JPS62269697A - エリスロポエチンの製造方法 - Google Patents
エリスロポエチンの製造方法Info
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
３、発明の詳細な説明
崖１」Ｊソ旧」１艷
本発明は、造血因子、すなわち、赤血球生成促進因子で
あるエリスロポエチン（ヒト・エリスロポエチン）の製
造方法、さらに詳しくは、ｍｔ＊えＤＮＡ技術によりエ
リスロポエチンの高い産生能を有する細胞を作成し、該
エリスロポエチン産生細胞を用いてヒト・エリスロポエ
チンを効率的に製造する方法に関する。
あるエリスロポエチン（ヒト・エリスロポエチン）の製
造方法、さらに詳しくは、ｍｔ＊えＤＮＡ技術によりエ
リスロポエチンの高い産生能を有する細胞を作成し、該
エリスロポエチン産生細胞を用いてヒト・エリスロポエ
チンを効率的に製造する方法に関する。
従 の 層とその５ 占
エリスロポエチンは、骨髄に存在する赤血球系前駆細胞
（ＣＦＵ−Ｅ）に作用して、赤血球細胞への分化を促進
する赤血球生成促進因子であって、ヒト・エリスロポエ
チンの物性は下記のとおり報告されている。
（ＣＦＵ−Ｅ）に作用して、赤血球細胞への分化を促進
する赤血球生成促進因子であって、ヒト・エリスロポエ
チンの物性は下記のとおり報告されている。
ヒト・エリスロポエチンは、分子３１３５．０００を有
する糖タンパク質であって、（Ｙａｎａｇａｗａ Ｓ、
ｅｔ ａｌ。
する糖タンパク質であって、（Ｙａｎａｇａｗａ Ｓ、
ｅｔ ａｌ。
ｒＪ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、Ｊ （ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリ伺、２５９．２７０７−２
７１０ （１９８４））、そのペプチド部分は１６６個
のアミノ酸より成る１本鎖ポリペプチドである（Ｊａｃ
ｏｂ Ｋ、ｅｔ ａｔ、 ｒＮａｔｕｒｅＪ （ネーチ
ア）、」旦、８０６−８１０ （１９８５）］とそれぞ
れ報告されている。
バイオロジカル ケミストリ伺、２５９．２７０７−２
７１０ （１９８４））、そのペプチド部分は１６６個
のアミノ酸より成る１本鎖ポリペプチドである（Ｊａｃ
ｏｂ Ｋ、ｅｔ ａｔ、 ｒＮａｔｕｒｅＪ （ネーチ
ア）、」旦、８０６−８１０ （１９８５）］とそれぞ
れ報告されている。
また、ヒト・エリスロポエチンのｃＤＮＡ及びゲノムＤ
ＮＡの構造も上記Ｊａｃｏｂ Ｋ、等の報告にみられる
とおり明らかにされている。
ＮＡの構造も上記Ｊａｃｏｂ Ｋ、等の報告にみられる
とおり明らかにされている。
また、エリスロポエチンの臨床的効用については、貧血
患者の尿より採取して純化した標品を用いての動物実験
に基づいて、エリスロポエチンの赤血球産生の亢進効果
が確認されている（ＭａｓｕｎａｇａＨ，ｅｔ ａｌ、
ｒ＾ｃｔａ Ｈｅ＋ｗａｔａｌ Ｊｐｎ、 Ｊ
ｉｎ ｐｒｅｓｓ （アクタ ヒマトロシイ ジャパン
）インプレス〕。
患者の尿より採取して純化した標品を用いての動物実験
に基づいて、エリスロポエチンの赤血球産生の亢進効果
が確認されている（ＭａｓｕｎａｇａＨ，ｅｔ ａｌ、
ｒ＾ｃｔａ Ｈｅ＋ｗａｔａｌ Ｊｐｎ、 Ｊ
ｉｎ ｐｒｅｓｓ （アクタ ヒマトロシイ ジャパン
）インプレス〕。
したがって、エリスロポエチンは、臨床上の応用として
腎疾患者の貧血治療、腎不全或は腎摘出後の血液透析患
者の貧血防止、手術後患者の赤血球産生増進による回復
促進等への適応が可能な医薬に用いられる。
腎疾患者の貧血治療、腎不全或は腎摘出後の血液透析患
者の貧血防止、手術後患者の赤血球産生増進による回復
促進等への適応が可能な医薬に用いられる。
而して、エリスロポエチンは、上述のように臨床上貧血
治療への応用が期待されるものの、医薬としての高純物
のものを大量に供給することが困難であるため、医薬品
として開発は遅れているのが現状である。すなわち、エ
リスロポエチンは再生不良性貧血患者の尿中に含まれて
いることから、従来は、該尿から分離、採取して精製し
たものを試験研究に用いられるにすぎなかった。
治療への応用が期待されるものの、医薬としての高純物
のものを大量に供給することが困難であるため、医薬品
として開発は遅れているのが現状である。すなわち、エ
リスロポエチンは再生不良性貧血患者の尿中に含まれて
いることから、従来は、該尿から分離、採取して精製し
たものを試験研究に用いられるにすぎなかった。
このような状況に鑑み、本発明者等は、最近エリスロポ
エチンで免役した実験動物の肺臓細胞とミエローマ細胞
とを細胞融合させたハイプリドーマより得られるモノク
ローナル抗エリスロポエチン抗体を結合した吸着剤を用
いることにより、貧血患者尿から純粋なエリスロポエチ
ンを高収率で製造する方法を開発したく特開昭６０−４
１６１４号）。
エチンで免役した実験動物の肺臓細胞とミエローマ細胞
とを細胞融合させたハイプリドーマより得られるモノク
ローナル抗エリスロポエチン抗体を結合した吸着剤を用
いることにより、貧血患者尿から純粋なエリスロポエチ
ンを高収率で製造する方法を開発したく特開昭６０−４
１６１４号）。
しかし、上記方法によるも原料としての上記尿の供給が
制限されるため、エリスロポエチンを大量に生産して医
薬として定常的に供給することは困難とされる。
制限されるため、エリスロポエチンを大量に生産して医
薬として定常的に供給することは困難とされる。
したがって、エリスロポエチンを貧血治療用医薬として
提供するには、高い生産量を示すエリスロポエチン産生
細胞の作成を確立することにより、高純度のエリスロポ
エチンを高収率で製造するための技術を確立する必要が
あると考えられている。
提供するには、高い生産量を示すエリスロポエチン産生
細胞の作成を確立することにより、高純度のエリスロポ
エチンを高収率で製造するための技術を確立する必要が
あると考えられている。
■がンしようとする課
本発明は、エリスロポエチン生産上の上述した状況に鑑
みなされたものであって、組換えＤＮＡ技術を利用する
ことにより、エリスロポエチンの高い生産能を有するエ
リスロポエチン産生細胞を作成し、該細胞を培養して得
られたエリスロポエチンをモノクローナル抗ヒト・エリ
スロポエチン抗体吸着カラムを用いて精製することによ
り、高純度のエリスロポエチンを高収率で製造し得る方
法を提供することを課題とする。すなわち、本発明は、
貧血患者尿或は低い生産性のエリスロポエチン産生細胞
の培養上清液を原料として用いてエリスロポエチンを製
造することから成る従来方法の問題点であった原料上の
制約を解消して、エリスロポエチンを大量生産方式で製
造することを可能とするものである。
みなされたものであって、組換えＤＮＡ技術を利用する
ことにより、エリスロポエチンの高い生産能を有するエ
リスロポエチン産生細胞を作成し、該細胞を培養して得
られたエリスロポエチンをモノクローナル抗ヒト・エリ
スロポエチン抗体吸着カラムを用いて精製することによ
り、高純度のエリスロポエチンを高収率で製造し得る方
法を提供することを課題とする。すなわち、本発明は、
貧血患者尿或は低い生産性のエリスロポエチン産生細胞
の培養上清液を原料として用いてエリスロポエチンを製
造することから成る従来方法の問題点であった原料上の
制約を解消して、エリスロポエチンを大量生産方式で製
造することを可能とするものである。
本発明者は、エリスロポエチン遺伝子を、特別に作成し
たベクターを介してマウス由来のプサイ（甲）２細胞或
はシリアンハムスター子腎由来のＢ ＨＫ２１）［１胞
へ導入することによりエリスロポエチンを恒常的に効率
よく産生ずる細胞を作成し、得られたエリスロポエチン
産生細胞を培養してエリスロポエチンを生産し、次いで
エリスロポエチンを単離、精製することにより、上記課
題の解決に成功した。
たベクターを介してマウス由来のプサイ（甲）２細胞或
はシリアンハムスター子腎由来のＢ ＨＫ２１）［１胞
へ導入することによりエリスロポエチンを恒常的に効率
よく産生ずる細胞を作成し、得られたエリスロポエチン
産生細胞を培養してエリスロポエチンを生産し、次いで
エリスロポエチンを単離、精製することにより、上記課
題の解決に成功した。
以下本発明の詳細な説明する。
ｌ豆立盪底
本発明の特徴は、エリスロポエチン遺伝子を、レトロウ
ィルスＬ Ｔ Ｒ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅ
ｐｅａｔ）のプロモーターを有するベクターに挿入する
ことによりエリスロポエチン形質導入ベクターを作成し
、該エリスロポエチン形質導入ベクターをＤＮＡトラン
スフェクション法によりプサイ（’Ｐ）２細胞或はＢＨ
Ｋ２１ｆ［胞へ導入してエリスロポエチン産生細胞を作
成するとともに工’ｆスロポエチンを恒常的に産生ずる
細胞を樹立し、次いで該細胞を培養してエリスロポエチ
ンを生産し、得られたエリスロポエチンをモノクローナ
ル抗ヒト・エリスロポエチン抗体吸着カラムにより単離
することにある。
ィルスＬ Ｔ Ｒ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅ
ｐｅａｔ）のプロモーターを有するベクターに挿入する
ことによりエリスロポエチン形質導入ベクターを作成し
、該エリスロポエチン形質導入ベクターをＤＮＡトラン
スフェクション法によりプサイ（’Ｐ）２細胞或はＢＨ
Ｋ２１ｆ［胞へ導入してエリスロポエチン産生細胞を作
成するとともに工’ｆスロポエチンを恒常的に産生ずる
細胞を樹立し、次いで該細胞を培養してエリスロポエチ
ンを生産し、得られたエリスロポエチンをモノクローナ
ル抗ヒト・エリスロポエチン抗体吸着カラムにより単離
することにある。
課 ”°するための
本発明では、まず下記手段に従ってエリスロポエチン形
質導入ベクターを作成する。
質導入ベクターを作成する。
■選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子を含有するエリスロポエ
