JPS61249394A - インタ−フエロン−γ - Google Patents
インタ−フエロン−γInfo
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- JPS61249394A JPS61249394A JP60091618A JP9161885A JPS61249394A JP S61249394 A JPS61249394 A JP S61249394A JP 60091618 A JP60091618 A JP 60091618A JP 9161885 A JP9161885 A JP 9161885A JP S61249394 A JPS61249394 A JP S61249394A
- Authority
- JP
- Japan
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- dna sequence
- cells
- dna
- sequence
- human interferon
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒトインターフェロン−γ（Ｈｕ Ｉ ＦＮ
−γ）遺伝子を含むＤＮＡ配列及びそのＤＮＡ配列によ
って形質転換された培養細胞、更にその形質転換細胞を
利用したＨｕＩＦＮ−γの製造法に係る。
−γ）遺伝子を含むＤＮＡ配列及びそのＤＮＡ配列によ
って形質転換された培養細胞、更にその形質転換細胞を
利用したＨｕＩＦＮ−γの製造法に係る。
（従来の技術）
インターフェロン（Ｉ ＦＮ）ｕ、抗ウィルス作用を持
つ物質として発見され、少くとも同種の細胞内における
ウィルスには非特異的な抗ウイルス状態を誘導する蛋白
である。ヒトインターフェロン（ＨｕｌＦＮ）は、蛋白
の生理学的、生化学的、免疫学的或いは、生産細胞と誘
発方法の差異により８つの種類に分類されておシ、それ
ぞれインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフ
ェロン−β（ＩＦＮ−β）及びインターフェロン−γ（
ＩＦＮ−ｒ）と命名されている（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｉ。
つ物質として発見され、少くとも同種の細胞内における
ウィルスには非特異的な抗ウイルス状態を誘導する蛋白
である。ヒトインターフェロン（ＨｕｌＦＮ）は、蛋白
の生理学的、生化学的、免疫学的或いは、生産細胞と誘
発方法の差異により８つの種類に分類されておシ、それ
ぞれインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフ
ェロン−β（ＩＦＮ−β）及びインターフェロン−γ（
ＩＦＮ−ｒ）と命名されている（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｉ。
Ｗ、Ｅ、ら（１９８０年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
。
。
２８６巻、１１０頁）。最近これら８種のヒトＩＦＮの
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がクローニングされ、ｃＤＮＡ
の塩基配列並びに塩基配列から推定されるアミノ酸配列
が決定された。
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がクローニングされ、ｃＤＮＡ
の塩基配列並びに塩基配列から推定されるアミノ酸配列
が決定された。
ＩＦＮの抗ウィルス作用は種特異的であり、ヒト細胞を
用いたウィルス感染試験では、ＨｕＩＦＮは抗ウィルス
作用を示すが、マウスＩＦＮけ示さない。しかし、ＩＦ
Ｎのウィルスに対する特異性はかなり広く、種々のウィ
ルスに対して活性を示す。
用いたウィルス感染試験では、ＨｕＩＦＮは抗ウィルス
作用を示すが、マウスＩＦＮけ示さない。しかし、ＩＦ
Ｎのウィルスに対する特異性はかなり広く、種々のウィ
ルスに対して活性を示す。
また、ＩＦＮが種々の生物学的及び免疫学的活性を持つ
物質であることも示された。ＩＦＮＩｆｉかなり古くか
ら細胞の増殖を抑制する作用があることが知られ（Ｒｕ
ｂｉｎ 、 Ｂ、Ｙ、ら（１９８０年）プロシーデイン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカテミー・オブ・サイ
エンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
物質であることも示された。ＩＦＮＩｆｉかなり古くか
ら細胞の増殖を抑制する作用があることが知られ（Ｒｕ
ｂｉｎ 、 Ｂ、Ｙ、ら（１９８０年）プロシーデイン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカテミー・オブ・サイ
エンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） 、 ７７巻、
５９２８頁）、また最近になり免疫学の進歩とともにＩ
ＦＮがいわゆる癌の免疫監視機構に関与していると考え
られているナチュラルキラー細胞や抗体依存性の細胞傷
害活性を持つ細胞を活性化し、これらの細胞の持つ抗腫
瘍活性を高める事が知られるようになった（Ｃａｔａｌ
ｏｎａ、Ｗ、Ｊ、ら（１９８１年）ネイチャー、２９１
巻、７７頁）。また細胞傷害性Ｔ細胞の活性増強（Ｌｉ
ｎｄａｈｌ、Ｐ、ら（１９７２年）プロシーデイングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・ニーニスニー。
５９２８頁）、また最近になり免疫学の進歩とともにＩ
ＦＮがいわゆる癌の免疫監視機構に関与していると考え
られているナチュラルキラー細胞や抗体依存性の細胞傷
害活性を持つ細胞を活性化し、これらの細胞の持つ抗腫
瘍活性を高める事が知られるようになった（Ｃａｔａｌ
ｏｎａ、Ｗ、Ｊ、ら（１９８１年）ネイチャー、２９１
巻、７７頁）。また細胞傷害性Ｔ細胞の活性増強（Ｌｉ
ｎｄａｈｌ、Ｐ、ら（１９７２年）プロシーデイングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・ニーニスニー。
６９巻、７２１頁）やマクロファージを活性化し抗腫瘍
性の活性化マクロファージにする作用をＩＦＮが持って
いる事が示された（Ｌｅ、Ｊら（１９８８年）ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジ＝ （Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ−
） 、 １８１巻、２８２１頁）。
性の活性化マクロファージにする作用をＩＦＮが持って
いる事が示された（Ｌｅ、Ｊら（１９８８年）ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジ＝ （Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ−
） 、 １８１巻、２８２１頁）。
これらの結果はＩＦＮの抗腫瘍剤としての可能性を示す
ものであったが、現在すでにＩＦＮは種々の腫瘍に対し
治験が行なわれつつあり、多発性骨髄腫、非ホジキンリ
ンパ腫、胃癌或いは乳癌その他で有効例も知られるよう
になっている。
ものであったが、現在すでにＩＦＮは種々の腫瘍に対し
治験が行なわれつつあり、多発性骨髄腫、非ホジキンリ
ンパ腫、胃癌或いは乳癌その他で有効例も知られるよう
になっている。
ＩＦＮＯ中でもＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−α。
ＩＦＮ−βに比べ、はるかに低濃度で細胞の増殖を抑制
する事ができ（Ｒｕｂｉｎ’、Ｂ、Ｙ、ら（１９８０年
）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
する事ができ（Ｒｕｂｉｎ’、Ｂ、Ｙ、ら（１９８０年
）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
７７巻、５９２８頁）、またナチュラルキラー細胞、キ
ラーＴ紬胞、に細胞及びマクロファージ等のいわゆる癌
の免疫監視機構に働いている細胞群の活性化を行うこと
ができ、臨床応用面での期待は大きい。
ラーＴ紬胞、に細胞及びマクロファージ等のいわゆる癌
の免疫監視機構に働いている細胞群の活性化を行うこと
ができ、臨床応用面での期待は大きい。
ＨｕＩＦＮ−γは、ヒトのリンパ球をフィトヘマグルチ
ニン、スタフイロコッ力ルエンテロトキシンＡ、コンカ
ナバリンＡ或いは、ガラクトーヌ酸化酵素での刺激に対
して誘導される事が知られている（Ｗｈｅｅｌｏｃｋ、
Ｅ、Ｆ、（１９６５年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
、１４９巻、３１０頁；Ｌａｎｇｆｏｒｄ、Ｍ、Ｐ、ら
（１９７９年）イン７エクシヨン・アンド・イミユニテ
イー（Ｉｎ、ｆ ｅｃ ｔ 。
ニン、スタフイロコッ力ルエンテロトキシンＡ、コンカ
ナバリンＡ或いは、ガラクトーヌ酸化酵素での刺激に対
して誘導される事が知られている（Ｗｈｅｅｌｏｃｋ、
Ｅ、Ｆ、（１９６５年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
、１４９巻、３１０頁；Ｌａｎｇｆｏｒｄ、Ｍ、Ｐ、ら
（１９７９年）イン７エクシヨン・アンド・イミユニテ
イー（Ｉｎ、ｆ ｅｃ ｔ 。
Ｉｍｍｕｎ、）、２６巻、３６頁Ｈｄｅ Ｌａｙ、Ｍ、
ら（１９８０年）ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジ−（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１０
巻、８７７頁； Ｄｉ ａｎｚａｎｉ 、 Ｅ、ら（１
９７９年）インフエクションーアンド・イミユニティ−
２２５巻、８７９頁）。しかし以上のような生産法は新
鮮なリンパ球が大量に必要となり、治療薬としてのＨｕ
ＩＦＮ−γの大量生産を困難にしている。近年ＨｕｌＦ
Ｎ−７のｃＤＮＡがクローニングされ、大腸菌でＨｕＩ
ＦＮ−γ様蛋白の生産が可能になった（Ｇｒａｙ、Ｐ、
Ｗ、ら（１９８２年）ネイチャー。
ら（１９８０年）ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ミュノロジ−（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１０
巻、８７７頁； Ｄｉ ａｎｚａｎｉ 、 Ｅ、ら（１
９７９年）インフエクションーアンド・イミユニティ−
２２５巻、８７９頁）。しかし以上のような生産法は新
鮮なリンパ球が大量に必要となり、治療薬としてのＨｕ
ＩＦＮ−γの大量生産を困難にしている。近年ＨｕｌＦ
Ｎ−７のｃＤＮＡがクローニングされ、大腸菌でＨｕＩ
ＦＮ−γ様蛋白の生産が可能になった（Ｇｒａｙ、Ｐ、
Ｗ、ら（１９８２年）ネイチャー。
