros (opcionalmente "cobrindo" os mesmos com uma superfície de tipo humano por substituição de resíduos expostosô sendo o resultado um anticorpo "revestido"'. Em alguns casosô os anticorpos humanizados podem conservar resíduos não humanos dentro dos domínios framework da região variável humana para aumentar as caraterísticas de ligação apropriadas. Por meio da humanização de anticorposô pode ser aumentada a semivida biológica e o potencial de reações imunes adversas após a administração a seres humanos é reduzido. Além dissoô podem ser produzidos anticorpos humanos em animais transgénicos não humanos que foram modificados por engenharia genética para conter genes de imunoglobulina humana como é revelado na publicação WIPO N° WO 98Ú24893. Prefere-se que os genes de imunoglobulina endógenos nestes animais sejam inativados ou eliminadosô tal como por recombinaçâo homóloga.

As técnicas alternativas para gerar ou selecionar anticorpos úteis nesta invenção incluemô exposição in vitro de linfócitos a proteína ou péptido de zcytorl7ô e a seleção de bibliotecas de apresentação de anticorpos em fagos ou vetores semelhantes (por exemploô através da utilização de proteína ou péptido de zcytorl7 imobilizado ou marcado'. Os genes que codificam polipéptidos com domínios de ligação potenciais de polipéptido de zcytorl7 podem ser obtidos por rastreio de bibliotecas de péptidos aleatórios apresentados em fagos (apresentação em fagos' ou em bactériasô tais como E. coli. As sequências de nucleótidos que codificam os polipéptidos podem ser obtidas a partir de um certo número de maneirasô tais como através de mutagénese aleatória e síntese de polinucleótidos aleatórios. Estas bibliotecas de apresentação em péptidos aleatórios podem ser utilizadas para pesquisar péptidos que interagem com um alvo conhecido que pode ser uma proteína ou polipéptidoô tal como um ligando ou recetorô uma macromolécula biológica ou sintéticaô ou substâncias orgânicas ou inorgânicas. As técnicas para criar e pesquisar estas bibliotecas de apresentação em péptidos aleatórios são conhecidas na especialidade (Ladner et al.ô Patente US N° 5.223.409; Ladner et al.ô Patente US N° 4.946.778; Ladner et al.ô Patente US N° 5.403,484 e Ladner et al.ô Patente US N° 5.571.698' e bibliotecas de apresentação em péptidos aleatórios e kits para rastrear estas bibliotecas estão disponíveis comercialmenteô por exemplo da Clontech (Paio Altoô CA'ô Invitrogen Inc. (San Diegoô CA' ô New England Biolabsô Inc. (Beverlyô MA' e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscatawayô NJ'. Bibliotecas de apresentação em péptidos aleatórios podem ser rastreadas utilizando as sequências de zcytorl7 reveladas no presente documento para identificar proteínas que se ligam a zcytorl7. Estes ãpéptidos de ligaç0 ã que interagem com polipéptidos de zcytorl7 podem ser utilizados para as células que expressam o recetor de marcaçH o para isolar polipéptidos homólogos através de purificação por afinidade; eles podem ser direta ou indiretamente conjugados a fármacosô toxinasô radionuclídeos e semelhantes. Estes péptidos de ligaçS o podem também ser utilizados em métodos analíticosô tais como para o rastreio de bibliotecas de express^ o e neutralizar a atividde. Os péptidos de ligaçKI o também podem ser utilizados paa ensaios de diagnóstico para a determinaçS o dos nívès circulantes de polipéptidos de zcytorl7; para detetar ou quantificar os polipéptidos de zcytorl7 solúvel como marcador de uma condiçKI o patológica ou doença subjaente. Estes péptidos de ligaçS o também podem atuar como ãantagonistas de zcytorl7ã para bloquear a ligaçlKI o de zcytorl7 e transduçS o de sinal in vitro e in vivo. Estes péptidos de ligaçEI o a anti-zcytorl7 seriam úteis paa inibir a açS o de um ligando que se liga com zcytorl.

Os anticorpos s0 o considerados de ligaçH o especíóà se: 1' apresentam um nível limite de atividade de ligaçlEI o e 2' nS o apresentam reaçlKI o cruzada significativa com moléculas polipeptídicas relacionadas. Determina-se um nível limite de ligaçS o se os anticorpos anti-zcyt®17 do presente documento se ligarem a um polipéptidoô péptido ou epítopo de zcytorl7 com uma afinidade de pelo menos 10 vezes maior que a afinidade de ligaçS o ao polipéptdo de controlo (nSS o-zcytorl7'. Prefere-se que os anticorps apresentem uma afinidade de ligaçS o (£' de 105 MT1 ou maiorô preferentemente 107 M"1 ou maiorô mais preferentemente 108 M”~ ou maior e ainda mais preferentemente 109 M"1 ou maior. A afinidade de ligaçS o de um anticorpo pode ser determinada facilmente por um perito na especialidadeô por exemploô por análise de Scatchard (Scatchardô G.ô Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672Ô 1949'.

Se os anticorpos anti -zcytorl? não apresentam reação cruzada significativa com moléculas polipeptídicas relacionadas é mostradoô por exemploô pelo anticorpo que deteta o polipéptido de zcyt.orl7ô mas não polipéptidos relacionados conhecidos utilizando uma análise de transferência de Western (Ausubel et al.ô ibid.B . São exemplos de polipéptidos relacionados conhecidos os revelados na técnica anteriorô tais como ortólogos conhecidosô e parãlogosô e membros conhecidos semelhantes de uma família de proteínas (por exemploô recetores gpl30ô LIFô WSX-1 e IL12'. 0 rastreio também pode ser realizado utilizando zcytorl7 não humano e polipéptidos mutantes zcytorl7. Além dissoô podem "ser rastreados anticorpos contra" polipéptidos relacionados conhecidosô para isolar uma população que se liga especificamente aos polipéptidos zcytorl7. Por exemploô absorvem-se anticorpos induzidos contra zcytorl7 em polipéptidos relacionados aderidos a uma matriz insolúvel; os anticorpos específicos para zcytorl7 fluirão através da matriz nas condições tamponantes apropriadas. 0 rastreio permite o isolamento de anticorpos policlonais e monoclonais que não apresentam reação cruzada com polipéptidos muito relacionados conhecidos (Antibodies: A Laboratory Manualô Harlow e Lane (eds.'o Cold Spring Harbor Laboratory Pressô 1988; Current Protocols in Immunologyô Cooliganô et al. (eds.'o National Institutes of Healthô John Wiley e Sonsô Inc.ô 1995'. 0 rastreio e isolamento de anticorpos específicos são bem conhecidos na técnica. Veja-seô Fundamental Immunologyô Paul (eds.'o Raven Pressô 1993; Getzoff et al.ô Adv. in Immunol. 43: 1-98ô 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practiceô Godingô J.W. (eds.'o Academic Press Ltd.ô 1996; Benjamin et al.ô Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101Ô 1984. Especificamenteô pode detetar-se a ligação de anticorpos anti-zyctorl7 por vários métodos da técnicaô e revela-se a seguir.

Pode utilizar-se uma variedade de ensaios conhecidos pelos peritos na especialidade para detetar anticorpos que se ligam especificamente a proteínas ou péptidos de zcytorl?. Descrevem-se ensaios exemplares em detalhe em Antibodies: A Laboratory Manualô Harlow e Lane (Eds.'o Cold Spring Harbor Laboratory Pressô 1988. Os exemplos representativos de ditos ensaios incluem: imunoeletroforese concorrenteô radioimunoensaioô radioimunoprecipitaçãoô ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA'ô ensaio de transferência pontual (dot blot' ou transferência de Westernô inibição ou ensaio competitivo e ensaio de tipo sanduíche. Além dissoô os anticorpos podem ser rastreados com respeito à ligação à proteína ou polipéptido de zcytorl7 mutante versus o de tipo selvagem.

Os anticorpos contra zcytorl7 podem utilizar-se para marcar células que expressam zcytorl7ô tal como células que expressam naturalmente zcytorl7 tal como monócito e células da próstataô bem como células que são transformadas com zcytorl7; para isolar zcytorl7 por purificação de afinidade; para ensaios de diagnóstico para determinar os níveis circulantes de polipéptidos de zcytorl7; para detetar ou quantificar zcytorl7 solúvel como um marcador da patologia ou doença subjacente; em métodos analíticos que utilizam FACS; para rastrear bibliotecas de expressão; para gerar anticorpos anti - idiot.ípicos; e como anticorpos neutralizadores ou como antagonistas para bloquear a atividade de zcytorl7 in vitro e in vivo. Os marcadores ou sinais diretos adequados incluem radionuclídeosô enzimasô substratosô cofatoresô inibidoresô marcadores fluorescentesô marcadores quimioluminescentesô partículas magnéticas e semelhantes; os marcadores ou sinais indiretos podem apresentar a utilização de biotina-avidina ou outros pares complementoúanticomplemento como intermediários. Os anticorpos do presente documento também podem ser conjugados diretamente ou indiretamente com fármacosô toxinasô radionuclídeos e semelhantesô e estes conjugados podem utilizar-se para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas in vivo. Além dissoô podem utilizar-se anticorpos contra zcytorl? ou fragmentos do mesmo in vitro para detetar zcytorl? desnaturado ou fragmentos do mesmo em ensaiosô por exemploô ensaios de Western ou outros ensaios conhecidos na especialidade.

Os anticorpos para zcytorl? são úteis para etiquetar as células que expressam o recetor e ensaiar os níveis de expressão de Zcytorl7ô para a purificação por afinidadeô dentro de ensaios de diagnóstico para a determinação dos níveis circulantes de polipéptidos de recetor solúvelô métodos analíticos empregando triagem de células ativadas por fluorescência. Anticorpos divalentes podem ser utilizados como agonistas para mimetizar o efeito de um ligando de zcytorl?.

Os anticorpos da invenção também podem ser direta ou indiretamente conjugados a fármacosô toxinasô radionuclídeos e semelhantes e estes conjugados utilizados para aplicações de diagnóstico in vivo ou terapêuticas. Por exemploô os anticorpos da presente invençãoô tal como é referido nas reivindicaçõesô podem ser utilizados para identificar ou tratar tecidos ou órgãos que expressam uma molécula anti-complementar correspondente (isto éô um recetor zcytorl?). Mais especificamenteô os anticorpos anti-zcytorl?ô ou fragmentos bioativos ou porções dos mesmosô podem ser acoplados a moléculas detetáveis ou citotóxicas e administrados a um mamífero com célulasô tecidos ou órgãos que expressam a molécula de zcytorl?.

As moléculas detetáveis adequadas podem ser direta ou indiretamente unidas a polipéptidos que se ligam a zcytorl7 ("polipéptidos de ligaçãoô" incluindo péptidos de ligação revelados acima)ô anticorposô ou fragmentos bioativos ou porções dos mesmos. As moléculas detetáveis adequadas incluem radionuclídeosô enzimasô substratosô cofatoresô inibidoresô marcadores fluorescentesô marcadores quimiluminescentesô partículas magnéticas e semelhantes. As moléculas citotõxicas adequadas podem ligar-se diretamente ou indiretamente ao polipéptido ou anticorpoô e incluem toxinas bacterianas ou vegetais (por exemploô toxina diftéricaô exotoxina de Pseudomonasô ricinaô abrina e semelhantes'ô assim como radionuclídeos terapêuticosô tais como iodo-131ô rénio-188 ou ítrio-90 (ligados diretamente ao polipéptido ou anticorpoô ou ligados indiretamente por meio de um resíduo quelanteô por exemplo'. Os polipéptidos de ligação ou anticorpos também podem ser conjugados com fãrmacos citotóxicos tais como adriamicina. Para a ligação indireta de uma molécula detetável ou citotóxicaô a molécula detetável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de uma parte complementarúanticomplementarô estando o outro membro ligado à parte de polipéptido ou anticorpo. Para estes propósitosô um par complementarúanticomplementar exemplar é biotinaúestreptavidina.

As proteínas de fusão de polipéptido de ligação-toxina ou proteínas de fusão de anticorpo-toxina podem ser usadas para uma inibição ou ablação celular ou tissular dirigida (por exemploô para tratar células ou tecidos cancerosos'. Como alternativaô se o polipéptido tem múltiplos domínios funcionais (isto éô um domínio de ativação ou um domínio de ligação ao ligandoô mais um domínio de direção'ô pode ser adequada uma proteína de fusão que inclua somente o domínio de direção para dirigir uma molécula detetávelô uma molécula citotóxica ou uma molécula complementar a um tipo celular ou tissular de interesse. Nos casos em que a proteína de fusão incluindo somente um único domínio inclui uma molécula complementarô a molécula anticomplementar pode ser conjugada com uma molécula detetável ou citotóxica. Ditas proteínas de fusão de domínio-molécula complementar desta forma representam um veículo de direção genérico para libertação específica de célulaútecido de conjugados genéricos de molécula citotóxicaúanti-complementar- detetável.

As proteínas de fusão de anticorpo-citocina ou polipéptido de ligação de zcytorl7-citocina podem ser usadas para aumentar a destruição in vivo de tecidos alvo (por exemploô cancros de sangueô linfoidesô de cólonô e de medula óssea'ô se o polipéptido de ligação- citocina ou anticorpo anti-zcytorl7 tiver como alvo a célula hiperproliferativa (Veja-seô geralmenteô Hornick et al.ô Sangue 89: 4437-47Ô 1997'. As proteínas de fusão descritas permitem dirigir uma citocina a um local de ação desejadoô proporcionando desta maneira uma concentração local elevada de citocina. Os anticorpos anti-zcytorligl7 adequados têm como alvo uma célula ou tecido indesejável (isto éô um tumor ou uma leucemia' e a citocina fusionada medeia a lise da célula alvo melhorada pelas células efetoras. As citocinas adequadas para este propósito incluemô por exemploô interleucina 2 e fator estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF'.

Alternativamenteô o polipéptido de ligação de zcytorl7 ou proteínas de fusão de anticorpo descrito no presente documento pode ser usado para aumentar a destruição in vivo de tecidos alvo por meio da estimulação direta de uma via apoptótica modulada por zcytorl7ô resultando em morte celular de células hiperproliferativas que expressam zcytorl7. 0 polipéptido de ligação bioativo ou conjugados de anticorpo descrito no presente documento pode ser administrado por via oralô por via intravenosaô intraarterial ou intradutalmenteô ou pode ser introduzido localmente no local de ação pretendido.

As citocinas de feixe de quatro hélices que se ligam a recetores de citocinaô bem como outras proteínas produzidas por linfócitos ativados desempenham um papel biológico importante na diferenciação celularô ativaçãoô o recrutamento e a hemóstase de células de todo o corpo. A utilidade terapêutica inclui o tratamento de doenças que requerem regulação imuneô incluindo doenças autoimunesô tais comoô artrite reumatoideô esclerose múltiplaô miastenia graveô eritromatose de lúpus sistémico e diabetes. Antagonistas ou agonistas de recetor zcytorl7ô incluindo recetores solúveisô anticorpos anti-recetorô e o ligando naturalô podem ser importantes na regulação da inflamaçãoô eô portantoô seriam úteis no tratamento de artrite reumatoideô asmaô colite ulcerosaô doença inflamatória do intestinoô doença de Crohn e sepse. Pode haver um papel de antagonistas ou agonistas de zcytor!7ô incluindo os recetores solúveisô anticorpos anti-recetor e o ligando naturalô na mediação tumorigéneseô eô portantoô seriam úteis no tratamento de cancro. Antagonistas ou agonistas de zcytorl7ô incluindo os recetores solúveisô anticorpos anti-recetor e o ligando naturalô podem ser um agente terapêutico potencial para suprimir o sistema imune o que seria importante para reduzir a rejeição do enxerto ou na prevenção de doença do enxerto versus hospedeiro.

Em alternativaô antagonistas ou agonistas de zcytorl7ô incluindo os recetores solúveisô anticorpos de recetor anti- zcytorl7 e o ligando natural podem ativar o sistema imuneô o que seria importante para aumentar a imunidade a doenças infeciosasô tratar pacientes imunocomprometidosô como pacientes VIH°ô ou na melhoria das vacinas. Em particularô os antagonistas ou agonistas de zcytor!7ô incluindo os recetores solúveis e o ligando natural podem modularô estimular ou expandir as células NKô ou respetivos progenitoresô e proporcionariam valor terapêutico no tratamento de uma infeção viralô e como um fator antineoplãsico. Pensa-se que as células NK desempenham um papel principal na eliminação de células tumorais metastáticas e pacientes com ambas as metástases e tumores sólidos têm níveis diminuídos de atividade das células NK (Whiteside et al.ô Curr. Top. Microbiol. Imunol. 230:221-24401998'.

Os polinucleótidos que codificam polipéptidos de zcytorl? são úteis dentro de aplicações de terapêutica genica nas quais se deseja aumentar ou inibir a atividade de zcytorl?. Se um mamífero tiver um gene de zcytorl7 mutado ou ausenteô o gene de zcytorl? pode ser introduzido nas células do mamífero. Numa forma de realizaçãoô introduz-se um gene que codifica um polipéptido de zcytorl7 in vivo num vetor virai. Ditos vetores incluem um vírus de ADN atenuado ou defeituoso tal comoô mas sem limitaçãoô o vírus do herpes simples (VHS'ô papilomavírusô vírus de Epstein Barr (VEB'ô adenovírusô vírus adeno-associado (VAA' e semelhantes. Preferem-se vírus defeituososô que carecem totalmente ou quase totalmente de genes virais. Um vírus defeituoso não é infecioso depois de ser introduzido numa célula. A utilização de vetores virais defeituosos permite a administração às células numa área localizada específicaô sem preocupação de que o vetor possa infetar outras células. Os exemplos de vetores particulares incluemô mas sem limitaçãoô vetor de vírus do herpes simples 1 defeituoso (VHS1' (Kaplitt et al.ô Molec. Cell. Neurosci. 2:320-300 1991'; um vetor adenoviral atenuadoô tal como o vetor descrito por Stratford-Perricaudet et al.ô J. Clin. Invest. 90:626-300 1992; e um vetor de vírus adeno-associado defeituoso (Samulski et al.ô J. Virol. 61:3096-101Ô1987; Samulski et al.ô J. Virol. 63:3822-80 1989'.

Um gene de zcytorl7 pode ser introduzido num vetor retroviralô por exemploô como é descrito em Anderson et al.ô Patente US N° 5.399.346; Mann et al. Cell 33:1530 1983; Temin et al.ô Patente US N° 4.650.764; Temin et al.ô Patente US N° 30 4.980.289; Markowitz et al.ô J. Virol. 62:11200 1988; Ternin et al.ô Patente US N° 5.124.263; Publicação de Patente Internacional N° WO 95/07358Ô publicada 16 de Março de 1995 por Dougherty et al. ; e Kuo et al.ô Blood 82:845o 1993. Como alternativaô o vetor pode ser introduzido por lipofeção in vivo utilizando lipossomas. Podem utilizar-se lípidos catiónicos sintéticos para preparar lipossomasô para a transfeção in vivo de um gene que codifica um marcador (Feigner et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-70 1987; Mackey et al.ô Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8027-310 1988'. A utilização de lipofeção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo tem certas vantagens práticas. 0 direcionamento molecular de lipossomas a células específicas representa uma área de efeitos benéficos. Mais particularmenteô o direcionamento da transfeção a células particulares representa uma área de efeitos benéficos. Por exemploô o direcionamento da transfeção a tipos celulares particulares seria particularmente vantajoso num tecido com heterogeneidade celularô tal como o pâncreasô fígadoô rim e cérebro. Os lípidos podem acoplar-se quimicamente a outras moléculas para o direcionamento. Os péptidos dirigidos (por exemplo hormonas ou neurotransmissores'ô proteínas tais como anticorpos ou moléculas não peptídicas podem ser acopladas a lipossomas quimicamente. É possível retirar as células alvo do corpo para introduzir o vetor como um plasmídeo de ADN nu; e depois reimplantar as células transformadas no corpo. Os vetores de ADN nu para terapêutica génica podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por métodos conhecidos na técnicaô por exemploô transfeçãoô eletroporaçãoô microinjeçãoô transduçãoô fusão celularô DEAE dextranoô precipitação com fosfato cálcicoô utilização de um bombardeamento de partículas ou utilização de um transportador de vetores de ADN. Veja-seô por exemploô Wu et al.ô J. Biol. Chemô 267:963-70 1992; Wu et al.ô J. Biol. Chem. 263:14621-40 1988.

Pode utilizar-se a metodologia antissense para inibir a transcrição do gene de zcytorl7ô tal como para inibir a proliferação celular in vivo. Desenham-se polinucleótidos que são complementares a um segmento de um polinucleótido que codifica zcytorl? (por exemploô um polinucleótido como é exposto na SEQ ID NO: 1Ô SEQ ID NO: 45Ô SEQ ID NO: 53Ô OU SEQ ID NO:57' para ligar-se ao ARNm que codifica zcytorl? e inibir a tradução de dito ARNm. Tais polinucleótidos antissense são utilizados para inibir a expressão de genes que codificam o polipéptido de zcytorl7 numa cultura celular ou num indivíduo.

Além dissoô como uma molécula da superfície celularô polipéptidos de zcytorl? podem ser utilizados como um alvo para introduzir a terapêutica genética para uma célula. Esta aplicação seria particularmente apropriada para a introdução de genes terapêuticos em células nas quais zcytorl? é normalmente expressoô tal como tecido linfoideô medula õsseaô próstataô tiroideô monócitos e PBL ou células cancerosas que expressam polipéptido de zcytorl?. Por exemploô a terapêutica de gene viralô tal como descrito acimaô pode ser direcionada para tipos específicos de células em que expressam um recetor celularô tal como polipéptido de zcytorl7ô em vez do recetor virai. Os anticorpos ou outras moléculas que reconhecem moléculas de zcytorl7 na superfície da célula alvo podem ser utilizados para dirigir o vírus para infetar e administrar material terapêutico do gene para a célula alvo. Veja-seô Wooô S.L.Cô Nature Biotech. 14:15380 1996; Wickhamô T.J. et alo Nature Biotech. 14:1570-15730 1996; Douglasô J.T et al.ô Nature Biotech. 14:1574-15780 1996; Rihovaô B.ô Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-1690 1997; e Vileô R.G. et al.ô Mol. Med. Today 4:84-920 1998. Por exemploô um anticorpo bi-específico que contém um fragmento Fab neutralizante de vírus acoplado a um anticorpo específico para o zcytorl? pode ser utilizado para dirigir o vírus a células que expressam o recetor zcytorl7 e permitir a entrada eficiente do vírus contendo um elemento genético nas células. Veja- seô por exemploô Wickhamô T.J.ô et al.ô J. Virol. 71:7663-7669Ô 1997; e Wickhamô T.J.ô et al.ô J. Virol. 70:6831-6838Ô 1996.

Além dissoô os anticorpos anti-zcytorl7 e fragmentos de ligação podem ser usados para a marcação e triagem de células que expressam especificamente Zcytorl7ô tais como células mononuclearesô células linfoidesô por exemploô células de monócitos não ativados e ativadosô tais como ativados CD3°ô CD4 0 e células CD8°ô células B CD19°ô e outras célulasô descritos no presente documento. Tais métodos de marcação de células e de triagem são bem conhecidos na especialidade (veja-seô por exemploô "Molecular Biology of the Cell"ô 3a Ed.ô Alberto B. et al. (Garland Publishingô London # Nova Iorqueô 1994'. Um perito na especialidade reconheceria a importância de separar os tipos de tecido celular para estudar as célulasô e a utilização de anticorpos para separar tipos de tecidos celulares específicos. Basicamenteô os anticorpos que se ligam à superfície de um tipo de célula são acoplados a várias matrizesô tais como o colagénioô pérolas de polissacáridosô ou de plãsticoô para formar uma superfície de afinidade à qual apenas as células reconhecidas pelos anticorpos aderirão. As células ligadas são então recuperadas por meio de técnicas convencionais. Outros métodos envolvem a separação de células por um separador de células ativado por fluorescência (FACS'. Nesta técnica etiqueta-se as células com os anticorpos que estão ligados a um corante fluorescente. As células marcadas são então separadas das células não marcadas numa máquina de FACS. Na separação por FACS de células individuais que viajam em passagem de fila única através de um feixe de laser e a fluorescência de cada célula é medida. Um pouco mais a jusanteô gotículas finasô mais contendo uma ou nenhuma célulaô são formadas por um bocal de vibração. As gotículas que contêm uma única célula dão automaticamente uma carga positiva ou negativa no momento da formaçãoô dependendo de se as células que contêm forem fluorescentesô eô em seguidaô defletidas por um forte campo elétrico dentro de um recipiente adequado. Tais máquinas podem selecionar uma célula em 1000 e classificar cerca de 5000 células por segundo. Isto produz uma população uniforme de células para cultura de células.

Um perito na especialidade reconheceria que os anticorpos para os polipéptidos Zcytor!7 da presente invençãoô tal como exposto nas reivindicaçõesô são úteisô porque nem todos os tipos de tecidos expressam o recetor Zcytorl7 e porque é importante que os biólogos sejam capazes de separar tipos de células específicas para estudos adicionais eúou reimplante terapêutico no corpo. Isto é particularmente relevante em célulasô tais como células do sistema imuneô em que zcytorl7 é expresso.

Os polinucleótidos da presente invenção podem encontrar utilização em aplicações de diagnóstico. Por exemploô o gene de zcytor!7ô tal como descrito no presente documentoô uma sonda de ADN que compreende zcytorl7 ou ARN ou uma subsequência do mesmo pode ser usado para determinar se o gene de zcytorl7 está presente no cromossoma 5 ou se uma mutação ocorreu. Zcytorl7 está localizado na região 5qll do cromossoma 5 (veja-se Exemplo 4'. Aberrações cromossómicas detetáveis no locus do gene de zcytorl7 incluemô mas não se limitam aô aneuploidiaô alterações de número de cópia de geneô perda de heterogeneidade (L0H'ô translocaçõesô deleçõesô inserçõesô modificações e rearranjos de locais de restrição. Tais aberrações podem ser detetadas usando os polinucleótidos da presente invençãoô tal como é referido nas reivindicaçõesô através da utilização de técnicas de genética molecularô tais como análise de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP'o métodos de hibridação de fluorescência in situô análise de repetições curtas em tandem (STR'ô que utilizam técnicas de PCR e outras técnicas de ligação genética conhecidas na especialidade (Sambrook et al.ô ibid.; Ausubel et al.. ibid.; Marian. Chest 108:255-650 1995' . O conhecimento preciso de uma posição de gene pode ser útil para uma série de finsô incluindo: 1' determinar se uma sequência é parte de um contig existente e obter sequências genéticas circundantes adicionais em várias formasô tais como YACsô BACs ou clones de ADNc; 2' proporcionar um possível gene candidato para uma doença hereditária que mostra a ligação da mesma região cromossómica; e 3' os organismos de modelo de referência cruzadaô tais como ratinhoô que podem ajudar a determinar qual a função que um gene particular poderia ter. 0 gene de zcytorl7 está localizado na região 5qll do cromossoma 5. Vários genes de função conhecida mapeiam para esta região. Por exemploô um recetor de citocina de classe I intimamente relacionadoô gpl30ô mapeia também o cromossoma 5qll sugerindo que a região 5qll é uma região importante para a expressão do recetor de citocina. Zcytorl? mapeia na região cromossómica 5qll (primeira região distal do centrómero no braço q' e gpl30 parece estar cerca de 92QÔ7 kb distai de Zcytor 17. Além dissoô o recetor de citocina de classe I intimamente relacionado LIFR recetor mapeia apenas do outro lado do centrómero no braço p na região 5pl3-pl2. 0 recetor de citocina gpl3Q é partilhado por vários outros recetores de citocina de modo a formar complexos heterodiméricosô que permitem a sinalização por citocinasô tais como IL-6Ô fator inibidor da leucemia (LIF'ô oncostatina M (0SM'ô e fator ciliar neurotrófico (CNTF'. Além dissoô a gpl3Q pode formar um complexo heterodiméricoô trimérico (por exemploô com gp!30 0 recetor de LIP'ô ou multimérico com o polipéptido de zcytorl7ô a fim de sinalizar. Além dissoô como no presente documento discutidoô recetores de citocinaô tais como zcytorl? e gpl30 desempenham papéis importantes na função celular imuneô proliferaçãoô migraçãoô inflamação e semelhantes. Como talô polinucleõtidosô polipéptidos de zcytorl? e anticorpos anti-zcytorl7 servem uma importante utilização como um diagnóstico para detetar defeitos no gene ou proteína de zcytorl7ô ou defeitos em regiões cromossómicas circundantes na região 5qll do cromossoma 5.

Além dissoô vários genes relacionados com a doença agrupam-se na região 5qll que estão associados a distúrbios humanos. Um perito na especialidade reconhecerá que um marcador em 5qllô tal como os polinucleótidos de zcytorl? da presente invençãoô seria útil na deteção de aberrações cromossómicas relacionadas com a doença humanaô uma vez que as aberrações em e ao redor de 5qll são conhecidas por serem ligadas à doença humana. Por exemploô duplicações de 5qll-ql3.3ô trissomia parcialô e translocaçõesô estão associados a anomalias múltiplasô incluindo esquizofreniaô uma psicose comum. Além dissoô Síndrome de Maroteaux-Lamyô ou mucopolissacaridose tipo VI (5qll-ql3' e síndrome de Klippel-Feil (5qll.2' estão associados a translocação neste locus. Além dissoô estas doenças estão ligadas a grandes rearranjos cromossómicosô tal como a duplicação de cromossomaô translocação ou perda de heterogeneidade no cromossoma 5 região 5qll. Utilizandoô por exemploô os polinucleótidos da presente invenção em conjunto com métodos conhecidos na técnica descrita no presente documentoô tais rearranjos em ou ao redor de 5qll podem ser detetados. Além dissoô entre outros loci genéticosô aqueles para malformação de péúmão partidaô tipo 1 (SHFM1' (5q'ô doença de Sandhoff (5ql3'ô recetor de glucocorticoide (5q31'ô dihidrofolato redutase (DHFR' (5qll.2-ql3.2' atrofia muscular espinal (5ql2.2-ql3.3' e Deficiência de Hormona Pituitária (5q' todos se manifestam em estados de doença humanaô bem como mapeiam para esta região do genoma humano. Veja-se the Online Mendellian Inheritance of Man (OMIM™ô National Center for Biotechnology Informationô mapa génico National Library of Medicine. Betesdaô MD'ô e referências no mesmoô para esta região de cromossoma 5 num publicamente 5 disponível servidor WWW (http:ÚÚwww3.ncbi.nlm.nih,govúhtbinpostú 0mímúgetmap?chromosome*5qll and surrounding loci'. Todos estes servem como possíveis genes candidatos para uma doença hereditária que mostram a ligação para a mesma região cromossõmica do gene como zcytorl?.

Do mesmo modoô os defeitos no locus zcytorl? por si mesmos podem resultar em estados de doença humana hereditãriaô tal como no presente documento discutido. Um perito na especialidade apreciará que os defeitos em recetores de citocina são conhecidos por causar estados de doença em seres humanos. Por exemploô a mutação do recetor da hormona de crescimento resulta em nanismo (Amselemô S et al.ô New Eng. J. Med. 321: 989-995Ô 1989'ô mutação do recetor gama de IL-2 resulta em imunodeficiência combinada grave (SCID' (Noguchiô M et al.ô Cell 73: 147-157Ô 1993'ô mutação c-Mpl resulta em trombocitopenia (Iharaô K et al.ô Proc. Nat. Acad. Sei. 96: 3132-3136Ô1999'ô e infeções micobacterianas grave e por Salmonella resultam em pacientes com deficiência do recetor de interleucina-12 (de Jongô R et al.ô Science 280: 1435-1438Ô 1998'ô entre outros. Assimô de igual modoô defeitos de zcytorl? podem causar um estado de doença ou suscetibilidade a doença ou infeção. Como o gene de zcytorl7 está localizado na região 5qll de zcytorl7ô sondas polinucleotídicas podem ser usadas para detetar perdaô trissomiaô duplicação ou translocação de cromossoma 5qll associadas a doenças humanasô tais como cancros das células imunesô cancros da medula ósseaô cancro da prõstataô da tiroideô paratiroide ou outros tipos de cancroô ou doenças imunes. Além dissoô os polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô tal como exposto nas reivindicaçõesô auxiliariam na deteçãoô prevenção diagnósticoô e tratamento associado com um defeito genético de zcytorl7.

