BR112020001255A2 - composições imunogênicas de neisseria meningitidis - Google Patents

Abstract

Composições imunogênicas são divulgadas, as quais incluem microvesículas de Neisseria meningitidis, tais como vesículas de membrana externa (OMV) e/ou bolhas, a partir de PorA-PorB- Neisseria, tal como PorA-PorB-RmpM- Neisseria meningitidis. Estas composições imunogênicas são úteis para induzir uma resposta imune a Neisseria, incluindo Neisseria meningitidis e Neisseria gonorreia.

Description

“COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS DE NEISSERIA MENINGITIDIS” REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADOEste pedido reivin- dica o benefício do Pedido Provisório U.S. No 62/535.627, depositado em 21 de Julho de 2017, o qual é incorporado neste relatório à título de referência.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[002]Este relatório refere-se às composições imunogênicas compreendendo microvesículas de membrana externa, que incluem vesículas de membrana externa (OMVs) e/ou bolhas, a partir de PorA-PorB- Neisseria, tais como PorA-PorB-RmpM- Neisseria (N.) meningitidis, que são úteis para induzir uma resposta imune a Neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae.

FUNDAMENTOS

[003]Neisseria é um gênero de bactérias Gram-negativas que colonizam as superfícies da mucosa de muitos animais. Existem onze espécies que colonizam se- res humanos, das quais duas, N. meningitidis e N. gonorrhoeae, são patogênicas. N.

meningitidis é o agente causador de meningite e septicemia meningocócica. N. gonor- rhoeae é o agente causador de gonorreia. Os genomas de pelo menos dez das espé- cies de Neisseria foram completamente sequenciados.

[004]As doenças causadas por N. meningitidis e N. gonorrhoeae são proble- mas de saúde significantes em todo o mundo; o controle destas doenças por meio do desenvolvimento de vacinas meningocócicas e gonocócicas é uma prioridade da sa- úde pública. Entretanto, o desenvolvimento de vacinas tem sido desafiador.

[005]N. meningitidis continua sendo uma causa significante de morbidez e mortalidade globais, apesar da disponibilidade de vacinas polissacarídicas capsulares (Ps) específicas do sorogrupo A, C, W e Y. A doença pode ser causada por cepas meningocócicas do sorogrupo B (MenB), que, no Estados Unidos representam um terço de todas as infecções invasivas por N. meningitidis e 60 % daquelas em bebês

(Prevention, C.f.D.C.a., (2015) Meningococcal Disease. In: Epidemiology and Preven- tion of Vaccine-Preventable Diseases. J. Hamborsky, A. Kroger & C. Wolfe (eds). Wa- shington, D.C.: Public Health Foundation, páginas 231 a 246). Diferentemente dos outros sorogrupos meningocócicos, a cápsula de MenB é deficientemente imunogê- nica (Wyle et al. (1972). J Infect Dis 126: 514 a 521), um resultado de sua semelhança a uma porção Ps polissialilada presente em células neurais humanas (Finne et al.

(1987) J Immunol 138: 4402 a 4407). Os esforços para o projeto de vacina se concen- tram na identificação de antígenos subcapsulares, incluindo proteínas de membrana externa (OMPs) expressadas na superfície. Entretanto, permanece uma necessidade quanto a vacinas adicionais. Além disso, N. gonorrhoeae é uma bactéria não encap- sulada e, atualmente, não existem vacinas gonocócicas eficazes. Permanece uma necessidade quanto às composições adicionais que podem ser usadas para induzir uma resposta imune a N. meningitidis e N. gonorrhoeae.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[006]Divulgadas são PorA-PorB-RmpM- Neisseria (N.) meningitidis isoladas (também chamadas ∆PorA∆PorB∆RmpM) e composições incluindo uma quantidade eficaz de microvesículas de membrana externa (tais como OMVs e bolhas) produzidas a partir destas PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis. Também divulgados são métodos para usar estas composições para induzir uma resposta imune a Neisseria, tal como N. meningitidis e N. gonorrhoeae.

[007]Também divulgados são métodos para induzir uma resposta imune a N.

gonorrhoeae em um mamífero. Estes métodos incluem administrar ao mamífero uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade eficaz de microvesículas a partir de PorA-PorB- N. meningitidis e um portador farmaceuticamente aceitável, desse modo, induzindo a resposta imune a N. gonorrhoeae.

[008]As características anteriores e outras características e vantagens da in- venção tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias formas de realização que prosseguem com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[009]FIGS. 1A a 1B. Construção de mutantes de deleção da proteína de mem- brana externa (OMP). A. A deleção apropriada das principais porinas meningocócicas PorB e PorA nas cepas de deleção isogênica de OMP, conforme confirmado por dot blot com anticorpos monoclonais Z15 específicos de PorB e P7 específicos de PorA (mAbs), respectivamente (painel superior). A deleção de rmpM é confirmada por PCR (painel inferior). rmpM (seta) indica a presença do produto de gene de ~1,35 kb e chl (seta), o cassete de resistência a cloranfenicol de ~1,5 kb introduzido durante a re- combinação homóloga dupla. B. O gel de SDS-PAGE pigmentado com Coomassie de OMVs confirma a deleção de PorA e PorB e não revela grandes rupturas na expressão da proteína não relacionada. Um aumento em PorA para a deleção única de PorB ΔB e para a deleção dupla de PorB/RmpM ΔBR é detectável. ΔA, ΔB e ΔR são indicativos da deleção de PorA, PorB e RmpM, respectivamente, onde múltiplas letras indicam múltiplas deleções. Os dados são representativos de dois experimentos independen- tes.

[010]FIGS. 2A a 2C. A deleção de OMP diminui a ligação de anticorpos espe- cíficos de PorB e altera a formação de complexos de OMP contendo PorB. A. A dele- ção de PorA e RmpM diminui a capacidade de OMVs inibirem a ligação de mAb Z15 específico de PorB a PorB recombinante (rPorB) MC58 em um ELISA competitivo (painel esquerdo). Quando fracionado por eletroforese em gel nativo azul (BNGE) e transferido para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF), Z15 se liga a todas as OMVs contendo PorB, embora a deleção de rmpM isoladamente (ΔR) ou em combinação com porA (ΔAR) induza a formação de um único complexo contendo PorB dominante que é de menor peso molecular (MW) do que o tipo selvagem (WT) (painel direito). B. Entre as OMVs contendo PorA, apenas ΔR exibe a ligação diminu-

ída do P7 mAb específico de PorA em ELISAs competitivos em rPorA (painel es- querdo). ΔB e ΔBR são caracterizado por formação de quatro grandes complexos contendo MW PorA (painel direito). C. O fracionamento de OMVs, seguido por visua- lização com coloração de Coomassie (painel superior) ou de prata (painel inferior), demonstra a presença de bandas dominantes únicas representativas de complexos de OMP para cada um dos mutantes de deleção. Os quatro mutantes de deleção porB (ΔB, ΔAB, ΔBR, ΔABR) exibem a maior alteração no perfil de bandas do complexo de OMP. Os números se correlacionam com complexos analisados por espectrometria de massas na Tabela 2. As bandas visualizadas por coloração de prata que são ob- servadas em OMVs obtidas a partir de múltiplos tipos de OMV são indicadas por setas.

Para ELISAs em A e B, os dados representam a média ± SEM de duplicatas de ≥3 experimentos independentes. * acima de cada ponto representa significância estatís- tica em relação a WT OMVs, onde # indica P < 0,0001 para ligação a todas as outras OMVs em relação ao WT. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 por ANOVA bilateral com pós-teste de múltiplas comparações de Tukey. NS = não signi- ficante. Os géis e immunoblots são representativos de pelo menos 2 experimentos independentes.

[011]FIGS. 3A a 3C. As cepas de deleção de PorB exibem defeitos no cresci- mento. A. Curva de crescimento de cepas de deleção de MC58 OMP. ΔA e ΔB cres- cem em uma taxa equivalente ao WT no caldo TSB. Todas as outras cepas exibem um defeito leve, mas estatisticamente significante no crescimento em relação às ou- tras. As cepas deletadas para a expressão de porB produzem menos (B) e menores (C) unidades formadoras de colônia (CFUs) em relação às outras cepas. A diferença nas contagens de UFC não é significante até a fase exponencial/estacionária tardia (8 h de crescimento). Os dados representam a média ± SEM de duplicatas de ≥3 expe- rimentos independentes. ****P < 0,0001 por ANOVA bilateral com pós-teste de múlti- plas comparações de Tukey. C é representativo de dois experimentos independentes.

[012]FIG. 4. O alinhamento ClustalW (MUSCLE, EMBL-EBI) dos tipos PorB da cepa WT MC58 (SEQ ID NO: 38) e a cepa isogênica OCh deficiente de PorA (SEQ ID NO: 39). Os tipos de PorB MC58 e OCh exibem homologia de sequência de ami- noácidos em L1 variável e L2-L3 estruturais. L4-L8 variáveis são heterólogas. L1-L8 representam as oito alças de PorB expostas à superfície.

[013]FIGS. 5A a 5D. Todos os antígenos de OMV induzem os anticorpos IgG séricos capazes de se ligar a múltiplas cepas meningocócicas. A. Esquema de imuni- zação de coelho para estudo da vacina OMV deficiente de PorA. Amostras sanguí- neas pré-imunes foram coletadas no primeiro dia de imunização (Dia 0) e duas sema- nas após a segunda (Dia 28) e terceira (Dia 56) imunizações. As amostras também foram coletadas no final do experimento (Dia 84) e avaliadas quanto à presença de anticorpos específicos para meningococos em relação às amostras pré-imunes em ELISAs de células totais (B-D). Para B-D, a marcação acima do gráfico indica a cepa usada para revestir ELISAs de células totais. A marcação numérica (B1-B16) repre- senta a amostra sérica obtida a partir de cada um dos 16 coelhos imunizados. A mar- cação abaixo da barra indica o antígeno imunizante para cada um dos soros. BEXSERO® e PBS apenas com adjuvante de hidróxido de alumínio foram usados como controles positivos e negativos, respectivamente. Os dados representam a mé- dia ± SEM de duplicatas de ≥3 experimentos independentes. *P < 0,0001 por ANOVA bilateral com pós-teste de múltiplas comparações de Tukey.

[014]FIG. 6. A deleção de OMP seletiva acentua as respostas de anticorpo de proteção cruzada. Os soros obtidos a partir de cada um dos coelhos imunizados com um dos seis antígenos OMV (WT, ΔA, ΔAB, ΔAR, ΔABR, OCh) ou com os antígenos controle positivo (BEXSERO®) ou negativo (PBS) foram inativados por calor e avalia- dos quanto à capacidade de matar cepas meningocócicas do tipo selvagem MC58 (barra preta), Cu385 (barra branca), BB1350 (barra diagonal), Ch501 (barra horizon-

tal) e BB1473 (barra quadriculada) na presença de soro humano (fonte de comple- mento). Os únicos dois antígenos que foram capazes de induzir respostas de anticor- pos bactericidas a partir dos dois coelhos imunizados que foram capazes de matar todas as cinco cepas testadas foram aqueles deletados para a expressão de PorA e PorB (ΔAB e ΔABR). A marcação numérica (B1-B16) representa a amostra sérica ob- tida a partir de cada um dos 16 coelhos imunizados. A marcação abaixo da barra indica o antígeno imunizante para cada um dos soros. A linha tracejada representa o limite de morte (equivalente a 2 vezes os títulos), onde os títulos >4 vezes (aqueles ascendentes acima da linha tracejada) se correlacionam com as respostas protetoras da vacina. Os títulos representados simbolizam os títulos de anticorpos séricos a partir do soro de sangria final subtraído para títulos de soro pré-imune.

[015]FIGS. 7A a 7B. As respostas de anticorpo de proteção cruzada se corre- lacionam com a imunogenicidade de proteínas de alto MW. Os lisatos celulares totais das cepas MenB MC58, Cu385, BB1350, Ch501 e BB1473 foram fracionados por in- termédio de SDS-PAGE e manchados para membranas de nitrocelulose. Os lisatos depois foram sondados com soros terminais obtidos a partir de cada um dos 16 coe- lhos imunizados para identificar as proteínas meningocócicas imunogênicas. Os antí- genos dominantes na preparações de WT OMV (setas) também são observados como fortemente imunogênicos nos antígenos mutantes únicos PorA (ΔA e OCh) e no con- trole positivo BEXSERO®, que, como o WT, expressa PorA, PorB e RmpM. Os anti- corpos séricos que são capazes de matar todas as cepas meningocócicas testadas em ensaios bactericidas (ΔAB e ΔABR) não possuem ligação a estas bandas e, em vez disso, exibem ligação de bandas de alto MW.

[016]FIG. 8. Esquema de imunização/colonização de camundongos. Os ca- mundongos foram imunizados com 12,5 µg OMVs/hidróxido de alumínio em três in- tervalos de quatorze dias. Três semanas depois da terceira imunização, os camun-

dongos receberam um coquetel de antibióticos para depletar a flora natural e β-estra- diol para facilitar o estadiamento do ciclo estral. Os animais depois foram intravaginal- mente inoculados com ~1,5 x 106 CFUs de cepa gonocócica F62. As lavagens vagi- nais foram coletadas nos dias 1, 3, 5, e 7 pós-inoculação para monitorar as contagens de UFC e anticorpos vaginais.

[017]FIGS. 9A a 9B. A imunização com OMV acentua a depuração gonocócica in vivo. A. Após a imunização, os camundongos foram inoculados com a cepa gono- cócica F62 e monitorados durante um período de uma semana para depuração de colonização. Os camundongos imunizados com OCh (quadrados abertos) ou ΔABR OMVs (triângulos fechados para cima) exibiram uma diminuição estatisticamente sig- nificante na densidade de colonização em 7 dias pós-infecção (d.p.i.), conforme ava- liado por ANOVA bilateral (negrito na tabela, onde P < 0,05). n representa o tamanho da amostra por grupo, onde os animais não colonizados dos vinte primeiros inocula- dos não foram incluídos no estudo. B. Densidades de colonização de F62 para ca- mundongos individuais em todo o curso do estudo. Por 7 d.p.i., a densidade média de colonização para camundongos imunizados OCh OMV e ΔABR OMV é equivalente a 0 UFC/ml, enquanto a densidade mediana para animais imunizados MC58 OMV é 60 UFC/ml. Os controles imunizados e não imunizados com alume permanecem ampla- mente colonizados. As barras representam mediana ± faixa interquartil de densidade de colonização. *P < 0,05 e **P < 0,01 pelo teste U de Mann-Whitney.

[018]FIG. 10. Os anticorpos presentes nos soros agrupados a partir de ca- mundongos imunizados com OCh OMV e ΔABR OMV se ligam às únicas proteínas de alto MW que não são ligadas por anticorpos séricos a partir de camundongos imu- nizados com MC58 OMV. Os lisatos celulares totais de cepa gonocócicas FA19, FA1090, MS11 e F62 foram fracionados por SDS-PAGE e manchados para nitrocelu- lose. Os lisatos da cepa meningocócica parental usados para criar os antígenos OMV, MC58, também foram fracionados como um controle. Os soros foram agrupados a partir de todos os vinte animais em cada grupo após a terceira imunização e foram usados para sondar os lisatos para a ligação de anticorpos séricos. Os anticorpos séricos a partir de animais imunizados com OCh OMV e ΔABR OMV ligaram proteínas únicas de ~70 kDa e ~90 kDa que não foram ligadas por soros a partir de animais imunizados com MC58 OMV (setas). Os anticorpos séricos a partir de camundongos controle imunizados com hidróxido de alumínio não exibiram ligação.

[019]FIGS. 11A a 11B. Análise ClustalW (MUSCLE, EMBL-EBI) dos tipos de PorB quiméricos produzidos. L1-L8 representa as alças expressadas na superfície.

São mostrados OCh (SEQ ID NO: 39), M(1-4)C(5-8)(SEQ ID NO: 40), M(1-6)C(7-8) (SEQ ID NO: 41), M(1-4)C(5-6)M(7-8) (SEQ ID NO: 42), C(1-4)M(5-8) (SEQ ID NO: 43), C(1-6)M(7-8)(SEQ ID NO: 44), C(1-4)M(5-6)C(7-8) (SEQ ID NO: 45), M(1-4)B(5- 8) (SEQ ID NO: 46), M(1-6)B(7-8) (SEQ ID NO: 47), M(1-4)B(5-6)M(7-8) (SEQ ID NO: 48), B(1-4)M(5-8) (SEQ ID NO: 49), B(1-6)M(7-8) (SEQ ID NO: 50) e B(1-4)M(5-6)B(7- 8) (SEQ ID NO: 51). A porção N-terminal de cada sequência é mostrada no painel A e a porção C-terminal da sequência é mostrada no painel B.

SEQUÊNCIAS

[020]As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos listadas neste relatório são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeos e có- digo de três letras para aminoácidos, conforme definido em 37 C.F.R. 1.822. Apenas uma fita de cada sequência de ácidos nucleicos é mostrada, mas a fita complementar é entendida como incluída por qualquer referência à fita exibida. A Listagem de Se- quências é enviada como um arquivo de texto ASCII no formato do arquivo nomeado “Sequence.txt” (47 kb), que foi criado em 16 de Julho de 2018, o qual é incorporado à título de referência neste relatório. Na listagem de sequências anexa: SEQ ID NOS: 1 a 37 são a sequência de ácidos nucleicos de iniciadores.

SEQ ID NOS: 38 a 51 são as sequências de aminoácidos de proteínas PorB.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS VÁRIAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

[021]N. meningitidis é uma bactéria Gram-negativa e o agente causador de meningite meningocócica e septicemia. Seu único hospedeiro conhecido é o ser hu- mano e pode ser portado de forma assintomática por aproximadamente 10 % da po- pulação (Caugant et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32 323). N. meningitidis pode expres- sar uma cápsula de polissacarídeo e isto permite a classificação das bactérias, de acordo com a natureza da cápsula expressada. Existem pelo menos doze sorogrupos de N. meningitidis: A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y e Z, dos quais os sorogrupos A, B, C, Y e W causam 90 % da doença meningocócica (Poolman et al. (1983) Infect Immun 40: 398 a 406, Infect. Agents and Dis. 4 13). As vacinas polissacarídicas cap- sulares dirigidas contra os sorogrupos A, C, Y e W estão disponíveis; as vacinas sub- capsulares para a prevenção da doença sorogrupo B estão disponíveis, mas nao al- vejam todos os sorotipos e não fornecem proteção cruzada contra N. gonorrhoeae.

