RU1780541C - Способ экспрессии цепей химерного антитела - Google Patents

Abstract

Использование: в иммунологии и медицине дл  диагностики прогнозировани  и лечени  болезненных состо ний, включа  аденокарциному. Сущность изобретени : сконструированы эукэриотические векторы экспрессии, которые могут быть использованы дл  создани  модифицированных и химерных производных KSI/4.

Description

Изобретение относитс  к иммунологии и генной инженерии, в частности к исследованию моноклональных антител, и направлено на продуцирование химерных моноклональных антител, которые могут быть использованы дл  лечени  рака и других заболеваний.

Изобретение относитс  к способу экспрессии т желых цепей химерного антитела KS.1/4 в эмбриональных клетках человеческой почки. В публикации Европатента № 0125023 от 14 но бр  1984 г. раскрываютс  рекомбинантные и химерные моноклональ- ные антитела. Однако эти молекулы реагируют с карциноэмбриональным антигеном, а не с антигеном аденокарциномы насто щего изобретени . Кроме того, СаЫНу и др. не раскрывают способ насто щего изобретени , в котором цепи антител продуцируютс  в нелимфоидных клетках почки.

Sherle L Morrison в Science. 229 : 1202- 1207 (1985) раскрывает получение химерных антител в клетках трансфектомы. Химерные

антитела, полученные Morrison реагируют с тринитрофенилом и были продуцированы в лимфоидных клетках, В работе Sun и др., (1987) Proc.Natl.Acad Sci США, 84 : 214-218 раскрывают химерные антитела, которые реагируют в аденокарциномой. Из сравнени  аминокислотной последовательности т желой цепи антитела, раскрытого Sun, и аминокислотной последовательности т желой цепи KS1/4  сно видно, что эти последовательности  вл ютс  на 48% негомологичными. Более того, в работе Sun и др. не раскрываетс  использование нелимфоидных клеток, которые используютс  в насто щем изобретении.

Насто щее изобретение относитс  к получению новых соединений ДНК и векторов клонировани  рекомбинатной ДНК, который кодирует мышиное (человеческое) химерное антитело с т желой цепью, происход щее от KS1/4. Эти векторы позвол ют экспрессировать новые ДНК-соединени  в нелимфоидных эукариотических клетках.

х 00 О

Сл)

Изобретение также позвол ет получить клетки хоз ина, трансформированные этими новыми клонирующими векторами. Эти трансформированные клетки хоз ина экс- прессируют рекомбинантные или химерные К51/4-антитела. Многие из существующих ДНК-соединений могут быть использованы дл  получени  К51/4-производных, которые до сих пор не были синтезированы ни в природе, нив лаборатории, и которые также вход т в объем насто щего изобретени .

Моноклональное антитело KS1 /4  вл етс  мышиным антителом, которое специфически св зываетс  с антигеном поверхностных клеток 40000 Д, обнаруженным в высокой плотности на клетках аденокарциномы, а также на нормальных эпителиальных клетках. Это антитело оказалось эффективным дл  диагностики заболеваний In vitro, а также дл  In vivo диагностики и лечени  аденокарцино- мы. Последние исследовани  подтвердили, что К51/4-лекарственные коньюгаты показывают дозозависимую суппрессию роста опухоли .

Возникает одна проблема с использова- нием мышиных антител в человеческом организме , если иммунна  система пациента с заболеванием раком вырабатывает антитела против мышиных иммуноглобулинов. Такой иммунный ответ происходит не у всех паци- ентов, но если он происходит, то он приводит к постепенному ухудшению эффективности лечени  в течение курса многократного приема лекарственного средства. Этот иммунный ответ пациента может также приводить к более сильным реакци м, таким, как анафилакси  или сывороточна  болезнь. Така  иммуногенность не позвол ет вводить многократные дозы антитела и поэтому снижает клиническую ценность лечени .

Человеческие моноклональные антитела получить очень трудно, поэтому во избежание иммунологических проблем конструируют химерные антитела. Химерные антитела содержат специфические или вари- абельные части антитела, происход щего от видов, св занных с посто нным участком от различных видов. См. Ol u Morrison; Bio techniques 4:214-221 (1986). Поскольку иммунный ответ бывает часто направлен против посто нного участка, замена мышиного посто нного участка человеческим посто нным участком способствует значительному ослаб лению иммунологической реакции пациента. В соответствии с этим химерные антитела  вл ютс  желательными дл  лечени  заболевани .

Основна  теори  химерных антител описана в литературе, однако еще остаетс  необходимость в разработке новых химерных

антител, обладающих определенной специфичностью . Насто щее изобретение относитс  к рекомбинантной ДНК и аминокислотным последовательност м, которые содержат полную молекулу KS1 /4 мо- ноклональногоантитела.Эти

последовательности воздействуют на экспрессию химерных антител, которые обладают той же тканевой специфичностью, что и KS1/4, но которые содержат при этом посто нные участки, происход щие от человеческих источников. Поэтому насто щее изобретение позвол ет примен ть терапевтический режим с той же тканевой специфичностью моноклинального антитела KS1/4, но со значительным уменьшением иммунологических побочных эффектов.

Кроме того, изобретение включает ре- комбинатную ДНК и аминокислотные последовательности KS1/4. Знание этих последовательностей позвол ет специалистам разработать новые К51/4-производные с модифицированными родством дл  KS1/4- антигена. Насто щее изобретение, кроме того , содержит способы получени  химерного и рекомбинантного KS1/4 в лини х нелимфо- идных клеток, чтобы тем самым разрешить проблему, часто возникающую в результате двойной секреции гетерогенных антител в лимфоидных клетках.

В цел х раскрыти  насто щего изобретени  ниже приведенные пон ти  определ ютс  следующим образом:

А - деоксиаденозин;

Ala - остаток аланина;

Ар - ампициллин-резистентный фенотип или ген, несущий устойчивость в ампициллину;

Arg - остаток аргинина;

Ash - остаток аспарагина;

ASp - остаток аспарагиновой кислоты;

С - деоксицитозин;

Химерное антитело - антитело, содержащее вариабельный участок от одного вида обычно мыши, который св зан с посто нным участком от другого и отличного от него вида, обычно человека;

CyS - остаток цистеина;

dhfr - фенотип дигидрофолат-редукта- зы или ген, несущий этот фенотип;

Enh - последовательность энхансера, полученна  от ВК-вируса;

G - деоксигуанозин;

Gin - остаток глутамина;

Glu - остаток глутаминовой кислоты;

Gly - остаток глицина:

G418-R устойчивый фенотип или ген, несущий этот фенотип, может быть также идентифицирован как KmR;

His - остаток гистидина;

HmR - гидромицинустойчивый фенотип или ген, несущий этот фенотип;

Не - остаток изолейцина;

Ivs - ДНК, кодирующа  интрон, так называема  вставочна  последовательность;

KSA - антиген поверхностного гликоп- ротеина клеток 40000 USLA-P3, которые  вл ютс  распознаваемыми моноклинальным антителом KS1/4;

KS1/4 - мышиное моноклональное антитело , происход щее от линии клеток гиб- ридомы; это антитело, распознающее гликопротеиновый антиген 40000 Д, обнаружено на поверхности клеток P3-UCLA;

Leu - остаток лейцина;

LP-ДНК-фрагмент, содержащий активность промотора аденовируса позднего промотора;

Lys - остаток лизина;

Met - остаток метионина;

МоАВ - моноклональное антитело;

Нативный белок- полипептид, продуцируемый при трансл ции и РНК-транскрипта, и любых посттрансл ционных модификаций;

РА - ДНК-последовательность, кодирующа  сигнал полиаденилации;

Phe - остаток фенилаланин;

PL-ДНК-фрагмент, содержащий активный промотор левого промотора бактериофага;

Pro - остаток пролина,

Промотор - ДНК-последовательность, котора  направл ет транскрипцию ДНК в РНК.

Вектор клонировани  рекомбинантной ДНК - любой автономно реплицирующий агент, включающий плазмиды и фаги, но не ограничивающийс  ими, содержащий ДНК- молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных фрагментов ДНК.

Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК - любой вектор клонировани  рекомбинантной ДНК, в который ввод т промотор .

Рекомбинантное KS1/4 - молекулы мо- ноклонального антитела KS1/4, экспресси- руемые в клетках, трансформированных вектором, вызывающим экспрессию KS1/4.

Репликон - ДНК-последовательность, котора  регулирует и обеспечивает автономную репликацию плазмиды или другого вектора.

Фрагмент рестрикции - люба  линейна  последовательность генерированна  одной или несколькими рекстриктрирующи- ми эндонуклеазами.

Восприимчива  клетка хоз ина - котора  не может расти в присутствии данного антибиотика или другого токсичного соединени  без устойчивого к нему ДНК-фрагмента .

Ser - остаток серина. Структурный ген - люба  ДНК - после- 5 довательность, кодирующа  функциональный полипептид, начало включени  трансл ции и стопсигналы. Т - деокситимидин.

TcR - тетрациклинустойчивый фенотип 0 или ген, несущий этот фенотип. Thr - остаток треонина. Тгр - остаток триптофана. Туг - остаток тирозина Val - остаток валина.

5 На фиг.1 показана схема конструкции плазмиды PL32 (дл  нагл дности фиг. точно не соответств уют масштабу); на фиг.2 - сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pNM789; на фиг.З - схема конструкции 0 плазмиды 120; на фиг.4 - схема конструкции плазмиды PL110; на фиг 5-сайт рестрикции и функциональные карты ВК - вируса и плазмиды рВК neol; на фиг.6 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид 5 pLPCat и pPLcat; на фиг.7 - схема конструкции плазмиды pL133; на фиг.8 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPC, pSV 2hyg и pLPChygl; на фиг.9 - схема конструкции плазми ды pBW25; на фиг.Ю - 0 схема конструкции плазмиды pBW32; на фиг 11 - сзйт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPChd и phd; на фиг. 12 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СНКС2-6 и СНКС2-18; на фиг.13 - 5 сайт рестрикции и функциональные карты плазмид СН2А5 и CH2A51G2; на фиг.14 - сайт рестрикции и функциональные карты плазмид CH2A51G3 и CH2A51G4.

Предметом насто щего изобретени   в- 0 л етс  способ экспрессии, заключающийс  в том, что конструируют рекомбинантную ДНК-плазмиду pHI-HI, котора  кодирует вариабельную область т желой цепи антитела KS1/4 с аминокислотной последовательно- 5 стью, состо щей в основном из

Gin Пг Gin Геи al Gin Ser Gly Pro Пи leu I) s Pro C1S Glu Thr Val I-, s lie Ser l-±s Ala Ч-r Cly 14 r Thr Phc Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Thr Pro Gly 0 LVS GIV Leu Lys Tip Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Cly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly .rij Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala ST Thr Ala Phe teu Gin lie flln Cln Pro Gin Asn Met ArS Thr Mcc Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe lie Ser Lys Asp Tyr Trp Gly Cln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

трансформируют штамм культивируемых клеток,  вл ющихс  эмбриональными клетками гючютг человека, трансформированными аденовирусом типа 5, с помощью плазмиды рН1-Н1, а затем культивируют

клетки, которые экспрессируют цепи химерного антитела.

Нуклеотидна  последовательность вариабельной области т желой цепи  вл етс  следующей5

CAG АТС САО TTG ОТО САС ТСТ EGA CCT GAG СТО AAG AAG CCT GOA GAG АСА СТС ААО АТС ТСС TGC АЛО GCT ТСТ GGG ТАТ АСС ТТС АС4 ААС ТАТ GCA ATG ААС TGG CTG AAG CAG ACT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GftC TGG ATA ААС ACC ТАС ACT GGA GAA CCA АСА TAT GCT GAT GAC TTC AAG GOA CGG TTT GCC ТТС ТСТ TTG CAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TTT TTG CAG ATT CAA CAA.CCT CAG AAT ATO AGO ACT ATG GCT АСА ТАТ ТТС ТОТ СТА АСА ТТТ ATT TCT. AAG GOG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACG TCA GTC ACC GTC ТСС ТСА

Молекулы легкой и т желой цепи насто-  щего изобретени  ассоциируютс  с отчетливыми сигнальными пептидами.

Последовательность аминокислотных остатков сигнального пептида т желой цепи в основном  вл етс  следующей Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gin Ser Ala Gin Ala

Нуклеотидна  последовательность этого сигнального пептида  вл етс  следующей

ATG GAT TGG CTG TGG ААС TTG СТА ТТС CTG ATG GCA GCT GCC CAA ACT GCC CAA GCA:

Новые ДНК-соединени  насто щего изобретени   вл ютс  производными от кДНК-клонов, полученных из мРНКот линии клеток гибридомы, котора  продуцирует мо- ноклональное антитело KS1/4. Плазмида рСКС2310 содержит полную кодирующую последовательность легкой цепи монокло- нального антитела KS1/4; кодирующую последовательность сигнального пептида, ассоциируемую с легкой цепью, и 5 и 3 - нетранслированные участки этой молекулы. 51 - нетраслйрованный участок имеет ДНК- поел едовател ьность:

51 -ТС TGA CAG АСА СТА CTG TGC CTC GTC .GGT TGG GAC СТА ААА GGG СТА СТА GAA ТСС GCA AGC ТТТ ТТА АТС ТСТ CCA AAG АА6 ATG AT G TCC GCC AGT АТб ТТб ТСА GGA AG С CCT TAA АСА AAG AAG GTA ATT AG С TAG GGA CCA ААА ТТС ААА GAC AAG-31 .

З1 - нетранслированный участок имеет ДН К-последовательность: 51 - TAG AGA CAA AGG ТСС TGA GAC GCC ACC ACC AGC TCC CCA GCT CCA TCC TAT CTT CCC TTC TAA GGA GGT CTT GGA GGC TTC CCC АСА AGC GAC ATA CCA CTG TTG CGG TGC TCC AAA CCT CCT CCC CAC CTC CTT CTC CTC CTC CTC CCT TTC GGC TTT TAT CAT GCT AAT ATT TGC AGA AAA TAT TCA ATA AAG TGA GTC TTT GCA CTT G-31

Плазмида рСКС2310 может быть выделена обычным способом из E.coll К 12 ММ294 (pGKC2310), штамм депонирован и

0

5

0

5

0 5 0

5

0 5

находитс  в посто нном фонде коллекции культур Северной областной исследовательской лаборатории (NRRL), Peorla, Иллинойс . Культура E.coli K12 ММ294/ рКС2310 может быть получена из NRRL под вход щим номером В-18356.

Плазмида рС2А52 содержит полную кодирующую последовательность т желой цепи моноклонального антитела KS1/4, кодирующую последовательность сигнального пептида, св занного с т желой цепью и 51 и З1 - нетранслированные области этой молекулы. Т жела  цепь, кодируема  этой молекулой,  вл етс  цепью подкласса IgG 2A, 51 - нетранслированна  область имеет ДНК-последовательность:

51 - TCG TTT GTC TTA AGG CAC CAC TGA GCC CAA GTC TTA GAC ATC-31 а З1 - нетранслируема  область имеет ДНК- последовательность:

51 - TGA GCT CAG CAC CCA CAA AAC TCT CAG GTC CAA AGA GAG ACC CAC

ACT CAT CTC CAT GCT TCC CTT GTA TAA ATA AAG CAC CCA CGA ATG CCT GGG ACC TAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AGA CG-31

Плазмида рС2А52 может быть выделена обычным способом из E.coli K12MM294/pG22A52, также депонированным и наход щимс  в посто нном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coll K12 MM294/pG2A52 может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL B-18357.

Плазмида СНКС2-6 содержит кодирующую КДНК-последовательность вариабельной области природной легкой цепи моноклонального антитела KS1/4, к ДНК кодирующую последовательность сигнального пептида, св занного с этой легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность, котора  кодирует посто нную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина. Плазмида СНКС2-6 может быть выделена обычным способом из Е. coll K12 DH5/CHKC2-6, также депонированном и наход щимс  в посто нном фонде коллекции культур NRRL Культура Е. coll K12 ДН5- СНКС2-6 может быть получена из NRRL под вход щим номером В-18358. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды СНКС-2-6 представлены на фиг. 12.

Плазмида СНКС-2-18 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области производного с легкой цепью моноклонального антитела KS1/4, кодирующую кДН К-последовательность сигнального пептида, ассоциируемого с легкой цепью, и геномную ДНК-последовательность , котора  кодирует посто нную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина . Вариаци  этой последовательности включает альтерацию кодона в З1 -конце. Вариабельна  область природной легкой цепи содержит кодом агригина в З1 - конце, тогда как кодон в том же положении в плазмиде СНКС2-18 кодирует остаток глицина . Плазмида СНКС2-18 может быть выделена обычным способом из Е. coll K12 ДН5/СнКС2-18, также депонированном и наход щимс  в посто нном фонде коллекции культур NRRL. Культура Е. coli K12 ДН5/СНКС2-18 может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL В/18359. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды СНКС2-18 представлены на фиг. 12.

Плазмида СН 2А5 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области т желой цепи моноклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-после- довательность сигнального пептида, ассоциированного с указанной т желой цепью, и геномную ДНК-последовательность, котора  кодирует посто нную область т желой цепи человеческого иммуноглобулина IgGI, Плазмида СН2А5 может быть выделена обычным способом из Е. coli K12 ММ294/СН2А5, также депонированном и наход щимс  в посто нном фонде коллекции культур NRRL Культура Е. coli K12 ММ294/СН2А5 может быть получена и NRRL под вход щим номером NRRL B-18360. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды СН2А5 представлены на фиг, 13.

Плазмида СН2А551С2 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области т желой цепи моноклонального антитела KS1 /4, кодирующую кДНК-последо- вательность сигнального пептида, ассоциированного с т желой цепью, и геномную ДНК-последовательность, котора  кодирует посто нную область т желой цепи человеческого иммуноглобулина lgG2. Плазмида СН2А51С2 может быть выделена обычным способом из Е. coli K12 ДН5/СН2А51С2, также депонированном и наход щимс  в посто нном фонде коллекций культур NRRL. Культура Е. coli K12 Н5/СН2А5102 может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL B-18361. Сайт ресктрикции и фун- кциональна  карта плазмиды CH2A51G2 представлены на фиг. 13.

Плазмида CH2A51G3 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области т желой цепи моноклонального антитела KS1/4; кодирующую кДНК-последовательность сигнального пептида, ассоциированного с т желой цепью, и геномную ДНК-последовательность, котора  кодирует посто нную область т желой цепи человеческого иммуноглобулина lgG3. Плазмида CH2A51G3 может быть выделена обычным способом из Е. coli K12 ДН5/СН2А51СЗ, также депонированном и 5 наход щимс  в посто нном фонде коллекции культур NRRL, Культура Е. coll K12 ДН5/СН2А51СЗ может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL B- 18362. Сайт рестрикции и функциональна  0 карта плазмид CH2A51G3 представлены на фиг. 14.

Плазмида CH2A51G4 содержит кодирующую кДНК-последовательность вариабельной области т желой цепи моноклонального 5 антитела KS1/4, кодирующую кДНК-последо- вательность сигнального пептида, ассоциированного с т желой цепью, и геномную ДНК-последовательность, котора  кодирует посто нную область т желой цепи человече0 ского иммуноглобулина lgG4. Плазмида CH2A51G4 может быть выделена обычным способом из Е. coll K12 ДН5/СН2А5164, также депонированном и наход щимс  в посто нном фонде коллекции культур NRRL.

5 Культура Е. coll K12 ДН5/СН2А5164 может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL B-18363. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды CH2A51G4 представлены на фиг.14.

0

ДНК-соединени  насто щего изобретени , кодирующие рекомбинантное KS1/4 и их производные, особенно предпочтительны дл  конструировани  векторов дл  трансфор5 мации и экспрессии различных цепей антитела в клетках млекопитающих и других эукарио- тических клетках. Хоз йские клетки многих млекопитающих обладают необходимым механизмом дл  распознавани  и соответствую0 щей обработки-сигнальных пептидов, наход щихс  на аминоконцах различных цепей антитела, рассматриваемых в насто щем изобретении. Клетки хоз ина некоторых млекопитающих также обеспечивают посттранс5 л ционные модификации, как, например, гликосилирование, наблюдаемое в молекулах антитела. Существует много разновидностей векторов дл  трансформации эукариотиче- ских клеток хоз ина; и специфические векто0 ры, описываемые ниже, не ограничивают объема насто щего изобретени .

Векторы экспрессии насто щего изобретени , которые способствуют получению ре- комбинантного KS1/4 и его химерных

5 производных, конструируютс  при помощи плазмиды phd. Плазмида phd конструируетс  из широко известных доступных исходных материалов. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды phd представлены на фиг.11.

Плазмида phd конструировалась сначала при помощи выделени  плазмиды рКС283 от Е. coll K12 ВЕ1201/рКС283. Эта культура может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL B-15830. Плазмида рКС283 содержит промотор гибрида Ipp- pZ бактериофага А. Эту плазмиду получали из клеток Е. coll K12 ВЕ1201, так как эти клетки содержат термовосприимчивый с I репрессор, интегрируемый в клеточную ДНК. Ненужный участок lacZ плазмиды рКС283 вырезали сначала путем переваривани  плазмиды рекстриктирующим ферментом PV и 11. Затем добавл ли к переваренной ДНКспецифические ДНК линкеры дл  превращени  PV и 11 сайтов в одиночный Xhol сайт, который создавал плазмиду рКС28РХ. Подробные описани  выделени  плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены соответственно в примерах 1 и 2. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид рКС283 и рКС283РХ представлены на фиг.1. Как описано в примере 3, плазмида рКС283РХ трансформируетс  в Е. coli K12 МО (А4) Е. coli K12 МО (А) может быть получена из NRRL под вход щим номером NRRL В-15993.

Затем при помощи рестриктирующих ферментов Bglll и Xhol переваривали плазмиду рКС283РХ. После этого вектор очищали , ДНК линкеры с Bglll и Xhol-концами лигировали в вектор дл  образовани  плазмиды рКС283-п, Bglll-Xhol линкер также одержал ХЬа 1-сайт. Xho-сайт плазмиды pKC283-Z затем трансформировали в BamHI-сайт. Это достигалось путем полного переварировани  плазмиды pKC283-L рестриктирующим ферментом Xh01, с последующей обработкой ф-м Кленова и добавлением BamHI-линке- рами дл  образовани  плазмиды pKC283LB. Подробное описание конструировани  плазмид pKC283-Ln pRC283-L В приводитс  соответственно в примерах 4 и 5. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pKC283-Lи pKC283-L В предстэрлены на фиг.1.

Периферическую ДНК Е. coll затем вырезали из плазмиды рКС283РХ путем полного переваривани  рестриктирующим ферментом Sal I с последующей обработкой 4,0 kb вектора Кленова и добавлением EcoR l-линкеров. После рециркул ризации путем лигировани  получали плазмиду рКС283Р RS. Затем плазмиду г ереваривали рестриктазами Pst и Sph I выдел ли 0,85 kb. Фрагмент рестрикции Psi + 1 - SpJbi I. Аналогичным образом плазмиду pKC283-Z В переваривали рестриктазами ESI + 1 и SpJi I и выдел ли 0,3 kb орагмент

0,85 kb Pst + 1 - Sph I фрагмента плазмиды рКС283Р RS затем лигировали в 3,0 kb Pst + I - $ph I фрагмента вектора плазмиды pKC282-L В дл  образовани 

плазмиды pL32. Подробные описани  конструировани  плазмид рКС283 PRS и pL32 приведены в примере 6. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид рКС283 PRS и pL32 представлены на фиг.1.

Плазмида pNM789 была получена из NRRL в Е. coll K12, PV 308 (pNM789 под вход щим номером В-18216. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмид pNM789 представлены на фиг.2. Плазмиду

pNM789 частично переваривали рестрикта- зой PVU II, полностью переваривали ре- стриктазой BamHI. а затем обрабатывали щелочной фосфатазой. Затем в переваренный , обработанный фосфатазой вектор

pNM789 лигировали новый PVU II - BamMI линкер с целью получени  плазмиды 120. Затем плазмиду 120 полностью переваривали рестриктазами ХЬа и BamHI и выдел ли 0,6 kb Xbal - BamHI EK-BGH-кодирующий

фрагмент рестрикции. Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазами Xbal и BamHI и выдел ли 3,9 kb фрагмента вектора. Затем во фрагмент 3.9 kb вектора плазмиды pL32 лигировали 0,6 kb Xbal - BamHI

фрагмента плазмиды 120 дл  получени  плазмиды pL47. Подробные описани  конструировани  плазмид 120 и pL47 привод тс  в примерах 6 и 7. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид 120 и pL47 представлены

соответственно на фиг.З и 4.