Um diagnóstico poderia ajudar os médicos a determinar o tipo de doença e terapêutica associada apropriadaô ou assistência no aconselhamento genético. Como talo os anticorpos anti-zcytorl7ô polinucleótidos e polipéptidos da invenção podem ser utilizados para a deteção de polipéptido de zcytorl7ô ARNm ou anticorpos anti-zcytorl7ô servindo assim como marcadores e ser utilizados diretamente para a deteção ou doenças genéticas ou cancrosô conforme descrito no presente documentoô utilizando métodos conhecidos na especialidade e descritos no presente documento. Além dissoô as sondas de polinucleótidos de zcytorl7 podem ser usadas para detetar anomalias ou genótipos associados a deleções e translocações do cromossoma 5qll associados a doenças humanasô outras translocações envolvidas com a progressão maligna de tumores ou outras mutações de 5qllô que se prevê que estejam envolvidas em rearranjos dos cromossomas na malignidade; ou em outros tipos de câncerô ou em aborto espontâneo. Da mesma formaô sondas de polinucleótidos de zcytorl7 podem ser usadas para detetar anomalias ou genótipos associados a trissomia de cromossoma 5qll e perda de cromossoma associada a doenças humanas ou aborto espontâneo. Assimô sondas de polinucleótidos de zcytorl7 podem ser usadas para detetar anomalias ou genótipos associados a estes defeitos.

Como discutido acimaô os defeitos no gene de zcytorl7 por si mesmos podem resultar num estado de doença humana hereditária. Os polinucleótidosô polipéptidos e anticorpos da presente invençãoô tal como exposto nas reivindicaçõesô auxiliariam na deteçãoô prevenção diagnósticoô e tratamento associado a um defeito genético de zcytorl7. Além dissoô as sondas de polinucleótidos de zcytorl7 podem ser usadas para detetar diferenças alélicas entre indivíduos doentes ou não-doentes no locus cromossómico de zcytorl7. Como talô as sequências de zcytorl? podem ser usadas como diagnóstico em perfis de ADN forense.

No geralô os métodos de diagnóstico utilizados na análise de ligação genéticaô para detetar uma anormalidade genética ou aberração num paciente são conhecidas na técnica. Sondas analíticas terão geralmente pelo menos 20 nt de comprimentoô embora sondas um pouco mais curtas possam ser utilizadas (por exemploô 14-17 nt'. Iniciadores de PCR são pelo menos 5 nt de comprimentoô preferentemente 15 ou maisô mais preferentemente 20-30 nt. Para a análise bruta de genesô ou ADN cromossómicoô uma sonda de polinucleótido de zcytorl? pode compreender um exão inteiro ou mais. Exões são prontamente determinados por um perito na especialidade por meio da comparação de sequências de zcytorl? (SEQ ID NO: 54' com o ADN genómico para zcytorl7 (N° de Acesso do Genbank AQ002781'. Em geralô os métodos de diagnóstico utilizados na análise de ligação genética para detetar uma anormalidade genética ou aberração num paciente são conhecidas na técnica. A maioria dos métodos de diagnóstico compreende as etapas de (a' obter uma amostra genética de um paciente potencialmente doenteô paciente doente ou portador não doente potencial de um alelo de doença recessivo; (b' produzir um primeiro produto de reação por meio da incubação da amostra genética com uma sonda de polinucleótido de zcytorl? em que o polinucleótido hibridará a sequência de polinucleótido complementarô tal como em análise RFLP ou por meio da incubação da amostra genética com iniciadores sense e antissense numa reação de PCR sob condições de reação de PCR apropriadas; (iii' visualizar o primeiro produto de reação por eletroforese em gel eúou outros métodos conhecidos tais como visualizar o primeiro produto de reação com uma sonda de polinucleótido de zcytorl? em que o polinucleótido hibridará à sequência de polinucleótido complementar da primeira reação; e (iv' comparar o primeiro produto de reação visualizado a um segundo produto de reação de controlo de uma amostra genética do paciente do tipo selvagemô ou um indivíduo normal ou de controlo. Uma diferença entre o primeiro produto de reação e o produto de reação de controlo é indicativo de uma anormalidade genética no paciente doente ou paciente potencialmente doenteô ou a presença de um fenótipo portador heterozigoto recessivo para um paciente não doenteô ou a presença de um defeito genético num tumor de um paciente doenteô ou a presença de uma anormalidade genética num feto ou embrião de pré-implantação. Por exemploô uma diferença em padrão de fragmento de restriçãoô comprimento de produtos de PCRô comprimento de sequências repetitivas no locus de gene de zcytor!7ô e semelhantesô são indicativos de uma anormalidade genéticaô aberração genéticaô ou diferença alélica em comparação com o controlo do tipo selvagem normal. Os controlos podem ser de membros de família não afetadosô ou indivíduos não relacionadosô dependendo do teste e disponibilidade de amostras. As amostras genéticas para utilização dentro da presente invenção incluem ADN genómicoô ARNmô e ADNc isolado de qualquer tecido ou outra amostra biológica de um pacienteô que incluiô mas não é limitada aô sangueô salivaô sémenô células embrionãriasô fluido amnióticoô e semelhantes. A sonda de polinucleótido ou iniciador pode ser ARN ou ADNô e compreenderá uma porção da SEQ ID NO: lô SEQ ID NO: 45 ou SEQ ID NO:53ô o complemento da SEQ ID NO:lô SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO: 53ô ouum equivalente de ARN do mesmo. Tais métodos para mostrar a análise de ligação genética a fenótipos de doença humana são bem conhecidos na técnica. Para a referência a métodos à base de PCR em diagnósticos veja-se geralmenteô Mathew (ed.'o Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Pressô Inc. 1991'ô White (ed.'o PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Pressô Inc. 1993'ô Cotter (ed.'o Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Pressô Inc. 1996'Ô Hanausek and Walaszek (eds.'o Tumor Marker Protocols (Humana Pressô Inc. 1998'o Lo (ed.'o Clinical Applications of PCR (Humana Pressô Inc. 199S'ô e Meltzer (ed.'o PCR in Bioanalysis (Humana Pressô Inc . 1998' ' .

Mutações associadas ao locus de zcytorl? podem ser detetadas utilizando moléculas de ácido nucleico utilizando métodos padrão para a análise de mutação diretaô tais como análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restriçãoô análise de repetição curta em tandem utilizando técnicas de PCRô análise de sistema de mutação refratária a amplificaçãoô deteção de polimorfismo de conformação de cadeia simplesô métodos de clivagem de ARNaseô eletroforese em gel em gradiente desnaturanteô análise de desemparelhamento assistida por fluorescênciaô e outras técnicas de análise genética conhecidas na especialidade (veja-seô por exemploô Mathew (ed.'o Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Pressô Inc. 1991'ô Marianô Chest 108:255 (1995'ô Coleman e Tsongalisô Molecular Diagnostics (Humana Pressô Inc. 1996'ô Elies (ed.' Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Pressô Inc. 1996'ô Landegren (ed.'o Laboratory Protocols for Mutation Detetion (Oxford University Press 1996'ô Birren et al. (eds.'o Genome Analysisô Vol. 2: Deteting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998'Ô Dracopoli et al. (eds.'o Current Protocols in Human Genetics (John Wiley &amp; Sons 1998'ô e Richards e Wardô "Molecular Diagnostic Testing"ô em Principles of Molecular Medicineô páginas 83-88 (Humana Pressô Inc. 1998'. A análise direta de um gene de zcytorl? para uma mutação pode ser realizada utilizando um ADN genõmico do indivíduo. Os métodos para amplificar ADN genómicoô obtidoô por exemploô de linfócitos de sangue periféricoô são bem conhecidos aos peritos na especialidade (veja-seô por exemploô Dracopoli et al. (eds.'o Current Protocols in Human Geneticsô nas páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley &amp; Sons 1998''.

Também podem ser gerados ratinhos modificados por engenharia genética que expressam o gene de zcytor!7ô denominados "ratinhos transgénicos" e ratinhos que apresentam uma ausência completa de função do gene zcytorl7ô denominados "ratinhos knock out" (Snouwaert et al.ô Science 257:10830 1992; Lowell et al.ô Nature 366:740-42ô 1993; Capecchiô M.R.ô Science 244: 1288-1292Ô 1989; Palmiterô R.D. et ai. Annu Rev Genet. 20: 465-499Ô 1986'. Por exemploô podem utilizar-se ratinhos transgénicos que sobre-expressam zcytorl7ô de forma ubíqua ou sob um promotor específico de tecido ou restringido a um tecido para perguntar se a sobre-expressão produz um fenótipo. Por exemploô a sobre-expressão de um polipéptido de zcytorl7 de tipo selvagemô fragmento do polipéptido ou um mutante do mesmo pode alterar processos celulares normaisô tendo como resultado um fenótipo que identifica um tecido em que a expressão de zcytorl7 é funcionalmente relevante e pode indicar um alvo terapêutico para o zcytorl7ô seus agonistas ou antagonistas. Por exemploô um ratinho transgénico preferido para modificar-se por engenharia genética é um que expressa um fenótipo "dominante-negativo"ô tal como um que sobre-expressa o polipéptido de zcytor!7 que compreende um domínio extracelular de ligação a citocina com o domínio transmembrana unido (aproximadamente aminoãcidos 20 (Ala' a 543 (Leu' da SEQ ID MO: 2 e SEQ ID MO: 46; ou 33 (Ala' a 556 (Leu' da SEQ ID NO: 54' . Um outro ratinho transgénico preferido é um que sobre-expressa recetores solúveis zcytorl7ô tais como aqueles revelados no presente documento. Além dissoô tal sobre-expressão pode ter como resultado um fenótipo que amostra similaridade com doenças humanas. De forma similarô podem utilizar-se ratinhos knockout para zcytorl7 para determinar se zcytorl7 é absolutamente necessário in vivo. 0 fenótipo de ratinhos knockout é preditivo dos efeitos in vivo que pode ter um antagonista de zcytorl7ô tais como aqueles descritos no presente documento. 0 ARNmô ADNc de zcytorl? de ratinho (SEQ ID NO: 56 eúou SEQ ID NO: 92' e ADN genõmicoô são usados para gerar ratinhos knockout. Estes ratinhos transgénicos e knockout podem ser utilizados para estudar o gene de zcytor!7 e a proteína por ele codificada num sistema in vivoô e podem ser utilizados como modelos in vivo para as doenças humanas ou animais correspondentes (tais como aquelas em populações animais comercialmente viáveis'. Os modelos de ratinho descritos no presente documento são particularmente relevantes comoô modelos do sistema imuneô modelos de inflamação ou tumor para o estudo da biologia e da progressão do cancro. Tais modelos são úteis no desenvolvimento e na eficácia de moléculas terapêuticas utilizadas em doenças imunes humanasô inflamação e cancros. Uma vez que os aumentos na expressão de zcytorl7ô bem como as diminuições na expressão de zcytorl7 estão associados a monócitosô ativação de monócitosô e células da próstataô e podem estar associados a inflamação e cancrosô ambos os ratinhos transgénicos e ratinhos knockout serviriam como modelos animais úteis para a doença humana. Além dissoô numa forma de realização preferidaô o ratinho transgénico de zcytor!7 pode servir como um modelo animal para as doenças específicasô particularmente aquelas associadas a monócitos. Além dissoô a expressão transgénica de ratinhos polinucleótidos antissense de zcytorl7 ou ribozimas direcionadas contra zcytorl7ô descritas no presente documentoô pode ser utilizada analogamente para ratinhos transgénicos descritos acima.

Para utilização farmacêuticaô os polipéptidos da presente invençãoô tal como descrito nas reivindicações podem ser formulados para administração parentéricaô particularmente intravenosa ou subcutâneaô de acordo com métodos convencionais. A administração intravenosa será por injeção de bolus ou infusão ao longo de um período típico de uma a várias horas. Em geralô as formulações farmacêuticas incluirão um polipéptido de recetor solúvel zcytorl7 em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitávelô tal como solução salinaô solução salina tamponadaô dextrose a 5 % em água ou semelhantes, As formulações podem ainda incluir um ou mais excipientesô conservantesô solubilizantesô agentes tamponantesô albumina para evitar perda de proteína nas superfícies dos frascosô etc. Os métodos de formulação são bem conhecidos na especialidade e são reveladosô por exemploô em Remington: The Science and Practice of Pharmacyô Gennaroô ed.ô Mack Publishing Co.ô Eastonô PAô 19a ed.ô 1995. As doses terapêuticas serão geralmente no intervalo de Oôl a 100 pgúkg de peso do paciente por diaô de preferência 0Ô5-20 mgúkg por diaô com a dose exata determinada pelo médico de acordo com os padrões aceitesô tendo em conta a natureza e gravidade da condição a ser tratadaô caraterísticas do doenteô etc. Determinação da dose está dentro do nível de habilidade ordinária na especialidade. As proteínas podem ser administradas para tratamento agudoô durante uma semana ou menosô muitas vezes ao longo de um período de um a três diasô ou poderão ser utilizados no tratamento crónicoô ao longo de vários meses ou anos. Em geralô uma quantidade terapeuticamente eficaz de polipéptido de recetor solúvel zcytorl7 é uma quantidade suficiente para produzir um efeito clinicamente significativo.

Os polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção encontrarãoô adicionalmenteô utilidade como ferramentas educacionais como kits de prática de laboratório para cursos relacionados com a genética e biologia molecularô química de proteínas e produção e análise de anticorpos. Devido à sua sequência polinucleotídica e polipeptídica única as moléculas de zcytorl7 podem ser utilizadas como padrões ou como "desconhecidos" para fins de teste. Por exemploô polinucleótidos de zcytorl7 podem ser utilizados como auxiliaresô tais comoô por exemploô para ensinar um estudante como preparar construções de expressão para a expressão bacterianaô viralô eúou em mamíferoô incluindo as construções de fusãoô em que zcytorl? é o gene a ser expresso; para determinar os locais de clivagem da endonuclease de restrição dos polinucleótidos; determinar a localização de ARNm e ADN de polinucleótidos de zcytorl7 em tecidos (ou sejaô por Northern e Southern blottingô bem como reação em cadeia de polimerase' ; e para a identificação de polinucleótidos e polipéptidos relacionados por hibridação de ácido nucleico.

Os polipéptidos de zcytorl? podem ser usados educacionalmente como uma ajuda para ensinar a preparação de anticorpos; identificação de proteínas por Western blotting; purificação de proteínas; determinação do peso dos polipéptidos de zcytorl? expressos como uma razão de proteína total expressa; identificação de locais de clivagem do péptido; acoplamento de etiquetas amino e carboxilo terminal; análise da sequência de aminoácidosô assim comoô mas não limitado a controlo das atividades biológicas de ambas a proteína nativa e etiquetada (ou sejaô ligação ao recetorô transdução de sinalô proliferação e diferenciação' in vitro e in vivo. Polipéptidos de zcytorl? também podem ser usados para ensinar habilidades analíticasô tais como espetrometria de massaô dicroísmo circular para determinar a conformaçãoô especialmente das quatro hélices alfaô cristalografia de raios x para determinar a estrutura tridimensional em detalhe atómicoô a espetroscopia de ressonância magnética nuclear para revelar a estrutura de proteínas em solução. Por exemploô um kit contendo o zcytorl7 pode ser dado ao estudante a analisar. Uma vez que a sequência de aminoácidos seria conhecida pelo professorô a proteína específica pode ser dada para o aluno como um teste para determinar as habilidades ou desenvolver as habilidades do alunoô o professorô entãoô saberia se o aluno analisou corretamente ou não o polipéptido. Uma vez que cada polipéptido é únicoô a utilidade educacional do zcytorl7 seria única em si mesma.

Além dissoô uma vez que zcytorl7 tem uma expressão específica de tecido e é um polipéptido com uma estrutura de recetor de citocina de classe I e uma localização cromossómica distintaô e padrão de expressãoô a atividade pode ser medida utilizando ensaios de proliferação; ensaios de luciferase e de ligação descritos no presente documento. Além dissoô a expressão de polinucleótidos e polipéptidos de zcytorl7 em monócitosô próstataô linfoides e outros tecidos podem ser analisados de modo a treinar os estudantes na utilização de métodos e identificação específica de tecido e diagnóstico. Além dissoô os polinucleótidos de zcytorl7 podem ser usados para treinar estudantes sobre a utilização de deteção cromossómica e métodos de diagnósticoô uma vez que seu locus é conhecido. Além dissoô os estudantes podem ser especificamente treinados e instruídos sobre o cromossomo humano lô e mais especificamente o locus 5qll em que o gene de zcytorl7 está localizado. Tais ensaios são bem conhecidos na especialidadeô e podem ser usados num ambiente de ensino para ensinar os estudantes sobre proteínas de recetor de citocina e examinar as propriedades diferentesô tais como efeitos celulares sobre as célulasô cinética da enzimaô variando afinidades de ligação do anticorpoô especificidade do tecidoô e semelhantesô entre zcytorl7 e outros polipéptidos de recetor de citocina na especialidade.

Os anticorpos que se ligam especificamente a zcytor!7 podem ser usados como uma ajuda ao ensino para instruir estudantes sobre como preparar colunas de cromatografia de afinidade para purificar zcytorl7ô clonagem e sequenciamento do polinucleótido que codifica um anticorpo eô assimô como uma prática para o ensino de um estudante sobre como conceber anticorpos humanizados. Além dissoô os anticorpos que se ligam especificamente a zcytor!7 podem ser usados como uma ajuda ao ensino para utilização na deteçãoô por exemploô de células de monõcitos ativadosô triagem de cêlulasô ou tecido linfoide e de cancro da próstataô utilizando métodos histológicos e in situo entre outros conhecidos na especialidade. 0 gene de zcytorl7ô polipéptido ou anticorpo seriamô entãoô embalados por empresas de reagentes e vendidos para universidades e outras entidades de ensino para que os alunos ganhem habilidade na especialidade de biologia molecular. Como cada gene e proteína é únicoô cada gene e proteína cria desafios únicos e experiências de aprendizagem para estudantes numa prática de laboratório. Tais kits educacionais contendo o gene de zcytorl7ô polipéptido ou anticorpo são considerados dentro do âmbito da presente revelação. A invenção é ilustrada adicionalmente por meio dos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1

Identificação e Isolamento de ADNc humano de zcytor!7 de Comprimento completo zcytorl7 foi identificado como um ADNc de comprimento completo predito a partir de ADN genómico humano. A sequência do polinucleõtido de zcytorl7 de comprimento completo predito é mostrada na SEQ ID NO:1 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO:2. Para obter um ADNc de comprimento completo de uma fonte de tecidoô 5' e 3' RACE foram utilizados. Diversos iniciadores de oligonucleótido foram projetados a partir da sequência genõmica identificada AQ002781 (Genbank). Os iniciadores foram usados para iniciar internamente dentro da sequencia genõmica para isolarô em último casoô um ADNc de comprimento completo. A. 5' RACE para zcytor!7

Um produto de 5' RACE foi gerado usando uma biblioteca de ADNc de HPVS como um molde e oligonucleótidos ZC12Ô7Q1 (SEQ ID NO: 5' e ZC27Ô898 (SEQ ID NO: 6' como iniciadores. HPVS é uma biblioteca de ADNc interna gerada de uma linha de célula epitelial de próstata humana (N° de ATCC CRL-

2221'. A reação de PCR usou aproximadamente 1 pg de ADN de plasmídeo preparado a partir da biblioteca de ADNc como um moldeô 5 μΐ de 10X tampão de PCR (GIBCOÚBRL'ô 5 μΐ de dNTPs a 10 mM (Perkin Elmer'ô 20 pmol de cada oligonucleótidoô e 1 μΐ (5Ô0 unidades' de polimerase Taq (GIBCOÚBRL' num 50 ul de volume de reação. Esta primeira ronda de reação de PCR

de 50 RACE foi executada como se segue: 30 ciclos a94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 2 minutosô então 72 °C durante 7 minutos; 4 °C de imersão. Uma alíquota de produto de PCR de 50 RACE foi remoída e analisada num gel de agarose a 1Ô0 %. Bandas múltiplas foram vistas no gel.

0 produto restante de PCR de 50 RACE foi precipitdo com etanol e diluído 1:50. Uma segunda ronda aninhada de reação de PCR de 50 RACE foi executada para ampliftrar a sequência de ADNc de molde. Esta reação de PCR usado oligonucleótidos ZC14Ô063 (SEQ ID NO:7' e ZC27Ô899 (SEQ ID NO:8'ô que foram projetados para anelar à sequência interna de ZC12Ô701 (SEQ ID NO: 5' e ZC27Ô898 (SEQ ID NO: 6' . Esta reação de PCR aninhada foi executada como para a primeira ronda de reação de 50 RACE revelada acima. Os prodtios de ADN resultantes foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a 1Ô0 % e uma banda proeminente em aproximadamente 900 pb foi vista. A banda de ADN foi purificada em gel e sequenciada usando métodos padrão. As análises de sequência revelaram que o produto de ADN incluiu parte da sequência de ADN genómico de AQQG2781 (Genbank' e pareceu estender a sequência de ADNc para zcytorl7 na extremidade 50 pra incluir um resíduo de metionina de iniciação de tradução e alguma sequência 50 não traduzida. A sequência de polinucleótido do produto de 50 RACE é mostrada naSEQ ID NO: 9 . B. 3' RACE para zcytorl7

Os iniciadores para 3' RACE foram projetados usando ο produto de 5' RACE (SEQ ID NO :90 obtido acima. Um poduto de 3' RACE foi gerado usando uma biblioteca de ADNc interna de próstata humana como um molde e oligonucleõtidos ZC28Ô4S1 (SEQ ID NO:10' e ZC6Ô346 (SEQ ID N0:11' como iniciadores. Esta primeira ronda de reação de PCR de 3' RACE foi executada sob as condições descritas no Exemplo IA. Uma aliquota de produto de PCR de 3' RACE foi removida e analisada num gel de agarose a 1Ô0 %. Bandas múltiplas foram vistas no gel. 0 produto restante de PCR de 3' RACE foi precipitado com etanol e diluído 1:40. Uma segunda ronda de reação aninhada de PCR de 3' RACE foi executada para amplificar a sequência de ADNc de molde. Esta reação de PCR usado oligonucleõtidos ZC28Ô480 (SEQ ID NO:120 e ZC26Ô405(SEQ ID NO:130 ô que foram projetados para anelar à sequêncà interna de ZC28Ô481 (SEQ ID NO: 1013 e ZC6Ô346 (SEQ ID NO :110 . Esta reação de PCR aninhada foi executada orno revelado acima. Os produtos de ADN resultantes foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a 1Ô0 % e uma banda proeminente em aproximadamente 2100 pb foi vista. O ADN restante foi precipitado com etanol e diluído 1:40. Uma terceira ronda de reação aninhada de PCR de 3' RACE foi executada para amplificar a sequência de ADNc de molde. Esta reação de PCR usou oligonucleótidos ZC27Ô895 (SEQ ID NO: 140 e ZC5Ô020 (SEQ ID NO: 150 ô que foma projetados para anelar à sequência interna de ZC28Ô480 (SEQ ID NO: 120 e ZC26Ô405 (SEQ ID NO: 130 . Esta reaçãde PCR aninhada foi executada como revelado acima. Os produtos resultantes de PCR foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a 1Ô0 % e uma banda proeminente em aproximadamente 2 000 pb foi vista. A banda de ADN foi purificada em gel e sequenciada. As análises de sequência revelaram que o produto de ADN incluiu parte do produto de 5' RACE (SEQ ID NO: 9' e pareceu estender a sequência de ADNc para zcytorl7 na extremidade 3' para incluir um codão de parada de tradução e alguma sequência 3' não traduzida. A sequência de polinucleótido do produto de 3' RACE é mostrada na SEQ ID NO:16. A sequência de polinucleótido do zcytorl? de comprimento completo é mostrada na SEQ ID NO:45 e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO:46. C. Um segundo 5' RACE para zcytorl? identificou um zcytor!7 alternativo de comprimento completo

Um produto de 5' RACE foi gerado usando uma biblioteca de ADNc de WI-38 como um molde e oligonucleõtidos ZC12Ô7Q1 (SEQ ID NO: 50 e ZC27Ô899 (SEQ ID NO: 80 como iniciades. WI-28 é uma biblioteca de ADNc interna gerada de uma linha de células embrionãrias de pulmão humano (N° de ATCC CRL-750 . A reação de PCR usou aproximadamente 1 pg de SN de plasmídeo preparado a partir da biblioteca de ADNc como um moldeô 5 ul de 10X tampão de PCR (GIBCOÚBRL0 ô 5 plde dNTPs a 10 mM (Perkin Elmer0 ô 20 pmol de cada oligonucleóidoô e 1 ml (5Ô0 unidades0 de polimerase Taq (GIBCOÚBRL0 ura 50 μΐ de volume de reação. Esta primeira ronda de reação de PCR de 5' RACE foi executada como se segue: 3 0 ciclos a 94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 2 minutosô então 72 °C durante 7 minutos; 4 °C de imersão. Uma alíquota de produto de PCR de 5' RACE foi removida e analisada num gel de agarose a 1Ô0 %, Bandas múltiplas foram vistas no gel. O ADN restante foi precipitado com etanol e diluído 1:50. Uma segunda ronda reação de PCR aninhada de 5' RACE foi executada para amplificar a sequência de ADNc de molde. Esta reação de PCR usou oligonucleõtidos ZC14Ô063 (SEQ ID NO:250 ô e ZC2 7Ô9Q0 (SEQ ID NO :510 ô que foram projados para anelar à sequência interna de ZC12Ô701 (SEQ ID NO:50 e ZC27Ô899 (SEQ ID NO:80 . Esta reação de PCR aninhada foi

executada como para a primeira ronda de reação de 5' RACE revelada acima. Os produtos de ADN resultantes foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a 1Ô0 ® e uma banda proeminente em aproximadamente 1200 pb foi vista. A banda de ADN foi purificada em gel e sequenciada. As análises de sequência revelaram que o produto de ADN incluiu parte da sequência de ADN genómico AQ002781 (Genbank' e pareceu estender a sequência de ADNc para zcytorl? na extremidade 5' para incluir um resíduo de metionina de iniciação de tradução e alguma sequência 50 não traduzida. 0 sequenciamento de ADN mostrou que o polipéptido gerado a partir de tradução desta metionina de iniciação alternativa (mostrada na SEQ ID NO:53 no nucleótido 497' gera uma segunda forma de comprimento completo de zcytorl7 que difere por uns adicionais 13 aminoãcidos em quadro na terminação N (MKLSPQPSCVNLG; SEQ ID NO:52' a partir desta mostrada na SEQ ID NO:46. A sequência de polinucleótido da segunda forma de comprimento completo de zcytorl7 é mostrada na SEQ ID NO: 53 e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO:54. A segunda forma de comprimento completo de zeytorl7 (SEQ ID NO:53 e SEQ ID NO:54' é provavelmente a forma mais comummente expressa.

Exemplo 2

Identificação e Isolamento de Formas Truncadas de ADNc humano de zcytorl7 A. Isolamento de um ADNc que codifica uma forma variante de zcytor!7 truncado no domínio de fibronectina

Um produto de 3' RACE para uma forma truncada solúvel de zcytorl7 foi gerado usando um protocolo idêntico a este descrito acima durante 3' RACE (Exemplo IBS ô excetoque o material de partida foi a biblioteca de ADNc de HPVS. HPVS é uma biblioteca de ADNc interna gerada de uma linha de célula epitelial de próstata humana (N° de ATCC CRL-2221'. Os produtos resultantes da terceira ronda aninhada de 3' RACE foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a lôO ® e uma banda proeminente em aproximadamente 700 pb foi vista. A banda de ADN foi purificada em gel e sequenciada. As análises de sequência revelaram que o produto de ADN incluiu parte do produto de 50 RACE (SEQ ID NO:9' epareceu estender a sequência de ADNc para zcytorl? para incluir um codão de parada de tradução próximo à extremidade do domínio de ligação a citocina. Isto poderia representar uma forma solúvel expressa do recetor truncado dentro do domínio de fibronectina. A sequência de polinucleótido da forma solúvel de zcytorl7 truncado dentro do domínio de fibronectina é mostrada na SEQ ID NO: 15 e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO:18. B. Isolamento de um ADNc que codifica uma forma de zcytor!7 truncado na extremidade do domínio de ligação a citocina

Um produto de 30 RACE para uma forma truncada de zcytorl7 foi gerado usando a biblioteca de ADNc de HPVS como um molde e ZC27Ô895 (SEQ ID NO: 14' e ZC6Ô346 (SEQ ID NO:11' como iniciadores. Esta primeira ronda de reação de PCR de 30 RACE foi executada como se segue: 30 ciccbs a 94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 2 minutosô então 72° C durante 7 minutos; 4 °C de imersão. Uma alíquota de produto de PCR de 3' RACE foi removida e analisada num gel de agarose a lôO ®, Bandas múltiplas foram vistas no gel. 0 ADN restante foi precipitado com etanol e diluído 1:40. Uma segunda ronda de reação aninhada de PCR de 3' RACE foi executada para amplificar a sequência de ADNc de molde. Esta reação de PCR usou oligonucleótidos ZC27Ô897 (SEQ ID NO:19' e ZC5Ô020 (SEQ ID N0:15'ô que foram projetados para anelar à sequência interna de ZC27Ô895 (SEQ ID NO: 14' e ZC6Ô346 (SEQ ID N0:11'. Esta reação de PCR aninhada foi executada como para a primeira ronda de 50 RACE revelada no Exemplo 1AÔ acima. Os produtos de ADN resultantes foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a 1Ô0 ® e uma banda proeminente em aproximadamente 1100 pb foi vista. A banda de ADN foi purificada em gel e sequenciada. A análise da sequência revelou que o produto de ADN incluiu parte da sequência de ADN genómico de AQ002781 (Genbank' e pareceu estender a sequência de ADNc para zcytorl7 na extremidade 30 para incluir um coão de parada de tradução na extremidade do domínio de ligação a citocina.

Para confirmar que a sequência acima de facto não se sobrepôs com a sequência de ADN genómico de AQ002781Ô uma reação de PCR adicional foi realizada. Um produto de PCR foi gerado usando a biblioteca de ADNc de HPVS como um molde e oligonucleotides ZC28Ô481 (SEQ ID NO:10' e ZC28Ô521 (SEQ ID NO: 20' como iniciadores. A reação de PCR foi executada como se segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 2 minutosô então 72 °C durante 7 minutos; 4 °C de imersão. Os produtos de ADN resultantes foram submetidos a eletroforese num gel de agarose a 1Ô0 ® e uma banda proeminente em aproximadamente 800 pb foi vista. A banda de ADN foi purificada em gel e sequenciada. As análises de sequência confirmaram que esta era uma forma truncada de zcytorl7. Isto poderia representar uma forma solúvel expressa do recetor truncado próximo à extremidade do domínio de ligação a citocina. A sequência de polinucleótido desta forma solúvel de zcytorl7 é mostrada na SEQ ID NO: 21 e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO:22'.

Um outro produto truncado de 30 RACE foi isolado usando o protocolo descrito acima para o isolamento de uma variante de ADNc truncada no domínio de fibronectina (Exemplo 2A' . 0 sequenciamento do produto de PCR isolado verificou a sequência da forma solúvel de zcytorl7 como mostrado na SEQ ID NO:21.

Exemplo 3

Distribuição de Tecido de zcytorl? Humano em Painéis de Tecido Usando Northern blot e PCR A. Distribuição De tecido de zcytorl? Humano Usando Northern blot

Foram sondadas manchas de Northern blot de Múltiplos tecidos humanos (manchas de transferência I e II de MTN de pista 12 humano e mancha de transferência II de MTN de sistema imune humano; MTN de tecido endõcrino humanoô transferência II de MTN de tecido fetal humanoô matriz de Múltiplos tecidos humanos' (Clontech' assim como manchas de transferência internas que continham diversos tecidosô para determinar a distribuição de tecido da expressão de zcytorl7 humano. As manchas de transferência preparadas internamente incluíam os seguintes ARNm de tecidos e linhas celulares: células SK-Hep-lô células THPlô Glândula suprarrenal (Clontech'; Rim (Clontech'o Fígado (Clontech e Invitrogen'; Médula espinal (Clontech'o Testículo (Clontech'o Células T CD4° humanosô Células T CD8° humanosô células T CD190 humanosô reação mista de linfócitos humanos (MLR'ô linha celular THP1 (ATCC N° ΤΙΒ-202'ô linha celular U937Ô linha celular de linfoblastos de ratinho p388DI (ATCC N° CCL-46' com ou sem estimulação por ionomicina; e linha celular de pulmão embrionário humano WI-38 (ATCC N° CRL-2221' com ou sem estimulação por ionomicina.