[022]Divulgadas neste relatório são as composições que incluem PorA-PorB- RmpM- N. meningitidis isolada. A PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis isolada pode ser o sorogrupo A, B ou C, ou qualquer outro sorotipo. As composições imunogênicas podem ser produzidas, as quais incluem microvesículas de membrana externa a partir destes PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis, tais como bolhas e/ou OMVs, e um portador farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, estes portadores farmacêuticos tam- bém podem incluir um adjuvante. Opcionalmente, as microvesículas podem incluir uma proteína heteróloga.

[023]Também é divulgado neste relatório que as composições farmacêuticas, incluindo um PorA-PorB- Neisseria meningitidis, tal como um PorA-PorB-RmpM- N. me- ningitidis, são úteis na indução de uma resposta imune em um indivíduo. A resposta imune pode ser uma resposta imune protetora ou uma resposta imune terapêutica.

[024]Em algumas formas de realização, o indivíduo apresenta uma infecção por N. meningitidis e a administração da composição imunogênica aumenta a depu-

ração da Neisseria meningitidis. Em outras formas de realização, o indivíduo apre- senta uma infecção por N. gonorrhoeae e a administração da composição imunogê- nica aumenta a depuração de N. gonorrhoeae. Em formas de realização adicionais, o mamífero é um indivíduo saudável. Em formas de realização adicionais, o mamífero é um ser humano. Em algumas formas de realização, a resposta imune é uma resposta imune protetora. Em outras formas de realização, a resposta imune é uma resposta terapêutica.

[025]Em mais formas de realização, os métodos são divulgados para incluir uma resposta imune a Neisseria gonorrhoeae em um mamífero. Estes métodos in- cluem administrar ao mamífero uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade eficaz de microvesículas de membrana externa a partir de PorA-PorB- N. meningitidis e um portador farmaceuticamente aceitável, desse modo, induzindo a resposta imune a Neisseria gonorrhoeae. Em algumas formas de realização, o PorA- PorB- N. meningitidis é RmpM-. As microvesículas podem ser vesículas de membrana externa, bolhas ou uma combinação das mesmas. Em exemplos não limitantes espe- cíficos, a N. meningitidis é o sorogrupo A, B ou C. Opcionalmente, a composição imu- nogênica ainda inclui um adjuvante.

[026]Em alguns exemplos não limitantes, o indivíduo apresenta uma infecção por Neisseria gonorrhoeae e a administração da composição imunogênica aumenta a depuração da Neisseria gonorrhoeae. Em outros exemplos não limitantes, o mamífero não apresenta uma infecção por Neisseria gonorrhoeae ou Neisseria meningitidis. Em qualquer um dos métodos divulgados, o mamífero pode ser humano.

[027]Em outras formas de realização, as composições são divulgadas neste relatório, as quais incluem PorB geneticamente modificadas que são combinações recombinantes quiméricas de duas ou mais PorB a partir de N. meningitidis. Sequên- cias de aminoácidos de PorB recombinantes quiméricas exemplares são mostradas nas FIGS. 11A a 11B. Moléculas de ácidos nucleicos podem ser produzidas, as quais codificam estas PorB quiméricas recombinantes. Uma N. meningitidis isolada que in- clui uma ou mais entre estas proteínas é PorB+. Uma PorA-PorB- N. meningitidis iso- lada não inclui uma destas proteínas PorB recombinantes quiméricas.

RESUMO DOS TERMOS

[028]A menos que de outro modo observado, os termos técnicos são usados, de acordo com a utilização convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes X, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2009; e Meyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Wiley-VCH em 16 volumes, 2008; e outras re- ferências similares. Conforme usado neste relatório, as formas no singular “um”, “uma” e “o”, “o” referem-se tanto ao singular quanto ao plural, a menos que o contexto indique de outro modo. Por exemplo, o termo “um antígeno” inclui antígenos únicos ou plurais e pode ser considerado equivalente à frase “pelo menos um antígeno”. Conforme usado neste relatório, o termo “compreende” significa “inclui”. Ainda deve ser enten- dido que quaisquer e todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos, são aproximados e são fornecidos para propósitos descritivos, a menos que de outro modo indicado. Embora muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório possam ser usados, métodos e materi- ais adequados particulares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o presente re- latório descritivo, incluindo explicações de termos, prevalecerá. Além disso, os mate- riais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretender ser limitantes. Para facilitar a revisão das várias formas de realização, as seguintes explicações de termos são fornecidas:

[029]Administração: Introdução de uma composição em um indivíduo por uma via escolhida. A administração pode ser local ou sistêmica. Por exemplo, se a via es-

colhida for intranasal, a composição é administrada por meio da introdução da com- posição nas passagens nasais do indivíduo. Similarmente, se a via escolhida for in- tramuscular, a composição é administrada por meio da introdução da composição em um músculo do indivíduo. Se a via escolhida for oral, a composição é administrada por meio da ingestão da composição pelo indivíduo. Vias exemplares de administra- ção de uso nos métodos divulgados neste relatório incluem, mas não são limitadas à vias orais, injeção (tal como subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), sublingual, retal, transdérmica (por exemplo, tópica), intranasal, vagi- nal e inalação.

[030]Substituição de aminoácidos: Substituição de um aminoácido em um po- lipeptídeo por um ou mais aminoácidos diferentes. No contexto de uma sequência de proteínas, uma substituição de aminoácidos também é referida como uma mutação.

[031]Anticorpo: Uma imunoglobulina, fragmento de ligação ao antígeno ou de- rivado da mesma, que se liga especificamente a e reconhece um analito (antígeno), tal como um antígeno em uma microvesícula (tal como uma vesícula de membrana externa (OMV) ou bolha) de Neisseria meningitidis. O termo “anticorpo” é usado neste relatório no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não limitadas aos anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos mul- tiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, con- tanto que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada. Exemplos não limitan- tes de anticorpos incluem, por exemplo, imunoglobulinas intactas e variantes e frag- mentos das mesmas que conservam a afinidade de ligação para o antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não são limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’- SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Os fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de ligação ao antígeno produzidos pela modificação de anticorpos totais ou aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante (veja, por exemplo, Kontermann e Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1 a 2, 2a Ed., Springer Press, 2010).

[032]Proteína Quimérica: Uma proteína quimérica, também chamada de pro- teína híbrida, que inclui porções da proteína a partir de duas fontes diferentes. Uma PorB quimérica inclui porções da PorB a partir de duas fontes diferentes, tais como uma porção a partir de N. meningitidis e uma porção a partir de N. gonorrhoeae, ou uma porção a partir de dois sorogrupos diferentes, tais como o sorogrupo A, B, C, Y e W-135. Em uma forma de realização, as porções diferentes podem ser N-terminais e C-terminais. Em outras formas de realização, domínios específicos, tais como alças, são substituídos pela proteína a partir de uma fonte diferente.

[033]Controle: Um padrão de referência. Em algumas formas de realização, o controle é uma amostra controle negativo obtida a partir de um paciente saudável. Em outras formas de realização, o controle é uma amostra controle positivo obtida a partir de um paciente imunizado com uma microvesícula (tal como uma vesícula de mem- brana externa (OMV) ou bolha) de Neisseria meningitidis. Ainda em outras formas de realização, o controle é um controle histórico ou valor de referência padrão ou faixa de valores (tal como uma amostra controle previamente testada, tal como um grupo de pacientes com prognóstico ou resultado conhecido, ou grupo de amostras que re- presentam o valor de referência ou valores normais).

[034]Uma diferença entre uma amostra de teste e um controle pode ser um aumento ou, reciprocamente, uma diminuição. A diferença pode ser uma diferença qualitativa ou uma diferença quantitativa, por exemplo, uma diferença estatisticamente significante. Em alguns exemplos, uma diferença é um aumento ou diminuição, em relação a um controle, de pelo menos cerca de 5 %, tal como pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 100

%, pelo menos cerca de 150 %, pelo menos cerca de 200 %, pelo menos cerca de 250 %, pelo menos cerca de 300 %, pelo menos cerca de 350 %, pelo menos cerca de 400 %, pelo menos cerca de 500 %, ou mais do que 500 %.

[035]Variante degenerada: No contexto da presente divulgação, uma “variante degenerada” refere-se a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que inclui uma sequência que é degenerada como um resultado do código genético. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais é especificada por mais do que um códon.

Portanto, todas as sequências de nucleotídeos degeneradas que codificam um peptí- deo são incluídas contanto que a sequência de aminoácidos do peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos não seja modificada.

[036]Quantidade eficaz: Uma quantidade de agente, tal como um imunógeno, tal como uma microvesícula de N. meningitidis, que é suficiente para induzir uma res- posta desejada, tal como uma resposta imune em um indivíduo. Deve ser entendido que obter uma resposta imune protetora contra um organismo de interesse pode exigir múltiplas administrações de um imunógeno divulgado e/ou administração de um imunógeno divulgado como o “principal” em um protocolo de reforço inicial em que o imunógeno de reforço pode ser diferente do imunógeno principal. Consequentemente, uma quantidade eficaz de um imunógeno divulgado pode ser a quantidade do imunó- geno suficiente para induzir uma resposta imune inicial em um indivíduo que pode ser subsequentemente reforçada com a mesmo ou um imunógeno diferente para induzir uma resposta imune protetora.

[037]Em um exemplo, uma resposta desejada é inibir ou reduzir ou prevenir uma infecção por Neisseria gonorrhoeae ou Neisseria meningitidis. A infecção por Neisseria gonorrhoeae ou N. meningitidis não precisa ser completamente eliminada ou reduzida ou prevenida para que o método seja eficaz. Por exemplo, a administra- ção de uma quantidade eficaz do agente pode diminuir a infecção por Neisseria go-

norrhoeae ou N. meningitidis (por exemplo, conforme medido pelo número de bacté- rias ou pelo número ou porcentagem de indivíduos infectados por Neisseria gonor- rhoeae ou Neisseria meningitidis) em uma quantidade desejada, por exemplo, em pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou ainda pelo menos 100 % (eliminação ou prevenção de infecção por hPIV detectável), em comparação a um controle adequado.

[038]Epítopo: Um determinante antigênico. Estes são grupos químicos parti- culares ou sequências de peptídeos em uma molécula que são antigênicos, tal que os mesmos induzam uma resposta imune específico, por exemplo, um epítopo é a região de um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Um anticorpo pode se ligar a um epítopo antigênico particular, tal como um epítopo apresentado em uma microvesícula de Neisseria gonorrhoeae ou Neisseria meningitidis. Os epítopos podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos pela do- bra terciária de uma proteína.

[039]Heterólogo: Originário de uma fonte genética diferente, de modo que os componentes biológicos não são encontrados juntos na natureza. Os componentes podem ser células hospedeiras, genes ou regiões reguladoras, tais como promotores.

Embora os componentes heterólogos não sejam encontrados juntos na natureza, os mesmos podem funionar juntos, tal como quando um promotor heterólogo a um gene ligado é de maneira operável ao gene. Um outro exemplo é onde uma sequência Neis- serial é heteróloga a um hospedeiro Neisserial de uma cepa diferente. “Heterólogo”, conforme usado neste relatório, no contexto de proteínas expressadas em duas cepas bacterianas diferentes, por exemplo, “PorA heteróloga”.

[040]Resposta imune: Uma resposta de uma célula do sistema imune, tal como células B, células T ou monócitos, a um estímulo, tal como Neisseria. Em uma forma de realização, a resposta é específica para um antígeno particular (uma “res- posta específica do antígeno”). Em uma forma de realização, uma resposta imune é uma resposta de células T, tal como uma resposta de CD4+ ou uma resposta de CD8+. Em outra forma de realização, a resposta é uma resposta de células B e resulta na produção de anticorpos específicos. Uma “resposta imune protetora” é uma res- posta imune que confere proteção contra uma doença causada por um membro de Neisseria, tal como sorogrupos de N. meningitidis, particularmente, os sorogrupos A, B, C, Y e W-135, e/ou Neisseria gonorrhoeae. Uma “resposta imune terapêutica” trata uma infecção existente com Neisseria. Em algumas formas de realização, o indivíduo apresenta uma infecção por N. meningitidis e a administração da composição imuno- gênica aumenta a depuração da Neisseria meningitidis. Em outras formas de realiza- ção, o indivíduo apresenta uma infecção por Neisseria gonorrhoeae e a administração da composição imunogênica aumenta a depuração de Neisseria gonorrhoeae.

[041]Imunógeno: Um composto, composição ou substância (por exemplo, uma composição incluindo microvesículas de membrana externa a partir de PorA- PorB- Neisseria meningitidis) que pode induzir uma resposta imune em um animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas em um animal. A administra- ção de um imunógeno a um indivíduo pode levar à imunidade contra um patógeno de interesse, tal como Neisseria gonorrhoeae e/ou Neisseria meningitidis.

[042]Composição imunogênica: Uma composição compreendendo microvesí- culas de membrana externa a partir de PorA-PorB- N. meningitidis que induz uma res- posta de CTL mensurável contra Neisseria gonorrhoeae e/ou Neisseria meningitidis, ou induz uma resposta de células B mensurável (tal como produção de anticorpos) contra Neisseria gonorrhoeae e/ou Neisseria meningitidis, quando administrada a um indivíduo. Para o uso in vivo, a composição imunogênica tipicamente incluirá microve- sículas de membrana externa a partir de PorA-PorB- N. meningitidis em um portador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, também pode incluir outros agentes, tais como um adjuvante. A frase “em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune” significa que existe uma diferença detectável entre um indicador de resposta imune medido antes e depois da administração de uma composição imunogênica par- ticular. Os indicadores de resposta imune incluem, mas não são limitados a: título ou especificidade do anticorpo, conforme detectado por um ensaio, tal como ensaio imu- nossorvente ligado à enzima (ELISA), ensaio bactericida, citometria de fluxo, imuno- precipitação, imunodifusão de Ouchterlony; ensaios de detecção de ligação, por exemplo, de manchas, western blot ou matrizes de antígeno; ensaios de citotoxici- dade, etc.

[043]Inibição ou tratamento de uma doença: A inibição do desenvolvimento completo de uma doença ou condição, por exemplo, em um indivíduo que está em risco para uma doença, tal como uma infecção por Neisseria gonorrhoeae e/ou N.

meningitidis. “Tratamento” refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após o início do desenvolvi- mento. O termo “melhorar”, com referência a uma doença ou condição patológica, refere-se a qualquer efeito benéfico observável do tratamento. A inibição uma doença pode incluir prevenir ou reduzir o risco da doença, tal como prevenir ou reduzir o risco de infecção bacteriana. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por exemplo, por um atraso no aparecimento de sintomas clínicos da doença em um indivíduo suscetível, uma redução na gravidade de alguns ou todos os sintomas clínicos da doença, uma progressão mais lenta da doença, uma redução na carga bacteriana, uma melhora na saúde ou bem estar global do indivíduo, ou por outros parâmetros que são específicos à doença particular. Um tratamento “profilático” é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença ou exibe apenas sinais precoces para o propósito de diminuir o risco de desenvolvimento da patologia.

[044]Isolado: Um componente biológico “isolado” foi substancialmente sepa- rado ou purificado de outros componentes biológicos, tais como outros componentes biológicos em que o componente ocorre naturalmente, tal como outro DNA cromossô- mico e extracromossômico, RNA, membranas, células e proteínas. Microvesículas que foram “isoladas” incluem aquelas purificadas por métodos de purificação padrão.

Isolado não exige pureza absoluta e pode incluir microvesículas que são pelo menos 50 % isoladas, tal como pelo menos 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou ainda 99,9 % isoladas de outros componentes das bactérias que produzem as mesmas.

[045]Microvesículas: Microvesículas de membrana externa são produzidas a partir da membrana externa de Neisseria e incluem vesículas de membrana externa (OMVs) e bolhas. OMVs são produzidas por meio da solubilização de Neisseria em um processo em que as membranas externas formam vesículas. As bolhas são pro- duzidas por meio da germinação de Neisseria viva. Os métodos a partir da produção de microvesículas de membrana externa são conhecidos na técnica, veja por exem- plo, van de Waterbeemd et al., PLOS One, doi.org/10.1371/journal.pone.0065157, 31 de Maio de 2013). OMV e bolhas podem ser purificadas a partir de Neisseria intacta e apresentam, em geral, 100 a 300 nm.

[046]Proteína Modificável para a Redução da Proteína de Membrana Externa (Rmp)M: Uma proteína periplasmática a partir de N. meningitidis que compreende um domínio N-terminal (resíduos 1 a 47) e um domínio C-terminal globular separado (re- síduos 65 - 219) responsável pela ligação ao peptidoglicano. O fragmento N-terminal de RmpM se liga às principais porinas de membrana externa, PorA e PorB. A análise por SDS-PAGE seminativa estabeleceu que tanto RmpM de comprimento total recom- binante quanto um fragmento N-terminal foram suficientes para estabilizar os comple- xos oligoméricos de PorA e PorB. A porção de meso-diaminopimelato desempenha um papel no reconhecimento de peptidoglicano por RmpM. A mutagênese sítio-diri- gida mostrou que dois resíduos altamente conservados, Asp120 e Arg135, desempe- nham um papel na ligação de peptidoglicano, veja Maharjan et al., Microbiology 162: 364 a 375, 2016. Veja também Li et al., PLOS Biology, doi.org/10.1371/jour- nal.pone.0090525, 4 de Março de 2014 e Acesso GENBANK No X05105.1, conforme disponível em 30 de Junho de 2018, incorporado neste relatório à título de referência.

A produção de OMV é maior em uma cepa de N. meningitidis que expressa um frag- mento N-terminal truncado de RmpM (RmpM ΔC-term) do que em uma cepa do tipo selvagem. Esta cepa também é RpmM-, pois não produz proteína RmpM funcional.

Em geral, uma RmpM- Neisseria (também chamada “∆R”) não produz proteína RmpM funcional.

[047]Portadores farmaceuticamente aceitáveis: Os portadores farmaceutica- mente aceitáveis de uso são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a Edição, 1995, descreve as composições e formulações adequadas para a liberação farmacêutica dos imunóge- nos divulgados.

[048]Em geral, a natureza do portador dependerá do modo particular de ad- ministração que será utilizado. Por exemplo, as formulações parenterais usualmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologica- mente aceitáveis, tais como água, solução salina fisiológica, soluções salinas balan- ceadas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como um veículo. Para composi- ções sólidas (por exemplo, formas de pó, pílula, tablete ou cápsula), portadores sóli- dos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de portadores biologicamente neutros, composições farmacêuticas (tais como composições imunogênicas) que se- rão administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, preservantes e agentes tamponantes de pH e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano. Em formas de realização particulares, adequado para a administração a um indivíduo, o portador pode ser estéril e/ou colocado em suspensão ou, de outro modo, contido em uma forma de dosagem unitária contendo uma ou mais doses medidas da composição adequada para induzir a resposta desejada imune. Também pode ser acompanhado por medicações para seu uso para propósitos de tratamento. A forma de dosagem unitária pode estar, por exemplo, em um frasco vedado que contém con- teúdos estéreis ou uma seringa para injeção em um indivíduo, ou ser liofilizada para solubilização e administração subsequentes ou em uma dosagem sólida ou de libera- ção controlada.