Плазмида pPR 12 содержит ген с 18157 термовосприимчивого pZ репрессиора, а плазмида рВ R 322 - ген, несущий устойчивость к тетрациклину. Плазмида р PR 12

раскрыта и за влена в патенте США № 4436815, выданном 13 марта 1984 г. Сайт рестрикции и функциональна  карта плгз- миды р PR12 представлены на фиг.4. Ecof. l- сайт удал ли из плазмиды pPR 12 путем.

первого полного переваривани  плазмиды рестриктазой EcoR I с обработкой ф-том Кленова. Затем век гор рециркулизовали ли- гированием дл  образовани  плазмиды pBL12 ARI. Затем плазмиду рР R 12 ДК

переваривали рестриктазой AVal с обработкой ф-м Кленова. Переваренную AVal и обработанную ф-том Клечова плазмиду рР R 12 ARI затем лигировали в Eco RI-линкеры, разрезали рестриктазои Ecol, а затем рециркулизовали с целью получени  плазмиды pPR 12A R I. Подробные описани  конструировани  плазмиды рР R I2A R 1 привод тс  в примере 8. Сайт рестрикции и функциональна  карта представлены на фиг.4.

л 2,9 kb Pstl - ECOR I фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I выдел ли после первого переваривани  плазмиды ре- сктриктазами Pstl и Eco R I, Плазмиду переваривали рестриктазами Pstl и BamHI, ил,2,6 kb Pstl-BamHI фрагмент рестрикции выдел ли. При помощи отдельной реакции плазмиду pZ47 переваривали рестриктазами Eco R I и BamHI, а- 1,03 kb Eco R I - BamHI фрагмента выдел ли. 2,7 kb Pstl- BamHI и 1,03 kb Eco R I - BamHI фрагмента ресктрикции плазмиды pL47 лигировали в 2,9 kb Pstl-EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I с целью образовани  плазмиды . Подробное описание конструировани  плазмиды pL110 приводитс  в примере 9, Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pL110 представлены на фиг.4.

Вектор типа ВК-энхансера, рассматриваемый в насто щем изобретении, содержит кассету ВК-энхансера и позднего промотора аденовируса, а также ген, несущий устойчивость к гидромицину, и мышиный ген дигидрофолат-редуктазы (dhbr). Использование ВК-вируса в соединении с поздним промотором аденовируса значительно способствует усилению транскрипции рекомбинатного гена в эукариотических клетках хоз ина, Ген, несущий устойчивость к гидромицину, используетс  в эукариотических клетках хоз ина в качестве отборочного маркера .Машинный ген дигидрофолат- редуктазы при соответствующих услови х амплифицируетс  в хромосоме хоз ина. Эта амплификаци , описанна  в обзоре Schimke 1984, Cell 37:705-713, может также включать ДНК-последовательности, близко соприкасающиес  с dhfr геном. Этот dhfr ген  вл етс  селектируемым маркером в dhfr отрицательных клетках и может быть использован дл  увеличени  числа копий сегментов ДНК путем экспонировани  клеток хоз ина дл  увеличени  уровней метот- рексата.

Плазмида pLPChd может быть использована дл  построени  эукариотического вектора экспрессии дл  экспрессии нового антитела KSI/4, рассматриваемого в насто щем изобретении. Плазмида pLPChd содержит ген dhfr промотор аденовируса типа-2 и энхансер ВК-вируса. ВК-вирус, содержащий энхансер ВК-вируса, может быть закуплен или легко выделен в больших количествах так, как описано в примере 10. ВК-вирус также имеетс  в Американской коллекции типовых культур под вход щим номером ATCCVR-837. Сайт рестрикции и функциональна  карта ВК-вируса представлены на фиг.5.

ВК-вирусный геном комбинировали с частью плазмиды pdBPV. MMT пео с целью построени  плазмиды рВК neol и рВК пео 2. Плазмида pdBPV-MMT пео размером около 5 15 kb, имеюща с  в АТСС под номером АТСС 37224, содержит репликон и ген / -лактомазы от плазмиды рВ R 322, промотор мышиного металлотионина, помещенного в цел х стимул ции экспрессии

0 структурного гена, который кодирует фермент , несущий устойчивость к неомицину, и 8 kb ДНК бычьего вируса папилломы (BPV). Плазмиду pdBPV-MMTneo можно переваривать рестриктирующим фермен5 том BamHI дл  получени  двух фрагментов: 8 kb фрагмента, содержащего BPV ДНК, и -1 kb фрагмента, содержащего другие последовательности, описанные выше, ВК-вирус имеет только один сайт рестрикции BamHI

0 и плазмиды рВК neol и рВК пео 2 конструировали путем лигировани  7 kb BamHI фрагмента рестрикции плазмиды pdBPV MMT пео в ДНК BamHI - линеаризованного ВК- вируса, Конструирование плазмид рВК пео

5 и рВК пео 2, которые отличаютс  только ориентацией дНК ВК-вируса, описано в примере 11. Плазмида рВК neol содержит - 2,1 kb фрагмента рестрикции Sall -Hindlll, тогда как плазмида рВК пео 2 содержите 1,0 kb

0 фрагмента рестрикции. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды рВК neol представлены на фиг.5.

Кажда  из плазмид рВК neol и рВК пео 2 содержит полный геном ВК-вируса, вклю5 чающий последовательность энхансера. поэтому  вл ютс  ценными исходным материалом дл  вектора экспрессии насто щего изобретени . Вектор экспрессии, плазмида рВв cat, содержит последовательо ность ВК-энхансера в тандеме с поздним промотором аденовируса типа 2, помещенного дл  стимул ции экспрессии фермента хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT). Плазмида pSV2 cat служит в качестве подхо5 д щего источника САТ-гена и может быть вз та из АТСС под вход щим номером АТСС 37155. ДНК человеческого аденовируса типа 2  вл етс  коммерчески доступной и может быть вз та из АТСС под номером

0 ATCCVR-2. Иллюстративную плазмиду pBZcat конструировали путем лигировани  содержащего поздний промотор Accl-PVU II фрагмента рестрикции ДНК человеческого аденовируса типа 2 в ВСИ-линкеры с тупым

5 концом, которые соедин ютс  только с PVU Il-концом Accl-PVU II фрагмента рестрикции . Полученный в результате фрагмент затем лигировали ,51 kb ACCI-PVU фрагмента рестрикции плазмиды pSV2cat с целью получени  промежуточной плазмиды

pLPcat. Целевую плазмиду pBLcat конструировали из плазмиды pLPcat путем лигировани  начала репликации и энхансер-содержаще- ro(A,1,28kb)Accl-PVU lf-фрагмента рестрикции ДНК ВК-вируса в л4,81 kb Accl-Stu фрагмента 5 рестрикции плазмиды pLPcat. Конструирование плазмиды pBLcat описано ниже в примере 12. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pLPcat и pBLcat представлены на фиг.6. 10

Затем из плазмид рНС7, pSV2-dpt и pSV2 Р-глобина конструировали плазмиду pL133. Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность , котора  кодирует человеческий белок. С. Плазмида рНС7 может быть выде- 15 лена из Е. coll K12 RR1/ рН С7, котора  имеетс  в NRRL под номером NRRL1-15926. Плазмиду рНС7 разрезали рестриказой Baml и выдел ли лИ,25 kb фрагмента рестрикции . Затем добавл ли линкеры и фраг- 20 мент разрезали рестриказами Apal и Hind II, а после этого выдел ли / ,23 kb фрагмента рестрикции. Далее плазмиду рНС7 разрезали рестриказой PstAO.Se kb фрагмента ре- стриказы выдел ли, добавл ли линкеры, 25 фрагмент снова разрезали рестриктазами и выдел л и 0,19 kb Apal-Bg II фрагмента рестрикции . Плазмиду pSV2 gpt (ATCC 37145) переваривали рестриктазами Hind III и Bg III и выде л ли 5,1 kb фрагмента. 1,23 kb 30 фрагмента рестрикции Hlndlll-Apal, 0,19 kb фрагмента Apal-Bg III и 5,1 kb фрагмента Hindlll-Bglll лигировали вместе дл  получени  промежуточной плазмиды pSV 2-HPC8. Более подробное объ снение конструиро- 35 вани  плазмиды psV2-HPC8 приводитс  в примере 13. Схема этого конструировани  представлена на фиг,7.

Затем плазмиду pSV2-HPC8 разрезали рестриктазами Hindlll и Sail и выдел ли 40 0,29 kb фрагмента рестрикции. Таким же образом разрезали также плазмиду pSV2- НРС8 рестриктазами Bg III и Sail и выдел ли фрагмент рестрикции (,15 kb). Плазмиду pSV2- -глобин (NRRL B-15928) 45 разрезали рестриктазами Bg III и Hind III. выдел ли 4,2 kb фрагмента рестрикции . Эти три фрагмента затем лигировали вместе с целью получени  pL133.Плазмиду pLl J3 переваривали рестриктазой Hindlll, 50 затем обрабатывали щелочной фосфатазой. Плазмиду pBLcat также разрезали рестриктазой Hindlll и выдел ли /0,87 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали в вектор разрезанной Hindlll и обработанной 55 фосфатазой плазмиды pL133 с целью получени  плазмиды pLPC. Так как фрагмент Hindlll плазмиды pBLcat может быть встав- .лен в плазмиду pL133 в двух ориентаци х

следует отметить, что pLPC  вл етс  плаз- мидой, где надлежаща  ориентаци  обеспечивает 1 kb фрагмента Ndll - Stul. Плазмида pLPC подобно miasMHflepLI33 содержит эн- хансер, ранний и поздний промоторы, Т-анти- ген св зывающие сайты и начало репликации SV40. Подробные протоколы конструировани  плазмид pL133 и pLPC приведены в примерах 13 и 14. Сайт рестрикции и функциональные карты плазмид pL133 и pLPC представлены соответственно на фиг.7 и 8.

Элементы SV40, присутствующие на плазмиде pLPC, расположены слишком близко и трудно различимы. Св зывание Т- антигена с Т-антигенсв зывающими сайтами , необходимое дл  SV40 репликации и примен емое дл  усилени  транскрипции из SV40 позднего промотора, неожиданно имело подобное действие на ВК поздний промотор. Так как высокий уровень Т-анти- генстимулированной репликации плазмиды , содержащей SV40 начала репликации,  вл етс  обычно летальным дл  клеток хоз ина ни плазмида pLPC, ни плазмида pL133 не могут стабильно поддерживатьс  в качестве эписомных (экстрахромосомных) элементов в присутствии SV40 Т-антигена, а скорее эти две плазмиды должны интегрироватьс  в хромосомной ДНК-клетке хоз ина дл  своего стабильного существовани . Полна  структура области ВК-энхансера полностью совпадает со структурой 40 дл  ВК-энхансера начала репликации, ранних и поздних промоторов и ВК-аналога Т-анти- генсв зывающих сайтов  вл ютс  близко расположенными и поэтому трудно различимыми на ВК-вирусной ДНК. Однако при выращивании в присутствии ВК-Т-антигена плазмида, содержаща  ВК начало репликации и Т-антигенсв зывающие сайти, не реплицируетс  до некоторого предела, который  вл етс  летальным, и стабильно поддерживаетс  в качестве эписомного элемента в клетке хоз ина. Более того репликаци , стимулированна  Т-антигеном, может быть использована дл  увеличени  числа копий вектора, содержащего ВН-начало репликаций , так, что если приложить давление отбора , большее число копий плазмиды, будет интегрироватьс  в хромосомную ДНК-клетки хоз ина. Очевидно, вследствие сходных структурно-функциональных соотношений между ВК- и SV40 Т-антигенами и их соответствующих св зывающих сайтов ВК-реплика- ци  также стимулируетс  SV40 Т-антигеном.

Эписомное поддержание вектора экспрессии рекомбинантной ДНК не всегда  вл етс  предпочтительным при интеграции в хромосому клетки хоз ина. Однако из-за отсутстви  селектируемого маркера, функционирующего в эукариотических клетках, идентификаци  стабильных эукариотических трансформантов плазмиды pLPC  вл етс  затруднительной, если только плазмида pLPC не трансформируетс  совместно с другими плазмидами, содержащими селектируемый маркер. Следовательно, плазмида pLPC была модифицирована с целью получени  производных плазмид,  вл ющихс  селектируемыми в эукариотических клетках хоз ина. Это достигаетс  лигированием плазмиды pLPC в часть плазмиды pSV2 hyg плазмиды, котора  содержит ген, несущий устойчивость к гидромицину. Плазмида pSV2 hyg может быть получена из Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL), Пеори , 1 61640, под номером NRRL B-18039. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pSV2 hyg представлены на фиг.8. Плазмиду SV2 hyg переваривали ре- стриктазой BamHI, и выдел ли 2,5 kB фрагмента ректрикции BamHI, который содержит полный ген, несущий устойчивость к гидромицину, затем обрабатывали ферментом Кленова (большой фрагмент, полученный при дроблении субтилизином Е. coli ДНК-полимеразы 1) и после этог,о лигировали в обработанные ферментом Кленова ч-5,82 kb Ndel-Stul фрагмента рестрикции плазмиды pLPC с целью получени  плазмид pLPChyg 1 и pLPChyg 2. Плазмиды pLPChyg 1 и pLPChyg 2 отличаютс  между собой только ориентацией фрагмента , несущего устойчивость к гидромицину. Плазмида pLPChyg содержит 5,0 kb фрагмента Hindll, тогда как плазмида pLPChyg 2 содержит А. 1,0 kb фрагмента. Протокол конструировани  дл  плазмид pLPChyg и pLPChyg 2 приводитс  в примере 15. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pLPChyg 1 представлены на фиг.8.

Затем конструировали плазмиду pBL32, котора  содержит мышиный ген (dhfr) гид- рофолат-редуктазы. Плазмиду рТРА102 (NRRL В-15834) разрезали рестриктазой Ith III и выдел ли 4,4 kb фрагмента ресктрик- ции. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, добавл ли линкеры и затем разрезали рестриктазами Hindlll - BamHI с целью получени л/2 kb фрагмента рестрикции , затем путем лигировани  288 п.о. Cla- l-EcoRI фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102 в Cla I 7,.EcoR в разрезанный вектор рКС7. Плазмида рКС7 может быть получена из АТСС под номером АТСС 37083. Плазмиду рКС переваривали рестриктазами BamAI и Hindlll, затем лигировали kb фрагмента рестрикции плазмиды рТРА102, полученной выше, и получали плазмиду

рТРАЮЗ. Протокол конструировани  плазмиды рТРАЮЗ приводитс  в примере 16А. Схема этого конструировани  представлена на фиг.9.

5Плазмиду рТРАЮЗ разрезали рестриктазой Bglll, обрабатывали ферментом Кленова и добавл ли линкеры Ndel. Затем эту смесь лигировали и получали плазмиду рТРАЮЗ der Ndel. Плазмиду pTPA103-der

0 Ndel разрезали рестриктазой и выдел ли /l,4 kb фрагмента. Этот фрагмент обрабатывали ферментом Кленова, затем после добавлени  Нра линкеров разрезали рестриктазой EcoRI- 770 п.о. фрагмента, со5 держащего trp РО и аминоконцы ТРА, лигировали в EcoRI Smal переваренный вектор pu C19 и получали плазмиду ри C19TPAFE. Плазмиду pu C19TPAFE частично переваривали рестриктазой Hpal, затем полностью

0 разрезали рестриктазой BamHI. Полученные 3,42 kb Hpal-BamHI фрагмента рестрикции затем лигировали в 1.015 Scal-BamHI - фрагмент, полученный из плазмиды рТРАЮЗ и получали плазмиду

5 pBW25. Протокол конструировани  плазмиды pBW25 приводитс  в примере 16В. Схема этой конструкции представлена на фиг.9. Плазмиду pBW25 разрезали рестриктазами Hindlll и EcoR I и полученные в резуль0 тате -810 п.о. фрагмента лигировали в Hind III - EcoR l-разрезанный фаг M13-mp8 (биолаборатории Новой Англии) и получали фаг PM8BW26. Затем на фаге pM8BW26 (при де- леции ДНК, кодирующей аминокислотные

5 остатки) осуществл ли In vitro реакцию мутагенеза, в результате чего получали фаг PM8BW27. Фаг pM8BW27 разрезали рестриктазами Eco RI и Ndel и выдел ли 560 п.о. фрагмента рестрикции. Затем синтези0 ровали 48 п.о. линкера Ndel - Xbal. Плазмиду рТРАЮЗ разрезали, рестриктазами Eco R I и BamHI и выдел ли 689 п.о. фрагмента. Плазмиду pL 110, построенную по методу примера 9, частично переваривали рестрик5 тазой BamHI, затем полностью разрезали Xbal и выдел ли 6 kB фрагмента, kb фрагмента вектора, 689 п.о. фрагмента плазмиды рТРАЮЗ, 560 п.о. фрагмента pM8BW27, и-48, п.о. линкера затем лигирова0 ли вместе, в результате чего получали плазмиду pBW28. Протокол конструировани  плазмиды pBW28 приводитс  в примере 16С, Схема этой конструкции представлена на фиг. 10.

5Затем путем лигировани  2 kb Hind III Bg III фрагмента плазмиды pTRA103 в 4,2 kb Hind III - Bg III фрагмента плазмиды pSV2 - /5-глобин плазмиду pSV2 - dhfr (АТСС 37146) разрезали рестриктазой PVUM. После добавлени  BamHI линкеров в BamHI

разрезанную и обработанную фосфатазой плазмиду рТРА301 лигировали 1,9 kb фрагмента, несущего ген dhfr, в результате чего получали плазмиду рТРАЗОЗ. Плазмиду рТРАЗО разрезали рестриктазами EcoR I и Вд II и получали 2,7КЬ фрагмента. Плазмиду рТРАЗОЗ разрезали рестриктазами Hind III и EcoR I и получали 2340 п.о. фрагмента, содержащего ген dhfr. Плазмиду рТРАЗОЗ разрезали рестриктазами Hind 111 и Sst I и получали л 1,7 kb фрагмента. Плазмиду pBW28 разрезали рестриктазами Xholl и Sstl и получали 680 п.о. фрагмента. С целью получени  плазмиды pBW32 лигировали вместе; 2,7 Eco R I - Вд II фрагмента плазмиды рТРА301, 2340 п.о. Hind III - Eco R I фрагмента плазмиды рТРАЗОЗ, 1,7 kb Hindlll - Sst I фрагмента плазмиды рТРАЗОЗ и 680 п.о. Xball - Sst I фрагмента плазмиды pBW28. Протокол конструировани  плазмиды pBW32 приводитс  в примере 16D, Схема конструкции представлена на фиг.10.

у 1,9 kb BamHI dhfr ген содержащего фрагмента плазмиды pBW32 изолировали, обрабатывали ферментом Кленова и вставл ли в частично Eco R I - переваренную плазмиду pLPC hygl с целью получени  плазмид pLPChygl и pLPChd2. Плазмида pLPChygl содержит два сайта распознавани  рестриктазы Eco R I; один в гене, несущем устройчивость к гидромицину, и один в последовательност х, происход щих от плазмиды РВР322. Фрагмент, содержащий ген dhfr вставл ли в Eco R I сайт, расположенный в рВ R 322-производных последовательност х плазмиды pLPChygl, и получали плазмиды pLPChd 1 и pLphd 2. В цел х раскрыти  насто щего изобретени  плазмиду pLPChd 1 обозначали как празмиду pLPChd. Сайт рестрикции м функциональна  карта плазмиды pLPChd представлены на фиг. 11. Конструирование плазмид pLPChdl и pLPChd2, которые отличаютс  только ориентацией ДНК-сегмента, содержащего ген dhfr, описано в примере 17,

Затем путем трансформировани  и повторного выделени  плазмиды pLPChd при помощи dam-штамма Е. coll конструировали плазмиду phd. После этого плазмиду pLPCnd переваривали растриктазой Bell и рециркулизовали дл  получени  плазмиды phd. Плазмида phd образовывалась от деле- ции экстра Bell линкеров, прицепленных при построении плазмиды pLPcat, и двух смежных Bell фрагментов рестрикции с общим размером около 1,45 kb от плазмиды pLPChd. ДНК, кодирующую полную кДНК, котора  кодирует легкую цепь моноклональ- ногоантитела KSI/4, лигировали в плазмиду phd дл  получени  вектора экспрессии pLKSL1100 п.о. Eco R I - фрагмента плазмиды рСКС2310 обрабатывали ферментом Кленова , лигировали в BamHI линкеры, а затем лигировали в Bell - переваренную плазмиду

phd. Подробные описани  конструировани  плазмид phd и pL-KSL привод тс  в примерах 18 и 19. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды представлены на фиг.11.

0 Плазмида pH-KS  вл етс  вектором насто щего изобретени , происход щим от плазмиды phd и плазмиды рС2А52. ,6 kb Eco R I -фрагмента плазмиды рС2А52 выдел ли , обрабатывали ферментом Кленова и

5 соедин ли с BamHI линкерами. Этот фрагмент содержит полную кДНК, котора  кодирует т желую цепь моноклонального антитела KS 1/4. Затем этот фрагмент лигировали с Bell - переваренную плазмиду phd

0 с целью получени  плазмиды экспрессии pH-KS. Плазмида pL-HD  вл етс  вектором экспрессии, построенном из плазмиды phd и плазмиды СНКС2-18, который содержит ДНК, кодирующую производное вари5 абельной области легкой цепи KS1/4, св занной с посто нной областью легкой цепи человека. 1,3 kb Рпи Д II - Hind III фрагмента плазмиды СЕКС2-18 выдел ли и обрабатывали ферментом Кленова. Затем

0 этот фрагмент лигировали в Bcll-переварен- ную, обработанную ферментом Кленова плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии pL-НД. Подробные описани  конструировани  плазмид рН S5 KS и pL-НД привод тс  в примерах 20 и 21.

Плазмида pL-НД 2  вл етс  вектором

экспрессии, построенным из плазмиды phd

и плазмиды СНКС2-6, который содержит

ДНК, кодирующую природную последова0 тельность вариабельной области легкой цепи KS1/4, св занной с посто нной областью легкой цепи человека,1,3 kb Рпи ДИ - Hind HI фрагмента плазмиды СНКС2-18 выдел ли и обрабатывали ферментом Кленова. Затем

5 этот фрагмент лигировали вВсИ-переварен- ную, Кленов - обработанную плазмиду phd, в результате чего гголучали плазмиду экспрессии pL-НД 2. Плазмиду рН 1-НД, котора  содержит кДНК, кодирующую

0 вариабельную область т желой цепи антитела KS1/4, св занную с геномной ДНК, кодирующей посто нную область человеческого lgG1, конструировали из плазмиды phd и плазмиды СН2А5. Плазмиду СН2А5 перева5 ривали рестриктазой Eco R I, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI-линкеры. Затем плазмиду переваривали растриктазой BamHI и выдел ли-,7,4 kb фрагмента рестрикции. Этот фрагмент лигировали с Bell-переваренную плазмиду phd и

получали плазмиду экспрессии рН1-НД. Подробные описани  конструировани  плазмид pL-НД и рН 1-НД, привод тс  соот- ветстенно в примерах 22 и 23.

Плазмиду рН2-НД, котора  содержит кДНК, кодирующую вариабельную область т желой цепи KS 1 /4, св занную с геномной ДНК, кодирующей посто нную область человеческого lgG2, конструировали из плаз- миды phd и плазмиды CH2A51G2. Плазмиду CH2A51G2 переваривали рестриктазой Eco R I, обрабатывали ферментом Кленова, затем лигировали Bam HI линкеры. После этого плазмиду переваривали рестриктазой BamHI и выдел ли ,1 kb фрагмента рестрикции . Этот фрагмент лигировали в Bcll- переваренную плазмиду phd в результате чего получали плазмиду экспрессии рН2- НД. Плазмиду рНЗ-НД. котора  содержит кДНК; кодирующую вариабельную область т желой цепи KS1/4, св занную с геномной ДНК, кодирующей посто нную область человеческого lgG3, конструировали из плазмиды phd и плазмиды CH2A51G3. Плазмиду CH2A51G3 переваривали рестриктазой Есо R I, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI линкеры. После этого, плазмиду переваривали рестриктазой BamHI и выдел ли 7,4 kb фрагмента рестрикции . Этот фрагмент лигировали в Bell - переваренную плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии рНЗ-НД. Подробные описани  конструировани  плазмид рН2-НД и рНЗ-НД привод тс  соответственно в примерах 24 и 25.