チン形質導入ベクターの作成： ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーから入手した全エリス
ロポエチンゲノム遺伝子を、プラスミドｐＵｃ８の制限
酵素ＥｃｏＲＩと５ｔｓａ Ｉによる切断部位に挿入し
たプラスミドｐｈＥＰ１４０４を制限酵素ＢｇｌＩｒ及
びＢａｍＨＩで切断してエリスロポエチン遺伝子を分離
し、該エリスロポエチン遺伝子を哺乳動物細胞用シャト
ルベクターｐＺＴＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１のＬＴＲの下
流でＮ ｅ ｏ ’遺伝子の上流の制限酵素ＢａｍＨｒ
切断部位に挿入し、エリスロポエチン遺伝子が正しく挿
入されたものを制限訪素地図解析により選択して得られ
る。
チン形質導入ベクターの作成： ヒト・ゲノムＤＮＡライブラリーから入手した全エリス
ロポエチンゲノム遺伝子を、プラスミドｐＵｃ８の制限
酵素ＥｃｏＲＩと５ｔｓａ Ｉによる切断部位に挿入し
たプラスミドｐｈＥＰ１４０４を制限酵素ＢｇｌＩｒ及
びＢａｍＨＩで切断してエリスロポエチン遺伝子を分離
し、該エリスロポエチン遺伝子を哺乳動物細胞用シャト
ルベクターｐＺＴＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１のＬＴＲの下
流でＮ ｅ ｏ ’遺伝子の上流の制限酵素ＢａｍＨｒ
切断部位に挿入し、エリスロポエチン遺伝子が正しく挿
入されたものを制限訪素地図解析により選択して得られ
る。
■エリスロポエチン形質導入ベクター（選択マーカーｎ
ｅｏｒ遺伝子を含まない）の作成：ヒトゲノムエリスロ
ポエチン遺伝子を哺乳動物細胞用シャトルベクターｐＫ
ＳＶ−１０の５Ｖ−４０初期遺伝子プロモーターの下流
に挿入したエリスロポエチン遺伝子発現ベクターρ５Ｖ
ｈＥＰＸを制限酵素Ａｐａｌで切断した後、Ｔ４ポリメ
ラーゼで３′突起部位を除去し、次いで制限酵素Ｂａｍ
Ｈｒで切断してエリスロポエチン遺伝子を含む切断片を
得、一方ＣＡＴ遺伝子発現ベクターｐＭＬＶＣＡＴを制
限酵素Ｂａ５ａｌとＳａａ＋１で切断してＬＴＲを含む
切断片を得、このようにして得た両断片を１４リガーゼ
により接続してエリスロポエチン遺伝子が正しく挿入さ
れたものを制限酵素地図解析により選択して得られる。
ｅｏｒ遺伝子を含まない）の作成：ヒトゲノムエリスロ
ポエチン遺伝子を哺乳動物細胞用シャトルベクターｐＫ
ＳＶ−１０の５Ｖ−４０初期遺伝子プロモーターの下流
に挿入したエリスロポエチン遺伝子発現ベクターρ５Ｖ
ｈＥＰＸを制限酵素Ａｐａｌで切断した後、Ｔ４ポリメ
ラーゼで３′突起部位を除去し、次いで制限酵素Ｂａｍ
Ｈｒで切断してエリスロポエチン遺伝子を含む切断片を
得、一方ＣＡＴ遺伝子発現ベクターｐＭＬＶＣＡＴを制
限酵素Ｂａ５ａｌとＳａａ＋１で切断してＬＴＲを含む
切断片を得、このようにして得た両断片を１４リガーゼ
により接続してエリスロポエチン遺伝子が正しく挿入さ
れたものを制限酵素地図解析により選択して得られる。
また、上記■により作成されるエリスロポエチン形′１
を導入ベクターを用いて動物細胞でエリスロポエチンの
形質導入を行うに際して、エリスロポエチン遺伝子を動
物細胞において高く発現させるために上記形質導入ベク
ターと混合して用いる選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子導入
ベクターは下記手順に従って作成し得る。
を導入ベクターを用いて動物細胞でエリスロポエチンの
形質導入を行うに際して、エリスロポエチン遺伝子を動
物細胞において高く発現させるために上記形質導入ベク
ターと混合して用いる選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子導入
ベクターは下記手順に従って作成し得る。
■選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子導入ベクター（ｐＫＳＶ
Ｎｅｏ）の作成： 選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子を含有するプラスミドｐＮ
ＥＯを制限酵素旧ｎｄｌＩ［で切断した後、ＫＩｅｎｏ
ｗ酵素ＤＮＡポリメラーゼ）で５′突起を修復し、次い
でＢａｆｆ１旧リンカ−を接続した後、ＢａｍＨＩで切
断したｎｅｏ遺伝子（１９４６ｂｐ）断片をシャトルベ
クター ｐＫＳＶ−１０のＢｇｌＩ［による切断部位に
挿入して該シャトルベクターｐＫＳＶ−１０のＳＶ４０
の初期遺伝子プロモーターの下流にｎｅｏ遺伝子が正し
く挿入されたものを制限酵素地図解析により選択して得
られる。
Ｎｅｏ）の作成： 選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子を含有するプラスミドｐＮ
ＥＯを制限酵素旧ｎｄｌＩ［で切断した後、ＫＩｅｎｏ
ｗ酵素ＤＮＡポリメラーゼ）で５′突起を修復し、次い
でＢａｆｆ１旧リンカ−を接続した後、ＢａｍＨＩで切
断したｎｅｏ遺伝子（１９４６ｂｐ）断片をシャトルベ
クター ｐＫＳＶ−１０のＢｇｌＩ［による切断部位に
挿入して該シャトルベクターｐＫＳＶ−１０のＳＶ４０
の初期遺伝子プロモーターの下流にｎｅｏ遺伝子が正し
く挿入されたものを制限酵素地図解析により選択して得
られる。
本発明は、上述のようにして作成されたエリスロポエチ
ン形質導入ベクターを用いてエリスロポエチン遺伝子を
動物細胞に導入することによりエリスロポエチン遺伝子
を高く発現した細胞を作成するものであって、下記手順
によりエリスロポエチン遺伝子を動物細胞へ導入する。
ン形質導入ベクターを用いてエリスロポエチン遺伝子を
動物細胞に導入することによりエリスロポエチン遺伝子
を高く発現した細胞を作成するものであって、下記手順
によりエリスロポエチン遺伝子を動物細胞へ導入する。
上記■により作成した選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子を含
有するエリスロポエチン形質導入ベクターを用いる場合
は、該ベクター単独を、リン酸カルシウムを用いるＤＮ
Ａ トランスフェクション法によりプサイ（’Ｐ） ２
細胞（マウス由来）或はＢＨＫ２１細胞（シリアンハム
スター子腎由来）へ導入し、上記■により作成したｎｅ
ｏｒ遺伝子を含有しないエリスロポエチン形質導入ベク
ターを用いる場合は、上記■により作成した選択マーカ
ーｎｅｏｒ遺伝子導入ベクターを好ましくは１０：ｌの
割合で混入して、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ ト
ランスフエクシ！ン法によりｌ３ＨＫ２１細胞（シリア
ンハムスター子腎由来）に導入する。
有するエリスロポエチン形質導入ベクターを用いる場合
は、該ベクター単独を、リン酸カルシウムを用いるＤＮ
Ａ トランスフェクション法によりプサイ（’Ｐ） ２
細胞（マウス由来）或はＢＨＫ２１細胞（シリアンハム
スター子腎由来）へ導入し、上記■により作成したｎｅ
ｏｒ遺伝子を含有しないエリスロポエチン形質導入ベク
ターを用いる場合は、上記■により作成した選択マーカ
ーｎｅｏｒ遺伝子導入ベクターを好ましくは１０：ｌの
割合で混入して、リン酸カルシウムを用いるＤＮＡ ト
ランスフエクシ！ン法によりｌ３ＨＫ２１細胞（シリア
ンハムスター子腎由来）に導入する。
次に、上述のごとくしてエリスロポエチン遺伝子を導入
することによる、上記動物細胞におけるエリスロポエチ
ン遺伝子の発現は、Ｇ４１８耐性細胞の生成によりＧＭ
Ｆ！ シ得る。すなわち、エリスロポエチン遺伝子を
導入した細胞を希釈して培地に接種して培養し、この培
養液にＧ４１８を添加して培養を行い生成するＧ４１８
耐性細胞を選択し、さらに、培養液中にエリスロポエチ
ンを放出している細胞を選択する。
することによる、上記動物細胞におけるエリスロポエチ
ン遺伝子の発現は、Ｇ４１８耐性細胞の生成によりＧＭ
Ｆ！ シ得る。すなわち、エリスロポエチン遺伝子を
導入した細胞を希釈して培地に接種して培養し、この培
養液にＧ４１８を添加して培養を行い生成するＧ４１８
耐性細胞を選択し、さらに、培養液中にエリスロポエチ
ンを放出している細胞を選択する。
次いで、このようにして選択した細胞を限界希釈法によ
りエリスロポエチン遺伝子を発現している細胞をクロー
ニングすることによる発現の高いものを選択し、エリス
ロポエチン遺伝子を恒常的に産生ずる細胞株を樹立する
。
りエリスロポエチン遺伝子を発現している細胞をクロー
ニングすることによる発現の高いものを選択し、エリス
ロポエチン遺伝子を恒常的に産生ずる細胞株を樹立する
。
なお、上記樹立された細胞株により産生されるエリスロ
ポエチンの確認はラジオイムノアッセイ法及びマウス胎
児肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ法に
より行った。
ポエチンの確認はラジオイムノアッセイ法及びマウス胎
児肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ法に
より行った。
次に、上述のようにして作成したエリスロポエチン産生
細胞を血清を含む合成培地中で培養し、得られた培養上
清を限外濾過膜（分画分子Ｊｉ１３０００）を用いて高
分子成分を濃縮して分離した後、上清液をモノクローナ
ル抗ヒト・エリスロポエチン抗体吸着カラムに通し、次
いで溶出して得られる溶出液をゲル濾過することにより
エリスロポエチンを単離して精製組換えエリスロポエチ
ンを得る。
細胞を血清を含む合成培地中で培養し、得られた培養上
清を限外濾過膜（分画分子Ｊｉ１３０００）を用いて高
分子成分を濃縮して分離した後、上清液をモノクローナ
ル抗ヒト・エリスロポエチン抗体吸着カラムに通し、次
いで溶出して得られる溶出液をゲル濾過することにより
エリスロポエチンを単離して精製組換えエリスロポエチ
ンを得る。