[049]Polipeptídeo: Qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente de comprimento ou modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ou fosforila- ção). “Polipeptídeo” se aplica aos polímeros de aminoácidos, incluindo polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos de ocorrência não na- tural, assim como nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido não natural, por exemplo, um mimético químico artificial de um aminoácido de ocor- rência natural correspondente. Um “resíduo” refere-se a um aminoácido ou mimético de aminoácido incorporado em um polipeptídeo por uma ligação amida ou mimético de ligação amida. Um polipeptídeo apresenta um extremidade do terminal amino (N- terminal) e um extremidade do terminal carbóxi (C-terminal). “Polipeptídeo” é permu- tavelmente usado com peptídeo ou proteína e é usado neste relatório para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos.

[050]Porina (Por)A: PorA é uma porina de Neisseria. A topologia do monô- mero de PorA mostra oito alças extracelulares (Derrick et al., 1999, Infect. Immun. 67 2406 a 13; van der Ley et al., 1991, Infect. Immun. 59 2963) na proteína. As alças mais longas (1 e 4) são as mais variáveis, consequentemente, são referidas como Região Variável 1 (VR1) e Região Variável 2 (VR2). Menos variabilidade é observada nas alças 5 e 6 (também chamadas SVR1 e 2 semivariáveis, ou região variável 3 e 4, respectivamente), com essencialmente nenhuma variabilidade nas alças remanes- centes. Prevê-se que a alça 3 forme um “tampão” no poro formado por cada subuni- dade do trímero de PorA. Mesmo dentro de VR1 e VR2, a maioria da variabilidade é confinada aos resíduos previstos para formar a ponta de cada alça. De fato, tanto em camundongos quanto em voluntários humanos imunizados, o mapeamento de epíto- pos mostrou que a maioria da resposta de anticorpos é dirigida no “topo” das alças 1 e 4, a região que é variável entre as cepas (van der Voort, et al., 1997, FEMS Immunol.

Med. Microbiol. 17 139 a 48).

[051]Esta proteína gera uma resposta imune em pacientes e portadores as- sintomáticos, na medida em que tem sido usada como um marcador para a identifica- ção da cepa, representando o sistema sorossubtipo (McGuinness et al., 1990, J Exp Med. 171 1871 a 82). PorA foi usada em formulações de vacina eficazes e registradas e induz os anticorpos bactericidas eficazes . Entretanto, a variabilidade cepa-a-cepa nas alças de superfície resulta em um alvo variável e as vacinas são tipicamente es- pecíficas do tipo PorA. Esforços foram feitos para gerar vacinas de PorA multivalentes cobrindo até seis tipos de PorA diferentes (van der Voort et al., 1996, Infect Immun.

64 2745 a 51). Uma PorA- Neisseria (também chamada ∆A) não produz proteína PorA funcional.

[052]Porina B (PorB): Uma proteína transmembrana de 16 passagens a partir de Neisseria que é uma porina e forma uma estrutura de barril β com oito alças ex- postas à superfície (L1-L8) (Tanabe et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107: 6811 a 6816). Duas destas, L2 e L3, são estruturais e não variam consideravelmente na se- quência de aminoácidos entre cepas de MenB diferentes. As seis remanescentes, L1 e L4-L8, sofrem variação antigênica; é a ligação de anticorpos a estas alças que forma a base para a sorotipagem meningocócica (Frasch et al. (1985) Rev Infect Dis 7: 504 a 510). Uma PorB- Neisseria (também chamada ∆B) não produz proteína PorB funci- onal.

[053]Vacinação de reforço principal: Uma imunoterapia, incluindo a adminis- tração de uma primeira composição imunogênica (a vacina inicial), seguido pela ad- ministração de outra composição imunogênica (a vacina de reforço) a um indivíduo para induzir uma resposta imune. A vacina inicial e/ou a vacina de reforço são imunó- genos aos quais a resposta imune é dirigida. A vacina de reforço é administrada ao indivíduo depois da vacina inicial; um intervalo de tempo adequado entre a adminis- tração da vacina inicial e da vacina de reforço, e exemplos de tais intervalos de tempo são divulgados neste relatório. Em algumas formas de realização, a vacina inicial, a vacina de reforço ou a vacina inicial e a vacina de reforço incluem adicionalmente um adjuvante

[054]Recombinante: Uma molécula de ácido nucleico recombinante é aquela que apresenta uma sequência que não ocorre naturalmente, por exemplo, inclui uma ou mais substituições, deleções ou inserções de ácidos nucleicos e/ou apresenta uma sequência que é preparada por uma combinação artificial de dois segmentos de se- quência separados. Esta combinação artificial pode ser realizada por síntese química ou, mais comumente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nu- cleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética.

[055]Uma proteína recombinante é aquela que apresenta uma sequência que não ocorre naturalmente ou apresenta uma sequência que é preparada por uma com- binação artificial de dois segmentos de sequência separados. Em várias formas de realização, uma proteína recombinante é codificada por um ácido nucleico heterólogo (por exemplo, recombinante) que foi introduzido em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana ou eucariótica, ou no genoma de um vírus recombinante.

[056]Identidade de sequência: A similaridade entre as sequências de amino- ácidos é expressada em termos da similaridade entre as sequências, de outro modo referida como identidade de sequência. A identidade de sequência é frequentemente medida em termos de identidade percentual; quanto maior a porcentagem, mais simi- lares são as duas sequências. Homólogos, ortólogos ou variantes de um polipeptídeo possuirão um grau relativamente alto de identidade de sequência quando alinhados usando métodos padrão.

[057]Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Várias programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol.

Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Hig- gins & Sharp, Gene, 73:237 a 44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 a 3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881 a 90, 1988; Huang et al. Computer Appls. In the Biosciences 8, 155 a 65, 1992; e Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307 a 31, 1994.

Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 a 10, 1990, apresentam uma consideração deta- lhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia.

[058]As variantes de um polipeptídeo são tipicamente caracterizadas pela posse de pelo menos cerca de 75 %, por exemplo, pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência contada no alinhamento de comprimento total com a sequência de amino- ácidos de interesse. As proteínas com maior similaridade às sequências de referência mostrarão aumento das identidades percentuais quando avaliadas por este método, tal como pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência. Quando menos do que a sequência total está sendo comparada quanto à identidade de sequência, os homólogos e variantes tipicamente possuirão pelo menos 80 % de identidade de se- quência em janelas curtas de 10 a 20 aminoácidos, e podem possuir identidades de sequência de pelo menos 85 % ou pelo menos 90 % ou 95 % dependendo de sua similaridade à sequência de referência. Métodos para determinar a identidade de se- quência em tais janelas curtas estão disponíveis no website do NCBI na Internet.

[059]Conforme usado neste relatório, referência a “pelo menos 90 % de iden- tidade” (ou linguagem similar) refere-se a “pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96

%, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou ainda 100 % de identi- dade” a uma sequência de referência especificada.

[060]Sorogrupo: Classificação, tal como de Neisseria meningitidis em virtude das variações imunologicamente detectáveis no polissacarídeo capsular. Cerca de 12 sorogrupos são conhecidos: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, H, I, K e L. Qualquer soro- grupo pode abranger múltiplos sorotipos e múltiplos sorossubtipos. Um sorotipo é classificação de cepas de Neisseria meningitidis com base em diferenças antigênicas definidas pelo anticorpo monoclonal na proteína porina PorB de membrana externa, ou após a tipagem VR de sequências de aminoácidos deduzidas a partir do sequen- ciamento de DNA. Um sorotipo único pode ser encontrado em múltiplos sorogrupos e múltiplos sorossubtipos. “Sorossubtipo” é a classificação de cepas de Neisseria me- ningitidis com base em variações antigênicas definidas pelo anticorpo na proteína po- rina PorA de membrana externa, ou após a tipagem VR de sequências de aminoáci- dos deduzidas a partir do sequenciamento de DNA (Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis.

182:1169; veja, também, o website Multi Locus Sequence Typing). A maior variabili- dade entre proteínas PorA ocorre em duas (alças I e IV) de oito alças putativas e expostas à superfície. As alças variáveis I e IV foram designadas VR1 e VR2, respec- tivamente. Um sorossubtipo único pode ser encontrado em múltiplos sorogrupos e múltiplos sorotipos.

[061]Indivíduo: Organismos vivos vertebrados multicelulares, uma categoria que inclui mamíferos humanos e não humanos. Em um exemplo, um indivíduo é um ser humano. Em um exemplo adicional, um indivíduo é selecionado, o qual precisa da inibição de uma infecção por Neisseria. Por exemplo, o indivíduo não está infectado e em risco para a infecção ou está infectado em necessidade de tratamento.

[062]Sob condições suficientes para: Uma frase que é usada para descrever qualquer meio que permita uma atividade desejada.

[063]Vacina: Uma preparação de material imunogênico capaz de estimular uma resposta imune, administrada para a prevenção, melhora ou tratamento de do- ença infecciosa ou outros tipos de doença. O material imunogênico pode incluir micro- organismos atenuados ou mortos (tais como bactérias ou vírus) ou proteínas antigê- nicas, peptídeos ou DNA derivado dos mesmo. Uma vacina pode incluir um imunó- geno divulgado, tal como microvesículas de membrana externa a partir de PorA-PorB- Neisseria meningitidis, tal como um PorA-PorB- RmpM- Neisseria meningitidis. As va- cinas podem induzir tanto respostas profiláticas (preventivas ou protetoras) quanto respostas terapêuticas. Os métodos de administração variam, de acordo com a va- cina, mas podem incluir inoculação, ingestão, inalação ou outras formas de adminis- tração. As vacinas podem ser administradas com um adjuvante para reforçar a res- posta imune. Em um exemplo específico e não limitante, uma vacina previne e/ou reduz a gravidade dos sintomas associados com infecção por hPIV e/ou diminui a carga viral em comparação a um controle.

[064]Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas neste relatório são integralmente incorporadas à título de referência. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, pre- valecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

Cepas de Neisseria e Microvesículas de Membrana Externa

[065]Em algumas formas de realização, PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis iso- ladas são divulgadas neste relatório. Estas N. meningitidis não ocorrem naturalmente, pois PorB- N. meningitidis não ocorre na natureza. PorA-PorB- N. meningitidis isoladas, tais como PorA-PorB-RmpM- Neisseria meningitidis isoladas, são úteis nos métodos divulgados.

[066]Em geral, PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis são deficientes na produção de PorA, PorB e RmpM. Assim, estas proteínas subcapsulares PorA, PorB, e RmpM não podem ser detectadas na superfície destas N. meningitidis. Assim, PorA, PorB e

Rpm não funcionam nestas N. meningitidis.

[067]Em algumas formas de realização, há uma deleção nos genes PorA, PorB, e/ou RmpM nestas N. meningitidis, de modo que a proteína correspondente não é produzida. Em outras formas de realização, há um códon de parada inserido nos genes PorA, PorB e/ou RmpM, de modo que a proteína correspondente não é produ- zida. Em outras formas de realização, os genes incluem uma mutação, tal que a pro- teína não é funcional ou imunogênica, por exemplo, a proteína não está presente na membrana externa da N. meningitidis.

[068]Em algumas formas de realização, a produção destas proteínas de su- perfície é diminuída em pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou está completamente ausente. Em geral, nas cepas de uso nos métodos divulgados neste relatório, PorA, PorB e RmpM não são detectáveis na superfície bacteriana. Métodos adequados para detectar PorA, PorB e RmpM na superfície celular incluem ELISA de célula inteira usando anticorpos específicos da proteína monoclonais e policlonais.

[069]Cepas modificadas podem ser geradas por técnicas de recombinação e por técnicas não recombinantes, tais como, por exemplo, exposição aos produtos quí- micos, radiação ou outro agente de modificação ou dano de DNA e semelhantes. Ce- pas modificadas que apresentam um perfil de expressão de proteína desejado, espe- cificamente em que PorA, PorB e/ou RmpM não são detectáveis na superfície celular, podem ser identificadas através da triagem.

[070]A N. meningitidis pode ser de qualquer tipo. As cepas de N. meningitidis podem ser divididas em grupos sorológicos, sorotipos e subtipos com base nas rea- ções com anticorpos policlonais (Frasch et al. (1985) Rev Infect Dis 7: 504 a 510, C.

E. e Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127: 149 a 154) ou monoclonais que interagem com antígenos de superfície diferentes. O sorogrupo é baseado em variações imuno- logicamente detectáveis no polissacarídeo capsular. Cerca de 12 sorogrupos (A, B, C, X, Y, Z, 29-E e W-135) são conhecidos. Em algumas formas de realização, as PorA-

PorB-RmpM- N. meningitidis são o sorogrupo A, B ou C.

[071]N. meningitidis também podem ser divididas em grupos ou subgrupos clonais, usando várias técnicas que caracterizam direta ou indiretamente o genoma bacteriano. Estas técnicas incluem eletroforese de enzimas multiloco (MLEE), com base na variação de mobilidade eletroforética de uma enzima, que reflete os polimor- fismos subjacentes em um loco genético particular. Por meio da caracterização das variantes de um número de tais proteínas, a “distância” genética entre duas cepas pode ser inferida a partir da proporção de pareamentos errôneos. Similarmente, a clo- nalidade entre dois isolados pode ser inferida se os dois apresentarem padrões idên- ticos de variantes eletroforéticas em um número de locos. A tipagem de sequências de multiloco (MLST) também pode ser usada para caracterizar os micro-organismos.

Usando MLST, a distância genética entre dois isolados, ou clonalidade, é inferida a partir da proporção de pareamentos errôneos nas sequências de DNA de 11 genes de manutenção nas cepas de N. meningitidis (Maiden et al., 1998, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 95:3140). Qualquer cepa pode ser selecionada e usada para produzir uma PorA-PorB- N. meningitidis, tal como uma PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis.

[072]N. meningitidis isolados podem ser transformados para expressar uma proteína heteróloga. Estas N. meningitidis recombinantes também são úteis nos mé- todos divulgados neste relatório, contanto que elas sejam PorA-PorB-RmpM-. As N.

meningitidis isoladas podem ser transformadas para expressar antígenos adicionais, tais como aqueles exemplificados nas Publicação PCT Nos WO 99/24578, WO 99/36544; WO 99/57280, WO 00/22430 e WO 00/66791, assim como fragmentos an- tigênicos de tais proteínas.

[073]Em algumas formas de realização, as microvesículas de membrana ex- terna são produzidas a partir de PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis. É divulgado neste relatório que uma quantidade eficaz de microvesículas a partir de uma PorA-PorB- N.

meningitidis, tal como uma quantidade eficaz de microvesículas a partir de uma PorA-

PorB-RmpM- N. meningitidis, pode ser usada para induzir uma resposta imune a Neis- seria, tal como a N. meningitidis e/ou N. gonorrhoeae. As composições imunogênicas podem ser produzidas, incluindo uma quantidade eficaz de microvesículas a partir de uma PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis e um portador farmaceuticamente aceitável.

Em algumas formas de realização, as microvesículas de membrana externa a partir das PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis que expressa uma proteína heteróloga. Estas vesículas não incluem a PorA, PorB ou RmpM, mas incluem a proteína heteróloga.

[074]As microvesículas podem ser vesículas de membrana externa, bolhas ou uma combinação das mesmas. As bolhas são germinadas a partir de N. meningitidis viva. Os métodos para isolar as bolhas também são conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Post et al., J. Biological Chem. 280: 38383 a 38394, 2005, incorporado neste relatório à título de referência. OMVs são produzidas por meio da solubilização de Neisseria. Os métodos para produzir OMV são divulgados, por exemplo, no Pedido de Patente Publicado U.S. No 2012/0328643, incorporado neste relatório à título de referência. Os métodos para a preparação de OMVs também são divulgados em Claassen et al. (Vaccine (1996) 14:1001 a 1008); Cartwright et al. (Vaccine (1999) 17:2612 a 2619); Peeters et al. (Vaccine (1996) 14:1009 a 1015); Fu et al. (Biotechno- logy NY (1995) 12:170 a 74); Davies et al. (J. Immunol. Meth. (1990) 134:215 a 225); Saunders et al. (Infect. Immun. (1999) 67:113 a 119); Draabick et al. (Vaccine (2000) 18:160 a 172); Moreno et al. (Infect. Immun. (1985) 47:527 a 533); Milagres et al.

(Infect. Immun. (1994) 62:4419 a 4424); Naess et al. (Infect. Immun. (1998) 66:959 a 965]; Rosenqvist et al. [Dev. Biol. Stand. (1998) 92:323 a 333]; Haneberg et al. [Infect.

Immunn. (1998) 66:1334 a 41); Andersen et al. (Vaccine (1997) 15:1225 a 34); e Bjune et al. (Lancet (1991) 338:1093 a 96).

[075]Em algumas formas de realização, as OMVs são preparadas pela extra- ção de desoxicolato. Um protocolo de extração é divulgado em Fredriksen et al., (1991) NIPH Ann. 14(2):67 a 79. Métodos adicionais são divulgados, por exemplo, em

Bjune et al. (Lancet (1991) 338(8775):1093 a 96), Fredriksen et al. (1991) NIPH Annals 14: 67 a 79, Páginas 818 a 824 de Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae (eds. Conde-Glez et al.) ISBN 968-6502-13-0). A OMV (por exemplo, conforme obtida pela extração de desoxicolato) pode ser tratada para remover certos componentes.

Por exemplo, pirogênios ou componentes tóxicos podem ser removidos (por exemplo, LOS).

Composições Imunogênicas e Métodos de Uso

[076]As composições imunogênicas de uso no método divulgado incluem mi- crovesículas de membrana externa a partir de PorA-PorB- N. meningitidis, tal como PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis. As microvesículas podem ser OMV e/ou bolhas. As composições imunogênicas de uso nos métodos divulgados podem incluir uma mis- tura de microvesículas (por exemplo, OMV e bolhas), cujas microvesículas podem ser da mesma cepa ou de cepas diferentes. Em outra forma de realização, as composi- ções imunogênicas podem compreender uma mistura de vesículas a partir de 2, 3, 4, 5 ou mais cepas de PorA-PorB- N. meningitidis, tais como cepas de PorA-PorB-RmpM- , onde as vesículas podem ser OMV, bolhas ou ambas.