２９５巻、５０８頁）。しかし微生物でつくられるＩＦ
Ｎ−γは動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多少異な
る為に、つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそれと異
なる場合が多い。現に大腸菌で作られた組換え型のＨｕ
ｌＦＮ−γのアミノ末端は天然のＨｕＩＦＮ−γと異な
りメチオニンになっている。更に微生物によってつくら
れるＩＦＮ−γは、天然のＨｕｌＦＮ−γが糖鎖を有し
ているのに対し、糖鎖が結合していない。このように微
生物の蛋白合成系によってつくられたＩＦＮ−γと天然
のＨｕｌＦＮ−γとは物質として異なり、治療薬として
長期間使用したり頻回使用する場合には、抗原抗体反応
による力価の減少、ショック等のアレルギー反応の問題
が懸念される。Ｌｅらは天然のＨｕＩＦＮ−γと大腸菌
でつくられたＩＦＮ−γとではモノクローナル抗体を用
いた抗原抗体反応の反応性が異なる事を報告しており、
この反応性の違いは糖鎖の有無に起因するものではない
ことを示した（Ｌｅら（１９８４年）ジャーナル・オフ
・イミュノロジー、１８２巻、１８００頁）。一方、株
化されたＴ細胞クローン（Ｎａｔｈａｎ 、 Ｈｌら（
１９８１年）ネイチャー、２９２巻、８４２頁）。
Ｎ−γは動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多少異な
る為に、つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそれと異
なる場合が多い。現に大腸菌で作られた組換え型のＨｕ
ｌＦＮ−γのアミノ末端は天然のＨｕＩＦＮ−γと異な
りメチオニンになっている。更に微生物によってつくら
れるＩＦＮ−γは、天然のＨｕｌＦＮ−γが糖鎖を有し
ているのに対し、糖鎖が結合していない。このように微
生物の蛋白合成系によってつくられたＩＦＮ−γと天然
のＨｕｌＦＮ−γとは物質として異なり、治療薬として
長期間使用したり頻回使用する場合には、抗原抗体反応
による力価の減少、ショック等のアレルギー反応の問題
が懸念される。Ｌｅらは天然のＨｕＩＦＮ−γと大腸菌
でつくられたＩＦＮ−γとではモノクローナル抗体を用
いた抗原抗体反応の反応性が異なる事を報告しており、
この反応性の違いは糖鎖の有無に起因するものではない
ことを示した（Ｌｅら（１９８４年）ジャーナル・オフ
・イミュノロジー、１８２巻、１８００頁）。一方、株
化されたＴ細胞クローン（Ｎａｔｈａｎ 、 Ｈｌら（
１９８１年）ネイチャー、２９２巻、８４２頁）。
Ｔ細胞ハイブリドーマ（Ｌｅら（１９８２年）プロシー
デイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ
・サイエンス・ニーニスニー、７９巻。
デイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ
・サイエンス・ニーニスニー、７９巻。
７８５７頁）、成人型白血病ウィルスで形質転換したＴ
細胞（Ｓｕｇａｍｕｒａ、にら（１９８８年）ジャーナ
ル・オフ・イミュノロジー、１３１巻。
細胞（Ｓｕｇａｍｕｒａ、にら（１９８８年）ジャーナ
ル・オフ・イミュノロジー、１３１巻。
１６１１頁）によるＨｕＩＦＮ−γの生産が報告されて
いるが、これらの細胞はヒト白血病ウィルスをプロウィ
ルスとして含み、或いはウィルス粒子を細胞外に放出し
ているものと思われ、生物的危険の問題が残されている
（Ｓｕｇａｍｕｒａら（１９８８年）ジャーナル・オフ
・イミュノロジー、１３１巻、１６１１頁）。
いるが、これらの細胞はヒト白血病ウィルスをプロウィ
ルスとして含み、或いはウィルス粒子を細胞外に放出し
ているものと思われ、生物的危険の問題が残されている
（Ｓｕｇａｍｕｒａら（１９８８年）ジャーナル・オフ
・イミュノロジー、１３１巻、１６１１頁）。
また、ＨｕＩＦＮ−ｒのｃＤＮＡ配列にＳＶ４０のプロ
モーターを接続し、動物細胞でのＨｕｌＦＮ−γの生産
が試みられた（Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、ら（１９８２年）ネ
イチャー、２９５巻、５０８頁； ＨａｙｎｅＳｓＪ、
ら（１９８８年）ニスクレイック・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） 、 １
１巻、６８７頁； ５ｃａｈｉｌｌ 、 Ｓ、Ｊ、ら（
１９８３年）プロシーデイングズ・オフーザ・ナショナ
ル・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー。
モーターを接続し、動物細胞でのＨｕｌＦＮ−γの生産
が試みられた（Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、ら（１９８２年）ネ
イチャー、２９５巻、５０８頁； ＨａｙｎｅＳｓＪ、
ら（１９８８年）ニスクレイック・アシッズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、） 、 １
１巻、６８７頁； ５ｃａｈｉｌｌ 、 Ｓ、Ｊ、ら（
１９８３年）プロシーデイングズ・オフーザ・ナショナ
ル・アカテミー・オフ・サイエンス・ニーニスニー。
８０巻、４６５４頁； Ｄ６ｖｏｓ 、 Ｒ，ら（１９
８２年）ニスクレイツク・アシツズ・リサーチ、１０巻
、２４８７頁）。高等生物の多くの蛋白は、核ＤＮＡ配
列上に、いくつかに分断されてコードされていることが
知られている。成熟型ｍＲＮＡの配列をコードしている
ＤＮＡ配列はエクソン（ｅｘｏｎ）、分断している配列
は介在配列またはイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）と呼ばれ
ている。イントロンの生物学的な意義や機能は現在不明
な点も多いが、オパルブミン（Ｗｉｃｋｅｎｓ 、Ｍ、
Ｐ、ら（１９８０年）ネイチャー、２８５巻、６２８頁
）やウィルス蛋白（Ｌａｉ 、Ｃ−Ｊ、ら（１９７９年
）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オフ・サイエンス・ユーエヌエー、７６巻、７１
頁）のイントロンを含まない遺伝子配列は、イントロン
を含む配列に比べ、導入した動物細胞内での蛋白の生産
が極めて少ないことが知られている。また、イントロン
を欠落させたＳＶ４０の遺伝子にβ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝
子のイントロンを加えることにより安定なメツセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の蓄積が起こる事が知られた（Ｈ
ａｍｅｒ 、Ｄ、Ｈ。
８２年）ニスクレイツク・アシツズ・リサーチ、１０巻
、２４８７頁）。高等生物の多くの蛋白は、核ＤＮＡ配
列上に、いくつかに分断されてコードされていることが
知られている。成熟型ｍＲＮＡの配列をコードしている
ＤＮＡ配列はエクソン（ｅｘｏｎ）、分断している配列
は介在配列またはイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）と呼ばれ
ている。イントロンの生物学的な意義や機能は現在不明
な点も多いが、オパルブミン（Ｗｉｃｋｅｎｓ 、Ｍ、
Ｐ、ら（１９８０年）ネイチャー、２８５巻、６２８頁
）やウィルス蛋白（Ｌａｉ 、Ｃ−Ｊ、ら（１９７９年
）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オフ・サイエンス・ユーエヌエー、７６巻、７１
頁）のイントロンを含まない遺伝子配列は、イントロン
を含む配列に比べ、導入した動物細胞内での蛋白の生産
が極めて少ないことが知られている。また、イントロン
を欠落させたＳＶ４０の遺伝子にβ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝
子のイントロンを加えることにより安定なメツセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の蓄積が起こる事が知られた（Ｈ
ａｍｅｒ 、Ｄ、Ｈ。
ら（１９７９年）セル（Ｃｅｌｌ）、１８巻、 １２９
９頁）。
９頁）。
（発明が解決しようとする問題点）
遺伝子から転写された初期ＲＮＡからのイントロン部分
の配列の除去をスプライシング（Ｓｐｌｉ−ｃｉｎｇ）
と呼ぶが、スプライシングは安定なｍ ＲＮｒＡｌ、の
蓄積あるいはｍＲＮＡの核から細胞質への移行の為に必
要な事象と推定される。従って、上記ＨｕｌＦＮ−γの
イントロンを含まないｃＤＮＡ配列を用いた生産法のい
くつかは、ＨｕＩＦＮ−γのｃＤＮＡ配列にウィルスの
イントロンを付加する事により、細胞内ｍＲＮＡの蓄積
を可能にしているものと推定される。ＨｕｌＦＮ−γ遺
伝子を含む領域は、第１図に示したように４つのエクソ
ンと８つのイントロン、５′側隣接配列及び３′側隣接
配列から構成されているが（Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、ら（１
９８２年）ネイチャー、２９８巻、８５９頁； Ｔａｙ
ａ 。
の配列の除去をスプライシング（Ｓｐｌｉ−ｃｉｎｇ）
と呼ぶが、スプライシングは安定なｍ ＲＮｒＡｌ、の
蓄積あるいはｍＲＮＡの核から細胞質への移行の為に必
要な事象と推定される。従って、上記ＨｕｌＦＮ−γの
イントロンを含まないｃＤＮＡ配列を用いた生産法のい
くつかは、ＨｕＩＦＮ−γのｃＤＮＡ配列にウィルスの
イントロンを付加する事により、細胞内ｍＲＮＡの蓄積
を可能にしているものと推定される。ＨｕｌＦＮ−γ遺
伝子を含む領域は、第１図に示したように４つのエクソ
ンと８つのイントロン、５′側隣接配列及び３′側隣接
配列から構成されているが（Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、ら（１
９８２年）ネイチャー、２９８巻、８５９頁； Ｔａｙ
ａ 。
Ｙ、ら（１９８２年）エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ
、）、 １巻、９５８頁）。
、）、 １巻、９５８頁）。
本発明者らは、本来のイントロンを有すＨｕＩＦＮ−γ
の核ＤＮＡ配列から転写されスプライシングを受けるｍ
ＲＮ Ａは、ｃＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡよ
りも、よ多安定で高濃度に細胞質内に蓄積される可能性
があると推定した。ＨｕｌＦＮ−γ遺伝子の５′側隣接
配列には、ＨｕＩＦＮ−γの発現を制御している調節部
位が存在し、特にＲＮＡポリメラーゼが結合し、ｍＲＮ
Ａの合成を開始するＤＮＡ配列を含む領域をプロモータ
ー領域と呼ぶが、本発明者らは、この領域を含むＨｕｌ
ＦＮ−γ遺伝子配列をそのまま動物細胞に導入してもＨ
ｕｉＦＮ−γの生産はごく微弱である事を知った。
の核ＤＮＡ配列から転写されスプライシングを受けるｍ