以下に実施例を示して本発明及びその効果を具体的に説
明する。
明する。
実施例１
本例は、選択マーカー遺伝子とエリスロポエチン遺伝子
を同一ベクター上に含有するベクターを用いて作成した
エリスロポエチン産生細胞によるエリスロポエチンの製
造を示したものである。
を同一ベクター上に含有するベクターを用いて作成した
エリスロポエチン産生細胞によるエリスロポエチンの製
造を示したものである。
底
１）６ｕｆｆｉのＴＥ−緩衝液（１０＋ｓＭ Ｔｒｉｓ
−）１ｃＩ、 １ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ７，４）に溶解し
たプラスミドｐｈＥＰ１４０４ （プラスミドｐＵｃ８
の制限酵素ＥｃｏＲＩ ５Ｓａｓ＋１切断部位にエリス
ロポエチンゲノム遺伝子の５′末端Ａｐａｌ切断部位よ
り下流部位２．４ｋｂの断片を挿入したもの：大きさ５
．１ｋｂ） １０μｇに対し、５倍濃度のＢｇｌＩＩ反
応緩衝液（５０ｍＭ↑ｒｉｓ−ＨＣＩｓ ３５＋Ｍ Ｍ
ｇＣｈ、５００ｍＭ ＮａＣｌ。
−）１ｃＩ、 １ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ７，４）に溶解し
たプラスミドｐｈＥＰ１４０４ （プラスミドｐＵｃ８
の制限酵素ＥｃｏＲＩ ５Ｓａｓ＋１切断部位にエリス
ロポエチンゲノム遺伝子の５′末端Ａｐａｌ切断部位よ
り下流部位２．４ｋｂの断片を挿入したもの：大きさ５
．１ｋｂ） １０μｇに対し、５倍濃度のＢｇｌＩＩ反
応緩衝液（５０ｍＭ↑ｒｉｓ−ＨＣＩｓ ３５＋Ｍ Ｍ
ｇＣｈ、５００ｍＭ ＮａＣｌ。
３５ｍＭメルカプトエタノール） ４０μｌを加えた後
に、各２０単位の制限酵素Ｂｇｌ １）及びＢａｍ１ｌ
［を加え、３７℃、２時間反応した後、３．５％アクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、２．４ｋｂのＢｇｌ Ｉ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（エリスロポエチン遺伝子）に相当
するゲルの部位を切り出し、ゲルを微細に破砕した後、
溶出用緩衝液（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、 ０．１％５ＯＳｐｉ ８．０）を１．０ｗ
＋ｊｌ加え、３７℃で１晩インキユベートし、ＤＮＡの
抽出を行った。ＤＮＡは遠心によりアクリルアミドゲル
を沈降させ、上層の水層を集め、１回のフェノール抽出
、３回のエーテル抽出により、水層に含まれるフェノー
ルを除去した後、２倍量のエタノールを加えＤＮＡ断片
を沈澱させた。ＤＮＡ断片（沈澱）を遠心により回収し
、ＤＮＡを乾燥させた後２０μｌの滅菌水に溶解し、エ
リスロポエチン遺伝子溶液とした。
に、各２０単位の制限酵素Ｂｇｌ １）及びＢａｍ１ｌ
［を加え、３７℃、２時間反応した後、３．５％アクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、２．４ｋｂのＢｇｌ Ｉ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（エリスロポエチン遺伝子）に相当
するゲルの部位を切り出し、ゲルを微細に破砕した後、
溶出用緩衝液（０，５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、 ０．１％５ＯＳｐｉ ８．０）を１．０ｗ
＋ｊｌ加え、３７℃で１晩インキユベートし、ＤＮＡの
抽出を行った。ＤＮＡは遠心によりアクリルアミドゲル
を沈降させ、上層の水層を集め、１回のフェノール抽出
、３回のエーテル抽出により、水層に含まれるフェノー
ルを除去した後、２倍量のエタノールを加えＤＮＡ断片
を沈澱させた。ＤＮＡ断片（沈澱）を遠心により回収し
、ＤＮＡを乾燥させた後２０μｌの滅菌水に溶解し、エ
リスロポエチン遺伝子溶液とした。
一方、シャトルヘク９−ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１
５ｕｇ（５μｉのＴＥ−緩衝液に溶解）に５倍濃度のＢ
ａｍＨＩ反応緩衝液（Ｂｇｌｌ１反応緩衝液に同じ＞
２０μｌを加えた後、制限酵素Ｂａａ＋旧を加え、３７
℃で１時間反応させ、開環させた。
５ｕｇ（５μｉのＴＥ−緩衝液に溶解）に５倍濃度のＢ
ａｍＨＩ反応緩衝液（Ｂｇｌｌ１反応緩衝液に同じ＞
２０μｌを加えた後、制限酵素Ｂａａ＋旧を加え、３７
℃で１時間反応させ、開環させた。
この反応液をフェノール抽出１回、エーテル抽出３回、
エタノール沈澱１回の処理を行い、ＤＮＡを乾燥させた
。 ３５０ｎｇ（ナノグラム１０−’ｇ）のＢａｍＨ１
開環ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）ｌ（４μｇの水に溶解
）に２００ｎｇのエリスロポエチン遺伝子（１６μｍ）
、２μｌのｌＯ倍淵度１ｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液（６
６０＋ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
エタノール沈澱１回の処理を行い、ＤＮＡを乾燥させた
。 ３５０ｎｇ（ナノグラム１０−’ｇ）のＢａｍＨ１
開環ｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）ｌ（４μｇの水に溶解
）に２００ｎｇのエリスロポエチン遺伝子（１６μｍ）
、２μｌのｌＯ倍淵度１ｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液（６
６０＋ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
６６５Ｍ ＭｇＣｈ−１００ｍＭ ０７丁、 ｐＨ
７，６） ２ｕ ｌ の９ｕＭ ＡＴＰ及び３ｐ
ｌのＴ４ＤＮＡ １ｉｊａｓｅ （８，４単位）を加え
、４℃で１晩反応を行った０反応液を２回フェノール抽
出、３回エーテル抽出、１回エタノール沈澱の処理を行
った後、Ｄ Ｎ Ａを乾燥させ２０μｌのＴＥ−緩衝液
に溶解して、形質転換用ＤＮＡ溶液とした。
７，６） ２ｕ ｌ の９ｕＭ ＡＴＰ及び３ｐ
ｌのＴ４ＤＮＡ １ｉｊａｓｅ （８，４単位）を加え
、４℃で１晩反応を行った０反応液を２回フェノール抽
出、３回エーテル抽出、１回エタノール沈澱の処理を行
った後、Ｄ Ｎ Ａを乾燥させ２０μｌのＴＥ−緩衝液
に溶解して、形質転換用ＤＮＡ溶液とした。
そのＤ Ｎ Ａ溶液１０Ｉ１）を用いて、２００μｌの
大腸ｒＭＤＨ−１コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）
細胞を形質転換した（形質転換頻度３×ｌＯ蟲個／μｇ
ｐＢＲ３２２） 。
大腸ｒＭＤＨ−１コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）
細胞を形質転換した（形質転換頻度３×ｌＯ蟲個／μｇ
ｐＢＲ３２２） 。
以上の操作により、３５株のアンピシリン−カナマイシ
ン耐性形質転換株を得た。うち１）株について、プラス
ミドの制限酵素切断地図解析を行い、目的とするエリス
ロポエチン形質導入ベクターを有する４株を選択した。
ン耐性形質転換株を得た。うち１）株について、プラス
ミドの制限酵素切断地図解析を行い、目的とするエリス
ロポエチン形質導入ベクターを有する４株を選択した。
さらにうち１株を用い、常法に従い、プラスミド調製を
行い、エリスロポエチン形質導入へ’） ９− （＄Ｉ
ＺＴＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）ＥＰＯ）を作成した０次いで、
このようにして作成したエリスロポエチン形質導入ベク
ターを用い、ＤＮＡ トランスフェクション法により下
記手順でエリスロポエチン遺伝子を動物細胞へ導入した
。
行い、エリスロポエチン形質導入へ’） ９− （＄Ｉ
ＺＴＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）ＥＰＯ）を作成した０次いで、
このようにして作成したエリスロポエチン形質導入ベク
ターを用い、ＤＮＡ トランスフェクション法により下
記手順でエリスロポエチン遺伝子を動物細胞へ導入した
。
４ Ｘ １Ｇ’個のマウス由来の％Ｐ２細胞を６ｃｍ径
シャーレに播種し、翌日、リン酸カルシウム法によるＤ
ＮＡトランスフェクションを行った。すなわち、５０ｐ
Ｈの水に溶解した５０ｕｇのｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ
）ＥＰｏ。
シャーレに播種し、翌日、リン酸カルシウム法によるＤ
ＮＡトランスフェクションを行った。すなわち、５０ｐ
Ｈの水に溶解した５０ｕｇのｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ
）ＥＰｏ。
３００μＪの２Ｍ塩化カルシウム液及び水２．１ｍｉ’
を混合しＡ溶液とした０次に、Ｂ溶液として、０．２８
ＭＮａＣ１を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，１）
２．５ｍＪと３５ｍＭＮａ）ＩｔＰＯａ−３５ｍＭ Ｎ
ａｚｔｌＰＯ４１００／”を混合した。Ｂ？ｇ液をはげ
しく撹拌しながら、これにＡ？容液を徐々に滴下し、Ｄ
ＮＡをリン酸カルシウムと共沈し、室温で３０分間放置
することにより沈澱を成長させた。
を混合しＡ溶液とした０次に、Ｂ溶液として、０．２８
ＭＮａＣ１を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，１）
２．５ｍＪと３５ｍＭＮａ）ＩｔＰＯａ−３５ｍＭ Ｎ
ａｚｔｌＰＯ４１００／”を混合した。Ｂ？ｇ液をはげ
しく撹拌しながら、これにＡ？容液を徐々に滴下し、Ｄ
ＮＡをリン酸カルシウムと共沈し、室温で３０分間放置
することにより沈澱を成長させた。