Плазмиду рН4-НД, котора  содержит кДНК, кодирующую вариабельную область т желой цепи KS1/4, св занную с геномной ДНК, кодирующей посто нную область человеческого lgG4, конструировали из плазмиды phd и плазмиды СН2Ф51С4 Плазмиду CH2A51G4 переваривали рестриктазой EcoR1, обрабатывали ферментом Кленова, а затем лигировали в BamHI линкеры. После этого плазмиду переваривали рестриктазой BamHI и выдел ли 6,4 kb фрагмента рестрикции . Этот фрагмент лигировали в Bell - переваренную плазмиду phd, в результате чего получали плазмиду экспрессии рН4-НД. Более подробные описани  конструировани  плазмиды привод тс  в примере 26.

Насто щее изобретение не ограничиваетс  использованием конкретных эукариоти- ческих промоторов, представленных в изобретении. Другие промоторы, например промоторы гомологичногно или гетерологич- ного иммуноглобулина, поздний промотор SV40 или промоторы от эукартиотических генов , в частности от экстроген-индуцируемого гена ципл чьего  ичного альбумина, гена интерферона, глюкокортикоид-индуцируемо- го гена тирозин-аминотрансферазы. главного раннего гена аденовируса и раннего промо- 5 тора SV40, могут быть легко выделены и модифицированы дл  использовани  на векторах экспрессии рекомбинантной ДНК, построенных дл  получени  антител в эукари- отических клетках хоз ина. Эукариотические

0 промоторы могут быть также использованы в совокупности в цел х стимулировани  таких антител. Кроме того, известно большое количество ретровирусов, инфецирующих широкий р д эукариотических клеток хоз ина.

5 Длинные концевые дупликации в ДНК ретро- вирусов часто кодируют активность промотора и могут быть использованы вместо позднего промотора ВК-энхансераденовиру- са, описанного выше, в цел х экспрессии ан0 титела KS1/4 и его производных. Насто щее изобретение также не ограничиваетс  приведенными селектируемыми маркерами на описанных плазмидах. Существует большое разнообразие селектируемых маркеров дл 

5 эукариотических клеток и прокэриотических клеток, которые  вл ютс  пригодными дл  использовани  при клонировании рекомбинантной ДНК или вектора экспрессии , содержащего ДНК-соединение или

0 последовательность насто щего изобретени . Различные векторы экспрессии могут быть трансформированы и экспрессирова- ны в целый р д эукариотических клеток хоз ина , в частности клеток млекопитающих.

5 Векторы экспрессии содержат также последовательности , которые получают дл  репликации в E.coli, так как более эффективно получать ДНК плазмиды в E.coli, чем в других клетках хоз ина. Экспресси  антител

0 происходит в клетках хоз ина, в которых конкретный промотор, ассоциированный с антителом,  вл етс  функцией структурного гена. Дл  специалистов очевидно, что р д эукариотических клеток хоз ина может

5 быть использован дл  экспрессии различных антител при использовании позднего промотора ВК-энхансера-аденовируса, поскольку клетка хоз ина экспрессирует продукт непосредственно раннего гена вируса

0 ДНК. Так как продукт непосредственно раннего гена может быть введен в клетки хоз ина многими способами, например трансформаци  плазмидой или другим вектором , практически люба  эукариотическа 

5 клетка может быть использована в насто щем способе. Предпочтительными клетками хоз ина в способе насто щего изобретени   вл ютс  клетки человека, так как человеческие клетки  вл ютс  естественными хоз евами дл  ВК-вируса и могут заключать

клеточные факторы, которые служат дл  стимул ции ВК-энхансера. Хот  человеческие клетки могут быть использованы в качестве клеток хоз ина, лини  12 - трансформированных клеток Syrian Hamster аденовируса AV12, которые экспрессируют гена Е1А,  вл етс  наиболее предпочтительной и имеетс  в Американской коллекции типовых культур в Роквилле, шт. Мэриленд, под вход щим номером АТСС С RL9595 (депонирована 24 но бр  1987 г.). Стандартна  процедура трансформации описана подробно в примере 27.

При трансформации вектором экспрессии , кодирующим т желую цепь иммуноглобулина , AV12 клетки выдел ют обработанную т желую цепи в супернатанте. Однако AV12 клетки,-трансформированные вектором экспрессии , кодирующим легкую цепь, не выдел ют указанную легкую цепь, если только эти клетки не  вл ютс  также трансформированными вектором экспрессии, кодирующим т желую цепь. Способ выделени  клонов, экспрессирующих различные иммуноглобулинов насто щего изобретени , описан в примере28. Функциональные К51/4и производные KS1/4 могут быть очищены от супер- натанта клеток AV12, которые  вл ютс  трансформированными совместно векторами , кодирующими легкую и т желую цепи. Таким образом, путем подбора и смешивани  различных легких и т желых цепей насто щего изобретени  можно получить множество вариантов KS1/4.

Экспресси  молекул иммуноглобулина с легкой и т желой цепью в нелимфоидной системе имеет значительное преимущество по сравнению с лимфоидными системами. Обычно моноклональные антитела выдел ютс  и очищаютс  от лимфоидных систем, например миело-мные и гибридомные клетки. Такие клетки часто экспрессируют значительное количество гетерогенных антител. Это  вление объ сн етс  тем, что лимфоидные клетки  вл ютс  естественными секретерами антител. При трансформации посредством ДНК, кодирующей отдельные антитела или сли ни  с другими клетками, продуцирующими различные антитела , эти лимфоидные клетки иногда станов тс  двойными секретерами. Клеточные линии с двойной секрецией производ т много антител с гибридноймолекул рной структурой, больша  попул ци  которых  вл етс  нежелательной. Эти нежелательные гибриды должны затем отдел тьс  от целевого продукта с использованием дорогой и занимающей много времени технологии. Способ насто щего изобретени  устран ет эту проблему путем использовани  нелимфоидных клеток, которые не секретируют молекул антител естественным образом. Поэтому, целевым гомогенным продуктом  вл ютс  только антитела, которые секретируютс  в супернатанте.

Возможны много модификаций и вариантов рассматриваемых в насто щем изобретении последовательностей ДНК и плазмид. Например, деградаци  генетиче0 ского кода корректируетс  заменой нуклеоти- дов на прот жении областей, кодирующих полипептиды, а также заменой, например, ТАС или ТСА-трансл ционных стоп-сигна- АТСACT

5 лов на ТАА - трансл ционный стоп-сигнал.

АТТ

Такие последовательности могут быть получены из ныне известных аминокислотной или ДНК-последовательности антитела

0 KS1 /4 и могут быть сконструированы в соответствии со стандартными синтетическими методами. Такие синтетические методы могут быть выполнены в соответствии с методикой Itakura et al 1977; Science 198:1956 и

5 Crea et al., 1978, Proc.Nat.Acad. Scl USA 75:5765. Кроме того, синтетические гены и линкеры могут быть синтезированы также с использованием синтезатора ДНК (Systec 1450А Systec Inc, 3816 Chaulder Drleve,

0 Minneapolis, MN) или синтезатор ABS380A (Applied Blpsystems Inc, 50 Zlucolu Center Drive, Forsber City CA 94404). Существуют также и многие другие синтезаторы ДНК, которые также могут быть использованы дл 

5 синтеза ДНК-фрагментов. Поэтому насто щее изобретение не может быть ограничено ДНК-последовательност ми и плазмидами, представленными в насто щем описании в качестве примеров.

0 Специалистам в данной области нетрудно пон ть, что векторы экспрессии насто щего изобретени  используютс  дл  трансформации эукариотических клеток хоз ина так, чтобы1 полипептиДы с различными

5 структурами легкой и т желой цепей экс- прессировались клеткой хоз ина. Если клетка хоз ина трансформируетс  вектрром, содержащим промотор, который функционирует в этой клетке хоз ина и стимулирует

0 транскрипцию структурных генов иммуноглобулина , и если эта клетка хоз ина обладает клеточным механизмом дл  обработки сигнальных пептидов, то зрелые антитела или цепи антител вырабатываютс  клетка5 ми. При других услови х экспрессии, когда только легкие цепи иммуноглобулина экс- прессируютс  клеткой хоз ина, эти легкие цепи должны быть выделены из клетки хоз ина. Как установлено выше, векторы, методы , трансформированные клетки и антитела , рассматриваемые в насто щем изобретении , могут быть весьма эффективными в борьбе против рака. Моноклональное антитело KS1/4  вл етс  эффективным агентом в диагностике, прогнозе и лечении адено- карциномы у Bumol In Relsfeld, R.A. и Sell S eds Monoclonal Antibodies and Cancer therapy, New York Alan R.Liss Inc. 1985,257- 259. Spearman et al., 1987, I.Pharmacol and Exp. Therap. 241:695-703, данные которых ввод тс  в насто щее описание посредством ссылки, раскрывают использование коньюгата; моноклональное антитело-вин- каалкалоид в распознавании локализации и лечении опухолей. Это KS1/4 - DAVL В (4- дезацитилвинобластин) - коньюгат вызывает также супрессию опухолевого роста, как описано Bumol et al. In Ceriani, R.L. ed Immunologie Approaches to the Diagnosis and Therapy of Breast Cancer, New York and London; Plenum Press 1987, 205-215, данные которых ввод тс  в описание насто щего изобретени  посредством ссылки. Биохимические и иммунологические исследовани  показали, что рекомбинантные и химерные молекулы KS1/4 насто щего изобретени  обладают такой же антигенной ре- активностью, как и молекулы KS1/4, происход щие из клеток гибридомы.

Однако использование мышиных антител имеет тот недостаток, что указанные антитела часто вызывают неправильный иммунологический ответ в организме человека . Это наблюдалось у некоторых пациентов , лечащихс  KS1/4. Этот недостаток можно устранить, если использовать химерные антитела насто щего изобретени , Если заменить посто нные области антитела KS1/4 посто нными област ми человеческого происхождени , иммунна  система пациента распознает химерное антитело как свое и поэтому вырабатывает меньше анти-К51 /4 антител. Более того использование человеческих посто нных областей способствует активации комлемента и других клеточных ответов.

Специалистам в данной области также нетрудно пон ть, что неизвестные до сих пор аминокислотные и ДНК-последовательности KS1/4 могут быть использованы дл  создани  новых производных с высокой или низкой степенью сродства.Различные части антитела могут быть подвергнуты делеции или мутации дл  создани  новых антител или же части одной цепи могут быть заменены участками другой цепи. Рентгеновское кристаллографическое исследование показывает, какие именно аминокислотные остатки антитела по вились в непосредственной близости аминокислотными остатками антигена, с которым св зываетс  антитело KS1 /4. Использу  белковую инженерию, антитело KS1/4 можно модифицировать дл  получени  негативных остатков около пози- 5 тивных остатков на антигене. Такие сконструированные антитела затем отображают модифицированное родство к поверхностному антигену клетки у больных раком.

Приведенные ниже примеры иллюстри0 руют осуществление насто щего изобретени . В этих примерах даютс  описани  способов конструировани  объектов насто щего изобретени  и объ снени  к ним, там, где это целесообразно.

5

П р и м е р 1. Выделение плазмиды рКС283.

Лиофилы Е. coll K12 ВЕ1201 /рКС283 были вз ты из Северной региональной иссле0 довательской лаборатории, Пеори , Иллинойс 61604, под номером NRRL В- 15830. Эти лиофилы сливали в пробирки, содержащие 10 мл LB-среды (10 г бактот- риптона, бактодрожжевого экстракта и 10 г

5 NaCI на литр; рН доведен до 7,5) и инкубировали в течение 2 ч при 32°С, после чего культуру помещали в 50 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 32°С в течение ночи. Клетки Е. coll K12 ВЕ1201/рКС 2283 культи0 вировали при 32°С, так как эти клетки содержат ген термовосприимчивого с L репрессора, интегрированный в клеточной ДНК. Если клетки, которые содержат ген дикого типа л мбда pL-penpeccopa или не

5 содержат л мбда pL-промотор, используютс  в процессе выделени  плазмиды, как описано в нижеследующих примерах, температура инкубации равна 37°С.

Небольшую часть ночной культуры по0 мещали в чашки с.1 В-агаром (LB-среда с 15 г/л бактоагара), содержание 50 мкг/мл ампициллина дл  получени  одноколониевого изол та Е. coli К 12 ВЕ1201/Р С283. Полученную одноколониевую культуру инокули5 ровали в 10 мл LB-среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи при 32°С при энергичном встр хивании.10 мп ночной культуры инокулировали в 50 мл LB-среды, содержа0 щей 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 32°С энергично встр хива  при этом до тех пор, пока культура не достигнет стационарной фазы.

Последующа  методика была заимство5 вана из работы Manlallsetal. 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor-laboratory).

Урожай клеток собирали при помощи центрифугировани  при 400 г за 10 мин при 4°С, а супернатант отбрасывали. Клеточный осадок промывали в 100 мл охлажденного

льдом STE-буфера (0,1М NaCI 10 мМ трис- HCI, рН 7,8 и 1 мМ ЭДТК). После промывани  клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл раствора 1 (50 мМ глюкозы; 25 мМ трис-HCI, рН 8 и 10 мМ ЭДТК), содержащего 5 мг/мл лизоцима, и оставл ли на 10 мин при комнатной температуре, 20 мл раствора 2 (0,2 н. NaOH и 1 % ДДС), затем добавл ли к клеткам, обработанным лизоцимом, и полученный раствор осторожно смешивали путем инверсии. Эту смесь инкубировали на льду в течение 10 мин.

К смеси лизированных клеток добавл ли 15 мл охлажденного льдом 5 мМ ацетата кали , рН 4,8 и раствор смешивали инверсией . Полученный раствор инкубировали на льду в течение 10 мин. 5 М раствор ацетата кали  изготовл ли путем добавлени  11,5 мл дел ной уксусной кислоты к 28,5 мл воды и 60 мл 5М ацетата кали ; полученный раствор имел соотношение: ЗМ относительно кали  и 5М относительно ацетата.

Смесь лизированных клеток центрифугировали в аппарате Beckman SW27 (или его эквиваленте) при 4°С со скоростью 20000 об/мин, в течение 20 мин. На дне пробирки образуетс  осадок из клеток ДНК и продукта распада клеток. Около 36 мл супернатан- та восстанавливали и добавл ли 0,6 объема изопропанола, смешивали и полученный в результате раствор оставл ли при комнатной температуре н а 15 мин, Плазмидную ДНК собирали при помощи центрифугировани  при 12000 г за 30 мин при комнатной температуре. Супернатант отбрасывали, а осадок ДНК промывали 70% этанола при комнатной температуре. Затем этанол сливали , а остаток высушивали в вакуумном испарителе. Затем осадок ресуспендировали в 8 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI, рН 8 и 1 мМ ЭДТК).

К раствору ДНК добавл ли 8 г CSCI. На каждые 10 мл CSCI - ДНК-раствора добавл ли около 0,8 мл 10 мг/мл раствора бромида этиди  в воде. Конечна  плотность раствора составл ла около 1,55 г/мл, а концентраци  бромида этиди  составл ла около 600 мг/мл. Раствор помещали в пробирку центрифуги Beckman типа 50, которую наполн ли до краев парафиновым маслом, герметично закрывали и центрифугировали при 40000 об/мин в течение 24 ч при 20°С. После центрифугировани  визуально прослеживались две полосы ДНК. После удалени  крышки из пробирки нижнюю полосу ДНК удал ли при помощи шприца с иглой (#21) дл  подкожных инъекций, введенной через боковую сторону пробирки центрифуги.

Бромид этиди  удал ли путем многократного экстрагировани  водонасыщенным 1-бутанолом, CSCI удал ли посредством диализа против ТЕ-буфера. После экстрагировани  буферным фенолом, а затем хлороформом, ДНК осаждали, промывали

70%-ым этанолом и высушивали. После чего получали 1 мг плазмиды рКС283, которую хранили при 4°С в ТЕ-буфере с концентрацией около 1 мкг/мкл. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды рКС283

представлены на фиг.1.

П р и м е р 2. Конструирование плазмиды рКС283РХ. ,

Около 10 мкм ДНК плазмиды рКС283,

полученной в примере 1, смешивали с 20 мкл 10-кратного солевого буфера рестрикции (500 мМ NaCI, 100 мМ трис-HCI, рН 7.5, 100 мМ MgCI2 и 10 мМ ДТТ), 20 мкл 1 мг/мл БСА. 5 мкл рестриктазы PVU II (50 ед., как

определено Bethesda Research Laboratorla BRL, где были получены все рестриктирую- щие ферменты) и 145 мкл воды, полученную в результате реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Реакции рестрикции, описываемые в насто щем изобретении, обычно заканчиваютс  экстрагированием фенолом и затем хлороформом с последующей преципитацией ДНК, промывкой этанолом и ресуспендированием ДНК в ТЕ-буфере. После переваривани  PVUII, как описано выше, PVU - переваренна  ДНК плазмиды рКС283 осаждали , затем ресуспендироеали в 5 мкл ТЕ- буфера.

Около 600 пикомолей (рМ) Xhol линкеров (5 - ССТ CGA GC-31 ) киназировали в смеси, содержащей 10 мкл 5-кратного ки- назного буфера (300 мМ трис-HCI, рН 7,8,50 мМ MgCl2, 25 мМ ДТТ), 5 мкл 5 мМ АТФ, 24

мкл Н20, 0,5 мкл Т4 полинуклеотидкиназы (около 2,5 ед. как определ лось при помощи P-L-биохишческого анализа). 5 мкл 1 мг/мл БСА и 5 мкл 10 мМ спермидина путем инкубировани  смеси в течение 30 мин при 37°С.

К 5 мкл ДНК PVUH-переваренной плазмиды рКС283 добавл ли около 12,5 мкл ки- назированных Xhol линкеров, затем 2,5 мкл 10-кратного лигазного буфера (300 мМ т рис- HCI, рН 7,6; 100 мМ и 50 мМ ДТТ), 2,5 мкл 1

мг/мл БСА, 7 мкл 5 мМ АТФ, 2,5 мкл (около 2,5 ед. как определено P-L-биохим. анализом ) Т4 ДНК-лигазы, 2,5 мкм 10 мМ спермидина и 3 мкл воды добавл ли к ДНК. Полученную в результате реакцию лигировани  инкубировали в течение ночи при 4°С. После реакции лигировани  реакционную смесь корректировали до состава высокосолевого буфера (0,1 М NaCI; 0,05 М трис-HCI; рН 7,5; 10,0 мМ MgClz и 1 мМ ДТТ). Затем в смесь добавл ли около 10 мкл (100 ед.) рестриктазы Xhol и полученную реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч при 37°С, По окончании реакции и преципитации Xhol-переваренной ДНК последнюю ресус- пендировали и лигировали, как было описано выше, за исключением того, что в смесь лигировани  Xhol-линкеры не добавл лись, Лигированна  ДНК образовывала желаемую плазмиду рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды рКС283РХ представлены на фиг.1.

П р и м е р 3. Конструирование Е, coll К12 МО (Я+)/рКС283РХ.

E.coli K12 МО (Я ) может быть получен из Северной региональной исследовательской лаборатории влиофилизированном виде под номером NRRL В-15993. Е. coll K12

МО (Я ) содержит ген дикого типа л мбда р L с1-репрессора дл  того, чтобы транскрипци  от гибридного pL-Lpp-промотра насто щего изобретени  не происходила в

клетках Е. coll K12 МО (Я ) , Лиофилы восстанавливали , одиночные колонии изолировали , затем приготовл ли 10 мл ночной

культуры МО (Я ) - клеток в соответствии с методикой, описанной в примере 1, за исключением того, что температура инкубировани  составл ла 37°С и в среде роста ампициллин не использовали,

Дл  инокул ции 5 мл LB-среды, содержащей также 10 мМ MgSO-i и 10 мМ MgCl2, использовали 50 мкл ночной культуры. Культуру инкубировали в течение ночи при 37°С с интенсивным встр хиванием. На следующее утро культуру разбавл ли до 200 LB- средой, содержащей 10 мМ MgS04 и 10 мМ MgCl2. Разбавленную культуру инкубировали при 37°С, интенсивно встр хива  до тех пор, пока оптическа  плотность при 550 нм (Asso) не достигнет величины около 0,5, котора  соответствует клеточной плотности около 1х108 кл./мл. Затем культуру охлаждали в течение 10 мин в лед ной бане, а клетки собирали путем центрифугировани  при 4000 г за 10 мин при 4°С. Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мл охлажденного 10 мМ MgS04, а затем тот же час снова осаждали путем центрифугировани . Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мл 30 мМ CaCl2 и инкубировали на льду в течение 20 мин.

Эти клетки снова собирали путем центрифугировани  и ресуспендировали в 10 мл 30 мМ CaCIa 1 /2 мл аликвоты клеток добавл ли кхлегированной ДНК, приготовленной в соответствии с описанием в примере 2; эту ДНК смешивали с 30 мМ СаС12. Смесь клеток с ДНК инкубировали на льду в течение часа, затем резко повышали температуру до 42°С в течение 90 с, а затем охлаждали на льду в течение 2 мин. Клеточную ДНК-смесь

5 разбавл ли в 10 мл LB-среды в 125 мл флаконах и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. 100 мкл аликвот высеивали на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин и инкубировали при 37°С до тех пор, пока не

0 по вл лись колонии.

Эти колонии культивировали отдельно и плазмидную ДНК отдельных колоний подвергали анализу рестриктирующими фер- . ментами и гельэлектрофорезу. Выделение

5 плазмидной ДНК осуществл ли в меньшем масштабе в соответствии с методикой, описанной в примере 1, но стадию градиента CSCI пропускали до тех пор, пока не было проведена индентификаци  трансформан0 тов Е. coli K12 МО (Я+) /рКС283РХ. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды рКС283 РХ. Сайт рестрикции и функци- ональна  карта плазмиды рКС283Х представлены на фиг.1.

О

П р и м е р 4. Конструирование Е. coli

К12МО (Я+)/pKC283-L.

10 мг ДНК плазмиды рКС283РХ, изго0 товленной в соответствии с методикой, описанной в примере 1, раствор ли в 20 мкл 10-кратного высокосолевого буфера, 20 мкл 1 мг/мл БСА, 5 мкл («SO ед.) рестриктазы Вд III,5 мкл (-50 ед.) рестриктазы Xhol и 150 мкл

5 воды и полученную реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Затем реакцию прекращали и после преципитации Bglll-Xhol-переваренной ДНК последнюю ресуспендировали в 5 мкл ТЕ-буфера.

0 ДНК-линкера с признаками расщеплени  рестриктазами BgMI и Xhol и с концами однонитевой ДНК синтезировали и кинази- ровали. Линкер киназировали в основном в соответствии с методикой, описанной в при5 мере 2.

ДНК - линкер имеет следующую структуру:

5- GATCTA ТТА ACT CAA ГСТАС АС - 3

3 - AT/, ATT САС ТТА cAt CTG AGCT - 5 Линкер, изображенный выше, синтезировали из однонитиевых деоксиолигонуклео- тидов по известной специалистам методике. Однонитиевые деоксиолигонуклеотиды могут быть синтезированы при помощи коммерчески приемлемой аппаратуры, как. например, 380А ДНК-синтезатора, маркированный Applied Blosystem (850 Lincoln CenterDrlve, Foster City, CA 94404), с использованием фос- форамидатов. Известны также и другие способы синтеза ДНК. Стандартный модифицированный способ синтеза однонитевой ДНК при помощи фосфотриэфира описан в Itakura et al., 1977, Science 198:1056 и в Сгеа etal., 1978. Proc. Nat. ACad. Scl USA 75:5765. Кроме того, особенно предпочтительный способ синтеза ДНК описан в Aslnng et al., 1983, Nucleic Acid Research II: 3227 и Harany etal., 1980, Methods In Enzymology 68:90.

Линкер и Bg III - Xho I переваренную плазмиду рКС283Х лигировали в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированна  ДНК образовывала целевую плазмиду pKC283-L Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды, p«C283-L представлены на рис.1 ДНК плазмиды, PKC283-L использовали дл  трансформации

Е. coll K12 МО (А+) и полученные в результате трансформаты Е. coll K12 МО

(A )/pKC283-L были индентифицированы в соответствии с методикой, описанной в примере 3.