ＲＮ Ａは、ｃＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡよ
りも、よ多安定で高濃度に細胞質内に蓄積される可能性
があると推定した。ＨｕｌＦＮ−γ遺伝子の５′側隣接
配列には、ＨｕＩＦＮ−γの発現を制御している調節部
位が存在し、特にＲＮＡポリメラーゼが結合し、ｍＲＮ
Ａの合成を開始するＤＮＡ配列を含む領域をプロモータ
ー領域と呼ぶが、本発明者らは、この領域を含むＨｕｌ
ＦＮ−γ遺伝子配列をそのまま動物細胞に導入してもＨ
ｕｉＦＮ−γの生産はごく微弱である事を知った。
この結果は、ＨｕｌＦＮ−γ遺伝子の５′側にあるプロ
モーター領域が、殆んどの動物細胞内で休止の状態にあ
る事を示しており、従って動物細胞で有効な生産をみる
には、このプロモーター領域を動物培養細胞でｍＲＮＡ
の合成を開始する事が可能な他の遺伝子のプロモーター
領域と置換する必要があることを示している。
モーター領域が、殆んどの動物細胞内で休止の状態にあ
る事を示しており、従って動物細胞で有効な生産をみる
には、このプロモーター領域を動物培養細胞でｍＲＮＡ
の合成を開始する事が可能な他の遺伝子のプロモーター
領域と置換する必要があることを示している。
正常で機能のある蛋白の発現の為には、イントロンの正
しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、インシ
ュリン遺伝子とシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のプ
ロモーター領域を結合し、ＣＯ８細胞に導入した場合の
異常なスプライシングが報告されている（Ｌａｕｂ、Ｏ
，ら（１９８８年）ジャーナル・オフ・バイオロジカル
・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５
８巻、６０４８頁）。
しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、インシ
ュリン遺伝子とシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のプ
ロモーター領域を結合し、ＣＯ８細胞に導入した場合の
異常なスプライシングが報告されている（Ｌａｕｂ、Ｏ
，ら（１９８８年）ジャーナル・オフ・バイオロジカル
・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５
８巻、６０４８頁）。
またアミラーゼの発現においては、組織特異的なスプラ
イシングが存在し、同一の遺伝子から２つの異ったスプ
ライシングを経て、唾液腺アミラーゼと肝臓アミラーゼ
が合成されることが知られている（Ｙｏｕｎｇ、Ｒ，Ａ
、ら（１９８１年）セル、２３巻、４５１頁）・。また
、ＳＶ４０ （Ｂｅｒｋ、Ａ、Ｊ。
イシングが存在し、同一の遺伝子から２つの異ったスプ
ライシングを経て、唾液腺アミラーゼと肝臓アミラーゼ
が合成されることが知られている（Ｙｏｕｎｇ、Ｒ，Ａ
、ら（１９８１年）セル、２３巻、４５１頁）・。また
、ＳＶ４０ （Ｂｅｒｋ、Ａ、Ｊ。
ら（１９７８年）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナシ
ョナルｅアカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニスニー
、７５巻、１２７４頁）、アデノウィルス（Ｃｈｏｗ、
Ｌ、Ｔ、（１９７７年）セル、１２巻、１頁）等におい
ても、同一の遺伝子から異ったスプライシングを経て複
数のｍＲＮＡ及び蛋白が合成されている。従って、動物
培養細胞にイントロンを含むＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を導
入し、ＨｕＩＦＮ−Ｔを産生するには正常なスプライシ
ングが起こる必要があるが、本発明者らはＨｕＩＦＮ−
γをコードしている核ＤＮＡ配列に５Ｖ４０の後期プロ
モーター領域を含むＤＮＡ配列を接続し、動物培養細胞
に導入した場合、正常にスプライシングが起り、ＨｕＩ
ＦＮ−γが培地中に著量分泌される事を見い出した。ま
た同時にＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列を導
入した場合は、［（ｕｌＦＮ−γの分泌量が増加するこ
とを知った。更に本発明者らは、動物細胞のクローニン
グベクターとして知られているボバイン・パピローマ・
ウィルスＤＮＡと適切なプロモーター領域を含むＤＮＡ
配列を接続したＨｕｌＦＮ−γをコードしている核ＤＮ
Ａ配列とを同一配列上に持つプラスミドを作製し、マウ
ヌ細胞を形質転換した結果、培地への高度のＨｕ Ｉ
ＦＮ−γの蓄積を見い出した。本発明により、極めて安
全性の高い天然型のＨｕＩＦＮ−γを大量に供給する事
が可能になるものと考えられる。以下に、本発明を更に
詳細に説明する。
ョナルｅアカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニスニー
、７５巻、１２７４頁）、アデノウィルス（Ｃｈｏｗ、
Ｌ、Ｔ、（１９７７年）セル、１２巻、１頁）等におい
ても、同一の遺伝子から異ったスプライシングを経て複
数のｍＲＮＡ及び蛋白が合成されている。従って、動物
培養細胞にイントロンを含むＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を導
入し、ＨｕＩＦＮ−Ｔを産生するには正常なスプライシ
ングが起こる必要があるが、本発明者らはＨｕＩＦＮ−
γをコードしている核ＤＮＡ配列に５Ｖ４０の後期プロ
モーター領域を含むＤＮＡ配列を接続し、動物培養細胞
に導入した場合、正常にスプライシングが起り、ＨｕＩ
ＦＮ−γが培地中に著量分泌される事を見い出した。ま
た同時にＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列を導
入した場合は、［（ｕｌＦＮ−γの分泌量が増加するこ
とを知った。更に本発明者らは、動物細胞のクローニン
グベクターとして知られているボバイン・パピローマ・
ウィルスＤＮＡと適切なプロモーター領域を含むＤＮＡ
配列を接続したＨｕｌＦＮ−γをコードしている核ＤＮ
Ａ配列とを同一配列上に持つプラスミドを作製し、マウ
ヌ細胞を形質転換した結果、培地への高度のＨｕ Ｉ
ＦＮ−γの蓄積を見い出した。本発明により、極めて安
全性の高い天然型のＨｕＩＦＮ−γを大量に供給する事
が可能になるものと考えられる。以下に、本発明を更に
詳細に説明する。
（問題点を解決するための手段）
ＨｕＩＦＮ−γをコードしている遺伝子領域は、第２図
に示したようにヒト染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断した場合、約８．６キロベース（Ｋｂ）のＤＮＡ
断片中に含まれる。ＨｕＩＦＮ−７の成熟型ｍＲＮＡを
コードしている配列（エクソン）は４ケ所に分断して存
在している。ＤＮＡ配列の５′側から第１エクソン、第
２エクソン、第３エクソン及び第４エクソンとする（図
中、太線で示す）。
に示したようにヒト染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断した場合、約８．６キロベース（Ｋｂ）のＤＮＡ
断片中に含まれる。ＨｕＩＦＮ−７の成熟型ｍＲＮＡを
コードしている配列（エクソン）は４ケ所に分断して存
在している。ＤＮＡ配列の５′側から第１エクソン、第
２エクソン、第３エクソン及び第４エクソンとする（図
中、太線で示す）。
第１エクンンの５？側に隣接する配列には、ＨｕＩＦＮ
−γの発現を制御している調節部位がある。第１エクソ
ンＦｉ８８残基のアミノ酸からなるポリペプチドをコー
ドしているが、蛋白合成開始のアミノ酸であるメチオニ
ンからはじまるＮ端の２３アミノ酸は、多くの分泌性蛋
白のＮ端にみられるシグナルペプタイドで、ＨｕｌＦＮ
−γが合成され、細胞外へ分泌される過程で切断される
。ＨｕＩＦＮ−γをコードする核ＤＮＡ配列とは、第１
図に示した４つのエクソンと３つのメントロンを含むＤ
ＮＡ配列を示す。ＨｕｌＦＮ−γをコードする核ＤＮＡ
配列は、ヒトＤＮＡからクローン化される。ヒトＤＮＡ
は、例えばヒト白血球細胞培養細胞或いは組織などを用
い、Ｂｊｉｎらの方法（Ｂｌｉｎ、Ｎら（１９７６年）
ニスクレイック・アシッーズ・リサーチ、３巻、２８０
８頁）により調製される。
−γの発現を制御している調節部位がある。第１エクソ
ンＦｉ８８残基のアミノ酸からなるポリペプチドをコー
ドしているが、蛋白合成開始のアミノ酸であるメチオニ
ンからはじまるＮ端の２３アミノ酸は、多くの分泌性蛋
白のＮ端にみられるシグナルペプタイドで、ＨｕｌＦＮ
−γが合成され、細胞外へ分泌される過程で切断される
。ＨｕＩＦＮ−γをコードする核ＤＮＡ配列とは、第１
図に示した４つのエクソンと３つのメントロンを含むＤ
ＮＡ配列を示す。ＨｕｌＦＮ−γをコードする核ＤＮＡ
配列は、ヒトＤＮＡからクローン化される。ヒトＤＮＡ
は、例えばヒト白血球細胞培養細胞或いは組織などを用
い、Ｂｊｉｎらの方法（Ｂｌｉｎ、Ｎら（１９７６年）
ニスクレイック・アシッーズ・リサーチ、３巻、２８０
８頁）により調製される。
ＨｕＩＦＮ−γ遺伝子のクローニングに用いるベクター
ｉｊ： Ｃｈａｒｏｎ ２８に代表されるλフアージベ
クター、ｐＢＲ８２２に代表されるプラスミドベクター
或いはｐＨＣ７９に代表されるニスミッドなどが利用で
きるが、一般的には高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニ
ングできるλフアージベクターをベクターとして用いる
遺伝子操作法が用いられる。
ｉｊ： Ｃｈａｒｏｎ ２８に代表されるλフアージベ
クター、ｐＢＲ８２２に代表されるプラスミドベクター
或いはｐＨＣ７９に代表されるニスミッドなどが利用で
きるが、一般的には高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニ
ングできるλフアージベクターをベクターとして用いる
遺伝子操作法が用いられる。
すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、
λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し、リ
コンビナント７アージＤＮＡをつくる。次にインビトロ
パッケージングの手法を用い、感染性のある７アージ粒
子を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートＫまき
、組換え型７アージのプラークを形成させる（Ｅｎｑｕ
ｉｓｔ 、Ｌら（１９７９年）メソッズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）、６８巻。
λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し、リ
コンビナント７アージＤＮＡをつくる。次にインビトロ