Foi amplificada uma sonda obtida por PCR de aproximadamente 500 pb para zcytorl7 SEQ ID NO: 4' usando o 5§ RACE (Exemplo IA' (SEQ ID NO: 9' como molde e oligonucleótidos ZC28Ô575 SEQ ID NO: 23' e ZC27Ô899 SEQ ID NO: 24' como iniciadores. A amplificação por PCR foi realizada como se indica a seguir: 30 ciclos de 94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante um minuto e 72 °C durante um minuto; seguido de um ciclo a 72 °C durante 7 minutos. 0 produto de PCR foi visualizado por eletroforese em gel de agarose e o produto de PCR de aproximadamente 500 pb foi purificado em gel como é descrito no presente documento. A sonda foi marcada radioativamente usando o kit de marcação de iniciador aleatório PRIME IT II™ (Stratagene' de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada usando uma coluna de pressão NUCTRAP™ (Stratagene'. Foi usada solução EXPRESSHYB™ (Clontech' para a pré-hibridação e como solução de hibridação para os Northern blot. A pré-hibridação foi realizada a 68 °C durante 2 horas. A hibridação foi realizada durante a noite a 68 °C com aproximadamente 1Ô5X105 cpmúml de sonda marcada. As manchas de transferência foram lavadas três vezes a temperatura ambiente em SSC 2Xô SDS a 0Ô05 % seguido de uma lavagem durante 10 minutos em SSC 2Xô SDS a Oôl % a 50 °C. Foram observadas várias bandas foram depois de uma exposição de vários dias. Foi observado um transcrito de aproximadamente 9 kb em traqueiaô músculo esquelético e timo; foi observado um transcrito de aproximadamente 2 kb em células PBLô HPVô U937 e THP-1; e foi observado um transcrito de aproximadamente 1Ô2 kb em placentaô médula óssea e tiroideô e em células HPV e U937. Em todos os tecidos indicados anteriormenteô a intensidade do sinal foi fraco. Parecia ter pouca expressão na maioria dos tecidos normaisô o que sugere que a expressão de zcytorl7 pode ser dependente da ativação das células ou tecidos em que se expressa. A análise de Northern é também realizada usando Linha de Célula de Cancro Humano MTN™ (Clontech'. PCR e condições de sondagem são como foram descritos acima. Um sinal forte numa linha de cancro sugere que a expressão de zcytorl7 pode ser expressa em células ativadas eúou pode indicar um estado de doença cancerosa. Além dissoô usando métodos conhecidos na especialidadeô Northern blots ou análise de PCR de células de linfócitos ativados podem também mostrar se o zcytor!7 é expresso em células imunes ativadas.

B. Distribuição De tecido em painéis de tecidos usando PCR

Um painel de ADNc de tecidos humanos foi rastreado com respeito à expressão de zcytorl? usando PCR. 0 painel foi realizado internamente e continha 94 amostras de ADNc marathon e amostras de ADNc de diversas linhas celulares e tecidos humanos normais e cancerosos e é mostrado no Quadro 5 apresentado a seguir. Os ADNc procediam de bibliotecas internas ou de ADNc marathon procedente de preparações de ARN internasô ARN de Clontech ou ARN de Invitrogen. Os ADNc marathon foram fabricados usando o kit marathon-Ready (Clontechô Paio Altoô CA'ô foram submetidos a ensaios de CC com iniciadores de clatrina ZC21195 SEQ ID NO: 49' e ZC21196 SEQ ID NO: 50' e depois foram diluídos com base na intensidade da banda de clatrina. Para garantir a qualidade das amostras do painelô foram realizados três ensaios de controlo de qualidade (CC® : (10 para avaliar a quàdade do ARN usado para as bibliotecasô os ADNc internos foram ensaiados com respeito ao tamanho médio do inserto por PCR com oligos do vetor que eram específicos para as sequências de vetor para uma biblioteca de ADNc individual; (20 a padronização da concentração do ADNc nas amostras do painel foi conseguida usando métodos de PCR convencionais para amplificar a alfa tubulina de comprimento completo ou ADNc de G3PDH usando um oligo de vetor 5' ZC14Ô063 SEQ ID NO: 25' e um iniciador oligo específico de alfa tubulina 3' ZC17Ô574 SEQ ID NO: 26' ou o iniciador oligo específico de G3PDH 30 ZC17Ô600 SEQ ID NO: 27'; e (3' uma amostra foi enviada a sequenciamento para verificar a possível contaminação com ADN ribossómico ou mitocondrial, 0 painel foi preparado num formato de 9 6 poços que incluía uma amostra de controlo positivo de ADN genómico humano (Clontechô Paio Altoô CA' . Cada poço continha aproximadamente QÔ2-100 pgújil de ADNc. As reações de PCR foram preparadas usando oligos ZC26Ô358 SEQ ID NO: 28' e

TW ZC2 6Ô3 5 9 SEQ ID NO: 29'ô TaKaRa Ex Taq (TAKARA Shuzo Co LTDô Biomedicals Groupô Japão'ô e corante Rediload (Research Geneticsô Inc.ô Huntsvilleô AO'. A amplificação foi realizada como se indica a seguir: um ciclo a S4 °C durante 2 minutosô 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundosô 6 6Ô3 °C durante 3 0 segundos e 72 °C durante 3 0 segundosô seguido de um ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Aproximadamente 10 μΐ do produto de reação de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose convencional usando um gel de agarose ao 4 ®. Foi observado o tamanho do fragmento de ADN previsto correto em gânglio linfáticoô próstataô tiroideô HPV (epitélio de próstata'ô HPVS (epitélio de próstataô selecionado'ô tumor de pulmãoô reações de tumor de úteroô junto com a reação de ADN genõmico. Um dos iniciadores pode anelar ao genómico ou ao recetor solúvel de forma curta zcytorl7 (SEQ ID N0:21'ô sugerindo que o padrão de expressão visto pode ser este desta forma alternativa de zcytorl7.

Os fragmentos de ADN para o tecido de próstata (2 amostras'ô HPV (epitélio de próstata'ô HPVS (epitélio de próstataô selecionado'ô e genómico foram cortados e purificados usando um kit de extração em gel (Qiagenô Chatsworthô CA' de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos foram confirmados por sequenciamento para mostrar que efetivamente era zcytorl7.

Quadro 5

C. Análise de expressão de zcytorl7 por PCR e Northern A anotação dos tipos celulares e as condições de crescimento que afetam à expressão do recetor é um meio útil para esclarecer sua função e predizer uma fonte de ligando. Para esta finalidadeô foram inspecionadas uma ampla diversidade de tecidos e tipos celulares por PCR. Foi usada a Polimerase termoestãvel Advantage II™ (Clontechô A Jollaô CA) com os iniciadores oligonucleotídicos ZC29Ô180 SEQ ID NO: 73) e ZC29Ô179 SEQ ID NO: 74) e 1-10 ng dos diversos moldes de ADNc indicados a seguir para 30 ciclos de amplificação de (94 °Cô 30 seg.; 66 °Cô 20 seg.; 68 °Cô 1 min. 30 seg.) . Depois distoô foi realizada um 20 % de cada reação em géis de agarose a 0Ô8 %ô TAE/ brometo de etídio e foram visualizadas com luz uv. Depoisô as amostras foram avaliadas com base na intensidade das bandas. Veja-se o Quadro 6 mostrada a seguir.

Quadro 6

Dos fortes sinais de PCR positivasô dois procediam das linhas celulares de monócitos humanos U937 e THP1.

Estas duas linhas celulares juntamente com uma linha de epitélio de próstata foram selecionadas para análise adicionais por Northern blot. Os intentos anteriores de visualizar um transcrito por análise de Northern usando ARNm de diversos tecidos produziram sinais fracos e difusos no intervalo de tamanho surpreendentemente grande de 7-10 kbô fazendo com que este dado seja difícil de interpretar. Foi preparado um gel desnaturalizante de formaldeídoÚMOPSÚagarose a 0Ô8 ® (RNA Methodologiesô Farrellô RE Academic Press' e foram postos 2 μg de polyA0 ARNm para cada amostra juntamente com uma escala de ARN (Life Technologiesô Bethesdaô MD'. 0 gel depois foi transferido a nylon Hybond (Amershamô Buckinghamshireô Reino Unido'ô foi submetido a entrecruzamento UV e foi hibridado em solução ExpressHyb (Clontechô A Jollaô CA' a 68 °C durante a noite usando uma sonda para zcytoR17 humano gerada por PCR com os oligos ZC28Ô575 SEQ ID NO: 23'ô e ZC27Ô899 SEQ ID NO: 24' e foi marcada com o kit Megaprime 32P (Amersham'. A mancha de Northern blot posteriormente foi lavada com SSC 0Ô2X 0 SDS a Oôl ® a 65 °C durante 15 minutos e foi exposta à película durante 7 dias com crivos de intensificação. Foi observado uma banda proeminente de 8 kb tanto no epitélio de próstata como nas pistas de U937 enquanto que estava presente uma banda mais débil no pista de THP1.

Para otimizar o ADNc usado como sonda de hibridaçãoô foram amplificadas quatro regiões diferentes da sequência de zcytoR17 humano de comprimento completo por PCRô foram marcadas e hibridadas como foi descrito anteriormente com manchas de southern blot que continham ADN da biblioteca de ADNc genómica e amplificada. As quatro sondasô denominadas no presente documento sondas A-Dô foram amplificadas usando os seguintes pares de iniciadores: (A' ZC28Ô575 (SEQ ID NO:2 3'Ô ZC27Ô899 (SEQ ID NO:24'; (B' ZC27Ô895 (SEQ ID NO:64'ô ZC28Ô917 (SEQ ID NO:73'; (C' ZC28Ô916 (SEQ ID NO: 75' Ô ZC28Ô918 (SEQ ID NO:76'; e (D' ZC28Ô916 (SEQ ID NO:75'ô ZC29Ô122 (SEQ ID NO:65'. 0 ADN genómico humano juntamente com as bibliotecas de ADNc amplificadas demostraram conter zcytoRl? por PCR e foram digeridos com EcoRl e Xhol para libertar insertos e foram processados em géis de TAEÚagarose a Qô8 ®ô em duplicataô foras desnaturalizados com NaOH 0Ô5 Mô NaCl 1Ô5 Mô foram trasferidos a Hybondô foram submetidos a entrecruzamento UV e cada um hibridou com uma sonda distinta. Foi observado que a sonda B tinha a menor ligação não específica e o sinal mais forte. Desta maneiraô a sonda B foi usada para todas as hibridações posteriores.

Dado que as células THP1 são um excelente modelo de monócitos circulantes e expressavam zcytoR17 a baixos níveisô foram tratadas com uma diversidade de compostos com a intenção de aumentar a expressão de zcytoRl?. As células foram cultivadas a uma densidade de 2X105Úmlô foram lavadas e foram ressuspensas em diversos meios de estimulaçãoô foram cultivadas durante quatro ou trinta horas e foram colhidas para as preparações de ARN. Cada meio foi suplementado com um dos seguintes fãrmacos ou pares de citocinas: LPS 2 ugúml (Sigma Chemicalsô St. Louisô MO)ô hTNFa2 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô hGM-CSF 2 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô hlFNy 50 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN) ô hMCSF 1 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô hIL6 1 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô hILlp 2 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô hlFNy 50 ngúml + hIL4 005 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô hlFNy 50 ngúml + hILlO 1 ngúml (R&amp;D Systemsô Minneapolisô MN)ô PMA 10 ngúml (Calbiochemô SanDiegoô CA) e um controlo não tratado. Ao final do período de cultura foi preparado ARN total usando um kit RNAeasy Midi (Qiagenô Valenciaô CA) . Foi selecionado o ARN poli A+ a partir do ARN total usando um kit MPG (CPGô Lincoln Parkô NJ) . Dois ug de ARN poli A+ de cada condição foram processados em géis de formaldeídoÚMQPSÚagaroseô foram transferidos a nylon e foram submetidos a entrecruzamento UV como foi descrito anteriormente. Estas manchas de Northern blot, depois foram hibridadasô como foi indicado anteriormenteô com a sonda B a 68 °C durante a noiteô foram lavados a alta restringência com SSC 0Ô2XÔ SDS a Oôl ® a 6 5 °Cô foram expostos a um filme durante a noite e depois foram expostos a crivos de fósforo para a quantificação do sinal. Em todos as pistas foi observado um ARNm de 8 kb dominante assim como uma banda de 2ô8 kb relativamente mais débil. Foi observado um aumento de 20 vezes no ARNm de zcytoR17 no ARM das células tratadas com hlFNy durante 30 horasô e este efeito foi mutado ligeiramente com tratamento simultâneo com IL4. Foram observadas aumentos minoritários de 3 vezes no ARNm no ARN procedente de células tratadas com LPSô TNFoc e GM-CSFô enquanto que o MCSFô IL6 e ΙΒίβ não tiveram nenhum efeito sobre os níveis de ARNm de zcytorl7. Estes dadosô em conjuntoô sugerem um papel para o recetor zcytorl7 e seu ligando na biologia dos monõcitos e macrófagos eô por extensãoô em vários processos de doença nos que participam estas células.

Exemplo 4

Mapeamento Cromossómico Com Base Em PCR do Gene de zcytorl7

Zcytorl7 foi mapeado ao cromossoma 5 usando o "GeneBridge 4 Radiation Hybrid (RH) Mapping Panel" comercialmente disponível (Research Geneticsô Inc.ô

Huntsvilleô AL) . 0 painel GeneBridge 4 RH contém ADN de cada um dos 93 clones híbridos de radiaçãoô mais dois ADN de controlo (o dador HFL e o recebedor A23) . Um servidor WWW publicamente disponível (http:ÚÚwww- genome.wi.mit.eduúcgi-binúcontigúrhmapper,pl) permite o mapeamento em relação ao mapa híbrido de radiação do Whitehead InstituteÚMTI Center for Genome Research do genoma humano (o mapa híbrido de radiação "WICGR") que foi construído com o painel GeneBridge 4 RH.

Para o mapeamento de Zcytorl7 com o painel GeneBridge 4 RHô reações de 2 0 μΐ foram preparadas numa placa de microtitulação de 96 poços compatível para PCR (Stratageneô

La Jollaô CA' e usado num ciclador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene' . Cada uma das 95 reações de PCR consistia em 2 μΐ 10X KlenTaq tampão de reação de PCR (CLONTECH Laboratoriesô Inc.ô Paio Altoô CA'ô 1Ô6 μΐ de mistura de dNTPs (2Ô5 mM cadaô PERKIN-ELMERô Foster Cityô CA' ô 1 μΐ de iniciador senseô ZC27Ô895 (SEQ ID NO: 14'ô 1 μΐ de iniciador antissenseô ZC27Ô899 (SEQ ID NO:24'ô 2 μΐ "RediLoad" (Research Geneticsô Inc.ô Huntsvilleô AL'ô 0Ô4 μΐ 5 OX Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratoriesô Inc. 'ô 25 ng de ADN de urn clone híbrido individual ou controlo e água destilada para um volume total de 20 μΐ. As reações foram cobertas com uma quantidade igual de óleo mineral e foram seladas. As condições do ciclador de PCR foram como se segue: um ciclo inicial de desnaturação de 5 minutos a 94 °Cô 35 ciclos de desnaturação de 4 5 segundos a 94 °Cô anelamento de 4 5 segundos a 54 °C e 1 minuto E 15 segundos de extensão a 72 °Cô seguido de uma extensão final de 1 ciclo de 7 minutos a 72 °C. As reações foram separadas por meio de eletroforese num gel de agarose a 2 % (EM Scienceô Gibbstownô NJ' e visualizado por meio de coloração com brometo de etídio.

Os resultados mostraram que Zcytorl7 mapeia 6Ô72 cR__3QQ0 distal do marcador de framework AFM183YB8 no mapa híbrido de radiação WICGR de cromossoma 5. A utilização de genesÚmarcadores circundantes posiciona Zcytorl7 na região cromossómica 5qll.

Exemplo 5

Construção de Quimera de polipéptido de MPL-zcytorl7: MPL Extracelular e Domínio TM Fusionado ao Domínio de Sinalização Intracelular zcytorl7 0 domínio extracelular 5S do recetor de MPL murinofoi isolado a partir de um plasmídeo que contém o recetor de MPL murino (plasmídeo PHZ1ÚMPL' por meio de digestão com EcoRI e BamHI gerando um fragmento de 1164 pb. A digestão foi executada num gel de agarose a 1 % e o fragmento foi isolado utilizando o kit de extração por gel Qiaquick (Qiagen' como pelas instruções do fabricante. 0 resto do domínio extracelular de MPL e domínio transmembrana foram gerados utilizando PCR com iniciadores ZC6Ô673 (SEQ ID NO: 58' e ZC29Ô082 (SEQ ID NO: 59' . As condições de reação foram como segue: 15 ciclos a 94 °C durante 1 min.ô 55 °C durante 1 min.ô 72 °C durante 2 min. ; seguido por 72 °C durante 7 min.; depois uma imersão a 4 °C. 0 produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1 ® e o aproximadamente fragmento de recetor MPL de 400 pb foi isolado utilizando kit de extração por gel Qiaquick™ (Qiagen' como pelas instruções do fabricante. 0 domínio intracelular de zcytorl7 humano foi isolado de um plasmídeo que contém ADNc de recetor zcytor!7 (#23tJpCAP' utilizando PCR com iniciadores ZC29Ô083 (SEQ ID NO: 60' e ZC29Ô145 (SEQ ID NO: 61'. A sequência de polinucleótido que corresponde à sequência codificante de recetor zcytor!7 é mostrada em SEQ ID NO: 54. As condições de reação foram como para anteriormente. O produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1 ® e o fragmento de zcytorl7 de aproximadamente 320 pb foi isolado utilizando kit de extração por gel Qiaquick como pelas instruções do fabricante.

Cada um dos fragmentos de PCR isolados descritos anteriormente foi misturado a uma razão volumétrica de 1:1 e utilizado numa reação de PCR utilizando ZC6673 (SEQ ID NO: 58' e ZC29145 (SEQ ID NO: 61' para criar tudoô menos a porção 50 de MPL da quimera de MPL-zcyt.orl7. As codições de reação foram como segue: 15 ciclos a 94 °C durante 1 min.ô 55 °C durante 1 min.ô 72 ’C durante 2 min.; seguido por 72 °C durante 7 min.; depois uma imersão a 4 °C. Todo o produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1 ® e o fragmento de quimera de MPL-zcytorl7 de aproximadamente 700 pb foi isolado utilizando kit de extração por gel Qiaquick (Qiagen' como pelas instruções do fabricante. 0 Fragmento de quimera MPL-zcytorl7 foi digerido com BamHI (BRL' e Xbal (Boerhinger Mannheim' como pelas instruções do fabricante. Todo o material digerido foi corrido num gel de agarose a 1 ® e a quimera MPL-zcytorl? clivada foi isolada utilizando kit de extração por gel Qiaquick™ (Qiagen' como pelas instruções do fabricante. A quimera MPL-zcytorl? clivada mais fragmento 50 de EcoRIÚBamHI de MPL descritos anteriormente foram inseridos num vetor de expressão para gerar o recetor quimérico de MPL-zcytorl7 completo como foi descrito a seguir. 0 vetor de expressão recipiente pZP-7 foi digerido com EcoRI (BRL' e Xbal (BRL' como pelas instruções do fabricanteô e purificado por gel como foi descrito anteriormente. Este fragmento de vetor foi combinado com a quimera de PCR MPL-zcytorl7 clivado com EcoRI e Xbal isolada anteriormente e o fragmento 50 de MPL de EoRI e BamHI isolado anterior numa reação de ligação. A ligação foi executada utilizando T4 Ligase (Epicentre Technologies'ô a temperatura ambiente durante 1 hora como pelas instruções do fabricante. Uma amostra da ligação foi eletroporada em células de E. coli eletrocompetentes DH10B EletroMAX™ (25 mFô 200 Ωό 1Ô8 V' . Transformantes foram inoculados em placa em placas de LB 0 Ampicilina e as colónias isoladas foram rastreadas por meio de miniprep (Qiagen' e digestão com EcoRI para verificar para a quimera MPL-zcytorl7. A digestão com EcoRI de clones corretos rendeu aproximadamente um fragmento de 2 kb. A confirmação da sequência de quimera MPL-zcytorl? foi feita por análises de sequência O inserto era de aproximadamente 3ôi kbô e era comprimento completo.

Exemplo 6

Proliferação com base em Quimera MPL-zcytorl7 ensaio de BAF3 Utilizando AIamar Blue A. Construção de Células BaF3 que expressam quimera MPL-zcytorl?

BaF3ô uma linha de célula pré-linfoide dependente de interleucina-3 derivado de medula óssea murina (Palacios e Steinmetzô Cell 41: 727-734Ô 1985; Mathey-Prevot et al.ô Mol. Cell. Biol. 6:4133-41350 1986'. Foi mantida em meios completos (Meio RPMIô JRH Bioscience Inc.ô Lenexaô KS' suplementado com 10 ® de soro fetal de bezerro inativado por calorô 1 ngúml de IL-3 murina (mIL-3' (R # Dô Minneapolisô MN'ô 2 mM de L-glutaMax-1™ (Gibco BRL'o 1 mM de Piruvato de sódio (Gibco BRL'o e antibiótico PSN (GIBCO BRL' ' . Antes da eletroporaçãoô ADN de plasmídeo de pZP-7ÚMPL-zcytorl7 (Exemplo 5' foi preparado e purificado utilizando um kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen' como pelas instruções do fabricante. Células BaF3 para eletroporação foram lavadas duas vezes em Meios RPMI e depois ressuspensas em Meios RPMI a uma densidade celular de 107 célulasúml. Um ml de células BaF3 ressuspensas foi misturado com 3 0 mg do ADN de plasmídeo de pZP-7ÚMPL-zcytorl7 e transferido a câmaras de eletroporação descartáveis separadas (GIBCO BRL'. A temperatura ambienteô foram dados às células 5 x choques de 1 mseg a 800 volts seguido por 5 x choques de 2 ms a 600 volts distribuídos por um aparelho de eletroporação (Cyto-Pulse'. As células eletroporadas foram transferidas a 50 ml de meios completos e colocadas numa incubadora durante 15-24 horas (37 °Cô 5 ® de C02'- Depois solução de Geneticin™ (Gibco' (1 mgúml G41S' foi adicionada às células num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a G-418. Agrupamentos das células BaF3 transfetadasô a seguir no presente documento denominados células BaF3ÚMPL-zcytorl7ô foram ensaiadas para capacidade de sinalização como é descrito a seguir. B. Testando a capacidade de sinalização das células BaF3ÚMPL-zcytor!7 utilizando um Ensaio de proliferação AIamar Blue Células BaF3ÚMPL-zcytorl7 foram precipitadas por centrifugação e lavadas nos meios completosô descritos anteriormenteô mas sem mIL-3 (a seguir no presente documento denominado como 0 meios livres de mIL-30 ' .As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada do mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3ÚMPL-zcytorl7 foi avaliada utilizando trombopoietina murina (mTPO' diluída com meios livres de mIL-3 a concentrações de 200 ngúmlô 100 ngtJmlô 50 ngúmlô 25 ngúmlô 12Ô5 ngúmlô 6Ô25 ngúmlô 3ôl ngúmlô 1Ô5 ngúml. Cem microlitros da mTPO diluído foram adicionados às células BaF3ÚMPL-zcytorl7. 0 volume de ensaio total é de 200 ml. Controlos negativos foram executados em paralelo utilizando meios livres de mIL-3 somenteô sem a adição de mTPO. As placas de ensaio foram incubadas a 37 "Cô 5 % de C02 durante 3 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumedô Chicagoô IL' foi adicionado a 20 mlúpoço. Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica com base na atividade de células de célulasô e é assim uma medida de direta proliferação celular em comparação com um controlo negativo. Placas foram incubadas de novo a 37 °Cô 5 % de C02 durante 24 horas. Placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvaleô CA' utilizando o programa SoftMax™ Proô a comprimentos de onda de 544 (Excitação' e 590 (Emissão'.

Os resultados confirmaram a capacidade de sinalização da porção intracelular do recetor zcytorl7ô como a proliferação induzida por trombopoietina a aproximadamente 9 “13 vezes sobre um fundo a concentrações de mTPO de 50 ngúml e superior.

Exemplo 7

Construção de Quimera de Polipéptido de Zcytorl7-mpl: Domínio Extracelular de Zcytorl7 Fusionado ao Domínio de Sinalização Intracelular Mpl e Domínio TM

Os domínios extracelulares do recetor zcytorl? são isolados de um plasmídeo contendo o recetor zcytorl7 usando PCR com iniciadores projetados para amplificar o domínio extracelular ou porção do mesmo de zcytorl? mostrado na SEQ ID NO: 1Ô SEQ ID NO:45Ô SEQ ID NO: 17 OU SEQ ID NO: 21 ou região correspondente da SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 56. Condições de reação preferidas são como se segue: 95 °C durante 1 min. ; 35 ciclos a 95 °C durante 1 min.ô 45 °C durante 1 min.ô 72 °C durante 2 min.; seguido de 72 °C a 10 min.; então uma imersão a 10 °C. O produto de PCR é executado numa agarose de ponto de fusão baixo a 1 ® (Boerhinger Mannheimô Indianápolisô EM' e o fragmento de recetor zcytorl? isolado usando kit de extração em gel Qiaquick™ (Qiagen' conforme as instruções do fabricante.

Os domínios intracelular e transmembrana de MPL são isolados de um plasmídeo contendo ADNc de recetor MPL (plasmídeo PHZ1ÚMPL' (Exemplo 5' usando PCR com iniciadores que vão da extremidade 30 do domínio extracelular d zcytorl7 e a extremidade 50 dos domínios intraceluàr e transmembrana de MPL e ZC17Ô206 (SEQ ID NO:33'. As condições de reação preferidas são executadas conforme acima. 0 produto de PCR é executado numa agarose de ponto de fusão baixo a 1 ® (Boerhinger Mannheim' e o fragmento de MPL de aproximadamente 450 pb isolado usando kit de extração em gel Qiaquick (Qiagen' conforme as instruções do fabricante.

Cada um dos fragmentos isolados descritos acima é misturado numa razão volumétrica 1:1 e usado numa reação de PCR usando o iniciador 50 usado para amplificar o dmínio extracelular de zcytorl7 e ZC17Ô2Q6 (SEQ NO:33' para criar uma quimera Zcytorl?- mpl. As condições de reação preferidas são como se segue: 95 °C durante 1 min.; 35 ciclos a 95 °C durante 1 min.ô 55 °C durante 1 min.ô 72 °C durante 2 min.; seguido de 72 °C a 10 min,; então uma imersão a 10 °C. Todo o produto de PCR é executado numa agarose de ponto de fusão baixo a 1 ® (Boehringer Mannheim' e um fragmento de quimera Zcytor!7-mpl de aproximadamente 1Ô2 kb isolado usando kit de extração em gel Qiaquick (Qiagen' conforme as instruções do fabricante. 0 fragmento de quimera zcytorl7-mpl é digerido como por exemploô EcoRI (ERL' e Xbal (Boerhinger Mannheim' conforme as instruções do fabricante. Toda a digestão é executada numa agarose de ponto de fusão baixo a 1 ® (Boehringer Mannheim' e a Quimera zcytorl7-mpl clivada isolada usando kit de extração em gel Qiaquick™ (Qiagen' conforme as instruções do fabricante. A quimera zcytorl7-mpl clivada resultante é inserida num vetor de expressão como descrito a seguir. 0 vetor de expressão pZP-5Z recebedor é digerido com EcoRI (BRL' e HindIII (BRL' conforme as instruções do fabricanteô e purificado em gel como descrito acima. Este fragmento de vetor é combinado com a quimera zcytorl7-mpl clivada por EcoRI e Xbal isolada acima e um fragmento de ligante XbalÚHindIII numa reação de ligação. A ligação é executada usando T4 Ligase (BRL'ô a 15 °C durante a noite. Uma amostra da ligação é submetida a eletroporação em células eletrocompetentes de E. coli DH10B ElectroMAX™ (25uFô 200QÔ 2Ô3V'. Os transformantes são plaqueados em placas de LB0 Ampicilina e colónias únicas rastreada por PCR para verificar a quimera zcytorl7-mpl usando um iniciador de domínio extracelular de zcytorl7 e ZC 17Ô206 (SEQ ID NO: 25' usando as condições de PCR como descrito acima. Confirmação da sequência de quimera zcytorl7-mpl é feita por análises de sequência.

Exemplo 8

Construção de Vetor de Expressão que Expressa zcytorl7: pZp7pXÚzcytorl7 de Comprimento Completo A. Clonagem de ADNc de zcytor!7 de Comprimento Completo para Expressão:

Para obter um ADNc de comprimento completoô produtos de PCR 50 e 30 foram isolados e unidos utilizandomulocal

PstI interno. Os iniciadores de PCR foram desenhados utilizando a sequência de nucleõtidos SEQ ID NO: 53 e incluem locais de restrição BamHI e Xho I para propósitos de clonagem.

Um produto de PCR 5' foi gerado utilizando uma biblioteca de ADNc WI-38 como um molde e oligonucleõtidos ZC29Ô359 (SEQ ID NO: 62' e ZC27Ô899 (SEQ ID NO: 19' como iniciadores. WI-38 é uma biblioteca de ADNc interna gerada a partir de uma linha de células embrionárias de pulmão humanas (ATCC CRL-2221'. Esta reação de PCR 5' foi executada como segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 2 minutosô depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reação de PCR utilizou aproximadamente 3 mg de plasmídeos preparados a partir da biblioteca de ADNcô 20 pmoles de cada oligonucleótidoô e cinco unidades de PWO ADN polimerase (Roche' . Aproximadamente 90 % do produto de PCR 5' foi precipitado com etanolô digerido com BamHI e PstI e purificado em gel num gel de agarose a 1Ô0 %. A banda de aproximadamente 600 pb foi cortada e utilizada para ligação ao vetor de clonagem pUC18 digerido com BamHI e PstI. Os transformant.es resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de zcytorl7. Para um destes transformantesô o ADN de plasmídeo foi preparado e digerido com BamHI e PstI. A banda de aproximadamente 600 pb resultante foi purificada por gel e utilizada para uma ligação abaixo para formar um ADNc de comprimento completo.

Um produto de PCR 3' foi gerado usando biblioteca de ADNc interna de testículos humanos como um molde e oligonucleõtidos ZC27Ô895 (SEQ ID NO: 64' e ZC29Ô122 (SEQ ID NO: 65' como iniciadores. Esta reação de PCR 3' foi executada como segue: 30 ciclos a 94° C durante 45 segundosô 65 ’C durante 45 segundosô 72 °C durante 2 minutosô depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. Toda a reação de PCR 3' foi purificada por gel num gel de agarose a 1Ô0 ® e a banda principal de 1500 pb foi cortada. Esta banda foi clonada no vetor PCRBIuntIITOPO utilizando o kit Zeroblunt TOPO (Invitrogen'. Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de zcytorl?. Para um destes transformantesô o ADN de plasmídeo foi preparado e digerido com PstI e Xhol. A banda resultante de aproximadamente 1500 pb foi purificada por gel. Uma ligação de três partes foi realizada com o fragmento 5' BamHI a Pst I anteriorô o fragmento 3' PstI a Xholô e o vetor de expressão pZp7pX digerido com BamHI e Xhol. Isto gerou um plasmídeo pZp7pX que contém um ADNc de comprimento completo para zcytorl7 (SEQ ID NO: 53'ô designado pZp7pÚzcytorl7. O ADNc de zcytorl7 de comprimento completo em pZp7pÚzcytorl7 tem mutações silenciosas que mudam o T para G na posição 1888 da SEQ ID NO: 53 (que codifica um resíduo Gly no resíduo 464 da SEQ ID NO: 54'. Como esta mutação é silenciosaô o ADNc de zcytorl7 em pZp7pÚzcytorl7 codifica o polipéptido como mostrado na SEQ ID NO: 54. Plasmídeo pZp7pX é um vetor de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor CMVô intrão A. múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantesô e um terminador de hormona de crescimento humano. 0 plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coliô uma unidade de expressão selecionãvel de mamífero que tem um promotor SV40Ô potenciador e origem de replicaçãoô um gene de resistência a puromicina e o terminador SV40.