П р и м е р 5. Конструирование Е. coll

К12 МО () /pKC283-L В.

Около 10 мкг плазмидной pKC283-Z ДНК, полученной в соответствии с методикой , описанной в примере 1, раствор ли в 20 мкл 10-кратного высокосолевого буфера, 20 мкл 1 мг/мл БСА, 5 мкл (-50 ед.) рестрик- тазы Xho I и 155 мкл Н20, полученную в результате реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Затем Xho I - переваренную плазмиду рКС283-1 -ДНК осаждали из реакционной смеси путем добавлени  трех объемов 95% этанола и 1/10 объема ЗМ ацетата натри , инкубированием в сухой бане из льда и этанола в течение 5 мин и центрифугированием. Полученный ДНК-осадок промывали 70% этанола , высушивали и ресуспендировали в 2 мкл 10-кратного ник-трансл ционного буфера (0,5 М трис-HCI, рН 7,2, 0,1 мМ MgSOi, и 1 мМ ДТТ), 1 мкл раствора 2 мМ в каждом из деоксинуклеотид-трифосфатов, 15 мкл Н20, 1 мкл (6 ед. как определено Р-1 биохимическим анализом) фермента Кленова, который  вл етс  большим фрагментом Е. coll ДНК-полимеразы, 1, и 1 мг/мл БСА. Полученную в результате реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 25°С. затем реакцию прекращали путем инкубировани  этого раствора при 70°С в течение 5 мин.

ВатН1 линкеры (5- CGGGATCCCC - 3) киназировали и сшивали с Xhol-переварен- ной Кленов-обработанной плазмидной рКС283-1 ДНК в соответствии с методикой, описанной в примере 2. После реакции лигировани  указанную ДНК переваривали -100 единицами BamHI в течение 2 ч при 37°С в высокосолевом буфере. После BamHI переваривани  указанную ДНК изготавливали дл  лигировани  в соответствии с методикой , описанной в примере 2.

л 5,9 kb фрагмента рестрикции BamHI циркул ризовали путем лигировани  и трансформировали в E.collK 2 МО (А ) всоответствии с методикой, описанной в примерах 2

и 3. Е. coll K12 МО (А+)/рКС283-1В-транс- форманты идентифицировали, а затем в соответствии с методикой, описанной в примере 1, изготавливали плазмидную рКС293-2В-ДН. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pKC283-LB представлены на фиг.1.

Примерб. Конструирование Е. coll

К12МО(А+)/р32.

Около 10 мкг плазмиды рКС283РХ переваривали рестриктазой Sail в высокосолевом буфере, обрабатывали ферментом

Кленова и сшивали с Eco R (-линкерами (51 - CAGGAATTCCTC - 3) в соответствии с методикой, описанной в примере 5, с тем лишь исключением, что в данном примере используютс  другие исходные материалы,

рестриктазы и линкеры. После переваривани  рестриктазой Eco R I, в результате чего вырезалось 2,1 kb ДНК, 4,0 kb Eco R I фрагмента рестрикции циркул ризовали путем лигироваки  с полученной плазмидой

рКС283РР. Лигированную ДНК использовали дл  трансформации Е. coll K12 МО (А ) в соответствии с методикой, описанной в примере 3. После идентификации Е. coll K12 МО

(A )/pKC283PRS трансформантов, в соответствии с методикой, описанной в примере 3, изготавливали плазмиду рКС283Р RS - ДНК. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды рКС 283Р RS представлены

на фиг.1 приложенных иллюстраций.

Около 10 мкг плазмиды рКС283Р RS переваривали в 200 мкл высокосолевого буфера каждой из рестриктаз (около 50 ед.) Pst и Sph I. После инкубировани  реакционной

смеси в течение 2 ч при 37°С, реакционную смесь подвергали электрофорезу на 6% низкотемпературном агарозном геле (FMC Corporation, Marine Colloids-Division Rockland) в течение 2-3 ч U 75 мА

в трис-ацетатном буфере.

Указанный гель окрашивали в разбавленном растворе бромистого этиди  и полосу ДНК. составл ющую 0,85 kb Pstl-Sphl фрагмента рестрикции, который визуалиро- вали длинноволновым УФ-излучением, вырезали из гел  в небольшом сегменте. Объем сегмента определ ли по весу и плотности сегмента и в пробирку, содержащую данный сегмент, добавл ли такой же объем 10 мМ Трис-HCI: рН 7,6, Затем этот сегмент рас- плавл ли путем инкубировани  при 72°С. В объеме около 1 мкл получали 1 мкг 0,85 kb Pstl-Sphl фрагментов ресктрикции плазми- ды рКС283Р RS. Аналогичным способом Pstl и Sphl - рестриктазами переваривали плаз- миду рКС283 - В, полученные в результате рестрикции А 3,0 kb фрагмент изолировали при помощи электрофореза на агарозном геле и готовили дл  лигировани ,

л 0,85 kb Pstl-Sphl фрагмента рестрик- ции плазмиды рКС283 Р RS сшивали ,0 kb Pstl-Sphl - фрагмента рестрикции плазмиды рКС283 - LB в соответствии с методи- кой, описанной в примере 2. Легированна  ДНК составл ла целевую плазмиду . Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pL32 представлены на фиг.1. Плазмиду трансформировали в Е. coli К12 МО (Я+) - клетках в соответствии с методикой , описанной в примере 3. Плазмид- ную pL32 - ДНК получали из Е. coli K12 МО (А+)/р1 32-трансформаторов в соответствии с методикой, описанной в примере 1. Ана-. лиз плазмидной р 32-ДНК показал, что обработанный ферментом Кленова Sail-концы плазмиды рКС283РХ сцеплены с более чем одним Eco R I - линкером. Присутствие более одного Eco R 1-линкера нежелательно дл  плазмиды или производных плазмиды pL32 и может быть обнаружено по присутствию Xhol-сайта рестрикции, который образуетс  всегда, когда два Eco R I- линкера сшиваютс  вместе. Альтернативно, плазмида может быть построена путем Sail - Eco R l-вырезани  и лигировани , выполненных в соответствии с описанием в первом абзаце насто щего примера по отношению к плазмиде pKC283-LB.

Пример. Конструирование Е. coli К12 МО (A+)/pL47.

Е, coll K12 RV 308-pNM789 может быть получен из Северной Региональной исследовательской лаборатории в лиофилизиро- ванном виде под номером NRRL В-182216. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pNM789 представлены на фиг.2, Плазмидную ДНК извлекали из культуры в соответствии с методикой, описанной в примере 1, за исключением того, что температу- ра инкубировани  составл ет 37°С. 10 мкг pNM789 суспендировали в 200 мкл PVUII- буфере(50мМтрис-НС1, рН 7,5; 60 мМ NaCI и 6 мМ MgCte). Затем добавл ли 1 ед. PVUII

и реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Фермент инактифиро- вали путем нагревани  при 65°С в течение 10 мин. Затем добавл ли 30 мкл 10-кратного BamHI - буфера (200 мМ трис-HCI, рН 8; 1 М NaCI и 70 мМ MgCIa). 70 мкл Н20 и 10 ед. BamHI и реакцию инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После этого добавл ли 5 ед. алкалин-фосфатазы и смесь инкубировали в течение 1 ч при 65°С. ДНК-фрагменты отдел ли на 1 % агарозном геле и один отрезанный фрагмент (фиг.З) очищали.

ДНК-линкер с тупым концом и с Bamll - концом синтезировали в соответствии с методикой , описанной в примере 4. Этот линкер (показан на фиг.З) имеет следующую структуру:

5 -CTGTGCCTTCTAG-3 3 -GACACGGAACATCCTAG - 5 Этот линкер киназировали и лигировали в BamHI-PVUII - переваренную плазмиду pNM789 в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Указанную смесь лигировани  использовали дл  трансформации клеток Е. coli K12 RV 308 и после трансформации плазмиду выдел ли по способу, описанному в примере 3. Затем отбирали несколько плазмид, которые содержали PVUII - фрагмент (494 п.о.) и Xhoal - BamHI фрагмент (628 п.о,). Последовательность, состо щую по меньшей мере из двух этих фрагментов, определ ли секвенированием от BamHI - сайта по направлению к специфическому Smal-сайту, а затем отбирали один клон с нужной последовательностью. Эту промежуточную плазмиду обозначали плаз- мидой 120. Схематическое описание этой процедуры, сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды 120 представлены на фиг.З приложенных иллюстраций.

В цел х изолировани  EK-BGH-кодиру- ющей ДНК около 10 мкг плазмиды 120 переваривали в 200 мкл высокосолевого буфера, содержащего около 50 ед. каждого из Хва l-Bam рестриктаз. Продукты переваривани  отдел ли при помощи электрофореза на гарозном геле, .б kb Хва l-BamHi-фраг- мента рестрикций, кодирующих EK-BGH, выдел ли и приготовл ли дл  лигировани  в соответствии с.методикой, описанной в примере 6.

Плазмиду pL32 также переваривали рестриктазами Xhal и BamHI и выдел ли 3,9 ks фрагмента рестрикции, который использовали дл  лигировани . -ч, 3,9 kb BamHI-фрагмента рестрикции плазмиды pL32 лигировали с- 0,6 Xeal-BamHI-фраг- мента рестрикции плазмиды 120 по способу , описанному в примере 2, и получали плазмиду pL47. Сайт рестрикции и функциональна  карта плазмиды pL47 представлены на фиг.4. Плазмиду pL47 трансформировали в Е. coll K12 МО (А+) в соответствии с методикой, описанной в примере 3, и Е. coll К12 МО (Я+) /pL47 - трансформанты идентифицировали . Плазмидную pL-47-ДНК получали из этих трансформантов в соответствии с методом, описанным в примере 1.

П р и м е р 8. Конструирование Е. coll K12RV308/pPR12ARI.

Плазмида рР R 12 содержит с 1857-ген термовосприимчивого pL-penpeccopa. а плазмида pBL322 содержит ген. несущий устойчивость к тетраклину. Плазмида рР R 12 раскрыта и за влена в патенте США № 44368Т5. выданном 13 марта 1984 г. Сайт рестрикции и функциональна  карта представлены на фиг.4.

Около 20 мкг плазмиды рР R 12 переваривали 50 ед. рестриктазы Eco R I в 200 мкл высокосолевого буфера в течение 2 ч при 37°С. ДНК Eco RI - переваренной плазмиды рР R I преципитировали и обрабатывали ферментом Кленова по способу, описанному в примере 5. После реакции Кленова Есо R I - переваренную, обработанную ферментом Кленова плазмидную рР R 12 - ДНК ре цир кул изо вал и путем лигировани  в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированна  в ДНК, котора  составл ет нужную плазмиду рР R 12AR I использовалась дл  трансформации Е. coll К12 RV308 по способу, описанному в примере 3, за исключением того, что селектирова- ние было основано на устойчивости к тетрациклину 5 мкг/мл, а не на устойчивости к ампициллину Е. coli K12 RV308 имеетс  в NRRL под номером NRRL В-15624. После того как трансформанты Е. coll K12 RV 308/рР R 12 AR I были идентифицированы, из этих трансформантов изготовл ли ДНК плазмиды рР R 12 AR I по способу, описанному в примере 1.

Около 10 мкг плазмиды рР R 12 AR I переваривали около 50 ед., рестриктазы AVal в 200 мкл среднесолевого буфера в течение 2ч при 37°С. ДНК AVal-переваренной плазмиды преципитировали и обрабатывали ферментом Кленова по способу, описанному в примере 5. После реакции Кленова ДНК AVal-переваренной и обработанной ферментом Кленова плазмиды рР R 12 AR I лигировали с Eco R (-линкерами (5; - CAGGAATTCCTC - 3) по способу, описанному в примере 2. После лигировани  линкера ДНК преципитировали, а затем ре- суспендировали в около 200 мкл высокосолевого буфера, содержащего 50 ед. рестриктазы Eco R I. Полученную в результате реакцию инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После Eco RI - переваривани  реакционную

смесь погружали в агарозный гель, 5,1 kb Eco R I фрагмента рестрикции очищали в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Лигированна  ДНК составл ла желаемую плазмиду рР R 12A R I. ДНК

плазмиды рР R 12A R I трансформировали в Е. coll K12 308 в соответствии с методикой, описанной в примере 3, за исключением того, что селекци  проводилась на основании устойчивости к тетрациклину, а не к

ампициллину. После идентификации Е. coll К12 RV 308/рР R I 12A R I - трансформантов, в соответствии с процедурой описанной в примере 1, получали ДНК плазмиды рР R 12А R I Сайт рестрикции и функциональна 

карта плазмиды рР R 12A R I представлены на фиг.4.

П р и м е р 9. Конструирование Е, coll К12 RC308/pL110.

Около 10 мкг ДНК плазмиды рР R 12AR

1 суспендировали в около 200 мкг высокосолевого буфера, содержащего около 50 ед. каждого из рестриктаз Pstl и Eco R I, и реакцию переваривани  инкубировали при 37°С

в течение 2 ч. Затем реакционную смесь погружали в агарозный гель, а 2,9 kb Pstl

-Eco R I - фрагмента рестрикции плазмиды рР R 12A R I выдел ли и готовили дл  лигировани  в соответствии с методикой, описанной в примере 6.

Около 10 мкг плазмиды pL47 переваривали Pstl и BamHI рестриктазами в 200 мкл высокосолевого буфера в течение 2 ч при 37°С. Затем Pstl - BamHI переаренную ДНК

погружали в агарозный гель, ИА/2,7 кв. Pstl

-BamHI - фрагмента рестрикции, содержащего начало репликации, и часть гена, несущего устойчивость к ампициллину, выдел ли и готовили дл  лигировани  в соответствии

с методикой, описанной в примере 6.В вы- , деленной реакции около 10 мкг ДНК плазмиды переваривали Eco R I и BamHI - рестриктазы в 200 мкл высокосолевого буфера при 37°С в течение 2 ч, а 1,03 kb Eco R I BamHI - фрагмента рестрикции, содержащего новую транскрипционную и трансл ционную активирующую последовательность и EK-BGH-кодирующую ДНК; выдел ли и подготавливали дл  лигировани  в соответствии

с методикой, описанной в примере 6.

/v 2 мкг из 1,0 kb полученного Eco R I - BamHI - фрагмента рестрикции использовались в конструировании плазмиды pL110. / 2,7kb Pstl -BamHI и 1,03kb Eco R I

-BamHI - фрагмента рестрикции плазмиды

pL47 лигировали с 2,9 kb Pstl - Eco R I - фрагмента рестрикции плазмиды pP R 12A R I с целью конструировани  плазмиды , а лигированную ДНК использовали дл  трансформации Е. coll K12 RV308 в соответствии с методикой, описанной в примерах 2 и 3, за исключением того, что выделение трансформантов проводилось на основе устойчивости к тетрациклину, а не к ампициллину.

В рестрикционном сайте и функциональных картах, приведенных на приложенных рисунках, не обозначена EK-BGH - кодирующа  область, в которой наход тс  сайты распознавани  двух Pstl - плазмиды pl 110 представлены на фиг.4

П р и м е р 10. Получение ДНК вируса В К.

Вирус ВК получают из Американской Коллекции Типовых культур под депозитарным номером ATCCVR-837. Вирус доставл ют в л-иофилизированной форме и ресуспендируют в уравновешенных сол х Хэнка (Гибко, 3175 Стэйли Роду, Грэнд Айланд, Нью-Йорк 14072) до титра около 10 бл шкообразующих единиц (б о е.) на миллилитр . Хоз ином дл  получени  ДНК вируса ВК  вл ютс  клетки человеческой первичной почки (РНЕК), которые могут быть получены из Флоу Лабораториез, Инк., 7655 Олд Спрингхауз Роуд, Мак Лин, Виргини  22101, под каталожным номером 0-100 или из М.А. Биопродактс под каталожным номером 70-151.

Около п ти 75 мм2 полистироловых колб, содержащих конфлуентные монослои около 10 клеток РНЕК, используют дл  получени  вируса. Около 1 мл вируса ВК при титре 105 б.о.е./мл прибавл ют в каждую колбу, которую затем инкубируют при 37°С в течение часа, после чего прибавл ли свежую культуральную среду (Дульбекко Модифицированна  среда Игл, Гибко, пополненна  10%-ной сывороткой плода коровы) и зараженные клетки инкубируют при 37°С в течение 10-14 дней или до полного цитопатогенно- го эффекта вируса. Этот цитопатогенный эфект варьируетс  от линии клеток до линии клеток и от вируса до вируса, однако обычно состоит в том, что клетки округл ют сверху, обособл ютс  попул ционно и отторгаютс  от культурального диска.

Вирус высвобождают из клеток при помощи трех циклов замораживани -оттаивани  и продукты распада клеток удал ют центрифугированием при 5000 х г. Вирус в 1 л надосадочной жидкости осаждают и собирают прибавлением 100 г ПЭГ-6000, инкубированием раствора в течение 24 ч при 4°С

и центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.Осадок после центрифугировани  раствор ют в 0,1Х SSC буфере (IXSSC 0,15 М Nad и 0,015 М Na цитрат, рН 7) при 5 концентраии. равной одна сота  первоначального объема. Вирусную суспензию расслаивают на 15 мл раствора насыщенного КВг в пробирке, которую центрифугируют при 75000 х г в течение 3 ч. После центрифу0 гировани  в растворе КВг видны - две полосы . Нижнюю полосу, котора  содержит полный вирион, собирают и обессоливают на колонке Сефадекс G-50 (Сигма Кемикал Ко., P.O. Бокс 14508, Сент-Луис, Миссури

5 63178), использу  ТЕ (10 мМ трис-HCI; рН 7,8 и 1 мМ ЭДТА) в качестве буферного раствора дл  элюировани .

Додецилсульфат натри  (ДДС-Na) прибавл ют в раствор очищенных вирианов,

0 полученный из колонки, до концентрации 1%, проназу прибавл ют до концентрации 100 мкг/мл и раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем в раствор прибавл ют хлорид цези  до плотности 1,56 г/мл, после

5 чего прибавл ют бромид этиди  до конечной концентрации, равной 100 мкг/мл. Раствор центрифугируют в роторе Сорвалл 865 (Дю Пон Инст. Продактс, Биомедицинское отделение, Ньютон, Коннектикут 06470) или

0 аналогичном вертикальном роторе при 260000 х г в течение 24 ч. После центрифугировани  полосу вирусной ДНК выдел ют и экстрагируют 5 раз с использованием изо- амилового спирта, насыщенного 100 мМ

5 трис-HCI, рН 7,8. Затем раствор ДНК вируса В К диализируют по буферу ТЕ до тех пор, пока отношение оптической плотности 260 нм/280 ДНК не станет равным от 1,75 до 1,90. ДНК осаждают путем приведени 

0 концентрации МаП к 0,15 М, прибавлени  двух объемов этанола, инкубировани  раствора при -70°С в течение по крайней мере 2 ч и центрифугировани  раствора при 12000 х г в течение 10 мин. Полученный

5 осадок ДНК вируса В К суспендируют в буфере ТЕ при концентрации 1 мг/мл. Ре- стрикционный сайт и функциональна  карта вируса В К представлены на фиг.5.

0 П р и м е р 11. Конструирование плазмид рВКпео 1 и рВКпео2.

Клетки Е. coli K12 HB101/pd BPV - MMTneo получают в лиофильной форме из американской коллекции типовых культур

5 под депозитарным номером АТСС 37224. Лиофилизированные клетки высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°С с получением одноколониевых изол тов.

1 л бульона L(10 гтриптона, 10rNaCI и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инкулируют колонией Е. coll K12 НВ 101/ pdBPV- MMTneo и инкубируют в воздушной качалке при 37°С до достижени  О. Дт равной около 1 единицы спектральной поглощательной способности , при которой 150 мг хлорамфеникола прибавл ют в смесь. Инкубирование продолжают в течение приблизительно 16ч, прибавление хлорамфеникола ингибируют синтез белков и тем самым ингибирует дальнейшее деление клеток, однако позвол ет продолжение плазмидной репликации.

Затем из этой культуры выдел ют плаз- мидную ДНК в соответствии с методикой призера 1 и около 1 мкг ДНК плазмиды pdBPVMMT neo. полученной этой методикой , суспендируют в 1 мл буфера ТЕ и сохран ют при -20°С.

Около 5 мкг (5 мкл) ДНК плазмиды pdBPV-MMT neo, полученной выше и 5 мкг (5 мкл) ДНК вируса В К, полученной в примере 10, переваривают каждые отдельно при 37°С в течение 2 ч в растворе, содержащем 2 мкл 10Х буфера BamHI (1,5 М NaCI. 60 мМ трис-HCI, рН 7,9. 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА), 1 мкл рестрикционного фермента BamHI и 7 мкл воды. Реакцию останавливают путем экстракции равным объемом фенола с последующими двум  экстракци ми хлороформом. Каждую BamHI переваренную ДНК затем осаждают, собирают фильтрацией и ресуспендируют в 5 мкл воды.

Около 1 мкл 10Х лигазного буфера прибавл ют в смесь BamHI-переваренной плазмидной pdBPV-MMT neo (1 мкл) и BamHI - переваренной ВК-вирусной ДНК(1 мкл). После прибавлени  1 мкл (около 1000 единиц) ДНК - лигазы Т4 и 6 мкл воды полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет желаемые плазмиды рВК neo 1 и рВК neo

2,которые отличаютс  только в отношении ориентации ДНК вируса ВК. Плазмида рВК neo 1 содержит около 2,1 kb фрагмент рестрикции .

Клетки Е. coll K12 НВ101 поставл ютс  в лиофилизированной форме из Норверы Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером HRRL В-15626. Клетки НВ 101 К12 Е. coll культивируют; делают компетентными дл  трансформации и трансформируют лигированной ДНК, полученной выше, в соответствии с методикой примера

3.Трансформированные клетки высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Трансформанты Е. coll K12 НВ101/рВК neo 1 и Е. coll K12/pBK neo 2 идентифицируют по их ампициллинустойчивому фенотипу и посредством анализа на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pBKneol представлены на фиг.5 прилагаемых чертежей.

П р и м е р 12. Конструирование плазмиды pBLcat,

А, Конструирование промежуточной

плазмиды pLPcat.

Вирионна  ДНК аденовируса 2 (Ad2) представл ет собой двухспиральную линейную молекулу размером около 35,94 ко. Поздний промотор Ad2 может быть выделен на

рестрикционном фрагменте Accl-PVUII около 0,316 kb генома Ad2, этот рестрикционный фрагмент размером около 0,32 kb соответствует последовательности между нуклеотидными положени ми 5755 и 6071

генома Ad2. Дл  выделени  желаемого рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb ДНК Ad2 вначале переваривают рестрикционным ферментом Ball и выдел ют рестрикционный фрагмент

Ball размером около 2,4 kb, который содержит полную последовательность рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb. Затем рестрикционный фрагмент Ball размером около 2.4 kb переваривают Асе и PVUII с получением требуемого фрагмента.

Около 50 мкг ДНК Ad2 (поставленной из В R 2 или АТСС VR-2) раствор ют в 80 мкл воды и 10 мкл 10Х буфера Ва (100 мМ

трис-HCI, рН 7,6, 12-мМ MgCl2, 100 мМ ДТФ и 1 мг/мл БСА). Около 10 мкл (около 20 ед.) рестрикционного фермента Ball прибавл ют в раствор ДНК Ad2 и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в

течение 4 ч,

Ball-переваренную ДНК помещают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до полного отделени  рестрикционных ферментов. Визуализацию элект офорезованной ДНК осуществл ют путем окрашивани  гел  в разбавленном растворе (0.5 ) бромида этиди  и экспонировани  окрашенного гел  длинноволновому ультрафиолетовому (УФ) свету. Один способ выделени  ДНК из агарозы заключаетс  в следующем. В геле впереди желаемого фрагмента небольшой продольный разрез, маленький кусок диэтиламиноэтилцеллюлозной мембраны А-45 (Шлейчер энд Шуелл. Кин.