パッケージングの手法を用い、感染性のある７アージ粒
子を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートＫまき
、組換え型７アージのプラークを形成させる（Ｅｎｑｕ
ｉｓｔ 、Ｌら（１９７９年）メソッズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）、６８巻。
２８１頁；Ｈｏｒｎ、Ｂ（−１９７９年）メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー、６８巻、２９９頁）。
ン・エンザイモロジー、６８巻、２９９頁）。
ＨｕｌＦＮ−γをコードするＤＮＡ断片を持つ組換え型
７アージのプラークの検出には、ｃＤＮＡや合成ＤＮＡ
をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションの手
法（Ｗｏｏ 、 Ｓ 、Ｌ、Ｃ０（１９７９年）メソツ
ズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。
７アージのプラークの検出には、ｃＤＮＡや合成ＤＮＡ
をプローブとしたプラークハイブリダイゼーションの手
法（Ｗｏｏ 、 Ｓ 、Ｌ、Ｃ０（１９７９年）メソツ
ズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。
３８９頁； ５ｚｏｓｔａｋ 、 Ｊ 、Ｗ、ら（１９
７９年）メンツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。
７９年）メンツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻。
４１９頁）が利用できる。実際にそのような手法を用い
ＨｕｌＦＮ−γをコードするＤＮＡ断片を持つ組換え型
７アージがつくられた（特願昭５９−１１９６４８ ；
Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、とＧｏｅｄｄｅｌ、Ｄ。
ＨｕｌＦＮ−γをコードするＤＮＡ断片を持つ組換え型
７アージがつくられた（特願昭５９−１１９６４８ ；
Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、とＧｏｅｄｄｅｌ、Ｄ。
Ｖ、（１９８２年）ネイチャー、２９８巻、８５９頁）
。またＨｕＩＦＮ−γの遺伝子を持つ組換え型ファージ
は、プラークハイブリダイゼーションによって選択され
たプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養するととＫ
よシ大量に調製できる。また組換え型７アージのＤＮＡ
はフェノール法等により調製できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ
、Ｔら（１９８２年）モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリ−・マニュアル・コールド・ヌフリング・
ハーバ−・ラボラトリ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）。
。またＨｕＩＦＮ−γの遺伝子を持つ組換え型ファージ
は、プラークハイブリダイゼーションによって選択され
たプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養するととＫ
よシ大量に調製できる。また組換え型７アージのＤＮＡ
はフェノール法等により調製できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ
、Ｔら（１９８２年）モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリ−・マニュアル・コールド・ヌフリング・
ハーバ−・ラボラトリ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）。
動物培養細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェ
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ 、Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ）、
１１巻、２２３頁）、マイクロインジェクション法（Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ 、 Ｗ、Ｆ、ら（１９８０年）プロシ
ーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
フ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５３９９頁）
、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞
融合法（Ｓｃｈｏｆｆｎｅｒ 。
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ 、Ｍ、ら（１９７７年）セル（Ｃｅｌｌ）、
１１巻、２２３頁）、マイクロインジェクション法（Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ 、 Ｗ、Ｆ、ら（１９８０年）プロシ
ーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
フ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５３９９頁）
、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞
融合法（Ｓｃｈｏｆｆｎｅｒ 。
Ｗ、ら（１９８０年）プロシーデイングズ・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニス
ニー、７７巻、２１６８頁）等が用いられている。リン
酸カルシウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮ
Ａ溶液の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用
できる。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドと
して保有している微生物のプロトプラストが用いられて
いる。
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニス
ニー、７７巻、２１６８頁）等が用いられている。リン
酸カルシウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮ
Ａ溶液の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用
できる。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドと
して保有している微生物のプロトプラストが用いられて
いる。
ＨｕＩＦＮ−γは誘導蛋白であり、ヒト白血球細胞を種
々のマイト−ジエンで刺激することにより誘導される。
々のマイト−ジエンで刺激することにより誘導される。
現在マイト−ジエンの刺激が、どのような形でＨｕｌＦ
Ｎ−γの遺伝子に働き、ＨｕｌＦＮ−γを誘導するかは
不明であるが、そのような誘導機構のない細胞にＨｕＩ
ＦＮ−γの調節部位を含む遺伝子を導入してもＨｕｌＦ
Ｎ−γの生産Ｉ−ｉ微弱なものであった。
Ｎ−γの遺伝子に働き、ＨｕｌＦＮ−γを誘導するかは
不明であるが、そのような誘導機構のない細胞にＨｕＩ
ＦＮ−γの調節部位を含む遺伝子を導入してもＨｕｌＦ
Ｎ−γの生産Ｉ−ｉ微弱なものであった。
本発明者らは、ＳＶ４０の後期プロモーター領域の配列
をＨｕｌＦＮ−γの族ＤＮＡ配列の５′側に接続し、細
胞に導入することによりＨｕｌＦＮ−γの非生産細胞を
高生産細胞に形質転換できることを見い出した。この場
合、ＨｕｌＦＮ−γのｍＲＮＡ合成は暮、接続した後期
プロモーターの制御下におかれる。５Ｖ４００後期プロ
モーターからの転写活性は、一般的にＳＶ４０のＴ抗原
の存在下で増強される。従ってＳＶ４０の後期プロモー
ターを接続したＨｕＩＦＮ−γの遺伝子が導入される細
胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望ましい。Ｔ抗原が
発現している細胞を作製するには、Ｔ抗原をコードして
いる遺伝子を細胞に導入すればよい。
をＨｕｌＦＮ−γの族ＤＮＡ配列の５′側に接続し、細
胞に導入することによりＨｕｌＦＮ−γの非生産細胞を
高生産細胞に形質転換できることを見い出した。この場
合、ＨｕｌＦＮ−γのｍＲＮＡ合成は暮、接続した後期
プロモーターの制御下におかれる。５Ｖ４００後期プロ
モーターからの転写活性は、一般的にＳＶ４０のＴ抗原
の存在下で増強される。従ってＳＶ４０の後期プロモー
ターを接続したＨｕＩＦＮ−γの遺伝子が導入される細
胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望ましい。Ｔ抗原が
発現している細胞を作製するには、Ｔ抗原をコードして
いる遺伝子を細胞に導入すればよい。
また５Ｖ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列とＳＶ４
０の後期プロモーター配列とを接続したＨｕＩＦＮ−γ
遺伝子配列が同一の配列上に存在するＤＮＡ配列で培養
細胞を形質転換した場合、多種の細胞株でＨｕＩＦＮ−
γの高発現株が得られるであろう。
０の後期プロモーター配列とを接続したＨｕＩＦＮ−γ
遺伝子配列が同一の配列上に存在するＤＮＡ配列で培養
細胞を形質転換した場合、多種の細胞株でＨｕＩＦＮ−
γの高発現株が得られるであろう。
遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は、宿主染色
体ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。遺伝子が組
み込まれる染色体上の位置は一見でたらめであり、また
組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則である。Ｈｕｌ
ＦＮ−γを細胞に導入した場合、組み込まれた位置やコ
ピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＩＦＮ生産量
は異なる。
体ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。遺伝子が組
み込まれる染色体上の位置は一見でたらめであり、また
組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則である。Ｈｕｌ