上記のようにして調製したＤＮＡ−リン酸カルシウム液
０．４１ａｌｌを先に調製した甲２細胞の培養液（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍ
ＥＭ（ＤＭＥ） ＋１０％子牛血清（Ｃ３）） ４ｍｌ
中に添加し、１８時間ＣＯｔインキュベーター内で培養
した。
０．４１ａｌｌを先に調製した甲２細胞の培養液（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍ
ＥＭ（ＤＭＥ） ＋１０％子牛血清（Ｃ３）） ４ｍｌ
中に添加し、１８時間ＣＯｔインキュベーター内で培養
した。
得られた培養液に２５％グリセロールを含むＰＢＳ溶液
０．４ｍｊ！を加え、１分間放置した後、Ｄ？ＩＥ溶液
で３回洗浄後、４ｔｎｌの上記培養液を加え、ＣＯ□イ
ンキュベーター内で更に培養を行った。１日後、培養液
を交換し、翌日シャーレ５枚に播種し直した（１）５５
ｐｌｉｔ） 、さらに、翌日から４００ｐｇ／ＩＩｌの
Ｇ４１８を含む培養液に取り換え、その後適時、培養液
を交換し、２週間培養を行い、Ｇ４１８耐性細胞を選択
し、限界希釈法によりクローニングを行った。
０．４ｍｊ！を加え、１分間放置した後、Ｄ？ＩＥ溶液
で３回洗浄後、４ｔｎｌの上記培養液を加え、ＣＯ□イ
ンキュベーター内で更に培養を行った。１日後、培養液
を交換し、翌日シャーレ５枚に播種し直した（１）５５
ｐｌｉｔ） 、さらに、翌日から４００ｐｇ／ＩＩｌの
Ｇ４１８を含む培養液に取り換え、その後適時、培養液
を交換し、２週間培養を行い、Ｇ４１８耐性細胞を選択
し、限界希釈法によりクローニングを行った。
クローニング時に適時Ｇ４１８４００μｇ ／ ｍ ｊ
！を含む培養液を取り換え、２週間後、９６六マイクロ
プレート１枚当り１９ウエール（プレート１枚当り５０
細胞をｔｉ種）にコロニーを見出した。
！を含む培養液を取り換え、２週間後、９６六マイクロ
プレート１枚当り１９ウエール（プレート１枚当り５０
細胞をｔｉ種）にコロニーを見出した。
上記により見出されたコロニーの培養上清中のエリスロ
ポエチン活性をラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）によ
り測定した結果、全ての培養上清についてエリスロポエ
チン活性（０，０２〜２単位／ ｍ Ｉ！ ）が認めら
れ、エリスロポエチン遺伝子発現量の高いコロニーを選
出し、６４１８含有培養液で増殖後、再び同様にして限
界希釈を行ってエリスロポエチンを恒常的に生産する細
胞株を樹立し、ＥＰＯ甲Ｘ９Ｅと命名した。なお、ＥＰ
○甲Ｘ９Ｅの培養上滑中に見出されるエリスロポエチン
とその生産量をラジオイムノアッセイ法及びマウス胎児
肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ法で調
べた結果、両者は同一の活性を示し、１５００単位／１
０’ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。
ポエチン活性をラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）によ
り測定した結果、全ての培養上清についてエリスロポエ
チン活性（０，０２〜２単位／ ｍ Ｉ！ ）が認めら
れ、エリスロポエチン遺伝子発現量の高いコロニーを選
出し、６４１８含有培養液で増殖後、再び同様にして限
界希釈を行ってエリスロポエチンを恒常的に生産する細
胞株を樹立し、ＥＰＯ甲Ｘ９Ｅと命名した。なお、ＥＰ
○甲Ｘ９Ｅの培養上滑中に見出されるエリスロポエチン
とその生産量をラジオイムノアッセイ法及びマウス胎児
肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ法で調
べた結果、両者は同一の活性を示し、１５００単位／１
０’ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。
（ロ）ＢＨＫ２１ 胞へのエリスロポエチン′伝のＪ
Ａ 上記ｖ２細胞へのエリスロポエチン遺伝子の導入方法と
同様な手順で行った。すなわち、２ＸｌＯ’個（７）Ｂ
ＨＫ２１）１）１ｔｌヲＤＮＡ トランスフェクション
の前日に２５ｃａｌＴ−フラスコに播種し〔培養液：
ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ （ＢＭＥ） ＋
１０％Ｃ３＋ １０％Ｔｒ−ｙｐｔｏｓｅ Ｐｈ−ｏｓ
ｐｈａｔｅ Ｂｒｏｔｈ ） 、前記と同様なりＮＡ−
リン酸カルシウム溶液を用い、Ｂ ＨＫ２１＄Ｉ胞へ（
７）ＤＮＡトランスフェクションを行った６次いでＧ４
１８耐性細胞を選択後、２回の限界希釈法を用いた細胞
のクローン化を行い、エリスロポエチンを恒常的に生産
する細胞株を樹立し、ＥＰＯＢＸ７Ａと命名した６本細
胞株のエリスロポエチンとその生産量をラジオイムノア
ッセイ法及びマウス胎児肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒ
ｏバイオアッセイ法で調べた結果、両者は同一の活性を
示し、１ｏｏｏＪ３位／１０’ｃｅｌｌ／ｄａｙであっ
た。
Ａ 上記ｖ２細胞へのエリスロポエチン遺伝子の導入方法と
同様な手順で行った。すなわち、２ＸｌＯ’個（７）Ｂ
ＨＫ２１）１）１ｔｌヲＤＮＡ トランスフェクション
の前日に２５ｃａｌＴ−フラスコに播種し〔培養液：
ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ （ＢＭＥ） ＋
１０％Ｃ３＋ １０％Ｔｒ−ｙｐｔｏｓｅ Ｐｈ−ｏｓ
ｐｈａｔｅ Ｂｒｏｔｈ ） 、前記と同様なりＮＡ−
リン酸カルシウム溶液を用い、Ｂ ＨＫ２１＄Ｉ胞へ（
７）ＤＮＡトランスフェクションを行った６次いでＧ４
１８耐性細胞を選択後、２回の限界希釈法を用いた細胞
のクローン化を行い、エリスロポエチンを恒常的に生産
する細胞株を樹立し、ＥＰＯＢＸ７Ａと命名した６本細
胞株のエリスロポエチンとその生産量をラジオイムノア
ッセイ法及びマウス胎児肝細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒ
ｏバイオアッセイ法で調べた結果、両者は同一の活性を
示し、１ｏｏｏＪ３位／１０’ｃｅｌｌ／ｄａｙであっ
た。
次に、上述のようにして組換えを行って作成したエリス
ロポエチン産生細胞、ＥＰＯ甲Ｘ９Ｅを下記手順により
培養してエリスロポエチンを生産し、次いで単離を行っ
た。なお、ＥＰＯＢＸ７Ａ細胞を用いて同様にしてエリ
スロポエチンを生産し得た。
ロポエチン産生細胞、ＥＰＯ甲Ｘ９Ｅを下記手順により
培養してエリスロポエチンを生産し、次いで単離を行っ
た。なお、ＥＰＯＢＸ７Ａ細胞を用いて同様にしてエリ
スロポエチンを生産し得た。
組 え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）エリスロポエチンの
生産とｌ星 ＥＰＯ甲ｘ ９ Ｅ １．５ｘｌＯ”細胞をセルフアク
トＵ−１０チャンバー（６０００ｃｄ） （ヌンク社製
）に播種し、培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ（ＤＭＥ）＋１０％子牛
血清（Ｃ５）） Ｉ Ｊ存在下で３日間培養した後、
３日毎に２１の培養液と交換した。本培養液中に含まれ
るエリスロポエチン活性をラジオイムノアッセイ法で定
量した結果、１００〜３００単位／ｍＩｌであった。エ
リスロポエチンの単離は特開昭６０−４１６１４号の方
法に準じて行った。
生産とｌ星 ＥＰＯ甲ｘ ９ Ｅ １．５ｘｌＯ”細胞をセルフアク
トＵ−１０チャンバー（６０００ｃｄ） （ヌンク社製
）に播種し、培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ（ＤＭＥ）＋１０％子牛
血清（Ｃ５）） Ｉ Ｊ存在下で３日間培養した後、
３日毎に２１の培養液と交換した。本培養液中に含まれ
るエリスロポエチン活性をラジオイムノアッセイ法で定
量した結果、１００〜３００単位／ｍＩｌであった。エ
リスロポエチンの単離は特開昭６０−４１６１４号の方
法に準じて行った。
上記の方法で培養して得られた培養？＆１）１ （ＥＰ
Ｏ活性２． ＯＸ １０’単位含有）を温度管理（５〜
１０℃）下において、限外濾、過装置を用いて分子量１
万以上の両分の濃縮し、さらに、Ｐｕ５（リン酸塩緩衝
食塩水）を加え、同様に濃縮することにより、エリスロ
ポエチン濃縮液１．５１を得た。
Ｏ活性２． ＯＸ １０’単位含有）を温度管理（５〜
１０℃）下において、限外濾、過装置を用いて分子量１
万以上の両分の濃縮し、さらに、Ｐｕ５（リン酸塩緩衝
食塩水）を加え、同様に濃縮することにより、エリスロ
ポエチン濃縮液１．５１を得た。
本濃縮液に２％ＳＯ５となる様にＳＯＳ粉末を加え、１
００℃３分間加熱後、４℃に冷却し、さらに０℃で１晩
放置した後、遠心によりＳＯＳを除去し、上滑液１．２
βを得た。本上清液をモノクローナル抗ヒト・エリスロ
ポエチン抗体をＡｆｆｉ−Ｇｅｔ １０に吸着させて作
成した抗体吸着カラム（抗体吸着量；０．５ｇ／１０ａ
＋ｊ！ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０；３．６ｃｍｘ３ｃａ
＋床容量３０ｍ ｌ ）に６０ｍｊ！／ｈｒの流速で通
した０次にＰＢ３２０００１）１．０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む１０１）１Ｍリンｅ１）ｉ衝液（ｐＨ７，４）、
４００ｍ ｌ 、 ０．１５Ｍ ＮａＣ１４００ｍ＋
１の順に１００ｍ ｌ ／ ｈｒでカラムを洗浄後、０
．２Ｍ酢酸と０．１５ＭＮａＣ１との混合液を３０ｍ１
／ｈｒの流速で流し、溶出液として１００ｍ ｊ！を得
た。尚、本溶出液中には、エリスロポエチン活性が１．
２ Ｘ １０”単位含まれていた。さらに次のようにし
てゲル濾過を行った。
００℃３分間加熱後、４℃に冷却し、さらに０℃で１晩