Нью-Хемпшир 03431) помещают в каждый разрез. После дальнейшего электрофореза ДНК нековалетно св зываетс  с диэтилами- ноэтилцеу люлозной мембраной. После того, как требуемый фрагмент прив залс  к

мембране, мембрану извлекают и промывают буферным раствором с низким содержанием соли (100 мМ КС, 0,1 мМ ЭДТК и 20 мМ трис-HCI, рН 8). Затем мембрану помещают в маленькую пробирку и погружают в буферный раствор с высоким содержанием соли (1 М NaCI, 0,1 мМ ЭДТК и 20 мМ трис- HCI, рН 8) и затем инкубируют при 65°С в течение часа с тем, чтобы извлечь ДНК из бумаги диэтиламиноэтилцеллюлозы. После инкубировани  при 65°С инкубационный буфер собирают в мембрану промывают буферным раствором с высоким содержанием соли. Высокосолевой промывочный раствор объедин ют с высокосолевым инкубационным буфером.

Объем высокосолевого ДНК-раствора регулируют так, чтобы концентраци  NaCI составила 0,25 М, после чего прибавл ют в раствор 3 объема холодного абсолютного этанола. Полученную смесь перемешивают и помещают при -70°С на 10-20 мин отстаиватьс . Затем раствор центрифугируют при 15000 об/мин, в течение 15 мин. После осуществлени  осаждени  с тем, чтобы удалить остаточную соль осадок ДНК промывают этанолом, сушат, ресуспендируют в 20 мкл буфера ТЕ и получают около 3 мкг трег буемого рестрикциейного фрагмента Ad2. Полученный очищенный фрагмент раствор ют в 10 мкл буфера ТЕ.

Около 6 мкл воды и 2 мкл 10Х буфера Асе (60 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ MgCIa, 60 мМ ЭДТК и 1 мг/мл БСА) прибавл ют в раствор рестрикционного фрагмента Bal 1 размером около 2,4 kb аденовируса 2. После прибавлени  около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Асе к раствору ДНК реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После переваривани  Асе ДНК собирают осаждением этанолом и ресуспендируют в 16 мкл воды и 2 мкл 10Х буфера PVUII/600 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,5, 60 мМ MgCl2, 60 мМ ДТФ и 1 мг/мл ВСА). После прибавлени  около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента PVUII к раствору ДНК реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.

Accl-PVUII-переваренный, растрикци- онный фрагмент Ad2 Ball размером около 1,4 kb нагружают на приблизительно 6%- ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока из других продуктов переваривани  не выделитс  ре- стрикционный фрагмент Accl-PVUII размером 0,32 kb, который содержит поздний промотор Ad2. Гель окрашивают бромидом этиди  и наблюдают в ультрафиолетовых лучах, после чего сегмент гел , содержащий

рестрикционный фрагмент Accl-PVUII размером около 0,32 kb отрезают от гел , дроб т и пропитывают в течение ночи при комнатной температуре в приблизительно 5 250 мкл экстракционного буферного раствора (500 мМ , 10 мМ МдОАс, 1 мМ ЭДТК и 0,1% ДДС Na). На следующее утро смесь центрифугируют и осадок сливают. ДНК в надосадочной жидкости осаждают

0 этанолом, прибавл ют около 2 мкг тРНК с тем, чтобы гарантировать полное осаждение требуемого фрагмента. Около 0,2 мкг рестрикционного фрагмента Accl-PVUH размером около 0,32 kb получают и суспен5 дируют в 7 мкл воды.

Около 0,25 мкг (в 0,5 мкл) линкеров Ball (51 - СТАТСАС - 3), поставл ютс  Нью Инг- ланд Биолабс), которые киназированы по существу в соответствии с методикой, опи0 санной в примере 2, прибавл ют раствор рестрикционного фрагмента Accl-PVUII размером около 0,32 kb и затем в ДНК прибавл ют 1 мкл (около 100 единиц) ДНК-лига- зы Т4 и 1 мкл 10Х лигазнрго буфера и

5 полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Линкеры Bell могут лигировать только к концу PVUII рестрикционного фрагмента Accl-PVUII. Сек- венирование ДНК позднее вы вл ет, что

0 четыре линкера Bell присоединены к концу PVUII рестрикционного фрагмента Accl- PVUII. Эти добавочные линкеры Bell могут быть извлечены перевариванием Bell и повторным лигированием, однако добавочные

5 линкеры ВСН не были извлечены, поскольку линкеры не преп тствуют должному функционированию векторов, которые составл ют добавочные линкеры.

Клетки Е. coli K12 HB101/pSV2 cat пол0 учают в лиофилизипованной форме из АТСС под депозитарным номером АТСС 37155, ДНК плазмиды pSV2 cat выдел ют из клеток в соответствии с методикой примера 1. Около 1 мг ДНК плазмиды pSV2 cat получают и

5 раствор ют в 1 мл буфера ТЕ. Около 3 мкг (3 мкл) ДНК плазмиды pSV2 cat прибавл ют в раствор 2 мкл 10Х буфера Асе и 16 мкл воды, после чего 3 мкл (около 9 единиц) рестрикционного фермента Асе прибавл 0 ют в раствор ДНК плазмиды pSV-2 cat и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Асе - переваренную ДНК плазмиды pSV2-cat затем переваривают рестрикционным ферментом

5 Stul путем прибавлени  3 мкл 10Х буфера (1 М NaCI, 10 мМ трис-HCI. рН 8,100 мМ MgCl2. 60 мМ ДТФ и 1 мг/мл БСА), 6 мкл воды и около 2 мкл (около 10 единиц)рестрикционного фермента Stul. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2

ч. Реакцию оканчивают экстрагированием реакционной смеси один раз фенолом, затем дважды хлороформом. Около 0,5 мкг требуемого фрагмента получают и раствор ют в 20 мкл буфера ТЕ.

Около 4 мкл Accl-Stul - переваренной ДНК плазмиды pSV2cat смешивают с приблизительно 7 мкл рестрикционного фрагмента Accl - PVUII размером около 0,32 kb (с присоединенными линкерами Bell) аденовируса 2, после прибавлени  3 мкл 10 X лигазного буфера, 15 мкл воды и 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 реакционную смесь лигировани  инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет требуемую плазмиду pLPcat, плазмиду, котора  содержит поздний промотор Ad2, расположенный так, чтобы стимулировать транскрипцию и тем самым экспрессию хлорамфениколаметилтранс- феразагена. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pLPcat представлены на фиг.6.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации клеток Е. coli K12 НВ101 в соответствии с методикой примера 3. Трансформированные клетки высеивают на -агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина; анализ на рестрикационный фермент плаз- мидной ДНК используют дл  идентификации трансформантов Е. coli K12 HB102/pLPcat. ДНК плазмиды pLPcat выдел ют из трансформантов дл  использовани  в последующих конструировани х по существу в соответствии с методикой выделени  плазмиды , описанной в примере 1.

В. Конечное конструирование плазмиды pBLcat.

Около 88 мкг ДНК плазмиды рВ пео 1 в 50 мкл буфера ТВ прибавл ют в 7,5 мкл 10Х буфера Accl, 30 мкл воды и 15 мкл (около 75 единиц) рестрикционного фермента Accl и полученную реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Accl-переварен- ную ДНК вируса ВК нагружают на агарозный гель, фрагмент размером около 1,4 kb, который содержит энхансер ВК, отдел ют от других продуктов переваривани . Рестрикционный фрагмент Accl размером около 1,4 kb затем выдел ют в соответствии с методикой, описанной в примере 12А. Около 5 мкг фрагмента ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера PVUII, 45 мкл воды и 5 мкл (около 25 единиц) рестрикционного фермента PVUII, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. PVUII переваренную ДНК затем выдел ют и приготавливают дл  лигировани  в соответствии с методикой примера 12А. Около 2 мкг желаемого фрагмента Accl-PVUII размером

около 1,28 kb получают и раствор ют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 1 мкг ДНК плазмиды pLPcat раствор ют в 5 мкл 10Х буфера Accl и 40 мкл

воды. Около 5 мкл (около 25 единиц) рестрикционного фермента Accl прибавл ют в раствор ДНК плазмиды pLPcat, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С. Accl - переваренную ДНК плазмиды pLPcat

0 осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Stul, 40 мкл воды и 5 мкл (около 25 единиц) ресктрикционного фермента Stul, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Accl 5 Stul - переваренную ДНК плазмиды pLPcat осаждают этанолом несколько раз с тем, чтобы очистить рестрикционный фрагмент Accl - Stul размером около 4,81 kb, который содержит Е. coll - начало репликации и озд0 ний промотор Ad2 вдали от других продуктов переваривани , причем рестрикционный фрагмент имеет размер около 16 пар оснований . Около 1 мкг требуемого рестрикционного фрагмента размером около 4,81 kb

5 получают и раствор ют в 20 мкл буфера ТЕ. 5 мкл рестрикционного фрагмента Accl - Stul размером около 4,81 kb плазмиды pLPcat прибавл ют к 5 мкл рестрикционного фрагмента Accl - PVUII размером около

0 1,28 kb вируса В К. После прибавлени  3 мкл 10Х лигазного буфера 15 мкл воды и 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 полученную лигационную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированна  ДНК

5 составл ет требуемую плазмиду pBLcat. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pBLcat представлены на фиг.6.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации клеток Е. coll K12 НВ101 в

0 соответствии с методикой, описанной в при- мере 3. Трансформанты E.coli K12 HB101/pBLcat идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды pBLcat получают дл 

5 использовани  в последующих конструктивных в основном в соответствии с методикой примера 1.

Пример 3. Конструирование плазмиды pL133.

0 А. Конструирование промежуточной плазмиды pSV2-HPC8.

Плазмида рНС7 содержит ДНК-последовательность , котора  кодирует человеческий протеин С. Один литр L-бульона,

5 содержащего 15 мкг/мло тетрациклина, инокулируют культурой Е, coll K12 RRI (рНС7) NRRL В-15926). ДНК плазмиды рНС7 выдел ют и очищают в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды

рНС7 представлены на фиг.7 Около 1 мг ДНК плазмиды рНС7 получают этой методикой , суспендируют в 1 мл буфера ТЕ и сохран ют при-20°С.

50 мкл ДНК плазмиды рНС7смешивают с 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Banl, 10 мкл 10Х реакционного буфера Banl (1,5 М NaCI, 60 мМ трис-HCI. рН 7,9, 60 мМ MgCI2 и 1 мг/мл ВСА) и 35 мкл воды и инкубируют до завершени  перева- ривани . Banl-переваренную ДНК плазмиды рНС7 затем подвергают электрофорезу на 3,5%-ном полиакриламидном геле (29:1, акриламид: бисакриламид) до тех пор, пока рестрикционный фрагмент Banl размером около 1,25kb не отделитс  от других продуктов переваривани .

Область гел , содержащую рестрикционный фрагмент Banl размером около 1,25 kb, отрезают от гел , помещают в испыта- тельную пробирку и разбивают на маленькие кусочки. 1 мл экстракционного буфера (500 мМ NH40Ac, 10 мМ МдОАс, 1 мМ ЭДТК, 1 % ДДС Na и 10 мг/мл тРНК) прибавл ют в пробирку, содержащую фрагменты, и про- бирку помещают при 37°С на ночь. Центрифугирование используют дл  осаждени  продуктов распада клеток и надосадочную жидкость перенос т в новую пробирку, Продукты распада промывают один раз 200 мкл экстракционного буфера, промытую над- осадочную жидкость объедин ют с первым надосадочным слоем от ночной экстракции. После пропускани  надосадочного сло  через пробку из стекловаты прибавл ют два объема этанола и смешивают с надосадоч- ной жидкостью. Полученный раствор помещают в ванну с сухим льдом и этанолом на 10 мин, после чего ДНК осаждают центрифугированием .

Приблизительно 8 мкг рестрикционного фрагмента Banl размером около 1,25 kb получают этой методикой. Очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохран ют при -20°С. Рестрикционный фрагмент Banl необходимо модифицировать путем прибавлени  линкера с тем, чтобы построить плазмиду pSV2-HPC8.

500 пикомолей каждого одиночной спирали линкера киназируют в 20 мкл реакци- онного буферного раствора, который содержит в 20 мкл реакционного буферного раствора, который содержит 15 единиц (около 0,5 мкл) полинуклеотид - киназы Т4,2 мкл 10Х лигазного буфера, 10 мкл из 500 мкМ АТФ и 7,5 мкл воды. Киназную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин и реакцию завершают инкубированием при 100°С в течение 10 мин Чтобы гаранти- ровать полную кинацию, реакционную

смесь охлаждают на льду, после чего прибавл ют 2 мкл 0,2 М дитиотрейтола, 2,5 мкл 5 мМ АТФ и 15 единиц Т4-полинуклеотидки- назы прибавл ют в реакционную смесь и перемешивают, после чего реакционную смесь инкубируют еще 30 мин при 37°С в течение 10 мин и осуществл ют охлаждение реакционного продуктэТна ль ду/

Хот  и киназированные отдельно две одиночные спирали ДНК-линкера смешивают друг с другом после киназной реакции. Дл  ренатурации спиралей «иназную реакционную смесь инкубируют при 100°С в течение 10 мин в вод ной , содержащей около 150 мл воды. После инкубации вод ную баню отключают и охлаждают до комнатной температуры, что занимает около 3 ч. Вод ную баню, все еще содержащую пробирку кинасированной ДНК, затем инкубируют при 4°С в течение ночи. Этот процесс позвол ет денатурирозать одиночные спирали . Построенный линкер имеет следующую структуру

5 -AGCTTTGATCAG-S1

3 - AACf AGTCCACG - 5

Линкер сохран ют при -20°С до его использовани .

Около 8 мкг фрагмента Banl размером около 1,25 kb прибавл ют в реакционную смесь и смешивают с 50 мкл линкера (около 500 пикомолей), 1 мкл ДНК - лигазы Т4 (около 500 единиц), 10 мкл 10Х лигазного буфера и 19 мкл воды и полученную лигационную смесь инкубируют при 4°С в течение ночи. Реакцию лигировани  прекращают путем 10-минутного инкубировани  при 65°С. ДНК осаждают путем прибавлени  аОАс до конечной концентрации 0,ЗМ прибавлени  2 объемов этанола, охлаждени  в ванне с сухим льдом и этанолом и центрифугировани  раствора

Осадок ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Apal (60 мМ NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,4, 60 мМ MgCte и 60 мМ 2-меркаптоэтанола), 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Apal и 85 мкл воды и рёакционную с мё сь% пЪ мёщают при 37°С на 2 ч. Затем реакцию останавливают и ДНК осаждают, как описано выше. Осадок ДНК после центрифугировани  раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буферного раствора Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) ре- сктрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч После переваривани  Hindlfl реакционную смесь нагружают на 3,5%-ный полиакриламидный гель и желаемый рестрикционный фрагмент Hindlll-Apal размером около 1,23 kb выдел ют в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А. Приблизительно 5 мкгтребуемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохран ют при -20°С,

50мкл ДНК плазмиды рНС7смешивают с 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Pstl. 10 мкл 10Х реакционного буфера Pstl (1.0 М NaCI. 100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 100 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА) и 35 мкл воды и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Pstl-переваренную ДНК плазмиды рН С7 затем подвергают электрофорезу на 3,5%- ном полиакриламидном геле, желаемый фрагмент размером около 0,88 kb очищают в основном в соответствии с методикой, описанной выше. Приблизительно 5 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохран ют при -20°С.

Около 5 мкг фрагмента Pstl размером около 0,88 kb прибавл ют и смешивают с 50 мкл следующего линкера, который конструируют в автоматизированном ДНК-синтезаторе:

51- GTGATCAA-3

3 - ACGTCAGTACTTCTAG - 5

Около 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (около 10 единиц), 10 мкл 10Х лигазного буфера и 29 мкл воды прибавл ют к смеси ДНК и полученную лигазную реакционную смесь инкубируют при 4°С в течение ночи.

Реакцию лигировани  прекращают путем 10-минутного инкубировани  при 65°С. После осаждени  лигированной ДН К осадок ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Apal, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Apal и 85 мкл воды и реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч. Затем реакцию прекращают и ДНК осаждают еще раз. Осадок ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Bglll (1 М NaCI, 100 мМ трис-HCI. рН 7,4, 100 мМ MgCl2,100 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА), 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционо- го фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь оставл ют при 37°С на 2 ч. После переваривани  Bglll реакционную смесь нагружают на 3.5%-ный полиакриламидный гель и желаемый рестрикционный фрагмент Apal-Bglll размером около 0,19 kb выдел ют в основном в соответствии с методикой, описанной выше. Приблизительно 1 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и сохран ют при -20°С.

Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды pSV2gpt (ATCC 37145) раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Hlndlll, 5 мкл (около 50 единиц), рестрикционного фермента Hlndlll и 85 мкл воды и реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч. Затем реакционную смесь довод т до 0.25 М в NaOAC. после прибавлени  двух объемов

этанола и инкубировани  в ванне в сухим льдом и этанолом ДНК осаждают центрифугированием . Осадок ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц ) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают при 37°С на 2 ч. После переваривани  Bglll реакционную смесь нагружают на 1%-ный агарозный гель и фрагменты отдел ют элек0 трофорезом. Гель окрашивают этиди  бромидом и наблюдают при УФ-свете и полосу, содержащую желаемый фрагмент Hindlll - Bglll размером около 5,1 kb, отрезают от гел  и помещают в пробирку дл  диализа,

5 электрофорез осуществл ют до тех пор. пока ДНК не отсоединитс  от агарозы. Буферный раствор, содержащий ДНК из пробирки дл  диализа, экстрагируют фенолом и . после чего ДНК осаждает. Осадок

0 ресуспендируют в 10 мкл буфера ТЕ и он составл ет около 5 мкг желаемого рестрикционного фрагмента Hlndlll - Bglll размером около 5,1 kb плазмиды pSV2gpt.

2 мкл рестрикционного фрагмента

5 Hindlll-Apal размером около 1,23 кл. 3 мкл фрагмента Apal-Bglll размером около 0,19 kb и 2 мкл фрагмента Hindlll-Bglll размером около 5,1 kb смешивают и затем инкубируют с 10 мкл 10Х лигазного буфера, 1 мкл ДНК0 лигазы Т4 (около 500 единиц) и 82 мкл воды при 16°С в течение ночи. Л игированна  ДНК составл ет желаемую плазмиду pSV2-HPC3. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pSV2-HPC8 представлены

5 на фиг.7.

Клетки Е, coll K12 RRI (NRRL В-15210) делают компетентными за трансформацию в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Полученную лиги0 рованную ДНК используют дл  трансформации клеток, аликвоты трансформационной смеси высеивают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Затем чашки инкубируют при 37°С. Трансформан5 ты Е. coll K12 RRI/pSV2-HPC8 оценивают анализом на рестрикционный фермент плазмидной ДНК.

В. Окончательное конструирование плазмиды .

0 50 мкг плазмиды pSV2-HPC8 раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Hlndlll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hlndlll и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют при 37°С в

5 течение 2 ч. После переваривани  Hlndlll ДНК осаждают и осадок ДНК раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Sail (1,5 М NaCI, 60 мМ трис-HCI. рН 7,9 мМ MgCte. 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА). 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Sail и 85 мкл воды. Полученную реакционную смесь Sail инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Hindlll - Sail - переваренную плазмиду pSV2-HPC8 нагружают на 3,5%- ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока желаемый рестрикционный фрагмент Hindlll - Sail размером около 0,29 kb не отделитс  от других реакционных продуктов. Требуемый фрагмент выдел ют из гел , при этом получают около 2 мкг фрагмента и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.

50 мкг плазмиды pSV2-HPC8 раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Bgllll, 5 мкл (50 единиц) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После переваривани  Bglll ДНК осаждают и осадок ДНК раствор ют в 10 мкл ЮХреакцион ного буфера Sail, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Sail b 85 мкл воды. Полученную реакционную смесь Sail инкубируют в течение 2 ч при 37оС. Sail - Bglll - переваренную плазмиду pSV2-HPC8 нагружают на 3,5%-ный полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока желаемый рестрикционный фрагмент Sail - Bglll размером около 1,15 kb не отделитс  от других реакционных продуктов . Рестрикционный фрагмент Sail - Bglll размером около 1.15 kb выдел ют из гел , при этом получают около 8 мкг фрагмента и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.

Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды pSV2- -глобина (NRRL В-15928) раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буфера Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды и реакционную смесь оставл ют при 37оС на 2 ч. Затем реакционную смесь довод т до 0,25 М в NaOAc и после прибавлени  двух объемов этанола и инкубации в ванне с сухим льдом - этанолом ДНК осаждают центрифугированием . Hindlll - переваренную плазмиду pSV2-/3 -глобин раствор ют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц ) рестрикционного фермента Bglll и 85 мкл воды и реакционную смесь оставл ют на2чпри37°С. После Bglll-переваривани  реакционную смесь нагружают на 1%-ный агарозный гель и фрагмент Hindlll - Bglll размером около 4,2 kb выдел ют из гел , при этом получают около 5 мкг желаемого фрагмента и суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.

2 мкл фрагмента Hindlll-Sall размером около 0,29 kb плазмиды pSV2 - HPC8, 2 мкл фрагмента Sall-Bglll размером около 1,15 kb плазмиды pSV2-HPC8 и 2 мкл фрагмента Hindlll - BgllJ размером около 4,2 kb плазмиды pSV2- /9-глобин смешивают и лигиру- ют в основном в соответствии с методикой примера 13А. Лигированна  ДНК составл ет желаемую плазмиду pL133. Рестрикцион- 5 ный сайт и функциональна  карта плазмиды рИЗЗ представлены на фиг.7. Требуемые трансформанты Е. coll K12 RRI/p 133 конструируют в основном в соответствии с методикой примера 16А за исключением того, 0 что вместо плазмиды pSV2-HPC8 плазмиду используют в качестве трансформирующей ДНК.

П р и м е р 14. Конструирование плазмиды pLPC.

5 Около 20 мкг плазмиды pBLcat раствор ют в 10 мкл 10Х буфера Hindlll и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 100 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавл ют в раствор ДНК плазмиды pBLcat и 0 полученную реакционную смесь инкубируют1 при 37°С в течение 2 ч. Hlndlll-перева- ренную ДНК плазмиды pBLcat нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до выселени  рестрикционного фраг- 5 мента Hindlll размером около 0,87 kb, который содержит энхансер В К и поздний промотор Ad2; затем данный фрагмент выдел ют и подготавливают дл  лигировани  в основном в соответствии с методикой при- 0 мера 12А.

Около 2 мкг желаемого фрагмента получают и раствор ют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 1,5 мкг ДНК плазмиды pL133 раствор ют в 2 мкл 10Х буфера Hindlll и 16 мкл 5 воды. Около 1 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавл ют в раствор ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем ДНК разбавл ют до 100 мкл буфером 0 ТЕ и обрабатывают тел чьекишечной щелочной фосфатазой в основном в соответствии с методикой примера 7. Hindlll-переваренную ДНК плазмиды pL133 экстрагируют дважды фенолом и один раз хлороформом, осажда- 5 ют этанолом и ресуспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.

Около 5 мкл рестрикционного фрагмента Hindlll размером около 0,87 kb плазмиды pBLcat прибавл ют к 1,5 мкл Hindlll-nepe- 0 варенной плазмиды pL133, а затем 1 мкл 10Х лигазного буфера, 1 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4 и 1,5 мкл воды прибавл ют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение ночи 5 при 16°С. Лигированна  ДНК составл ет желаемую плазмиду pLPC. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pLPC представлены на фиг.8.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации Е. coli K12 НВ101 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий амипицил- лин и плазмидную ДНК ампициллин-устойчивых трансформантов, исследуют анализом нерестрикционный фермент с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coll K12 НВ101/ - pLPC. Рестрикционный фрагмент Himdlll размером около 0,87 kb, кодирующий энхансер ВК и поздний промотор Ad2 можно инсерцировать в Hindlll-переваренную плаз- миду pL133 в одной или двух ориентаци х, единственна  конструкци , котора  содержит фрагмент Ndel-Stul размером около 1 kb, и приводит к получению плазмид pLPC,

Пример15. Конструирование плазмид pLPChyg и pLPChyg2.

Клетки Е. coli K12 RRI/pSV2hyg получают из Норзерн Риджионал Рисерч Лабора- тори под депозитарным номером В-18039. ДНК плазмиды pSV2hyg получают из клеток в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pSV2hyg представлены на фиг.8.

Около 10 мкг (в 10 мкл буфера ТЕ) плазмиды pSV2hyg прибавл ют в 2 мкл буфера BamHI и 6 мкл воды. Около 2 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента BamHt прибавл ют в раствор ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.