ＦＮ−γを細胞に導入した場合、組み込まれた位置やコ
ピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＩＦＮ生産量
は異なる。
従って細胞をクローン化することにより種々の生産量を
有する細胞を得ることができる。目的遺伝子を導入し、
安定に発現する細胞のみを選択的に増殖させる為には、
ＳＶ４０の後期プロモーター配列とＨｕＩＦＮ−γ遺伝
子が接続した配列と選択マーカーを同一ＤＮＡ配列上に
持つＤＮＡ配列が適切である。動物細胞での選択マーカ
ーとしてはＥｃｏｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，
ら（１９８０年）サイエンス、２０９巻、１４２２頁）
、ｎｅ。
有する細胞を得ることができる。目的遺伝子を導入し、
安定に発現する細胞のみを選択的に増殖させる為には、
ＳＶ４０の後期プロモーター配列とＨｕＩＦＮ−γ遺伝
子が接続した配列と選択マーカーを同一ＤＮＡ配列上に
持つＤＮＡ配列が適切である。動物細胞での選択マーカ
ーとしてはＥｃｏｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，
ら（１９８０年）サイエンス、２０９巻、１４２２頁）
、ｎｅ。
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 、 、Ｐ、 Ｊ 、ら（ｔ ９８
２４）ジャーナル・オフ・モレキュラー・アンド・アプ
ライド・ジエネテイツクス（ＪｏＭｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇ
ｅｎｅｔ、）。
２４）ジャーナル・オフ・モレキュラー・アンド・アプ
ライド・ジエネテイツクス（ＪｏＭｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇ
ｅｎｅｔ、）。
１巻、３２７頁）、ｄｈｆ ｒ（Ｗｉｇｌｅｒ 、 Ｍ
、ら（１９８０年）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニスニ
ー、７７巻、８５６７頁）などの遺伝子が用いられる。
、ら（１９８０年）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・ニーニスニ
ー、７７巻、８５６７頁）などの遺伝子が用いられる。
また、そのようなＤＮＡ配列を大量に調製する為には、
そのようなＤＮＡ配列が大腸菌で複製し且つ大量調製可
能なプラスミドやファージであることが望ましい。実施
例に示したプラスミドｐＳＶ２Ｌγ及びｐＳＶ８Ｌγは
、以上のような目的にかなうプラスミドである。すなわ
ち大腸菌で複製可能にするＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ）
と、選択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子）及び動物
培養細胞での選択マーカー（Ｅｃｏｇｐｔ）及び機能す
るプロモーターと接続したＨｕＩＦＮ−γの核ＤＮＡ配
列が同一のＤＮＡ配列上に存在している事を特徴とした
プラスミドである。
そのようなＤＮＡ配列が大腸菌で複製し且つ大量調製可
能なプラスミドやファージであることが望ましい。実施
例に示したプラスミドｐＳＶ２Ｌγ及びｐＳＶ８Ｌγは
、以上のような目的にかなうプラスミドである。すなわ
ち大腸菌で複製可能にするＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ）
と、選択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子）及び動物
培養細胞での選択マーカー（Ｅｃｏｇｐｔ）及び機能す
るプロモーターと接続したＨｕＩＦＮ−γの核ＤＮＡ配
列が同一のＤＮＡ配列上に存在している事を特徴とした
プラスミドである。
ＳＶ４０の後期プロモーター領域を接続したＨｕｌＦＮ
−γの核ＤＮＡ配列を導入された細胞がＨｕｌＦＮ−γ
を産生ずる為には、該ＤＮＡ配列が、用いた細胞固有の
ＲＮＡ合成系、ＲＮＡの成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟
、分泌等の機能に適合している必要がある。導入された
ＤＮＡからはｍＲＮＡが合成されるが、ｍＲＮＡの５′
末端はキャップ構造の付加、正常な位置でのヌプライシ
ング及び３１末端へのポリアゾニレ−ジョンが必要であ
る。
−γの核ＤＮＡ配列を導入された細胞がＨｕｌＦＮ−γ
を産生ずる為には、該ＤＮＡ配列が、用いた細胞固有の
ＲＮＡ合成系、ＲＮＡの成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟
、分泌等の機能に適合している必要がある。導入された
ＤＮＡからはｍＲＮＡが合成されるが、ｍＲＮＡの５′
末端はキャップ構造の付加、正常な位置でのヌプライシ
ング及び３１末端へのポリアゾニレ−ジョンが必要であ
る。
また活性のあるＩＦＮの発現には、合成されるＩＦＮペ
プタイドの正常な高次構造の形成と維持、更にはシグナ
ルペプタイドの切断、細胞からの分泌が正確に行なわれ
る必要がある。本発明者らが試用した動物培養細胞はア
メリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ
）から入手可能なハムスター由来のＣＨＯ−Ｋｌ（ＣＣ
Ｌ−６１）細胞であるが、本明細書に示されているＨｕ
ＩＦＮ−γの製造法を用いれば、少くともを椎動物由来
の培養細胞、融合細胞、正常及び変異細胞、ウィルスに
よる形質転換細胞等において活性あるＨｕｌＦＮ−γを
産生ずることが可能である。
プタイドの正常な高次構造の形成と維持、更にはシグナ
ルペプタイドの切断、細胞からの分泌が正確に行なわれ
る必要がある。本発明者らが試用した動物培養細胞はア
メリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ
）から入手可能なハムスター由来のＣＨＯ−Ｋｌ（ＣＣ
Ｌ−６１）細胞であるが、本明細書に示されているＨｕ
ＩＦＮ−γの製造法を用いれば、少くともを椎動物由来
の培養細胞、融合細胞、正常及び変異細胞、ウィルスに
よる形質転換細胞等において活性あるＨｕｌＦＮ−γを
産生ずることが可能である。
例えば、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌細胞）（ＣＣＬ−２）
。
。
ＦＬ（ヒト羊膜細胞）、ＷＩＳＨ（ヒト羊膜細胞）（Ｃ
ＣＬ−２５）、Ｃｈｌｍｐ Ｌｉｖｅｒ（チンパンジ
ー肝細胞）（大日本製薬から購入）、Ｗ罵−：２６ＶＡ
４（ＳＶ４０で形質転換したヒト肺細胞）（ＣＣＬ−９
５，１）Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎細胞（ＣＣＬ
−８１）を使用することができる。
ＣＬ−２５）、Ｃｈｌｍｐ Ｌｉｖｅｒ（チンパンジ
ー肝細胞）（大日本製薬から購入）、Ｗ罵−：２６ＶＡ
４（ＳＶ４０で形質転換したヒト肺細胞）（ＣＣＬ−９
５，１）Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎細胞（ＣＣＬ
−８１）を使用することができる。
ボバイン・パピローマ・ウィルスのゲノムは、マウスの
細胞で複製する事が知られ、全ゲノム或いは形質転換能
及び複製に必要な領域が動物細胞におけするベクターに
利用されている（Ｓａｒｒｅｒ 。
細胞で複製する事が知られ、全ゲノム或いは形質転換能
及び複製に必要な領域が動物細胞におけするベクターに
利用されている（Ｓａｒｒｅｒ 。
Ｎｌ、（１９８１４）モレキュラーｅアンド・セルラー
・バイオロジー（Ｍｏ、１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）。
・バイオロジー（Ｍｏ、１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）。
１巻、４８６頁）。本発明者らは、動物細胞で機能する
プロモーター領域のＤＮＡ配列を接続させたＨｕｌＦＮ
−γをコードしている核ＤＮＡ配列をポバイン・パピロ
ーマ・ウィルスをベクターとしてマウス細胞に導入した
場合、培地にＨｕＩＦＮ−γが著量分泌される事を見い
出した。この場合、機能するプロモーター領域とは、ｍ
ＲＮＡの合成開始点は含むが、そのプロモーターが調節
している遺伝子の最初のアミノ酸であるメチオニンコド
ンは含まないプロモーター領域の配列をさす。そのよう
なプロモーター領域としてＳＶ４０の初期及び後期フロ
モーター領域ヘルペス・シンプレックス・ウィルスのチ
ミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター領域やレトロウィ
ルスのＬＴＲプロモーター領域等が知られており、利用
可能である。
プロモーター領域のＤＮＡ配列を接続させたＨｕｌＦＮ
−γをコードしている核ＤＮＡ配列をポバイン・パピロ
ーマ・ウィルスをベクターとしてマウス細胞に導入した
場合、培地にＨｕＩＦＮ−γが著量分泌される事を見い
出した。この場合、機能するプロモーター領域とは、ｍ
ＲＮＡの合成開始点は含むが、そのプロモーターが調節
している遺伝子の最初のアミノ酸であるメチオニンコド
ンは含まないプロモーター領域の配列をさす。そのよう
なプロモーター領域としてＳＶ４０の初期及び後期フロ
モーター領域ヘルペス・シンプレックス・ウィルスのチ
ミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター領域やレトロウィ
ルスのＬＴＲプロモーター領域等が知られており、利用
可能である。
機能するプロモーターを接続したＨｕｌＦＮ−γ核ＤＮ
Ａ配列をボバイン・パピローマ・ウィルスの全ゲノム或
いは一部をベクターとして、例えばリン酸カルシウム法
で動物培養細胞に導入し、ＨｕＩＦＮ−γを産生するよ
うになった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を
含んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血清培
地でもＨｕＩＦＮ−γを産生する事を見い出した。Ｈｕ
ＩＦＮ−γの生産に無血清培地を用いる事はＨｕｌＦＮ
−γの培地からの回収精製をより容易にするものである
。
Ａ配列をボバイン・パピローマ・ウィルスの全ゲノム或
いは一部をベクターとして、例えばリン酸カルシウム法
で動物培養細胞に導入し、ＨｕＩＦＮ−γを産生するよ
うになった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を
含んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血清培
地でもＨｕＩＦＮ−γを産生する事を見い出した。Ｈｕ
ＩＦＮ−γの生産に無血清培地を用いる事はＨｕｌＦＮ
−γの培地からの回収精製をより容易にするものである
。
（発明の効果）