放置した後、遠心によりＳＯＳを除去し、上滑液１．２
βを得た。本上清液をモノクローナル抗ヒト・エリスロ
ポエチン抗体をＡｆｆｉ−Ｇｅｔ １０に吸着させて作
成した抗体吸着カラム（抗体吸着量；０．５ｇ／１０ａ
＋ｊ！ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０；３．６ｃｍｘ３ｃａ
＋床容量３０ｍ ｌ ）に６０ｍｊ！／ｈｒの流速で通
した０次にＰＢ３２０００１）１．０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む１０１）１Ｍリンｅ１）ｉ衝液（ｐＨ７，４）、
４００ｍ ｌ 、 ０．１５Ｍ ＮａＣ１４００ｍ＋
１の順に１００ｍ ｌ ／ ｈｒでカラムを洗浄後、０
．２Ｍ酢酸と０．１５ＭＮａＣ１との混合液を３０ｍ１
／ｈｒの流速で流し、溶出液として１００ｍ ｊ！を得
た。尚、本溶出液中には、エリスロポエチン活性が１．
２ Ｘ １０”単位含まれていた。さらに次のようにし
てゲル濾過を行った。
上記溶出液に対し、３．４Ｍ ）リス溶液を適量加え、
中和後水に対して透析した後、凍結乾燥を行うことによ
り濃縮を行った。次に本凍結乾燥粉末に０．１５Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，５）６ｍｎに溶解し、そのうちの３１）＋１を予め、
前記と同じ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ１００
充填カラム（１，２ｃｉ Ｘ １５０ｃｍ 、床容１）
７０ｎ＋ｊりに６１）ＩＩｌ／ｈｒで通し、分子量によ
る分画を行い、高分子不純物を除去し、エリスロポエチ
ン活性画分を得た。残り３ｍ１ｔのエリスロポエチン濃
縮液も同様の操作を行うことにより分子量分画を行い、
エリスロポエチン活性画分を得た。両操作によって得ら
れたエリスロポエチンは１．０８ Ｘ １０’単位であ
った。本標品の純度検定をＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動法により行ったが、不純なタンパク質は認めらさ
なかった（分子量約３５０００の部位に単一なバンドと
して認められた）。
中和後水に対して透析した後、凍結乾燥を行うことによ
り濃縮を行った。次に本凍結乾燥粉末に０．１５Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，５）６ｍｎに溶解し、そのうちの３１）＋１を予め、
前記と同じ緩衝液で平衡化したセファデックスＧ１００
充填カラム（１，２ｃｉ Ｘ １５０ｃｍ 、床容１）
７０ｎ＋ｊりに６１）ＩＩｌ／ｈｒで通し、分子量によ
る分画を行い、高分子不純物を除去し、エリスロポエチ
ン活性画分を得た。残り３ｍ１ｔのエリスロポエチン濃
縮液も同様の操作を行うことにより分子量分画を行い、
エリスロポエチン活性画分を得た。両操作によって得ら
れたエリスロポエチンは１．０８ Ｘ １０’単位であ
った。本標品の純度検定をＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動法により行ったが、不純なタンパク質は認めらさ
なかった（分子量約３５０００の部位に単一なバンドと
して認められた）。
以上の様にして高純度のγ−エリスロポエチンを取得す
ることができた。
ることができた。
実施例２
本例は、エリスロポエチン形質導入ベクターとｉＨ択マ
マ−カー形質導入ベクターコ・トランスフェクションに
より作成したエリスロポエチン産生細胞によりエリスロ
ポエチンの製造を示したものである。
マ−カー形質導入ベクターコ・トランスフェクションに
より作成したエリスロポエチン産生細胞によりエリスロ
ポエチンの製造を示したものである。
エリスロポエチンノー ベクター（ＭしりＥＰＯ）の
生成 １０μＡ（７）水に溶解したプラスミドｐｓＶｈＥＰＸ
１０＃ｇに対し、５倍濃度のＡｐａ１反応緩衝液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 、５０ｍＭ ＭｇＣｈ、５
（１ｗＭメルカプトエタノール、０．０５％ＢＳＡＳｐ
Ｈ７，５）２０・μｌ及び水７０μｌを加えた後に制限
酵素ＡｐａＩ ２０単位を加え、３７℃１時間反応させ
た後、１回のフェノール抽出及び３回のエーテル抽出に
より、水層に含まれるフェノールを除去した後に２倍量
のエタノールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。遠心により
、ＤＮＡ （沈澱）を回収し、ＤＮＡを乾燥させた後に
、７８μｌの水、１００倍濃の７４ＤＮＡポリメラ一ゼ
反応緩衝液（６７０ｍＭ↑ｒｉｓ−ＩＩＣＩ 、 ６７
ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０（１ｍＭメルカプトエタノール
、６７μＭ ［！ＤＴＡ−１６６１！Ｍ （Ｎ＋（４）
２ＳＯ４，０，１６７％ＢＳＡ 、ｐＨ８，８） １０
μｌ及び２ｍＭｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ。
生成 １０μＡ（７）水に溶解したプラスミドｐｓＶｈＥＰＸ
１０＃ｇに対し、５倍濃度のＡｐａ１反応緩衝液（５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 、５０ｍＭ ＭｇＣｈ、５
（１ｗＭメルカプトエタノール、０．０５％ＢＳＡＳｐ
Ｈ７，５）２０・μｌ及び水７０μｌを加えた後に制限
酵素ＡｐａＩ ２０単位を加え、３７℃１時間反応させ
た後、１回のフェノール抽出及び３回のエーテル抽出に
より、水層に含まれるフェノールを除去した後に２倍量
のエタノールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。遠心により
、ＤＮＡ （沈澱）を回収し、ＤＮＡを乾燥させた後に
、７８μｌの水、１００倍濃の７４ＤＮＡポリメラ一ゼ
反応緩衝液（６７０ｍＭ↑ｒｉｓ−ＩＩＣＩ 、 ６７
ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０（１ｍＭメルカプトエタノール
、６７μＭ ［！ＤＴＡ−１６６１！Ｍ （Ｎ＋（４）
２ＳＯ４，０，１６７％ＢＳＡ 、ｐＨ８，８） １０
μｌ及び２ｍＭｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ。
ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの混合液）８μｌを
加え、混合した後２０単位の７４ＤＮＡポリメラーゼを
加え、３７℃ｌＯ分間反応させた後、１回のフェノール
抽出によりＤＮＡを回収した後、予めＴ Ｅ −４１衝
液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０スパンカラム
により未反応のｄＮＴＰを除去した後、２倍量のエタノ
ールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。遠心によりＤＮＡ
（沈′Ｒ）を回収し、乾燥した後に水８０μ！及び５倍
濃度のＢａｍ旧反応緩衝液（前記Ｂｇｌ １）反応緩衝
液に同じ）２０μｌを加えＤＮＡを溶解した後に、制限
△ゲ素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え、３７℃で１時間反
応後、１回のフェノール抽出、３回のエーテル抽出によ
り水層に含まれ名フェノールを除去した後に、２倍量の
エタノールを加え、ＤＮＡ断片を沈澱させた。
加え、混合した後２０単位の７４ＤＮＡポリメラーゼを
加え、３７℃ｌＯ分間反応させた後、１回のフェノール
抽出によりＤＮＡを回収した後、予めＴ Ｅ −４１衝
液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０スパンカラム
により未反応のｄＮＴＰを除去した後、２倍量のエタノ
ールを加え、ＤＮＡを沈澱させた。遠心によりＤＮＡ
（沈′Ｒ）を回収し、乾燥した後に水８０μ！及び５倍
濃度のＢａｍ旧反応緩衝液（前記Ｂｇｌ １）反応緩衝
液に同じ）２０μｌを加えＤＮＡを溶解した後に、制限
△ゲ素ＢａｍＨＩ ２０単位を加え、３７℃で１時間反
応後、１回のフェノール抽出、３回のエーテル抽出によ
り水層に含まれ名フェノールを除去した後に、２倍量の
エタノールを加え、ＤＮＡ断片を沈澱させた。
遠心により回収したＤＮＡ断片を乾燥した後に水１８０
．１７４！ 、 １００倍濃ＥｃｏＲＩ反応緩衝液（５
００ｎ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ７０ｍＭ ＭｇＣＩｚ
、ＩＭ ＮａＣｌ 、７０ｍＭメルカプトエタノール、
０．１％ＢＳＡ） ２０μｌを加えてＤ Ｎ 、Ａを溶
解した後に、これに２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加
え、３７℃で１時間反応を行った後、１回のフェノール
抽出、３回のエーテル抽出により水層に含まれるフェノ
ールを除去後、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡ断片
を沈澱させ、遠心により回収した後、常法に従い、１％
アガロースゲル電気泳動を行い、エリスロポエチン遺伝
子を含むＢａｇＨｌ−Ａｐａｌ断片に相当するゲルの部
位を切り出し、ＤＥ−８１ペーパー法により、４μｇの
ＤＮＡ断片（エリスロポエチン遺伝子）を回収した。
．１７４！ 、 １００倍濃ＥｃｏＲＩ反応緩衝液（５
００ｎ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ７０ｍＭ ＭｇＣＩｚ
、ＩＭ ＮａＣｌ 、７０ｍＭメルカプトエタノール、
０．１％ＢＳＡ） ２０μｌを加えてＤ Ｎ 、Ａを溶