[077]Opcionalmente, uma composição imunogênica podem incluir um adju- vante. Os adjuvantes podem incluir uma suspensão de minerais (alume, hidróxido de alumínio ou fosfato) na qual o antígeno é adsorvido; ou emulsão água-em-óleo na qual a solução de antígeno é emulsificada em óleo mineral (por exemplo, adjuvante incom- pleto de Freund), algumas vezes com a inclusão de micobactérias mortas (adjuvante completo de Freund) para ainda acentuar a antigenicidade. Os oligonucleotídeos imu- noestimuladores (tais como aqueles incluindo um motivo CpG) também podem ser usados como adjuvantes (por exemplo, veja as Patentes U.S. Nos 6.194.388;

6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; 6.339.068; 6.406.705; e 6.429.199). Os adjuvantes também incluem moléculas biológicas, tais como moléculas coestimulan-

tes. Adjuvantes biológicos exemplares incluem interleucina (IL)-2, IL-12, RANTES, fa- tor estimulante da colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de necrose tumoral (TNF)-α e interferon (IFN)-γ.

[078]Em uma forma de realização, as microvesículas, tais como a OMV e/ou bolhas, podem ser usadas com um adjuvante de hidróxido de alumínio. Uma razão proteína:adjuvante é 1:67 (p/p). Entretanto, outras razões podem ser usadas, tais como 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:33, 1;60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80 ou 1:85).

[079]Adjuvantes adicionais incluem Adjuvante Completo de Freund, Adju- vante Incompleto de Freund, adjuvante de Gerbu (GMDP; C.C. Biotech Corp.), adju- vante de aves RIBI (MPL; RIBI Immunochemical Research, Inc.), alume de potássio, fosfato de alumínio, QS21 (Cambridge Biotech), adjuvante Titer Max (CytRx), e adju- vante Quil A. O lipopolissacarídeo exógeno (LPS) também pode ser usado como um adjuvante.

[080]As composições imunogênicas também podem incluir outros agentes, tais como aglutinantes. Os aglutinantes incluem, mas não são limitados à carboxime- tilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina ou gelatina; excipientes, tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes, tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e semelhantes; lubrificantes, tais como estearato de magnésio ou Sterotex; deslizantes, tais como dióxido de silício coloidal; agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina, um agente flavorizante, tal como hortelã- pimenta, salicilato de metila ou flavorizante de laranja, e um agente corante. As com- posições também podem incluir goma arábica, xarope, lanolina, amido, etc., que for- mam um veículo para liberação. Incluídas são substâncias que, na presença de líquido suficiente, conferem a uma composição a qualidade adesiva necessária para a pre- paração de pílulas ou tabletes.

[081]“Portadores farmaceuticamente aceitáveis” exemplares incluem portado-

res líquidos (tais como água, solução salina, meio de cultura, dextrose aquosa e gli- cóis) e portadores sólidos (tais como carboidratos exemplificados por amido, glicose, lactose, sacarose e dextranos, antioxidantes exemplificados por ascórbico ácido e glu- tationa e proteínas hidrolisadas). Diluentes exemplares incluem água, solução salina fisiológica, albumina de soro humano, óleos, polietilenoglicóis, glicerina, propileno gli- col ou outros solventes sintéticos. As composições também podem incluir agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico, antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio, agentes quelantes, tais como ácido etileno diamino-tetra-acé- tico, tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para ajustar a osmo- laridade, tais como cloreto de sódio ou dextrose.

[082]Em algumas formas de realização, a composição imunogênica pode ser formulada para a administração por injeção por intermédio das vias intramusculares, intraperitoneais, intradérmicas ou subcutâneas; ou por intermédio de administração da mucosa aos tratos orais/alimentares, respiratórios (por exemplo, administração in- tranasal), geniturinários. Embora a composição imunogênica possa ser administrada como uma dose única, os componentes da mesma também podem ser coadministra- dos juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes. Além de uma via de adminis- tração única, duas ou mais vias de administração diferentes podem ser usadas.

[083]As composições imunogênicas podem ser liofilizadas ou estar na forma aquosa, por exemplo, soluções ou suspensões. As formulações líquidas permitem que as composições sejam administradas diretamente a partir de sua forma embalada, sem a necessidade de reconstituição em um meio aquoso. As composições podem ser apresentadas em frascos ou podem ser apresentadas nas seringas pronta para o uso. As seringas podem ser fornecidas com ou sem agulhas. Uma seringa incluirá uma dose única da composição, ao passo que um frasco pode incluir uma dose única ou múltiplas doses (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 doses). Em uma forma de realização, a dose é para o uso em um ser humano. Em uma forma de realização adicional, a dose é para um adulto, adolescente, criança pequena, bebê ou ser hu- mano com menos do que um ano de idade e pode ser administrada por injeção. Os kits podem incluir uma dose medida para a administração a um indivíduo.

[084]Uma composição imunogênica pode ser liofilizada. Quando uma compo- sição imunogênica exige reconstituição, a mesma pode ser fornecida na forma de um kit que pode compreender dois frascos ou pode compreender uma seringa pronta para o uso e um frasco, com os conteúdos da seringa sendo usados para reconstituir os conteúdos do frasco antes da injeção.

[085]As OMVs podem ser usadas em combinação com outros agentes, tais como outra vacina ou agente terapêutico. Em algumas formas de realização, a vacina pode ser uma vacina meningocócica, tal como uma vacina conjugada ou uma vacina polissacarídica. Em exemplos não limitantes específicos, a vacina é MPSV4 (MENOMUNE®), MCV4 (MENACTRA®, MENHIBRIX®, MENVEO®) ou uma vacina meningocócica do sorogrupo B (TRUMENBA® e BEXSERO®). Vacinas adicionais são MENCEVAX®, uma vacina polissacarídica purificada, tal como NmVac4- A/C/Y/W-135, e NIMENTRIX®.

[086]Métodos são divulgado neste relatório para induzir uma resposta imune a Neisseria em um mamífero usando qualquer uma das composições imunogênicas divulgadas, incluindo uma quantidade eficaz de microvesículas de membrana externa (por exemplo, OMV e/ou bolhas) a partir de PorA-PorB- N. meningitidis, tal como uma PorA-PorB-rmpM- N. meningitidis. A resposta imune pode ser uma resposta imune pro- tetora ou uma resposta imune terapêutica. O indivíduo pode ser um ser humano ou veterinário. O indivíduo pode ser um adulto ou um indivíduo jovem. Em algumas for- mas de realização, o indivíduo é um ser humano de duas semanas, um mês, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses, ou um ano ou 15, 18, ou 21 meses de idade, ou uma criança de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 anos de idade. O indivíduo pode ser um adulto, tal como um indivíduo humano de 18 ou mais anos de idade. O método pode incluir administrar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 doses de uma quantidade eficaz de microvesículas de membrana externa (por exemplo, OMV e/ou bolhas) a partir de PorA-PorB- N. meningitidis, tal como um PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis. Em algu- mas formas de realização, uma dose única é usado. Em outras formas de realização, múltiplas doses são usadas, tais como em um protocolo de reforço inicial. Protocolos não limitantes exemplares são mostrados na seção exemplos. Uma dose inicial e uma dose adicional podem ser administradas dentro de dias, semanas ou meses entre si.

[087]Em algumas formas de realização, o indivíduo apresenta uma infecção por N. meningitidis e a administração da composição imunogênica aumenta a depu- ração da N. meningitidis. A N. meningitidis na composição imunogênica pode ser qual- quer sorogrupo, tal como o sorogrupo A, B ou C. A infecção por N. meningitidis pode ser de qualquer sorogrupo, tal como sorogrupo A, B e C. Opcionalmente, a N. menin- gitidis na composição imunogênica e a infecção por N. meningitidis são o mesmo so- rogrupo.

[088]Em outras formas de realização, o indivíduo apresenta uma infecção por N. gonorrhoeae e a administração da composição imunogênica aumenta a depuração da N. gonorrhoeae. Em formas de realização adicionais, o indivíduo é um indivíduo saudável e não apresenta uma infecção por N. meningitidis ou por N. gonorrhoeae.

Em algumas formas de realização, métodos são fornecidos para induzir uma resposta imune a N. gonorrhoeae em um mamífero, compreendendo administrar ao mamífero uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade eficaz de microvesí- culas de membrana externa, tais como bolhas e/ou OMVs, a partir de PorA-PorB- N.

meningitidis e um portador farmaceuticamente aceitável. A PorA-PorB- N. meningitidis pode ser RmpM-. A N. meningitidis pode ser o sorogrupo A, B ou C, ou qualquer outro sorogrupo (W, Y, etc.). A N. gonorrhoeae pode ser de qualquer sorotipo.

[089]Os métodos da invenção fornecem a administração de uma ou mais com- posições antigênicas a um mamífero (por exemplo, um ser humano) para induzir uma resposta imune. A resposta imune pode ser contra mais do que uma cepa de bactérias da espécie Neisseria e, assim, a proteção contra a doença causada por tais bactérias.

Os métodos divulgados podem fornecer uma resposta imune protetora contra um 1, 2, 3, 4, 5 ou mais cepas da espécie N. meningitidis, onde as cepas diferem em pelo menos um entre sorogrupo, sorotipo ou sorossubtipo. Veja o Pedido de Patente Pu- blicado U.S. No US 20170065699, incorporado neste relatório à título de referência, que divulga métodos para a imunização contra múltiplas cepas, tais como 2, 3, 4, 5 ou mais cepas.

[090]Opcionalmente, a composição imunogênica pode incluir um adjuvante. Adjuvantes adequados são divulgados acima.

[091]A composição imunogênica pode ser administrada por qualquer via. Isto inclui por intermédio de injeção para as vias intramusculares, intraperitoneais, intra- dérmicas ou subcutâneas; ou por intermédio da administração mucosal aos tratos orais/alimentares, respiratórios (por exemplo, administração intranasal), genituriná- rios. Embora a composição imunogênica possa ser administrada como uma dose única, doses adicionais podem ser coadministradas juntas ao mesmo tempo ou em tempo diferentes. Além de uma via de administração única, duas ou mais vias de ad- ministração diferentes podem ser usadas.

[092]A administração pode ser realizada por doses únicas ou múltiplas. A dose administrada a um indivíduo no contexto da presente divulgação deve ser sufici- ente para induzir uma resposta terapêutica benéfica em um indivíduo com o passar do tempo ou inibir ou prevenir infecção. A dose exigida variará de indivíduo para indi- víduo dependendo da espécie, idade, peso e condição geral do indivíduo, da gravi- dade da infecção que será tratada, da composição particular que será usada e seu modo de administração. Uma dose apropriada pode ser determinada por um técnico no assunto usando apenas experimentação de rotina.

[093]Em algumas formas de realização, uma composição imunogênica pode ser administrada por via oral, nasal, nasofaríngea, parenteral, entérica, gástrica, tó- pica, transdérmica, subcutânea, intramuscular, em tablete, sólida, em pó, líquida, forma de aerossol, local ou sistemicamente, com ou sem excipientes adicionados.

Métodos reais para preparar parenteralmente composições administráveis são descri- tos em tais publicações como Remington’s Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980).

[094]Para administração oral, as composições podem precisar ser protegidas da digestão. Isto é tipicamente realizado pela associação da composição com um agente que a torna resistente à hidrólise ácida e enzimática ou pelo empacotamento da composição em um portador apropriadamente resistente. Meios para proteger da digestão são bem conhecidos na técnica.

[095]As composições imunogênicas são administradas a um animal que apre- senta ou está em risco de adquirir uma infecção por Neisseria, para prevenir ou pelo menos interromper parcialmente o desenvolvimento da doença e suas complicações.

Uma quantidade adequada para fazer isso é definida como uma “dose eficaz” ou uma “quantidade imunogenicamente eficaz”. Quantidades eficazes para o uso dependerão, por exemplo, da composição antigênica, da maneira de administração, do peso e es- tado geral de saúde do indivíduo e do julgamento do médico prescritor. Doses únicas ou múltiplas das composições antigênicas podem ser administradas, dependendo da dosagem e frequência exigidas e toleradas pelo paciente e via de administração. Uma estratégia de reforço principal pode ser utilizada.

[096]A quantidade de microvesículas de membrana externa incluída na com- posição imunogênica é suficiente para induzir uma resposta imune, tal como uma res- posta imune humoral e/ou uma resposta imune celular, no indivíduo. Quantidades para a imunização da mistura, em geral, variam de cerca de 0,001 mg a cerca de 1,0 mg por 70 quilogramas do paciente, mais comumente, de cerca de 0,001 mg a cerca de 0,2 mg por 70 quilogramas do paciente. Dosagens a partir de 0,001 até cerca de

10 mg por paciente por dia podem ser usadas, particularmente quando o antígeno é administrada a um sítio isolado e não na corrente sanguínea, tal como em uma cavi- dade do corpo ou em um lúmen de um órgão. Dosagens substancialmente maiores (por exemplo, 10 a 100 mg ou mais) são possíveis na administração oral, nasal ou tópica. A administração inicial da mistura pode ser seguida pela imunização de reforço da mesma mistura diferente, com pelo menos um reforço, tais como dois reforços.

[097]Em algumas formas de realização, a administração é iniciada antes do primeiro sinal de sintomas da doença, ou no primeiro sinal de exposição possível ou real a Neisseria patogênica. Sem limitar a invenção a uma teoria, os anticorpos imu- noprotetores para N. meningitidis e/ou N. gonorrhoeae podem ser gerados pela imu- nização com uma composição imunogênica.

[098]Os anticorpos imunoprotetores para N. meningitidis e/ou N. gonorrhoeae podem ser administrados a um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) para fornecer imunidade passiva, para prevenir a ocorrência de infecção ou doença, ou como uma terapia para melhorar o resultado clínico em pacientes com doença esta- belecida (por exemplo, taxa de complicação diminuída, tal como choque, taxa de mor- talidade diminuída ou morbidez diminuída, tal como surdez). Os anticorpos adminis- trados a um indivíduo que é de uma espécie, exceto a espécie em que são criados, são frequentemente imunogênicos. Assim, por exemplo, anticorpos murinos ou porci- nos administrados a um ser humano frequentemente induzem uma resposta imunoló- gica contra o anticorpo. As propriedades imunogênicas do anticorpo são reduzidas por meio da alteração das porções, ou a totalidade, do anticorpo em sequências ca- racteristicamente humanas, desse modo, produzindo anticorpos quiméricos ou huma- nos, respectivamente.

[099]Anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina compreendendo uma porção humana e não humana. Mais especificamente, a região de combinação de antígeno (ou região variável) de um anticorpo quimérico humanizado é derivada de uma fonte não humana (por exemplo, murina), e a região constante do anticorpo qui- mérico (que confere função efetora biológica à imunoglobulina) é derivada de uma fonte humana. O anticorpo quimérico deve apresentar a especificidade de ligação ao antígeno da molécula de anticorpo não humano e a função efetora conferida pela mo- lécula de anticorpo humano. Um grande número de métodos para gerar anticorpos quiméricos é bem conhecido aos técnicos no assunto (veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.502.167, 5.500.362, 5.491.088, 5.482.856, 5.472.693, 5.354.847,

5.292.867, 5.231.026, 5.204.244, 5.202.238, 5.169.939, 5.081.235, 5.075.431 e

4.975.369). Um método alternativo é a geração de anticorpos humanizados por meio da ligação da regiões CDR de anticorpos não humanos às regiões constantes huma- nas por técnicas de DNA recombinante. Veja Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 a 10033 (1989) e WO 90/07861.

[0100]Anticorpos completamente humanos também são úteis. Os anticorpos humanos consistem totalmente de sequências de polipeptídeos caracteristicamente humanas. Os anticorpos humanos desta invenção podem ser produzidos por uma am- pla variedade de métodos (veja, por exemplo, Larrick et al., Patente U.S. No

5.001.065). Em uma forma de realização, os anticorpos humanos da presente inven- ção são produzidos inicialmente em células de trioma (descendentes de três células, duas humanas e uma de camundongo). Os genes que codificam os anticorpos depois são clonados e expressados em outras células, particularmente, células de mamíferos não humanos. O método geral para produzir anticorpos humanos pela tecnologia do trioma foi descrita por Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361 a 367, Ostberg, Patente U.S. No 4.634.664, e Engelman et al., Patente U.S. No 4.634.666. Foi descoberto que os triomas produzem anticorpo de forma mais estável do que hibridomas habituais preparados a partir de células humanas.

[0101]Métodos para produzir e formular anticorpos adequados para a admi- nistração a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano) são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser fornecidos em uma composição far- macêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo e um excipiente farmacêutico (por exemplo, solução salina). A composição farmacêutica pode incluir opcionalmente outros aditivos (por exemplo, tampões, estabilizadores, preservantes e semelhantes). Uma quantidade eficaz de anticorpo é, em geral, uma quantidade eficaz para fornecer proteção contra doença ou sintomas por Neisseria durante um período desejado, por exemplo, um período de pelo menos cerca de 2 dias a 10 dias ou 1 mês a 2 meses).

PorB Recombinante Quimérica

[0102]Os polipeptídeos de PorB recombinante quimérica são mostrados nas FIGS. 11A a 11B e SEQ ID NOs; 39 a 51. Estas sequências de PorB não ocorrem naturalmente. Estes polipeptídeos de PorB recombinante quimérica podem ser inclu- ídos em um Neisseria. Uma cepa de Neisseria que expressa a PorB recombinante quimérica é PorB+. Os polipeptídeos podem ser produzidos que são pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idênticos a estas proteínas.

[0103]Moléculas de ácidos nucleicos, tais como DNA e RNA, podem ser pro- duzidas codificando estes polipeptídeos de PorB recombinante quimérica. Estes poli- nucleotídeos incluem sequências de DNA, cDNA e RNA que codificam o polipeptídeo de interesse. Mutações silenciosas na sequência codificante resultam da degenera- ção (isto é, redundância) do código genético, em que mais do que um códon pode codificar os mesmos resíduos de aminoácidos. Assim, por exemplo, leucina pode ser codificada por CTT, CTC, CTA, CTG, TTA ou TTG; serina pode ser codificada por TCT, TCC, TCA, TCG, AGT ou AGC; asparagina pode ser codificada por AAT ou AAC; ácido aspártico pode ser codificado por GAT ou GAC; cisteína pode ser codificada por TGT ou TGC; alanina pode ser codificada por GCT, GCC, GCA ou GCG; glutamina pode ser codificada por CAA ou CAG; tirosina pode ser codificada por TAT ou TAC; e isoleucina pode ser codificada por ATT, ATC ou ATA. As Tabelas que mostram o có- digo genético padrão podem ser encontradas em várias fontes (por exemplo, L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3.sup.a Edição, W.H. 5 Freeman e Co., NY). As moléculas de ácidos nucleicos podem ser facilmente produzidas por um técnico no assunto, usando as sequências de aminoácidos fornecidas neste relatório, e o código genético.