以上のように遺伝子導入によりＨｕＩＦＮ−γの生産株
になった細胞は、現在の知見からは、ヌードマウス或い
はハムスター等の動物体内で増殖させることが可能であ
る。又それらの動物の腹腔液や血清中からＨｕＩＦＮ−
γを回収する事も可能なことと思われる。また細胞を動
物体内で増殖させ、細胞を回収し、培養液中で培養する
ことによりＨｕＩＦＮ−γを産生する事も可能と思われ
る。
になった細胞は、現在の知見からは、ヌードマウス或い
はハムスター等の動物体内で増殖させることが可能であ
る。又それらの動物の腹腔液や血清中からＨｕＩＦＮ−
γを回収する事も可能なことと思われる。また細胞を動
物体内で増殖させ、細胞を回収し、培養液中で培養する
ことによりＨｕＩＦＮ−γを産生する事も可能と思われ
る。
（実施例）
以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、装置を参考とした。
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、装置を参考とした。
（１） 蛋白質 核酸 酵素、２６巻、４号、（１９
８１年）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）（２）遺伝
子操作実験法、高木康敬 編著（１９８０年）講談社 （３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬 編著（１９８
２年）講談社 （４） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ 、Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編（１９８２年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（５） Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ６
５巻。
８１年）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）（２）遺伝
子操作実験法、高木康敬 編著（１９８０年）講談社 （３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬 編著（１９８
２年）講談社 （４） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ 、Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編（１９８２年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（５） Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、 ６
５巻。
Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｎら編（１９８０年） Ａｃａｄｅ
ｍｉｃｒｅｓｓ （６） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、 ６８巻。
ｍｉｃｒｅｓｓ （６） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、 ６８巻。
Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年） Ａｃａｄｅｍ ｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ実施例Ｉ ＨｕＩＦＮ−７発現ベクターｐＳＶ２Ｌ７の作製ＨｕＩ
ＦＮ−γ遺伝子は、第２図に示したように、ヒト染色体
ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨｉで切断した場合、８．６キ
ロベース（Ｋｂ）のＤＮＡ断片中に含まれる（タヤら（
１９８２年）ザ・エンボジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ
Ｊ、） １巻、９５３頁）。この断片をプラスミドｐＢ
Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ 、Ｆ、。
ｒｅｓｓ実施例Ｉ ＨｕＩＦＮ−７発現ベクターｐＳＶ２Ｌ７の作製ＨｕＩ
ＦＮ−γ遺伝子は、第２図に示したように、ヒト染色体
ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨｉで切断した場合、８．６キ
ロベース（Ｋｂ）のＤＮＡ断片中に含まれる（タヤら（
１９８２年）ザ・エンボジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ
Ｊ、） １巻、９５３頁）。この断片をプラスミドｐＢ
Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ 、Ｆ、。
ら（１９７７年）ジーン（Ｇｅｎｅ）、２巻、９５頁）
のＢａｍ８１部位に挿入したプラスミドｐＢＲ７８，６
−１を作製した（プラスミドｐＢＲ１８，６−１の作製
については既に特願昭５９−１１９６４８に詳しく記述
した）。
のＢａｍ８１部位に挿入したプラスミドｐＢＲ７８，６
−１を作製した（プラスミドｐＢＲ１８，６−１の作製
については既に特願昭５９−１１９６４８に詳しく記述
した）。
ＨｕｌＦＮ発現ベクターｐＳＶ２Ｌγの作製は次の様に
行った。アンピシリン耐性遺伝子と大腸菌のグアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ
）を有するプラスミドｐ ＳＶ２ ｇ ｐ ｔ（Ｍｕｌ
ｌ ｉｇａｎ 、 Ｒ０Ｃ６とＢｅｒｇ、Ｐ（１９８０
年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０９巻、１４２
２頁）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ Ｉで切断し、切断部位に
Ｔ４ポリヌクレオタイドキナーゼで５′末端をリン酸化
したＢｃｌ）リンカ−（ＣＴＧＡＴＣＡＧ）をＴ４リガ
ーゼで接続後、制限酵素Ｂｃｌ（で処理し、０．８％ア
ガロースゲル電気泳動で回収した。回収したＤＮＡ断片
を７４ＤＮＡリガーゼで環状化し、大腸菌ＧＭ８３ｄａ
ｍ−をトランヌフオームしｐＳＶ２ｇｐｔＢｃｌｌを得
た。ｐＢＲ７８，６−１をＢａｍＨｌ及びＢｃｌｌで切
断し、ＨｕｌＦＮ−７遺伝子を持つ５．５Ｋｂ１７）Ｄ
ＮＡ断片を回収し、ｐＳＶ２ｇｐｔ Ｂｃ １１ ノＢ
ｅ１１部位に挿入しｐＳＶ２Ｌｒを得た。ｐＳＶ２Ｌ７
の作製を第１図に示した。
行った。アンピシリン耐性遺伝子と大腸菌のグアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ
）を有するプラスミドｐ ＳＶ２ ｇ ｐ ｔ（Ｍｕｌ
ｌ ｉｇａｎ 、 Ｒ０Ｃ６とＢｅｒｇ、Ｐ（１９８０
年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０９巻、１４２
２頁）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ Ｉで切断し、切断部位に
Ｔ４ポリヌクレオタイドキナーゼで５′末端をリン酸化
したＢｃｌ）リンカ−（ＣＴＧＡＴＣＡＧ）をＴ４リガ
ーゼで接続後、制限酵素Ｂｃｌ（で処理し、０．８％ア
ガロースゲル電気泳動で回収した。回収したＤＮＡ断片
を７４ＤＮＡリガーゼで環状化し、大腸菌ＧＭ８３ｄａ
ｍ−をトランヌフオームしｐＳＶ２ｇｐｔＢｃｌｌを得
た。ｐＢＲ７８，６−１をＢａｍＨｌ及びＢｃｌｌで切
断し、ＨｕｌＦＮ−７遺伝子を持つ５．５Ｋｂ１７）Ｄ
ＮＡ断片を回収し、ｐＳＶ２ｇｐｔ Ｂｃ １１ ノＢ
ｅ１１部位に挿入しｐＳＶ２Ｌｒを得た。ｐＳＶ２Ｌ７
の作製を第１図に示した。
実施例２
ＨｕＩＦＮ−７発現ベクターｐｓｖａＬｙの作製実施例
１に記述したプラスミドｐ ＳＶ２ Ｌγを制限酵素Ｐ
ｖｕＩ及びＢｇｌｌで切断し、ＨｕＩＦＮ−７遺伝子を
含む約７．８ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲ
ル電気激動により回収した。この断片をＰｖｕｌ及びＢ
ｇｌ ｌで切断したｐＳＶ８ｇｐｔ （Ｍｕ−１１ｉｇ
ａｎ、ＲｏＣｏとＢｅｒｇ、Ｐ、（１９８０年）サイエ
ンス、２０９巻、１４２２頁）のＳＶ４０のＴ抗原を含
むＤＮＡ断片と接続環状化し、ｐ：５Ｖ８Ｌγを作製し
た。ｐｓＶ３Ｌγの作製手順を第３図に示した。
１に記述したプラスミドｐ ＳＶ２ Ｌγを制限酵素Ｐ
ｖｕＩ及びＢｇｌｌで切断し、ＨｕＩＦＮ−７遺伝子を
含む約７．８ＫｂのＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲ
ル電気激動により回収した。この断片をＰｖｕｌ及びＢ
ｇｌ ｌで切断したｐＳＶ８ｇｐｔ （Ｍｕ−１１ｉｇ
ａｎ、ＲｏＣｏとＢｅｒｇ、Ｐ、（１９８０年）サイエ
ンス、２０９巻、１４２２頁）のＳＶ４０のＴ抗原を含
むＤＮＡ断片と接続環状化し、ｐ：５Ｖ８Ｌγを作製し
た。ｐｓＶ３Ｌγの作製手順を第３図に示した。
実施例３
ＨｕｌＦＮ−７発現ベクターｐＳＶｅＢＰＶ７の作製ｐ
ｓＶｅｓｍａ７７ＦｉＨｕＩＦＮ−７遺伝子にＳＶ４０
の初期プロモーターが接続した配列を有している（ｐｓ
ＶｅｓｍａＸγの作製については既に特願昭５９−１１
９６４８に詳しく記述した）。ｐＳ；ＶｅＳｍａＩγを
制限酵素５ａｌｌ及びＢ ａ ｍ、ＨＪで切断しＳＶ４
０の初期プロモーターの付いたＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を
含む約６．ＯＫｂのＤＮＡ断片を得た。ボバイン・パピ
ローマ・ウィルスのゲノムとＰＭＬ２ｄから成るｐｄＢ
ＰＶ−１（Ｓａｒｖｅｒ 、 Ｎら（１９８２年）プロ
シーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス・ニーニスニー、７９巻、７１４７頁
）を５ａｉｌ及びＢａｍＨｉで切断し、アンピシリン耐
性遺伝子を含む約２．４ＫｂのＤＮＡ断片を得た。この
２．４ＫｂＤＮＡ断片を６．ＯＫｂ断片と接続し、ｐＭ
Ｌ２ｄγを作製した。次にボバイン・パピローマ・ウィ
ルスのゲノム約７．９ ＫｂＤＮＡ断片をｐｄＢＰＶ−
１から切り出し、この断片をｐＭＬ２ｄ７のＢａｍＨ１
部位に導入し約１６．３Ｋｂの大きさを有するプラスミ
ドｐＳＶｅＢＰＶγを作製した。ｐＳＶｅＢＰＶγの作
製の手順を第４図−ａ及び第４図−ｂに示した。
ｓＶｅｓｍａ７７ＦｉＨｕＩＦＮ−７遺伝子にＳＶ４０
の初期プロモーターが接続した配列を有している（ｐｓ
ＶｅｓｍａＸγの作製については既に特願昭５９−１１
９６４８に詳しく記述した）。ｐＳ；ＶｅＳｍａＩγを
制限酵素５ａｌｌ及びＢ ａ ｍ、ＨＪで切断しＳＶ４
０の初期プロモーターの付いたＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を