解した後に、これに２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加
え、３７℃で１時間反応を行った後、１回のフェノール
抽出、３回のエーテル抽出により水層に含まれるフェノ
ールを除去後、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡ断片
を沈澱させ、遠心により回収した後、常法に従い、１％
アガロースゲル電気泳動を行い、エリスロポエチン遺伝
子を含むＢａｇＨｌ−Ａｐａｌ断片に相当するゲルの部
位を切り出し、ＤＥ−８１ペーパー法により、４μｇの
ＤＮＡ断片（エリスロポエチン遺伝子）を回収した。
一方、レトロウィルス（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ
ＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ） Ｌ Ｔ Ｒのプロモー
ターを含有するＣＡＴ発現ヘクターｐＭＬＶＣＡＴ １
０μｇ（１０＃ ｌの水に溶解）に１００倍程の５ａｓ
ｌ反応緩衝液（１００ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｓ７０
＋＋＋Ｍ ＭｇＣ１ｇ、２００ｍＭ ＭＣＩ 、 ７０
５Ｍメルカプトエタノール、０．１％ＢＳＡ）１０／Ｊ
１、及び水８０μ２を加えた後、これに制限酵素Ｓａ
ｍＩ １０単位を加え、３７℃で１時間反応した後、１
回のフェノール抽出、３回のエーテル抽出、１回のエタ
ノール沈澱操作により、ＤＮＡを回収し、乾燥後、１６
０μｌの水に溶解し、５倍程度のＲａｍ旧反応緩衝液４
０μｌを加え、制限酵素２０単位を加え、３７℃で１時
間反応を行った後、１回のフェノール抽出、３回のエー
テル抽出、１回のエタノール沈：Ｒ掻作により、ＤＮＡ
断片を回収し、乾燥後１５０μｌの水、５倍濃度のＣＩ
Ｐ反応緩衝液（２５０＋ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 、５
ｎ＋Ｍ ＭｇＣｈ 、０．５ａ＋ＭＺｎＣ１ｇ 、５ｇ
Ｍ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｐＨ９，０）、３０単位の
ＣＩＰ（ｃａｌｆ １ｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌ
ｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加え、３７℃で１５分
間次いで５６℃で１５分間反応後更に３０単位のＣＩＰ
を加え、同様の反応を行った後、１回のフェノール抽出
、３回のエーテル抽出及び１回のエタノール沈澱操作に
より、ＤＮＡを回収した。
ＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ） Ｌ Ｔ Ｒのプロモー
ターを含有するＣＡＴ発現ヘクターｐＭＬＶＣＡＴ １
０μｇ（１０＃ ｌの水に溶解）に１００倍程の５ａｓ
ｌ反応緩衝液（１００ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｓ７０
＋＋＋Ｍ ＭｇＣ１ｇ、２００ｍＭ ＭＣＩ 、 ７０
５Ｍメルカプトエタノール、０．１％ＢＳＡ）１０／Ｊ
１、及び水８０μ２を加えた後、これに制限酵素Ｓａ
ｍＩ １０単位を加え、３７℃で１時間反応した後、１
回のフェノール抽出、３回のエーテル抽出、１回のエタ
ノール沈澱操作により、ＤＮＡを回収し、乾燥後、１６
０μｌの水に溶解し、５倍程度のＲａｍ旧反応緩衝液４
０μｌを加え、制限酵素２０単位を加え、３７℃で１時
間反応を行った後、１回のフェノール抽出、３回のエー
テル抽出、１回のエタノール沈：Ｒ掻作により、ＤＮＡ
断片を回収し、乾燥後１５０μｌの水、５倍濃度のＣＩ
Ｐ反応緩衝液（２５０＋ｓＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ 、５
ｎ＋Ｍ ＭｇＣｈ 、０．５ａ＋ＭＺｎＣ１ｇ 、５ｇ
Ｍ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｐＨ９，０）、３０単位の
ＣＩＰ（ｃａｌｆ １ｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌ
ｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加え、３７℃で１５分
間次いで５６℃で１５分間反応後更に３０単位のＣＩＰ
を加え、同様の反応を行った後、１回のフェノール抽出
、３回のエーテル抽出及び１回のエタノール沈澱操作に
より、ＤＮＡを回収した。
得られたＤＮＡを常法に従い、１％アガロースゲル電気
泳動を行い、ＬＴＲのプロモーターを含有する５ａｓｌ
−ＢａｍＨＩ断片に相当するゲルの部位を切り出し、
ＤＥ−８１ペーパー法により、４μｇのＤＮＡ断片（ｐ
ＭＬＶに相当）を得た。
泳動を行い、ＬＴＲのプロモーターを含有する５ａｓｌ
−ＢａｍＨＩ断片に相当するゲルの部位を切り出し、
ＤＥ−８１ペーパー法により、４μｇのＤＮＡ断片（ｐ
ＭＬＶに相当）を得た。
ｌμｇのＳ５＠１−ＢａｓｉＨＩ断片と２ｇｇのＢａｍ
ＨＩ−Ａｐａｌ断片を６μｌのＴＥ−緩衝液に溶解し、
４０％ポリエチレングリコール２ｕｊ！、１００倍濃１
ｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液を加え、３７℃で１０分間、
２５℃で１０分間、次いで４℃で１０分間反応を行った
後、これに１０−ＭＡＴＰ １μｌ、ｌμｊ！のＴ４Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｓｅ（２，８単位）を加え、４℃で１晩
反応を行った。得られた反応液についてＴＥ−緩衝液４
０μｌを加えた後に、１回のフェノール抽出、３回のエ
ーテル抽出及び１回のエタノール沈澱操作を行った後、
遠心により、Ｄ Ｎ Ａを回収し、乾燥後２０μｌのＴ
Ｅ−緩衝液に溶解して、形質転換用ＤＮＡ溶液とした。
ＨＩ−Ａｐａｌ断片を６μｌのＴＥ−緩衝液に溶解し、
４０％ポリエチレングリコール２ｕｊ！、１００倍濃１
ｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液を加え、３７℃で１０分間、
２５℃で１０分間、次いで４℃で１０分間反応を行った
後、これに１０−ＭＡＴＰ １μｌ、ｌμｊ！のＴ４Ｄ
ＮＡ ｌｉｇａｓｅ（２，８単位）を加え、４℃で１晩
反応を行った。得られた反応液についてＴＥ−緩衝液４
０μｌを加えた後に、１回のフェノール抽出、３回のエ
ーテル抽出及び１回のエタノール沈澱操作を行った後、
遠心により、Ｄ Ｎ Ａを回収し、乾燥後２０μｌのＴ
Ｅ−緩衝液に溶解して、形質転換用ＤＮＡ溶液とした。
このＤＮＡ溶液ｌＯμｌを用いて２００μｌの大腸菌Ｄ
Ｈ−１コンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン耐
性形質転換細胞を得、プラスミドの制限酵素の切断地図
解析を行い、目的とするエリスロポエチン形質導入ベク
ターを選択し、常法に従いプラスミド調製を行い、エリ
スロポエチン形質導入ベクター（ｐＭＬＶＥＰｏ）を調
製した。
Ｈ−１コンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン耐
性形質転換細胞を得、プラスミドの制限酵素の切断地図
解析を行い、目的とするエリスロポエチン形質導入ベク
ターを選択し、常法に従いプラスミド調製を行い、エリ
スロポエチン形質導入ベクター（ｐＭＬＶＥＰｏ）を調
製した。
゛ 尺マーカーｎｅｏｒ゛伝 ベクターの作成１０
μｌのＴＥ−緩衝液に溶解した２、５ｇｇのプラスミド
ｐＮＥＯに対し、１００倍濃の旧ｎｄＩ［Ｉ反応緩衝液
（１００ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ 、 １００＋ｌ
ＩＭ ＭｇＣｈ 、５００ｍＭ ＮａＣ１゜１０ｎ＋Ｍ
ＤＴＴ、 ｐＨ７，５） １０μｌ、滅菌水７６μ２
を加えた後、５０単位の旧ｎｄ １）を加え、３７℃で
２時間反応した後、１回フェノール抽出、３回エーテル
抽出、エタノール沈澱１回の処理を行い、ＤＮＡを乾燥
させた後、５０μｌの滅菌水に溶解した０本溶液に１０
０倍濃のＫＩｅｎｏｗ反応緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ 、 １００ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍ
Ｍ ＯＴＴ 、 ５００μｇ／ｓ＋ １ＢＳ＾
）、２５μＥの２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴ
Ｐ、 ｄＣＴＰ。
μｌのＴＥ−緩衝液に溶解した２、５ｇｇのプラスミド
ｐＮＥＯに対し、１００倍濃の旧ｎｄＩ［Ｉ反応緩衝液
（１００ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ 、 １００＋ｌ
ＩＭ ＭｇＣｈ 、５００ｍＭ ＮａＣ１゜１０ｎ＋Ｍ
ＤＴＴ、 ｐＨ７，５） １０μｌ、滅菌水７６μ２
を加えた後、５０単位の旧ｎｄ １）を加え、３７℃で
２時間反応した後、１回フェノール抽出、３回エーテル
抽出、エタノール沈澱１回の処理を行い、ＤＮＡを乾燥
させた後、５０μｌの滅菌水に溶解した０本溶液に１０
０倍濃のＫＩｅｎｏｗ反応緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ 、 １００ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍ
Ｍ ＯＴＴ 、 ５００μｇ／ｓ＋ １ＢＳ＾
）、２５μＥの２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、 ｄＧＴ
Ｐ、 ｄＣＴＰ。