[0104]Uma molécula de ácido nucleico pode ser clonada ou amplificada por métodos in vitro, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase (LCR), o sistema de amplifcação com base na transcrição (TAS), o sistema de replicação de sequência autossustentado (3SR) e o sistema de amplifica- ção de replicase Qβ (QB). Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica a proteína pode ser isolado pela reação em cadeia da polimerase de cDNA usando iniciadores com base na sequência de DNA da molécula. Uma ampla variedade de metodologias de clonagem e amplificação in vitro é bem conhecida aos técnicos no assunto. Méto- dos de PCR são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No 4,683,195; Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; e Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

[0105]Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo de PorB recombinante quimérico pode ser incorporada em um vetor capaz de expressão em uma célula hospedeira, usando procedimentos de biologia molecular estabeleci- dos. Por exemplo, ácidos nucleicos, tais como cDNAs, que codificam o polipeptídeo de PorB recombinante quimérico, podem ser manipulados com procedimentos pa- drão, tais como digestão com enzimas de restrição, preenchimento com DNA polime- rase, deleção por exonuclease, extensão por desoxinucleotídeo transferase terminal, ligação de sequências de DNA sintéticas ou clonadas, alteração de sequência dirigida ao sítio via intermediário de bacteriófago de fita única ou com o uso de oligonucleotí- deos específicos em combinação com PCR ou outra amplificação in vitro.

[0106]Procedimentos exemplares suficientes para guiar um técnico no as- sunto através da produção de vetor capaz de expressão em uma célula hospedeira (tal como um vetor adenoviral) que inclui uma sequência de polinucleotídeos que co- difica um polipeptídeo de PorB recombinante quimérico podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora- tory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (e Suplementos até 2003); e Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4a ed., Wiley & Sons, 1999.

[0107]Tipicamente, uma sequência de polinucleotídeos que codifica um poli- peptídeo de PorB recombinante quimérico é ligada de maneira operável às sequên- cias controle transcricionais, incluindo, por exemplo, um promotor. Um promotor é uma sequência de polinucleotídeos reconhecida pela maquinaria transcricional da célula hospedeira (ou maquinaria sintética introduzida) que está envolvida na iniciação da transcrição.

[0108]Promotores exemplares incluem promotores virais, tais como promotor do gene precoce imediato de citomegalovírus (“CMV”), timidina cinase (“tk”) do vírus do herpes simples, Unidade de transcrição precoce SV40, polioma, retrovírus, papi- loma vírus, vírus da hepatite B e vírus da imunodeficiência humana e de símio. Outros promotores são isolados a partir de genes de mamíferos, incluindo a cadeia pesada de imunoglobulina, cadeia leve de imunoglobulina, receptor de células T, HLA DQ α e DQ β, interferon β, interleucina-2, receptor de interleucina-2, classe II do MHC, HLA- DRα, β-actina, creatina cinase do músculo, pré-albumina (transtirretina), elastase I, metalotioneína, colagenase, albumina, fetoproteína, β-globina, c-fos, c-HA-ras, insu- lina, molécula de adesão às células neurais (NCAM), α1-antitripsina, H2B (TH2B) his- tona, colágeno tipo I, proteínas reguladas por glicose (GRP94 e GRP78), hormônio de crescimento do rato, amiloide sérico humano A (SAA), troponina I (TNI), fator de cres- cimento derivado de plaquetas e distrofina e promotores específicos para queratinóci- tos e células epiteliais.

[0109]O promotor pode ser induzível ou constitutivo. Um promotor induzível é um promotor que é inativo ou exibe baixa atividade, exceto na presença de uma subs- tância indutora. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não são limitados a MT II, MMTV, colagenase, estromelisina, SV40, murino MX gene, α-2-macroglobulin, MHC classe I gene h-2kb, HSP70, proliferina, fator de necrose tumoral, ou promotor do gene do hormônio estimulante da tireoide.

[0110]Tipicamente, o promotor é um promotor constitutivo que resulta em al- tos níveis de transcrição após a introdução em uma célula hospedeira na ausência de fatores adicionais. Opcionalmente, as sequências controle de transcrição incluem um ou mais elementos acentuadores, que são sítios de reconhecimento de ligação para um ou mais fatores de transcrição que aumentam a transcrição acima daquela obser- vada para o promotor mínimo sozinho.

[0111]Pode ser desejável incluir um sinal de poliadenilação para efetuar a ter- minação e poliadenilação apropriadas do transcrito do gene. Sinais de poliadenilação exemplares foram isolados do hormônio de crescimento bovino, SV40 e dos genes da timidina cinase do vírus do herpes simples. Qualquer um destes ou outros sinais de poliadenilação podem ser utilizados no contexto dos vetores de adenovírus descritos neste relatório.

[0112]Os polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de PorB recombi- nante quimérico incluem um DNA recombinante que é incorporado em um vetor em um plasmídeo ou vírus autonomamente replicante ou no DNA genômico de um pro- carionte ou eucarionte, ou que existe como uma molécula separada (tal como um cDNA) independente de outras sequências. Os nucleotídeos podem ser ribonucleotí- deos, desoxirribonucleotídeos ou formas modificadas de qualquer nucleotídeo. O termo inclui formas únicas e duplas de DNA.

[0113]Vetores virais também podem ser preparados codificando o polipeptí- deo de PorB recombinante quimérico. Vários vetores virais foram construídos, inclu- indo polioma, SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol., 73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39 a 6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616 a 629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407 a 4412; Quantin et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 89:2581 a 2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143 a 155; Wilkinson et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233 a 2239; Stratford-Per- ricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241 a 256), vírus da vacínia (Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495 a 499), vírus adeno-associado (Muzyczka, 1992, Curr.

Top. Microbiol. Immunol., 158:91 a 123; Em et al., 1990, Gene, 89:279 a 282), vírus do herpes, incluindo HSV e EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67 a 90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11 a 19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol., 1:337 a 371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189 a 2199), vírus Sindbis (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161 a 1167; Patentes U.S. Nos 5.091.309 e 5.2217.879), alfavírus (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18 a 22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371 a 11377) e retrovírus de aves (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:749 a 754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391 a 3397), origem murina (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1 a 24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431 a 437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730 a 1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401 a 407) e humana (Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370 a 5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol., 66:2731 a 2739). Vetores de baculovírus (poliedrovírus multinuclear de Autographa californica; AcMNPV) também são conhecidos na técnica e podem ser obtidos a partir de fontes comerciais (tais como PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Strata-

gene, La Jolla, Calif.). Assim, em uma forma de realização, o polinucleotídeo que co- difica um polipeptídeo de PorB recombinante quimérico é incluído em um vetor viral.

Vetores adequados incluem vetores de retrovírus, vetores de ortopox, vetores de avi- pox, vetores de fowlpox, vetores de capripox, vetores de suipox, vetores adenovirais, vetores do vírus do herpes, vetores de alfa vírus, vetores de baculovírus, vetores do vírus Sindbis, vetores do vírus da vacínia e vetores de poliovírus. vetores exemplares específicos são vetores de poxvírus, tais como vírus da vacínia, vírus de fowlpox e um vírus da vacínia altamente atenuado (MVA), adenovírus, baculovírus, levedura e se- melhantes.

[0114]O polipeptídeo de PorB recombinante quimérico ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de PorB recombinante quimérico, conforme divulgado neste relatório, pode ser formulado de várias maneiras. As composições farmacêuti- cas podem incluir o polipeptídeo de PorB recombinante quimérico, o portador farma- ceuticamente aceitável e, opcionalmente, um adjuvante. Os portadores farmaceutica- mente aceitáveis e adjuvantes são divulgados acima e são úteis com um polipeptídeo de PorB recombinante quimérico divulgado ou um polinucleotídeo que codifica o poli- peptídeo de PorB recombinante quimérico.

EXEMPLOS

[0115]A proteína porina PorB é a proteína de membrana externa dominante (OMP) sobre a superfície meningocócica e foi proposta como uma candidata à vacina MenB. Expressada em todos os isolados clínicos conhecidos, acredita-se que seja essencial para a sobrevivência meningocócica in vivo e não está sujeira à variação de fase (Abad et al. (2006) Clin Vaccine Immunol 13: 1087 a 1091). Tanto a PorB nativa quanto a recombinante induzem a produção de anticorpos bactericidas (Poolman et al. (1983) Infect Immun 40: 398 a 406, Wright et al. (2002) Infect Immun 70: 4028 a 4034), e anticorpos específicos de PorB são gerados em resposta à imunização com vacinas de vesícula de membrana externa (OMV) de N. meningitidis (Bash et al.

(2000) FEMS Immunol Med Microbiol 29: 169 a 176, Marzoa et al. (2012) Vaccine 30: 2387 a 2395, Norheim et al. (2012) Scand J. Immunol 76: 99 a 107), destacando a interação direta de PorB com o sistema imune do hospedeiro.

[0116]As respostas do anticorpo induzidas por PorB são dirigidas contra seis alças variáveis expostas à superfície que diferem em sequência dependendo do so- rotipo. Embora N. meningitidis seja naturalmente competente e o mosaicismo genético porB forneça evidência para troca genética horizontal e forte seleção positiva, as se- quências de alguns sorotipos de PorB comumente associados com doença invasiva são frequentemente conservados, questionando a interação de sequências de alça de PorB específicas no envolvimento imune.

Exemplo 1 Proteínas PorB Recombinantes Quiméricas (rPorB) e Cepas que expressam PorB Isogênicas

[0117]Neste exemplo, foi demonstrado que a ligação do anticorpo a um epí- topo PorB pode ser alterada pelas mutações de sequência nas alças não epítópicas.

Através da construção de tipos de PorB quiméricos (veja as Figs. 11A a 11B) e simu- lações de dinâmica molecular de PorB, foi demonstrado que as alças adjacentes e não adjacentes à alça do epítopo podem acentuar ou diminuir a ligação do anticorpo, um fenótipo que se correlaciona com a atividade bactericida sérica.

[0118]PorB pode se automontar em homotrímeros e é conhecida por interagir com outras OMPs para formar complexos proteicos maiores. Um painel de cepas mu- tantes de deleção de OMP seletiva (Fig. 1) foi construída para analisar o impacto da formação de complexo sobre a ligação de anticorpos específicos de PorB (Fig. 2). A deleção de PorA e RmpM resultou em ligação do anticorpo diminuída à PorB e títulos bactericidas menores em um ensaio de morte dependente de PorB.

Exemplo 2 Ensaios Bactericidas Séricos

[0119]Z15 é um mAb bactericida; ensaios bactericidas séricos (SBAs) foram realizados para avaliar a morte mediada pelo complemento. Embora os títulos tenham sido baixos, as únicas cepas nas cepas híbridas isogênicas que expressam PorB qui- mérica que foram consistentemente mortas foram aquelas que foram ligadas por Z15 mais eficazmente nos ensaios dot blot de células inteiras, isto é, a cepa que expressa PorB MC58 e os dois mutantes L54-L64, M(1-4)C(5-6)M(7-8) e M(1-4)B(5-6)M(7-8). Assim, diminuições na ligação de mAb associada às alterações nas sequências não epitópicas correlacionaram-se a uma redução na atividade de morte dependente do anticorpo. Exemplo 3 OMV a partir de cepas isogênicas de PorA(-) com várias PorB

[0120]Nas seguintes tabelas, o antígeno imunizante usado para gerar os so- ros imunes é listado na coluna da extrema esquerda e a cepa que está sendo testada (morta) no ensaio bactericida é mostrada na primeira linha no topo de cada coluna.

Os números são a recíproca da maior diluição que mata pelo menos 50 % das bacté- rias. Consequentemente, um número maior significa que há uma morte mais potente, isto é, uma concentração maior dos anticorpos funcionais (protetores).

[0121]A Tabela A abaixo é apresentada a partir dos experimentos com OMV a partir de cepas isogênicas de PorA(-) (fundo MC58), mas com PorB diferente. Os antissoros gerados mataram todas as 4 cepas do tipo selvagem testadas. Os altos títulos contra a cepa MC58 para todas podem ser explicados, pelo fato de que tal cepa é homóloga à cepa parental a partir da qual a OMV foi derivada, exceto para a expres- são de um tipo de PorB heterólogo e falta de expressão de PorA. Em geral, a maior proteção cruzada é aquela induzida pelo imunógeno OCh OMV (FIGS. 11A a 11B), em que a PorB é uma PorB quimérica construída não encontrada na natureza que não era imunogênica.

Tabela A MC58ΔporA::porB MC58 WT Cu385 WT Ch501 WT BB1350 WT

OMV Mc58 PorB Coelho 1 64 8 32 128 Mc58 PorB Coelho 2 512 4 32 16 Bb1350 PorB Coelho 256 16 16 16 1 Bb1350 PorB Coelho 256 16 16 512 2 Ch501 PorB Coelho 1 512 16 32 128 Ch501PorB Coelho 2 512 8 64 16 Och PorB Coelho 1 512 64 128 256 Och PorB Coelho 2 512 64 256 256 Cu385 coelho 1 1024 128 64 16 Cu385 Coelho 2 512 128 64 16

[0122]A Tabela B é de Bash et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2000 Nov;29(3):169 a 76), em que a OMV são das cepas do tipo selvagem e os antissoros testados contra a mesmas cepas do tipo selvagem (a nomenclatura após a cepa na coluna superior mostra o sorogrupo (cápsula); sorotipo (PorB); subsorotipo (PorA). A cepa M1.2 é negativa para PorA e classe 5. De maneira importante, H355 é similar a MC58 e apresenta a mesma PorA que Cu385. Neste experimento, os antissoros Cu385 reduziu a atividade bactericida, mas os antissoros H355 são bactericidas - mas apenas contra as duas cepas que compartilham o mesmo tipo de PorA. A Tabela B ilustra a especificidade de PorA de respostas imunes à OMV contendo PorA.

Tabela B Ch501 Cu385 M1,2 H355 OMV (B:4,15; nss) (B:4:P1,15) (B:4:P1-:P5-) (B:15:P1,15) Ch501 Coelho 1 6 a 12 12 a 48 6 a 12 6 a 12 Ch501 Coelho 2 12 a 48 12 a 48 12 a 48 6 a 12 Ch501 Coelho 3 12 a 48 12 a 48 12 a 48 - Cu385 Coelho 1 - - - - Cu385 Coelho 2 - 6 a 12 - -

H355 Coelho 1 - >48 - >48 H355 Coelho 2 - >48 - >48 Exemplo 7

[0123]Deleções únicas, duplas ou triplas dos genes que codificam as Proteí- nas de membrana externa PorA (ΔA), PorB (ΔB), e a proteína estabilizante de OMP RmpM (ΔR)

[0124]Neste exemplo, os mutantes foram gerados com deleções únicas, du- plas, ou triplas dos genes que codificam PorA (PorA- ou ΔA), PorB (PorB- ou ΔB) e a proteína estabilizante de OMP RmpM (RmpM-, ou ΔR) no fundo MC58.

[0125]Desenvolvimento e Caracterização: Pelo fato de que PorB é mais fre- quentemente encontrado no contexto de um homotrímero ou em associação com PorA em heterotrímeros (Sánchez et al. (2009) Vaccine 27: 5338 a 5343, Marzoa et al. (2009) Proteomics 9: 648 a 656), foi explorada a possibilidade de que diferenças na expressão de OMPs que interagem com PorB podem alterar a ligação de anticor- pos específicos de PorB. Uma série de mutantes foi gerada com deleções únicas, duplas ou triplas dos genes que codificam PorA (ΔA), PorB (ΔB) e RmpM (ΔR) no fundo MC58. A deleção apropriada foi confirmada por dot blot, PCR e análises de sequenciamento (Fig. 1A). OMVs obtidas a partir de cada uma das cepas não exibiram diferença no tamanho ou pureza quando avaliadas por microscopia eletrônica de cen- trifugação e transmissão de densidade OptiPrep, embora as OMVs ΔAB e ΔABR e suas respectivas cepas tenham expressado aproximadamente ~2 vezes menos a cáp- sula em relação às outras OMVs/cepas quando sondadas com SEAM12 anticapsular em um dot blot. Quando analisadas por intermédio de SDS-PAGE (Fig. 1B), não foram observadas grandes diferenças nos padrões de bandas observadas, exceto para a perda esperada de expressão de PorA e PorB nas cepas de deleção respectivas e níveis de PorA elevados em ΔB e ΔBR, um fenômeno que foi previamente descrito para o mutante único porB (Peak et al., 2015). Consequentemente, ΔB exibiu um au- mento nos níveis do transcrito de porA (variação de 2,83 ± 0,09 em relação ao WT)

quando examinado por PCR em tempo real quantitativa (qPCR), embora os níveis de porB em ΔA tenham sido inalterados. Apesar da expressão de PorB e cápsula similar, todas as OMVs deficientes de PorA e RmpM exibiram perfis de ligação diminuídos em relação ao tipo selvagem (WT) quando usadas para inibir competitivamente a ligação de Z15 a rMC58 (Fig. 2A, painel esquerdo), um fenótipo compatível com títulos bac- tericidas menores em um SBA dependente de Z15 (Tabela 1). A ligação de P7 a PorA foi apenas diminuída em ΔR em comparação às outras cepas (Fig. 2B, painel es- querdo).

TABELA 1. Atividade bactericida dependente do anticorpo monoclonal Z15 PorB de soros humanos contra a cepa MC58 WT e mutantes de deleção únicos, du- plos e triplos de OMP isogênicos. Os títulos são representados como a recíproca da maior diluição resultando em ≥50 % de morte em relação aos poços controle inativa- dos por calor sem Z15. Os resultados mostrados foram os mesmos para dois ensaios independentes.

Cepa Título WT >1024 ΔA 32 ΔB <4 ΔR 256 ΔAB <4 ΔAR 128 ΔBR <4 ΔABR <4

[0126]Quando as OMVs foram fracionadas por eletroforese em gel nativo azul (BNGE) e sondadas com os mesmos anticorpos para examinar a formação de com- plexo OMP, surgiram diferenças nos padrões de bandas. Ao passo que ΔA exibiu um fenótipo similar ao WT depois da sondagem com Z15 (Fig. 2A, painel direito) e soros policlonais adsorvidos ΔB MB1 e MB2, ΔR e ΔAR foram caracterizados por apenas uma banda grande que foi de peso molecular menor (MW). Esta mesma banda em ΔR também testada foi positiva quanto à presença de PorA (Fig. 2B, painel direito).

Quando porB foi deletada isoladamente ou em combinação com rmpM, a sondagem com P7 demonstrou a presença de uma banda que apresentou aproximadamente a mesma MW encontrada no WT e três que foram de MW maior (Fig. 2B, painel direito).

A maior destas (~700 kDa) foi confirmada previamente como um complexo de alto MW que consiste de PorA por espectrometria de massas (Marzoa et al. (2009) Prote- omics 9: 648 a 656).