含む約６．ＯＫｂのＤＮＡ断片を得た。ボバイン・パピ
ローマ・ウィルスのゲノムとＰＭＬ２ｄから成るｐｄＢ
ＰＶ−１（Ｓａｒｖｅｒ 、 Ｎら（１９８２年）プロ
シーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オフ・サイエンス・ニーニスニー、７９巻、７１４７頁
）を５ａｉｌ及びＢａｍＨｉで切断し、アンピシリン耐
性遺伝子を含む約２．４ＫｂのＤＮＡ断片を得た。この
２．４ＫｂＤＮＡ断片を６．ＯＫｂ断片と接続し、ｐＭ
Ｌ２ｄγを作製した。次にボバイン・パピローマ・ウィ
ルスのゲノム約７．９ ＫｂＤＮＡ断片をｐｄＢＰＶ−
１から切り出し、この断片をｐＭＬ２ｄ７のＢａｍＨ１
部位に導入し約１６．３Ｋｂの大きさを有するプラスミ
ドｐＳＶｅＢＰＶγを作製した。ｐＳＶｅＢＰＶγの作
製の手順を第４図−ａ及び第４図−ｂに示した。
実施例４
ｐＳＶ２Ｌγ及びｐＳＶ８Ｌγの動物培養細胞への導入
とＨｕＩＦＮ−γの産生 ｐＳＶ２Ｌｒ及びｐＳＶ８Ｌｒに含まれるＨｕｌＦＮ−
ｒ遺伝子の発現を調べる為に、動物培養細胞へＷｉｇｌ
ｅｒらの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年）セル、１
１巻、２２８頁）に準じてプラスミドの導入を行った。
とＨｕＩＦＮ−γの産生 ｐＳＶ２Ｌｒ及びｐＳＶ８Ｌｒに含まれるＨｕｌＦＮ−
ｒ遺伝子の発現を調べる為に、動物培養細胞へＷｉｇｌ
ｅｒらの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年）セル、１
１巻、２２８頁）に準じてプラスミドの導入を行った。
プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め１０チ牛
新生児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細胞
（８Ｘ １０５細胞／３．６ｄ培地／直径６ｃｒＩＬ培
養■）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養をつづ
け４８時間後の培地に含まれるＩＦＮ活性を、ＦＬ細胞
とベスキュラーーストマチチス・ウィルス（Ｖａｓｃｕ
ｌａｒ Ｓｔｏ−ｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）或
いはシンドビヌ・ウィルス（Ｓｉｎｄｏｂｉ３ Ｖｉｒ
ｕｓ）を用いたＣＰＥ阻止法（Ｐｈｉｌｉｐ、Ｃ０ら（
１９８１年）メソツズ・イン・エンザイモロジー、７８
巻、３８７頁）で測定した。
新生児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細胞
（８Ｘ １０５細胞／３．６ｄ培地／直径６ｃｒＩＬ培
養■）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養をつづ
け４８時間後の培地に含まれるＩＦＮ活性を、ＦＬ細胞
とベスキュラーーストマチチス・ウィルス（Ｖａｓｃｕ
ｌａｒ Ｓｔｏ−ｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）或
いはシンドビヌ・ウィルス（Ｓｉｎｄｏｂｉ３ Ｖｉｒ
ｕｓ）を用いたＣＰＥ阻止法（Ｐｈｉｌｉｐ、Ｃ０ら（
１９８１年）メソツズ・イン・エンザイモロジー、７８
巻、３８７頁）で測定した。
表に示すようにｐＳＶ２Ｌγ或いはｐｓｖａＬγを導入
したＣＨＯ−Ｋｌ細胞、Ｖｅｒｏ或いはＷＩ−２６ＶＡ
４でＩＦＮ活性の発現がみられたが、仔牛胸腺ＤＮＡを
導入した細胞では活性がみられなかった。
したＣＨＯ−Ｋｌ細胞、Ｖｅｒｏ或いはＷＩ−２６ＶＡ
４でＩＦＮ活性の発現がみられたが、仔牛胸腺ＤＮＡを
導入した細胞では活性がみられなかった。
（以下余白）
またｐｓＶ８ｇｐｔｉｓＶ４０ のＴ抗原ヲ：ｌ−１’
−ｉる遺伝子を有しているが、ｐＳＶ２ＬγをｐｓＶＩ
ｇｐｔと同時導入した場合はｐＳＶ２Ｌγ単独の場合に
比して約８〜１５倍の高活性を示した。ＷＩ−２６ＶＡ
４はもともと５Ｖ４００Ｔ抗原を発現している細胞であ
るが、ＣＨＯ−Ｋｌ よりも高い発現量を示した。
−ｉる遺伝子を有しているが、ｐＳＶ２ＬγをｐｓＶＩ
ｇｐｔと同時導入した場合はｐＳＶ２Ｌγ単独の場合に
比して約８〜１５倍の高活性を示した。ＷＩ−２６ＶＡ
４はもともと５Ｖ４００Ｔ抗原を発現している細胞であ
るが、ＣＨＯ−Ｋｌ よりも高い発現量を示した。
実施例５
ＨｕＩＦＮ−γの通常培地及び無血清培地での生実施例
４でｐｓｖｓ Ｌγを導入したＣＨＯ−Ｋｌ細胞の培地
を、１０チ牛脂児血清、２５μＩ／ｍｌ ミコフェノー
ル酸、２５０μｇ ／Ｍｌキサンチンを含むＭＥＭ培地
に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミコフ
ェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユの底面全面
に生育させ、５％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥＭ培
地と牛脂児血清を全く含まないＭＥＭ培地で２４時間培
養し、培地中に含まれるＩＦＮ活性を測定した。その結
果、分離された細胞株８５株のうち５株が１８８ユニッ
ト／ｍ１以上のＩＦＮを培地中に分泌しておシ、１５０
０ユニツ） ／ ｍ１以上のＩＦＮを分泌する株も得ら
れた。この株を牛脂児血清を含まない培地で培養した結
果、１５０ユニツ） ／ ｍｌのＩＦＮを含む培養液が
得られた。
４でｐｓｖｓ Ｌγを導入したＣＨＯ−Ｋｌ細胞の培地
を、１０チ牛脂児血清、２５μＩ／ｍｌ ミコフェノー
ル酸、２５０μｇ ／Ｍｌキサンチンを含むＭＥＭ培地
に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミコフ
ェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユの底面全面
に生育させ、５％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥＭ培
地と牛脂児血清を全く含まないＭＥＭ培地で２４時間培
養し、培地中に含まれるＩＦＮ活性を測定した。その結
果、分離された細胞株８５株のうち５株が１８８ユニッ
ト／ｍ１以上のＩＦＮを培地中に分泌しておシ、１５０
０ユニツ） ／ ｍ１以上のＩＦＮを分泌する株も得ら
れた。この株を牛脂児血清を含まない培地で培養した結
果、１５０ユニツ） ／ ｍｌのＩＦＮを含む培養液が
得られた。
実施例６
ｐＳＶｅＢＰＶγの動物培養細胞への導入とＨｕＩＦＮ
−γの産生 ｐｓＶｅＢＰＶ７７．２１１９をＣＨＯ−Ｋｌ及びマウ
ス細胞ＣＩ ２７１へＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉｇｌ
ｅｒら（１９７７年）セル、１１巻、２２３頁）に準じ
て導入した。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を
予め１０チの牛脂児血清を含むダルベツコ変法イーグル
ＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）で予め生育させた細胞（８
〜１０ Ｘ １０５細胞／８．６ｍｌ培地／直径６ｃｒ
ｒＬ培養皿）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養
をつづけ、４８時間後の培地を回収しＩＦＮ活性を測定
した。その結果、ＣＨＯ−Ｋｌで２８ユニツト／ｇｊ、
Ｃ１２７Ｉで１４ユニツト／ ｍｌの活性がみられた。
−γの産生 ｐｓＶｅＢＰＶ７７．２１１９をＣＨＯ−Ｋｌ及びマウ
ス細胞ＣＩ ２７１へＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉｇｌ
ｅｒら（１９７７年）セル、１１巻、２２３頁）に準じ
て導入した。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を
予め１０チの牛脂児血清を含むダルベツコ変法イーグル
ＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地）で予め生育させた細胞（８
〜１０ Ｘ １０５細胞／８．６ｍｌ培地／直径６ｃｒ
ｒＬ培養皿）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養
をつづけ、４８時間後の培地を回収しＩＦＮ活性を測定
した。その結果、ＣＨＯ−Ｋｌで２８ユニツト／ｇｊ、
Ｃ１２７Ｉで１４ユニツト／ ｍｌの活性がみられた。
また２週間培養後生じた形質転換株を９６穴マルチデイ
ツシユに植えつぎ（２００ｔｔｌ培地／Ｗｅｌｌ）、８
日後の培養液のＩＦＮ活性を測定した結果、ＣＨＯ−Ｋ
ｌで７５０゜Ｃ１２７Ｉ細胞で１５００ユニツト／ ｍ
ｌのＩＦＮ活性を示す形質転換株が得られた。
ツシユに植えつぎ（２００ｔｔｌ培地／Ｗｅｌｌ）、８
日後の培養液のＩＦＮ活性を測定した結果、ＣＨＯ−Ｋ
ｌで７５０゜Ｃ１２７Ｉ細胞で１５００ユニツト／ ｍ
ｌのＩＦＮ活性を示す形質転換株が得られた。
実施例７
ＨｕｌＦＮ−γの精製
実施例５で得られたｔ（ｕＩＦＮ−γ産生ＣＨＯ細胞を
５％の仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地で４日間培養し、
６０ｍ１の培地を回収した。培養液にコンドロールドポ
アーグラス（エレクトロヌクレオニクス社）ＣＰＧ８５
０ （メツシュサイズ１２０／２００）を０．５ｇ加え
、４℃８時間撹拌後、コントロールトポアグラスをカラ
ムにつめ、１５０ｍＭリン酸緩衝液（、ｐＨ７，４）
、 ０．１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄後、５０チのエチレン
グリコールを含む同緩衝液で溶出し、活性活分を２０ｍ
Ｍ ！Ｊン酸緩衝液で１０倍に希釈した。約２万ユニツ
トのＩＦＮが精製回収された。
５％の仔牛脂児血清を含むＭＥＭ培地で４日間培養し、
６０ｍ１の培地を回収した。培養液にコンドロールドポ
アーグラス（エレクトロヌクレオニクス社）ＣＰＧ８５
０ （メツシュサイズ１２０／２００）を０．５ｇ加え
、４℃８時間撹拌後、コントロールトポアグラスをカラ
ムにつめ、１５０ｍＭリン酸緩衝液（、ｐＨ７，４）
、 ０．１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄後、５０チのエチレン
グリコールを含む同緩衝液で溶出し、活性活分を２０ｍ
Ｍ ！Ｊン酸緩衝液で１０倍に希釈した。約２万ユニツ
トのＩＦＮが精製回収された。
第１図は、プラスミドｐＳＶ２Ｌγの作製法を示す模式
図、第２図はＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を含むＢａｍＨｌ
８．６キロベ一スＤＮＡ断片の制限酵素切断部位を示す
図、第３図はプラスミドｐＳＶ８Ｌγの作製法を示す模