Exemplo 9

Construção de Células para Avaliar a Proliferação Com Base em zcytorl7 em Ensaio de BAF3 Usando Alamar Blue A. Construção de Células BaF3 que Expressam Recetor zcytor!7-MPL

As células BaF3 que expressam o recetor zcytorl7-MPL são construídas conforme o Exemplo 6Aô usando 30 pg do vetor de expressão de zcytorl7ô descrito no Exemplo 7. As células BaF3 que expressam o plasmídeo de recetor pZP-5ZtJzcytorl7 são designadas como BaF3ÚZcytorl7-mpl. Estas células são usadas para rastrear uma atividade de zcytorl7 como descrito a seguir nos Exemplos 10 e 18. B. Construção de Células BaF3 que Expressam Recetor zcytorl7

As células BaF3 que expressam o recetor zcytorl7 de comprimento completo são construídas conforme o Exemplo 6Aô usando 30 pg do vetor de expressão de zcytor!7ô descrito no Exemplo 8. As células BaF3 que expressam o plasmídeo de recetor pZp7pÚzcytorl7 são designadas como BaF3Izcytorl7. Estas células são usadas para rastrear uma atividade de zcytorl7 como descrito a seguir nos Exemplos 10 e 18.

Exemplo 10

Rastreio para Atividade de zcytorl7 Usando Células

BaF3Úzcytorl7-MPL e Células Baf3Úzcytorl7 Usando um Ensaio de Proliferação com Alamar Blue

As células de quimera Baf3Úzcytorl7-mpl e células Baf3Úzcytorl7 (Exemplo 9' são precipitadas por centrifugação e lavadas independentemente em meios livres de mIL-3 (Exemplo 6'. As células são precipitadas por centrifugação e lavadas 3 vezes para garantir a remoção do mIL-3. As células são então contadas num hematocitómetro. As células são plaqueadas num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço usando os meios livres de mIL-3.

Para provar e identificar uma fonte para o ligando de zcytorl7ô aproximadamente 124 meios condicionados e amostras de uma variedade de linhas de células e tecidos são rastreados. 100 μΐ de cada amostra de meios condicionados é adicionado às células de quimera BaF3ÚMPL-zcytorl7 bem como as células Baf3Úzcytorl7. 0 volume total do ensaio é de 200 μΐ. Todas as citocinas conhecidas são também rastreadas numa concentração de cerca de 100 pgúml - 250 ngúml em ambas as linhas de células. Controlos negativos são executados em paralelo usando meios livres de mIL-3 somente. IL-3 de ratinho numa concentração de 250 pgúml é usado como um controlo positivo. As placas de ensaio são incubadas a 37 °Cô C02 a 5 ® durante 3 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumedô Chicagoô IL' é adicionado a 20 plúpoço. Alamar Blue dã uma leitura fluorométrica com base em número de células vivasô e é assim uma medição direta de proliferação celular em comparação a um controlo negativo. As placas são de novo incubadas a 37 °Cô C02 a 5 ® durante 24 horas. As placas são lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvaleô CA' usando o programa SoftMax™ Proô em comprimento de ondas 544 (Excitação' e 590 (Emissão'.

Os resultados que mostram proliferação na linha de célula de quimera Baf3Úzcytorl7-mpl ou na linha de célula Baf3Úzcytorl7 em resposta às amostras de meios condicionados ou os ligandos conhecidos identificam uma fonte para o ligandoô e sugerem que o recetor zcytorl7 pode sinalizar como um homodímeroô ou heterodimerizar ou multimerizar com um recetor presente nas células BaF3. Se nenhum sinal estiver presented o presente complexo de recetor-sinalização pode heterodimerizar ou multimerizar com uma outra subunidade de recetor não presente nas células BaF3. Veja-se exemplo 18 e Exemplol9 a seguir. Exemplo 11

Construção de Vetores de expressão de mamífero Que expressar Recetores solúveis de zcytor 17: zcytorl7CEEô zcytorl7CFLGô zcytorl7CHIS e zcytorl7-Fc4

A. Construção de Vetor de expressão de mamífero de zcytorl7 que contém zcytorl7CEEô zcytorl7CFLG e zcytorl7CHIS

Um vetor de expressão foi preparado para a expressão doô domínio extracelular solúvel do polipéptido de zcytorl7ô pZp9zcytorl7CEEô onde a construção foi desenhada para expressar um polipéptido de zcytorl7 compreendido da metionina de iniciação predita e adjacente truncado ao domínio transmerabrana preditoô e com uma etiqueta GLU-GLU C-terminal. (SEQ ID N4:34'.

Um produto de PCR de aproximadamente 1500 pb foi gerado utilizando ZC29Ô451 (SEQ ID NO: 66' e ZC29Ô124 (SEQ ID NO: 67' como iniciadores de PCR para adicionais locais de restrição EcoRI e BamHI. Uma biblioteca interna de ADNc HPVS humano foi utilizada como um molde e amplificação por PCR foi realizada como segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 1Ô5 minutos; depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reação de PCR foi precipitada com etanol e digerida com enzimas de restrição EcoRI e BamHI. 0 produto de PCR digerido foi purificado por gel num gel de agarose a 1Ô0 ® e a banda de aproximadamente 1500 pb foi cortada. Esta banda foi depois re-amplificada utilizando iniciadores idênticos com a seguinte ciclagem: 30 ciclos a 944 °C durante 1 minutoô 65 °C durante 1 minutoô 72 °C durante 3 minutosô depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reação de PCR foi precipitada com etanol e digerida com enzimas de restrição EcoRI e BamHI. 0 produto de PCR digerido foi purificado por gel num gel de agarose a 1Ô0 ® e a banda de aproximadamente 1500 pb foi cortada. 0 ADN cortado foi subclonado em plasmídeo CEEpZp9 que foi cortado com EcoRI e BamHIô para gerar plasmídeo com um recetor solúvel etiquetado no C terminal com GLU-GLU para zcytorl7ô zcytorl7CEEpZp9. 0 domínio extracelular no ADNc de zcytorl7CEE em zcytorl7CEEpZp9 tem uma mutação silenciosa que muda o T para C na posição 1705 da SEQ ID NO: 53 (que codifica um resíduo Pro no resíduo 403 da SEQ ID NO: 54'. Como esta mutação é silenciosaô o ADNc de zcytorl7 em zcytorl7CEEpZp9 codifica o polipéptido como mostrado na SEQ ID NO: 5. Além dissoô devido a construção utilizadaô um par de resíduos Gly-Ser é inserido C-terminal na extremidade do domínio extracelular solúvel de zcytorl7 e antes da Etiqueta C- terminal de Glu-Glu (SEQ ID NO: 32'. Como talô a etiqueta na terminação C do domínio extracelular de zcytorlVô foi uma etiqueta Glu-Glu modificada como mostrado na (SEQ ID NO: 91'. Plasmídeo CEEpZp9 é um vetor de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de metalotioneína-1 de ratinhoô múltiplos locais de restrição para inserção de sequências codificantesô e um terminador de hormona de crescimento humano, 0 plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coliô uma unidade de expressão de marcador detetável de mamífero que tem um promotor de SV40Ô potenciador e origem de replicaçãoô um gene DHFR e o terminador de SV40. Utilizando técnicas de biologia molecular padrão zcytor!7CEEpZp9 foi eletroporada em células DH10B competentes (GIBCO BRLô Gaithersburgô MD' de acordo com a orientação do fabricante e inoculada em placa em placas de LB que contém 100 pgúrnl de ampicilinaô e incubada durante a noite. Colónias foram rastreadas por análise de restriçãoô ou PCR de ADN preparado a partir de colónias individuais. A sequência de inserto de clones positivos foi verificada por meio de análise de sequência. Uma preparação de plasmídeo em larga escala foi feita utilizando um kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen' de acordo com instruções do fabricante. 0 mesmo processo é utilizado para preparar os recetores solúveis zcytorl? com uma etiqueta de His C-terminalô composta de 6 resíduos de His numa fila; e uma etiqueta C-terminal FLAG® (SEQ ID NO: 35'ô zcytorl7CFLAG. Para construir estas construçõesô o vetor mencionado anteriormente tem a etiqueta de HIS ou a etiqueta FLAG® em lugar da etiqueta glu-glu (SEQ ID NO: 34'. B. Construção de Expressão em Mamífero de Recetor zcytor!7 Humano Solúvel: zcytor!7-Fc4.

Um vetor de expressãoô pEZE-2 hzcytorl7ÚFc4ô foi preparado para expressar um Versão solúvel marcada com Fc4 na porção C-terminal de hzcytorl7 (zcytorl7 humano-Fc4' em células PF. CHO. As células PF CEO são uma linha de célula CEO interna adaptadas para crescimento em meio livre de proteína (meio ExCell 325 PF; JRH Biosciences'. A linha de célula CHO interna foi originalmente derivada de células CEO DG44 (G. Urlaubô J. Mitchellô E. Kasô L.A. Chasinô V.L. Funanageô T.T. Myoda e J.L. Hamlinô 0 The Effect of Gamma Rays at the Dihidrofolate Reductase Locus: Deletions e InversionsôH Somatic Cell and Molec. Genet.ô 12: 55-566 (1986'. Um fragmento de ADNc de zcytorl7 que inclui a sequência de polinucleótido do domínio extracelular do recetor zcytorl7 foi fusionado in frame à sequência de polinucleótido de Fc4 (SEQ ID NO: 36' para gerar uma fusão de zcytorl7-Fc4 (SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69'. 0 vetor pEZE-2 é um vetor de expressão de mamífero que contém a sequência de polinucleótido Fc4 e um local clonagem que permite a rápida construção de fusões de Fc4 C-terminal utilizando técnicas de biologia molecular padrão.

Um fragmento do par de base 156 6 foi gerado por meio de PCRô que contém o domínio extracelular de zcytorl7 humano e os primeiros dois aminoácidos de Fc4 (Glu e Pro' com locais Fsel e BglII codificado nas extremidades 50 e 30 ô respetivamente. Este fragmento de PCR foi gerad utilizando iniciadores ZC29Ô157 (SEQ ID NO: 70' e ZC29Ô150 (SEQ ID NO: 71' por meio de amplificação a partir de um plasmídeo que contém o domínio extracelular de zcytorl7 humano (pZp9zcytorl7CEE' (Exemplo 11A' . As condições de reação de PCR foram como segue: 25 ciclos a 94 °C durante 1 minutoô 60 °C durante 1 minutoô e 72 °C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos; seguido por uma imersão a 4 °C. O fragmento foi digerido com endonuleases de restrição Fsel e BglII e subsequentemente purificado por eletroforese em gel a 1 % e purificação da banda utilizando kit de extração por gel QiaQuick (Qiagen'. O ADN purificado resultante foi ligado durante 5 horas a temperatura ambiente num vetor pEZE-2 previamente digerido com Fsel e

BglII que contém Fc4 3' dos locais Fsel e BglII.

Dois μΐ da mistura de ligação foi eletroporada em 3 7 μΐ de E. coli DH10B eletrocompetente (Gibco' de acordo com as orientações do fabricante. As células transformadas foram diluídas em 400 ml de meios LB e inoculadas em placa em placas de LB que contém 100 mgúml de ampicilina. Os clones foram analisados por material digerido de restrição e os clones positivos foram enviados para sequenciamento de ADN para confirmar a sequência da construção de fusão. 1 ml de um clone positivo foi transformado em 37 μΐ de E. coli DH10B eletrocompetente e riscado numa placa de LBÚamp. Uma colónia individual foi colhida desta placa riscada para começar uma cultura de 250 ml de LBÚamp que foi depois crescida durante a noite a 3 7 °C com agitação a 250 rpm. Esta cultura foi utilizada para gerar 750 mg de ADN purificado utilizando um kit Qiagen plasmid Maxi (Qiagen'. Exemplo 12

Transfeção E Expressão De Polipéptidos de Recetor zcytorl7 Solúvel

As Células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314'Ô DG-44 CHOÔ OU outras células de mamífero são inoculados em placa a aproximadamente !Ô2 X 10s célulasúpoço (placa de 6 poços' em 800 ml de meios livres de soros apropriados (SF' (por exemploô DMEMô GibcolBRL High Glucose' (Gibco BRLô

Gaithersburgô MD' . As células são transfetadas com plasmídeos de expressão que contém zcytorl7CEEô zcytorl7CFLGô zcytorl7CHIS ou zcytorl7-Fc4 (Exemplo 8'ô utilizando Lipofectin™ (Gibco BRL'ô em meios livres de soro (SF' de acordo com instrução do fabricante. Clones individuais que expressam os recetores solúveis são isoladosô selecionados e crescidos em meios de cultura de célulaô e purificados utilizando técnicas padrão. A. Expressão em mamífero de recetor zcytorl7CEE humano solúvel Células 570 BHK (ATCC N° : CRL-10314' foram inoculadas em placa em balões de cultura de tecido T-75 e deixados que crescessem até aproximadamente 50 a 70 ® de confluência a 37 *C. 5 ® de C02ô em meios DMEMIFBS (DMEMô GibcoÚBRL High Glucoseô (Gibco BRLô Gaithersburgô MD'ô 5 ® de soro bovino fetalô 1 mM de L-glutamina (JRH Biosciencesô Leneaô KS'ô 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL''. As células foram depois transfetadas com o plasmídeo que contém zcytorl7CEE (Exemplo 11A' utilizando Lipofectamine™ (Gibco BRL'ô em formulação de meios livres de soro (SF' (DMEMô 10 mgúml de transferrinaô 5 mgúml de insulinaô 2 mgúml de fetuína; 1 ® de L-glutamina e 1 ® piruvato de sódio', Dez microgramas do ADN de plasmídeo pZp9zcytorl7CEE (Exemplo 8A' foram diluídos num tubo 15m' a um volume total final de 500 μΐ com meio SF. Cinquenta microlitros de Lipofectamine foram misturados com 450 μΐ de meio SF. A mistura de Lipofectamine foi adicionada à mistura de ADN e permitida que incubasse durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Quatro ml de meio SF foram adicionados à mistura de ADN:Lipofectamine. As células foram enxaguadas uma vez com 5 ml de meio SFô aspiradasô e a mistura de ADN:Lipofectamine foi adicionada. As células foram incubadas a 37 °C durante cinco horasô e depois 5 ml de meios DMEMÚ10 ® de FBS foram adicionados. 0 balão foi incubado a 37 °C durante a noite após cujo tempo as células foram divididas entre o meio de seleção (meios DMEMÚFBS de acima com a adição de 1 μΜ de metotrexato ou 10 μΜ Metotrexato (Sigma Chemical Co.ô St. Louisô Mo.' em placas de 150 mm a l:2ô l:10ô e 1:50. Aproximadamente 10 dias após a transfeçãoô uma placa de 150 mm de colónias resistentes a 1 μΜ de metotrexato foi tripsinizadaô as células foram agrupadasô e metade das células foram reinoculadas em placa em 10 μΜ de metotrexato; para amplificar adicionalmente a expressão da proteína zcytorl7CEE. Uma amostra meios condicionados deste agrupamento de células amplificadas foi testada para a níveis de expressão utilizando SDS-PAGE e análise de Western. B. Expressão em mamífero de recetor zcytorl7-Fc4 humano solúvel

Vinte mg de ADN de plasmídeo pEZE-2hzcytorl7Fc4 (Exemplo 11B' foram linearizados por meio de digestão de restrição com Fsplô uma enzima de restrição que corta uma vez dentro do vetor pEZE-2 e não interrompe os genes necessários para a expressão. 2 00 pg de ADN de salmão cisalhado foi adicionado como ADN portador e depois o ADN foi precipitado pela adição de Oôl volumes de 3 M de Acetato de sódio pH 5Ô2 e 2ô2 volumes de etanol seguido por um incubação em gelo de 15 minutos e microcentrifugação a 4 °C. 0 precipitado de ADN resultante foi lavado em etanol a 70 % e seco ao ar antes de ser ressuspenso em 100 ml de meios de crescimento não seletivo de PF CHO (21 gÚL de PF CHO Ex Cell 325 Ú200 mM de L-glutamina (Gibco'Ú100 mM de piruvato de sódio (Gibco'Úlx de suplemento HT (Gibco'. Cinco milhões de células de 43 passagens PF CHO foram adicionados ao ADN em 600 μΐ de Meios de crescimento não seletivos PF CHO e depois foram eletroporadas num sistema de eletroporação Gene Pulser II (BioRad' utilizando 1070 μΡ de capacitância e 380 volts utilizando uma cuveta de eletroporação Gene Pulser de 0Ô4 cm de lacuna (BioRad'. As células eletroporadas foram deixadas a recuperar durante 48 horas em meios de crescimento não seletivos antes da seleção em meios -HT (21 gÚL PF CHO Ex Cell 325Ú 200 mM de L-glutamina (Gibco'Ú100 mM de piruvato de sódio (Gibco'. As células foram selecionadas durante 5 dias em meios -HT antes de ser passadas a 5 x 105 ml em seleção de 50 nm de MTX. As células selecionadas em 50 nm de MTX foram semeadas a 6 X 105 célulasúml num frasco agitado para gerar meios condicionados. Os meios condicionados de 72 hora resultantes foram analisados sondando western blots com um anticorpo gerado contra Ig humana. As células produziram proteína hzcytorl7ÚFc4 a aproximadamente 1 mgÚL. C. Expressão em maior escala em mamífero de recetor zcytorl7-Fc4 humano solúvel

Duzentos pg de ADN de plasmídeo de pEZE-2hzcytorl7Fc4 (Exemplo 11B' foram linearizados por meio de digestão de restrição com Fsplô uma enzima de restrição que corta uma vez dentro do vetor pEZE-2 e não interrompe os genes necessários para a expressão. 200 mg de ADN genómico de CHO (preparados no laboratório' foram adicionados como ADN portador e depois o ADN foi precipitado pela adição de Oôl volumes de 3 M de Acetato de sódio pH 5Ô2 e 2Ô5 volumes de etanol seguido por microcentrifugação a temperatura ambiente. Cinco replicatas de sedimento de ADN foram preparados e transformados. 0 sedimento de ADN resultante foi lavado em etanol a 7 0 ® e seco ao ar antes de ser ressuspenso em 100 μΐ de meios de crescimento não seletivo PF CHO (21 gÚL PF CHO Ex Cell 325 Ú200 mM de L-glutamina (Gibco'Ú100 mM de piruvato de sódio (Gibco'Úlx de complemento HT (Gibco'. Dez milhões de células CHO PF foram adicionadas ao ADN em 600 μΐ de Meios de crescimento não seletivo PF CHO e depois foram eletroporadas num sistema de eletroporação Gene Pulser II (BioRad' utilizando 950 pF de capacitância e 300 volts utilizando uma cuveta de eletroporação Gene Pulser de 0Ô4 cm de lacuna (BioRad'. As células eletroporadas foram agrupadas e postas diretamente em seleção em meios -HT (21 gÚL PF CHO Ex Cell 325Ú 200 mM de L-glutamina (Gibco'Ú100 mM de piruvato de sódio (Gibco'. As células foram selecionadas durante 14 dias em meios -HT antes de ser passadas a 4 x 105Úml em seleção de 50 nm MTX. As células foram amplificadas a 200nNM MTN e depois a luM MTX. Os agrupamentos -HTô 50nMô e luM foram semeados a 1 x 106 ctJmi durante 48 horasô e os meios condicionados resultantes foram analisados sondando western blots com um anticorpo gerado contra Ig humana. C. Expressão transitória em mamífero e purificação de recetor zcytor!7-Fc4 humano solúvel ADN de plasmídeo pEZE-2hzcyt.orl7Fc4 (Exemplo 8B' foi introduzido em 40 maxi placas de células BHK utilizando Lipofectamine (Gibco BRL' como foi descrito no presente documento e nas instruções do fabricante. As células foram permitidas que se recuperassem durante a noiteô depois foram enxaguadas e realimentadas com meio livre de soro (SL7V4Ô preparado no laboratório'. Após 72 horasô os meios foram colhidos e filtradosô e as células foram realimentadas com meio livre de soro. Após 72 horasô os meios foram colhidos e filtrados de novo.

Os meios condicionados livres de soro (2 x 1Ô5 L lotes' de células BHK transfetadas de forma transitória foi bombeado numa coluna Proteína A-agarose de 1Ô5 ml em 20 mM de Trisô pH 7ô5ô 0Ô5 M de NaCl. A coluna foi lavada extensivamente com este tampão e depois a proteína ligada foi eluída com 1 ml de 0Ô2 M de glicinaô pH 2ô5ô 0Ô5 M de NaCl. A proteína eluída foi colhida em Oôl ml de 2 M de Trisô pH 8ô5.

As alíquotas foram colhidas para eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida e o zcytorl7-Fc bruto foi submetido a diálise durante a noite contra PBS. 0 recetor solúvel foi filtrado de forma estéril e colocado em alíquotas a -80 °C. Exemplo 13

Expressão de Recetor Solúvel zcytor!7 em E. coli A. Construção de vetor de expressão pCZR225 que expressa polipéptido de fusão huzcytorl7ÚMBP-6H

Foi construído um plasmídeo de expressão que continha um polinucleótido que codificava um recetor solúvel zcytorl7 fusionado na extremidade C a proteína de ligação a maltose (MBP' por meio de recombinação homóloga. 0 polipéptido de fusão contém uma parte de MBP de aproximadamente 388 aminoãcidos N-terminal fusionada a qualquer dos recetores solúveis zcytorl7 descritos no presente documento. Foi isolado um fragmento de ADNc de zcytorl7 (SEQ ID N0:1Ô SEQ ID NO:45Ô SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:21' utilizando PCR como é descrito no presente documento. Foram utilizados dois iniciadores na produção do fragmento de zcytorl? numa reação de PCR convencional: (1' um que contém aproximadamente 40 pb da sequência flanqueante do vetor e aproximadamente 25 pb correspondentes à extremidade amino do zcytorl7ô e (2' outro que contém aproximadamente 40 pb da extremidade 3' correspondente à sequência flanqueante do vetor e aproximadamente 25 pb correspondentes à extremidade carboxilo do zcytorl7. Dois μΐ da reação de PCR de 100 μΐ foram introduzidos num gel de agarose a 1Ô0 ® com tampão TBE 1 x para a anãliseô e o fragmento aproximadamente esperado foi observado. A reação de PCR restante foi combinada com o segundo tubo de PCR e foi precipitada com 400 μΐ de etanol absoluto. 0 ADN precipitado foi utilizado para a recombinação no vetor pTAP170 recetor cortado com Smal para produzir a construção que codificava a fusão M33P-zcytorl7 como é descrito a seguir.

Foi derivado o plasmídeo pTAP170 a partir dos plasmídeos pRS316 e pMAL-c2. 0 plasmídeo pRS316 foi um vetor transportador de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. e Sikorskiô R.ô Genetics 122:19-270 1989'. pMAL-C2 (NEB' foi um plasmídeo de expressão de E. coli. Porta o promotor tac que dirige MalE (gene que codifica MBP' seguido de um marcador Hisô um local de clivagem por trombinaô um local de clonagem e o terminador rmB. 0 vetor pTAP98 foi construído utilizando recombinação homóloga da levedura. Foram recombinados 100 ng de pMAL-c2 cortado com EcoRl com 1 μg de pRS3!6 cortado com Pvulô 1 μg de ligante e 1 μα de pRS316 cortado com ScalÚEcoRI foram combinados numa reação de PCR. Os produtos de PCR foram concentrados por meio de precipitação com etanol a 100 ®.

As células de levedura competentes (S. cerevisiae' foram combinadas com cerca de 10 μΐ de uma mistura que continha aproximadamente 1 μg do produto de PCR de recetor zcytorl? acimaô e 100 ng de vetor pTAP98 digerido com Srnalo e submetidas a eletroporação usando métodos padrão e plaqueadas em placas URA-D e incubadas a 30 °C.

Depois de cerca de 48 horasô os transformantes de levedura UralKI de somente uma placa foram selecionadsô foi isolado o ADN e foi utilizado para transformar células E. coli eletrocompetentes (por exemploô MC1061Ô Casadaban et. al. J. Mol. Biol. 138Ô 179-207' e são inoculados em placas com MMÚCA °AMP a 100 mgÚL (Pryor e Leitingô Protein Expression and Purification 10:309-3190 1997'ô utilizando métodos convencionais. As células são inoculadas em MMÚCA com 100 iugúml de Ampicilina durante duas horasô com agitação a 37 °C. 1 ml da cultura foi induzido com IPTG 1 mM. 2-4 horas depoisô os 250 μΐ de cada cultura foram misturados com 250 μΐ de pérolas de vidro lavadas com ácido e 250 μΐ de tampão Thomer com βΜΕ a 5 % e corante (ureia 8 Mô Tris 100 mM pH 7ô0ô glicerol a 10 %ô 2 mM de EDTAô SDS a 5 %'. As amostras foram submetidas a agitação com vórtex durante um minuto e foram aquecidas a 65 °C durante 10 minutos. Foram carregados 20 μΐ por pista num gel PAGE de 4 % a 12 % (NOVEX' . Os géis foram processados em tampão MES IX. Os clones positivos foram denominados pCZR225 e foram submetidos a análise de sequência.

Um microlitro de ADN de sequenciamento foi utilizado para transformar a estirpe BL21. As células foram submetidas a eletropulsos a 2Ô0 kVô 25 μΡ e 400 ohm. Depois da eletroporaçãoô 0Ô6 ml de MMÚCA com 100 μ9ύΐ de Ampicilina. As células foram crescidas em MMÚCA e foram induzidas com ITPG como foi descrito anteriormente. Os clones positivos foram utilizados para crescer com respeito à purificação de proteína da proteína de fusão huzcytorl7ÚMBP-6H utilizando técnicas convencionais. B. Purificação do recetor solúvel huzcytorl7ÚMBP-6H por fermentação de E. coli A menos que se indique outra cosaô todas as operações foram realizadas a 4 °C. 0 seguinte método foi utilizado para purificar o polipéptido recetor solúvel huzcytorl7ÚMBP-6H. Foram construídas células E. coli que continham a construção pCZR225 e que expressavam o recetor solúvel huzcytorl7ÚMBP-6H (Exemplo 13A' foram crescidas em SuperBroth II (12 gÚL de Casienô 24 gÚL Extrato de Leveduraô 11Ô4 gÚL de fosfato de di-potássioô 1Ô7 gÚL fosfato de Monopotãssio; Becton Dickensonô Cockeysvilleô MD0 ô e congeladas em 0Ô5 % de glicerol. Vinte grama das células congeladas em SuperBroth II 0 Glicerol foram usados para purificar a proteína. As células congeladas foram descongeladas e diluídas 1:10 numa solução de inibidor de protease (Tampão de extração' antes de lisar as células e libertar a proteína de recetor solúvel huzcytorl7ÚMBP-6H. As células diluídas continham concentrações finais de 20 mM Tris (JT Bakerô Philipsburgô NJ' 100 mM de Cloreto de Sódio (NaClô Mallinkrodtô Parisô KY'ô 0Ô5 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSFô Sigma Chemical Co.ô St. Louisô MO' ô 2 mgtJml de Leupeptin (Flukaô Suíça'ô e 2 mgúml de Aprotinin (Sigma'. Um sistema de quebra de célula French Press (Constant Systems Ltd.ô Warwickô UK' com temperatura de -7 a -10 °C e 30K PSI foi usado para lisar as células. As células diluídas foram verificadas quanto à quebra leituras ASOo antes e após o French Press. As células lisadas foram centrifugadas a 18.000G durante 45 minutos para remover os detritos de célula quebradaô e o sobrenadante usado para purificar a proteína.

Uma coluna de 25 ml de resina de amilose (New England Biolabsô Beverlyô MA' (preparada como descrito a seguir' foi deitada numa coluna de vidro Bio-Radô 2Ô5 cm D x 10 cm Η. A coluna foi empacotada e equilibrada por gravidade com 10 volumes de coluna (VC' de tampão de Equilíbrio de Amilose (20 mM de Trisô 100 mM de NaClô pH 8Ô0' . 0 sobrenadante foi carregado em lote à resina Amilose e foi sacudido durante a noite. A resina foi deitada de volta na coluna e foi lavada com 10 VC de Tampão de Equilíbrio de Amilose por gravidade. A coluna foi lavada para 10 VC com Tampão de Equilíbrio de Amiloseô então eluída com ~2 VC de Tampão de Equilíbrio de Amilose 0 10 mM de Maltose (Fluka Biochemicalô Suíça' por gravidade. Frações de 5 ml foram colhidas ao longo de toda a cromatografia e absorvância a 280 e 320 nM foi lida. A coluna de amilose foi regenerada com 1 VC de H20 destiladaô 5 VC de Oôl ® (púv' SDS (Sigma'ô 5 VC de H20 destiladaô e então 5 VC de Tampão de Equilíbrio de Amilose.

As frações de interesse foram agrupadas e dialisadas num Slide-A-Lyzer (Pierce' com 4 x 4 L de PBS pH 7Ô4 (Sigma' para remover contaminantes de baixo massa molecularô permuta de tampão e dessalinização. Após as alterações de PBSô o material colhido representou o polipéptido de huzcytorl7ÚMBP-6H purificado. 0 polipéptido huzcytorl7ÚMBP-6H purificado foi analisado via coloração de SDS-PAGE Coomassie e análises de Western blot com o anticorpo conjugado com HRP anti-coelho (Rocklandô Gilbertsvilleô PA'. A concentração do polipéptido huzcytorl7ÚMBP-6H foi 1Ô92 mgúml como determinado por análise de BCA. 0 polipéptido huzcytorl7ÚMBP-6H purificado foi preparado para injeção em coelhos e enviado a R &amp; R Research and Development (Stanwoodô WA' para produção de anticorpo. Os coelhos foram injetados para produzir anti soro anti-huzcytorl7ÚMBP- 6H (Exemplo 15ô a seguir'.

Exemplo 14

Recetor solúvel de zcytor!7 Anticorpo policlonals

Anticorpos policlonais foram preparados por meio de imunização de 2 coelhos brancos New Zealand fémeas com o polipéptido huzcytorl7ÚMBP-6H purificado (Exemplo 13'. Os coelhos sãoô cada umô administrados com uma injeção intraperitoneal inicial (IP' de 200 pg de proteína purificada em Adjuvante Completo de Freund (Pierceô

Rockfordô IL' seguido de injeções IP de reforço de 100 ug proteína purificada em Adjuvante Incompleto de Freund a cada três semanas. Sete a dez dias após a administração da terceira injeção de reforçoô os animais são sangrados e o soro é colhido. Os coelhos são então reforçados e sangrados a cada três semanas.

Os anticorpos policlonais específicos de zcytorl? são purificados por afinidade a partir do soro de coelho usando uma coluna de proteína CNBr-SEPHA- ROSE 4B (Pharmacia LKB' que é preparada usando cerca de 10 mg do polipéptido huzcytorl7ÚMBP-6H purificado por grama de CNBr-SEPHAROSEô seguido de 20X diãlise em PBS durante a noite. Anticorpos específicos de zcytorl7 caraterizam-se por uma verificação de titulação de ELISA usando 1 ugúml do antigénio proteico apropriado como um alvo de anticorpo. 0 limite inferior de deteção (LLD' dos anticorpos purificados por afinidade anti- zcytorl7 de coelho é determinado utilizando métodos padrão.

Exemplo 15

Anticorpos Monoclonais de recetor zcytorl7

Anticorpos monoclonais de recetor solúvel zcytorl7 preparados por imunização de ratinhos BalbC fêmea com as proteínas recombinantes solúveis zcytorl7 purificadas descritas no presente documento. Os ratinhos sãoô cada umô administrados com uma injeção intraperitoneal inicial (IP' de 20 ug de proteína purificada em Adjuvante Completo de Freund (Pierceô Rockfordô IL' seguido de injeções IP de reforço de 10 ug de proteína purificada em Adjuvante Incompleto de Freund a cada duas semanas. Sete a dez dias após a administração da terceira injeção de reforçoô os animais são sangrados e o soro é colhidoô e a titulação de anticorpo avaliada.