Реакционную смесь экстрагируют вначале фенолом и затем дважды хлороформом , BamHI2 переваренную ДНК плазмиды pSV2hyg нагружают на агарозный гель и гиг- ромицин-устойчивый генсодержащий ре- стрикционный фрагмент размером около 2,5 kb выдел ют в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А,

Около 5 мкл 1DX буферного раствора Кленова (0,2 мМ в каждой из четырех дНТФ, 0,5 трис-HCI, рН 7,8, 50 мМ MgCh, 0,1 М 2-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл ВСА) и 35 мкл воды прибавл ют к раствору BamHI-ne- реваренной ДНК плазмиды pSV2hyg, затем около 25 единиц фермента Кленова (около 5 мкл, поставл емых на рынок фирмой в RL) прибавл ют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 30 мин при 16°С. Обработанную ферментом Кленова BamHI - переваренную ДНК плазмиды pSV2hyg экстрагируют один раз фенолом и один раз хлороформом и затем осаждают этанолом. Около 2 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 10 мкг (10 мкл) ДНК плазмиды pLPC прибавл ли к 2 мкл 10Х буфера Stul и 6 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц)

рестрикциоиного фермента Stul прибавл ют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Stul - переваренную ДНК плазмиды pLPC

осаждают этанолом, собирают центрифугированием ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Nde 1 (1,5 М NaCI, 0,2 М трис-HCI, рН 7,8, 70 мМ MgCl2, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл

0 (около 10 единиц) рестрикционного фермента Ndt 1 прибавл ют к раствору Stul-перева- ренной ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Ndel и Stul переваренную ДНК плазми5 ды pLPC осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Кленова и 40 мкл воды. Около 5 мкл (около 25 единиц) фермента Кленова прибавл ют к раствору и ДНК и полученную

0 реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 30 мин. После завершени  реакции Кленова реакционную смесь нагружают на агарозный гель и рестрикционный фрагмент размером около 5,82 kb Ndel-Stul выдел ют

5 из гел . Около 5 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ. Около 2 мкл Кленов-обработанного рестрикционного фрагмента BamHI размером около 2,5 kb плазмиды pSV2hyg смешивают

0 с приблизительно 1 мкл Кленов-обработанного рестрикционного фрагмента Ndel- Stul размером около 5,82 kb плазмиды pLPC, в раствор ДНК прибавл ют около 3 мкл 10Х лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК-ли5 газы (около 1000 единиц), 1 мкл Т4 РНК лигазы (около 1 единицы) и 14 мкл воды. Полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет желаемые плазмиды

0 pLPChygl и pLPChyg2, которые отличаютс  друг от друга только в отношении ориентации рестрикционного фрагмента BamHI, обработанного ферментом Кленова, размером около2,5 kb, плазмиды pSV2hyg. Рестрикци5 онный сайт и функциональна  карта плазмиды pLPChygl представлены на фиг.8. Лигированную ДНК используют дл  трансформации Е. coli K12 НВ101 в основном в соответствии с методикой примера 3. Желаемые

0 трансформэнты E.coli K12 НВ101/pLPChygl и Е. coll K12 HB-101/pLPChyg2 высевают на L- агар, содержащий ампициллин, и идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК.

5 Пример1б. Конструирование плазмиды pBW32.

А, Конструирование промежуточной плазмиды рТРА103.

Плазмида рТРА102 содержит кодирующую последовательность тканевого активатора плазминогена (АПТ) человека. Плазми- ду рТРА102 можно выделить из Е. coll K12 ММ294/рТРА102, штамма, поставл емого Норзерн Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным номером NRRL В- 15834. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды рТРА102 представлены на фиг.9. ДНК плазмиды рТРА102 выдел ют из Е. coll K12 ММ294/рТРА102 в основном в соответствии с методикой примера 1.

Около 5 мкг плазмиды рТРА102 (в приблизительно 50 мкл буфера ТЕ) прибавл ют к 10 мкл 10Х буфера Tthllll (0,5 М NaCI, 80 мМ трис-HCI, рН 7,4. 80 мМ MgChz, 80 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрик- ционного фермента Tthllll прибавл ют к раствору ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 65°С в течение 2 ч. Реакционную смесь нагружают на агарозный гель, рестрикционный фрагмент Tthllll размером около 4,4 kb, который содержит последовательность , кодирующую АПТ, выдел ют из гел . Другие продукты переваривани , ре- стрикционные фрагменты размером около 3,1 kb и 0,5 kb удал ют. Около 10 мкг желаемого рестрикционного фрагмента TthllH размером около 4,4 kb получают и суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.

Около 5 мкл 10Х буфера Кленова и 30 мкл воды прибавл ют к раствору, содержащему рестрикционный фрагмент Tthllll размером около 4,4 kb, и после прибавлени  около 5 мкл фермента Кленова (около 5 единиц ) реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 30 мин. После завершени  реакции Кленова ДН К осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 14 мкл воды.

Линкеры BamHI (Нью-Инглэнд иолабо), имеющие следующую последовательность

5 -CGGATCCG-3

3 -GdctAdGC-S

киназируют и подготавливают дл  лигиро- вани  следующим образом. 4 мкл линкера (около 2 мкг) раствор ют в 20,15 мкл воды и 5 мкл 10Х киназного буфера (500 мМ трис- HCI, рН 7,6 и 100 мМ MgCte), инкубируют приЭОоС в течение 2 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. 5 мкл уг2-р- АТФ (около 20 мкС), 2,5 мкл Ш ДТТ и 5 мкл полинуклеотидкиназы (около 10 единиц) прибавл ют в смесь, которую затем инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем прибавл ют 3,35 мкл 0,01 М АТФ и 5 мкл киназы и реакцию продолжают еще 30 мин при 37°С. Радиоактивна  АТФ помогает в определении лигированы или нет линкеры к искомой ДНК.

Около 10 мкл киназированных линкеров BamHI прибавл ют к раствору рестрикционного фрагмента Tthllll размером около 4,4 kb и после прибавлени  2 мкл Т4 ДНК-лига5 зы (около 1000 единиц) и 1 мкл Т4 ДНК-лига- зы (около 2 единиц) смесь реакции лигировани  инкубируют при 4°С в течение ночи. Лигированную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера

0 Hindlll и 40 мкл воды. Около 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Hindi If прибавл ют к раствору ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.

5 Hlndlll-переваренную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют 10 мкл 10Х буфера BamHI и 90 мкл воды. Около 10 мкл (около 100 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавл ют к раствору

0 ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С. После ВатНt-перевариванй  реакционную смесь нагружают на ага роЗньТй гель и рестрикционный фрагмент BamHI-Hindlll

5 размером около 2 kb выдел ют из гел . Около 4 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

0 Дл  построени  плазмиды рТРАЮЗ рестрикционный фрагмент BamHI-Hlndlll размером около 2 kb, полученный из плазмиды рТРА102, инсерцируют в BamHI-Hfndlll-пе- реваренную плазмиду pRC. Плазмиду pRC

5 конструируют путем инсерции рестрикционного фрагмента Eco R l-Clal размером около 288 пар оснований, который содержит последовательности промотора и оператора (trpPO) оперона trp Е. coll b Eco R l-Clal0 переваренную K12N10b/pKC7 плазмиду PKC7. Плазмида рКС7 может быть получена под депозитарным номером АТСС37084. Рестрикционный фрагмент из Американской коллекции Типовых культур в Е. coll Eco

5 R l-Clal размером около 288 пар оснований, который содержит trp PO, может быть выделен из плазмиды рТРА102, которую можно выделить из Е. coli K12 ММ294/рТРА102 (NRRL B-15834). ДНК плазмид рКС7 и

0 рТРА102 могут быть получены из упом нутых клеточных линий в основном в соответствии с методикой примера 1. Этот рестрикционный фрагмент Eco R l-CIal размером около 0,29 kb плазмиды рТРА102 со5 держит последовательность активации транскрипции и большую часть последовательности активации трансл ции гена trp E. coll и имеет следующую последовательность .

S-AAITCACGCT СТОСГОТТЛТ GCTCGGTGGT CGCTAGCGTO CCGACGCCCA

ним i mi inn mi i HIM mi mm 11111 inn

З -СТСССА CACCACAATA CCACCCACCA CCCATCCCAC GGCTGCGCGT

TCTCG CTCC AtGJTGCICC «-fTCCTTCTG СССААТССЗ.

ii mm 11 1111 iiini 111 mn 11 m mi m 11 m и 111

AGAGCTGACG TGCCACGTGG TTACGAACAC CGCAGTCCGT CGGTTAGCCT

AGCTGTGGTA TGCCTGTCCA GGTCGTATAA TCACCGCATA ATTCGACTCO 111 III II11 III 11 Mill I III 111111 1111111111 III1111111

TCGACACCAT ACCGACACGT CCAGCATATT AOTCGCOTAT TAAGCTCAGC

MO 170 190 190 90 CTCAAGGCGC ACTCCCGTTC CGGATAATGT TTTTTGCTCC CACATCATAA

mmiiii пинии hiiiiiiii iimimi iniinm

CAGITCCGCG TGAGGGCAAG GCCTATTACA AAAAACGAGG CTGTAGTATT

3102202 ЭО2402

CGGTTCCGCC AAATATTCTG AAATGAGCTG TTGACAЈTT4 ATCATCGAAC

mmmi iiimmi mmiiii mimm пинии

CCCAAGGCCG TTTATAAGAC TTTACTCGAC AACTGTTAAT TAGTAGCTTG

460270280 287

TAGTTAACTA GTACGCAAGT TCTCGTAAAA AGCGTAT-3

mmmi i mi 11 m mi i mi i и i им

AICAATTGAT CATGCGTTCA ACAGCATTTt TCCCATAGC-5

Таким образом, дл  построени  плазми- ды PRC около 2 мкг плазмиды рКС7 в 10 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 2 мкл 10Х буфера Clal (0,5 M NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,9, 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА) и 6 мкл воды. Около 3 мкл (около 10 единиц) рестрикцион- ного фермента Clal прибавл ют к раствору ДНК плазмиды рКС7, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Clal-переваренную ДНК плазмиды рКС7 осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Eco R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикцион- ного фермента Eco R I прибавл ют к раствору Clal-переваренной ДНК плазмиды рКС7 и полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С.

Eco R l-Clal-переваренную ДНК плазмиды рКС7 экстрагируют один раз фенолом и затем дважды хлороформом. Затем ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды, Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды рКС7 могут быть получены из работы Маниатиса и др., Молекул рное клонирование (Коулд Спринг Харбор Лабо- ратори, 1982, с.8).

Около 20 мкг плазмиды рТРА102 в приблизительно 20 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 10 мкл 10Х буфера Clal и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикци- онного фермента Clal прибавл ют к раствору ДНК плазмиды рТРА102, полученную реакционную смесь инкубируют при 37оС в течение 2 ч. Clal-переваренную ДНК плаз- миды рТРА102 осаждают этанолом и ресуспендируют в 10 мкл 10Х буфера Eco R I и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Eco RI прибавл ют к раствору Clal-переваренной ДНК плаз- миды рТРА102 и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.

Eco R l-Clal-переваренную ДНК плазмиды рТРА102 экстрагируют один раз фено- лом, нагружают нэ 7%-ный

0

5

0 5 0

5 0

5 0 5

полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока от других продуктов переваривани  не отделитс  рестрикционный фрагмент Eco R l-Clal размером около 288 пар оснований, который содержит trpPo. Данный рестрикционный фрагмент Eco R l-Clal размером около 288 пар оснований выдел ют из гел ; около 1 мкг желаемого фрагмента получают, суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ и прибавл ют к раствору Eco RI Clal-переваренной ДНК плазмиды рКС7, полученной, как описано выше. Около 2 мкл (около 1000 единиц) ДНК- лигазы Т4 затем прибавл ют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь дл  лигиро- вани  инкубируют при 16°С в течение 2 ч. Лигированна  ДНК составл ет требуемую ДНК плазмиды pRC.

Л игированную ДНК используют дл  трансформации компетентных клеток НВ101 К12 Е, coli в основном в соответствии с методикой примера 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, и ампициллинустойчивые трансформанты подвергают скринингу посредством анализа на рестрикционный фермент их плаз- мидной ДНК с тем, чтобы идентифицировать желаемые колонки Е. coli K12 HB101/pRC.flHK плазмиды pRC получают из трансформантов Е. coli K12 НВ101/pRC в основном в соответствии с методикой примера 1,

Около 2 мкг ДНК плазмиды pRC в 2 мкл буфера ТВ прибавл ют к 2 мкл 10Х буфера Hlndlll и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавл ют к раствору ДНК плазмиды pRC, полученную реакционную смесь икубируют при 37°С в течение 2 ч. Hindlll-переварен- ную ДНК плазмиды PR С осаждают этанол ом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера BamHI и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавл ют к раствору Hindlll-переварен- ной ДИК плазмиды pRC, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч.

BamHI-Hindlll-переваренную ДНК плазмиды pRC экстрагируют один раз фенолом и затем два раза хлороформом, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды. Приблизительно 4 мкг (в приблизительно 5 мкл буфера ТЕ) рестрикционного фрагмента Hindlll-BamHl размером около 2 kb плазмиды рТРА102 затем прибавл ют к раствору BamHI-Hindlll- переваренной ДНК плазмиды pRC. Около 2 мкл (около 100 единиц) Т4 ДНК-лигазы при- бав(л ют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение

2 ч. Лигированна  ДНК составл ет желаемую ДНК плазмиды рТРАЮЗ.

Дл  уменьшени  количества нежелательных трансформантов лигированную ДНК переваривают рестрикционным фер- ментом Ncol. который отрезает плазмиду pRC, но не плазмиду рТРАЮЗ. Таким образом переваривание лигированной ДНК ферментом Ncol, уменьшает количество нежелательных трансформантов, поскольку линеаризованна  ДНК трансформирует Е. coli с более низ кой частотой, нежели закрыта  кольцева  ДНК. Дл  переваривани  лигированной ДНК последнюю вначале осаждают этанолом и затем ресуспендиру- ют в 2 мкл 10Х буфера Ncol (1.5 М NaCI, 60 мМ трис-HCl, рН 7,8, 60 мМ MgCl2 и 2 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Ncol прибавл ют к раствору ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2

4при 37°С.

Лигированную, а затем Ncol-перева- ренную ДНК используют дл  трансформации Е. coli K12 RV308/NRRL 15624). Клетки RV308 К12 Е. coll делают компетентными и трансформируют в основном в соответствии с методикой примера 3. Трансформационную смесь высеивают на L-arap, содержащий 1000 мкг/мл ампициллина. Ампициллину- стойчивые трансформанты испытывают на чувствительность к канамицину, поскольку если плазмида pRC придает устойчивость к канамицину, то плазмида рТРАЮЗ не придает. Ампициллинустойчивые, канамицинчувстви- тельные трансформанты затем используют дл  получени  плазмидной ДНК, плазмидную ДНК исследуют анализом на рестрикцион- ный фермент с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coli K12 RV308/pTPA-103. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды рТРА-103 представлены на фиг.9. ДНК плазмиды рТРАЮЗ выдел ют из клеток Е. coli Kl2RV308/pTPA103 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 1.

В. Конструирование промежуточной плазмиды pBW25.

Около 1 мкг ДНК плазмиды рТРАЮЗ в 1 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 2 мкл 10Х бу- фера Bglll и 16 мкл воды. Около 1 мкл (около

5единиц) рестрикционного фермента Bglll прибавл ют к раствору ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Bglll-ne- реваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл 10Х буфера Кленова и 44 мкл воды. Около 1 мкл фермента Кленова (около 1 единицы) прибавл ют к раствору Bglll-переваренной

ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 2 ч. Обработанную ферментом Кленова Bglll-переваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 22 мкл воды.

Около 2 мкл (0,2 мкг) некиназированных линкеров (Нью Инглэнд Биолабс) последовательности

5 - CCATATGG - 5

З1 -GGTATACC-5

прибавл ют в раствор, обработанный ферментом Кленова, Bglll-переваренной ДНК плазмиды рТРАЮЗ вместе с 2 мкл (около 100 единиц) Т4 ДНК-лигазы и 1 мкл (около 2 единиц) Т4 РНК-лигазы и полученную смесь дл  реакции лигировани  инкубируют в течение ночи при 4°С. Лигированна  ДНК составл ет плазмиду рТРАЮЗ der Ndel, котора  в основном аналогична плазмиде рТРАЮЗ за исключением того, что плазмида рТРАЮЗ - der Ndel имеет последовательность распознавани  Ndel так, где плазмиды рТРАЮЗ имеет последовательность распознавани  Bglll.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации компетентных клеток Е, coll К12 RV308 в основном в соответствии с методикой , описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий ампициллин, и трансформанты Е. coli K12 RV308/pTPA103 der Ndel идентифицируют анализом нерестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды рТРАЮЗ - der Ndel выдел ют из трансформантов дл  использовани  в последующих построени х в основном в соответствии с методикой , описанной в примере 1.

Около 10 мкг ДНК плазмиды рТРАЮЗ der Ndel в 10 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 2 мкл 10Х буфера AVall (0.6 М NaCI, 60 мМ трис-HCl. рН 8, 0,1 М MgCIa, 60 мМ 2-мер- капроэтанола и 1 мкг/мл БСА) и 6 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента AVall прибавл ют к ДНК и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. AVall-переваренную ДНК нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до отделени  от других продуктов переваривани  рестрикционного фермента размером около 1,4 kb. Рестрикционный фрагмент AVall размером около 1,4 kb плазмиды рТРАЮЗ der Ndel выдел ют из гел , получа  при этом около 2 мкг желаемого фрагмента, которые суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 5 мкл ЮХ буфера Кпенова,35мкл воды и 5 мкл (около 5 единиц) фермента Кленова прибавл ют к раствору рестрикционного фрагмента AVall размером около 1.4

kb, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 30 мин. Кленов-об- работанную ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 14 мкл воды.

Около 2 мкг линкеров Нра последовательности

51 - CqiTAACG - 3

3 -GCAAfTGC-5

киназируют в основном в соответствии с методикой примера 2. Около 10 мкл кинази- рованных линкеров прибавл ют к раствору Кленов-обработанного рестрикциейного фрагмента AVall размером около 1,4 kb плазмиды рТРАЮЗ der Ndel вместе с 2 мкл (около 100 единиц Т4 ДНК - лигазы и 1 мкл) около 1 единицы Т4 ДНК-лигазы, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи.

Лигированную ДНК экстрагируют один раз фенолом, дважды хлороформом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Eco R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавл ют к раствору ДНК, полученную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Eco R l-переваренную ДНК экстрагируют один раз фенолом, дважды хлороформом , осаждают этанолом и ресуспендируют в 3 мкл 10Х лигазного буфера и 20 мкл воды. Фрагмент, имеющий около 770 пар оснований в размере и кодирующий trpPO и аминоконец тканевого активатора плазминогена человека (АПТ), имеет один Eco R l-совместимый конец и один тупой конец и его лигируют в Eco R l-Smal переваренную плазмиду PUCI с образованием плазмиды PUC19NPAFE.

Около 2 мкл плазмиды pUC19 (поставл етс  Бетесда Рисирч Лабораториез) раствор ют в 2 мкл 10Х буфера Smal (0,2 М KCI, 60 мМ трис-HCI, рН 8, 60 мМ MgCIa, 60 мМ 2-меркаптоэтанола и 1 мг/мл БСА) и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Smal прибавл ют к раствору ДНК, полученную реационную смесь инкубируют при 25°С в течение 2 ч. Smal переваренную ДНК плазмиды pUC19 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспендируют в 2 мкл 10Х буфера Eco R I и 16 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавл ют к раствору Smal-ne- реваренной ДНК плазмиды р(1С19, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Eco R l-Smal-ne- реваренную ДНК плазмиды pUC19 экстрагируют один раз фенолом, затем два раза хлороформом и ресуспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

Eco R l-Smal-переваренную ДНК плазмиды p(JC19 прибавл ют к раствору, содержащему тупоконечный рестрикционный фрагмент Eco R f размером около 770 пар

оснований, полученный из плазмиды рТРАЮЗ der Ndel. Около 2 мкл (около 1000 единиц)Т4 ДНК-лигазы прибавл ют к смеси ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Л игированна  ДНК составл ет желаемую плазмиду PU019TPAFE. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pUC19TPAFE представлены на фиг.9.

Многоклонирующий сайт плазмиды

pUC19 содержит последовательности распознавани  Eco R I и Smal, используемые при конструировании плазмиды pUC19TPAFE, расположен в пределах кодирующей последовательности дл  фрагмента

lacL2. Экспресси  фрагмента lacL2 в клетках, содержащих мутацию М15 Iac2, мутацию в гене lacL, который кодирует /3-галактозида- зу, позвол ет этим клеткам экспрессировать функциональную молекулу / -галактозидазы и тем самым позвол ет этим клеткам гидролизовать X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индо- лил- галактопиранозид, бесцветное соединение ) в его индиго-окрашенный продукт гидролиза. Инсерци  ДНК в многоклонирующий сайт плазмиды pUC19 мешает кодирующей последовательности дл  фрагмента 1ас21и клеткам с мутацией М151ас1 так,что хоз ин, например плазмида, не в состо нии гидролизовать X-Gal Лигированную ДНК,

котора  составл ет плазмиду pUC19TPAFE. используют дл  трансформации клеток Е. coll K12 RRI M15 (NRR LB-15440), которые делают компетентными дл  трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3.

Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина , 40 мкг/мл X-Gal и 1 мМ IPTG. Колонии, которые не про вл ют индиго-окраску, субкультивируют и используют дл  получени  плазмидной ДНК; трансформанты Е. coll К12 RRI AM15/pUC19TPAF E идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды

pUC19TPAF Е выдел ют из клеток Е. coli K12

RRI AM15/pUC19TPAF Е, дл  использованй   в пбШГбдую щйх пбст роёнй х в основном

в соответствии с методикой примера 1.

Около 7 мкг плазмиды pUC19TPAF E в

20 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 10 мкл 10Х буфера Hpal (0,2 М KCI. 0,1 М трис-HCI, рН 7,4 и 0,1 М MgCI2) и 70 мкл воды. Около 3 мкл (около 6 единиц) рестрикционного фермента Hpal прибавл ют в раствор ДНК плазмиды pUC19TPAF Е, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 20 мин; короткий период реакции предназначен дл  получени  частичного Hpal-перева- ривани . Реакционную смесь довод т до 150 мкл IX буфера BamHI (150 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, рН 8 и 10 мМ MgCl2, поднима  концентрацию соли, инактивирующую Hpal). Около 1 мкл (около 16 единиц) рестрикцион- ного фермента BamHI прибавл ют к раств о- ру частично-Нра1-переваренной ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 90 мин.

BamHI-частично-Н pal-переваренную ДНК плазмиды pUC19TPAF E концентриру- ют осаждением этанола, нагружают на 1,5%-ный агарозный гель и рестрикцион- ный фрагмент Hpal-BamHI размером околб 3,42 kb, содержащий репликон, ген /3-лак- тамазы и йсю АПТ-кодирующую ДНК плаз- миды pUCATPAF Е, выдел ют из гел  путем отрезани  сегмента гел , который содержит желаемый фрагмент, замораживан и  сег- мента и последующего выдавливани  жидкости из сегмента. ДНК осаждают из жидкости осаждением этанола. Около 1 мкг желаемого фрагмента получают и суспендируют в 20 мкл буфера ТЕ.

Около 10 мкг плазмиды рТРАЮЗ в 10 мкл буфера ТЕ раствор ют в 10 мкл 10Х буфера Scal-(1 M NaCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,4, и 60 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ и 1 мг/мл ВСА) и 80 мкл воды, Около 3 мкл (около 18 единиц) рестрикционного фермента Seal прибавл Ют к рае твору ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 90 мин при 37°С. Реакционный объем довод т до 150 мкл IX буфера BamHI и около 1 мкл (около 16 единиц ) рестрикционного фермента BamHI прибавл ют в смесь, которую затем инкубируют при 37°С в течение 90 мин. ДНК осаждают этанолом , собирают центрифугированием и ресуспендируют при получении дл  Электрофореза . Scal-BamHI-переваренную ДНК плаз- миды рТРА-103 нагружают на 1,5%-ный агарозный гель и подвергают электрофорезу до отделени  от других продуктов перев ар й ба- ни  рестрикционного фрагмента Scal-BamHI размером около 1,015 kb.

Данный рестрикционный фрагмент, содержащий АПТ-карбоксиконец-кодирую- щую ДНК плазмиды рТРАЮЗ, выдел ют из гел , получа  при этом около 0,5 мкг желаемого фрагмента, которые раствор ют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды.