式図、第４図−ａ及び第４図−すはプラスミドｐＳＶｅ
ＢＰＶγの作製法を示す模式％式％ Ｂｇ１Ｍ及び５ａｉｌは、夫々の制限酵素の認識部位を
示す。またＨｕＩＦＮ−ｒ 、 Ｅｃｏｇｐｔ 、 Ｓ
Ｖ４０ｏｒｉ 、Ｔａｎｔｉ、及びＡｐは、それぞれ
ＨｕｌＦＮ−γ遺伝子、大腸菌のグアニン・ホスホリボ
シル・トランスフェラーゼ、ＳＶ４０ウィルスのプロモ
ーター領域を含むＤＮＡ複製起点、ＳＶ４０のＴ抗原遺
伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を示す。 ＢＰＶはボバイン・パピローマ・ウィルスである。 特 許出願人 鐘淵化学工業株式会社代珊人 弁理士
浅 野 真 −第１図 第２図 ＠３図 ｅｌｌ 第４図−ｂ ＢＰＶｎｌｈ’ｌｌ軌ａｒ−＋＊Ｉｌｒｉ６９ｇ ｑ％
ｔｔｉ。 （Ｍ襲ｔ１１）
図、第２図はＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を含むＢａｍＨｌ
８．６キロベ一スＤＮＡ断片の制限酵素切断部位を示す
図、第３図はプラスミドｐＳＶ８Ｌγの作製法を示す模
式図、第４図−ａ及び第４図−すはプラスミドｐＳＶｅ
ＢＰＶγの作製法を示す模式％式％ Ｂｇ１Ｍ及び５ａｉｌは、夫々の制限酵素の認識部位を
示す。またＨｕＩＦＮ−ｒ 、 Ｅｃｏｇｐｔ 、 Ｓ
Ｖ４０ｏｒｉ 、Ｔａｎｔｉ、及びＡｐは、それぞれ
ＨｕｌＦＮ−γ遺伝子、大腸菌のグアニン・ホスホリボ
シル・トランスフェラーゼ、ＳＶ４０ウィルスのプロモ
ーター領域を含むＤＮＡ複製起点、ＳＶ４０のＴ抗原遺
伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を示す。 ＢＰＶはボバイン・パピローマ・ウィルスである。 特 許出願人 鐘淵化学工業株式会社代珊人 弁理士
浅 野 真 −第１図 第２図 ＠３図 ｅｌｌ 第４図−ｂ ＢＰＶｎｌｈ’ｌｌ軌ａｒ−＋＊Ｉｌｒｉ６９ｇ ｑ％
ｔｔｉ。 （Ｍ襲ｔ１１）
Claims (24)
- （１）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮＡ
配列とＳＶ４０の後期プロモーター領域を含むＤＮＡ配
列とを接続したＤＮＡ配列。 - （２）ＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列が同一
のＤＮＡ配列上に存在する特許請求の範囲第１項記載の
ＤＮＡ配列。 - （３）動物細胞での選択マーカー遺伝子が同一ＤＮＡ配
列上に存在する特許請求の範囲第１項または第２項記載
のＤＮＡ配列。 - （４）微生物での選択マーカー遺伝子及び微生物でのＤ
ＮＡ複製起点が同一ＤＮＡ配列上に存在する特許請求の
範囲第１項乃至第３項の何れかの項記載のＤＮＡ配列。 - （５）ＤＮＡ配列がプラスミドｐＳＶ２Ｌγ或いはｐＳ
Ｖ３Ｌγである特許請求の範囲第１項乃至第４項の何れ
かの項記載のＤＮＡ配列。 - （６）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮＡ
配列とＳＶ４０の後期プロモーター領域を含むＤＮＡ配
列とを接続したＤＮＡ配列によつて形質転換された動物
培養細胞。 - （７）細胞がＳＶ４０による形質転換株である特許請求
の範囲第６項記載の動物培養細胞。 - （８）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮＡ
配列とＳＶ４０の後期プロモーター領域を含むＤＮＡ配
列とを接続したＤＮＡ配列を持つＤＮＡとＳＶ４０のＴ
抗原をコードするＤＮＡの２種のＤＮＡによつて形質転
換された動物培養細胞。 - （９）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮＡ
配列とＳＶ４０の後期プロモーター領域を含むＤＮＡ配
列とを接続したＤＮＡ配列によつて形質転換された動物
培養細胞を培養し、ヒトインターフェロン−γを生成せ
しめ、これを採取するヒトインターフェロン−γの製造
方法。 - （１０）形質転換細胞を培養液中で培養し、培養液から
ヒトインターフェロン−γを回収する特許請求の範囲第
９項記載の製造方法。 - （１１）形質転換細胞を動物体内で増殖させ、ヒトイン
ターフェロン−γを該動物から回収する特許請求の範囲
第９項記載の製造方法。 - （１２）形質転換細胞を動物体内で増殖させた後、細胞
を回収し、培養液中で培養する特許請求の範囲第１０項
記載の製造方法。 - （１３）培養培地が、無血清培地である特許請求の範囲
第１０項または第１２項記載の製造方法。 - （１４）細胞がＳＶ４０による形質転換株である特許請
求の範囲第９項乃至第１３項の何れかの項記載の製造方
法。 - （１５）細胞がＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡに
よつて形質転換された細胞である特許請求の範囲第９項
乃至第１３項の何れかの項記載の製造方法。 - （１６）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮ
Ａ配列と動物培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモー
ター領域とを接続したＤＮＡ配列が、ボバイン・パピロ
ーマ・ウィルス （Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の
少くとも動物細胞での複製に必要なＤＮＡ配列と同一 ＤＮＡ配列上に存在するＤＮＡ配列。 - （１７）微生物での選択マーカー遺伝子及び微生物での
ＤＮＡ複製起点が同一ＤＮＡ配列上に存在する特許請求
の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列。 - （１８）ＤＮＡ配列がプラスミドｐＳＶｅＢＰＶγであ
る特許請求の範囲第１６項または第１７項記載のＤＮＡ
配列。 - （１９）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮ
Ａ配列と動物培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモー
ター領域とを接続したＤＮＡ配列が、ボバイン・パピロ
ーマ・ウィルスの少くとも動物細胞での複製に必要なＤ
ＮＡ配列と同一ＤＮＡ配列上に存在するＤＮＡ配列を有
するＤＮＡによつて形質転換された動物培養細胞。 - （２０）ヒトインターフェロン−γをコードする核ＤＮ
Ａ配列と動物培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモー
ター領域とを接続したＤＮＡ配列が、ボバイン・パピロ
ーマ・ウィルスの少くとも動物細胞での複製に必要なＤ
ＮＡ配列と同一ＤＮＡ配列上に存在するＤＮＡ配列を有
するＤＮＡによつて形質転換された動物培養細胞を培養
することによりヒトインターフェロン−γを生成せしめ
、これを採取するヒトインターフェロン−γの製造方法
。 - （２１）形質転換細胞を培養液中で培養し、培養液から
ヒトインターフェロン−γを回収する特許請求の範囲第
２０項記載の製造方法。 - （２２）形質転換細胞を動物体内で増殖させ、ヒトイン
ターフェロン−γを該動物から回収する特許請求の範囲
第２０項記載の製造方法。 - （２３）形質転換細胞を動物体内で増殖させた後、細胞
を回収し、培養培地中で培養する特許請求の範囲第２１
項記載の製造方法。 - （２４）培養液が無血清培地である特許請求の範囲第２
１項または第２３項記載の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60091618A JPS61249394A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | インタ−フエロン−γ |
| CA000482839A CA1302320C (en) | 1984-06-11 | 1985-05-30 | Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells |
| EP85107142A EP0167852B1 (en) | 1984-06-11 | 1985-06-11 | Human interferon-gamma |
| DE8585107142T DE3586574T2 (de) | 1984-06-11 | 1985-06-11 | Menschliches gamma-interferon. |
| US07/144,988 US4970161A (en) | 1984-06-11 | 1988-01-19 | Human interferon-gamma |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60091618A JPS61249394A (ja) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | インタ−フエロン−γ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61249394A true JPS61249394A (ja) | 1986-11-06 |
Family
ID=14031558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60091618A Pending JPS61249394A (ja) | 1984-06-11 | 1985-04-27 | インタ−フエロン−γ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61249394A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63141588A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 組換え体ｄｎａおよび形質転換体 |
| JPH01128788A (ja) * | 1987-11-12 | 1989-05-22 | Ichio Yanagi | Ｅｂｎａ関連抗原遺伝子の発現組み換え体ｄｎａおよびそれを移入した細胞 |
-
1985
- 1985-04-27 JP JP60091618A patent/JPS61249394A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63141588A (ja) * | 1986-12-05 | 1988-06-14 | Toray Ind Inc | 組換え体ｄｎａおよび形質転換体 |
| JPH01128788A (ja) * | 1987-11-12 | 1989-05-22 | Ichio Yanagi | Ｅｂｎａ関連抗原遺伝子の発現組み換え体ｄｎａおよびそれを移入した細胞 |
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