Os esplenócitos são colhidos a partir de ratinhos com títulos altos e fusionados com células murinas de mieloma SP2Ú0 usando PEG 1500 (Boerhinger Mannheimô UK' usando uma razão de fusão 4:1 de esplenócitos em relação a células de mieloma (Antibodies: A Laboratory Manualô E. Harlow e D. Laneô Cold Spring Harbor Press' . Em seguida a 10 dias de crescimento pós-fusãoô hibridomas que produzem anticorpo específico são identificados por ELISA usando proteína de recetor solúvel de zcytorl7 recombinante purificada (Exemplo 6C' como um alvo de anticorpo e por meio de FACS usando células BaF3 que expressam a sequência de zcytorl? (Exemplo 8' como um alvo de anticorpo. Os hibridomas resultantes positivos por ambos os métodos são clonados tres vezes por diluição limitativa.

Exemplo 16

Avaliando a Heterodimerização de Recetor zcytorl? Usando o Ensaio ORIGEN

Recetor zcytorl7 solúvel zcytorl7CFLAG (Exemplo 11'ô ou gpl30 (Hibiô M. et al.ô Cell 63:114 9-11570 1990' são biotinilados por reação com um excesso molar de cinco vezes de sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierceô Inc.ô Rockfordô IL' de acordo com o protocolo do fabricante. Recetor zcytorl? solúvel e uma outra subunidade de recetor solúvelô por exemploô solúvel gpl30ô LIFô IL-12Ô WSX-lô IL-7Ra (sIL-7Ra' ou recetor de IL-2-γ (sIL-2Rv' (R#D Systemsô Mineãpolisô MN'ô ou recetor zalphall solúvel (IL-21R; de propriedade comum com o Pedido de Patente US N° 09Ú404.641' são marcados com um excesso molar de cinco vezes de Ru-BPY-NHS (Igenô Inc.ô Gaithersburgô MD' de acordo com o protocolo do fabricante. As formas biotiniladas e Ru- BPY-NHS-marcadas do recetor zcytorl? solúvel podem ser respetivamente designadas recetor Bio- zcytor!7 e Ru- zcytorl7; as formas biotiniladas e Ru- BPY-NHS-marcadas da outra subunidade de recetor solúvel podem ser de igual modo designadas. Os ensaios podem ser levados a cabo usando meios condicionados a partir de células que expressam um ligando que se liga recetores heterodiméricos zcytorl7ô ou usando ligandos purificados. Ligandos oreferidos são aqueles que podem se ligar a recetores heterodiméricos de citocina de classe 1 tais comoô gpl30ô LIFô IL-12Ô IL-2Ô IL-4Ô IL-7Ô IL-9Ô IL-15ô Ligando zalphall (IL-21' (de propriedade comum com o Pedido de Patente US N° 09Ú522.217'ô TSLP (Levineô SD et al. o ibid. f Isakseno DE et aí, o ibid, ; Rayo RJ et a 1. ô ibid.; Friendô SL et al.ô ibid.'.

Para a caraterização de ligação a recetor inicial um painel de citocinas ou meio condicionado são testados para determinar se podem mediar a homodimerização de recetor zcytorl7 e se podem mediar a heterodimerização de recetor zcytorl7 com as subunidades de recetor solúvel descritas acima. Para fazer istoô 50 μΐ de meios condicionados ou TBS-B contendo citocina purificadaô é combinado com 50 μΐ de TBS-B (20 mM de Trisô 150 mM de NaClô 1 mgúml de BSAô pH 702' contendoô por exemploô 400 ngúml de recetor Ru- zcytorl7 e Bio-zcytorl7ô ou 400 ngúml de recetor Ru- zcytorl7 eô por exemploô Bio-gpl30ô ou 400 ngúml deô por exemploô Ru-IL2Ry e Bio-zcytorl7. Em seguida a incubação durante uma hora à temperatura ambienteô 30 pg de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina de 2ô8 mm (Dynalô Inc.ô Osloô Noruega' são adicionados e a reação incubada uma hora adicional à temperatura ambiente. 200 μΐ de tampão de ensaio ORIGEN (Igenô Inc.ô Gaithersburgô MD' é então adicionado e a extensão de associação de recetor medida usando um analisador M8 ORIGEN (Igenô Inc.'.

Exemplo 17

Construção para Gerar um Heterodímero de Recetor zcytorl?

Um vetor que expressa um heterodímero de zcytorl7 humano segregado é construído. Nesta construçãoô o domínio extracelular de ligação a citocina de zcytorl7 é fusionado à cadeia pesada de IgG gama 1 (IgGy 1' (SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:38'ô enquanto a porção extracelular da subunidade de recetor de citocina heteromérica (por exemploô um gpl30ô LIFô IL-12Ô WSX-lô ou componente recetor de IL-2 (IL-2Roíô IL-2Ri3ô IL-2Ry'ô um componentes de recetor de família de recetor IL-4ÚIL-13 (IL-4Raô IL- 13Raô IL-13Ra''ô subunidades de recetor de interleucina (por exemploô IL-15 Raô IL-7R0ÍÔ IL~9Ra'; ou recetor zalphall (IL-21R'' é fusionado a uma cadeia leve capa humana (cadeia leve κ humana' (SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:40' . A. Construção de vetores de fusão de IgG gama 1 e cadeia leve κ humana A cadeia pesada de IgGyl (SEQ ID NO:37' é clonada no vetor de expressão de mamíferos Zem229R (N° de depósito de ATCC 69447' tal que qualquer domínio extracelular de recetor de citocina desejado que tem um local 50 EoRI e 30 Nhel pode ser clonado como resultado de uma fusão de domínio extracelular N-terminal - IgGyl C-terminal. 0 fragmento IgGyl usado nesta construção é feito usando PCR para isolar a sequência de IgGyl de uma biblioteca de ADNc de Fígado hFetal da Clontech como um molde. Os produtos de PCR são purificados usando métodos descritos no presente documento e digeridos com MluI e EcoRI (Boerhinger-Mannheim'o precipitados com etanol e ligados com oligos ZC11Ô440 (SEQ ID N0:41' e ZC11Ô441 (SEQ ID NO:42'ô que compreendem um ligante MluIÚEcoRIô em Zem229R anteriormente digerido com e EcoRI usando técnicas de biologia molecular padrão reveladas no presente documento. A cadeia leve κ humana (SEQ ID NO: 39' é clonada no vetor de expressão de mamíferos Zem228R (N° de depósito de ATCC 69446' tal que qualquer domínio extracelular de recetor de citocina desejado que tem um local 50 EoRI e um local 30 Kpnl pode ser clonado como resultado de ua fusão domínio extracelular de citocina N-terminal - cadeia leve κ humana C-terminal. Como um local Kpnl está localizado dentro da sequência de cadeia leve κ humana (clivada pela enzima Kpnl após o nucleótido 62 na SEQ ID NO:39'ô um iniciador especial é projetado para clonar a extremidade 30 do domínio extracelular desejado de um recetor de citocina neste local Kpnl: 0 iniciador é projetado de modo que o produto de PCR resultante contém o domínio extracelular de recetor de citocina desejado com um segmento da cadeia leve k humana até o local Kpnl (SEQ ID NO:39'. Este iniciador preferentemente compreende uma porção de pelo menos 10 nucleótidos da extremidade 3' do domínio extracelular de recetor de citocina desejado fusionado em grelha 5' a SEQ ID NO: 39. 0 fragmento de cadeia leve κ humana usado nesta construção é feito usando PCR para isolar a sequência de cadeia leve κ humana da mesma biblioteca de ADNc de Fígado Fetal humano da Clontech usado acima. Os produtos de PCR são purificados usando métodos descritos no presente documento e digeridos com MluI e EcoRI (Boerhinger-Mannheim'o precipitados com etanol e ligados com o ligante MluIÚEcoRI descrito acimaô em Zem228R anteriormente digerido com e EcoRI usando técnicas de biologia molecular padrão reveladas no presente documento. B. Inserção de recetor zcytor!7 ou domínios extracelulares de subunidade heterodimérica em construções de vetor de fusão

Usando os vetores de construção acimaô uma construção que tem zcytorl7 fusionado a IgGvl é feita. Esta construção é feita por meio do PCR do domínio extracelular ou domínio de ligação a citocina de recetor zcytor!7 descrito no presente documento de um biblioteca de ADNc de próstata (Clontech' ou biblioteca de ADNc de linfócitos ativados usando métodos padrão (por exemploô Exemplo 7'ô e oligos que proporcionam locais de restrição EcoRI e Nhel. 0 produto de PCR resultante é digerido com EcoRI e Nhelô purificado em gelô como descrito no presente documentoô e ligado num Zem22gRUIgGylanteriormente EcoRI e Nhel digerido e purificado por banda descrito acima. 0 vetor resultante é sequenciado para confirmar que a fusão de zcytor!7ÚIgG gama 1 (zcytorl7ÚChl IgG' está correta.

Uma construção separada que tem um domínio extracelular de subunidade recetor de citocina heterodimérica fusionado à cadeia leve κ é também construída como acima. A construção de recetor de citocinaú cadeia leve κ humana é realizada como acima por meio de PCR deô por exemploô uma biblioteca de ADNc de linfócitos (Clontech' usando métodos padrãoô e oligos que proporcionam locais de restrição EcoRI e Kpnl. 0 produto de PCR resultante é digerido com EcoRI e Kpnl e então ligando este produto num vetor de Zem228RÚ cadeia leve κ humana anteriormente digerido com EcoRI e Kpnl e purificado por banda descrito acima. 0 vetor resultante é sequenciado para confirmar que a fusão de subunidade de recetor de citocina Ú cadeia leve κ humana está correta. D. Co-expressão do zcytorl7 e domínio extracelular de subunidade de recetor de citocina heterodimérica

Aproximadamente 15 pg de cada um dos vetores acimaô são co-transfetados em células de mamíferosô por exemploô células BHK-570 (N° de ATCC CRL-10314' usando reagente LipofectaminePlus™ (GibcoBRL'0 conforme as instruções do fabricante. As células transfetadas são selecionadas durante 10 dias em DMEM 0 5 % de FBS (GibcoBRL' contendo 1 μΜ de metotrexato (MTX' (Sigmaô St. Louisô MO' e 0Ô5 mgúml G418 (GibcoBRL' durante 10 dias. 0 grupo resultante de transfetantes é selecionado de novo em 10 pm de MTX e 0Ô5 mgúml de G418 durante 10 dias. 0 grupo resultante de células duplamente selecionadas é usado para gerar proteína. Três Factories (Nuncô Dinamarca' deste grupo são usados para gerar 10 L de meio condicionado livre de soro. Este meio condicionado é passado sobre uma coluna de proteína-A de 1 ml e eluído em cerca de 10Ô 750 frações de microtitulação. As frações que têm a concentração de proteína mais alta são agrupadas e dialisadas (10 kD MM de corte' contra PBS. Finalmente o material dialisado é submetido a análise de aminoácido (AAA' usando métodos de rotina.

Exemplo 18

Determinação de Subunidades de Recetor Que Heterodimerizam ou Muitimerizam Com Recetor zcytorl?

Usando métodos padrão descritos no presente documentoô as células de quimera BaF3ÚMPL-zcytorl? (Exemplo 6' são transfetadas com uma subunidade de recetor heterodimérico de citocina adicional que servem como um linha de célula de bioensaio para medir a resposta de transdução de sinal de complexos de recetor heterodimérico zcytorl7 ao repórter luciferase na presença de TPO (Exemplo 6'. Transfeção da linha de célula BaF3ÚMPL-zcytorl7 com uma fusão de MPL-recetor de citocina de classe I adicional que sinaliza na presença do ligando de TPOô determina que subunidades heterodiméricas de recetor de citocina são requeridas para sinalização de recetor zcytorl7, A utilização de fusões de MPL-recetor para este propósito alivia o requisito para a presença de um ligando natural para o recetor zcytorl7.

Fusões de MPL-recetor de citocina de classe I são feitas conforme o Exemplo 5 usando o domínio extracelular e domínios transmembrana do recetor MPL e o domínio de sinalização intracelular do recetor de citocina de classe I desejado. A linha de célula de bioensaio BaF3ÍJMPL-zcytorl7 co-transfetada com umas Fusões de MPL-recetor de citocina de classe I individuais conforme o Exemplo 6 para formar uma linha de célula de BaF3ÚMPL-zcytorl7ÚMPL-recet.or de citocina de classe I. Complexos de recetor incluemô mas não se limitam a recetor zcytorl7 em combinação com uma fusão de MPL-recetor de citocina que compreende um gpl30ô LIFô IL- 12ô ou componente de WSX-lô ou um ou mais dos componentes de recetor de IL-2 (IL-2Raô IL-2Rpô IL-2Ry'ô recetor zcytorl7 com um ou mais dos componentes de recetor de família de recetor de IL-4ÚIL-13 (IL-4Rqô IL-13Raô IL-13Ro;B ' ô bem como outros recetores de interleucina (por exemploô IL-15 Raô IL-7Raô IL-9Raô IL-21R (Recetor zalphall''. Cada linha de célula de complexo de recetor independente é então ensaiada na presença de TPO (exemplo 6' e a proliferação medida usando métodos de rotina (por exemploô ensaio de Alamar Blue como descrito no Exemplo 6'. A linha de célula de bioensaio BaF3ÚMPL-zcytorl7 serve como um controlo para a atividade de fundoô e é assim usado como uma linha de base para comparar a sinalização pelas várias combinações de complexo de recetor. Além dissoô o ensaio por meio do ensaio de repórter luciferase (ativação de transcrição de um gene repórter' pode também ser usado como uma maneira de medir a sinalização independente da indução de proliferação. Além dissoô uma linha de célula BaF3ÚMPL-recetor de citocina de classe I pode ser construída para controlar os efeitos de homodimerização de MPL-recetor de citocina de classe I para aqueles recetores de citocina de classe I conhecidos por sinalizar após a homodimerização. Espera-se que o TPO na presença do complexo de recetor corretoô aumente a proliferação da linha de célula BaF3ÚMPL-zcytorl7ÚMPL-recetor de citocina de classe I aproximadamente 5 vezes sobre o fundo ou mais na presença de TPO.

Exemplo 19

Reconstituição de Recetor zcytor!7 in vitro

Para identificar componentes envolvidos no complexo de zcytorl7-sinalizaçãoô estudos de reconstituição de recetor são realizados como se segue. Por exemploô as células BHK 570 (N° de ATCC CRL-10314' transfetadasô usando métodos padrão descritos no presente documentoô com um plasmídeo de vetor de expressão de repórter luciferase de mamíferos servem como uma linha de célula de bioensaio para medir a resposta de transdução de sinal de um complexo de recetor zcytorl7 transfetado ao repórter luciferase na presença de ligando de zcytor!7. As células BHK seriam usadas no evento de que as células BHK não expressem endogenamente o recetor zcytorl7. Outras linhas de células podem ser usadas. Um vetor de expressão repórter luciferase de mamíferos exemplar é o plasmídeo ΚΖ134 que é construído com oligonucleótidos complementares ZC12Ô749 (SEQ ID NO: 43' e ZC12Ô74S (SEQ ID NO: 44' que contêm elementos de ligação ao fator de transcrição STAT de 4 genes. Um elemento induzível c-fos Sis modificado (m67SIE ou hSIE' (Sadowskiô H. et al.ô Science 261: 1739-1744Ô 1993'ô o p21 SIE1 do gene p21 WAF1 (Chinô Eô et al.ô Science 272: 719-722Ô 1996'ô o elemento de resposta de glândula mamária do gene da β-caseína (Schmitt-Neyô M. et al.ô Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755Ô 1991'ô e um elemento induzível STAT do gene Fcg RIô (Seidelô H. et al.ô Proc. NatL Acad. Sei. 92:3041-30450 1995'. Estes oligonucleótidos contêm extremidades compatíveis com Asp718-XhoI e são ligadosô utilizando métodos convencionaisô a um vetor indicador de luciferase de pirilampo recetor com um promotor de c-Fos (Poulsenô LK. et al.ô J. Biol. Chem. 273: 6229-6232Ô 1998' digerido com as mesmas enzimas e que continha um marcador de seleção de neomicina. 0 plasmídeo KZ134 é utilizado para transfetar de forma estável células BaF3ô ou BHKô utilizando métodos de transfeção e seleção padrão para obter a linha celular BaF3tJKZ134 ou BHKÚKZ134 respetivamente. A linha de célula de bioensaio é transfetada com recetor zcytorl7 em separadoô ou co-transfetada com recetor zcytorl7 juntamente com uma de uma variedade de outra subunidades de recetor conhecidas. Os complexos de recetor incluemô mas não se limitam a recetor zcytorl7 somenteô várias combinações de recetor zcytorl7 com gpl30ô LIFô IL-12ô ou WSX-1 subunidades de recetorô ou um ou mais dos componentes de recetor de IL-2 (IL-2Raô IL-2R3ô IL-2Ry'ô recetor zcytorl7 com um ou mais dos componentes de recetor de família de recetor de IL-4ÚIL-13 (IL-4Roíô IL-13Raô IL-13Rcx0 'ô bem como outros recetores de interleucina (por exemploô IL-15 Raô IL-7Raô IL-9Raô IL-21R (zalphall''. Cada linha de célula de complexo de recetor independente é então ensaiada na presença de meios condicionados com citocina ou citocinas purificadas e a atividade de luciferase medida usando métodos de rotina. A linha de célula de bioensaio não transfetada serve como um controlo para a atividade de luciferase de fundoô e é assim usada como uma linha de base para comparar a sinalização pelas várias combinações de complexo de recetor. Espera-se que o meio condicionado ou citocina que se liga ao recetor zcytorl7 na presença do complexo de recetor corretoô dê uma leitura de luciferase de aproximadamente 5 vezes sobre o fundo ou mais.

Como uma alternativaô um ensaio similar pode ser realizado em que as linhas de células Baf3Úzcytorl7-mpl e Baf3Úzcytorl7 (Exemplo 10' são co-transfetadas como descrito acima e a proliferação medida.

Exemplo 20

Construção de Células BaF3 que expressam Zcytorl7 de comprimento completo

BaF3ô uma linha de célula pré-linfoide dependente de interleucina-3 (IL-3' derivada de medula óssea murina (Palacios e Steinmetzô Cell 41: 727-734Ô 1985; Mathey-

Prevot et al.ô Mol. Cell. Biol. 6.: 4133-4135Ô 1986'ô foi mantida em meios completos (meio RPMI (JRH Bioscience Inc.ô Lenexaô KS' suplementado com soro inativado por calor de vitelo fetal a 10 %ô 2 ngúml de IL-3 murina (mIL-3' (R 0 Dô Mineápolisô MN'ô 2 mM de L-glutamina (Gibco-BRL'ô e 1 mM de piruvato de sódio (Gibco- BRL'.

As células BaF3 para eletroporação foram lavadas duas vezes em PBSô pH 7ô2 (Gibco-BRL' e então ressuspensas em PBS e uma densidade celular de 107 célulasúml. Um ml de células BaF3 ressuspensas foi misturado com 30 pg do ADN de plasmídeo pZP7PXÚzcytorl7 e transferido para separar câmaras de eletroporação descartáveis (Gibco-BRL'. Deram-se às célulasô em seguidaô 2 choques em série (800 iFadÍJ300V. ; 1180 lFadÚ3Q0V.' entregues por um aparelho de eletroporação (CELL-PORATOR™; Gibco-BRL'. As células submetidas a eletroporação foram então transferidas a 20 mis de meios completos e colocadas num incubador durante 48 horas (37 °Cô C02 a 5 ®' . As células foram então precipitadas por centrifugação e ressuspensas em 20 mis de meios completos contendo 2 pgúml de Puromicina (ClonTech' Seleção num T75 balão para isolar o grupo resistente à puromicina. Linhas clonais de células BaF3 transfetadasô a seguir no presente documento chamadas células BaF3Úzcytorl7ô foram isoladas como descrito a seguir.

As células BaF3Úzcytorl7 foram contadas num hemocitõmetroô e plaqueadas a 1 célulaúpoçoô 0Ô5 célulatJpoçoô Oôl célulaúpoçoô e 0Ô01 célulaúpoçoô num volume de 100 mlúpoço em meios completos contendo 2 pglJml de Puromicina. 15 clones foram graduados a balões T75Ô e 5 clones foram ensaiados para produção de ARN. As células foram lavadas uma vez com PBS e contadas com um hemocitõmetro. 5 x 106 células foram precipitadas por centrifugação e os meios removidos. As células não transfetadas BaF3 foram também contadas e precipitadas. Quatro dos péletes foram congelados a -80 °C durante a noite. ARN foi isolado usando o Kit de Isolamento de ARN Total S.N.A.P.™ (Invitrogen' conforme as instruções do fabricanteô e o rendimento de ARN total foi determinado por espetrofotómetro. A quantidade de ARN de zcytorl7 foi então determinada por RT-PCR usando o Kit RT-PCR (Stratagene' conforme as instruções do fabricanteô usando iniciadores específicos de zcytorl7 ZC29Ô180 (SEQ ID NO:72' e ZC29Ô122 (SEQ ID NO:65' . Um clone que deu uma forte banda de ARN de zcytorl7 foi selecionado para utilização em ensaios de proliferação BaF3 Alamar Blue (Exemplo 6' para testar ligandos potenciais.

Exemplo 21

Clonagem de zcytoR17 de Ratinho De uma Biblioteca de ADNc de Testículos de Ratinho

Rastreou-se uma biblioteca de ADNc de testículo de ratinho com respeito a um clone de comprimento completo de zcytoRl? de ratinho. A biblioteca foi inoculada em placa a 65.500 ufcúplaca em 24 placas de LB 0 Amp. Prepararam-se elevações de filtro utilizando Hybond N (Amersham-Pharmacia Biotechô Inc.ô Piscatawayô NJ' sobre um total de aproximadamente 1Ô6 milhões de colónias. Os filtros foram marcados com uma agulha quente para a orientação e depois desnaturalizados durante 6 minutos em NaOH 0Ô5 M e Tris-HCl 1Ô5 Mô pH 7ô2. Os filtros depois foram neutralizados em NaCl !Ô5 M e Tris-HCl 0Ô5 Mô pH 7Ô2 durante 6 minutos. 0 ADN foi fixo aos filtros utilizando um agente de entrecruzamento UV (Strat.alinker®ô Stratageneô A Jollaô CA' a 1200 joules. Os filtros depois foram deixados secar durante a noite a temperatura ambiente.

Ao dia seguinteô os filtros foram pré-lavados a 65 °C em tampão de pré-lavagem que consistia em SSC 0Ô25XÔ SDS a 0Ô25 % e EDTA 1 mM. Os detritos celulares foram retirados manualmente utilizando Kimwipes® (Kimberly-Clark' e a solução foi mudada 3 vezes durante um período de 1 hora. Os filtros foram secos ao ar e armazenados a temperatura ambiente até serem necessários. Os filtros depois foram pré-hibridados durante aproximadamente 3 horas a 63 0C em 20 ml de solução de hibridação ExpressHyb™ (Clontechô Paio Altoô CA'. A sonda B (Exemplo 3C' foi gerada por PCR a partir de molde de zcytoRl? humano utilizando iniciadores oligonucleotídicos ZC27Ô895 (SEQ ID NO: 64' e ZC28Ô917 (SEQ ID NO: 73' e marcada radiativamente com 32P utilizando um kit disponível comercialmente (Megaprime DNA Labeling System; Amersham Pharmacia Biotechô Piscatawayô NJ' de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada utilizando uma coluna de pressão Stratagene™ (coluna NucTrap®; Stratageneô A Jollaô CA'. A sonda foi desnaturada a 100 °C durante 15 min e adicionada a ExpressHyb™. Os filtros foram hibridados em 15 ml de solução de hibridação que continha 1Ô6 x 10b cpmúml de sonda a 63 °C durante a noite. Os filtros foram lavados a 55 °C em SSC 2Xô SDS a Oôl ® e EDTA 1 mM e expostos a uma película de raios X a -80 °C durante 4 dias e meio. Colheram-se 13 positivos das placas como blocos e colocaram-se em 1 ml de LB 0 amp em tubos de 1Ô7 ml. Os tubos foram colocados a 4 °C durante a noite. Estes 13 positivos foram submetidos a duas rondas mais de purificação. As placas terciárias foram cultivadas a 37 °Cô depois realizaram-se elevações de filtro e colheram-se colónias individuais e enviaram-se ao sequenciamento. Determinou-se que três destas continham a sequência do ortõlogo de ratinho de zcytoR17.

Além dissoô gerou-se um produto de PCR utilizando ADNc de CTLL-2 como molde e oligonucleótidos ZC38Ô239 (SEQ ID NO: 88) e ZC38Ô245 (SEQ ID MO: 89) como iniciadores. CTLL-2 é uma linha celular de linfõcitos T citotóxicos de ratinho (ATCC N° TIB-214) . Esta reação de PCR realizou-se como é indicado a seguir: um ciclo a 95 °C durante 1 minutoô 30 ciclos a 95 °C durante 15 segundosô 68 °C durante 3 minutosô e depois 68 °C durante 10 minutos; imersão a 4 °C. A reação de PCR utilizou aproximadamente 0Ô5 ng de ADNcô 20 pmol de cada oligonucleótido e 1 μΐ de mistura de polimerase Advantage II (ClonTech). Aproximadamente 6 ® do produto de PCR foram utilizados como molde numa nova reação de PCRô como foi indicado anteriormenteô com a exceção de que se utilizaram os oligonucleótidos ZC38Ô239 (SEQ ID NO: 88) e ZC3SÔ238 (SEQ ID NO: 90). Esta reação de PCR realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 94 °C durante 45 segundosô 65 °C durante 45 segundosô 72 °C durante 1 minutoô e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A maior parte da reação de PCR foi carregada num gel de agarose a 1Ô0 ® e excisou-se a banda predominante a aproximadamente 360 pbô eluiu-se o fragmento de ADN e realizou-se o sequenciamento de ADN. A sequência do polinucleótido zcytorl7 de ratinho é mostrada na SEQ ID NO: 56 e a sequência de aminoãcidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 57. Além dissoô é mostrada uma forma solúvel truncada do polinucleótido zcytorl? de ratinho na SEQ ID NO: 92 e a sequência de aminoãcidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 93. Exemplo 22

Distribuição De tecido de zcytor!7 humano em Painéis de Tecidos Utilizando PCR

Um painel de ADNc de tecidos murinos foi rastreado com respeito à expressão de zcytorl7 de ratinho utilizando PCR. 0 painel foi realizado internamente e continha 94 ADNc marathon e amostras de ADNc de diversas linhas celulares e tecidos murinos normais e cancerosos como é mostrado no Quadro 7 proporcionado a seguir. Os ADNc procediam de bibliotecas internas ou ADNc marathon de preps de ARM internasô ARN Clontech ou ARN de Invitrogen. Os ADNc marathon de ratinho foram fabricados utilizando o kit marathon Ready™ (Clontechô Paio Altoô CA' e foram ensaiadas QC com iniciadores de recetor de transferrina de ratinho ZC10Ô651 (SEQ ID NO: 79' e ZC10Ô565 (SEQ ID NO: 80' e depois foram diluídos com base na intensidade da banda de transferrina. Para garantir a qualidade das amostras de biblioteca amplificadas no painelô foram realizadas três ensaios de controlo de qualidade (QC': (1' para avaliar a qualidade do ARN utilizado para as bibliotecasô os ADNc internos foram ensaiados com respeito ao tamanho médio do inserto por PCR com oligos do vetor que eram específicos para as sequências de vetor para uma biblioteca de ADNc individual; (20 a padronização da concentração do MNc nas amostras do painel foi conseguida utilizando métodos de PCR convencionais para amplificar a alfa tubulina de comprimento completo ou o ADNc de G3PDH utilizando um oligo de vetor 50 : ZC14ÔQ63 (SEQ ID NO: 7' e um iniciador de oligo específico de alfa tubulina 3' ZC17Ô574 (SEQ ID NO: 26' ou iniciador de oligo específico de G3PDH 30 ZC7Ô600 (SEQ ID NO: 27'; e (3' foi enviado uma amostra a sequenciamento para verificar a possível contaminação do ADN ribossómico ou mitocondrial. 0 painel foi estabelecido num formato de 96 poços que incluía uma amostra de controlo positiva para ADN genómico de ratinho (Clontechô Paio Altoô CA' . Cada poço continha aproximadamente 0Ô2-100 pgt^l de ADNc. A PCR foi preparada utilizando oligos ZC3SÔ065 (SEQ ID NO: 77' e ZC3 8Ô06 8 (SEQ ID NO: 78'Ô TaKaRa Ex Taq™ (TAKARA Shuzo Co LTDô Biomedicals Groupô Japão'ô e corante Rediload (Resejarch Geneticsô Inc.ô Huntsvilleô AO'. A amplificação foi realizada como segue: 1 ciclo a 94 °C durante 5 minutos; 5 ciclos de 94 °C durante 30 segundosô 6 8 °C durante 3 0 segundos; 3 5 ciclos de 94 °C durante 3 0 segundosô 56 °C durante 3 0 segundos e 72 °C durante 30 segundosô seguido de 1 ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Aproximadamente 10 μΐ do produto de reação de PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose convencional utilizando um gel de agarose a 4 ®. 0 tamanho correto do fragmento de ADN previsto foi observado em cérebroô células CD90°ô dendríticasô embriõesô MEWt#2ô linha celular de próstata Tuvakô glândula salivarô pele e testículo. 0 fragmento de ADN para pele e testículo foi cortado e purificado utilizando um Kit de Extração de Gel (Qiagenô Chatsworthô CA' de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos foram confirmados por sequenciamento para demostrar que efetivamente eram zcytorl7 de ratinho.***

Quadro 7

Exemplo 23

Expressão de zcytorl? em Diversos Tecidos Utilizando RTÚPCR Quantitativa em Tempo Real A. Iniciadores e Sondas para RT-PCR Quantitativa

Previamente foi descrito a RT-PCR quantitativa em tempo real utilizando o Sistema de Deteção de Sequência ABI PRISM 7900 (PE Applied Biosystemsô Inc.ô Foster Cityô CA' (Veja-seô Heidô C.A. et al.ô Genome Resejarch 6:986-9940 1996; Gibsonô OU.E.M. et al.ô Genome Resejarch 6:995-10010 1996; Sundaresanô S. et al.ô Endocrinology 139:4756-47640 1998'. Este método incorpora o uso de uma sonda específica de gene que contém corantes fluorescentes indicadores e inativadores. Quando a sonda está intactaô a emissão de corante indicador é anulada devido à proximidade do corante inativador. Durante a extensão de PCR utilizando iniciadores diretos e inversos específicos de genes adicionaisô a sonda é cortada pela atividade nuclease 50 da Taq polimerase que liberta o corante indicador da sonda dando como resultado um aumento na emissão de fluorescência.

Os iniciadores e sondas utilizados para as análises de RT-PCR quantitativa em tempo real da expressão de Zcytorl7 foram desenhados utilizando o software de desenho de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystemsô Foster Cityô CA'. Foram desenhados iniciadores para Zcytorl7 humano que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a amplificação do ADN genómico. 0 iniciador diretoô ZC37Ô877 (SEQ ID NO: 81' e o iniciador reversoô ZC37Ô876 (SEQ ID NO: 82' foram utilizados numa reação de PCR (a seguir' a uma concentração de cerca de 300 nM para sintetizar um produto de 73 pb. A sonda Zcytorl7TaqMan® correspondenteô denominada ZC37Ô776 (SEQ ID NO: 83' foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems. A sonda ZC37Ô776 (SEQ ID NO: 55' foi marcada na extremidade 50 com um coranfe

fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína' (FAM' (PE

Applied Biosystems' e na extremidade 30 com um corate indicador fluorescente (6-carboxi-tetrametilrodamina' (TAMRA' (PE Applied Biosystems'.

Como controlo para ensaiar a integridade e qualidade das amostras de ARM ensaiadasô todas as amostras de ARM (a seguir' foram rastreadas com respeito ao ARNr usando um conjunto de iniciador e sonda pedidas a PE Applied Biosystems (n° de catálogo 4304483', 0 kit contém o iniciador direto de ARNr (SEQ ID NO:84'ô o iniciador indireto de ARNr (SEQ ID NO:85'ô e a sonda TaqMan® de ARNr (SEQ ID NO:86'. A sonda de ARNr foi marcada na extremidade 5(3 com um corante fluorescente indicador VIC (PE Aplied Biosystems' e na extremidade 30 com o corante fluoescente inativador TAMRA (PE Applied Biosystems', Os resultados do ARNr também servem como controlo endógeno e permitem a normalização dos resultados de expressão de ARNm de Zcytorl7 vistos nas amostras de ensaio.