[0127]Nocautes dos genes porA, porB e rmpM: As diferenças observadas por intermédio de immunoblot sugeriram que a deleção de OMP levou à formação de complexos contendo PorA e PorB atípicos. Para avaliar sua composição, BNGE foi realizado em OMVs. Pós-coloração com Coomassie R-250 revelou as mesmas ban- das dominantes observadas no western blot (Fig. 2C, painel superior), embora múlti- plas bandas de MW maior e menor tenham sido visíveis por coloração de prata (Fig.

2D, painel inferior). As bandas dominantes foram cortadas e a digestão em gel reali- zada, seguido por espectrometria de massas para identificação. A análise dos peptí- deos recuperados revelou a ausência de PorA, PorB e RmpM nos complexos das cepas nocaute respectivas e a presença de múltiplas proteínas que não foram detec- tadas nos complexos WT, incluindo aquelas envolvidas na redobra da proteína (GroEL e DsbD), síntese de aminoácidos (IlvC), glicólise (GapA, AceE) e metabolismo depen- dente da cadeia de transporte de elétrons (FixN, NqrA) (Tabela 2). Além de expressar muitas destas mesmas proteínas, o receptor dependente de TonB provável TdfH tam- bém foi encontrado nos complexos dominantes das cepas ΔBR e ΔABR, sugerindo que a deleção de PorB e RmpM em tandem diminui a aquisição de nutrientes e pode levar às alterações na expressão e metabolismo do gene meningocócico. Ensaios de viabilidade foram usados para sustentar este estudo, que mostrou crescimento dimi- nuído para as cepas em relação ao WT durante um curso de tempo de 8 h (Fig. 3A), incluindo uma redução significante no número de unidades formadoras de colônia (CFUs) (Fig. 3B) e produção de colônias menores, conforme avaliado pelo cresci- mento em meio sólido BHI (Fig. 3C). Embora os mutantes ΔB e ΔAB também tenham sido caracterizados por uma pequeno fenótipo de colônia (Fig. 3C), este efeito foi he- terogêneo e mantido na cultura repetida, sugerindo a presença de uma proteína não específica de PorA que pudesse compensar a pequena morfologia de colônia na pre- sença de RmpM. Tabela 2. Lista de proteínas identificadas a partir de complexos dominantes de OMVs mutantes de deleção de OMP. OMVs foram fracionadas via eletroforese em gel nativo azul, visualizadas com coloração Coomassie e cortadas do gel. Após a re- moção e tripsinização de SDS, os peptídeos foram extraídos dos fragmentos do gel e identificados usando cromatografia líquida unidimensional de fase reversa-espectro- metria de massas (1D LC-MS/MS). O complexo a partir do qual cada proteína é deri- vada é observado e corresponde às bandas observadas na Fig. 2C. As proteínas lis- tadas em negrito indicam aquelas não identificadas em complexos WT. Os números de Acesso Uniprot são fornecidos e são incorporados à título de referência, conforme disponível em 21 de Julho de 2017.

Cepa Compo- Função UnitProt ID Com- nentes plexo WT PorB Classe 3 OMP; porina Q6LD38 1, 2 PorA OMP Classe 1; porina P0DH58 1, 2 RmpM Classe 4 OMP; proteína de integri- P0A0V3 1, 2 Opa dade da membrana O30755 1, 2 Opc Proteína de opacidade Q9AE79 1, 2 NMB0378 Classe 5 OMP; adesina Q7DDQ8 1, 2 MtrE Transportador de fosfato inorgânico Q9JY68 1 TbpA Proteína do canal da bomba de efluxo Q9JPJ0 1, 2 NMA1697 de multifármaco A0A0H5QUW8 1, 2 LpdA2 Proteína de ligação à transferrina Q9JZ09 1, 2 LptD Lipoproteína provável Q9K187 1, 2

NMB1964 Di-hidrolipoil desidrogenase Q7DD60 1 AniA Proteína de montagem de LPS Q9JYE1 1, 2 NorB Proteína não caracterizada Q9JYE2 1 Pnp Nitrito redutase contendo cobre Q9K062 1, 2 PetB Óxido nítrico redutase Q9JXH0 2 PetC Polirribonucleotídeo nucleotidiltrans- Q9JXH1 2 NMB1805 ferase Q7DD79 2 NMB1677 Citocromo b Q9JYA2 1 FixO Ubiquinol--citocromo c redutase, cito- Q9JY59 1, 2 FixP cromo c1 E1AA24 2 Citocromo c4 Citocromo c5 Citocromo c oxidase subunidade II Citocromo c oxidase subunidade III ΔA PorB Classe 3 OMP; porina Q6LD38 3, 4 RmpM Classe 4 OMP; proteína de integri- P0A0V3 3, 4 Opa dade da membrana O30755 3, 4 Opc Proteína de opacidade Q9AE79 3, 4 TbpA Classe 5 OMP; adesina Q9JPJ0 3, 4 NMA1697 Proteína de ligação à transferrina A0A0H5QUW8 4 LpdA2 Lipoproteína provável Q9JZ09 3, 4 LptD Di-hidrolipoil desidrogenase Q9K187 4 AniA Proteína de montagem de LPS Q9JYE1 3, 4 NorB Nitrito redutase contendo cobre Q9JYE2 4 Pnp Óxido nítrico redutase Q9K062 3, 4 PetC Polirribonucleotídeo nucleotidiltrans- Q9JXH1 3, 4 NMB1805 ferase Q7DD79 3, 4 FixO Ubiquinol--citocromo c redutase, cito- Q9JY59 3, 4 FixP cromo c1 E1AA24 3, 4 GroEL Citocromo c4 X5EPF8 3 GapA Citocromo c oxidase subunidade II C6SEX6 3 DsbD Citocromo c oxidase subunidade III Q9JYM0 4 Chaperonina 60 kDa Gliceraldeído-3-fosfato desidroge- nase Proteína de intercâmbio tiol:dissulfeto ΔB PorA OMP Classe 1; porina P0DH58 5, 6 RmpM Classe 4 OMP; proteína de integri- P0A0V3 5 Opa dade da membrana O30755 5, 6 NMB0378 Proteína de opacidade Q7DDQ8 6 MtrE Transportador de fosfato inorgânico Q9JY68 5 TbpA Proteína do canal da bomba de efluxo Q9JPJ0 5 LpdA2 de multifármaco Q9JZ09 5 LptD Proteína de ligação à transferrina Q9K187 5, 6 NMB1964 Di-hidrolipoil desidrogenase Q7DD60 5 AniA Proteína de montagem de LPS Q9JYE1 5, 6 Pnp Proteína não caracterizada Q9K062 5, 6 PetC Nitrito redutase contendo cobre Q9JXH1 6

NMB1805 Polirribonucleotídeo nucleotidiltrans- Q7DD79 6 FixN ferase Q7DD90 6 FixO Ubiquinol--citocromo c redutase, cito- Q9JY59 5, 6 DsbD cromo c1 Q9JYM0 5 Citocromo c4 Citocromo c oxidase subunidade I Citocromo c oxidase subunidade II Proteína de intercâmbio tiol:dissulfeto ΔR PorB Classe 3 OMP; porina Q6LD38 7 PorA OMP Classe 1; porina P0DH58 7 Opa Proteína de opacidade O30755 7 Opc Classe 5 OMP; adesina Q9AE79 7 PilE Proteína fimbrial (pilina) P05431 7 TbpA Proteína de ligação à transferrina Q9JPJ0 7 NMA1697 Lipoproteína provável A0A0H5QUW8 7 LptD Proteína de montagem de LPS Q9K187 7 AniA Nitrito redutase contendo cobre Q9JYE1 7 AceE Piruvato desidrogenase subunidade Q9JZ12 7 SucB E1 Q9JZP6 7 Componente de succiniltransferase NMB1677 do resíduo de di-hidrolipoillisina do Q9JYA2 7 FixN complexo 2-oxoglutarato desidroge- Q7DD90 7 FixO nase Q9JY59 7 FixP Citocromo c5 E1AA24 7 NqrA Citocromo c oxidase subunidade I Q9K0M3 7 GroEL Citocromo c oxidase subunidade II X5EPF8 7 Fhs Citocromo c oxidase subunidade III Q9JXY2 7 NADH-quinone redutase de translo- cação de Na(+) subunidade A Chaperonina 60 kDa Formiato--tetra-hidrofolato ligase ΔAB Opa Proteína de opacidade O30755 8 NMB0378 Transportador de fosfato inorgânico Q7DDQ8 8 TbpA Proteína de ligação à transferrina Q9JPJ0 8 AniA Nitrito redutase contendo cobre Q9JYE1 8 PetC Ubiquinol--citocromo c redutase, cito- Q9JXH1 8 NMB1805 cromo c1 Q7DD79 8 FixN Citocromo c4 Q7DD90 8 FixO Citocromo c oxidase subunidade I Q9JY59 8 Citocromo c oxidase subunidade II ΔAR TbpA Proteína de ligação à transferrina Q9JPJ0 9 AniA Nitrito redutase contendo cobre Q9JYE1 9 FixO Citocromo c oxidase subunidade II Q9JY59 9 ΔBR PorA OMP Classe 1; porina P0DH58 10 Opa Proteína de opacidade O30755 10, 11 NMB0378 Transportador de fosfato inorgânico Q7DDQ8 11 MtrE Proteína do canal da bomba de efluxo Q9JY68 10 NMA1697 de multifármaco A0A0H5QUW8 11

Lipoproteína provável LpdA2 Q9JZ09 10, 11 LptD Di-hidrolipoil desidrogenase Q9K187 11 Proteína de montagem de LPS TdfH Q7DDB6 11 Receptor dependente de TonB prová- AniA Q9JYE1 10, 11 vel Pnp Q9K062 10, 11 Nitrito redutase contendo cobre AceE Q9JZ12 11 PetB Polirribonucleotídeo nucleotidiltrans- Q9JXH0 11 ferase PetC Q9JXH1 11 Piruvato desidrogenase subunidade NMB1805 Q7DD79 11 FixN E1 Q7DD90 11 FixO Citocromo b Q9JY59 11 FixP Ubiquinol--citocromo c redutase, cito- E1AA24 11 GroEL cromo c1 X5EPF8 11 Citocromo c4 GapA C6SEX6 11 DsbD Citocromo c oxidase subunidade I Q9JYM0 11 Citocromo c oxidase subunidade II Fhs Q9JXY2 11 Citocromo c oxidase subunidade III Chaperonina 60 kDa Gliceraldeído-3-fosfato desidroge- nase Proteína de intercâmbio tiol:dissulfeto Formiato--tetra-hidrofolato ligase ΔABR Opa Proteína de opacidade O30755 12 NMB0378 Transportador de fosfato inorgânico Q7DDQ8 12 TbpA Proteína de ligação à transferrina Q9JPJ0 12 LptD Proteína de montagem de LPS Q9K187 12 TdfH Receptor dependente de TonB prová- Q7DDB6 12 AniA vel Q9JYE1 12 PetC Nitrito redutase contendo cobre Q9JXH1 12 NMB1805 Ubiquinol--citocromo c redutase, cito- Q7DD79 12 FixN cromo c1 Q7DD90 12 FixO Citocromo c4 Q9JY59 12 IlvC Citocromo c oxidase subunidade I Q9JYI2 12 Citocromo c oxidase subunidade II Cetol-ácido redutoisomerase TABELA 3. Oligonucleotídeos usado neste estudo. Os sítios de endonuclease de restrição e a sequência de absorção de DNA (DUS) são representados como sub- linhados e em negrito, respectivamente.

*Resíduos iniciadores numerados em relação à sequência de MC58.

Nome do Inicia- Sequência (5’ → 3’) SEQ Descrição dor ID NO: Construção da Cepa: Imunização de an- tígenos OMV PorB porBNdeIF GACTCATATGTTCAGACATGGAAT 1 Iniciador forward, CGCC amplifica porB ORF total; contém sítio de restrição de NdeI. porBBamHIR ATATGGATCCTTCAGACGGCGCAT 2 Iniciador reverso , TTTTATG amplifica porB ORF total; contém sítio de restrição de BamHI e DUS.

Construção da cepa: mutantes de dele- ção de OMP 3 por- ATATGGATCCTGCAATGCCCTCCA Iniciador forward, BUPBamHIF ATAC amplifica ~290 bp 5’ MC58 porB re- gião a montante; contém sítio de restrição de BamHI. porBUPXbaIR CGCGTCTAGATGCTGTATTCCTTT 4 Iniciador reverso , TTTGGTTAA amplifica ~290 bp 5’ MC58 porB re- gião a montante; contém sítio de restrição de XbaI. porBDOWNS- ATATGCATGCTCTGCAAAGATTGG 5 Iniciador forward, phIF TATCAACA amplifica 310 bp 3’ MC58 porB re- gião a jusante; contém SphI res- trição sítio. porBDO- ATATAAGCTTCAGACGGCTGAAAC 6 Iniciador reverso , WNHindIIIR TCAACG amplifica 310 bp 3’ MC58 porB re- gião a jusante; contém sítio de restrição de Hin- dIII e DUS.

eryXbaIF ATATTCTAGACACCATAGGCTTTA 7 Iniciador forward, GAGAAGTATTTGAATGC amplifica cassete ermB 1,1 kb; con- tém sítio de restri- ção de XbaI. erySphIR CCGAGCATGCTTATTATTATTTCCT 8 Iniciador reverso , CCCGTTAAATAATAG amplifica cassete ermB 1,1 kb; con- tém sítio de restri- ção de SphI. po- ATATGGATCCAAGCCGAGACTGCA 9 Iniciador forward, rAUPBamHIF TC amplifica ~260 bp 5’ MC58 porA re- gião a montante; contém sítio de restrição de BamHI. porAUPXbaIR CGCGTCTAGAATCGGCTTCCTTTT 10 Iniciador reverso , GTAAAT amplifica ~260 bp 5’ MC58 porA re- gião a montante; contém sítio de restrição de XbaI. porADOWNS- ATATGCATGCATATCGGGGCGG 11 Iniciador forward, phIF amplifica ~250 bp 3’ MC58 porA re- gião a jusante; contém sítio de restrição de SphI. porA- ATATAAGCTTCAGACGGCGCATTT 12 Iniciador reverso , DOWNHindIIIR TTATGC amplifica ~250 bp 3’ MC58 porA re- gião a jusante; contém sítio de restrição de Hin- dIII e DUS. kanXbaIF ATATTCTAGAGGGAAAGCCACTTT 13 Iniciador forward, GTGTCTCA amplifica cassete aph3A ~950 bp; contém sítio de restrição de XbaI. kanSphIR GTATGCATGCTTATTATTAGAAAAA 14 Iniciador reverso , CTCATCGAGCATC amplifica cassete aph3A ~950 bp; contém sítio de restrição de SphI.

rmpMUPBamHI TAGTGGATCCAATCGTGCGATATG 15 Iniciador forward, F GAA amplifica ~250 bp 5’ MC58 rmpM re- gião a montante; contém sítio de restrição de BamHI. rmpMUPXbaIR CGCGTCTAGATTTATTCCCTCATTA 16 Iniciador reverso , AATTTGTACAGC amplifica ~250 bp 5’ MC58 rmpM re- gião a montante; contém sítio de restrição de XbaI. rmpMDOWNS- GTATGCATGCGGCTAGGCAATATC 17 Iniciador forward, phIF TTG amplifica ~260 bp 3’ MC58 rmpM re- gião a jusante; contém sítio de restrição de SphI. rmpMDOWNHi ATATAAGCTTCAGACGGCGTTAAT 18 Iniciador reverso , ndIIIR CCACTATAAAGC amplifica ~260 bp 3’ MC58 rmpM re- gião a jusante; contém sítio de restrição de Hin- dIII e DUS. chlXbaIF GTATTCTAGACGCCGAATAAATAC 19 Iniciador forward, CTGTGACGG amplifica cassete cat ~870 bp; con- tém sítio de restri- ção de XbaI. chlSphIR ATATGCATGCTTATTATTACGCCC 20 Iniciador reverso , CGCC amplifica cassete cat ~870 bp; con- tém sítio de restri- ção de SphI.

Construção da cepa: tipos de PorB híbri- dos* 21 porBORFXbaIF ATATTCTAGAATGAAAAAATCCCTG Iniciador forward, ATTGCCCTGAC posição de amino- ácidos de porB M1; contém sítio de restrição de XbaI.

porBF189R GAAGAAGCCACCGTTTTTGTAGTT 22 iniciador reverso, GAAGC posição de amino- ácidos de porB F189; contém 15 bp sobrepostos com porBN185F. porBN185F AACGGTGGCTTCTTCGTGCAATAT 23 Iniciador forward, G posição de amino- ácidos de porB N185; contém 15 bp sobrepostos com porBF189R. porBS267R AGAAACTCGGGGCGTTACGTTG 24 Iniciador reverso, posição de amino- ácidos de porB S267; contém 15 bp sobrepostos com porBT263F. porBT263F ACGCCCCGAGTTTCTTACGC 25 Iniciador forward, porB posição de aminoácidos T263; contém 15 bp sobrepostos com porBS267R. porBORFSphIR ATATGCATGCTTAGAATTTGTGGC 26 Iniciador reverso , GCAG porB posição de aminoácidos F331; contém sí- tio de restrição de SphI. kanSphIF ATATGCATGCGAAAGCCACTTTGT 27 Iniciador forward, GTCT usado com kanS- phIR para amplifi- car o cassete aph3A ~950 bp; contém sítio de restrição de SphI.

Síntese de rPorB/rPorA 28 porBNdeIF2 ATATCATATGGACGTTACCCTGTA Iniciador forward, CGGCA amplifica porB ORF iniciando no aminoácido D20; contém sítio de restrição de NdeI.

porBBlpIR ATATGCTCAGCTTAGAATTTGTGG 29 Iniciador reverso , CGC amplifica porB ORF iniciando no aminoácido D20; contém sítio de restrição de BlpI. porANdeIF ATATCATATGGATGTCAGCCTATA 30 Iniciador forward, CGGCGA amplifica porA ORF iniciando no aminoácido D20; contém sítio de restrição de NdeI. porABlpIR ATATCTCGAGGAATTTGTGGCGCA 31 Iniciador forward, AAC amplifica porA ORF iniciando no aminoácido D20; contém sítio de restrição de BlpI. Análise de qPCR 32 porAF TGTCGGACGTAATGCTTTTG Iniciador forward, amplifica o trans- crito 199 bp porA. porAR GGCAATTTCGGTCGTACTGT 33 Iniciador reverso , amplifica o trans- crito 199 bp porA. porBF CAATACGCGCTTAACGACAA 34 Iniciador forward, amplifica o trans- crito 200 bp porB. porBR GAAGCGTACAGGGCATCATT 35 Iniciador reverso , amplifica o trans- crito 200 bp porB. 16SF GCGCAACCCTTGTCATTAGT 36 Iniciador forward, amplifica o trans- crito 198 bp 16S rRNA. 16SR CGGACTACGATCGGTTTTGT 37 Iniciador reverso , amplifica o trans- crito 198 bp 16S rRNA.