Около 2 мкл рестрикционного фрагмента BamHI2Hpal размером около 3,42 kb плазмиды pUC19TPAF E прибавл ют в 2 мкл рестрикциОнно го фрагмента Scal-ВатНГ

размеромокЪлОТ,015 kb плазмиды рТРАЮЗ вместе с 2 мкл 10Х лигазного буфера и 1 мкл (около 1 единицы Вейса); лигаза получена из Промега Биотек, 2800 С.Фиш Хэтчери Роуд, Мэдисон, Биосконсин 53711/Т4 ДНК-лига- зы, и полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигированна  ДНК составл ет желаемую плазмиду pBW25. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pBW25 представлены на фиг.9.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации E. coll K12 I M105 (поставл ют их BRL), которые были сделаны компетентными дл  трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3 за исключением тогоГчто в методике используют 50 мМ CaCI2. Трансформированные клетки Вйс евают на В HI (Дифко Лабораториез, Детройт , Мичиган), содержащий 100 мкг/мл ампициллина, и транспорируют E. coll K12 IM105/pBW25, идентифицируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК. Переваривание плазмиды pBW25 pe- стрикционным ферментом Eco R I приводит к получению рестрикционных фрагментов размером 3,38 kb и около 1,08 kb. Плазмиду pBW25 получают дл  использовани  в дальнейших конструировани х в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 1.

С. Сайт-специфический мутагенез АПТ- кодирующей области и конструирование плазмиды pBW28.

Около 5 мкл плазмиды pBW25 в 10 мкл, дистиллированной через стекло воды прибавл ют к приблизительно 10 мкл 10Х реакционного буфера HindiII и 80 мкл воды. Около 1 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента Hlndlll прибавл ют к раствору ДНК плазмиды pBW25, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 90 мин. Около 3 мкл (около 24 единиц ) рестрикционного фермента Eco R I и 10 м кл ТМ трис-HCI, рН 7,6, прибавл ют в раствор Hindlll-переваренную ДНК плазмиды pBW25, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 90 мин при 37°С. Eco R l-Hlndlll-переваренную ДНК плазмиды pBW25 концентрируют осаждением этанола , нагружают на 1,5%-ный агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока реакционный фрагмент EcoRI-Hlndlll размером около 810 пар оснований не отделитс  от других продуктов переваривани . Около 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Eco R l-Hindlll размером около 810 пар оснований выдел ют из гел , приготавливают дл  лигировани  и ресуспендируют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды.

Около 4,5 мкг репликативной формы (РФ) ДНК М13тр8 (поставл етс  из Нью- Инглэнд Биолабс) в 35 мкл дистиллированной через стекло воды прибавл ют к 10 мкл 10Х буфера Hlndlll и 55 мкл воды. Около 1 мкл (около 20 единиц) рестрикционного фермента Hindlll прибавл ют к раствору ДНК М13тр8, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение часа. Около 3 мкл (около 24 единиц) рестрикционного фермента ЕсоР1иоколо 10мкл 1Мтрис-НС1. рН 7,6, прибавл ют к раствору Hlndlll-nepe- варенной М13тр8 ДНК, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение часа. Hindlll-EcoRI-переваренную М13тр8 ДНК собирают осаждением этанола , ресуспендируют в препарате дл  электрофореза в агарозном геле и большой рестрикционный фрагмент выдел ют гель- электрофорезом. Около 1 мкг большого рестрикционного фрагмента Eco R l-Hindlll ДНК М13тр8 получают и суспендируют в 20 мкл дистиллированной через стекло воды. Около 2 мкл большого рестрикционного фрагмента Eco R l-Hlndll N13 mp8, 2 мкл 10Х лигазного буфера, 12 мкл воды и около 1 мкл (около 1 единицы Вейса)Т4 ДНК-лига- зы прибавл ют в 3 мкл рестрикционного фрагмента Eco R l-Hlndlll размером около 810 пар оснований плазмиды pBW25, полученную смесь реакции лигировани  инкубируют при 16°С в течение ночи.

Клетки IM103 Е. coli, поставл емые фирмой BPL, делают компетентными итрансфе- цируют лигационной смесью в основном в соответствии с методикой, описанной в руководстве по дидезокси (секвенировани ) клонировани  М13 BRL за исключением того , что измен ют количество ДНК, используемой при трансфекции. Рекомбинатные бл шки идентифицируют инсерционной инактивацией гена, кодирующего о:-фрагмент/ -галактозидазы , что приводит к потере способности расщепл ть X-gal в его индиго-окрашенный продукт расщеплени . Дл  целей скрининга шесть белых бл шек собирают в 2,5 мл L-бульона, куда прибавл ют 0,4 мл IM103 К12 Е. coli, культивируют в минимальных средах с тем, чтобы гарантировать удерживание эписомы Г, котора  несет ,ргоАВ в фазе логарифмического роста, бл  ш косо держащие растворы инкубируют в воздушной качалке при 37°С в течение 8 ч. Клетки из 1,5 мл - аликвот осаждают и ДНК РФ (репликативной формы) выдел ют в основном в Соответствии с методикой щелочного минискринига, описанной Бернобоймом и Доули, 1979, Nuc, Acids Res. 7:1513. Оставшуюс  часть каждой культуры сохран ют при 4°С дл  попул ции. Желаемый фаг, обозначенный pM88W26, содержит рестрикционный фрагмент EcoRI-Hlndlll размером около 810 пар оснований плазмиды pBW25, лигиро- ванный к рестрикционному фрагменту Eco R

l-Hlnd ll размером около 7,2 kb M13 mp8.

Около50 мл IM103 Е. coli лог-фазы заражают рМ 8BW26 и инкубируют в воздушной качалке при 37°С в течение 18 ч. Зараженные клетки осаждают путем центрифугировани  с малой скоростью, односпиральную ДНК рМ8В W26 получают из культурального надосадочного сло  путем пропорционального увеличени  методики, приведенной в руководстве. Односпиральную pM8BW26

мутагенизируют в основном в соответствии сдоктриной Адельманаидр., 1983. ДНК2(3). с. 183-193, за исключением того, что реакцию Кленова осуществл ют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем при

37°С в течение 60 мин, затем при 10°С в течение 18 ч. Кроме того, обработку SI осуществл ют при 20°С, солева  концентраци  буферного раствора составл ет половину той, которую рекомендуют использовать изготовители и также примен ют праймер секвенировани  М13 (BRL). Синтетический олигодезоксирибонуклеотидный праймер.

30

543GGAA3TCO GAAATATCC CCTGOGGCCTG CA-3

используют дл  делеции кодирующей последовательности дл  аминокислотных остатков с 87 по 261 нативного АПТ.

Полученную мутагенезную смесь ис5 пользуют дл  трансфекции IM103 К12 Е. coli в основном в соответствии с описанной методикой заражени . Желаемые мутанты идентифицируют анализом на рестрикционный фермент ДНК РФ и секвенированием

0 ДНК по Максаму и Гилберту. Желаемый мутант , который имеет кодирующую последовательность дл  аминокислотных остатков с 87 по 261 делецированного нативного АПТ. обозначают pM8BW27.

5 Дл  построени  плазмиды pBW28 необходимо большое разнообразие ДНК-фрагмент . Первый из этих фрагментов получают путем прибавлени  около 20 мкг ДНК РФ pM8BW27 в 20 мкл дистиллированной через

0 стекло воды к 10 мкл 10Х буфера Ndll и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Ndll прибавл ют к смеси ДНК плазмиды pM8BW27, полученную реакционную смесь инкубируют

5 при 37°С в течение 2 ч, Ndll-переваренную ДНК плазмиды pM8BW27 осаждают этанолом , собирают центрифугированием и ресуспендируют в 10 мкл 10Х буфера EcoRI и 90 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента EcoRI прибавл ют к раствору Ndll-переваренной ДНК плазмиды pM8BW26, полученную реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С, Eco R l-Ndll-переваренную ДНК плазмиды pM8BW27 подвергают электрофорезу на агарозном геле до отделени  от других продуктов переваривани  рестрикционного фрагмента Ndel-Eco R I размером около 560 пар оснований, который содержит часть по- следовательнЬсти, кодирующей АПТ, котора  охватывает сайт делеции. Рестрикционный фрагмент Mdel-EcoRf размером около 560 пар оснований выдел ют из гел , получа  при этом около 0,5 мкг желаемого фрагмента, которые суспендируют в 20 мкг дистиллирован- ной через стекло воды.

Второй фрагмент, необходимый дл  построени  плазмиды pBW28, синтезируют (одну спираль одновременно) на автоматизированном ДНК-синтезаторе Две ком племен- тарные спирали, которые гибридизируют с образованием двухспирального сегмента ДНК с област ми перекрыти  Xbal и Ndel киназируют и ренатурируют в основном в соответствии с методикой примера 2. Линкер имеет следующую структуру

Xbal

5- CTAGAGGGTATTAATAATGTATCGA ТСС С АТА АТТАТТА С ATAG СТ

TTTAAATAAGGAGGAATAACA -3

AAATTTATTCCTCCTTATTGTAT.

Третий фрагмент, необходимый дл  построени  плаЗмиды pBW28, получают путем прибавлени  около 20 мкг плазмиды рТРА- 103 в 20 мкл буфера ТЕ к 10 мкл 10Х буфера BamHI и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавл ют к раствору ДНК плазми- ды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI-переваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспёндируют в 10 мкл 10Х буфера Eco R I и 80 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавл ют к раствору BamHI- переваренной ДНК плазмиды рТРАЮЗ, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI- Eco R l-переваренную ДНК плазмиды рТРАЮЗ нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока не отделитс  от других продуктов перевари- вани  рестрикционный фрагмент Eco R I- BamHl размером около 689 пар оснований, который содержит последовательность, кодирующую карбокси-конец АПТ. Около 0,5 мкг фрагмента размером около 689 пар оснований выдел ют из гел  и затем ресуспёндируют в 10 мкл дистиллированной через стекло воды.

Последний фрагмент, необходимый дл  построени  плазмиды pBW28, выдел ют из плазмиды pL110, конструирование которой раскрываетс  в примере 9. Около 25 мкг плазмиды в 25 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 10 мкл 10Х буфера Xbal (0,5 М NaCt, 60 мМ трис-HCI, рН 2,9. 60 мМ MgCl2 и 1 мг/мл БСА) и 55 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Xbal прибавл ют к раствору ДНК плазмиды pL110, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2ч.ХЬа -переварен- ную ДНК плазмиды осаждают этанолом, собирают центрифугированием и ресуспёндируют в 10 мкл 10Х буфера BamHI и 89 мкл воды. Около 1 мкл (около 5 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавл ют к раствору Xbal-переваренной ДНК плазмиды pL110, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин с получением частичного BamHI-nepe- варивани . Xbal - частично - BamHI - переваренную ДНК плазмиды pL110 нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока от других продуктов переваривани  не отделитс  фрагмент Xbal-BamHI размером около 6 kb. Рестрикционный фрагмент Xbal-BamHI размером около 6 kb выдел ют из гел , получа  при этом около 0,5 мкг рестрикционного фрагмента Xbal-BamHI размером около 6 kb, которые суспендируют в приблизительно 40 мкл дистиллированной через стекло воды. Этот рестрикционный фрагмент Xbal- BamHI размером около 6 kb содержит всю плазмиду pLHO за исключением ВК-ВСН- кодирующей ДНК.

Дл  построени  плазмиды pBW28 следующие фрагменты смешивают друг с другом: около 0,1 мкг (около 8 мкл) рестрикционного фрагмента BamHI-Xbal размером около 6 kb плазмиды pL110, около 0.5 мкг (около 2 мкл) рестрикционного фрагмента Ndei-Eco R I размером около 560 пар оснований плазмиды pM8-BW27, около 0.1 мкг (около 2 мкл) рестрикционного фрагмента Eco R l-BamHI размером около 689 пар оснований плазмиды рТРА-ЮЗ, а также около 0,02 мкг (около 1 мкл) синтетического линкеры Xbal-Ndel размером около 45 пар оснований. Около 2 мкл 10Х лигазного буферного раствора и 1 мкл (около 1 единицы Вейса)ДНК-лигазы Т4 прибавл ют к смеси ДНК, полученную смесь реакции лигировани  инкубируют при 4°С в течение ночи, Лигированна  ДНК составл ет желаемую плазмиду pBW28 Ректрикционный сайт и функциональна  карта плаз- миды pBW28 представлены на фиг.10.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации клеток ММ294 К12 Е. coll (NRRL В-15625), которые делают компетентными в основном в соответствии с методикой , описанной в примере 3 за исключением того, что в методике используют 50 мМ СаСЬ. Вследствие присутстви  л мбда-pL- промотора и гена, кодирующего температур- но-чувствительный л мбда-pL-penpeccop на плазмиде pBW28, методику трансформации и культивирование трансформантов измен ют некоторым образом. Клетки не подвергают воздействию температуры свыше 32°С во врем  трансформации и последующего культивировани . Искомые трансформанты E.coll К12 MM294/pBW28 идентифицируют по их тетрациклинустойчивому, ампициллинчувст- вительному фенотипу и путем анализа на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК.

Д. Окончательное конструирование плазмиды pBW32,

Приблизительно 10 мкг ДНК плазмиды pSV2- / -глобин (NRRL B-15928) раствор ют в 10 мкл 10Х реакционного буферного раствора Hindlll, 5 мкл (около 50 единиц) ре- стрикционного фермента Hindlll и 85 мкл воды, реакционную смесь помещают на 2 ч при 37°С. Затем реакционную смесь довод т до концентрации 0,15 М в LICI и после прибавлени  2,5 объема этанола и инкубации в ванне с сухим льдом и этанолом ДНК осаждают центрифугированием.

Осадок ДНК после центрифугировани  раствор ют в 10 мкл 10Х буфера Bglll, 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BglH и 85 мкл воды, реакционную смесь инкубируют в течение 2 ч при 37°С. После Bglll-переваривани  реакционную смесь нагружают на 0,85%-ный агарозный гель и фрагменты раздел ют электрофорезом. Гель визуализируют с использованием бромида этиди  и ультрафиолетового света и полосу, содержащую желаемый фрагмент Hindlll-Bglll размером около 4,2 kb, отрезают от гел , как описано, Осадок ресуспенди- руют в 10 мкл воды и получают около 5 мкг желаемого рестрикционного фрагмента Hindlll-Bglll размером около 4,2 kb плазмиды pSV2-/3 -глобин. Рестрикционный фрагмент Hlndlll-BamHI размером около 2 kb плазмиды рТРАЮЗ, который кодирует АПТ, выдел ют из плазмиды рТРАЮЗ в основном в соответствии с вышеприведенными положени ми . Около 5 мкг рестрикционного фрагмента Hindlll-BamHI размером около 2

kb плазмиды рТРАЮЗ получают, суспендируют в 10 мкл воды и сохран ют при -20°С. 2 мкл рестрикционного фрагмента Bglll-Hindlll размером около 4,2 kb плазмиды pSV2- ft -глобин и 4 мкл фрагмента Hlndlll-BanHI размером около 2kb плазмиды рТРАЮЗ смешивают друг с другом и затем инкубируют с 2 мкл 10Х лигазного буфера, 11 мкл воды и 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (около 500

0 единиц) при 4°С в течение ночи. Лигирован- на  ДНК составл ет искомую плазмиду рТРА301. Лигированную ДНК используют дл  трансформации клеток RRI K12 Е. coli (MRRL В-15210), которые делают компетентными

5 дл  трансформации в основном в соответствии с методикой примера 3. Плазмидную ДНК получают из трансформантов Е. coli K12 RRI/pTPA301 в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт

0 и функциональна  карта плазмиды рТРА301 представлены на фиг. 10.

Плазмида р5У2-дгфр содержит ген ди- гидрофол тредуктазы (дгфр), пригодный дл  селекции трансформированных эукариоти5 ческих клеток и амплификации ДНК, кова- лентно св занной с геном дгфр. 10 мкг плазмиды р5 /2-дгфр, выделенной из Е. coli К12 HBIOI/pSV-2-дгфр, АТСС 37146, смешивают с 10 мкл 10Х буфера PVUII, 2 мкл

0 (около 20 единиц) рестрикционного фермента PVUII и 88 мкл воды, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию завершают экстракци ми фенолом и хлороформом, после чего PVUI 1-перева5 ренную ДНК плазмиды рЗУ2-дгфр осаждают и собирают центрифугированием.

Линкеры BamHI (5 - CCCATCCCG -3 ) киназируют и подготавливают дл  лигиро- вани  следующим образом. К 1 мкг линкера

0 в 5 мкл воды прибавл ют 10 мкл 5Х солей киназы 300 мМ трис-HCI, рН 7,8, 50 мМ MgCI2 и 25 мМ (ДТТ), 5 мкл 5 мМ АТФ, 5 мкл БСА(1 мг/мл), 5 мкл 10 мМ спермидина, 19 мкл воды и 1 мкл полинуклеотидкиназы (10

5 единиц/мкл). Эту реакционную смесь затем инкубируют при 37°С в течение 60 мин и сохран ют при -20°С. 5 мкл (около 5 мкг) PVUII-переваренной плазмиды рУ2-дгфр и 12 мкл (околоО,25мкг)киназированных лин0 керов BamHI смешивают и инкубируют при 16оС в течение ночи вместе с 11 мкл воды. 2 мкл 10Х лигазного буфера и 1 мкл (около 1000 единиц) ДНК-лигазы Т4.

10 мкл 10Х реакционного буфера

5 BamHI, 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI и 48 мкл воды прибавл ют в смесь реакции лигировани , которую затем инкубируют при 37°С в течение 3 ч, Реакционную смесь нагружают на 1%-ный агарозный гель и искомый фрагмент размером около 1,9 kb, содержащий ген дгфр, выдел ют из гел . Все прибавлени  линкеров, осуществл емые в данном примере, очищают традиционным образом на агарозном геле с тем, чтобы уменьшить веро тность присутстви  многолинкерных последовательностей в конечном векторе. Полученный фрагмент в количестве около 3 мкг суспендируют в 10 мкл буфера ТЕ.

Затем приблизительно 15 мкл (около 1 мкг) плазмиды рТРА-301 переваривают ре- стрикционным ферментом BamHI, как указано выше. Поскольку существует уникальный сайт BamHI в плазмиде рТРА301, данное BamHI-переваривание генерирует линейную ДНК плазмиды рТРА301. BamHI-переварен- ную плазмиду рТРАЮЗ осаждают этанолом и ресуспендируют в 94 мкл и фосфатазируют с использованием 1 мкл тел чьекишечной щелочной фосфатазы (Коллаборатив Рисерч, Инк., 128 Спринг Стрит, Лексингтон, Минне- сета 02173) и 5 мкл 1 М трис-HCI, рН 9, при 65°С в течение 45 мин. ДНК экстрагируют фенол: хлороформом, затем экстрагируют хлороформ: изоамиловым спиртом, осаждают этанолом и ресуспендируют в 20 мкл воды . 10 мкл (около 0,25 мкг) фосфатазированной плазмиды рТРАЗО прибавл ют к 5 мкл BamHI, дгфр-генсодер- жащего рестрикционного фрагмента (около 1,5 мкг), 3 мкл 10Х лигазного буфера, 3 мкл (около 1500 единиц) ДНК-лигазы Т4 и 9 мкл воды. Эту смесь реакции лигировани  инкубируют при 15°С в течение ночи; лигирован- на  ДНК составл ет желаемую ДНК плазмиды рТРАЗОЗ.

Плазмиду рТРАЗОЗ используют дл  трансформации Е. coli K12 RRI (NRRL В- 15210), полученные трансформанты Е. coli К12 RRI/рТРАЗОЗ идентифицируют по их ампициллинустойчивому фенотипу и анализом на рестрикционный фермент их плаз- мидной ДНК. Плазмиду рТРАЗОЗ выдел ют из трансформантов в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды рТРАЗОЗ представлены на фиг. 10.

Дл  выделени  рестрикционного фрагмента Eco R l-Bglll размером около 2,7 kb, который кодирует репликон рВ R 322 и ген /3-лактамазы из плазмиды рТРА301, около 10 мкг плазмиды рТРА301 переваривают в 400 мкл полного реакционного объема с использованием 20 единиц рестрикционного фермента Bglll в IX буфера Bglll при 37°С. После Bglll-переваривани  концентрацию трис-HCI довод т до 110 мМ и 20 единиц рестрикционного фермента Eco R I прибавл ют к Bglll-перевэренной ДНК

Данную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Eco R l-Bglll-ne- реваренную ДНК нагружают на агарозный гель и подвергают э л ёктрофорезу до тех 5 пор, пока рестрикционный фрагмент Eco R l-Bglll размером около 3,7 kb не отделитс  от других продуктов переваривани , после чего фрагмент размер ом около 2,7 kb выдел ют и подготавливают дл  лигировани . 0 Дл  выделени  рестрикционного фрагмента , содержащего ген дгфр, плазмиду рТРАЗОЗ подвергают двойному перевариванию рестрикционными ферментами Hindlll Eco R I, в результате чего выдел ют и вос5 станавливают рестрикционный фрагмент Eco R l-Hindlll - размером около 2340 пар оснований, который содержит указанный ген дигидрофол тредуктазы.

Дл  выделени  рестрикционного фраг0 мента Hlndlll-Sstl размером около 2 kb плазмиды рТРАЗОЗ, который содержит область кодировани  карбокси-конца тканевого активатора плазминогена человека и промотор SV40. плазмиду рТРАЗОЗ подвер5 гают двойному перевариванию рестрикционными ферментами Hindlll и Sstl в IX буфере Hindlll. Фрагмент размером около 1,7 kb выдел ют из гел  и подготавливают дл  лигировани .

0 Дл  выделени  рестрикционного фрагмента Xholl (совместимого дл  лигировани  с областью перекрыти  Bgl(ll)-Sstl) размером около 680 пар оснований плазмиды pBW28, который содержит область кодиро5 вани  аминоконца модифицированного АПТ, около 10 мкг плазмиды pBW28 переваривают ферментом Xholl в IX буфере Xholl (0,1 М трис-HCI, рН 8, 0,1 м MgCl2, 0,1% тритон X - 100 и 1 мг/мл БСА),

0 Xholl-переваренную ДНК извлекают осаждением этанола и затем переваривают ферментом Sstl. Xholl-Sstl-переваренную ДНК нагружают на акриламидный гель и желаемый фрагмент выдел ют из гел  и под5 готавливают дл  лигировани .

Около 0,1 мкг каждого из указанных фрагментов: рестрикционного фрагмента Eco R l-Bglll размером около 2,7 kb плазмиды рТРА301, рестрикционного фрагмента

0 Eco R l-Hindlll размером около 2,34 kb плазмиды рТРАЗОЗ, рестрикционного фрагмента Sstl-Hindlll размером около 1,7 kb плазмиды рТРАЗОЗ и рестрикционного фрагмента Sst l-Xholl размером около 0,68 kb плазми5 ды pBW28 лигируют вместе с образованием плазмиды pBW32. Лигационную смесь используют дл  трансформации Е. coli K12 ММ293, как описано в примере 3 за исключением того, что в методике используют 50 мМ СаС12. Трансформанты идентифицируют

по их ампициллинустойчивому фенотипу и анализом на рестрикционный фрагмент их плазмидной ДНК. ДНК плазмиды pBW32 получают из трансформантов Е. coll K12 MM294/pBW32 в основном в соответствии с методикой примера 1. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pBW32 представлены на фиг.10.

П р и м е р 17. Конструирование плазмид pLPChd 1 и pLPChd 2.

Около 20 мкг плазмиды pBW32 в 20 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 10 мкл 10Х буфера Bam HI и 60 мкл воды. Около 10 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента BamHI прибавл ют к раствору ДНК плазмиды pBW32, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. BamHI-ne- реваренную ДНК плазмиды pBW32 осаждают этанолом, собирают центрифугированием и суспендируют в 5 мкл 10Х буфера Кленова, 45 мкл воды и 2 мкл (около 100 единиц ) фермента Кленова. Реакционную смесь инкубируют при 1б°С в течение 30 мин, затем реакционную смесь нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до полного разделени  продуктов переваривани . Обработанный раствором Кленова BamHI-рестрикционный фрагмент размером около 1,9 kb плазмиды pBW32. содержащий ген дгфр, выдел ют из гел  и подготавливают дл  лигировани  в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 12А. Около 4 мкг искомого фрагмента получают и суспендируют в 5 мкл буфера ТЕ.