Foi colhido o sangue de vários dadores an0 nimos eas PBMC isoladas. Vários subconjuntos de células imunes (CD3°ô CD4°ô CD8°ô CD14 °ô CD19°ô CD4 5RAÔ CD45RO e CD560 ' foram depois isolados utilizando microesferas e o sistema de separação celular magnética da Miltenyi Biotec. 0 ARN foi preparado a partir de todas as populações CD45RAÔ CD45RO e CD560 em seu estado de repouso usando um Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagenô Valenciaô CA' de acordo com as instruções do fabricante. As populações de CD3°ô CD4° e CDS0 foram ativadas utilizando 200 ng/ml de anticorpo anti-CD3 ligado a placa e 5 ug/ml de anticorpo anti-CD28 solúvel e as células foram colhidas para isolamento de ARN a Oô 4 e 16 horas. As amostras de CD190 foram isoladas a partir de amígdalas humanas e ativadas com 0Ô5 ug/ml de ionomicina e 10 ng/ml de PMA. As células foram então colhidas a Oô 4 horas e 24 horas e o ARN isolado. Os monõcitos CD140 humanos foram ativados com Oôl ug/ml de LPS ou 1Ô0 ug/ml de LPS durante 20 horas. As células em repouso e ativadas foram então colhidas e o ARM isolado. Além dissoô o ARN foi isolado das linhas de células de monócitos humanos em repouso e ativadas (10Ô0 ugúml de LPS' HL-60Ô THP-1 (N° de ATCC TIB-202' e U937. 0 ARN de THP-1 foi usado como controlo porque foi mostrou expressar Zcytorl7 por Northern Blot (Exemplo 3'. B, rt-PCR quantitativo em Tempo Real

Os níveis relativos de ARNm de Zcytorl7 foram determinados através da análise de amostras de ARN total utilizando o método de RT-PCR de uma só etapa (PE Applied Biosystems'. 0 ARN total das células THP-1 que expressam Zcytorl7 foi isolado por métodos padrão e usado para gerar uma curva padrão utilizada para quantificação. A curva consistiu em diluições em série de 10 vezes variando de 0Ô25-0Ô00025 ngúpl para o rastreio de ARNr e 250-0Ô25 ngúpl para o rastreio de Zcytorl7 com cada ponto da curva padrão analisado em triplicado. As amostras de ARN total das células humanas também foram analisadas em triplicado para os níveis de transcritos de Zcytorl7 humanos e para os níveis de ARNr como um controlo endógeno. Num volume total de 2 5 μΐο cada amostra de ARN foi submetida a uma reação RT-PCR de uma só etapa contendo: cerca de 50 ng de ARN total em tampão A (50 mM de KClô 10 mM de Tris-HCl' ; o corante padrão internoô carboxi-x-rodamina (ROX''; iniciadores apropriados (cerca de 50 nM de iniciadores de ARNr (SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 85' para as amostras de ARNrô e cerca de 300 nM de iniciadores de ZC37Ô877 (SEQ ID NO: 81' e ZC22Ô276 (SEQ ID NO: 87' para as amostras Zcytorl7'; a sonda adequada (aproximadamente 50 nM de sonda TaqMan® de ARNr (SEQ ID NO: 86' para amostras de ARNrô aproximadamente 100 nM de sonda de ZG37Ô776 (SEQ ID NO: 83' para amostras de Zcytorl7'; 5Ô5 mM de MgCl2; 300 μΜ de cada d-CTPô d-ATPô e d-GTP e 600 μΜ de d-UTP; transcriptase reversa de MuLV (0Ô25 υύμΐ'; polimerase de ADN AmpliTaq™ Gold (0Ô025 υύμΐ' (PE Applied Biosystems'; e Inibidor de ARNase (0Ô4 υύμΐ' (PE Applied Biosystems'. PCR thermal cycling condições foram como se segue: As condições de ciclagem térmica de PCR foram como se segue: uma etapa de transcrição reversa (TR' inicial de um ciclo a 48 °C durante 30 minutos; seguido de uma etapa de ativação com AmpliTaq Gold™ (PE Applied Biosystems' de um ciclo a 95 °C durante 10 minutos; seguido de 40 ciclos de amplificação a 95 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 1 minuto.

Os níveis de ARN de Zcytor!7 relativos foram determinados usando o método de curva padrãoô como descrito pelo fabricanteô PE Biosystems (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection Systemô Relative Quantitation of Gene Expressionô 11 de Dezembro de 1997'. As medições de ARNr foram usadas para normalizar os níveis de Zcytorl7. Três experiências foram feitas com o teste mencionado anteriormente. Os dados mostrados nos Quadros 8 e 9 a seguir são expressos como uma razão de ARNm em relação a ARNr de Zcytorl7.

Quadro 8

Quadro 9

Embora tenha havido alguma expressão de mensagem de Zcytorl7 em células B CD190 em repouso a partir do sangue periféricoô tanto as células B CD190 em repouso e ativadas isoladas a partir de amígdala humana mostraram apenas expressão mínima. As células T de memória em repouso (CD4 5R0'ô células T naive (CD45RA' e células NK (CD560 ' todas apresentaram resultados negativos para a mensagem de Zcytorl7, No entantoô nas células T CD3°ô a mensagem de Zcytorl7 sofreu uma regulação positiva dramática a uma razão de cerca de 0Ô72 após uma ativação de 4 horas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. A razãoô em seguidaô desceu para 0Ô51 em 16 horas de pós-ativação. Antes da ativaçãoô nenhum ARNm de Zcytorl7 foi detetado em células T CD3 0 em repouso.

Os resultados revelaram que Zcytorl7 não estava presente em níveis apreciáveis em subconjuntos de células T CD8° ou CD40 em repouso. Após uma ativação 4 horas com anticorpos anti-CD28 e anti-CD3ô parece haver uma regulação positiva substancial de mensagem de Zcytorl7 produzida em ambos os subconjuntos de células T CD4° e CD8°. Em 16 horas pós-ativaçãoô o ARNm de Zcytorl7 tinha diminuído para 0Ô41 em células T CD4° e 0Ô13 em células T CD8°.

Havia uma expressão extremamente elevada de mensagem de Zcytorl7 em ambas as linhas celulares de monócitos THP-1 e U937 em repouso e ativadas. As células de U937 ativadas têm o maior nível de expressão. As células de HL-6 0Ô uma linha celular de monócitos pré-diferenciadaô mostraram uma diminuição na expressão de ARNm de Zcytorl7 após ativação. Estes resultados apoiam os resultados de expressão feitos por Northern blot (Exemplo 2'. Havia muito pouca expressão de mensagem de Zcyt.orl7 em monócitos CD140 primários ambos repouso e ativados com 1Ô0 ugúml e Oôl ugúml de LPS. A partir do expostoô será apreciado queô embora as formas de realização específicas da invenção tenham sido descritas no presente documento para efeitos de ilustraçãoô várias modificações podem ser feitas.

Consequentementeô a invenção não é limitada exceto pelas reivindicações anexas.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> ZymoGeneticsô Inc. <120> RECETOR DE CITOCINA ZCYT0R17

<130> 00-42PC <150> US 60Ú214.282 <151> 26-06-2000 <150> US 60Ú214.955 <151> 29-06-2000 <150> US 60Ú267.963 <151> 02-08-2001 <160> 93 <170> FastSEQ para Windows Versão 3.0

<210> 1 <211> 2402 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

< 2 21> CDS <222> (171' . . . (2366' <400> 1 ggcacgaggt gtgtgtgcag tatgaaaatt gagacaggaa ggcagagtgt cagcttgttc 60 cacctcagct gggaatgtgc atcaggcaac tcaagttttt caccacggca tgtgtctgtg 120 aatgtccgca aaacattctc tctccccagc cttcatgtgt taacctgggg atg atg 176

Met Met 1 tgg acc tgg gca ctg tgg atg etc ccc tea etc tgc aaa ttc age ctg 224

Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu 5 10 15 gca get ctg cca get aag cct gag aae att tee tgt gtc tac tac tat 272

Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr 20 25 30 agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat 320

Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr 35 40 45 50 acc cag tac aca gtt aag aga act tac get ttt gga gaa aaa cat gat 368

Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp 55 60 65 aat tgt aca acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt get teg tgc tet 416

Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser 70 75 80 ttt ttc ett cca aga ata aeg ate cca gat aat tat acc att gag gtg 464

Phe Phe Leu Pro Arg lie Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr He Glu Val 85 90 95 gaa get gaa aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg 512

Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr Tyr Trp 100 105 110 aga tta gag aac ata geg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg 560

Arg Leu Glu Asn He Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys lie Phe Arg Val 115 120 125 130 aaa cca gtt ttg ggc ate aaa ega atg att caa att gaa tgg ata aag 608

Lys Pro Val Leu Gly lie Lys Arg Met He Gin lie Glu Trp He Lys 135 140 145 cct gag ttg geg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ett ega ttc 656

Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe 150 155 160 agg aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc taac ttc get aag aac 704

Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn 165 170 175 cgt aag gat aaa aac caa aeg tac: aac etc aeg ggg ctg cag cct ttt 752

Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe " 180 185 190 aca gaa tat gtc ata get ctg ega tgt geg gtc aag gag tea aag ttc 800

Thr Glu Tyr Val He Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe 195 200 205 210 tgg agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa get 848

Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Net Thr Glu Glu Glu Ala 215 220 225 cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca get. gag geg gat 896

Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp 230 235 ” 240 gga aga agg cca gtg egg ttg tta tgg aag aag gca aga gga gee cca 944

Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro 245 250 255 gtc eta gag aaa aca ett ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age 992

Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser 260 265 270 aac act aac etc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ett gaa 1040 Λ.- ^ 1 Λ1>, TU« Μλ+. A TU« Π « Π η 1 Γ 3 »

Mill MM Mbll MM U Mi Mil i'lKL M5JI till MM Mb!! U)il U ΙΠ Lt’U U!U 275 280 285 290 ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att tet tat aat 1088

Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met ile Ser Tyr Asrs 295 300 305 tet ett ggg aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca get att caa 1136

Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg He Pro Ala He Gin 310 315 320 gaa aaa tea ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt get gag 1184

Glu Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Val Met Gin Ala Cys Val Ala Glu 325 330 335 gac cag eta gtg gtg aag tgg caa age tet get eta gac gtg aac act 1232

Asp Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr 340 345 350 tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc acc acc ett 1280

Trp Net Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu 355 360 365 370 tcc tgg gaa tct gtg tct cag gcc acg aac tgg acg ate cag caa gat 1328

Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr He Gin Gin Asp 375 380 385 aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac ate tct gtg tat cca atg ttg 1376

Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr Pro Met Leu 390 395 400 cat gac. aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag get tat gcc aaa gaa 1424

His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala Lys Glu 405 410 415 ggc gtt cca tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att ggc gtg 1472

Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn lie Gly Val 420 425 430 aag acg gtc acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag aga aag 1520

Lys Thr Val Thr lie Thr Trp Lys Glu lie Pro Lys Ser Glu Arg Lys 435 440 445 450 ggt ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa get gaa ggt gga aaa 1568

Gly He He Cys Asn Tyr Thr He Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 455 460 465 gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac ggc ctg gag 1616

Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser lie Leu Gin Tyr Gly Leu Glu 470 475 480 tcc ctg aaa ega aag acc tct tac att gtt cag gtc atg gcc age acc 1664

Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr lie Val Gin Val Met Ala Ser Thr 485 490 495 agt get ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag aca ttg tea 1712

Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys Thr Leu Ser 500 505 510 ttc agt gtc ttt gag att ate etc ata act tct. ctg att ggt gga ggc 1760

Phe Ser Val Phe Glu lie lie Leu He Thr Ser Leu lie Gly Gly Gly 515 520 525 530 ett ett att etc att ate ctg aca gtg gca tat ggt etc aaa aaa ccc 1808

Leu Leu lie Leu He He Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro 535 540 545 aac aaa ttg act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt ccc aac cct get gaa 1855

Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu 550 555 560 agt agt ata gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat aag eta aac 1904

Ser Ser lie Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn 565 570 575 ctg aag gag tet gat gac tet gtg aac aca gaa gac agg ate tta aaa 1952

Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg lie Leu Lys 580 585 590 cca tgt tcc acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag ttg gtg gtg 2000

Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val He Asp Lys Leu Val Val 595 600 605 610 aac ttt ggg aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa gcc aga aeg 2048

Asn Phe Gly Asn Val Leu Gin Glu lie Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr 615 620 625 ggt cag gaa aac aat tta gga ggg gaa aag aat ggg tat gtg acc tgc 2096

Gly Gin Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Tyr Val Thr Cys 630 635 640 ccc ttc agg cct gat tgt ccc ctg ggg aaa agt ttt gag gag etc cca 2144

Pro Phe Arg Pro Asp Cys Pro Leu Gly Lys Ser Phe Glu Glu Leu Pro 645 650 655 gtt tea cct gag att ccg ccc aga aaa tcc caa tac eta cgt teg agg 2192

Val Ser Pro Glu lie Pro Pro Arg Lys Ser Gin Tyr Leu Arg Ser Arg 660 665 670 atg cca gag ggg acc ege cca gaa gcc aaa gag cag ett etc ttt tet 2240

Met Pro Glu Gly Thr Arg Pro Glu Ala Lys Glu Gin Leu Leu Phe Ser 675 680 685 690 ggt caa agt tta gta cca gat cat ctg tgt gag gaa gga gcc cca aat 2288

Gly Gin Ser Leu Val Pro Asp His Leu Cys Glu Glu Gly Ala Pro Asn 695 700 705 cca tat ttg aaa aat tea gtg aca gee agg gaa ttt ett gtg tet gaa 2336

Pro Tyr Leu Lys Asn Ser l/al Thr Ala Arg Glu Phe Leu Val Sen Glu 710 715 720 aaa ett cca gag cac acc aag gga gaa gtc taaatgcgac catagcatga 2386

Lys Leu Pro Glu His Thr Lys Gly Glu Val 725 730 gaccctcggg gcctca 2402

<210> 2 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15

Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val Tyr 20 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45

Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 55 60

His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80

Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg He Thr lie Pro Asp Asn Tyr Thr He 85 90 95

Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr 100 105 110

Tyr Trp Arg Leu Glu Asn He Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe 115 120 125

Arg Val Lys Pro Val Leu Gly He Lys Arg Met He Gin He Glu Trp 130 135 140

He Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala 165 170 175

Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin 180 185 190

Pro Phe Thr Glu Tyr Val He Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205

Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220

Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240

Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly 245 250 255

Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn He Trp Tyr Tyr Pro 260 265 270

Glu Ser Asn Thr Asm Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin 275 280 285

Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met lie Ser 290 295 300

Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg He Pro Ala 305 310 315 320

He Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys Val 325 330 335

Ala Glu Asp Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val 340 345 350

Asn Thr Trp Met lie Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr 355 360 365

Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr He Gin 370 375 380

Gin Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn He Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400

Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala 405 410 415

Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn He 420 425 430

Gly Val Lys Thr Val Thr He Thr Trp Lys Glu lie Pro Lys Ser Glu 435 440 445

Arg Lys Gly He He Cys Asn Tyr Thr He Phe Tyr Gin Ala Glu Gly 450 455 460

Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser He Leu Gin Tyr Gly 465 470 475 480

Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr lie Val Gin Val Met Ala 485 490 495

Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys Thr 500 ' 505 510

Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu lie lie Leu He Thr Ser Leu He Gly 515 520 525

Gly Gly Leu Leu He Leu lie He Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys 530 535 540

Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro 545 550 555 560

Ala Glu Ser Ser He Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys 565 570 575

Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg lie 580 585 590

Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val lie Asp Lys Leu 595 600 605

Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gin Glu He Phe Thr Asp Glu Ala 610 615 620

Arg Thr Gly Gin Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640

Thr Cys Pro Phe Arg Pro Asp Cys Pro Leu Gly Lys Ser Phe Glu Glu 645 650 655

Leu Pro Val Ser Pro Glu He Pro Pro Arg Lys Ser Gin Tyr Leu Arg 660 665 670

Ser Arg Met Pro Glu Gly Thr Arg Pro Glu Ala Lys Glu Gin Leu Leu 675 680 685

Phe Ser Gly Gin Ser Leu Val Pro Asp His Leu Cys Glu Glu Gly Ala 690 695 700

Pro Asn Pro Tyr Leu Lys Asn Ser Val Thr Ala Arg Glu Phe Leu Val 705 710 715 720

Ser Glu Lys Leu Pro Glu His Thr Lys Gly Glu Val 725 730 < 210 > 3 <211> 5

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> motivo de péptido WSXWS

<221> VARIANTE <222 > (1' . . , (5' <223> Xaa * Qualquer aminoácido <400> 3

Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5 <210> 4

<211> 2196 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sequência de polinucleótido degenerada da SEQ ID NO :2 <221> misc_feature <222> (1' . . . (2196'

<223> n * AôTôC ou G <400> 4 atgatgtgga cntgggcnyt ntggatgytn ccnwsnytnt gyaarttyws nytngcngcn 60 ytnccngcna arccngaraa yathwsntgy gtntaytayt ayjngnaaraa yytnacntgy 120 acntggwsnc cnggnaarga racnwsntay acncartaya cngtnaarmg nacntaygcn 180 ttyggngara arcaygayaa ytgyacnacn aaywsnwsna cnwsngaraa ymgngcnwsn 240 tgywsnttyt tyytnccnmg nathacnath ccngayaayt ayacnathga rgtngargcn 300 garaayggng ayggngtnat haarwsncay atgacntayt ggmgnytnga raayathgcn 360 aaracngarc cnccnaarat httyngngtn aarccngtny tnggnathaa rmgnatgath 420 carathgart ggathaarcc ngarytngcn ccngtnwsnw sngayytnaa rtayacnytn 480 mgnttymgna cngtnaayws nacnwsntgg atggargtna ayttygcnaa raaytngnaar 540 gayaaraayc aracntayaa yytnacnggn ytncarccnt tyacngarta ygtnathgcn 600

ytnmgntgyg cngtnaarga rwsnaartty tggwsngayt ggwsncarga raaratgggn 66C

atgacngarg argargcncc ntgyggnytn garytntggm gngtnytnaa rccngcngar 72C gcngayggnm gnmgnccngt nmgnytnytn tggaaraarg cnmgnggngc nccngtnytn 780 garaaracny tnggntayaa yathtggtay tayccngarw snaayacnaa yytnacngar 840 acnatgaaya cnacnaayca rcarytngar ytncayytng gnggngarws nttytgggtn 900 wsnatgathw sntayaayws nytnggnaar wsnccngtng cnacnytnng nathccngcn 960 athcargara arwsnttyca rtgyathgar gtnatgcarg cntgygtngc ngargaycar 1020 ytngtngtna artggcarws nwsngcnytn gaygtnaaya cntggatgat hgartggtty 1080 ccngaygtng aywsngarcc nacnacnytn wsntgggarw sngtnwsnca rgcnacnaay 1140 tggacnathc arcargayaa rytnaarccn ttytggtgyt ayaayathws ngtntayccn 1200 atgytncayg ayaargtngg ngarccntay wsnathcarg cntaygcnaa rgarggngtn 1260 ccnwsngarg gnccngarac naargtngar aayathggng tnaaracngt nacnathacn 1320 tggaargara thccnaarws ngarmgnaar ggnathatht gyaaytayac nathttytay 1380 cargcngarg gnggnaargg nttywsnaar acngtnaayw snwsnathyt ncartayggn 1440 ytngarwsny tnaarmgnaa racnwsntay athgtncarg tnatggcnws nacnwsngcn 1500 ggnggnacna ayggnacnws nathaaytty aaracnytnw snttywsngt nttvgarath 1560 athytnatha cnwsnytnat hggnggnggn ytnytnathy tnathathyt nacngtngcn 1620 tayggnytna araarccnaa yaarytnacn cayytntgyt ggccnacngt nccnaayccn 1680 gcngarwsnw snathgcnac ntggcayggn gaygayttya argayaaryt naayytnaar 1740 garwsngayg aywsngtnaa yacngargay mgnathytna arccntgyws nacnccnwsn 1800 gayaarytrig tnathgayaa rytngtngtn aayttyggna aygtnytnca rgarathtty 1860 acngaygarg cnmgnacngg ncargaraay aayytnggng gngaraaraa yggntaygtn 1920 acntgycçnt tymgnccnga ytgyccnytn ggnaarwsnt tygargaryt nccngtnwsn 1980 ccngarathc cnccnmgnaa rwsrcartay ytnmgnwsnm gnatgccnga rggnacnmgn 2040 ccngargcna argarcaryt nytnttywsn ggncarwsny tngtnccnga ycayytntgy 2100 gargarggng cnccnaaycc ntayytnaar aaywsngtna cngcnmgnga rttyytngtn 2160 wsngaraary tnccngarca yacnaarggn gargtn 2196 < 210 > 5 < 211> 2 0

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleotide ZC127Q1 <400> 5 tcagaggtaa ctcccgttgc 20

<210> 6 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27898 <400> 6 ttagcgcaga gcagccatac acc 23

<210> 7 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC14063 <400> 7 caccagacat aatagctgac agact 25

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27899 <400> 8 ccagaacttt gactccttga ccg 23

<210> 9 <211> 765 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 9 tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt. ccacctcagc 60 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt gaatgtccgc 120 aaaacattct ctctccccag ccttcatgtg ttaacctggg gatgatgtgg acctgggcac 180 tgtggatgct cccttcactc tgcaaattca gcctggcagc tctgccagct aagcctgaga 240 acatttcctg tgtctactac tataggaaaa atttaacctg cacttggagt ccaggaaagg 300 aaaccagtta tacccagtac acagttaaga gaacttacgc ttttggagaa aaacatgata 360 attgtacaac caatagttct acaagtgaaa atcgtgcttc gtgctctttt ttccttccaa 420 gaataaegat cccagataat. tataccattg aggtggaagc tgaaaatgga gatggtgtaa 480 ttaaatctca tatgacatac tggagattag agaacatagc gaaaactgaa ccacctaaga 540 ttttccgtgt gaaaccagtt ttgggcatca aacgaatgat tcaaattgaa tggataaagc 600 ctgagttggc gcctgtttca tctgatttaa aatacacact tcgattcagg acagtcaaca 660 gtaccagctg gatggaagtc aacttcgcta agaaccgtaa ggataaaaac caaacgtaca 720 acctcacggg gctgcagcct tttacagaat atgtcatagc tctgc 765 <210> 10 <211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleõtido ZC28481 <400> 10 gaatggataa agcctgagtt ggcg 24

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleõtido ZC6346 <400> 11 ggccccttgc tccataccac 20

<210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleõtido ZC28480 <400> 12 cgattcagga cagtcaacag tacc 24

<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC26405 < 4 0 0 > 13 tatagaagga cacctagtca gaca 24

< 210 > 14 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27895 <400> 14 gaagtcaact tcgctaagaa ccg 23

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC5020 <400> 15 cactggagtg gcaacttcca g 21 <210> 16 <211> 1853

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 16 agtcaacttc gctaagaacc gtaaggataa aaaccaaacg tacaacctca cggggctgca 60 gccttttaca gaatatgtca tagctctgcg atgtgcggtc aaggagtcaa agttctggag 120 tgactggagc caagaaaaaa tgggaatgac tgaggaagaa gctccatgtg gcctggaact 180 gtggggagtc ctgaaaccag ctgaggcgga tggaagaagg ccagtgcggt tgttatggaa 240 gaaggcaaga ggagccccag tcctagagaa aacacttggc tacaacatat ggtactatcc 300 agaaagcaac actaacctca cagaaacaat gaacactact aaccagcagc ttgaactgca 360 tctgggaggc gagagctttt gggtgtctat gatttcttat aattctcttg ggaagtctcc 420 agtggccacc ctgaggattc cagctattca agaaaaatca tttcagtgca ttgaggtcat 480 gcaggcctgc gttgctgagg accagctagt ggtgaagtgg caaagctctg ctctagacgt 540 gaacacttgg atgattgaat ggtttccgga tgtggactca gagcccacca ccctttcctg 600 ggaatctgtg tctcaggcca cgaactggac gatccagcaa gataaattaa aacctttctg 660 gtgctataac atctctgtgt atccaatgtt gcatgacaaa gttggcgagc catattccat 720 ccaggct.tat gccaaagaag gcgttccatc agaaggtcct gagaccaagg tggagaacat 780 tggcgtgaag acggtxacga tcacatggag agagattccc aagagtgaga gaaagggtat 840 catctgcaac tacaccatct tttaccaagc tgaaggtgga aaaggattct ccaagacagt 900 caattccagc atcttgcagt acggcctgga gtccctgaaa cgaaagacct cttacattgt 960 tcaggtcatg gccagcacca gtgctggggg aaccaacggg accagcataa atttcaagac 1020 attgtcattc agtgtctttg agattatcct cataacttct ctgattggtg gaggccttct 1080 tattctcatt atcctgacag tggcatatgg tctcaaaaaa cccaacaaat tgactcatct 1140 gtgttggccc accgttccca accctgctga gagtagtata gccacacggc atggagatga 1200 tttcaaggat aagctaaacc tgaaggagtc tgatgactct gtgaacacag aagacaggat 1260 cttaaaacca tgttccaccc ccagtgacaa gttggtgatt gacaagttgg tggtgaactt 1320 tgggaatgtt ctgcaagaaa ttttcacaga tgaagccaga acgggtcagg aaaacaattt 1380 aggaggggaa aagaatggga ctagaattct gtcttcctgc ccaacttcaa tataagtgtg 1440 gactaaaatg cgagaaaggt gtcctgtggt ctatgcaaat tagaaaggac atgcagagtt 1500 ttccaactag gaagactgaa tctgtggccc caagagaacc atctctgaag actgggtatg 1560 tggtcttttc cacaeatgga ccacctacgg atgtaatctg taatgcatgt gcatgagaag 1520 tctgttatta agtagagtgt gaaaacatgg ttatggtaat aggaacagct tttaaaatgc 1680 ttttgcattt gggcctttca tacaaaaaag ccataatacc attttcatgt aatgctatac 1740 ttctatacta ttttcatgta atactatact tctatactat tttcatgtaa tactatactt 1800 ctatactatt ttcatgtaat actatacttc tatattaaag ttttacccac tea 1853

<210> 17 <211> 1299 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222 > (162' . . . (1133' <400> 17 tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt ccacctcagc 60 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt gaatgtccgc 120 aaaacattct ctctccccag ccttcatgtg ttaacctggg g atg atg tgg acc tgg 176

Met Met Trp Thr Trp 1 5 gca ctg tgg atg etc ccc tea etc tgc aaa ttc age ctg gca get ctg 224

Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Ala Leu 10 15 20 cca get aag cct gag aac att tee tgt gtc tac tac tat agg aaa aat 272

Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asn 25 30 35 tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc cag tac 320

Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr Gin Tyr 40 45 50 aca gtt, aag aga act tac get ttt gga gaa aaa cat gat aat tgt aca 368

Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn Cys Thr 55 60 65 acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt get teg tgc tet ttt ttc ett 416

Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe Phe Leu 70 75 80 85 cca aga ata aeg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa get gaa ' 464

Pro Arg He Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr He Glu Val Glu Ala Glu 90 95 100 aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg aca tac tgg aga tta gag 512

Asn Gly Asp Gly Val lie Lys $er His Met Tbr Tyr Trp Arg Leu Glu 105 110 115 aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa cca gtt 560

Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe Arg Val Lys Pro Val 120 125 130 ttg ggc ate aaa ega atg att caa att gaa tgg ata aag cct gag ttg 608

Leu Gly lie Lys Arg Met He Gin lie Glu Trp lie Lys Pro Glu Leu 135 " 140 145 gcg cct gtt tea tct gat. tta aaa tac aca ett ega ttc agg aca gtc 656

Ala Pro Val Sen Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg Thr Val 150 155 160 165 aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc get aag aac cgt aag gat 704

Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg Lys Asp 170 175 180 aaa aac caa aeg tac aac etc aeg ggg ctg cag cct ttt aca gaa tat 752

Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr Glu Tyr 185 190 195 gtc ata get ctg ega tgt. gcg gtc aag gag tea aag ttc tgg agt gac 800

Val He Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp Ser Asp 200 205 210 tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa get cca tgt ggc 848

Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro Cys Gly 215 220 225 ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca get gag gcg gat gga aga agg 896

Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly Arg Arg 230 235 240 245 cca gtg egg ttg tta tgg aag aag gca aga gga gcc cca gtc eta gag 944

Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu Glu 250 255 260 aaa aca ett ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age aac act aac 992

Lys Thr Leu Gly Tyr Asn He Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn Thr Asn 265 270 275 etc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ett gaa ctg cat ctg 1040

Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu His Leu 280 285 290 gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att tet tat aat tet ett ggg 1088

Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met He Ser Tyr Asn Sen Leu Gly 295 300 305 aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca get att caa gaa aaa 1133

Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg He Pro Ala lie Gin Glu Lys 310 315 320 tagaaacttt acagatgcta gtcccagaca taaaagaaaa taatgttctg gatgtgcacg 1193 atggctcacg cctgtaatcc cagcactttg aggccaagac gggtggatcg ctgagttcag 1253 gagttcaaga caagtccagg caacatagtg aaaccttgtt tctaca 1299

<210> 18 <211> 324 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15

Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr 20 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35’ 40 45

Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 55 60

His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80

Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg He Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr He 85 90 95

Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr 100 105 110

Tyr Trp Arg Leu Glu Asn He Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe 115 120 125

Arg Val Lys Pro Val Leu Gly He Lys Arg Met lie Gin He Glu Trp 130 135 140 lie Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala 165 170 175

Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin 180 185 190

Pro Phe Thr Glu Tyr Val lie Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205

Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220

Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240

Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly 245 250 255

Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr Pro 260 265 270

Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin 275 280 285

Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met lie Ser 290 295 300

Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg He Pro Ala 305 310 315 320 lie Gin Glu Lys

< 210 > 19 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27897 <400> 19 caagctactt ctctggtgta tgg 23 <210> 20 <211> 22

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC28521 <400> 20 gagtagtagc tccaggattc ac 22

<210> 21 <211> 1476 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222 > (162' . . . (878' < 4 0 0 > 21 tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt ccacctcagc 60 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt gaatgtccgc 120 aaaacatixt ctctccccag ccttcatgtg ttaacctggg g atg atg tgg acc tgg 176

Met Met Trp Thr Trp 1 5 gca ctg tgg atg etc ccc tea etc tgc aaa ttc age ctg gca get ctg 224

Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Ala Leu 10 15 20 cca get aag ect gag aac att tcc tgt gtc tac tac tat agg aaa aat 272

Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asrt 25 30 35 tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc cag tac 320

Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr Gin Tyr 40 45 50 aca gtt aag aga act tac get ttt gga gaa aaa cat gat aat tgt aca 368

Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn Cys Thr 55 60 65 acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt get teg tgc Let ttt ttc ett 416

Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe Phe Leu 70 75 80 85 cca aga ata aeg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa get gaa 464

Pro Arg He Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr lie Glu Val Glu Ala Glu 90 95 100 aat gga gat ggt gta att aaa tet, cat atg aca tac tgg aga tta gag 512

Asrt Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg Leu Glu 105 110 115 aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa cca gtt 560

Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe Arg Val Lys Pro Val 120 125 130 ttg ggc ate aaa ega atg att eaa att gaa tgg ata aag cct gag ttg 608

Leu Gly lie Lys Arg Met lie Gin He Glu Trp lie Lys Pro Glu Leu 135 140 , 145 gcg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ett ega ttc agg aca gtc 656

Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg Thr Val 150 155 160 165 aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc get aag aac cgt aag gat 704

Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg Lys Asp 170 175 180 aaa aac caa aeg tac aac etc aeg ggg ctg cag cct ttt aca gaa tat 752

Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr Glu Tyr 185 190 195 gtc ata get ctg ega tgt gcg gtc aag gag tea aag ttc tgg agt gac 800

Val lie Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp Ser Asp 200 205 210 tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa ggc aag eta etc 848

Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Gly Lys Leu Leu 215 220 225 cct gcg att ccc gtc ctg tet get ctg gtg tagggctgct ttgggctaga 898