Exemplo 8 Materiais e Métodos para os Exemplos 1 a 7

[0128]Condições de crescimento bacteriano: Cepas de N. meningitidis foram rotineiramente incubadas durante a noite a 37 graus Celsius na presença de CO2 5 %

em placas de ágar BBL Brain Heart Infusion (BHI) (Becton Dickinson, Sparks, MD) suplementadas com HyClone Donor Equine Serum inativado por calor 5 % (Thermo- Fisher Scientific, Waltham, MA). Para crescimento em cultura, Bacto Tryptic Soy Broth (TSB) (Becton Dickinson) foi usado com agitação a 250 rpm. Cepas de Escherichia coli foram cultivadas em Difco Luria Bertani Miller Broth ou em placas de ágar LB (Becton Dickinson). Os antibióticos foram adicionados, conforme necessário, nas se- guintes concentrações: N. meningitidis, eritromicina (3 microgramas ml-1), canamicina (50 microgramas ml-1), cloranfenicol (5 microgramas ml-1); E. coli, eritromicina (300 microgramas ml-1), canamicina (50 microgramas ml-1), cloranfenicol (50 microgramas ml-1), ampicilina (100 microgramas ml-1).

[0129]Construção de antígenos OMV e imunizações de coelho: O par de ini- ciador porBNdeIF/porBBamHIR (Tabela 3) foi usado para amplificar o gene porB de cepas WT MC58, Cu385, BB1350, e Ch501; produtos de gene foram digeridos com NdeIF e BamHI e ligados em pUC18. Os plasmídeos foram verificados por sequenci- amento e transformados em MC58 porA::kan (presente generoso de D. M. Granoff).

Os transformantes foram selecionados e a expressão de PorB confirmada via dot blot com sorotipo 15 e 4 mAbs, Z15 (8B5-5-G9) e Z4 (5DC4C8G8) (National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), South Mimms, Hertfordshire, Inglaterra).

[0130]Durante o sequenciamento da cepa meningocócica confirmatório, foi descoberto que a transformação com pUC18-Cu385 resultou em um evento de cruza- mento em um dos isolados entre o gene MC58nativo e a Cu385 porB na extremidade de L1 (Fig. 4). Esta cepa, designada MC58 porA::kan-OCh (também conhecida como OCh), e as cepas isogênicas que expressam os genes WT porB, foram incubadas no caldo TSB e OMVs desentoxicadas foram obtidas, conforme previamente descrito, por incubação em desoxicolato 5 % (Bash et al. (2000) FEMS Immunol Med Microbiol 29: 169 a 176). O teor de proteína e níveis de endotoxina foram estimados usando o Pi-

erce BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher) e LAL Chromogenic Endotoxin Quantita- tion Kit (ThermoFisher), respectivamente, de acordo com os protocolos do fabricante.

[0131]Os coelhos foram imunizados com uma mistura equivalente de 25 mi- crogramas de OMVs/Imject Alume Adjuvant (ThermoFisher) via injeção intramuscular do membro traseiro. Duas imunizações adicionais foram administradas em intervalos de três semanas e as amostras sanguíneas foram coletadas uma semana antes da primeira imunização e duas semanas após a segunda e terceira imunizações.

[0132]Geração de mutantes de deleção de OMP: Os pares de iniciadores por- BUPBamHIF/porBUPXbaIR, porAUPBamHIF/porAUPXbaIR e rmpMUPBamHIF/rmpMUPXbaIR foram usados para amplificar por PCR a região pro- motora de porB, porA e rmpM, respectivamente. Cada produto foi digerido com BamHI e XbaI e inserido em pGEM-3Z (Promega, Madison, WI). A região a jusante de cada gene depois foi amplificada usando porBDOWNSphIF/porBDOWNHindIIIR, porA- DOWNSphIF/porADOWNHindIIIR e rmpMDOWNSphIF/rmpMDOWNHindIIIR; os pro- dutos foram digeridos com SphI e HindIII e inseridos no vetor correspondente ao gene.

Os cassetes ermB, aph3A e cat que codificam resistência à eritromicina, canamicina e cloranfenicol, respectivamente, foram amplificados usando eryXbaIF/erySphIR, kan- XbaIF/kanSphIR e chlXbaIF/chlSphIR. A digestão com XbaI/SphI e inserção em veto- res resultou na formação dos plasmídeos pKAM53, pKAM60 e pKAM106. Os plasmí- deos foram linearizados e usados para transformar a cepa MenB MC58. As colônias foram triadas para recombinação homóloga dupla via crescimento em antibióticos e PCR. A deleção de proteínas PorB e PorA foi confirmada via dot blot com mAbs Z15 e P7 (MN14C11,6; NIBSC). A deleção do gene foi confirmada em todos os mutantes via análise de sequenciamento.

[0133]Construção de cepas de PorB híbridas: para gerar genes porB quiméri- cos (Figs. 11A a 11B), uma série de amplificações de PCR sobrepostas foi realizada.

Para M(1-4)C(5-8) e M(1-4)B(5-8), pares de iniciadores porBORFXbaIF/porBF189R e porBN185F/porBORFSphIR foram usados para amplificar L1-L4 de MC58 porB e L5- L8 de Cu385/BB1350 porB, respectivamente; para gerar M(1-6)C(7-8) e M(1-6)B(7-8), pares de iniciadores porBORFXbaIF/porBS267R e porBT263F/porBORFSphIR foram usados para amplificar as porções de gene das mesmas cepas. Os produtos de cada reação depois foram purificados em gel e uma segunda amplificação por PCR foi con- duzida usando o par de iniciador porBORFXbaIF/porBSphIR. O produto da PCR so- breposta foi digerido com XbaI e SphI e inserido em pKAM53. A inserção de porB e remoção de ermB apropriadas foram verificadas por meio da avaliação das colônias quanto à resistência à ampicilina e sensibilidade à eritromicina.

[0134]Para M(1-4)C(5- 6)M(7-8) e M(1-4)B(5-6)M(7-8), o mesmo procedi- mento foi usado, exceto que duas amplificações de PCR sobrepostas foram realiza- das. Na primeira, porBORFXbaIF/porBF189R foi usado para amplificar MC58 L1-L4; L5-L6 de Cu385 ou BB1350 foi amplificado com porBN185F/porB267R. L1-L6 híbridos foram reunidos por amplificação usando porBORFXbaIF/porB267R. MC58 L7-L8 de- pois foi obtido por PCR com porBT263F/porBORFSphIR. O produto de gene quimérico final foi gerado por amplificação por PCR usando porBORFXbaIF/porBORFSphIR. Ve- tores de porB mutantes recíprocos (aqueles portadores da sequência do sorotipo 4 na extremidade 5’ do gene) para todos os tipos quiméricos foram criados usando os mes- mos pares de iniciadores descritos acima, mas as cepas a partir das quais as sequên- cias de alça de porB foram amplificadas foram trocadas. Os vetores que expressam os quatro tipos WT PorB e o tipo OCh também foram amplificados usando o par de iniciador porBORFXbaIF/porBORFSphIR e DNA genômico modelo isolado das cepas imunizantes.

[0135]Após a inserção dos genes WT e porB quiméricos em seus vetores res- pectivos, o cassete aph3A foi amplificado por PCR com kanSphIF/kanSphIR e depois foi digerido com SphI e inserido em cada plasmídeo. Os plasmídeos foram lineariza-

dos e usados para transformar a cepa ΔB de deleção de OMP. Os isolados que exibi- ram um fenótipo sensível à eritromicina, resistente à canamicina indicativo de um evento de recombinação homóloga dupla foram triados via PCR e dot blot para a ex- pressão de PorB.

[0136]Síntese de PorB e PorA recombinante: O par de iniciador porB- NdeIF2/porBBlpIR foi usado para amplificar cada um dos tipos WT e PorB quimérica a partir dos constructos de plasmídeo pGEM-3Z-porB-kan descritos na seção acima.

Cada um dos produtos foi purificado em gel, digerido com NdeI e BlpI, e inserido em pET-28a(+) (Promega). Os vetores rPorB depois foram transformados na cepa de ex- pressão de E. coli BL21(DE3) ΔompA, a construção da qual foi previamente descrita (Qi et al. (1994) Infect Immun 62: 2432 a 2439). Após a triagem e sequenciamento, as cepas portadoras de plasmídeo foram induzidas para a expressão de rPorB His-eti- quetada com isopropil beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) 0,5 mM. As culturas fo- ram centrifugadas e a pelota foi colocada em suspensão em 1X BugBuster Protein Extraction Reagent (EMD Millipore, Temecula, CA) em tampão Tris (Tris 30 mM, clo- reto de sódio 300 mM, pH 8,0), suplementada com rLysozyme (EMD Millipore). Os corpos de inclusão foram purificados via centrifugação e lisados com ureia 8 M em tampão Tris. Os lisatos foram conduzidos através de resina Qiagen Ni-NTA Superflow (Valência, CA), e rPorB foi redobrado na coluna com detergente Zwittergent 3-14 0,1 % em tampão Tris. As proteínas foram eluídas com imidazol e dialisadas e a concen- tração da proteína foi estimada por BCA. PorA recombinante (sorossubtipo P1.7) tam- bém foi produzida a partir de WT MC58 usando o mesmo método. A amplificação de porA foi obtida com o par de iniciador porANdeIF/porABlpIR.

[0137]Purificação de OMV: As cepas mutantes de deleção de OMP e aquelas que expressam os tipos PorB quiméricos (híbridos) foram cultivadas em TSB durante 6 h com agitação (130 rpm), tempo no qual as células foram usadas para inocular uma grande cultura de TSB em lote cultivada durante 16 h com agitação. As bactérias fo- ram mortas por calor durante 1 h a 65 graus Celsius, centrifugadas durante 30 min em

50.000 x g e colocadas em suspensão em água destilada. As células depois foram quebradas abertas via prensa francesa, conforme previamente descrito (Marzoa et al.

(2009) Proteomics 9: 648 a 656). Os detritos grandes foram removidos com centrifu- gação em 10.000 x g durante 15 min e o sobrenadante foi ultracentrifugado em 40.000 x g durante 30 min para purificar as OMVs. As OMVs foram colocadas em suspensão em uma concentração de 1 mg/ml em água destilada e armazenadas a -80 graus Celsius até o uso posterior. Para as imunizações dos animais, as OMVs desentoxica- das por LOS foram obtidas, conforme previamente descrito (Bash et al., 2000).

[0138]Immunoblots/dot blots: 500 ng de WT e rPorB quiméricas (híbridas) fo- ram fracionados via SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose iBlot (ThermoFisher). Alternativamente, 20 microgramas de OMVs a partir dos mutantes de deleção de OMP foram fracionados por eletroforese em gel nativo azul (BNGE) (Mar- zoa et al. (2009) Proteomics 9: 648 a 656) e os complexos de OMP foram transferidos para as membranas de difluoreto de polivinilideno iBlot (PVDF) (ThermoFisher). Para dot blots, as cepas de deleção de OMP foram cultivadas em placas BHI durante a noite e colocadas em suspensão a uma densidade óptica de OD600 nm = 1,0 em PBS. Após a incubação durante 1 h a 65 graus Celsius para matar por calor as bactérias, lisatos foram manchados em volumes de 5 microlitros sobre membranas de nitrocelu- lose. Todas as membranas foram bloqueadas com leite desnatado 10 % e sondadas com mAbs ou soros de anticorpos policlonais. As membranas foram lavadas, incuba- das com anticorpo secundário apropriado (IgG anti-camundongo de cabra ou anti-co- elho de cabra conjugada à peroxidase de raiz forte (HRP), Bio-Rad Laboratories, Her- cules, CA) e desenvolvidas com Pierce ECL Western Blotting Substrate (ThermoFis- her).

[0139]ELISAs Competitivos: Para ELISAs competitivos, placas Immulon 4

HBX (ThermoFisher) foram revestidas com 500 ng de rPorB ou rPorA em tampão car- bonato (carbonato de sódio 15 mM, bicarbonato de sódio 35 mM, pH 9,6) durante a noite a 4 graus Celsius. As placas foram lavadas em PBS Tween (0,05 %), bloqueadas em albumina de soro bovino 1 % (BSA) e sondadas para ligação com uma mistura de mAbs específicos de Z15 PorB ou específicos de P7 PorA pré-incubada (durante a noite a 4 graus Celsius) com concentrações aumentadas de OMVs (0 a 50 µg). Após a incubação durante a noite a 4 graus Celsius, as placas foram lavadas e incubadas com anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado à HRP a 37 graus Celsius du- rante 2 h. As placas foram desenvolvidas com o- di-cloridreto de fenilenodiamina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e lidas em 490 nm. A porcentagem de inibição foi de- terminada pelo cálculo: ((densidade óptica da amostra - densidade óptica de con- trole)/densidade óptica de controle)*100, onde controle = ligação de anticorpo a rPorB na ausência de OMVs.

[0140]Testes de viabilidade: As cepas de deleção de OMP foram riscadas do crescimento durante a noite em placas e colocadas em suspensão em caldo TSB em uma densidade de OD600 = 0,1. As bactérias foram cultivadas com agitação (250 rpm) e foram avaliadas a cada hora para o valor de OD600 durante um período de 8 h. Em t = 0, 3, e 8 h, tempos correspondentes com a fase lag, fase log e fase estacionária inicial, respectivamente, alíquotas foram obtidas e diluídas em série para enumerar CFUs; as amostras também foram obtidas em 8 h para obter mRNA (veja abaixo). As imagens representativas de CFUs em t = 8 h foram obtidas em um estereomicroscópio Olympus SZX16.

[0141]Para o exame dos transcritos de porA e porB por qPCR, o mRNA foi extraído a partir de alíquotas das cepas WT, ΔA, e ΔB bacterianas usando o TRIzol Max Bacterial RNA Isolation Kit (ThermoFisher), de acordo com o protocolo do fabri- cante. O High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit (ThermoFisher) foi usado para sintetizar o cDNA e 50 ng de cada amostra foram avaliados usando SYBR Green

PCR MasterMix (ThermoFisher). Os níveis do transcrito foram normalizados a 16S rRNA (iniciadores mostrados na Tabela 3) e a alteração da dobra foi determinada em relação ao WT usando o método ΔΔCt (Livak e Schmittgen, 2001).

[0142]Ensaio bactericida no soro: O ensaio SBA do complemento exógeno foi realizado em placas de 96 poços, conforme previamente descrito (Bash et al. (2014) Clin Vaccine Immunol 21: 755 a 761) com pequenas modificações. Brevemente, as cepas de deleção de OMP foram incubadas a 37 graus Celsius com agitação (65 rpm) na presença de diluições de 2 vezes de Z15 mAb (em BSA 0,5 % em Solução Salina Tamponada de Hank) e soros humanos agrupados que foram pré-triados quanto a falta de atividade de morte endógena. Depois de 1 h, uma sobreposição de TSB com ágar nobre 0,7 % foi adicionada e as placas foram incubadas durante a noite. Na manhã seguinte, as CFUs foram enumeradas e o título de SBA foi registrado como a recíproca da maior diluição resultando em ≥50 % de morte em relação à média dos controles negativos (as bactérias que foram incubadas com soros inativados por calor na ausência de Z15).

[0143]Simulações da dinâmica molecular: A estrutura de trímero de PorB da cepa do tipo selvagem MC58 foi retirada da estrutura cristalina (PDB:3WI4) e um mo- delo de trímero de PorB para a cepa Cu385 foi construído pela mutação das cadeias laterais da estrutura MC58 PorB para a sequência de Cu385. Cada proteína depois foi incorporada em bicamadas assimétricas de imunotipo L3 LOS no folheto externo e fosfolipídeos no folheto interno, que imita a membrana externa de N. meningitidis.

Construção, montagem e equilíbrios com base em CHARMM iniciais destes sistemas (MC58 e Cu385) foram obtidos pelo protocolo passo a passo com base em CHARMM- GUI (Jo et al. (2008). J Comput Chem 29: 1859 a 1865, Wu et al. (2013) Biophys J 105: 1444 a 1455), Wu et al. (2014a) CHARMM-GUI J Comput Chem 35: 1997 a 2004, Wu et al. (2014b) Biophys J 106: 2493 a 2502., Patel et al. (2016) Biofísico J 110: 930 a 938). Rodadas de produção de 450-ns NPT (número de partícula constante, pressão e temperatura) foram realizadas para ambos os sistemas usando NAMD (Phillips et al. (2005) J Comput Chem 26: 1781 a 1802) com uma temperatura de 310,15 K e uma pressão de 1 bar. Um intervalo de tempo de 2-fs junto com o algoritmo SHAKE (Ryckaert et al. (1977) J Comput Phys 23: 327 a 341) foi usado e as interações de van der Waals foram suavemente desligadas em 10-12 Angstrom (Å) por uma função de troca de força (Steinbach e Brooks (1994) J Comput Chem 15: 667 a 683), enquanto as interações eletrostáticas de longo alcance foram calculadas usando o método Ewald de malha de partículas (Essmann et al. (1995) J Chem Phys 103: 8577 a 8593).

Na condução da produção de NAMD, dinâmica de Langevin foi usada para manter a temperatura constante com um coeficiente de ligação de Langevin de 1 ps-1 e um pistão Nosé-Hoover Langevin (Feller et al. (1995) J Chem Phys 103: 4613 a 4621, Martyna et al.. (1994) J Chem Phys 101: 4177 a 418) foi usado para manter a pressão constante com um período de pistão de 50 fs e um tempo de decaimento do pistão de 25 fs. Todas as simulações foram realizadas usando o campo de força C36 para lipí- deos (Klauda et al. (2010) J Phys Chem B 114: 7830 a 7843), carboidratos (Guvench et al. (2008) J Comput Chem 29: 2543 a 2564, Guvench et al. (2009) J Chem Theory Comput 5: 2353 a 2370, Guvench et al. (2011) J Chem Theory Comput 7: 3162 a 3180) e o modelo de água TIP3P (Jorgensen et al. (1983) J Chem Phys 79: 926 a 935).

[0144]Análise de espectrometria de massas: 20 microgramas de OMVs a par- tir de cepas de deleção de OMP foram fracionados por BNGE e pigmentados com Coomassie R-250. As bandas dominantes foram cortadas do gel e a digestão em gel foi realizada, conforme previamente descrito (Jensen et al. (1999) In: Methods in Mo- lecular Biology. A.J. Link (ed). Totowa, NJ: Humana Press, páginas 513 a 53). Breve- mente, SDS foi removido dos pedaços de gel com lavagens sequenciais de acetonitrila e água, seguido por secagem em um speed vacuum. As amostras foram reidratadas com bicarbonato de amônio, reduzidas com ditiotreitol40 mM e alquiladas com iodoa- cetamida 100 mM. Depois da lavagem, os peptídeos foram digeridos durante a noite na temperatura ambiente com tripsina 150 ng e extraídos dos pedaços de gel com ácido fórmico.