ｄＴＴＰの混合液）、滅菌水１）３μｌ及びｌＯ単位の
Ｋｌｅｎｏｖ酵素（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ
ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｎ＋ｅｎｔ）を加え、２２℃で
３０分間反応を行い、５′末端突起部位の修復を行った
。フェノール抽出１回、エーテル抽出３回、エタノール
沈澱１回の処理を行いＤ Ｎ Ａを乾燥させ、１０μｌ
の滅菌水に溶解した。
Ｋｌｅｎｏｖ酵素（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ
ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｎ＋ｅｎｔ）を加え、２２℃で
３０分間反応を行い、５′末端突起部位の修復を行った
。フェノール抽出１回、エーテル抽出３回、エタノール
沈澱１回の処理を行いＤ Ｎ Ａを乾燥させ、１０μｌ
の滅菌水に溶解した。
次に、３ｕｌのＲａｍ旧リクリンカｄ （ｐＣＧＧＡＴ
ＣＣＧ）、１μｌの水に溶解）、１００倍濃のｌｉｇａ
ｔｉｏｎ反応緩衝液３μｌ、滅菌水１６μｌ及び４μｌ
のＴ４− ＤＮ Ａ ｌｉｇａｓｅ（１），２単位）を
加え、２２℃６時間の反応を行った。フェノール抽出１
回、エーテル抽出３回、エタノール沈澱１回の処理後、
ＤＮＡを乾燥させ、８０μｌの滅菌水に溶解し、５倍濃
度のＢｇｌＩＩ反応緩衝液２０μｍ５０単位のＲａｍ旧
を加えて、３７℃で３時間反応を行った。本反応液を３
．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによ
りＤＮＡ断片を分離し、１４９６ ｂｐのｎｅｏ遺伝子
に相当するゲルの部位を切り出し、ゲルを微細に破砕し
た後溶出用緩衝液４００μｌを加え、３７℃で１晩の抽
出を行った。遠心によりアクリルアミドゲルと水層とに
分け、水層をフェノール抽出１回、エーテル抽出３回、
エタノール沈澱１回を行いＤＮＡを精製した。
ＣＣＧ）、１μｌの水に溶解）、１００倍濃のｌｉｇａ
ｔｉｏｎ反応緩衝液３μｌ、滅菌水１６μｌ及び４μｌ
のＴ４− ＤＮ Ａ ｌｉｇａｓｅ（１），２単位）を
加え、２２℃６時間の反応を行った。フェノール抽出１
回、エーテル抽出３回、エタノール沈澱１回の処理後、
ＤＮＡを乾燥させ、８０μｌの滅菌水に溶解し、５倍濃
度のＢｇｌＩＩ反応緩衝液２０μｍ５０単位のＲａｍ旧
を加えて、３７℃で３時間反応を行った。本反応液を３
．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによ
りＤＮＡ断片を分離し、１４９６ ｂｐのｎｅｏ遺伝子
に相当するゲルの部位を切り出し、ゲルを微細に破砕し
た後溶出用緩衝液４００μｌを加え、３７℃で１晩の抽
出を行った。遠心によりアクリルアミドゲルと水層とに
分け、水層をフェノール抽出１回、エーテル抽出３回、
エタノール沈澱１回を行いＤＮＡを精製した。
５０ｎｇのｎｅｏ遺伝子（１９μＪの水に溶解）と、１
）０、ｕｇのＢｇｌｆｆ切断ｃｒｐ処理ｐＫＳＶ−１０
（４μｌ （７）水に溶解）に１００倍濃の１ｉｇａｔ
ｉＯｎ反応緩衝液３μｍ 、９ｍＭ ＡＴＰ溶液１．２
μｌ及び２μｌのＴ４−Ｄ Ｎ Ａ ｌｉｇａｓｅ （
５，６単位）を加え、４℃１晩の反応を行った。
）０、ｕｇのＢｇｌｆｆ切断ｃｒｐ処理ｐＫＳＶ−１０
（４μｌ （７）水に溶解）に１００倍濃の１ｉｇａｔ
ｉＯｎ反応緩衝液３μｍ 、９ｍＭ ＡＴＰ溶液１．２
μｌ及び２μｌのＴ４−Ｄ Ｎ Ａ ｌｉｇａｓｅ （
５，６単位）を加え、４℃１晩の反応を行った。
反応液を２回フェノール抽出、３回エーテル抽出、１回
のエタノール沈澱の処理を行ったのち、ＤＮＡを乾燥さ
せ、２０μｌのＴＥ−緩衝液に溶解し、形質転換用ＤＮ
Ａ溶液とした。その溶液５μｌを用いて２００μｌの大
腸菌ＤＨ−１コンピテント細胞に形質転換した。（形質
転換頻度３Ｘ１０’個／μｇｐＢＲ３２２）。
のエタノール沈澱の処理を行ったのち、ＤＮＡを乾燥さ
せ、２０μｌのＴＥ−緩衝液に溶解し、形質転換用ＤＮ
Ａ溶液とした。その溶液５μｌを用いて２００μｌの大
腸菌ＤＨ−１コンピテント細胞に形質転換した。（形質
転換頻度３Ｘ１０’個／μｇｐＢＲ３２２）。
以上の操作により２１株のアンピシリン−カナマイシン
耐性形質転換株を得た。うち１）株についてプラスミド
の制限酵素切断地図解析を行い、正確な方向にｎｅｏ遺
伝子の挿入された選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子導入ベク
ターを有する４株を選択した。さらに、うち１株を用い
て、常法に従いプラスミド調製を行い選択マーカーｎｅ
ｏｒ遺伝子導入ベクター（ｐＫＳＶ Ｎｅｏ）を調製し
た。尚本ベクターの動物細胞におけるｎｅｏ遺伝子の発
現はＬ−９２９細胞へのｎｅｏ遺伝子の形質導入を行い
、Ｇ−４１８耐性細胞の生成により確認した。
耐性形質転換株を得た。うち１）株についてプラスミド
の制限酵素切断地図解析を行い、正確な方向にｎｅｏ遺
伝子の挿入された選択マーカーｎｅｏｒ遺伝子導入ベク
ターを有する４株を選択した。さらに、うち１株を用い
て、常法に従いプラスミド調製を行い選択マーカーｎｅ
ｏｒ遺伝子導入ベクター（ｐＫＳＶ Ｎｅｏ）を調製し
た。尚本ベクターの動物細胞におけるｎｅｏ遺伝子の発
現はＬ−９２９細胞へのｎｅｏ遺伝子の形質導入を行い
、Ｇ−４１８耐性細胞の生成により確認した。
ＢＨＫ２１ へのエリスロポエチン゛伝 の実施例
１に記載したと同様な手順で行った。すなわち、２×ｌ
Ｏ−個のＢＨＫ２１細胞を２５ａＪ−Ｔフラスコに播種
し、翌日［）ＮＡ トランスフェクションを行った。５
０ｔｔｌの水に溶解した５０μｇ （７） ｐＭＬＶｆ
！ＰＯ１５ｔｔｌ（Ｄ水に溶解した５回ｇのｐＫＳＶＮ
ｅｏ 、３００μｌの２Ｍ塩化カルシウム液及び水２．
１＋Ｊ！を混合しＡ溶液として使用した。ＤＮＡトラン
スフェクション後、Ｇ４１８耐性細胞を選択し、２回の
限界希釈法を用いた細胞のクローン化を行い、エリスロ
ポエチンを恒常的に生産する細胞株を樹立しＥＰＯＢＭ
８Ｅと命名した０本細胞株のエリスロポエチン生産量は
ラジオイムノアッセイ法及びマウス胎児肝細胞を用いた
ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ法で調べた結果、両者
は同一の活性を示し１３００単位／１０ｈｃｅｌｌ／ｄ
ａｙであった。
１に記載したと同様な手順で行った。すなわち、２×ｌ
Ｏ−個のＢＨＫ２１細胞を２５ａＪ−Ｔフラスコに播種
し、翌日［）ＮＡ トランスフェクションを行った。５
０ｔｔｌの水に溶解した５０μｇ （７） ｐＭＬＶｆ
！ＰＯ１５ｔｔｌ（Ｄ水に溶解した５回ｇのｐＫＳＶＮ
ｅｏ 、３００μｌの２Ｍ塩化カルシウム液及び水２．
１＋Ｊ！を混合しＡ溶液として使用した。ＤＮＡトラン
スフェクション後、Ｇ４１８耐性細胞を選択し、２回の
限界希釈法を用いた細胞のクローン化を行い、エリスロ
ポエチンを恒常的に生産する細胞株を樹立しＥＰＯＢＭ
８Ｅと命名した０本細胞株のエリスロポエチン生産量は
ラジオイムノアッセイ法及びマウス胎児肝細胞を用いた
ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイ法で調べた結果、両者
は同一の活性を示し１３００単位／１０ｈｃｅｌｌ／ｄ
ａｙであった。
組み えエリスロポエチンの生産と 離実施例１に記載
したと同様な手順で行った。１）１の培養上清（ＥＰＯ
活性１．７ Ｘ １０’単位）から精製を行い、抗体カ
ラム、セファデックスＧ１００によるゲル濾過を経て、
１．０ Ｘ １０’単位のエリスロポエチン活性が回収
された。なお、最終標品は実施例１の標品と同様ＳＯＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約３５０００
の単一のバンドを与えた。
したと同様な手順で行った。１）１の培養上清（ＥＰＯ
活性１．７ Ｘ １０’単位）から精製を行い、抗体カ
ラム、セファデックスＧ１００によるゲル濾過を経て、
１．０ Ｘ １０’単位のエリスロポエチン活性が回収
された。なお、最終標品は実施例１の標品と同様ＳＯＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約３５０００
の単一のバンドを与えた。
Claims (6)
- （１）エリスロポエチン遺伝子を、レトロウィルスＬＴ
Ｒ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）のプ
ロモーターを有するベクターに挿入することによりエリ
スロポエチン形質導入ベクターを作成し、該エリスロポ
エチン形質導入ベクターをＤＮＡトランスフェクション
法によりプサイ（Ψ）２細胞或はＢＨＫ２１細胞へ導入
してエリスロポエチン産生細胞を作成するとともにエリ
スロポエチンを恒常的に産生する細胞を樹立し、次いで
該細胞を培養してエリスロポエチンを生産し、得られた
エリスロポエチンをモノクローナル抗ヒト・エリスロポ
エチン抗体吸着カラムにより単離することを特徴とする
エリスロポエチンの製造方法。 - （２）エリスロポエチン形質導入ベクターは、全エリス
ロポエチンゲノム遺伝子を、プラスミドｐＵＣ８の制限
酵素ＥｃｏＲ I とＳｍａ I による切断部位に挿入した
プラスミドｐｈＥＰ１４０４を制限酵素ＢｇｌII及びＢ
ａｍＨ I で切断してエリスロポエチン遺伝子を分離し
、該エリスロポエチン遺伝子を哺乳動物細胞用シャトル
ベクターｐＺＩＰ−ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１のＬＴＲの下流
でＮｅｏ＾ｒ遺伝子の上流の制限酵素ＢａｍＨ I 切断
部位に挿入し、エリスロポエチン遺伝子が正しく挿入さ
れたものを制限酵素地図解析により選択して得られる、
選択マーカーｎｅｏ＾ｒ遺伝子を含有するエリスロポエ