Pro Ala lie Pro Val Leu Ser Ala Leu Val 230 235 cttggtgggg tttgtcacca cctggttggg aatcatggaa tctcatgacc ccaggggccc 958 cctgtaccat egagagtgag cctgcacaac tttgtgcccc aaaggcaaag gatcacattt 1018 taatactcat gaggttctta tactatacat gaaagggtat catatcattt gttttgtttt 1078 gttttgtttt tgagatggag tcttactctg tcacccagga tggagtgcag tgatgtgatc 1138 tcggctcact gccaccacca cctcccgagt tcaagcaatt cttgtgcctc agcctcccaa 1198 gtagctggga ttacaggggc ccacgaccat gcccggttga tttttgtatt tttagtagag 1258 aagggatatc accatgttgg etaggetagt cttgaactcc tgacctcagg taatctgccc 1318 accttgacct cccaaagtgt tgggattaca ggcgtgagcc actgtgcccc gccagtatca 1378 tatcatctga aggtatcctg tgataaatta aagatacata ttgtgaatcc tggagctact 1438 actcaaaaaa taaataaagg tgtaactaat acaattta 1476

<210> 22 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15

Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val Tyr 20 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45

Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 55 60

His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80

Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg lie Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr lie 85 90 95

Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val lie Lys Ser His Met Thr 100 105 110

Tyr Trp Arg Leu Glu Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe 115 120 125

Arg Val Lys Pro Val Leu Gly lie Lys Arg Met He Gin He Glu Trp 130 135 140

He Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Net Glu Val Asn Phe Ala 165 170 175

Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin 180 185 190

Pro Phe Thr Glu Tyr Val He Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205

Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220

Glu Gly Lys Leu Leu Pro Ala He Pro Val Leu Ser Ala Leu Val 225 230 235 < 210 > 2 3 <211> 24

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC28575 <400> 23 ccaggaaagg aaaccagtta tacc 24 < 210 > 24 <211> 23

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27899 <400> 24 ccagaacttt gactccttga ccg 23 < 210 > 2 5

< 211> 2 5 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC14063 <400> 25 caccagacat aatagctgac agact 25

< 210 > 2 6 <211>21 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC17574 <400> 26 ggtrttgctc agcatgcaca c 21 <210> 27 < 211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC17600 <400> 27 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24 <210> 28 <211> 25

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC26358 <400> 28 aaaaccaaac gtacaacctc acggg 25 <210> 29 < 211> 2 5

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC26359 < 4 0 0 > 2 9 gagcagccat acaccagagc agaca 25

<210> 30 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC17212 <400> 30 ggggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc ctc 33 <21G> 31 <211> 30

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleotide ZC17313 <400>31 caccctgcga agccttagca gcagtaggcc 30

<210> 32 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC17205 <400> 32 cccgccccat ccccgtggat caccttggtg 30

<210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC17206 <400> 33 gggtctagac cttcagggct gctgccaata 30

<210> 34 < 211 > 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de marcador Glu-Glu <400> 34 G1u Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Sequência de péptidos de marcador FLAG <400> 35

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 36 <211> 699

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 36 gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgccxaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct. 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 699 <210> 37 <211> 990

<212> ADN <213> Homo sapiens <220>

< 2 21> CDS <222> (990' <400> 37 get age acc aag ggc cca teg gtc ttc ccc ctg gca ccc tee tee aag 48

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 age acc tet ggg ggc aca geg gee ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg aeg gtg teg tgg aac tea ggc gee ctg acc age 144

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg get gtc eta cag tee tea gga etc tac tee 192

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 etc age age gtg gtg acc gtg ccc tee age age ttg ggc acc cag acc 240

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag 288

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca 384

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee egg acc cct gag gtc aca t.gc 432

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg egg gag 528

Tyr Val Asp Gly Val Glu Va'i His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg 576

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tee aac 624

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gee etc cca gee ccc ate gag aaa acc ate tee aaa gee aaa ggg 672

Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tee egg gat gag 720

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac 816

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc aeg cct ccc gtg ctg gac tee gac ggc tee ttc ttc 864

Asn Tyr L.ys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac 912

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 gtc ttc. tea tgc tee gtg atg cat gag get ctg cac aac cac tac aeg 960

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag age etc tee ctg tet ccg ggt aaa 990

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 . 330 < 210 > 3 8 <211> 330

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys loo 105 no

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu i r r 1 '7 Λ Ί ‘7 r 100 i/υ irj

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 " 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 39 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222 > (1 ' . . . (321' < 4 0 0 > 3 9 act gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag cag 48

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 61n 15 10 15 ttg aaa tet ggt acc gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 96

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 * 30 cce aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee etc caa teg 144

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45 ggt aac tee cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac age acc 192

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 tac age etc age age acc ctg aeg ctg age aaa gca gac tac gag aaa 240

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age teg ccc 288

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag 321

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys * 100 105

<210> 40 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210> 41 <211> 8 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC11440 <400> 41 aattgaga 8 <210> 42 <211> 8

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC11441 <400> 42 cgcgtctc 8

< 210 > 4 3 <211> 100 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC12749 <400> 43 gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacacc cgcgtatttc ccagaaaagg 60 aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc 100

<210> 44 <211> 100 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC12748 <400> 44 tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatctac agttcctttt ctgggaaata 60 cgcgggtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag ' 100

< 210 > 4 5 <211> 2529 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (162' . . . (2108' <400> 45 tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt ccacctcagc 60 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt gaatgtccgc 120 aaaacattct ctctccccag ccttcatgtg ttaacctggg g atg atg tgg acc tgg 176

Met Met Trp Thr Trp 1 5 gca ctg tgg atg etc ccc tea etc tgc aaa ttc age ctg gca get ctg 224

Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Ala Leu 10 15 20 cca get aag cct gag aac att tee tgt gtc tac tac tat agg aaa aat 272

Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asn 25 30 35 tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc cag tac 320

Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr Gin Tyr 40 45 50 aca gtt aag aga act tac get ttt gga gaa aaa cat gat aat tgt aca 368

Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn Cys Thr 55 60 65 acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt get teg tgc tet ttt ttc ett 416

Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe Phe Leu 70 75 80 85 cca aga ata aeg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa get gaa 464

Pro Arg lie Thr lie Pro Asp Asn Tyr Thr lie Glu Val Glu Ala Glu 90 95 100 aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg aga tta gag 512

Asn Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg Leu Glu 105 110 115 aac ata geg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa cca gtt 560

Asn He Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe Arg Val Lys Pro Val 120 125 130 ttg ggc ate aaa ega atg att caa att gaa tgg ata aag cct gag ttg 608

Leu Gly lie Lys Arg Met lie Gin lie Glu Trp lie Lys Pro Glu Leu 135 140 145 geg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ett ega ttc agg aca gtc 656

Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg Thr Val 150 155 160 165 aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc get aag aac cgt aag gat 704

Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg Lys Asp 170 175 ' 180 aas aac caa acg tac sac etc aeg ggg ctg cag cct ttt aca gaa tat 752

Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr Glu Tyr 185 190 195 gtc ata get ctg ega tgt geg gtc aag gag tea aag ttc tgg agt gac 800

Val lie Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp Ser Asp 200 205 210 tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa get cea tgt ggc 848

Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro Cys Gly 215 220 225 ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca get gag geg gat gga aga agg 896

Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly Arg Arg 230 235 240 245 cca gtg egg ttg tta tgg aag aag gca aga gga gee cca gtc eta gag 944

Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu Glu 250 ' 255 260 aaa aca ett ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age aac act aac 992

Lys Thr Leu Gly Tyr Asn He Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn Thr Asn 265 270 275 etc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ett gaa ctg cat ctg 1040

Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu His Leu 280 285 290 gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att tet tat aat tet ett ggg 1088

Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met lie Ser Tyr Asn Ser Leu Gly 295 300 305 aag tet cca gtg gee ace ctg agg att cca get. att caa gaa aaa tea 1136

Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg lie Pro Ala He Gin Glu Lys Ser 310 315 ' 320 325 ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt get gag gac cag eta 1184

Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys Val Ala Glu Asp Gin Leu 330 335 340 gtg gtg aag tgg caa age tet get eta gac gtg aac act tgg atg att 1232

Vai Vai Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Vai Asrt Tbr Trp Met lie 345 350 355 gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc acc acc ctt tcc tgg gaa 1280

Glu Trp Phe Pro Asp Vai Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser Trp Glu 360 365 370 tet gtg tet cag gee acg aac tgg acg ate cag caa gat aaa tta aaa 1328

Ser Vai Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr I1e Gin Gin Asp Lys Leu Lys 375 380 385 cct ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat cca atg ttg cat gac aaa 1376

Pro Phe Trp Cys Tyr Asn I1e Ser Vai Tyr Pro Met Leu His Asp Lys 390 395 400 405 gtt ggc gag cca tat tee ate cag get tat gee aaa gaa ggc gtt cca 1424

Vai Gly Glu Pro Tyr Ser I1e Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Vai Pro 410 415 420 tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att ggc gtg aag acg gtc 1472

Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Vai Glu Asn Ile Gly Vai Lys Thr Vai 425 430 435 acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag aga aag ggt ate ate 1520

Thr lie Thr Trp Lys Glu lie Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly lie Ile 440 445 450 tgc aac tac acc ate ttt tac caa get gaa ggt gga aaa gga ttc tcc 1568

Cys Asn Tyr Thr íle Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Gly Phe Ser 455 460 465 aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac ggc ctg gag tcc ctg aaa 1616

Lys Thr Vai Asn Ser Ser Ile Leu Gin Tyr Gly Leu Glu Ser Leu Lys 470 475 480 485 ega aag acc tet tac att gtt cag gtc atg gee age acc agt get ggg 1664

Arg Lys Thr Ser Tyr íle Vai Gin Vai Met. Ala Ser Thr Ser Ala Gly 490 495 500 gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag aca ttg tea ttc agt gtc 1712

Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe Ser Vai 505 510 515 ttt gag att ate etc ata act tet ctg att ggt gga ggc ett ett att 1760

Phe Glu lie lie Leu lie Thr Ser Leu He Gly Gly Gly Leu Leu He 520 525 530 etc att ate ctg aca gtg gca tat ggt etc aaa aaa ccc aac aaa ttg 1808

Leu He He Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn Lys Leu 535 540 545 act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt ccc aac cct get gaa agt agt ata 1856

Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser Ser lie 550 555 560 565 gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat aag eta aac ctg aag gag 1904

Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu Lys Glu 570 575 580 tet gat gac tet gtg aac aca gaa gac agg ate tta aaa cca tgt tee 1952

Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg He Leu Lys Pro Cys Ser 585 590 595 acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag ttg gtg gtg aac ttt ggg 2000

Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val lie Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Gly 600 605 610 aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa gcc aga aeg ggt cag gaa 2048

Asn Val Leu Gin Glu lie Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly Gin Glu 615 620 625 aac aat tta gga ggg gaa aag aat ggg act aga att ctg tet tcc tgc 2096

Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg lie Leu Ser Ser Cys 630 635 640 645 cca act tea ata taagtgtgga ctaaaatgcg agaaaggtgt cctgtggtct 2148

Pro Thr Ser He atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga agactgaatc tgtggcccca 2208 agagaaecat ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca cacatggacc acctacggat 2268 gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag tagagtgtga aaacatggtt 2328 atggtaatag gaacagcttt taaaatgctt ttgtatttgg gcctttcata caaaaaagcc 2388 ataataccat tttcatgtaa tgetataett ctatactatt ttcatgtaat actatacttc 2448 tatactattt tcatgtaata etataettet atactatttt catgtaatac tataetteta 2508 tattaaagtt ttacccactc a 2529

< 210 > 4 6 <211> 649 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 15 10 15

Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr 20 ' 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45

Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 55 60

His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80

Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg lie Thr lie Pro Asp Asn Tyr Thr lie 85 ' 90 95

Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr 100 105 110

Tyr Trp Arg Leu Glu Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys lie Phe 115 120 125

Arg Val Lys Pro Val Leu Gly He Lys Arg Met lie Gin lie Glu Trp 130 135 140 lie Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala 165 170 175

Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin 180 185 190

Pro Phe Thr Glu Tyr Val lie Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205

Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220

Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240

Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly 245 250 255

Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr Pro 260 265 270

Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin 275 280 285

Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met He Ser 290 295 300

Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg lie Pro Ala 305 310 315 320 lie Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys Val 325 330 335

Ala Glu Asp Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val 340 345 350

Asn Thr Trp Met lie Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr 355 360 365

Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr He Gin 370 375 380

Gin Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn He Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400

Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala 405 410 415

Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn lie 420 425 430

Gly Val Lys Thr Val Thr He Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser Glu 435 440 445

Arg Lys Gly He He Cys Asn Tyr Thr He Phe Tyr Gin Ala Glu Gly 450 455 460

Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser He Leu Gin Tyr Gly 465 470 475 480

Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr He Val Gin Val Met Ala 485 490 495

Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys Thr 500 505 510

Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu lie He Leu He Thr Ser Leu He Gly 515 520 525

Gly Gly Leu Leu lie Leu lie lie Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys 530 535 540

Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro 545 550 555 560

Ala Glu Ser Ser lie Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys 565 570 575

Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg He 580 585 590

Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val lie Asp Lys Leu 595 600 605

Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gin Glu lie Phe Thr Asp Glu Ala 610 615 620

Arg Thr Gly Gin 61u Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg 625 630 635 640 lie Leu Ser Ser Cys Pro Thr Ser lie 645

<210> 47 <211> 1947 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Sequência de polinucleótido degenerada da SEQ ID NO :46 <221> misc__feature <222> (1' . . . (1947'

<223> n * AÔTÔC ou G <400> 47 atgatgtgga cntgggcriyt ntggatgytn ccnwsriytnt gyaarttyws nytngcngcn 60 ytnccngcna arccngaraa yathwsntgy gtntaytayt ayingnaaraa yytnacntgy 120 acntggwsnc cnggnaarga racnwsntay acncartaya cngtnaarmg nacntaygcn 180 ttyggngara arcaygayaa ytgyacnacn aaywsnwsna cnwsngaraa ymgngcnwsn 240 tgywsnttyt tyytnccnrng nathacnath ccrigayaayt ayacnathga rgtngargcn 300 garaayggrig ayggngtnat haarwsncay atgacntayt ggmgnytnga raayathgcn 360 aaracngarc cnccnaarat httymgngtn aarccngtny tnggnathaa rnignatgath 420 carathgart ggathaarcc ngarytngcn ccngtriwsriw sngayytnaa rtayacnytn 480 mgnttymgna cngtnaayws nacnwsntgg atggargtna ayttygcnaa raaymgnaar 540 gayaaraayc aracntayaa yyfnacnggn ytncarccnf tyacngarta ygtnathgcn 600 ytnmgntgyg cngtnaarga rwsnaartty tggwsngayt ggwsncarga raaratgggn 660 atgacngarg argargcncc ntgyggnytn garytntggm gngtnytnaa rccngcngar 720 gcngayggnm gningnccngt nmgnytnytn tggaaraarg cnrngnggngc nccngtnytn 780 garaaracny tnggntayaa yathtggtay tayccngarw snaayacnaa yytnacngar 840 acnatgaaya cnacnaayca rcarytngar ytncayytng gnggrigarws nttytgggtn 900 wsnatgathw sntayaayws nytnggnaar wsrccngtng cnacnytnmg nathccngcn 960 athcargara arwsnttyca rtgyathgar gtnatgcarg cntgygtngc ngargaycar 1020 ytngtngtna artggcarws nwsngcnytn gaygtnaaya cntggatgat hgartggtty 1080 ccngaygtng aywsngarcc nacnacnytn wsntgggarw sngtnwsnca rgcnacnaay 1140 tggacnathc arcargayaa rytriaarccn ttytggtgyt ayaayathws ngtntayccn 1200 atgytncayg ayaargtngg ngarccntay wsnathcarg cntaygcnaa rgarggngtn 1260 ccnwsngarg gnccngarac naargtngar aayathggng tnaaracngt nacnathacn 1320 tggaargara thccnaarws ngarmgnaar ggnathatht gyaaytayac nathttytay 1380 cargcngarg gnggnaargg nttywsnaar acngtriaayw snwsnathyt ncartayggn 1440 ytngarwsny tnaarmgnaa racnwsntay athgtncarg tnatggcnws nacnwsngcn 1500 ggnggnacna ayggnacnws nathaaytty aaracnytnw snttywsngt nttygarath 1550 athytnatha enwsnytnat hggnggnggn ytnytnathy tnathathyt nacngtngcn 1620 tayggnytna araarccnaa yaarytnacn cayytntgyt ggccnacngt nccnaayccn 1680 gcngarwsnw snathgcnac ntggcayggn gaygayttya argayaaryt naayytnaar 1740 garwsngayg aywsngtnaa yacngargay mgnathytna arccntgyws nacnccnwsn 1800 gayaarytng tnathgayaa rytngtngtn aayttyggna aygtnytnca rgarathtty 1860 acngaygarg cnmgnacngg ncargaraay aayytnggng gngaraaraa yggnacnmgn 1920 athytnwsnw sntgyccnac nwsnath 1947

<210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Met Cys lie Arg Gin Leu Lys Phe Phe Thr Thr Ala Cys Val Cys Glu 15 10 15

Cys Pro Gin Asn lie Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly 20 25 30

<210> 49 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC21195 <400> 49 gaggagacca taacccccga cag 23 <210> 50 <211> 23

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC21196 <400> 50 catagctccc accacacgat ttt 23 < 210 > 51 <211> 23

<212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleotide* ZC27900 <400> 51 gccccgtgag gttgtacgtt tgg 23

<210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cy$ Val Asn Leu Gly 1 5 10

<210> 53 <211> 2903 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

< 2 21> CDS <222 > (497' . . . (2482' <400> 53 tgaaaagaca tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt 60 ccacctcagc tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt 120 gaatgtccgc aaaacattag tttcactctt gtcgccaggt tggagtacaa tggcacgatc 180 ftggctcact gcaacctctg cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 240 gtagctggga ttacagttaa caataatgca atccatttcc cagcataagt gggtaagtgc 300 cactttgact tgggctgggc ttaaaagcac aagaaaagct cgcagacaat cagagtggaa 360 acactcccac atcttagtgt ggataaatta aagtccagat tgttcttcct gtcctgactt 420 gtgctgtggg aggtggagtt gcctttgatg caaatccttt gagccagcag aacatctgtg 480 gaacatcccc tgatac atg aag etc tet ccc cag cct tea tgt gtt aac ctg 532

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Val Asn Leu 1 5 10 ggg atg atg tgg acc tgg gca ctg tgg atg etc cct tea etc tgc aaa 58(3

Gly Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys 15 20 25 ttc age ctg gca get ctg cca get aag cct gag aac att tcc tgt gtc 628

Phe Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val 30 35 40 tac tac tat agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa 676

Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu 45 50 55 60 acc agt tat acc cag tac aca gtt aag aga act tac get ttt gga gaa 724

Thr Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu 65 70 75 aaa cat gat aat tgt aca acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt get 772

Lys His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala 80 85 90 teg tgc tet ttt ttc ett cca aga ata aeg ate cca gat aat tat acc 820

Ser Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg lie Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr 95 100 105 att gag gtg gaa get gaa aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg 868 lie Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ele Lys Ser His Met 110 115 120 aca tac tgg aga tta gag aac ata geg aaa act gaa cca cct aag att 916

Thr Tyr Trp Arg Leu Glu Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys lie 125 130 135 140 ttc cgt gtg aaa cca gtt ttg ggc ate aaa ega atg att caa att gaa 964

Phe Arg Val Lys Pro Val Leu Gly lie Lys Arg Met lie Gin He Glu 145 150 155 tgg ata aag cct gag ttg geg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca 1012

Trp He Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr

160 165 17Q ett ega ttc agg aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc 1060

Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe 175 180 185 get aag aac cgt aag gat aaa aac caa aeg tac aac etc aeg ggg ctg 1108

Ala Lys Asπ Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu 190 195 200 cag cct ttt aca gaa tat gtc ata get ctg ega tgt geg gtc aag gag 1156

Gin Pro Phe Thr Glu Tyr Val lie Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu 205 210 215 220 tea aag ttc tgg agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag 1204

Ser Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu 225 230 235 gaa gaa get cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca get 1252

Glu Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala 240 245 250 gag geg gat gga aga agg cca gtg egg ttg tta tgg aag aag gca aga 1300

Glu Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg 255 260 265 gga gee cca gtc eta gag aaa aca ett ggc tac aac ata tgg tac tat 1348

Gly Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr 270 275 280 cca gaa age aac act aac etc aca gaa aca atg aac act act aac cag 1396

Pro Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin 285 290 295 ' 300 cag ett gaa ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att 1444

Gin Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met He 305 310 315 tet tat aat tet ett ggg aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca 1492

Ser Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg He Pro 320 325 330 get att caa gaa aaa tea ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc 1540

Ala He Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys 335 340 345 gtt get gag gac cag eta gtg gtg aag tgg caa age tet get eta gac 1588

Val Ala Glu Asp Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp 350 355 360 gtg aac act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc 1636

Val Asn Thr Trp Met lie Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro 365 370 375 380 acc acc ett tec tgg gaa tet gtg tet cag gee aeg aac tgg aeg ate 1684

Thr Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr lie 385 390 395 cag caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat 1732

Gin Gin Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr 400 405 410 cca atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tee ate cag get tat 1780

Pro Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr 415 420 425 gee aaa gaa ggc gtt cca tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac 1828

Ala Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn 430 435 440 att ggc gtg aag aeg gtc aeg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt 1876

He Gly Val Lys Thr Val Thr lie Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser 445 ' 450 455 460 gag aga aag ggt ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa get gaa 1924

Glu Arg Lys Gly lie He Cys Asn Tyr Thr lie Phe Tyr Gin Ala Glu 465 470 475 ggt gga aaa gga ttc tee aag aca gtc aat tee age ate ttg cag tac 1972

Gly Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser lie Leu Gin Tyr 480 485 490 ggc ctg gag tee ctg aaa ega aag acc tet tac att gtt cag gtc atg 2020

Gly Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr He Val Gin Val Met 495 500 505 gee age acc agt get ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag 2068

Ala Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys 510 515 520 aca ttg tea ttc agt gtc ttt gag att ate etc ata act tet ctg att 2116

Thr Leu Ser Phe Ser Vai Phe 61 u He lie Leu He Thr $er Leu lie 525 530 535 540 ggt gga ggc ctt ctt att etc att ate ctg aca gtg gca tat ggt etc 2164

Gly Gly Gly Leu Leu He Leu He lie Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu 545 550 555 aaa aaa ccc aac aaa ttg act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt ccc aac 2212

Lys Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn 560 565 570 cct get gaa agt agt ata gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat 2260

Pro Ala Glu Ser Ser lie Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp 575 580 585 aag eta aac ctg aag gag tet gat gac tet gtg aac aca gaa gac agg 2308

Lys Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg 590 595 600 ate tta aaa cca tgt tcc acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag 2356

He Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val He Asp Lys 605 610 615 620 ttg gtg gtg aac ttt ggg aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa 2404

Leu Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gin Glu He Phe Thr Asp Glu 625 630 635 gcc aga aeg ggt cag gaa aac aat tta gga ggg gaa aag aat ggg act 2452

Ala Arg Thr Gly Gin Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr 640 645 650 aga att ctg tet tcc tgc cca act tea ata taagtgtgga ctaaaatgcg 2502

Arg He Leu Ser Ser Cys Pro Thr Ser lie 655 660 agaaaggtgt cctgtggtct atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga 2562 agactgaatc tgtggcccca agagaaccat ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca 2622 cacatggacc acctacggat gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag 2682 tagagtgtga aaacatggtt atggtaatag gaacagcttt taaaatgctt ttgtatttgg 2742 gcctttcata caaaaaagcc ataataccat tttcatgtaa tgetataett ctatactatt 2802 ttcatgtaat actatacttc tatactattt tcatgtaata etataettet atactatttt 2862 catgtaatac tataetteta tattaaagtt ttacccactc a 2903 <210> 54 <211> 662

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp 15 10 15

Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30

Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45

Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60

Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80

Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95

Phe Leu Pro Arg lie Thr lie Pro Asp Asn Tyr Thr lie Glu Val Glu 100 105 110

Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val lie Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125

Leu Glu Asn He Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe Arg Val Lys 130 135 140

Pro Val Leu Gly He Lys Arg Met lie Gin He Glu Trp He Lys Pro 145 150 155 · 160

Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175

Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190

Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr 195 200 205

Glu Tyr Val lie Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp 210 215 220

Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 ' 230 235 240

Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255

Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270

Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285

Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu 290 295 300

His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met lie Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320

Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg lie Pro Ala lie Gin Glu 325 330 335

Lys Ser Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350

Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365

Met He Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 380

Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr He Gin Gin Asp Lys 385 390 395 400

Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn He Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415

Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430

Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn lie Gly Val Lys 435 440 445

Thr Val Thr He Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460 lie lie Cys Asn Tyr Thr lie Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480

Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser He Leu Gin Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495

Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr lie Val Glr? Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510

Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525

Ser Val Phe Glu lie He Leu He Thr Ser Leu lie Gly Gly Gly Leu 530 535 540

Leu He Leu He He Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn 545 550 555 560

Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser 565 570 575

Ser lie Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu 580 585 590

Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg He Leu Lys Pro 595 600 605

Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val He Asp Lys Leu Val Val Asn 610 615 620

Phe Gly Asn Val Leu Gin Glu lie Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly 625 630 635 640

Gin Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg lie Leu Ser 645 650 655

Ser Cys Pro Thr Ser lie 660

<210> 55 <211> 1986 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de polinucleótido degenerada da SEQ ID NO: 54 <221> misc__feature <222 > (1' . . . (1986'

<223> n * AôTôC ou G <400> 55 atgaarytnw snccncarcc nwsntgygtn aayytnggna tgatgtggac ntgggcnytn 60 tggatgytnc cnwsnytntg yaarttywsn ytngcngcny tnccngcnaa rccngaraay 120 athwsntgyg tntaytayta ymgnaaraay ytnacntgya cntggwsncc nggnaargar 180 acnwsntaya cncartayac ngtnaarmgn acntaygcnt tyggngaraa rcaygayaay 240 tgyacnacna aywsnwsnac nwsngaraay mgngcnwsnt gywsnttytt yytnccningn 300 athacnathc cngayaayta yacnathgar gtngargcng araayggnga yggngtnath 360 aarwsncaya tgacntaytg gmgnytngar aayathgcna aracngarcc nccnaarath 420 ttymgngtna arccngtnyt nggnathaar mgnatgathc arathgartg gathaarccn 480 garytngcnc cngtnwsnws ngayytnaar tayacnytnm gnttymgnac ngtnaaywsn 540 acnwsntgga tggargtnaa yttygcnaar aaymgnaarg ayaaraayca racntayaay 600 ytnacnggny tncarccntt yacngartay gtnathgcny tnmgntgygc ngtnaargar 660 wsnaarttyt ggwsngaytg gwsncargar aaratgggna tgacngarga rgargcnccn 720 tgyggnytng arytritggmg ngtnytnaar ccngcrigarg cngayggnmg nmgnccngtn 780 mgnytnytnt ggaaraargc nmgnggngcn ccngtnytng araaracnyt rtggntayaay 840 athtggtayt ayccngarws naayacnaay ytnacngara cnatgaayac nacnaaycar 900 carytngary tncayytngg nggngarwsn ttytgggtnw snatgathws ntayaaywsn 960 ytnggnaarw snccngtngc nacnytnmgri athccngcna thcargaraa rwsrittycar 1020 tgyathgarg tnatgcargc ntgygtngcn gargaycary tngtngtnaa rtggcarwsn 1080 wsngcnytng aygtnaayac ntggatgath gartggttyc cngaygtnga ywsngarccn 1140 acnacnytnw sntgggarws ngtnwsncar gcnacnaayt ggacnathca rcargayaar 1200 ytnaarccnt tytggtgyta yaayathwsn gtntayccna tgytncayga yaargtnggn 1260 garccntayw snathcargc ntaygcnaar garggngtrtc cnwsrtgargg nccngaracn 1320 aangtngara ayathggngt naaracngtn acnathacnt ggaargarat hccnaarwsn 1380 garmgnaarg gnathathtg yaaytayacn athttytayc argcngargg nggnaarggn 1440 ttywsnaara cngtnaayws nwsnathytn cartayggny tngarwsnyt naarmgnaar 1500 acnwsntaya thgtncargt natggcnwsn acnwsngcng gnggnacnaa yggnacnwsn 1560 athaayttya aracnytnws nttywsngtn ttygaratha thytnathac nwsnytnath 1620 ggnggnggny tr.ytnathyt nathathytn acngtngcnt ayggnytnaa raarccnaay 1680 aarytnacnc ayytntgytg gccnacngtn ccnaayccng cngarwsnws nathgcnacn 1740 tggcayggng aygayttyaa rgayaarytn aayytnaarg arwsngayga ywsngtnaay 1800 acngargaym gnathytnaa rccntgywsn acnccnwsng ayaarytngt nathgayaar 1860 ytngtngtna ayttyggnaa ygtriytncar garathttya cngaygargc nmgnacnggn 1920 cargaraaya ayytnggngg ngaraaraay ggnacnmgna thytnwsnws ntgyccnacn i960 wsnath 1986

< 210 > 56 <211> 2748 <212> ADN <213> mus musculus <220>

<221> CDS <222 > (237' . . , (2222' <400> 56 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met 1 ctg age age cag aag gga tee tgc age cag gaa cca ggg gca gee cac 287

Leu See Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala His 5 10 15 gtc cag cct ctg ggt gtg aac get gga ata atg tgg acc ttg gca ctg 335

Val Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly He Met Trp Thr Leu Ala Leu 20 26 30 tgg gca ttc tet ttc etc tgc aaa ttc age ctg gca gtc ctg ccg act 383

Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro Thr 35 40 45 aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431

Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu Thr 50 55 60 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat ace age tac att gtg 479

Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr He Val 70 75 80 act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat get aca 527

Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala Thr 85 90 95 gag get tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gca atg ccc cca gac ate 575

Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp He 100 105 110 tgc agt gtt gaa gta caa get caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623

Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys Ser 115 120 125 gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gca aaa acc gaa cca cct 671

Asp lie Thr Tyr Trp His Leu He Ser lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro 130 135 140 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719

He He Leu Ser Val Asn Pro lie Cys Asn Arg Met Phe Gin He Gin 150 155 160 tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ett 767

Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met Leu 165 ' 170 175 egg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg aeg gaa gtc aat ttt gaa 815

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe Glu 180 185 190 aac tgt aaa cag gtc tgc aac etc aca gga ett cag get ttc aca gaa 863

Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr Glu 195 200 205 tat gtc ctg get eta ega ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911

Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp Ser 210 215 220 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959

Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro His 230 235 240 gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gca gac atg aac gga gac 1007

Val Leu Asp Leu Trp Arg He Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp 245 250 255 agg aag gtg ega ttg ctg tgg aag aag gca aga gga gcc ccc gtc. ttg 1055

Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu 260 265 270 gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gca gag aac age act 1103

Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His lie Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr 275 280 285 aac etc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ett 1151

Asn Leu Thr Glu He Asn Asn lie Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu Leu 290 295 300 305 ctg atg age cag gca cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ett 1199

Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu 310 315 320 ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247

Gly Lys Ser Gin Glu Thr lie Leu Arg lie Pro Asp Val His Glu Lys 325 330 335 acc ttc cag tac att aag age atg cag gcc tac ata gcc gag ccc ctg 1295

Thr Phe Gin Tyr lie Lys Ser Met Gin Ala Tyr He Ala Glu Pro Leu 340 345 350 ttg gtg gtg aac tgg caa age tcc att cct geg gtg gac act tgg ata 1343

Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser lie Pro Ala Val Asp Thr Trp lie 355 360 365 gtg gag tgg etc cca gaa get gcc atg teg aag ttc cct gcc ett tcc 1391

Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser 370 375 380 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc aeg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439

Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr He Glu Gin Asp Lys 39D 395 400 eta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487

Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn He $er Val Tyr Pro Val Leu Gly 405 410 415 cac ega gtt gga gag ccg tat tea ate caa get tat gee aaa gaa gga 1535

His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583

Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn He Gly Leu Arg 435 440 445 aca gee aeg ate aca tgg aag gag att cct aag agt get agg aat gga 1531

Thr Ala Thr He Thr Trp Lys Glu lie Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly 450 455 460 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa get gaa ggt gga aaa gaa 1679

Phe lie Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 61u 470 475 480 etc tee aag act gtt aac tet cat gee ctg cag tgt gac ctg gag tet 1727

Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu Ser 485 490 495 ctg aca ega agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gee age acc aga 1775

Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg 500 505 510 get gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate 1823

Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg lie Asn Phe Lys Thr Leu Ser He 515 520 525 agt gtg ttt gaa att gtc ett eta aca tet eta gtt gga gga ggc ett 1871

Ser Val Phe Glu lie Val Leu Leu Thr Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu 530 535 540 545 ett eta ett age ate aaa aca gtg act ttt ggc etc aga aag cca aac 1919

Leu Leu Leu Ser lie Lys Thr Val Thr Phe Gly Leu Arg Lys Pro Asn 550 555 560 egg ttg act ccc ctg tgt tgt cct gat. gtt ccc aac cct get gaa agt 1967

Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser 565 570 575 agt tta gcc aca tgg etc gga gat ggt ttc aag aag tea aat atg aag 2015

Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe Lys Lys Ser Asn Met Lys 580 585 590 gag act gga aac tet ggg aac aca gaa gac gtg gtc eta aaa cca tgt 2063

Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Glu Asp Val Val Leu Lys Pro Cys 595 600 605 ccc gtc ccc geg gat etc att gac aag ctg gta gtg aac ttt gag aat 2111

Pro Val Pro Ala Asp Leu He Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Asn 610 615 620 625 ttt ctg gaa gta gtt ttg aca gag gaa get gga aag ggt cag geg age 2159

Phe Leu Glu Val Val Leu Thr Glu Glu Ala Gly Lys Gly Gin Ala Ser 630 635 640 att ttg gga gga gaa geg aat gag tat ate tta tee cag gaa cca age 2207

He Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr He Leu Ser Gin Glu Pro Ser 645 650 655 tgt cct ggc cat tgc tgaagctacc ctcagggtcc aggacagctg tcttgttggc 2262 Cys Pro Gly His Cys 660 acttgactct ggcaggaacc tgatctctac ttttcttctc cctgtctccg gacactttct 2322 ctccttcatg cagagaccag gactagagcg gattcctcat ggtttgccag gctcctcagt 2382 ccttgctcgg gctcaggatc ttcaacaatg ccctttctgg gacactccat catccactta 2442 tatttatttt ttgcaacatt gtggattgaa cccagggact tgtttatgcg cgcaacttca 2502 gtaactgtgg cagagactta ggaatggaga tctgaccctt tgcagaaggt ttctggacat 2562 ccgtccctgt gtgagectca gacagcattg tctttacttt gaatcagctt ccaagttaat 2622 aaaagaaaaa cagagaggtg gcataacagc tcctgcttcc tgacctgctt gagttccagt 2682 tctgacttcc tttggtgatg aacagcaatg tgggaagtgt aagctgaata aaccctttcc 2742 tcccca 2748

<210> 57 <211> 662 <212> PRT <213> mus musculus <400> 57

Met Leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala 1 5 10 15

His Val Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly He Met Trp Thr Leu Ala 20 25 30

Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro 35 40 45

Thr Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu 50 55 60

Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr lie 65 70 75 80

Val Thr Let Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala 85 90 95

Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp 100 105 110

He Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys 115 120 125

Ser Asp lie Thr Tyr Trp His Leu He Ser He Ala Lys Thr Glu Pro 130 135 140

Pro lie He Leu Ser Val Asn Pro He Cys Asn Arg Met Phe Gin He 145 150 155 160

Gin Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met 165 170 175

Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe 180 185 190

Glu Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr 195 200 205

Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp 210 215 220

Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro 225 230 235 240

His Val Leu Asp Leu Trp Arg lie Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly 245 250 255

Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270

Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His lie Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser 275 280 285

Thr Asn Leu Thr Glu He Asn Asn He Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu 290 295 300

Leu Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser 305 310 315 320

Leu Gly Lys Ser Gin Glu Thr lie Leu Arg He Pro Asp Val His Glu 325 330 335

Lys Thr Phe Gin Tyr lie Lys Ser Met 61n Ala Tyr lie Ala Glu Pro 340 345 350

Leu Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser lie Pro Ala Val Asp Thr Trp 355 360 365

He Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu 370 375 380

Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr lie Glu Gin Asp 385 390 395 400

Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr Pro Val Leu 405 410 415

Gly His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala Lys Glu 420 425 430

Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn lie Gly Leu 435 440 445

Arg Thr Ala Thr lie Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser Ala Arg Asn 450 455 460

Gly Phe He Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 465 470 475 480

Glu Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu 485 490 495

Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr 500 ' 505 510

Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg He Asn Phe Lys Thr Leu Ser 515 520 525 lie Ser Val Phe Glu lie Val Leu Leu Thr Ser Leu Val Gly Gly Gly 530 535 540

Leu Leu Leu Leu Ser lie Lys Thr Val Thr Phe Gly Leu Arg Lys Pro 545 550 555 560

Asn Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val Pro Asn Pro Ala Glu 565 570 575

Ser Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe Lys Lys Ser Asn Met 580 585 590

Lys Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Glu Asp Val Val Leu Lys Pro 595 600 605

Cys Pro Val Pro Ala Asp Leu lie Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Glu 610 615 620

Asn Phe Leu Glu Val Val Leu Thr Glu Glu Ala Gly Lys Gly Gin Ala 625 630 635 640

Ser lie Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr He Leu Ser Gin Glu Pro 645 650 655

Ser Cys Pro Gly His Cys 660

<210> 58 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC6673 <400> 58 gcgcaaggtg ccgttcacag c 21 < 210 > 5 9

< 211> 3 6 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29082 <400> 59 caatttgttg ggttttttta gcagcagtag gcccag 36

<210> 60 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC290S3 <400> 60 ctgggcctac tgctgctaaa aaaacccaac aaattg 36 <210> 61 <211> 36

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29145 < 4 0 0 > 61 gcgtctagag ggttatattg aagttgggca ggaaga 36 < 210 > 62 <211> 33

<212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29359 <400> 62 gcgggatcca tgaagctctc tccccagcct tea 33 <210> 63 <211> 23

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27899 <400> 63 ccagaacttt gactccttga ccg 23

<210> 64 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC27895 <400> 64 gaagtcaact tegetaagaa ccg 23

<210> 65 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29122 <4GG> 65 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34 <210> 66 < 211> 33

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29451 <400> 66 ccggaattcc cctgatacat gaagctctct ccc 33 <210> 67 <211> 33

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29124 <400> 67 cgcggatccc tcaaagacac tgaatgacaa tgt 33 < 210 > 6 8 <211> 2295

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Polinucleótido que codifica fusão de zcytorl7-Fc4 humano

< 2 21> CDS <222> (2295' <400> 68 atg aag etc tct ccc cag cct tea tgt gtt aac: ctg ggg atg atg tgg 48

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Vai Asn Leu Gly Met Met Trp 15 10 15 acc tgg gea ctg tgg atg etc cct tea etc tgc aaa ttc age ctg gea 96

Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30 get ctg cca get aag cct gag aac att tee tgt gtc tac tac tat 'agg 144

Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45 aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa ace agt tat acc 192

Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60 cag tac aca gtt aag aga act tac get ttt gga gaa aaa cat. gat aat 240

Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80 tgt aca acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt get teg tgc tet ttt 288

Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95 ttc ett cca aga ata aeg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa 336

Phe Leu Pro Arg He Thr lie Pro Asp Asn Tyr Thr lie Glu Val Glu 100 105 110 get gaa aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg aga 384

Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val lie Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125 tta gag aac ata geg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa 432

Leu Glu Asn He Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys lie Phe Arg Val Lys 130 135 140 cca gtt ttg ggc ate aaa ega atg att caa att gaa tgg ata aag cct 480

Pro Val Leu Gly lie Lys Arg Met He Gin lie Glu Trp lie Lys Pro 145 150 155 160 gag ttg geg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ett ega ttc agg 528

Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175 aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc get aag aac cgt 576

Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190 aag gat aaa aac caa aeg tac aac etc aeg ggg ctg cag cct ttt aca 624

Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr 195 200 205 gaa tat gtc ata get ctg ega tgt geg gtc aag gag tea aag ttc tgg 672

Glu Tyr Val He Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp 210 215 220 agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa get cca 720

Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240 tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca get gag geg gat gga 768

Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255 aga agg cca gtg egg ttg tta tgg aag aag gca aga gga gee cca gtc 316

Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270 eta gag aaa aca ett ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age aac 864

Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285 act aac etc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ett gaa ctg 912

Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu 290 295 300 cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att tet tat aat tet 960

His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met lie Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320 ett ggg aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca get att caa gaa 1008

Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg lie Pro Ala lie Gin Glu 325 330 335 aaa tea ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt get gag gac 1056

Lys Ser Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350 cag eta gtg gtg aag tgg caa age tet get eta gac gtg aac act tgg 1104

Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365 atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc acc acc ett tee 1152

Net He Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 360 tgg gaa tet gtg tet cag gee aeg aac tgg aeg ate cag caa gat aaa 1200

Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr lie Gin Gin Asp Lys 385 390 395 400 tta aaa ccc ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat cca atg ttg cat 1248

Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415 gac aaa gtt ggc gag cca tat tee ate cag get tat gee aaa gaa ggc 1296

Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser lie Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 gtt cca tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att ggc gtg aag 1344

Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn lie Gly Val Lys 435 440 445 aeg gtc aeg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag aga aag ggt 1392

Thr Val Thr lie Thr Trp Lys Glu lie Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460 ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa get gaa ggt gga aaa gga 1440 lie He Cys Asn Tyr Thr He Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480 ttc tee aag aca gtc aat tee age ate ttg cag tac ggc ctg gag tee 1488

Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser He Leu Gin Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495 ctg aaa ega aag acc tet tac att gtt cag gtc atg gee age acc agt 1536

Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr He Val Gin Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510 get ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag aca ttg tea ttc 1584

Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525 agt gtc ttt gag gag ccc aga tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 1632

Ser Vai Phe Glu Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 530 535 540 ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tea gtc ttc ctc ttc 1680

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu Phe 545 550 555 560 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc egg acc cct gag gtc 1728

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai 555 570 " 575 aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 1776

Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 580 585 590 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 1824

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 595 600 605 egg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc 1872

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 610 615 620 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1920

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 625 630 635 640 tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 1968

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser IIe Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 645 650 655 aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 2016

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 660 665 670 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 2064

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 675 680 685 ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 2112

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 690 695 700 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 2160

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 2208

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 725 730 735 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag get ctg cac aac cac 2256

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 740 745 750 tac acg cag aag age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa taa 2295

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys * 755 760

<210> 69 <211> 764 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Polipéptido de fusão de Zcytorl7-Fc4 humano <400> 69

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp 15 10 15

Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30

Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45

Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60

Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 ' 70 75 80

Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95

Phe Leu Pro Arg lie Thr He Pro Asp Asn Tyr Thr He Glu Val Glu 100 105 110

Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val He Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125

Leu Glu Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys He Phe Arg Val Lys 130 135 140

Pro Val Leu Gly He Lys Arg Met He Gin He Glu Trp lie Lys Pro 145 150 155 160

Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175

Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190

Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr 195 200 205

Glu Tyr Val He Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp 210 215 220

Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240

Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255

Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270

Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn lie Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285

Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu 290 295 300

His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met lie Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320

Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg lie Pro Ala lie Gin Glu 325 330 335

Lys Ser Phe Gin Cys lie Glu Val Met Gin Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350

Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365

Met lie Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 380

Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr lie Gin Gin Asp Lys 385 390 395 400

Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415

Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430

Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn He Gly Val Lys 435 440 445

Thr Val Thr lie Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460

He lie Cys Asn Tyr Thr lie Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480

Phe Ser Lys Thr Val Asn Sen Ser He Leu Gin Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495

Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr He Val Gin Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510

Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser lie Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525

Ser Val Phe Glu Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 530 535 540

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 545 550 555 560

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val 565 570 575

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 580 585 590

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 595 600 605

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr ' 610 615 ' 620

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 625 630 635 640

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr He Ser Lys Ala 645 650 655

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 660 665 670

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 675 680 685

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 690 695 700

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 725 730 735

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 740 745 750

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 755 760 <210> 70 <211> 34

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29157 <400> 70 ctagtatggc cggccatgaa gctctctccc cage 34 <210> 71 < 211> 41

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29150 <400> 71 gtctgaagat ctgggetcct caaagacact gaatgaeaat g 41 < 210 > 72

< 211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29180 <400> 72 cctggagtcc ctgaaacgaa ag 22

<210> 73 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC28917 <400> 73 tgcaagatgc tggaattgac 20

<210> 74 <211> 19 < 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC29179 <400> 74 gcagggttgg gaacggtgg 19 <210> 75 <211> 20

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC28916 <400> 75 agtcaattcc agcatcttgc 20 <210> 76 < 211> 2 0

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC28918 < 4 0 0 > 7 6 tcacagagtc atcagactcc 20

<210> 77 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC38065 <400> 77 ctttcctggg aatctgtgtc t 21 <21G> 78 <211> 18

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleotide ZC38068 <400> 78 cctccagctc tggtgctg 18

<210> 79 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC10651 <400> 7 9 agcttttctg cagcagctct 20

<210> 80 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador de oligonucleótido ZC10565 <400> 80 tttgcagaaa aggttgcaaa tgc 23

<210> 81 <211> 24 <212> ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC37877 <400> 81 caaaaaaccc aacaaattga etea 24

<21Q> 82 <211> 25 <212> ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC37876 <400> 82 catgtggcta tactactttc agcag 25

<210> 83 < 211> 22 <212> ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC37776 zcytorl7 Sonda TaqMan® <400> 83 ctgtgttggc ccaccgttcc ca 22

<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial < 2 2 0 > <223> iniciador direto de ARNm <400> 84 cggctaccac atccaaggaa 20 <210> 85 <211> 18

< 212 > ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial <220> <223> Iniciador reverso de ARNr <400> 85 gctggaatta ccgcggct 18

< 210 > 86 <211> 22 <212> ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial <220> <223> ARNr Sonda TaqMan® <400> 86 tgctggcacc agacttgccc tc 22 <210> 87 <211> 21

< 212 > ADN <213> Iniciador de oligonucleótido ZCSequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC22276 <400> 87 gcttgccctt cagcatgtag a 21

< 210 > 88 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC38239 <400> 88 gccgactaag ccagagaac 19 <210> 89 <211> 20

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC38245 <400> 89 ctgttgacag ttctgaaccg 20 <210> 90 < 211> 2 0

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleótido ZC38238 < 4 0 0 > 90 cgcggtttcc attgtatctg 20

<210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de marcador Glu-Glu modificado <400> 91

Gly Sen Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 92 <211> 2728 <212> ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222 > (237' . . . (1877' <400> 92 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 tfcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gcfggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met 1 ctg age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca ggg gca gcc cac 287

Leu 5er Ser Gin Lys Gly Ser C.ys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala His 5 10 15 gtc cag cct ctg ggt gtg aac get gga ata atg tgg acc ttg gca ctg 335

Val Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly He Met Trp Thr Leu Ala Leu 20 25 30 tgg gca ttc tet ttc etc tgc aaa ttc age ctg gca gtc ctg ccg act 383

Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro Thr 35 40 45 aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431

Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu Thr 50 55 60 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479

Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr He Val 70 75 80 act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat get aca 527

Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala Thr 85 90 95 gag get tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gca atg ccc cca gac ate 575

Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp lie 100 105 110 tgc agt gtt gaa gta caa get caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623

Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys Ser 115 120 125 gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gca aaa acc gaa cca cct 671

Asp Tie Thr Tyr Trp His Leu He Ser He Ala Lys Thr Glu Pro Pro 130 135 140 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719 lie.lie Leu Ser Val Asn Pro He Cys Asn Arg Met Phe Gin lie Gin 150 155 160 tgg aaa ccg cgt gaa aag act. cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ett 767

Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met Leu 155 170 175 egg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg aeg gaa gtc aat ttt gaa 815

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe Glu 180 185 190 aac tgt aaa cag gtc tgc aac etc aca gga ett cag get ttc aca gaa 863

Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr Glu 195 200 205 tat gtc ctg get eta ega ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911

Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp Ser 210 215 220 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959

Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro His 230 235 240 gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gca gac atg aac gga gac 1007

Val Leu Asp Leu Trp Arg He Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp 245 250 255 agg aag gtg ega ttg ctg tgg aag aag gca aga gga gee ccc gtc ttg 1055

Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu 260 265 270 gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gca gag aac age act 1103

Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His He Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr 275 280 285 aac etc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ett 1151

Asn Leu Thr Glu He Asn Asn He Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu Leu 290 295 300 305 ctg atg age cag gca cac tet gtg tee gtg act tet ttt aat tet ett 1199

Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu 310 315 320 ggc aag tee caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247

Gly Lys Ser Gin Glu Thr lie Leu Arg lie Pro Asp Val His Glu Lys 325 330 335 acc ttc cag tac att aag age atg cag gee tac ata gee gag ccc ctg 1295

Thr Phe Gin Tyr He Lys Ser Met Gin Ala Tyr He Ala Glu Pro Leu 340. ’ 345 350 ttg gtg gtg aac tgg caa age tee att cct geg gtg gae act tgg ata 1343

Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser He Pro Ala Val Asp Thr Trp lie 355 360 365 gtg gag tgg etc cca gaa get gee atg teg aag ttc cct gee ett tee 1391

Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser 370 375 380 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc aeg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439

Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr He Glu Gin Asp Lys 390 395 400 eta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487

Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly 405 410 415 cac ega gtt gga gag ccg tat tea ate caa get tat gee aaa gaa gga 1535

His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser lie Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583

Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn lie Gly Leu Arg 435 440 445 aca gee aeg ate aca tgg aag gag att cct aag agt get agg aat gga 1631

Thr Ala Thr lie Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly 450 455 460 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa get gaa ggt gga aaa gaa 1679

Phe lie Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Glu 470 475 480 etc tee aag act gtt aac tet cat gee ctg cag tgt gae ctg gag tet 1727

Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu Ser 485 490 495 ctg aca ega agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gee age acc aga .1775

Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg 500 505 510 get gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate 1823

Ala G'ly Gly Thr Asn Gly Val Arg He Asn Phe Lys Thr Leu Ser lie 515 520 525 agt gag tac tgg ctt cag gcc tea ttc tgg agt tta ett egg gtt gga 1871

Ser Glu Tyr Trp Leu Gin Ala Ser Phe Trp Ser Leu Leu Arg Val Gly 530 535 540 545 aat gtt tgacaggagc aaggagagee ageagaggge ageagageat ggcttctcct 1927 Asn Val gctctctctg getcactcae ctcceaggag ttactgagga gctggcaaag ggagggctga 1987 gttagaccaa caggccattt tgatccttgc tggtaageag ccacaaataa tettaagatg 2047 aagcaagcaa catccacttc agcctcagcc acgtcaaagg ctgttgcctg agctcacact 2107 ggccagttcc taaatgtcag gagttgtgca atagaacctg ggaaggaaca actggttgat 2167 cagaggtcac tgacaaggga cttaatgtta ccatctgcgg tggggctttt gtttcgtttt 2227 gtttgtttgt tatgtgtatt caacttatca gcttttacgt tgaaaacatg aaaagcaaga 2287 caaatttgtt agatatcaca tataatgtga aatataatag tttaataatt gagtaggaaa 2347 gctgagggca tgtaatagac agagggaaaa gaagaggaaa gccagtctgg tetacaaagt 2407 gagttccagg acagccaggg ctacatggag aaaccctgtc tcaatcaatc aatcaatcaa 2467 tcaatcagtc aatcaatcaa aattcaagca gcattgacaa gttttgcaat aactactata 2527 aaccaaaaaa gtcatcttga tgtatctcag aagccccttg ttatttatgt tcctgaagac 2587 taaagtagac cgtggctctg agaaccatga gcaagataac acgttctgtc ctgcagccta 2647 acaatgcctt cttggtattc tttttgatac aacttctaaa ataacttttt tttaaaaaaa 2707 ataaaaatca tgttacagct a 2728

<210> 93 <211> 547 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 93

Met Leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala 1 5 10 15

His Val Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly He Met Trp Thr Leu Ala 20 25 30

Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro 35 40 45

Thr Lys Pro Glu Asn lie Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu 50 55 60

Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ele 55 70 75 80

Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asm Ala 85 90 95

Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp 100 105 110 lie Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys 115 120 125

Ser Asp He Thr Tyr Trp His Leu lie Ser He Ala Lys Thr Glu Pro 130 135 140

Pro He He Leu Ser Val Asn Pro lie Cys Asn Arg Met Phe Gin lie 145 150 155 160

Gin Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met 165 ' 170 175

Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe 180 185 190

Glu Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr 195 200 205

Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp 210 215 220

Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro 225 230 235 240

His Val Leu Asp Leu Trp Arg He Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly 245 250 255

Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270

Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His lie Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser 275 280 285

Thr Asn Leu Thr Glu He Asn Asn lie Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu 290 295 300

Leu Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser 305 310 315 320

Leu Gly Lys Ser Gin Glu Thr lie Leu Arg He Pro Asp Val His Glu 325 330 335

Lys Thr Phe Gin Tyr He Lys Ser Met Gin Ala Tyr He Ala Glu Pro 340 345 350

Leu Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser lie Pro Ala Val Asp Thr Trp 355 360 365 lie Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu 370 375 380

Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr lie Glu Gin Asp 385 390 395 400

Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn lie Ser Val Tyr Pro Val Leu 405 410 415 61 y His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser He Gin Ala Tyr Ala Lys Glu 420 425 430

Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn lie Gly Leu 435 440 445

Arg Thr Ala Thr lie Thr Trp Lys Glu He Pro Lys Ser Ala Arg Asn 450 455 460

Gly Phe lie Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 465 470 475 480

Glu Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu 485 490 495

Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr 500 505 510

Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg lie Asn Phe Lys Thr Leu Ser 515 520 525 lie Ser Glu Tyr Trp Leu Gin Ala Ser Phe Trp Ser Leu Leu Arg Val 530 535 540

Gly Asn Val 545

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboraçãoô ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 1188830 A[0002] • WO 0073451 A [0042] • US 4683202 Aô Mullis [0056] • US 5284755 Aô Gearing [0064] [0106] • US 5155027 A [0073] • US 5567584 A [0073] • US 5223409 Aô Ladner [0086] [0166] • WO 92062045 A [0086] • WO 9720078 A [0087] • US 5037743 Aô Welch [0095] [0101] • US 5143830 Aô Holland [0095] • US 4713339 Aô Levinson [0097] • US 4784950 Aô Hagen [0097] • US 4579821 Aô Palmiter [0097] • US 4656134 Aô Ringold [0097] • US 4956288 A [0097] • US 4601978 A [0097] • US 5162222 Aô Guarino [0099] • WO 9406463 A [0099] • US 5300435 A [0100] • US 4599311 Aô Kawasaki [0101] • US 4931373 Aô Kawasaki [0101] • US 4870008 Aô Brake [0101] • US 4845075 Aô Murray [0101] • US 4615974 Aô Kingsman [0101] • US 4977092 Aô Bitter [0101] • US 4990446 A [0101] • US 5063154 A [0101] • US 5139936 A [0101] • US 4661454 A [0101] • US 4882279 Aô Gregg [0101] • US 4935349 AÔ McKnight [0101] • US 5162228 Aô Sumino [0101] • US 4486533 Aô Lambowitz [0101] • WO 9717450 A [0102] • WO 9717451 A [0102] • WO 9802536 A [0102] • WO 9802565 A [0102] • WO 9521930 A [0108] • WO 9824893 A [0165] • US 4946778 Aô Ladner [0166] • US 5403484 Aô Ladner [0166] • US 5571698 Aô Ladner [0166] • US 5399346 Aô Anderson [0181] • US 4650764 AÔ Temin [0181] • US 304980289 BÔ Temin [0181] • US 5124263 Aô Temin [0181] • WO 9507358 Aô Dougherty [0181] • US 09404641 B [0276] • US 09522217 B [0276] • US 60214282 B [0311] • US 60214955 B [0311] • US 60267963 B [0311]

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Claims (30)

REIVINDICAÇÕES

1. Um polinucleótido isolado que codifica um polipêptidoô em que a sequência de aminoãcidos do polipéptido é selecionada a partir do grupo de: (a' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 1 (Met' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2 ; (b' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; (c' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 544 (Lys' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; (d' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 1-239 da SEQ ID NO: 22; (e' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO:2; (f' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1 (Met' a 649 (Ile' como mostrado na SEQ ID NO:46; e (g' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1-324 da SEQ ID NO: 18.

2. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação lô em que o polipéptido codificado consiste numa sequência de aminoãcidos selecionada a partir de: (i' resíduos de aminoãcidos 1-732 da SEQ ID NO:2; (ii' resíduos de aminoãcidos 20-732 da SEQ ID N0:2; (iii' resíduos de aminoãcidos 544-732 da SEQ ID NO: 2; e (iv' resíduos de aminoãcidos 1-239 da SEQ ID NO: 22.

3. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1 (c'ô em que o polipéptido compreende ainda um domínio transmembrana que consiste nos resíduos 520 (lie' a 543 (Leu' da SEQ ID NO:2.

4. Um polinucleótido isoladoô em que a sequência de ácidos nucleicos do polinucleótido é selecionada a partir do grupo de: (a' uma sequência de polinucleótidos que compreendem os resíduos de nucleótidos de 1 a 2402 como mostrado na SEQ ID NO:1; (b' uma sequência de polinucleótidos que compreendem os resíduos de nucleótidos de 1 a 2366 como mostrado na SEQ ID NO:1; (c' uma sequência de polinucleótidos que compreendem os resíduos de nucleótidos 171 a 2366 como mostrado na SEQ ID NO:1; (d' uma sequência de polinucleótidos que compreendem os resíduos de nucleótidos 228 a 2366 como mostrado na SEQ ID NO:1; (e' uma sequência de polinucleótidos que compreendem os resíduos de nucleótidos 1800 a 2366 como mostrado na SEQ ID NO:1; (f' uma sequência de polinucleótidos que compreendem SEQ ID NO: 21; (g' uma sequência de polinucleótidos que consiste em resíduos de nucleótidos 228 a 851 como mostrado na SEQ ID NO : 1; (h' uma sequência de polinucleótidos que consiste em resíduos de nucleótidosl62 a 2108 como mostrado na SEQ ID NO:4 5; (i' uma sequência de polinucleótidos que consiste na SEQ ID NO: 17; e (j ' uma sequência de polinucleótidos complementar a (a' até (i'.

5. Um vetor de expressão que compreende os seguintes elementos operativamente ligados: um promotor de transcrição; um segmento de ADN que codifica um polipéptido; e um terminador de transcriçãoô em que o promotorô segmento de ADNô e terminador são operativamente ligados; e em que a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i' uma sequência de aminoácidos que compreendem os resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO:2; (ii' uma sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; e (iii' uma sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO:2.

6. Um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 5ô em que o polipéptido codificado é como definido em (i' ou (ii'ô e em que o vetor de expressão compreende ainda uma sequência de sinal secretor operativamente ligada ao segmento de ADN.

7. Um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 6 em que a sequência de sinal secretor compreende os resíduos de aminoácidos 1-19 da SEQ ID NO:2.

8. Uma célula cultivada que compreende um vetor de expressão de acordo com qualquer das reivindicações 5-7ô em que a célula expressa o polipéptido codificado pelo segmento de ADN.

9. Uma construção de ADN que codifica uma proteína de fusãoô em que a construção de ADN compreende: (i' um primeiro segmento de ADN que codifica um polipéptidoô em que a sequência de aminoácidos do polipéptido é selecionada a partir do grupo de: (a' uma sequência de aminoácidos que compreendem os resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2 ; (b' uma sequência de aminoácidos que compreendem os resíduos de aminoácidos 544 (Lys' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; (c' uma sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; e (d' uma sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO:2; e (ii' um outro segmento de ADN que codifica um polipéptido adicionalô em que o polipéptido adicional é uma proteína heteróloga selecionada a partir de: (a' uma região ou domínio de uma outra proteína da família de recetor de citocina humana; (b' um péptido de sinal secretor não nativo eúou não relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão; e (c' uma etiqueta de afinidade selecionada a partir de uma proteína de ligação a maltose ou um domínio de imunoglobulinaa; em que o dito primeiro segmento de ADN ou outros codificam a proteína de fusão.

10. Um vetor de expressão que compreende os seguintes elementos operativamente ligados: um promotor de transcrição; uma construção de ADN que codifica uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 9; e um terminador de transcriçãoô em que o promotor é operativamente ligado à construção de ADNô e a construção de ADM é operativamente ligada ao terminador de transcrição.

11. Uma célula cultivada que compreende um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 10Ô em que a célula expressa o polipéptido codificado pela construção de ADN.

12. Um método de produção de uma proteína de fusãoô que compreende cultivar uma célula de acordo com a reivindicação 11 e isolar o polipéptido produzido pela célula.

13. Um polipéptido isoladoô em que a sequência de aminoãcidos do polipéptido é selecionada a partir do grupo de: (a' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 1 (Met' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2 ; (b' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; (c' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 544 (Lys' a 732 (Vai' como mostrado na SEQ ID NO: 2; (d' uma sequência de aminoãcidos que compreendem os resíduos de aminoãcidos 1-239 da SEQ ID NO: 22; (e' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO:2; (f' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1 (Met' a 649 (Ile' como mostrado na SEQ ID NO:46; e (g' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1-324 da SEQ ID NO: 18.

14. Um polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 13ô em que o polipéptido consiste numa sequência de aminoácidos selecionada a partir de: (i' resíduos de aminoácidos 1-732 da SEQ ID NO: 2 ; (ii' resíduos de aminoácidos 20-732 da SEQ ID N0:2; (iii' resíduos de aminoácidos 544-732 da SEQ ID NO: 2; e (iv' resíduos de aminoácidos 1-239 da SEQ ID NO: 22.

15. Um polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 13(c'ô em que o polipéptido compreende ainda um domínio transmembrana que consiste nos resíduos 520 (lie' a 543 (Leu' da SEQ ID NO:2.

16. Um método de produção de um polipéptido que compreende cultivar a célula de acordo com a reivindicação 8 e isolar o polipéptido produzido pela célula.

17. Um método de produção de um anticorpo não humano a um polipéptido de acordo com a reivindicação 13 ou 14ô em que o polipéptido provoca uma resposta imune num animal não humano inoculado para produzir um anticorpo que se liga especificamente ao polipéptidoô e em que o anticorpo pode ser isolado a partir do animal não humano.

18. Um anticorpo que se liga especificamente ao polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 13-15 .

19. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 18ô que se liga especificamente a um polipéptido que consiste nos resíduos de aminoácidos 20-732 da SEQ ID NQ:2.

20. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 18 ou 19ô em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

21. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 18 ou 19ô em que o anticorpo é um anticorpo policlonal.

22. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 20ô em que o anticorpo monoclonal é humanizado.

23. Um método de deteçãoô numa amostra de tested da presença de um modulador de atividade de proteína de recetor de citocinaô que compreende: cultivar uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 5ô em que a célula expressa a proteína codificada pelo segmento de ADN na presença e ausência de uma amostra de teste; e comparar níveis de atividade da proteína na presença e ausência de uma amostra de testeô por um ensaio biológico ou bioquímico; e determinar a partir da comparaçãoô a presença de modulador da atividade de proteína na amostra de teste.

24. Um método para detetar um ligando de recetor de citocina dentro de uma amostra de testeô que compreende: colocar em contato uma amostra de teste com um polipéptidoô em que a sequência de aminoãcidos do polipéptido é selecionada a partir do grupo de: (a' uma sequência de aminoácidos que compreendem os resíduos de aminoácidos 1-239 da SEQ ID NO:22; (b' a sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 1-324 da SEQ ID NO:18; (c' uma sequência de aminoãcidos que consiste nos resíduos de aminoãcidos 20 (Ala' a 227 (Pro' como mostrado na SEQ ID NO: 2; e detetar a ligação do dito polipéptido a um ligando na amostra.

25. Um método de acordo com a reivindicação 24ô em que o polipéptido é ligado à membrana dentro de uma célula cultivadaô e a etapa de deteção compreende medir uma resposta biológica na célula cultivada.

26. Um método de acordo com a reivindicação 2 5ô em que a resposta biológica é proliferação celular ou ativação de transcrição de um gene repórter.

27. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação lô em que a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado é como foi definida em (b'.

28. Um polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação l(b'ô em que o polipéptido codificado consiste nos resíduos de aminoácidos 20-732 da SEO ID NO:2.

29. Um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 5ô em que a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado é como foi definida em (i' .

30. Uma construção de ADN de acordo com a reivindicação 9ô em que a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado é como foi definida em (i'(a'.