[0145]Os peptídeos extraídos para cada banda de gel foram analisados usando cromatografia líquida unidimensional de fase reversa-espectrometria de mas- sas (1D LC-MS/MS) com um sistema de HPLC de nanofluxo Easy nLC II Proxeon que foi ligado online a um espectrômetro de massas Q-Exactive Orbitrap (ThermoFisher).

As varreduras da pesquisa foram adquiridas no analisador Orbitrap em uma resolução de 70.000 e os íons de fragmento foram adquiridos com uma resolução de 17.000. Os arquivos de dados da MS foram pesquisados contra o banco de dados de N. menin- gitidis UniProtKB/Swiss-Prot (2015) suplementados com a sequência de tripsina por- cina usando o mecanismo de busca Mascot (Matrix Sciences; versão 2.4.0). Os arqui- vos de saída Mascot foram analisados usando o software Scaffold 4.2.0 (Proteome Software Inc.). As identificações da proteína foram aceitas se pudessem ser estabe- lecidas em mais do que uma probabilidade de 99,9 % e continham pelo menos 2 pep- tídeos identificados (Tabela 2). As probabilidades da proteína foram atribuídas pelo algoritmo Protein Prophet (Nesvizhskii et al. (2003) Anal Chem 75: 4646 a 4658) e aquelas que continham peptídeos similares e não puderam ser diferenciadas com base em uma análise MS/MS sozinha foram agrupadas para satisfazer os princípios de parcimônia.

[0146]Análise estatística: A significância de todos os dados foi determinada com ANOVA bilateral, seguido por pós-teste de múltiplas comparações de Tukey. A análise foi realizada usando software GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ***P < 0,0001.

Exemplo 9 Resultados em Modelo Animal Demonstrando a Resposta imune a Neisseria meningitidis

[0147]A deleção das proteínas de membrana externa (OMPs) PorA e RmpM resulta em ligação de anticorpos específicos de PorB diminuída à molécula de PorB, um efeito que se correlaciona à capacidade diminuída de anticorpos específicos de PorB induzirem a bacteriólise nos ensaios de morte mediados pelo complemento de- pendentes do anticorpo. A deleção de OMPs dominantes pode afetar a imunogenici- dade e/ou adjuvanticidade da superfície de membrana meningocócica. Este efeito foi diretamente avaliado em um estudo com animais.

[0148]As vesículas de membrana externa (OMVs) foram isoladas da cepa MC58 parental do tipo selvagem (WT) e cepas mutantes de deleção de PorA (ΔA, ΔAB, ΔAR, ΔABR, OCh) (Tabela 4). Dois coelhos por grupo foram imunizados em três intervalos de quatro semanas com OMVs/hidróxido de alumínio 25 µg (Fig. 5A). Os coelhos também foram imunizados com concentrações equivalentes da vacina BEXSERO® meningocócica e solução salina tamponada com fosfato (PBS)/hidróxido de alumínio sozinha como controles positivos e negativos, respectivamente. Após o término do estudo, os soros foram obtidos a partir de cada coelho e avaliados quanto à presença de anticorpos capazes de se ligar a e matar bactérias em uma série de ELISAs, immunoblots e ensaios bactericidas séricos (SBAs).

Tabela 4. Descrição de antígenos OMV. Nome do Descrição do Antígeno Antígeno WT OMVs a partir da cepa parental MC58 PorA+ PorB+ RmpM+ ΔA OMVs a partir da cepa WT deletada para a expressão de PorA ΔAB OMVs a partir da cepa WT deletada para a expressão de PorA e PorB OMVs a partir da cepa WT deletada para a expressão de PorA e

ΔAR RmpM OMVs a partir da cepa WT deletada para a expressão de PorA, PorB

ΔABR e RmpM OMVs a partir da cepa WT deletada para a expressão de PorA e con- OCh tendo uma sequência de aminoácidos alça 4 - alça 8 de PorB gene- ticamente modificada em relação a MC58 BEXSERO® Vacina a partir da GSK Pharmaceuticals contendo OMVs a partir da cepa NZ98/254 que exibe tipos de sequência de aminoácidos dife- rentes de PorA e PorB em relação a MC58 Controle negativo contendo quantidades equimolares de PBS e hi-

PBS dróxido de alumínio fornecidas aos animais experimentais

[0149]ELISAs de células totais demonstraram a capacidade de todos os antí- genos OMV, exceto o controle PBS negativo, para induzir respostas do anticorpo es- pecíficas à cepa MC58 parental (Fig. 5B) e quatro cepas do sorogrupo B heterogêneas (Figs. 5C e 5D). Os antissoros obtidos a partir dos animais imunizados com antígenos OMV ΔAB ou OCh, exibiram concentrações de ligação dos anticorpos às células totais de N. meningitidis que foram altas, mas diminuíram em relação aos outros antígenos OMV (Figs. 5B a 5D). Apesar das similaridades na ligação do anticorpo total às células totais, os soros exibiram atividade bactericida diferente. Os soros B1 e B5 obtidos a partir de coelhos imunizados com WT OMVs foram capazes de mediar a morte da cepa MC58 homóloga e da cepa Cu385 heteróloga nos ensaios bactericidas no soro humano (hSBAs) (Fig. 6). Os anticorpos B1 também foram bactericidas contra a cepa BB1350. Uma deleção única de PorA resultou na atividade de morte heteróloga acen- tuada, pois os anticorpos séricos B2 foram capazes de matar todas as cepas testadas e os anticorpos séricos B6 foram capazes de matar todas, exceto uma (Cu385) (Fig.

6). Os anticorpos a partir dos soros obtidos a partir dos animais imunizados com ΔAB ou ΔABR OMVs exibiram a capacidade de matar todas as cinco cepas testadas (Fig.

6), indicando que a deleção de PorA e PorB em conjunto acentua a imunogenicidade de OMPs de proteção cruzada.

[0150]A capacidade dos anticorpos séricos a partir de coelhos imunizados com ΔAB OMV e ΔABR OMV de matar cepas meningocócicas heterólogas em hSBAs sugeriu a possibilidade de que respostas imunes do hospedeiro estivessem sendo dirigidas contra antígenos que foram distintos daqueles induzidos por imunização com os tipos de OMV suficientes para PorA e PorB. Para abordar esta possibilidade, immu- noblots foram realizados, sondando os lisatos celulares totais das cinco cepas testa-

das nos hSBAs com anticorpos séricos a partir de cada um dos seis coelhos imuniza- dos. Os anticorpos a partir dos soros B1 e B5, imunizados com WT OMVs, ligaram as bandas dominantes em ~17 e ~34 kDa (Figs. 7A a 7B). As bandas de tamanho similar também foram ligadas pelos anticorpos presentes nos soros a partir dos animais imu- nizados com ΔA (B2, B6) e OCh (B3, B7) OMVs, assim como BEXSERO® (B15, B16) (Figs. 7A a 7B). Os soros a partir dos coelhos imunizados com ΔAB (B9, B10) e ΔABR (B13, B14) OMVs não possuíam anticorpos capazes de se ligar às mesmas bandas, mas continham anticorpos que ligaram as bandas de MW maior de ~72 e ~95 kDa (Figs. 7A-7B). A presença de anticorpos capazes de se ligar às bandas de alto peso molecular correlacionou-se à capacidade de matar cepas heterólogas (>4) em hSBAs, conforme demonstrado pelos perfis de bandas dos soros B2, B3, B6, B11, B15 e B16 (Figs. 7A a 7B).

Exemplo 10 Vacina Gonocócica a partir do Mutante de Deleção Tripla de N. meningitidis desprovida das Proteínas PorA, PorB e proteína modificável por redução (RmpM)

[0151]Um estudo in vivo de colonização gonocócica foi conduzido. Neste es- tudo, os camundongos (n = 20 por grupo) foram imunizados em três intervalos de quatorze dias com 12,5 µg de vesículas de membrana externa (OMVs)/hidróxido de alumínio derivados de (A) uma cepa MC58 de N. meningitidis do tipo selvagem con- tendo proteínas de membrana externa PorA, PorB e RmpM (OMPs), (B) cepa ΔABR, em que a cepa MC58 foi deletada para a expressão de PorA, PorB e RmpM, ou (C) cepa OCh, em que a cepa MC58 foi deletada para a expressão de PorA e a sequência de aminoácidos de PorB é geneticamente alterada nas alças 4 a 8 expressadas na superfície. Os camundongos também foram imunizados com volumes equimolares de PBS/hidróxido de alumínio ou não foram imunizados como controles negativos. Após a imunização, os camundongos foram inoculados intravaginalmente com a cepa F62 de N. gonorrhoeae e os níveis de colonização/anticorpo monitorados durante sete dias

(Fig. 8).

[0152]Os camundongos imunizados com MC58 OMVs começaram a depurar a infecção gonocócica 3 dias pós-infecção (d.p.i.), com 39 % dos animais depurados no dia 7 d.p.i. (Fig. 9A). Estes níveis brutos de depuração foram maiores do que aque- les de animais imunizados com hidróxido de alumínio (Alume) apenas ou controles negativos não imunizados (Unimm.) (17 % e 19 %, respectivamente), embora a ten- dência não tenha atingido a significância estatística quando avaliada por ANOVA bi- lateral (Fig. 9A). Ao contrário, significantemente mais camundongos imunizados com OCh ou ΔABR OMVs depuraram gonococos em relação aos grupos controle negativo, com apenas 23 % dos animais imunizados dom ΔABR OMV remanescentes coloniza- dos por 7 d.p.i. (Fig. 9A). Os animais imunizados com OCh OMV e ΔABR OMV tam- bém exibiram uma densidade mediana correspondente de colonização equivalente a 0 UFC/ml em 7 d.p.i. (Fig. 9B).

[0153]A depuração gonocócica acentuada observada quando os camundon- gos foram imunizados com antígenos OMV deficientes de PorA sugeriu que outras OMPs induziram a produção de anticorpos que contribuíram para a proteção do hos- pedeiro. Para identificar tais antígenos, western blots foram realizados, sondando li- satos celulares totais das cepas gonocócicas F62, FA19, FA1090 e MS11, com antis- soros agrupados obtidos a partir dos animais após a terceira imunização. Os anticor- pos a partir dos soros de animais imunizados com MC58, OCh e ΔABR OMVs ligaram uma proteína ~70 kDa presente em todas as quatro cepa gonocócicas testadas, assim como a cepa de N. meningitidis MC58 a partir da qual as OMVs foram derivadas (Fig.

10). Os anticorpos a partir de camundongos imunizados com OCh OMV e ΔABR OMV também ligaram uma proteína ~75 kDa que não foi ligada por anticorpos séricos a partir de camundongos imunizados com MC58 OMV (Fig. 10). Os anticorpos policlo- nais presentes nos soros ΔABR agrupados ligaram uma proteína ~95 kDa que não foi ligada pelos soros agrupados MC58 ou OCh (Fig. 10). Estes dados sugerem que os antígenos únicos em OMV a partir de mutantes de deleção contribuem para o efeito protetor das OCh e ΔABR OMVs observado no modelo de depuração in vivo. Exemplo 11 Protocolos Adicionais

[0154]Construção de Cepas Adicionais: Para construir uma cepa mutante de deleção tripla de N. meningitidis em que as proteínas de membrana externa PorA, PorB, e RmpM são removidas do genoma sem substituição de um marcador selecio- nável, um plasmídeo é construído incorporando sequência ~1 kb homóloga a mon- tante (5’) e intergênica a jusante (3’) do gene a partir da cepa a ser deletada. Após a incorporação das sequências 5’ e 3’ em uma cadeia principal do vetor, um cassete contrasselecionável derivado do plasmídeo pJJ260 (Johnston, Gene 492: 325 a 328, 2012) portador de um gene de resistência à canamicina (nptII) e um gene de levansu- crase (sacB) expressado sob o controle de um promotor de tetraciclina induzível (tetA) é inserido na junção da sequência 5’/3’. Isto permite a triagem de clones por um me- canismo de seleção positiva e negativa; cepas transformadas que incorporam o plas- mídeo no genoma por intermédio de um evento de recombinação homóloga dupla exibirão resistência ao antibiótico canamicina, mas serão sensíveis à presença de sa- carose, que é convertida no produto tóxico levan na presença de levansucrase indu- zida. O plasmídeo completo é transformado em N. meningitidis e a deleção do gene de interesse é confirmada por (1) crescimento em meio seletivo contendo canamicina e (2) ausência de crescimento em meio seletivo contendo sacarose e clortetraciclina.

Para remover o cassete contrasselecionável, a cepa de deleção resultante é transfor- mada com o plasmídeo portador da sequência homóloga 5’/3’ sozinha (sem o cassete contrasselecionável). A ausência do cassete é confirmada por (1) crescimento em meio seletivo contendo sacarose e clortetraciclina, (2) ausência de crescimento em meio seletivo contendo canamicina, e (3) sequenciamento genético. O processo é re- petido para os dois genes remanescentes até que uma cepa de deleção tripla de

PorA/PorB/RmpM seja construída.

[0155]Construção de Cepas e Composições incluindo Microvesículas de Membrana Externa e Proteínas Heterólogas: As proteínas identificadas através de tri- agem proteômica ou bioinformática que são sugestivas de proteção mediada por OMV contra espécies de Neisseria serão (1) suprarreguladas na cepa ΔABR via manipula- ção genética ou (2) produzidas recombinantemente e adicionadas como um antígeno adicional às ΔABR OMVs. Os seguintes protocolos são úteis.

[0156]Para construir uma vacina de ΔABR OMV contendo antígenos de pro- teína altamente expressados de interesse, a região promotora endógena do gene cor- respondente é geneticamente deletada utilizando os mesmos métodos detalhados para o mutante de deleção tripla limpa e é substituída por um promotor induzível. As regiões imediatamente a montante (5’) e a jusante (3’) do promotor são clonadas em um plasmídeo, com um cassete contrasselecionável portador do gene de resistência à canamicina nptII e o gene de levansucrase sacB inserido na junção 5’/3’. O plasmí- deo contrasselecionável é transformado na cepa ΔABR e o mutante de deleção do promotor isolado via triagem com canamicina. Um segundo plasmídeo é construído a partir do vetor portador das regiões de flanqueamento do promotor 5’/3’. Um promotor induzível por isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) (por exemplo, T5) é inserido diretamente a montante da região 3’ (codificando o quadro aberto de leitura do gene de interesse) com duas sequências genéticas sequenciais codificando o operador de lactose (lacO) e a sequência do sítio de ligação ribossômica. A sequência que codifica o gene repressor de lactose (lacI), que se liga ao operador de lactose para controlar a expressão do gene, é inserida diretamente a jusante da região 5’ na orientação oposta ao promotor T5. O vetor completo é transformado na cepa ΔABR contendo o plasmí- deo genomicamente inserido contrasselecionável e a substituição do plasmídeo com o promotor induzível T5 é confirmada via seleção em placas de sacarose. OMVs de- sentoxicadas são obtidas, de acordo com o protocolo para a cepa ΔABR, exceto que

IPTG é adicionado ao meio para induzir a expressão de genes controlados por T5 durante o crescimento em cultura.

[0157]Para obter antígenos recombinantes de proteínas de Neisseria especí- ficas, genes que codificam a proteína de interesse são inseridos em quadro em um vetor de expressão contendo uma sequência de gene His-etiquetada (por exemplo, pET-28a(+)) a jusante do promotor T7 induzível. O vetor é transformado em uma cepa de expressão de Escherichia coli (por exemplo, BL21(DE3)); a expressão do gene de interesse é induzida via crescimento em meio Luria Bertani na presença de IPTG. As bactérias são lisadas e a proteína His-etiquetada é purificado pela condução do lisato em uma coluna de níquel agarose (Qiagen). Purificação adicional é obtida por FPLC, se necessário. As proteínas recombinantes são adicionadas às ΔABR OMVs para pro- duzir uma vacina de múltiplos componentes.

[0158]Tendo em vista as muitas formas de realização possíveis às quais os princípios de nossa invenção podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as for- mas de realização ilustradas são apenas exemplos da invenção e não devem ser con- sideradas uma limitação no escopo da invenção. Em vez disso, o escopo da invenção é definido pelas seguintes reivindicações. Portanto, reivindicamos como nossa inven- ção tudo que está no escopo e espírito destas reivindicações.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. PorA-PorB-RmpM- Neisseria meningitidis, CARACTERIZADA pelo fato de que é isolada.

2. PorA-PorB-RmpM- N. meningitidis isolada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a N. meningitidis é o sorogrupo A, B ou C.

3. Composição imunogênica, CARACTERIZADA pelo fato de que compre- ende uma quantidade eficaz de microvesículas de membrana externa a partir da PorA- PorB-RmpM- N. meningitidis isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, e um portador farmaceuticamente aceitável.

4. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que as microvesículas são vesículas de membrana externa, bolhas ou uma combinação das mesmas.

5. Composição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende adicionalmente um adju- vante.

6. Método para induzir uma resposta imune a Neisseria em um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao mamífero a compo- sição imunogênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 3 a 5, desse modo, induzindo a resposta imune.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imune é uma resposta imune protetora.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imune é uma resposta terapêutica.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta uma infecção por N. meningitidis e a administração da com- posição imunogênica aumenta a depuração da Neisseria meningitidis.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta uma infecção por Neisseria gonorrhoeae e a administração da composição imunogênica aumenta a depuração de Neisseria gonorrhoeae.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um indivíduo saudável.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

13. Método para induzir uma resposta imune a Neisseria gonorrhoeae em um mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao mamífero uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade eficaz de microvesí- culas a partir de uma PorA-PorB- N. meningitidis e um portador farmaceuticamente aceitável, desse modo, induzindo a resposta imune a Neisseria gonorrhoeae.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a PorA-PorB- N. meningitidis é RmpM-.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, CARACTERIZADO pelo fato de que as microvesículas são vesículas de membrana externa, bolhas ou uma combinação das mesmas.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a N. meningitidis é o sorogrupo A, B ou C.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição imunogênica compreende adicio- nalmente um adjuvante.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imune é uma resposta imune prote- tora.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a resposta imune é uma resposta terapêutica.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo apresenta uma infecção por Neisseria gonorrhoeae e a administra- ção da composição imunogênica aumenta a depuração da Neisseria gonorrhoeae.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero não apresenta uma infecção por Neisseria gonorrhoeae ou Neis- seria meningitidis.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que as microvesículas são vesículas de membrana externa ou bolhas.