Около 200 мкг плазмиды pLPChyg 1 в 100 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 15 мкл 10Х буфера Eco R I и 30 мкл воды. Около 5 мкл (около 50 единиц) рестрикционного фермента Eco R I прибавл ют к раствору ДНК плазмиды pLPChyg 1, полученную реакционную смесь инкубируют при 37оС в течение 10 мин. Короткий период реакции рассчитывают дл  получени  частичного Eco R l-nepe- варивани . Плазмида pLPChyg 1 имеет два рестрикционных сайта Eco RI, один из которых находитс  в пределах кодирующей последовательности гена, придающего устойчивость к гидромицину (HmR), и желательно инсерцировать дгфр-генсодержащий рестрикционный фрагмент в сайт Eco RI плазмиды pLPChyg 1, который не содержитс  в гене дгфр. Частично - Eco R I - переварен-, ную ДНК плазмиды pLPChyg 1 нагружают на агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока отрезанна  ДНК плазмиды pLPChyg 1 не отделитс  от неотрезанной плазмидной ДНК и других продуктов переваривани . Отрезанную ДНК выдел ют из гел  и подготавливают дл  лигировани  в основном в соответствии с методикой примера 12А. Около 2 мкг Eco R I - отрезанной плазмиды pLPChyg 1 получают и суспендируют в 25 мкл буфера ТЕ. К данной пробе прибавл ют около 5 мкл (около 25 единиц)

фермента Кленова, 5 мкл 10Х буфера Кленова и 40 мкл воды, полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение 60 мин.Кленов - обработанную, частично - Есо RI - переваренную ДНК затем экстрагируют

0 дважды фенолом и затем один раз хлороформом , осаждают этанолом и ресуспенди- руют в 25 мкл буфера ТЕ.

Около 5 мкл Кленов - обработанного рестрикционного фрагмента ВатН1размером

5 около 1,9 kb плазмиды pBW32 и около 5 мкл Eco R I - разрезанной ДНК плазмиды pLPChyg 1 смешивают друг с другом, в смесь ДНК прибавл ют 1 мкл ЮХлигазного буфера, 5 мкл воды, 1 мкл (около 500 единиц) Т4 ДНК0 лигазы и 1 мкл (около 2 единиц) Т4 ДНК-лига- зы и полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Лигиро- ванна  ДНК составл ет искомую плазмиду pLPChyg 1 и искомую плазмиду pLPChyg2, ко5 торые отличаютс  друг от друга только в отношении ориентации фрагмента размером около 1,9 kb, который содержит ген дгфр.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации клеток Е. coli K12 НВ101,

0 которые делают компетентными дл  трансформации в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, ампи5 циллинустойчивые трансформанты анализируют анализом на рестрикционный фермент их плазмидной ДНК с тем, чтобы идентифицировать трансформанты Е. coli K12 НВ101 (pLPChdl иЕ-. coli K12 НВ101) pLPChd2. Дл 

0 целей данного раскрыти  плазмиду pLPChdl обозначают плазмидои pLPChd. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды pLPChd представлены на фиг. 11. ДН К плазмиды р LPChd 1 и pLPChd2

5 выдел ют из соответствующих трансформантов в основном в соответствии с методикой примера 1.

Пример 8. Конструирование плэзми- ды phd.

0 Дл  конструировани  плазмиды phd необходимо получить ДНК плазмиды pLPChdl, используемую в качестве исходного материала при конструировании плазмиды phd из клеток хоз ина Е. coli, которые не содержат

5 аденинметилазу, такую, котора  кодируетс  геном dam, продукт которого метилирует адениностаток в последовательности 5 - GATC З1 . Ecoli K12 GM48 (NRRL В- 15725) не содержит функциональную dam-мё- тилазу и поэтому представл ет собой

пригодный хоз ин Дл  использований Qe- л х получени  ДНК плазмиды pl PChdl, примен емой в качестве исходного материала при конструировании плазмиды phd.

Клетки Ё. coli K12 GM48 культивируют и делают компетентными дл  трансформации , плазмиду pLPChygl используют дл  трансформации клеток Е coll K12 GM48 в основном в соответствии с методикой, описанной в примере 3. Трансформирование клетки высевают на L-arap, содержащий ампициллин и как только ампициллинустойчи- вые трансформанты Е. coli K12 GM48/ - pLPChdl образуют колонии, одну такую колонию используют дл  получени  ДНК плаз- миды pLPChdl в основном в соответствии с методикой примера 1 Около 1 мг ДНК плазмиды pLPChdl получают и суспендируют в приблизительно 1 мл буфера ТЕ

Около 2 мкг ДНК плазмиды pLPChdl в 2 мкл буфера ТЕ прибавл ют к 2 мкл 10Х буфера BCI1 (750 мМ KCI, 60 мМ трис-HCI, рН 7,4,100 мМ MgCl2,10 мМ ДТТ и 1 мг/мл БСА) и 14 мкл воды. Около 2 мкл (около 10 единиц) рестрикционного фермента BCII прибавл - ют к раствору ДНК плазмиды pLPChdl, полученную реакционную смесь инкубируют при 50оС в течение 2 ч Реакцию прекращают экстрагированием смеси oflViri раз фенолом и два раза хлороформом

Около 1 мкл ВСИ - переваренной ДНК плазмиды pLPChdl прибавл ют к 2 мкл 10Х лигазного буфера, 8 мкл воды и 1 мкл (около 50 единиц) Т4 ДНК-лигазы Смесь реакции лигировани  инкубируют при 16°С в тече- ние ночи и лигированна  ДНК составл ет искомую плазмиду phd. Плазмида phd происходит в результате делецИи дополнителШШ линкеров ВСИ, которые присоедин ютс  Тзо врем  конструировани  плазмиды pLPea и двух смежных рестрикционных фрагментов ВСИ, имеющих общий размер около 1,45 kb от плазмиды pLPChdl. Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды phd представлены на фиг.11. Плазмида phd со- действует экспрессии любой ДНК-последовательности из энхансера вируса ВК-позднего промотора аденовируса в соответстви с1 йа сто щим изобретением, поскольку экспресси- руема  ДНК легко поддаетс  инсерцйи в правильном положении дл  экспрессии в единственном сайте BCI на плазмиде phd.

Лигированную ДНК используют дл  трансформации Е. coli K12 GM48 в основном в соответствии с методикой, описанной в приме- ре 3. Трансформированные клетки высевают на L-arap, содержащий ампициллин- и ампи- циллинустойчивые трансформанты Е. coll K12 GM48 (phd идентифицируют анализом на рё- стрикационный фермент их плазмидной ДНК).

При мер 19 Конструирование плазмиды pH1-HD.

Плазмида рСН2А5 содержит фрагмент кДНК, который кодирует вариабельную область т желой цепи мышиного монокло- нального антитела KS1/4, присоединенный к фрагменту геномной ДНК, который кодирует человеческую посто нную область т желой цепи иммуноглобулина Е. coli K12 ММ294/рСН2А5 можно получить из Нор- зерн Риджионал Рисерч Лаборатори под депозитарным HONfep tiM NRRL В-18360 Рестрикционный сайт и функциональна  карта плазмиды рСН2А5 представлены на фиг.13 прилагаемых чертежей. Плазмидную ДНК экстрагируют из культуру в основном в соответствии с методикой примера 1, за исключением того, что температура инкубации составл ет 37°С.

Около 10 мкг плазмиды рСН2А5 разрезают рестрикционным ферментом Eco R I в основном в соответствии с методикой примера 5. ДНК обрабатывают Кленовым и ликерами BamHI (поставл ютс  Нью Инглэнд Биолабэ) и затем прибавл ют в основном в соответствии с методикой примера 2, ДНК переваривают рестрикционным ферментом BamHI в основном в соответствии с методикой примера 5. Рестрикционный фрагмент BamHI-Eco R l/BamHI размером около 7,4 kb затем выдел ют из агарозного гел  в основном в соответствии с методикой примера 12. Данный фрагмент затем лигируют в ВСИ - переваренный вектор phd в основном в соответствии с методикой примера 2. ДНК затем трансформируют в Е. coll, повторно выдел ют, плёзмиду с правильной ориентацией (доказываемой фрагментом Maell -Stu2 размером около 780 пар оснований ) обозначают плазмиды pHI-HD.

П р и м е р 20. Конструирование трансформантов эукариотных клеток хоз ев векторов экспрессии.

Насто щие векторы экспрессии содержат энхансер ВК. Энхансер ВК стимулирует экспрессию гена в присутствии генного продукта Е1 А. Поскольку клетки 293 существенно экспрессируют генный продукт Е1А, клетки 293 представл ют собой эффективный хоз ин и дл  векторов эукариотической экспрессии насто щего изобретени . Клетки 293  вл ютс  клетками человеческой первичной почки, трансформированными аденовирусом типа 5 (следует отметить, что в способе насто щего изобретени  может быть использован любой тип аденовируса с тем, чтобы обеспечить получение генного продукта Е1А), и они доступны из АТСС под flenosnYapHbiM номером С RL 1573. Однако векторы экспрессии насто щего изобретени  функционируют в широком круге клеток хоз ина, даже если генный продукт Е1А от- сутствет. Кроме того, генный продукт Е1А может быть интродуцирован в не-Е1А-про- дуцирующую клеточную линию либо трансформацией вектором, который содержит ген Е1А, либо разрезанной аденовирусной ДНК, либо путем заражени  аденовирусом.

Описанна  ниже методика трансформации касаетс  клеток 293 в качестве линии клеток хоз ина, однако методика как правило приемлема дл  большинства линий эука- риотических клеток. Клетки 293 получают из АТСС под депозитарным номером CRL1573 в 25 мм2 колбе, содержащей конфлюентный монослой около 5,5 хЮ6 клеток в минимальной питательной среде игл с 10%-ной термо- инактивированной лошадиной сывороткой. Колбу инкубируют при 37°С, среду мен ют дважды в неделю. Клетки субкультивируют путем удалени  среды, промывки раствором сбалансированных солей Хэенка (Гибко), прибавлени  0,25%-ного трипсина в течение 1-2 мин, промывки свежей средой, аспирации и розлиаа в новые колбы при соотношении субкультивации 1:5 или 1:10.

За один день до трансформации клетки высевают при 0,7 хЮ6 клеток на чашку. Среду мен ют за 4 ч до трансформации. Стерильную , этанолосажденную плазмидную ДНК, растворенную в буфере ТЕ, используют дл  получени  2Х ДНК-СаС1-раствора, содержащего 40 мкг/мл ДНК и 250 мМ CaCl2 2Х HBS, получают содержащим 280 мМ Nad, 50 мМ HepeS и 1,5 мМ фосфат натри , при этом рН раствора довод т до 7,05 -7,15. Раствор 2Х ДНК-СаСг прибавл ют по капл м к равному объему стерильного 2Х HBS, 1 мл стерильную пластмассовую пипетку с хлопчатобумажной пробкой вставл ют в смесительную пробирку, котора  содержит 2Х HBS, и пузырьки ввод т продувкой при одновременном прибавлении ДНК. Кальций фосфатный ДНК-осадок образуют без перемешивани  в течение 30- 40 мин при комнатной температуре.

Затем осадок смешивают путем отсасывани  пипеткой, использу  пластмассовую пипетку, и 1 мл (на чашку) осадка прибавл ют непосредственно к 10 мл питательной среды, котора  oxBaYbmaef рёпйциентныё клетки. Через 4 ч инкубировали при 37°С среду замен ют DMEM с 10%-ной сывороткой плода коровы и клетки инкубируют 72 ч перед подачей селективного давлени . Дл  плазмид, которые не содержат селектируемый маркерГфункцио нйрующий в эукариот- ных клетках, методика трансформации включает смесь плазмид: вектора экспрессии , который не содержит се лёктируемый

маркер, и вектора экспрессии, который содержит селектируемый маркер, функционирующий в эукариотных клетках. Эта методика совместной трансформации позвол ет осуществить идентификацию клеток , содержащих обе трансформирующие плазмиды.

Дл  клеток, зараженных плазмидами, содержащими ген, придающий устойчи0 вость к гигромицину, гигромицин прибавл ют в питательную среду до конечной концентрации около 200-400 мкг/мл. Затем клетки инкубируют при 37°С в течение 2-4 недель при замене сред с 3-4-дневными

5 интервалами. Полученные гиромицину- стойчивые колонии перенос т в отдельные колбы с культурами дл  определени  характеристик . Выбор неомицин (G418 также используют вместо неомицина) - устойчивых

0 колоний осуществл ют в основном в соответствии с методикой отбора дл  гигроми- цинустойчивых клеток за исключением того, что неомицин прибавл ют до конечной концентрации 400 мкг/мл, а не гигромицин.

5 Клетки 293  вл ютс  дгфр-положительны- ми, так что трансфоманты 293, которые содержат плазмиды с геном дгфр, не отбирают просто на основании дгфр - положительного фенотипа, что  вл етс  способностью ра0 сти в средах, не содержащих гипоксантин и тимин. Линии клеток, которые не содержат функциональный ген дгфр и которые трансформированы дгфр-содержащими плазмидами , могут быть отобраны на основании

5 фенотипа дгфр+.

Использование гена дигирофол т ре- дуктазы (дгфр) в качестве селектируемого маркера дл  введени  гена или плазмиды в линию клеток, лишенных дгфр. и последую0 щее использование метотрексата дл  амплификации числа копий плазмиды хорошо известно в литературе. Хот  использование дгфр в качестве селектируемого и амплифи- цируемого маркера в дгфр-продуцирующих

5 клетках еще не исследовано достаточно, можно предположить на основе литературных данных, что дгфр можно использовать в качестве селектируемого маркера в дгфр- продуцирущих клетках и дл  генной амплифи0 кации. Использование насто щего изобретени  ограничиваетс  селектируемым маркером. Более того могут быть использованы амплифицируемые маркеры. Такие, как гены металлотионеина, гены аденозиндеами5 назы или члены многогенустойчивого семейства , например, Р-гликопротеид. В клетках 293 выгодно осуществл ть трансформацию вектором, который содержит селектируемый маркер, такой, как ген. придающий устойчивость к гигромицину В, а затем амплификацию

с использованием метотрексата, который не может быть испрльзован дл  селекции мышиных дгфр - содержащих плазмид в клетках 293.

Лини  клеток AV12 (АТСС С RL9595) трансформируетс  в основном в соответствии с методикой, описанной дл  клеток 293. Клетки AV12 также существенно экспресси- руют продукт гена Е1А и  вл ютс  предпочтительным хоз ином дл  эукариотичесКйх векторов экспрессии насто щего изобретени . Однако в отличие от клеток 293 клетки AV12 непосредственно отбирают метотрек- сатом (200-500 нМ) при трансформации вектором , содержащим мышиный ген дгфр. Дл  экспрессии т желой цепи необходимо трансформировать клетки AV12 любым вектором экспрессии, который кодирует т желую цепь. Однако т жела  цепь не будет секретировать в надосадочный слой, если клетки AV12 не будут совместно трансформироватьс  вектором, кодирующим лёгкую цепь. Легкие цепи будут секретировать из клеток хоз ина после трансформации вектором , кодирующим легкие цепи. Таким образом , путем совместной трансформации и селекции клеток AV12 экспрессированы различные комбинации легких и т желых цепей. Дл  исследовани  получени  полностью собранного секретируемого иммуноглобулина необходимо таким образом исследовать присутствие секретируемой т желой цепи.

Пример21. Исследование получени  иммуноглобулина.

Метотрексатустойчивые трансформанты , полученные в примере 17, выращивают на 100 м чашках дл  культивировани  тканевой культуры при плотности несколько сотен клеточных клонов на чашку дл  культивировани  тканевой культуры. Среды декантируют и клетки промывают дважды 5 мл-аликвотами раствора сбалансированных солей Хэнка (Гибко). Раствор стерильного 0,45%-ного агара (агароза типа 4 Сигма, каталожный номер А3643, Сигма Кемикал Ком- пани, P.O. Бокс 14508, Сент-Луис, Мисмури 63178) получают смешиванием 1 мл 1,арного агара (47оС) с 3 мл Дульбекко модифицированной соли Игл (Д М Е) (Гибко) (37°С) и 2 мл этого 0,45%-ного агарового раствора наслаивани  вокруг клеток.

Нитроцеллюлозные фильтры (Шлейшер энд Шуелл, Инк., Киин, Нью-Гемпшир 03431) кип т т и затем автоклавируют 2 ч дл  удалени  смачивающего вещества, которое  вл етс  токсичным дл  клеток. Фильтры затем помещают поверх агарового сло  и после удалени  пузырьков воздуха чашки инкубируют при 37°С в течение 1 -3 ч. Фильтры , ранее меченые дл  того, чтобы указать

первоначальную ориентацию фильтра на чашке с тем, чтобы облегчить дальнейшую идентификацию колонии, затем снимают и помещают и PBS (50 мМ трис-HCI, рН 7,2 и 5 150 мМ NaCI).

Дл  сохранени  клеток на чашке жизнеспособными во врем  анализа фильтров клетки покрывают слоёМ смеси объемом 8 мл, содержащей 2 мл 1,8%-ного агара (47°С), 2 мл

0 солей ОМЕ(37°С)и4мл солей ДМЕ с20%-ной сывороткой плода коровы (37°С). Клетки затем помещают в инкубатор при 37°С.

Все промывки и реакции, осуществл емые в отношении фильтров, провод т в тот

5 момент, когда фильтры наход тс  на качающейс  платформе. Фильтры вначале блокируют инкубированием при комнатной температуре в 5%-ном молоке в pBS. Затем фильтры промывают (5 мин промывка) четы0 ре раза в PBS, 10 мкг/мл биотинилирован- ного козлиного античеловеческого т желоцепного (Вектор Лабораториез, Инк., 30 Ингоулд Rd., Берлингэйм, Калифорни  94010) в 2,5%-ном бычьем сывороточ5 ном альбумине прибавл ют к фильтру (в достаточном количестве с тем, чтобы покрыть фильтр), который затем инкубируют при 37°С в течение 1 ч.

Поликлональное антитело можно пол0 учить методом, описанным в структурных концепци х в иммунологии и иммунохимии Е.А.Кабатом; опубликованы в 1968 году Хол- том, Ринехартом и Уинстоном. Моноклональ- ное антитело, которое также пригодно дл 

5 использовани  в анализе, можно получить, как раскрыто в работе Кеглера и Милстейна, 1975, Нэйчур, 256, 495 или, как раскрыто в патенте США № 4696895, Европатенте № 205046; Лауреллом и др., 1985, FEBS 191/1):

0 75, Сузуки и др., 1985, J. Biochem 97:127-138 и Европатенте № 138222. Авидин Д и биоти- нилированную пероксидазу ложечницы приморской (HR Р), используемые в анализе, получают в оборудовании Вектастаин ТМ

5 (вектор Лабораториез, Инк.). Биотин также получают из Вектор Лабораториез, Инк.

Фильтры промывают четыре раза PBS при 4°С. Затем получают авидин D и биоти- нилированную пероксидазу ложечницы

0 приморской и прибавл ют, как описано в руководстве изготовителей в оборудовании Вектастаин ТМ (Вектор Лабораториез, Инк). Фильтры инкубируют HRP-сопр женным авидином D в течение 1 ч при 4°С (более

5 длительные периоды инкубировани , т.е. в течение ночи, могут быть использованы в том случае, когда секретирует небольшое количество протеина); затем фильтры промывают 4 раза в PBS при 4°С.

Дл  про влени  индикаторного цвета на фильтрах около 30 мг HRP - цветопро в- л ющего реагента (4-хлор-1 -нафтол, Сигма), растворенного в охлажденном на льду 100%-ном метаноле прибавл ют к 50 мл PBS и 30 мкл 30%-ного раствора НаОа. Эту смесь прибавл ют к нитроцеллюлозным фильтрам, которые инкубируют при комнатной температуре до про влени  цвета. Колонии , секретирующие наибольшую часть антитела изобретени , отмечаютс  на фильтрах не только посредством наиболее раннего по влени  цвета, но также посредством более темных п тен на фильтре.

После по влени  цвета фильтры вновь перегруппируют с первоначальными чашками дл  определени  того, какие колонии ассоциируютс  с какими п тнами на фильтре. Колонии, секретирующие большую часть антитела , затем отбирают и используют дл  получени  антитела.

Специалист поймет, что приведенный анализ  вл етс  только иллюстративным атрибутом способа идентификации высоко- секретирующих линий клеток. В способе можно также использовать целый р д методик анализа, например реакцию двойного

антитела можно использовать таким образом , что бмотинилированное козлиное античеловеческое т желоцепочечное антитело замещают козлиной античеловеческой т - желой цепью (IgG) и биотинилированным антикозлиным IgG антителом.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ экспрессии цепей химерного антитела, заключающийс  в том, что конст- руируют рекомбинантную плазмидную ДНК pPI-HD, кодирующую вариабельную область т желой цепи антитела RSI/4-антиге- на с аминокислотной последовательностью

   Gln Ile «л V.I Gin Чет Gly ProGlu leu Lyi

   Lys Pro Cly Glu Thr V.I ly. He Ser Cyt Lys AlaSer Cly Tyr

   Thr Phe Thr Asc T/r Gly Met A.n Trp V.I ly, GinThe Pro Gly

   Ly. Gly Leu Ly Trp Met Gly Trp lie Ala Thr TyrThr Gly Olu

   Pro Thr Tyr Al« Aip Phe Lyt Oly Ar| Phe AltPhe Ser Leu

   Clu Tbr Ser Al. Ser Thr Al. Phe Leu Gin lie GinGin Pro Gin

   Asn Met Arg Tbr Met Al. Thr Tyr Phe Cyi V.I ArgPhe lie Ser

   Lye Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser V.I ThrV.I Ser Ser

   полученной плазмидой трансформируют штамм культивируемых эмбриональных клеток почки человека, зараженных вирусом типа 5, и культивируют.

   PvuII

   PstI

   tern HI

   CH2AS1G3

   Eco RI I -45Јbp

   Bam HI СН2А5Ю4-

   EcoRI

   -458 bp

   Hind ПЬ

   -7ССОЬр

   Hindni

   -eocobp

   PvuII

   . 2.

   Bam HI

   1780541

   Hind II

   Ao

   Xbal

   НраП PvuII

   PvuII Bam HI

   Pvu II Bam HI

   Xbal

   PvuII

   PvuII

   Фиг.З

   StuI

   SstI

   Ace I

   stul /| Shi I

   Hindm Bglll

   P

   PstI

   Hind III

   Pvu ll Hind III

   Bglll

   f.5

   SstI

   PvuII

   Hind III SstI

   Slul Pvu II

   c° RI .Hind III EcoRI Kpnl

   Bgln PstI PvuH Smal PvuII PstI

   Hpal

   Bam HI EcoRl PvuU

   Bglll Hind III

   Ndol- /( N-Hindm

   AccIStuI Bell

   PstI

   JI 1 Bell

   Stul Stul/Pvull . Stu I

   1780541

   EcoRI PstI

   Bam HI

   EcoRI

   PstI

   Bam HI

   Hind III

   Фиг 6

   ГУ

   Г

   Bam HI/RI Bgl III Bam HI

   Hlndm I/Bam H;

   Bell

   J4de I/Bam HI

   /

   -:Hindm

   Eco

   Pvull

   Bell Hind III Bell

   Stu I/Pvu П Stu I/Bam HI

   Bgfll pLPChd

   Bgtn

   Bam HI/RI

   BsmHI

   Hind Ш R I/Bam HI

   Nde I/Cam HI

   Bell

   -Bell

   -SluI/Pvu П

   SluI/BsmHI

   oR Hindm -513 bp

   Mae II

   -GAA ATA AAA CGT ЈrЈ I L-Glu lie Lys Arg

   Ec°1Rl/H:ndm 513bp Mae II

   r GAA ATA AAA GGT

   EcoRl lle 1У8 G|y

   Ndal

   CHKC2 ia

   Фиг 12

   EcoRI

   I -432 bp

   Mae III Hind III

   Bam HI

   CH2A5

   PstI

   TT Eco RI P™11 I -458 bp

   HinciHI

   -5700 bp

   EcoRl

   -513 bp

   39 II

   5S4bp

   Bgll

   EcoRI

   PGKC2310

   EcoRl 435bp Мэе III

   -1,133 bp

   EcoRl

   pG2A52

   Й/г. /4