チン形質導入ベクターである特許請求の範囲第（１）項
記載のエリスロポエチンの製造方法。 - （３）エリスロポエチン形質導入ベクターは、ヒトゲノ
ムエリスロポエチン遺伝子を哺乳動物細胞用シャトルベ
クターｐＫＳＶ−１０のＳＶ−４０初期遺伝子プロモー
ターの下流に挿入したエリスロポエチン遺伝子発現ベク
ターｐＳＶｈＥＰＸを制限酵素Ａｐａｌで切断した後、
Ｔ４ポリメラーゼで３′突起部位を除去し、次いで制限
酵素ＢａｍＨ I で切断してエリスロポエチン遺伝子を
含む切断片を得、一方ＣＡＴ遺伝子発現ベクターｐＭＬ
ＶＣＡＴ制限酵素ＢａｍＨ I とＳａｍ I で切断してＬ
ＴＲを含む切断片を得、このようにして得た両断片をＴ
４リガーゼにより接続してエリスロポエチン遺伝子が正
しく挿入されたものを制限酵素地図解析により選択して
得られるエリスロポエチン形質導入ベクター（ｎｅｏ＾
ｒ遺伝子を含まない）である特許請求の範囲第（１）項
記載のエリスロポエチンの製造方法。 - （４）上記選択マーカーｎｅｏ＾ｒ遺伝子を含有するエ
リスロポエチン形質導入ベクターをＤＮＡトランスフェ
クション法によりプサイ（Ψ）２細胞或はＢＨＫ２１細
胞へ導入してエリスロポエチン産生細胞を作成する特許
請求の範囲第（１）項記載のエリスロポエチンの製造方
法。 - （５）上記エリスロポエチン形質導入ベクター（ｎｅｏ
＾ｒ）遺伝子を含まない）を選択マーカーｎｅｏ＾ｒ遺
伝子導入ベクターｐＫＳＶＮｅｏと混合してＤＮＡトラ
ンスフェクション法によりＢＨＫ２１細胞へ導入してエ
リスロポエチン産生細胞を作成する特許請求の範囲第（
１）項記載のエリスロポエチンの製造方法。 - （６）選択マーカーｎｅｏ＾ｒ遺伝子導入ベクターｐＫ
ＳＶＮｅｏは、選択マーカーｎｅｏ＾ｒ遺伝子を含有す
るプラスミドｐＮＥＯを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し
た後、ＫＩｅｎｏｗ酵素（ＤＮＡポリメラーゼ I ）で
５′突起を修復し、次いでＢａｍＨ I リンカーを接続
した後、ＢａｍＨ I で切断したｎｅｏ遺伝子（１９４
６ｂｐ）断片をシャトルベクターｐＫＳＶ−１０のＢｇ
ｌIIによる切断部位に挿入して該シャトルベクターｐＫ
ＳＶ−１０のＳＶ４０の初期遺伝子プロモーターの下流
にｎｅｏ遺伝子が正しく挿入されたものを制限酵素地図
解析により選択して得られたものである特許請求の範囲
第（５）項記載のエリスロポエチンの製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61112537A JPS62269697A (ja) | 1986-05-19 | 1986-05-19 | エリスロポエチンの製造方法 |
| EP87301626A EP0236059B1 (en) | 1986-02-27 | 1987-02-25 | Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same |
| DE3789678T DE3789678T2 (de) | 1986-02-27 | 1987-02-25 | Herstellung von erythropoietinproduzierenden Zellen und Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin mit Verwendung dieser Zellen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61112537A JPS62269697A (ja) | 1986-05-19 | 1986-05-19 | エリスロポエチンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62269697A true JPS62269697A (ja) | 1987-11-24 |
| JPH0379000B2 JPH0379000B2 (ja) | 1991-12-17 |
Family
ID=14589124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61112537A Granted JPS62269697A (ja) | 1986-02-27 | 1986-05-19 | エリスロポエチンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62269697A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005082599A (ja) * | 2003-09-08 | 2005-03-31 | Depuy Mitek Inc | 軟骨細胞治療薬配給システム |
| US7927599B2 (en) | 2003-09-08 | 2011-04-19 | Ethicon, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US8257963B2 (en) | 2007-06-01 | 2012-09-04 | Depuy Mitek, Inc. | Chondrocyte container and method of use |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5942321A (ja) * | 1982-05-05 | 1984-03-08 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子 |
| JPS6041614A (ja) * | 1983-08-16 | 1985-03-05 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 純粋なエリスロポエチンの製造法 |
| JPS6112288A (ja) * | 1983-12-27 | 1986-01-20 | ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド | 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクタ− |
| JPH01228492A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
-
1986
- 1986-05-19 JP JP61112537A patent/JPS62269697A/ja active Granted
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5942321A (ja) * | 1982-05-05 | 1984-03-08 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子 |
| JPS6041614A (ja) * | 1983-08-16 | 1985-03-05 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 純粋なエリスロポエチンの製造法 |
| JPS6112288A (ja) * | 1983-12-27 | 1986-01-20 | ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド | 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクタ− |
| JPH01228492A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005082599A (ja) * | 2003-09-08 | 2005-03-31 | Depuy Mitek Inc | 軟骨細胞治療薬配給システム |
| US7897384B2 (en) | 2003-09-08 | 2011-03-01 | Ethicon, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US7927599B2 (en) | 2003-09-08 | 2011-04-19 | Ethicon, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US8153117B2 (en) | 2003-09-08 | 2012-04-10 | Depuy Mitek, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US8354100B2 (en) | 2003-09-08 | 2013-01-15 | Depuy Mitek, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US8394369B2 (en) | 2003-09-08 | 2013-03-12 | Depuy Mitek, Inc. | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US9125888B2 (en) | 2003-09-08 | 2015-09-08 | Depuy Mitek, Llc | Chondrocyte therapeutic delivery system |
| US8257963B2 (en) | 2007-06-01 | 2012-09-04 | Depuy Mitek, Inc. | Chondrocyte container and method of use |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0379000B2 (ja) | 1991-12-17 |
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